BE1029436A1

BE1029436A1 - Scheiding van moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillon

Info

Publication number: BE1029436A1
Application number: BE20225467A
Authority: BE
Inventors: Nikolay Khanzhin; Pierre Chassagne
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2021-06-15
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2022-12-21
Also published as: BE1029436B1; WO2022263425A1

Abstract

De uitvinding heeft betrekking op een methode voor de terugwinning en de zuivering van een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide (HMO) uit een fermentatiebouillon, die bestaat uit de stappen van ofwel de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door aanpassing van de pH, verdunning en/of warmtebehandeling en vervolgens de zuivering van de voorbehandelde fermentatiebouillon door een behandeling met actieve koolstof of de scheiding van de fermentatiebouillon van biomassa. De methode omvat verder de nanofiltratie, de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom en de droging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen. Bovendien heeft de uitvinding ook betrekking op een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide, verkregen volgens de methode van de uitvinding, en op het gebruik ervan in levensmiddelen, voeder en medische toepassingen.

Description

| BE2022/5467

SCHEIDING VAN MOEDERMELKOLIGOSACHARIDEN UIT EEN FERMENTATIEBOUILLON

GEBIED VAN DE UITVINDING De uitvinding heeft betrekking op de scheiding en de isolatie van neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden (HMO's) uit een reactiemengsel waarin ze zijn geproduceerd.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING In de afgelopen decennia is de interesse in de bereiding en commercialisering van moedermelkoligosachariden (HMO's) gestaag toegenomen. Het belang van HMO's houdt rechtstreeks verband met hun unieke biologische activiteiten. Daarom zijn HMO's belangrijke potentiële producten voor voedings- en therapeutische doeleinden geworden. Er werd dan ook gezocht naar goedkope manieren om HMO's industrieel te produceren. Tot vandaag zijn de structuren van meer dan 140 HMO's bepaald en waarschijnlijk zijn er aanzienlijk meer aanwezig in moedermelk (Urashima et al.: Milk oligosaccharides, Nova Biomedical Books, 2011; Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)). De HMO's bevatten een lactosedeel (GalB1-4Glc) aan het reducerende uiteinde en kunnen worden verlengd met een N-acetylglucosaminedeel of een of meerdere N-acetyllactosaminedelen (GalB1-4GIcNAc) en/of een lacto-N-biosedeel (GalB1-3GlcNAc). Lactose en de N- acetyllactosaminyl- of lacto-N-biosylderivaten van lactose kunnen verder worden gesubstitueerd met een of meerdere fucose- en/of siaalzuurresiduen of lactose kan worden gesubstitueerd met een extra galactose om de tot dusver bekende HMO's te verkrijgen. De inspanningen voor de ontwikkeling van processen voor de synthese van HMO's, inclusief gesialyleerde HMO's, zijn in de laatste tien jaar sterk toegenomen wegens hun rol in talrijke menselijke biologische processen. In dit verband zijn processen ontwikkeld voor de productie van HMO's door microbiële fermentaties, enzymatische processen, chemische syntheses of combinaties van deze technologieën. De directe fermentatieve productie van HMO's, vooral van HMO's die een trisacharide zijn, is onlangs in de praktijk gebracht (Han et al. Biotechnol. Adv. 30, 1268 (2012) en hierin aangegeven referenties). Bij een dergelijke fermentatietechnologie werd een recombinant Æ.

coli-systeem gebruikt waarbij een of meerdere types glycosyltransferases afkomstig van virussen of bacteriën zijn gecoëxpresseerd om exogeen toegevoegde lactose te glycosyleren, die is geïnternaliseerd door de LacY-permease van de Æ. coli. Het gebruik van een recombinante glycosyltransferase, voornamelijk reeksen van recombinante glycosyltransferasen voor de productie van oligosachariden met vier of meer monosacharide-

° BE2022/5467 eenheden, heeft echter altijd geleid tot de vorming van bijproducten, wat resulteert in een complex mengsel van oligosachariden in de fermentatiebouillon. Verder bevat een fermentatiebouillon onvermijdelijk een uitgebreid gamma van niet-oligosacharidestoffen zoals cellen, celfragmenten, eiwitten, erwitfragmenten, DNA, DNA-fragmenten, endotoxinen, gekarameliseerde bijproducten, mineralen, zouten of andere geladen moleculen. Daarom is het een bijzondere uitdaging om neutrale of gesialyleerde HMO's uit een complexe matrix zoals een fermentatiebouillon te isoleren.

Voor de scheiding van HMO's van koolhydraatbijproducten en andere verontreinigende bestanddelen werd een behandeling met actieve koolstof in combinatie met een gelfiltratiechromatografie voorgesteld als een voorkeursmethode (WO 01/04341, EP-A- 2479263, Dumon et al. Glycoconj. J. 18, 465 (2001), Priem et al. Glycobiology 12, 235 (2002), Drouillard et al. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 1778 (2006), Gebus et al. Carbohydr. Res. 361, 83 (2012), Baumgärtner et al. ChemBioChem 15, 1896 (2014)). Hoewel gelfiltratiechromatografie een geschikte methode is voor in het laboratorium, kan die niet efficiënt worden opgeschaald voor industriële productie. EP-A-2896628 beschrijft een proces voor de zuivering van 2'-FL uit een fermentatiebouillon verkregen door microbiële fermentatie, dat uit de volgende stappen bestaat: ultrafiltratie, harschromatografie met sterke kationenwisseling (H*-vorm), neutralisatie, harschromatografie met sterke anionenwisseling (acetaatvorm), neutralisatie, behandeling met actieve koolstof, elektrodialyse, tweede harschromatografie met sterke kationenwisseling (H*- of Na*-vorm), tweede harschromatografie met sterke anionenwisseling (Cl-vorm), tweede behandeling met actieve koolstof, optionele tweede elektrodialyse en steriele filtratie. Een dergelijk zuiveringsproces is intrinsiek beperkt tot neutrale moedermelkoligosachariden. WO 2017/182965 en WO 2017/221208 beschrijven een proces voor de zuivering van LNT of LNnT uit fermentatiebouillon bestaande uit ultrafiltratie, nanofiltratie, behandeling met actieve koolstof en behandeling met hars met sterke kationenwisseling (H’-vorm) gevolgd door hars met zwakke anionenwisseling (basevorm). WO 2015/188834 en WO 2016/095924 beschrijven de kristallisatie van 2'-FL uit een gezuiverde fermentatiebouillon, waarbij de zuivering bestaat uit ultrafiltratie, nanofiltratie, behandeling met actieve koolstof en behandeling met hars met sterke kationenwisseling (H*- vorm) gevolgd door zwak basisch hars (basevorm). Eerdere documenten beschreven zuiveringsmethoden die zijn uitgewerkt voor fermentatiebouillons met een laag lactosegehalte of zonder lactose. Volgens deze procedures is lactose die tijdens de fermentatieve productie van een neutrale HMO in overmaat is

) BE2022/5467 toegevoegd, na voltooiing van de fermentatie in situ gehydrolyseerd door de werking van een B-galactosidase, wat leidt tot een bouillon die in wezen geen residuele lactose meer bevat.

Overeenkomstig beschrijft WO 2012/112777 een reeks stappen om 2'-FL te zuiveren, bestaande uit centrifugeren, het vastleggen van de oligosacharide op koolstof gevolgd door elutie en flashchromatografie op ionenwisselingsmiddelen.

WO 2015/106943 beschrijft de zuivering van 2'-FL bestaande uit ultrafiltratie, chromatografie met hars met sterke kationenwisseling (H'-vorm), neutralisatie, chromatografie met hars met sterke anionenwisseling (Cl-vorm), neutralisatie, nanofiltratie/diafiltratie, behandeling met actieve koolstof, elektrodialyse, facultatieve tweede chromatografie met hars met sterke kationenwisseling (Na*-vorm), tweede chromatografie met hars met sterke anionenwisseling (CI-vorm), tweede behandeling met actieve koolstof, optionele tweede elektrodialyse en steriele filtratie.

WO 2019/063757 beschrijft een proces voor de zuivering van een neutrale HMO, bestaande uit het scheiden van biomassa uit fermentatiebouillon en behandeling met een kationenwisselingsmateriaal, een anionenwisselingsmateriaal en een kationenwisselingsadsorptiehars.

Antoine et al.

Angew.

Chem.

Int.

Ed. 44, 1350 (2005) en US 2007/0020736 beschreven de productie van 3'-SL en bijbehorende di- en trigesialyleerde lactoses door een genetisch gemodificeerde Æ. coli; de bouillon met ca. 0,8 mM 3'-SL werd als volgt behandeld: adsorptie van de producten uit het gecentrifugeerde supernatans op houtskool/celiet, wegspoelen van de in water oplosbare zouten met gedestilleerd water, elueren van de verbindingen met gradiënt waterig ethanol, scheiding van de gesialyleerde producten op een Biogel-kolom en ontzouten, wat leidde tot 49 mg 3'-SL uit 1 liter bouillon.

WO 01/04341 en Priem et al.

Glycobiology 12, 235 (2002) beschreven de productie van 3'-SL door een genetisch gemodificeerde Æ. coli; 3'- SL werd geïsoleerd door de volgende opeenvolging van bewerkingen: warmtepermeabilisatie van de producerende cellen gevolgd door centrifugatie, adsorptie van het product uit het supernatans op houtskool/celiet, wegspoelen van de in water oplosbare zouten met gedestilleerd water, elueren van de verbinding met gradiënt waterig ethanol, binden van de verbinding aan een sterke anionenwisselaar in HCO:'-vorm, elutie van de verbinding met een lineaire gradiënt NaHCO:-oplossing, vervolgens verwijdering van het natriumbicarbonaat met een kationenwisselaar (in H”-vorm), wat leidde tot geïsoleerd 3'-SL met een zuiveringsrendement van 49 %. WO 2007/101862 en Fierfort et al.

J.

Biotechnol. 134, 261 (2008) beschreven een alternatieve verwerkingsprocedure van een 3'-SL fermentatiebouillon.

De procedure bestaat uit de volgende stappen: warmtepermeabilisatie van de producerende cel, centrifugatie, aanpassing van de pH van het extracellulaire tot 3,0 door de toevoeging van

’ BE2022/5467 een hars met sterke kationenwisseling in zuurvorm, verwijdering van de neergeslagen eiwitten door centrifugatie, aanpassing van de pH van het supernatans aan 6,0 door de toevoeging van een zwakke anionenwisselaar in basevorm, binding van de sialyllactose aan een anionenwisselaar in HCO:'-vorm, spoeling met gedestilleerd water, elutie van de verbinding met een continue gradiënt NaHCO:-oplossing, verwijdering van het natriumbicarbonaat met een kationenwisselaar (in H”-vorm) tot pH 3,0 is bereikt, vervolgens aanpassing van de pH tot 6,0 met NaOH.

Met de bovenstaande zuivering kon 15 g 3'-SL worden geïsoleerd uit 1 liter bouillon met 25,5 g 3'-SL.

Drouillard et al.

Carbohydr.

Res. 345, 1394 (2010)) paste de bovenstaande procedure van Fierfort toe op een fermentatiebouillon met 6'-SL (11 g/l) en een beetje 6,6'-disialyllactose (DSL) en isoleerde zo 3,34 g 6'-SL + DSL in een verhouding van 155/86. WO 2006/034225 beschrijft twee alternatieve zuiveringen van 3'-SL uit een producerende fermentatiebouillon.

Volgens de eerste procedure werd het lysaat van de kweek verdund met gedestilleerd water en geroerd met actieve koolstof/celiet.

Het influent werd met water gespoeld, waarna het product met waterig ethanol van de houtskool/celiet werd geëlueerd.

Volgens de tweede methode werden de kweekcellen warmtebehandeld en werden de neergeslagen vaste deeltjes door centrifugatie van het supernatans gescheiden.

Het resulterende supernatans werd door een microfilter geleid, het permeaat werd door een 10 kDa-membraan geleid en vervolgens nanogefiltreerd.

Het resulterende retentaat werd vervolgens gediafiltreerd om het uiteindelijke monster te verzamelen.

Beide zuiveringsmethoden zorgden voor 90-100 mg 3'-SL uit 1 liter fermentatiebouillon.

Gilbert et al.

Nature Biotechnol. 16, 769 (1998) en WO 99/31224 beschrijven de enzymatische productie van 3'-SL vanaf lactose, siaalzuur, fosfoenolpyruvaat, ATP en CMP met behulp van een CMP-Neu5Ac synthetase/a-2,3-sialyltransferase fusie-eiwitextract.

Het product werd gezuiverd door een opeenvolging van ultrafiltratie (3000 MWCO), C18 omgekeerde-fasechromatografie, nanofiltratie/diafiltratie bij pH = 3 en pH = 7, aanzuring met een hars met sterke kationenwisseling (H”), neutralisatie met NaOH-oplossing en ontkleuring met actieve koolstof.

WO 2009/113861 beschrijft een proces voor de isolatie sialyllactose uit een ontvette en eiwitvrije melkstroom, bestaande uit een contact van deze melkstroom met een eerste anionenwisselaarshars in vrije basevorm en met een vochtgehalte van 30-48 %, zodat de negatief geladen mineralen aan het hars gebonden zijn en de sialyllactose niet, gevolgd door een behandeling met een tweede anionenwisselaarshars in vrije basevorm, van het macroporeuze of geltype, met een vochtgehalte tussen 50 en 70 %, zodat de sialyllactose aan

> BE2022/5467 het hars wordt gebonden.

Bij dit proces is de sialyllactose bevattende stroom redelijk verdund (een concentratie van enkele honderden ppm) en is de terugwinning van sialyllactose uit het eerste hars matig.

WO 2017/152918 beschrijft een methode voor het verkrijgen van een gesialyleerd oligosacharide uit een fermentatiebouillon, waarin dit gesialyleerd oligosacharide wordt geproduceerd door het kweken van een genetisch gemodificeerd micro-organisme dat in staat is om dit gesialyleerd oligosacharide te produceren uit een geïnternaliseerde koolhydraatprecursor, bestaande uit de volgende stappen: 1) ultrafiltratie (UF), ii) nanofiltratie (NF), 111) optionele behandeling met actieve koolstof, en iv) behandeling van de bouillon met een hars met sterke anionenwisseling en/of een kationenwisselaarshars.

EP-A-3456836 beschrijft een methode voor de scheiding van een gesialyleerd oligosacharide uit een waterig medium, waarbij de methode bestaat uit een behandeling van een waterige oplossing die dit gesialyleerd oligosacharide bevat, met minstens twee soorten ionenwisselaarshars, waarvan de ene een sterk anionenwisselaarshars in Cl'-vorm en de andere een sterk kationenwisselaarshars is.

WO 2019/043029 beschrijft een methode voor de zuivering van gesialyleerde oligosachariden die zijn geproduceerd door microbiële fermentatie of in vitro biokatalyse, waarbij de methode bestaat uit de volgende stappen: 1) de scheiding van biomassa uit de fermentatiebouillon, 11) de verwijdering van kationen uit de fermentatiebouillon of het reactiemengsel, iii) de verwijdering van anionische onzuiverheden uit de fermentatiebouillon of het reactiemengsel, en iv) de verwijdering van verbindingen met een lager molecuulgewicht dan dat van het te zuiveren gesialyleerde oligosacharide uit de fermentatiebouillon of het reactiemengsel.

WO 2019/2291 18 beschrijft een methode voor de zuivering van een sialyllactose uit andere koolhydraten, waarbij de sialyllactose wordt geproduceerd door fermentatie, bestaande uit: a) de scheiding van de celmassa met ultrafiltratie, b) de behandeling met een sterk kationische ionenwisselaar, gevolgd door de behandeling van het filtraat met een sterk anionische ionenwisselaar (Cl’-vorm), c) eerste nanofiltratie, d) tweede nanofiltratie,

° BE2022/5467 e) elektrodialyse, f) omgekeerde osmose, g) behandeling met actieve koolstof, h) steriele filtratie, en 1) sproeidroging. Er is echter behoefte aan alternatieve en/of verbeterde procedures voor de isolatie en zuivering van neutrale of gesialyleerde HMO's uit niet-koolhydraatbestanddelen van de fermentatiebouillon waarin ze zijn geproduceerd, met name procedures die geschikt zijn voor industriële schaal, om het terugwinningsrendement van de neutrale of gesialyleerde HMO's te verbeteren en/of de geavanceerde methoden te vereenvoudigen terwijl de zuiverheid van de neutrale of gesialyleerde HMO's minstens behouden blijft en bij voorkeur wordt verbeterd. Bovendien leiden dergelijke alternatieve zuiveringsprocedures bij voorkeur tot gezuiverde neutrale of gesialyleerde HMO's die vrij zijn van eiwitten en recombinant materiaal afkomstig van de gebruikte recombinante microbiële stammen, en die dus zeer geschikt zijn voor gebruik in levensmiddelen, medische levensmiddelen en voedertoepassingen.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING De uitvinding heeft betrekking op een methode voor de terugwinning en de zuivering van een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide (HMO) uit een fermentatiebouillon, die bestaat uit de volgende stappen: a. de voorziening van een HMO-bevattende fermentatiebouillon en al. de scheiding van de fermentatiebouillon om een gescheiden HMO-bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen; of a2. de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door pH-aanpassing, verdunning en/of warmtebehandeling, b. de behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom van stap al) of de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) met actieve koolstof om een HMO-bevattende stroom te verkrijgen; c. de zuivering van de HMO-bevattende stroom door nanofiltratie; d. de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom; en e. de droging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.

In een ander aspect heeft de uitvinding betrekking op een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide, verkregen of te verkrijgen volgens de methode van de uitvinding.

! BE2022/5467 Een ander aspect van de uitvinding heeft betrekking op een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide, verkregen of te verkrijgen volgens de methode van de uitvinding, voor gebruik in de geneeskunde. Een ander aspect van de uitvinding heeft betrekking op het gebruik van een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide, verkregen of te verkrijgen volgens de methode van de uitvinding, voor voedings- en/of voedertoepassingen. Een ander aspect van de uitvinding heeft betrekking op een voedingsmiddel of cosmetisch product dat de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide bevat, verkregen of te verkrijgen volgens de methode van de uitvinding.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

1. Termen en definities De term ”fermentatiebouillon”, zoals gebruikt in deze specificatie, verwijst naar een product verkregen door de fermentatie van het microbiële organisme. Het fermentatieproduct omvat dus cellen (biomassa), het fermentatiemedium, zouten, residueel substraatmateriaal en alle moleculen/bijproducten die tijdens de fermentatie ontstaan, zoals de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO's. Na elke stap van de zuiveringsmethode worden een of meerdere bestanddelen van het fermentatieproduct verwijderd, wat leidt tot een meer gezuiverde neutrale of gesialyleerde HMO. De term ”monosacharide” duidt op een suiker met 5-9 koolstofatomen, zijnde een aldose (bijv. D-glucose, D-galactose, D-mannose, D-ribose, D-arabinose, L-arabinose, D-xylose enz.), een ketose (bijv. D-fructose, D-sorbose, D-tagatose enz. ), een deoxysuiker (bijv. L- rhamnose, L-fucose enz.), een deoxyaminosuiker (bijv. N-acetylglucosamine, N- acetylmannosamine, N-acetylgalactosamine enz.), een ureumzuur, een ketoaldonzuur (bijv. siaalzuur) of equivalenten daarvan.

De term ”disacharide” betekent een koolhydraat bestaande uit twee monosacharide-eenheden die via een interglycosidebinding met elkaar zijn verbonden. De term ”trioligosacharide” of hoger betekent een suikerpolymeer dat bestaat uit minstens drie, bij voorkeur drie tot acht, en bij voorkeur drie tot zes monosacharide-eenheden (vide supra). De oligosacharide kan een lineaire of vertakte structuur hebben die monosacharide- eenheden bevat die via een interglycosidebinding met elkaar zijn verbonden. De term ”moedermelkoligosacharide” of ”HMO” betekent een complex koolhydraat dat voorkomt in moedermelk (Urashima et al.: Milk Oligosaccharides, Nova Medical Books, NY, 2011; Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)). De HMO's hebben een kernstructuur bestaande uit een lactose-eenheid aan het reducerende uiteinde die wordt

© BE2022/5467 verlengd i) door een B-N-acetyl-glucosaminylgroep of ii) door een of meerdere B-N-acetyl- lactosaminyl- en/of een of meerdere B-lacto-N-biosyl-eenheden. De kernstructuren kunnen worden gesubstitueerd door een a-L-fucopyranosyl- en/of een a-N-acetyl-neuraminyl (sialyl)- deel. In dit verband zijn de niet-zure (of neutrale) HMO's vrij van een sialylresidu en hebben de zure HMO's minstens één sialylresidu in hun structuur. De niet-zure (of neutrale) HMO's kunnen gefucosyleerd of niet-gefucosyleerd zijn. Voorbeelden van dergelijke neutrale niet- gefucosyleerde HMO's zijn lacto-N-triose II (LNTri, GlcNAc{(B1-3)Gal(B1-4)Glc), lacto-N- tetraose (LNT), lacto-N-neotetraose (LNnT), lacto-N-neohexaose (LNnH), para-lacto-N- neohexaose (pLNnH), para-lacto-N-hexaose (pLNH) en lacto-N-hexaose (LNH).

Voorbeelden van neutrale gefucosyleerde HMO's zijn 2'-fucosyllactose (2'-FL), lacto-N- fucopentaose I (LNFP-I), lacto-N-difucohexaose I (LNDFH-I), 3-fucosyllactose (3-FL), difucosyllactose (DFL), lacto-N-fucopentaose II (LNFP-H), lacto-N-fucopentaose III (LNFP- III), lacto-N-difucohexaose III (LNDFH-III), fucosyl-lacto-N-hexaose II (FLNH-IT), lacto-N- fucopentaose V (LNFP-V), lacto-N-difucohexaose II (LNDFH-H), fucosyl-lacto-N-hexaose I (FLNH-I), fucosyl-para-lacto-N-hexaose I (FpLNH-D), fucosyl-para-lacto-N-neohexaose II (F-pLNnH II) en fucosyl-lacto-N-neohexaose (FLNnH). Voorbeelden van zure HMO's zijn 3'- sialyllactose (3'-SL), 6'-sialyllactose (6'-SL), 3-fucosyl-3'-sialyllactose (FSL), LST a, fucosyl- LST a (FLST a), LST b, fucosyl-LST b (FLST b), LST c fucosyl-LST c (FLST c), sialyl-LNH (SLNH), sialyl-lacto-N-hexaose (SLNH), sialyl-lacto-N-neohexaose I (SLNH-I), sialyl-lacto- N-neohexaose II (SLNH-IT) en disialyl-lacto-N-tetraose (DSLNT).

De term ”sialyl” of ”sialyldeel” duidt op het glycosylresidu van siaalzuur (N-acetyl- neuraminezuur, NeuSAc), bij voorkeur verbonden met een a-binding: Ho Pp! COOH > O De term ”fucosyl” betekent een L-fucopyranosylgroep, bij voorkeur verbonden met een a- 1nterglycosidebinding: 2 27 OH

OH ”N-acetyl-glucosaminyl” betekent een N-acetyl-2-amino-2-deoxy-D-glucopyranosylgroep (GleNAc), bij voorkeur verbonden met een B-binding:

OH HO 0 %

HO NHAc ”N-acetyl-lactosaminyl” betekent het glycosylresidu van N-acetyl-lactosamine (LacNAc, GalpB1-4GIcNAc), bij voorkeur verbonden met een B-binding: on CH

OH oO HO o © %

OH HO NHAc Verder betekent de term ”lacto-N-biosyl” het glycosylresidu van lacto-N-biose (LNB, GalpB1-3GIcNAc), bij voorkeur verbonden met een B-binding:

OH OH OH Q HO Q %

HO O De term ”biomassa”, in de context van fermentatie, verwijst naar de gesuspendeerde, neergeslagen of onoplosbare materialen afkomstig van fermentatiecellen, zoals intacte cellen, ontregelde cellen, celfragmenten, eiwitten, eiwitfragmenten, polysachariden.

De term ”Brix” verwijst naar graden Brix, d.w.z. het suikergehalte van een waterige oplossing (g suiker in 100 g oplossing). In dit verband verwijst de Brix van een moedermelkoligosacharideoplossing van deze toepassing naar het totale koolhydraatgehalte van de oplossing, inclusief de moedermelkoligosachariden en de begeleidende koolhydraten.

Brix wordt met een geijkte refractometer gemeten.

”Demineralisatie” betekent bij voorkeur een proces voor het verwijderen van mineralen of minerale zouten uit een vloeistof. In de context van deze uitvinding kan de demineralisatie plaatsvinden in de nanofiltratiestap, vooral wanneer die wordt gecombineerd met diafiltratie of door kation- en anionenwisselingsharsen te gebruiken (indien van toepassing).

De term ”eiwitvrij waterig medium” betekent bij voorkeur een waterig medium of een waterige bouillon, afkomstig van een fermentatie- of enzymatisch proces dat een neutraal of gesialyleerd HMO oplevert en dat is behandeld voor de verwijdering van nagenoeg alle eiwitten en peptiden, peptidefragmenten, RNA's en DNA's en endotoxinen en glycolipiden die de uiteindelijke zuivering van een of meerdere neutrale of gesialyleerde HMO's en/of een of meerdere bestanddelen ervan, met name het mengsel ervan, uit de fermentatiebouillon of het enzymatische procesmengsel zouden kunnen hinderen.

De term ”HMO-bevattende stroom” betekent een waterig medium dat neutrale of gesialyleerde HMO's bevat die zijn verkregen uit een fermentatieproces en dat is behandeld om gesuspendeerde deeltjes en verontreinigingen uit het proces te verwijderen, met name cellen, celbestanddelen, onoplosbare metabolieten en afval dat de uiteindelijke zuivering van een of meerdere neutrale of gesialyleerde HMO's en/of een of meerdere bestanddelen ervan, met name mengels ervan, zouden kunnen hinderen.

De term ”biomassa-afvalstroom” betekent bij voorkeur gesuspendeerde deeltjes en verontreinigingen van het fermentatieproces, met name cellen, celbestanddelen, onoplosbare metabolieten en afval.

De afstotingsfactor van een zout (in procent) wordt berekend als (1-kp/kr)-100, waarbij kp het geleidingsvermogen van het zout in het permeaat en kr het geleidingsvermogen van het zout in het retentaat is.

De afstotingsfactor van een koolhydraat (in procent) wordt berekend als (1-Cp/Cr)-100, waarbij Cp de concentratie van het koolhydraat in het permeaat en C, de concentratie van het koolhydraat in het retentaat is.

De term ”diafiltratie” verwijst naar de toevoeging van oplosmiddel (water) tijdens het membraanfiltratieproces. Als diafiltratie tijdens ultrafiltratie wordt toegepast, verbetert dit het rendement van de gewenste HMO in het permeaat. Als diafiltratie tijdens nanofiltratie wordt toegepast, verbetert dit de scheiding van kleinschalige onzuiverheden en zouten naar het permeaat. Het rendement van de opgeloste stof en dus de verrijking van het product kunnen worden berekend aan de hand van de formules die de professional kent op basis van de afstotingsfactoren en de relatieve hoeveelheid toegevoegd water.

De term ”concentreren”, zoals gebruikt in stap d) van de methode volgens de uitvinding, verwijst naar de verwijdering van vloeistof, meestal water, waardoor een hogere concentratie van een neutrale of gesialyleerde HMO in de gezuiverde HMO-bevattende productstroom ontstaat.

2. Methode voor de zuivering van neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillon De uitvinding heeft betrekking op een methode voor de terugwinning en de zuivering van een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide (HMO) uit een fermentatiebouillon, die bestaat uit de volgende stappen: a. de voorziening van een HMO-bevattende fermentatiebouillon en al. de scheiding van de fermentatiebouillon om een gescheiden HMO-bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen;

“U BE2022/5467 of a2. de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door pH-aanpassing, verdunning en/of warmtebehandeling; b. de behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom van stap al) of de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) met actieve koolstof om een HMO-bevattende stroom te verkrijgen; c. de zuivering van de HMO-bevattende stroom door nanofiltratie; d. de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom; en e. de droging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.

Bij voorkeur bestaat de methode volgens de uitvinding uit een opeenvolging van stappen bestaande uit de stappen al), b), c), d) en e). Bij voorkeur bestaat de methode volgens de uitvinding uit een opeenvolging van stappen bestaande uit de stappen a2), b), c), d) en e). Bij voorkeur bevat de methode geen behandeling met een ionenwisselaarshars, maar in teder geval geen behandeling met basisch anionenwisselaarshars.

Bij voorkeur is een behandeling met ionenwisselaarshars, maar in ieder geval een behandeling met basische anionenwisselaarshars, uitgesloten van de methode volgens de uitvinding.

Bij voorkeur bestaat de methode volgens de uitvinding uit de stappen al), b), c), d) en e). Bij voorkeur bestaat de methode volgens de uitvinding uit de stappen a2), b), c), d) en e). Bij voorkeur worden de methodestappen al), b), c), d) en e) uitgevoerd in de opeenvolgende volgorde al), b), c), d) en e) zoals hierboven aangegeven.

Bij voorkeur worden de methodestappen a2), b), c), d) en e) uitgevoerd in de opeenvolgende volgorde a2), b), c), d) en e) zoals hierboven aangegeven.

De fermentatiebouillon: In een uitvoering werd de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide in de fermentatiebouillon verkregen door het kweken van een genetisch gemodificeerd micro- organisme dat in staat is om deze neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide te produceren uit een geïnternaliseerde koolhydraatprecursor.

Bij voorkeur is het microbiële organisme een genetisch gemodificeerde bacterie of gist, zoals een E. coli-stam, een Bacillus- stam, een Saccharomyces-stam, een Candida-stam, een Hansenula-stam, een Kluyveromyces- stam, een Pichia-stam, een Schizosaccharomyces-stam, een Schwanniomyces-stam, een Torulaspora-stam, een Yarrowia-stam of een Zygosaccharomyces-stam.

Nog meer bij voorkeur is de gist Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis,

Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia stipites, Candida boidinii, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Torulaspora delbrueckii, Yarrowia lipolytica, Zygosaccharomyces rouxii of Zygosaccharomyces bailii; en de Bacillus is Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis of Bacillus subtilis.

Ineen uitvoering is minstens één neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide aanwezig in de fermentatiebouillon niet verkregen door microbiële fermentatie, maar is het bijvoorbeeld aan de fermentatiebouillon toegevoegd nadat het is geproduceerd door een niet- microbiële methode, bijvoorbeeld chemische en/of enzymatische synthese.

In een uitvoering is de zuiverheid van de neutrale of gesialyleerde HMO in de fermentatiebouillon <70 %, bij voorkeur <60 %, nog meer bij voorkeur <50 %, meest bij voorkeur <40 %. In de context van de zuiverheid van HMO of HMO's in een oplossing of in een uiteindelijke gestolde vorm wordt het percentage in deze specificatie geïnterpreteerd als massaprocent. De zuiverheid kan worden bepaald met behulp van bekende conventionele analyseprotocollen, bij voorkeur met HPLC.

De HMO is bij voorkeur een neutrale HMO. In een uitvoering wordt de neutrale HMO bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, 2',3- difucosyllactose, lacto-N-triose II, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, lacto-N- fucopentaose I, lacto-N-fucopentaose II, lacto-N-fucopentaose III, lacto-N-fucopentaose V, lacto-N-neofucopentaose V (alternatieve naam: lacto-N-fucopentaose VI), lacto-N- difucohexaose I, lacto-N-difucohexaose II, lacto-N-difucohexaose III, 6'-galactosyllactose, 3'- galactosyllactose, lacto-N-hexaose, lacto-N-neohexaose en elk mengsel daarvan. Nog meer bij voorkeur is de HMO 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, 2',3-difucosyllactose, lacto-N- triose IL, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose of een lacto-N-fucopentaose, meer bij voorkeur 2'-fucosyllactose, LNT, LNnT of een lacto-N-fucopentaose.

In een uitvoering wordt de gesialyleerde HMO gekozen uit de groep bestaande uit 3'- sialyllactose (3'-SL) en 6'-sialyllactose (6'-SL).

In een uitvoering 1s de neutrale of gesialyleerde HMO in de fermentatiebouillon één enkele neutrale of gesialyleerde HMO. In een uitvoering is de neutrale of gesialyleerde HMO in de fermentatiebouillon een mengsel van verschillende afzonderlijke neutrale of gesialyleerde HMO's.

In een uitvoering is de neutrale of gesialyleerde HMO een mengsel van twee afzonderlijke neutrale of gesialyleerde HMO's. In een andere uitvoering is de neutrale of gesialyleerde HMO een mengsel van drie afzonderlijke neutrale of gesialyleerde HMO's. In een andere uitvoering is de neutrale of gesialyleerde HMO een mengsel van vier afzonderlijke neutrale of gesialyleerde HMO's. In een andere uitvoering is de neutrale of gesialyleerde HMO een mengsel van vijf afzonderlijke neutrale of gesialyleerde HMO's.

In een uitvoering is de neutrale of gesialyleerde HMO in de fermentatiebouillon een mengsel van een neutrale of gesialyleerde HMO die door microbiële fermentatie is verkregen en een neutrale of gesialyleerde HMO die niet door microbiële fermentatie is verkregen, maar bijv.

door chemische en/of enzymatische synthese.

De scheiding van de fermentatiebouillon om een gescheiden neutrale of gesialyleerde HMO- bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen in stap al) van de methode volgens de uitvinding Instap al) van de methode volgens de uitvinding wordt de neutrale of gesialyleerde HMO- bevattende stroom van de biomassa-afvalstroom gescheiden.

De fermentatiebouillon bevat doorgaans, naast de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO, de biomassa van de cellen van het gebruikte micro-organisme samen met eiwitten, eiwitfragmenten, peptiden, DNA's, RNA's, endotoxinen, biogene aminen, aminozuren, organische zuren, anorganische zouten, niet-gereageerde koolhydraatacceptoren zoals lactose, suikerachtige bijproducten, monosachariden, kleurstoffen enz. In stap a) van de methode volgens de uitvinding moet de biomassa van de neutrale of gesialyleerde HMO worden gescheiden.

Bij voorkeur wordt de biomassa van de neutrale of gesialyleerde HMO in stap al) gescheiden door microfiltratie. De microfiltratiestap is bedoeld om de biomassa en, bij voorkeur, ook de hoogmoleculaire bestanddelen en gesuspendeerde vaste stoffen te scheiden van de laagmoleculaire oplosbare bestanddelen van de bouillon, die door het microfiltratiemembraan in het permeaat gaan. Dit microfiltratiepermeaat is een waterige oplossing die de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide bevat, ook wel de HMO-bevattende stroom genoemd, terwijl het microfiltratieretentaat de biomassa-afvalstroom omvat. Elk conventioneel microfiltratemembraan met een poriegrootte van 0,1 tot 10 um kan worden gebruikt. Stap 1) van de methode volgens de uitvinding kan meer dan één microfiltratiestap met membranen met een verschillende poriegrootte bevatten, bijvoorbeeld met toepassing van twee microfiltratiescheidingen, waarbij het eerste membraan een grotere poriegrootte heeft dan het tweede membraan. Deze opstelling kan zorgen voor een betere scheidingsefficiëntie van de bestanddelen met een hoger molecuulgewicht van de bouillon. Na deze scheidingsstap bevat het permeaat de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden die van belang zijn.

In een andere voorkeursuitvoering wordt de biomassa in stap al) door ultrafiltratie gescheiden van de neutrale of gesialyleerde HMO. De ultrafiltratiestap is bedoeld om de biomassa en, bij voorkeur, ook de hoogmoleculaire bestanddelen en gesuspendeerde vaste stoffen te scheiden van de laagmoleculaire oplosbare bestanddelen van de bouillon, die door het ultrafiltratiemembraan in het permeaat gaan. Dit ultrafiltratiepermeaat is een waterige oplossing die de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide bevat, ook wel de HMO-bevattende stroom genoemd, terwijl het ultrafiltratieretentaat de biomassa-afvalstroom omvat. Elk conventioneel ultrafiltratiemembraan met een molecuulgewicht cut-off (MWCO) tussen ongeveer 1 en ongeveer 500 kDa, zoals 10-250, 50-100, 200-500, 100-250, 1-100, 1-50, 10- 25, 1-5 kDa of een ander geschikt subbereik kan worden gebruikt. Het membraanmateriaal kan keramisch zijn of gemaakt zijn van een synthetisch of natuurlijk polymeer, bijv. polysulfon, polyvinylideenfluoride, polyacrylonitril, polypropyleen, cellulose, celluloseacetaat of polymelkzuur. De ultrafiltratiestap kan in doodlopende of doorstromingsmodus worden toegepast. Stap al) van de methode volgens de uitvinding kan meer dan één ultrafiltratiestap met membranen met een verschillende MWCO bevatten, bijvoorbeeld met toepassing van twee ultrafiltratiescheidingen, waarbij het eerste membraan een hogere MWCO heeft dan het tweede membraan. Deze opstelling kan zorgen voor een betere scheidingsefficiëntie van de bestanddelen met een hoger molecuulgewicht van de bouillon. Na deze scheidingsstap bevat het permeaat materialen met een molecuulgewicht dat lager is dan de MWCO van het tweede membraan, inclusief de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden die van belang zijn. In een uitvoering wordt de fermentatiebouillon ultragefiltreerd met een membraan met een MWCO van 5 tot 30 kDa, zoals 10-25, 15 of 20 kDa.

Bij voorkeur is het rendement van de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO in het permeaat na de ultrafiltratiestap hoger dan 50 %, hoger dan 60 %, hoger dan 70 %, hoger dan 80 %, hoger dan 90 %, hoger dan 91 %, hoger dan 92 %, hoger dan 93 %, hoger dan 94 %, hoger dan 95 %, hoger dan 96 %, hoger dan 97 %, hoger dan 98 %, of hoger dan 99 %. In een andere uitvoering wordt de door fermentatie verkregen bouillon onderworpen aan centrifugatie om de biomassa in stap al) van de methode volgens de uitvinding van de neutrale of gesialyleerde HMO (HMO-bevattende stroom) te scheiden. In deze uitvoering vertegenwoordigt het supernatans de HMO-bevattende stroom, terwijl het resterende materiaal, d.w.z. de ”biomassa-afvalstroom”, kan worden gescheiden. Door centrifugatie kan een helder supernatans met de neutrale of gesialyleerde HMO worden verkregen, die de HMO-bevattende stroom vormt. De centrifugatie kan op laboratoriumschaal of, bij voorkeur over eerdere centrifugeermethoden, op commerciële schaal (bijv. industriële schaal, volledige productieschaal) plaatsvinden.

In sommige uitvoeringen kan een centrifugatie in meerdere stappen worden gebruikt. Er kan bijvoorbeeld een reeks van 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 of 10 centrifugatiestappen worden uitgevoerd. In andere uitvoeringen kan de centrifugatie in één enkele stap gebeuren. De centrifugatie zorgt voor een snelle verwijdering van de biomassa.

In bepaalde uitvoeringen kan een Sedicanter®-centrifuge, ontworpen en geproduceerd door Flottweg, worden gebruikt. Dit specifieke type centrifuge is niet beperkend. Er kunnen vele types centrifuges worden gebruikt. Het centrifugeren kan een continu proces zijn. In sommige uitvoeringen kan het centrifugeren een toevoer hebben. Het centrifugeren kan bijvoorbeeld een continue toevoer hebben. In bepaalde uitvoeringen kan het centrifugeren een verwijdering van vaste stoffen omvatten, zoals de verwijdering van natte vaste stoffen. De verwijdering van natte vaste stoffen kan in sommige implementaties continu en in andere implementaties periodiek zijn. Er kan bijvoorbeeld een conische plaatcentrifuge (bijv. schijkomcentrifuge of schijfstapelscheider) worden gebruikt. De conische plaatcentrifuge kan worden gebruikt om vaste stoffen (doorgaans onzuiverheden) uit vloeistoffen te verwijderen of om twee vloeistoffasen met een grote centrifugale kracht van elkaar te scheiden. De dichtere vaste stoffen of vloeistoffen die aan deze krachten worden onderworpen, bewegen zich naar buiten in de richting van de draaiende komwand, terwijl de minder dichte vloeistoffen zich naar het midden bewegen. De speciale platen (bekend als schijfstapels) vergroten het bezinkingsoppervlak waardoor het scheidingsproces sneller verloopt. Voor verschillende processen worden verschillende stapelontwerpen, schikkingen en vormen gebruikt, afhankelijk van het aanwezige type voeder. De geconcentreerde dichtere vaste stof of vloeistof kan dan continu handmatig of met tussenpozen worden verwijderd, afhankelijk van het ontwerp van de conische plaatcentrifuge. Deze centrifuge is zeer geschikt voor het klaren van vloeistoffen met een kleine hoeveelheid gesuspendeerde vaste stoffen. De centrifuge werkt volgens het principe van de hellende plaat. Een reeks parallelle platen met een kantelhoek 6 ten opzichte van het horizontale vlak wordt geïnstalleerd om de afstand van de deeltjesbezinking te verkleinen. De reden voor de schuine hoek is dat de neergeslagen vaste stoffen op de platen door de centrifugale kracht naar beneden kunnen glijden, zodat ze zich niet ophopen en het kanaal tussen de aangrenzende platen verstoppen. Dit type centrifuge bestaat in verschillende ontwerpen, zoals met nozzle, handmatige reiniging, zelfreiniging en hermetisch. De specifieke centrifuge is niet beperkend.

Factoren met een invloed op de centrifuge zijn onder andere de schijfhoek, het effect van de g-kracht, de schijfafstand, de toegevoerde vaste stoffen, de hoek van de kegel voor de afvoer, de afvoerfrequentie en de vloeistofafvoer.

Als alternatief kan een centrifuge met vaste kom (bijv. een decanteercentrifuge) worden gebruikt. Dit is een soort centrifuge volgens het sedimentatieprincipe. Een centrifuge wordt gebruikt om een mengsel van twee substanties met verschillende dichtheid te scheiden door de centrifugale kracht als gevolg van de voortdurende rotatie te gebruiken. Hij wordt doorgaans gebruikt voor het scheiden van mengsels van een vaste stof en een vloeistof, twee vloeistoffen en twee vaste stoffen. Een voordeel van centrifuges met vaste kommen voor industrieel gebruik is de eenvoud van de installatie in vergelijking met andere soorten centrifuges. Er zijn drie ontwerptypes van centrifuges met vaste kommen, namelijk conisch, cilindrisch en conisch-cilindrisch. Centrifuges met vaste kommen kunnen een aantal verschillende ontwerpen hebben, die allemaal voor de beschreven methode kunnen worden gebruikt. Er kunnen bijvoorbeeld conische centrifuges met vaste kom, cilindrische centrifuges met vaste kom en conisch- cilindrische centrifuges met vaste kom worden gebruikt. Het centrifugeren kan met een aantal snelheden en verblijftijden worden uitgevoerd. Het centrifugeren kan bijvoorbeeld met een relatieve centrifugale kracht (RCF) van 20000 g, 15000 g, 10000 g of 5000 g worden uitgevoerd. In sommige uitvoeringen kan het centrifugeren met een relatieve centrifugale kracht (RCF) van minder dan 20000 g, 15000 g, 10000 g of 5000 g worden uitgevoerd. In sommige uitvoeringen kan het centrifugeren met een relatieve centrifugale kracht (RCF) van meer dan 20000 g, 15000 g, 10000 g of 5000 g worden uitgevoerd. In sommige uitvoeringen kan het centrifugeren door het werkvolume worden gekarakteriseerd. In sommige uitvoeringen kan het werkvolume 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 300, of 500 | zijn. In sommige uitvoeringen kan het werkvolume minder dan 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 300, of 500 | zijn. In sommige uitvoeringen kan het werkvolume meer dan 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 300, of 500 1 zijn. In sommige uitvoeringen kan het centrifugeren door het toevoerdebiet worden gekarakteriseerd. In sommige uitvoeringen kan het toevoerdebiet 100, 500, 1000, 1500, 2000,

5000, 10000, 20000, 40000, of 100000 l/uur zijn. In sommige uitvoeringen kan het toevoerdebiet meer dan 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000, 20000, 40000, of 100000 Vuur zijn. In sommige uitvoeringen kan het toevoerdebiet minder dan 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000, 20000, 40000, of 100000 l/uur zijn.

Detijd die aan centrifugeren wordt besteed (bijv. verblijftijd), kan ook variëren. De verblijftijd kan bijvoorbeeld 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, of 10 minuten zijn. In sommige uitvoeringen kan de verblijftijd meer dan 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, of 10 minuten zijn. In sommige uitvoeringen kan de verblijftijd minder dan 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, of 10 minuten zijn.

Elk van de bovengenoemde eigenschappen van het supernatans kan door één keer centrifugeren worden verkregen. Ze kunnen ook door meerdere keren te centrifugeren worden geproduceerd.

Gezien het bovenstaande kan stap al) van de methode volgens de uitvinding worden uitgevoerd via microfiltratie zoals hierboven gedefinieerd, ultrafiltratie zoals hierboven gedefinieerd of centrifugatie, of via een combinatie van: ultrafiltratie en centrifugatie, microfiltratie en ultrafiltratie, microfiltratie en centrifugatie, microfiltratie en ultrafiltratie en centrifugatie. Bij voorkeur wordt methodestap al) uitgevoerd door ultrafiltratie zoals hierboven gedefinieerd om de HMO-bevattende stroom te verkrijgen die van de biomassa- afvalstroom 1s gescheiden.

Bij voorkeur is het rendement van de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO in het permeaat/supernatans na de microfiltratie-, ultrafiltratie- of centrifugatiestap, of een combinatie daarvan, uitgevoerd in stap a) groter dan 50 %, groter dan 60 %, groter dan 70 %, groter dan 80 %, groter dan 90 %, groter dan 91 %, groter dan 92 %, groter dan 93 %, groter dan 94 %, groter dan 95 %, groter dan 96 %, groter dan 97 %, groter dan 98 %, of groter dan 99 %.

Voor de microfiltratie- en/of de ultrafiltratie- en/of de centrifugatiestap kan de fermentatiebouillon aan een voorbehandelingsstap worden onderworpen. De voorbehandeling van de fermentatiebouillon kan een aanpassing van de pH en/of een verdunning en/of een warmtebehandeling omvatten. In bepaalde implementaties kunnen de aanpassing van de pH, de verdunning en de warmtebehandeling allemaal worden uitgevoerd. In alternatieve uitvoeringen kunnen de aanpassing van de pH en de verdunning worden uitgevoerd. In alternatieve uitvoeringen kunnen de aanpassing van de pH en de warmtebehandeling worden uitgevoerd. In alternatieve uitvoeringen kunnen de warmtebehandeling en de verdunning worden uitgevoerd. Een combinatie van verschillende voorbehandelingsmethoden kan een verbeterd synergetisch effect opleveren dat bij afzonderlijke voorbehandelingen niet wordt aangetroffen. In bepaalde uitvoeringen kunnen een of meerdere van de bovengenoemde voorbehandelingsstappen plaatsvinden tijdens de verwijdering van biomassa in stap al) door centrifugatie en/of ultrafiltratie en/of microfiltratie. Bijvoorbeeld tussen de stappen in een meerstapscentrifuge of het centrifugeervat kan de fermentatiebouillon tijdens het centrifugeren verwarmen. De voorbehandeling kan de bezinkingssnelheid van de vaste deeltjes (biomassa) in de fermentatiebouillon met een factor van 100 tot 20000 verhogen, waardoor de scheiding van de biomassa door centrifugatie veel efficiënter wordt en dus op industriële schaal kan worden toegepast. Naast de bezinkingssnelheid worden door de voorbehandelingminstens drie andere parameters aanzienlijk verbeterd, namelijk een beter rendement van neutrale of gesialyleerde HMO's in de HMO-bevattende stroom, een lager eiwit- en DNA-gehalte in het supernatans en een aanzienlijke verlaging van het gehalte aan residuen van gesuspendeerde vaste stoffen.

Voorbehandeling van de fermentatiebouillon door aanpassing van de pH, verdunning en/of warmtebehandeling in stap a2) van de methode volgens de uitvinding In stap a2) van de methode volgens de uitvinding wordt de fermentatiebouillon voorbehandeld door aanpassing van de pH, verdunning en/of warmtebehandeling.

De fermentatiebouillon bevat doorgaans, naast de gewenste HMO, de biomassa van de cellen van het gebruikte micro-organisme samen met eiwitten, erwitfragmenten, peptiden, DNA's, RNA's, endotoxinen, biogene aminen, aminozuren, organische zuren, anorganische zouten, niet-gereageerde koolhydraatacceptoren zoals lactose, suikerachtige bijproducten, monosachariden, kleurstoffen enz. Deze onzuiverheden moeten zo volledig mogelijk van de gewenste HMO worden gescheiden.

Instap a2) van de methode volgens de uitvinding wordt de fermentatiebouillon voorbehandeld door aanpassing van de pH, verdunning en/of warmtebehandeling om de effectiviteit te verhogen en/of de volgende zuiveringsstappen te vereenvoudigen.

De voorbehandeling van de fermentatiebouillon omvat een aanpassing van de pH en/of een verdunning en/of een warmtebehandeling. In bepaalde uitvoeringen worden de aanpassing van de pH, de verdunning en de warmtebehandeling allemaal uitgevoerd. In alternatieve uitvoeringen worden de aanpassing van de pH en de verdunning uitgevoerd. In alternatieve uitvoeringen worden de aanpassing van de pH en de warmtebehandeling uitgevoerd. In alternatieve uitvoeringen worden de warmtebehandeling en de verdunning uitgevoerd. Een combinatie van de bovengenoemde voorbehandelingen levert een verbeterd synergetisch effect op dat bij afzonderlijke voorbehandelingen niet wordt aangetroffen. De voorbehandeling van de fermentatiebouillon in stap a2) van de methode volgens de uitvinding leidt tot een verbeterd HMO-rendement in de verdere zuiveringsstappen.

Bovendien kan in de daaropvolgende zuiveringsstappen door toepassing van de voorbehandelingen een lager eiwit- en DNA-gehalte worden bereikt. Verder kunnen biomassa en gesuspendeerde vaste stoffen in de daaropvolgende zuiveringsstappen efficiënter worden verwijderd.

Bij voorkeur wordt de pH-waarde van de fermentatiebouillon ingesteld op een zure pH- waarde, zoals van 3 tot 6, bij voorkeur op een pH-waarde die niet hoger is dan 5, bij voorkeur niet hoger dan 4, en het meest bij voorkeur op een pH-waarde van 3 tot 4.

De pH van de fermentatiebouillon kan op elke geschikte manier worden verlaagd. Zo kan bijvoorbeeld een zuur aan de fermentatiebouillon worden toegevoegd om de pH-waarde van de fermentatiebouillon te verlagen. Dit kan een organisch of een anorganisch zuur zijn.

Zo kan bijvoorbeeld zwavelzuur worden gebruikt om de pH-waarde van de gistingsbouillon te verlagen. Bijvoorbeeld een 20 % zwavelzuur. Er kunnen echter ook andere zuren worden gebruikt en het gebruikte specifieke zuur is niet beperkend. Het zuur kan bijvoorbeeld worden gekozen uit één of meerdere van zwavelzuur, zoutzuur, fosforzuur, mierenzuur, azijnzuur en citroenzuur of een mengsel daarvan.

De instelling van de pH-waarde op een dergelijke zure pH-waarde is bijzonder voordelig omdat dit leidt tot een aanzienlijke vermindering van opgeloste biomoleculen in de fermentatiebouillon, zoals oplosbare eiwitten en DNA's door denaturatie en precipitatie. Deze vermindering van de opgeloste biomoleculen maakt een efficiëntere scheiding van deze verbindingen tijdens de daaropvolgende zuiveringsstappen mogelijk.

Bij voorkeur wordt de fermentatiebouillon verwarmd tot een temperatuur die hoger is dan de omgevingstemperatuur. Bij voorkeur wordt de fermentatiebouillon verwarmd tot een temperatuur tussen 30 en 90 °C, meer bij voorkeur tussen 35 en 85 °C, en meest bij voorkeur tussen 50 en 75 °C. Deze warmtebehandeling vermindert het totale aantal levensvatbare micro-organismen (totaal microbieel aantal) in de fermentatiebouillon aanzienlijk. Bovendien vermindert deze verhittingsstap de hoeveelheid oplosbare eiwitten als gevolg van temperatuurgeïnduceerde denaturatie en precipitatie waardoor de efficiëntie van de verwijdering van resteiwitten in de daaropvolgende zuiveringsstappen (bijv. stap b) en stap c) van de methode volgens de uitvinding) toeneemt.

In bepaalde uitvoeringen wordt de fermentatiebouillon verwarmd tot een temperatuur van 20 tot 120 °C, bij voorkeur van 45 tot 110 °C, meer bij voorkeur van 60 tot 90 °C, meest bij voorkeur van 70 tot 80 °C. De warmtebehandeling kan met elke bekende methode worden uitgevoerd, zoals het gebruik van een oven, een brander, een waterbad, een oliebad, een verwarmingsmantel of andere verwarmingssystemen. Bij voorkeur wordt de warmtebehandeling uitgevoerd met behulp van een industriële verwarmingen waarbij één of een combinatie van de volgende warmteoverdrachtsmethoden wordt gebruikt: geleiding, convectie, straling. Dergelijke verwarmingen kunnen bijv. circulatieverwarmingen, warmtelampen, dompelaars, verwarmingen met stoom of verwarmingen met een verwarmingsmantel zijn. In sommige uitvoeringen kan de fermentatiebouillon gedurende een bepaalde tijd op de warmtebehandelingstemperatuur worden gehouden. De fermentatiebouillon kan bijvoorbeeld gedurende 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 of 30 minuten op een van de hierboven genoemde verwarmingstemperaturen worden gehouden. In sommige uitvoeringen kan de suspensie langer dan 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 of 30 minuten op een van de hierboven genoemde verwarmingstemperaturen worden gehouden. In sommige uitvoeringen kan de suspensie minder dan 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 of 30 minuten op een van de hierboven genoemde verwarmingstemperaturen worden gehouden. In bepaalde uitvoeringen wordt de fermentatiebouillon voorbehandeld door de fermentatiebouillon rechtstreeks tot een van de hierboven genoemde temperaturen te verwarmen. In andere uitvoeringen wordt de fermentatiebouillon stapsgewijs verwarmd, waarbij die tot een eerste temperatuur wordt verwarmd, optioneel gedurende een bepaalde tijd op die eerste temperatuur wordt gehouden, en vervolgens tot een tweede temperatuur wordt verwarmd, optioneel gedurende een bepaalde tijd op die tweede temperatuur wordt gehouden.

Bij voorkeur wordt in stap al) van de methode volgens de uitvinding de pH-waarde verlaagd en de fermentatiebouillon verwarmd, waardoor met name de oplosbaarheid van de eiwitten wordt verminderd en de daaropvolgende zuiveringsstappen worden vereenvoudigd. Bij voorkeur wordt de fermentatiebouillon zodanig verdund dat het gewicht van de verdunde suspensie tussen 1,1 en 10 maal het oorspronkelijke gewicht van de fermentatiebouillon ligt, bij voorkeur tussen 1,5 en 10, meer bij voorkeur tussen 2 en 4, en meest bij voorkeur tussen 2,5 en 3,5. De verdunning gebeurt bij voorkeur met water. Het water kan kraanwater, gedeïoniseerd water of gedestilleerd water zijn.

In bepaalde uitvoeringen heeft de fermentatiebouillon een verdunningsverhouding van 2 tot 10, bij voorkeur van 3 tot 8, meer bij voorkeur van 4 tot 6. De verdunningsverhouding is de verhouding tussen het uiteindelijke volume van de fermentatiebouillon (d.w.z. na de verdunning) en het oorspronkelijke volume van de fermentatiebouillon (d.w.z. voor de verdunning). De fermentatiebouillon kan bijvoorbeeld worden verdund met een factor 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, of 10,0 ten opzichte van het oorspronkelijke volume van de fermentatiebouillon. Een voordeel van de verdunning van de fermentatiebouillon is dat een hoger rendement van HMO na de daaropvolgende zuiveringsstappen kan worden bereikt (bijv. na stap b) en/of stap c) van de methode volgens de uitvinding).

Bij voorkeur wordt de fermentatiebouillon door een aanpassing van de pH en een warmtebehandeling voorbehandeld, waarbij de pH van de fermentatiebouillon bij voorkeur wordt aangepast tot een pH-waarde van 3 tot 4 en bij voorkeur wordt verwarmd tot een temperatuur van 50 tot 75 °C.

De behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom van stap al) of de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) met actieve koolstof om een HMO- bevattende stroom te verkrijgen (stap b) In de methode volgens de uitvinding wordt in stap b) een behandeling met actieve koolstof uitgevoerd.

De behandeling met actieve koolstof is een ontkleuringsstap (verwijdering van de kleurende bestanddelen). Bij voorkeur kan actieve koolstof, zoals Norit CA1 actieve koolstof, worden gebruikt.

De behandeling met actieve koolstof dient om de kleurstoffen te verwijderen en kan de hoeveelheden in water oplosbare verontreinigingen, zoals zouten, verminderen. Bovendien dient de behandeling met actieve koolstof om eiwitten, DNA's, RNA's of endotoxines te verwijderen die in de HMO-bevattende stroom aanwezig kunnen zijn.

De behandeling met actieve koolstof in stap b1) van de methode volgens de uitvinding leidt dus tot een vermindering van kleurstoffen en/of zouten en/of eiwitten en/of DNA's en/of RNA's en/of endotoxines in de HMO-bevattende stroom. Na de scheiding van deze bestanddelen van de gewenste HMO in stap b) wordt een HMO-bevattende stroom verkregen die van de bovengenoemde onzuiverheden is gescheiden.

Neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden hebben de neiging om aan het oppervlak van koolstofdeeltjes uit de waterige oplossing te worden gebonden. Ook kleurstoffen kunnen aan de koolstof worden geadsorbeerd. Terwijl de neutrale of gesialyleerde HMO's en de kleurgevende stoffen worden geadsorbeerd, kunnen in water oplosbare stoffen die niet of slechts zwak aan de koolstof zijn gebonden, met water worden geëlueerd. Door het eluent te veranderen van water in waterig ethanol of andere in water oplosbare organische oplosmiddelen (bijv. methanol of isopropanol) kunnen de geadsorbeerde neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden eenvoudig worden geëlueerd en in een afzonderlijke fractie worden verzameld. Daarbij blijven de geadsorbeerde kleurgevende stoffen aan de koolstof geadsorbeerd, zodat tegelijkertijd ontkleuring en gedeeltelijke ontzilting kunnen worden bereikt. Door de aanwezigheid van een organisch oplosmiddel (ethanol) in het elutieoplosmiddel is de ontkleuringsefficiëntie echter lager dan wanneer de elutie met zuiver water wordt uitgevoerd.

In een aspect van stap b) wordt de neutrale of gesialyleerde HMO dus geadsorbeerd door de actieve koolstof en weer gedesorbeerd door een waterig organisch oplosmiddel zoals bijvoorbeeld ethanol, methanol, isopropanol of een mengsel daarvan. Om ervoor te zorgen dat de actieve koolstof een aanzienlijke hoeveelheid (d.w.z. 80 % of meer) neutrale of gesialyleerde HMO uit de in de vorige stap verkregen gescheiden HMO-bevattende stroom adsorbeert, bedraagt de hoeveelheid actieve koolstof ongeveer 250-300 massaprocent of meer in verhouding tot de neutrale of gesialyleerde HMO die in de voorbehandelde bouillon (stap a2)) of in de gescheiden HMO-bevattende stroom (stap al)) aanwezig is. Dit aspect verdient de voorkeur om de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) te ontkleuren.

Onder bepaalde omstandigheden worden de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden niet of althans niet sterk aan de koolstofdeeltjes geadsorbeerd en geeft de elutie met water een waterige oplossing van de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden zonder een aanzienlijk verlies van hun hoeveelheden, terwijl de kleurstoffen geadsorbeerd blijven. In dit geval is het niet nodig om een organisch oplosmiddel zoals ethanol voor de elutie te gebruiken. Het is slechts een kwestie van routine om de omstandigheden te bepalen waaronder de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden aan de koolstof uit zijn waterige oplossing worden gebonden.

In een ander aspect van stap b) wordt de neutrale of gesialyleerde HMO dus niet of althans niet aanzienlijk door de actieve koolstof geadsorbeerd. Onder ”niet aanzienlijk geadsorbeerd” wordt verstaan dat minder dan 10 %, bij voorkeur minder dan 5 %, en meer bij voorkeur minder dan 1 % van de neutrale of gesialyleerde HMO door de actieve koolstof wordt geadsorbeerd. De hoeveelheid actieve koolstof die in dit aspect wordt gebruikt is <100 % in gewicht ten opzichte van de neutrale of gesialyleerde HMO die in de HMO-bevattende stroom aanwezig is, bij voorkeur <10 %. Hierdoor kan het grootste deel van de neutrale of gesialyleerde HMO passeren, terwijl residuele biomoleculen, gekleurde verbindingen en andere hydrofobe moleculen door de actieve koolstof worden tegengehouden.

In een uitvoering bedraagt de hoeveelheid actieve koolstof ongeveer 2-6 massaprocent.

Dit is economisch omdat alle hierboven beschreven voordelen eenvoudig met een zeer kleine hoeveelheid koolstof kunnen worden bereikt.

In een andere uitvoering wordt de actieve koolstof toegevoegd in een hoeveelheid tussen 0,25 en 3 massaprocent, bij voorkeur tussen 0,5 en 2,5 massaprocent, en meer bij voorkeur tussen 0,75 en 2,2 massaprocent, en nog meer bij voorkeur tussen 1,0 en 2,0 massaprocent, waarbij de percentages gebaseerd zijn op het totale gewicht van de HMO-bevattende stroom die aan de behandeling met actieve koolstof in stap b) wordt onderworpen.

Deze kleine hoeveelheid actieve koolstof maakt een aanzienlijke vermindering van het verbruik van actieve koolstof en een aanzienlijke vermindering van productverliezen (neutrale of gesialyleerde HMO) mogelijk.

In elk van de aspecten van stap b) hierboven kan de behandeling met actieve koolstof worden uitgevoerd door koolstofpoeder al roerend aan de HMO-bevattende stroom toe te voegen en de koolstof te filteren.

In het aspect van adsorptie/desorptie wordt de gefiltreerde koolstof opnieuw gesuspendeerd in waterige ethanol, methanol, isopropanol, of een mengsel daarvan, door te roeren en de koolstof door filtratie te scheiden.

Bij een zuivering op grotere schaal wordt de gescheiden HMO-bevattende stroom volgens stap al) of de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) bij voorkeur geladen in een kolom die is gevuld met actieve koolstof, die een gegranuleerde koolstof kan zijn of eventueel kan zijn gemengd met inerte filterhulpstof, waarna de kolom met het vereiste eluent wordt gespoeld.

De fracties die de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide bevatten, worden verzameld.

De resterende organische oplosmiddelen kunnen indien nodig uit deze fracties worden verwijderd, bijv. door verdamping, zodat een waterige oplossing van de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden (HMO-bevattende stroom) wordt verkregen.

In elk van de aspecten van stap b) hierboven is de gebruikte actieve koolstof gegranuleerd.

Dit zorgt voor een gunstige stroomsnelheid zonder hoge druk.

In een uitvoering wordt de behandeling met actieve koolstof, bij voorkeur bestaande uit een chromatografie met actieve koolstof, bij een verhoogde temperatuur uitgevoerd.

Bij een verhoogde temperatuur vindt de binding van kleurstoffen, resterwitten enz. aan de koolstofdeeltjes in een kortere contacttijd plaats, zodat de stroomsnelheid eenvoudig kan worden verhoogd.

Bovendien zorgt de behandeling met actieve koolstof bij een verhoogde temperatuur voor een aanzienlijke vermindering het totale aantal levensvatbare micro-

organismen (totaal microbieel aantal) in de HMO-bevattende stroom.

De verhoogde temperatuur mag minstens 30-35 °C bedragen, zoals minstens 40 °C, minstens 50 °C, circa 40-50 °C of circa 60 °C.

In een uitvoering wordt de actieve koolstof toegevoegd als een poeder met een deeltjesgrootteverdeling met een diameter d50 tussen 2 um en 25 um, bij voorkeur tussen 3 um en 20 um, en meer bij voorkeur tussen 3 um en 7 um, en nog meer bij voorkeur tussen 5 um en 7 um.

De d50-waarde wordt met standaardprocedures bepaald.

In een uitvoering wordt de pH van de gescheiden HMO-bevattende stroom volgens stap al) of de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) aangepast voordat de behandeling met actieve koolstof wordt uitgevoerd om de vermindering van kleurstoffen en/of eiwitten tijdens stap b) van de methode volgens de uitvinding te verbeteren.

Bij voorkeur wordt de pH aangepast tot 5,5, bij voorkeur tot 5,0 en nog meer bij voorkeur tot 4,5 door een geschikt zuur toe te voegen.

In een uitvoering wordt in stap b) een hoeveelheid actieve koolstof gebruikt die in staat is om minstens 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 92 %, 95 % of meer van de kleurstoffen en/of polysachariden en/of eiwitten en/of nucleïnezuren zoals DNA of RNA, die in de gescheiden HMO-bevattende stroom volgens stap al) of de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) aanwezig zijn, te binden.

De gezuiverde oplossing verkregen na stap b) van de methode volgens de uitvinding bevat de neutrale of gesialyleerde HMO met een zuiverheid van >50 %, bij voorkeur >60 %, meer bij voorkeur >70 %. In een uitvoering is het rendement van de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO na de behandeling met actieve koolstof hoger dan 50 %, hoger dan 60 %, hoger dan 70 %, hoger dan 80 %, hoger dan 90 %, hoger dan 91 %, hoger dan 92 %, hoger dan 93 %, hoger dan 94 %, hoger dan 95 %, hoger dan 96 %, hoger dan 97 %, hoger dan 98 % of hoger dan 99 %. In elk van de aspecten van stap b) hierboven 1s de gezuiverde oplossing (HMO-bevattende stroom) verkregen na stap b) van de methode volgens de uitvinding vrij van eiwitten en/of recombinant genetisch materiaal.

Verdere zuivering van de HMO-bevattende stroom in stap c) door nanofiltratie Instap c) van de methode volgens de uitvinding wordt de HMO-bevattende stroom verder gezuiverd door nanofiltratie.

Nanofiltratie (NF) kan worden gebruikt om moleculen met een laag molecuulgewicht die kleiner zijn dan de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO's te verwijderen, zoals mono- en disachariden, korte peptiden, kleine organische zuren, water en zouten.

De productstroom, d.w.z. de neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stoom, is het NF- retentaat.

Het nanofiltratiemembraan heeft dus een MWCO of een poriegrootte die de retentie van de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide garandeert, d.w.z. dat de MWCO van het nanofiltratiemembraan overeenkomstig wordt aangepast.

Doorgaans bedraagt de poriegrootte van het nanofiltratiemembraan 0,5 nm tot 2 nm en/of 150 dalton (Da) molecuulgewicht cut-off (MWCO) tot 3000 Da MWCO.

In een uitvoering liggen de membranen in het bereik van 150-300 Da MWCO, die worden gedefinieerd als ”dichte” NF-membranen.

Bij voorkeur zijn de membranen groter dan 300 Da MWCO en bij voorkeur niet groter dan

3000 Da MWCO.

In deze uitvoering worden de membranen beschouwd als ”losse” NF- membranen.

In een andere voorkeursuitvoering heeft het ”losse” nanofiltratiemembraan een molecuulgewicht cut-off (MWCO) van 500-3000 Da en is de actieve (top)laag van het membraan bij voorkeur samengesteld uit polyamide, bij voorkeur polyamide op basis van piperazine.

Daarbij wordt de retentie van trioligosachariden of hoger gegarandeerd en kan minstens een deel van de disachariden het membraan passeren.

In deze uitvoering moet het toegepaste nanofiltrattemembraan dicht zijn voor trioligosachariden of hoger, zodat die efficiënt worden tegengehouden.

Tegelijkertijd moet het membraan relatief los zijn voor MgSO4, zodat de afstoting ongeveer 50-90 % bedraagt, zodat disachariden het membraan kunnen passeren.

Op deze manier is het mogelijk om bijv. lactose, die een precursor is bij het maken van moedermelkoligosachariden bijv. door fermentatie, af te scheiden van het neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharidenproduct met een goede efficiëntie, en bovendien gaat een aanzienlijk deel van de divalente ionen ook naar het permeaat.

In sommige uitvoeringen is de MgSO4-afstotingsfactor 60-90 %, 70-90 %, 50-80 %, 50-70 %, 60-70 % of

70-80 %. Bij voorkeur bedraagt de MgSO4-afstotingsfactor op dit membraan 80-90 %. Bij voorkeur heeft het membraan een afstotingsfactor voor NaCl die lager is dan die voor MgSO4. In een uitvoering is de afstotingsfactor voor NaCl niet meer dan 50 %. In een andere uitvoering is de afstotingsfactor voor NaCl niet hoger dan 40 %. In een andere uitvoering is de afstotingsfactor voor NaCl niet hoger dan 30 %. In deze laatste uitvoering kan ook een aanzienlijke vermindering van alle monovalente zouten in het retentaat worden bereikt.

In deze uitvoering is het membraan een dunnefilmcomposietmembraan (TFC). Een voorbeeld van een geschikt op piperazine gebaseerd polyamide TFC-membraan is TriSep” UA60. Andere voorbeelden van geschikte NF-membranen zijn Synder NFG (600-800 Da), Synder NDX (500-700 Da) en TriSep® XN-45 (500 Da).

Bij voorkeur is het rendement van de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO in het retentaat na een nanofiltratiestap hoger dan 50 %, hoger dan 60 %, hoger dan 70 %, hoger dan 80 %, hoger dan 90 %, hoger dan 91 %, hoger dan 92 %, hoger dan 93 %, hoger dan 94 %, hoger dan 95 %, hoger dan 96 %, hoger dan 97 %, hoger dan 98 % of hoger dan 99 %.

Bij voorkeur omvat de nanofiltratiestap ook een diafiltratiestap, dat wil zeggen dat de nanofiltratie in diafiltratiemodus wordt uitgevoerd. Bij voorkeur volgt de diafiltratie op de bovengenoemde (conventioneel uitgevoerde) nanofiltratiestap.

Diafiltratie is een proces waarbij tijdens het membraanfiltratieproces gezuiverd water aan een oplossing wordt toegevoegd om de membraandoorlaatbare bestanddelen efficiënter te verwijderen. Diafiltratie kan dus worden gebruikt om bestanddelen te scheiden op basis van hun eigenschappen, met name molecuulgrootte, lading of polariteit, door geschikte membranen te gebruiken, waarbij één of meerde soorten efficiënt worden tegengehouden en andere soorten membraandoorlaatbaar zijn. Bij voorkeur worden de diafiltratie en de nanofiltratie in een stap (nanofiltratie/diafiltratie of NF/DF genoemd) gecombineerd, waarbij de diafiltratie wordt uitgevoerd met een nanofiltrattemembraan dat doeltreffend is voor de scheiding van verbindingen en/of zouten met een laag molecuulgewicht uit de neutrale of gesialyleerde HMO's. Diafiltratie met een ”los” NF-membraan, zoals hierboven gedefinieerd, is bijzonder efficiënt voor zowel de verwijdering van mono- en divalente zouten als de verwijdering van disachariden uit neutrale of gesialyleerde HMO's. Bij voorkeur wordt de DF-stap of de NF/DF-stap zodanig uitgevoerd dat de pH lager is dan 5,0, bij voorkeur lager dan 4,5, bij voorkeur lager dan 4,0, maar bij voorkeur niet lager dan 3,0. Onder deze omstandigheden worden zouten bestaande uit monovalente kationen zoals natriumzouten (d.w.z. natriumion samen met de co-anionen) effectief verwijderd, zodat een zoutarme of vrijwel zoutloze gezuiverde oplossing ontstaat die een neutrale of gesialyleerde HMO in het retentaat bevat. In een uitvoering wordt een tweede nanofiltratiestap uitgevoerd in de methode volgens de uitvinding, zodat deze stap deel uitmaakt van stap c). In deze tweede nanofiltratiestap is het nanofiltratiemembraan een ”los” NF-membraan of een ”dicht” NF-membraan. De tweede optionele nanofiltratiestap wordt uitgevoerd na de eerste nanofiltratiestap (stap c), maar wordt bij voorkeur uitgevoerd voor stap d) van de methode volgens de uitvinding. Evenzo kan een tweede diafiltratie in stap c) volgens de uitvinding worden uitgevoerd, zodat deze tweede optionele diafiltratiestap ook met de tweede nanofiltratiestap kan worden gecombineerd. Deze tweede NF/DF-stap, wanneer een ”los” NF-membraan wordt toegepast zoals hierboven beschreven, wordt zodanig uitgevoerd dat de pH lager 1s dan 5,0, bij voorkeur lager dan 4,5, bij voorkeur lager dan 4,0, maar bij voorkeur niet lager dan 3,0. In een uitvoering bevat de gezuiverde oplossing verkregen na stap c) van de methode volgens de uitvinding de neutrale of gesialyleerde HMO met een zuiverheid van >80 %, bij voorkeur 285 %, meer bij voorkeur >90 %. In een uitvoering is de gezuiverde oplossing (HMO-bevattende stroom) verkregen na stap c) van de methode volgens de uitvinding vrij van eiwitten en/of recombinant genetisch materiaal. Concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom in stap d) van de methode volgens deuitvinding Een concentratiestap wordt gebruikt om aanzienlijke hoeveelheden vloeistof, meestal water, op een economische manier uit de neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stroom te verwijderen door middel van bijv. verdamping, nanofiltratie of omgekeerde-osmosefiltratie. Verdampingsprocessen kunnen bijvoorbeeld dalende filmverdamping, klimmende filmverdamping en roterende verdamping omvatten. De verdamping kan ook onder vacuüm worden uitgevoerd. De concentratie inkomende vaste stoffen in het proces is bij voorkeur ongeveer 5 tot 30 massaprocent. De concentratie uitgaande vaste stoffen uit een dergelijk proces is doorgaans meer dan 30 massaprocent, bij voorkeur meer dan 50 massaprocent. Meer bij voorkeur bedraagt de concentratie uitgaande stoffen bij het ontwateringsproces 60 tot 80 massaprocent. Het gedeelte vaste stoffen van het teruggewonnen materiaal is bij voorkeur groter dan 80 massaprocent neutrale of gesialyleerde HMO.

In een uitvoering wordt de gezuiverde neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stroom geconcentreerd tot een concentratie van > 100 g/l neutrale of gesialyleerde HMO, bij voorkeur > 200 g/l, en nog meer bij voorkeur > 300 g/l.

Wanneer de gezuiverde neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stroom wordt geconcentreerd door verdamping, wordt de verdamping bij voorkeur uitgevoerd bij een temperatuur van ongeveer 20 tot ongeveer 80 °C. In sommige uitvoeringen wordt de verdamping uitgevoerd bij een temperatuur van 25 tot 75 °C. In sommige uitvoeringen wordt de verdamping uitgevoerd bij een temperatuur van 30 tot 70 °C. In sommige uitvoeringen wordt de verdamping uitgevoerd bij een temperatuur van 30 tot 65 °C. Bij voorkeur wordt de verdamping onder vacuüm uitgevoerd.

Wanneer de gezuiverde neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stroom wordt geconcentreerd door membraanfiltratie, is elk membraan, doorgaans een nanofiltrattemembraan, geschikt dat de neutrale of gesialyleerde HMO voldoende afstoot. Een concentratie door membraanfiltratie levert doorgaans een HMO-oplossing van ongeveer 30- 35 massaprocent op. Deze concentratie kan geschikt zijn voor de uitvoering van de daaropvolgende drogingsstollingsstap, bijv. vriesdrogen. Voor andere drogingsmethoden kunnen echter meer geconcentreerde oplossingen nodig zijn, bijv. sproeidroging of kristallisatie. In dit geval gaat de voorkeur uit naar een concentratie door verdamping, bij voorkeur onder vacuüm. Bij wijze van alternatief wordt de in de vorige stap verkregen neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stroom geconcentreerd tot ongeveer 30-35 massaprocent met behulp van een nanofiltratiemembraan en wordt de oplossing verder geconcentreerd door verdamping.

In een uitvoering van de concentratie door membraanfiltratie is het gekozen membraan een ”dicht” NF met 150-300 Da MWCO. In een andere uitvoering van de concentratie door membraanfiltratie is het gekozen membraan een nanofiltratiemembraan met een molecuulgewicht cut-off (MWCO) van 500-3500 Da en een actieve (top)laag van polyamide (”los” NF-membraan) en wordt de concentratiestap zodanig uitgevoerd dat de pH lager is dan 5,0, bij voorkeur lager dan 4,5, bij voorkeur lager dan 4,0, maar bij voorkeur niet lager dan 3,0. In deze laatste uitvoering kan ook een aanzienlijke vermindering van alle monovalente zouten in het retentaat worden bereikt. In deze uitvoering is het membraan bij voorkeur een dunnefilmcomposietmembraan (TFC), een polyamidemembraan op basis van piperazin, met een MgSO4-afstoting van ongeveer 50-90 %, en een NaCl-afstoting van niet meer dan 50 %. Een voorbeeld van een dergelijk membraan is TriSep” UA60. Onder deze omstandigheden worden ook de resterende zouten effectief verwijderd, zodat een zoutarm of vrijwel zoutloos gezuiverd neutrale of gesialyleerde HMO- concentraat ontstaat. In deze uitvoering wordt na voltooiing van de concentratiestap de pH van het neutrale of gesialyleerde HMO-concentraat bij voorkeur ingesteld tussen 4-6 voordat de volgende stap wordt uitgevoerd (bijv. verdamping, drogingsstolling, steriele filtratie). Droging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen in stap e) Bij voorkeur wordt de neutrale of gesialyleerde HMO na de scheidings-/zuiverings- /concentratiestappen volgens de stappen a) tot en met d) en de hieronder aangegeven optionele methodestappen in vaste vorm via een drogingsstap (stap e)) bezorgd. Bij voorkeur bestaat de drogingsstap e) uit de sproeidroging van de neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur uit de sproeidroging van de neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stroom.

Bij voorkeur leidt de sproeidroging tot een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO met een amorfe structuur, d.w.z. dat een amorf poeder wordt verkregen.

In een uitvoering wordt de sproeidroging uitgevoerd bij een concentratie van de neutrale of gesialyleerde HMO van 20-60 % (w/v), bij voorkeur 30-50 % (w/v), meer bij voorkeur 35-45 % (w/v), en een inlaattemperatuur van 110-150 °C, bij voorkeur 120-140 °C, meer bij voorkeur 125-135 °C en/of een uitlaattemperatuur van 60-80 °C, bij voorkeur 65-70 °C.

In sommige uitvoeringen heeft de neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stroom die in de sproeidroger wordt gevoerd een Brix-waarde van ongeveer 8 tot ongeveer 75 % Brix.

In sommige uitvoeringen ligt de Brix-waarde tussen ongeveer 30 en ongeveer 65 % Brix.

In sommige uitvoeringen ligt de Brix-waarde tussen ongeveer 50 en ongeveer 60 % Brix.

In sommige uitvoeringen heeft de toevoer in de sproeidroger een temperatuur van ongeveer 2 tot ongeveer 70 °C vlak voordat hij in druppeltjes in de sproeidroger wordt verdeeld.

In sommige uitvoeringen heeft de toevoer in de sproeidroger een temperatuur van ongeveer 30 tot ongeveer 60 °C vlak voordat hij in druppeltjes in de sproeidroger wordt verdeeld.

In sommige uitvoeringen heeft de toevoer in de sproeidroger een temperatuur van ongeveer 2 tot ongeveer 30 °C vlak voordat hij in druppeltjes in de sproeidroger wordt verdeeld.

In sommige uitvoeringen wordt bij de sproeidroging lucht met een inlaattemperatuur van 120 tot 280 °C gebruikt.

In sommige uitvoeringen is de luchtinlaattemperatuur van 120 tot 210 °C.

In sommige uitvoeringen is de luchtinlaattemperatuur van ongeveer 130 tot ongeveer 190 °C.

In sommige uitvoeringen is de luchtinlaattemperatuur van ongeveer 135 tot ongeveer 160 °C.

In sommige uitvoeringen wordt bij de sproeidroging lucht met een luchtuitlaattemperatuur van ongeveer 80 tot ongeveer 110 °C gebruikt.

In sommige uitvoeringen is de luchtuitlaattemperatuur van ongeveer 100 tot ongeveer 110 °C.

In sommige uitvoeringen wordt de sproeidroging bij een temperatuur van ongeveer 20 tot ongeveer 90 °C uitgevoerd.

In sommige uitvoeringen is de sproeidroger een co-current sproeidroger.

In sommige uitvoeringen is de sproeidroger aan een extern vloeistofbed vastgemaakt.

In sommige uitvoeringen bestaat de sproeidroger uit een roterende schijf, een hogedrukspuitstuk of een spuitstuk met twee vloeistoffen.

In sommige uitvoeringen bestaat de sproeidroger uit een verstuiverwiel.

In sommige uitvoeringen is de sproeidroging de laatste zuiveringsstap voor de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO.

Een andere mogelijkheid is dat de drogingsstollingsstap uit een indirecte drogingsmethode bestaat.

In deze specificatie zijn indirecte drogers apparaten die geen gebruik maken van direct contact van het te drogen materiaal met een verwarmd procesgas voor de droging, maar in plaats daarvan rekenen op de warmteoverdracht via de wanden van de droger, bijv. via de wanden van de kuip in het geval van een trommeldroger, of afwisselend via de wanden van holle schoepen van een schoependroger, wanneer deze door de vaste stoffen draaien terwijl het warmteoverdrachtsmedium in de holle binnenkant van de schoepen circuleert. Andere voorbeelden van indirecte drogers zijn contactdrogers en vacuümtrommeldrogers. Een andere mogelijkheid is dat de drogingsstollingsstap uit een vriesdroging bestaat. Een andere mogelijkheid is dat de drogingsstollingsstap uit een kristallisatie bestaat (op voorwaarde dat de HMO in kristallijne vorm kan worden verkregen). Optionele stappen Bij voorkeur omvat de methode volgens de uitvinding verder een zuivering van de HMO- bevattende stroom met een zuur kationenwisselaarshars, bij voorkeur een sterk zuur kationenwisselaarshars. Bij voorkeur is het kattonenwisselaarshars een polystyreen- divinylbenzeen-kationenwisselaarshars, meer bij voorkeur in geprotoneerde vorm.

In een dergelijke optionele behandeling met kationenwisselaarshars kunnen positief geladen materialen verder efficiënt uit de HMO-bevattende stroom worden verwijderd, bijvoorbeeld na de behandeling met actieve koolstof of de NF-stap, aangezien zij zich aan het hars binden, terwijl zure en neutrale HMO's niet door het zure kationenwisselaarshars zullen worden vastgehouden. Daarbij kunnen ook de hoeveelheden zouten en/of kleurstoffen en/of eiwitten verder worden verminderd.

In een uitvoering bevat de stationaire fase (hars) sulfonaatgroepen. De bindingscapaciteit van de gebruikte harsen ligt doorgaans tussen 1,2 en 2,2 eq/l.

Wanneer een kationisch ionenwisselaarshars wordt gebruikt, kan de mate van verknoping worden gekozen afhankelijk van de bedrijfsomstandigheden van de ionenwisselaarskolom. Een sterk verknoopt hars biedt het voordeel van duurzaamheid en een hoge mate van mechanische integriteit, maar heeft een verminderde porositeit en een afname van de massa- overdracht. Een zwak verknoopt hars is kwetsbaarder en heeft de neiging om op te zwellen door absorptie van de mobiele fase. De deeltjesgrootte van het ionenwisselaarshars wordt zodanig gekozen dat een efficiënte stroming van het eluent mogelijk is, terwijl de geladen materialen toch effectief worden verwijderd. Een geschikt debiet kan ook worden verkregen door een negatieve druk op het eluerende uiteinde van de kolom of een positieve druk op het ladende uiteinde van de kolom uit te oefenen en het eluent op te vangen. Een combinatie van positieve en negatieve druk kan ook worden gebruikt. De behandeling met kationisch ionenwisselaarshars kan op een conventionele manier worden uitgevoerd, bijv. per batch of continu.

Niet-limitatieve voorbeelden van een geschikt zuur kationenwisselaarshars zijn Amberlite IR100, Amberlite IR120, Amberlite FPC22, Dowex 50WX, Finex CS16GC, Finex CS13GC, Finex CS12GC, Finex CS11GC, Lewatit S, Diaion SK, Diaion UBK, Amberjet 1000 en Amberjet 1200. Bij voorkeur wordt de bovengenoemde optionele behandeling met kationenuitwisselaarshars uitgevoerd na stap b) of stap c) van de methode volgens de uitvinding. In een andere voorkeursuitvoering omvat de methode volgens de uitvinding, inclusief de voorkeurs- en meer voorkeursrealisaties ervan, verder een stap waarin de gezuiverde neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende oplossing, bij voorkeur na de concentratie volgens stap d) en voor de drogingsstap volgens stap e), steriel wordt gefilterd en/of aan endotoxineverwijdering wordt onderworpen, bij voorkeur door filtratie van de gezuiverde oplossing door een filter met 3 kDa of met behulp van een membraan met een poriegrootte van minder dan 0,5 um, minder dan 0,4 um, minder dan 0,3 um, of minder dan 0,2 um. Er moet echter worden opgemerkt dat de steriele filtratiestap niet bijdraagt aan de oplossing van het technische probleem, namelijk het verkrijgen van gezuiverde HMO of HMO's die geschikt zijn voor toediening aan de mens. Volgens een uitvoering maken zowel de stap van de behandeling met kationenwisselaarshars als de stap van de steriele filtratie, die hierboven zijn beschreven, deel uit van de methode van de uitvinding.

Bijzondere uitvoeringen van de uitvinding Bij voorkeur omvat de methode volgens deze uitvinding geen ionenwisselaarsbehandelingsstap, d.w.z. dat de methode geen behandeling met een kationisch en/of anionisch ionenwisselaarshars omvat. Bij voorkeur omvat de methode volgens deze uitvinding geen behandelingsstap met een basisch anionenwisselaarshars. Bij voorkeur omvat de methode volgens deze uitvinding geen elektrodialysestap. Bij voorkeur omvat de methode volgens deze uitvinding geen elektrodialysestap en geen behandelingsstap met een ionenwisselaarshars. Bij voorkeur omvat de methode volgens deze uitvinding geen elektrodialysestap en geen behandelingsstap met een basisch anionenwisselaarshars. In een voorkeursuitvoering waarin de methode volgens deze uitvinding stap a2) omvat, omvat die geen ultrafiltratie- en/of centrifugatiestap. In een voorkeursuitvoering waarin de methode volgens deze uitvinding stap a2) omvat, omvat die geen ultrafiltratie- en/of centrifugatiestap en geen elektrodialysestap.

In een voorkeursuitvoering waarin de methode volgens deze uitvinding stap a2) omvat, omvat die geen ultrafiltratie- en/of centrifugatiestap en geen behandelingsstap met een ionenwisselaarshars. In een voorkeursuitvoering waarin de methode volgens deze uitvinding stap a2) omvat, omvat die geen ultrafiltratie- en/of centrifugatiestap en geen behandelingsstap met een basisch anionenwisselaarshars. In een voorkeursuitvoering waarin de methode volgens deze uitvinding stap a2) omvat, omvat die geen ultrafiltratie- en/of centrifugatiestap en geen behandelingsstap met een ionenwisselaarshars en elektrodialysestap.

In een voorkeursuitvoering waarin de methode volgens deze uitvinding stap a2) omvat, omvat die geen ultrafiltratie- en/of centrifugatiestap en geen behandelingsstap met een basisch anionenwisselaarshars en elektrodialysestap.

Bij voorkeur bestaat de methode volgens de uitvinding uit de volgende stappen, bij voorkeur in de volgende volgorde: - de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door pH-aanpassing, verdunning en/of warmtebehandeling;, - de behandeling van de voorbehandelde fermentatiebouillon met actieve koolstof om een HMO-bevattende stroom te verkrijgen, waarbij de HMO door de actieve koolstof wordt geadsorbeerd en weer wordt gedesorbeerd door een waterig organisch oplosmiddel als eluent; - de zuivering van de hierboven verkregen HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltratiemembraan bij voorkeur in het bereik van 500-3000 Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en - de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.

Nog meer bij voorkeur bestaat de methode volgens de uitvinding uit een opeenvolging van de volgende stappen, bij voorkeur in de volgende volgorde: - de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door pH-aanpassing, verdunning en/of warmtebehandeling;, - de behandeling van de voorbehandelde fermentatiebouillon met actieve koolstof om een HMO-bevattende stroom te verkrijgen, waarbij de HMO door de actieve koolstof wordt geadsorbeerd en weer wordt gedesorbeerd door een waterig organisch oplosmiddel als eluent; - de zuivering van de hierboven verkregen HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltratiemembraan bij voorkeur in het bereik van 500-3000 Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en - de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen; of de methode bestaat uit de volgende stappen, bij voorkeur in de volgende volgorde: - de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door pH-aanpassing, verdunning en/of warmtebehandeling;, - de behandeling van de voorbehandelde fermentatiebouillon met actieve koolstof om een HMO-bevattende stroom te verkrijgen, waarbij de HMO door de actieve koolstof wordt geadsorbeerd en weer wordt gedesorbeerd door een waterig organisch oplosmiddel als eluent; - de zuivering van de hierboven verkregen HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltrattemembraan bij voorkeur in het bereik van 500-3000 Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en - de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.

In een andere voorkeursuitvoering bestaat de methode volgens de uitvinding uit de volgende stappen, bij voorkeur in de volgende volgorde: - de scheiding van de fermentatiebouillon door ultrafiltratie om een gescheiden HMO- bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen; - de behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom met een behandeling van actieve koolstof; - de zuivering van de HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltratiemembraan bij voorkeur in het bereik van 500-3000 Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en

- de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.

Nog meer bij voorkeur bestaat de methode volgens de uitvinding uit een opeenvolging van de volgende stappen, bij voorkeur in de volgende volgorde: - de scheiding van de fermentatiebouillon door ultrafiltratie om een gescheiden HMO- bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen; - de behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom met een behandeling van actieve koolstof; - de zuivering van de HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltratiemembraan bij voorkeur in het bereik van 500-3000 Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en - de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen; of de methode bestaat uit de volgende stappen, bij voorkeur in de volgende volgorde: - de scheiding van de fermentatiebouillon door ultrafiltratie om een gescheiden HMO- bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen; - de behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom met een behandeling van actieve koolstof, - de zuivering van de HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltratiemembraan bij voorkeur in het bereik van 500-3000 Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en - de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.

In een aspect omvat de methode volgens de uitvinding, inclusief de hierboven beschreven voorkeurs- en meer voorkeursuitvoeringen, minstens een nanofiltratiestap waarbij het nanofiltratiemembraan een molecuulgewicht cut-off (MWCO) van 500-3000 Da heeft, de actieve (top)laag van het membraan uit polyamide bestaat, bij voorkeur polyamide op basis van piperazine, het membraan een MgSO4-afstotingsfactor van ongeveer 50-90 % en bij voorkeur een NaCl-afstotingsfactor van niet meer dan 50 % heeft en de nanofiltratiestap wordt uitgevoerd zodat de pH lager is dan 5,0, bij voorkeur lager dan 4,5, bij voorkeur lager dan 4,0, maar bij voorkeur niet lager dan 3,0, zodat de te zuiveren neutrale of gesialyleerde HMO wordt tegengehouden en de mono- en divalente zouten kunnen passeren en zich in het permeaat ophopen, en ook minstens een deel van de lactose kan passeren en zich in het permeaat kan ophopen.

3. Neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide geproduceerd volgens de methode van de uitvinding In een ander aspect heeft de uitvinding betrekking op een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide, verkregen volgens de methode van de uitvinding. De neutrale of gesialyleerde HMO die volgens de beschreven methode in deze specificatie wordt gewonnen en gezuiverd, kan amorf of kristallijn zijn, maar is bij voorkeur amorf. Bij voorkeur is de zuiverheid van de neutrale of gesialyleerde HMO op droge basis groter dan 80 massaprocent voor een enkele neutrale of gesialyleerde HMO op basis van droog materiaal; of voor mengsels van HMO's is de zuiverheid groter dan 70 % op basis van droog materiaal, voor de combinatie. Nog meer bij voorkeur is de zuiverheid van een enkele neutrale of gesialyleerde HMO groter dan 90 massaprocent. Bij voorkeur heeft de neutrale of gesialyleerde HMO minstens een van de volgende kenmerken (in gewicht): <2 % lactulose, <3 % fucose, <1 % galactose of <3 % glucose. In een uitvoering heeft de neutrale of gesialyleerde HMO een fijne fractie (kleiner dan of gelijk aan 10 um), van minder dan 10 %, bij voorkeur minder dan 5 %, meer bij voorkeur minder dan 1 %, meest bij voorkeur minder dan 0,1 %. De neutrale of gesialyleerde HMO heeft bij voorkeur ook een gemiddelde deeltjesgrootte (d 50) van meer dan 100 um, bij voorkeur meer dan 150 um, nog meer bij voorkeur meer dan 200 um. De neutrale of gesialyleerde HMO geproduceerd volgens de methode van de uitvinding heeft een goede stroombaarheid. Bij voorkeur heeft de neutrale of gesialyleerde HMO een Carr- index van minder dan 30, waarbij de Carr-index (C) wordt bepaald aan de hand van de formule C = 100(1-p B/ p T), waarbij p B de vrij neergeslagen bulkdichtheid van het poeder en p T de afgetapte bulkdichtheid van het poeder na het ” neerslaan” is. Voor vrij stromende vaste stoffen zouden de waarden van bulkdichtheid en afgetapte dichtheid gelijkaardig zijn, met een lage waarde tot gevolg. Voor minder goed stromende vaste stoffen zouden de verschillen tussen deze waarden groter zijn, waardoor de Carr-index groter zou zijn. Bij voorkeur heeft de neutrale of gesialyleerde HMO een watergehalte van minder dan 15 massaprocent, minder dan 10 massaprocent, minder dan 9 massaprocent, minder dan 8 massaprocent, minder dan 7 massaprocent of minder dan 6 massaprocent. Om de terugwinning van het product te optimaliseren, heeft de neutrale of gesialyleerde HMO bij voorkeur een pH groter dan 3,0 in een oplossing van minstens 5 % en bij voorkeur een pH groter dan 4,0. Doorgaans wordt dit bereikt door de pH van de HMO-bevattende stroom voor de drogingsstap aan te passen tot meer dan 3,0. Bij voorkeur heeft de neutrale of gesialyleerde HMO een pH tussen 4 en 7, meer bij voorkeur tussen 4,5 en 5,5.

Ineen uitvoering is de volgens de methode van de uitvinding verkregen HMO een gedroogde neutrale of gesialyleerde HMO, bij voorkeur met een watergehalte van minder dan 6 massaprocent.

Ineen uitvoering is de volgens de methode van de uitvinding verkregen neutrale of gesialyleerde HMO in een voedingsproduct (bijv. voedsel voor mensen of dieren), voedingssupplement of geneesmiddel verwerkt.

In sommige uitvoeringen wordt de neutrale of gesialyleerde HMO in babyvoeding verwerkt (bijv. zuigelingenvoeding). Zuigelingenvoeding is in het algemeen een gefabriceerd voedingsmiddel voor het voeden van zuigelingen als volledige of gedeeltelijke vervanging van moedermelk. In sommige uitvoerignen wordt zuigelingenvoeding verkocht als een poeder voor flesvoeding aan een zuigeling door het met water te mengen. De samenstelling van zuigelingenvoeding is meestal zodanig ontworpen dat ze moedermelk min of meer nabootst. In sommige uitvoeringen wordt een neutrale of gesialyleerde HMO gezuiverd volgens een methode in deze specificatie in zuigelingenvoeding verwerkt om voedingsvoordelen te bieden die vergelijkbaar zijn met de voordelen die worden geboden door een of meerdere neutrale of gesialyleerde HMO's in moedermelk. In sommige uitvoeringen wordt de neutrale of gesialyleerde HMO met een of meerdere ingrediënten van de zuigelingenvoeding gemengd. Voorbeelden van ingrediënten van zuigelingenvoeding zijn magere melk, koolhydraatbronnen

(bijv. lactose), eiwitbronnen (bijv. wei-eiwitconcentraat en caseïne), vetbronnen (bijv. plantaardige oliën zoals palmolie, saffloerolie met een hoog oliegehalte, raapzaadolie, kokosolie en/of zonnebloemolie; en visoliën), vitaminen (zoals vitamine A, B, B2, C en D), mineralen (zoals kaliumcitraat, calciumcitraat, magnesiumchloride, natriumchloride, natriumcitraat en calciumfosfaat).

Een ander aspect van de uitvinding heeft dus betrekking op een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide, verkregen volgens de methode van de uitvinding, voor gebruik in de geneeskunde. Een ander aspect van de uitvinding heeft dus betrekking op het gebruik van een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide, verkregen volgens de methode van de uitvinding, voor voedings- en/of voedertoepassingen. Een ander aspect van de uitvinding heeft dus betrekking op een voedingsmiddel of cosmetisch product dat de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide bevat, verkregen volgens de methode van de uitvinding.

VOORBEELDEN Voorbeeld 1: vergelijking van MgSO4- en Na:SO4-afstoting 2,01 van 0,2 % MgSO4-oplossing werd geladen in een MMS SW18-systeem uitgerust met spiraalgewonden Trisep” UA60-element met een grootte van 1812 (piperazine-amide, MWCO 1000-3500 Da, membraanoppervlakte 0,23 m?). Het systeem draaide met een doorstroming van 400 l/u, waarbij het permeaat terug naar de toevoertank vloeide. Er werd gedurende minstens 5 min. of tot een constant geleidingsvermogen in het permeaat onder elke omstandigheid gestabiliseerd. De pH werd aangepast door een kleine hoeveelheid 25 % H;SO:-oplossing toe te voegen. Het geleidingsvermogen van het permeaat en het retentaat wordt in de onderstaande tabel aangegeven.

MgSO4-afstoting vs pH T 25 % Stro | Geleidingsver | Geleidingsver T pH | Deb MP H;SO4 | om mogen mogen Afstotingsf (© (retent | iet (ba toegevo (1/m? retentaat permeaat actor C) aat) | (lu) r) egd (ul) u) (mS/em) (mS/em) 24, 6,06 | 21,1 | 91,6 2.100 0,785 62,61 % 7 25, 10 > 20 4,91 20,9 | 90,8 2.100 0,587 72,05 % 24, 10 40 435 | 20,9 | 90,8 2.130 0,624 70,70 % 9 25, 10 3,93 | 20,5 | 892 2.170 0,520 76,04 % 1 25, 10 1 160 3,56 | 20,2 | 87,7 2.260 0,538 76,19 % Hetzelfde experiment werd uitgevoerd met een 0,2 % Na:SO4-oplossing.

T 25% Stro | Geleidingsver | Geleidingsver T pH Deb MP H;SO4 om mogen mogen Afstotingsf (© (retent | iet (ba toegevo (1/m? retentaat permeaat actor C) aat) | (lu) 10 | 22, 5,70 | 16,7 | 72,6 2.840 0,0755 97,34 % Jp VTT EE 10 [22,] 10 5,24 | 15,6 | 67,8 2.840 0,1706 93,99 % Cp LT EE 10 | 22, 30 439 | nvt|nvt. 2.840 0,824 70,99 %

HEN 10 |22,| 70 3,91 | 13,6 | 59,1 2.850 1,706 40,14 % ep LVL EE 10 [22,| 110 3,71 | 18,0 | 78,3 2.880 1,939 32,67 %

DA A 10 | 22, 190 3,48 18,4 | 80,0 2.970 2.090 28,67 %

EH RE 10 | 22, 350 3,21 18,4 | 80,0 3.060 2.230 27,12 %

DA 10 | 22, 670 2,94 18,4 | 80,0 3.280 2.500 23,78%

EN NH 10 | 22, 1310 2,65 18,1 | 78,7 3.730 2.870 23,06 %

DN Er werd aangetoond dat de afstoting van natriumzout met divalent tegenion, zoals sulfaat, sterk pH-afhankelijk is in het geval van NF met polyamidemembraan. Omdat na de behandeling met een sterk kationenwisselaarshars een aanzienlijke hoeveelheid natriumzout in de verzamelde fracties aanwezig is als gevolg van de neutralisatie met een NaOH-oplossing (zie stap #3 in voorbeeld 4), kunnen deze zouten doeltreffend worden verwijderd in een tweede NF/DF (zie stap #5 in voorbeeld 4) wanneer de DF wordt uitgevoerd bij een pH van minder dan 4,5, bij voorkeur minder dan 4,0, wat leidt tot een vrijwel zoutvrije oplossing (zoals beoordeeld aan de hand van het geleidingsvermogen). In dit opzicht is het niet nodig om basische anionische harsen te gebruiken om een zoutvrije oplossing te verkrijgen.

Voorbeeld 2 — Bepaling van de afstotingsfactor van een substantie op een membraan De afstoting van NaCl en MgSO4 op een membraan wordt als volgt bepaald: in een membraanfiltratiesysteem wordt een NaCl- (0,1 %) of een MgSO4-oplossing (0,2 %) over de gekozen membraanplaat (voor Tami: buismodule) gecirculeerd terwijl de permeaatstroom terug naar de toevoertank wordt geleid. Het systeem wordt gedurende 10 minuten bij 10 bar en 25 °C gestabiliseerd voordat monsters van het permeaat en het retentaat worden genomen. De afstotingsfactor wordt aan de hand van het gemeten geleidingsvermogen van de monsters berekend: (1-kp/kr): 100, waarbij kp het geleidingsvermogen van NaCl of MgSO4 in het permeaat en kr het geleidingsvermogen van NaCl of MgSO4 in het retentaat is.

membraan | actieve laag | MWCO spec. meting in spec. meting in Trisep® | piperazine- | 1000- iN

EE ES De afstotingsfactor van een koolhydraat wordt op een gelijkaardige manier, met dit verschil dat de afstotingsfactor wordt berekend op basis van de concentratie van de monsters (bepaald door HPLC): (1-Cp/Cr)-100, waarbij Cp de concentratie van het koolhydraat in het permeaat en Cr de concentratie van het koolhydraat in het retentaat is.

Voorbeeld 3 Algemeen: Het gehalte aan koolhydraten en onzuiverheden werd gekwantificeerd met behulp van gekalibreerde HPLC en/of HPAEC. De oplosbare eiwitten werden met de Bradford- bepaling gekwantificeerd. De kleur werd gekwantificeerd door UV-absorptiemeting bij 400 nm in een cuvette met een pad van 1 cm. De kleurindex CI 400 wordt aan de hand van de volgende formule berekend: CI 400 = 1000* Abs 400/Brix.

Fermentatie: LNT werd geproduceerd door microbiële fermentatie met behulp van een genetisch gemodificeerde E.coli-stam. De fermentatie werd uitgevoerd door de stam te kweken in aanwezigheid van exogeen toegevoegde lactose en een geschikte koolstofbron, waarbij LNT werd geproduceerd dat vergezeld ging van de trisacharide lacto-N-triose II, de hexasacharide pLNH II en niet-gereageerde lactose als belangrijkste koolhydraatonzuiverheden in de fermentatiebouillon. Aan het einde van de fermentatie werd de pH op 4 gebracht door 25 % zwavelzuur toe te voegen.

Voorbehandeling van de bouillon en verwijdering van de biomassa door centrifugati: een deel van de verkregen bouillon (4,3 kg, pH 4,45 na opslag) werd verdund tot een totaal van 11,1 kg met gedestilleerd water, gevolgd door een verwarming tot 80 °C binnen 40 minuten en onmiddellijk laten afkoelen tot de omgevingstemperatuur.

De pH werd op 3,2 gebracht en de bouillon werd gecentrifugeerd.

Het verkregen supernatans (9,0 kg) werd voorzichtig weggepompt om het van het sedigment (2130 g) te scheiden.

Het verkregen geklaarde supernatans had de volgende parameters: Brix = 8,1, geleidingsvermogen 7,50 mS/cm, pH

3,27. Membraanfiltratie: een deel van het verkregen supernatans (4,5 kg) werd onderworpen aan membraanfiltratie in een MMS SW18-systeem uitgerust met Synder® XT2B-1812F- membraanelement (UF PES-membraan, MWCO 1000 Da, oppervlakte 0,32 m°) bij transmembraandruk (TMP) = 3,0 bar, T = 23-25 °C en een doorstroming van 400 l/u. 3,5 kg membraanpermeaat werd in 35 min. opgevangen.

Vervolgens werd het resterende retentaat (Brix 9,7, geleidingsvermogen 7,28 mS/cm) gediafiltreerd door continue toevoeging van water (3,0 | bij een debiet van 5,4 l/uur) onder dezelfde omstandigheden, zodat uiteindelijk een membraanpermeaat (6,9 kg, Brix 5,4) werd verkregen en een retentaat dat grotendeels ontdaan was van HMO's (Brix 1,0) en verrijkt was met eiwitten en resterende gesuspendeerde vaste stoffen.

Losse NF: het hierboven verkregen productbevattend membraanpermeaat (6,8 kg, geleidingsvermogen 5,84 mS/cm, pH 3,40) werd eerst geconcentreerd in hetzelfde SW18- systeem uitgerust met Trisep® UA60-1812-membraanelement (piperazine-amide, MWCO

1000-3500 Da, oppervlakte 0,23 m”, LNT-afstotingsfactor >99 %) door 5,44 kg permeaat te verwijderen in 26 minuten (TMP = 30 bar, T = 40-42 °C, doorstroming 400 l/u), gevolgd door diafiltratie onder dezelfde omstandigheden met toevoeging van 4 1 water met een debiet van 5,0 l/u debiet om in totaal 9,4 kg NF-permeaat te bekomen (Brix 0,6, geleidingsvermogen 4,28 mS/cm, pH 3,21). Het verkregen retentaat (Brix 20,2, geleidingsvermogen 1,67 mS/em,

pH 3,54) werd verder gediafiltreerd met nog eens 10 liter water om een tweede NF-permeaat te verkrijgen (10,3 kg, Brix 0,1, geleidingsvermogen 0,458 mS/cm, pH 3,71) en het uiteindelijke NF-retentaat dat vrijwel zoutvrij was (ca. 1500 g, Brix 18,2, geleidingsvermogen 0,48 mS/cm, pH 4,28). AC-behandeling: Een deel van het verkregen NF-retentaat (379 g) werd met een toevoersnelheid van ca. 6 ml/min. door een korte kolom gevoerd, die wa gevuld met Silcarbon® CW20 (6,00 g, ID = 2,1 cm, bedhoogte = 5,3 cm, voorgespoeld met 200 ml gedeïoniseerd water), gevolgd door 50 ml waterelutie om 407 g kleurloze oplossing te verkrijgen (Brix 16,2, geleidingsvermogen 0,455 mS/cm, pH 4,17, Abs 400 0,0130 in overeenstemming met CI 400 = 0,80). De verkregen oplossing werd gevriesdroogd en leverde 62 g witte vaste stof op. Voorbeeld 4 Algemeen: Het gehalte aan koolhydraten en onzuiverheden werd gekwantificeerd met behulp van gekalibreerde HPLC en/of HPAEC. De oplosbare eiwitten werden met de Bradford- bepaling gekwantificeerd. De kleur werd gekwantificeerd door UV-absorptiemeting bij 400 nm in een cuvette met een pad van 1 cm. De kleurindex CI 400 wordt aan de hand van de volgende formule berekend: CI 400 = 1000* Abs 400/Brix. Fermentatie: 2'-FL werd geproduceerd door microbiële fermentatie met behulp van een genetisch gemodificeerde Æ. coli-stam die een recombinant gen bevat dat een a-1,2- fucosyltransferase codeert. De fermentatie werd uitgevoerd door de stam te kweken in aanwezigheid van exogeen toegevoegde lactose en een geschikte koolstofbron, waarbij 2’-FL werd geproduceerd dat vergezeld ging van DFL en niet-gereageerde lactose als belangrijkste koolhydraatonzuiverheden in de fermentatiebouillon.

Zuivering:

1. UF/DF: De verkregen bouillon werd aangezuurd tot pH = 3,8 met zwavelzuur, gevolgd door ultrafiltratie-diafiltratie door keramische membraanelementen van 15 kDa bij T = 60 °C in een industrieel continu UF-systeem met een DF-waterstroom van ongeveer 2 keer de toevoerstroom en een UF-retentaatstroom van ca. de helft van de toevoerstroom.

2. NF/DF: De productbevattende UF-permeaatstroom (Brix ca. 5) werd onmiddellijk verwerkt door losse nanofiltratie met diafiltratie in een industrieel continu NF-systeem dat was uitgerust met Trisep® UA60-membraanelementen (piperazine-amide, MWCO 1000-3500 Da) (TMP = 30 bar, T = 15 °C) en met een DF-waterstroom die ongeveer twee keer zo groot was als de toevoerstroom (UF-permeaat).

3. Behandeling met een sterk kationenwisselaarshars: Een monster van het verkregen NF- retentaat (4,7 kg, Brix 23,8, geleidingsvermogen: 2,20 mS/cm, pH = 3,9, CI 400: 134) werd door een kolom geleid die was gevuld met 800 ml Dowex® 88 hars in H*-vorm (capaciteit 1,8 eq/l) bij een debiet van 2 bedvolumes per uur, gevolgd door elutie met water (730 ml). Er werd 400 ml fracties verzameld. Elke fractie werd getitreerd met IM NaOH tot pH = 4,5 en geanalyseerd op suiker-, kleur- en eiwitgehalte. De fracties #2-13 met aangepaste pH werden gecombineerd om 5,4 kg gele oplossing te verkrijgen (Brix 20,2, geleidingsvermogen: 3,48 mS/cm, pH = 4,55, CI 400: 67,3).

4. Ontkleuring met actieve houtskool: Een deel van de verkregen oplossing (3,5 kg) werd door gegranuleerde actieve houtskool CPG LF (75 g, 150 ml) geleid die in een kolom (ID =

16 mm) was geplaatst bij +60 °C en een debiet van 2 bedvolumes per uur, gevolgd door elutie met water (300 ml). Er werd 150 ml fracties verzameld. De fracties #2-24 werden gecombineerd om 3,5 kg vrijwel kleurloze oplossing te verkrijgen (Brix 19,7, geleidingsvermogen 3,42 mS/cm, pH = 5,19, CI 400: 1,23).

5. NF/DF: De verkregen oplossing (3,4 kg) werd onderworpen aan diafiltratie met constant volume in een MMS SW 18-membraanfiltratiesysteem, uitgerust met een spiraalgewonden Trisep” UA60-membraan met een grootte van 1812, onder de volgende omstandigheden: doorstroming = 400 l/u, TMP = 30 bar, T = 30-35 °C en DF waterstroom 4,0 l/u. Eerst werd de DF uitgevoerd bij een pH van ongeveer 5 (10 1), vervolgens bij 3,8 (nog eens 10 1). Tot slot werd het retentaat verder geconcentreerd bij TMP = 39 bar, gevolgd door een aanpassing van de pH tot 4,5 met een 4 % NaOH-oplossing en uit het systeem gepompt om 1,8 kg eindoplossing te verkrijgen (Brix 30,6, geleidingsvermogen: 0,216 mS/cm, pH = 4,49, CI 400: 1,35).

6. Microfiltratie en vriesdroging: Het hierboven verkregen NF-retentaat werd door een PES- microfilter van 0,2 um geleid, zodat 1,6 kg oplossing (Brix 30,6) overbleef en werd gevriesdroogd tot 492 g wit poeder.

Claims

CONCLUSIES

1. Een methode voor de terugwinning en de zuivering van een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide (HMO) uit een fermentatiebouillon, die bestaat uit de volgende stappen: a. de voorziening van een HMO-bevattende fermentatiebouillon en al. de scheiding van de fermentatiebouillon om een gescheiden HMO-bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen; of a2. de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door pH-aanpassing, verdunning en/of warmtebehandeling;, b. de behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom van stap al) of de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) met actieve koolstof om een HMO-bevattende stroom te verkrijgen; c. de zuivering van de HMO-bevattende stroom door nanofiltratie; d. de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom; en e. de droging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.

2. De methode volgens conclusie 1, waarbij de zuiverheid van de HMO in de fermentatiebouillon <70 %, bij voorkeur <60 %, nog meer bij voorkeur <50 %, meest bij voorkeur <40 % is.

3. De methode volgens conclusie 1 of 2, waarbij in stap a2) de pH-waarde van de fermentatiebouillon wordt verlaagd en de fermentatiebouillon wordt verwarmd.

4. De methode volgens conclusie 3, waarbij de pH-waarde van de fermentatiebouillon op een zure pH-waarde wordt ingesteld, bij voorkeur van 3 tot 6.

5. De methode volgens conclusie 3 of 4, waarbij de fermentatiebouillon tot een temperatuur van 30 tot 90 °C, bij voorkeur van 35 tot 85 °C wordt verwarmd.

6. De methode volgens een van de conclusies 3 tot 5 die geen ultrafiltratie- en/of centrifugatiestap omvat.

7. De methode volgens een van de conclusies 3 tot 6, waarbij de HMO wordt geadsorbeerd door de actieve koolstof in stap b) en weer gedesorbeerd, bij voorkeur door een waterig organisch oplosmiddel.

8. De methode volgens conclusie 1 of 2, waarbij de HMO uit de gescheiden HMO- bevattende stroom van stap al) niet of althans niet aanzienlijk door de actieve koolstof wordt geadsorbeerd in stap b).

9. De methode volgens conclusie 8, waarbij in stap b) een hoeveelheid actieve koolstof wordt gebruikt van <10 % in gewicht ten opzichte van de HMO die in de HMO- bevattende stroom aanwezig is, en bij voorkeur een hoeveelheid van 2 tot 6 %.

10. De methode volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij het nanofiltrattemembraan in stap c) een molecuulgewicht cut-off (MWCO) van 500-3000 Da heeft en de actieve laag van het membraan bij voorkeur bestaat uit polyamide, bij voorkeur polyamide op basis van piperazine.

11. De methode volgens conclusie 10, waarbij het nanofiltratiemembraan een MgSO:- afstotingsfactor van ongeveer 50-90 % en bij voorkeur een NaCl-afstotingsfactor van niet meer dan 50 % heeft.

12. De methode volgens conclusie 10 of 11, waarbij stap c) wordt uitgevoerd zodat de pH lager wordt dan 5,0, bij voorkeur lager dan 4,5, bij voorkeur lager dan 4,0, maar bij voorkeur niet lager dan 3,0.

13. De methode volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij stap d) bestaat uit verdamping, nanofiltratie en/of omgekeerde-osmosefiltratie, bij voorkeur uit verdamping.

14. De methode volgens conclusie 13, waarbij stap d) een concentratie met een nanofiltrattemembraan omvat, waarbij het nanofiltratiemembraan bij voorkeur een molecuulgewicht cut-off (MWCO) van 150-300 Da heeft.

15. De methode volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij stap e) bij voorkeur bestaat uit de sproeidroging om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.

16. De methode volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij de methode een verdere zuivering van de HMO-bevattende stroom omvat, bij voorkeur na stap c), met een zuur kationenwisselaarshars, bij voorkeur een sterk zuur kationenwisselaarshars.

17. De methode volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij een behandelingsstap met basisch anionisch wisselaarshars en/of een elektrodialysestap is uitgesloten.

18. De methode volgens conclusie 1 of 2 die uit de volgende stappen bestaat: - de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door pH-aanpassing, verdunning en/of warmtebehandeling;

- de behandeling van de voorbehandelde fermentatiebouillon met actieve koolstof om een HMO-bevattende stroom te verkrijgen, waarbij de HMO door de actieve koolstof wordt geadsorbeerd en weer wordt gedesorbeerd door een waterig organisch oplosmiddel als eluent; - de zuivering van de hierboven verkregen HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltrattemembraan bij voorkeur in het bereik van 500-3000 Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en - de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.

19. De methode volgens conclusie 1 of 2 die uit de volgende stappen bestaat: - de scheiding van de fermentatiebouillon door ultrafiltratie om een gescheiden HMO-bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen; - de behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom met een behandeling van actieve koolstof, - de zuivering van de HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltratiemembraan bij voorkeur in het bereik van 500- 3000 Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en - de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.

20. De methode volgens conclusie 18 of 19, waarbij het nanofiltratiemembraan een actieve (top)laag heeft die bestaat uit polyamide, het membraan een MgSO:- afstotingsfactor van ongeveer 50-90 % en een NaCl-afstotingsfactor van niet meer dan 50 % heeft, en de nanofiltratiestap zodanig wordt uitgevoerd dat de pH lager dan 5,0 is, bij voorkeur lager dan 4,5, bij voorkeur lager dan 4,0, maar bij voorkeur niet lager dan 3,0.

21. De methode volgens een van de conclusies 18 tot en met 20, waarbij een behandelingsstap met ionenwisselaarshars en een elektrodialysestap zijn uitgesloten.

22. De methode volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij de HMO een neutrale HMO is.

23. De methode volgens conclusie 22, waarbij de HMO wordt gekozen uit de groep bestaande uit: 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, 2',3-difucosyllactose, lacto-N-triose IL lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, lacto-N-fucopentaose I, lacto-N-fucopentaose IL lacto-N-fucopentaose III lacto-N-fucopentaose V, lacto-N-fucopentaose VI, lacto- N-difucohexaose I, lacto-N-difucohexaose II, lacto-N-difucohexaose III, 6'- galactosyllactose, 3'-galactosyllactose, lacto-N-hexaose en lacto-N-neohexaose.

24. De methode volgens conclusie 22 of 23, waarbij de HMO 2'-fucosyllactose, 3- fucosyllactose, 2',3-difucosyllactose, lacto-N-triose IL, lacto-N-tetraose, lacto-N- neotetraose of een lacto-N-fucopentaose is, bij voorkeur 2'-fucosyllactose, LNT, LNnT of een lacto-N-fucopentaose.

25. De methode volgens een van de conclusies 1 tot 21, waarbij de HMO een gesialyleerde HMO is, bij voorkeur 3'-sialyllactose (3'-SL) of 6'-sialyllactose (6'-SL).