BE1028574A1 - Heterocyclische verbindingen gebruikt als nitrificatieremmer - Google Patents

Description

Heterocyclische verbindingen gebruikt als nitrificatieremmer Beschrijving De onderhavige uitvinding heeft betrekking op het gebruik van een specifieke N- heterocyclische verbinding als nitrificatieremmer of als stikstofstabilisator, op meststof- mengsels die deze verbinding bevatten, op een procedé voor de bereiding ervan, en op de methode voor de bemesting van de bodem waarbij deze verbinding wordt toegepast.

Om planten in de land- of tuinbouw te voorzien van de stikstof die zij nodig hebben, worden vaak meststoffen gebruikt die ammoniumverbindingen bevatten.

Met de uitvinding van het Haber-Bosch-proces in 1908 hebben meststoffen de Groene Revolutie in de jaren '50 en '60 gestimuleerd en bijgedragen tot de voeding van de ex- ponentieel groeiende wereldbevolking.

Aangezien stikstof (N) een van de belangrijkste voedingsstoffen is voor planten om te groeien, verhoogde deze industriële synthese van ammoniak (NH3) de grenzen van de aarde om voedselgewassen te produceren.

De N- bronnen, voornamelijk ammonium (NH4+) en nitraat (NO3-), die voor de bemesting werden gebruikt, werden echter niet alleen door de planten gebruikt, maar lekten ook uit in het milieu of werden microbieel omgezet via de stikstofcyclus in ontoegankelijke N- vormen.

Gemiddeld gaat er dus bijna 50% van de N-meststoffen verloren.

Bovendien leidt uitspoeling van N tot eutrofiëring van grondwater en vrij water en veroorzaakt het toxische algenbloei, verminderde waarde van recreatiewater of verontreiniging van drinkwater.

Microbiële omzetting in het broeikasgas N20 draagt sterk bij tot de opwar- ming van de aarde.

Met een wereldbevolking die tegen 2050 naar verwachting 9,7 mil- jard zal bedragen, verwacht de FAO echter dat de vraag naar meststoffen met 50% of meer zal toenemen.

Daarom zijn mitigatiestrategieën belangrijk om de hoeveelheid N- uitstoot zo veel mogelijk te beperken.

Eén aanpak is het remmen van de nitrificatie, d.w.z. de omzetting van NH4+ of NH3 in NO3-. In tegenstelling tot NO3- bindt het positief geladen NH4+ zich aan de negatief geladen bodemdeeltjes en zal het nauwelijks uit de bodem uitspoelen.

Daarom heeft NH4+ de voorkeur als N-bron en moet het in de bodem beschikbaar worden gehouden voor op- name door planten.

NH4+ kan echter worden omgezet in NO3- via nitrificatie, een mi- crobieel proces van de mondiale N-cyclus waarbij NH3, dat zich in een pH-afhankelijk evenwicht met NH4+ bevindt, door bodemmicro-organismen wordt omgezet in NO3- via nitriet (NO2-). Nitrificatie is dus een centrale stap die ervoor zorgt dat NH4+ in de N- cyclus terechtkomt en vervolgens wordt omgezet in ongewenste uitloogbare of vluchtige N-vormen.

De eerste stap in de nitrificatie, de oxidatie van NH3, wordt in landbouwgronden en - substraten hoofdzakelijk uitgevoerd door ammonia-oxiderende bacteriën (AOB). Zij oxi- deren NH3 eerst tot hydroxylamine (NH2OH), wat wordt gekatalyseerd door het enzym ammonia-monooxygenase (AMO). Vervolgens katalyseert het enzym hydroxylamine oxidoreductase (HAO) de tweede stap: oxidatie van NH2OH tot nitriet (NO2-). In het verleden zijn verschillende organische en anorganische verbindingen geïdentifi- ceerd als nitrificatieremmers, maar slechts enkele daarvan worden momenteel in de handel gebracht, waaronder dicyaandiamide (DCD), nitrapyrine (2-chloor-6- (trichloormethyl)-pyridine) of 3,4-dimethylpyrazolfosfaat (DMPP). De doeltreffendheid van nitrificatieremmers kan echter variëren tussen verschillende stammen en geslach- ten van AOB.

Daarom is het belangrijk het scala van toegepaste nitrificatieremmers uit te breiden.

Een probleem bij het gebruik van pyrazoolverbindingen als nitrificatieremmers is hun hoge vluchtigheid.

Wanneer meststofpreparaten die pyrazoolverbindingen bevatten worden opgeslagen, is er een voortdurend verlies van actieve stof als gevolg van ver- damping.

Daarom moeten de pyrazoolverbindingen door middel van passende maatre- gelen in een niet-vluchtige vorm worden geformuleerd.

EP-B-1 120 388 beschrijft additiezouten in fosforzuur van 3,4-dimethylpyrazool en 4- chloor-3-methylpyrazool voor gebruik als nitrificatieremmer.

Door de zoutvorm is het mogelijk de vluchtigheid aanzienlijk te verminderen.

WO 96/24566 heeft betrekking op het gebruik van laag-volatiele pyrazoolderivaten met hydrofiele groepen als nitrificatieremmers.

Als voorbeeld wordt 2-(N-3- methylpyrazool)barnsteenzuur (DMPSA) voorgesteld als nitrificatieremmer.

Als geschik- te minerale meststoffen worden ammoniumhoudende nitraten, sulfaten of fosfaten ge- noemd.

WO 2011/032904 en WO 2013/121384 beschrijven pyrazolderivaten als nitrificatierem- mers, waarvan DMPSA er een is.

A.

Saha et al. beschrijven in J.

Heterocyclic.

Chem., 47, 838 (2010) de groene synthese van 5-gesubstitueerde-1-3,4-thiadiazool-2-thiolen als nieuwe krachtige nitrificatierem-

mers.

De 1,3,4-thiaidazool-2-thiolen zijn 5-gesubstitueerd met alkyl- of arylresiduen.

De verbindingen werden gescreend op hun in vitro nitrificatieremmende activiteit.

Verbin- dingen die 5-gesubstitueerd zijn met heptyl, 2-chloorfenyl, 2,4-dichloorfenyl, 2- methylfenyl, 3-methylfenyl, 3,4-dimethoxyfenyl, 2-hydroxyfenyl, 4-hydroxy-3-

methoxyfenyl worden beschouwd als veelbelovende nitrificatieremmers.

WO 2020/020765 A1 vermeldt het gebruik van gesubstitueerde thiazolidineverbindingen als nitrificatieremmer.

De verbindingen zijn afgeleid van 1,3-thiozolidine-2-thione zoals weergegeven in de tabel op bladzijde 71. WO 2020/020777 A1 onthult gesubstitueerde 2-thiazoline als nitrificatieremmers.

De verbindingen zijn afgeleid van 2-mercapto-2-thiazoline door substitutie van waterstof- atomen van de ringstructuur of de mercaptogroep.

CN 103 524 159 A vermeldt dat naast andere ingrediënten oxazolidion in de meststof aanwezig kan zijn.

Er wordt geen functie voor deze verbinding vermeld.

Er is een blijvende behoefte aan nieuwe nitrificatieremmers met een hoge nitrificatie- remmende werking, een lage toxiciteit en een lage vluchtigheid.

Het doel van de onderhavige uitvinding is daarom nieuwe nitrificatieremmers te ver- schaffen die bij voorkeur een hoge nitrificatieremmende activiteit hebben.

Een ander doel van de uitvinding is de ontwikkeling van een meststofmengsel dat een dergelijke nitrificatieremmer bevat, een methode voor de bereiding ervan en een me- thode voor de bemesting van de bodem met behulp van dit mengsel.

De doelstellingen worden bereikt door het gebruik van een N-heterocyclische verbinding van de algemene formule (a) of (b) R2 FS RMI R2 f Se 4 ë ; R37 | Nx RE Nr BF (a) NF {b} met de volgende definities: X1is SofO, X2 is S of O en ten minste een van X1 en X2 is S

R2H of c1-4-aikyl, R3H of c1-4-alkyl R6 en R7 zijn waterstof of vormen samen een covalente koolstof-koolstofverbinding in de algemene formule (a) R1 zijnde H, c1-12-alkym of -CH2-NRARS met R4-waterstof Of c1-4-alky,

R5C1-12-koolwaterstofresidu dat één tot drie halogeenatomen en/of één tot vier hete- roatomen, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, kan bevatten, waarbij het ook mogelijk is dat R4 en R5 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt, een verza- digde of onverzadigde heterocyclische radicaal met vijf of zes leden vormen, die naar keuze ook één of twee heteroatomen, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, kan bevatten, in algemene formule b) R1 zijnde H of c1-17-koolwaterstor, bij voorkeur H, of -CH2-R5 waarbij R5 H of C1-16-koolwaterstofresidu is, welke koolwaterstof één tot drie halogeenatomen en/of één tot zes heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, en bij voorkeur in de algemene formules (a) en (b) waarbij X1 en X2 S zijn, als nitrificatieremmer.

De doelstellingen worden bij voorkeur bereikt door het gebruik van een N- heterocyclische verbinding van de algemene formule (1) of (Il) of (II!) of (IV)

R2 R1 R2

TA N Je Ve R1 R3 RS X1 XI (1) (Il) R2 R1 R2

NT N / Je / ae R3 X1 R3 X1 (INN) (IV) met de volgende definities: X1 is Sof O, X2 is S of O en ten minste een van X1 en X2 is S R2H of c1-4-aikyl, 5 R3H of c1-4-alkyl in de algemene formules (I) en (II!) R1 zijnde H, c1-12-aiky1 Of -CH2-NR4R5 met R4-waterstof Of c1-4-alky, R5C1-12-koolwaterstofresidu dat één tot drie halogeenatomen en/of één tot vier hete- roatomen, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, kan bevatten, waarbij het ook mogelijk is dat R4 en R5 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt, een verza- digde of onverzadigde heterocyclische radicaal met vijf of zes leden vormen, die naar keuze ook één of twee heteroatomen, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, kan bevatten, in de algemene formules (Il) en (IV) is R1 H of c1-17-koolwaterstof, bij voorkeur H, of -CH2- R5 waarbij R5 H of C1-16-koolwaterstofresidu is, welke koolwaterstof één tot drie halo- geenatomen en/of één tot zes heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep stik- stof, zuurstof en zwavel, en bij voorkeur in de algemene formules (Il), (Ill) en (IV) X1 en X2 zijn S, als nitrificatieremmer, bij voorkeur gericht tegen AOB en eventueel comammox.

In het navolgende wordt vaak verwezen naar N-heterocyclische verbindingen van de algemene formules (I) tot (IV). De verbindingen van de hierboven genoemde algemene formules (a) en (b) kunnen eveneens worden gebruikt en de verwijzingen gelden ook voor de formules (a) en (b). Formule (a) is een combinatie van formule (I) en (Ill). For- mule (b) is een combinatie van formule (II) en (IV).

Daarin fungeren de N-heterocyclische verbindingen van de algemene formule (I) en/of (II) en/of (III) en/of (IV) als nitrificatieremmers in vaste of vloeibare meststoffen. Boven- dien fungeren zij ook als stikstofstabilisator in vloeibare meststoffen of in mest. Mest- stoffen kunnen organische en/of anorganische en/of organominerale meststoffen zijn.

Het doel wordt verder bereikt door het gebruik van de N-heterocyclische verbinding van algemene formule (I) en/of (Il) en/of (III) en/of (IV) als additief of bekledingsmateriaal voor, bij voorkeur anorganische, meststoffen, bij voorkeur ammonium- en/of ureumhou- dende stikstofnoudende meststoffen.

Het doel wordt verder bereikt door het gebruik van de N-heterocyclische verbinding van algemene formule (1) en/of (Il) en/of (II!) en/of (IV) voor het verminderen van de stikstof- of koolstofverliezen in anorganische en/of organische en/of organinerale meststoffen of stikstof- of koolstofhoudende verbindingen of materialen en ook op oogstafval en weide- land of tijdens de opslag van vloeibare mest, en voor het verminderen van de ammoni- akbelasting in dierenstallen.

Het kan voorts voordelig zijn om de N-heterocyclische verbinding van algemene formule (I) en/of (Il) en/of (II!) en/of (IV) nitrificatieremmer te gebruiken in combinatie met een aanvullend agrochemisch middel, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit - ten minste één andere nitrificatieremmer, bij voorkeur gekozen uit de groep be- staande uit 2-(3,4-dimethyl-pyrazol-1-yl)-barnsteenzuur (DMPSA), 3,4-dimethylpyrazool (DMP), 3,4-dimethylpyrazoolfosfaat (DMPP) dicyaandiamide (DCD), 1H-1,2,4-triazool, 3-methylpyrazool (3-MP), 2-chloor-6-(trichloormethyl)-pyridine, 5-ethoxy-3- trichloormethyl-1,2,4-thiadiazol, 2-amino-4-chloor-6-methyl-pyrimidine, 2-mercapto- benzothiazool, 2-sulfanilamidothiazool, thioureum, natriumazide, kaliumazide, 1- hydroxypyrazool, 2-methylpyrazool-1-carboxamide, 4-amino-1,2,4-triazool, 3-mercapto- 1,2,4-triazool, 2,4-diamino-6-trichloormethyl-5-triazine, koolstofbisulfide, ammoniumthi- osulfaat, natriumtrithiocarbonaat, 2,3-dinydro-2,2-dimethyl-7- benzofuranolmethylcarbamaat en N-(2,6-dimethylfenyl)-N-(methoxyacetyl)-alanine- methylester, AOA-remmers of comammoxremmers,

- ten minste één ureaseremmer, bij voorkeur gekozen uit N- butylthiofosforzuurtriamide (NBTPT) en/of N-n-propylthiofosforzuurtriamide (NPTPT), - ten minste één gebruikelijke agrochemische hulpstof, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit waterige en/of organische oplosmiddelen, pH-regelaars, oppervlak- teactieve stoffen, bevochtigingsmiddelen, spreidingsmiddelen, adhesiebevorderaars, dragers, vulstoffen, viscositeitsregelaars, emulgatoren, dispergeermiddelen, se- questreermiddelen antizinkmiddelen, coalescentiemiddelen, reologische difiers, anti- schuimmiddelen, fotobeschermingsmiddelen, antivriesmiddelen, biostimulanten, pesti- ciden, biociden, plantengroeiregulatoren, beschermstoffen, penetrerende middelen, an- tiklontermiddelen, minerale en/of plantaardige oliën en/of wassen, kleurstoffen en drift- werende middelen, en mengsels daarvan.

Wanneer de aanvullende nitrificatieremmer wordt gebruikt, is de gewichtsverhouding tussen de N-heterocyclische verbinding van algemene formule (I) en/of (Il) en/of (III) en/of (IV) en de aanvullende nitrificatieremmer bij voorkeur 0,1 tot 10 : 1, bij voorkeur 0,2 tot 5 : 1, en het meest bij voorkeur 0,5 tot 2 : 1. Daarom kan de nitrificatieremmer volgens de onderhavige uitvinding bij voorkeur wor- den gebruikt samen met of in combinatie met andere nitrificatieremmers die bij voorkeur ammoniakoxiderende bacteriën (AOB) of archaea (AOA) remmen, bijvoorbeeld ammo- niakbindend vloeibaar inoculum (ABIL), of volledige ammoniakoxidatiebacteriën (co- mammox). Voorts kan, vooral wanneer de anorganische meststof ureum bevat, de nitrificatierem- mer ook worden gebruikt samen met of in combinatie met een ureaseremmer, die bij voorkeur wordt gekozen uit N-butylthiofosfortriamide (NBTPT of NBPT) en/of N-n- propylthiofosfortriamide (NPTPT of NPPT). Indien de N-heterocyclische verbinding van algemene formule (I) en/of (Il) en/of (III) en/of (IV) van de onderhavige uitvinding gecombineerd wordt met N-n- butylthiofosfortriamide (NBTPT) en/of N-n-propylthiofosfortriamide (NPTPT), ligt de ge- wichtsverhouding tussen nitrificatieremmer(s) en ureaseremmer bij voorkeur tussen 0,1 en 10:1, bij voorkeur tussen 0,5 en 8 : 1, en bij voorkeur tussen 1 en 6 : 1. Daarom heeft de uitvinding ook betrekking op een mengsel dat ten minste één N- heterocyclische verbinding van de algemene formule (1) of (Il) of (II!) of (IV) bevat

R2 R1 R2

NT N Je Ve R1 R3 RS X1 XI (1) (Il) R2 R1 R2

NT N / Ye / ae R3 X1 R3 X1 (IHN) (IV) met de volgende definities: X1 is Sof O, X2 is S of O en ten minste een van X1 en X2 is S R2H Of c1-4-alkyl, R3H of c1-4alkyl in de algemene formules (I) en (II!) R1 zijnde H, c1-12-aiky1 of -CH2-NR4R5 met R4-waterstof Of c1-4-alky, R5C1-12-koolwaterstofresidu dat één tot drie halogeenatomen en/of één tot vier hete- roatomen, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, kan bevatten, waarbij het ook mogelijk is dat R4 en R5 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt, een verza- digde of onverzadigde heterocyclische radicaal met vijf of zes leden vormen, die naar keuze ook één of twee heteroatomen, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, kan bevatten, in de algemene formules (Il) en (IV) is R1 H of c1-17-koolwaterstof, bij voorkeur H, of -CH2- R5 waarbij R5 H of C1-16-koolwaterstofresidu is, welke koolwaterstof één tot drie halo- geenatomen en/of één tot zes heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep stik- stof, zuurstof en zwavel, en bij voorkeur in de algemene formules (Il), (Ill) en (IV) X1 en X2 zijn S,

en ten minste één aanvullend agrochemisch agens, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit - ten minste één andere nitrificatieremmer, bij voorkeur gekozen uit de groep be- staande uit 2-(3,4-dimethyl-pyrazol-1-yl)-barnsteenzuur (DMPSA), 3,4-dimethylpyrazool (DMP), 3,4-dimethylpyrazoolfosfaat (DMPP) dicyaandiamide (DCD), 1H-1,2,4-triazool, 3-methylpyrazool (3-MP), 2-chloor-6-(trichloormethyl)-pyridine, 5-ethoxy-3- trichloormethyl-1,2,4-thiadiazol, 2-amino-4-chloor-6-methyl-pyrimidine, 2-mercapto- benzothiazool, 2-sulfanilamidothiazool, thioureum, natriumazide, kaliumazide, 1- hydroxypyrazool, 2-methylpyrazool-1-carboxamide, 4-amino-1,2,4-triazool, 3-mercapto- 1,2,4-triazool, 2,4-diamino-6-trichloormethyl-5-triazine, koolstofbisulfide, ammoniumthi- osulfaat, natriumtrithiocarbonaat, 2,3-dinydro-2,2-dimethyl-7- benzofuranolmethylcarbamaat en N-(2,6-dimethylfenyl)-N-(methoxyacetyl)-alanine- methylester, AOA-remmers of comammoxremmers, - ten minste één ureaseremmer, bij voorkeur gekozen uit N- butylthiofosforzuurtriamide (NBTPT) en/of N-n-propylthiofosforzuurtriamide (NPTPT), - ten minste één gebruikelijke agrochemische hulpstof, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit waterige en/of organische oplosmiddelen, pH-regelaars, oppervlak- teactieve stoffen, bevochtigingsmiddelen, spreidingsmiddelen, adhesiebevorderaars, dragers, vulstoffen, viscositeitsregelaars, emulgatoren, dispergeermiddelen, se- questreermiddelen antizinkmiddelen, coalescentiemiddelen, reologiemodificatoren, anti- schuimmiddelen, fotobeschermingsmiddelen, antivriesmiddelen, biostimulanten, pesti- ciden, biociden, plantengroeiregulatoren, beschermstoffen, penetrerende middelen, an- tiklontermiddelen, minerale en/of plantaardige oliën en/of wassen, kleurstoffen en drift- werende middelen, en mengsels daarvan.

Een combinatie met ten minste één andere nitrificatieremmer en/of ureaseremmer ver- dient de voorkeur.

Volgens de onderhavige uitvinding is gebleken dat de N-heterocyclische verbindingen van de algemene formule (1) en (Il) en (II!) en (IV) sterke nieuwe nitrificatieremmers zijn, die gericht zijn tegen micro-organismen en bij voorkeur ammoniak-oxiderende bacteriën (AOB) en mogelijk ook ammoniak-oxiderende archaea (AOA) en/of volledige ammoni-

ak-oxidatie (comammox) bacteriën zoals Candidatus Nitrospira kreftii. Zij kunnen wor- den gecombineerd met bekende nitrificatieremmers en/of ureaseremmers. Het nieuwe type nitrificatieremmers is in staat de nitrificatie vooral in de bodem te rem- men.

Thiazolidine-thiolen, en meer bepaald de structuurvarianten van deze moleculen van formule (1) en (II) en (II!) en (IV), bleken nitrificatieremmers te zijn. Deze nitrificatierem- mers remmen specifiek de ammoniakoxidatie in ammoniakoxiderende bacteriën, en verminderen op doeltreffende wijze het ammoniumverlies in landbouwgrond. Bovendien zijn zij Cu-chelatoren, en schakelen zij dus de werking van Cu uit. Cu is noodzakelijk voor de activiteit van het AMO-enzymcomplex, dat essentieel is voor ammoniakoxidatie. Daarom remmen de verbindingen de nitrificatie omdat ze Cu cheleren. Volgens de onderhavige uitvinding kan een N-heterocyclische verbinding van de alge- mene formule (a) en/of (b), bij voorkeur van de algemene formule (1) en/of (Il) en/of (Ill) en/of (IV) R2 Da R2

N N Az Ve R1 R3 R3 X1 XI (1) (Il) R2 R1 R2

NT N / Ye / ae R3 X1 R3 X1 (IN) (IV) met de volgende definities: X1 is Sof O, X2 is S of O en ten minste een van X1 en X2 is S R2H of c1-4-aikyl, R3H of c1-4-alkyl in de algemene formules (I) en (II!) R1 zijnde H, c1-12-aiky1 of -CH2-NR4R5 met

R4-waterstof Of c1-4-alkyl, R5C1-12-koolwaterstofresidu dat één tot drie halogeenatomen en/of één tot vier hete- roatomen, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, kan bevatten, waarbij het ook mogelijk is dat R4 en R5 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt, een verza- digde of onverzadigde heterocyclische radicaal met vijf of zes leden vormen, die naar keuze ook één of twee heteroatomen, gekozen uit de groep stikstof, kan bevatten zuurstof en zwavel, in de algemene formules (Il) en (IV) is R1 H of c1-17-koolwaterstof, bij voorkeur H, of -CH2- R5 waarbij R5 H of C1-16-koolwaterstofresidu is, welke koolwaterstof één tot drie halo- geenatomen en/of één tot zes heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep stik- stof, zuurstof en zwavel, wordt gebruikt als nitrificatieremmer, bij voorkeur in combinatie met een meststof, bij voorkeur een (ammonium)stikstofnhoudende meststof, bijvoorbeeld een vaste of vloeiba- re anorganische, organische en/of organominerale meststof, of mest.

De heterocycli- sche verbinding wordt bijvoorbeeld gebruikt als nitrificatieremmer op vaste meststoffen, of wordt gebruikt als nitrificatieremmer of als stikstofstabilisator in vloeibare organische of anorganische of organominerale meststoffen of mest.

De N-heterocyclische verbindingen van de algemene formule (I) en/of (Il) en/of (III) en/of (IV) zijn meestal op zich bekend en kunnen volgens standaardtechnieken worden gesynthetiseerd.

Zij zijn gedeeltelijk in de handel verkrijgbare verbindingen en kunnen worden verkregen bij ENAMINE Ltd., UkrOrgSynthesis Ltd., of Vitas-M Laboratory, Ltd., of bij Merck Millipore, Burlington, MA, USA, of Merck KGaA.

In de algemene formules (I) en (Il) en (II!) en (IV) kunnen X1 en X2 bij voorkeur zwavel (S) zijn.

In dit geval zijn de N-heterocyclische verbindingen thiazolidine-2-thiol/thion- verbindingen of verbindingen die gemakkelijk kunnen worden gesplitst om thiazolidine- 2-thiol-verbindingen te vormen die tautomerisch zijn met thiazolidine-2-thion- verbindingen.

De eenvoudigste molecule van dit type is er een waarin in de algemene formules (1) en (III) X1 en X2 S zijn en R1, R2 en R3 waterstof zijn.

Deze verbindingen worden getoond in de voorbeelden 3 en 26 hieronder.

Als X1 zuurstof (O) is en X2 zwavel (S), zijn de verbindingen oxazolidine-2-thiol/thion- verbindingen of verbindingen die gemakkelijk kunnen worden gesplitst om oxazolidine-

2-thiol-verbindingen te vormen die tautomerisch zijn met de oxazolidine-2-thion- verbindingen.

Wanneer in de algemene formule (I) X1 zwavel (S) is en X2 zuurstof (O), is de verbin- ding een thiazolidine-2-0n-verbinding.

Bij voorkeur is in de algemene formules (I) en (II) en (II!) en (IV) X2 S en X1 is O of S, en bij voorkeur zijn X1 en X2 S. De verbindingen van algemene formule (Il) zijn bij voorkeur thiazolidine-2-thioethers die kunnen worden gesplitst om thiazolidine-2-thiolen en de tautomere thiazolidine-2- thionen te vormen.

Daarom zijn bijvoorbeeld de verbindingen van algemene formule (I) en algemene for- mule (Il) - en algemene formules (Ill) en (IV) op analoge wijze - waarin X1 en X2 S zijn, technisch met elkaar verbonden in die zin dat het "afgedekte" thiazolidine- thiolverbindingen zijn of verbindingen die een van thiazolidine-thiol afgeleide substruc- tuur bevatten. In beide substructuren kan het residu R1 worden gesplitst, waardoor de thiazolidine-thiolverbinding ontstaat.

De meest geprefereerde verbindingen zijn die van de algemene formule (I) en (Il) en (II) en (IV) waarin X1 en X2 S zijn.

Deze soorten verbindingen zijn krachtige nitrificatieremmers, bij voorkeur tegen AOB, en mogelijk ook AOA en/of comammox.

In de verbindingen van de algemene formule (I) en (II) en (II!) en (IV) is een deel van de residuen een koolwaterstofresidu. Koolwaterstofresiduen zijn samengesteld uit water- stof- en koolstofatomen. Zij kunnen verzadigd, onverzadigd of aromatisch zijn. Voorts kunnen zij de heteroatomen bevatten die hierboven zijn genoemd. De koolwaterstofre- siduen kunnen lineair, vertakt of cyclisch zijn, of kunnen ten minste één lineair of vertakt residu en ten minste één cyclisch residu in dezelfde structuur bevatten.

Als er meer dan één heteroatoom in de structuur aanwezig is, zijn heteroatomen van hetzelfde type niet direct covalent met elkaar verbonden. Bij voorkeur zijn de heteroa- tomen niet direct covalent verbonden met andere heteroatomen, maar doorsnijden Zij het koolwaterstofresidu, met uitzondering van sulfonamiden en sulfonzuurgroepen.

Daarom zijn de heteroatomen bij voorkeur niet-aangrenzend.

Daarom liggen in R5 heteroatomen van hetzelfde chemische element niet naast elkaar. Bij voorkeur zijn in R5 de heteroatomen niet direct met elkaar verbonden.

In de algemene formules (I) en (II!) kan RS ten minste één cyclische structuur bevatten.

Bij voorkeur bevat R5 een 5- of 6-ledige cyclische structuur die kan worden geannu- leerd tot een tweede 5- of 6-ledige cyclische structuur.

In totaal bevat de verbinding van de algemene formules (I) en (III) de extra cyclische structuur die in de formules (I) en (Ill) is weergegeven.

De verbinding van de algemene formules (1) en (Ill) bevat bij voorkeur twee, drie of vier cyclische structuren die bovendien al dan niet gecondenseerd of geannuleerd kunnen zijn.

De cyclische structuren zijn bij voorkeur vijf- of zesledig.

De in de algemene formu- les (1) en (Ill) afgebeelde cyclische structuur is een van de cyclische structuren die de verbinding van algemene formule (I) vormen.

In de algemene formules (Il) en (IV) kan R5 ten minste één cyclische structuur bevatten, bij voorkeur geen, één of twee cyclische structuren, bij voorkeur één of twee cyclische structuren.

Als er twee cyclische structuren in R5 aanwezig zijn, kunnen deze al dan niet gecondenseerd of geannuleerd zijn.

De cyclische structuren zijn bij voorkeur vijf- of zesledig.

Daarom bevat de verbinding van de algemene formules (II) en (IV) bij voor- keur in R5 een 5- of 6-ledige cyclische structuur die kan worden geannuleerd tot een tweede 5- of 6-ledige cyclische structuur.

De verbinding van de algemene formules (Il) en (IV) bevat bij voorkeur twee of drie cy- clische structuren, waarvan er één de in de algemene formules (Il) en (IV) afgebeelde cyclische structuur is.

De cyclische structuren in RS van de verbindingen (I) en (Il) en (II!) en (IV) kunnen car- bocyclisch of heterocyclisch zijn.

In gecondenseerde of geannelliseerde structuren kun- nen een of meer van de cyclische structuren heterocyclisch zijn.

Gecondenseerde of geannelleerde cyclische structuren zijn cyclische structuren waarbij twee cyclische structuren twee chemische elementen, bij voorkeur twee koolstofato- men, in hun respectieve ringstructuren gemeen hebben.

De cyclische structuur weergegeven in algemene formule (1) of (Il) of (II!) of (IV) kan niet worden gecondenseerd met een andere cyclische structuur.

Derhalve kunnen alleen indien naast de in algemene formule (I) of (Il) of (III) of (IV) afgebeelde cyclische struc- tuur twee cyclische structuren aanwezig zijn, deze twee extra cyclische structuren wor- den gecondenseerd.

De extra cyclische structuren kunnen verzadigd, onverzadigd of aromatisch zijn.

Indien twee gecondenseerde cyclische structuren aanwezig zijn, is het mogelijk dat één cyclische structuur aromatisch is en de andere cyclische structuur niet- aromatisch is.

Als twee extra cyclische structuren niet gecondenseerd zijn, kunnen zij direct covalent met elkaar verbonden zijn. Als alternatief kunnen zij worden verbonden door een af- standsbus die koolstofatomen, heteroatomen of beide kan bevatten. De afstandsbus kan bijvoorbeeld een C1-6-alkyleengroep zijn, een heteroatoom gekozen uit de groep bestaande uit zuurstof, zwavel en stikstof, of de afstandsbus kan bijvoorbeeld een amidogroep -C(=0)-NH- zijn. Indien de cyclische groepen verbonden zijn door een stik- stofatoom, is dit stikstofatoom bij voorkeur -NH- of -NR- waarbij R c1-4-alky is, en R bij voorkeur methyl of ethyl.

Cyclische structuren kunnen ook worden omschreven als structuurelementen die deel uitmaken van de verbindingen van de algemene formules (I) en (Il) en (II!) en (IV).

Bij voorkeur is R2 waterstof, methyl of ethyl. Bij voorkeur is R3 waterstof, methyl of ethyl. Bij voorkeur is R4 waterstof, methyl of ethyl.

Bij voorkeur zijn R2 en R3 waterstof.

R4 is bij voorkeur methyl of ethyl.

De voorkeur gaat uit naar verbindingen van algemene formule (I), waarin in algemene formule (I) R5 een C3-10-koolwaterstofresidu is dat één tot twee halogeenatomen en/of één tot drie heteroatomen kan bevatten en dat ten minste één cyclische structuur bevat.

De voorkeur gaat uit naar verbindingen van algemene formule (I), waarin in algemene formule (|) R5 een C3-8-koolwaterstofresidu is dat één tot twee halogeenatomen en/of één tot drie heteroatomen kan bevatten en dat een cyclische structuur met vijf of zes leden bevat die kan worden geannelliseerd tot een tweede cyclische structuur met vijf of zes leden.

De voorkeur gaat uit naar verbindingen van algemene formule (Il), waarin in algemene formule (Il) R1 c1-4alky Of -CH2-R5 is, met R5 C3-14-koolwaterstofresidu, dat een of twee halogeenatomen en/of twee tot zes heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof en zwavel.

De voorkeur gaat uit naar verbindingen van algemene formule (Il), waarin in algemene formule (Il) R1 methyl, ethyl of -CH2-R5 is, met R5 C5-12-koolwaterstofresidu, dat één halogeenatoom en/of twee tot vier heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof en zwavel. De halogeenatomen worden bij voorkeur ge-

kozen uit F, Cl en Br, bij voorkeur uit F en CI. Het residu R5 kan halogeenatomen bevat- ten in combinatie met heteroatomen of als alternatief voor heteroatomen.

In een bijkomende belichaming vormen R4 en RS in algemene formule (|) samen met een stikstofatoom dat hen verbindt, een 5- of bij voorkeur 6-ledig verzadigd of onverza- digd heterocyclisch radicaal. In deze belichaming vormen R4 en R5 bij voorkeur samen met een stikstofatoom dat hen verbindt een 5- of bij voorkeur 6-ledig verzadigd of on- verzadigd heterocyclisch radicaal dat naar keuze ook nog een heteroatoom kan bevat- ten dat wordt gekozen uit de groep bestaande uit stikstof en zuurstof, en dat deel kan uitmaken van een C4-16-koolwaterstofresidu dat zelf (in totaal) 1 tot 4 heteroatomen kan bevatten die worden gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof, zwavel en fluor, naast het stikstofatoom dat R4 en R5 verbindt.

Meer bij voorkeur kunnen R4 en R5 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt, het verzadigde of onverzadigde structuurelement vormen —— N 3 — N CO ——N N or or die deel kunnen uitmaken van een C4-15-koolwaterstofresidu dat naast het stikstof- atoom dat R4 en R5 verbindt, 1 tot 4 heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof, zwavel en fluor. De afgebeelde structuren kunnen dus al dan niet C=C- of C=N-bindingen bevatten.

Zij kunnen bij voorkeur deel uitmaken van een C4-13-koolwaterstofresidu, bij voorkeur C4-10-koolwaterstofresidu, bij voorkeur C7-9-koolwaterstofresidu. Dit koolwaterstofresi- du kan 1 tot 3 heteroatomen bevatten, bij voorkeur 1 of 2 heteroatomen, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof, zwavel en fluor, naast het stikstofatoom dat R4 en R5 verbindt. Verzadigde structuurelementen zoals hierboven afgebeeld genieten de voorkeur.

Volgens één belichaming van de uitvinding kan het structuurelement of de cyclische structuur één of twee extra bindingen bevatten op het structuurelement of de cyclische structuur aan koolstofatomen. Daarom kan het structuurelement of de cyclische struc- tuur één of twee substituenten bevatten die via een koolstofatoom met het structuur-

element of de cyclische structuur verbonden zijn. Deze één of twee substituenten vor- men samen met het structuurelement of de cyclische structuur het C4-16- koolwaterstofresidu, bij voorkeur C4-13-koolwaterstofresidu, meer bij voorkeur C4-10- koolwaterstofresidu, meer bepaald C7-9-koolwaterstofresidu.

Bij voorkeur kan het hierboven afgebeelde structuurelement een of twee bindingen be- vatten met andere koolstofatomen in de meta- of para-positie ten opzichte van de stik- stof van de NR4R5-groep. Meer bij voorkeur bevat het structuurelement geen andere substituenten naast de een of twee verbindingen met andere koolstofatomen op de me- ta- of para-positie met de stikstof van de NR4R5-groep.

Bij voorkeur zijn R4 en R5 elk via een koolstofatoom verbonden met de N in NRARS. In de voorbeelden worden specifieke residuen R1, R2, R3, X1/X2, R4 en R5 vermeld voor formule (l) en (Il). Elk van deze residuen kan worden gebruikt voor het beperken van de verbindingen van algemene formule (I) en (Il), ongeacht de andere residuen. Aldus kunnen de verbindingen van algemene formule (1) en (Il) één of meer van de re- siduen R1, R2, R3, R4, R5, X1 en X2 bevatten zoals vermeld in elk van de voorbeel- den. In de verbindingen van de formules (II!) en (IV) is R1 bij voorkeur waterstof, zodat de verbindingen van de formules (Ill) en (IV) tautomerische vormen van één enkele verbin- ding zijn. Bij voorkeur zijn in de verbindingen van formule (II!) en (IV), R2 en R3 water- stof, methyl of ethyl, meer bij voorkeur waterstof of methyl, specifiek waterstof. Daarom zijn in het meest geprefereerde geval van de verbindingen van formule (Ill) en (IV), X1 en X2 S en R1, R2 en R3 waterstof. Alkylresiduen kunnen lineair of vertakt zijn. Cyclische groepen in de residuen zijn bij voorkeur ringen met 5 of 6 leden die verza- digd, onverzadigd of aromatisch kunnen zijn. De ringen kunnen zuiver koolwaterstof- houdend zijn, b.v. fenylgroepen. Zij kunnen ook stikstof-, zuurstof- en/of zwavelatomen als heteroatomen bevatten, bij voorkeur stikstof- of zwavelatomen. Voorbeelden van deze residuen worden in de onderstaande voorbeelden genoemd. De verbindingen van de algemene formule (I) en (Il) en (II!) en (IV) zijn nitrificatierem- mers die de ammoniak-oxiderende bacteriën (AOB) en mogelijk ook de ammoniak- oxiderende archaea (AOA), met name Nitrosomonas europaea en/of Nitrosospira multi- formis, remmen.

De nitrificatieremmer van de onderhavige uitvinding valt met name op door het feit dat hij de nitrificatie van ammoniumstikstof in de bodem gedurende een lange periode ef- fectief remt. Verbindingen die de vorming van een thiol-tautomeer mogelijk maken, zijn zeer werk- zaam en hebben de voorkeur. Zo voldoen de 3H-1,3-thiazool-2-thiontautomeren aan respectievelijk algemene formule (Ill) en (IV), waarin R1 tot en met R3 waterstof zijn en X1 en X2 zwavel. Hieronder vallen ook de verbindingen met een labiele aminomethyl- Inker of een Hop de N in de 5-ring. De bezetting van de N in de 5-ring voorkomt moge- lijke thiolvorming, en vermindert ook de remming van de nitrificatie. Evenzo vermindert de afwezigheid van de thion-groep de activiteit. Zijgroepen op de koolstaven van de thiazol 5-ring hebben niet of nauwelijks invloed op de activiteit. Bovendien vertoont de meest essentiële substructuur, namelijk 1,3-thiazol-2-thion of afgeleid van 2-thiazoline- 2-thiol, ook een sterke nitrificatieremming in de bodem.

De respectieve hoeveelheid van elke tautomeer (evenwichtsconcentratie) kan worden verschoven door b.v. de pH van een oplossing van de verbinding op een gewenste waarde te brengen.

Bovendien werd een superieure nitrificatieremmende werking gevonden voor moleculen met een van thiazolidine-thiol afgeleide substructuur. Deze moleculen voldoen aan for- mule (Il) en zijn bij voorkeur thiazolidine-2-thioethers.

De nitrificatieremmers worden beschreven als die van de algemene formules (I) en (Il) en (II!) en (IV). Een of meer verbindingen van formule (I) of (Il) of (III) of (IV) kunnen worden gebruikt als nitrificatieremmer en in de hieronder besproken meststof. Boven- dien is het mogelijk mengsels van een of meer verbindingen van algemene formule (I) en een of meer verbindingen van algemene formule (Il) te gebruiken, alsmede meng- sels van een of meer verbindingen van ten minste twee van de algemene formules (I) tot en met (IV). Dit komt tot uiting in de uitdrukking formule (I) en/of (IV) en/of (Ill) en/of (IV).

Volgens één belichaming van de uitvinding zijn de verbindingen nr. 1-12 in de tabel op bladzijde 71 van WO 2020/020765 uitgesloten van de te gebruiken N-heterocyclische verbindingen. Verder worden de verbindingen nr. 1-11 die in WO 2020/020777 worden vermeld, bij voorkeur uitgesloten van de te gebruiken N-heterocyclische verbindingen.

Bij voorkeur worden in formule (I) verbindingen uitgesloten waarbij X1 en X2 S zijn en R1 H of CH3 of C (=O) hydrocarbyl. Hydrocarbyl is in dit geval een C1-20- koolwaterstofresidu, dat 1 tot 3 halogeenatomen en/of 1 tot 4 heteroatomen kan bevat- ten, geselecteerd uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof en zwavel.

Bij voorkeur zijn de verbindingen van algemene formule (1), R1 is niet waterstof, c1-6-alkyl en bij voorkeur is niet waterstof Of c1-12alky. Daarom is in algemene formule (I), R1 bij voorkeur -CH2-NH4R:5.

In formule (Il) is R1 bij voorkeur geen waterstof, methyl, ethyl, propagyl, C(=O)NH(fenyl), CH2C(=O)(fenyl)H+Br-, 2-methyl-4-chloorfenyl, C(FO)NH(CH2CH3). CH2C(=0)OCH3 of C(=S)N(CH3)2. Bij voorkeur is R1 in algemene formule (I) geen van de residuen die voor FN in WO 2020/020765 zijn vermeld, en is R1 in algemene formule (Il) geen van de residuen die voor RS in WO 2020/020777 zijn vermeld. De bovenstaande disclaimers hebben alle betrekking op verbindingen waarin X1 en X2 zwavel zijn. Volgens één belichaming van de uitvinding bevatten de meststofmengsels geen oxazo- lidintion, in tegenstelling tot CN 103 524 159 A. Verwacht wordt dat de nitrificatieremmer van de onderhavige uitvinding gunstige toxico- logische eigenschappen bezit, een lage dampspanning heeft en goed in de bodem wordt gesorbeerd. Dientengevolge wordt de nitrificatieremmer niet in significante mate door sublimatie in de atmosfeer uitgestoten, noch wordt hij gemakkelijk door water uit- gespoeld. Hieruit vloeien in de eerste plaats economische voordelen voort, zoals een hoge rentabiliteit gezien de langduriger werking van het nitrificatieremmer, en milieu- voordelen, zoals een vermindering van de belasting van de lucht (klimaatgasreductie) en van het oppervlakte- en grondwater. De nitrificatieremmers kunnen worden toegepast op bodems of substraten die worden bemest met een anorganische of organische of organominerale meststof. Gewoonlijk worden zij toegepast in een meststofmengsel dat een (bij voorkeur anorganische) mest- stof bevat en de N-heterocyclische verbinding van algemene formule (1) en/of (Il) en/of (II) en/of (IV). Gewoonlijk wordt de N-heterocyclische verbinding van de algemene for- mule (1) en/of (Il) en/of (III) en/of (IV) gebruikt in een hoeveelheid van 10 tot 10000 ppm per gewicht, bij voorkeur 100 tot 10000 ppm per gewicht, op basis van de (bij voorkeur anorganische) meststof zonder water. De gebruikte hoeveelheid is gebaseerd op de droge meststof.

De nitrificatieremmer volgens de onderhavige uitvinding kan worden gebruikt in stof, in oplossing, dispersie of emulsie. Daarom heeft de uitvinding ook betrekking op een op- lossing, dispersie of emulsie die de N-heterocyclische verbinding van algemene formule (I) en/of (II) en/of (III) en/of (IV) van de onderhavige uitvinding bevat, bij voorkeur in een hoeveelheid van 0,1 tot 50 wt%, bij voorkeur 0,5 tot 30 wt%, en bij voorkeur 1 tot 20 wt%.

Volgens de huidige uitvinding worden bij voorkeur anorganische meststoffen gebruikt voor de vorming van een meststofmengsel, dat verbindingen A en B bevat A. een anorganische en/of organische en/of organominerale meststof en B. 10 tot 10000 gewichtsprocenten, bij voorkeur 100 tot 10000 gewichtsprocenten, op basis van de bij voorkeur anorganische meststof, van de N-heterocyclische verbinding van algemene formule (1) en/of (Il) en/of (II!) en/of (IV) zoals hierboven gedefinieerd.

De waterfractie in verbinding A en in het meststoffenmengsel bedraagt vaak niet meer dan 1,5 wt%, bij voorkeur niet meer dan 1,0 wt%, bij voorkeur niet meer dan 0,5 wt%, bij voorkeur niet meer dan 0,3 wt%, en is in de balans van de hoeveelheden dus verwaar- loosbaar. De bestanddelen A en B vormen bij voorkeur ten minste 95 gew%, bij voor- keur ten minste 98 gew% van het meststofmengsel.

Het stikstofgehalte van component A (zonder water) bedraagt vaak ten minste 12 wt%, bij voorkeur ten minste 20 wt%, en bij voorkeur ten minste 22 wt%. Het stikstofgehalte kan bijvoorbeeld 25 tot 29 wt% bedragen, in het bijzonder 26 tot 28 wt%. Het stikstofge- halte kan worden verdeeld over snel werkende nitraatstikstof en langzaam werkende ammoniumstikstof.

De anorganische meststoffen zijn bij voorkeur ammonium- en/of ureumhoudende mest- stoffen, bij voorkeur ammoniumhoudende meststoffen die bovendien ureum kunnen bevatten.

Ureum bevattende meststoffen worden verder beschreven in WO 2016/207210. De meststoffen die volgens de onderhavige uitvinding worden gebruikt, kunnen van na- tuurlijke of synthetische oorsprong zijn en worden op de bodem of op plantweefsels aangebracht om een of meer plantenvoedingsstoffen te leveren die essentieel zijn voor de groei van planten. De meststoffen die volgens de onderhavige uitvinding worden ge-

bruikt, moeten ten minste stikstof als nutriënt leveren. Andere nutriënten zijn bijvoor- beeld K en P. Multinutriëntenmeststoffen of complexe meststoffen leveren twee of meer nutriënten. Anorganische meststoffen bevatten geen koolstofhoudende stoffen, behalve ureum. Organische meststoffen zijn meestal van planten of dieren afkomstig materiaal.

Organische minerale meststoffen (een combinatie van anorganische en organische meststoffen) kunnen eveneens worden gebruikt. De belangrijkste enkelvoudige meststof op basis van stikstof is ammoniak of oplossin- gen daarvan. Ammoniaknitraat wordt ook veel gebruikt. Ureum is een andere populaire bron van stikstof, met het voordeel dat het vast en niet-explosief is. Een andere mest- stof op basis van stikstof is calciumammoniumnitraat.

De belangrijkste enkelvoudige fosfaatmeststoffen zijn de superfosfaten, waaronder en- kelvoudig superfosfaat, fosfogips en drievoudig superfosfaat. De belangrijkste kalium- houdende enkelvoudige meststof is kaliummuriaat (MOP).

De binaire meststoffen zijn bij voorkeur NP- of NK-meststoffen, die kunnen bestaan uit monoammoniumfosfaat (MAP) en diáammoniumfosfaat (DAP).

NPK-meststoffen zijn drie-componenten-meststoffen die stikstof, fosfor en kalium leve- ren. NPK-meststoffen kunnen worden geproduceerd door het mengen van de bovenge- noemde enkelvoudige meststoffen in bulk of in korrels per stuk, zoals in Nitrophoska®. In sommige gevallen kunnen chemische reacties optreden tussen de twee of meer componenten.

Naast de hoofdbestanddelen, zoals N, P en K, kunnen micronutriënten (sporenelemen- ten) in de meststoffen aanwezig zijn. De belangrijkste micronutriënten zijn molybdeen, zink, borium en koper. Deze elementen worden meestal als in water oplosbare zouten geleverd.

De meststoffen die de voorkeur genieten, bevatten ammonium of ureum. Voorbeelden van ammoniumhoudende meststoffen die de voorkeur genieten zijn NPK-meststoffen, calciumammoniumnitraat, ammoniumsulfaatnitraat, ammoniumsulfaat en ammonium- fosfaat.

Andere geprefereerde ingrediënten van de meststofsamenstellingen zijn bijvoorbeeld spoorelementen, andere mineralen, standaardisatoren en bindmiddelen.

Organische meststoffen zijn meststoffen met een organische of biologische oorsprong, d.w.z. meststoffen die afkomstig zijn van levende of voorheen levende materialen, zoals dieren, planten of algen. Meststoffen van biologische oorsprong zijn onder meer dierlijk afval, plantaardig afval, bijvoorbeeld van de voedselverwerking of de landbouw, com- post, en behandeld zuiveringsslib (biosolids). Dierlijke bronnen kunnen mest zijn, maar ook producten van het slachten van dieren, zoals bloedmeel, beendermeel, verenmeel, huiden, hoeven en hoorns. Bodemverbeteraars, zoals turf of kokos, schors en zaagsel, kunnen ook worden toege- voegd.

Meststoffen kunnen onder meer zijn: ammoniumsulfaat, ammoniumnitraat, ammonium- sulfaatnitraat, ammoniumchloride, ammoniumbisulfaat, ammoniumpolysulfide, ammoni- umthiosulfaat, waterige ammoniak, watervrije ammoniak, ammoniumpolyfosfaat, alumi- niumsulfaat, calciumnitraat, calciumammoniumnitraat, calciumsulfaat gebrand magne- siet, calcietkalksteen, calciumoxide, hampeen (gechelateerd ijzer), dolomietkalksteen, hydraatkalk, calciumcarbonaat, diammoniumfosfaat, monoammoniumfosfaat, kaliumni- traat, kaliumbicarbonaat, monokaliumfosfaat, magnesiumnitraat, magnesiumsulfaat, kaliumsulfaat, kaliumchloride, natriumnitraten, magnesische kalksteen, magnesia, dina- triumdihydromolybdaat, kobaltchloride-hexahydraat, nikkelchloride-hexahydraat, indool- boterzuur, L-tryptofaan, ureum, ureum-formaldehyden, ureum-ammoniumnitraat, ureum met zwavelcoating, ureum met polymeercoating, isobutylideendiureum, K2SO4- 2MgSO4, kainiet, sylviniet, kieseriet, Epsomzouten, elementaire zwavel, mergel, gema- len oesterschelpen, vismeel, oliekoeken, vismest, bloedmeel, rotsfosfaat, superfosfaten, slakken, beendermeel, houtas, biochar, algen, algenextract, struviet, mest, vleermuis- guano, turfmolm, compost, groen zand, katoenzaadmeel, verenmeel, krabmeel, visemulsie of een combinatie daarvan. Het micronutriëntenmeststofmateriaal kan boor- zuur, een boraat, een boorfrit, kopersulfaat, een kopersfrit, een koperchelaat, een natri- umtetraboraatdecahydraat, een ijzersulfaat, een ijzeroxide, ijzerammoniumsulfaat, een jzersfrit, een ijzerchelaat, een mangaansulfaat, een mangaansulfaat, een ijzeroxide, een ijzeroxide, een ijzerchelaat of een combinatie daarvan bevatten, mangaansulfaat, mangaanoxide, mangaanchelaat, mangaanchloride, mangaanfrit, natriummolybdaat, molybdizuur, zinksulfaat, zinkoxide, zinkcarbonaat, zinkfrit, zinkfosfaat, zinkchelaat of een combinatie daarvan. In een bijzondere belichaming bevat genoemde meststof of meststofsamenstelling geen onoplosbaar selenium, seleniummineraal, oplosbaar sele- nium of zouten daarvan.

De behandelde (anorganische, organische of organominerale) meststoffen volgens de uitvinding zijn bij voorkeur aanwezig in poedervorm, in prilvorm of in korrelvorm.

Naast de N-heterocyclische verbinding van de algemene formule (I) en/of (Il) kunnen formuleringen die de verbinding en agronomische hulpstoffen bevatten, worden gebruikt om de nitrificatieremmer in de meststof op te nemen.

Agronomische hulpstoffen zijn bijvoorbeeld oplosmiddelen, dispergeermiddelen, pH-regelaars, vulstoffen, stabiliteits- verbeteraars, oppervlakte-actieve stoffen.

De nitrificatieremmer kan in het meststoffenmengsel worden opgenomen door het mengsel of de formulering die het bevat te mengen met een vaste of vloeibare meststof of meststofformulering.

Bij voorkeur is het meststofmengsel in vaste vorm en wordt de nitrificatieremmer op het oppervlak van de (anorganische, organische of organinerale) meststof aangebracht.

In een proces voor de productie van het meststofmengsel van de onderhavige uitvin- ding kan de nitrificatieremmer of de formulering die deze bevat, worden ingebracht in de (anorganische, organische of organominerale) meststof en/of worden aangebracht op het oppervlak van de anorganische meststof.

Mestkorrels worden geïmpregneerd of bedekt met de nitrificatieremmer, bijvoorbeeld door ze te besproeien met een formulering zoals een oplossing of een dispersie van de nitrificatieremmer en ze vervolgens te drogen.

De methode is bijvoorbeeld bekend uit DE-A-41 28 828. Het verzegelen van de geïmpregneerde korrels met bijvoorbeeld pa- raffinewas, een aanvullend voorstel in laatstgenoemd document, is mogelijk, maar in het algemeen niet nodig.

Granulerende hulpstoffen die kunnen worden gebruikt voor de bereiding van vaste meststofsamenstellingen kunnen kalk, gips, siliciumdioxide of kaoliniet zijn.

Een alternatief is de toevoeging van de nitrificatieremmer tijdens de eigenlijke productie van de meststof, bijvoorbeeld in de drijfmest.

In de regel worden nitrificatieremmers in de bodem toegepast in hoeveelheden van 100 g/ha tot 10 kg/ha.

Bij voorkeur ligt de hoeveelheid tussen 300 g/ha en 5 kg/ha.

De toediening van de nitrificatieremmer in vloeibare meststofformuleringen kan bijvoor- beeld geschieden door fertigatie met of zonder overmaat water, zoals beschreven in DE-C-102 30 593.

Het meststofmengsel kan ten minste één extra nitrificatieremmer bevatten. Deze ten minste één nitrificatieremmer remt bij voorkeur de ammoniakoxiderende bacteriën (AOB) en wordt bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit 2-(3,4-dimethyl- pyrazol-1-yl)-barnsteenzuur, 3,4-dimethylpyrazool (DMP), 3,4-dimethylpyrazoolfosfaat (DMPP), dicyaandiamide (DCD), 1H-1,2,4-triazool, 3-methylpyrazool (3-MP), 2-chloor- 6-(trichloormethyl)-pyridine, 5-ethoxy-3-trichlo romethyl-1,2,4-thiadiazol, 2-amino-4- chloor-6-methyl-pyrimidine, 2-mercapto-benzothiazool, 2-sulfanilamidothiazool, thiou- reum, natriumazide, kaliumazide, 1-hydroxypyrazool, 2-methyl-pyr razool-1- carboxamide, 4-amino-1,2,4-triazool, 3-mercapto-1,2,4-triazool, 2.,4-diamino-6-trichlo - romethyl-5-triazine, koolstofbisulfide, ammoniumthiosulfaat, natriumtriocarbonaat, 2,3- diny dro-2,2-dimethyl-7-benzofuanolmethylcarbamaat en N-(2,6-dimethylfenyl)-N- (methoxya cetyl)-alanine-methylester. Ook nitrificatieremmers die ammoniakoxiderende archaea (AOA) remmen, kunnen tezamen met de N-heterocyclische verbinding van al- gemene formule (1) worden gebruikt.

Wanneer de aanvullende nitrificatieremmer wordt gebruikt, is de gewichtsverhouding tussen de N-heterocyclische verbinding van algemene formule (I) en/of (Il) en/of (III) en/of (IV) en de aanvullende nitrificatieremmer bij voorkeur 0,1 tot 10 : 1, bij voorkeur 0,2 tot 5 : 1, en het meest bij voorkeur 0,5 tot 2 : 1.

Voorts kan het meststofmengsel ten minste één ureaseremmer bevatten, die bij voor- keur wordt gekozen uit N-n-butylthiofosforzuur-triamide (NBTPT) en/of N-n- propylthiofosforzuur-triamide (NPTPT). Een ureaseremmer wordt gewoonlijk toege- voegd wanneer de meststof ureum bevat. Stikstof uit ureum komt door de werking van urease vrij in de vorm van ammonium, en het ammonium kan nitrificatie ondergaan. Daarom kan het voordelig zijn om een ureaseremmer te combineren met de nitrificatie- remmer.

Indien de N-heterocyclische verbinding van algemene formule (I) en/of (Il) en/of (III) en/of (IV) van de onderhavige uitvinding gecombineerd wordt met N-n- butylthiofosfortriamide (NBTPT) en/of N-n-propylthiofosfortriamide (NPTPT), ligt de ge- wichtsverhouding tussen nitrificatieremmer(s) en ureaseremmer bij voorkeur tussen 0,1 en 10:1, bij voorkeur tussen 0,5 en 8 : 1, en bij voorkeur tussen 1 en 6 : 1.

Van thiofosfortriamiden is bekend dat zij betrekkelijk gemakkelijk worden omgezet in de overeenkomstige fosfortriamiden en thiofosfortdiamiden, alsmede in andere metabolie- ten. Aangezien vocht in het algemeen niet volledig kan worden uitgesloten, zijn thiofos-

forhoudende triamiden en de overeenkomstige fosforhoudende triamiden vaak in een mengsel met elkaar aanwezig. In deze specificatie worden daarom met de term “(thio)fosforzuurtriamide" niet alleen de zuivere thiofosforzuurtriamiden, respectievelijk fosforzuurtriamiden aangeduid, maar ook mengsels daarvan.

Volgens de onderhavige uitvinding kunnen ook mengsels van N-n- butyl)thiofosfortriamide en N-(n-)propylthiofosfortriamide worden gebruikt, zoals be- schreven in EP-A-1 820 788.

De meststofmengsels kunnen andere ingrediënten bevatten, zoals coatings, bijvoor- beeld van anorganische of organische polyzuren, die worden beschreven in US

6.139.596. Verder kunnen coatings van poeders, prils en granules worden gevormd van anorga- nisch materiaal, zoals coatings op zwavel- of mineraalbasis, of met een organisch po- lymeer. Respectieve coatings worden beschreven in WO 2013/121384 op pagina 23, regel 37 tot pagina 24, regel 16. Zoals hierboven vermeld, worden de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (1) en/of (Il) bevatten, gebruikt in "effectieve hoeveelheden". Dit betekent dat zij worden gebruikt in een hoeveelheid die het mogelijk maakt het gewenste effect te verkrijgen, namelijk een (synergistische) verbetering van de gezondheid van een plant, maar die geen aanleiding geeft tot fytotoxische symptomen op de behandelde plant. Voor gebruik volgens de onderhavige uitvinding kunnen de agrochemische formulerin- gen die de verbindingen van formule (1) en/of (Il) en/of (Ill) en/of (IV) bevatten, worden omgezet in de gebruikelijke formuleringen, bijvoorbeeld oplossingen, emulsies, suspen- sies, stofdeeltjes, poeders, pasta's en granules. De gebruiksvorm hangt af van het spe- cifieke beoogde doel; in elk geval moet het zorgen voor een fijne en gelijkmatige verde- ling van de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (1) en/of (Il) en/of (Ill) en/of (IV) bevatten volgens de onderhavige uitvinding. De formuleringen wor- den op een voor de vakman bekende wijze bereid. De agrochemische formuleringen kunnen ook hulpstoffen bevatten die gebruikelijk zijn in agrochemische formuleringen. Welke hulpstoffen worden gebruikt, hangt af van res- pectievelijk de specifieke toepassingsvorm en de werkzame stof. Voorbeelden van ge- schikte hulpstoffen zijn oplosmiddelen, vaste dragers, dispergeermiddelen of emulgato-

ren (zoals verdere oplosbaarheidsbevorderende stoffen, beschermende colloïden, op- pervlakteactieve stoffen en adhesiemiddelen), organische en anorganische verdik- kingsmiddelen, bactericiden, antivriesmiddelen, antischuimmiddelen, eventueel kleur- stoffen en tackifieermiddelen of bindmiddelen (bijvoorbeeld voor formuleringen voor zaadbehandeling). Geschikte oplosmiddelen zijn water, organische oplosmiddelen zoals minerale oliefrac- ties met een gemiddeld tot hoog kookpunt, zoals kerosine of dieselolie, voorts koolteer- olie en oliën van plantaardige of dierlijke oorsprong, alifatische, cyclische en aromati- sche koolwaterstoffen, bijv. tolueen, xyleen, paraffine, tetrahydronaftaleen, gealkyleerde naftalenen of derivaten daarvan, alcoholen zoals methanol, ethanol, propanol, butanol en cyclohexanol, glycolen, ketonen zoals cyclohexanon en gamma-butyrolacton, dime- thylamiden van vetzuren, vetzuren en esters van vetzuren en sterk polaire oplosmidde- len, bijvoorbeeld aminen zoals N-methylpyrrolidon.

Vaste dragers zijn minerale aardmetalen zoals silicaten, silicagels, talk, kaolien, kalk- steen, krijt, keileem, löss, klei, dolomiet, diatomeeënaarde, calciumsulfaat, magnesium- sulfaat, magnesiumoxide, gemalen synthetische stoffen, meststoffen, zoals bv.ammoniumsulfaat, ammoniumfosfaat, ammoniumnitraat, ureum en producten van plantaardige oorsprong, zoals graanmeel, boomschorsmeel, houtmeel en notenscha- lenmeel, cellulosepoeders en andere vaste dragers.

Geschikte oppervlakte-actieve stoffen (hulpstoffen, bevochtigers, tackifiers, disper- geermiddelen of emulgeermiddelen) zijn alkalimetaal-, aardalkalimetaal- en ammonium- zouten van aromatische sulfonzuren, zoals ligninesulfonzuur, fenolsulfonzuur, nafta- leensulfonzuur, dibutylnaftaleensulfonzuur en vetzuren alkylsulfonaten, alkyl- arylsulfonaten, alkylsulfaten, laurylether-sulfaten, vetalcoholsulfaten en gesulfateerde hexa- hepta- en octadecanolaten, gesulfateerde vetalcoholglycolethers, voorts conden- saten van naftaleen of van naftaleensulfonzuur met fenol en formaldehyde polyoxy- ethyleen-octylfenylether, geëthoxyleerd isooctylfenol, octylfenol, nonylfenol, alkylfenyl- polyglycolethers, tributylfenylpolyglycolether, tristearylfenylpolyglycolether, alkylarylpo- lyetheralcoholen, alcohol- en vetalcohol/ethyleenoxidecondensaten, geëthoxyleerde ricinusolie, polyoxyethyleenalkylethers, geëthoxyleerd polyoxypropyleen, laurylalcohol- polyglycoletheracetaal, sorbitolesters, lignine-sulfietafvalvloeistof en eiwitten, gedenatu- reerde eiwitten, polysacchariden (bijv.b.v. methylcellulose), hydrofoob gewijzigd zet- meel, polyvinylalcoholen, polycarboxylaten, polyalkoxylaten, polyvinylamines, polyvinyl-

pyrrolidon en de copolymeren daarvan. Voorbeelden van verdikkingsmiddelen (d.w.z. verbindingen die aan formuleringen een gewijzigde vloeibaarheid verlenen, d.w.z. een hoge viscositeit onder statische omstandigheden en een lage viscositeit bij agitatie) zijn polysacchariden en organische en anorganische klei zoals Xanthaangom.

Een "pesticide" is iets dat een schadelijk organisme ("plaag") of een ziekte voorkomt, vernietigt of onder controle houdt, of planten of plantaardige producten beschermt tij- dens de productie, de opslag en het vervoer.

De term omvat onder meer: herbiciden, fungiciden, insecticiden, acariciden, nematici- den, molluskiciden, rodenticiden, groeiregulatoren, afweermiddelen, rodenticiden en biociden, alsmede gewasbeschermingsmiddelen.

Gewasbeschermingsmiddelen zijn "pesticiden" die gewassen of gewenste of beoogde planten beschermen. Zij worden hoofdzakelijk gebruikt in de landbouwsector, maar ook in de bosbouw, de tuinbouw, in recreatiegebieden en in tuinen voor eigen gebruik. Zij bevatten ten minste één werkzame stof en hebben een van de volgende functies: -planten of plantaardige producten te beschermen tegen plagen/ziekten, voor of na de oogst; -beïnvloeden de levensprocessen van planten (zoals stoffen die hun groei beïnvloe- den, met uitzondering van voedingsstoffen), -plantaardige producten te bewaren ; -het vernietigen of voorkomen van de groei van ongewenste planten of delen van planten.

Zij kunnen ook andere bestanddelen bevatten, waaronder beschermstoffen en synergis- tische middelen.

Een werkzame stof is een chemische stof, een plantenextract, een feromoon of een micro-organisme (met inbegrip van virussen), die werkzaam is tegen "schadelijke orga- nismen" of op planten, delen van planten of plantaardige producten.

Het meest gebruikelijke gebruik van pesticiden is in de vorm van gewasbeschermings- middelen (GBP's).

De term "pesticide" wordt vaak door elkaar gebruikt met "gewasbeschermingsmiddel", maar pes-ticide is een bredere term die ook andere toepassingen dan plant/gewas om- vat, bijvoorbeeld biociden.

Biociden, zoals herbiciden, bactericiden, mollusciciden, algiciden, fytotoxische stoffen, fungiciden, en mengsels daarvan kunnen worden toegevoegd.

Ter conservering en stabilisering van de formulering kunnen bactericiden worden toe- gevoegd.

Voorbeelden van geschikte bactericiden zijn die op basis van dichlorofeen en benzylalcohol hemi-formal (Proxel® van ICI of Acticide® RS van Thor Chemie en Ka- thon® MK van Rohm & Haas) en isothiazolinone-derivaten zoals alkylisothiazolinonen en benzisothiazolinonen (Acticide® M BS van Thor Chemie). Voorbeelden van geschik- te antivriesmiddelen zijn ethyleenglycol, propyleenglycol, ureum en glycerine.

Voorbeel- den voor antischuimmiddelen zijn siliconenemulsies (zoals bijvoorbeeld Silikon® SRE, Wacker, Duitsland of Rhodorsil®, Rhodia, Frankrijk), langketenalcoholen, vetzuren, zouten van vetzuren, fluororganische verbindingen en agrochemische formuleringen die verbindingen van formule (I) of (Il) daarvan bevatten.

Geschikte kleurstoffen zijn pigmenten met een lage oplosbaarheid in water en in oplos- middelen oplosbare, bv. in water oplosbare, kleurstoffen.

Voorbeelden van adhesiepromotoren, zoals tackifiers of binders, zijn polyvinylpyrroli- dons, polyvinylacetaten, polyvinylalcoholen en cellulose-ethers (Tylose®, Shin-Etsu, Japan). Granulaten, bijvoorbeeld gecoate granulaten, geïmpregneerde granulaten en homoge- ne granulaten, kunnen worden bereid door de werkzame stoffen aan vaste dragers te binden.

Voorbeelden van vaste dragers zijn minerale aardes zoals silicagels, silicaten, talk, kaolien, attaclay, kalksteen, kalk, krijt, bole, löss, klei, dolomiet, diatomeeënaarde, calciumsulfaat, magnesiumsulfaat, magnesiumoxide, gemalen synthetische stoffen, meststoffen, zoals bijv, ammoniumsulfaat, ammoniumfosfaat, ammoniumnitraat, ureum, en producten van plantaardige oorsprong, zoals graanmeel, boomschorsmeel, hout- meel en notenschalenmeel, cellulosepoeders en andere vaste dragers.

Antiklontermiddelen zoals oliën en/of wassen kunnen worden toegevoegd.

De agrochemische formuleringen bevatten over het algemeen tussen 0,01 en 95%, bij voorkeur tussen 0,1 en 90%, en het meest bij voorkeur tussen 0,5 en 90%, in gewicht aan werkzame stoffen.

De verbindingen van de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (|) bevatten, worden gebruikt in een zuiverheid van 90% tot 100%, bij voorkeur van 95% tot 100% (volgens hun NMR-spectrum).

De verbindingen van de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (I) of (II) of (III) of (IV) bevatten, kunnen als zodanig of in de vorm van hun landbouw- kundige samenstellingen worden gebruikt, b.v. in de vorm van rechtstreeks vernevelba- re oplossingen, poeders, suspensies, dispersies, emulsies, oliedispersies, pasta's, stuifbare producten, strooimiddelen of granulaten, door middel van verstuiven, verstui- ven, verstuiven, uitspreiden, afborstelen, onderdompelen of gieten. De toepassingsvor- men hangen volledig af van de beoogde doeleinden; het is de bedoeling om in elk geval te zorgen voor een zo goed mogelijke verdeling van de verbindingen die aanwezig zijn in de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (I) of (Il) of (III) of (IV) bevatten. Waterige toepassingsvormen kunnen worden bereid uit emulsieconcentraten, pasta's of bevochtigbare poeders (verspuitbare poeders, oliedispersies) door toevoeging van wa- ter. Voor de bereiding van emulsies, pasta's of oliedispersies kunnen de stoffen, als zodanig of opgelost in een olie of oplosmiddel, in water worden gehomogeniseerd met behulp van een bevochtiger, tackifieerder, dispergeermiddel of emulgator. Als alternatief kunnen concentraten worden bereid die bestaan uit een werkzame stof, een bevochti- gingsmiddel, een tackifieermiddel, een dispergeermiddel of een emulgator en eventueel een oplosmiddel of olie, en dergelijke concentraten zijn geschikt om met water te wor- den verdund. De concentraties van de werkzame stoffen in de gebruiksklare preparaten kunnen bin- nen betrekkelijk ruime marges worden gevarieerd. In het algemeen liggen zij tussen 0,0001 en 10%, bij voorkeur tussen 0,001 en 1%, van het gewicht van de verbindingen van de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (I) of (II) of (II!) of (IV) bevatten. De agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (I) bevatten, kunnen ook met succes worden gebruikt in het ultra-lage-volume-proces (ULV), waarbij het mo- gelijk is om composities toe te passen die meer dan 95 gewichtspercenten werkzame stof bevatten, of zelfs om de werkzame stof zonder additieven toe te passen. Verschillende soorten oliën, bevochtigers, hulpstoffen, herbiciden, fungiciden, andere pesticiden, of bactericiden kunnen aan de actieve verbindingen worden toegevoegd, eventueel pas vlak voor het gebruik (tankmix). Deze middelen kunnen worden gemengd met de verbindingen van de agrochemische formuleringen die bestaan uit de verbindin- gen van formule (I) of (Il) of (II!) of (IV) in een gewichtsverhouding van 1:100 tot 100:1, bij voorkeur 1:10 tot 10:1. De samenstellingen van deze uitvinding kunnen ook meststoffen (zoals ammoniumni- traat, ureum, kalium en superfosfaat), fytotoxische stoffen en plantengroeiregulatoren (plant growth amendments) en beschermstoffen bevatten. Deze kunnen achtereenvol- gens of in combinatie met de hierboven beschreven samenstellingen worden gebruikt, eventueel ook pas vlak voor het gebruik toegevoegd (tankmix). De plant(en) kan (kun- nen) bijvoorbeeld met een samenstelling van deze uitvinding worden besproeid, hetzij vóór, hetzij na de behandeling met de meststoffen.

In de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (I) of (Il) of (III) of (IV) bevatten, hangt de gewichtsverhouding van de verbindingen in het algemeen af van de eigenschappen van de verbindingen van de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (1) of (Il) of (II!) of (IV) bevatten.

De agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (1) of (Il) of (III) of (IV) bevatten, kunnen afzonderlijk worden gebruikt of reeds geheel of gedeeltelijk met elkaar worden vermengd om de samenstelling volgens de uitvinding te bereiden. Zij kunnen ook worden verpakt en verder worden gebruikt als combinatiesamenstelling zoals een "kit of parts".

De gebruiker brengt de samenstelling volgens de uitvinding gewoonlijk aan vanuit een voordoseertoestel, een rugspuit, een spuittank of een sproeivliegtuig. Hierbij wordt de agrochemische samenstelling aangemaakt met water en/of buffer tot de gewenste toe- passingsconcentratie, waarbij eventueel nog andere hulpstoffen kunnen worden toege- voegd, en aldus wordt de gebruiksklare spuitvloeistof of de agrochemische samenstel- ling volgens de uitvinding verkregen. Gewoonlijk wordt 50 tot 500 liter gebruiksklare spuitvloeistof per hectare nuttig landbouwareaal toegediend, bij voorkeur 50 tot 400 Ii- ter.

In een bepaalde belichaming wordt de absolute hoeveelheid van de werkzame stoffen, vertegenwoordigd door formule (I) of (II) of (Ill) of (IV), gebruikt in een bereik tussen 1 mg/liter en 100 mg/liter, in het bijzonder in een bereik tussen 1 mg/liter en 20 mg/liter, in het bijzonder in een bereik tussen 1 mg/liter en 25 mg/liter in het bijzonder tussen 2 mg/l en 200 mg/l, in het bijzonder tussen 2 mg/l en 100 mg/l, in het bijzonder tussen 2 mg/l en 50 mg/l, in het bijzonder tussen 2 mg/l en 25 mg/l, in het bijzonder tussen 4 mg/l en

40 mg/l, in het bijzonder tussen 4 mg/l en 20 mg/l, in het bijzonder tussen 4 mg/l en 16 mg/l, in het bijzonder tussen 4 mg/l en 12 mg/l.

Volgens één belichaming kunnen de afzonderlijke verbindingen van de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (I) of (Il) of (II!) of (IV) bevatten en die zijn geformuleerd als samenstelling (of formulering), zoals delen van een kit of delen van het inventieve mengsel, door de gebruiker zelf worden gemengd in een spuittank en kunnen verdere hulpstoffen worden toegevoegd, indien van toepassing (tankmeng- sel). Onder "agrochemisch middel" wordt hier verstaan: elke werkzame stof die in de agro- chemische industrie kan worden gebruikt (met inbegrip van toepassingen in de land- bouw, de tuinbouw, de bloementeelt en voor gebruik in huis en tuin, maar ook pro- ducten die bestemd zijn voor niet-gewasgebonden toepassingen zoals toepassingen ter bestrijding van ongewenste insecten en knaagdieren in het kader van de volksgezond- heid/bestrijding van ongedierte, huishoudelijk gebruik, zoals fungiciden en insecticiden voor huishoudelijk gebruik, en middelen ter bescherming van planten of delen van plan- ten, gewassen, bollen, knollen, vruchten (bijv.b.v. tegen schadelijke organismen, ziek- ten of plagen), voor het onder controle houden, bij voorkeur bevorderen of doen toene- men van de groei van planten; en/of voor het bevorderen van de opbrengst van planten, gewassen of de delen van planten die worden geoogst (b.v. de vruchten, bloemen, za- den enz.). Een "agrochemische samenstelling" zoals hier gebruikt, is een samenstelling voor agro- chemisch gebruik, zoals hier gedefinieerd, die ten minste één werkzame stof van een verbinding van formule (I) bevat, eventueel met één of meer additieven die een optimale dispersie, atomisering, depositie, bevochtiging van de bladeren, distributie, retentie en/of opname van agrochemische middelen bevorderen.

Dergelijke additieven zijn bij- voorbeeld verdunningsmiddelen, oplosmiddelen, hulpstoffen, oppervlakte-actieve stof- fen, bevochtigingsmiddelen, spreidingsmiddelen, oliën, stickers, viscositeitsregelaars (zoals verdikkingsmiddelen, penetranten), pH-regelaars (zoals buffers, aanzuringsmid- delen), antizinkmiddelen, antivriesmiddelen, fotobeschermingsmiddelen, antischuim- middelen, biociden en/of driftremmers.

Een "drager", zoals hierin gebruikt, is een vaste, halfvaste of vloeibare drager waarin of waarop een werkzame stof op geschikte wijze kan worden opgenomen, geïmmobili- seerd, geïmmobiliseerd, geadsorbeerd, geabsorbeerd, gebonden, ingekapseld, inge-

bed, bevestigd of gecomprimeerd.

Niet-limiterende voorbeelden van dergelijke dragers zijn nanocapsules, microcapsules, nanosferen, microsferen, nanodeeltjes, microdeel- ties, liposomen, blaasjes, parels, een gel, zwakke ionische harsdeeltjes, liposomen, cochleaat-afleveringsvehikels kleine korrels, granulaten, nanobuisjes, bucky-balletjes,

waterdruppeltjes die deel uitmaken van een water-in-olie-emulsie, oliedruppeltjes die deel uitmaken van een olie-in-water-emulsie, organische materialen zoals kurk, hout of andere materialen van plantaardige oorsprong (bv.bijvoorbeeld in de vorm van zaad- doppen, houtspaanders, pulp, bolletjes, kralen, vellen of enige andere geschikte vorm), papier of karton, anorganische materialen zoals talk, klei, microkristallijne cellulose, sili-

ca, aluminiumoxide, silicaten en zeolieten, of zelfs microbiële cellen (zoals gistcellen) of geschikte fracties of fragmenten daarvan.

De termen "effectieve hoeveelheid", "effectieve dosis" en "effectieve hoeveelheid", zo- als hier gebruikt, betekenen de hoeveelheid die nodig is om het gewenste resultaat of de gewenste resultaten te bereiken.

Meer exemplarische informatie over hoeveelheden, toepassingswijzen en te gebruiken geschikte verhoudingen wordt hieronder gegeven.

De vakman is zich terdege bewust van het feit dat een dergelijke hoeveelheid kan vari- eren in een breed bereik en afhankelijk is van diverse factoren zoals de behandelde cultuurplant en de klimatologische en bodemomstandigheden.

De hier gebruikte termen "bepalen", "meten", "beoordelen", "controleren" en "analyse- ren" zijn onderling verwisselbaar en omvatten zowel kwantitatieve als kwalitatieve bepa- Ingen.

Het is duidelijk dat de agrochemische samenstelling stabiel is, zowel tijdens opslag als tijdens gebruik, wat betekent dat de integriteit van de agrochemische samenstelling be- houden blijft onder opslag- en/of gebruiksomstandigheden van de agrochemische sa- menstelling, die verhoogde temperaturen, vries-dooicycli, veranderingen in pH of in io- nensterkte, UV-straling, aanwezigheid van schadelijke chemicaliën en dergelijke kun- nen omvatten.

Meer bij voorkeur blijven de verbindingen van formule (I), (Il), (I), (IV) zoals hier beschreven stabiel in de agrochemische samenstelling, wat betekent dat de integriteit en de activiteit van de verbindingen behouden blijven onder opslag- en/of ge- bruiksomstandigheden van de agrochemische samenstelling, die verhoogde tempera- turen, vries-dooicycli, veranderingen in de pH of in de ionensterkte, UV-straling, aanwe- zigheid van schadelijke chemicaliën en dergelijke kunnen omvatten.

Bij voorkeur blijven de verbindingen van formule (1), (II), (II), (IV) stabiel in de agrochemische samenstel-

Ing wanneer de agrochemische samenstelling wordt opgeslagen bij omgevingstem- peratuur gedurende een periode van twee jaar of wanneer de agrochemische samen- stelling wordt opgeslagen bij 54°C gedurende een periode van twee weken. Bij voor- keur behoudt de agrochemische samenstelling van de onderhavige uitvinding ten min- ste ongeveer 70% activiteit, bij voorkeur ten minste ongeveer 70% tot 80% activiteit, bij voorkeur ongeveer 80% tot 90% activiteit of meer. Voorbeelden van geschikte draag- stoffen zijn onder meer alginaten, gommen, zetmeel, B-cyclodextrinen, cellulosen, poly- ureum, polyurethaan, polyester of klei.

De agrochemische samenstelling kan in om het even welke formulering voorkomen; de voorkeur gaat uit naar poeders, bevochtigbare poeders, bevochtigbare granulaten, in water dispergeerbare granulaten, emulsies, emulgeerbare concentraten, stof, suspen- sies, suspensieconcentraten, suspoemulsies, capsulesuspensies, waterige dispersies, oliedispersies, aërosolen, pasta's, schuim, slurries of vloeibaar gemaakte concentraten. In weer een andere belichaming voorziet de uitvinding in het gebruik van de agrochemi- sche samenstellingen van de uitvinding voor het verhogen van de abiotische stresstole- rantie bij planten.

De agrochemische samenstelling volgens de uitvinding kan eenmaal op een gewas worden toegepast, maar kan ook twee of meer keren na elkaar worden toegepast met een interval tussen elke twee toepassingen. De agrochemische samenstelling volgens de uitvinding kan alleen of in combinatie met andere materialen, bij voorkeur andere agrochemische samenstellingen, op het gewas worden aangebracht; als alternatief kan de agrochemische samenstelling volgens de uitvinding afzonderlijk op het gewas wor- den aangebracht met andere materialen, bij voorkeur andere agrochemische samen- stellingen, die op verschillende tijdstippen op hetzelfde gewas worden aangebracht.

In weer een andere belichaming voorziet de uitvinding in een methode voor de vervaar- diging van ("of de productie van" hetgeen gelijkwaardig is aan verwoording) een agro- chemische samenstelling volgens de uitvinding, bestaande uit de formulering van een molecuul van formule (I) of (Il) of (Ill) of (IV) als hiervoor gedefinieerd, samen met ten minste één gebruikelijke agrochemische hulpstof. Geschikte fabricagemethoden zijn bekend in de kunst en omvatten, maar zijn niet beperkt tot, mengen met hoge of lage afschuifsnelheid, nat of droog malen, druipgieten, inkapselen, emulgeren, coaten, en- crusteren, pilling, extrusiegranulatie, wervelbedgranulatie, co-extrusie, sproeidrogen, sproeikoelen, verneveling, additie- of condensatiepolymerisatie, interfaciale polymerisa-

tie, polymerisatie in situ, coacervatie, sproei-inkapseling, afkoeling van gesmolten dis- persies, verdamping van oplosmiddelen, fasescheiding, solventextractie, sol- gelpolymerisatie, bekleding met een vloeistofbed, bekleding met een pan, smelten, pas- sieve of actieve absorptie of adsorptie.

De gebruikelijke agrochemische hulpstoffen zijn algemeen bekend en omvatten bij voorkeur, maar zijn niet beperkt tot, waterige en/of organische oplosmiddelen, pH- regelaars (zoals buffers, zuurteregelaars), oppervlakteactieve stoffen, bevochtigings- middelen, spreidingsmiddelen, adhesiebevorderaars (zoals tackifiers, stickers), draag- stoffen, vulstoffen, viscositeitsregelaars (zoals verdikkingsmiddelen), emulgatoren, dis- pergeermiddelen, sequestreermiddelen, antizinkmiddelen, coalescentiemiddelen, reolo- gieversterkers, antischuimmiddelen, fotobeschermers, antivriesmiddelen, biostimulan- ten (met inbegrip van bacteriële en/of schimmelinoculanten of micro-organismen), bio- ciden (bij voorkeur geselecteerd uit herbiciden, bactericiden, fytotoxische stoffen, fungi- ciden, pesticiden en mengsels daarvan), plantengroeiregulatoren, beschermstoffen, penetrerende stoffen, antiklontermiddelen, minerale en/of plantaardige oliën en/of was- sen, kleurstoffen en driftwerende stoffen of een geschikte combinatie daarvan.

Het insecticide kan bestaan uit een organofosfaat, een carbamaat, een pyrethroïde, een acaricide, een alkylftalaat, boorzuur, een boraat, een fluoride, zwavel, een haloaroma- tisch gesubstitueerd ureum, een koolwaterstofester, een insecticide op biologische ba- sis of een combinatie daarvan. Het herbicide, dat wordt gebruikt om ongewenste plan- ten te verwijderen, kan een chloorfenoxyverbinding, een nitrofenolverbinding, een nitro- cresolverbinding, een dipyridylverbinding, een acetamide, een alifatische acide, een anilide, een benzamide, een benzoëzuur, een benzoëzuurderivaat, anijszuur, een anijs- zuurderivaat, een benzonitril, benzothiadiazinon-dioxide, een thiocarbamaat, een car- bamaat, een carbanilaat, een chloropyridilaat of een combinatie daarvan bevatten, car- banilaat, chlooropyridinyl, een cyclohexenon derivaat, een dinitroaminobenzeen deri- vaat, een fluorodinitrotoluidine verbinding, isoxazolidinon, nicotinezuur acide, isopro- pylamine, een isopropylaminederivaat, oxadiazolinon, een fosfaat, een ftalaat, een pico- linezuurverbinding, een triazine, een triazool, een uracil, een ureumderivaat, endothall, natriumchloraat, of een combinatie daarvan. Het fungicide kan bestaan uit een gesubsti- tueerd benzeen, een thiocarbamaat, een ethyleen-bis-dithiocarbamaat, een thiofthali- damide, een koperverbinding, een organische kwikverbinding, een organotinverbinding, een cadmiumverbinding, anilazine, benomyl, cyclohexamide, dodine, etridiazool, iprodi- on, metlaxyl, thiamimefon, triforine, of een combinatie daarvan. De schimmelinoculant kan bestaan uit een schimmelinoculant van de familie Glomeraceae, een schim- melinoculant van de familie Claroidoglomeraceae, een schimmelinoculant van de fami- lie Acaulosporaceae, een schimmelinoculant van de familie Sacculospraceae een schimmelinoculant van de familie Entrophosporaceae, een schimmelinoculant van de familie Pacidsproraceae, een schimmelinoculant van de familie Diversisporaceae, een schimmelinoculant van de familie Paraglomeraceae, een schimmelinoculant van de fa- milie Archaeosporaceae een schimmelinoculant van de familie Geosiphonaceae, een schimmelinoculant van de familie Ambisporacea, een schimmelinoculant van de familie Scutellosproaceae, een schimmelinoculant van de familie Dentiscultataceae, een schimmelinoculant van de familie Racocetraceae een schimmelinoculant van het fylum Basidiomycota, een schimmelinoculant van het fylum Ascomycota, een schimmelinocu- lant van het fylum Zygomycota, een schimmelinoculant van het genus Glomus of een combinatie daarvan.

De bacteriële inoculant kan een bacteriële inoculant van het ge- slacht Rhizobium omvatten, een bacteriële inoculant van het geslacht Bradyrhizobium, een bacteriële inoculant van het geslacht Mesorhizobium, een bacteriële inoculant van het geslacht Azorhizobium, een bacteriële inoculant van het geslacht Allorhizobium bac- teriële inoculant van het genus Burkholderia, bacteriële inoculant van het genus Sinor- hizobium, bacteriële inoculant van het genus Kluyvera, bacteriële inoculant van het ge- nus Azotobacter, bacteriële inoculant van het genus Pseudomonas bacteriële inoculant van het genus Azosprillium, bacteriële inoculant van het genus Bacillus, bacteriële in- oculant van het genus Streptomyces, bacteriële inoculant van het genus Paenibacillus, bacteriële inoculant van het genus Paracoccus, bacteriële inoculant van het genus En- terobacter bacteriële inoculant van het genus Alcaligenes, bacteriële inoculant van het genus Mycobacterium, bacteriële inoculant van het genus Trichoderma, bacteriële in- oculant van het genus Gliocladium, bacteriële inoculant van het genus Klebsiella, of een combinatie daarvan.

Het mengsel kan bovendien ten minste één micro-organisme bevatten, gekozen uit de lijst bestaande uit Bacillus subtilis stam 713, Bacillus amyloliquefaciens MBI 600, Bacil- lus pumillus QST2808, Pseudomonas fluorescens, Bradyrhizobium japonicum, Tricho- derma vireus, Pseudomonas putida, Trichoderma harzianum Rifai-stam T22, Penicillium bilaii, Mesorhizobium, Azospirillum, Azotobacter vinelandii en Clostridium pasteurianum, Glomus-soorten.

De N-heterocyclische verbindingen van de algemene formule (I) en/of (Il) en/of (III) en/of (IV) die volgens de onderhavige uitvinding worden gebruikt, kunnen in combinatie met deze hulpstoffen worden gebruikt. De gebruikte hulpstoffen hangen af van de spe- cifieke toepassingsvorm en de werkzame stof en omvatten bij voorkeur oplosmiddelen, vaste dragers, dispergeermiddelen of emulgeermiddelen, zoals oplosbaarheidsbevorde- rende stoffen, beschermende colloïden, oppervlakteactieve stoffen en hechtmiddelen.

Verder kunnen organische en anorganische verdikkingsmiddelen, bactericiden, anti- vriesmiddelen, antischuimmiddelen, eventueel kleurstoffen en tackifieermiddelen of bindmiddelen worden gebruikt in combinatie met de nitrificatieremmers en in het mest- stofmengsel. Geschikte hulpstoffen worden besproken in WO 2013/121384 op blz. 25 t/m 26.

Andere mogelijke voorkeursingrediënten zijn oliën, bevochtigers, hulpstoffen, biostimu- lanten, herbiciden, bactericiden, andere fungiciden en/of pesticiden. Deze worden bij- voorbeeld besproken in WO 2013/121384 op blz. 28/29.

De meststofmengsels zijn bij voorkeur in vaste vorm, waaronder poeders, prils en gra- nules. Voorts is het mogelijk de nitrificatieremmer in de vorm van een formulering, op- lossing of dispersie afzonderlijk of gelijktijdig met een meststof toe te dienen.

Bovendien kan de nitrificatieremmer van de onderhavige uitvinding worden gebruikt voor het verminderen van stikstofverliezen in organische meststoffen en ook op oogst- afval en weidegrond of tijdens de opslag van vloeibare mest en het volgen van de am- moniumbelasting in dierenstallen.

Voor de respectieve toepassingen kan worden verwezen naar US 6.139.596 en WO 2013/121384 alsook naar WO 2015/086823 en WO 2016/207210.

De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op een methode voor de bemesting van land- of tuinbouwgronden, waarbij een meststofmengsel dat verbindingen A en B bevat A. een anorganische en/of organische en/of organominerale meststof en B. 10 tot 10000 gewichtsprocenten, berekend op de anorganische meststof, van een N-heterocyclische verbinding met algemene formule (1) en/of (Il) en/of (III) en/of (IV) als hierboven omschreven, of de verbindingen A en B afzonderlijk, maar binnen een periode van O tot 5 uur, bij voorkeur 0 tot 1 uur, en bij voorkeur ongeveer op hetzelfde tijdstip, wordt op de bodem aangebracht.

Parallel aan de verbetering van het stikstofgebruik in de ammonium- of ureumhoudende minerale, organische en organominerale meststoffen heeft het gebruik van de nitrifica- tieremmers, volgens de huidige uitvinding, en van samenstellingen die deze bevatten, tot gevolg dat de opbrengst en de productie van biomassa van gewasgewassen, in sommige gevallen aanzienlijk, toeneemt. Evenzo kan de nitrificatieremmer volgens de uitvinding worden toegevoegd aan organi- sche meststoffen, zoals vloeibare mest, bijvoorbeeld tijdens de feitelijke opslag van dergelijke meststoffen, om te voorkomen dat stikstofvoedingsstoffen verloren gaan door een vertraagde omzetting van de afzonderlijke stikstofvormen in gasvormige, dus vluch- tige, stikstofverbindingen, en tegelijkertijd bij te dragen aan een verlaging van de am- moniakbelasting in dierenstallen. Bovendien kunnen de nitrificatieremmer of samenstel- Ingen die de nitrificatieremmer bevatten, worden gebruikt op landbouwstengels en wei- degronden om gasvormig stikstofverlies te verminderen en nitraatuitspoeling te voor- komen.

In het algemeen kan de N-heterocyclische verbinding van de algemene formule (I) of (Il) of (Ill) of (IV) worden gebruikt voor het verminderen van de stikstof- of koolstofverliezen in anorganische en/of organische en/of organinerale meststoffen of stikstof- of koolstof- houdende verbindingen of materialen en ook op oogstafval en weidegrond of tijdens de opslag van vloeibare mest en voor het verminderen van de ammoniakbelasting in die- renstallen.

Stikstofverliezen zijn vaak te wijten aan N20- en/of NO-emissies of NO3-uitspoeling. Stikstofverliezen kunnen optreden in stikstofhoudende verbindingen of materialen, zoals wortels, planten, meststoffen, dieren, enz. Stikstofverliezen treden meestal op bij stik- stofhoudende minerale meststoffen of organische stikstofhoudende stoffen. De term "stikstofverliezen" omvat alle vormen van stikstof of stikstofverbindingen die verloren gaan via emissies of uitspoeling, zoals hierboven aangegeven. Een voorbeeld zijn broeikasgasemissies die kunnen worden verminderd door het gebruik van de N- heterocyclische verbinding van de onderhavige uitvinding.

Hetzelfde geldt voor koolstofverliezen die kunnen optreden in koolstofhoudende verbin- dingen of materialen. Koolstofhoudende verbindingen of materialen zijn bijvoorbeeld carbonaathoudende minerale meststoffen en koolstofnoudend organisch materiaal, zo- als wortels, planten, dieren, organische meststoffen, enz. Koolstofverliezen treden vaak op in de vorm van CO2-emissies, die deel uitmaken van de broeikasgasemissies.

Daarom kunnen de N-heterocyclische verbindingen van de onderhavige uitvinding wor- den gebruikt voor het voorkomen of verminderen van broeikasgasemissies van stikstof- of koolstofhoudende verbindingen of materialen. Deze materialen bevatten vaak stikstof en/of koolstof in covalent of ionisch gebonden vorm, b.v. in de vorm van ammonium, eiwit, nitraat, carbonaat, koolhydraten, cellulose, of andere organische koolstofhouden- de verbindingen. De termen "koolstof" en "stikstof" kunnen dus verwijzen naar de ele- mentaire vorm of naar verbindingen of materialen die koolstof- en/of stikstofatomen be- vatten. Stikstof- en/of koolstofhoudende verbindingen of materialen kunnen aanwezig zijn in meststoffen, in de bodem, of in het milieu. Het meest in het oog springende effect van de N-heterocyclische verbindingen van de onderhavige uitvinding is de vermindering van de uitstoot van broeikasgassen uit grond die stikstofhoudende verbindingen of ma- terialen bevat.

Het meest efficiënt is de vermindering van broeikasgasemissies uit bemeste grond. De- ze broeikasgasemissies worden vaak veroorzaakt door processen na de nitrificatie.

De volgens de uitvinding te behandelen of in de grond te wortelen planten worden bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit landbouw-, bosbouw-, sier- en tuinbouw- gewassen, elk in hun natuurlijke of genetisch gemodificeerde vorm. Bij voorkeur worden niet-transgene landbouwplanten behandeld.

Landbouwgewassen die de voorkeur genieten zijn veldgewassen die worden gekozen uit de groep bestaande uit aardappelen, suikerbieten, tarwe, gerst, rogge, haver, sor- ghum, rijst, maïs, katoen, koolzaad, raapzaad, canola, sojabonen, erwten, veldbonen, zonnebloemen, suikerriet komkommers, tomaten, uien, prei, sla, pompoenen; nog meer bij voorkeur wordt de plant gekozen uit de groep bestaande uit tarwe, gerst, haver, rog- ge, sojabonen, maïs, koolzaad, katoen, suikerriet, rijst en sorghum.

In een voorkeursbelichaming van de uitvinding wordt het te behandelen gewas gekozen uit de groep bestaande uit tomaat, aardappel, tarwe, gerst, haver, rogge, sojaboon, ma- is, koolzaad, canola, zonnebloem, katoen, suikerriet, suikerbiet, rijst, sorghum, weide- gras en weideland.

In een andere voorkeursbelichaming van de uitvinding wordt het te behandelen gewas gekozen uit de groep bestaande uit tomaat, aardappel, tarwe, gerst, haver, rogge, soja-

boon, maïs, koolzaad, canola, zonnebloem, katoen, suikerriet, suikerbiet, rijst en sor- ghum.

In een bijzonder voorkeursgeval van de uitvinding worden de te behandelen planten gekozen uit de groep bestaande uit tomaat, tarwe, gerst, haver, rogge, maïs, koolzaad, canola, suikerriet en rijst.

In één belichaming is de plant die volgens de methode van de uitvinding moet worden behandeld, een landbouwplant. "Landbouwgewassen" zijn planten waarvan een deel (bijv. zaden) of het geheel op commerciële schaal wordt geoogst of geteeld of die als belangrijke bron dienen voor veevoer, voedingsmiddelen, vezels (bijv. katoen, linnen), brandstoffen (bijv. hout, bio-ethanol, biodiesel, biomassa) of andere chemische verbin- dingen. Landbouwgewassen die de voorkeur genieten zijn bijvoorbeeld granen, zoals tarwe, rogge, gerst, triticale, haver, sorghum of rijst, bieten, zoals suikerbieten of voe- derbieten; vruchten, zoals pruimen, steenvruchten of zacht fruit, zoals appelen, peren, pruimen, perziken, amandelen, kersen, aardbeien, frambozen, bramen of kruisbessen; peulvruchten, zoals linzen, erwten, luzerne of sojabonen; oliehoudende gewassen, zo- als koolzaad, raapzaad, canola, lijnzaad, mosterd, olijven, zonnebloemen, kokosnoot, cacaobonen, ricinusolie, oliepalmen, grondnoten of sojabonen; cucurbitaceae, zoals pompoenen, komkommers of meloenen; vezelgewassen, zoals katoen, vlas, hennep of jute; citrusvruchten, zoals sinaasappelen, citroenen, grapefruits (pompelmoezen) of mandarijnen; groenten, zoals spinazie, sla, asperges, kool, wortelen, uien, tomaten, aardappelen, komkommers of paprika's; laurahoudende planten, zoals avocado’s, ka- neel of kamfer; energie- en grondstofplanten, zoals maïs, soja, koolzaad, canola, sui- kerriet of oliepalm; tabak; noten; koffie; thee; bananen; wijnstokken (tafeldruiven en druivensapdruiven); hop; turf; natuurrubberplanten.

Weidegras en grasland bestaan uit grassen of grasmengsels bestaande uit bijvoorbeeld blauwgras (Poa spp.), bentgras (Agrostis spp. ), raaigras (Lolium spp.), zwenkgras (Fes- tuca spp, hybriden en cultivars), Zoysiagras (Zoysia spp.), Bermudagras (Cynodon spp.), St. Augustinegras, Bahigras (Paspalum), Duizendbladgras (Eremachloa), Tapijt- gras (Axonopus), Buffalogras en Gramagras. Weiden kunnen ook bestaan uit mengsels van bovengenoemde grassen, bijvoorbeeld raaigras, en Trifolium-soorten, bijvoorbeeld Trifolium pratensis en Trifolium repens, Medicago-soorten zoals Medicago sativa, Lo- tus-soorten zoals Lotus corniculatus, en Melilotus-soorten, bijvoorbeeld Melilotus albus.

In één geval is de plant die volgens de methode van de uitvinding moet worden behan- deld, een tuinbouwplant. Onder "tuinbouwgewassen" worden planten verstaan die al- gemeen worden gebruikt in de tuinbouw - bijvoorbeeld de teelt van sierplanten, kruiden, groenten en/of fruit. Voorbeelden van siergewassen zijn graszoden, geraniums, pelar- gonia's, petunia's, begonia's en fuchsia's. Voorbeelden voor groenten zijn aardappelen, tomaten, paprika's, cucurbitaceae, komkommers, meloenen, watermeloenen, knoflook, uien, wortelen, kool, bonen, erwten en sla en meer bij voorkeur van tomaten, uien, erw- ten en sla. Voorbeelden voor fruit zijn appels, peren, kersen, aardbeien, citrusvruchten, perziken, abrikozen en bosbessen. In de tuinbouw vervangt een substraat vaak (een deel van) de grond.

In één geval is de plant die volgens de methode van de uitvinding moet worden behan- deld, een sierplant. "Sierplanten" zijn planten die gewoonlijk in de tuin worden gebruikt, b.v. in parken, tuinen en op balkons. Voorbeelden zijn graszoden, geraniums, pelargo- nia's, petunia's, begonia's en fuchsia's.

In één geval is de plant die volgens de methode van de uitvinding moet worden behan- deld, een bosbouwgewas. Met de term "bosbouwgewas" worden bomen bedoeld, meer in het bijzonder bomen die in herbebossing of industriële aanplantingen worden ge- bruikt. Industriële aanplantingen dienen in het algemeen voor de commerciële productie van bosproducten, zoals hout, pulp, papier, rubberbomen, kerstbomen, of jonge bomen voor tuindoeleinden. Voorbeelden van bosbouwgewassen zijn naaldbomen, zoals den- nen, in het bijzonder Pinus spec, sparren en sparren, eucalyptus, tropische bomen, zo- als teak, rubberboom, oliepalm, wilg (Salix), in het bijzonder Salix spec, populier (cot- tonwood), in het bijzonder Populus spec, beuk, in het bijzonder Fagus spec, berk, olie- palm, en eik.

De volgende definities zijn van toepassing: De term "planten" moet worden opgevat als planten van economisch belang en/of door de mens gekweekte planten. Zij worden bij voorkeur gekozen uit landbouw-, bosbouw-, sier- en tuinbouwgewassen, elk in hun natuurlijke of genetisch gemodificeerde vorm. De hier gebruikte term "plant" omvat alle delen van een plant, zoals ontkiemende zaden, opkomende zaailingen, kruidachtige vegetatie, alsmede gevestigde houtige gewassen,

met inbegrip van alle onder de grond liggende delen (zoals de wortels) en boven de grond liggende delen.

De term "bodem" moet worden opgevat als een natuurlijk lichaam dat bestaat uit leven- de (bijvoorbeeld micro-organismen (zoals bacteriën en schimmels), dieren en planten) en niet-levende materie (bijvoorbeeld mineralen en organische materie (bijvoorbeeld organische verbindingen in verschillende ontbindingsgraden), vloeistof en gassen) die zich op het landoppervlak bevindt, en gekenmerkt wordt door bodemhorizonten die van het oorspronkelijke materiaal te onderscheiden zijn als gevolg van diverse fysische, chemische, biologische en antropogene processen.

De term "nitrificatieremmer" moet worden opgevat als een chemische stof die het nitrifi- catieproces, dat gewoonlijk in (bemeste) grond plaatsvindt, vertraagt of vertraagt. Nitrifi- catieremmers vertragen de natuurlijke omzetting van ammonium in nitraat en zijn ge- richt tegen micro-organismen en bij voorkeur ammonia-oxiderende bacteriën (AOB), bij voorkeur door remming van de activiteit van de bacteriën, zoals Nitrosomonas spp.

en/of Nitrosospira spp. Zij kunnen ook inwerken op ammonia-oxiderende archaea (AOA). De nitrificatieremmer wordt meestal gecombineerd met een meststof, bij voor- keur een (ammonium)stikstofhoudende meststof, bv. een vaste of vloeibare anorgani- sche, organische en/of organominerale meststof, of mest.

Onder "nitrificatie" moet worden verstaan de biologische oxidatie van ammoniak (NH3) of ammonium (NH4+) met zuurstof tot nitriet (NO2-), gevolgd door de oxidatie van deze nitrieten tot nitraat (NO3-) door micro-organismen. Naast nitraat (NO3-) wordt door nitri- ficatie ook distikstofoxide geproduceerd. Nitrificatie is een belangrijke stap in de stik- stofcyclus in de bodem.

De term "denitrificatie" moet worden opgevat als de microbiologische omzetting van nitraat (NO3-) en nitriet (NO2-) in gasvormige vormen van stikstof, in het algemeen N2 of N20. Dit ademhalingsproces vermindert geoxideerde vormen van stikstof in reactie op de oxidatie van een elektronendonor zoals organisch materiaal. De stikstofelektro- nenacceptoren die de voorkeur genieten, in volgorde van meest naar minst thermody- namisch gunstig, zijn: nitraat (NO3-), nitriet (NO2-), stikstofmonoxide (NO) en distik- stofmonoxide (N20). Binnen de algemene stikstofcyclus rondt denitrificatie de cyclus af door N2 terug te voeren naar de atmosfeer. Dit proces wordt voornamelijk uitgevoerd door heterotrofe bacteriën (zoals Paracoccus denitrificans en diverse pseudomonaden), hoewel er ook autotrofe denitrificeerders zijn geïdentificeerd (b.v. Thiobacillus denitrifi-

cans). Denitrificeerders zijn in alle belangrijke fylogenetische groepen vertegenwoor- digd.

Bij zuurstoftekort kunnen veel bacteriesoorten overschakelen van zuurstof naar nitraten ter ondersteuning van de ademhaling in een proces dat denitrificatie wordt ge- noemd en waarbij de in water oplosbare nitraten worden omgezet in gasvormige pro-

ducten, waaronder distikstofoxide, die in de atmosfeer worden uitgestoten.

Lachgas", gewoonlijk "happy gas" of "lachgas" genoemd, is een chemische verbinding met de chemische formule N20. Bij kamertemperatuur is het een kleurloos, niet- ontvlambaar gas.

Lachgas wordt op natuurlijke wijze in de bodem geproduceerd door de microbiële processen nitrificatie en denitrificatie.

Deze natuurlijke emissies van distikstofoxide kunnen worden verhoogd door een verscheidenheid van landbouwprak- tijken en -activiteiten, waaronder bijvoorbeeld a) de directe toevoeging van stikstof aan de bodem door het gebruik van minerale en organische meststoffen, b) de teelt van stikstoffixerende gewassen, c) de teelt van bodems met een hoog organisch gehalte.

De term "meststoffen" moet worden opgevat als (chemische) verbindingen die worden toegepast om de groei van planten en vruchten te bevorderen.

Meststoffen worden ge- woonlijk toegediend via de bodem (voor opname door de wortels van de plant) of via bladvoeding (voor opname door de bladeren). De term "meststoffen" kan in twee grote categorieën worden onderverdeeld: a) organische meststoffen (samengesteld uit rot- tend plantaardig/dierlijk materiaal) en b) anorganische meststoffen (samengesteld uit chemicaliën en mineralen). Organische meststoffen zijn onder meer drijfmest, wormen- giet, turf, zeewier, rioolwater en guano.

Gefabriceerde organische meststoffen zijn on- der meer compost, bloedmeel, beendermeel en zeewierextracten.

Andere voorbeelden zijn enzymatisch verteerde eiwitten, vismeel en verenmeel.

De ontbindende gewasres- ten van voorgaande jaren en mest zijn een andere bron van vruchtbaarheid.

Daarnaast worden in de natuur voorkomende mineralen, zoals fosfaat uit mijnsteen, kaliumsulfaat en kalksteen, ook tot de anorganische meststoffen gerekend.

Anorganische meststoffen worden gewoonlijk vervaardigd door middel van chemische processen (zoals het Ha- ber-Bosch-proces), waarbij ook gebruik wordt gemaakt van in de natuur voorkomende afzettingen, terwijl deze chemisch worden gewijzigd (b.v. geconcentreerd tripelsuperfos- faat). In de natuur voorkomende anorganische meststoffen zijn onder meer Chileens natriumnitraat, mijnsteenfosfaat en kalksteen.

Als derde categorie kunnen organinerale meststoffen worden genoemd, als combinatie van anorganische en organische mest- stoffen.

Onder "meststof die ureum bevat" (ueummeststof) worden verstaan synthetische meststoffen die ureum bevatten, met uitzondering van in de natuur voorkomende mest- stoffen die ureum bevatten (bijvoorbeeld mest als voorbeeld van een in de natuur voor- komende meststof die ureum bevat). Voorbeelden van meststoffen die ureum bevatten zijn ureum-ammoniumnitraat (UAN), isobutylideendiureum (IBDU), crotonylideendiure- um (CDU) en ueumformaldehyde (UF). Ureum wordt gewoonlijk in de vorm van korrels of prills geproduceerd. Ureummeststof kan worden geproduceerd door het vloeibare ureum uit een prillentoren te laten vallen en het product te drogen. Ureum kan ook wor- den verkregen in vloeibare vorm, die kan worden gebruikt voor bladbemesting, b.v. op aardappelen, tarwe, groenten en sojabonen, en voor vloeibare toepassing op het veld. Gewoonlijk wordt het gemengd met ammoniumnitraat om UAN te vormen met 28% N. De term "locus" (habitat van de plant) moet worden opgevat als elk type omgeving, bo- dem, gebied of materiaal waar de plant groeit of moet groeien. Volgens de uitvinding wordt in het bijzonder de voorkeur gegeven aan grond. De uitvinding wordt verder geïllustreerd door de volgende voorbeelden, die aantonen dat: -De verbindingen van formule (I) en (Il) en (Ill) en (IV) zijn sterke nitrificatieremmers; -Nieuwe nitrificatieremmers vertonen een hoge potentie en specificiteit; -de nieuwe nitrificatieremmers werken specifiek in op nitrificerende bacteriën en rich- ten zich op de NH3-oxidatiestap in de nitrificerende bacteriën; -de nieuwe nitrificatieremmers verminderen het ammoniumverbruik in de bodem. Voorbeelden

1. Heterocyclische verbindingen van de algemene formule (I) tot en met (IV) Verschillende heterocyclische verbindingen van de algemene formule (I) tot (IV) werden verkregen van ENAMINE Ltd., UkrOrgSynthesis Ltd., of Vitas-M Laboratory, Ltd. De respectieve verbindingen zijn opgenomen in tabel 1 hieronder. 2-Thiazoline-2-thiol is ook verkrijgbaar bij Sigma-Aldrich. De verbindingen van formule (I) en (Il) en (IIN/(IV) werden getest op hun nitrificatierem- mende werking in twee schermen, waarbij gebruik werd gemaakt van tests met de nitri- ficerende bacteriën N. europaea en N. multiformis. In de praktijk werden ammonium en kandidaat-nitrificatieremmers (bij 100 UM) toegevoegd aan een dichte bacteriecultuur in multiwell-kweekplaten en na 24 uur incubatie werd het nitrietgehalte gemeten. Om te normaliseren voor verschillen tussen batches culturen en multiwell-kweekplaten, werd voor elke well een relatieve nitrificatie berekend die werd genormaliseerd ten opzichte van zowel de negatieve als de positieve controles (zie "Materiaal en Methoden" hieron- der voor volledige details).

2. Materiaal en methoden

2. 1Nitrietmetingen Nitriet (NO2-) werd gemeten met behulp van het Griess-reagens (Productnummer: G4410, Griess reagens (gemodificeerd), Sigma-Aldrich). Gelijke volumes van het mon- ster of een verdund monster en het Griess-reagens werden gemengd in een transpa- rante multi-well-plaat met vlakke bodem en gedurende 10 minuten in het donker bij ka- mertemperatuur geïncubeerd. Absorbantiewaarden bij 540 nm werden spectrofotome- trisch gemeten (EnVision, Perkin Elmer®) en gebruikt om de [NO2-] te berekenen met behulp van een standaardcurve.

2. 2Ammoniummetingen Ammonium (NH4+) werd gemeten via een gemodificeerd Berthelot's reagens protocol. 8 pl cultuurmonster, 35 ul reagens A (0,5 g NaOH met 8 ml NaCIO (2,5%) in 92 ml Mil- IQ) en 33 ul reagens B (1 g salicylzuur, 0,5 g NaOH en 1,0237 g natriumnitroprussi- dedihydraat in 100 ml MilliQ) werden achtereenvolgens toegevoegd aan 160 ul MilliQ in 9S6-well platen met vlakke bodem (cat. nr. 353072, Falcon® 96 Well Clear Microplate, Corning). Absorbantiewaarden bij 635 nm werden spectrofotometrisch gemeten (EnVi- sion, Perkin Elmer®) na een incubatie van 30 minuten en gebruikt om [NH4+] te bere- kenen met behulp van een standaardcurve.

2. 3Cultuurbehoud

2.3.1Nitrosomonas europaea Nitrosomonas europaea groeimedium werd bereid door aseptisch samenvoegen van 900 mL stamoplossing 1 (27,75 mM (NH4)2S04, 3,35 mM KH2PO4, 0,83 uM MgSO4, 0,22 uM CaCl2, 11 uM FeSO4, 18.33 uM EDTA en 0,56 uM CuSO4) met 100 mL stockoplossing 2 (400 mM KH2PO4 en 40 mM NaH2PO4, pH 8.0 (NaOH)) en 8 mL stockoplossing 3 (5% watervrij Na2CO3) oplossing. Alle drie de stamoplossingen wer- den vooraf geautoclaveerd. Nitrosomonas europaea (ATCC 25978) cellen werden ge-

kweekt in steriele erlenmeyers verzegeld met tape (Micropore TM Surgical Tape 1530-1, 3MTM) bij 28°C en geschud (+ 150 rpm) in het donker. Culturen in de late log-fase ([NO2-] = 10 - 20 mM) werden gesubcultiveerd door centrifugering (4000 rpm, 15 min, 5°C) en volledige mediumverversing door het supernatant weg te gooien en de bacteri- ele celpellets opnieuw te resuspensie in vers bereid Nitrosomonas europaea- groeimedium.

2.3.2Nitrosospira multiformis Nitrosospira multiformis (NCIMB 11849) cellen werden gekweekt in erlenmeyers gevuld met geautoclaveerd 181-medium voor AOB (NCIMB Ltd) dat 1,78 mM (NH4)2S04, 1,47 mM KH2PO4, 272 UM CaCl2 x 2 H20, 162 UM MgSO4 x 7 H2O, 1 ml stockoplossing 1 (1.8 mM FeSO4 x 7 H20 en 1,49 mM NaEDTA) en 1 ml stockoplossing 2 (0,5% fenol- rood, pH-indicator) (pH 7,5-8). De pH werd op peil gehouden door regelmatig steriel 5% Na2CO3 toe te voegen. De kweekflessen werden afgesloten met tape (Micropore TM Surgical Tape 1530-1, 3MTM) en in het donker geïncubeerd bij 30°C onder schudden (+ 150 rpm). Laat-log fase culturen ([NO2-] = + 3 mM) werden gekweekt door centrifugatie (4000 rpm, 15 min, 5°C) en volledige medium verversing door het weggooien van het supernatant en resuspensie van de bacteriële cel pellets in pH-aangepast 181-medium. Nitrificatieremmingstests

2.4.1Nitrosomonas europaea Om een nitrificatieremmingstest met N. europaea met hoge doorvoer te kunnen uitvoe- ren, werden culturen in de late log-fase twee dagen voor de test ondergekweekt. Vlak voor de bepaling werden de culturen na centrifugatie (4000 rpm, 15 min, 5°C) in centri- fugebuizen van 50 ml (cat. nr. 430829, CentriStarT" Conical Centrifuge Tubes, Cor- ning®) 5 keer overgeconcentreerd met vers groeimedium. Per batch werden alle cultu- ren samengevoegd in één steriele Schott-fles en vervolgens gedoseerd in 384-well- platen (Cat. nr. 781086, CELLSTAR®-plaat, Greiner Bio-One; 50 pl/well) met behulp van een dispenser (Multidrop"" Combi Reagent Dispenser, Thermo Scientific") die eerst werd gespoeld met groeimedium. Specifiek voor de high-throughput screening voor nieuwe nitrificatieremmers werd 0,5 ul 99,99% DMSO (negatieve controle - eind- concentratie 1%) toegevoegd aan de buitenste twee kolommen aan de linkerkant van de plaat en 0,5 ul 10 MM DMP (3,4-dimethylpyrazool, positieve controle - eindconcen- tratie 100 uM) werd handmatig toegevoegd aan de buitenste twee kolommen aan de rechterkant. Ten slotte werd 0,5 pl kandidaat-nitrificatieremmers (stockoplossingen van mM in 99,99% DMSO - eindconcentratie 50 uM) aan de centrale wells toegevoegd met behulp van een pennentang op een Tecan-robot (Freedom EVO®, Tecan). Tussen de toevoegingen door werden de pennen achtereenvolgens gewassen met 99,5% 5 DMSO, MilliQ-water en 100% ethanol en aan de lucht gedroogd. Alle platen werden afzonderlijk in Parafilm gewikkeld. Stapels van 4 platen werden op een 96-well-plaat gezet, gevuld met 100 pi MilliQ per well, afgedekt met aluminiumfolie en geschud bij 150 omwentelingen per minuut bij 28°C. 24 uur later werd de NO2-productie beoor- deeld. Daartoe werden de monsters eerst 200 maal verdund door 1,5 ul monster te pi- petteren in 300 pl vers groeimedium in tussenplaten (cat. nr. 353077, Falcon® 96-well Clear Round Bottom Microplate, Corning®), om vervolgens 15 pl van de verdunde monsters te mengen met 15 ul Griess-reagens in de putjes van een transparante 384- well-plaat met vlakke bodem (Cat. No. X7001, Low Profile Microplate, Molecular Devi- ces), dat spectrofotometrisch werd gemeten bij 540 nm (EnVision, Perkin Elmer®).

24.2Nitrosospira multiformis Culturen van 500 ml, gekweekt in erlenmeyers van 1 liter die binnen 3 tot 4 dagen de laatlogfase ([NO2-] = 3 mM) bereikten en = 500 uM stijging van [NO2-] gedurende de laatste 24 uur vertoonden, werden gebruikt voor een high-throughput nitrificatierem- mingstest. De culturen werden eerst 5 keer overgeconcentreerd in vers 181-medium door centrifugatie (4000 rpm, 15 min, 5°C) in centrifugebuizen van 50 ml (cat. nr. 430829, CentriStar"" Conical Centrifuge Tubes, Corning®). Per batch werden alle cul- turen samengevoegd in één steriele Schott-fles en vervolgens gedoseerd in 384-well- platen (cat. nr. 781086, CELLSTAR®-plaat, Greiner Bio-One; 50 ul per putje) met be- hulp van een dispenser (Multidrop TV Combi Reagent Dispenser, Thermo Scientific TM) die eerst werd gespoeld met 181-medium. 0,5 ul 99,99% DMSO (negatieve controle - eindconcentratie 1%) werd toegevoegd aan de buitenste twee kolommen aan de linker- kant van de plaat en 0,5 ul 10 MM DMP (3,4-dimethylpyrazool, positieve controle - eindconcentratie 100 HM) werd handmatig toegevoegd aan de buitenste twee kolom- men aan de rechterkant. Ten slotte werd 0,5 ul kandidaat-nitrificatieremmers (stockop- lossingen van 5 mM in 99,99% DMSO - eindconcentratie 50 uM) aan de centrale wells toegevoegd met behulp van een pennentang op een Tecan-robot (Freedom EVO®, Te- can). Tussen de toevoegingen door werden de pennen achtereenvolgens gewassen met 99,5% DMSO, MilliQ-water en 100% ethanol en aan de lucht gedroogd. Alle platen werden afzonderlijk in Parafilm gewikkeld. Stapels van 4 platen werden op een 96-well- plaat gezet, gevuld met 100 pi MilliQ per well, afgedekt met aluminiumfolie en geschud (+ 150 rpm) bij 30 °C. 24 uur later werd de NO2-productie beoordeeld. Daartoe werden de monsters eerst 100-maal verdund door 3 pl monster te pipetteren in 300 pl vers groeimedium in tussenplaten (cat. nr. 353077, Falcon® 96-well Clear Round Bottom Microplate, Corning®) om vervolgens 15 ul van de verdunde monsters te mengen met 15 pl Griess-reagens in de putjes van een transparante 384-well-plaat met vlakke bo- dem (Cat. No. X7001, Low Profile Microplate, Molecular Devices) dat spectrofotome- trisch werd gemeten bij 540 nm (EnVision, Perkin Elmer®).

2.4.3 Kwantificering van de remming van de nitrificatie Om de doeltreffendheid van de verbindingen (in termen van remming van de nitrificatie) te beoordelen en een vergelijking tussen platen en partijen culturen mogelijk te maken, berekenden wij de relatieve nitrificatie. Meer in detail werden alle nitrietresultaten ge- normaliseerd ten opzichte van zowel een negatieve controle, die geen verbinding bevat- te, als een positieve controle,die de benchmark (100 uM DMP) bevatte, met gebruikma- king van vergelijking 1. Deze normalisatie werd uitgevoerd per multi-well plaat en elke plaat bevatte 32 positieve en 32 negatieve controles. Relative nitrifieation = re Wergeliking 1) Dit betekent dat verbindingen die volledige nitrificatie (geen nitrificatieremming) mogelijk maakten, een relatieve nitrificatie van 1 (of 100%) te zien geven. Een verbinding die dezelfde nitrificatieremming vertoont als de positieve controle, vertoont een nitrificatie- remming van 0. IC50-waarden, d.w.z. de concentratie die 50% van de nitrificatie remt, werden berekend na fitting van een logistische curve op 8-punts dosis-responsgegevens, waarbij doses tussen 2 en 100 uM met 1,75-voudige stappen werden gebruikt. Als een concentratie van 2 uM de nitrificatie al remde, kon de IC50-waarde niet worden berekend. In dat ge- val vertegenwoordigen de IC50-waarden de dosis die de remming het dichtst bij 50% brengt.

Celgroeiremmingstests De bestudeerde structuren hebben (althans in de geteste assays) geen toxi- sche/aspecifieke effecten. Er is geen effect op AOA-systemen (ABIL, van Avecom, en Nitrososphaera viennensis) en geen effect op microtox.

2.6. Nitrosomonas europaea ammoniak- vs. hydroxylamine-oxidatietests Om te bepalen of verbindingen specifiek NH3- of NH2OH-oxidatie remden, werden N. europaea-cellen voorzien van NH3 of hydroxylamine (NH2OH) als N-bron. Twee dagen oude, laat-log fase culturen met een NO2- concentratie tussen 10 en 20 MM werden 3 keer gewassen in vers groeimedium (zonder N) en tenslotte 4 keer overgeconcentreerd via centrifugatie (4000 rpm, 15 min, 4°C). Transparante, vlakke bodem 96-well platen (Cat. Nr. 353072, Falcon® 96 Well Clear Flat Bottom Microplate, Corning®) werden gevuld met 150 jl cultuur per well met behulp van een dispenser (Multidrop TM Combi Reagent Dispenser, Thermo Scientific"). De verbindingen (eindconcentratie 50 uM) werden in drievoud toegevoegd aan de multi-well-plaat met behulp van een Tecan-robot (Freedom EVO®, Tecan). Thioureum (positieve controle voor remming van NH3- oxidatie - eindconcentratie 100 uM) en fenylhydrazinehydrochloride (positieve controle voor remming van NH2OH-oxidatie - eindconcentratie 1 mM) werden toegevoegd aan de buitenste twee kolommen. Elke plaat werd in tweevoud gemaakt om hetzij 500 uM (NH4)2S04 (eindconcentratie [NH4+] = 1 mM) of 1 mM NH2OH toe te voegen. Alle pla- ten werden afzonderlijk in Parafilm gewikkeld. Stapels van 4 platen werden bovenop een 96-well plaat gevuld met 100 ul MilliQ per well, bedekt met aluminiumfolie en ge- schud (+ 150 rpm) bij 28 ° C. Om aflezing van secundaire effecten op de NO2-productie te voorkomen, werd NO2- pas 30 min later gemeten. Daartoe werden de monsters eerst 2 maal verdund door 15 ul te pipetteren in 15 ul vers groeimedium in 96-well- tussenplaten (cat. ref. PCR-96-FS-C, 96-well PCR Microplate, Axygen®) om vervolgens 15 ul van de verdunde monsters te mengen met 15 pl Griess-reagens in de wells van een transparante 384-well-plaat met vlakke bodem (Cat. Nr. X7001, Low Profile Mi- croplate, Molecular Devices) dat spectrofotometrisch werd gemeten bij 540 nm (EnVisi- on, Perkin Elmer®).

2.7In de bodem verrichte analyses Toplaagmonsters (O tot 10 cm) van de bodem werden genomen op verschillende perce- len in België (Merelbeke en Moorslede). Vegetatie op de veldproef werd verwijderd en er werden monsters genomen van verschillende percelen. Alle bodemmonsters werden gemengd en gezeefd (maaswijdte 2,8 mm) om grote brokstukken te filteren en de bo- dem te homogeniseren. De grond werd opgeslagen bij 5°C in plastic containers bedekt met Saran folie om veranderingen in de samenstelling van de microbiële gemeenschap te voorkomen en om het oorspronkelijke bodemvochtgehalte te behouden.

Het vochtgehalte van de bodem werd bepaald door 20 g grond gedurende = 48 uur in een oven bij 60 °C te drogen en het gewicht vóór en na het drogen te meten. Op basis van het bodemvochtgehalte (+ 20%) werden samengestelde oplossingen bereid, zodat toevoeging van 200 ul verbinding en 200 ul NHACI-oplossing zou resulteren in een eindconcentratie van de verbinding van 50 HM en een eindconcentratie van NH4+ van 10 mM. Per behandeling werden 5 kleine potjes gevuld met 20 g grond. Vervolgens werd de grond eerst behandeld met de respectieve verbindingsoplossing en vervolgens met de NH4Cl-oplossing. Per bakje werden positieve (50 uM DMP) en negatieve con- troles (DMSO) opgenomen. De potten werden gedurende 7 dagen bij 21°C (6.00 tot

22.00 uur licht) geïncubeerd. Om de 2 à 3 dagen werd gedemineraliseerd water aan de grond toegevoegd tot een bodemgewicht van 20 g. Uiteindelijk werd elk monster van 20 g grond opgelost in 100 ml 1M KCI en gedurende 1 uur geschud, gevolgd door filtratie door Whatmann®-papier. Het filtraat werd gebruikt om de pH-, NH4+- en NO3- concen- traties te meten.

2.8. Cu-bindingstest DMSO-oplossingen met verbinding in een eindconcentratie van 2,5 mM of 10 mM en CuSO4 in een eindconcentratie van 5 mM werden vergeleken met zuivere verbinding of CuSO4-oplossingen in dezelfde concentraties. 100 ul van de oplossing werd toege- voegd aan een 96-wells-plaat en het volledige absorptiespectrum werd gemeten met een SpectraMex2550-plaatlezer (Molecular devices). Er werden twee landbouwgronden gebruikt die afkomstig waren van velden in Moorsle- de en Sint-Laureins. Vials met schroefdop werden gevuld met 10 g grond. De flesjes werden verzegeld met parafilm en gedurende 5 dagen in het donker bij 21°C voorgeïn- cubeerd. Na de preincubatie werden de flesjes met een ventilator geventileerd. Er werd 100 UL van een 1 mM samengestelde oplossing (10 % DMSO) toegevoegd, onmiddel- lijk gevolgd door de toevoeging van 100 uL 200 mM NH4CI. De flesjes werden gasdicht afgesloten en met een plastic injectiespuit werd 5 mL synthetische lucht aan de headspace toegevoegd, waarna 5 mL headspace werd overgebracht in een geëvacu-

eerde exetainer van 3 mL. De flesjes werden bij 21 °C in het donker geïncubeerd en de NO-achtergrondconcentratie werd genoteerd. Op elk bemonsteringstijdstip werd met een plastic injectiespuit opnieuw 5 mi synthetische lucht aan de headspace toegevoegd, waarna opnieuw 5 ml headspace werd overgebracht in een geëvacueerde exetainer van 3 ml. De flesjes werden geventileerd en weer gesloten, en nieuwe gasmonsters werden zoals voorheen overgebracht in exetainers. N20, CO2, CH4 in de exetainers werden gemeten via gaschromatografie. De NO-concentratie werd rechtstreeks geme- ten.

3. Resultaten De verbindingen van formule (1) en (Il) werden getest op hun nitrificatieremmende wer- king in twee schermen, waarbij gebruik werd gemaakt van assays met de nitrificerende bacteriën N. europaea en N. multiformis. In de praktijk werden ammonium en kandi- daat-nitrificatieremmers (bij 100 uM) toegevoegd aan een dichte bacteriecultuur in mul- tiwell-kweekplaten en na 24 uur incubatie werd het nitrietgehalte gemeten. Om te nor- maliseren voor verschillen tussen batches culturen en multiwell-kweekplaten, werd voor elke well een relatieve nitrificatie berekend die werd genormaliseerd ten opzichte van zowel de negatieve als de positieve controles (zie "Materiaal en Methoden" hierboven voor volledige details). Een relatieve nitrificatie van 100% of 0% wijst dus respectievelijk op geen nitrificatieremming of nitrificatieremming op het niveau van de positieve contro- le (100 UM 3,4-dimethylpyrazool (DMP)).

3.1 Resultaten in tabel 1 De in tabel 1 weergegeven resultaten zijn gebaseerd op het gebruik van de nitrificeren- de bacteriën Nitrosomonas europaea en Nitrosospira multiformis. De N-heterocyclische verbindingen van de algemene formule (1) en (Il) en (II!) en (IV) remmen de nitrificatie in ten minste één van de onderzochte systemen. De remmende activiteit van deze klasse moleculen werd bevestigd voor een aantal structuren met variërende subgroepen. Er werden acht verschillende doses en vier biologische herhalingen gebruikt. Uit tabel 1 blijkt dat alle (geteste) stoffen de nitrificatie in de geteste systemen duidelijk remmen, en dat sommige remmers al bij zeer lage doses een sterke remming vertonen (sommige vertonen nog volledige remming bij 2 UM). Als referentie werd 3,4-dimethylpyrazool gebruikt in vergelijkend voorbeeld C1. De IC50-waarden geven de geschatte concentratie aan die 50% remming van de nitrificatie veroorzaakt. De waarden werden voorspeld door het passen van een logistische curve op 8-punts dosis-responsgegevens of op basis van de laagste geteste dosis die een remming van meer dan 50% geeft.

IC50 is de concentratie waarbij 50% remming optreedt. Lagere waarden duiden dus op een sterkere remming van de nitrificatie. Alle geteste nitrificatieremmers hebben een sterker effect op Nitrosospira multiformis. Uit tabel 1 blijkt dat alle (geteste) moleculen in staat waren de nitrificatie te remmen. Daarom is de aanwezigheid van de algemene formule (I), (Il), (II) of (IV) substructuur noodzakelijk en lijkt voldoende te zijn om de nitrificatieremming te bewerkstelligen. Ver- schillende zijgroepen op de aminomethylgroep in de algemene formules (I) en (Ill), ge- bonden via het stikstofatoom of op de thioethergroep in de algemene formules (Il) en (IV), hebben nauwelijks invloed op de remming van de nitrificatie. Toevoeging van mo- leculaire structuren aan de groepen R2 en R3 van de structuren van algemene formule (I) en (Il) zijn ook mogelijk, maar bijzonder complexe substructuren zouden de neiging kunnen hebben om het nitrificatieremmend vermogen te verzwakken. Niettemin rem- men alle moleculen van de substructuren van de algemene formule (1) en (Il) en (Ill) en (IV) de nitrificatie in zekere mate bij ten minste één van de twee geteste nitrificerende bacteriën. Niet alle in tabel 1 vermelde moleculen zijn getest. Alle geteste moleculen zijn sterke nitrificatieremmers die specifiek inwerken op nitrifice- rende bacteriën. NA betekent niet geanalyseerd. Tabel 1 Voor- Structuur Nitrosomonas Nitrosospira beeld europaea multiformis

Nitrifica- | 1C50 Nitrifi- | IC50 | Getest tie (%) [UM] catie [MM] | e con- bij de (%) bij cen- geteste de ge- tratie concen- teste (HM) tratie (0 con- = centra- maxi- tie (0 = male maxi- activi- male teit) activi- teit) ) { 14 | 100 SH & SP 8 de ej <2 <0.8 100 A 7 Lt sl À ON <2 <2 100 Ss

N u

S A <3.5 <2 100

S Ar <2 <2 100

N AT) s SA 3 11 <35 | 100

SN 0) A © 14 <35 | 100 sg)

G

À NH <6 <10 | 100 Lt © Ar 47 <100 | 31 |<100| 100 \ —/ ®» Y 0 ; X >100 <6 | 100 A,

LS A

OH 27 81 | >100 <10 | 100 y 9 TON (> NA NA <20 | 100 à 5 N 8 Br

* sd <100 11 <20 100 eg > pe 8 _ == Ne 73 NA NA 50 ; { ag 82 x Sa i. <57 <20 | 100 Bt Le” 2 cn 5 art Te s 78 NA 13 NA 50 à, 8% id

AT Fr &. Vas oe &

SN

Ss 100 NA 26 NA 50

A 5° NN \ 7 at SN = A ES 2

JA À Par ge, ee ON S T3 Ÿ ; ü X - ee

A «A [ e= 15 TI N° Se í ee ar, 6 > ew | > & ee 8 NN of ue

SR à; Lj

FE Ä x Is ; %

A

À Le

À, = v < >

SN FA a Ar 1 13 1.3 | 100 \—/

CH À 2 12 53 140 | 100 Ss AN \/

À S * 38 21 100

CH HO = < 0 9 en) 62 | >100 | 77 |>100| 100 oO &

<< CD 65 | >100 12 | 100

HN HN

N ON 28 | 61 |>100| 100 N= s 3 CH, 5 sl \ N 21 42 36 | 100

H

HO N #7 12 14 11 | 16 | 100 5 Br N < VOST Nu 46 | <100 | 75 |>100| 100 Ss 3

‚8 S Br HC OT >100 | 64 |>100| 100

N H

N 52 11 100 < H,C

NH XL à 12 43 3 100 H,C s = 5 = \ An 16 15 49 | 100

TN 58 | >100 | 7 | 44 | 100 5 H.N

H,C ue 92 >100 53 >100 100 Ss

N

À S 22 26 52 >100 100 / O H;C

HN A \ 4 3 100 > O

N À) 7 0 88 >100 >100 | 100 H3C N = 40 12 <57 100 A ; S ©

CH N CH, [ 7 20 100 se

NH À N 2 24 | 100 ST Po Met name de molecule van voorbeeld 1, 3-[(6-chloorimidazo[2,1-b][1,3]thiazol-5- yl)methyl-methylamino]methyl]-1,3-thiazolidine-2-thion remde de nitrificatie op beide geteste bacteriën sterk af. Twee soortgelijke moleculen, 3-[[1,3-benzothiazol-2- ylmethyl(methyl)amino]methyl]-1,3-oxazoli dine-2-dion en 3-[[(2-chloor-6- fluorfenyl)methyl-methylamino]methyl]-1,3-oxazolidine-2-dion van respectievelijk de voorbeelden 5 en 6, vertoonden een sterke nitrificatieremming ten aanzien van de twee ammoniakoxiderende bacteriën. De drie structuren van de voorbeelden 1, 5 en 6 die in het bijzonder de voorkeur genie- ten, zijn hieronder afgebeeld: Na 3 NF I AUS / I sn YEN Sas Lt 0} ot

3.2 Ammoniak vs hydroxylamine oxidatieproef Om inzicht te krijgen in de beoogde metabolische route en om onderscheid te maken tussen verbindingen die specifiek de NH3-oxidatie beïnvloeden of die een andere route beïnvloeden, werden drie representatieve nieuwe nitrificatieremmers (voorbeelden 1, 5 en 6) getest in de "ammonia vs hydroxylamine oxidatie assay" waarbij de NO2- productie uit NH3 werd vergeleken met de NO2-productie uit NH2O0H. Aangezien NH3 wordt omgezet in NH2OH voordat NO2- wordt geproduceerd, geeft een vergelijking van de nitrificatieremming van de nieuwe verbindingen ten opzichte van NH3 (zie "1." in het schema hieronder) versus NH2OH (zie "2." in het schema hieronder) aan welk deel van de route wordt geremd. Geen nitrificatieremmer: NH, ammonia oxidation NH,OH hydroxylamine oxidation NO; NH,0H — NO; Niet-specifieke of algemene metabolische remmer: NH3 — X

NH,0H > X Ammoniak oxidatie specifieke remmer: NH; > X NH,0H — NO, Ammoniakoxidatie is een essentiële stap voor het metabolisme van nitrificerende bacte- rien. Daarom zal remming van ammoniakoxidatie door een nitrificatieremmer indirect alle andere enzymatische stappen beïnvloeden en ook de tweede stap beïnvloeden, zij het minder sterk dan de eerste stap. Zelfs in een test van 30 minuten verminderde DMP, waarvan bekend is dat het gericht is tegen ammoniakoxidatie, ook de oxidatie van NH2OH, maar in mindere mate dan het effect op ammoniakoxidatie. Uit onderstaande tabel 2 blijkt dat de drie nieuwe nitrificatieremmers duidelijk de oxida- tie van ammoniak remmen, maar nauwelijks de oxidatie van hydroxylamine. Het be- perkte effect op hydroxylamine-oxidatie is hoogstwaarschijnlijk een indirect effect, aan- gezien remming van ammoniak-oxidatie van invloed is op het gehele metabolisme. DMP, waarvan bekend is dat het gericht is tegen de eerste stap, heeft in de test inder- daad ook een beperkt effect op de tweede stap (tabel 2). De nieuwe nitrificatieremmers zijn dus specifiek gericht tegen ammoniakoxidatie (de eerste stap van nitrificatie), wat verder bevestigt dat zij specifiek inwerken op AOB's en in het algemeen niet toxisch zijn. Tabel2 Nitrificatie uit NH3 | Nitrificatie uit NH2OH Voorbe- id Structuur (% vergeleken met|(% vergeleken met e DMSO) DMSO) Ne

HN C1 LS 27 56

NS T3 IA nf 1 SON J 12 81 À 5 2 NT Lt

Nm

AO 5 ZA > > 17 77 0A

A A, à 18 Sa Ep

3.3Test uitgevoerd in landbouwgrond Tenslotte werd het effect van een representatieve reeks van de nieuwe nitrificatierem- mers in de bodem getest.

5 De nitrificatieremmers werden toegepast in een nitrificatieremmingstest met landbouw- grond. In de praktijk werd ammonium met of zonder de nieuwe nitrificatieremmers toe- gevoegd aan grond van een akker in Merelbeke (België). Het ammoniumgehalte werd gemeten aan het begin van het experiment en aan het einde van het experiment, na een week incubatie. Er werd een nitrificatieremming berekend door de ammoniumre- ductie met nitrificatieremmer te vergelijken met de ammoniumreductie zonder nitrifica- tieremmer. Ammonium werd toegevoegd aan grond met een hoge nitrificatie-activiteit en behandeld met de nitrificatieremmers (eindconcentratie van 50 HM). Uit tabel 3 blijkt dat na een week behandeling vooral de thiazolidine-bevattende verbindingen van voorbeeld 1 de ammoniumconsumptie sterk remden. Ook de thiazolidine-bevattende verbindingen die thio-ethers vormen (Voorbeelden 9 en 10) en de oxazolidine-bevattende verbinding van Voorbeeld 5 vertoonden significante remming. Dit bevestigt dat de nieuwe nitrificatie- remmers de ammoniakoxidatie door bodemgemeenschappen effectief remmen. Tabel 3 Voorbeeld | Structuur % remming van de nitrificatie in de bodem (7 dagen incubatie, Merelbeke bo-

LD 75 an

SON

A Ÿ Ss n— u N A 14 A)

SONO Sa © 0A

A Ss

A

LJ 10 7 oi

À STN

LJ Gebleken is dat de aanwezigheid van een thiazolidine-thiol substructuur in verband kan worden gebracht met de remmende werking op nitrificatie. Uit de evaluatie van verschil- lende structuurvarianten blijkt dat thiazolidine-thiol- en oxazolidine-thiol-bevattende 5 structuren de voorkeur verdienen als nitrificatieremmers. De geprefereerde verbindin- gen hebben een substructuur die via een amino-methyl gebonden is aan een complexe- re structuur. Dergelijke moleculen kunnen ook de thiol-tautomeren vormen als R1 wa- terstof is in algemene formule (1). Voorkeur verdienen de verbindingen met een thiazoli- dine-thiol substructuur, een oxazolidine-thiol substructuur, of een thiazolidine-thioether 10 substructuur.

Een reeks voorbeelden werd in dezelfde omstandigheden getest (Moorslede bodem, 3 dagen incubatie) bij een concentratie van 50 uM. De resultaten zijn weergegeven in tabel 4. Tabel 4 Voorbeeld | Structuur % remming van de nitrificatie in de bodem (3 dagen incubatie, bodem van Moorslede) bij 50 uM 7 À 100

O NH \ / 24 À 40

S NH \/ 25 s CH 73

A \—/ Een andere reeks voorbeelden werd eveneens in verschillende concentraties in Moor- slede-bodem getest, en na 5 dagen bemonsterd. De resultaten zijn weergegeven in ta- bel 5. Tabel 3-7 laat zien dat diverse variaties binnen de geclaimde algemene formule de nitrificatie in de bodem effectief remmen. Tabel 5 Voorbe- | Structuur % remming van de nitrificatie in de bodem (5 dagen eld incubatie, bodem van Moorslede) bij de aangegeven concentratie

7 À 38 32

O NH

LJ 25 s —CH3 30 14 3

A \—/ 39 N 62 NA NA À \ 7 3} H3C

3. 4Nitrificatieremmingstest met 3H-1,3-thiazool-2-thion De verbinding van voorbeeld 24, 3H-1,3-thiazool-2-thion, werd gebruikt in een volledige dosis-effect-test met de twee ammoniak-oxiderende bacteriën Nitrosomonas europaea en Nitrosospira multiformis overeenkomstig de bovenstaande punten 1, 2.4.1 tot en met

2.43. Tabel 6 Beproefde concentratie 2 3.5 11 119 33 | 57 | 100 [MM] Gemiddelde nitrificatie S 79 78 76 74 43 | 20 |1 [%] in Nitrosomonas Ar europaea \=— s CH3| 85 76 73 58 | 50 32 120 |2 A, \/ À 91 84 83 | 78 71 |50 Ss NH

CH

Gemiddelde nitrificatie S 25 4 [%] in Nitrosospira multi- De formis dt a CH 81 76 |74 1867 162 | 53

A \/ À 51 27 2

ST NH

CH Concentraties variërend van 2 tot 100 uM van 3H-1,3-thiazool-2-thion (de tautomere vorm is 3H-1,3-thiazool-2-thiol), 2-(methylsulfanyl)-1,3-thiazool en 4-methyl-1,3-thiazool- 2-thiol werden getest. De resultaten zijn weergegeven in tabel 5. De resultaten voor 100 MM zijn eveneens opgenomen in tabel 1. 3H-1,3-thiazool-2-thion heeft een zeer sterk effect op Nitrosospira multiformis (slechts 25% nitrificatie na toepassing van 2 UM), maar remt ook bij hogere concentraties nog bijna volledig de nitrificatie bij Nitrosomonas europaea.

3.5Test uitgevoerd in landbouwgrond Het effect van 3H-1,3-thiazool-2-thion is in de bodem getest overeenkomstig de hierbo- ven in punt 3.3 beschreven proef. De resultaten zijn samengevat in de volgende tabel 7. Tabel 7 Naam Structuur Gemiddelde % nitrificatieremming in de bo- dem (5 dagen incubatie, bodem van Moor- slede) bij 20 uM 3H-1,3-thiazole-2-thione À 014

S NH \—/

1,3-thiazolidine-2-thion I 7

S NH \_7/ 3H-1,3-thiazool-2-thion remt effectief de nitrificatie in de bodem. In de gepresenteerde gegevens lijkt de mate van remming beperkt te zijn, maar dit ex- periment werd opzettelijk uitgevoerd bij een lage concentratie (20 uM) om een vergelij- king van de werkzaamheid tussen verschillende remmers mogelijk te maken.

3. 6Beperking van de uitstoot van broeikasgassen Om het remmende effect van de nieuwe klasse nitrificatieremmers op stikstofverliezen verder te bevestigen, werden gasemissies opgevangen uit grond bemest met ammoni- um en behandeld met 1,3-thiazolidine-2-thion. NO, N20, CO2 en CH4 gemeten. Tabel 7 geeft de cumulatieve waarden gedurende een incubatieperiode van 99 uur, en laat zien dat vooral NO en N20, maar ook CO2, sterk worden gereduceerd bij gebruik van de nieuwe nitrificatieremmer, hetgeen het geval was in twee verschillende landbouwbo- dems. Er konden geen significante effecten op CH4 worden vastgesteld. Tabel 8 Cumulatieve emissie op het aangegeven tijdstip [ppm] Bo- | Broei- Behandeling 4h 24h 48h 72h 99h dem | kasgas Moor | N20 DMSO (geen remmer) 1895 |3733 | 4466 4466 sle- de 1,3-thiazolidine-2-thion DMSO (geen remmer) 1014 | 1162 1160 28 43 65 65 1,3-thiazolidine-2-thion DMSO (geen remmer) 2825 |5175 |7359 9431

1,3-thiazolidine-2-thion

0.20 | 0.38 0.38 0.51 0.51 1,3-thiazolidine-2-thion Sint- | N20 DMSO (geen remmer) 1065 | 1587 1730 Lau- 1 1 2 reins 1,3-thiazolidine-2-thion 17 52 140 161 1,3-thiazolidine-2-thion CO2 DMSO (geen remmer) 1367 |3041 | 5330 7596 372 1179 2094 3101 4168 1,3-thiazolidine-2-thion

0.10 0.16 0.25 0.25 1,3-thiazolidine-2-thion

4. Nieuwe nitrificatieremmers zijn Cu-chelatoren De nieuwe nitrificatieremmers vormen complexen met Cu. Aangezien meerdere bekende nitrificatieremmers Cu-chelatoren zijn, werd het Cu- chelerend vermogen getest door voor de nieuwe remmers de absorptiespectra met en zonder Cu te analyseren. Als Cu een complex vormt met de nitrificatieremmer, wordt verwacht dat de absorptiespectra verschuiven. De absorptiespectra van de nieuwe remmers zijn inderdaad duidelijk verschoven als ze met Cu worden gecombineerd, wat erop wijst dat ze complexen vormen met Cu, en wat hun werking als nitrificatieremmer verder bevestigt.

Vertaling van Engelse uitdrukkingen in de tekeningen Wavelength Golflengte

Claims (15)

Conclusies

1. Het gebruik van een N-heterocyclische verbinding van de algemene formule (a) of (b) R2 B R1 R2 fé / V7 NN | ze A Ve R1 R3 | 5x4 RIT XT R7 (a) 87 {b} met de volgende definities: X1 is Sof O, X2 is S of O en ten minste een van X1 en X2 is S R2H of C1-4-alkyl, R3H of C1-4-alkyl R6 en R7 zijn waterstof of vormen samen een covalente koolstof- koolstofverbinding in de algemene formule (a) R1 zijnde H, C1-12-alkyl of -CH2-NR4R5 met R4-waterstof of C1-4-alkyl, R5C1-12-koolwaterstofresidu dat één tot drie halogeenatomen en/of één tot vier heteroatomen, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, kan be- vatten, waarbij het ook mogelijk is dat R4 en R5 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt, een verzadigde of onverzadigde heterocyclische radicaal met vijf of zes leden vormen, die naar keuze ook één of twee heteroatomen, geko- zen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, kan bevatten, in algemene formule b) R1 zijnde H of C1-17-koolwaterstof, bij voorkeur H, of - CH2-R5 waarbij R5 H of C1-16-koolwaterstofresidu is, welke koolwaterstof één tot drie halogeenatomen en/of één tot zes heteroatomen kan bevatten, geko- zen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, en bij voorkeur in de algemene formules (a) en (b) waarbij X1 en X2 S zijn, als nitrificatieremmer.

2. Het gebruik zoals geclaimd in claim 1, waarin de N-heterocyclische verbinding van de algemene formule (a) of (b) een N-heterocyclische verbinding is van de algemene formule (I) of (Il) of (II) of (IV)

R2 R1 R2 LS | Ja Ne R1 R3 X1 0) R3 X1 (I) R2 R1 R2

NT N / A / et R3 X1 R3 X1 (I) (IV) met de volgende definities: X1 is S of O, X2 is S of O en ten minste een van X1 en X2 is S R2H of C1-4-alkyl, R3H of C1-4-alkyl in de algemene formules (I) en (Ill) R1 zijnde H, C1-12-alkyl of -CH2-NR4R5 met R4-waterstof of C1-4-alkyl, R5C1-12-koolwaterstofresidu dat één tot drie halogeenatomen en/of één tot vier heteroatomen, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, kan be- vatten, waarbij het ook mogelijk is dat R4 en R5 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt, een verzadigde of onverzadigde heterocyclische radicaal met vijf of zes leden vormen, die naar keuze ook één of twee heteroatomen, geko- zen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, kan bevatten, in de algemene formules (Il) en (IV) is R1 H of C1-17-koolwaterstof, bij voor- keur H, of -CH2-R5 waarbij R5 H of C1-16-koolwaterstofresidu is, welke kool- waterstof één tot drie halogeenatomen en/of één tot zes heteroatomen kan be- vatten, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, en bij voorkeur in de algemene formules (I), (Il), (II!) en (IV) X1 en X2 zijn S.

3. Het gebruik zoals geclaimd in claim 1 of 2, waarbij R2, R3 en R4 onafhankelijk van elkaar waterstof, methyl of ethyl zijn, en/of het gebruik zoals geclaimd in een van de claims 1 tot en met 4, waarbij in de algemene formules (1) en (Ill) X1 S of O is, en X2 S is, bij voorkeur waarbij in de algemene formules (I) en (IN), X1 en X2 S zijn.

4. Het gebruik zoals geclaimd in één van de aanspraken 1 tot en met 3, waarin in de algemene formules (I) en (II!) R5 een C3-10-koolwaterstofresidu is dat één tot twee halogeenatomen en/of één tot drie heteroatomen kan bevatten en dat ten minste één cyclische structuur bevat, waarbij bij voorkeur in de algemene formules (I) en (II!) R5 een C3-8-koolwaterstofresidu is dat één tot twee halo- geenatomen en/of één tot drie heteroatomen kan bevatten en dat een cycli- sche structuur met vijf of zes leden bevat die kan worden geannuleerd tot een tweede cyclische structuur met vijf of zes leden, waarbij in formule (III) R1, R2 en R3 onafhankelijk van elkaar waterstof, methyl of ethyl zijn.

5. Het gebruik zoals geclaimd in één van de aanspraken 1 tot en met 3, waarin in de algemene formules (Il) en (IV) R1 C1-4-alkyl of -CH2-R5 is met R5 C3-14- koolwaterstofresidu, dat één of twee halogeenatomen en/of twee tot zes hete- roatomen kan bevatten, geselecteerd uit de groep bestaande uit stikstof, zuur- stof en zwavel, waarin bij voorkeur in de algemene formules (II) en (IV) R1 me- thyl, ethyl of -CH2-R5 is met R5 C5-12-koolwaterstofresidu, dat één halogeen- atoom en/of twee tot vier heteroatomen kan bevatten, geselecteerd uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof en zwavel waarin meer bij voorkeur in formule (IV) R1 waterstof, methyl of ethyl is.

6. Het gebruik van een N-heterocyclische verbinding van de algemene formule (I) of (Il) of (III) of (IV) zoals gedefinieerd in een van de claims 1 tot en met 5 als additief of bekledingsmateriaal voor anorganische en/of organische en/of orga- nominerale meststoffen, bij voorkeur anorganische meststoffen, meer bij voor- keur ammonium- en/of ureumhoudende stikstofnoudende meststoffen.

7. Het gebruik zoals geclaimd in claim 6, waarbij de N-heterocyclische verbinding van de algemene formule (1) of (Il) of (II!) of (IV) wordt geleverd in de vorm van een formulering, oplossing of dispersie, afzonderlijk of gelijktijdig met een meststof, of wordt opgenomen in de meststof of wordt toegepast op de mest- stof.

8. Het gebruik van een N-heterocyclische verbinding van de algemene formule (I) of (Il) of (III) of (IV) zoals omschreven in één van de claims 1 tot en met 5 voor het verminderen van het stikstof- of koolstofverlies in anorganische en/of orga- nische en/of organinerale meststoffen of stikstof- of koolstofhoudende verbin- dingen of materialen en ook op oogstafval en weideland of tijdens de opslag van vloeibare mest en voor het verminderen van de ammoniakbelasting in die- renstallen.

9. Het gebruik zoals geclaimd in een van de claims 1 tot en met 8, waarbij de N- heterocyclische verbinding van de algemene formule (I) of (Il) of (III) of (IV) wordt gebruikt in combinatie met ten minste één aanvullend agrochemisch agens, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit ten minste één andere nitrificatieremmer, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit 2-(3,4-dimethyl-pyrazol-1-yl)-barnsteenzuur (DMPSA), 3,4- dimethylpyrazool (DMP), 3,4-dimethylpyrazoolfosfaat (DMPP) dicyaandiamide (DCD), 1H-1,2,4-triazool, 3-methylpyrazool (3-MP), 2-chloor-6- (trichloormethyl)-pyridine, 5-ethoxy-3-trichloormethyl-1,2,4-thiadiazol, 2-amino- 4-chloor-6-methyl-pyrimidine, 2-mercapto-benzothia zole, 2- sulfanilamidothiazool, thioureum, natriumazide, kaliumazide, 1-hydroxypyra - zole, 2-methylpyrazool-1-carboxamide, 4-amino-1,2,4-triazool, 3-mercapto- 1,2,4-triazo le, 2,4-diamino-6-trichloormethyl-5-triazine, koolstofbisulfide, am- moniumthiosulfaat, natriumtrithiocarbonaat, 2,3-dinydro-2,2-dimethyl-7- benzofuranolmethylcarbamaat en N-(2,6-dimethylfenyl)-N-(methoxyacetyl)- alaninemethylester, ten minste één ureaseremmer, bij voorkeur gekozen uit N- butylthiofosforzuurtriamide (NBTPT) en/of N-n-propylthiofosforzuurtriamide (NPTPT), ten minste één gebruikelijke agrochemische hulpstof, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit waterige en/of organische oplosmiddelen, pH- regelaars, oppervlakteactieve stoffen, bevochtigingsmiddelen, spreidingsmid- delen, adhesiebevorderaars, dragers, vulstoffen, viscositeitsregelaars, emulga- toren, dispergeermiddelen, sequestreermiddelen antizinkmiddelen, coalescen- temiddelen, reologiemodificatoren, antischuimmiddelen, fotobeschermings- middelen, antivriesmiddelen, biostimulanten, pesticiden, biociden, planten- groeiregulatoren, beschermstoffen, penetrerende middelen, antiklontermidde- len, minerale en/of plantaardige oliën en/of wassen, kleurstoffen en driftweren- de middelen, en mengsels daarvan.

10. Een mengsel dat ten minste één N-heterocyclische verbinding bevat zoals ge- definieerd in één van de claims 1 tot en met 5 en ten minste één aanvullend agrochemisch agens, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit ten minste één andere nitrificatieremmer, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit 2-(3,4-dimethyl-pyrazol-1-yl)-barnsteenzuur (DMPSA), 3,4- dimethylpyrazool (DMP), 3,4-dimethylpyrazoolfosfaat (DMPP) dicyaandiamide (DCD), 1H-1,2,4-triazool, 3-methylpyrazool (3-MP), 2-chloor-6- (trichloormethyl)-pyridine, 5-ethoxy-3-trichloormethyl-1,2,4-diazol, 2-amino-4- chloor-6-methyl-pyrimidine, 2-mercapto-benzothia zole, 2-sulfanilamido - thiazool, thioureum, natriumazide, kaliumazide, 1-hydroxypyra zole, 2- methylpyrazool-1-carboxamide, 4-amino-1,2,4-triazool, 3-mercapto-1,2,4-triazo le, 2,4-diamino-6-trichloormethyl-5-triazine, koolstofbisulfide, ammoniumthio- sulfaat, so-diumtrithiocarbonaat, 2,3-di hydro-2,2-dimethyl-7- benzofuranolmethylcarbamaat en N-(2,6-dimethylfenyl)-N-(me thoxyacetyl)- alanine-methylester, ten minste één ureaseremmer, bij voorkeur gekozen uit N- butylthiofosforzuurtriamide (NBTPT) en/of N-n-propylthiofosforzuurtriamide (NPTPT), ten minste één gebruikelijke agrochemische hulpstof, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit waterige en/of organische oplosmiddelen, pH- regelaars, oppervlakteactieve stoffen, bevochtigingsmiddelen, spreidingsmid- delen, adhesiebevorderaars, dragers, vulstoffen, viscositeitsregelaars, emulga- toren, dispergeermiddelen, sequestreermiddelen antizinkmiddelen, coalescen- temiddelen, reologiemodificatoren, antischuimmiddelen, fotobeschermings- middelen, antivriesmiddelen, biostimulanten, pesticiden, biociden, planten- groeiregulatoren, beschermstoffen, penetrerende middelen, antiklontermidde- len, minerale en/of plantaardige oliën en/of wassen, kleurstoffen en driftweren- de middelen, en mengsels daarvan.

11. Een meststofmengsel, bestaande uit A. een anorganische en/of organische en/of organominerale meststof en B. 10 tot 10000 gewichtsprocent, berekend op de anorganische meststof, van ten minste een N-heterocyclische verbinding als gedefinieerd in een van de claims 1 tot en met 5.

12. Het meststofmengsel zoals beweerd in stelling 11, waarbij het meststofmeng- sel in vaste vorm is en de N-heterocyclische verbinding van de algemene for- mule (1) en/of (Il) en/of (III) en/of (IV) wordt aangebracht op het oppervlak van de, bij voorkeur anorganische, meststof.

13. Het meststofmengsel zoals bedoeld in een van de vorderingen 11 of 12, waarin het meststofmengsel ten minste één aanvullend agrochemisch agens bevat, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit ten minste één andere nitrificatieremmer, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit 2-(3,4-dimethyl-pyrazol-1-yl)-barnsteenzuur (DMPSA), 3,4- dimethylpyrazool (DMP), 3,4-dimethylpyrazoolfosfaat (DMPP) dicyaandiamide (DCD), 1H-1,2,4-triazool, 3-methylpyrazool (3-MP), 2-chloor-6- (trichloormethyl)-pyridine, 5-ethoxy-3-trichloormethyl-1,2,4-thiadiazol, 2-amino- 4-chloor-6-methyl-pyrimidine, 2-mercapto-benzothia zole, 2- sulfanilamidothiazool, thioureum, natriumazide, kaliumazide, 1-hydroxypyra - zole, 2-methylpyrazool-1-carboxamide, 4-amino-1,2,4-triazool, 3-mercapto- 1,2,4-tria zole, 2,4-diamino-6-trichloormethyl-5-triazine, koolstofbisulfide, am- moniumthiosulfaat, natriumtrithiocarbonaat, 2,3-dinydro-2,2-dimethyl-7- benzofuranolmethylcarbamaat en N-(2,6-dimethylfenyl)-N-(methoxyacetyl)- alaninemethylester, ten minste één ureaseremmer, bij voorkeur gekozen uit N- butylthiofosforzuurtriamide (NBTPT) en/of N-n-propylthiofosforzuurtriamide (NPTPT), ten minste één gebruikelijke agrochemische hulpstof, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit waterige en/of organische oplosmiddelen, pH- regelaars, oppervlakteactieve stoffen, bevochtigingsmiddelen, spreidingsmid- delen, adhesiebevorderaars, dragers, vulstoffen, viscositeitsregelaars, emulga- toren, dispergeermiddelen, sequestreermiddelen antizinkmiddelen, coalescen- temiddelen, reologiemodificatoren, antischuimmiddelen, fotobeschermings- middelen, antivriesmiddelen, biostimulanten, pesticiden, biociden, planten- groeiregulatoren, beschermstoffen, penetrerende middelen, antiklontermidde- len, minerale en/of plantaardige oliën en/of wassen, kleurstoffen en driftweren- de middelen, en mengsels daarvan.

14. Een werkwijze voor de productie van het meststofmengsel zoals beweerd in een van de vorderingen 11 tot en met 13 door het inbrengen van de N- heterocyclische verbinding in de meststof en/of het aanbrengen van de N- heterocyclische verbinding op het oppervlak van de meststof.

15. Een methode voor de bemesting van land- of tuinbouwgronden, waarbij een meststofmengsel dat verbindingen A en B bevat A. een anorganische en/of organische en/of organominerale meststof en B. 10 tot 10000 gewichtsprocent, berekend op de anorganische meststof, van een N-heterocyclische verbinding met als algemene formule (I) en/of (Il) en/of (II!) en/of (IV) zoals omschreven in een van de claims 1 tot en met 5, of de verbindingen A en B afzonderlijk, maar binnen een periode van 0 tot 5 uur, bij voorkeur 0 tot 1 uur, en bij voorkeur ongeveer op hetzelfde tijdstip, wordt op de bodem aangebracht.