BE1028573B1 - Heterocyclische verbindingen gebruikt als nitrificatieremmer - Google Patents

Description

Heterocyclische verbindingen gebruikt als nitrificatieremmer Beschrijving De onderhavige uitvinding heeft betrekking op het gebruik van een specifieke heterocy- clische verbinding als nitrificatieremmer of als stikstofstabilisator, op meststofmengsels die deze verbinding bevatten, op een procedé voor de bereiding ervan, en op de me- thode voor de bemesting van de bodem, met inbegrip van de toepassing ervan.

Om planten in de land- of tuinbouw te voorzien van de stikstof die zij nodig hebben, worden vaak meststoffen gebruikt die ammoniumverbindingen bevatten.

Met de uitvinding van het Haber-Bosch-proces in 1908 hebben meststoffen de Groene Revolutie in de jaren '50 en '60 gestimuleerd en bijgedragen tot de voeding van de ex- ponentieel groeiende wereldbevolking.

Aangezien stikstof (N) een van de belangrijkste voedingsstoffen is voor planten om te groeien, verhoogde deze industriële synthese van ammoniak (NH3) de grenzen van de aarde om voedselgewassen te produceren.

De N- bronnen, voornamelijk ammonium (NH4+) en nitraat (NO3-), die voor de bemesting werden gebruikt, werden echter niet alleen door de planten gebruikt, maar lekten ook uit in het milieu of werden microbieel omgezet via de stikstofcyclus in ontoegankelijke N- vormen.

Gemiddeld gaat er dus bijna 50% van de N-meststoffen verloren.

Bovendien leidt uitspoeling van N tot eutrofiëring van grondwater en vrij water en veroorzaakt het toxische algenbloei, verminderde waarde van recreatiewater of verontreiniging van drinkwater.

Microbiële omzetting in het broeikasgas N20 draagt sterk bij tot de opwar- ming van de aarde.

Met een wereldbevolking die tegen 2050 naar verwachting 9,7 mil- jard zal bedragen, verwacht de FAO echter dat de vraag naar meststoffen met 50% of meer zal toenemen.

Daarom zijn mitigatiestrategieën belangrijk om de hoeveelheid N- uitstoot zo veel mogelijk te beperken.

Eén aanpak is het remmen van de nitrificatie, d.w.z. de omzetting van NH4+ of NH3 in NO3-. In tegenstelling tot NO3- bindt het positief geladen NH4+ zich aan de negatief geladen bodemdeeltjes en zal het nauwelijks uit de bodem uitspoelen.

Daarom heeft NH4+ de voorkeur als N-bron en moet het in de bodem beschikbaar worden gehouden voor op- name door planten.

NH4+ kan echter worden omgezet in NO3- via nitrificatie, een mi- crobieel proces van de mondiale N-cyclus waarbij NH3, dat zich in een pH-afhankelijk evenwicht met NH4+ bevindt, door bodemmicro-organismen wordt omgezet in NO3- via nitriet (NO2-). Nitrificatie is dus een centrale stap die ervoor zorgt dat NH4+ in de N- cyclus terechtkomt en vervolgens wordt omgezet in ongewenste uitloogbare of vluchtige N-vormen. De eerste stap in de nitrificatie, de oxidatie van NH3, wordt in landbouwgronden en - substraten hoofdzakelijk uitgevoerd door ammonia-oxiderende bacteriën (AOB). Zij oxi- deren NH3 eerst tot hydroxylamine (NH2OH), wat wordt gekatalyseerd door het enzym ammonia-monooxygenase (AMO). Vervolgens katalyseert het enzym hydroxylamine oxidoreductase (HAO) de tweede stap: oxidatie van NH2OH tot nitriet (NO2-). In het verleden zijn verschillende organische en anorganische verbindingen geïdentifi- ceerd als nitrificatieremmers, maar slechts enkele daarvan worden momenteel in de handel gebracht, waaronder dicyaandiamide (DCD), nitrapyrine (2-chloor-6- (trichloormethyl)-pyridine) of 3,4-dimethylpyrazolfosfaat (DMPP). De doeltreffendheid van nitrificatieremmers kan echter variëren tussen verschillende stammen en geslach- ten. Daarom is het belangrijk het scala van toegepaste nitrificatieremmers uit te breiden.

Een probleem bij het gebruik van pyrazoolverbindingen als nitrificatieremmers is hun hoge vluchtigheid. Wanneer meststofpreparaten die pyrazoolverbindingen bevatten worden opgeslagen, is er een voortdurend verlies van actieve stof als gevolg van ver- damping. Daarom moeten de pyrazoolverbindingen door middel van passende maatre- gelen in een niet-vluchtige vorm worden geformuleerd.

EP-B-1 120 388 beschrijft additiezouten in fosforzuur van 3,4-dimethylpyrazool en 4- chloor-3-methylpyrazool voor gebruik als nitrificatieremmer. Door de zoutvorm is het mogelijk de vluchtigheid aanzienlijk te verminderen.

WO 96/24566 heeft betrekking op het gebruik van laag-volatiele pyrazoolderivaten met hydrofiele groepen als nitrificatieremmers. Als voorbeeld wordt 2-(N-3- methylpyrazool)barnsteenzuur (DMPSA) voorgesteld als nitrificatieremmer. Als geschik- te minerale meststoffen worden ammoniumhoudende nitraten, sulfaten of fosfaten ge- noemd.

WO 2011/032904 en WO 2013/121384 beschrijven pyrazolderivaten als nitrificatierem- mers, waarvan DMPSA er een is.

A. Saha et al. beschrijven in J. Heterocyclic. Chem, 47, 838 (2010) de groene synthese van 5-gesubstitueerde-1-3,4-thiadiazool-2-thiolen als nieuwe krachtige nitrificatierem- mers. De 1,3,4-thiaidazool-2-thiolen zijn 5-gesubstitueerd met alkyl- of arylresiduen. De verbindingen werden gescreend op hun in vitro nitrificatieremmende activiteit. Verbin- dingen die 5-gesubstitueerd zijn met heptyl, 2-chloorfenyl, 2,4-dichloorfenyl, 2- methylfenyl, 3-methylfenyl, 3,4-dimethoxyfenyl, 2-hydroxyfenyl, = 4-hydroxy-3- methoxyfenyl worden beschouwd als veelbelovende nitrificatieremmers.

GMW. McCarty en J.M. Bremner beschrijven in Biol Fertil Soils (1989) 8:204-211, de remming van nitrificatie in de bodem door heterocyclische stikstofverbindingen. Pyra- zool, 1,2,4-triazool en benzotriazool worden beschreven als de meest effectieve nitrifi- catieremmers in de bodem. 1,3,4-thiadiazool-2-thiolen, 5-gesubstitueerd met NH2 of SH worden onthuld als structuren (41) en (42). Gesubstitueerde 1,3,4-thiadiazolen worden beschreven in de structuren (43), (44) en (45). De effecten van thiadiazolen op de nitri- ficatie van ammonium in de bodem zijn samengevat in tabel 7. De structuren (41) en (42) behoorden tot de actieve nitrificatieremmers, maar alleen 5-ethoxy-3- trichloormethyl-1,2,4-thiadiazool en 3,4-dichloor-1,2,5-thiadiazool werden als krachtige remmers beschouwd.

WO 2005/007636 beschrijft 1,2,4-thiadiazool-thiolverbindingen als nitrificatieremmers. Er is een blijvende behoefte aan nieuwe nitrificatieremmers met een hoge nitrificatie- remmende werking, een lage toxiciteit en een lage vluchtigheid.

Het doel van de onderhavige uitvinding is daarom nieuwe nitrificatieremmers te ver- schaffen die bij voorkeur een hoge nitrificatieremmende activiteit hebben.

Een ander doel van de uitvinding is de ontwikkeling van een meststofmengsel dat een dergelijke nitrificatieremmer bevat, een methode voor de bereiding ervan en een me- thode voor de bemesting van de bodem met behulp van dit mengsel.

De doelstellingen worden bereikt door het gebruik van een heterocyclische verbinding van de algemene formule (I)

NN + de

X (D met de volgende definities: XS of NRA, waarbij R4 H is of bij voorkeur c1-4-alkyl, R1 H of bij voorkeur C3-12-koolwaterstofresidu dat 1 tot 3 heteroatomen kan bevat- ten, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, R2 Hof bij voorkeur C1-6-koolwaterstofresidu dat één heteroatoom kan bevatten, ge- kozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, of waarin R1 en R2 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt, een verzadigde of on- verzadigde heterocyclische radicaal met vijf of zes leden vormen die naar keuze nog een of twee heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof en zwavel, en welke heterocyclische radicaal deel kan uitmaken van een C4- 20-koolwaterstofresidu dat naar keuze naast het stikstofatoom dat R1 en R2 verbindt, nog een tot vier heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stik- stof, zuurstof, zwavel en fluor, waarin R1 en R2 elk via een koolstofatoom verbonden zijn met het stikstofatoom in NR1R2 en waarin in R1 en R2 heteroatomen van hetzelfde chemische element niet naast elkaar liggen, R3H , c1-4alky, S-C1-4-alkyl, NR5R6 waarbij R5 en R6 onafhankelijk van elkaar H, c1-- alkyı, fenyl, fluorofenyl zijn, als nitrificatieremmer, bij voorkeur gericht tegen AOB en eventueel comammox.

Daarin fungeren de heterocyclische verbindingen van de algemene formule (I), met na- me de N-gesubstitueerde 3-(aminomethyl)-1,3,4-thiadiazool-2-ionverbindingen en N- gesubstitueerde 1-(aminomethyl})-1,2,4-triazool-5-ionverbindingen (of -3- ionverbindingen) als nitrificatieremmer op vaste of in vloeibare meststoffen. Zij onder- gaan geen tautomerisme vanwege de N-substituent in de ring. Bovendien fungeren ze ook als stikstofstabilisator in vloeibare meststoffen of mest. Meststoffen kunnen organi- sche en/of anorganische en/of organominerale meststoffen zijn.

Het doel wordt verder bereikt door het gebruik van de heterocyclische verbinding van algemene formule (|) als additief of bekledingsmateriaal voor, bij voorkeur anorgani-

sche, meststoffen, bij voorkeur ammonium- en/of ureumhoudende stikstofhoudende meststoffen.

Het doel wordt verder bereikt door het gebruik van de heterocyclische verbinding van algemene formule (I) voor het verminderen van de stikstof- of koolstofverliezen in anor- 5 ganische en/of organische en/of organinerale meststoffen of stikstof- of koolstofhou- dende verbindingen of materialen en ook op oogstafval en weidegrond of tijdens de op- slag van vloeibare mest, en voor het verminderen van de ammoniakbelasting in dieren- stallen.

Het kan voorts voordelig zijn om de heterocyclische verbinding van algemene formule (N) nitrificatieremmer te gebruiken in combinatie met een aanvullend agrochemisch mid- del, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit - ten minste één andere nitrificatieremmer, bij voorkeur gekozen uit de groep be- staande uit 2-(3,4-dimethyl-pyrazol-1-yl)-barnsteenzuur (DMPSA), 3,4-dimethylpyrazool (DMP), 3,4-dimethylpyrazoolfosfaat (DMPP) dicyaandiamide (DCD), 1H-1,2,4-triazool, 3-methylpyrazool (3-MP), 2-chloor-6-(trichloormethyl)-pyridine, 5-ethoxy-3- trichloormethyl-1,2,4-thiadiazol, 2-amino-4-chloor-6-methyl-pyrimidine, 2-mercapto- benzothiazool, 2-sulfanilamidothiazool, thioureum, natriumazide, kaliumazide, 1- hydroxypyrazool, 2-methylpyrazool-1-carboxamide, 4-amino-1,2,4-triazool, 3-mercapto- 1,2,4-triazool, 2,4-diamino-6-trichloormethyl-5-triazine, koolstofbisulfide, ammoniumthi- osulfaat, natriumtrithiocarbonaat, 2,3-dinydro-2,2-dimethyl-7- benzofuranolmethylcarbamaat en N-(2,6-dimethylfenyl)-N-(methoxyacetyl)-alanine- methylester, AOA- of comammoxremmers, - ten minste één ureaseremmer, bij voorkeur gekozen uit N- butylthiofosforzuurtriamide (NBTPT) en/of N-n-propylthiofosforzuurtriamide (NPTPT), - ten minste één gebruikelijke agrochemische hulpstof, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit waterige en/of organische oplosmiddelen, pH-regelaars, oppervlak- teactieve stoffen, bevochtigingsmiddelen, spreidingsmiddelen, adhesiebevorderaars, dragers, vulstoffen, viscositeitsregelaars, emulgatoren, dispergeermiddelen, se- questreermiddelen antizinkmiddelen, coalescentiemiddelen, reologiemodificatoren, anti- schuimmiddelen, fotobeschermingsmiddelen, antivriesmiddelen, biostimulanten, pesti- ciden, biociden, plantengroeiregulatoren, beschermstoffen, penetrerende middelen, an- tiklontermiddelen, minerale en/of plantaardige oliën en/of wassen, kleurstoffen en drift- werende middelen,

en mengsels daarvan.

Wanneer de aanvullende nitrificatieremmer wordt gebruikt, is de gewichtsverhouding tussen de heterocyclische verbinding van algemene formule (I) en de aanvullende nitri- ficatieremmer bij voorkeur 0,1 tot 10 : 1, bij voorkeur 0,2 tot 5 : 1, en het meest bij voor- keur05tot2 1.

Daarom kan de nitrificatieremmer volgens de onderhavige uitvinding voordelig worden gebruikt samen met of gecombineerd met of vermengd met andere nitrificatieremmers die bij voorkeur ammoniakoxiderende bacteriën (AOB) of archae (AOA) of volledige ammoniakoxidatiebacteriën (comammox) remmen.-* Voorts kan, vooral wanneer de anorganische meststof ureum bevat, de nitrificatierem- mer ook worden gebruikt samen met of in combinatie met een ureaseremmer, die bij voorkeur wordt gekozen uit N-n-butylthiofosfortriamide (NBTPT of NBPT) en/of N-n- propylthiofosfortriamide (NPTPT of NPPT).

Indien de heterocyclische verbinding van algemene formule (I) van de onderhavige uit- vinding gecombineerd wordt met N-n-butylthiofosfortriamide (NBTPT) en/of N-n- propylthiofosfortriamide (NPTPT), ligt de gewichtsverhouding tussen nitrificatierem- mer(s) en ureaseremmer bij voorkeur tussen 0,1 en 10 : 1, bij voorkeur tussen 0,5 en 8 : 1, en bij voorkeur tussen 1 en 6 : 1.

Daarom heeft de uitvinding ook betrekking op een mengsel dat ten minste één hetero- cyclische verbinding van de algemene formule (I) bevat

NN A pe

X (D met de volgende definities: XS of NR4, waarbij R4 c1-4-alky IS, R1C3-12-koolwaterstofresidu dat 1 tot 3 heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel,

R2C1-6-koolwaterstofresidu dat één heteroatoom kan bevatten, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, of waarin R1 en R2 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt, een verzadigde of on- verzadigde heterocyclische radicaal met vijf of zes leden vormen die naar keuze nog een of twee heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof en zwavel, en welke heterocyclische radicaal deel kan uitmaken van een C4- 20-koolwaterstofresidu dat naar keuze naast het stikstofatoom dat R1 en R2 verbindt, nog een tot vier heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stik- stof, zuurstof, zwavel en fluor, waarin R1 en R2 elk via een koolstofatoom verbonden zijn met het stikstofatoom in NR1R2 en waarin in R1 en R2 heteroatomen van hetzelfde chemische element niet naast elkaar liggen, R3H , c1-4alky, S-C1-4-alkyl, NR5R6 waarbij R5 en R6 onafhankelijk van elkaar H, c1-- ally, fenyl, fluorofenyl zijn, en ten minste één aanvullend agrochemisch agens, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit - ten minste één andere nitrificatieremmer, bij voorkeur gekozen uit de groep be- staande uit 2-(3,4-dimethyl-pyrazol-1-yl)-barnsteenzuur (DMPSA), 3,4-dimethylpyrazool (DMP), 3,4-dimethylpyrazoolfosfaat (DMPP) dicyaandiamide (DCD), 1H-1,2,4-triazool, 3-methylpyrazool (3-MP), 2-chloor-6-(trichloormethyl)-pyridine, 5-ethoxy-3- trichloormethyl-1,2,4-thiadiazol, 2-amino-4-chloor-6-methyl-pyrimidine, 2-mercapto- benzothiazool, 2-sulfanilamidothiazool, thioureum, natriumazide, kaliumazide, 1- hydroxypyrazool, 2-methylpyrazool-1-carboxamide, 4-amino-1,2,4-triazool, 3-mercapto- 1,2,4-triazool, 2.,4-diamino-6-trichloormethyl-5-triazine, koolstofbisulfide, ammoniumthi- osulfaat, natriumtrithiocarbonaat, 2,3-dinydro-2,2-dimethyl-7- benzofuranolmethylcarbamaat en N-(2,6-dimethylfenyl)-N-(methoxyacetyl)-alanine- methylester, - ten minste één ureaseremmer, bij voorkeur gekozen uit N- butylthiofosforzuurtriamide (NBTPT) en/of N-n-propylthiofosforzuurtriamide (NPTPT), - ten minste één gebruikelijke agrochemische hulpstof, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit waterige en/of organische oplosmiddelen, pH-regelaars, oppervlak-

teactieve stoffen, bevochtigingsmiddelen, spreidingsmiddelen, adhesiebevorderaars, dragers, vulstoffen, viscositeitsregelaars, emulgatoren, dispergeermiddelen, se- questreermiddelen antizinkmiddelen, coalescentiemiddelen, reologiemodificatoren, anti- schuimmiddelen, fotobeschermingsmiddelen, antivriesmiddelen, biostimulanten, pesti- ciden, biociden, plantengroeiregulatoren, beschermstoffen, penetrerende middelen, an- tiklontermiddelen, minerale en/of plantaardige oliën en/of wassen, kleurstoffen en drift- werende middelen, en mengsels daarvan.

Een combinatie met ten minste één andere nitrificatieremmer en/of ureaseremmer ver- dient de voorkeur.

Volgens de onderhavige uitvinding zijn de heterocyclische verbindingen van algemene formule (I) sterke nieuwe nitrificatieremmers, die gericht zijn tegen micro-organismen en bij voorkeur tegen ammoniak-oxiderende bacteriën (AOB) en mogelijk ook ammoniak- oxiderende archaea (AOA) en/of comammoxbacteriën. Zij kunnen worden gecombi- neerd met bekende nitrificatieremmers en/of ueaseremmers.

Het nieuwe type nitrificatieremmers is in staat de nitrificatie vooral in de bodem te rem- men.

Volgens de onderhavige uitvinding kan een heterocyclische verbinding van algemene formule (I)

NN A pe

X (D met de volgende definities: XS of NRA, waarbij R4 H is of bij voorkeur c1-4-alkyl, R1 H of bij voorkeur C3-12-koolwaterstofresidu dat 1 tot 3 heteroatomen kan bevat- ten, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel,

R2 Hof bij voorkeur C1-6-koolwaterstofresidu dat één heteroatoom kan bevatten, ge- kozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, of waarin R1 en R2 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt, een verzadigde of on- verzadigde heterocyclische radicaal met vijf of zes leden vormen die naar keuze nog een of twee heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof en zwavel, en welke heterocyclische radicaal deel kan uitmaken van een C4- 20-koolwaterstofresidu dat naar keuze naast het stikstofatoom dat R1 en R2 verbindt, nog een tot vier heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stik- stof, zuurstof, zwavel en fluor, waarin R1 en R2 elk via een koolstofatoom verbonden zijn met het stikstofatoom in NR1R2 en waarin in R1 en R2 heteroatomen van hetzelfde chemische element niet naast elkaar liggen, R3H , c1-4alky, S-C1-4-alkyl, NR5R6 waarbij R5 en R6 onafhankelijk van elkaar H, c1-- ally, fenyl, fluorofenyl zijn, wordt gebruikt als nitrificatieremmer, bij voorkeur in combinatie met een meststof, bij voorkeur een (ammonium)stikstofhoudende meststof, bijvoorbeeld een vaste of vloeiba- re anorganische, organische en/of organominerale meststof, of mest. De heterocycli- sche verbinding wordt bijvoorbeeld gebruikt als nitrificatieremmer op vaste meststoffen, of wordt gebruikt als nitrificatieremmer of als stikstofstabilisator in vloeibare organische of anorganische of organominerale meststoffen of mest.

De heterocyclische verbindingen van de algemene formule (I) zijn meestal op zich be- kend en kunnen worden gesynthetiseerd volgens standaardtechnieken. Zij zijn gedeel- telijk commercieel verkrijgbare verbindingen en kunnen worden verkregen bij ENAMINE Ltd. UkrOrgSynthesis Ltd., of Vitas-M Laboratory, Ltd., of bij Merck Millipore, Burling- ton, MA, USA, of Merck KGaA.

In de algemene formule (I) is X S of NRA, waarbij R4 H of c1-4alky IS.

Wanneer X S is, zijn de verbindingen N-gesubstitueerde 3-(aminomethyl)-1,3,4- thiadiazool-2-thionverbindingen. Wanneer X NR4 is, zijn de verbindingen van algemene formule (1) N-gesubstitueerde 1-(aminomethyl)-1,2,4-triazool-5-thionverbindingen (of -3- thionverbindingen). In deze verbindingen is de aminogroep van het aminomethylresidu N-gesubstitueerd, zoals blijkt uit algemene formule (I).

Beide soorten verbindingen zijn krachtige nitrificatieremmers. Aangezien de 1,3,4-thiadiazool-2-thionverbindingen een 3-aminomethylsubstituent be- vatten, kunnen zij geen tautomerisme van de thionfunctie ondergaan. Hetzelfde geldt voor de 1,2,4-triazool-5-thionverbinding. Daarom kan er geen thiol-thione tautomerisme optreden, in tegenstelling tot de verbindingen van formule (Il) van WO 2005/007636 A1. In de verbindingen van de algemene formule (I) zijn sommige van de residuen koolwa- terstofresiduen. Koolwaterstofresiduen zijn samengesteld uit waterstof- en koolstofato- men. Zij kunnen verzadigd, onverzadigd of aromatisch zijn. Bovendien kunnen zij de heteroatomen bevatten die hierboven zijn genoemd. De koolwaterstofresiduen kunnen lineair, vertakt of cyclisch zijn, of kunnen een lineair of vertakt residu en een cyclisch residu in dezelfde structuur bevatten.

Als er meer dan één heteroatoom in de structuur aanwezig is, zijn heteroatomen van hetzelfde type niet direct covalent met elkaar verbonden. Bij voorkeur zijn de heteroa- tomen niet direct covalent verbonden met andere heteroatomen, maar doorsnijden Zij het koolwaterstofresidu. Daarom zijn de heteroatomen bij voorkeur niet-aangrenzend. Daarom liggen in R1 en R2 heteroatomen van hetzelfde chemische element niet naast elkaar. Bij voorkeur zijn in R1 en R2 de heteroatomen niet direct met elkaar verbonden. De verbinding van algemene formule (I) bevat bij voorkeur twee of drie cyclische struc- turen die bovendien al dan niet gecondenseerd kunnen zijn. De cyclische structuren zijn bij voorkeur vijf- of zesledig. De in algemene formule (I) afgebeelde cyclische structuur is een van de cyclische structuren die de verbinding van algemene formule (I) vormen. Gecondenseerde cyclische structuren zijn cyclische structuren waarbij twee cyclische structuren twee chemische elementen, bij voorkeur twee koolstofatomen, in hun respec- tieve ringstructuren gemeen hebben.

De cyclische structuur weergegeven in algemene formule (I) kan niet worden gecon- denseerd met een andere cyclische structuur. Derhalve kunnen alleen indien naast de in algemene formule (|) weergegeven cyclische structuur twee cyclische structuren aanwezig zijn, deze twee extra cyclische structuren worden gecondenseerd. De aanvul- lende cyclische structuren kunnen verzadigd, onverzadigd of aromatisch zijn. Indien twee gecondenseerde cyclische structuren aanwezig zijn, is het mogelijk dat één cycli- sche structuur aromatisch is en de andere cyclische structuur niet-aromatisch is.

Als twee extra cyclische structuren niet gecondenseerd zijn, kunnen zij direct covalent met elkaar verbonden zijn. Als alternatief kunnen zij worden verbonden door een af- standsbus die koolstofatomen, heteroatomen of beide kan bevatten. De afstandsbus kan bijvoorbeeld een C1-6-alkyleengroep zijn, een heteroatoom gekozen uit de groep bestaande uit zuurstof, zwavel en stikstof, of de afstandsbus kan bijvoorbeeld een amidogroep -C(=0)-NH- zijn. Indien de cyclische groepen verbonden zijn door een stik- stofatoom, is dit stikstofatoom bij voorkeur -NH- of -NR- waarbij R c1-4alky is, en R bij voorkeur methyl of ethyl. Bij voorkeur zijn R1, R2 en R4 niet H.

Bij voorkeur is R4 c1-3-aiky1, bij voorkeur methyl of ethyl. Bij voorkeur is R3 H, c1-3-alky1 Of S- C1-3-alkyl. Meer bij voorkeur is R3 H, methyl, ethyl, S-CH3 of S-C2H5, meest bij voor- keur H of methyl.

In NRSR6 is R5 bij voorkeur H of methyl. R6 is bij voorkeur c1-4-aiky1, fenyl of fluorfenyl. R1 is bij voorkeur een C4-10-koolwaterstofresidu dat één of twee heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel. Meer bij voorkeur is R1 een C4-8-koolwaterstofresidu met N en optioneel nog een heteroatoom, gekozen uit de groep stikstof en zwavel als heteroatomen.

R2 is bij voorkeur c1-6-aikyi Of C3-6-cycloalkyl dat één heteroatoom kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof en zwavel. Meer bij voorkeur is R2 c1-4-alkyl dat één heteroatoom kan bevatten, gekozen uit S.

In een bijkomende belichaming vormen R1 en R2 samen met een stikstofatoom dat hen verbindt een 5- of bij voorkeur 6-ledig verzadigd of onverzadigd heterocyclisch radicaal. In deze belichaming vormen R1 en R2 bij voorkeur samen met een stikstofatoom dat hen verbindt, een verzadigde of onverzadigde heterocyclische radicaal met 5 of bij voorkeur 6 leden die naar keuze ook een ander heteroatoom kan bevatten dat wordt gekozen uit de groep bestaande uit stikstof en zuurstof, en die deel kan uitmaken van een C4-20-koolwaterstofresidu dat zelf (in totaal) 1 tot 4 heteroatomen kan bevatten die worden gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof, zwavel en fluor, naast het stikstofatoom dat R1 en R2 verbindt.

Meer bij voorkeur vormen R1 en R2 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt, het verzadigde of onverzadigde structuurelement

— N > me © me N or or die deel kunnen uitmaken van een C4-20-koolwaterstofresidu dat naast het stikstof- atoom dat R1 en R2 verbindt, 1 tot 4 heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof, zwavel en fluor. De afgebeelde structuren kunnen dus al dan niet C=C- of C=N-bindingen bevatten.

Zij kunnen bij voorkeur deel uitmaken van een C4-15-koolwaterstofresidu, bij voorkeur C4-13-koolwaterstofresidu, bij voorkeur C7-13-koolwaterstofresidu. Dit koolwaterstofre- sidu kan 1 tot 3 heteroatomen bevatten, bij voorkeur 1 of 2 heteroatomen, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof, zwavel en fluor, naast het stikstofatoom dat R1 en R2 ver- bindt.

Verzadigde structuurelementen zoals hierboven afgebeeld genieten de voorkeur.

Volgens één belichaming van de uitvinding kan het structuurelement één of twee extra bindingen bevatten op het structuurelement aan koolstofatomen. Daarom kan het struc- tuurelement één of twee substituenten bevatten die via een koolstofatoom met het structuurelement verbonden zijn. Deze één of twee substituenten vormen samen met een structureel element het C4-20-koolwaterstofresidu, bij voorkeur C4-15- koolwaterstofresidu, meer bij voorkeur C4-13-koolwaterstofresidu, met name C7-13- koolwaterstofresidu.

Bij voorkeur bevat het hierboven afgebeelde structuurelement een of twee bindingen met andere koolstofatomen in de meta- of para-positie ten opzichte van de stikstof van de NR1R2-groep. Meer bij voorkeur bevat het structuurelement geen andere substitu- enten naast de een of twee verbindingen met andere koolstofatomen op de meta- of para-positie met de stikstof van de NR1R2-groep.

Met name moleculen zonder de methylzijdegroep op positie 5 van de thiadiazool zijn actief in de bodem. Daarom gaat de voorkeur vooral uit naar heterocyclische verbindin- gen waarbij R3 waterstof is.

Bij voorkeur zijn R1 en R2 elk via een koolstofatoom verbonden met de N in NR1R2.

In de voorbeelden worden specifieke residuen R1, R2, R3, X, R4, R5 en R6 genoemd.

Elk van deze residuen kan worden gebruikt om de verbindingen van algemene formule

(|) te beperken, ongeacht de andere residuen. Aldus kunnen de verbindingen van alge- mene formule (I) één of meer van de residuen R1, R2, R3, R4, R5, R6 en X bevatten zoals die in elk van de voorbeelden worden vermeld. In het bijzonder kan R2 methyl, ethyl, cyclopropyl of cyclopentyl zijn, waarbij één CH2- groep kan worden uitgewisseld en bij voorkeur wordt uitgewisseld door S. In een speci- fieke belichaming wordt één van deze vier betekenissen voor R2 gecombineerd met de betekenissen voor R1, zoals in de voorbeelden wordt getoond. Alkylresiduen kunnen lineair of vertakt zijn. Cyclische groepen in de residuen zijn bij voorkeur ringen met 5 of 6 leden die verza- digd, onverzadigd of aromatisch kunnen zijn. De ringen kunnen zuiver koolwaterstof- houdend zijn, b.v. fenylgroepen. Zij kunnen ook stikstof of zuurstof als heteroatoom be- vatten, bij voorkeur één stikstof- of zuurstofatoom. Voorbeelden van deze residuen wor- den in de onderstaande voorbeelden genoemd.

Bij voorkeur bevatten de verbindingen van de algemene formule (I) geen pyrazool of gesubstitueerde pyrazool structuurgroepen.

De verbindingen van de algemene formule (1) zijn nitrificatieremmers die de ammoniak- oxiderende bacteriën (AOB) en mogelijk ook de ammoniak-oxiderende archaea (AOA), met name Nitrosomonas europaea en/of Nitrosospira multiformis, en mogelijk ook de comammoxbacteriën, remmen.

De nitrificatieremmer van de onderhavige uitvinding valt met name op door het feit dat hij de nitrificatie van ammoniumstikstof in de bodem gedurende een lange periode ef- fectief remt.

Verwacht wordt dat de nitrificatieremmer van de onderhavige uitvinding gunstige toxico- logische eigenschappen bezit, een lage dampspanning heeft en goed in de bodem wordt gesorbeerd. Dientengevolge wordt de nitrificatieremmer niet in significante mate door sublimatie in de atmosfeer uitgestoten, noch wordt hij gemakkelijk door water uit- gespoeld. Hieruit vloeien in de eerste plaats economische voordelen voort, zoals een hoge rentabiliteit gezien de langduriger werking van het nitrificatieremmer, en milieu- voordelen, zoals een vermindering van de belasting van de lucht (klimaatgasreductie) en van het oppervlakte- en grondwater.

De nitrificatieremmers kunnen worden toegepast op bodems of substraten die worden bemest met een anorganische of organische of organominerale meststof. Gewoonlijk worden zij gebruikt in een meststofmengsel dat een (bij voorkeur anorganische) mest- stof en de heterocyclische verbinding van algemene formule (I) omvat.

Gewoonlijk wordt de heterocyclische verbinding van algemene formule (|) gebruikt in een hoeveel- heid van 10 tot 10000 ppm per gewicht, meer bij voorkeur 100 tot 10000 ppm per ge-

wicht, gebaseerd op de (bij voorkeur anorganische) meststof zonder water.

De gebruik- te hoeveelheid is gebaseerd op de droge meststof.

De nitrificatieremmer volgens de onderhavige uitvinding kan worden gebruikt in stof, in oplossing, dispersie of emulsie.

Daarom heeft de uitvinding ook betrekking op een op- lossing, dispersie of emulsie die de heterocyclische verbinding van algemene formule (I) van de onderhavige uitvinding bevat, bij voorkeur in een hoeveelheid van 0,1 tot 50 wt%, bij voorkeur 0,5 tot 30 wt%, en bij voorkeur 1 tot 20 wt%. Bij voorkeur wordt volgens de onderhavige uitvinding een meststofmengsel gevormd, dat verbindingen A en B bevat A. een anorganische en/of organische en/of organominerale meststof en B. 10 tot 10000 gewichtsprocenten, bij voorkeur 100 tot 10000 gewichtsprocenten, op basis van de meststof, van de heterocyclische verbinding van algemene formule (I) zo- als hierboven gedefinieerd.

De waterfractie in verbinding A en in het meststoffenmengsel bedraagt vaak niet meer dan 1,5 wt%, bij voorkeur niet meer dan 1,0 wt%, bij voorkeur niet meer dan 0,5 wt%, bij voorkeur niet meer dan 0,3 wt%, en is in de balans van de hoeveelheden dus verwaar- loosbaar.

De bestanddelen A en B vormen bij voorkeur ten minste 95 gew%, bij voor- keur ten minste 98 gew% van het meststofmengsel.

Het stikstofgehalte van component A (zonder water) bedraagt vaak ten minste 12 wt%, bij voorkeur ten minste 20 wt%, en bij voorkeur ten minste 22 wt%. Het stikstofgehalte kan bijvoorbeeld 25 tot 29 wt% bedragen, in het bijzonder 26 tot 28 wt%. Het stikstofge- halte kan worden verdeeld over snel werkende nitraatstikstof en langzaam werkende ammoniumstikstof.

De anorganische meststoffen zijn bij voorkeur ammonium- en/of ureumhoudende mest- stoffen, bij voorkeur ammoniumhoudende meststoffen die bovendien ureum kunnen bevatten.

Ureum bevattende meststoffen worden verder beschreven in WO 2016/207210.

De meststoffen die volgens de onderhavige uitvinding worden gebruikt, kunnen van na- tuurlijke of synthetische oorsprong zijn en worden op de bodem of op plantweefsels aangebracht om een of meer plantenvoedingsstoffen te leveren die essentieel zijn voor de groei van planten. De meststoffen die volgens de onderhavige uitvinding worden ge- bruikt, moeten ten minste stikstof als nutriënt leveren. Andere nutriënten zijn bijvoor- beeld K en P. Multinutriëntenmeststoffen of complexe meststoffen leveren twee of meer nutriënten. Anorganische meststoffen bevatten geen koolstofhoudende stoffen, behalve ureum. Organische meststoffen zijn meestal van planten of dieren afkomstig materiaal. Organische minerale meststoffen (combinaties van anorganische en organische mest- stoffen) kunnen eveneens worden gebruikt.

De belangrijkste enkelvoudige meststof op basis van stikstof is ammoniak of oplossin- gen daarvan. Ammoniaknitraat wordt ook veel gebruikt. Ureum is een andere populaire bron van stikstof, met het voordeel dat het vast en niet-explosief is. Een andere mest- stof op basis van stikstof is calciumammoniumnitraat.

De belangrijkste enkelvoudige fosfaatmeststoffen zijn de superfosfaten, waaronder en- kelvoudig superfosfaat, fosfogips en drievoudig superfosfaat. De belangrijkste kalium- houdende enkelvoudige meststof is kaliummuriaat (MOP).

De binaire meststoffen zijn bij voorkeur NP- of NK-meststoffen, die kunnen bestaan uit monoammoniumfosfaat (MAP) en diammoniumfosfaat (DAP).

NPK-meststoffen zijn drie-componenten-meststoffen die stikstof, fosfor en kalium leve- ren. NPK-meststoffen kunnen worden geproduceerd door het mengen van de bovenge- noemde enkelvoudige meststoffen in bulk of in korrels per stuk, zoals in Nitrophoska®. In sommige gevallen kunnen chemische reacties optreden tussen de twee of meer componenten.

Naast de hoofdbestanddelen, zoals N, P en K, kunnen micronutriënten (sporenelemen- ten) in de meststoffen aanwezig zijn. De belangrijkste micronutriënten zijn molybdeen, zink, borium en koper. Deze elementen worden meestal als in water oplosbare zouten geleverd.

De meststoffen die de voorkeur genieten, bevatten ammonium of ureum. Voorbeelden van ammoniumhoudende meststoffen die de voorkeur genieten zijn NPK-meststoffen, calciumammoniumnitraat, ammoniumsulfaatnitraat, ammoniumsulfaat en ammonium- fosfaat.

Andere geprefereerde ingrediënten van de meststofsamenstellingen zijn bijvoorbeeld spoorelementen, andere mineralen, standaardisatoren en bindmiddelen.

Organische meststoffen zijn meststoffen met een organische of biologische oorsprong, d.w.z. meststoffen die afkomstig zijn van levende of voorheen levende materialen, zoals dieren, planten of algen.

Meststoffen van biologische oorsprong zijn onder meer dierlijk afval, plantaardig afval, bijvoorbeeld van de voedselverwerking of de landbouw, com- post, en behandeld zuiveringsslib (biosolids). Dierlijke bronnen kunnen mest zijn, maar ook producten van het slachten van dieren, zoals bloedmeel, beendermeel, verenmeel, huiden, hoeven en hoorns.

Bodemverbeteraars, zoals turf of kokos, schors en zaagsel, kunnen ook worden toege- voegd.

Meststoffen kunnen onder meer zijn: ammoniumsulfaat, ammoniumnitraat, ammonium- sulfaatnitraat, ammoniumchloride, ammoniumbisulfaat, ammoniumpolysulfide, ammoni- umthiosulfaat, waterige ammoniak, watervrije ammoniak, ammoniumpolyfosfaat, alumi- niumsulfaat, calciumnitraat, calciumammoniumnitraat, calciumsulfaat gebrand magne- siet, calcietkalksteen, calciumoxide, hampeen (gechelateerd ijzer), dolomietkalksteen, hydraatkalk, calciumcarbonaat, diammoniumfosfaat, monoammoniumfosfaat, kaliumni- traat, kaliumbicarbonaat, monopotassiumfosfaat, magnesiumnitraat, magnesiumsulfaat, kaliumsulfaat, kaliumchloride, natriumnitraten, magnesische kalksteen, magnesia, dina- — triumdihydromolybdaat, kobaltchloride-hexahydraat, nikkelchloride-hexahydraat, indool- boterzuur, L-tryptofaan, ureum, ureum-formaldehyden, ureum-ammoniumnitraat, ureum met zwavelcoating, ureum met polymeercoating, isobutylideendiureum, K2SO4- 2MgSO4, kainiet, sylviniet, kieseriet, Epsomzouten, elementaire zwavel, mergel, gema- len oesterschelpen, vismeel, oliekoeken, vismest, bloedmeel, rotsfosfaat, superfosfaten, slakken, beendermeel, houtas, biochar, algen, algenextracten, struviet, mest, vleer- muisguano, turfmolm, compost, groen zand, katoenzaadmeel, verenmeel, krabmeel, visemulsie of een combinatie daarvan.

Het micronutriëntenmeststofmateriaal kan boor- zuur, een boraat, een boorfrit, kopersulfaat, een kopersfrit, een koperchelaat, een natri- umtetraboraatdecahydraat, een ijzersulfaat, een ijzeroxide, ijzerammoniumsulfaat, een ijzersfrit, een ijzerchelaat, een mangaansulfaat, een mangaansulfaat, een ijzeroxide, een ijzeroxide, een ijzerchelaat of een combinatie daarvan bevatten, mangaansulfaat, mangaanoxide, mangaanchelaat, mangaanchloride, mangaanfrit, natriummolybdaat, molybdizuur, zinksulfaat, zinkoxide, zinkcarbonaat, zinkfrit, zinkfosfaat, zinkchelaat of een combinatie daarvan. In een bijzondere belichaming bevat genoemde meststof of meststofsamenstelling geen onoplosbaar selenium, seleniummineraal, oplosbaar sele- nium of zouten daarvan.

De behandelde (anorganische, organische of organominerale) meststoffen volgens de uitvinding zijn bij voorkeur aanwezig in poedervorm, in prilvorm of in korrelvorm.

Naast de heterocyclische verbinding van de algemene formule (1) kunnen formuleringen bestaande uit de verbinding en agronomische hulpstoffen worden gebruikt om de nitrifi- catieremmer in de meststof op te nemen. Agronomische hulpstoffen zijn bijvoorbeeld oplosmiddelen, dispergeermiddelen, pH-regelaars, vulstoffen, stabiliteitsverbeteraars, oppervlakte-actieve stoffen.

De nitrificatieremmer kan in het meststoffenmengsel worden opgenomen door het mengsel of de formulering die het bevat te mengen met een vaste of vloeibare meststof of meststofformulering. Bij voorkeur is het meststofmengsel in vaste vorm en wordt de nitrificatieremmer op het oppervlak van de (anorganische, organische of organinerale) meststof aangebracht.

In een proces voor de productie van het meststofmengsel van de onderhavige uitvin- ding kan de nitrificatieremmer of de formulering die deze bevat, worden ingebracht in de (anorganische, organische of organominerale) meststof en/of worden aangebracht op het oppervlak van de anorganische meststof.

Mestkorrels worden geïmpregneerd of bedekt met de nitrificatieremmer, bijvoorbeeld door ze te besproeien met een formulering zoals een oplossing of een dispersie van de nitrificatieremmer en ze vervolgens te drogen. De methode is bijvoorbeeld bekend uit DE-A-41 28 828. Het verzegelen van de geïmpregneerde korrels met bijvoorbeeld pa- raffinewas, een aanvullend voorstel in laatstgenoemd document, is mogelijk, maar in het algemeen niet nodig.

Granulerende hulpstoffen die kunnen worden gebruikt voor de bereiding van vaste meststofsamenstellingen kunnen kalk, gips, siliciumdioxide of kaoliniet zijn.

Een alternatief is de toevoeging van de nitrificatieremmer tijdens de eigenlijke productie van de meststof, bijvoorbeeld in de drijfmest.

In de regel worden nitrificatieremmers in de bodem toegepast in hoeveelheden van 100 g/ha tot 10 kg/ha. Bij voorkeur ligt de hoeveelheid tussen 300 g/ha en 5 kg/ha.

De toediening van de nitrificatieremmer in vloeibare meststofformuleringen kan bijvoor- beeld geschieden door fertigatie met of zonder overmaat water, zoals beschreven in DE-C-102 30 593. Het meststofmengsel kan ten minste één extra nitrificatieremmer bevatten.

Deze ten minste één verdere nitrificatieremmer remt bij voorkeur de ammoniakoxiderende bacte- rien (AOB) en wordt bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit 2-(3,4-dimethyl- pyrazol-1-yl)-barnsteenzuur, 3,4-dimethylpyrazool (DMP), 3,4-dimethylpyrazoolfosfaat (DMPP), dicyaandiamide (DCD), 1H-1,2,4-triazool, 3-methylpyrazool (3-MP), 2-chloor- 6-(trichloormethyl)-pyridine, 5-ethoxy-3-trichloormethyl-1,2,4-thiadiazol, 2-amino-4- chloor-6-methyl-pyrimidine, 2-mercapto-benzothiazool, 2-sulfanilamidothiazool, thiou- reum, natriumazide, kaliumazide, 1-hydroxypyrazool, 2-methylpyrazool-1-carboxamide, 4-amino-1,2,4-triazool, 3-mercapto-1,2,4-triazool, 2.,4-diamino-6-trichloormethyl-5- triazine, koolstofbisulfide, ammoniumthiosulfaat, natriumtriocarbonaat, 2,3-dihydro-2,2- dimethyl-7-benzofuranolmethylcarbamaat en N-(2,6-dimethylfenyl)-N-(methoxyacetyl)- alanine-methylester.

Ook nitrificatieremmers die ammoniakoxiderende archaea (AOA) remmen, kunnen samen met de heterocyclische verbinding van algemene formule (I) worden gebruikt.

Wanneer de aanvullende nitrificatieremmer wordt gebruikt, is de gewichtsverhouding tussen de heterocyclische verbinding van algemene formule (I) en de aanvullende nitri- ficatieremmer bij voorkeur 0,1 tot 10 : 1, bij voorkeur 0,2 tot 5 : 1, en het meest bij voor- keur 0,5 tot 2 : 1. Voorts kan het meststofmengsel ten minste één ureaseremmer bevatten, die bij voor- keur wordt gekozen uit N-n-butylthiofosforzuur-triamide (NBTPT) en/of N-n- propylthiofosforzuur-triamide (NPTPT). Een ureaseremmer wordt gewoonlijk toege- voegd wanneer de meststof ureum bevat.

Stikstof uit ureum komt door de werking van urease vrij in de vorm van ammonium, en het ammonium kan nitrificatie ondergaan.

Daarom kan het voordelig zijn om een ureaseremmer te combineren met de nitrificatie- remmer.

Indien de heterocyclische verbinding van algemene formule (I) van de onderhavige uit- vinding gecombineerd wordt met N-n-butylthiofosfortriamide (NBTPT) en/of N-n- propylthiofosfortriamide (NPTPT), ligt de gewichtsverhouding tussen nitrificatierem- mer(s) en ureaseremmer bij voorkeur tussen 0,1 en 10 : 1, bij voorkeur tussen 0,5 en 8 : 1, en bij voorkeur tussen 1 en 6 : 1.

Van thiofosfortriamiden is bekend dat zij betrekkelijk gemakkelijk worden omgezet in de overeenkomstige fosfortriamiden en thiofosfortdiamiden, alsmede in andere metabolie- ten. Aangezien vocht in het algemeen niet volledig kan worden uitgesloten, zijn thiofos- forhoudende triamiden en de overeenkomstige fosfornoudende triamiden vaak in een mengsel met elkaar aanwezig. In deze specificatie worden daarom met de term “(thio)fosforzuurtriamide" niet alleen de zuivere thiofosforzuurtriamiden, respectievelijk fosforzuurtriamiden aangeduid, maar ook mengsels daarvan. Volgens de onderhavige uitvinding kunnen ook mengsels van N-n- butyl)thiofosfortriamide en N-(n-)propylthiofosfortriamide worden gebruikt, zoals be- schreven in EP-A-1 820 788. De meststofmengsels kunnen andere ingrediënten bevatten, zoals coatings, bijvoor- beeld van anorganische of organische polyzuren, die worden beschreven in US

6.139.596. Verder kunnen coatings van poeders, prils en granules worden gevormd van anorga- nisch materiaal, zoals coatings op zwavel- of mineraalbasis, of met een organisch po- lymeer. Respectieve coatings worden beschreven in WO 2013/121384 op pagina 23, regel 37 tot pagina 24, regel 16. Zoals hierboven vermeld, worden de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (|) bevatten, gebruikt in "effectieve hoeveelheden". Dit betekent dat zij wor- den gebruikt in een hoeveelheid die het mogelijk maakt het gewenste effect te verkrij- gen, namelijk een (synergistische) verbetering van de gezondheid van een plant, maar die geen aanleiding geeft tot fytotoxische symptomen op de behandelde plant. Voor gebruik volgens de onderhavige uitvinding kunnen de agrochemische formulerin- gen die de verbindingen van formule (|) bevatten, worden omgezet in de gebruikelijke formuleringen, bijvoorbeeld oplossingen, emulsies, suspensies, stof, poeders, pasta's en korrels. De gebruiksvorm hangt af van het specifieke beoogde doel; in elk geval moet het zorgen voor een fijne en gelijkmatige verdeling van de agrochemische formu- leringen die de verbindingen van formule (I) bevatten volgens de huidige uitvinding. De formuleringen worden op een voor de vakman bekende wijze bereid. De agrochemische formuleringen kunnen ook hulpstoffen bevatten die gebruikelijk zijn in agrochemische formuleringen. Welke hulpstoffen worden gebruikt, hangt af van res- pectievelijk de specifieke toepassingsvorm en de werkzame stof. Voorbeelden van ge-

schikte hulpstoffen zijn oplosmiddelen, vaste dragers, dispergeermiddelen of emulgato- ren (zoals verdere oplosbaarheidsbevorderende stoffen, beschermende colloïden, op- pervlakteactieve stoffen en hechtmiddelen), organische en anorganische verdikkings- middelen, bactericiden, antivriesmiddelen, antischuimmiddelen, eventueel kleurstoffen en tackifieermiddelen of bindmiddelen (bijv. voor formuleringen voor zaadbehandeling). Geschikte oplosmiddelen zijn water, organische oplosmiddelen zoals minerale oliefrac- ties met een gemiddeld tot hoog kookpunt, zoals kerosine of dieselolie, voorts koolteer- olie en oliën van plantaardige of dierlijke oorsprong, alifatische, cyclische en aromati- sche koolwaterstoffen, bijv. tolueen, xyleen, paraffine, tetrahydronaftaleen, gealkyleerde naftalenen of derivaten daarvan, alcoholen zoals methanol, ethanol, propanol, butanol en cyclohexanol, glycolen, ketonen zoals cyclohexanon en gamma-butyrolacton, dime- thylamiden van vetzuren, vetzuren en esters van vetzuren en sterk polaire oplosmidde- len, bijvoorbeeld aminen zoals N-methylpyrrolidon.

Vaste dragers zijn minerale aardmetalen zoals silicaten, silicagels, talk, kaolien, kalk- steen, krijt, keileem, löss, klei, dolomiet, diatomeeënaarde, calciumsulfaat, magnesium- sulfaat, magnesiumoxide, gemalen synthetische stoffen, meststoffen, zoals bv.ammoniumsulfaat, ammoniumfosfaat, ammoniumnitraat, ureum en producten van plantaardige oorsprong, zoals graanmeel, boomschorsmeel, houtmeel en notenscha- lenmeel, cellulosepoeders en andere vaste dragers.

Geschikte oppervlakte-actieve stoffen (hulpstoffen, bevochtigers, tackifiers, disper- geermiddelen of emulgeermiddelen) zijn alkalimetaal-, aardalkalimetaal- en ammonium- zouten van aromatische sulfonzuren, zoals ligninesulfonzuur, fenolsulfonzuur, nafta- leensulfonzuur, dibutylnaftaleensulfonzuur en vetzuren alkylsulfonaten, alkyl- arylsulfonaten, alkylsulfaten, laurylether-sulfaten, vetalcoholsulfaten en gesulfateerde hexa-, hepta- en octadecanolaten, gesulfateerde vetalcoholglycolethers, voorts conden- saten van naftaleen of van naftaleensulfonzuur met fenol en formaldehyde polyoxy- ethyleen-octylfenylether, geëthoxyleerd isooctylfenol, octylfenol, nonylfenol, alkylfenyl- polyglycolethers, tributylfenylpolyglycolether, tristearylfenylpolyglycolether, alkylarylpo- lyetheralcoholen, alcohol- en vetalcohol/ethyleenoxidecondensaten, geëthoxyleerde — ricinusolie, polyoxyethyleenalkylethers, geëthoxyleerd polyoxypropyleen, laurylalcohol- polyglycoletheracetaal, sorbitolesters, lignine-sulfietafvalvloeistof en eiwitten, gedenatu- reerde eiwitten, polysacchariden (bijv.b.v. methylcellulose), hydrofoob gewijzigd zet- meel, polyvinylalcoholen, polycarboxylaten, polyalkoxylaten, polyvinylamines, polyvinyl-

pyrrolidon en de copolymeren daarvan. Voorbeelden van verdikkingsmiddelen (d.w.z. verbindingen die aan formuleringen een gewijzigde vloeibaarheid verlenen, d.w.z. een hoge viscositeit onder statische omstandigheden en een lage viscositeit bij agitatie) zijn polysacchariden en organische en anorganische kleisoorten zoals Xanthaangom.

Een "pesticide" is iets dat een schadelijk organisme ("plaag") of een ziekte voorkomt, vernietigt of bestrijdt, of planten of plantaardige producten beschermt tijdens de produc- tie, de opslag en het vervoer.

De term omvat onder meer: herbiciden, fungiciden, insecticiden, acariciden, nematici- den, molluskiciden, rodenticiden, groeiregulatoren, afweermiddelen, rodenticiden en biociden, alsmede gewasbeschermingsmiddelen. Gewasbeschermingsmiddelen zijn "pesticiden" die gewassen of gewenste of beoogde planten beschermen. Zij worden hoofdzakelijk gebruikt in de landbouwsector, maar ook in de bosbouw, de tuinbouw, in recreatiegebieden en in tuinen voor eigen gebruik. Zij bevatten ten minste één werkzame stof en hebben een van de volgende functies: - planten of plantaardige producten te beschermen tegen plagen/ziekten, vóór of na de oogst; - de levensprocessen van planten beïnvloeden (zoals stoffen die hun groei beïn- vloeden, met uitzondering van voedingsstoffen), - plantaardige producten te bewaren; - de groei van ongewenste planten of delen van planten te vernietigen of te voor- komen. Zij kunnen ook andere bestanddelen bevatten, waaronder beschermstoffen en synergis- tische middelen. Een werkzame stof is een chemische stof, een plantenextract, een feromoon of een micro-organisme (met inbegrip van virussen), die werkzaam is tegen "schadelijke orga- nismen" of op planten, delen van planten of plantaardige producten. Het meest gebruikelijke gebruik van pesticiden is in de vorm van gewasbeschermings- middelen (GBP's). De term "pesticide" wordt vaak door elkaar gebruikt met "gewasbeschermingsmiddel", maar pesticide is een bredere term die ook andere toepassingen dan planten/gewassen omvat, bijvoorbeeld biociden.

Biociden, zoals herbiciden, bactericiden, mollusciciden, algiciden, fytotoxische stoffen, fungiciden, en mengsels daarvan kunnen worden toegevoegd. Ter conservering en stabilisering van de formulering kunnen bactericiden worden toe- gevoegd. Voorbeelden van geschikte bactericiden zijn die op basis van dichlorofeen en benzylalcohol hemi-formal (Proxel® van ICI of Acticide® RS van Thor Chemie en Ka- thon® MK van Rohm & Haas) en isothiazolinone-derivaten zoals alkylisothiazolinonen en benzisothiazolinonen (Acticide® M BS van Thor Chemie). Voorbeelden van geschik- te antivriesmiddelen zijn ethyleenglycol, propyleenglycol, ureum en glycerine. Voorbeel- den voor antischuimmiddelen zijn siliconenemulsies (zoals bijvoorbeeld Silikon® SRE, Wacker, Duitsland of Rhodorsil®, Rhodia, Frankrijk), lange ketenalcoholen, vetzuren, zouten van vetzuren, fluororganische verbindingen en agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (I) daarvan bevatten.

Geschikte kleurstoffen zijn pigmenten met een lage oplosbaarheid in water en in oplos- middelen oplosbare, bv. in water oplosbare, kleurstoffen.

Voorbeelden van adhesiepromotoren, zoals tackifiers of binders, zijn polyvinylpyrroli- dons, polyvinylacetaten, polyvinylalcoholen en cellulose-ethers (Tylose®, Shin-Etsu, Japan).

Granulaten, bijvoorbeeld gecoate granulaten, geïmpregneerde granulaten en homoge- ne granulaten, kunnen worden bereid door de werkzame stoffen aan vaste dragers te binden. Voorbeelden van vaste dragers zijn minerale aardes zoals silicagels, silicaten, talk, kaolien, attaclay, kalksteen, kalk, krijt, bole, löss, klei, dolomiet, diatomeeënaarde, calciumsulfaat, magnesiumsulfaat, magnesiumoxide, gemalen synthetische stoffen, meststoffen, zoals bijv, ammoniumsulfaat, ammoniumfosfaat, ammoniumnitraat, ureum, en producten van plantaardige oorsprong, zoals graanmeel, boomschorsmeel, hout- meelen notenschalenmeel, cellulosepoeders en andere vaste dragers. Antiklontermiddelen zoals oliën en/of wassen kunnen worden toegevoegd.

De agrochemische formuleringen bevatten over het algemeen tussen 0,01 en 95%, bij voorkeur tussen 0,1 en 90%, en het meest bij voorkeur tussen 0,5 en 90%, in gewicht aan werkzame stoffen. De verbindingen van de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (I) bevatten, worden gebruikt in een zuiverheid van 90% tot 100%, bij voorkeur van 95% tot 100% (volgens hun NMR-spectrum).

De verbindingen van de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (I) bevatten, kunnen als zodanig of in de vorm van hun landbouwkundige samenstellin- gen worden gebruikt, b.v. in de vorm van rechtstreeks vernevelbare oplossingen, poe- ders, suspensies, dispersies, emulsies, oliedispersies, pasta's, stuifbare producten, strooimiddelen of granulaten, door middel van verstuiven, verstuiven, verstuiven, uit- spreiden, borstelen, onderdompelen of gieten. De toepassingsvormen hangen volledig af van de beoogde doeleinden; het is de bedoeling om in elk geval te zorgen voor een zo goed mogelijke verdeling van de verbindingen die aanwezig zijn in de agrochemi- sche formuleringen die de verbindingen van formule (I) bevatten.

Waterige toepassingsvormen kunnen worden bereid uit emulsieconcentraten, pasta's of bevochtigbare poeders (verspuitbare poeders, oliedispersies) door toevoeging van wa- ter. Voor de bereiding van emulsies, pasta's of oliedispersies kunnen de stoffen, als zo- danig of opgelost in een olie of oplosmiddel, in water worden gehomogeniseerd met behulp van een bevochtiger, tackifieerder, dispergeermiddel of emulgator. Als alternatief kunnen concentraten worden bereid die bestaan uit een werkzame stof, een bevochti- gingsmiddel, een tackifieermiddel, een dispergeermiddel of een emulgator en eventueel een oplosmiddel of olie, en dergelijke concentraten zijn geschikt om met water te wor- den verdund.

De concentraties van de werkzame stoffen in de gebruiksklare preparaten kunnen bin- nen betrekkelijk ruime marges worden gevarieerd. In het algemeen liggen zij tussen 0,0001 en 10%, bij voorkeur tussen 0,001 en 1%, van het gewicht van de verbindingen van de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (1) bevatten.

De agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (I) bevatten, kunnen ook met succes worden gebruikt in het ultra-lage-volume-proces (ULV), waarbij het mo- gelijk is om composities toe te passen die meer dan 95 gewichtspercenten werkzame stof bevatten, of zelfs om de werkzame stof zonder additieven toe te passen. Verschillende soorten oliën, bevochtigers, hulpstoffen, herbiciden, fungiciden, andere pesticiden, of bactericiden kunnen aan de actieve verbindingen worden toegevoegd, eventueel pas vlak voor het gebruik (tankmix). Deze middelen kunnen worden ver- mengd met de verbindingen van de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (|) bevatten in een gewichtsverhouding van 1:100 tot 100:1, bij voorkeur 1:10 tot 10:1.

De samenstellingen van deze uitvinding kunnen ook meststoffen (zoals ammoniumni- traat, ureum, kalium en superfosfaat), fytotoxische stoffen en plantengroeiregulatoren (plant growth amendments) en beschermstoffen bevatten. Deze kunnen achtereenvol- gens of in combinatie met de hierboven beschreven samenstellingen worden gebruikt, eventueel ook pas vlak voor gebruik toegevoegd (tankmix). De plant(en) kan (kunnen) bijvoorbeeld met een samenstelling van deze uitvinding worden besproeid, hetzij vóór, hetzij na de behandeling met de meststoffen. In de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (I) bevatten, hangt de gewichtsverhouding van de verbindingen in het algemeen af van de eigenschappen van de verbindingen van de agrochemische formuleringen die de verbindingen van for- mule (1) bevatten.

De agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (I) bevatten, kunnen afzonderlijk worden gebruikt of reeds geheel of gedeeltelijk met elkaar worden ver- mengd om de samenstelling volgens de uitvinding te bereiden. Zij kunnen ook worden verpakt en verder worden gebruikt als combinatiecompositie zoals een kit van onderde- len.

De gebruiker brengt de samenstelling volgens de uitvinding gewoonlijk aan vanuit een voordoseertoestel, een rugspuit, een spuittank of een sproeivliegtuig. Hierbij wordt de agrochemische samenstelling aangemaakt met water en/of buffer tot de gewenste toe- passingsconcentratie, waarbij eventueel nog andere hulpstoffen kunnen worden toege- voegd, en aldus wordt de gebruiksklare spuitvloeistof of de agrochemische samenstel- ling volgens de uitvinding verkregen. Gewoonlijk wordt 50 tot 500 liter gebruiksklare spuitvloeistof per hectare nuttig landbouwareaal toegediend, bij voorkeur 50 tot 400 Ii- ter.

In een bijzondere belichaming wordt de absolute hoeveelheid van de werkzame stoffen, vertegenwoordigd door formule (1), gebruikt tussen 1 mg/liter en 100 mg/liter, in het bij- zonder tussen 1 mg/liter en 20 mg/liter, in het bijzonder tussen 1 mg/liter en 25 mg/liter, in het bijzonder tussen 2 mg/liter en 200 mg/liter vooral tussen 2 mg/l en 100 mg/l, vooral tussen 2 mg/l en 50 mg/l, vooral tussen 2 mg/l en 25 mg/l, vooral tussen 4 mg/l en 40 mg/l, vooral tussen 4 mg/l en 20 mg/l, vooral tussen 4 mg/l en 16 mg/l, en vooral tussen 4 mg/l en 12 mg/l.

Volgens één belichaming kunnen de afzonderlijke verbindingen van de agrochemische formuleringen die de verbindingen van formule (I) bevatten, geformuleerd als samen-

stelling (of formulering) zoals delen van een kit of delen van het inventieve mengsel, door de gebruiker zelf worden gemengd in een spuittank en kunnen verdere hulpstoffen worden toegevoegd, indien van toepassing (tankmengsel).

Onder "agrochemisch middel" wordt hier verstaan: elke werkzame stof die in de agro- chemische industrie kan worden gebruikt (met inbegrip van toepassingen in de land- bouw, de tuinbouw, de bloementeelt en voor gebruik in huis en tuin, maar ook pro- ducten die bestemd zijn voor niet-gewasgebonden toepassingen zoals toepassingen ter bestrijding van ongewenste insecten en knaagdieren in het kader van de volksgezond- heid/bestrijding van ongedierte, huishoudelijk gebruik, zoals fungiciden en insecticiden voor huishoudelijk gebruik, en middelen ter bescherming van planten of delen van plan- ten, gewassen, bollen, knollen, vruchten (bijv.b.v. tegen schadelijke organismen, ziek- ten of plagen); voor het onder controle houden, bij voorkeur bevorderen of doen toene- men van de groei van planten; en/of voor het bevorderen van de opbrengst van planten, gewassen of de delen van planten die worden geoogst (b.v. de vruchten, bloemen, za- den enz.). Een "agrochemische samenstelling" zoals hier gebruikt, is een samenstelling voor agro- chemisch gebruik, zoals hier gedefinieerd, die ten minste één werkzame stof van een verbinding van formule (I) bevat, eventueel met één of meer additieven die een optimale dispersie, atomisering, depositie, bevochtiging van de bladeren, distributie, retentie en/of opname van agrochemische middelen bevorderen. Dergelijke additieven zijn bij- voorbeeld verdunningsmiddelen, oplosmiddelen, hulpstoffen, oppervlakte-actieve stof- fen, bevochtigingsmiddelen, spreidingsmiddelen, oliën, stickers, viscositeitsregelaars (zoals verdikkingsmiddelen, penetranten), pH-regelaars (zoals buffers, aanzuringsmid- delen), antizinkmiddelen, antivriesmiddelen, fotobeschermingsmiddelen, antischuim- middelen, biociden en/of driftremmers. Een "drager", zoals hierin gebruikt, is een vaste, halfvaste of vloeibare drager waarin of waarop een werkzame stof op geschikte wijze kan worden opgenomen, geïmmobili- seerd, geïmmobiliseerd, geadsorbeerd, geabsorbeerd, gebonden, ingekapseld, inge- bed, bevestigd of gecomprimeerd. Niet-limiterende voorbeelden van dergelijke dragers zijn nanocapsules, microcapsules, nanosferen, microsferen, nanodeeltjes, microdeel- tjes, liposomen, blaasjes, parels, een gel, zwakke ionische harsdeeltjes, liposomen, cochleaat-afleveringsvehikels kleine korrels, granulaten, nanobuisjes, bucky-balletjes, waterdruppeltjes die deel uitmaken van een water-in-olie-emulsie, oliedruppeltjes die deel uitmaken van een olie-in-water-emulsie, organische materialen zoals kurk, hout of andere materialen van plantaardige oorsprong (bv.bijvoorbeeld in de vorm van zaad- doppen, houtspaanders, pulp, bolletjes, kralen, vellen of enige andere geschikte vorm), papier of karton, anorganische materialen zoals talk, klei, microkristallijne cellulose, sili-

ca, aluminiumoxide, silicaten en zeolieten, of zelfs microbiële cellen (zoals gistcellen) of geschikte fracties of fragmenten daarvan.

De termen "effectieve hoeveelheid", "effectieve dosis" en "effectieve hoeveelheid", zoals hier gebruikt, betekenen de hoeveelheid die nodig is om het gewenste resultaat of de gewenste resultaten te bereiken.

Meer exemplarische informatie over hoeveelheden, toepassingswijzen en te gebruiken geschikte verhoudingen wordt hieronder gegeven.

De vakman is zich terdege bewust van het feit dat een dergelijke hoeveelheid kan vari- eren in een breed bereik en afhankelijk is van diverse factoren zoals de behandelde cultuurplant en de klimatologische en bodemomstandigheden.

De hier gebruikte termen "bepalen", "meten", "beoordelen", "controleren" en "analyse- ren" zijn onderling verwisselbaar en omvatten zowel kwantitatieve als kwalitatieve bepa- lingen.

Het is duidelijk dat de agrochemische samenstelling stabiel is, zowel tijdens opslag als tijdens gebruik, wat betekent dat de integriteit van de agrochemische samenstelling be- houden blijft onder opslag- en/of gebruiksomstandigheden van de agrochemische sa- menstelling, die verhoogde temperaturen, vries-dooicycli, veranderingen in pH of in io- nensterkte, UV-straling, aanwezigheid van schadelijke chemicaliën en dergelijke kun- nen omvatten.

Meer bij voorkeur blijven de verbindingen van formule (I) zoals hier be- schreven stabiel in de agrochemische samenstelling, wat betekent dat de integriteit en de activiteit van de verbindingen behouden blijven onder opslag- en/of gebruiksomstan- digheden van de agrochemische samenstelling, die verhoogde temperaturen, vries- dooicycli, veranderingen in pH of in ionensterkte, UV-straling, de aanwezigheid van schadelijke chemicaliën en dergelijke kunnen omvatten.

Bij voorkeur blijven de verbin- dingen van formule (|) stabiel in de agrochemische samenstelling wanneer de agro- chemische samenstelling wordt opgeslagen bij omgevingstemperatuur gedurende een periode van twee jaar of wanneer de agrochemische samenstelling wordt opgeslagen bij 54°C gedurende een periode van twee weken.

Bij voorkeur behoudt de agrochemi- sche samenstelling van de onderhavige uitvinding ten minste ongeveer 70% activiteit, bij voorkeur ten minste ongeveer 70% tot 80% activiteit, bij voorkeur ongeveer 80% tot

90% activiteit of meer. Voorbeelden van geschikte draagstoffen zijn onder meer al- ginaten, gommen, zetmeel, B-cyclodextrinen, cellulosen, polyureum, polyurethaan, po- lyester of klei. De agrochemische samenstelling kan in om het even welke formulering voorkomen; de voorkeur gaat uit naar poeders, bevochtigbare poeders, bevochtigbare granulaten, in water dispergeerbare granulaten, emulsies, emulgeerbare concentraten, stof, suspen- sies, suspensieconcentraten, suspoemulsies, capsulesuspensies, waterige dispersies, oliedispersies, aërosolen, pasta's, schuim, slurries of vloeibaar gemaakte concentraten. In weer een andere belichaming voorziet de uitvinding in het gebruik van de agrochemi- sche samenstellingen van de uitvinding voor het verhogen van de abiotische stresstole- rantie bij planten.

De agrochemische samenstelling volgens de uitvinding kan eenmaal op een gewas worden toegepast, maar kan ook twee of meer keren na elkaar worden toegepast met een interval tussen elke twee toepassingen. De agrochemische samenstelling volgens de uitvinding kan alleen of in combinatie met andere materialen, bij voorkeur andere agrochemische samenstellingen, op het gewas worden aangebracht; als alternatief kan de agrochemische samenstelling volgens de uitvinding afzonderlijk op het gewas wor- den aangebracht met andere materialen, bij voorkeur andere agrochemische samen- stellingen, die op verschillende tijdstippen op hetzelfde gewas worden aangebracht.

In weer een andere belichaming voorziet de uitvinding in een methode voor de vervaar- diging van ("of de productie van" hetgeen gelijkwaardig is aan verwoording) een agro- chemische samenstelling volgens de uitvinding, bestaande uit de formulering van een molecuul van formule (1) zoals hiervóór gedefinieerd, samen met ten minste één gebrui- kelijke agrochemische hulpstof. Geschikte fabricagemethoden zijn bekend in de kunst en omvatten, maar zijn niet beperkt tot, mengen met hoge of lage afschuifsnelheid, nat of droog malen, druipgieten, inkapselen, emulgeren, coaten, encrusteren, pilling, extru- siegranulatie, wervelbedgranulatie, co-extrusie, sproeidrogen, sproeikoelen, verneve- ling, additie- of condensatiepolymerisatie, interfaciale polymerisatie, polymerisatie in situ, coacervatie, sproei-inkapseling, afkoeling van gesmolten dispersies, verdamping van oplosmiddelen, fasescheiding, solventextractie, sol-gelpolymerisatie, bekleding met een vloeistofbed, bekleding met een pan, smelten, passieve of actieve absorptie of ad- sorptie.

De gebruikelijke agrochemische hulpstoffen zijn algemeen bekend en omvatten bij voorkeur, maar zijn niet beperkt tot, waterige en/of organische oplosmiddelen, pH- regelaars (zoals buffers, zuurteregelaars), oppervlakteactieve stoffen, bevochtigings- middelen, spreidingsmiddelen, adhesiebevorderaars (zoals tackifiers, stickers), draag- stoffen, vulstoffen, viscositeitsregelaars (zoals verdikkingsmiddelen), emulgatoren, dis- pergeermiddelen, sequestreermiddelen, antizinkmiddelen, coalescentiemiddelen, reolo- gieversterkers, antischuimmiddelen, fotobeschermers, antivriesmiddelen, biostimulan- ten (met inbegrip van bacteriële en/of schimmelinoculanten of micro-organismen), bio- ciden (bij voorkeur geselecteerd uit herbiciden, bactericiden, fytotoxische stoffen, fungi- ciden, pesticiden en mengsels daarvan), plantengroeiregulatoren, beschermstoffen, penetranten, antiklontermiddelen, minerale en/of plantaardige oliën en/of wassen, kleurstoffen en driftwerende middelen of een geschikte combinatie daarvan. De gebrui- kelijke agrochemische hulpstoffen zijn bij voorkeur geen waterige of organische oplos- middelen.

Het insecticide kan bestaan uit een organofosfaat, een carbamaat, een pyrethroïde, een acaricide, een alkylftalaat, boorzuur, een boraat, een fluoride, zwavel, een haloaroma- tisch gesubstitueerd ureum, een koolwaterstofester, een insecticide op biologische ba- sis of een combinatie daarvan. Het herbicide, dat wordt gebruikt om ongewenste plan- ten te verwijderen, kan een chloorfenoxyverbinding, een nitrofenolverbinding, een nitro- cresolverbinding, een dipyridylverbinding, een acetamide, een alifatische acide, een anilide, een benzamide, een benzoëzuur, een benzoëzuurderivaat, anijszuur, een anijs- zuurderivaat, een benzonitril, benzothiadiazinon-dioxide, een thiocarbamaat, een car- bamaat, een carbanilaat, een chloropyridilaat of een combinatie daarvan bevatten, carbanilaat, chlooropyridinyl, een cyclohexenon derivaat, een dinitroaminobenzeen derivaat, een fluorodinitrotoluidine verbinding, isoxazolidinon, nicotinezuur acide, isopropylamine, een isopropylaminederivaat, oxadiazolinon, een fosfaat, een ftalaat, een picolinezuurverbin- ding, een triazine, een triazool, een uracil, een ureumderivaat, endothall, natriumchlo- raat, of een combinatie daarvan. Het fungicide kan bestaan uit een gesubstitueerd ben- zeen, een thiocarbamaat, een ethyleen-bis-dithiocarbamaat, een thiofthalidamide, een koperverbinding, een organische kwikverbinding, een organotinverbinding, een cadmi- umverbinding, anilazine, benomyl, cyclohexamide, dodine, etridiazool, iprodion, met- laxyl, thiamimefon, triforine, of een combinatie daarvan. De schimmelinoculant kan be- staan uit een schimmelinoculant van de familie Glomeraceae, een schimmelinoculant van de familie Claroidoglomeraceae, een schimmelinoculant van de familie Acaulospo-

raceae, een schimmelinoculant van de familie Sacculospraceae een schimmelinoculant van de familie Entrophosporaceae, een schimmelinoculant van de familie Pacidsprora- ceae, een schimmelinoculant van de familie Diversisporaceae, een schimmelinoculant van de familie Paraglomeraceae, een schimmelinoculant van de familie Archaeospora- ceae een schimmelinoculant van de familie Geosiphonaceae, een schimmelinoculant van de familie Ambisporacea, een schimmelinoculant van de familie Scutellosproaceae, een schimmelinoculant van de familie Dentiscultataceae, een schimmelinoculant van de familie Racocetraceae een schimmelinoculant van het fylum Basidiomycota, een schimmelinoculant van het fylum Ascomycota, een schimmelinoculant van het fylum Zygomycota, een schimmelinoculant van het genus G/omus of een combinatie daarvan. De bacteriële inoculant kan een bacteriële inoculant van het geslacht Rhizobium omvat- ten, een bacteriële inoculant van het geslacht Bradyrhizobium, een bacteriële inoculant van het geslacht Mesorhizobium, een bacteriële inoculant van het geslacht Azorhizobi- um, een bacteriële inoculant van het geslacht Allorhizobium bacteriële inoculant van het genus Burkholderia, bacteriële inoculant van het genus Sinorhizobium, bacteriële inocu- lant van het genus K/uyvera, bacteriële inoculant van het genus Azotobacter, bacteriële inoculant van het genus Pseudomonas bacteriële inoculant van het genus Azosprillium, bacteriële inoculant van het genus Bacillus, bacteriële inoculant van het genus Strepto- myces, bacteriële inoculant van het genus Paenibacillus, bacteriële inoculant van het genus Paracoccus, bacteriële inoculant van het genus Enterobacter bacteriële inoculant van het genus A/caligenes, bacteriële inoculant van het genus Mycobacterium, bacteri- ele inoculant van het genus Trichoderma, bacteriële inoculant van het genus G/ioc/adi- um, bacteriële inoculant van het genus K/ebsiella, of een combinatie daarvan.

Het mengsel kan bovendien ten minste één micro-organisme bevatten, gekozen uit de list bestaande uit Bacillus subtilis stam 713, Bacillus amyloliquefaciens MBI 600, Bacil- lus pumillus QST2808, Pseudomonas fluorescens, Bradyrhizobium japonicum, Tricho- derma vireus, Pseudomonas putida, Trichoderma harzianum Rifai-stam T22, Penicillium bilaii, Mesorhizobium, Azospirillum, Azotobacter vinelandii en Clostridium pasteurianum, Glomus-soorten.

De heterocyclische verbindingen van de algemene formule (I) die volgens de onderha- vige uitvinding worden gebruikt, kunnen in combinatie met deze hulpstoffen worden ge- bruikt. De gebruikte hulpstoffen hangen af van de specifieke toepassingsvorm en de werkzame stof en omvatten bij voorkeur oplosmiddelen, vaste dragers, dispergeermid- delen of emulgeermiddelen, zoals oplosbaarheidsbevorderende stoffen, beschermende colloïden, oppervlakteactieve stoffen en adhesiemiddelen. Verder kunnen organische en anorganische verdikkingsmiddelen, bactericiden, antivriesmiddelen, antischuimmid- delen, eventueel kleurstoffen en tackifiers of bindmiddelen worden gebruikt in combina- tie met de nitrificatieremmers en in het meststofmengsel. Geschikte hulpstoffen worden besproken in WO 2013/121384 op biz. 25 t/m 26. Andere mogelijke voorkeursingrediënten zijn oliën, bevochtigers, hulpstoffen, biostimu- lanten, herbiciden, bactericiden, andere fungiciden en/of pesticiden. Deze worden bij- voorbeeld besproken in WO 2013/121384 op biz. 28/29. Volgens één belichaming van de uitvinding zijn de hulpstoffen geen oplosmiddelen.

De meststofmengsels zijn bij voorkeur in vaste vorm, waaronder poeders, prils en gra- nules. Voorts is het mogelijk de nitrificatieremmer in de vorm van een formulering, op- lossing of dispersie afzonderlijk of gelijktijdig met een meststof toe te dienen.

Bovendien kan de nitrificatieremmer van de onderhavige uitvinding worden gebruikt voor het verminderen van de stikstofverliezen in organische meststoffen en ook op oogstafval en weiland of tijdens de opslag van vloeibare mest en het volgen van de ammoniumbelasting in dierenstallen.

Voor de respectieve toepassingen kan worden verwezen naar US 6.139.596 en WO 2013/121384 alsook naar WO 2015/086823 en WO 2016/207210. De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op een methode voor de bemesting van land- of tuinbouwgronden, waarbij een meststofmengsel dat verbindingen A en B bevat A. een anorganische en/of organische en/of organominerale meststof en B. 10 tot 10000 gewichtsprocenten, berekend op de meststof, van een heterocycli- sche verbinding met algemene formule (I) als hierboven omschreven, of de verbindingen A en B afzonderlijk, maar binnen een periode van O tot 5 uur, bij voorkeur O tot 1 uur, en bij voorkeur ongeveer op hetzelfde tijdstip, wordt op de bodem aangebracht.

Parallel aan de verbetering van de stikstofbenutting in de ammonium- of ureumhouden- de minerale en organische en organominerale meststoffen, heeft het gebruik van de nitrificatieremmers, volgens de huidige uitvinding, en van samenstellingen die deze be- vatten, tot gevolg dat de opbrengst en de productie van biomassa van gewasgewassen, in sommige gevallen aanzienlijk, toeneemt.

Evenzo kan de nitrificatieremmer volgens de uitvinding worden toegevoegd aan organi- sche meststoffen, zoals vloeibare mest, bijvoorbeeld tijdens de feitelijke opslag van dergelijke meststoffen, om te voorkomen dat stikstofvoedingsstoffen verloren gaan door een vertraagde omzetting van de afzonderlijke stikstofvormen in gasvormige, dus vluch- tige, stikstofverbindingen, en tegelijkertijd bij te dragen aan een verlaging van de am- moniakbelasting in dierenstallen. Bovendien kunnen de nitrificatieremmer of samenstel- lingen die de nitrificatieremmer bevatten, worden gebruikt op landbouwstengels en wei- degronden om gasvormig stikstofverlies te verminderen en nitraatuitspoeling te voor- komen.

In het algemeen kan de N-heterocyclische verbinding van de algemene formule (1) of (Il) of (Ill) of (IV) worden gebruikt voor het verminderen van de stikstof- of koolstofverliezen in anorganische en/of organische en/of organinerale meststoffen of stikstof- of koolstof- houdende verbindingen of materialen en ook op oogstafval en weidegrond of tijdens de opslag van vloeibare mest en voor het verminderen van de ammoniakbelasting in die- renstallen.

Stikstofverliezen zijn vaak te wijten aan N20- en/of NO-emissies of NO3-uitspoeling. Stikstofverliezen kunnen optreden in stikstofnoudende verbindingen of materialen, zoals wortels, planten, meststoffen, dieren, enz. Stikstofverliezen treden meestal op bij stik- stofhoudende minerale meststoffen of organische stikstofhoudende stoffen. De term "stikstofverliezen" omvat alle vormen van stikstof of stikstofverbindingen die verloren gaan via emissies of uitspoeling, zoals hierboven aangegeven. Een voorbeeld zijn broeikasgasemissies die kunnen worden verminderd door het gebruik van de N- heterocyclische verbinding van de onderhavige uitvinding.

Hetzelfde geldt voor koolstofverliezen die kunnen optreden in koolstofhoudende verbin- dingen of materialen. Koolstofhoudende verbindingen of materialen zijn bijvoorbeeld carbonaathoudende minerale meststoffen en koolstofnhoudend organisch materiaal, zo- als wortels, planten, dieren, organische meststoffen, enz. Koolstofverliezen treden vaak op in de vorm van CO2-emissies, die deel uitmaken van de broeikasgasemissies. Daarom kunnen de N-heterocyclische verbindingen van de onderhavige uitvinding wor- den gebruikt voor het voorkomen of verminderen van broeikasgasemissies van stikstof- of koolstofhoudende verbindingen of materialen. Deze materialen bevatten vaak stikstof en/of koolstof in covalent of ionisch gebonden vorm, b.v. in de vorm van ammonium, eiwit, nitraat, carbonaat, koolhydraten, cellulose, of andere organische koolstofhouden-

de verbindingen. De termen "koolstof" en "stikstof" kunnen dus verwijzen naar de ele- mentaire vorm of naar verbindingen of materialen die koolstof- en/of stikstofatomen be- vatten.

Stikstof- en/of koolstofhoudende verbindingen of materialen kunnen aanwezig zijn in meststoffen, in de bodem, of in het milieu. Het meest in het oog springende effect van de N-heterocyclische verbindingen van de onderhavige uitvinding is de vermindering van broeikasgasemissies uit de bodem die stikstofnhoudende verbindingen of materialen bevat.

Het meest efficiënt is de vermindering van broeikasgasemissies uit bemeste grond. De- ze broeikasgasemissies worden vaak veroorzaakt door processen na de nitrificatie.

De volgens de uitvinding te behandelen of in de grond te wortelen planten worden bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit landbouw-, bosbouw-, sier- en tuinbouw- gewassen, elk in hun natuurlijke of genetisch gemodificeerde vorm. Bij voorkeur worden niet-transgene landbouwplanten behandeld.

Landbouwgewassen die de voorkeur genieten zijn veldgewassen die worden gekozen uit de groep bestaande uit aardappelen, suikerbieten, tarwe, gerst, rogge, haver, sor- ghum, rijst, maïs, katoen, koolzaad, raapzaad, canola, sojabonen, erwten, veldbonen, zonnebloemen, suikerriet komkommers, tomaten, uien, prei, sla, pompoenen; nog meer bij voorkeur wordt de plant gekozen uit de groep bestaande uit tarwe, gerst, haver, rog- ge, sojabonen, maïs, koolzaad, katoen, suikerriet, rijst en sorghum.

In een voorkeursbelichaming van de uitvinding wordt het te behandelen gewas gekozen uit de groep bestaande uit tomaat, aardappel, tarwe, gerst, haver, rogge, sojaboon, ma- is, koolzaad, canola, zonnebloem, katoen, suikerriet, suikerbiet, rijst, sorghum, weide- gras en weideland.

In een andere voorkeursbelichaming van de uitvinding wordt het te behandelen gewas gekozen uit de groep bestaande uit tomaat, aardappel, tarwe, gerst, haver, rogge, soja- boon, maïs, koolzaad, canola, zonnebloem, katoen, suikerriet, suikerbiet, rijst en sor- ghum.

In een bijzonder voorkeursgeval van de uitvinding worden de te behandelen planten gekozen uit de groep bestaande uit tomaat, tarwe, gerst, haver, rogge, maïs, koolzaad, canola, suikerriet en rijst.

In één belichaming is de plant die volgens de methode van de uitvinding moet worden behandeld, een landbouwplant. "Landbouwgewassen" zijn planten waarvan een deel (bijv. zaden) of het geheel op commerciële schaal wordt geoogst of geteeld of die als belangrijke bron dienen voor veevoer, voedingsmiddelen, vezels (bijv. katoen, linnen), brandstoffen (bijv. hout, bio-ethanol, biodiesel, biomassa) of andere chemische verbin- dingen. Landbouwgewassen die de voorkeur genieten zijn bijvoorbeeld granen, zoals tarwe, rogge, gerst, triticale, haver, sorghum of rijst, bieten, zoals suikerbieten of voe- derbieten; vruchten, zoals pruimen, steenvruchten of zacht fruit, zoals appelen, peren, pruimen, perziken, amandelen, kersen, aardbeien, frambozen, bramen of kruisbessen; peulvruchten, zoals linzen, erwten, luzerne of sojabonen; oliehoudende gewassen, zo- als koolzaad, raapzaad, canola, lijnzaad, mosterd, olijven, zonnebloemen, kokosnoot, cacaobonen, ricinusolie, oliepalmen, grondnoten of sojabonen; cucurbitaceae, zoals pompoenen, komkommers of meloenen; vezelgewassen, zoals katoen, vlas, hennep of jute; citrusvruchten, zoals sinaasappelen, citroenen, grapefruits (pompelmoezen) of mandarijnen; groenten, zoals spinazie, sla, asperges, kool, wortelen, uien, tomaten, aardappelen, komkommers of paprika's; laurahoudende planten, zoals avocado's, ka- neel of kamfer; energie- en grondstofplanten, zoals maïs, soja, koolzaad, canola, sui- kerriet of oliepalm; tabak; noten; koffie; thee; bananen; wijnstokken (tafeldruiven en druivensapdruiven); hop; turf; natuurrubberplanten.

Weidegras en grasland bestaan uit grassen of grasmengsels bestaande uit bijvoorbeeld blauwgras (Poa spp.), bentgras (Agrostis spp.), raaigras (Lolium spp.), zwenkgras (Fes- tuca spp, hybriden en cultivars), Zoysiagras (Zoysia spp.), Bermudagras (Cynodon spp.), St. Augustinegras, Bahigras (Paspalum), Duizendbladgras (Eremachloa), Tapijt- gras (Axonopus), Buffalogras en Gramagras. Weiden kunnen ook bestaan uit mengsels van bovengenoemde grassen, bijvoorbeeld raaigras, en Trifolium-soorten, bijvoorbeeld Trifolium pratensis en Trifolium repens, Medicago-soorten zoals Medicago sativa, Lo- tus-soorten zoals Lotus corniculatus, en Melilotus-soorten, bijvoorbeeld Melilotus albus. In één geval is de plant die volgens de methode van de uitvinding moet worden behan- deld, een tuinbouwplant. Onder "tuinbouwgewassen" worden planten verstaan die al- gemeen worden gebruikt in de tuinbouw - bijvoorbeeld de teelt van sierplanten, kruiden, groenten en/of fruit. Voorbeelden van siergewassen zijn graszoden, geraniums, pelar- gonia's, petunia's, begonia's en fuchsia's. Voorbeelden voor groenten zijn aardappelen, tomaten, paprika's, cucurbitaceae, komkommers, meloenen, watermeloenen, knoflook, uien, wortelen, kool, bonen, erwten en sla en meer bij voorkeur van tomaten, uien, erw-

ten en sla. Voorbeelden voor fruit zijn appels, peren, kersen, aardbeien, citrusvruchten, perziken, abrikozen en bosbessen. In de tuinbouw vervangt een substraat vaak (een deel van) de grond.

In één geval is de plant die volgens de methode van de uitvinding moet worden behan- deld, een sierplant. "Sierplanten" zijn planten die gewoonlijk in de tuin worden gebruikt, b.v. in parken, tuinen en op balkons. Voorbeelden zijn graszoden, geraniums, pelargo- nia's, petunia's, begonia's en fuchsia's. In één geval is de plant die volgens de methode van de uitvinding moet worden behan- deld, een bosbouwgewas. Met de term "bosbouwgewas" worden bomen bedoeld, meer in het bijzonder bomen die in herbebossing of industriële aanplantingen worden ge- bruikt. Industriële aanplantingen dienen in het algemeen voor de commerciële productie van bosproducten, zoals hout, pulp, papier, rubberbomen, kerstbomen, of jonge bomen voor tuindoeleinden. Voorbeelden van bosbouwgewassen zijn naaldbomen, zoals den- nen, in het bijzonder Pinus spec, sparren en sparren, eucalyptus, tropische bomen, zo- als teak, rubberboom, oliepalm, wilg (Salix), in het bijzonder Salix spec, populier (cot- tonwood), in het bijzonder Populus spec, beuk, in het bijzonder Fagus spec, berk, olie- palm, en eik. De volgende definities zijn van toepassing: De term "planten" moet worden opgevat als planten van economisch belang en/of door de mens gekweekte planten. Zij worden bij voorkeur gekozen uit landbouw-, bosbouw-, sier- en tuinbouwgewassen, elk in hun natuurlijke of genetisch gemodificeerde vorm. De hier gebruikte term "plant" omvat alle delen van een plant, zoals ontkiemende zaden, opkomende zaailingen, kruidachtige vegetatie, alsmede gevestigde houtige gewassen, met inbegrip van alle onder de grond liggende delen (zoals de wortels) en boven de grond liggende delen. De term "bodem" moet worden opgevat als een natuurlijk lichaam dat bestaat uit leven- de (bijvoorbeeld micro-organismen (zoals bacteriën en schimmels), dieren en planten) en niet-levende materie (bijvoorbeeld mineralen en organische materie (bijvoorbeeld organische verbindingen in verschillende ontbindingsgraden), vloeistof en gassen) die zich op het landoppervlak bevindt, en gekenmerkt wordt door bodemhorizonten die van het oorspronkelijke materiaal te onderscheiden zijn als gevolg van diverse fysische, chemische, biologische en antropogene processen.

Onder "nitrificatieremmer" wordt verstaan: een chemische stof die het nitrificatieproces, dat gewoonlijk in (bemeste) grond plaatsvindt, vertraagt of vertraagt. Nitrificatieremmers vertragen de natuurlijke omzetting van ammonium in nitraat en zijn gericht tegen micro- organismen en bij voorkeur ammonia-oxiderende bacteriën (AOB) en/of ammonia- oxiderende archaea (AOA), bij voorkeur door de activiteit van bacteriën, bijvoorbeeld AOB en AOA, zoals Nitrosomonas spp. , Nitrosospira spp. en/of Archaea, te remmen. De nitrificatieremmer wordt meestal gecombineerd met een meststof, bij voorkeur een (ammonium)stikstofhoudende meststof, bijvoorbeeld een vaste of vloeibare anorgani- sche, organische en/of organo minerale meststof, of mest.

Onder "nitrificatie" moet worden verstaan de biologische oxidatie van ammoniak (NH3) of ammonium (NH4+) met zuurstof tot nitriet (NO2-), gevolgd door de oxidatie van deze nitrieten tot nitraat (NO3-) door micro-organismen. Naast nitraat (NO3-) wordt door nitri- ficatie ook distikstofoxide geproduceerd. Nitrificatie is een belangrijke stap in de stik- stofcyclus in de bodem.

De term "denitrificatie" moet worden opgevat als de microbiologische omzetting van nitraat (NO3-) en nitriet (NO2-) in gasvormige vormen van stikstof, in het algemeen N2 of N20. Dit ademhalingsproces vermindert geoxideerde vormen van stikstof in reactie op de oxidatie van een elektronendonor zoals organisch materiaal. De stikstofelektro- nenacceptoren die de voorkeur genieten, in volgorde van meest naar minst thermody- namisch gunstig, zijn: nitraat (NO3-), nitriet (NO2-), stikstofmonoxide (NO) en distik- stofmonoxide (N20). Binnen de algemene stikstofcyclus rondt denitrificatie de cyclus af door N2 terug te voeren naar de atmosfeer. Dit proces wordt voornamelijk uitgevoerd door heterotrofe bacteriën (zoals Paracoccus denitrificans en diverse pseudomonaden), hoewel er ook autotrofe denitrificeerders zijn geïdentificeerd (b.v. Thiobacillus denitrifi- cans). Denitrificeerders zijn in alle belangrijke fylogenetische groepen vertegenwoor- digd. Bij zuurstoftekort kunnen veel bacteriesoorten overschakelen van zuurstof naar nitraten ter ondersteuning van de ademhaling in een proces dat denitrificatie wordt ge- noemd en waarbij de in water oplosbare nitraten worden omgezet in gasvormige pro- ducten, waaronder distikstofoxide, die in de atmosfeer worden uitgestoten.

Lachgas", gewoonlijk "happy gas" of "lachgas" genoemd, is een chemische verbinding met de chemische formule N20. Bij kamertemperatuur is het een kleurloos, niet- ontvlambaar gas. Lachgas wordt op natuurlijke wijze in de bodem geproduceerd door de microbiële processen nitrificatie en denitrificatie. Deze natuurlijke emissies van distikstofoxide kunnen worden verhoogd door een verscheidenheid van landbouwprak- tijken en -activiteiten, waaronder bijvoorbeeld a) de directe toevoeging van stikstof aan de bodem door het gebruik van minerale en organische meststoffen, b) de teelt van stikstoffixerende gewassen, c) de teelt van bodems met een hoog organisch gehalte.

De term "meststoffen" moet worden opgevat als (chemische) verbindingen die worden toegepast om de groei van planten en vruchten te bevorderen. Meststoffen worden ge- woonlijk toegediend via de bodem (voor opname door de wortels van de plant) of via bladvoeding (voor opname door de bladeren). De term "meststoffen" kan in twee grote categorieën worden onderverdeeld: a) organische meststoffen (samengesteld uit rot- tend plantaardig/dierlijk materiaal) en b) anorganische meststoffen (samengesteld uit chemicaliën en mineralen). Organische meststoffen zijn onder meer drijfmest, wormen- giet, turf, zeewier, rioolwater en guano. Gefabriceerde organische meststoffen zijn on- der meer compost, bloedmeel, beendermeel en zeewierextracten. Andere voorbeelden zijn enzymatisch verteerde eiwitten, vismeel en verenmeel. De ontbindende gewasres- ten van voorgaande jaren en mest zijn een andere bron van vruchtbaarheid. Daarnaast worden in de natuur voorkomende mineralen, zoals fosfaat uit mijnsteen, kaliumsulfaat en kalksteen, ook tot de anorganische meststoffen gerekend. Anorganische meststoffen worden gewoonlijk vervaardigd door middel van chemische processen (zoals het Ha- ber-Bosch-proces), waarbij ook gebruik wordt gemaakt van in de natuur voorkomende afzettingen, terwijl deze chemisch worden gewijzigd (b.v. geconcentreerd tripelsuperfos- faat). In de natuur voorkomende anorganische meststoffen zijn onder meer Chileens natriumnitraat, mijnsteenfosfaat en kalksteen. Als derde categorie kunnen organinerale meststoffen worden genoemd, een combinatie van anorganische en organische mest- stoffen.

Onder "meststof die ueum bevat" (ureummeststof) worden verstaan synthetische meststoffen die ureum bevatten, met uitzondering van in de natuur voorkomende mest- stoffen die ureum bevatten (bijvoorbeeld mest als voorbeeld van een in de natuur voor- komende meststof die ureum bevat). Voorbeelden van meststoffen die ureum bevatten zijn ureum-ammoniumnitraat (UAN), isobutylideendiureum (IBDU), crotonylideendiure- um (CDU) en ureumformaldehyde (UF). Ureum wordt meestal in de vorm van korrels of prills geproduceerd. Ureummeststof kan worden geproduceerd door het vloeibare ure- um uit een prillentoren te laten vallen en het product te drogen. Ureum kan ook worden verkregen in vloeibare vorm, die kan worden gebruikt voor bladbemesting, b.v. op aard-

appelen, tarwe, groenten en sojabonen, en voor vloeibare toepassing op het veld. Ge- woonlijk wordt het gemengd met ammoniumnitraat om UAN te vormen met 28% N.

De term "locus" (habitat van de plant) moet worden opgevat als elk type omgeving, bo- dem, gebied of materiaal waar de plant groeit of moet groeien. Volgens de uitvinding wordt in het bijzonder de voorkeur gegeven aan grond.

De uitvinding wordt verder geïllustreerd door de volgende voorbeelden.

Voorbeelden

1. Heterocyclische verbindingen van algemene formule (I) Verschillende heterocyclische verbindingen van algemene formule (I) werden verkregen van ENAMINE Ltd, UkrOrgSynthesis Ltd., of Vitas-M Laboratory, Ltd. De respectieve verbindingen zijn vermeld in tabel 1 hieronder.

2. Materiaal en methoden

2. 1Nitrietmetingen Nitriet (NO2-) werd gemeten met behulp van het Griess-reagens (Productnummer: G4410, Griess reagens (gemodificeerd), Sigma-Aldrich). Gelijke volumes van het mon- ster of een verdund monster en het Griess-reagens werden gemengd in een transpa- rante multi-well-plaat met vlakke bodem en gedurende 10 minuten in het donker bij ka- mertemperatuur geïncubeerd. Absorbantiewaarden bij 540 nm werden spectrofotome- trisch gemeten (EnVision, Perkin Elmer®) en gebruikt om de [NO2-] te berekenen met behulp van een standaardcurve.

2. 2Ammoniummetingen Ammonium (NH4+) werd gemeten via een gemodificeerd Berthelot's reagens protocol.

8 pl cultuurmonster, 35 ul reagens A (0,5 g NaOH met 8 ml NaCIO (2,5%) in 92 ml Mil- IQ) en 33 ul reagens B (1 g salicylzuur, 0,5 g NaOH en 1,0237 g natriumnitroprussi- dedihydraat in 100 ml MilliQ) werden achtereenvolgens toegevoegd aan 160 pl MilliQ in 96-well platen met vlakke bodem (cat. nr. 353072, Falcon® 96 Well Clear Microplate, Corning). Absorbantiewaarden bij 635 nm werden spectrofotometrisch gemeten (EnVi- sion, Perkin Elmer®) na een incubatie van 30 min en gebruikt om [NH4+] te berekenen met behulp van een standaardcurve.

2. 3Cultuurbehoud

2.3.1Nitrosomonas europaea Nitrosomonas europaea groeimedium werd bereid door aseptisch samenvoegen van 900 mL stamoplossing 1 (27,75 MM (NH4)2s04, 3,35 MM KH2PO4, 0,83 uM MgS04, 0,22 uM CaCl2, 11 uM FeSO4, 18.33 uM EDTA en 0,56 uM CuSO4) met 100 mL stockoplossing 2 (400 mM KH2PO4 en 40 mM NaH2PO4, pH 8.0 (NaOH)) en 8 mL stockoplossing 3 (5% watervrij Na2CO3) oplossing. Alle drie de stamoplossingen wer- den vooraf geautoclaveerd. Nitrosomonas europaea (ATCC 25978) cellen werden ge- kweekt in steriele erlenmeyers verzegeld met tape (Micropore TM Surgical Tape 1530-1, 3M") bij 28°C en geschud (+ 150 rpm) in het donker. Culturen in de late log-fase ([NO2-] = 10 - 20 MM) werden gesubcultiveerd door centrifugering (4000 rpm, 15 min, 5°C) en volledige mediumverversing door het supernatant weg te gooien en de bacteri- ele celpellets opnieuw te resuspensie in vers bereid Nitrosomonas europaea- groeimedium.

2.3.2Nitrosospira multiformis Nitrosospira multiformis (NCIMB 11849) cellen werden gekweekt in erlenmeyers gevuld met geautoclaveerd 181-medium voor AOB (NCIMB Ltd) dat 1,78 mM (NH4)2s04, 1,47 mM KH2PO4, 272 HM CaCl2 x 2 Ho, 162 uM MgSO4 x 7 H20, 1 ml stockoplossing 1 (1.8 MM FeSO4 x 7 Ho en 1,49 mM NaEDTA) en 1 ml stockoplossing 2 (0,5% fenol- rood, pH-indicator) (pH 7,5-8). De pH werd op peil gehouden door regelmatig steriel 5% Na2CO3 toe te voegen. De kweekflessen werden afgesloten met tape (Micropore TM Surgical Tape 1530-1, 3MTM) en in het donker geïncubeerd bij 30°C onder schudden (+ 150 rpm). Laat-log fase culturen ([NO2-] = + 3 MM) werden gekweekt door centrifugatie (4000 rpm, 15 min, 5°C) en volledige medium verversing door het weggooien van het superatant en resuspensie van de bacteriële cel pellets in pH-aangepast 181-medium.

2.4Nitrificatieremmingstests

2.4.1Nitrosomonas europaea Om een nitrificatieremmingstest met N. europaea met hoge doorvoer te kunnen uitvoe- ren, werden culturen in de late log-fase twee dagen voor de test ondergekweekt. Vlak voor de bepaling werden de culturen na centrifugatie (4000 rpm, 15 min, 5°C) in centri- fugebuizen van 50 ml (cat. nr. 430829, CentriStar"" Conical Centrifuge Tubes, Cor-

ning®) 5 keer overgeconcentreerd met vers groeimedium. Per batch werden alle cultu- ren samengevoegd in één steriele Schott-fles en vervolgens gedoseerd in 384-well- platen (Cat. nr. 781086, CELLSTAR®-plaat, Greiner Bio-One; 50 ul/well) met behulp van een dispenser (Multidrop "MV Combi Reagent Dispenser, Thermo Scientific TM) die eerst werd gespoeld met groeimedium. Specifiek voor de high-throughput screening voor nieuwe nitrificatieremmers werd 0,5 ul 99,99% DMSO (negatieve controle - eind- concentratie 1%) toegevoegd aan de buitenste twee kolommen aan de linkerkant van de plaat en 0,5 ul 10 MM DMP (3,4-dimethylpyrazool, positieve controle - eindconcen- tratie 100 uM) werd handmatig toegevoegd aan de buitenste twee kolommen aan de rechterkant. Ten slotte werd 0,5 ul kandidaat-nitrificatieremmers (stockoplossingen van 5 mM in 99,99% DMSO - eindconcentratie 50 uM) aan de centrale wells toegevoegd met behulp van een pennentang op een Tecan-robot (Freedom EVO®, Tecan). Tussen de toevoegingen door werden de pennen achtereenvolgens gewassen met 99,5% DMSO, Milli@-water en 100% ethanol en aan de lucht gedroogd. Alle platen werden afzonderlijk in Parafilm gewikkeld. Stapels van 4 platen werden op een 96-well-plaat gezet, gevuld met 100 pi MilliQ per well, afgedekt met aluminiumfolie en geschud bij 150 omwentelingen per minuut bij 28°C. 24 uur later werd de NO2-productie beoor- deeld. Daartoe werden de monsters eerst 200 maal verdund door 1,5 ul monster te pi- petteren in 300 ul vers groeimedium in tussenplaten (cat. nr. 353077, Falcon® 96-well Clear Round Bottom Microplate, Corning®), om vervolgens 15 ul van de verdunde monsters te mengen met 15 ul Griess-reagens in de putjes van een transparante 384- well-plaat met vlakke bodem (Cat. No. X7001, Low Profile Microplate, Molecular Devi- ces), dat spectrofotometrisch werd gemeten bij 540 nm (EnVision, Perkin Elmer®).

24.2Nitrosospira multiformis Culturen van 500 ml, gekweekt in erlenmeyers van 1 liter die binnen 3 tot 4 dagen de laatlogfase ([NO2-] = 3 mM) bereikten en = 500 UM stijging van [NO2-] gedurende de laatste 24 uur vertoonden, werden gebruikt voor een high-throughput nitrificatierem- mingstest. De culturen werden eerst 5 keer overgeconcentreerd in vers 181-medium door centrifugatie (4000 rpm, 15 min, 5°C) in centrifugebuizen van 50 ml (cat. nr.

430829, CentriStar"" Conical Centrifuge Tubes, Corning®). Per batch werden alle cul- turen samengevoegd in één steriele Schott-fles en vervolgens gedoseerd in 384-well- platen (cat. nr. 781086, CELLSTAR®-plaat, Greiner Bio-One; 50 ul per putje) met be- hulp van een dispenser (Multidrop TM Combi Reagent Dispenser, Thermo Scientific M)

die eerst werd gespoeld met 181-medium. 0,5 ul 99,99% DMSO (negatieve controle - eindconcentratie 1%) werd toegevoegd aan de buitenste twee kolommen aan de linker- kant van de plaat en 0,5 ul 10 MM DMP (3,4-dimethylpyrazool, positieve controle - eindconcentratie 100 uM) werd handmatig toegevoegd aan de buitenste twee kolom- men aan de rechterkant. Ten slotte werd 0,5 ul kandidaat-nitrificatieremmers (stockop- lossingen van 5 mM in 99,99% DMSO - eindconcentratie 50 uM) aan de centrale wells toegevoegd met behulp van een pennentang op een Tecan-robot (Freedom EVO®, Te- can). Tussen de toevoegingen door werden de pennen achtereenvolgens gewassen met 99,5% DMSO, Milli@-water en 100% ethanol en aan de lucht gedroogd. Alle platen werden afzonderlijk in Parafilm gewikkeld. Stapels van 4 platen werden op een 96-well- plaat gezet, gevuld met 100 pi MilliQ per well, afgedekt met aluminiumfolie en geschud (+ 150 rpm) bij 30 °C. 24 uur later werd de NO2-productie beoordeeld. Daartoe werden de monsters eerst 100-maal verdund door 3 ul monster te pipetteren in 300 ul vers groeimedium in tussenplaten (cat. nr. 353077, Falcon® 96-well Clear Round Bottom Microplate, Corning®) om vervolgens 15 ul van de verdunde monsters te mengen met 15 ul Griess-reagens in de putjes van een transparante 384-well-plaat met vlakke bo- dem (Cat. No. X7001, Low Profile Microplate, Molecular Devices) dat spectrofotome- trisch werd gemeten bij 540 nm (EnVision, Perkin Elmer®).

2.4.3 Kwantificering van de remming van de nitrificatie Om de doeltreffendheid van de verbindingen (in termen van remming van de nitrificatie) te beoordelen en een vergelijking tussen platen en partijen culturen mogelijk te maken, berekenden wij de relatieve nitrificatie. Meer in detail werden alle nitrietresultaten ge- normaliseerd ten opzichte van zowel een negatieve controle, die geen verbinding bevat- te, als een positieve controle, die de benchmark (100 uM DMP) bevatte, met gebruik- making van vergelijking 1. Deze normalisatie werd uitgevoerd per multi-well plaat en elke plaat bevatte 32 positieve en 32 negatieve controles. Relative nitrification = OCTO (Vergelijking 1 ) Dit betekent dat verbindingen die volledige nitrificatie (geen nitrificatieremming) mogelijk maakten, een relatieve nitrificatie van 1 (of 100%) te zien geven. Een verbinding die dezelfde nitrificatieremming vertoont als de positieve controle, vertoont een nitrificatie- remming van 0.

Celgroeiremmingstests De bestudeerde structuren hebben (althans in de geteste assays) geen toxi- sche/aspecifieke effecten. Er is geen effect op AOA-systemen (ABIL, van Avecom, en Nitrososphaera viennensis) en geen effect op microtox.

2.6 Nitrosomonas europaea ammoniak- vs hydroxylamine-oxidatietests Om te bepalen of verbindingen specifiek NH3- of NH2OH-oxidatie remden, werden N. europaea-cellen voorzien van NH3 of hydroxylamine (NH2OH) als N-bron. Twee dagen oude, laat-log fase culturen met een NO2- concentratie tussen 10 en 20 MM werden 3 keer gewassen in vers groeimedium (zonder N) en tenslotte 4 keer overgeconcentreerd via centrifugatie (4000 rpm, 15 min, 4°C). Transparante, vlakke bodem 96-well platen (Cat. Nr. 353072, Falcon® 96 Well Clear Flat Bottom Microplate, Corning®) werden ge- vuld met 150 pl cultuur per well met behulp van een dispenser (Multidrop TM Combi Re- agent Dispenser, Thermo Scientific TM). De verbindingen (eindconcentratie 50 uM) wer- den in drievoud toegevoegd aan de multi-well-plaat met behulp van een Tecan-robot (Freedom EVO®, Tecan). Thioureum (positieve controle voor remming van NH3- oxidatie - eindconcentratie 100 HM) en fenylhydrazinehydrochloride (positieve controle voor remming van NH2OH-oxidatie - eindconcentratie 1 mM) werden toegevoegd aan de buitenste twee kolommen. Elke plaat werd in tweevoud gemaakt om hetzij 500 uM (NH4)2s04 (eindconcentratie [NH4+] = 1 mM) of 1 mM NH2OH toe te voegen. Alle platen werden afzonderlijk in Parafilm gewikkeld. Stapels van 4 platen werden bovenop een 96-well plaat gevuld met 100 ul MilliQ per well, bedekt met aluminiumfolie en geschud (+ 150 rpm) bij 28 ° C. Om aflezing van secundaire effecten op de NO2-productie te voorkomen, werd NO2- pas 30 min later gemeten. Daartoe werden de monsters eerst 2 maal verdund door 15 ul te pipetteren in 15 ul vers groeimedium in 96-well-tussenplaten (cat. ref. PCR-96-FS-C, 96-well PCR Microplate, Axygen®) om vervolgens 15 ul van de verdunde monsters te mengen met 15 ul Griess-reagens in de wells van een transpa- rante 384-well-plaat met vlakke bodem (Cat. Nr. X7001, Low Profile Microplate, Molecu- lar Devices) dat spectrofotometrisch werd gemeten bij 540 nm (EnVision, Perkin El- mer®).

2.7Inde bodem verrichte analyses Toplaagmonsters (0 tot 10 cm) van de bodem werden genomen op verschillende perce- len in België (Merelbeke en Moorslede). Vegetatie werd verwijderd en monsters werden genomen van verschillende percelen. Alle bodemmonsters werden gemengd en ge- zeefd (maaswijdte 2,8 mm) om grote brokstukken te filteren en de bodem te homogeni- seren. De grond werd bewaard bij 5°C in plastic containers bedekt met Saran-folie om veranderingen in de samenstelling van de microbiële gemeenschap te voorkomen en om het oorspronkelijke bodemvochtgehalte te behouden.

Het vochtgehalte van de bodem werd bepaald door 20 g grond gedurende = 48 uur in een oven bij 60 °C te drogen en het gewicht vóór en na het drogen te meten. Op basis van het bodemvochtgehalte (+ 20%) werden samengestelde oplossingen bereid, zodat toevoeging van 200 pl verbinding en 200 ul NH4Cl-oplossing zou resulteren in een eindconcentratie van de verbinding van 50 uM en een eindconcentratie van NH4+ van 10 mM. Per behandeling werden 5 kleine potjes gevuld met 20 g grond. Vervolgens werd de grond eerst behandeld met de respectieve verbindingsoplossing en vervolgens met de NH4ClI-oplossing. Per bakje werden positieve (50 uM DMP) en negatieve con- troles (DMSO) opgenomen. De potten werden gedurende 7 dagen bij 21°C (6.00 tot

22.00 uur licht) geïncubeerd. Om de 2 à 3 dagen werd gedemineraliseerd water aan de grond toegevoegd tot een bodemgewicht van 20 g. Uiteindelijk werd elk monster van 20 g grond opgelost in 100 ml 1M KCI en gedurende 1 uur geschud, gevolgd door filtratie door Whatmann®-papier. Het filtraat werd gebruikt om de pH-, NH4+- en NO3- concen- traties te meten.

3. Resultaten

3.1 De in tabel 1 hieronder weergegeven resultaten zijn gebaseerd op het gebruik van de nitrificerende bacteriën Nitrosomonas europaea en Nitrosospira multiformis. De (ge- teste) heterocyclische verbindingen van algemene formule (|) remmen de nitrificatie in ten minste één van de onderzochte systemen. De remmende activiteit van deze klasse moleculen werd bevestigd voor een aantal structuren met variërende subgroepen. Er werden verschillende doses gebruikt. Uit tabel 1 blijkt dat alle geteste stoffen de nitrifi- catie in de geteste systemen duidelijk remmen, en dat sommige remmers al bij zeer lage doses een sterke remming vertonen. Als referentie werd 3,4-dimethylpyrazool gebruikt in vergelijkend voorbeeld C1. De 1C50-waarden geven de geschatte concentratie aan die 50% remming van de nitrificatie veroorzaakt. De waarden werden voorspeld door het passen van een logistische curve op 8-punts dosis-responsgegevens of op basis van de laagste geteste dosis die een remming van meer dan 50% geeft.

IC50 is de concentratie waarbij 50% remming optreedt. Lagere waarden wijzen dus op een sterkere remming van de nitrificatie.

Uit tabel 1 blijkt dat alle geteste moleculen in staat waren de nitrificatie te remmen. De aanwezigheid van de 3-(aminomethyl)-1,3,4-thiadizool-2-thione substructuur of 1-(ami - nomethyl)-1,2,4-triazool-5-thione substructuur is dus noodzakelijk en lijkt voldoende te zijn om de nitrificatieremming te bewerkstelligen. Verschillende zijgroepen op de ami- nomethylgroep, gebonden via het stikstofatoom, hebben nauwelijks invloed op de nitrifi- catieremming. Toevoeging van moleculaire structuren aan het thiadiazool is eveneens mogelijk, maar bijzonder complexe substructuren hebben de neiging het nitrificatierem- mend vermogen te verzwakken. Door vervanging van de zwavel in het thiadiazool door stikstof, wat resulteert in 1-(aminomethyl)-1,2,4-triazool-5-thion, wordt de nitrificatie- remming doorgaans enigszins verzwakt. Niettemin remmen alle geteste moleculen van de twee substructuren de nitrificatie in zekere mate bij ten minste één van de twee ge- teste nitrificerende bacteriën.

Niet alle in tabel 1 vermelde moleculen zijn getest. Alle geteste moleculen zijn sterke nitrificatieremmers die specifiek inwerken op nitrifice- rende bacteriën. NA betekent niet geanalyseerd.

De voorbeelden C40-C54 in tabel 1 passen moleculen die lijken op die welke zijn be- schreven in WO 2005/007636, maar verschillen van de voorbeelden 1-33 doordat zij een stikstof op positie 2, naast de zwavel, in de thiadiazoolheterocyclische ring hebben, en van de voorbeelden 1-39, die een thion hebben dat geen thiol of thioetheter kan vormen vanwege de bezetting van de stikstof op positie 3 (overeenkomend met positie 4 in de voorbeelden 40-54, die vrij is van substituenten). In tegenstelling tot de voor- beelden 1-30, 34 en 35, die leiden tot een volledige of bijna volledige remming van de nitrificatie in een van de geteste nitrificerende culturen, geeft geen van de voorbeelden C40-C54 een significante remming in een van de nitrificerende culturen (waarden onder 100% zijn te wijten aan variatie, maar verschillen niet significant van de controle).

Voo Structureel Structuur Nitrosomo- Nitrosospira Getes rbee element nas euro- multiformis te paea con- cen- IC50 tratie (voor (HM) speld door het pas- sen Nitri- | van IC50 fica- | een ( tie | logis- laag- (%) | tisch ste bij de e ge- ge- | curve teste teste | of de dosis con- | laag- (HM) cen- ste die tratie | ge- meer ( teste dan O= | dosis 50% maxi | (HM) rem male | die ming acti- | een geeft viteit) | inhi- ) bitie van meer dan 50% ople- vert) NA CH, C1 ) { 20 100 1 O0 1 su 6 N 16 <3.5 | 100 Se N n° 8 LJ a uv

“ij ON > a An SAS, 2 | N 19 <6 100 Ds Se x

N 3 OU 16 <6 | 100 SA, a

0. Go = 500 es 4 ON 17 100 zn RE. Se “5 a

AT “ 18 <6 | 100 ex “0 Says es # pv Rene PE TS ie x CA, 17 <6 100 Ex x ; y Ho Pau. 7 Dg? À se 19 <6 | 100 Sant

EN

We y COCO. 6 3 19 100

AN -

A X 18 | 1 | < | 100 ë N° Ad

NA La Nm À NA | 22 | NA | 50 wy 8 as u (A a 11 CONS F et, NA | 12 | NA | 50 Qu oP Se ied a Rn, 12 (1170 NA | 33 | NA | 50

DE CSN

PE € A Ho 13 (} NA | 10 | NA | 50 — X Le 3 N=

STA

SN 14 J NA | 18 | NA | 50

ETON < Ù 87 6 ab | EN L À 10 | NA | 27 | NA | 50 Ss VE >

N 16 CN NA | 16 | NA | 50 a“ 5 yes / a Mass 7 À 17 AN 5 10 <2 | 100 On Sr + A os ee ON 1 N Bm 5° %

N J ‘ ON, 18 {> 11 <2 | 100

ET

HN ea et,

FEN * #

ge N 19 OP 11 <2 100 is NT 1) Bn 7 N LÀ Ni, TN <20 <08 | 100

À ie 21 X 12 <2 100 9 A, En a ER Sy > 22 LN, 15 <2 | 100 Si 4 se

SN s ) 23 ITN 20 <2 100 ne” Af La (a 24 ! | NA 1 NA 50 N ss js

SN AH, 8} 25 ê NA NA | 50 7

A FEN F

AN 8) 26 f ON, NA 1 NA 50 0} of F 57 75, y A, An 27 TN NA NA 50 od

AT ©

MA

EN 28 - oM NA 4 NA 50 = oe s & À 7 es, 2 xs ig” 28 à. A. A es > < 29 = N Sar N "Ss 5 58 100 100 100 x, “a

“ee Las CN 63 |>100 | 27 |<100 | 100 ( ) ‚NT Oes

N en 31 LN} od Le ne ET ‘ & Se 32 Om, ZN, > SS Fe ë X 3 N Na vr bu ES > X Le. { / ; a

TRES 6 a Bin p A = \n 33 An

N / * “, A &r Ps eg =H B us À 34 ON, ' 34 7 <33 | 100 Sat = > Ei

À - s æÆ Sg Ns, 35 | TO NN 38 <100 21 <100 100 3 N | S 7 € À > > | \ = &, \ A N. + AR ° TS 36 od Og = N , DR, NN © pan {3 Kime

À

SN = + 7 B 37 N 7

ET & x N

NN ee >

N N

KI oo A , | ST Ng

EN FA TE N € & # 38 Sue és m f % > êtes

M ; Ha TES a ES & + <= No

SU & ; ; , ve

© A

TTT C40 À 0 | 83 100 50

Ç

Ÿ BAD 24 / C41 | Cr 85 100 50 © 2 C42 Ï | 88 100 50 ss ed ©. SN / —É SN G44 IN 100 50 [7 TOS 8” nu / }

À 45 Tx | 91 100 50 C a en, gen 2

ES

N } C46 IN 93 100 50 TT ge me” Al

N + C47 re, ge a” 94 100 50

GT Pace alte

T oO Cu — N

PN ON C48 à 100 > X Ï 2 I ; , | 5 ss racernate / N-— G U Se

LN

X C50 nn AA | 100 100 90 a TS es] /

S a _f vs | FR C51 ST grs | 400 100 50 % N 4

ON

\ iv, C52 | ASS ng 100 100 50 | )

LA C53 >> 100 100 50

SE

NÀ C54 U x | 100 94 50 OO neg”

OT \_ó In een afzonderlijk experiment werd de werkzaamheid van voorbeeld 2 uit tabel 1 ver- geleken met het eerder beschreven 1,3,4-thiadiazool-2-thion in verschillende doserin- gen. In tegenstelling tot voorbeeld 2 heeft 1,3,4-thiadiazool-2-thion geen bezetting van de stikstof op positie 3, waardoor thiol/thion tautomerisme mogelijk is. Uit tabel 2 blijkt dat voorbeeld 2 doeltreffender is in vergelijking met 1,3,4-thiadiazool-2-thion. Tabel 2 Nitrificatie (%) bij de geteste concentratie ( 0 = maximale activiteit) 3 6 11 19 | 33 | 57 | 100 Structuur Naam UM | WM | UM | HM | HM | uM | uM

1,3,4- N N thiadiazool- 2 ee Ny . A 2tnion |100|100 | 82 | 45 | 13 vs Voorbeeld 10 = > SA, Voorbeeld | 94 | 58 | 32 | SN 2 #5 3

3.2Ammonia vs. hydroxylamine oxidatie assay Om inzicht te krijgen in de beoogde metabolische route en om onderscheid te maken tussen verbindingen die specifiek de NH3-oxidatie beïnvloeden of die een andere route beïnvloeden, werden de nieuwe nitrificatieremmers getest in de "ammonia vs hy- droxylamine oxidatie assay" waarin de NO2-productie uit NH3 werd vergeleken met de NO2-productie uit NH2OH. Aangezien NH3 wordt omgezet in NH2OH voordat NO2- wordt geproduceerd, geeft een vergelijking van de nitrificatieremming van de nieuwe verbindingen ten opzichte van NH3 (zie "1." in het onderstaande schema) en NH2OH (zie "2." in het onderstaande schema) aan welk deel van de route wordt geremd. Geen nitrificatieremmer: ammonia oxidation hydroxylamine oxidation LNH NH; 0H N96;

2. NH,0H > NO, Niet-specifieke of algemene metabolische remmer:

1. NH, >X

2. NH,OH>X Ammoniak oxidatie specifieke remmer:

1. NH, >X

2. NH,0H > NO; Ammoniakoxidatie is een essentiële stap voor het metabolisme van nitrificerende bacte- rien. Daarom zal remming van ammoniakoxidatie door een nitrificatieremmer indirect alle andere enzymatische stappen beïnvloeden en ook de tweede stap beïnvloeden, Zij het minder sterk dan de eerste stap. Zelfs in een 30 minuten durende test verminderde DMP, waarvan bekend is dat het gericht is tegen ammoniakoxidatie, ook de oxidatie van NH2OH, maar in mindere mate dan het effect op ammoniakoxidatie (tabel 2). Ook de nieuwe nitrificatieremmers hebben een verschillend effect op de nitrificatie van de twee producten (tabel 2): Alle geteste nitrificatieremmers vertonen nog steeds een rela- tief hoge nitrificatie als NH2OH als stikstofbron wordt verstrekt, waaruit blijkt dat de om- zetting van NH2OH naar NO2- niet rechtstreeks wordt geremd. Als NH3 wordt toege- diend, vertonen de nitrificatieremmers een sterker negatief effect op de nitrietproductie, wat erop wijst dat de omzetting van ammoniak in hydroxylamine rechtstreeks wordt ge- remd. De nitrificatieremmers beïnvloeden dus de eerste stap van de nitrificatie. Dit be- vestigt verder dat de klasse van nieuwe nitrificatieremmers specifiek de nitrificatie remt. In tabel 3 staan de resultaten van de oxidatieproef met ammoniak en hydroxylamine, met de OD540 (maat voor nitriet) na 30 minuten met ammoniak of hydroxylamine als stikstofbron. Alle nieuwe nitrificatieremmers maken nitrietproductie uit hydroxylamine mogelijk die dicht in de buurt komt van de nitrietproductie zonder remmer (DMSO). De nitrificatie wordt echter geremd als ammoniak als stikstofbron wordt gebruikt. Tabel 3 Voor- Structuur Nitrificatie uit NH3/[Nitrificatie uit NH2OH beeld (% vergeleken met/(% vergeleken met DMSO) DMSO) co A E

1 LN 54 83

TN Sn

N 2 © y 62 ® N=Á

U

OO 3 f 34 81 ‘ Ss N f

IT se

N 4 3 79 A N°

CI 1e 1 Sa

À B, De GC mM Ÿ 48 81 oh

3 DN NS 7 Ln 54

ON a.

À = ON 47 85 N,

SO Ee A, An s 7 () 49 79

HN S

N ) 38 85 sg N +

NS 11 eeen 47 85

SN

ON Ss +0 12 OA, 46 79 sy <>

>o

A 13 x 63 84 Ne ON 9 si

F € 14 © . 48 82

EN Sy

AD Ns 15 NN OO 63 88

N # 3 A. 16 ee 3 ls 52 87 Hy

3.3Test uitgevoerd in landbouwgrond De werkzaamheid van de 15 moleculen in tabel 3 werd in de bodem getest. Ammonium werd toegevoegd aan grond met een hoge nitrificatieactiviteit en behandeld met de nitri- ficatieremmers volgens de onderhavige uitvinding. Na een week behandeling bleek een subset van de geteste moleculen het ammoniumverbruik effectief te verminderen. Ver- schillende moleculen hadden hetzelfde effect als DMP. De resultaten bevestigen dat nitrificatieremmers de ammoniumoxidatie door bodemgemeenschappen remmen en tonen hun potentieel aan als nieuwe nitrificatieremmers.

De nitrificatieremmers werden toegepast in een nitrificatieremmingstest met landbouw- grond. In de praktijk werd ammonium met of zonder de nieuwe nitrificatieremmers toe- gevoegd aan grond van een akker in Merelbeke. Het ammoniumgehalte werd gemeten bij de start van het experiment en op het einde van het experiment, na een week incu- batie. Een nitrificatieremmingspercentage werd berekend door de vermindering in am-

moniumgehalte met de nitrificatieremmer te vergelijken met de vermindering in ammo- nium zonder de nitrificatieremmer. Voorbeeld 10 in tabel 3 is het eerder beschreven 1,3,4-thiadiazool-2-thion. Wij bevestigen zijn activiteit als nitrificatieremmer, die echter minder sterk is dan die van de geteste moleculen volgens de huidige uitvinding die vol- doen aan de algemene formule (I). Alle andere verbindingen in de voorbeelden remden de nitrificatie aanzienlijk. Dit valideert dat de nieuwe nitrificatieremmers de ammoniak- oxidatie door bodemgemeenschappen effectief remmen.

Tabel 4 Voorbeeld % remming van nitrificatie in de bodem Ne? Gs ; 52 va Ve PN, N 7 À N 6 IN Js 50 y À Su N el 3 43 Qi A a Res

OÙ ve gi ma 0 à 43 got

SN 2% 9 N Y 39 ; „Nh,

AM

SS gm

EY, dg A bt, Ï N 37 gd Sr 35 en

F re" 07 34 ed, eN, ie st T3 Sn A x 3

N X FE 24 Om deze resultaten te bevestigen werd een voorbeeld eveneens getest in een andere bodem, afkomstig van een veld in Moorslede, wederom met een incubatietijd van 7 da- gen (tabel 5).

Tabel 5 Voorbeeld | Structuur % remming van nitrificatie in de bodem (Moorslede) 1 PA TN 30

TO ea SA ve.

ON 5-3 Er bestaan verschillende voorbeelden van nitrificatieremmers die een negatief effect hebben op de groei van planten, waaronder DMP, vooral bij zeer hoge concentraties. Om een mogelijk negatief effect van de nitrificatieremmers volgens de onderhavige uit- vinding te testen, hebben wij een groeiproef uitgevoerd met Arabidopsis thaliana, ge- kweekt op verticaal staande vierkante Petridish-platen op een halfsterk Murashige- Skoog-medium, verhard met 0,8% agar, en aangevuld met voorbeeld 21 uit tabel 1 of het eerder beschreven 1,3,4-thiadiazool-2-thion in verschillende doses. De wortellengte werd gemeten om een eventuele groeivertraging te evalueren en werd uitgedrukt ten opzichte van de wortellengte van planten die zonder nitrificatieremmer werden ge- kweekt (tabel 6). Tabel 6 Groei ten opzichte van de controle zonder verbinding (%) 12,5 25 50 100 Structuur Naam 5 UM

UM UM UM UM 1,3,4- N N thiadiazool-2- % À thion 110 | 110 | 95 | 26 5" Voorbeeld C10

De

LN à Voorbeeld 21 | 109 111 110 | 92 24 dd "N sX

Claims (15)

Conclusies

1. Het gebruik van een heterocyclische verbinding van de algemene formule (I) NRIR2 + de * () XS of NRA, waarbij R4 c1-4alky IS, R1C3-12-koolwaterstofresidu dat 1 tot 3 heteroatomen kan bevatten, geko- zen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, R2C1-6-koolwaterstofresidu dat één heteroatoom kan bevatten, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, of waarin R1 en R2 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt, een verza- digde of onverzadigde heterocyclische radicaal met vijf of zes leden vormen die naar keuze nog een of twee heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof en zwavel, en welke heterocyclische radicaal deel kan uitmaken van een C4-20-koolwaterstofresidu dat naar keuze naast het stikstofatoom dat R1 en R2 verbindt, nog een tot vier hete- roatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuur- stof, zwavel en fluor, waarin R1 en R2 elk via een koolstofatoom verbonden zijn met het stikstof- atoom in NR1R2 en waarin in R1 en R2 heteroatomen van hetzelfde che- mische element niet naast elkaar liggen, R3H ‚ C1-4-alkyl, S-C1-4-alkyl, NR5R6 waarbij R5 en R6 onafhankelijk van elkaar H, c1-6-aiky1, fenyl, fluorofenyl zijn, als nitrificatieremmer.

2. Het gebruik zoals geclaimd in claim 1, waarin R3 H, c1-3-aiky, S-C1-3-alkyl, bij voorkeur H, methyl, ethyl, S-CH3 of S-C2H5 is, of waarin R3 NR5R6 is waarbij RS H of methyl is en R6 c1-4-alky, fenyl of fluorfenyl, en/of waarin R4 C1-3-alkyl is, bij voorkeur methyl of ethyl.

3. Het gebruik zoals geclaimd in een van de claims 1 of 2, waarin R1 een C4- 10-koolwaterstofresidu is dat een of twee heteroatomen kan bevatten, ge- kozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof en zwavel, bij voorkeur een C4-18-koolwaterstofresidu dat N bevat en optioneel nog een heteroa- toom, gekozen uit de groep bestaande uit stikstof en zwavel.

4. Het gebruik zoals geclaimd in een van de claims 1 tot en met 3, waarin R2 C1-6-alky1 Of C3-6-cycloalkyl is dat een heteroatoom kan bevatten dat wordt gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof en zwavel, en bij voor- keur c1-4alky is dat een heteroatoom kan bevatten dat wordt gekozen uit S.

5. Het gebruik zoals geclaimd in een van de claims 1 of 2, waarin R1 en R2 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt een 5- of bij voorkeur 6- voudig verzadigd of onverzadigd heterocyclisch radicaal vormen, dat naar keuze ook een extra heteroatoom kan bevatten, gekozen uit de groep be- staande uit stikstof en zuurstof, en dat deel kan uitmaken van een C4-20- koolwaterstofresidu dat, naast het stikstofatoom dat R1 en R2 verbindt, ook 1 tot 4 heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, bij voorkeur waarin R1 en R2 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt, het verzadigde of onverzadigde structuurelement vormen an — N 0 —N N dat deel kan uitmaken van een C4-20-koolwaterstofresidu dat naast het stikstofatoom dat R1 en R2 verbindt, 1 tot 4 heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof en zwavel, waarbij het verzadigde of onverzadigde structuurelement bij voorkeur één of twee bin- dingen bevat met andere koolstofatomen in de meta- of para-positie ten op- zichte van de stikstof van de NR1R2-groep, en meer bij voorkeur geen an- dere substituenten bevat.

6. Het gebruik van een heterocyclische verbinding van de algemene formule (|) zoals gedefinieerd in een van de claims 1 tot en met 5 als additief of be-

kledingsmateriaal voor anorganische en/of organische en/of organominera- le meststoffen, bij voorkeur anorganische meststoffen, meer bij voorkeur ammonium- en/of ureumhoudende stikstofnoudende meststoffen.

7. Het gebruik zoals geclaimd in claim 6, waarbij de heterocyclische verbin- ding van de algemene formule (I) wordt geleverd in de vorm van een formu- lering, oplossing of dispersie, afzonderlijk of gelijktijdig met een meststof, of wordt opgenomen in de meststof of wordt toegepast op de meststof.

8. Het gebruik van een heterocyclische verbinding van de algemene formule (I) zoals omschreven in een van de claims 1 tot en met 5 voor het vermin- deren van de stikstof- of koolstofverliezen in anorganische en/of organische en/of organinerale meststoffen of stikstof- of koolstofhoudende verbindin- gen of materialen en ook op oogstafval en weideland of tijdens de opslag van vloeibare mest en voor het verminderen van de ammoniakbelasting in dierenstallen.

9. Het gebruik zoals geclaimd in een van de claims 1 tot en met 8, waarbij de heterocyclische verbinding van de algemene formule (I) wordt gebruikt in combinatie met ten minste één aanvullend agrochemisch agens, bij voor- keur gekozen uit de groep bestaande uit - ten minste één andere nitrificatieremmer, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit 2-(3,4-dimethyl-pyrazol-1-yl)-barnsteenzuur (DMPSA), 3,4-dimethylpyrazool (DMP), 3,4-dimethylpyrazoolfosfaat (DMPP) dicyaandiamide (DCD), 1H-1,2,4-triazool, 3-methylpyrazool (3-MP), 2-chloor-6-(trichloormethyl)-pyridine, 5-ethoxy-3- trichloormethyl-1,2,4-thiadiazol, 2-amino-4-chloor-6-methyl- pyrimidine, 2-mercapto-benzothia zole, 2-sulfanilamidothiazool, thioureum, natriumazide, kaliumazide, 1-hydroxypyra zole, 2- methylpyrazool-1-carboxamide, 4-amino-1,2,4-triazool, 3-mercapto- 1,2,4-triazo le, 2,4-diamino-6-trichloormethyl-5-triazine, koolstofbisul- fide, ammoniumthiosulfaat, natriumtrithiocarbonaat, 2,3-dihydro-2,2- dimethyl-7-benzofuranolmethylcarbamaat en N-(2,6-dimethylfenyl)- N-(methoxyacetyl)-alaninemethylester,

- en/of ten minste één ureaseremmer, bij voorkeur gekozen uit N- butylthiofosforzuurtriamide (NBTPT) en/of N-n- propylthiofosforzuurtriamide (NPTPT), - ten minste één gebruikelijke agrochemische hulpstof, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit waterige en/of organische op- losmiddelen, pH-regelaars, oppervlakteactieve stoffen, bevochti- gingsmiddelen, spreidingsmiddelen, adhesiebevorderaars, draag- stoffen, vulstoffen, viscositeitsverbeteraars, emulgatoren, disper- geermiddelen, sequestreermiddelen antizinkmiddelen, coalescen- temiddelen, reologiemodificatoren, antischuimmiddelen, fotobe- schermingsmiddelen, antivriesmiddelen, biostimulanten, pesticiden, biociden, plantengroeiregulatoren, beschermstoffen, penetrerende - middelen, antiklontermiddelen, minerale en/of plantaardige oliën en/of wassen, kleurstoffen en driftwerende middelen, en mengsels daarvan.

10. Een mengsel dat ten minste één heterocyclische verbinding met als alge- mene formule (I) bevat NRIR2 A Vee " () met de volgende definities: XS of NRA, waarbij R4 c1-4alky IS, R1C3-12-koolwaterstofresidu dat 1 tot 3 heteroatomen kan bevatten, geko- zen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, R2C1-6-koolwaterstofresidu dat één heteroatoom kan bevatten, gekozen uit de groep stikstof, zuurstof en zwavel, of waarin R1 en R2 samen met het stikstofatoom dat hen verbindt, een verza- digde of onverzadigde heterocyclische radicaal met vijf of zes leden vormen die naar keuze nog een of twee heteroatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuurstof en zwavel, en welke heterocyclische radicaal deel kan uitmaken van een C4-20-koolwaterstofresidu dat naar keuze naast het stikstofatoom dat R1 en R2 verbindt, nog een tot vier hete- roatomen kan bevatten, gekozen uit de groep bestaande uit stikstof, zuur-

stof, zwavel en fluor,

waarin R1 en R2 elk via een koolstofatoom verbonden zijn met het stikstof- atoom in NR1R2 en waarin in R1 en R2 heteroatomen van hetzelfde che- mische element niet naast elkaar liggen,

R3H ‚ C1-4-alkyl, S-C1-4-alkyl, NR5R6 waarbij R5 en R6 onafhankelijk van elkaar H, c1-6-aiky1, fenyl, fluorofenyl zijn,

en ten minste één aanvullend agrochemisch agens, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit

- ten minste één andere nitrificatieremmer, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit 2-(3,4-dimethyl-pyrazol-1-yl)-barnsteenzuur

(DMPSA), 3,4-dimethylpyrazool (DMP), 3,4-dimethylpyrazoolfosfaat (DMPP) dicyaandiamide (DCD), 1H-1,2,4-triazool, 3-methylpyrazool (3-MP), 2-chloor-6-(trichloormethyl)-pyridine, 5-ethoxy-3- trichloormethyl-1,2,4-thiadiazol, 2-amino-4-chloor-6-methyl- pyrimidine, 2-mercapto-benzothiazool, 2-sulfanilamidothiazool, thiou-

reum, natriumazide, kaliumazide, 1-hydroxypyrazool, 2- methylpyrazool-1-carboxamide, 4-amino-1,2,4-triazool, 3-mercapto- 1,2,4-triazool, 2.,4-diamino-6-trichloormethyl-5-triazine, koolstofbisul- fide, ammoniumthiosulfaat, natriumtrithiocarbonaat, 2,3-dihydro-2,2- dimethyl-7-benzofuranolmethylcarbamaat en N-(2,6-dimethylfenyl)-

N-(methoxyacetyl)-alanine-methylester,

- ten minste één ureaseremmer, bij voorkeur gekozen uit N- butylthiofosforzuurtriamide (NBTPT) en/of N-n- propylthiofosforzuurtriamide (NPTPT),

- ten minste één gebruikelijke agrochemische hulpstof, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit waterige en/of organische op- losmiddelen, pH-regelaars, oppervlakteactieve stoffen, bevochti- gingsmiddelen, spreidingsmiddelen, adhesiebevorderaars, dragers, vulstoffen, viscositeitsregelaars, emulgatoren, dispergeermiddelen, sequestreermiddelen antizinkmiddelen, coalescentiemiddelen, reolo-

giemodificatoren, antischuimmiddelen, fotobeschermingsmiddelen, antivriesmiddelen, biostimulanten, pesticiden, biociden, plantengroei- regulatoren, beschermstoffen, penetrerende middelen, antiklonter- middelen, minerale en/of plantaardige oliën en/of wassen, kleurstof- fen en driftwerende middelen, en mengsels daarvan.

11. Een meststofmengsel, bestaande uit A. een anorganische en/of organische en/of organominerale meststof en B. 10 tot 10000 gewichtsprocenten, op basis van de meststof, van een heterocyclische verbinding van de algemene formu- le (1) als omschreven in een van de claims 1 tot en met 5.

12. Het meststofmengsel zoals beweerd in claim 11, waarbij het meststof- mengsel in vaste vorm is en de heterocyclische verbinding van de algeme- ne formule (1) wordt aangebracht op het oppervlak van de, bij voorkeur an- organische, meststof.

13. Het meststofmengsel zoals bedoeld in een van de vorderingen 11 of 12, waarin het meststofmengsel ten minste één aanvullend agrochemisch agens bevat, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit - ten minste één andere nitrificatieremmer, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit 2-(3,4-dimethyl-pyrazol-1-yl)-barnsteenzuur (DMPSA), 3,4-dimethylpyrazool (DMP), 3,4-dimethylpyrazoolfosfaat (DMPP) dicyaandiamide (DCD), 1H-1,2,4-triazool, 3-methylpyrazool (3-MP), 2-chloor-6-(trichloormethyl)-pyridine, 5-ethoxy-3- trichloormethyl-1,2,4-thiadiazol, 2-amino-4-chloor-6-methyl- pyrimidine, 2-mercapto-benzothiazool, 2-sulfanilamidothiazool, thiou- reum, natriumazide, kaliumazide, 1-hydroxypyrazool, 2- methylpyrazool-1-carboxamide, 4-amino-1,2,4-triazool, 3-mercapto- 1,2,4-triazool, 2.,4-diamino-6-trichloormethyl-5-triazine, koolstofbisul- fide, ammoniumthiosulfaat, natriumtrithiocarbonaat, 2,3-dihydro-2,2- dimethyl-7-benzofuranolmethylcarbamaat en N-(2,6-dimethylfenyl)- N-(methoxyacetyl)-alanine-methylester,

- ten minste één ureaseremmer, bij voorkeur gekozen uit N- butylthiofosforzuurtriamide (NBTPT) en/of N-n- propylthiofosforzuurtriamide (NPTPT), - ten minste één gebruikelijke agrochemische hulpstof, bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit waterige en/of organische op- losmiddelen, pH-regelaars, oppervlakteactieve stoffen, bevochti- gingsmiddelen, spreidingsmiddelen, adhesiebevorderaars, dragers, vulstoffen, viscositeitsregelaars, emulgatoren, dispergeermiddelen, sequestreermiddelen antizinkmiddelen, coalescentiemiddelen, reolo- giemodificatoren, antischuimmiddelen, fotobeschermingsmiddelen, antivriesmiddelen, biostimulanten, pesticiden, biociden, plantengroei- regulatoren, beschermstoffen, penetrerende middelen, antiklonter- middelen, minerale en/of plantaardige oliën en/of wassen, kleurstof- fen en driftwerende middelen, en mengsels daarvan.

14. Een werkwijze voor de productie van het meststofmengsel zoals beweerd in een van de vorderingen 11 tot en met 13 door het inbrengen van de hetero- cyclische verbinding van de algemene formule (I) in de anorganische mest- stof, en/of het aanbrengen van de heterocyclische verbinding van de alge- mene formule (I) op het oppervlak van de anorganische meststof.

15. Een methode voor de bemesting van land- of tuinbouwgronden, waarbij een meststofmengsel dat verbindingen A en B bevat A. een anorganische en/of organische en/of organominerale meststof en B. 10 tot 10000 gewichtsprocenten, op basis van de meststof, van een heterocyclische verbinding van de algemene formu- le (1) als omschreven in een van de claims 1 tot en met 5, of de verbindingen A en B afzonderlijk, maar binnen een periode van O tot 5 uur, bij voorkeur O tot 1 uur, bij voorkeur ongeveer gelijktijdig, op de bo- dems worden aangebracht.