BE1024794A1 - Compositions immunogenes - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne le domaine des vésicules de membrane externe native (nOMV), en particulier des nOMV présentant des taux accrus de lipoprotéines sur leur surface et leur utilisation dans des compositions immunogènes.

Description

(71) Demandeur(s) :

GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA

1330, RIXENSART

Belgique (72) Inventeur(s) :

RICCHETTI Beatrice 53100 SIENA Italie

DELANY Isabel 53100 SIENA Italie (54) COMPOSITIONS IMMUNOGENES (57) La présente invention concerne le domaine des vésicules de membrane externe native (nOMV), en particulier des nOMV présentant des taux accrus de lipoprotéines sur leur surface et leur utilisation dans des compositions immunogènes.

11: -V.

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COMPOSITIONS IMMUNOGENES

Domaine technique

La présente invention concerne le domaine des vésicules de membrane externe native (nOMV), particulièrement des nOMV présentant des taux accrus de lipoprotéines sur leur surface et leur utilisation dans des compositions immunogènes. L'invention concerne en outre de nouvelles souches bactériennes Gram négatif modifiées génétiquement et leur utilisation dans la préparation et la fabrication de nOMV.

Contexte de 1¹ invention

Les bactéries Gram négatif libèrent spontanément des particules de type bleb de la membrane externe de la paroi cellulaire qualifiées de vésicules de membrane externe native (nOMV) [1] . Les vésicules de membrane externe peuvent être également produites de façon artificielle, par exemple, par extraction avec un détergent (qualifiées de dOMV). Des vésicules de membrane externe peuvent être également produites à partir de bactéries modifiées génétiquement pour présenter un phénotype « hyperbleb » dans lesquelles, comme conséquence de la modification génétique, des grandes quantités de membrane externe bourgeonnent fournissant de cette façon une source pratique de matériau membranaire. Les OMV extraites par un détergent diffèrent des nOMV parce que le détergent requis élimine des composants de la membrane tels que des lipoprotéines et augmente le coût de production des dOMV par rapport aux nOMV. Alors que les nOMV peuvent

BE2017/5464 être isolées du milieu de culture, généralement les quantités produites sont trop faibles pour être pratiques pour une production commerciale de vaccins.

L'expression des protéines complexes de la membrane externe dans leur conformation native et orientation correcte dans les nOMV fournit des avantages potentiels significatifs par rapport aux protéines recombinantes. Pour induire la formation de nOMV afin de fournir de plus grandes quantités suffisantes pour la production commerciale de vaccins, la structure membranaire est modifiée par la délétion de gènes codant pour des composants structuraux clés, par exemple gna33 (méningocoque) ou tolR (Shigella et Salmonella) [2] . A la différence des vaccins à base de bactéries entières, aux nOMV, il manque la membrane interne et des composants cytoplasmiques qui sont rarement les cibles de l'immunité protectrice. Puisque les nOMV, particulièrement les nOMV isolées de bactéries « hyperblebs », sont particulièrement adaptées au développement de vaccins, un objet de 1'invention est de fournir des procédés pour la production de nOMV présentant des caractéristiques et des qualités améliorées.

Brève description de 1'invention

Dans un premier aspect, l'invention fournit une bactérie Gram négatif qui surexprime, exprime de façon constitutive ou exprime de façon inductible une flippase. La bactérie peut être « hyperbleb ». En particulier, la bactérie Gram négatif est choisie dans le groupe constitué de Neisseria, Salmonella, Shigella,

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Haemophilus, Bordetella, Moraxella, Chlamydia et Escherichia. De façon encore plus particulière, la bactérie Gram négatif est choisie dans le groupe constitué de Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Shigella boydii, Shigella sonnei, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Chlamydia trachomatis et Escherichia coli.

Le terme « hyperbleb », tel qu'utilisé ici, se rapporte à une souche mutante de bactérie qui libère spontanément des vésicules de membrane externe dans de plus grandes quantités qu'une souche de type sauvage ou parente à partir de laquelle elle a été dérivée (par exemple, par unité de temps). En général, les mutants « hyperblebs » libèrent de plus grandes quantités de vésicules de membrane externe que la souche de type sauvage ou parente à partir de laquelle ils ont été dérivés, par exemple, de plus de 10 %, de plus de 20 %, de plus de 30 % ou de plus de 40 %. La bactérie Gram négatif « hyperbleb » peut être une souche mutante existant à l'état naturel ou elle peut être modifiée génétiquement pour présenter un phénotype « hyperbleb » Le terme « type sauvage » en référence à des bactéries se rapporte à une bactérie qui n'a pas été modifiée soit chimiquement soit génétiquement d'une façon quelconque (autre que développée dans un milieu de culture). Particulièrement, une bactérie de « type sauvage » est une bactérie qui n'a pas été modifiée génétiquement pour augmenter la libération de vésicules de membrane externe. Au contraire, le terme

BE2017/5464 « modifié(e) » ou « mutant(e) » se rapporte à une bactérie, un gène ou un produit de gène qui affiche des modifications dans la séquence et/ou les propriétés (c'est-à-dire, des caractéristiques modifiées) lors d'une comparaison à la bactérie, au gène ou au produit de gène de type sauvage. Il est noté que les mutants existant à l'état naturel peuvent être isolés ; ceux-ci sont identifiés par le fait qu'ils présentent des caractéristiques modifiées (y compris des séquences d'acide nucléique modifiées) lors d'une comparaison à la bactérie, au gène ou au produit de gène de type sauvage.

Le terme « exprime de façon constitutive » se rapporte à l'expression continue d'un gène d'intérêt sans aucune régulation (la transcription n'est ni supprimée ni induite). Au contraire, le terme « exprime de façon inductible » se rapporte à régulée d'un gène d'intérêt dans

1'expression laquelle la transcription se produit en réponse à un inducteur. Le terme « surexprime » est utilisé pour indiquer un taux d'expression qui est supérieur à celui généralement observé dans une bactérie témoin, de type sauvage et/ou non transgénique. En particulier, en référence aux taux d'ARNm qui peuvent être mesurés en utilisant l'une quelconque d'un certain nombre de techniques connues de l'homme du métier y compris, mais n'y étant pas limités, l'analyse Northern blot et/ou la réaction en chaîne de la polymérase quantitative en temps réel (qRT-PCR).

Les souches neissériennes, telles que Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae, peuvent être modifiées génétiquement pour présenter un phénotype

BE2017/5464 « hyperbleb » par régulation négative ou abolissement de l'expression, à titre d'exemple non limitatif, de GNA33. Des mutations similaires sont connues dans d'autres bactéries, par exemple, les souches d'Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis et Escherichia coli peuvent être modifiées génétiquement pour présenter un phénotype « hyperbleb » par régulation négative ou abolissement de l'expression d'un ou de plusieurs gènes choisis dans le groupe constitué de tolQ, tolR, tolX, tolA et tolB. Les souches de Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Shigella boydii et Shigella sonnei peuvent être modifiées génétiquement pour présenter un phénotype « hyperbleb » par régulation négative ou abolissement de l'expression d'un ou de plusieurs de tolR ou OmpA. Les mutations appropriées pour la régulation négative ou l'abolissement de l'expression comprennent des des délétions de gènes, des et toute modification des séquences génomiques qui entraîne un changement de l'expression génique, particulièrement une réduction et plus particulièrement une inactivation ou un silençage. D'autres mutations appropriées sont connues dans l'art.

Dans certains modes de réalisation, la bactérie Gram négatif « hyperbleb » est modifiée génétiquement par mutation pour réduire le potentiel pyrogène du lipopolysaccharide (LPS) des bactéries. Des mutations particulières comprennent, à titre d'exemple non limitatif, des mutations dans IpxLl, synX, IgtA, htrA, msbBl, msbB2, virG et leurs homologues. Des mutations appropriées pour la régulation négative ou mutations ponctuelles, insertions de gènes,

BE2017/5464 l'abolissement de l'expression comprennent des mutations ponctuelles, des délétions de gènes, des insertions de gènes, et toute modification des séquences génomiques qui entraîne un changement de l'expression génique, particulièrement une réduction et de façon encore plus particulière une inactivation ou un silençage. De préférence, la mutation est une délétion. D'autres mutations appropriées sont connues dans 1'art.

La bactérie Gram négatif « hyperbleb » peut être en outre modifiée génétiquement par un ou plusieurs procédés choisis dans le groupe suivant : (a) un procédé de régulation négative de l'expression des antigènes immunodominants variables ou non protecteurs, (b) un procédé de régulation positive de l'expression des antigènes protecteurs OMP, (c) un procédé de régulation négative d'un gène impliqué pour rendre la partie lipide A du LPS toxique, (d) un procédé de régulation positive d'un gène impliqué pour rendre la partie lipide A du LPS moins toxique, et (e) un procédé de modification génétique de la bactérie pour exprimer un antigène hétérologue.

Particulièrement, la flippase comprend une séquence présentant 80 % d'identité de séquence avec,

ou	qui	est	un homologue	de,	une	séquence	choisie	dans
le	groupe	constitué de	SEQ	ID	NO : 1, SEQ ID NO	: 2,
SEQ	ID	NO :	3 et SEQ ID	NO :	4 .	De façon	encore	plus

particulière, la flippase comprend une séquence présentant plus de 85 %, plus de 90 %, plus de 95 %, plus de 96 %, plus de 97 %, plus de 98 % ou plus de 99 % d'identité avec une séquence choisie dans le groupe

BE2017/5464 constitué de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4. Dans certains modes de réalisation, la flippase comprend une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4.

Dans un deuxième aspect de l'invention, il est fourni une préparation des vésicules de membrane externe obtenues à partir de la bactérie du premier aspect. Les vésicules de membrane externe obtenues à partir d'une telle bactérie présentent un taux ou une quantité supérieure d'au moins une lipoprotéine exposée sur la surface, par exemple, comme il est mesuré par une analyse FACS et lors d'une comparaison aux vésicules de membrane externe obtenues à partir d'une souche de type sauvage ou parente. En particulier, les vésicules de membrane externe peuvent être filtrées à travers une membrane de 0,22 pm.

Dans un troisième aspect de l'invention, il est fourni des compositions pharmaceutiques comprenant la préparation de vésicules de membrane externe du deuxième aspect de l'invention. En particulier, la composition pharmaceutique comprend un diluant ou un support pharmaceutiquement acceptable. Plus particulièrement, la composition pharmaceutique est destinée à une utilisation dans un procédé de traitement du corps humain ou animal. De préférence, la composition pharmaceutique est une composition vaccinale.

Un quatrième aspect de 1'invention fournit un procédé de protection, de prévention ou de traitement d'un individu contre une infection bactérienne qui

BE2017/5464 comprend l'administration à l'individu d'une quantité efficace de vésicules de membrane externe du deuxième aspect ou de la composition pharmaceutique du troisième aspect. En particulier, l'individu est un mammifère, de préférence un être humain. L'infection bactérienne peut correspondre au genre et/ou à l'espèce à partir duquel/de laquelle 1'OMV a été obtenue (par exemple, une OMV dérivée de Neisseria meningitidis utilisée pour protéger, prévenir ou traiter une infection par Neisseria meningitidis) . Lorsqu'elles sont présentes, les une ou plusieurs protéines hétérologues de membrane externe peuvent ou pas correspondre au genre et/ou à l'espèce à partir duquel/de laquelle 1'OMV a été obtenue. L'infection bactérienne peut correspondre au genre et/ou à l'espèce à partir duquel/de laquelle les une ou plusieurs protéines hétérologues de membrane externe ont été obtenues ou dérivées (par exemple, la protéine de membrane externe dérivée de Neisseria meningitidis utilisée pour protéger, prévenir ou traiter une infection par Neisseria meningitidis). L'espèce à partir de laquelle 1'OMV a été obtenue peut ou pas correspondre à l'infection bactérienne. Dans un mode de réalisation, l'espèce à partir de laquelle 1 ' OMV a été obtenue et les une ou plusieurs protéines hétérologues correspondent à l'infection bactérienne.

Selon un cinquième aspect, il est fourni un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique comprenant une préparation de vésicules de membrane externe du deuxième aspect, le procédé comprenant : (a) l'inoculation d'un récipient de culture contenant un milieu nutritif approprié pour la croissance de la

BE2017/5464 bactérie du premier aspect ; (b) la culture de ladite bactérie ; (c) la récupération des vésicules de membrane externe à partir du milieu ; et (d) le mélange des vésicules de membrane externe avec un diluant ou un support pharmaceutiquement acceptable. Dans certains modes de réalisation, le procédé peut comprendre en outre une étape, après soit l'étape (c) soit l'étape (d) , comprenant la stérilisation par filtration de la préparation de vésicules de membrane externe. En particulier, l'étape de filtration comprend au moins une étape de filtration à flux tangentiel (FFT) . De façon encore plus particulière, le procédé n'utilise pas de centrifugation.

Dans un sixième aspect, il est fourni un procédé de production d'une bactérie « hyperbleb » selon le cinquième aspect, lequel procédé comprend la modification génétique d'une souche bactérienne Gram négatif par : (a) modification de la souche pour réguler négativement l'expression d'un ou de plusieurs gènes Toi ; et (b) modification de la souche pour surexprimer, exprimer de façon constitutive ou exprimer de façon inductible une flippase. Les étapes (a) et (b) du procédé peuvent être effectuées dans un ordre quelconque ou elles peuvent être réalisées sensiblement en même temps.

Brève description des figures

Figure 1 - (A) Représentation schématique des domaines structuraux prédits de NMB0313 (BLASTP 2.3.1) ;

(B) représentation schématique de la stratégie de knock-out (inactivation) de nmb0313.

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Figure 2 - Analyse Western blot de l'expression de NMB0313 dans les souches de type sauvage et knock-out (inactivées) pour nmb0313 (i) MC58, (ii) NGH38 et (iii) NZ 98/254.

Figure 3 - Analyse de l'expression et de l'exposition sur la surface des lipoprotéines fHbp et NHBA dans des souches nmb0313KO par analyse Western blot et FACS.

Figure 4 - (A) Représentation schématique de la stratégie de complémentation génomique par nmb0313 ; (B) analyse Western blot de l'expression de NMB0313 dans des concentrations croissantes d'IPTG.

Figure 5 - Analyse de l'expression et de l'exposition sur la surface des lipoprotéines fHbp et NHBA dans la souche NGH38 complémentée par nmb0313 par

A) analyse Western blot et FACS ; B) sur les diagrammes, sont rapportés les pourcentages de la fluorescence moyenne (IMF) extrapolée de l'analyse FACS de fHbp ou NHBA par rapport aux taux de type sauvage (wt) aux différentes concentrations d'IPTG.

Figure 6 - A) Représentation schématique des plasmides utilisés pour la transformation d'E. coli ;

B) analyse Western blot de l'expression recombinante de NMB0313 et fHbp en présence de concentrations croissantes d'IPTG et analyse FACS de fHbp ; C) sur les diagrammes, sont rapportées les IMF extrapolées de l'analyse FACS de fHbp aux différentes concentrations d'IPTG ; D) analyse western blot de l'expression recombinante de NHBA et analyse FACS de NHBA (résultats préliminaires).

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Figure 7 - Représentation schématique des plasmides pet Cola DUET avec NMB0313, et fHBP ou NHBA, clonés dans l'un des deux sites de clonage multiple.

Figure 8 - Analyse Western blot de lysats d'E. coli après culture dans 0,1 mM d'IPTG colorés avec un sérum polyclonal A) anti-fHbp et B) anti-NHBA à partir de cultures portant pETCOLA seul (Vide) ou pETCOLA exprimant l'une ou l'autre lipoprotéine seule (NHBA ou fHbp, respectivement) ou coexprimant chaque lipoprotéine avec NMB0313 (NHBA 0313 ou fHbp 0313, respectivement) . Analyse FACS sur les cultures respectives y compris E. coli exprimant la NMB0313 seule (0313) en utilisant un anticorps (C) α-NHBA et (D) a-fHbp.

Figure 9-4 pg d'OMV ont été chargés sur un gel de SDS-PAGE et les bandes relatives à NMB0313 (rose), NHBA (vert) et fHBP (rouge) sont affichées en surbrillance.

Figure 10 - Western blot en utilisant un anticorps polyclonal a-fHbp d'une dilution en série d'OMV d'E. coli en démarrant à des quantités de 1 pg.

Figure 11 - Grandes lignes du schéma d'immunisation.

Figure 12 - Titres ELISA en utilisant de la fHbp recombinante en tant qu'antigène de sensibilisation. L'analyse statistique a été effectuée en utilisant le test des comparaisons multiples de Kruskal-Wallis (ns : non significatif ; **p < 0,0065 ; ***p < 0,0009, ****p < 0, 0001) .

Figure 13 - Titres de rSBA avec des sérums de souris groupés.

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Figure 14 - rSBA avec des souris simples. L'analyse statistique a été effectuée en utilisant le test des comparaisons multiples de Kruskal-Wallis (**p < 0,0024, ****p < 0,0001).

Figure 15 - litres ELISA en utilisant α-NHBA en tant qu'antigène de sensibilisation. L'analyse statistique a été effectuée en utilisant le test des

comparaisons	multiples	de	Kruskal-Wallis (ns :	non
significatif	; **p < 0,	0 0 60 ;	***p < 0,0002) .
Figure	16 - litres	de rSBA de sérums groupés	issus
des groupes	indiqués 1	(OMV	vides 2 pg) , 2 (OMV	0313

pg) , 8 (OMV NHBA 2 pg) , 9 (OMV NHBA+0313 2 pg), et 10 (rNHBA 1 pg).

Figure 17 - rSBA avec des souris simples. L'analyse statistique a été effectuée en utilisant le test des comparaisons multiples de Kruskal-Wallis (**p < 0,0051).

Figure 18 - Analyse Western blot de lysats de N. meningitis colorés avec un sérum polyclonal antiNHBA A) anti-NMB0313 et B) anti-fHbp, à partir de cultures liquides. La souche complémentée NGH38 (Ci0313) est cultivée avec différentes concentrations d'IPIG.

C) L'analyse FACS de fHbp ou NHBA sur les cultures respectives est rapportée sous la forme de diagrammes avec le pourcentage de la fluorescence moyenne (IMF) extrapolée de l'analyse FACS.

Figure 19 - A) 4 pg d'OMV sont chargés sur un gel de SDS-PAGE. B) Analyse WB de 1 pg d'OMV colorées avec un sérum polyclonal α-fHbp et un sérum polyclonal aNHBA.

Figure 20 - rSBA avec des sérums de souris groupés.

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Figure 21 - Données brutes de l'exemple B.

Description détaillée de l'invention

Les inventeurs ont découvert que la coexpression d'une flippase dans une cellule bactérienne avec au moins une lipoprotéine d'intérêt (telle que la protéine de liaison du facteur H (fHbp)) influence fortement la quantité totale de la lipoprotéine d'intérêt et/ou la proportion de la lipoprotéine d'intérêt qui est exposée à la surface. Les inventeurs ont découvert en outre que des cellules bactériennes Gram négatif coexprimant une flippase et au moins une lipoprotéine d'intérêt peuvent être utilisées pour produire des vésicules de membrane externe qui sont enrichies en ladite au moins une lipoprotéine d'intérêt. De telles OMV (parfois qualifiées de modules généralisés pour antigènes membranaires ou GMMA) isolées de telles cellules bactériennes Gram négatif sont particulièrement appropriées pour une utilisation dans des compositions immunogènes telles que des vaccins. Pour éviter toute ambiguïté, la référence à des OMV ou GMMA est censée se rapporter à des vésicules de membrane externe native, particulièrement des vésicules de membrane externe native dérivées de bactéries qui ont ou affichent un phénotype « hyperbleb » et ne vésicules de membrane externe détergent.

Les membranes externes des bactéries Gram négatif sont des structures immunologiquement importantes en raison de leur accessibilité aux mécanismes de défense de l'hôte. Les lipoprotéines sont des protéines comprend pas les extraites avec un

BE2017/5464 caractérisées par la présence d'une cystéine lipidée qui permet l'ancrage de la molécule à la membrane. De préférence, 1 ' au moins une lipoprotéine d'intérêt est fixée du côté extracellulaire de la membrane externe. De façon encore plus particulière, 1'au moins une lipoprotéine d'intérêt est une lipoprotéine immunogène. Ainsi, le terme « exposée à la surface » est utilisé pour signifier que les lipoprotéines sont disponibles pour la liaison d'anticorps (par exemple, sur le feuillet externe de la membrane externe des cellules bactériennes et/ou des OMV) . Ainsi, les OMV de l'invention comprennent plus de 1 ' au moins une lipoprotéine d'intérêt et/ou une proportion et/ou une quantité accrue de 1'au moins une lipoprotéine d'intérêt qui est exposée à la surface.

Le terme « enrichi (e) », se rapporte à un composé ou une composition qui présente une proportion accrue d'une propriété ou d'un élément souhaité. Par exemple, une OMV ou GMMA qui est « enrichie » pour une lipoprotéine signifie que 1'OMV ou GMMA comprend une

proportion	supérieure	de	la	lipoprotéine	(par	exemple,
plus de 50	%, 55 %, 60	O O r	65	%, 70 %, 75 %	, 80	%, 85 %,
90 %, 95 %	ou plus jusqu	' à	100 %) et/ou	une	fraction

supérieure (supérieure à 1,25, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 5, 5,5 fois ou plus) de lipoprotéine totale et/ou une fraction supérieure (supérieure à 1,25, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 5, 5,5 fois ou plus) de lipoprotéine exposée à la surface par rapport à une OMV ou GMMA dérivée d'une cellule qui ne surexprime pas, n'exprime pas de façon constitutive ou qui n'a pas été induite pour exprimer une flippase.

BE2017/5464 facteur H identifiée

Ceci est avantageux parce que les lipoprotéines sont capables d'activer une réponse immunitaire chez l'hôte allant de la production d'anticorps bactéricides jusqu'à la production d'une réponse en lymphocytes T cytotoxiques. Par exemple, la protéine de liaison du (fHbp) est une lipoprotéine de 28 kD comme un antigène protecteur contre

Neisseria meningitidis qui est capable de déclencher une réponse bactéricide indépendante de PorA affichant une réactivité largement croisée. L'amélioration de l'exposition ou de la quantité de lipoprotéines sur la surface des vésicules de membrane externe, particulièrement des GMMA, peut mener à des améliorations de la réponse immunitaire obtenue à la suite d'une vaccination. En outre, la coexpression d'une flippase peut également faciliter l'exposition à la surface de lipoprotéines exprimées de façon hétérologue. Ainsi, l'invention a également le potentiel d'aider à économiser les doses, réduisant la quantité du composant des vésicules de membrane externe nécessaire dans une composition pharmaceutique ou vaccinale pour induire une réponse immunitaire souhaitée, réduisant de cette façon le risque, par exemple, de pyrogénicité.

La bactérie

L'invention peut s'appliquer à diverses bactéries Gram négatif, comme des espèces de l'un quelconque des genres Escherichia, Shigella, Neisseria, Moraxella, Bordetella, Borrelia, Brucella, Chlamydia, Haemophilus, Legionella, Pseudomonas, Yersinia, Helicobacter, Salmonella, Vibrio, et analogues. Par exemple, la

BE2017/5464 bactérie peut être Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis. Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Moraxella catarrhalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae (y compris les souches non

Legionella

Neisseria

Pseudomonas

Helicobacter typables), gonorrhoeae, lactamica, pneumophila, meningitidis, aeruginosa,

Neisseria

Neisseria

Yersinia enterocolitica, pylori, Salmonella enterica (y compris les sérovars typhi et typhimurium, ainsi que les sérovars paratyphi et enteritidis), Vibrio cholerae, etc.

L'invention est particulièrement appropriée pour une utilisation avec Neisseria (comme Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae), Salmonella (comme Salmonella typhi ou Salmonella typhimurium), Shigella (comme S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii ou S. sonnei), Escherichia coli (y compris les souches pathogènes extra-intestinales) , Haemophilus influenzae (par exemple, Haemophilus influenzae non typable ou NtHI) et Bordetella pertussis.

Les bactéries Gram négatif libèrent spontanément les vésicules de membrane externe durant la croissance bactérienne et celles-ci peuvent être purifiées à partir du milieu de culture. Dans des modes de réalisation préférés, les bactéries pour une utilisation dans l'invention sont, par rapport à leurs souches de type sauvage correspondantes, « hyperbleb », c'est-à-dire qu'elles libèrent dans leur milieu de culture de plus grandes quantités de vésicules de membrane externe que la souche de type sauvage. Des souches « hyperblebs » existant à l'état naturel pour

BE2017/5464 une utilisation dans l'invention sont connues dans l'art, par exemple, la souche de N. gonorrhoeae WR302. Dans certains modes de réalisation, les bactéries sont modifiées génétiquement pour libérer de plus grandes quantités de vésicules de membrane externe ou GMMA dans le milieu de culture durant la croissance et la réplication des cellules bactériennes. Les gènes ou les protéines particuliers connus pour modifier la vésiculation comprennent, à titre d'exemple non limitatif, GNA33, ompA, degP, degS, nlpl, ompC, ompR, pnp, ponB, rmpM, rseA, tatC, tolA, tolQ, tolR, tolB, pal, wag/rfaG, wzxE, yieM et leurs homologues.

Dans certains modes de réalisation, au moins l'une des protéines connues pour modifier la vésiculation est éliminée, par exemple, par délétion ou inactivation du gène. Des procédés appropriés pour déléter ou inactiver des gènes sont connus dans l'art. Dans d'autres modes de réalisation, la surexpression de gènes/protéines particuliers comme le domaine N-terminal de la protéine de phage g3P ou les domaines de translocation des colicines A et E3 peut mener à une augmentation de la vésiculation. Des procédés appropriés pour exprimer, particulièrement surexprimer, des gènes/protéines sont connus dans l'art.

Flippases

Les flippases sont des protéines transporteuses de lipides transmembranaires localisées dans la membrane cellulaire qui sont responsables de l'aide au mouvement des molécules des phospholipides entre ou à travers la membrane cellulaire. Ainsi, les flippases de la présente invention sont des transporteurs de lipides

BE2017/5464 (lipoprotéines) avec la capacité de bouger ou de faciliter le mouvement (par exemple, en tant que partie d'un processus multifactoriel) d'une ou de plusieurs lipoprotéines vers le côté extracellulaire de la membrane externe.

Un exemple de flippase impliquée dans l'exposition à la surface des lipoprotéines de N. meningitidis, a été identifié et est codé par le gène nmb0313. Il s'agit d'une protéine de la membrane externe caractérisée par la présence d'un domaine N-terminal avec un domaine de répétition tétratricopeptide (TRP) et d'un domaine transmembranaire C-terminal structuré comme un domaine de type porine. Les séquences nucléiques et d'acides aminés de nmb0313 sont fournies sous la forme de SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, respectivement. La séquence d'acides aminés d'une autre flippase de N. meningitidis, nmbl971, est fournie sous la forme de SEQ ID NO : 3. Des homologues de flippases de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae ont été également identifiés et sont fournis sous la forme de SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5, respectivement

Dans certains modes de réalisation de l'invention, la bactérie Gram négatif est modifiée génétiquement pour exprimer de façon inductible au moins une flippase (dérivée d'une souche qui n'exprime pas naturellement une flippase ou, en variante, dérivée d'une souche qui exprime naturellement une flippase [par exemple, en remplacement de ou en plus de la flippase exprimée naturellement]). Dans un système d'expression inductible, l'expression de la séquence codante de la flippase se produit dans la cellule bactérienne en

BE2017/5464 réponse à un stimulus appliqué, par exemple, en réponse à un contact avec un composé médiateur de l'expression tel que, à titre d'exemple non limitatif, l'IPTG. Ainsi, dans certains modes de réalisation, la bactérie Gram négatif est modifiée génétiquement pour comprendre une cassette d'expression inductible qui est sensible à un modulateur de la transcription configurée de telle façon qu'il est obtenu l'expression inductible d'une séquence codante de flippase. Dans d'autres modes de réalisation de l'invention, la bactérie Gram négatif est modifiée génétiquement pour exprimer de façon constitutive au moins une flippase de telle façon que l'expression d'une séquence codante de flippase dans une cellule bactérienne Gram négatif est continue sans tenir compte de la présence ou de l'absence d'un composant médiateur de l'expression particulier. Le terme « surexprime » ou « surexpression » se rapporte à l'expression d'un produit de gène à un taux supérieur à celui exprimé avant la manipulation du micro-organisme ou dans un micro-organisme comparable qui n'a pas été manipulé. Ainsi, le micro-organisme peut être conçu ou modifié génétiquement pour surexprimer un taux de flippase supérieur à celui exprimé dans un microorganisme comparable qui n'a pas été modifié. Le génie génétique peut comprendre, mais n'y est pas limité, l'altération ou la modification de séquences régulatrices ou de sites associés à l'expression d'un gène particulier (par exemple, par l'addition de promoteurs forts, de promoteurs inductibles ou de promoteurs multiples ou par élimination de séquences régulatrices de telle façon que l'expression est

BE2017/5464 constitutive), la modification de l'emplacement chromosomique d'un gène particulier, la modification des séquences d'acide nucléique adjacentes à un gène particulier comme un site de liaison des ribosomes, l'augmentation du nombre de copies d'un gène particulier, la modification de protéines (par exemple, des protéines régulatrices, des suppresseurs, des amplificateurs, des activateurs de la transcription et analogues) impliquées dans la transcription d'un gène particulier et/ou la traduction d'un produit de gène particulier, ou tout autre moyen traditionnel de dérégulation de l'expression d'un gène particulier de routine dans l'art (y compris, mais n'y étant pas limité, l'utilisation de molécules d'acides nucléiques antisens, par exemple, pour bloquer l'expression de protéines répresseurs). Le génie génétique peut également comprendre la délétion d'un gène, par exemple, pour bloquer une voie ou pour éliminer un répresseur. La flippase peut être une flippase hétérologue. Le terme « flippase hétérologue » se rapporte à un gène de flippase qui est soit étranger à une cellule hôte choisie, soit sinon est modifié (par exemple, un gène natif placé sous le contrôle d'un promoteur différent). Par exemple, un acide nucléique hétérologue peut être un acide nucléique qui est normalement trouvé dans l'organisme de référence à un emplacement génomique différent ou ce peut être un acide nucléique qui n'est pas normalement trouvé dans l'organisme de référence. Une bactérie Gram négatif comprenant une flippase hétérologue peut être produite par introduction de la séquence polynucléotidique ou génique de la flippase

BE2017/5464 dans la bactérie Gram négatif. Dans des exemples particuliers, la séquence polynucléotidique d'une flippase hétérologue comprend une séquence codante native, ou l'une de ses parties, qui est réintroduite dans une bactérie Gram négatif sous une forme qui est différente du polynucléotide natif correspondant. Par exemple, une séquence polynucléotidique d'une flippase hétérologue peut comprendre une séquence codante native qui est une partie d'un gène chimérique comprenant des régions régulatrices non natives qui est réintroduite dans la bactérie Gram négatif native.

Vésicules de membrane externe ou GMMA

Les OMV ou GMMA ont généralement un diamètre de 35 à 120 nm par microscopie électronique, par exemple, 50 nm de diamètre. Les OMV ou GMMA libérées durant la croissance bactérienne peuvent être purifiées à partir du milieu de culture. La purification implique idéalement la séparation des GMMA des bactéries vivantes et/ou intactes, par exemple, par une filtration basée sur la taille en utilisant un filtre, tel qu'un filtre de 0,22 pm, qui permet aux GMMA de passer à travers mais qui ne permet pas aux bactéries intactes de passer à travers, ou par l'utilisation d'une centrifugation à basse vitesse pour agréger les cellules tout en laissant les GMMA en suspension. Des procédés de purification appropriés sont connus dans l'art. Un procédé de purification par filtration en deux étapes préféré est décrit dans le document WO 2011/036562 incorporé ici en référence. En particulier, le procédé de filtration en deux étapes

BE2017/5464 est utilisé pour séparer les GMMA de la biomasse de la culture cellulaire sans utilisation de centrifugation.

Les compositions de l'invention contenant des OMV ou GMMA seront généralement sensiblement dépourvues de bactéries entières, qu'elles soient vivantes ou mortes. La taille des GMMA signifie qu'elles peuvent être facilement séparées des bactéries entières par filtration, par exemple, telle que généralement utilisée pour la stérilisation sur filtre. Bien que les GMMA passent à travers les filtres classiques de 0,22 pm, ceux-ci peuvent se retrouver rapidement colmatés par d'autres matériaux, et ainsi il peut être utile d'effectuer des étapes séquentielles de stérilisation sur filtre à travers une série de filtres de taille de pore décroissante avant l'utilisation d'un filtre de 0,22 pm. Des exemples des filtres précédents seront ceux avec une taille de pore de 0,8 pm, 0,45 pm, etc. Les GMMA sont libérés spontanément à partir des bactéries et une séparation à partir du milieu de culture, par exemple, en utilisant une filtration, est pratique. Les vésicules de membrane externe formées par des procédés qui impliquent une rupture délibérée de la membrane externe (par exemple, par un traitement avec un détergent, tel qu'une extraction avec du désoxycholate, ou une sonication) pour provoquer la formation des vésicules de membrane externe sont exclues de l'étendue de l'invention. De préférence, les OMV ou GMMA utilisées dans l'invention sont sensiblement dépourvues de membrane interne et de contamination cytoplasmique et elles contiennent des lipides et des protéines.

BE2017/5464

Modification de la structure du lipide A

De	préférence, les	OMV	ou GMMA	sont	préparées à
partir	d'une bactérie	Gram	négatif	présentant une
modification génétique	qui	pousse	la	bactérie à
produire	un lipopolysaccharide (LPS)	qui	est modifié

pour avoir une toxicité réduite. De préférence, la bactérie Gram négatif produit du LPS avec une toxicité réduite dans laquelle le LPS (ou sa fraction lipide A (LA)) est modifié pour avoir une toxicité réduite. Un LPS qui est modifié pour avoir une toxicité réduite est compris ici comme un LPS qui est modifié pour présenter moins de toxicité que la toxicité d'un LPS de type sauvage correspondant. De préférence, le LPS modifié présente moins d'environ 90, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2,

1, 0,5, ou 0,2 % de la toxicité du LPS de type sauvage correspondant. Les toxicités du LPS de type sauvage et des divers LPS modifiés avec une toxicité réduite peuvent être déterminées dans tout test approprié connu dans l'art. Un test préféré pour déterminer la toxicité, c'est-à-dire l'activité biologique du LPS, est le test WEHI pour l'induction du TNF-alpha dans la lignée cellulaire de macrophages MM6 [43, 44].

Toutefois, alors qu'il est préféré que le LPS de la bactérie Gram négatif (ou sa fraction LA) présente une toxicité réduite, il est en outre préféré que le LPS conserve au moins une partie de son activité immunostimulante, c'est-à-dire, son activité adjuvante. Ainsi, le LPS avec une toxicité réduite de la bactérie Gram négatif à utiliser dans l'invention possède de préférence au moins environ 10, 20, 40, 80, 90 ou 100 % de l'activité immunostimulante du LPS de type sauvage

BE2017/5464 costimulante dendritiques une molécule de cellules Gram négatif correspondant, grâce à quoi l'activité immunostimulante est déterminée en mesurant la production d'au moins une cytokine ou l'expression d'au moins lors de la coculture (CD) avec la bactérie produisant le LPS avec une toxicité réduite comme il est décrit dans l'exemple 3 du document WO 2005/107798.

Les LPS des bactéries Gram négatif présentant une toxicité réduite de la fraction lipide A mais conservant (une partie de) l'activité adjuvante, peuvent être obtenus, par exemple, à partir de pathogènes Gram négatif modifiés génétiquement et comme il est décrit dans le document WO 02/09746. Des pathogènes Gram négatif modifiés génétiquement produisant du LPS avec une toxicité réduite de la fraction lipide A mais conservant (une partie de) leur activité adjuvante comprennent, par exemple, des bactéries Gram négatif comportant une ou plusieurs modifications génétiques qui diminuent ou inactivent (knock-out) l'expression d'un ou de plusieurs gènes choisis parmi les gènes IpxLl et lpxL2 ou leurs homologues (anciennement connus sous le nom de htrB et msbB ; voir par exemple, le document WO 00/26384 ; le brevet US No. 5 997 881) et le gène IpxK codant pour le lipide A 4'-kinase ou l'un de ses homologues (voir également ci-dessous) ; et des modifications génétiques qui affectent l'expression d'un ou de plusieurs gènes hétérologues lpxE et pagL. Des modifications génétiques particulières sont des modifications qui diminuent ou inactivent (knock-out) l'expression d'un ou de plusieurs gènes choisis parmi les gènes IpxLl et lpxL2

BE2017/5464 ou leurs homologues. Un LPS préféré avec une toxicité réduite de la fraction lipide A mais conservant (une partie de) son activité adjuvante est un LPS décrit dans le document WO 00/26384.

Par exemple, on sait modifier des bactéries de telle façon qu'elles n'expriment pas un lipopolysaccharide (LPS) natif, particulièrement pour E. coli, le méningocoque, Shigella, et analogues. Diverses modifications de LPS natif peuvent être réalisées, par exemple, celles-ci peuvent perturber la structure du lipide A natif, le noyau oligosaccharidique, ou l'antigène O externe. Les modifications appropriées comprennent la délétion ou l'inactivation, à titre d'exemple non limitatif, de IpxL, IpxLl, lpxL2, IpxM, htr, msbBl, msbB2, pagP, lgtA, synX et analogues.

Des souches appropriées de Shigella pour une utilisation dans l'invention peuvent comprendre un ou plusieurs autres changements par rapport à une souche de type sauvage. En particulier, des souches pour une utilisation avec l'invention comprennent une ou plusieurs mutations entraînant l'inactivation de htrB, msbBl et/ou msbB2. A titre d'exemple non limitatif, des mutations appropriées peuvent être choisies dans le groupe constitué de AhtrB, AmsbBl et AmsbB2. Pour simplifier, des délétions doubles à la fois de msbBl et msbB2 peuvent être également qualifiées de ADmsbB. L'inactivation de htrB ou msbBl et msbB2 réduit l'acylation dans le lipide A. Dans certains modes de réalisation, aux souches pour une utilisation avec l'invention, il manque l'antigène O dans le LPS,

BE2017/5464 évitant de cette façon les réponses spécifiques du sérotype lorsque

Dans S. sonnei, l'antigène le plasmide virulence est d'autres modes de réalisation, des souches pour une utilisation avec l'invention produisent du LPS comprenant l'antigène O. La présence de l'antigène O peut être avantageuse puisque des compositions immunogènes déclencheront des réponses immunitaires à réactivité croisée à la fois spécifiques du sérotype et supplémentaires. La perte du plasmide de virulence mène à la perte du gène msbB2, et le gène chromosomique msbBl peut être inactivé, éliminant de cette façon myristoyl-transférase et

O est absent éliminé. Dans

1'activité fournissant un lipide A penta-acylé dans le LPS. Des souches particulières de Shigella pour une utilisation dans l'invention ont un LPS penta-acylé. En variante, l'inactivation de htrB entraîne la perte de la chaîne lauroyle et ainsi peut produire un LPS penta-acylé dans certaines souches et/ou des formes de lipide A qui sont moins toxiques que le lipide A de type sauvage. Par exemple, dans S. flexneri, l'inactivation de htrB peut être compensée par l'activité d'une autre enzyme, LpxP qui produit un lipide A hexa-acylé dans lequel la chaîne lauroyle est remplacée par une chaîne palmitoléoyle. Le lipide A hexa-acylé comprenant des chaînes palmitoléoyle est moins toxique que le lipide A de type sauvage.

Des souches appropriées sont divulguées dans les exemples. D'autres souches appropriées sont connues dans l'art, à titre d'exemple non limitatif, dans les

BE2017/5464 documents WO 2006/046143, EP 2279747, WO 2011/036564 et WO 2014/174043.

Lipoprotéines d'un intérêt particulier

En particulier, les cellules des bactéries Gram négatif coexprimeront au moins une flippase et au moins une lipoprotéine d'intérêt de telle façon que les cellules bactériennes peuvent être utilisées pour produire des vésicules de membranes externes qui sont enrichies en ladite au moins une lipoprotéine d'intérêt

L'au moins une lipoprotéine d'intérêt peut être une lipoprotéine hétérologue ou une lipoprotéine native Le terme « lipoprotéine hétérologue » se rapporte à une lipoprotéine qui est soit étrangère à une cellule hôte choisie, et/soit sinon est modifiée (par exemple, un gène natif placé sous le contrôle d'un promoteur différent). Par exemple, la séquence nucléotidique d'une lipoprotéine hétérologue peut être une séquence nucléotidique qui se trouve normalement dans l'organisme de référence à un emplacement génomique différent ou peut être un acide nucléique qui se trouve normalement dans l'organisme de référence. Une bactérie Gram négatif comprenant une lipoprotéine hétérologue peut être produite par introduction de la séquence polynucléotidique ou génique de la lipoprotéine hétérologue dans la bactérie Gram négatif. Dans des exemples particuliers, la séquence polynucléotidique ou génique de la lipoprotéine hétérologue comprend une séquence codante native, ou l'une de ses parties, qui est réintroduite dans une bactérie Gram négatif sous une forme qui est différente du polynucléotide natif correspondant. Par exemple, la séquence

BE2017/5464 polynucléotidique ou génique de la lipoprotéine hétérologue peut comprendre une séquence codante native qui est une partie d'un gène chimérique incluant des régions régulatrices non natives qui est réintroduite dans la bactérie Gram négatif native.

Toutefois, l'au moins une lipoprotéine d'intérêt peut être également une lipoprotéine native qui est une lipoprotéine exprimée de façon endogène et normalement présente dans la cellule. A titre d'exemple non limitatif, les suivantes sont des lipoprotéines d'un intérêt particulier :

fHbp (protéine de liaison du facteur H)

L'antigène fHbp a été caractérisé en détail. Il est également connu comme la protéine '741' (SEQ ID NO : 2535 et 2536 dans la référence 29), 'NMB 1870', 'GNA1870' [34 à 36], 'P2086', 'LP2086' ou 'ORF2086' [37 à 39]. Il s'agit naturellement d'une lipoprotéine et elle est exprimée parmi de nombreux sérogroupes méningococciques. La structure du domaine immunodominant C-terminal de la fHbp ('fHbpC' ) a été déterminée par RMN [40] . Cette partie de la protéine forme un tonneau ß à huit brins, dont les brins sont reliés par des boucles de longueurs variables. Le tonneau est précédé d'une hélice a courte et d'une queue N-terminale flexible. La protéine a été confirmée comme une protéine de liaison du facteur H, et nommée fHbp, dans la référence 41.

L'antigène fHbp se décline en trois variants distincts [42] et il a été découvert que le sérum dirigé contre une famille donnée est bactéricide au sein de la même famille, mais n'est pas actif contre

BE2017/5464 des souches qui expriment l'une des deux autres familles, c'est-à-dire qu'il existe une protection croisée intra-famille, mais pas de protection croisée inter-famille. L'invention peut utiliser un seul variant de la fHbp, mais pour fournir une couverture plus large une composition peut comprendre de façon utile au moins deux variants de la fHbp ou au moins trois variants de la fHbp. Le gène de la fHbp exprime une protéine précurseur qui contient un motif de signal de lipoprotéine, LXXC. La séquence signal est clivée de telle façon que la cystéine (C) devient l'extrémité Nterminale de la fHbp mature et est modifiée de façon cotraductionnelle en un résidu tri-Pam-Cys qui sert à ancrer la protéine à la membrane externe neissérienne. La fHbp mature a une longueur de 253 à 266 acides aminés ; la majeure partie de la variation de taille est le résultat de la longueur variable d'un segment flexible ou espaceur, composé de 2 à 15 résidus de glycine et de sérine suivant immédiatement la cystéine N-terminale. Des exemples de séquences de la protéine précurseur et de la fHbp mature sont fournis par SEQ ID NO : 8 et 9 respectivement, d'autres séquences appropriées sont connues dans l'art.

NHBA (antigène neissérien de liaison de l'héparine) Le NHBA a été inclus dans la séquence génomique publiée pour la souche de méningocoque du sérogroupe B MC58 [30] en tant que gène NMB2132 (numéro d'accession GenBank GL7227388 ; SEQ ID NO : 7 ici) . Les séquences du NHBA provenant de nombreuses souches ont été publiées depuis lors. Par exemple, des formes alléliques du NHBA (appelé protéine '287') peuvent être

BE2017/5464 observées sur les figures 5 et 15 de la référence 33, et dans l'exemple 13 et sur la figure 21 de la référence 29 (SEQ ID NO : 3179 à 3184 dans cette référence). De nombreux fragments immunogènes du NHBA ont été également rapportés.

NadA (adhésine A neissérienne)

La 'NadA' (adhésine A neissérienne) du sérogroupe B de N. meningitidis est divulguée comme la protéine '961' dans la référence 29 (SEQ ID NO : 2943 et 2944) et en tant que 'NMB1994' dans la référence 30 (voir également les numéros d'accession GenBank : 11352904 et 7227256). Une description détaillée de la protéine peut se trouver dans la référence 31. Lorsqu'elle est utilisée selon la présente invention, la NadA peut prendre des formes diverses. Les formes préférées de la NadA comprennent une ancre membranaire C-terminale (par exemple, les résidus 351 à 405 pour la souche 2996), puisque l'expression de la NadA sans son domaine d'ancrage membranaire entraîne la sécrétion de la protéine dans le surnageant de la culture. Des séquences particulières de la NadA présentent 50 % d'identité ou plus (par exemple, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % ou plus) avec SEQ ID NO : 6. Ceci comprend des variants de la NadA (par exemple, des variants alléliques, des homologues, des orthologues, des paralogues, des mutants, etc.) Des formes alléliques de la NadA sont présentées sur la figure 9 de la référence 32.

Compositions immunogènes

Les compositions immunogènes peuvent comprendre toute quantité appropriée de vésicules de membrane

BE2017/5464 externe ou GMMA par dose unitaire. Les quantités appropriées de protéine de GMMA peuvent être de 0,1 à 200 pg par dose unitaire. Par dose unitaire, les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre une concentration totale de protéine de GMMA

inférieure à 200 pg/ml	r	inférieure à	100	pg/ml	ou
inférieure, 80	pg/ml	OU	inférieure,	50	pg/ml	ou
inférieure, 25	pg/ml	OU	inférieure,	20	pg/ml	ou
inférieure, 15	pg/ml	ou	inférieure,	10	pg/ml	ou

inférieure. Par dose unitaire, les compositions de 1'invention peuvent comprendre une concentration totale de protéine de GMMA de 5 pg/ml à 200 pg/ml, de 5 pg/ml à 100 pg/ml, de 10 à 100 pg/ml, de 10 pg/ml à 80 pg/ml, de 10 pg/ml à 50 pg/ml, 25 pg/ml à 50 pg/ml. Par dose unitaire, les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre une concentration totale de protéine de GMMA de plus de 100 pg/ml, plus de 80 pg/ml, plus de 50 pg/ml, plus de 25 pg/ml, plus de 20 pg/ml, plus de 15 pg/ml ou plus de 10 pg/ml.

La protéine de GMMA provenant de chaque sérotype différent peut être présente dans une quantité de 0,1 à 200 pg, par exemple, de 0,1 à 80 pg, 0,1 à 100 pg et en particulier de 5 à 25 pg. Les quantités appropriées de GMMA provenant de chaque sérotype différent peuvent comprendre 0,1, 1, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50,

60, 70, 80, 90 et 100 pg par dose unitaire.

En bref, les compositions immunogènes de l'invention peuvent être administrées dans des doses simples ou multiples. Une dose simple des compositions immunogènes de l'invention peut être efficace. En variante, une dose unitaire suivie d'une seconde dose

BE2017/5464 unitaire peut être efficace. Généralement, la deuxième (ou troisième, quatrième, cinquième, etc.) dose unitaire est identique à la première dose unitaire. La seconde dose unitaire peut être administrée à tout moment approprié après la première dose unitaire, en particulier après 1, 2 ou 3 mois. Généralement, les compositions immunogènes de l'invention seront administrées par voie intramusculaire, par exemple, par administration intramusculaire dans la cuisse ou le haut du bras comme il est décrit ci-dessous mais elles peuvent être également administrées par voie intradermique ou intranasale.

Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre un ou plusieurs adjuvants. Les adjuvants particuliers comprennent des adjuvants d'aluminium, par exemple, 1'hydroxyde d'aluminium, l'Alhydrogel, le phosphate d'aluminium, le sulfate de potassium et d'aluminium et l'alun. L'utilisation d'adjuvants d'aluminium est avantageuse puisque

1'adsorption des GMMA sur l'adjuvant réduit la réponse pyrogène permettant, chez des lapins, d'administrer des doses 100 fois supérieures de GMMA comparativement aux GMMA seuls. L'utilisation d'autres adjuvants qui réduisent également la réponse pyrogène est également envisagée et pourra être identifiée par l'homme du métier en utilisant les tests illustrés ci-dessous.

Procédés pharmaceutiques et utilisations

Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre en outre un support pharmaceutiquement acceptable. Les « supports pharmaceutiquement acceptables » types comprennent tout

BE2017/5464 support qui n'induit pas lui-même la production d'anticorps nocifs pour l'individu recevant la composition. Les supports appropriés sont généralement des grosses macromolécules métabolisées lentement telles que des protéines, des polysaccharides, des polyacides lactiques, des polyacides glycoliques, des acides aminés polymères, des copolymères d'acides aminés, le saccharose, le tréhalose, le lactose et des agrégats lipidiques (tels que des gouttelettes d'huile ou des liposomes) . De tels supports sont bien connus d'une personne ayant des compétences moyennes dans le domaine. Les compositions immunogènes de l'invention peuvent également contenir des diluants, tels que l'eau, le sérum physiologique, le glycérol, etc. En outre, des substances auxiliaires, telles que des agents de mouillage ou d'émulsification, des substances tampons du pH, et analogues peuvent être présentes. Le sérum physiologique tamponné par Tris, apyrogène stérile est un support préféré, particulièrement lorsqu'il est utilisé des adjuvants d'aluminium puisque le phosphate dans la solution tampon phosphate peut interférer avec la liaison des GMMA à l'aluminium.

Les compositions peuvent être préparées sous la forme d'injectables, sous la forme soit de solutions liquides soit de suspensions. Des formes solides appropriées pour une solution dans, ou une suspension dans, des véhicules liquides avant l'injection peuvent être également préparées (par exemple, une composition lyophilisée ou une composition cryodesséchée par pulvérisation). La composition peut être préparée pour une administration topique, par exemple, sous la forme

BE2017/5464 d'une pommade, d'une crème ou d'une poudre. La composition peut être préparée pour une administration orale, par exemple, sous la forme d'un comprimé ou d'une capsule, sous la forme d'une pulvérisation, ou sous la forme d'un sirop (éventuellement aromatisé). La composition peut être préparée pour une administration pulmonaire, par exemple, sous la forme d'un inhalateur, en utilisant une poudre fine ou une pulvérisation. La composition peut être préparée sous la forme d'un suppositoire ou d'un ovule. La composition peut être préparée pour une administration nasale, auriculaire ou oculaire, par exemple, sous la forme de gouttes. La composition peut être sous forme de kit, conçu de telle façon qu'une composition combinée est reconstituée juste avant l'administration à un mammifère. De tels kits peuvent comprendre un ou plusieurs antigènes sous forme liquide et un ou plusieurs antigènes lyophilisés. Les compositions peuvent se présenter dans des flacons, ou elles peuvent se présenter dans des seringues préremplies. Les seringues peuvent être fournies avec ou sans aiguille. Une seringue comprendra une dose unique de la composition, tandis qu'un flacon peut comprendre une dose unique ou des doses multiples.

Les compositions aqueuses de l'invention sont également appropriées pour la reconstitution d'autres vaccins à partir d'une forme lyophilisée. Lorsqu'une composition de l'invention doit être utilisée pour une telle reconstitution extemporanée, l'invention fournit un kit, qui peut comprendre deux flacons, ou peut comprendre une seringue préremplie et un flacon, avec

BE2017/5464 le contenu de la seringue étant utilisé pour réactiver le contenu du flacon avant l'injection.

Les compositions de l'invention peuvent être conditionnées sous forme de dose unitaire ou sous forme de doses multiples. Pour les formes de doses multiples, les flacons sont préférés aux seringues préremplies. Les volumes des dosages efficaces peuvent être établis en routine, mais une dose humaine type de la composition a un volume de 0,5 ml, par exemple, pour une injection intramusculaire.

Le pH de la composition est de préférence situé entre 6 et 8, de préférence environ 7. Un pH stable peut être maintenu par l'utilisation d'un tampon. Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre un tampon Tris [Tris(hydroxyméthyl)aminométhane]. Le tampon Tris peut comprendre environ 1 à 20 mM [de Tris(hydroxyméthyl)aminométhane], par exemple, 1,25 mM, 2,5 mM, 5,0 mM ou 10,0 mM. La composition sera stérile. Les compositions de l'invention peuvent être isotoniques par rapport aux êtres humains.

Ainsi, les compositions de l'invention peuvent être utiles en tant que vaccins. Les vaccins selon l'invention peuvent être soit prophylactiques (c'est-àdire, pour prévenir une infection) soit thérapeutiques (c'est-à-dire, pour traiter une infection), mais ils seront généralement prophylactiques. Le terme « protégé contre une infection » signifie que le système immunitaire d'un sujet a été sensibilisé (par exemple, par vaccination) pour déclencher une réponse immunitaire et repousser l'infection. Il sera évident pour l'homme du métier qu'un sujet vacciné peut ainsi

BE2017/5464 par exemple, combinaisons .

du nombre, se retrouver infecté mais est plus à même de repousser l'infection qu'un sujet témoin. Le terme « traitement » comprend à la fois un traitement thérapeutique et un traitement prophylactique ou préventif, dans lequel l'objet est de prévenir ou d'amoindrir une infection. Par exemple, un traitement peut comprendre l'action visant à toucher directement ou à guérir, supprimer, inhiber, prévenir, réduire la gravité de, retarder l'installation de, réduire les symptômes associés à, une infection, ou l'une de leurs La « prévention » peut se rapporter, entre autres, au retard de l'installation des symptômes, à la prévention d'une rechute en une maladie, et analogues. Le traitement peut également comprendre la « suppression » ou 1'« inhibition » d'une infection ou d'une maladie, par exemple la réduction de la gravité, de 1 ' incidence ou de la latence des symptômes, l'amélioration des symptômes, la réduction des symptômes secondaires, la réduction des infections secondaires, la prolongation de la survie du patient, ou leurs combinaisons. Les compositions immunogènes utilisées en tant que vaccins comprennent une quantité immunologiquement efficace d'antigène(s), ainsi que tout autre composant, selon les besoins. Par « quantité immunologiquement efficace », il est signifié que l'administration de cette quantité à un individu, soit sous la forme d'une dose unique soit faisant partie d'une série, est efficace pour le traitement ou la prévention. Cette quantité varie selon l'état de santé et la condition physique de l'individu à traiter, l'âge, le groupe taxonomique de 1'individu à traiter (par

BE2017/5464 exemple, primate non humain, primate, etc.), la capacité du système immunitaire de 1'individu à synthétiser des anticorps, le degré de protection souhaité, la formulation du vaccin, l'estimation par le médecin traitant de la situation médicale, et d'autres facteurs pertinents. On s'attend à ce que la quantité se situe dans une plage relativement large qui peut être déterminée par l'intermédiaire d'essais de routine.

Les compositions de l'invention peuvent comprendre un antimicrobien, particulièrement lorsqu'elles sont conditionnées sous un format de doses multiples. Les compositions de l'invention peuvent comprendre des sels de sodium (par exemple, le chlorure de sodium) pour donner la tonicité. Une concentration de 10 ± 2 mg/ml de NaCl est typique. Dans certains modes de réalisation, une concentration de 4 à 10 mg/ml de NaCl peut être utilisée, par exemple, 9,0, 7,0, 6,75 ou 4,5 mg/ml. Les compositions de l'invention comprendront généralement un tampon.

Procédés de traitement

L'invention fournit également un procédé pour soulever une réponse immunitaire chez un mammifère approprié, comprenant l'administration d'une composition pharmaceutique de l'invention au mammifère approprié. La réponse immunitaire est de préférence protectrice et de préférence implique des anticorps. Le procédé peut soulever une réponse de rappel.

Le mammifère approprié peut être un animal tel qu'une vache, un cheval, un chien, un chat et analogues mais il est de préférence un être humain. Lorsque le vaccin est destiné à une utilisation prophylactique,

BE2017/5464 l'être humain peut être un enfant (par exemple, un jeune enfant ou un nourrisson) ou un adolescent ; lorsque le vaccin est destiné à une utilisation thérapeutique, l'être humain peut être un adulte. Un vaccin prévu pour les enfants peut être également administré à des adultes, par exemple, pour estimer l'innocuité, le dosage, immunogénicité, etc. Une classe préférée d'êtres humains pour le traitement consiste en des femmes en âge de procréer (par exemple, des adolescentes et d'un âge supérieur). Une autre classe préférée consiste en des femmes enceintes.

L'invention fournit également une composition de l'invention pour une utilisation en tant que médicament. Le médicament est de préférence capable de soulever une réponse immunitaire chez un mammifère (c'est-à-dire qu'il s'agit d'une composition immunogène) et est de façon davantage préférée un vaccin. L'invention fournit également l'utilisation d'une composition de l'invention dans la fabrication d'un médicament pour soulever une réponse immunitaire chez un mammifère. Ces utilisations et procédés sont de préférence pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie et en particulier, la réponse immunitaire est une réponse immunitaire protectrice.

Les compositions de l'invention seront généralement administrées directement à un patient. L'administration directe peut s'accomplir par une injection parentérale (par exemple, par voie souscutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu), ou par administration rectale, orale, vaginale

BE2017/5464 réalisée aiguille topique, transdermique, intranasale, oculaire, auriculaire, pulmonaire ou autre mucosale. L'administration intramusculaire dans la cuisse ou le haut du bras est préférée. L'injection peut être à l'aide d'une aiguille (par exemple, une hypodermique), mais une injection sans aiguille peut être utilisée en variante. Une dose intramusculaire type est de 0,5 ml. L'invention peut être utilisée pour déclencher une immunité systémique et/ou mucosale. Le traitement posologique peut être un calendrier de dose unique ou un calendrier de doses multiples. Les doses multiples peuvent être utilisées dans un calendrier d'immunisation primaire et/ou dans un calendrier d'immunisation de rappel. Un calendrier de dose primaire peut être suivi d'un calendrier de dose de rappel. Le temps approprié entre les doses de sensibilisation (par exemple, entre 4 et 16 semaines), et entre la sensibilisation et le rappel, peut être déterminé en routine.

Généralités

Le terme « comprenant » englobe « incluant » ainsi que « constitué de », par exemple, une composition « comprenant » X peut être constituée exclusivement de X ou elle peut inclure quelque chose de supplémentaire, par exemple, X + Y.

Le terme « sensiblement » n'exclut pas « complètement », par exemple, une composition qui est « sensiblement dépourvue » de Y peut être complètement dépourvue de Y. Lorsque c'est nécessaire, le terme « sensiblement » peut être omis de la définition de

1'invention.

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Sauf indication spécifique, un procédé comprenant une étape de mélange de deux composants ou plus ne requiert aucun ordre spécifique de mélange. Ainsi, les composants peuvent être mélangés dans n'importe quel ordre. Lorsqu'il y a trois composants alors deux composants peuvent être combinés l'un avec l'autre, et ensuite la combinaison peut être combinée avec le troisième composant, etc.

Sauf indication contraire, l'identité entre des séquences polypeptidiques est déterminée de préférence par l'algorithme de recherche d'homologie de SmithWaterman tel que mis en œuvre dans le programme MPSRCH (Oxford Molecular), en utilisant une recherche affine de brèche avec les paramètres pénalité d'ouverture de brèche = 12 et pénalité d'extension de brèche = 1.

La pratique de la présente invention emploiera, sauf indication contraire, des procédés traditionnels de chimie, de biochimie, de biologie moléculaire, d'immunologie et de pharmacologie, au sein des compétences de l'art. De telles techniques sont pleinement expliquées dans la littérature.

Dans certaines mises en œuvre, le terme « comprenant » se rapporte à l'inclusion de l'agent actif indiqué, tel que des polypeptides cités, ainsi qu'à l'inclusion d'autres agents actifs, et de supports, excipients, émollients, stabilisants, etc., pharmaceutiquement acceptables tels que connus dans l'industrie pharmaceutique. Dans certaines mises en œuvre, le terme « constituée essentiellement de » se rapporte à une composition, dont le seul principe actif est le ou les principes actifs indiqués, toutefois, il

BE2017/5464 peut être inclus d'autres composés qui sont destinés à la stabilisation, la conservation, etc. de la formulation, mais qui ne sont pas impliqués directement dans l'effet thérapeutique du principe actif indiqué. L'utilisation de la phase de transition « constitué essentiellement » signifie que l'étendue d'une revendication doit être interprétée comme englobant les matériaux ou les étapes spécifiés cités dans la revendication, et ceux qui n'affectent pas matériellement la ou les caractéristiques basiques et nouvelles de l'invention revendiquée. Voir, In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976) (en italiques dans l'original) ; voir également MPEP § 2111.03. Ainsi, le terme « constitué essentiellement de » lorsqu'il est utilisé dans une revendication de cette invention n'est pas censé être interprété comme étant équivalent à « comprenant ». Le terme « constitué de » et ses variations comprennent incluant et limité à sauf s'il est expressément spécifié autrement. Le terme « environ » en relation avec une valeur numérique x signifie, par exemple, x + 10 %, x + 5 %, x + 4 %, x + 3%, x + 2%, x + 1%.

Modes de réalisation de l'invention

Exemple A

La membrane externe (OM) des bactéries Gram négatif est une bicouche lipidique asymétrique parsemée de protéines intégrales de 1 ' OM et de lipoprotéines périphériques qui sont souvent immunogènes et peuvent être exploitées en tant qu'antigènes vaccinaux. Les

BE2017/5464 lipoprotéines (LP) sont des protéines caractérisées par la présence d'une cystéine lipidée qui permet l'ancrage de cette molécule à la membrane (Kovacs-Simon, A., R.W. Titball, and S.L. Michell, Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun, 2011. 79(2): p. 548-61).

Deux des principaux antigènes du vaccin à composants multiples Bexsero® dirigé contre le méningocoque du groupe B sont des lipoprotéines, à savoir l'antigène neissérien de liaison de l'héparine (NHBA) et la protéine de liaison du facteur H (fHbp). Dans Neisseria meningitidis, ainsi que dans d'autres bactéries Gram négatif, les lipoprotéines destinées à 1 ' OM sont synthétisées sous la forme d'un précurseur dans le cytosol et soumises à une translocation à travers la membrane interne (IM) par la machinerie Sec et ensuite vers la membrane externe (OM) par le système Loi. Le système Loi les transporte à travers le périplasme et sécurise les protéines à 1 ' OM par incorporation de la fraction diacylglycérol dans le feuillet interne de 1 ' OM (Bos, M.P., V. Robert, and J. Tommassen, Biogenesis of the gram-negative bacterial outer membrane. Annu Rev Microbiol, 2007. 61: p. 191214) .

Le composant spécifique de la translocation, SLAM1 (flippases 1 modulatrices de l'assemblage des lipoprotéines à la surface), impliqué dans l'exposition à la surface des lipoprotéines spécifiques de N. meningitidis, a été récemment identifié comme étant suffisant pour reconstituer le transport de certaines lipoprotéines méningococciques vers la surface d'E. coli (fHbp, TbpB et LpbB) (Yogesh Hooda, C.C.-L.L

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Andrew Judd, Carolyn M. Buckwalter, Hyejin Esther Shin, Scott D. Gray-Owen and Trevor F. Moraes, Slam is an outer membrane protein that is required for the surface display of lipidated virulence factors in Neisseria. Nature microbiology, 2016. 1).

SLAM1 est codé par le gène nmb0313 et il s'agit d'une protéine de la membrane externe caractérisée par la présence d'un domaine N-terminal avec un domaine de répétition tétratricopeptide (TPR) et d'un domaine transmembranaire C-terminal structuré comme un domaine de type porine (figure 1 (A)) .

Afin de mieux caractériser la fonctionnalité de cette protéine, le gène nmb0313 a été délété dans différentes souches représentatives de N. meningitidis du groupe B, MC58, NGH38 et NZ 98/254 (figure 1(B)). L'inactivation (knock-out) a été obtenue en remplaçant le gène nmb0313 par une cassette de résistance à un antibiotique comme suit, résultats confirmés par une analyse Western blot (figure 2).

Souches bactériennes et conditions de culture

Les souches de Neisseria meningitidis (Nm) du sérogroupe B (MC58, NHGH38, NZ 98/254 et ses dérivés isogènes) et les souches d'Escherichia coli (Ec) (DH5a et BL21-DE3) utilisées dans cette étude sont énumérées dans le tableau 1 ci-dessous :

Nom

Description

Cassette de résistance à un antibiotique

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Nom	Description	Cassette de résistance à un antibiotique
MC5 8	Souches de référence adaptée au laboratoire de Neisseria meningitidis
NGH38	Neisseria meningitidis
NZ 98/254	Neisseria meningitidis
MC5 8 Δ0313	Dérivé de Neisseria meningitidis MC58, insertion de kanamycine dans le locus de nmb 0 313	kanamycine
NGH38 Δ0313	Dérivé de Neisseria meningitidis NGH38, insertion de kanamycine dans le locus de nmb0313	kanamycine
ΝΖΔ0313	Dérivé de Neisseria meningitidis NZ 98/254, insertion de kanamycine dans le locus de nmb0313	kanamycine

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Nom	Description	Cassette de résistance à un antibiotique
MC58A0313	Dérivé de Neisseria	Chloramphénicol
CÏ0313	meningitidis MC58, auquel il manque le gène nmb0313 avec une copie de nmb0313 réintroduite en dehors du locus sous le contrôle d'un promoteur PTAC inductible par 1'IPTG
NGH38	Dérivé de Neisseria	Chloramphénicol
Δ0313	meningitidis NGH38, auquel
CÏ0313	il manque le gène nmb0313 avec une copie de nmb0313 réintroduite en dehors du locus sous le contrôle d'un promoteur PTAC inductible par 1'IPTG
DH5a	E. coli : fhuA2 lac (del) U169 phoA glnV44 Φ80' lacZ (del)MIS gyrA96 recAl relAl endAl thi-1 hsdR17
BL21 (DE3)	E. coli :
BL21	E. coli : BL21 (DE3) auquel
(DE3) ATolR	il manque le gène b0738

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Les souches de N. meningitidis ont été cultivées sur des plaques de gélose de milieu de base pour les gonocoques (GC) (Difco) ou dans du bouillon GC à 37 °C dans 5 % de CO2. Les souches d'E. coli ont été cultivées dans de la gélose LB ou du bouillon LB à 37 °C.

Des antibiotiques ont été ajoutés lorsque c'était nécessaire. De la kanamycine et du chloramphénicol ont été ajoutés à des concentrations finales de 150 pg/ml et 5 pg/ml pour la sélection des mutants par délétion et des souches de complémentation de N. meningitidis, respectivement. De l'ampicilline, de la kanamycine, ou

du chloramphénicol a été	ajouté à	des	concentrations
finales de 100, 150 ou	10 pg/ml	pour	la sélection
d'EL coli.
Lorsque cela a été nécessaire,	de 1’	'isopropyl-ß-D-
1-thiogalactopyranoside	(IPTG) (1	mM)	(Sigma) a été
ajouté aux milieux de	culture	aux	concentrations
finales indiquées.

Construction de souches mutantes et de complémentation

Les manipulations d'ADN ont été réalisées en utilisant des procédés classiques de laboratoire (Sambrook J, F.E., Maniatis T, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 2nde éd.)

Pour construire le mutant par délétion de NMB0313, le gène nmb0313 a été remplacé par une cassette de kanamycine par double enjambement. Pour réaliser ceci, le plasmide pGEMTUD313Kan a été produit comme suit. Les

BE2017/5464 régions flanquantes en amont et en aval de nmb0313 ont été amplifiées à partir du chromosome de MC58 avec des sites d'enzymes de restriction et clonées dans le plasmide pGEMT. La cassette de la kanamycine a été clonée sous la forme d'un fragment Xbal de 1,4 kb dans le site Xbal entre les deux régions flanquantes. Ce plasmide a été utilisé pour transformer des souches de N. meningitidis.

La complémentation de nmb0313 a été obtenue par l'insertion d'une copie du nmb0313 dans la région non codante entre les ORF convergents NMB1428 et NMB1429 du chromosome des souches Δ0313. Pour réaliser ceci, le plasmide pComPIndNMB0313 a été produit en amplifiant le gène nmb0313 et cloné sous la forme d'un fragment Asel/Nsil sous le contrôle du promoteur inductible Tac et du répresseur Lacl dans le plasmide pComPInd (leva, R., etah, CrgA is an inducible LysR-type regulator of Neisseria meningitidis, acting both as a repressor and as an activator of gene transcription. J Bacterid, 2005. 187(10): p. 3421-30). Les amorces et les plasmides sont énumérés dans les tableaux 2 et 3 cidessous :

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Tableau 2

Nom	Description	Cassette de résistance à un antibiotique	Référence
pCOLA DUET	Le vecteur code pour deux sites de clonage multiple avec le promoteur T7, le réplicon COLA à partir de ColA, le répresseur lacl et KanR	Kanamycine	Novagen
pGEM-T	Vecteur de clonage d'E. coli, AmpR	Ampicilline	Promega
pComPIND CmR	Plasmide pour le remplacement allélique au niveau d'un emplacement chromosomique entre les ORF NMB1428 et NMB1429 et expression inductible sous le contrôle du promoteur PTAC et du répresseur lacl. En amont du site de clonage, il y a une cassette de résistance au Cm	Ampicilline, Chloramphénicol	leva, R., et al. J Bacterid, 2005.
pUD0313Kan	pGEM-T contenant la région flanquante de nmb0313 avec la cassette de résistance à Kan cloné en tant que fragment Xmal entre les régions flanquantes	Ampicilline, Kanamycine	Cette étude

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Nom	Description	Cassette de résistance à un antibiotique	Référence
pIND ΝΗΒΑ- f Hbp ( fusion pIND N-f)	Plasmide pour la complémentation de la protéine de fusion NHBA-fHbp avec l'extrémité N-terminale du NHBA et le domaine C-terminal dans la région Corn avec un promoteur Tac inductible par l'IPTG.	Ampicilline, Chloramphénicol	Cette étude
pIND0313	Plasmide pour la complémentation de nmb0313 dans la région Corn avec un promoteur tac inductible par l'IPTG. En aval de nmb0313, est clonée une cassette de résistance au Cm.	Ampicilline, Chloramphénicol	Cette étude
pCOLA_0313	Construction pour exprimer la protéine recombinante NMB0313 de N. meningitidis dans E. coli	Kanamycine	Cette étude
pIND NHBA	Construction pour exprimer la protéine p3 du variant du NHBA de N. meningitidis MC58 dans E. coli	Ampicilline, Chloramphénicol	Cette étude

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Nom	Description	Cassette de résistance à un antibiotique	Référence
pIND fHbp	Construction pour	Ampicilline,	Cette
	exprimer la protéine vl.1 du variant de la fHbp de N. meningitidis MC58 dans E. coli	Chloramphénicol	étude
	Construction GeneArt avec un domaine N- terminal du NHBA fusionné au domaine C- terminal de la fHbp	Ampicilline	Cette étude

Tableau 3

Nom de 1'amorce	Application	Séquence
0313UP_F	Fragment pour la production de 0313 KO dans MenB	GAGATCTAGAGCCGGCATTCGGG CAAAAACC
0313UP_R	Amorce de fusion en amont et en aval du flanc de NMB0313 avec un site de restriction Xmal	AACAGCAACCCGGGTATCAATCG GCGGAT
NMB0313 FW DO	Amorce de fusion en amont et en aval du flanc de NMB0313 avec un site de restriction Xmal	CCGATTGATACCCGGGTTGCTGT TCCTTTTCG
0313pC_F	Clonage du gène NMB0313 dans le plasmide pCOM pour la complémentation dans MENB NM0313KO	GTGTATTAATATGGTTATTTTTTA TTTTTGTG

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0313pC_R	Clonage de NMB0313 dans le plasmide pCOM pour la complémentation dans MENES NM0313KO	GTGTATGCATTCAGAACGTTTTA TTAAACTC
0313pD F2	Clonage du gène NMES0313 dans MCS2 de pCOLA	GTGTATTAATATGGTTATTTTTTA TTTTTGTG
0313pD R2	Clonage du gène NMES0313 dans MCS2 de pCOLA	GTGTCTCGAGTCAGAACGTTTTA TTAAACTC

La séquence nucléotidique correcte de chaque plasmide a été confirmée par séquençage d'ADN. Les plasmides ont été linéarisés et utilisés pour la transformation des souches de N. meningitidis. Tous les transformants ont été vérifiés à la fois par une analyse par PCR et Western blot comme suit :

Analyse Western blot

Des souches	cultivées pendant	une nuit	sur	des
plaques de gélose	ont	été remises en	suspension	dans	du
bouillon GC	jusqu'à	une DOsoo de	0,5. 1	ml	de	la
resuspension	a	été	centrifugé	pendant	5	min	à
13 000 tr/min	et	le	culot a été remis en	suspension

dans 50 μΐ de tampon de chargement SDS (50 mM de TrisHC1 [pH 6,8], 2,5 % de SDS, 0,1 % de bleu de bromophénol, 10 % de glycérol, 5 % de 3-mercaptoéthanol, 50 mM de DTT) (Oriente, F., V. Scarlato, and I. Delany, Expression of factor H binding protein of meningococcus responds to oxygen limitation through a dedicated FNRregulated promoter. J Bacteriol, 2010. 192(3): p. 691701) .

Les cultures liquides ont été cultivées jusqu'à ce qu'une DO600 de 0,50 ait été atteinte et 1 ml de la

BE2017/5464 culture a été agrégé et remis en suspension dans 50 μΐ de tampon de chargement SDS. Les extraits protéiques ont été séparés par SDS-PAGE sur des gels NuPAGE® Novex® 4-12 % Bis-Tris Protein Gels dans du MES IX (Life Technologies) et ensuite transférés sur des membranes de nitrocellulose. Les membranes ont été bloquées pendant une nuit à 4 °C avec du PBS + 0,05 % de Tween 20 (Sigma) et 10 % de lait en poudre (Sigma). L'anticorps primaire a été dilué (tableau 4) dans du

PBS + 0,05 % de Tween 20 et 3 % de lait en poudre et incubé pendant lh avec la membrane.

Tableau des anticorps	Dilution WB	Dilution FACS
Sérum α-fHbp	polyclonal	de	souris	1/5000	1/1000
Sérum	polyclonal	de	souris	1/2000	1/1000
a-NHBA
Sérum	monoclonal	de	souris		1/1000
a-NHBA
a-souris-FITC		1/1000
a-souris-HRP	1/1000

Un anticorps anti-IgG de souris conjugué à de la 15 peroxydase de raifort (HRP) et le réactif Western Lightning ECL (Perkin Elmer) ont été utilisés selon les

BE2017/5464 instructions du fabricant pour la détection. Les résultats sont présentés sur la figure 2.

Après la production du nmbO313YJd, les mutants ont été analysés par la présence sur la surface de lipoprotéines exposées à la surface connues comme le NHBA et la fHbp :

Analyse par tri des cellules activées par fluorescence (FACS) de l'expression de fHbp/NHBA

Des souches de N. meningitidis et des dérivés isogènes, ont été recueillies après des cultures liquides à DCPoo 0,5, lorsque cela a été nécessaire, de l'IPTG a été également ajouté. Les bactéries ont été inactivées par incubation avec du formaldéhyde à 0,5 % pendant 1 heure à température ambiante. Le marquage a été effectué avec l'anticorps primaire dilué dans du de BSA (Sigma) tel que rapporté dans le La liaison de l'anticorps primaire a été en utilisant un anticorps anti-souris (molécule entière) conjugué à du FITC (Sigma) à la dilution correcte (figure 3).

La délétion de nmb0313 touche l'exposition à la surface des lipoprotéines analysées dans les souches méningococciques choisies. En particulier, l'absence de NMB0313 entraîne un manque de taux détectables du NHBA sur la surface cellulaire avec l'accumulation simultanée du NHBA au sein des bactéries. Au contraire, des taux diminués de la fHbp ont été détectés sur la surface cellulaire et ces taux bas ont été une

PBS-0,5 % tableau 4 détectée conséquence d'une réduction générale de la quantité de fHbp dans le contexte de nmb0313 KO comparativement au type sauvage. Par conséquent, NMB0313 joue un rôle

BE2017/5464 essentiel dans la translocation du NHBA à la surface de la bactérie mais sa délétion de touche pas l'expression du NHBA en soi. Toutefois, NMB0313 contribue à l'expression stable de la fHbp et par conséquent à son expression à la surface.

Ensuite, le phénotype a été restauré dans la souche NGH38 nmb0313 KO par complémentation génomique d'une copie fonctionnelle du gène nmb0313 sous le contrôle du promoteur Tac inductible par l'IPTG (figure 4A). La souche complémentée est capable d'exprimer NMB0313 d'une façon dépendante de l'IPTG comme il est démontré par l'analyse Western blot et les concentrations les plus élevées d'IPTG induisent une surexpression de la protéine NMB0313 par rapport aux taux de type sauvage (figure 4B).

La souche complémentée a été ensuite analysée pour l'exposition à la surface du NHBA et de la fHbp (figure 5). L'expression à la surface du NHBA et de la fHbp a été restaurée dans la souche complémentée par nmb0313. De façon intéressante, l'augmentation des taux d'expression de NMB0313 a entraîné une augmentation simultanée de l'expression à la surface à la fois du NHBA et de la fHbp comme il est observé par les analyses FACS et de façon surprenante, la surexpression de NMB0313, à une concentration de 0,1 et 1 mM d'IPTG, a entraîné des taux supérieurs à la surface du NHBA et de la fHbp par rapport à la souche de type sauvage. D'après l'analyse Western blot, ceci semble être dû à des taux d'expression accrus de ces lipoprotéines dans la souche surexprimant NMB0313.

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Coexpression de la flippase avec des lipoprotéines dans un système hétérologue

Les lipoprotéines fHbp et NHBA issues de N. meningitidis MC58 ont été clonées sous le contrôle d'un promoteur inductible par l'IPTG et exprimées dans une souche non pathogène d'Escherichia coli seules ou avec coexpression de NMB0313. La souche d'E. coli BL21 (DE3) a été cotransformée avec deux plasmides comparables différents portant la fHbp ou le NHBA et nmb0313, respectivement ou en tant que témoin négatif un plasmide portant la fHBP ou le NHBA et le plasmide vide pCOLA. Les taux d'expression des deux protéines ont répondu à l'induction par l'IPTG et l'expression des deux protéines a été confirmée par une analyse WB (figure 6).

En présence de NMB0313, la quantité de fHbp dans les extraits totaux a fortement augmenté comparativement à la souche exprimant la fHbp seule. Ce taux accru de fHbp a été reflété par une fHbp détectable supérieure sur la surface d'E. coli.

L'expression de la fHbp seule est détectable à la fois dans l'analyse Western Blot et par FACS sur la surface d'E. coli uniquement aux concentrations de 0,01 et 0,1 mM d'IPTG, toutefois, lors de la coexpression simultanée de NMB0313, l'expression est également détectable à des concentrations de 0,001 mM d'IPTG et aux taux supérieurs d'IPTG, la coexpression de NMB0313 entraîne significativement plus d'expression de fHBP globale et sur la surface d'E. coli. Ces résultats indiquent que NMB0313 a un effet positif sur

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1'analyse détectable l'expression stable et l'expression à la surface de la fHBP dans E. coli.

Les résultats préliminaires de l'expression du NHBA dans des souches d'E. coli mettent en évidence l'expression stable du NHBA dans les échantillons à la fois en présence ou en l'absence de NMB0313, alors que FACS révèle qu'il n'y a pas de NHBA sur la surface cellulaire d'E. coli.

Toutefois, lorsque le NHBA est exprimé avec NMB0313, les bactéries montrent également le NHBA sur la surface, confirmant le rôle clé de NMB0313 dans la translocation du NHBA à travers la surface.

Production d'OMV à partir de souches exprimant des flippases

La souche NGH38 complémentée décrite ci-dessus, est utilisée pour produire des vésicules de membrane externe. En bref, pour abolir la production de la capsule, un fragment du chromosome bactérien contenant synX, ctrA et le promoteur contrôlant leur expression, est remplacé par un gène de résistance à la spectinomycine. En premier, les sites de recombinaison sont amplifiés à partir de l'ADN génomique avec les amorces suivantes :

ctrAf_Xma : CCCCCCGGGCAGGAAAGCGCTGCATAG ;

[SEQ ID NO : 10] ctrAr_Xba : CGTCTAGAGGTTCAACGGCAAATGTGC ;

[SEQ ID NO : 11]

Synf_Kpn : CGGGGTACCCGTGGAATGTTTCTGCTCAA ;

[SEQ ID NO : 12]

Synr_Spe : GGACTAGTCCATTAGGCCTAAATGCCTG ;

[SEQ ID NO : 13]

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Les fragments sont pComPtac (leva et al., insérés dans J Bacteriol, pp. 3421-3430) en amont et le plasmide 187 (2005), du gène de le gène de en aval Ensuite, résistance au chloramphénicol résistance au chloramphénicol est remplacé par une cassette de résistance à la spectinomycine. Le gène IpxLl est délété par remplacement par un gène de résistance à la kanamycine (Koeberling étal., J Infect Dis, 198 (2008), pp. 262-270) et le gène gna33 par une cassette de résistance à l'érythromycine (Adu-Bobie et al., Infect Immun, 72 (2004), pp. 1914-1919).

Préparation des GMMA

Les bactéries sont cultivées à 37 °C, 5 % de CO2 dans 50 ml d'un milieu défini pour les méningocoques à 180 tr/min jusqu'à la phase stationnaire précoce. Les cellules ont été récoltées (2200 g, 30 min, 4 °C) et le surnageant de la culture contenant les GMMA est filtré à travers une membrane d'une taille de pore de 0,22 pm (Millipore, Billerica, MA, Etats-Unis)

Pour recueillir ultracentrifugé les

GMMA, le surnageant est (142 000 x g, 2h, 4 °C) . Le culot membranaire est lavé avec de la solution tampon phosphate (PBS) , remis en suspension dans du PBS et stérilisé par filtration. La concentration des GMMA est mesurée selon la teneur en protéines par le test de Lowry (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Etats-Unis) . Pour l'analyse des protéines et du lipooligosaccharide, les GMMA sont séparés par SDSPAGE en utilisant un gel à 12 % et du tampon MOPS ou MES (Invitrogen, Carlsbad, CA, Etats-Unis). Les protéines totales sont colorées avec une coloration au bleu de Coomassie. La fHbp est détectée par Western

BE2017/5464 blot en utilisant un anticorps polyclonal tel que décrit ci-dessus.

Immunisation des souris

Des souris CD-I femelles sont obtenues chez Charles River Laboratories (Wilmington, MA, Etats-Unis), Huit souris par groupe sont immunisées par voie intrapéritonéale trois fois avec des intervalles de 2 semaines. Des échantillons de sérum sont obtenus 2 semaines après la troisième dose. Les OMV provenant de la souche surexprimant la flippase sont données à des doses de 0,2, 1 et 5 pg en se basant sur les protéines totales. Les souris témoins sont immunisées avec uniquement 5 pg d'hydroxyde d'aluminium. Tous les vaccins sont adsorbés sur 3 mg/ml d'hydroxyde d'aluminium dans une formulation de 100 pl contenant 10 mM d'histidine et 0,9 mg/ml de NaCl. Les sérums sont stockés à -80 °C jusqu'à utilisation. Tous les travaux sur les animaux ont été approuvés par 1'Italian Animal Ethics Committee.

Analyse sérologique

Les titres en anticorps IgG anti-fHbp sont mesurés par un test ELISA tel que décrit dans Beernink et al. (Clin Vaccine Immunol, 17 (2010), pp. 1074-1078).

Alors que certains modes de réalisation de la été il l'invention soit limitée à de tels modes de réalisation, Diverses modifications peuvent y être apportées sans s'écarter de l'étendue et de l'esprit de la présente invention telle que présentée dans les revendications présente invention ont spécifiquement ci-dessus, décrits et illustrés n'est pas prévu que suivantes

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Séquences

SEQ ID NO : 1 ; gi177358697 : 323429-324895 Neisseria meningitidis MC58

ATœTTATmTTATTFFÎGTGGGAÂOACATTTATG€CT€<ACCA.4ACAOATGGATG€rG

CTGG'TGG<'TTTATTGGGAAGC'GC'OGCATATGC'€CiAAGAAA<'A<'CGGGCGAÄf.CGGATTT

GAGAAGCCGT€CC'GAGTTCAG<KTTCATOAACjC6iGÄGGTCAAACCGAK'GAGACKjöAO

AAGG7GCCG<X?X?CAGCTGCGGGAAAAAGGAAAAGTT?ÏGCAGA?ÏGACGG<'GAAACCC

TGC'TGAAAAATCCOGAÂTTGTTGTCX'CœœGATGTATTCGGt'AGTGCiTCTGAAAÎ'AAT

ATKî<7<''G<îIATCÎ.<KGT7ATTTTœC'GATTTAÎ.CTACAAÎ.ACA?A'GC'AGt'A<XïATAA6iÂT

G‘rrGGCAC'rrFArGCACA4GG<LArrrrf7GCOCACK.K'AGÄ<OGrAGGG'rG^GGAGGCG

ArriCCOATrA<X?CKXîAATrGArr<X;'<?(X?œÂA<?CS;'GACGŒKX<'<K'CGTCC'CÏAiœGT 'rïG<X'<7Ai€'.A€A'ArrGTrTGAÂÂA<?A<jGGAGAA<?(5ÂGGC'CAîfG(K'AGA(37AG-n'<'GAC'G

GGÎ.T<îAAGG<'GAiAAAA<?i'T<iÎ.<;'GC'<'<X?AGGTGAHXiAGC'AGGr<'GÂGCTGl'A<'GG('AA

G^ATTGC'GtOAArGCOATGCGTGG.AAGGrAÄATGGCGGCTTCACXOK'ACCCGCGAA rACAATATCAACCAAGCCCCGÄAACGGCAGCAGTACGOCAAATGGACTn'CCCGA.AÄC

ÄGGTGGACGGC'ACGiSCGGTCÄATTACCGGC'TCGGC’GCGGAGAAAAAATGGTCGCTGAA

AjWGCATCAÎTÂCACGACOGCC<XÏCGCKOA€7yrGr<\?œ<'AGCXJTnATCC'GGGGÆAT

AA<sAAAÏÏ<7AA<'<?iÂ'ÏAr<ïA(7Cj<X'A<HX'<yn'TGf.'G<X'(Xjé'A'K/GGïrn'GA'GGAG<'(XiGG < AAAGAÏGCCGGXsCTGGGAGTGTTGC ACGAAC GCCCXACCTACGGC AACGAC GCTTATT

CriACACf AACGéïf G€ Ai/GCC'rrrAn'K'AACf'G'rïGGT'AAAGCC'i'G AAAÏGGO'AAAGG

ÏTG r<?'rïC'GG<?G<jA<jïGG<jiX?5GG'r’n'GAÂGAÂ'rA<?G<'G<'GiXîG<g'X?G'rT<'CGi\GAAÏA<' <?ί:·Α'ΐ1ΊΌ<?ΑΑΑ1ΪΊΌ<ΆΑΪΊ'ί.·<ϊ<7ΚΚΪΓΟ'ΠΤΤΑ<?0<?</ΑΑ·ΚΧ'<Κ'(?Α'<?ΑΑΤΑ'ϊ'ϊ'ίΧϊΑΪ(ΧΧέ

CGGTTTGGATTTTTACCŒ'GAGCGC'AÂCLX'CGCÎOACCGGGGCGAC'AATTÎCAACCGTT

ÂCGG<'CT€<r<TTTGCCTCKiGGGCACA7AATGGC<K'CK?XAGCœACTGTCTTCG<TGTTG

CCAOTCGœCX'CXX ''GAAA<?<XX;'A'rTAl'GAAAAAC'<?L<XX?'n'rn'GA<X?<Xnn'TAAAGG

GCTAAA<O?G<'A<jGGÄTAAAGAATTGAA<'A<:ATCCITGAi:iCf.TTTCX;iCACCÖGGCÄTT<:K?

ATTK\AAAG(X'ÂTCA<'GGCœGCCTGAC'GTTGTGGCACCG<GAAACœœAGTAACGAT

GTGTrCAACGAATACGAGA,AAA.AKOGGCGTTTGKGAOTTTAÄTAA,AACGTrCTGÄ

SEQ ID NO : 2 ; Q9K165 | Y0313_NEIMB protéine NMB0313 contenant des répétitions TPR

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MVffYFXOKIFMRARNSWM{JJ..R1J.ASAAYAEE.TPRFPDLRSRREPRl.HEAEVKPÏDREK.V?

<iQVRFRGS\R..Q1DR;jEÏÏ,E.RNREL.lARAY1YSAVVSNNÏA<?ÎRYR,PÏYÏ,QQAQQDKMEAFYA <X»ÎLAQAlX5RVKEAÎSÎiYR£LIAÀQ?DA?ÂWMRLAAAL^>?RQ'NEAAAI)QPDRLKAENLE

PQLMEQV^YSKAIJŒRDAW^WœFSXniŒïîhTNQAPKRQQYGKWTn^OXTXjïAVNY

RLG?lEKKWSLKNGWYnTA<RFDVSŒY^?GNKKFFO4TAGVSôGRjFADRRKDAGLAVFH

ERRTYGNDAYSYIYGAKiYFNRWQ'FPKVVQ'rLSRAEWCPLKN'ÏRRARSDNTHLQISNSLVF

YRNARQYWMGOLDF¥RERNPADRGDNENRYGLRF?\WöQEWöGSöi.RSLLRLGAAKSHY

ERPGFESGFRGERRRDREENTSLSLUE-iRALHEKGITPRl.TI.SHRE.TRSND\^;TNE'1TKXRAR'

EENRTE

SEQ ID NO : 3 ; tr|Q9JXM5|Q9JXM5_NEIMB protéine non caractérisée

MLYFRYGFL\YW€AAGVSAAYC»ÂDAPAELDDKALLQVQRSVSDKWA£SDXVKVENDAî^t

VVDŒ>FLLAHî^iMLEHSIRDALNGNQADLXASLADLYAKL?DYDAVLYGRARAILAKLAG

RP?YEAVARY/RELHGENAADERILLDLAAAEEDDERER.SÄERKEAEAARIDLPAPVEENY’GR

FRKKIEGLTCG!a<ESCR?dSPA\3<RXANNAÄ?<jYTP.QXGGRQR'SYSPAEPX4.GLNYE1EAEK LI?LADN^YLLH«K1GGTSYYFSSKSA¥DDGFGRAYLGWQYKNARQTAGÎL?EYQV^LSG SJXfFDAKTKRVNNRRLPRY^iLÂîîGVOVQLSFîrYRPNPGWQESVALEFIYRQRYREQDRAS Y^GRQDGFSVSSAKSLGESATVFGGWQFVRFVPKREÎYGGÂVNNAAYSRNGXY'AGWA ^Ε^^Ε€<τΕΑ^\^Α5ΥΑΡ^ΝΎΚΟΙ^ΑΕ5ΤΕΑΡΪΕΥΡΈ\Υ^ί\^!ν5ΕΑΙ.$ΗΕ)ΚΡΑΥήΚ€τΑ^ίΡΑΕΝΥ' RFGRrESNVPYARRRNSFYPVSADWRE

SEQ ID NO : 4 ; tr|A0A0Y0BKC0|A0A0Y0BKC0_STREE protéine NMB0313 contenant des répétitions TPR ; Streptococcus pneumoniae fASÏQÏKFHJTSSSLPLTPYSVAYERSPQPlîDôRLDEQLFSukRPNLPQKRÏiXLLl/NYNPSRILSI

TS£ELW«^J»LilRGLIPAVLQNHÖEAYQLLL?LYQH.PKKD?FLLEWAEAIDLREKGHF^-SDS

VKAVRHLF^QKTOLLPLRYQLAQALELNWNEÄAKIXJFQKLRAEQVSPDSYEHEQYLSAL

YQEJ>QWKKj<XïPSFLNESNINNAPKAGTER?ïNW?A\VEKFSARGPSYFGN.AEKi<WSFRHNH

FTRlALEGSGSYAAVDNK:RYNrEFNARAGAGFGYQTARFEW.MRPTESRUGA^?GCsSSGGNA

MK.QYSKNSGARF.DLSAAVi.NEKWQI5TALE.YGEQRYETRRHl,NYiNNYl,ASATFI,YLAKSGQ

Y^TœADY^TŒATI1DII>NAYQSKK\^LGWGQEWKA<KSTRIJLNTASRAYKEKDLÎGIRQ

RNREYASVFTR\TiRRTHIWGn'RKI,SWSYQ5RVTSNHPfYYYl>RN11^YEföKTE

SEQ ID NO : 5 : R2846 1315

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MXNGVKQLSLLSLIGLSLTNYAWAEYARPKND'rLTSTlQKAELXTSRESSMP&KPlPN'RH ftSLS&SQLAHHPRLVLRGLH^LYGNCTQAVQLLLFLYKQFPQQDNFLLTWÄKÄlEARE

QôDLÏQSLAYYPJïLEâïEnIASÎJLPERYQLAQALEENYEXEâAXÎQEEKLEOŒVTIDEKFLGV

ÎDQYLLTLNQEXQY.aAVQVGLNEÎAWNLNN'AFKAÔTKÎGSWTAAŒKESGQGYGY'SLSVEK

KWFWAGiiEESKlAÜ'AKEAX3KYYWDNKKY\EGvrYRI.GGGEGYQTASVEVSLEFEQEKRWYA

G GSSGIKÏMKQYÂDSLGîRLENVDWLSKTWQlSIAI^YGESKYKIRKiînXfNYYFISSIir

YLPK.STQB3TV<WAU-ÎRENrQÂn>Kl\Y<^RT.IJ<LCAVeÇ>»WSKGISSRLTFSYÆA'R\A^rREK

DUGX<XjKNREYTTTFîLWîlRNaiFMGLT?KLSWDYQKSISXiiAFYRYDKNïUYIJîïGKIF

SEQ ID NO : 6 : NadA

ÂTNDDDY'XKAATVGVIÂAAYNNGQEINGFRjlGETnOIDEDGTn'RXDAYXADXŒADDFKGL

6ΕΧΚνΥΤΝΕΉ<ΤΥ^ΐ\ΈΝ^ΝΑΊ>ΑΚΥΈΧΑΕ8ΕΪΕΚΕΪΤΚΕ<ΑΙ>ΤΟΑΑΕ,Α0'Ο>ΑΑΕΟΑΤΕΝΑΕΝ

ΚΙ,ΟΕΝ9·ΓπΐΑΕΕΙΚ'ΪΤ/ηΤ<Π>ΕΚΙ.ΕΑΥΛΠΤνΓ)ΚΚΑΕΑΪ>;ΐ>ίΛί)8Ι.0ΕΤΝ·Γ&ΑΪ)ΕΑνΚΊ'ΑΗΕΑ

KQTAEETKQNVDAXVKAAE.TA.AGKAEAAAGTAYTAAGRAEAVAARVTERKAGEATNRDN

LAKRANSADYA'TREESDSKFVTîIDGiXATTEKLDTSJASAEKSIADHDTRLNGLDKTYSDLR

SETRQ<H.AEGAALSGLEQ?VNVG

SEQ ID NO : 7 ; gi | 7227388|gb|AAF42440.1 | protéine apparentée à la protéine de liaison de la transferrine [Neisseria meningitidis MC58]

KÔ-lO<SYXAMA€ô⁵ALSÂCGœûCK»SH)VKS>Wl'LSKPAAFYVS£KE’rEAKEDAPQAGSQGQ

G?\PSA<Xï$QDMÂ/WSEENTGNG<LWTADN?KNTGEVAQNDMFQNAAGïDSS'FFN'HTPD?

NR^GNMEMMrDAGESSQF^ANQPD^NAArXlMQGinY^CKÏQNAGNnAÂÇRiANQAG

Ν^^ΌΥ5ΠΡΪΡΑΥΕΨΑΕΑΝΕτΟ5ΝΕΌΚ\Υ>Ε,ΑΝ€ΛΥ1ΪΧ3Ρ$(3ΝΪΤΕΙ1χ·ΚΟ03£·ΑΌΝΝΕΕ0ΕΕ

VQXJLS&FEKL%FMDKISNYKKIXfKNDKFVGLVADSVQMKGn>iQ\lïFY'K?KPTSFASPÏîRSA

RSRRSLPAEYnXIPYNQADTRIVIXrEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYETY'GAEK.LPGOSYALP.

Vi;CïEFAKGEYRAGAAVY\GE\7.HFbriENGRF^TTSGRFAÂK\TîEC3SKS\ⁱIXinrJSGrjiDLEÎ

MGTQREK.A.AnxiN&FRGTWENGAGDWlKEYGPAGEEVAijRYSYRPTDAEKGGFGVFA

GKKEQD

SEQ ID NO : 8

ΜΡΕΕΡΡΕσΡΗΕ.ΙΕΑ5ΐ/Γ€Ι1ΟΑν<?ΚΚΑΥ.ΗΝ!;ΐΝνΥίί.8ΙΪΧΜΤΡ8ΚΡνΝΕ.ΤΑΕ<'<?ΙΑΪ,ΤΓΑΕΪί,Τ

ACGS«?KîGVAAD.IGAGÎAaAETAFn>HKI>KGLQRLTErX5SVRRNEKEKlAAÇRiAER-rs’GN

GDSLKTGKLKNDKVSRÎDFÎRQÎEVIXXQLÎTLESGEFQWKQSHSALTAFQTEQXQDSEHSGK

YiVAKRQFP.R7R)LAGEHISFl)KLPEGGRÂÏYRGTAFGSi3i>AGGROYnDEÂAKQ<iA^:GRÎEH

LXSPEENVDLAAAæKPÏXîKKHAVX$GSVLYNQÂEXGSY$EGXFGGKAQEVAGXAE?VKrVN

ŒRHKH.ÂAXQ

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SEQ ID NO : 9

CSSöö<XfSCKKK?»VÄADIöÄOLÄDÄL.TÄPLDfS3>KöLKSLTLEDSiSQNöTLTLSAQöAER.T

FKÂOÏ>KDKS{.KTGKIKXOK)SRH>F)RQÎE\nX»Q1JTÏ.ES«BPQIVKQ»HSA\’V/\F..Q1EKn<S^

DKXDSUNQP^FRX'SGLGG^HAFNQLPDGKAEYlJOKÄFSSDDAGGKL'n’TIDFAAK.QGHO

KIEIßJiTPEQNVEIAAAmCWEKSILWimDTRYGSESKG'nTiLALFGDRÄQEIÄGSATVK

Ï0EKWEIGW3KQ

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Exemple B

Dans une seconde stratégie, les lipoprotéines fHbp et NHBA issues de N. meningitidis MC58 ont été clonées dans le plasmide pETCOLA (qui comporte 2 sites de clonage pour la coexpression de gènes d'intérêt) sous le contrôle d'un promoteur inductible par l'IPTG soit seul soit simultanément à NMB0313 et exprimées dans une souche non pathogène d'Escherichia coli, ou avec la coexpression de NMB0313.

La souche d'E. coli BL21 (DE3) a été transformé avec le plasmide petCOLA vide ou petCOLA portant fHbp, nhba ou nmb0313 seuls ou pETCOLA portant NHBA et nmb0313 ou fHbp et nmb0313, respectivement (figure 7).

Les taux d'expression de toutes les protéines ont répondu à l'induction par l'IPTG (données non présentées) et l'expression des deux lipoprotéines a été confirmée par une analyse Western Blot (figure 8) . L'expression de la fHbp et du NHBA dans les lysats totaux provenant d'E. coli coexprimant NMB0313 a été supérieure aux lysats d'E. coli exprimant uniquement les lipoprotéines (figure 8). Ceci confirme que la présence de NMB0313 a un effet positif sur l'expression de la fHbp et du NHBA dans le système hétérologue d'E. coli. L'analyse FACS a révélé que NMB0313 est nécessaire pour l'exposition à la surface à la fois du NHBA et de la fHbp (deux lipoprotéines de N. meningitidis) . Alors que l'expression dans les lysats totaux a été clairement détectable par Western blot, aucune fHbp ni aucun NHBA n'a été détectable sur la surface lorsque NMB0313 n'est pas coexprimée.

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Nous avons généré des OMV à partir des 6 souches différentes d'E. coli exprimant différentes la fois avec et lipoprotéines de N. meningitidis, sans coexpression de NMB0313, ce qui a mené à leur expression différentielle à la surface. Après la purification des OMV issues d'E. coli, une PAGE sur gel SDS a été effectuée pour caractériser la préparation. Les OMV d'E. coli ont été enrichies avec les protéines de N. meningitidis (NMB0313, fHbp et NHBA) qui sont visibles à partir de la PAGE sur gel de SDS (figure 9). En particulier, les différences de quantité de fHbp et de NHBA dans les OMV provenant des cultures lorsqu'elles sont exprimées seules ou coexprimées avec NMB0313 ont été évidentes. Les deux lipoprotéines sont présentes dans de plus grandes quantités dans les OMV provenant des cultures avec coexpression de NMB0313 et couloir 6 contre été des (couloir 4 contre couloir 3, couloir 5).

Après purification des OMV à partir d'E. coli, les rendements pour toutes les préparations ont quantifiés. L'évaluation des rendements préparations révèle une augmentation de la quantité des OMV purifiées à partir des souches d'E. coli exprimant des protéines de N. meningitidis, en particulier pour la fHbp et NMB0313. Comme il est montré dans le tableau ci-dessous, les OMV provenant de la souche d'E. coli n'exprimant pas de protéines (vide) présentent la récupération d'OMV la plus basse. Ceci suggère que la surexpression de ces protéines de la membrane externe entraîne la formation de souches recombinantes « hyperblebs » d'E. coli.

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	Concentration pg/pl	Rendement (mg/1)
Vide	0,344	1,769
0313	2, 694	13,085
fHbp	0, 982	10,381
fHbp + 0313	1,851	19, 566
NHBA	0, 639	4, 932
NHBA + 0313	0,484	3, 740

Les OMV provenant d'E. col! coexprimant la fHbp et NMB0313 contiennent des quantités élevées de fHbp, où elle apparaît comme la protéine la plus abondante dans les OMV. Afin de mieux quantifier la différence de quantité totale de fHbp dans les OMV préparées à partir des cultures exprimant la fHbp seule ou avec NMB0313, l'analyse WB en utilisant une dilution en série des OMV a été effectuée (figure 10). La coexpression de la fHbp et de NMB0313 a entraîné plus de 10 fois plus de fHbp que l'expression de la fHbp seule.

Ces préparations d'OMV ont été incluses dans un schéma d'immunisation (figure 11) . L'étude a testé si la coexpression de NMB0313 avec les lipoprotéines méningococciques dans un contexte hétérologue d'E. coli a un effet sur l'immunogénicité des OMV résultantes. Des souris CD1 ont été immunisées par voie intrapéritonéale avec les doses indiquées des OMV (soit

2 pg soit 0,2 pg) deux fois au jour 1 et au jour 21, et le prélèvement de sang final a été pris au jour 35. Les fHbp et NHBA recombinantes (1 pg) ont été utilisées en tant que témoins positifs.

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Les titres ELISA en utilisant la fHbp recombinante en tant qu'antigène de sensibilisation (figure 12) sur les sérums provenant des groupes 1 à 7 ont révélé que les formulations d'OMV portant la fHbp, à l'exception de 0,2 pg d'OMV portant la fHbp seule, ont déclenché des titres en anticorps qui ont été significativement supérieurs aux témoins négatifs (OMV vides et OMV-0313) Les immunisations avec 1 pg de fHbp recombinante ont entraîné des titres en IgG similaires aux immunisations avec 2 pg d'OMV-fHbp et 0,2 pg d'OMV-fHbp+0313. Il existe une tendance pour des titres anti-fHbp dépendants de la dose avec les OMV portant la fHbp

seule (FHBP)	î , mais	aucune	différence	apparente entre
les 2 doses	de s OMV	avec à	la fois la	fHbp	et NMB0313
(FHBP+0313).
Pour	mesurer	les	réponses	en	anticorps

fonctionnels, nous avons effectué des tests d'activité bactéricide des sérums avec du complément de lapin (rSBA) sur les sérums groupés provenant des groupes 1 à 7 sur la souche à tester H44/76 fHbp (figure 13) . Il n'a été obtenu aucune destruction par le sérum des témoins. De façon surprenante, les sérums groupés dérivés de toutes les immunisations y compris 0,2 pg d'OMV portant la fHbp seule, montrent une activité bactéricide élevée. Les sérums groupés provenant des groupes immunisés avec 2 pg d'OMV portant la fHbp seule, et les deux doses d'OMV portant la fHbp et NMB0313 ont donné des titres supérieurs comparativement à 1 pg de rfHbp vl.1.

La réalisation du test rSBA en utilisant des sérums de souris simples (figure 14) a confirmé les

BE2017/5464 résultats obtenus avec les sérums groupés (figure 14) . De façon intéressante, les titres de 6 souris sur 8 provenant des immunisations (2 pg et 0,2 pg) des OMV avec la fHbp et NMB0313, ont été supérieurs à la limite technique quantifiable dans ces expériences (titres > 524288) . En général, les réponses bactéricides fonctionnelles déclenchées à partir des formulations d'OMV lorsque la fHbp est coexprimée avec NMB0313 sont supérieures aux réponses avec la protéine recombinante, et aux doses équivalentes d'OMV avec la fHBP exprimée seule. En conclusion, toutes les préparations sont capables de produire des anticorps contre la fHbp y compris 1 pg de fHbp recombinante. Néanmoins, la fHbp exprimée sur les OMV d'E. coli dans une conformation native est capable de déclencher des titres bactéricides supérieurs comparativement à 1 pg de fHbp recombinante. Ces formulations d'OMV résultant de la coexpression de NMB0313 avec la fHbp montrent les réponses bactéricides les plus élevées avec à la fois les doses élevées (2 pg) et basses (0,2 pg) entraînant des réponses supérieures à la plage quantifiable des dilutions effectuées ici. Ces données confirment que la coexpression de NMB0313 avec les lipoprotéines du modèle telles que la fHbp peut significativement améliorer l'immunogénicité des préparations d'OMV.

Les titres ELISA en utilisant du NHBA recombinant en tant qu'antigène de sensibilisation (figure 15) à partir des sérums provenant des groupes 1, 2, 8, 9 et 10 ont révélé que toutes les préparations comprenant du NHBA ont déclenché des titres en anticorps qui étaient significativement supérieurs aux témoins négatifs (OMV

BE2017/5464 vides et OMV-0313) . Les sérums provenant des souris immunisées avec des OMV-NHBA+0313 montrent des titres en anticorps supérieurs comparativement aux sérums des souris immunisées avec des OMV avec seulement l'expression du NHBA, et montrent une tendance pour être supérieurs aux souris immunisées avec 1 pg de NHBA

Les réponses fonctionnelles ont été mesurées en utilisant un test rSBA des sérums groupés contre des souches méningococciques recombinantes à tester exprimant le NHBA (5/99 OE nHBAp2) ou auxquelles il manque l'expression du NHBA (5/99AnhbA) (figure 16). Les sérums groupés provenant du groupe de souris immunisées avec des OMV issues du NHBA coexprimé avec NM0313 ont donné des titres bactéricides élevés qui ont été supérieurs à ceux du groupe immunisé avec 1 pg de protéine NHBA recombinante. Ces titres bactéricides étaient spécifiques du NHBA car aucune réponse bactéricide n'a été mesurée contre la souche à tester à laquelle il manque l'expression du NHBA. Alors que des titres positifs en IgG ont été mesurés par un test ELISA avec les OMV exprimant le NHBA seul, ceux-ci n'ont pas entraîné de réponse fonctionnelle à partir des sérums groupés issus de ce groupe. L'analyse des réponses bactéricides pour les sérums groupés dirigés contre 2 autres souches à tester M4407 et NGH38 a montré que les sérums groupés issus du groupe 7 (OMVNHBA) ne sont pas parvenus à présenter des titres bactéricides tandis que les sérums groupés issus des OMV exprimant à la fois le NHBA et NMB0313 ont présenté des réponses supérieures aux sérums groupés provenant

BE2017/5464 (figure 17) confirme les sérums groupés. Le test du groupe immunisé avec 1 pg de protéine recombinante (figure 16b).

La réalisation du test rSBA en utilisant des sérums de souris simples résultats obtenus avec les

ELISA montre que les OMV d'E. coli portant le NHBA seul ou avec NMB0313 sont capables de produire des anticorps dirigés contre le NHBA, alors qu'aucune réponse fonctionnelle n'a été déclenchée par les OMV avec le NHBA seul. Ces données confirment que la coexpression de NMB0313 avec le NHBA augmente significativement 1'immunogénicité des OMV résultantes comparativement à celles préparées à partir de la souche exprimant le NHBA seul.

La délétion de nmb0313 touche l'exposition à la surface des lipoprotéines analysées dans la souche méningococcique NGH38. En particulier, l'absence de NMB0313 entraîne des taux indétectables de NHBA sur la surface et, comme conséquence, son accumulation au sein des bactéries. D'autre part, des taux de fHbp diminués sur la surface ont été détectés et ces taux bas ont été une conséquence d'une réduction générale de la quantité de fHbp dans le contexte de nmb0313 KO comparativement au type sauvage. Par conséquent, NMB0313 joue un rôle essentiel dans la translocation du NHBA vers la surface de la bactérie mais sa délétion ne touche pas l'expression du NHBA en soi, toutefois, NMB0313 contribue à l'expression stable de la fHbp et par conséquent à son expression à la surface. Ensuite, le phénotype a été restauré dans la souche NGH38 nmb0313 KO par complémentation génomique d'une copie

BE2017/5464 fonctionnelle du gène nmb0313 sous le contrôle du promoteur Tac inductible par l'IPTG (figure 18) . La souche complémentée est capable d'exprimer NMB0313 d'une façon dépendante de l'IPTG comme il est démontré par Western blot, et les concentrations les plus élevées d'IPTG induisent une surexpression de la protéine NMB0313.

Pour tester comment les SLP différentielles exposées sur le système d'administration des OMV en fonction de la quantité modifiée de NMB0313 dirigent des réponses immunitaires différentielles contre ces SLP, des OMV issues de souches NGH38 ont été produites. Des OMV issues de WT, Δ0313 et CÏ0313 avec 0,1 mM d'IPTG ont été purifiées et analysées par WB et PAGE sur gel de SDS. La surexpression de NMB0313 est visible dans la souche complémentée, mais il n'y a aucune autre différence significative dans le profil SDS-PAGE des protéines (figure 19) . Ces OMV ont été utilisées pour l'immunisation des souris et l'analyse rSBA a été réalisée sur les sérums groupés avec 3 souches à tester L'analyse rSBA montre une tendance pour des titres SBA réduits à partir de ces OMV méningococciques préparées en l'absence d'expression constitutive (WT) et d'expression inductible (Ci0313) et, par conséquent, d'activité destructrice dans ces groupes immunisés. Ceci confirme le rôle de NMB0313 dans la direction de l'activité bactéricide également dans un système homologue.

Les différences des titres bactéricides ont été diminuées dans les sérums produits à partir de l'immunisation avec la préparation NGH38A0313, alors

BE2017/5464 que les titres de NGH38 CÏ0313 montrent une activité bactéricide comparable à la souche NGH38 WT (figure 20). L'analyse rSBA en utilisant la souche de référence 5/99 OE NHBAp2 et la souche ΔΝΗΒΑ correspondante montre également que cette immunogénicité n'est pas exclusivement dirigée par le NHBA. Probablement, d'autres lipoprotéines subissent une translocation sur la surface d'une façon dépendante de NMB0313 et ces SLP ont pu affecter l'immunogénicité.

Ces données confirment un rôle pour NMB0313 dans 1 ' immunogénicité des OMV méningococciques en ce que l'expression de NMB0313 dans une souche vaccinale méningococcique mène à des préparations d'OMV avec une immunogénicité supérieure.

Matériaux et procédés

Souches bactériennes et conditions de culture

Les souches de Neisseria meningitidis (Nm) du sérogroupe B (MC58, NHGH38, NZ 98/254 et ses dérivés isogènes) et les souches d'Escherichia coli (Ec) (DH5a et BL21-DE3) utilisées dans cette étude sont énumérées.

Les souches de N. meningitidis ont été cultivées sur des plaques de gélose de milieu de base pour les gonocoques (GC) (Difco) ou dans du bouillon GC à 37 °C dans 5 % de CO2.

Les souches d'E. coli ont été cultivées dans de la gélose LB ou du bouillon LB à 37 °C.

Des antibiotiques ont été ajoutés lorsque c'était nécessaire. De la kanamycine et du chloramphénicol ont été ajoutés à des concentrations finales de 150 pg/ml et 5 pg/ml pour la sélection des mutants par délétion

BE2017/5464 et des souches de complémentation de N. meningitidis, respectivement.

De l'ampicilline, de la kanamycine, ou du chloramphénicol a été ajouté à des concentrations finales de 100, 150 ou 10 pg/ml pour la sélection d'E. coli.

Lorsque cela a été nécessaire, de 1'isopropyl-ß-D1-thiogalactopyranoside (IPTG) (1 mM) (Sigma) a été ajouté au milieu de culture aux concentrations finales indiquées.

Construction des	souches	mutantes	et	de
complémentation
Les manipulations	d'ADN ont	été	réalisées	en
routine comme il est	décrit	pour	des	procédés

classiques en laboratoire [4].

Pour construire un mutant par délétion de NMB0313, le gène nmb0313 a été remplacé par une cassette de kanamycine par double enjambement. Pour réaliser ceci, le plasmide pGEMTUD313Kan a été produit comme suit. Les régions flanquantes en amont et en aval de nmb0313 ont été amplifiées à partir du chromosome de MC58 avec des sites d'enzymes de restriction et clonées dans le plasmide pGEMT. La cassette de la kanamycine a été clonée sous la forme d'un fragment Xbal de 1,4 kb dans le site Xbal entre les deux régions flanquantes. Ce plasmide a été utilisé pour transformer les souches de N. meningitidis.

La complémentation de nmb0313 a été obtenue par insertion d'une copie du nmb0313 dans la région non codante entre les ORF convergents NMB1428 et NMB1429 du chromosome des souches Δ0313. Pour réaliser ceci, le

BE2017/5464 plasmide pComPIndNMB0313 a été produit par amplification du gène nmb0313 et cloné sous la forme d'un fragment Asel/Nsil sous le contrôle du promoteur inductible Tac et du répresseur Lacl dans le plasmide pComPInd [5].

Les amorces et les plasmides sont énumérés dans les tableaux joints.

La séquence nucléotidique correcte de chaque plasmide a été confirmée par séquençage d'ADN.

Les plasmides ont été linéarisés et utilisés pour la transformation des souches de N. meningitidis.

Tous les transformants ont été vérifiés par une analyse à la fois PCR et Western blot.

Analyse Western blot

Les cultures d'une nuit sur des plaques de gélose ont été remises en suspension dans du GC jusqu'à 0,5 DCGoo/ml. Un millilitre de la resuspension a été centrifugé pendant 5 min à 13 000 tr/min et le culot a été remis en suspension dans 100 μΐ de tampon de chargement SDS (50 mM de Tris-HCl [pH 6,8], 2,5 % de

SDS, 0,1 % de bleu de bromophénol, 10 % de glycérol, 5 % de 3-mercaptoéthanol, 50 mM de DTT) [6].

Dans le cas des cultures liquides, les souches ont été cultivées jusqu'à 0,5 DCUoo/ml et un millilitre de la culture a été agrégé et remis en suspension dans 100 μΐ de tampon de chargement SDS. Les extraits protéiques ont été séparés par SDS-PAGE sur des gels NuPAGE® Novex® 4-12 % Bis-Tris Protein Gels dans du MES IX (Life Technologies) et ensuite transférés sur des membranes de nitrocellulose. Les membranes ont été

BE2017/5464 bloquées pendant une nuit à 4 °C avec du PBS + 0,05 % de Tween 20 (Sigma) et 10 % de lait en poudre (Sigma).

L'anticorps primaire a été dilué comme il a été rapporté dans le tableau des anticorps dans du PBS + 0,05 % de Tween 20 et 3 % de lait en poudre et incubé pendant lh avec la membrane. Un anticorps antiIgG de souris conjugué à de la peroxydase de raifort (HRP) et le réactif Western Lightning ECL (Perkin Elmer) ont été utilisés selon les instructions du fabricant pour la détection.

Analyse par tri des cellules activées par fluorescence (FACS) de l'expression de la fHbp

Les souches de N. meningitidis et leurs dérivés isogènes, ont été recueillis après des cultures liquides à DCUoo de 0,5, lorsque cela a été nécessaire, de l'IPTG a été également ajouté. Les bactéries ont été inactivées par incubation avec du formaldéhyde à 0,5 % pendant 1 heure à température ambiante.

Le marquage a été effectué avec l'anticorps primaire dilué dans du PBS-0,5 % de BSA (Sigma) comme il a été rapporté dans le tableau.

La liaison de l'anticorps primaire a été détectée en utilisant un anticorps anti-souris (molécule entière) conjugué à du FITC (Sigma) à la dilution correcte.

Test d'activité bactéricide du sérum (SBA)

Jour 1 :

Etaler en stries sur une plaque de gélose chocolat ronde les bactéries provenant du stock congelé et incuber 18 heures à 37 °C avec 5 % de CO2.

Jour 2 :

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Inoculer 7 ml de bouillon Mueller Hinton (MHB) avec du glucose à 0,25 % (p/v), avec les bactéries jusqu'à DOsoo = 0,05, blanc = MHB

Incuber les 7 ml de bactéries dans un agitateur à 150 tr/min à 37 °C avec 5 % de CO2

Stopper l'incubation lorsque la DCboo = 0,24 à 0,26 (environ 2 à 4 x 10⁸ CFU/ml) , normalement après 1,5 à 2 heures

Effectuer une dilution de travail des bactéries dans un tampon du test de 2 à 4 x 10⁴ CFU/ml (1/10 000) en diluant les bactéries en deux étapes (c'est-à-dire, 10 μΐ de la culture bactérienne dans 1 ml de tampon, 100 μΐ de cette suspension dans 10 μΐ de tampon) pour arriver à une dilution finale au 1/10 000.

Dilution des sérums :

Remplir les puits de la plaque stérile à fond arrondi de 96 puits de la colonne A à G avec 25 ml de tampon et les puits de la colonne H avec 20 ml.

Les colonnes A à F sont pour la dilution des sérums : ajouter au premier puits de chaque rangée 25 ml d'échantillon de sérum et effectuer une dilution en série au demi. Le volume final dans les colonnes A à G est à présent de 25 ml/puits.

Ajouter 5 ml d'échantillon et 12,5 ml/puits de complément inactivé à la colonne H.

Les colonnes G et H représentent les témoins expérimentaux négatifs : la colonne G est le témoin du complément, contient du tampon, des bactéries et du complément actif, la colonne H est le témoin du sérum, contient du tampon, des bactéries, du sérum et du complément inactivé.

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Ajouter 12,5 ml/puits de bactéries à la dilution de travail à tous les puits des colonnes A à H.

Ajouter 12,5 ml/puits de complément actif à chaque puits des colonnes A à G.

Homogénéiser par agitation la plaque de microtitrage.

Immédiatement après l'addition du complément, prélever 10 ml de réaction à partir des puits témoins négatifs des G et H et étaler en stries sur des plaques carrées de gélose de Mueller-Hinton (gélose MH) en utilisant le procédé d'oscillation, ce moment représente le temps zéro (t = 0) . Incuber la plaque de 96 puits avec la réaction à 37 °C avec 5 % de CO2.

Après 60 minutes (t = 60), prélever 10 ml des puits témoins négatifs des colonnes G et H et étaler en stries sur des plaques de gélose en utilisant le procédé d'oscillation. Déposer 7 ml de chaque puits d'échantillon en double sur des boîtes de Petri carrées avec de la gélose MH en utilisant des pipettes multicanaux à 12 canaux (1 à 50 ml) . Incuber pendant une nuit à 37 °C avec 5 % de CO2.

Jour 3 :

Compter la quantité de colonies dans les témoins à t = 0 et t = 60.

Compter la quantité de colonies dans les plaques carrées avec les dépôts.

Calculer le nombre de colonies qui représentent les 50 % de destruction.

Titre bactéricide = la dilution du sérum qui détruit 50 % des bactéries ajoutées au temps zéro.

Analyse des sérums - ELISA

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100 μΐ d'antigène à 0,015 μΜ ont été ajoutés dans chaque puits d'une plaque Nunc Maxisorp de 96 puits et incubés pendant une nuit à 4 °C.

Les puits ont été ensuite lavés trois fois avec du tampon de lavage (PBT).

250 μΐ de tampon de saturation (PVP) ont été ajoutés dans chaque puits et les plaques ont été incubées pendant 2 heures à 37 °C.

Les puits ont été lavés trois fois avec du PBT.

100 μΐ des sérums dilués ont été ajoutés dans chaque puits et les plaques ont été incubées pendant 2 heures à 37 °C.

Les puits ont été lavés trois fois avec du PBT.

100 μΐ des sérums des anticorps secondaires conjugués à de la phosphatase alcaline dilués au 1/2000 dans du tampon de dilution ont été ajoutés dans chaque puits et les plaques ont été incubées pendant 90 minutes à 37 °C.

Les puits ont été lavés trois fois avec du tampon

PBT.

100 μΐ de substrat phosphate de p-nitrophényle ont été ajoutés dans chaque puits et les plaques ont été laissées à température ambiante pendant 30 minutes.

100 μΐ de NaOH 4N ont été ajoutés dans chaque puits et la DO à 405/620-630 nm a été suivie.

Les titres en anticorps ont été quantifiés par interpolation contre une courbe d'étalonnage de référence.

Réactifs :

1) Plaque Nunc Maxisorp Code 442404

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2) Tampon de saturation (PVP) 2,7 % de polyvinylpyrrolidone dans de l'eau

3) Tampon de lavage (PBT) 0,05 % de Tween-20, dans du PBS 0,074 M

4) Tampon de dilution : 1 % de BSA, 0,05 % de

Tween-20, dans du PBS 0,074 M

5) Anticorps secondaires conjugués à de la phosphatase alcaline Sigma Code A3562

6) Substrat phosphate de p-nitrophényle (pNPP) Sigma code P 7998

7) tampon de l'antigène (0,148 M) . Na₂HPO₄ 1,15 g . KC1 0,2 g . KH2PO4 0,2 g . NaCl 8,0 g . pH 7,4 ± 0,1 . Eau distillée q.s.p. 1 litre

Isolement des vésicules de membrane externe (OMV) native de Neisseria meningitidis

Culture des souches • Inoculer la souche souhaitée le jour précédant l'expérience sur une plaque de gélose GC • Inoculer un flacon d'agitation de 250 ml contenant 50 ml (MCDMI) avec la culture de départ jusqu'à une DO600 de 0,15 à 0,25 • Incuber le flacon à 37 °C, 0 % de CO2 et

160 tr/min jusqu'à la phase stationnaire (approximativement pendant une nuit) • Evaluer la DO/ml (nécessaire pour le rendement) et prélever des échantillons pour les analyses Wb et FACS (si nécessaire)

BE2017/5464 • Transférer les cultures dans des tubes Falcon de 50 ml • Centrifuger les cultures à 3500 tr/min pendant 30 min à 4 °C • Retirer les paniers de la centrifugeuse et transférer dans une enceinte de biosécurité • Transférer le surnageant dans des bouteilles à filtre Stericup de 125 ml (taille de pore de 0,22 pm) et filtrer.

• Prélever 100 pl du surnageant filtré et le déposer sur une plaque de gélose GC en tant que témoin pour l'élimination de Neisseria • Stocker le flacon à 4 °C jusqu'à la confirmation de 1'inactivation/élimination des bactéries dans le surnageant filtré après 24 à 48h d'incubation des plaques de gélose témoins • Les surnageants filtrés peuvent être considérés comme stériles si les plaques recouvertes du surnageant filtré ne présentent aucune croissance ET que les plaques avec les cultures après incubation présentent une croissance

Culture d'E. coli BL21 • Inoculer la souche souhaitée le jour précédant l'expérience sur une plaque LB Kan • Le jour de l'expérience, déposer quelques colonies sur LB+Kan et croissance jour 0 180 tr/min, 37 °C • Inoculer au 1/100 dans un flacon contenant 50 ml (HTMC) avec de la kanamycine (50 pg/ml) et de 1'IPTG (0,1 mM)

BE2017/5464 • Incuber le flacon à 30 °C et 160 tr/min jusqu'à la phase stationnaire (approximativement pendant une nuit)

Evaluer la DO/ml (nécessaire pour le rendement) et prélever des échantillons pour les analyses Wb et FACS (si nécessaire)

Transférer les cultures dans des tubes Falcon de 50 ml

Centrifuger les cultures à 3500 tr/min pendant 30 min à 4 °C

Transférer le surnageant dans des bouteilles à filtre Stericup de 125 ml (taille de pore de

0,22 pm) et filtrer • Stocker le flacon étapes

Préparation des nOMV filtrés à 4 °C jusqu'aux autres à partir des surnageants • Transférer le surnageant filtré dans des tubes d'ultracentrifugeuse de 70 ml (appropriés pour une centrifugeuse 45Ti) et remplir tout espace de tube vide avec du PBS • Centrifuger les échantillons à 35 000 tr/min (96 000 x g, moyenne) et 4 °C pendant 2h • Etape de lavage avec du PBS • Prélever soigneusement le surnageant • Remettre en suspension le culot dans 200 à 500 pl de PBS (des inhibiteurs des protéases peuvent être ajoutés au tampon à ce stade) • Eventuellement, le culot peut être laissé immergé dans le tampon pendant une nuit

BE2017/5464 • Stocker les culots à -20 °C jusqu'à une autre analyse

Analyse des préparations des nOMV

Détermination de la concentration des protéines • Déterminer la concentration des protéines en utilisant le kit BioRad DC • Utiliser une courbe d'étalonnage des protéines de 2 à 0,06 mg/ml (trois réplicats) • Effectuer des dilutions appropriées des échantillons d'OMV (jusqu'à 1/10, jusqu'à 1/100 pour l'isolement à rendement élevé ; taille du culot) • Mesurer l'absorbance à 750 nm dans un lecteur de plaques en utilisant la mesure du critère final • Calculer la concentration des protéines en utilisant une relation à la fois linéaire et de meilleur ajustement

Détermination de la composition des nOMV • Remettre en suspension la quantité spécifique de nOMV avec du tampon de chargement SDS 2X (volume final de 10 à 15 μΐ) • Passer l'échantillon des protéines sur un gel de SDS-PAGE en utilisant du tampon MES • Prélever 1 pg des nOMV totales pour l'analyse WB, transférer le gel et développer en utilisant un anticorps spécifique • Prélever 5 à 10 pg des nOMV pour la SDS-PAGE sur gel en utilisant soit SimplyBlue

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SafeStain soit une coloration des protéines à 1'argent

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Tableau des souches
Nom	Description	Cassette de résistance à un antibiotique	Référence
Souches de
N. meningitidis
NGH38	Souche wt de Neisseria meningitidis
NGH38 Δ0313	Dérivé de NGH38, insertion de kanamycine dans le locus de nmb0313	Kanamycine	Cette étude
NGH38 Δ0313 ci0313	Dérivé de NGH38, à laquelle il manque le gène nmb0313 avec une copie de nmb0313 réintroduite en dehors du locus sous le pTAC inductible par 1'IPTG	Chloramphénicol	Cette étude
Souches
d'E. coli
DH5a	fhuA2 lac (del) U169 phoA glnV44 Φ80' lacZ (del)Ml 5 gyrA96 recAl relAl endAl thi—1 hsdRl7
BL21 (DE3)

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Tableau des souches
Nom	Description	Cassette de résistance à un antibiotique	Référence
pCOLA DUET	Le vecteur code pour deux sites de clonage multiple, avec le promoteur T7, le réplicon COLA de ColA, le répresseur lacl et KanR	Kanamycine	Novagen
pGEM-T	Vecteur de clonage d'E. coli, AmpR	Ampicilline	Promega
pComPIND CmR	Plasmide pour le remplacement allélique au niveau d'un emplacement chromosomique entre les ORF NMB1428 et NMB1429 et expression inductible sous le contrôle du promoteur PTAC et du répresseur lacl. En amont du site de clonage, il y a une cassette de résistance au Cm	Ampicilline, Chloramphénicol	leva, R., et al. J Bacterid, 2005.

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Tableau des souches
Nom	Description	Cassette de résistance à un antibiotique	Référence
pUD0313Kan	pGEM-T contenant la région flanquante de nmb0313 avec la cassette de résistance à Kan clonée sous la forme d'un fragment Xmal entre les régions flanquantes	Ampicilline, Kanamycine	Cette étude
pIND0313	Plasmide pour la complémentation de nmb0313 dans la région Corn avec un promoteur tac inductible par l'IPTG. En aval de nmb0313, une cassette de résistance au Cm est clonée.	Ampicilline, Chloramphénicol	Cette étude
pCOLA_0313	Construction pour exprimer la protéine recombinante NMB0313 de N. meningitidis dans E. coli	Kanamycine	Cette étude

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Tableau des souches
Nom	Description	Cassette de résistance à un antibiotique	Référence
pCOLA NHBA	Construction pour exprimer la protéine recombinante NMB2132 de N. meningitidis dans E. coli	Kanamycine	Cette étude
pCOLA fHbp	Construction pour exprimer la protéine recombinante NMB1870 de N. meningitidis dans E. coli	Kanamycine	Cette étude
pCOLA NHBA 0313	Construction pour coexprimer les protéines recombinantes NMB0313 et NMB2132 de N. meningitidis dans E. coli	Kanamycine	Cette étude
pCOLA fHbp 0313	Construction pour coexprimer les protéines recombinantes NMB0313 et NMB1870 de N. meningitidis dans E. coli	Kanamycine	Cette étude

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Tableau des
amorces
Nom de	Application	Séquence
1'amorce
0313UP_F	Fragment pour la production de 0313 KO dans MenB avec le site de restriction Xbal	GagatctagaGCCGGcattcgggcaaaaacc SEQ ID NO : 14
0313UP_R	Amorce de fusion en amont et en aval du flanc de NMB0313 avec le site de restriction Xmal	AACAGCAACCCGGGTATCAATCGGCG GAT SEQ ID NO : 15
NMB0313 FW DO	Amorce de fusion en amont et en aval du flanc de NMB0313 avec le site de restriction Xmal	CCGATTGATACCCGGGTTGCTGTTCC TTTTCG SEQ ID NO : 16
NMB0313 RV UP	Amorce de fusion en amont et en aval du flanc de NMB0313 avec le site de restriction Xmal	AACAGCAACCCGGGTATCAATCGGCG GAT SEQ ID NO : 17
0313pC_F	Clonage du gène de NMB0313 dans le plasmide pCOM pour la complémentation dans MENB NM0313KO	Gtgtattaatatggttattttttatttttgtg SEQ ID NO : 18
0313pC_R	Clonage de NMB0313 dans le plasmide pCOM pour la complémentation dans MENB NM0313KO	Gtgtatgcattcagaacgttttattaaactc SEQ ID NO : 19

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Tableau des amorces
Nom de 1'amorce	Application	Séquence
Î313F2	Clonage du gène de NMB0313 dans MCS2 de pCOLA avec le site de restriction Mfel	GCAGATCTCAATTGatggttattttttattttt gtg SEQ ID NO : 20
Î313R2	Clonage du gène de NMB0313 dans MCS2 de pCOLA avec le site de restriction Xhol	TTACCAGActcgagtcagaacgttttattaaac te SEQ ID NO : 21
iPCR fhbp MCS	Clonage du gène de	AGCATTATgcggccgcTTATTGCTTGGC
1 R V	NMB1870 dans MCS1 de pCOLA	GGCAAG SEQ ID NO : 22
iPCR fHBP MCS	Clonage du gène de	GGAGATATAccatggTGAATCGAACTG
l_(ifHbpl_2)	NMB1870 dans MCS1 de pCOLA	CCTTCTG SEQ ID NO : 23
iPCR NHBA MCS	Clonage du gène de	GGAGATATAccatggTCTTTAAACGCA
1 FW	NMB2132 dans MCS1 de	GCGTAATC
(iNHBAl 2)	pCOLA	SEQ ID NO : 24
iPCR NHBA MCS	Clonage du gène de	AGCATTATgcggccgcTCAATCCTGCTC
1 RV	NMB2132 dans MCS1 de pCOLA	TTTTTTGC SEQ ID NO : 25

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Tableau des anticorps	Dilution WB	Dilution FACS
Sérum a-fHbp	polyclonal	de	souris	1/5000	1/1000
Sérum	polyclonal	de	souris	1/2000	1/800
a-NHBA
Sérum	monoclonal	de	souris	1/4000	1/1000
a-NHBA
a-souris-FITC		1/1000
a-souris-HRP	1/1000

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Références

1. Schwechheimer, C. membrane vesicles from biogenesis and functions.

and M.J. Kuehn, Outer Gram-negative bacteria

Nat Rev Microbiol, 2015 (10) : p. 605-19.

2. Fantappie, L., et al. , Antibody-mediated immunity induced by engineered Escherichia coli OMVs carrying heterologous antigens in their lumen. J Extracell Vesicles, 2014. 3.

3. Yogesh Hooda, C.C.-L.L., Andrew Judd, Carolyn M. Buckwalter, Hyejin Esther Shin, Scott D. Gray-Owen and Trevor F. Moraes, Slam is an outer membrane protein that is required for the surface display of lipidated virulence factors in Neisseria. Nature microbiology, 2016. 1.

4. Sambrook J, F.E., Maniatis T, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 2nd ed.

5. leva, R., et al. , CrgA is an inducible LysRtype regulator of Neisseria meningitidis, acting both as a repressor and as an activator of gene transcription. J Bacteriol, 2005. 187(10): p. 3421-30.

6. Oriente, F., V. Scarlato, and I. Delany,

Expression of factor H binding protein of meningococcus responds to oxygen limitation through a dedicated FNRregulated promoter. J Bacteriol, 2010. 192(3): p. 691701.

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Claims (17)

1. REVENDICATIONS

   1. Bactérie Gram négatif « hyperbleb » qui surexprime, exprime de façon constitutive ou exprime de façon inductible une flippase.
2. 2. Bactérie Gram négatif « hyperbleb » selon la revendication 1 qui est choisie dans le groupe constitué de Neisseria, Salmonella, Shigella, Haemophilus, Bordetella, Moraxella et Escherichia.
3. 3. Bactérie Gram négatif « hyperbleb » selon la revendication 2 qui est choisie dans le groupe constitué de Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Shigella boydii, Shigella sonnei, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis et Escherichia coli.
4. 4. Bactérie Gram négatif « hyperbleb » selon la revendication 3 qui est une souche de Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae qui a été modifiée génétiquement par régulation négative de l'expression de GNA33.
5. 5. Bactérie Gram négatif « hyperbleb » selon la revendication 4 qui a été modifiée génétiquement par mutation d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué de IpxLl, synX et IgtA.
6. 6. Bactérie Gram négatif « hyperbleb » selon la revendication 3 qui est une souche de Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis ou Escherichia coli qui a été modifiée génétiquement par régulation négative d'un ou de plusieurs gènes choisis dans le groupe constitué de tolQ, tolR, tolX, tolA et tolB.

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7. 7. Bactérie Gram négatif « hyperbleb » selon la revendication 3 qui est une souche de Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Shigella boydii ou Shigella sonnei qui a été modifiée génétiquement par régulation négative de tolR ou OmpA.
8. 8. Bactérie Gram négatif « hyperbleb » selon la revendication 7 qui a été modifiée génétiquement par mutation d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué de htrA, msbBl, msbB2 et virG.
9. 9. Bactérie Gram négatif « hyperbleb » selon l'une quelconque des revendications précédentes qui a été en outre modifiée génétiquement par un ou plusieurs procédés choisis dans le groupe suivant : (a) un procédé de régulation négative de l'expression d'antigènes immunodominants variables ou non protecteurs, (b) un procédé de régulation positive de l'expression d'antigènes d'OMV protecteurs, (c) un procédé de régulation négative d'un gène impliqué pour rendre la partie lipide A du LPS toxique, (d) un procédé de régulation positive d'un gène impliqué pour rendre la partie lipide A du LPS moins toxique, et (e) un procédé de modification génétique de la bactérie pour exprimer un antigène hétérologue.
10. 10. Bactérie Gram négatif « hyperbleb » selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle la flippase comprend une séquence présentant 80 % d'identité de séquence avec une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4.

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11. 11. Préparation de vésicules de membrane externe obtenues à partir de la bactérie telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12. 12. Préparation de vésicules de membrane selon la revendication 11 qui peut être filtrée à travers une membrane de 0,22 pm.
13. 13. Composition pharmaceutique comprenant la préparation de vésicules de membrane externe selon les revendications 11 et 12 conjointement avec un diluant ou un support pharmaceutiquement acceptable.
14. 14. Composition pharmaceutique selon la revendication 13 pour une utilisation dans un procédé de traitement du corps humain ou animal.
15. 15. Procédé de protection d'un individu contre une infection bactérienne qui comprend l'administration à l'individu d'une quantité efficace de la préparation telle que définie dans l'une quelconque des revendications 11 à 14.
16. 16. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique comprenant une préparation de vésicules de membrane externe telle que définie dans les revendications 11 et 12, le procédé comprenant : (a) l'inoculation d'un récipient de culture contenant un milieu nutritif approprié pour la croissance de la bactérie selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ; (b) la culture de ladite bactérie ; (c) la récupération des vésicules de membrane externe à partir du milieu ; et (d) le mélange des vésicules de membrane externe avec un diluant ou un support pharmaceutiquement acceptable.

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17. 17. Procédé selon la revendication 16 qui comprend en outre une étape après soit l'étape (c) soit l'étape (d) comprenant la stérilisation par filtration de la préparation de vésicules de membrane externe.

    5 18. Procédé de production d'une bactérie « hyperbleb » selon la revendication 1, lequel procédé comprend la modification génétique d'une souche bactérienne Gram négatif par : (a) modification de la souche pour réguler négativement l'expression d'un ou de

    10 plusieurs gènes Toi ; et (b) modification de la souche pour surexprimer, exprimer de façon constitutive ou exprimer de façon inductible une flippase.

    100

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