<Desc/Clms Page number 1>
WERKWIJZE VOOR HET GENEREREN VAN EMBRYOGENE CELKWEKEN
VOOR DE PRODUCTIE VAN BANANEN (Musa spp.)
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een nieuwe werkwijze voor het bereiden van regenereerbare embryogene celkweken van banaan en op hun gebruik voor lange-termijnopslag en voor het produceren van eventueel transgene bananenplanten.
Vanwege het gemak van hanteren en productie heeft zaad verreweg de voorkeur als vehikel voor de vermenigvuldiging en verbouwing van de meeste agronomische en bosboomsoorten. Echter in bepaalde gevallen kan geen uniform homogeen zaad geproduceerd of gebruikt worden voor een aantal agronomische en tuinbouwgewassen.
Bijvoorbeeld, tien van de dertig gewassen met een jaarlijkse productie tussen 10 en 450 miljoen metrische tonnen worden vegetatief vermeerderd. Deze gewassen vereisen derhalve een alternatief vehikel dat tot een volledige plant geregenereerd kan worden. Uniforme verveelvoudiging op grote schaal van deze gewassen wordt bereikt door middel van biotechnologie, welke gebaseerd is op een verscheidenheid aan in vitro kweektechnieken, inclusief klonale vermeerdering van vegetatief meristematische weefsels en de kweek van morfogene of embryogene cellen en protoplasten.
Bananen vormen belangrijke voedselgewassen in de vochtige en halfvochtige tropische gebieden van de wereld. Met een jaarlijkse productie van meer dan 85 miljoen metrische tonnen in 1994 zijn bananen de meest belangrijke fruitgewassen wereldwijd en dragen zeer significant bij aan de voedselzekerheid in ontwikkelingslanden. Meer dan 10% van de wereldproductie met een waarde van meer dan 4 biljoen Amerikaanse dollar komen terecht in de internationale exporthandel en genereren een enorme bron van inkomsten voor derde-wereldlanden.
In de afgelopen decaden, hebben afnemende opbrengsten of epidemieën door de verspreiding van virulente ziekten en
EMI1.1
plagen zoals zwarte-vlekkenziekte ("black sigatoka"), fusarium-wilt en de"banana van de banaan en nematoden en bananensnuitkevers geleid tot
<Desc/Clms Page number 2>
toenemende inspanningen voor effectieve gewasbescherming door gebruik van grote hoeveelheden pesticiden. Niet al deze pathogenen kunnen echter behandeld worden met chemi- maliën en het gebruik van grote hoeveelheden pesticiden is niet slechts een last voor het milieu maar leidt eveneens tot het resistent worden van de plagen voor het pesticide.
Als alternatief zijn verscheidene genetische verbeteringsprogramma's gestart om ziekteresistente cultivars te kweken. Bananen zijn echter voedselgewassen die exclusief vegetatief vermeerderd kunnen worden en worden gekenmerkt door een lage mate aan genetische variabiliteit. Conventionele kweek van gecultiveerde bananen blijft eveneens moeilijk door hoge steriliteitsniveaus en polyploidy van de meeste eetbare klonen.
Daarnaast kan slechts een langzame vooruitgang worden verkregen in klassieke kruisingsprogramma's omdat zij aangevangen moeten worden met slecht gekarakteriseerd en niet verbeterde klonen.
Plantweefselkweek en moleculair genetische
EMI2.1
technieken hebben om een aantal van de -,,,, factoren die de traditionele voor bananen- < '-r - -'"-. -. - I'.. , "-' verbetering te overwinnen en zijn zeer wenselijk zowel vanuit een economisch als een milieutechnisch -..... -- standpunt. Deze procedures hangen echter af van een succesvolle regeneratie van planten uit cellen of protoplasten.
Somatische embryogenese is het specifieke type differentiatie dat wordt waargenomen uit cellen of protoplasten. Het is de ontwikkeling van embryoachtige structuren die de typische stadia in de embryogenese van een zygote lijken te hebben hernoemen. Plantenregeneratiemethoden gebaseerd op somatische embryo's omvatten het verschaffen van een celkweek, inductie van embryogenese, het kweken van embryo's en daaropvolgende regeneratie en massale klonale vermeerdering van planten. Voor genetische modificatie is de toevoeging van een genetische transformatie voor plantregeneratie vereist. Voor lange-
<Desc/Clms Page number 3>
termijnopslag van de cellen, protoplasten of embryo's zijn cryopreserveringsmethoden zeer bruikbaar.
Er bestaan verscheidene plantregeneratiemethoden in de stand van de techniek die gebruik maken van somatische embryo's, ofwel afgeleid van celkweken of anderszins.
Zo omvat plantenregeneratie in lange termijn embryogene celsuspensiekweken zoals beschreven door Dhed'a et al. (1991) het kweken van meristematische scalps die zijn gescheiden van een prolifererende scheuttopkweken in een gemodificeerd vloeibaar MS medium dat 5 AM 2, 4-dichloorfenoxyazijnzuur (2, 4-D) en 1 MM zeatine bevat.
Er zijn andere methoden gemeld over de inductie van somatische embryogenese uit alternatieve explantaten zoals onrijpe zygotische embryo's (Cronauer-Mitra en Krikorian, 1988 ; Esealant en Teisson, 1989), en onrijpe mannelijke bloemen (scalant et al., 1994).
De gemiddelde frequentie van somatische embryogenese lag in het bereik van 12-30% en 2-5% voor respectievelijk zygotische embryo-explantaten en mannelijke bloemen, hetgeen efficient genoeg voor het tot stand brengen van embryogene celsuspensies van beide typen explantaten (Marroquin et al., 1993 ; Cote et al., 1996).
Een procedure voor de inductie van celsuspensies uit in vitro rhizome- en bladbasisexplantaten werd eveneens beschreven (Novak et al., 1989).
Hoewel de bovenstaande methoden reproduceerbaar zijn in onafhankelijke laboratoria voor de vorming van regenereerbare embryogene bananencelsuspensies behalve die welke beschreven is door Novak et al. (1989), heeft elk van hen zijn eigen tekortkomingen. Een algemene restrictie aan deze procedures is dat zij slechts kunnen worden toegepast op een beperkte groep bananen. De methode van Marroquin et al. (1993) werkt slechts met een paar, voornamelijk wilde soorten die in staat zijn zaden te zetten en derhalve zygotische embryo's, het explantaat dat voor deze methode vereist is, te vormen. De procedure
<Desc/Clms Page number 4>
die beschreven is door Cote et al. (1996) baseert zieh op de beschikbaarheid van mannelijke bloemen, hetgeen de meeste plantanen uitsluit inclusief de belangrijkste cultivars waarvan de mannelijke bloemen gedegenereerd zijn of totaal niet worden gevormd.
Daarnaast vereist deze methode directe toegang tot het veld en de kwaliteit van de explantaten vertoont seizoensafhankelijkheid.
Terwijl voor testen van virusindexatie bladeren van individuele planten in het veld dubieuze resultaten zal geven met betrekking tot de gezondheidstoestand van de mannelijke bloemen, zijn betrouwbare standaardprotocollen beschikbaar voor het routinematig testen van in vitro planten die zijn afgeleid van de werkwijze die hier wordt beschreven. Tenslotte, hoewel de scaipmethode zoals be-
EMI4.1
schreven door Dhed'a et 91t gebruik maakt van de algemeen en permanent beschikbare in vitro scheuttoppen als startmateriaal, blijkt dit slechts te werken voor een bepaald bereik aan kookbananen, enn plantaan en een wilde diploid, allen waarvan ten minste een set B genoom bevatten (Dhed'a, 1992a).
Deze methode wordt eveneens gekenmerkt door andere nadelen, omvattende lage proliferatiesnelheden of degeneratie van meristematische explantaten en het zwart worden van de kweken door de afgifte van polyfenolsubstanties. Als een resultaat daarvan, kunnen geen hoge kwaliteitsscalps verkregen worden of op zijn best zeer zelden voor initiatie van somatische embryogenese.'Daarnaast vereist de methode een langdurige (tot 6 maanden) kweek in vloeibaar medium, hetgeen de kansen op contaminatie verhoogt door de noodzaak van frequente subkweken.
Het is het doel van de onderhavige uitvinding een algemene methode te verschaffen voor plantregeneratie uit eventueel genetisch getransformeerde cellen, embryo's, protoplasten en dergelijke in Cavendish en andere typen bananen, in welke methode ten minste één van de stappen van celkweek, regeneratie en cryopreservering zoals boven geïdentificeerd verbeterd is in vergelijking met de stappen die voor deze uitvinding werden gebruikt.
<Desc/Clms Page number 5>
Dit wordt bereikt volgens de uitvinding door een plantregeneratiemethode, omvattende het verschaffen van een startmateriaal voor regeneratie en het regenereren van planten uit het startmateriaal.
Het verschaffen van een startmateriaal omvat het in vitro prolifereren van meristemen in aanwezigheid van cytokinines in een concentratie van ten minste 50 MM, bij voorkeur ten minste 100 M. Gewoonlijk zou de deskundige niet een dergelijk hoge concentratie cytokinine voor proliferatie gebruiken omdat hij/zij zou verwachten dat dit phytotoxisch is.
De aanname dat hoge concentraties cytokinine phytotoxisch zouden kunnen zijn, gaat terug naar de oorsprong van plantweefselkweek. In een in vitro biobepaling vond Letham (1967) bijvoorbeeld dat 50 M zeatine of kinetine de groei van wortelphloemexplantaten sterk remt.
Overeenkomende resultaten werden verkregen in een andere biotest die gebruik maakt van tabakcalluskweken door de onderzoeksgroep van Skoog, een van de pioniers in plantweefselkweek (Leonard et al., 1969). In feite vertonen cytokinines in deze hoge concentraties een male van groeiremming die vergelijkbaar was met wat later werd verkregen door cytokinine-antagonisten (Skoog & Schmitz, 1973).
Dit effect wordt eveneens gedemonstreerd zelfs in banaan toen Dhed'a (1992a, 1992b) 100 M benzyladenine toepaste gedurende niet meer dan vijf subkweken en degeneratie van meristeemkweken waarnam. Dit is allemaal niet verrassend omdat veelvuldige studies aantonen dat hoge concentraties cytokinine, in het bijzonder benzyladenine, een remmend effect hadden op de ademhaling van de cellen (Miller, 1979) door remming van succinaatoxidatie in plantmitochondrium (Ralph & Wojcik, 1982 ; Chauveau & Rousseaux, 1996).
Deze waarnemingen verklaren eveneens waarom cytokinineconcentraties van meer dan 800 M toegediend zijn aan een grote verscheidenheid aan plantensoorten slechts in de vorm van een puls, dat wil zeggen gedurende een beperkte tijdsperiode die varieerde van 2
<Desc/Clms Page number 6>
minuten tot 4 uur (Goldfarb, 1991 ; Klerk et al., 1996 ; Drake et al., 1997).
In tegenstelling tot deze bevindingen werd volgens de uitvinding gevonden dat de meeste bananen in vitro kweken goed groeien na langdurige incubatie (meer dan 6 maanden) in de aanwezigheid van ten minste 100 AM van verschillende cytokinines maar slechts wanneer zij geselecteerd zijn op hoogprolifererend en hoogmeristematische weefsels. Bovendien werd gevonden dat deze geselecteerde kweken in feite een dergelijk hoge concentratie vereisen voor de initiatie van meristematische globulen die geschikt zijn voor somatische embryogenese.
Bij voorkeur wordt deze proliferatiestap gecombineerd met een rigoureuze selectie op hoog meristematisch weefsel. Een dergelijke selectie bestaat uit het herhaald verwijderen van niet-regenereerbaar en niet- levensvatbaar weefsel en regelmatige subkweek van het overblijvende levensvatbare en bij voorkeur meristematische weefsel voor de productie van hoge dichtheid-mens- tematische zones met een"bloemkoolachtig"uiterlijk.
In een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt de stap van de regeneratie van planten geinitieerd door inductie van somatische embryogenese op halfvast medium. Op dit medium worden geen subkweken uitgevoerd.
Het voordeel van een halfvast inductiemedium in plaats van een vloeibare is dat het sneller is, selectief, minder tijd en ruimte innemend en dat een lager risico is dat het gecontamineerd zal worden. Wanneer een vloeibaar medium gebruikt wordt voor inductie worden embryogene cellen verdund en dit vereist een extra verrijkingsstap die veel tijd vergt. De stap van inductie van embryogenese is niet beperkt tot gebruik samen met de bovenbeschre-
EMI6.1
... ven werkwijze voor het verschaffen van startmaterialen voor regeneratie in de vorm van celsuspensies, maar kan eveneens gebruikt worden met kweken die verschaft zijn door enig andere methode.
De meristemen zijn bijvoorbeeld scheuttoppen, maar de uitvinding is niet beperkt tot scheuttoppen.
<Desc/Clms Page number 7>
Een geoptimaliseerde proliferatie van in vitro meristemen voorafgaand aan de bereiding van een scalp en het gebruik van hoge-kwaliteitsscalps resulteert in embryogene respons in een ruime verscheidenheid aan bananencultivars. Derhalve elimineert deze procedure genoomafhankelijkheid en vermindert in belangrijke mate de cultivar-afhankelijke beperkingen die inherent zijn aan de gepubliceerde methoden zoals boven uiteengezet.
Daarnaast is de gemiddelde frequentie van somatische embryogenese (15-80%) ten minste gelijk of hoger dan welke verkregen worden met zygotische embryo's of met onrijpe mannelijke bloemen.
Verder wijkt volgens de uitvinding de regeneratie van planten uit eventueel getransformeerde cellen in kweek af van het eerder gebruikte regeneratieproces. De nieuwe methode is een vereenvoudigd driestapsproces waarin embryogene cellen op een halfvast medium gehouden worden, hetgeen resulteert in hoger plant regeneratiefrequenties dan vroeger.
De plantenregeneratiemethode van de uitvinding kan verder een eerdere of intermediaire cryopreserveringsstap bevatten, ofwel voorafgaand aan of na het verschaffen van het startmateriaal, welke cryopreserveringsstap de toevoeging. omvat van sucrose aan het materiaal dat gecryopreserveerd moet worden in een concentratie van ten minste 0, 3 M. Het materiaal dat gecryopreserveerd moet worden kan het startmateriaal zijn, dat wil zeggen de prolifererend kweken, van de suspensiebereidingsmethode. In dat geval wordt de toevoeging van sucrose daaraan bereikt door het prekweken van de meristeem op media die hoge sucroseconcentraties bevatten. Deze cryobeschermende stap wordt gevolgd door snel invriezen.
In een alternatief geval kan het materiaal dat gecryopreserveerd moet worden het eindproduct van deze methode zijn, dat wil zeggen embryogene celsuspensies, en wordt de toevoeging van sucrose daaraan bereikt door een gecombineerde behandeling met sucrose en dimethylsulfoxide. Deze cryobe-
<Desc/Clms Page number 8>
schermde suspensies worden onderworpen aan langzaam invriezen.
De kweekmethode volgens de uitvinding kan niet slechts gebruikt worden om embryogene celkweken te produceren, maar eveneens voor somatische embryo's en regenereerbare protoplasten die geschikt zijn voor genetische transformatie door elektroporatie en kan eveneens worden toegepast op somatische hybridisatie.
De nieuwe of geoptimaliseerde cryopreserveringsprotocollen voor lange-termijnopslag van zowel prolifererende kweken als embryogene celsuspensies kan eveneens worden gebruikt in combinatie met andere plantregeneratiestappen dan die welke hiervoor beschreven zijn of als zodanig. De uitvinding sluit deze mogelijkheden niet uit. De cryopreserveringsmethode is eveneens zeer geschikt voor algemene opslag van kiemplasma.
Eventueel kan elke uitvoeringsvorm van de methode, namelijk een methode met slechts de nieuwe celsuspensiestap, of slechts de inductiestap of beide verder een genetische transformatie van de cellen bevatten voor plantregeneratie. Derhalve wordt het mogelijk de resulterende geregenereerde bananenplanten genetisch te modificeren.
Wanneer gebruik gemaakt wordt van de methode volgens de uitvinding wordt het mogelijk om in het laboratorium cellen van alle belangrijke bananengroepen genetisch te manipuleren door het toevoegen van de genetische transformatiestap voor plantregeneratie. Een voorkeurstransformatiemethode te gebruiken in de genetische modificatiestap in de regeneratiemethode volgens de uitvinding wordt beschreven door Sägi. et al. in Bio/Technology 13,481-485 (1995).
In deze aanvrage zijn de volgende definities van toepassing zoals onder uiteengezet :
Bananen : dessert-, kook-, hoogland-, bier-, sier-en textielbananen evenals plantanen, eveneens gezamenlijk benoemd onder de genusnaam Musa. Van eetbare bananen wordt gedacht dat ze zijn afgeleid van waar-
<Desc/Clms Page number 9>
schijnlijk onafhankelijke inter-en intraspecifieke hybridisatiegebeurtenissen waarbij twee wilde diploide species betrokken zijn, M. acuminata en M. balbisiana. De genoomsamenstelling van deze twee soorten wordt aangeduid met respectievelijk AA en BB. Dientengevolge worden afhankelijk van hoe de genomen van deze wilde soorten gecombineerd werden de natuurlijke triploide hibriden gekenmerkt door verschillende genoomsamenstellingen.
Bijvoorbeeld, dessert-en hooglandbananen-meestal AAA, kookbananen-meestal ABB, plantanen-AAB, etc. Ongeveer 10% van de wereldbananenproductie komt terecht in de internationale exporthandel en wordt gedistribueerd als dessertbanaan. Verreweg de meest wijdverspreide groep van dessertbananen wordt Cavendish genoemd, waarbij de com- mereiële klonen Grande Naine en Williams worden genoemd.
Platanen zijn basisvoedsel voor ongeveer 100 miljoen mensen omdat zij rijk zijn aan koolhydraten en vers, gekookt of gebakken, geconsumeerd kunnen worden. Van de plantanen zijn de cultivars Agbagba/Harton en Dominico Harton de belangrijkste terwijl onder kookbananen de cultivars Bluggoe en Pisang Awak zeer algemeen zijn.
Cel-en weefselkweek : een complex proces onder steriele of in vitro omstandigheden dat de stappen bevat van (i) de productie van hoogprolifererende scheuttopkweken waaruit embryogenese competente scalps worden afgeleid, (ii) in vitro kweek van scalps tot vorming van embryogene kweken, en (iii) daaropvolgende instandhouding van celsuspensies.
Cytokinines : een groep van plantengroeisubstanties (hormonen) die plantfysiologische processen beinvloeden, zowel in de natuur als in cel-en weefselkweken. Op het cellulaire niveau en de aanwezigheid van andere plantenhormonen, in het bijzonder auxines, stimuleren zij celdeling en bepalen de richting van celdifferentiatie. Op het weefselniveau induceren cytokinines scheutvorming, chloroplastontwikkeling en bladuitbreiding en vertragen zijn bladveroudering. Op het moleculaire niveau wordt hun werking nog niet goed begrepen. Hoewel
<Desc/Clms Page number 10>
een ruime verscheidenheid aan substanties cytokinineachtige activiteiten vertoont, worden gewoonlijk twee belangrijke groepen onderscheiden : (i) N'-gesubstitueerde adeninederivaten en (ii) gesubstitueerde fenylureas.
De eerste groep bevat de meeste natuurlijk voorkomende cytokinines zoals zeatine, dihydrozeatine, isopentenyladenine en hun ribosiden of glycosylconjugaten evenals synthetische verbindingen zoals kinetine, 6-benzyladenine en 6-benzyladenosine. Thidiazuron en N, N'-difenylureum en hun derivaten zijn de typische voorbeelden van gesubstitueerde fenylureas.
Explantaat : een orgaan, een weefsel of cellen afgeleid van een plant en in vitro gekweekt met het doel een plantencel-of weefselkweek te starten.
Initiatie : de initiële cellulaire proliferatie of morfogene ontwikkeling die uiteindelijk resulteert in het vestigen van een cel-of weefselkweek uit een explantaat.
Meristeemkweek : de in vitro kweek van scheutmeristemen.
Regeneratie : een morfogene respons op stimuli, hetgeen resulteert in een productie van organen, embryo's of volledige planten uit cel-of weefselkweken.
Cryopreservering : een werkwijze voor de langetermijnopslag van cellen en weefsels, gebaseerd op de onderbreking van metabole activiteiten in cellen door de toepassing van ultralage temperaturen, zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid.
Genetische transformatie : de unidirectionele overdracht en inbouw van vreemd gezuiverd of recombinant DNA in het genoom van plantencellen voor de productie van transgene planten is genetische transformatie een extra stap voorafgaand aan regeneratie.
Protoplast : een plantencel waarvan de celwand verwijderd is.
Somatische embryogenese : de werkwijze van initiatie en ontwikkeling van embryo's in vitro uit somatische cellen en weefsels.
<Desc/Clms Page number 11>
Embryogene cellen : cellen die zieh zullen ontwikkelen tot somatische embryo's na overbrengen op het geschikte regeneratiemedium.
Embryogene kweek : een plantencel-of weefselkweek die in staat is somatische embryo's te vormen en planten te regeneren via somatische embryogenese. Embryogene kweken van bananen bestaan uit een massa embryogene cellen, vroege-stadia somatische embryo's en weefsels die dergelijke cellen en embryo's produceren.
Somatisch embryo : gevormd tijdens het proces van somatische embryogenese of na het overbrengen van embryogene cellen en weefsels naar media die plantregeneratie uit embryogene cellen mogelijk maken.
Vroeg-stadium somatisch embryo : morfologisch gelijk aan onrijpe zygotische embryo's. In deze context verwijzen dergelijke embryo's naar preglobulaire, globulaire embryo's en embryo's in de vroege stadia van zaadlobvorming.
Plantje : een kleine plant afgeleid van een ontkiemen somatisch embryo.
Beworteling : het ontspruiten van de kiemwortel of wortel uit een somatisch embryo.
Hoogprolifererend meristeem : in scheuttopkweken betekent dat hoge aantallen secundaire meristemen worden gevormd zonder enig verdere scheutuitgroei.
Scalp : een explantaat afgeleid van prolifererende scheuttopkweken door het afnemen van de bovenste 2 tot 6 mm laag van een klomp van prolifererende scheutmeristemen.
Hoge-kwaliteitsscalp : een scalp bereid uit scheuttopkweken met een bloemkoolachtig uiterlijk en competent voor inductie van somatische embryogenese.
De verschillende stappen van de onderhavige uitvinding zullen verder geillustreerd worden in de volgende voorbeelden die op geen enkele wijze bedoeld zijn om de uitvinding te beperken.
VOORBEELDEN
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
VOORBEELD 1 Productie van hoog-prolifererende meristemen van banaan uit in vitro scheuttoppen Dit voorbeeld beschrijft een verbeterde methode om hoog-prolifererende in vitro scheuttopkweken van banaan te produceren, welke resulteren in embryogenese competente scalps.
In vitro scheuttopculturen van banaan worden gestart zoals beschreven door Banerjee et al. (1985) en overgebracht naar een proliferatiemedium dat bestaat uit een standaard basaal plantengroeimedium, inclusief maar niet beperkt tot die van Schenk en Hildebrandt (1972) of Murashige en Skoog (1962, MS medium) en aangevuld met (i) 0,5 tot 2, M (IAA) en bij voorkeur in een concentratie van 1 M, (ii) 50 AM tot 250 AM cytokinine, zoals zeatine, dihydrozeatine, isopentenyladenine en hun ribosiden, kinetine en benzyladenosine, bij voorkeur benzyladenine (BAP) en bij voorkeur in een concentratie van 100 M, (iii) 2% tot 4% (w/v) van een suiker gekozen uit de groep sucrose, glucose, maltose, fructose of combinaties daarvan, bij voorkeur sucrose in een voorkeursconcentratie van 3% (w/v), en tot stollen gebracht met 0, (w/v) Gelrite. Dit proliferatiemedium wordt p4 genoemd.
Meristeemkweken worden gegroeid bij ongeveer 240C tot ongeveer 30OC, en bij voorkeur bij 270C onder fluorescerend licht bij ongeveer 20 einstein/m/s tot ongeveer 80 einstein/m/s Fotosynthetisch Actieve Straling (PAS) en bij voorkeur bij 50 einstein/m2/s PAS in standaard in vitro kweekcontainers, bij voorkeur in 150 ml glastestbuizen gevuld met ongeveer 18 ml tot ongeveer 25 ml medium p4. De lichtperiode van de kweek is ongeveer 12 uur tot ongeveer 24 uur en bij voorkeur ongeveer 16 uur.
Onder deze omstandigheden worden de kweken geincubeerd en elke 1 tot 3 maanden gesubkweekt. Hoogprolifererende delen (zie fig. 1A) met worden slechts verkregen na een rigoureuze selectie voor elke subkweek. De criteria voor deze selectie zijn als
<Desc/Clms Page number 13>
mMvolgt : (i) selectie van explantaten met een grootte van 0, 4 tot 2, 3 cm2 en bij voorkeur 0, 5 cm2, (ii) verwijdering van rhizomatisch cormusweefsel en zwart, geoxideerde weefselgebieden. Het aantal subkweken op medium p4 ligt tussen 1 tot 10 afhankelijk van de cultivar, totdat prolifererende kweken, die geschikt zijn voor de inductie van somatische embryogenese worden verkregen. Deze prolifererende kweken bevatten veel kleine scheuttoppen die een'bloemkoolachtig'uiterlijk geven (fig. 1B).
Scalps (zie voorbeeld 2) die 2 tot 20 kleine scheutmeristemen dragen (fig. IC) worden bereid uit dergelijke kweken.
Een prekweek op medium p4 verbetert de in vitro proliferatiesnelheden van alle tot nu toe geteste cultivars (tabel 1), inclusief maar niet beperkt tot : - Cavendish (AAA) dessertbananen : Williams, Grande
Naine, Cavendish 901 - Gros Michel (AAA) dessertbananen : Gros Michel, High- gate
AAA hooglandbananen : Igitsiri, Nakitengwa
AAB dessertbananen : Prata, Lady Finger, Silk
EMI13.1
AAB Three Hand Planty, Bise.
ABB Cardaba, Saba, Pisang Awak AA eetbare cultivar plantanen : Agbagba/Harton,AB eetbare cultivar : Kamaramasenge, Kisubi
BB wilde diploid : Musa balbisiana Tani
Een geschikte prekweek met continue selectie van hoogprolifererende meristemen op het proliferatiemedium p4 zoals boven beschreven is de meest kritische stap om hoogprolifererende kweken met'bloemkoolachtig'uiterlijk (fig. 1B) te verkrijgen in een grote verscheidenheid aan cultivars. Het p4 medium maakt hoge proliferatiesnelheden in tot 10 subkweekcycli mogelijk en de resulterende kweken kunnen direct gecryopreserveerd worden (voorbeeld 6).
Deze nieuwe methode, welke (i) drastisch in vitro proliferatiesnelheden verbetert, (ii) resulteert in embryogenese competente explantaten en (iii) minder
<Desc/Clms Page number 14>
gevoelig is voor zwart worden van het weefsel is geoptimaliseerd voor banaan, maar is mogelijk toepasbaar op de orde van de Zingiberalen (bijvoorbeeld Ensete spp., Heliconia spp., Canna spp., Strelitzia spp., Zinqiber spp. ) en andere monocotyle soorten zoals palmen en cocojams.
VOORBEELD 2 Inductie van somatische embryogenese in bananen uit scalps
Dit voorbeeld toont de inductie van embryogene kweek op halfvast medium.
Scalps worden bereid voor geoptimaliseerde in vitro bananenmeristeemkweken (zie voorbeeld l) door de bovenste 2 mm tot 6 mm laag van klompen van 2 tot 20 prolifererende scheutmeristemen te nemen. Scalps van ongeveer 1 mm bij ongeveer 1 mm tot ongeveer 7 mm bij ongeveer 7 mm en bij voorkeur 3 mm bij 3 mm worden geinduceerd in standaard in vitro kweekcontainers (zie voorbeeld l) gevuld met halfvaste inductiemedia bestaande uit standaard basaal plantengroeimedium, bij voorkeur halfversterkte MS medium aangevuld met (i) 4 tot 20 M auxine, bij voorkeur 2, 4-D en bij voorkeur in een concentratie van 5 MM, (ii) 0 tot 2 UM cytokinine, bij voorkeur zeatine, en bij voorkeur in een concentratie van 1 MM, (iii) 2% tot 6% (w/v)
van een suiker gekozen uit de groep sucrose, glucose, maltose, fructose of combinaties daarvan, bij voorkeur sucrose, in een voorkeursconcentratie van 3% (w/v) en tot stolling gebracht met 0, 2% (w/v) Gelrite. Dit inductiemedium wordt afgekort als ZZ medium.
De scalpkweken worden gegroeid onder de lichtomstandigheden gedefinieerd in voorbeeld 1 en bij een temperatuur tussen ongeveer 180C en ongeveer 30 C, bij voorkeur bij 270C en zonder subkweek gehouden tot de ontwikkeling van een embryogene kweek (fig. 1D) na 5 tot 30 weken van kweek afhankelijk van de cultivar.
De substitutie van vloeibaar medium door halfvast inductiemedium induceert een embryogene respons in
<Desc/Clms Page number 15>
een grote verscheidenheid aan bananencultivars inclusief maar niet beperkt tot Cavendish dessertbananencultivars (tabel 1) en vermindert de inductietijd. De instandhouding van scalpkweken zonder subkweek is significant effectiever in vergelijking met frequente verversingen en daarnaast vermindert het het risico van contaminatie.
De scalp-afgeleide embryogene kweken bevatten vroege-stadia somatische embryo's en embryogene cellen, welke geregenereerd kunnen worden zoals beschreven in voorbeeld 4. Elk ander somatisch bananenexplantaat geschikt voor inductie van somatische embryogenese kan de scalp in de bovenbeschreven methode vervangen.
Scalp-afgeleide embryogene kweken worden geinduceerd in een frequentie van 15-80% in het volgende ruime bereik aan cultivars : - Cavendish (AAA) dessertbananen : Williams, Grande
Naine, Cavendish 901 - Gros Michel (AAA) dessertbananen : Gros Michel, High- gate
EMI15.1
- Igitsiri, Nakitengwa AAB Prata, Lady Finger AAB Agbagba/Harton, Three Hand Planty,
Bise Egome-1, Dominico Harton
ABB kookbananen : Bluggoe, Cardaba, Saba - AA eetbare cultivar : Guyod - AB eetbare cultivar : Kamaramasenge, Kisubi - BB wilde diploid : Musa balbisiana Tani
De lijst van succesvolle cultivars hierboven geeft aan dat er weinig cultivar-afhankelijkheid is en dat de verbeterde scalpmethode in het algemeen toepasbaar is op banaan, inclusief de commerciële Cavendish-type dessertbananen.
De methode zou mogelijk kunnen worden uitgebreid naar verwante soorten (zie voorbeeld 1).
VOORBEELD 3 Productie en instandhouding van lange-termijn bananenembryogene celkweken en celsuspensies
<Desc/Clms Page number 16>
Dit voorbeeld illustreert de proliferatie van embryogene celkweken op halfvaste media en het vestigen van embryogene celsuspensies daaruit in vloeibaar medium.
Voorafgaand aan de overdracht naar vloeibare instandhoudingsmedia, worden embryogene kweken eventueel overgebracht naar vers halfvast ZZ medium (voor samenstelling zie voorbeeld 2) in standaard in vitro kweekcontainers, bij voorkeur petrischalen of 150 ml glazen testbuizen gevuld met 18 ml tot 25 ml ZZ medium. Het ZZ medium maakt eveneens een snelle proliferatie mogelijk van embryogeen celmateriaal. Embryogene bananenkweken worden gesubkweekt en als zodanig tot 8 maanden in stand gehouden.
Embryogene kweken geinduceerd zoals beschreven in voorbeeld 2 of in stand gehouden zoals hierboven worden overgebracht naar een vloeibaar instandhoudingsmedium dat identiek is aan het inductiemedium ZZ (voorbeeld 2). Per ml medium wordt 0, 02 g tot ongeveer 0, 10 g en bij voorkeur 0, 04 g vers gewicht embryogeen celmateriaal geinoculeerd. Na 2 tot 20 subkweken van elk 10 dagen worden embryogene celsuspensies (fig. 2A) gevestigd met een maandelijkse vermenigvuldigingssnelheid van 2 tot 8 (fig. 2B).
Deze embryogene celsuspensies worden geregenereerd tot bewortelde planten in een tijdspanne van 3 maanden tot 8 maanden (voorbeeld 4). Embryogene celsuspensies worden in Erlenmeyer flessen in stand gehouden op een roterende schudinrichting bij ongeveer 40 rpm tot ongeveer 120 rpm en bij voorkeur bij 70 rpm, en gegroeid onder de licht-en temperatuuromstandigheden gedefinieerd in voorbeeld 1. De gevestigde embryogene celsuspensies worden ongeveer elke 10 dagen tot ongeveer elke 30 dagen en bij voorkeur ongeveer elke 14 dagen gesubkweekt.
Scalp-afgeleide regenereerbare embryogene celsuspensies worden verkregen in maar niet zijn beperkt tot de volgende cultivars (tabel l) :
<Desc/Clms Page number 17>
Cavendish (AAA) dessertbananen : Williams, Grande
Naine
AAA hooglandbananen : Igitsiri, Nakitengwa
AAB dessertbananen : Prata
AAB plantanen : Agbagba/Harton, Three Hand Planty,
Bise Egome-1
ABB kookbananen : Bluggoe, Cardaba, Saba
AB eetbare cultivar : Kamaramasenge, Kisubi
BB wilde diploid : Musa balbisiana Tani Scalp-afgeleide bananen embryogene celsuspensies kunnen tot 5 jaar in stand gehouden worden zonder hun morfogeen potentieel te verliezen.
Deze embryogene celsuspensies worden succesvol gecryopreserveerd. (voorbeeld 7) en hebben bewezen meest geschikt te zijn voor andere toepassingen zoals isolatie van regenereerbare protoplasten (voorbeeld 5) en genetische transformatie (voorbeelden 8 en 9).
Tabel 1 Lijst van bananencultivars waaruit meristeemkweken met 'bloemkoolachtig'uiterlijk worden verkregen. Voor elk van deze cultivars wordt aangegeven of dergelijke kweken geresulteerd hebben in de vestiging van embryogene kweken (EC) en regenereerbare celsuspensies (ECS)
<Desc/Clms Page number 18>
EMI18.1
<tb>
<tb> Groep <SEP> Cultivar <SEP> EC <SEP> ECS <SEP>
<tb> Cavendish <SEP> (AAA) <SEP> Williams <SEP> + <SEP> +
<tb> dessertbananen <SEP> Grande <SEP> Name <SEP> + <SEP> +
<tb> Cavendlsh <SEP> 901 <SEP> + <SEP>
<tb> Gros <SEP> Michel <SEP> (AAA) <SEP> Gros <SEP> Michel <SEP> +
<tb> dessertbananen <SEP> Htghgate <SEP> +
<tb> AAA <SEP> hoogland <SEP> Igltsln <SEP> + <SEP> +
<tb> bananen <SEP> Nakitengwa <SEP> + <SEP> +
<tb> AAB <SEP> dessertbananen <SEP> Prata <SEP> + <SEP> +
<tb> Lady <SEP> Finger <SEP> +
<tb> Silk.
<SEP> - <SEP>
<tb> AAB <SEP> plantanen <SEP> Agbagba/Harton <SEP> + <SEP> +
<tb> Three <SEP> Hand <SEP> Planty <SEP> + <SEP> +
<tb> Bise <SEP> Egome-1 <SEP> + <SEP> +
<tb> Dominico <SEP> Harton <SEP> + <SEP> +
<tb> ABB <SEP> kookbananen <SEP> Bluggoe <SEP> + <SEP> +
<tb> Cardaba <SEP> + <SEP> +
<tb> Saba <SEP> + <SEP> +
<tb> Pisang <SEP> Awak <SEP> NB <SEP> NB
<tb> AA <SEP> eetbare <SEP> cultlvar <SEP> Guyod <SEP> NB <SEP> NB
<tb> AB <SEP> eetbare <SEP> cultlvars <SEP> Kamaramasenge <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> Kisubi
<tb> BB <SEP> wilde <SEP> diploid <SEP> M. <SEP> balblsiana <SEP> + <SEP> +
<tb>
+ = succes = geen succes NB = met bepaald
<Desc/Clms Page number 19>
VOORBEELD 4 Plantregeneratie uit embryoqene celkweken van banaan.
Plantregeneratie uit banaanembryogene celsuspensie is gebaseerd op het meerstaps protocol beschreven door Dhed'a et al. (1991) met de modificaties zoals hieronder beschreven.
Stadium 1 : De vorming van globulaire tot vroeg-zaadlobbig stadium somatische embryo's uit embryogene suspensiecellen
De vorming van globulaire tot vroeg-zaadlobbig stadium somatische embryo's uit embryogene cellen in de suspensiekweek wordt verkregen op een standaard plantengroeimedium, bij voorkeur het standaard MS medium aangevuld met 2% tot 4% (w/v) van een suiker gekozen uit de groep sucrose, glucose, maltose, fructose of combinaties daarvan, bij voorkeur sucrose, in een voorkeursconcentratie van 3% (w/v), 0 mg/l tot 100 mg/l en bij voorkeur 100 mg/l myo-inositol, en 0, 2% (w/v) Gelrite. Dit medium dat niet wordt aangevuld met groeiregulatoren wordt basaal regeneratiemedium genoemd.
Globulaire tot vroeg-zaadlobbig stadium embryo's worden continu gevormd gedurende een periode van 1 - tot 3 maanden. Voorafgaand aan het uitplaten worden de celsuspensies gezeefd door een zeef van 500 Um en grondig gewassen met een vloeibaar hormoonvrij plantengroeimedium, bij voorkeur het basale regeneratiemedium zoals boven gedefinieerd. Per test buis wordt een druppel (0, 05 ml) van een uitgezakte celsuspensie toegevoegd. In petrischalen worden 0, 05 ml tot 0, 5 ml van een uitgezakte celsuspensie gebruikt voor regeneratie.
Stadium 2 : Scheutvorming
Stadium 1 somatische embryos geregenereerd uit celsuspensies of direct verkregen uit de embryogene kweek worden vervolgens individueel of in kleine groepen overgebracht naar standaard in vitro kweekcontainers en bij
<Desc/Clms Page number 20>
voorkeur 150 ml glazen testbuizen gevuld met het basale regeneratiemedium aangevuld met 0 AM tot 10 AM cytokinine, bij voorkeur BAP en bij voorkeur in een concentratie van 2 AM. Toevoeging van cytokinines aan het basale regeneratiemedium verhogen daaropvolgend scheutvorming.
De kweken worden geincubeerd onder de standaard groeiomstandigheden (voorbeeld 1) gedurende 1 tot 3 maanden.
Stadium 3 : Beworteling
Eén tot drie cm lange scheuten worden overgebracht naar standaard in vitro kweekcontainers en bij voorkeur naar 150 ml glazen testbuizen gevuld met 18 ml tot 25 ml van een bewortelingsmedium bestaande uit een basaal regeneratiemedium aangevuld met (i) 1 M tot 3 AM auxine, bij voorkeur IAA en bij voorkeur in een concentratie van 1 M, en (ii) 1 AM tot 3 MM cytokinine, bij voorkeur BAP en bij voorkeur in een concentratie van 1 AM. Wortelvorming vindt gewoonlijk plaats binnen 1-2 maanden kweek onder de standaard groei-omstandigheden (voorbeeld 1). Meer dan 90% van de planten van 10-15 cm hoogte die geregenereerd waren met deze procedure overleven de overgang naar de volle grond.
Het bovenbeschreven regeneratieprotocol is superieur aan dat wat beschreven is door Dhed'a et al.
(1991) aangezien het een stap elimineert en het gebruik van vloeibare media vermijdt. Daarnaast resulteert dit protocol in een hoge frequentie van plantenregeneratie welke valt tussen 7 103 tot 7 104 planten per ml uitgezakt celvolume van cellen. De frequentie van somaklonale variatie tijdens vegetatieve ontwikkeling van planten geregenereerd uit scalp-afgeleide embryogene kweken en celsuspensies overschrijdt de 2% niet (tabel 2), hetgeen een gunstige vergelijking is met de controleplantpopulaties afgeleid van klassieke micropropagatie.
Vanwege hun hoge regeneratiepotentieel en de lage mate van somoklonale variatie kunnen de scalp-afgeleide embryogene kweeksuspensies eveneens worden toegepast voor grote-schaal klonale vermeerdering in banaan.
<Desc/Clms Page number 21>
Dit zou bereikt kunnen worden door massacultivering in bioreactoren, het grote aantal embryo's verkregen door somatische embryogenese kan eveneens gebruikt worden voor de productie van kunstmatige zaden (Redenbaugh et al., 1986) door hen in te kapselen in alginaat-of agarkor- rels.
Tabel 2 Percentage van "off-type" planten geregenereerd uit embryo's direct afgeleid van embryogene kweken (EC) of van embryogene celsuspensies (ECS) van drie bananencultivars. Controleplanten worden geregenereerd uit scheuttopkweken (STC). Evaluaties worden uitgevoerd in de vegetatieve ontwikkelingsfase.
EMI21.1
<tb>
<tb>
Cultivar <SEP> Oorsprong <SEP> Aantal <SEP> Aantal <SEP> % <SEP> "off- <SEP>
<tb> Cultivar <SEP> Oorsprong <SEP> Aantal <SEP> Aantal <SEP> % <SEP> "offplanten <SEP> "off-types" <SEP> types"
<tb> Williams <SEP> STC <SEP> 20 <SEP> 3 <SEP> 15. <SEP> 0
<tb> ECS <SEP> 110 <SEP> 2 <SEP> 1. <SEP> 8 <SEP>
<tb> Agbagba/Harton <SEP> ECS <SEP> 105 <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 0 <SEP>
<tb> Three <SEP> Hand <SEP> STC <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 0 <SEP>
<tb> Planty <SEP> EC <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 0 <SEP>
<tb> ECS <SEP> 50 <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 0
<tb>
VOORBEELD 5 Isolatie van protoplasten uit embryogene bananencelsuspenses en daaropvolgende regeneratie van planten door somatische embryoqenese
Voor granen, zijn embryogene celsuspensies de enige bron geweest voor regenereerbare protoplasten.
Op overeenkomstige wijze hebben embryogene celsuspensies van bananen bewezen geschikt te zijn voor isolatie van proto-
<Desc/Clms Page number 22>
plast met een capaciteit voor plantenregeneratie (Panis et al., 1993). Deze regenereerbare protoplasten zijn geschikt voor genetische transformatie door elektroporatie (voorbeeld 6) en kunnen eveneens gebruikt worden voor somatische hybridisatie.
Protoplastisolatie
Eén tot drie weken en bij voorkeur twee weken na hun laatste subkweek worden embryogene cellen van, maar niet beperkt tot, de kookbanaancultivar Bluggoe geconcentreerd tot een gepakt celvolume (PCV) tussen 10%
EMI22.1
en 30% en bij voorkeur 20% (v/v). Eén ml van deze gecon- centreerde suspensie wordt daaropvolgend overgebracht naar 6 ml van een enzymoplossing met cellulose Onozuka R- 10 van Trichoderma viridae, macerozyme R-10 van Rhizopus spp., en pectinase 5S van Asperqillus niger alleen of in combinatie in een concentratie van 0, 1% tot 2, 0%. De enzymoplossing bevat eveneens 7 mM CaC12 H2O, 0, 7 mM NaH2P04 2H2O, 3 mM 2-N-morfolinoethaansulfonzuur en 10% (w/v) mannitol. De pH wordt ingesteld op 5, 8 en de oplossing filter-gesteriliseerd.
De cellen worden geincubeerd bij 40 rpm om op een roterende schudinrichting in het donker gedurende perioden die variëren van 4 tot 24 uur.
Optimale protoplastopbrengsten met gebruik van een 2 weken oude suspensie worden verkregen na een 24-uurs digestie met een combinatie van cellulase en macerozyme en pectinase elk in een concentratie van 1% (w/v) en bereiken zoveel als 70 miljoen protoplasten per ml PCV cellen.
Protoplastzuivering
Na de enzymbehandeling bevat de protoplast bevattende suspensie nog steeds niet gedigesteerde celklonten en celdebris. Daarom wordt de suspensie gewassen door centrifugatie bij 66 g gedurende 5 minuten met 10 ml MS medium zonder plantengroeiregulatoren maar aangevuld met 10% (w/v) mannitol. Vervolgens worden de protoplasten gezuiverd, ofwel door flotatie op 20% tot 25% (w/v)
<Desc/Clms Page number 23>
EMI23.1
sucrose of zeven door een 100-m filter en daaropvolgend door een 25-m filter. Gezuiverde protoplasten worden geteld voor en na zuivering om zuiveringsefficiëntie te bepalen. Celwandafbraak en levensvatbaarheid worden zichtbaar gemaakt met een UV-fluorescente die gebruik maakt van respectievelijk Calcofluor wit en fluorescinediacetaat.
De zuiveringsefficiëntie met de flotatiemethode varieert tussen 15% en 35%, terwijl de zeefmethode resulteert in slechts 0-26% verlies van protoplasten na zuivering.
Protoplastkweek Protoplasten worden geresuspendeerd in dichtheden variërend tussen 105 en 106 protoplasten per ml in halfsterk Murashige en Skoog (MS) medium met 5 AM 2, en 10% (w/v) mannitol. Drie regeneratiemethoden zijn succesvol toegepast.
1/Kweek vast medium Een ml van de verdunde suspensie wordt geplaatst op een halfsterk MS medium met 5 AM 2, 5% (w/v) mannitol en 0, agarose of 0, (w/v) Gelrite (Phytagel, Sigma), met of zonder het afdekken met een zwart gerasterd 0, (Millipore, nOAABG04700).
2/Kweek met voedsellaqen Deze methode is gebaseerd op het principe ontwikkeld door Rhodes et al. (1988). In de petrischaal met een doorsnede van 90 mm, wordt 20 ml van een halfsterk MS medium. aangevuld met 5 AM 2, (w/v) mannitol en 0, (w/v) Gelrite gegoten. Op deze laag wordt 2 ml van de voedsterkweek geplaatst die verkregen wordt door het mengen van 1 ml van een 1-week oude embryogene celsuspensie geconcentreerd tot 5% (v/v) PCV met 1 ml MS medium aangevuld met 5 AM 2, (w/v) mannitol, 200 mg/l myo-inositol, en 1, (w/v) agarose. Bovenop de voedingslaag wordt een zwart Millipore-filter (zie boven) geplaatst en op het filter wordt voorzichtig 1 ml protoplasten gegoten.
3/Kweek
<Desc/Clms Page number 24>
Deze methode lijkt op de eerste. Echter in plaats van 1 ml embryogene celsuspensie wordt 1 ml gepreconditioneerd medium gebruikt. Het gepreconditioneerde medium wordt bereid door het scheiden van het medium van een l-week oude celkweek met een Whatman-filter gevolgd door filtratiesterilisatie.
Twee basale strategieën zijn toepasbaar voor het bereiken van aanhoudende deling (meer dan 50%) in bananenprotoplasten, dat wil zeggen het gebruik van voedingscellen of het uitplaten van protoplasten in zeer hoge (106 protoplast per ml) concentratie. Het laatste is succesvol met elk van de drie toegepaste kweekmethoden.
Vijf weken na inoculate worden microkolonies van gelijke grootte gevormd met ongeveer 100 cellen met embryogene kenmerken gelijk aan embryogene celsuspensies. Deze microkolonies worden overgebracht naar een standaard MS medium zonder plantengroeiregulatoren waar zij zieh ontwikkelen tot somatische embryo's. Bewortelde planten worden vier maanden na protoplastisolatie geregenereerd.
VOORBEELD 6 Cryopreservering van prolifererende meristemen van banaan
Cryopreservering van prolifererende meristemen dient twee doeleinden. Ten eerste kan het startmateriaal voor inductie van embryogene celkweek worden opgeslagen zonder het risico van microbille contaminatie. Ten tweede kunnen transgene scheutkweken veilig worden opgeslagen op de lange termijn. Recentelijk is een cryopreserveringsmethode voor prolifererende meristemen ontwikkeld (Panis et al., 1996), welke bestaat uit een meristeme prekweekstap op media met hoge suikerconcentraties gevolgd door snel invriezen. Kweek na ontdooien vindt plaats op halfvast regeneratiemedium. In dit voorbeeld wordt een verbeterd cryopreserveringsprotocol beschreven met gebruik van vloeibare regeneratiemedia hetgeen resulteert in significant hogere overlevingsgetallen na ontdooien.
<Desc/Clms Page number 25>
Startmateriaal
Voor meristeme cryopreservering, zijn'bloem- koolachtige'prolifererende meristeemkweken vereist (zie voorbeeld 1).
Prekweek
Uit prolifererende meristeemkweken worden witte meristematische klompen van ongeveer 4 mm doorsnede, elk met tenminste 4 apicale meristematische platen uitgesneden en overgebracht naar een prekweekmedium. Dit medium bestaat uit halfvast MS medium aangevuld met 10 AM BAP en 1 AM IAA en verrijkt met sucrose, glucose of fructose of een combinatie van deze suikers tot een eindconcentratie van 0, 3 M tot 0, 6 M, bij voorkeur sucrose en bij voorkeur in een concentratie van 0, 4 M. Deze kweken worden gedurende ongeveer 1 week tot ongeveer 4 weken en bij voorkeur gedurende ongeveer 2 weken onder omstandigheden gehouden die identiek zijn aan die voor normale meristeemkweek (voorbeeld 1).
Cryopreservering en ontdooien
Kleine klompjes van 5-15 mg, met 3 tot 6 meristematische platen worden uitgesneden uit de voorgekweekte knoppen. Bruine weefsels worden verwijderd en slechts het meest gezonde deel zoals wordt aangegeven door een witgele kleur geselecteerd. Deze klompjes worden overgebracht naar 2 ml steriele cryobuizen en direct in vloeibare stikstof ondergedompeld. Elke cryobuis bevat 7 tot 10 klompen. Na opslag in vloeibare stikstof worden de bevroren cryobuizen ontdooid door roeren gedurende 1, 5 minuut in een waterbad van 40 C.
Terugwinning na ontdooien
Ontdooide explantaten worden overgebracht naar 100 ml Erlenmeyer flessen met 30 ml vloeibaar MS medium aangevuld met 10 AM BAP, 1 MM IAA en 3% (w/v) sucrose en op een roterende schudinrichting geplaatst bij ongeveer 40 rpm tot ongeveer 80 rpm en bij voorkeur bij ongeveer
<Desc/Clms Page number 26>
70 rpm. De eerste week na ontdooien worden de kweken gedurende 1 week in het donker geplaatst waarna zij in de kweekkamer geplaatst worden onder standaard groeiomstandigheden. Zes weken na ontdooien wordt de hergroei bepaald onder een binoculaire microscoop. De regeneratiefrequenties van een aantal bananencultivars behorende tot verschillende genoomgroepen worden opgesomd in tabel 3.
Teruggewonnen klompjes worden overgebracht naar testbuizen met een semivast MS medium aangevuld met 1 AM BAP, 1 AM IAA en 3% (w/v) sucrose. Zodra bewortelde planten de bovenkant van de testbuis bereiken, worden zij overgebracht naar de grond.
Tabel 3 Regeneratiefrequenties na cryopreservering van prolifererende meristemen van bananencultivars die tot verschillende genomische groepen behoren
<Desc/Clms Page number 27>
EMI27.1
<tb>
<tb> Groep <SEP> Cultivar <SEP> Regeneratiefrequenties <SEP> (%)
<tb> Cavendish <SEP> (AAA) <SEP> Grande <SEP> Name <SEP> 19. <SEP> 2 <SEP>
<tb> dessertbananen <SEP> Wdliams <SEP> 12. <SEP> 5 <SEP>
<tb> Cavendlsh <SEP> 901 <SEP> 7. <SEP> 4 <SEP>
<tb> AAB <SEP> dessertbananen <SEP> Prata, <SEP> kloon <SEP> 1 <SEP> 53. <SEP> 8 <SEP>
<tb> Prata, <SEP> kloon <SEP> 2 <SEP> 10. <SEP> 0
<tb> Lady <SEP> Finger <SEP> 33. <SEP> 3 <SEP>
<tb> AAB <SEP> plantanen <SEP> Dominico <SEP> Harton <SEP> 42. <SEP> 5 <SEP>
<tb> Agbagba/Harton <SEP> 12. <SEP> 3 <SEP>
<tb> Three <SEP> Hand <SEP> Planty <SEP> 30. <SEP> 0
<tb> ABB <SEP> kookbananen <SEP> Bluggoe, <SEP> kloon <SEP> 1 <SEP> 33.
<SEP> 3 <SEP>
<tb> Bluggoe, <SEP> kloon <SEP> 2 <SEP> 49. <SEP> 1 <SEP>
<tb> Saba <SEP> 68. <SEP> 9 <SEP>
<tb> AA <SEP> eetbare <SEP> cultivar <SEP> Guyod <SEP> 34. <SEP> 4 <SEP>
<tb> AB <SEP> eetbare <SEP> cultivars <SEP> Kamaramasenge <SEP> 20. <SEP> 5 <SEP>
<tb> Klsubi <SEP> 41. <SEP> 3 <SEP>
<tb> BB <SEP> wilde <SEP> diploid <SEP> M. <SEP> balblslana <SEP> Tant <SEP> 29. <SEP> 9 <SEP>
<tb>
VOORBEELD 7
EMI27.2
i Cryopreserverincf
Tijdens langdurige celsuspensiekweek is er altijd het risico dit materiaal te verliezen door microbiële contaminatie, verlies van regeneratievermogen en somaklonale variatie. Het is derhalve belangrijk dit waardevolle materiaal op een veilige manier te bewaren.
Bij ultralage temperaturen (cryopreservering), worden alle metabolen, fysische en chemische processen stil gezet. Als zodanig kan het materiaal veilig opgeslagen worden gedurende onbeperkte periode. Panis et al. (1990)'
<Desc/Clms Page number 28>
beschreven een bevriezingsmethode voor embryogene celsuspensies van de kookbanaancultivar Bluggoe. Echter, generalisering van deze bevriezingsmethode in de richting van embryogene celsuspensies van een groot aantal bananencultivars kan slechts verkregen worden wanneer hoge concentraties sucrose aan het cryobeschermend medium worden toegevoegd. Het onderhavige cryopreserveringsprotocol is ontwikkeld voor het vestigen van embryogene celkweken (voorbeeld 3).
Echter, scalp-afgeleide embryogene kweken (voorbeeld 2) en globulaire, somatische embryo's (voorbeeld 4) kunnen eveneens worden onderworpen aan cryopreservering.
Cryobescherming.
Een gelijk volume van steriel MS-medium met dimethylsulfoxide (DMSO) en sucrose wordt geleidelijk toegevoegd aan een geconcentreerde celsuspensie gedurende een uur tot een uiteindelijk uitgezakt celvolume van 5% tot 15% (v/v), een DMSO-concentratie van 5% tot 15% (v/v)
EMI28.1
en een sucroseconcentratie van 0, M tot 0, M wordt verkregen. De beste resultaten worden bereikt met een. uitgezakt celvolume van 10% (v/v), een DMSO-concentratie van 7, 5% (v/v) en een sucroseconcentratie van 0, 3 M.
Bevriezing, opslag en ontdooien
Anderhalve ml-porties van de cryobeschermde suspensies worden overgebracht naar 2 ml cryobuizen en in een geroerd methanolbad geplaatst. Dit methanolbad koelt
EMI28.2
bij een snelheid van l C/min. Zodra ongeveer tot ongeveer en bij voorkeur ongeveer-7, is be- reikt, worden de cryobuizen gedurende 3 seconden ondergedompeld in vloeibare stikstof om ijskristallisatie te initiëren. Vervolgens worden ze verder gekoeld tot-40 C, na 30 min. bij-40 C worden de cryobuizen ondergedompeld voor opslag in vloeibare stikstof. Vervolgens worden de cryobuizen snel ontdooid in een beker gevuld met steriel water van 400C gedurende ongeveer 1, 5 min. totdat het meeste ijs is gesmolten.
<Desc/Clms Page number 29>
Terugwinning.
Halve ml-porties genomen uit de bevroren-ontdooide cryobuizen worden op steriele filterpapieren geplaatst op halfvast medium ZZ in 90 mm Petri-schalen.
Voor regeneratie van somatische embryo's wordt de bevroren-ontdooide portie gedruppeld op een halfvast MS-medium aangevuld met 1 AM BAP. Gedurende de eerste week na ontdooiing worden de Petri-schalen in het donker gehouden. Cellevensvatbaarheid wordt bepaald door fluorescinediacetaattest waardoor levende cellen zeer heldere fluorescentie vertonen onder UV-belichting. Ontdooide cellen, die op het halfvaste ZZ-medium geplaatst zijn, worden geinoculeerd in vloeibaar ZZ-medium om een embryogene celsuspensie te vormen die vergelijkbaar is met het originele materiaal. De gereinitieerde celsuspensies worden geregenereerd in kweekbuizen met halfvast basaal regeneratiemedium volgens het protocol beschreven in voorbeeld 4.
Deze cryopreserveringsmethode is succesvol voor embryogene celsuspensies van verschillende cultivars die behoren tot verschillende genoomgroepen, inclusief, maar niet beperkt tot, de Cavendish-groep van dessertbananen, de kookbananen, de plantanen en wilde diploïde soorten zoals Musa balbisiana. Aangezien deze groepen een significant bereik van genetische diversiteit in bananen vertegenwoordigen, wordt aangenomen dat deze cryopreserveringsmethode een ruime, zo niet universele, toepasbaarheid biedt.
VOORBEELD 8 Genetische transformatie van bananenprotoplasten Celsuspensies en plasmiden.
Embryogene celsuspensies (ECSs) worden in stand gehouden en gesubkweekt zoals beschreven in voorbeeld 3.
The ECSs worden gedurende ten minste een jaar gekweekt, voorafgaand aan gebruik in de experimenten, en bestaan uit kleine clusters van isodiametrische, cytoplasmarijke cellen.
<Desc/Clms Page number 30>
De plasmiden die gebruikt worden voor transformatie worden vermenigvuldigd in de E. eoli-DH5a-stam.
Plasmide-DNA bereid door alkalische lyse wordt gezuiverd op Qiagen-kolommen (Diagen GmbH). DNA-concentraties worden bepaald door absorptiemetingen bij 260 nm en door gelelektroforese.
Protoplastisolatie,
Isolatie en zuivering van protoplasten uit embryogene celsuspensies wordt gedaan door de procedure, die uiteengezet is in voorbeeld 5, strikt te volgen.
Gezuiverde protoplasten worden geresuspendeerd in elektroporatiebuffer in een concentratie van 1, 25 x 106 protoplasten/ml. De elektroporatiebuffer is samengesteld uit 70 mM kaliumaspertaat, 5 mM calciumgluconaat, 5 mM 2-Nmorfolino-ethaansulfonzuur en 0, 55 M mannitol, de pH waarvan is ingesteld op 5, 8 (Tada et al., 1990). Protoplasten worden geteld door gebruikmaking van een gemodificeerde Neubauer haemocytometer. Volledige verwijdering van de celwand wordt bevestigd door Calcofluor-witkleu- ring, terwijl de levensvatbaarheid van vers geisoleerde of geëlektroporeerde protoplasten routinematig wordt bepaald door kleuring met ofwel fluorescinediacetaat of Evans'Blue.
Transformatieprocedure.
Transformatie van protoplasten door elektroporatie wordt beschreven door Sági et al. (1994). Een 800 go-porte met 106 protoplasten in elektroporatiebuffer wordt in een elektroporatiecuvette geplaatst met een 0, 4 cm opening. Na toevoeging van plasmide-DNA tot een concentratie van 60 g/ml, worden de cuvettes gedurende 10 min. op ijs gezet, en vervolgens geëlektroporeerd met een 960 y-capacitor van een Bio-Rad Gene Pulser'-transfec- tieapparaat of van een equivalent bij een veldsterkte van 800 V/cm. Na elektroporatie worden de cuvettes gedurende 10 min. op ijs gezet en vervolgens 10 min. bij kamertemperatuur.
Protoplasten worden verdund met ZZ-medium
<Desc/Clms Page number 31>
aangevuld met 0, 55 M mannitol tot een concentratie van 105 protoplasten/ml en in het donker geincubeerd bij 24 C. De volgende controles werden gebruikt : (i) monsters geëlektroporeerd met pUC19-plasmide-DNA, (ii) monsters geëlek- troporeerd zonder plasmide-DNA, (iii) niet-geëlektroporeerde monsters geincubeerd met het plasmide-DNA gebruikt voor elektroporatie.
ss-glucoronidase-expressiebepaling.
Voor de histochemische in situ-bepalingen worden protoplasten 48 uur na elektroporatie verzameld, geresuspendeerd in 50 mM natriumfosfaatbuffer, pH 7, 0 en geincubeerd gedurende perioden die variëren van overnacht tot 10 dagen bij 370C in de aanwezigheid van 1 mM X-gluc (5-broom-4-chloor-3-indolyl-ss-D-glucoronide) zoals beschreven door Jefferson (1987). Protoplast-transformatiefrequentie wordt bepaald door het tellen van blauwgekleurde protoplasten en het hiervan relateren aan het totale aantal protoplasten. Twee tot vier interne repeats worden geteld en gemiddeld voor elke behandeling en elk experiment. Gemiddeld 105 protoplasten worden waargenomen voor elke repeat. Het totale aantal behandelde protoplasten wordt onafhankelijk bepaald voor elke repeat.
Kweken van E. coli worden in parallel gebruikt als positieve controles voor de GUS-bepaling.
VOORBEELD 9 Genetische transformatie van embryoqene celsuspensies van banaan Plantmateriaal en kweekcondities.
Embryogene celsuspensies (ECSs) en prolifererende. meristemen of scalps van verschillende bananencultivars, inclusief, maar niet beperkt tot, de Cavendishdessertbanaancultivar Williams (Musa'spp., AAA-groep), en die beschreven in voorbeeld 3 worden gebruikt voor genetische transformatie. Deze ECSs worden gekweekt in ZZmedium (beschreven in voorbeeld 2), op een roterende schudinrichting gehouden zoals beschreven in voorbeeld 3
<Desc/Clms Page number 32>
en ten minste eenmaal, maar bij voorkeur tweemaal, per elke twee weken gesubkweekt. Cellen worden ongeveer 3 tot ongeveer 6 dagen na subkweek en bij voorkeur 4 dagen na subkweek verzameld en gebruikt voor genetische transformatie. Prolifererende meristemen, worden gesubkweekt op medium p4 zoals beschreven in voorbeeld 1 en direct gebruikt voor transformatie.
Scalps worden bereid voor transformatie voor of tijdens inductie van somatische embryogenese zoals uiteengezet in voorbeeld 2.
Bereiding van DNA voor deeltjesbombardement.
Plasmide-DNA wordt geisoleerd uit de E. coliDH5a-stam door standaard grote-schaalzuiveringsmethoden met gebruik van alkalische lyse en polethyleenglycolprecipitatie of Qiagen-kolommen. Aangezien wij herkennen dat een uniforme en reproduceerbare bekleding van de deeltjes een sleutelfactor is voor succesvolle transformatie, worden voor elk bombardement. vers bereide en beklede deeltjes gebruikt. Bekleding van wolfraamdeeltjes (Sylvania M-17) wordt als volgt uitgevoerd.
Ongeveer 2 mg tot 4 mg deeltjes, en bij voorkeur 3 mg deeltjes, worden vermengd met ongeveer 3 Mg DNA tot ongeveer 6 Mg DNA, en bij voorkeur 5 Mg DNA (in een concentratie van ongeveer 0, 6 gg/gl tot ongeveer 1, 2 g/l, maar bij voorkeur bij 1, 0 Mg/gl) en onder heftig vortexen wordt een gelijk volume van 1 M van calciumnitrat (tussen Ph 4, 0 en Ph 10, 0, maar bij voorkeur bij ongeveer Ph 5, 0) toegevoegd, vervolgens verder gevortexed gedurende 2 min. tot ongeveer 4 min., en bij voorkeur gedurende 3 min. Vervolgens worden de beklede deeltjes gewassen met 70% en 100% (v/v) ethanol.
Uiteindelijk worden de met DNA beklede deeltjes
EMI32.1
geresuspendeerd in 50 gl 100% (v/v) ethanol en gepipet- teerd (8 l/dosis) op ongeveer 100 Mm tot ongeveer 1000 m plastic of roestvrijstalen roosters om ze te laten dragen (tussen ongeveer 1 min. tot ongeveer 5 min., bij voorkeur gedurende ongeveer 2 min. ) voor het deeltjesbombardement.
<Desc/Clms Page number 33>
Deeltjesbombardment van bananen in embryogene celsuspensies.
Ongeveer 20 gl tot ongeveer 200 Al, en bij voorkeur 50-100 Al van suspensiecellen bij een uitgezakt celvolume van ongeveer 20% tot ongeveer 40% en bij voorkeur ongeveer 30% (v/v), gelijk aan ongeveer 25-60 mg versgewicht, worden verzameld op een ongeveer 50 Am tot ongeveer 200 Am, en bij voorkeur 100 Am plastic, bij voorkeur nylon rooster met een doorsnede van ongeveer 10 tot ongeveer 20 mm, en bij voorkeur 12 mm. Het deeltjesbombardement wordt uitgevoerd met een zelf gemaakte, door helium aangedreven deeltjeskanon, geconstrueerd volgens Sági et al.
(1995) onder de volgende standaardomstandigheden : (i) afstand tot doelwit ongeveer 8 cm tot ongeveer 14 cm, bij voorkeur ongeveer 12 cm ; (ii) heliumdruk, ongeveer 6 bar tot ongeveer 10 bar, bij voorkeur ongeveer 8 bar ; (iii) vacuüm, ongeveer-0, 7 bar tot ongeveer-0, 9 bar, en bij voorkeur ongeveer-0, 8 bar ; (iv) een dosis tot drie doses per doelwit, maar bij voorkeur een dosis per doelwit ; en (v) met of zonder een ongeveer 4 uur tot ongeveer een overnacht osmotische voorbehandeling op ZZ-medium met 0, 2 M sorbitol plus 0, 2 M mannitol.
Bepaling van kritische concentraties van selectieve agentia.
Groeikineticen worden bepaald voor verschillende ECSs door het meten van de versgewichttoename van gelijke hoeveelheden embryogene cellen die uitgeplaat worden op selectieve ZZ-media met de volgende concentraties (mg/l) van de selectieve agentia kanamycin, geneticine en hygromycine : 5,10, 20,50, 75 en 100. Metingen worden uitgevoerd op twee tijdpunten, twee en vier weken kweek nadat de behandeling gestart is. Alle metingen worden uitgevoerd in ten minste twee herhalingen met twee onafhankelijke experimenten. Selectieve agentia en concentraties worden als optimaal beschouwd, wanneer een minimale of geen celgroei wordt waargenomen na de eerste
<Desc/Clms Page number 34>
twee of vier weken kweek. Levensvatbaarheid van gedode of overlevende cellen wordt eveneens bevestigd door standaard kleuringsproeven, zoals die met fluorescinediacetaat of trifenyltetrazoliumchloride.
Terugwinning en regeneratie van transgene bananenplanten.
Na deeltjesbombardement worden ECSs gekweekt op een vast ZZ-medium (beschreven in voorbeeld 2) zonder selectie voor ongeveer 7 dagen tot ongeveer 14 dagen, en bij voorkeur voor ongeveer 10 dagen, en vervolgens geplaatst op vast of vloeistof selectief ZZ-medium zoals beschreven in voorbeeld 3, maar aangevuld met ongeveer 25 mg/l tot ongeveer 75 mg/l, en bij voorkeur 50 mg/l geneticine of hygromicine en elke twee weken gesubkweekt. Na ongeveer 2-3 maanden kweek worden actief groeiende celaggregaten geselecteerd en individueel gesubkweekt op vast proliferatiemedium gedurende 1-2 maanden met of zonder selectie, vervolgens overgebracht naar niet-selectief of selectief proliferatiemedium zoals beschreven in voorbeeld 4.
EMI34.1
ss-glucuronidase (GUS)-bepalingen.
Histochemische en fluorometrische GUS-bepalingen voor transiënte en stabiele expressie in getransformeerde cellen en plantenweefsels worden uitgevoerd onder standaardbepalingscondities (Jefferson, 1987).
DNA-isolatie, PCR en Southern-analyse.
Gnomisch DNA wordt geëxtraheerd voor PCR en Southern-analyse met behulp van een standaard CTAB-extractiemethode. Een 50 gl PCR-reactiemengsel bevat de primers (1 AM eindconcentratie elk), Taqpolymerase (1, 0 U), 125 AM van elk dNTP, 1 x PCR-reactiebuffer en ongeveer 50 ng DNA. De reactiemengsels worden afgesloten met 50 gl minerale olie. PCR-omstandigheden zijn 940C ini- tiële smelting gedurende 3 min., gevolgd door 30 cycli van 94 C/1 min., 60 C/1 min., 72 C/2 min., met een 72 C/7 min.-eindextensie. PCR-producten en totaal gnomisch DNA
<Desc/Clms Page number 35>
worden gescheiden in respectievelijk 1, 2% en 0, 8% agarosegel en geblot of nylonmembranen.
Digoxigenine-gelabelde probes worden bereid door PCR zoals boven beschreven en gebruikt voor hybridisatie volgens standaardprotocollen.
EMI35.1
LEGENDA VAN DE FIGUREN Figuur 1 A. Prolifererende meristeemkweek van de kookbanaancultivar Bluggoe, 3 weken na subkweek. :B."Bloemkoolachtig"uiterlijk van een hoog prolifererende scheuttopkweek van de dessertbanaancultivar Gros Michel, drie weken na subkweek.
C. Hoge kwaliteit scalp van de cultivar Bluggoe afgeleid van een meristeemkweek met "bloemkoolachtig"uiterlijk.
D. Embryogene kweek van plantaancultivar Three Hand Planty 6 weken na scalpinductie. (balk = 1 mm) Figuur-2 : A. Embryogene celaggregaten in een celsuspensie van de Cavendish-banaancultivar Williams (balk = 10 hum).
B. Logaritmische groeicurve van dezelfde celsuspensie uitgedrukt in uitgezakt celvolumepercentage (UCV%).
<Desc/Clms Page number 36>
REFERENTIES 1. Banerjee N, De Langhe E (1985) A tissue culture technique for rapid clonal propagation and storage under minimal growth conditions of Musa (Banana and plantain). Plant Cell Reports 4 : 351-354 2. Chauveau M, Rousseaux J (1996) EPR studies on 6- benzoylaminopurine and thenoyltrifluoroacetone inhi- bition sites of succinate dehydrogenase in plant mitochondria. Plant Cell Physiol 37 : 914-921 3. Cote FX, Domergue R, Monmarson S, Schwendiman J,
Teisson C, Escalant JV (1996) Embryogenic cell sus- pensions from the male flower of Musa AAA cv. Grand nain. Physiol Plantarum 97 : 285-290 4. Cronauer-Mitra SS, Krikorian AD (1988) Plant regene- ration via somatic embryogenesis in the seeded di- ploid banana Musa ornata Roxb. Plant Cell Reports 7 :
23-25 5.
Dhed'a D (1992a) Culture de suspensions cellulaires et régénération en plantules par embryogénèse soma- tique chez le bananier et le bananier plantain (Musa spp. ). PhD thesis, Katholieke Universiteit Leuven,
167 pp 6. Dhed'a D (1992b) Culture de suspensions cellulaires embryogéniques et régénération en plantules par embryongénèse somatique chez le bananier et le bana- nier plantain Musa spp. Tropicultura 10 : 152-154 7. Dhed'a D, Dumortier F, Panis B, Vuylsteke D, De
Langhe E (1991) Plant regeneration in cell suspensi- on cultures of the cooking banana cv.'Bluggoe' (Musa spp. ABB group). Fruits 46 : 125-135 8.
Drake PMW, John A, Power JB, Davey MR (1997) Cytoki- nin pulse-mediated shoot organogenesis from cotyle- dons of Sitka spruce [Picea sitchensis (Bong. )
Carr.] and high frequency in vitro rooting of shoots. Plant Cell Tissue Organ Cult 50 : 147-151 9. Escalant JV, Teisson C (1989) Somatic embryogenesis and plants from immature zygotic embryos of the
<Desc/Clms Page number 37>
species Musa acuminata and Musa balbisiana. Plant
Cell Reports 7 : 665-668 10. Escalant J-V, Teisson C, Cote F (1994) Amplified somatic embryogenesis from male flowers of triploid banana and plantain cultivars (Musa spp. ). In Vitro
Cell Dev Biol 30P : 181-186 11. Jefferson RA (1987) Assaying chimeric genes in plants : the GUS fusion system. Plant Mol Biol Rep 5 :
387-405 12. Goldfarb B (1991) A liquid cytokinin pulse induces adventitious shoot formation from Douglas-fir cotyledons.
Plant Cell Reports 10 : 156-160 13. Klerk GJ de, Keppel M, Brugge J ter, Meekes H (1996)
Timing of the phases in adventitious root formation in apple microcuttings. J Exp Bot 46 : 965-972 14. Leonard NJ, Hecht SM, Skoog F, Schmitz RY (1969) Cytokinins : Synthesis, mass spectra and biological activity of compounds related to zeatin. Proc Natl
Acad Sei USA 63 : 175-182 15. Letham DS (1967) Regulators of cell division in plant tissues. V. A comparison of the activities of zeatin and other cytokinins in five bioassays.
Planta 74 : 228-242 16. Marroquin CG, Paduscheck C, Escalant JV, Teisson C (1993) Somatic embryogenesis and plant regeneration through cell suspensions in Musa acuminata. In Vitro
Cell Dev Biol 29P : 43-46 17. Miller CO (1979) Cytokinin inhibition of respiration by cells and mitochondria of soybean, Glycine max (L. ) Merrill. Planta 146 : 503-511 18. Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plantarum 15 : 473-497 19. Novak FJ, Afza R, Van Duren M, Perea-Dallos M,
Conger BV, Tang XL (1989) Somatic embryogenesis and plant regeneration in suspension cultures of dessert (AA and AAA) and cooking (ABB) bananas (Musa spp.).
Bio/Technology 7 : 154-159
<Desc/Clms Page number 38>
20. Panis BJ, Withers LA, De Langhe EAL (1990) Cryopre- servation of Musa suspension cultures and subsequent regeneration of plants. Cryo-Letters 11 : 337-350 21. Panis B, Van Wauwe A, Swennen R (1993) Plant regeneration through direct somatic embryogenesis from protoplasts of banana (Musa spp. ). Plant Cell
Reports 12 : 403-407 22. Panis B, Totté N, Van Nimmen K, Withers LA, Swennen
R (1996) Cryopreservation of banana (Musa spp.) meristem cultures after preculture on sucrose. Plant
Science 121 : 95-106 23. Ralph RK, Wojcik SJ (1982) Cytokinin effects on mitochondria and calcium metabolism. Plant Sei
Letters 25 : 321-328 24. Redenbaugh K, Paasch B, Nichol J, Kossler M, Viss P,
Walker K (1986) Somatic seeds : encapsulation of asexual embryos. Bio/Technology 4 : 797-801 25.
Rhodes CA, Lowe KS, Ruby KL (1988) Plant regeneration from protoplasts isolated from embryogenic maize cell cultures. Bio/Technology 6 :
56-60 26. Sági L, Remy S, Panis B, Swennen R, Volckaert G (1994) Transient gene expression in electroporated banana (Musa spp., cv.'Bluggoe', ABB group) protoplasts isolated from regenerable embryogenic cell suspensions. Plant Cell Reports 13 : 262-266 27. Sági L, Panis B, Remy S, Schoofs H, De Smet K,
Swennen R, Cammue BPA (1995) Genetic transformation of banana and plantain (Musa spp. ) via particle bombardment. Bio/Technology 13 : 481-485 28. Schenk RU, Hildebrandt AC (1972) Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyedonous plant cell cultures. Can J Bot 50 : 199-204 29.
Skoog F, Schmitz RY (1973) Cytokinin antagonists :
Synthesis and physiological effects of 7-substituted 3-methylpyrazolo[4, 3-d]pyrimidines. Phytoehemistry
12 : 25-37
<Desc/Clms Page number 39>
30. Tada Y, Sakamoto M, Fukimura T (1990) Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants : use of electroporation buffer lacking chloride ions. Theor
Appl Genet 80 : 475-480