<Desc/Clms Page number 1>
Procédé de préparation de peptides exempts de phénylalanine.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation de peptides exempts de phénylalanine, en particulier comme aliment protéique de complément pour malades atteints de phénylcétonurie.
La phénylcétonurie fait partie des maladies dites aminoacidopathies. Elle est la conséquence d'un dysfonctionnement complet ou partiel de l'enzyme phénylalanine hydroxylase dû à des mutations génétiques. Les personnes atteintes ne catabolisent plus normalement la phénylalanine (Phe) en tyrosine. La Phe s'accumule alors en excès dans le sang et son taux plasmatique élevé entraîne, au niveau du cerveau, une diminution de la synthèse de la myéline et des altérations de la croissance de certains axones. On constate, chez les enfants atteints, de nombreuses anomalies neurologiques affectant principalement les réflexes. L'épilepsie apparaît et ces enfants présentent une hyperactivité extrême, des états psychotiques ainsi qu'une nette diminution de leur quotient intellectuel.
En Belgique, on dénombre actuellement 350 phénylcétonuriques (PCU), ce qui représente une naissance sur 10.000. Aussi a-t-on rendu le dépistage obligatoire de la maladie, dès après la naissance, par détection de la Phe (Test de Guthrie), d'un métabolite (phénylpyruvate dans les urines) ou de la Phe dans le plasma sanguin.
Le traitement de cette maladie consiste à limiter, le plus tôt possible après la naissance et par un régime, les apports de Phe dans l'alimentation de l'enfant, tout en satisfaisant ses besoins en acides aminés essentiels, dont la Phe. Il est donc nécessaire de nourrir l'enfant avec des aliments naturels à faible teneur en protéines (fruits, légumes, céréales ...), de tenir compte de la teneur moyenne de ces aliments en
<Desc/Clms Page number 2>
protéines et en Phe et de compléter les besoins en protéines par des aliments de complément appauvris ou exempts de Phe. Il est exclu d'utiliser les protéines naturelles (viande, oeufs, lait, fromage), car elles contiennent en moyenne plus de 4% de Phe.
On connaît déjà des procédés de fabrication d'aliments protéiques de complément dont les plus anciens sont obtenus par hydrolyse acide des protéines en acides aminés, les acides aminés aromatiques, y compris la Phe, étant éliminés notamment par passage sur des colonnes de charbon activé. La mise en oeuvre de ces procédés présente l'inconvénient d'entraîner la destruction du tryptophane et la perte des acides aminés aromatiques. Ces procédés sont pratiquement abandonnés à l'heure actuelle.
On a aussi déjà pensé à produire, d'une part, des aliments de complément en mélangeant des acides aminés purifiés qui sont obtenus par fermentation (sans Phe) et, d'autre part, des aliments complets qui comprennent, outre lesdits acides aminés purifiés, des matières grasses, des hydrates de carbone, des vitamines, etc... Ces aliments, qu'ils soient de complément ou complets, présentent des inconvénients majeurs. En effet, ils sont amers et ils provoquent le dégoût. C'est pourquoi les malades et surtout, parmi ceux-ci, les enfants ne montrent aucun appétit pour ces aliments. En outre, l'ingestion de ces derniers déclenche l'arrivée, en grande quantité, des acides aminés libres au niveau intestinal, d'où surcharge et perturbation des mécanismes d'absorption et de transport transmembranaire.
Pour pallier à ces inconvénients, des procédés de fabrication mettant en oeuvre une hydrolyse enzymatique des protéines à l'aide de deux enzymes ont été imaginés. La première de ces enzymes est une endopeptidase, choisie pour rompre de nombreuses liaisons peptidiques notamment du côté carboxyle des acides aminés aromatiques, tandis que la seconde enzyme est une exopeptidase qui sépare bon nombre d'acides aminés. L'hydrolysat est composé essentiellement d'acides aminés libres et de très petits peptides dont la Phe doit être extraite par passage sur
<Desc/Clms Page number 3>
colonne chromatographique de séparation.
Ces derniers procédés présentent à leur tour un inconvénient de taille. Les produits obtenus selon ces procédés ne sont pas commercialisables compte tenu de leur coût de fabrication particulièrement élevé.
Donc, en résumé, on ne trouve actuellement, sur le marché, que deux types d'aliments pour malades atteints de phénylcétonurie, à savoir les aliments obtenus uniquement à partir de mélange d'acides aminés libres dépourvus de Phe et ceux obtenus à partir d'hydrolysats de protéines du lait, tels que les compléments connus sous les noms de"P. K. U. drink" (qui contient le glycomacropeptide) et de"Lophénalac". Tous ces aliments ont un si mauvais goût que leur ingestion suscite de très grandes réticences. La seule parade envisagée à ce jour pour remédier à cet état de fait consiste, lorsque lesdits aliments se présentent sous forme de poudre, à en garnir des gélules qui sont à absorber, en grand nombre, chaque jour.
Indépendamment de la préparation d'aliments de complément pour PCU, on connaît actuellement des procédés de séparation des peptides phosphorylés ou caséinophosphopeptides (CPP) rangés en deux catégories, à savoir : la séparation en masse et la séparation par chromatographie.
La séparation en masse, par agrégation phosphocalcique et soit précipitation en présence d'éthanol, soit séparation par ultrafiltration et diafiltration, ne permet pas de séparer les CPP avec un grand degré de pureté. Par contre, les techniques chromographiques, qui sont beaucoup plus spécifiques, le permettent.
Aucun de ces derniers procédés ne vise à séparer spécifiquement les CPP dans le but de les utiliser comme aliment de complément protéique pour les PCU, pas plus, qu'il ne vise, d'une part, à doser la Phe dans les CPP séparés et, d'autre part, à séparer les CPP exempts de Phe des CPP renfermant encore des résidus de Phe.
L'invention a pour but de remédier aux inconvénients
<Desc/Clms Page number 4>
précités et de procurer un procédé simple qui permet la production, à coût réduit, d'aliments de complément pour PCU, dont le goût est nettement moins prononcé et moins désagréable que celui des aliments de complément connus, ceci étant dû au fait que la mise en oeuvre dudit procédé ne requiert qu'une seule enzyme et que l'élution chromatographique des phosphopeptides s'effectue donc en une seul étape.
Parmi les autres avantages présentés par le procédé suivant l'invention, on retiendra, d'une part, que le groupement phosphorylé a la propriété de se lier aux cations bivalents Ca++, Fie.., Zen*", etc... et, d'autre part, que les peptides, de par leur nature, sont digérés plus lentement et mieux absorbés au niveau intestinal et que, contrairement au mélange d'acides aminés libres, ils peuvent se prêter à diverses préparations culinaires.
A cet effet, suivant l'invention, on hydrolyse de la caséine par la trypsine, on inactive ladite enzyme, on clarifie l'hydrolysat, on abaisse le pH de ce dernier, après avoir préalablement déterminé la charge électrique et le point isoélectrique des peptides trypsiques, jusqu'à une valeur de 2, 7 à 2,5, on charge alors l'hydrolysat dans une colonne de chromatographie garnie d'une résine échangeuse d'anions choisie pour que seuls les caséinophosphopeptides exempts de phénylalanine s'y fixent tandis que les autres peptides percolent directement et qu'enfin on élue les caséinophosphopeptides fixés sur la résine soit en les entraînant par une solution tamponnée de force ionique supérieure à celle de l'hydrolysat introduit dans la colonne, soit au moyen d'une solution de pH inférieur à celui de l'hydrolysat chargé dans la colonne.
D'autres détails et particularités de l'invention ressortiront de la description du procédé donnée ci-après, à titre d'exemple non limitatif.
L'hydrolyse enzymatique qui clive les protéines en peptides et ne détruit pas les acides aminés, convient bien pour la production d'un aliment protéique de complément amélioré pour PCU. Par l'action d'une enzyme naturelle très spécifique, telle
<Desc/Clms Page number 5>
que la trypsine, sur les protéines, on obtient de longs peptides. Si on hydrolyse les caséines (protéines phosphorylées du lait) par la trypsine, on obtient des peptides trypsiques phosphorylés et des peptides trypsiques non phosphorylés. Les peptides phosphorylés ou caséinophosphopeptides (CPP) ne contiennent presque plus de Phe, la méthode d'extraction et de séparation chromatographique spécifique suivant l'invention, qui sera décrite ci-après, permettant d'obtenir des CPP exempts de Phe.
Le clivage de la caséine par la trypsine, du côté carboxyle des résidus arginine et lysine, donne lieu à l'apparition de nombreux peptides non phosphorylés ainsi qu'à une vingtaine de CPP.
Le tableau 1 reprend la description des peptides non phosphorylés renfermant un ou plusieurs résidus Phe et la valeur de leur point isoélectrique (PI). Ces calculs ont été effectués sur base de la séquence primaire de la caséine et du site de clivage de l'enzyme.
EMI5.1
Tableau 1-PI des peptides trypsiques non phosphorylés renfermant un ou plusieurs résidus Phe.
EMI5.2
<tb>
<tb>
NO <SEP> Description <SEP> Résidus <SEP> Phe <SEP> PI
<tb> 1 <SEP> oSl-CN <SEP> (137-58) <SEP> 3 <SEP> 9. <SEP> 82
<tb> 2 <SEP> aSt-CN <SEP> (ri33-151) <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 95
<tb> 3 <SEP> aSl-CN <SEP> (fl52-193) <SEP> 2 <SEP> 3. <SEP> 41
<tb> 4 <SEP> oS2-CN <SEP> (t33-41) <SEP> 6, <SEP> 56
<tb> 5 <SEP> αS2-CN <SEP> (MI-91) <SEP> 1 <SEP> 4, <SEP> 25
<tb> 6 <SEP> asz <SEP> (M- <SEP> 2-113) <SEP> 1 <SEP> 6. <SEP> 13
<tb> 7 <SEP> αS2-CN <SEP> (f161-165) <SEP> # <SEP> 1 <SEP> # <SEP> 10. <SEP> 07
<tb> 8 <SEP> α
S2-CN( <SEP> f174-181) <SEP> # <SEP> 1 <SEP> # <SEP> 9. <SEP> 50
<tb> 9 <SEP> ss-CN <SEP> (f49-69) <SEP> # <SEP> 2 <SEP> # <SEP> 7, <SEP> 70
<tb> 10 <SEP> # <SEP> ss-CN(f69-97) <SEP> # <SEP> 1 <SEP> # <SEP> 6,45
<tb> H <SEP> f-CN <SEP> (rI08-113) <SEP> 1 <SEP> 6. <SEP> 58
<tb> 12 <SEP> # <SEP> ss-CN(f114-169) <SEP> 2 <SEP> 5, <SEP> 74
<tb> 13 <SEP> 3 <SEP> # <SEP> ss-CN(f184-190) <SEP> # <SEP> 1 <SEP> # <SEP> 6,30
<tb> 14 <SEP> ss-CN <SEP> (f203-209) <SEP> # <SEP> 1 <SEP> # <SEP> 5,13
<tb> 15 <SEP> K-CN <SEP> (f17-21) <SEP> 2 <SEP> 6, <SEP> 17
<tb> 16 <SEP> K-CN <SEP> (r47-63) <SEP> 1 <SEP> 9. <SEP> 62
<tb> 17 <SEP> #-CN <SEP> (f98-105) <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 80
<tb> 18 <SEP> K-CN <SEP> (f98-111) <SEP> 1 <SEP> 9.
<SEP> 84
<tb> 19 <SEP> pp <SEP> 3 <SEP> (f5-24) <SEP> # <SEP> 1 <SEP> # <SEP> 3,91
<tb> 20 <SEP> pp <SEP> 3 <SEP> (rl24-134) <SEP> 2 <SEP> 7, <SEP> 52
<tb>
<Desc/Clms Page number 6>
Comme montré au tableau 2, les CPP se caractérisent par une proportion nettement moindre de Phe et par un PI plus bas que les autres peptides non phosphorylés. Seuls les CPP qui proviennent de la caséine ss (ss-CNlP (f33-48) et de la caséine as2 (αs@-CN1p (f137/138-149)) renferment un seul résidu de Phe.
En isolant spécifiquement tous les CPP et en extrayant de cet isolat les deux peptides précités, on obtient un produit peptidique sans Phe.
Tableau 2-Valeurs des points isoélectriques et des charges à différents pH des peptides trypsiques phosphorylés.
EMI6.1
<tb>
<tb>
Charge
<tb> N* <SEP> Description <SEP> Res. <SEP> P. <SEP> l. <SEP> à <SEP> pif <SEP> 2,5 <SEP> à <SEP> pli <SEP> 2,75 <SEP> à <SEP> pH <SEP> 3,0 <SEP> à <SEP> pH <SEP> 8,0
<tb> Plie
<tb> 1 <SEP> ss-CN <SEP> 4P <SEP> (f1-25) <SEP> 0 <SEP> 1,80 <SEP> -1,45 <SEP> -1,80 <SEP> -2,12 <SEP> -12, <SEP> 98
<tb> 2 <SEP> ss-CN <SEP> 4P <SEP> (f1-28) <SEP> 0 <SEP> 2,24 <SEP> -0,44 <SEP> -0,80 <SEP> -1,12 <SEP> -11, <SEP> 99
<tb> 3 <SEP> ss-CN <SEP> 4P <SEP> (f2-28) <SEP> 0 <SEP> 1,80 <SEP> -1,44 <SEP> -1,80 <SEP> -2,12 <SEP> -12, <SEP> 92
<tb> 4 <SEP> p-CNlP <SEP> (f33) <SEP> 8) <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 74 <SEP> +0. <SEP> 25 <SEP> -0,02 <SEP> -0,29 <SEP> -7, <SEP> 05
<tb> 5 <SEP> aSl-CN <SEP> 2P <SEP> ( <SEP> (37-58) <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 73 <SEP> +0, <SEP> 32 <SEP> -0,03 <SEP> -0,38 <SEP> -8, <SEP> 98
<tb> 6 <SEP> aSI-CN2P <SEP> (f43-58) <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 01-0. <SEP> 68-0. <SEP> 99-1.
<SEP> 33-8. <SEP> 97
<tb> 7 <SEP> aSl-CN <SEP> 7P <SEP> (f43-79) <SEP> 0 <SEP> 1. <SEP> 34-4, <SEP> 13-4, <SEP> 88-5, <SEP> 45-22, <SEP> 85
<tb> 8 <SEP> αS1-CN <SEP> 5P <SEP> (f59-79) <SEP> 0 <SEP> 1,28 <SEP> -3,31 <SEP> -3,68 <SEP> -3,98 <SEP> -13, <SEP> 95
<tb> 9 <SEP> αS1-CN <SEP> 1P <SEP> (f104-119) <SEP> 0 <SEP> 3,95 <SEP> +1.35 <SEP> +1.16 <SEP> +1,00 <SEP> -3. <SEP> 06
<tb> 10 <SEP> αS1-CN <SEP> 1P <SEP> (f106-119) <SEP> 0 <SEP> 2,99 <SEP> +0,35 <SEP> +0, <SEP> 16 <SEP> +0. <SEP> 00-4. <SEP> 00
<tb> 11 <SEP> αS2-CN <SEP> 4P <SEP> (f1-21) <SEP> 0 <SEP> 2,26 <SEP> -0,39 <SEP> -0.70 <SEP> -0,96 <SEP> -10, <SEP> 01
<tb> 12 <SEP> αS2-CN <SEP> 4P <SEP> (f46-70) <SEP> 0 <SEP> 1,43 <SEP> -2,46 <SEP> -2,83 <SEP> -3,17 <SEP> -15,05
<tb> 13 <SEP> α
S2-CN <SEP> 3P <SEP> (f46-70) <SEP> 0 <SEP> 1,64 <SEP> -1.46 <SEP> -1.83 <SEP> -2,20 <SEP> -13, <SEP> 07
<tb> 14 <SEP> αS2-CN <SEP> 2P <SEP> (f126-136) <SEP> 0 <SEP> 2,04 <SEP> -0,55 <SEP> -0,78 <SEP> -0,97 <SEP> -5, <SEP> 97
<tb> 15 <SEP> αS2-CN <SEP> 1P <SEP> (f137-149 <SEP> 1 <SEP> 3, <SEP> 82 <SEP> +1,33 <SEP> +1. <SEP> 13 <SEP> +0. <SEP> 93 <SEP> -3. <SEP> 08
<tb> 16 <SEP> aS2-CN <SEP> CN <SEP> 1P <SEP> (f138-149) <SEP> 1 <SEP> 2,91 <SEP> +0.33 <SEP> +0.13 <SEP> -0.07 <SEP> -3.
<SEP> 98
<tb> 17 <SEP> K-CNlP <SEP> (ri <SEP> 12-169) <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 25 <SEP> +1, <SEP> 26 <SEP> +0, <SEP> 93 <SEP> +0, <SEP> 53 <SEP> -in, <SEP> 08
<tb> 18 <SEP> #-CN <SEP> 1P <SEP> (f113-169) <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 70 <SEP> +0, <SEP> 26-0, <SEP> 07-0, <SEP> 47-11, <SEP> 11
<tb> 19 <SEP> #-CN <SEP> IP <SEP> (f117-169) <SEP> 0 <SEP> 1,87 <SEP> -0,70 <SEP> -1,00 <SEP> -1,34 <SEP> -10, <SEP> 98
<tb> 20 <SEP> α
S0-SN <SEP> 3P <SEP> (f37-58) <SEP> 0 <SEP> 2,13 <SEP> -0,60 <SEP> -0,97 <SEP> -1,35 <SEP> -10, <SEP> 96
<tb> 21 <SEP> PP3 <SEP> (f <SEP> 25-35) <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 04 <SEP> -0,56 <SEP> -0,79 <SEP> -0,98 <SEP> -5, <SEP> 09
<tb> 22 <SEP> PP3 <SEP> (f <SEP> 36-47) <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 95 <SEP> +0, <SEP> 42 <SEP> +0,18 <SEP> -0,04 <SEP> -5. <SEP> 20
<tb>
<Desc/Clms Page number 7>
Les matières premières qui peuvent être utilisées pour la mise en oeuvre du procédé suivant l'invention contiennent les caséines du lait. Ces matières sont soit du lait écrémé liquide ou en poudre, soit du caséinate de sodium en poudre, qui, mises en solution, peuvent être hydrolysées. La trypsine, qui est une protéase appartenant à la famille des sérines actives, est une enzyme naturelle de la digestion, présente dans le pancréas.
Elle est très connue, très utilisée et très spécifique. Elle clive les liens peptidiques des protéines du côté carboxyle de la lysine et de l'arginine. Agissant sur les protéines du lait, elle produit de grands peptides dont la taille ne peut plus être réduite.
Les produits en poudre sont reconstitués à 10% pour le lait écrémé et de préférence à 3 à 5% pour le caséinate de sodium avant d'être soumis à l'hydrolyse.
L'hydrolyse trypsique peut être effectuée de deux manières, à savoir hydrolyse sous agitation dans une cuve et hydrolyse dans un réacteur enzymatique.
Dans le cas où l'hydrolyse est effectuée sous agitation, à l'aide d'un agitateur à pales, dans une cuve, la température d'hydrolyse doit être fixée, pour obtenir un bon rendement, entre 37 et 550C et le pH doit être neutre ou légèrement alcalin. 0n utilise de préférence une température de l'ordre de 500C et un pH de 8, 0. Ce pH est maintenu constant à l'aide d'un système pH-stat à électrode qui, par addition automatique de soude, maintient l'hydrolysat au pH choisi. Le rapport enzyme/substrat est de 1 : 1000 (m/v). La durée de l'hydrolyse peut varier d'une à trois heures.
Dès que l'hydrolyse est terminée, l'hydrolysat subit un traitement thermique, pour inactiver l'enzyme et pour pasteuriser les caséinophosphopeptides, à une température de 80 C pendant un laps de temps de 10 minutes. Le pH de l'hydrolysat est ensuite abaissé jusqu'à 4,6 point isoélectrique de la caséine. On centrifuge alors la solution afin d'éliminer les fractions protéiques insolubles et de clarifier ainsi l'hydrolysat.
<Desc/Clms Page number 8>
Lorsque l'hydrolyse est effectuée dans un réacteur enzymatique, on utilise un réacteur enzymatique à membranes, qui est un appareil pilote d'ultrafiltration composé d'une cuve d'alimentation, d'une pompe de circulation et de membranes d'ultrafiltration. Les membranes peuvent être en polysulfone (2e génération) ou minérales (3e génération). On choisit avantageusement des membranes de 3e génération, de seuil de coupure de 50.000 D (daltons). La solution de protéines est déposée dans la cuve d'alimentation et, après ajout de l'enzyme, l'hydrolyse commence.
La différence de taille entre, d'une part, les micelles de caséine, les protéines solubles et l'enzyme, et, d'autre part, les peptides trypsiques obtenus permet, selon le seuil de coupure de la membrane choisie, d'ultrafiltrer en permanence les peptides trypsiques qui passent dans le perméat alors que les composés de masse moléculaire plus importante ne peuvent franchir la membrane et sont retenus du côté rétentat. Si l'activité enzymatique diminue, on ajoute une quantité d'enzyme et de substrat afin de maintenir l'hydrolyse au niveau désiré.
L'utilisation d'un réacteur enzymatique permet de simplifier le procédé au niveau de l'hydrolyse, du fait que les étapes d'inactivation de l'enzyme et de centrifugation peuvent être supprimées, le perméat d'ultrafiltration étant clair et ne contenant que des peptides trypsiques.
Le procédé, suivant l'invention, utilise la chromatographie d'échange d'anions pour opérer une séparation efficace entre CPP et peptides non phosphorylés. Cette séparation est basée sur la charge et le point isoélectrique des peptides.
Depuis le milieu des années 1980, les séquences en acides aminés des fractions de caséine et les séquences des protéines solubles sont connues. En tenant compte de la spécificité de la trypsine, il est donc possible de déterminer les séquences des peptides trypsiques, d'en calculer la charge à différents pH et leur point isoélectrique (PI).
L'étape du procédé qui suit les étapes décrites cidessus consiste à isoler les CPP sans Phe. Elle est effectuée
<Desc/Clms Page number 9>
par chromatographie sur colonne échangeuse d'anions. Cette technique s'avère efficace et sélective ; elle permet de séparer des protéines et des peptides avec un grand degré de pureté.
Dans le domaine laitier, on a déjà utilisé industriellement ce genre de résine pour récupérer les protéines du lactoserum. Pour la séparation des CPP, on a testé plusieurs résines et finalement opté pour la résine échangeuse d'anions connue sous le nom "DEAE SPHERODEX".
Le procédé suivant l'invention est basé sur le fait que les peptides non phosphorylés ayant des résidus de Phe ont des PI largement supérieurs à 3, 0, tandis que les CPP ont presque tous des PI inférieurs à 3,0 et que les CPP avec 1 résidus de Phe ont un PI supérieur à 2,7. Si on charge une colonne renfermant une résine échangeuse d'anions avec un hydrolysat trypsique à pH 3,0, les peptides non phosphorylés chargés positivement ne seront pas retenus, tandis que la plupart des CPP chargés négativement formeront des liaisons avec la résine et seront retenus sélectivement ; ils pourront être ensuite élués ; ce qui permet d'obtenir des peptides à taux réduit en Phe.
Conformément à l'invention, on charge une colonne, de même résine que dans le cas précédent, avec un hydrolysat trypsique porté à pH 2,7 ou 2,5, c'est-à-dire à des pH plus bas que les PI des 3 CPP renfermant encore un résidu de Phe. Ces 3 CPP ne seront pas retenus par la résine, ce qui permet d'isoler les seuls CPP absolument exempts de Phe.
Seuls les CPP chargés négativement sont retenus tandis que les autres peptides percolent directement à travers la colonne, Les CPP sont élués soit par augmentation de la force ionique, soit par diminution du pH. Si nécessaire, les peptides peuvent être dessalés par ultrafiltration et diafiltration en utilisant une membrane de seuil de coupure de 1000 D, telle qu'une membrane connue sous le nom"AMICON".
On trouvera, ci-après, deux exemples concernant l'obtention de peptides exempts de Phe obtenus à partir de deux
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
matières premières se présentant sous des formes différentes.
Exemple 1 : Obtention de peptides sans Phe à partir de caséinate de sodium et séparation sur colonne connue sous le nom "DEAE SPHERODEX"à pH 2, 5.
La matière première utilisée est le caséinate de sodium sous forme de poudre. 100 g de poudre de caséinate de sodium sont dissous dans 900 g d'eau distillée. Le rapport enzyme/substrat lors de l'hydrolyse est de 1/1000 (m/v). Après hydrolyse et séparation des CPP selon le procédé décrit précédemment, on obtient une poudre dont la composition en acides aminés est reprise dans le tableau 3 suivant.
Tableau 3. Dosage des acides aminés des phosphopeptides trypsiques de caséinate de sodium séparés sur"SPHERODEX".
EMI10.2
<tb>
<tb>
Ppept
<tb> caséinate <SEP> de <SEP> Na
<tb> % <SEP> M.S. <SEP> 93, <SEP> 34
<tb> % <SEP> N/M.F. <SEP> 9.97.
<tb>
% <SEP> Prot./M.F. <SEP> 63.61
<tb> % <SEP> N/M. <SEP> S. <SEP> 10. <SEP> 68
<tb> % <SEP> Prot./M. <SEP> S. <SEP> 68. <SEP> 15
<tb> Par <SEP> 100 <SEP> g <SEP> M. <SEP> S. <SEP> g <SEP> %
<tb> ASP <SEP> 5. <SEP> 446 <SEP> 6. <SEP> 98
<tb> TIIR <SEP> 2. <SEP> 787 <SEP> 3. <SEP> 57
<tb> SUR <SEP> H. <SEP> 683 <SEP> 14. <SEP> 98
<tb> GLU <SEP> 26376 <SEP> 33. <SEP> 82
<tb> PRO <SEP> 3. <SEP> 539 <SEP> 4, <SEP> 54
<tb> GLY <SEP> 0. <SEP> 989 <SEP> t. <SEP> 27
<tb> ALA <SEP> 2, <SEP> 817 <SEP> 3. <SEP> 61
<tb> CYS
<tb> VAL <SEP> 5, <SEP> 711 <SEP> 7, <SEP> 32
<tb> MET <SEP> 1.809 <SEP> 2. <SEP> 32
<tb> ILE <SEP> 6.951 <SEP> 8.91
<tb> Lieu <SEP> 2. <SEP> 879 <SEP> 3, <SEP> 69
<tb> TYR <SEP> 1.351 <SEP> 1.71
<tb> PHE
<tb> IIIS <SEP> 0, <SEP> 615 <SEP> 0, <SEP> 79
<tb> LYS <SEP> 3. <SEP> 384 <SEP> 434
<tb> ARG <SEP> 1, <SEP> 660 <SEP> 2.
<SEP> 1J
<tb> Total <SEP> 77, <SEP> 997 <SEP> 100.00
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
La phénylalanine a totalement disparu du produit final, tandis que la concentration en sérine atteint une valeur élevée. Le rendement obtenu est de 5% du total des caséines de départ.
Exemple 2 : Obtention de peptides sans Phe à partir de lait écrémé et séparation sur colonne connue sous le nom"DEAE SPHERODEX"à pH 2,5.
Un litre de lait écrémé est hydrolysé par la trypsine et les phosphopeptides sont séparés selon la méthode décrite précédemment. On obtient une poudre dont la composition en acides aminés est reprise dans le tableau 4. La phénylalanine est absente. Le rendement expérimental obtenu est de 5% par rapport à la caséine.
Tableau 4. Dosage des acides aminés des phosphopeptides trypsiques de lait écrémé séparés sur"SPHERODEX".
EMI11.1
<tb>
<tb>
Ppept
<tb> Lait <SEP> écrémé
<tb> % <SEP> M. <SEP> S. <SEP> 95. <SEP> 95
<tb> % <SEP> N/M.F. <SEP> 10,34
<tb> % <SEP> Prot./M.F. <SEP> 65.94
<tb> % <SEP> N/M. <SEP> S. <SEP> 10, <SEP> 77
<tb> % <SEP> Prot./M.s. <SEP> 68,72
<tb> Par <SEP> 100 <SEP> g <SEP> M.S. <SEP> g <SEP> %
<tb> ASP <SEP> 5. <SEP> 118 <SEP> 6. <SEP> 28
<tb> THR <SEP> 1. <SEP> 906 <SEP> 2. <SEP> 34
<tb> SER <SEP> 11, <SEP> 131 <SEP> 13, <SEP> 67
<tb> GLU <SEP> 30. <SEP> 743 <SEP> 37. <SEP> 74
<tb> PRO <SEP> 3, <SEP> 339 <SEP> 4, <SEP> 10
<tb> GLY <SEP> 0,838 <SEP> 1, <SEP> 03
<tb> ALA <SEP> 2, <SEP> 610 <SEP> 3, <SEP> 20
<tb> CYS <SEP> 0, <SEP> 876 <SEP> 1, <SEP> 08
<tb> VAL <SEP> 6, <SEP> 442 <SEP> 7, <SEP> 91
<tb> MET <SEP> 2, <SEP> 589 <SEP> 3, <SEP> 18
<tb> ILE <SEP> 6.
<SEP> 956 <SEP> 8, <SEP> 54
<tb> LEU <SEP> 2, <SEP> 454 <SEP> 3, <SEP> 01
<tb> TYR <SEP> 1, <SEP> 200 <SEP> 1, <SEP> 47
<tb> PHE
<tb> ! <SEP> US <SEP> 0. <SEP> 472 <SEP> 0, <SEP> 58
<tb> LYS <SEP> 3. <SEP> 339 <SEP> 4, <SEP> 10
<tb> ARG <SEP> 1, <SEP> 440 <SEP> 1, <SEP> 77
<tb> Total <SEP> 81, <SEP> 453 <SEP> 100, <SEP> 00
<tb>
<Desc / Clms Page number 1>
Process for the preparation of phenylalanine-free peptides.
The present invention relates to a process for the preparation of phenylalanine-free peptides, in particular as a complementary protein food for patients suffering from phenylketonuria.
Phenylketonuria is one of the so-called amino acid disease. It is the consequence of a complete or partial dysfunction of the enzyme phenylalanine hydroxylase due to genetic mutations. People with cancer no longer normally catabolize phenylalanine (Phe) to tyrosine. Phe then accumulates in excess in the blood and its high plasma level causes, in the brain, a decrease in the synthesis of myelin and alterations in the growth of certain axons. There are many neurological abnormalities in affected children, mainly affecting reflexes. Epilepsy appears and these children have extreme hyperactivity, psychotic states and a marked decrease in their IQ.
In Belgium, there are currently 350 phenylketonurics (PKU), which represents one birth in 10,000. As a result, mandatory screening for the disease has been made after birth by detecting Phe (Guthrie Test), a metabolite (phenylpyruvate in the urine) or Phe in the blood plasma.
The treatment of this disease consists in limiting, as soon as possible after birth and with a diet, the intake of Phe in the child's diet, while satisfying his needs in essential amino acids, including Phe. It is therefore necessary to feed the child with natural foods with low protein content (fruits, vegetables, cereals ...), to take into account the average content of these foods in
<Desc / Clms Page number 2>
protein and Phe and supplement protein requirements with depleted or Phe-free complementary foods. It is excluded to use natural proteins (meat, eggs, milk, cheese), because they contain on average more than 4% Phe.
Processes for the production of complementary protein foods are already known, the oldest of which are obtained by acid hydrolysis of proteins into amino acids, the aromatic amino acids, including Phe, being eliminated in particular by passage over columns of activated charcoal. The implementation of these methods has the drawback of causing the destruction of tryptophan and the loss of aromatic amino acids. These methods are practically abandoned at present.
We have also already thought of producing, on the one hand, complementary foods by mixing purified amino acids which are obtained by fermentation (without Phe) and, on the other hand, whole foods which include, in addition to said purified amino acids , fats, carbohydrates, vitamins, etc ... These foods, whether complementary or complete, have major drawbacks. Indeed, they are bitter and they provoke disgust. This is why the sick and especially, among these, children do not show an appetite for these foods. In addition, the ingestion of these triggers the arrival, in large quantities, of free amino acids in the intestine, hence overload and disturbance of the mechanisms of absorption and transmembrane transport.
To overcome these drawbacks, manufacturing methods using enzymatic hydrolysis of proteins using two enzymes have been devised. The first of these enzymes is an endopeptidase, chosen to break many peptide bonds in particular on the carboxyl side of aromatic amino acids, while the second enzyme is an exopeptidase which separates many amino acids. The hydrolyzate is essentially composed of free amino acids and very small peptides from which the Phe must be extracted by passing over
<Desc / Clms Page number 3>
separation chromatographic column.
These latter methods in turn have a significant drawback. The products obtained according to these processes are not marketable given their particularly high manufacturing cost.
So, in summary, there are currently only two types of food for patients with phenylketonuria on the market, namely foods obtained only from a mixture of free amino acids free of Phe and those obtained from milk protein hydrolysates, such as supplements known as "PKU drink" (which contains glycomacropeptide) and "Lophenalac". All these foods have such a bad taste that their ingestion arouses great reluctance. The only display envisaged to date to remedy this state of affairs consists, when said foods are in powder form, to garnish capsules which are to be absorbed, in large numbers, every day.
Independently of the preparation of complementary food for PKU, processes for the separation of phosphorylated peptides or caseinophosphopeptides (CPP) are currently known, classified into two categories, namely: bulk separation and separation by chromatography.
Mass separation, by phosphocalcic aggregation and either precipitation in the presence of ethanol, or separation by ultrafiltration and diafiltration, does not make it possible to separate the CPPs with a high degree of purity. On the other hand, chromographic techniques, which are much more specific, allow this.
Neither of these latter methods is aimed specifically at separating the CPPs with the aim of using them as a protein supplement food for the ECPs, any more than it aims, on the one hand, at assaying the Phe in the separate CPPs and , on the other hand, to separate the Phe-free PPCs from the PPCs still containing Phe residues.
The object of the invention is to remedy the drawbacks
<Desc / Clms Page number 4>
aforementioned and to provide a simple process which allows the production, at reduced cost, of complementary food for PKU, whose taste is much less pronounced and less unpleasant than that of known complementary food, this being due to the fact that the setting implementing said method requires only a single enzyme and the chromatographic elution of the phosphopeptides is therefore carried out in a single step.
Among the other advantages presented by the process according to the invention, it will be noted, on the one hand, that the phosphorylated group has the property of binding to the bivalent cations Ca ++, Fie .., Zen * ", etc ... and, on the other hand, that peptides, by their nature, are digested more slowly and better absorbed in the intestine and that, unlike the mixture of free amino acids, they can lend themselves to various culinary preparations.
To this end, according to the invention, the casein is hydrolyzed by trypsin, the said enzyme is inactivated, the hydrolyzate is clarified, the pH of the latter is lowered, after having previously determined the electrical charge and the isoelectric point of the peptides tryptic, up to a value of 2.7 to 2.5, the hydrolyzate is then loaded into a chromatography column packed with an anion exchange resin chosen so that only the caseinophosphopeptides free of phenylalanine are fixed there while that the other peptides percolate directly and that finally the caseinophosphopeptides fixed on the resin are eluted either by entraining them by a buffered solution of ionic strength greater than that of the hydrolyzate introduced into the column, or by means of a pH solution lower than that of the hydrolyzate loaded in the column.
Other details and particularities of the invention will emerge from the description of the process given below, by way of nonlimiting example.
Enzymatic hydrolysis, which cleaves proteins into peptides and does not destroy amino acids, is well suited for the production of an improved protein food supplement for PKU. By the action of a very specific natural enzyme, such
<Desc / Clms Page number 5>
that trypsin, on proteins, we get long peptides. If the caseins (phosphorylated milk proteins) are hydrolyzed with trypsin, we obtain phosphorylated tryptic peptides and non-phosphorylated tryptic peptides. Phosphorylated peptides or caseinophosphopeptides (CPP) contain almost no more Phe, the specific chromatographic extraction and separation method according to the invention, which will be described below, making it possible to obtain Phe-free CPPs.
The cleavage of casein by trypsin, on the carboxyl side of the arginine and lysine residues, gives rise to the appearance of numerous non-phosphorylated peptides as well as around twenty PPCs.
Table 1 shows the description of the non-phosphorylated peptides containing one or more Phe residues and the value of their isoelectric point (PI). These calculations were made on the basis of the primary casein sequence and the enzyme cleavage site.
EMI5.1
Table 1-PI of non-phosphorylated tryptic peptides containing one or more Phe residues.
EMI5.2
<tb>
<tb>
NO <SEP> Description <SEP> Residues <SEP> Phe <SEP> PI
<tb> 1 <SEP> oSl-CN <SEP> (137-58) <SEP> 3 <SEP> 9. <SEP> 82
<tb> 2 <SEP> aSt-CN <SEP> (ri33-151) <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 95
<tb> 3 <SEP> aSl-CN <SEP> (fl52-193) <SEP> 2 <SEP> 3. <SEP> 41
<tb> 4 <SEP> oS2-CN <SEP> (t33-41) <SEP> 6, <SEP> 56
<tb> 5 <SEP> α S2-CN <SEP> (MI-91) <SEP> 1 <SEP> 4, <SEP> 25
<tb> 6 <SEP> asz <SEP> (M- <SEP> 2-113) <SEP> 1 <SEP> 6. <SEP> 13
<tb> 7 <SEP> α S2-CN <SEP> (f161-165) <SEP> # <SEP> 1 <SEP> # <SEP> 10. <SEP> 07
<tb> 8 <SEP> α
S2-CN (<SEP> f174-181) <SEP> # <SEP> 1 <SEP> # <SEP> 9. <SEP> 50
<tb> 9 <SEP> ss-CN <SEP> (f49-69) <SEP> # <SEP> 2 <SEP> # <SEP> 7, <SEP> 70
<tb> 10 <SEP> # <SEP> ss-CN (f69-97) <SEP> # <SEP> 1 <SEP> # <SEP> 6.45
<tb> H <SEP> f-CN <SEP> (rI08-113) <SEP> 1 <SEP> 6. <SEP> 58
<tb> 12 <SEP> # <SEP> ss-CN (f114-169) <SEP> 2 <SEP> 5, <SEP> 74
<tb> 13 <SEP> 3 <SEP> # <SEP> ss-CN (f184-190) <SEP> # <SEP> 1 <SEP> # <SEP> 6.30
<tb> 14 <SEP> ss-CN <SEP> (f203-209) <SEP> # <SEP> 1 <SEP> # <SEP> 5,13
<tb> 15 <SEP> K-CN <SEP> (f17-21) <SEP> 2 <SEP> 6, <SEP> 17
<tb> 16 <SEP> K-CN <SEP> (r47-63) <SEP> 1 <SEP> 9. <SEP> 62
<tb> 17 <SEP> # -CN <SEP> (f98-105) <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 80
<tb> 18 <SEP> K-CN <SEP> (f98-111) <SEP> 1 <SEP> 9.
<SEP> 84
<tb> 19 <SEP> pp <SEP> 3 <SEP> (f5-24) <SEP> # <SEP> 1 <SEP> # <SEP> 3.91
<tb> 20 <SEP> pp <SEP> 3 <SEP> (rl24-134) <SEP> 2 <SEP> 7, <SEP> 52
<tb>
<Desc / Clms Page number 6>
As shown in Table 2, CPPs are characterized by a significantly lower proportion of Phe and by a lower PI than the other non-phosphorylated peptides. Only the CPPs which originate from casein ss (ss-CNlP (f33-48) and from casein as2 (α s @ -CN1p (f137 / 138-149)) contain a single residue of Phe.
By specifically isolating all of the CPPs and extracting the two aforementioned peptides from this isolate, a peptide product without Phe is obtained.
Table 2-Values of isoelectric points and charges at different pHs of phosphorylated tryptic peptides.
EMI6.1
<tb>
<tb>
Charge
<tb> N * <SEP> Description <SEP> Res. <SEP> P. <SEP> l. <SEP> to <SEP> pif <SEP> 2.5 <SEP> to <SEP> fold <SEP> 2.75 <SEP> to <SEP> pH <SEP> 3.0 <SEP> to <SEP> pH <SEP> 8.0
<tb> Plaice
<tb> 1 <SEP> ss-CN <SEP> 4P <SEP> (f1-25) <SEP> 0 <SEP> 1.80 <SEP> -1.45 <SEP> -1.80 <SEP> - 2.12 <SEP> -12, <SEP> 98
<tb> 2 <SEP> ss-CN <SEP> 4P <SEP> (f1-28) <SEP> 0 <SEP> 2.24 <SEP> -0.44 <SEP> -0.80 <SEP> - 1.12 <SEP> -11, <SEP> 99
<tb> 3 <SEP> ss-CN <SEP> 4P <SEP> (f2-28) <SEP> 0 <SEP> 1.80 <SEP> -1.44 <SEP> -1.80 <SEP> - 2.12 <SEP> -12, <SEP> 92
<tb> 4 <SEP> p-CNlP <SEP> (f33) <SEP> 8) <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 74 <SEP> +0. <SEP> 25 <SEP> -0.02 <SEP> -0.29 <SEP> -7, <SEP> 05
<tb> 5 <SEP> aSl-CN <SEP> 2P <SEP> (<SEP> (37-58) <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 73 <SEP> +0, <SEP> 32 < SEP> -0.03 <SEP> -0.38 <SEP> -8, <SEP> 98
<tb> 6 <SEP> aSI-CN2P <SEP> (f43-58) <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 01-0. <SEP> 68-0. <SEP> 99-1.
<SEP> 33-8. <SEP> 97
<tb> 7 <SEP> aSl-CN <SEP> 7P <SEP> (f43-79) <SEP> 0 <SEP> 1. <SEP> 34-4, <SEP> 13-4, <SEP> 88- 5, <SEP> 45-22, <SEP> 85
<tb> 8 <SEP> α S1-CN <SEP> 5P <SEP> (f59-79) <SEP> 0 <SEP> 1.28 <SEP> -3.31 <SEP> -3.68 <SEP > -3.98 <SEP> -13, <SEP> 95
<tb> 9 <SEP> α S1-CN <SEP> 1P <SEP> (f104-119) <SEP> 0 <SEP> 3.95 <SEP> +1.35 <SEP> +1.16 <SEP> +1, 00 <SEP> -3. <SEP> 06
<tb> 10 <SEP> α S1-CN <SEP> 1P <SEP> (f106-119) <SEP> 0 <SEP> 2.99 <SEP> +0.35 <SEP> +0, <SEP> 16 <SEP> +0. <SEP> 00-4. <SEP> 00
<tb> 11 <SEP> α S2-CN <SEP> 4P <SEP> (f1-21) <SEP> 0 <SEP> 2.26 <SEP> -0.39 <SEP> -0.70 <SEP> - 0.96 <SEP> -10, <SEP> 01
<tb> 12 <SEP> α S2-CN <SEP> 4P <SEP> (f46-70) <SEP> 0 <SEP> 1.43 <SEP> -2.46 <SEP> -2.83 <SEP > -3.17 <SEP> -15.05
<tb> 13 <SEP> α
S2-CN <SEP> 3P <SEP> (f46-70) <SEP> 0 <SEP> 1.64 <SEP> -1.46 <SEP> -1.83 <SEP> -2.20 <SEP> -13, <SEP > 07
<tb> 14 <SEP> α S2-CN <SEP> 2P <SEP> (f126-136) <SEP> 0 <SEP> 2.04 <SEP> -0.55 <SEP> -0.78 <SEP > -0.97 <SEP> -5, <SEP> 97
<tb> 15 <SEP> α S2-CN <SEP> 1P <SEP> (f137-149 <SEP> 1 <SEP> 3, <SEP> 82 <SEP> +1.33 <SEP> +1. < SEP> 13 <SEP> +0. <SEP> 93 <SEP> -3. <SEP> 08
<tb> 16 <SEP> aS2-CN <SEP> CN <SEP> 1P <SEP> (f138-149) <SEP> 1 <SEP> 2.91 <SEP> +0.33 <SEP> +0.13 <SEP> - 0.07 <SEP> -3.
<SEP> 98
<tb> 17 <SEP> K-CNlP <SEP> (ri <SEP> 12-169) <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 25 <SEP> +1, <SEP> 26 <SEP> +0 , <SEP> 93 <SEP> +0, <SEP> 53 <SEP> -in, <SEP> 08
<tb> 18 <SEP> # -CN <SEP> 1P <SEP> (f113-169) <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 70 <SEP> +0, <SEP> 26-0, <SEP > 07-0, <SEP> 47-11, <SEP> 11
<tb> 19 <SEP> # -CN <SEP> IP <SEP> (f117-169) <SEP> 0 <SEP> 1.87 <SEP> -0.70 <SEP> -1.00 <SEP> - 1.34 <SEP> -10, <SEP> 98
<tb> 20 <SEP> α
S0-SN <SEP> 3P <SEP> (f37-58) <SEP> 0 <SEP> 2.13 <SEP> -0.60 <SEP> -0.97 <SEP> -1.35 <SEP> - 10, <SEP> 96
<tb> 21 <SEP> PP3 <SEP> (f <SEP> 25-35) <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 04 <SEP> -0.56 <SEP> -0.79 <SEP> -0.98 <SEP> -5, <SEP> 09
<tb> 22 <SEP> PP3 <SEP> (f <SEP> 36-47) <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 95 <SEP> +0, <SEP> 42 <SEP> +0.18 <SEP> -0.04 <SEP> -5. <SEP> 20
<tb>
<Desc / Clms Page number 7>
The raw materials which can be used for carrying out the process according to the invention contain the caseins of milk. These materials are either liquid or powdered skimmed milk or powdered sodium caseinate, which, when dissolved, can be hydrolyzed. Trypsin, a protease belonging to the family of active serines, is a natural digestive enzyme found in the pancreas.
It is well known, very used and very specific. It cleaves the peptide links of proteins on the carboxyl side of lysine and arginine. Acting on milk proteins, it produces large peptides whose size can no longer be reduced.
The powdered products are reconstituted at 10% for skimmed milk and preferably at 3 to 5% for sodium caseinate before being subjected to hydrolysis.
Trypsic hydrolysis can be carried out in two ways, namely hydrolysis with stirring in a tank and hydrolysis in an enzymatic reactor.
In the case where the hydrolysis is carried out with stirring, using a paddle stirrer, in a tank, the hydrolysis temperature must be fixed, to obtain a good yield, between 37 and 550C and the pH must be neutral or slightly alkaline. We preferably use a temperature of the order of 500C and a pH of 8.0. This pH is kept constant using a pH-stat system with an electrode which, by automatic addition of soda, maintains the hydrolyzate at the chosen pH. The enzyme / substrate ratio is 1: 1000 (m / v). The duration of the hydrolysis can vary from one to three hours.
As soon as the hydrolysis is complete, the hydrolyzate undergoes a heat treatment, to inactivate the enzyme and to pasteurize the caseinophosphopeptides, at a temperature of 80 ° C. for a period of 10 minutes. The pH of the hydrolyzate is then lowered to 4.6 isoelectric point of casein. The solution is then centrifuged in order to eliminate the insoluble protein fractions and thus to clarify the hydrolyzate.
<Desc / Clms Page number 8>
When the hydrolysis is carried out in an enzymatic reactor, an membrane enzymatic reactor is used, which is a pilot ultrafiltration device composed of a feed tank, a circulation pump and ultrafiltration membranes. The membranes can be made of polysulfone (2nd generation) or mineral (3rd generation). Advantageously, 3rd generation membranes are chosen, with a cutoff threshold of 50,000 D (daltons). The protein solution is deposited in the feed tank and, after adding the enzyme, hydrolysis begins.
The size difference between, on the one hand, the casein micelles, the soluble proteins and the enzyme, and, on the other hand, the tryptic peptides obtained makes it possible, according to the cutoff threshold of the membrane chosen, to ultrafiltrate. permanently the tryptic peptides which pass into the permeate while the compounds of larger molecular mass cannot cross the membrane and are retained on the retentate side. If the enzymatic activity decreases, an amount of enzyme and substrate is added in order to maintain the hydrolysis at the desired level.
The use of an enzymatic reactor makes it possible to simplify the process at the hydrolysis level, since the steps of inactivation of the enzyme and of centrifugation can be omitted, the ultrafiltration permeate being clear and containing only tryptic peptides.
The process according to the invention uses anion exchange chromatography to effect an effective separation between CPP and non-phosphorylated peptides. This separation is based on the charge and the isoelectric point of the peptides.
Since the mid-1980s, the amino acid sequences of casein fractions and the sequences of soluble proteins have been known. Taking into account the specificity of trypsin, it is therefore possible to determine the sequences of trypsin peptides, to calculate the charge at different pH and their isoelectric point (PI).
The step of the process which follows the steps described above consists in isolating the CPPs without Phe. It is performed
<Desc / Clms Page number 9>
by chromatography on an anion exchange column. This technique is effective and selective; it allows proteins and peptides to be separated with a high degree of purity.
In the dairy sector, this type of resin has already been used industrially to recover the proteins of the whey. For the separation of CPP, several resins were tested and finally opted for the anion exchange resin known as "DEAE SPHERODEX".
The process according to the invention is based on the fact that the non-phosphorylated peptides having Phe residues have PIs much higher than 3.0, while the CPPs almost all have PIs lower than 3.0 and that the CPPs with 1 Phe residue has a PI greater than 2.7. If a column containing an anion exchange resin is loaded with a tryptic hydrolyzate at pH 3.0, the positively charged non-phosphorylated peptides will not be retained, while most of the negatively charged CPPs will form bonds with the resin and will be retained selectively; they can then be elected; which makes it possible to obtain peptides with a reduced Phe level.
In accordance with the invention, a column, of the same resin as in the previous case, is loaded with a tryptic hydrolyzate brought to pH 2.7 or 2.5, that is to say to pH lower than the PI of the 3 CPPs still containing a Phe residue. These 3 CPPs will not be retained by the resin, which makes it possible to isolate the only CPPs absolutely free of Phe.
Only the negatively charged CPPs are retained while the other peptides percolate directly through the column. The CPPs are eluted either by increasing the ionic strength or by decreasing the pH. If necessary, the peptides can be desalted by ultrafiltration and diafiltration using a cutoff threshold membrane of 1000 D, such as a membrane known as "AMICON".
Two examples are given below for obtaining Phe-free peptides obtained from two
<Desc / Clms Page number 10>
EMI10.1
raw materials in different forms.
Example 1: Obtaining Phe-free peptides from sodium caseinate and separation on a column known as "DEAE SPHERODEX" at pH 2.5.
The raw material used is sodium caseinate in powder form. 100 g of sodium caseinate powder are dissolved in 900 g of distilled water. The enzyme / substrate ratio during hydrolysis is 1/1000 (m / v). After hydrolysis and separation of the CPPs according to the process described above, a powder is obtained, the amino acid composition of which is given in table 3 below.
Table 3. Determination of the amino acids of the tryptic phosphopeptides of sodium caseinate separated on "SPHERODEX".
EMI10.2
<tb>
<tb>
Ppept
<tb> <SEP> caseinate <SEP> Na
<tb>% <SEP> M.S. <SEP> 93, <SEP> 34
<tb>% <SEP> N / M.F. <SEP> 9.97.
<tb>
% <SEP> Prot./M.F. <SEP> 63.61
<tb>% <SEP> N / M. <SEP> S. <SEP> 10. <SEP> 68
<tb>% <SEP> Prot./M. <SEP> S. <SEP> 68. <SEP> 15
<tb> With <SEP> 100 <SEP> g <SEP> M. <SEP> S. <SEP> g <SEP>%
<tb> ASP <SEP> 5. <SEP> 446 <SEP> 6. <SEP> 98
<tb> TIIR <SEP> 2. <SEP> 787 <SEP> 3. <SEP> 57
<tb> ON <SEP> H. <SEP> 683 <SEP> 14. <SEP> 98
<tb> GLU <SEP> 26376 <SEP> 33. <SEP> 82
<tb> PRO <SEP> 3. <SEP> 539 <SEP> 4, <SEP> 54
<tb> GLY <SEP> 0. <SEP> 989 <SEP> t. <SEP> 27
<tb> ALA <SEP> 2, <SEP> 817 <SEP> 3. <SEP> 61
<tb> CYS
<tb> VAL <SEP> 5, <SEP> 711 <SEP> 7, <SEP> 32
<tb> MET <SEP> 1.809 <SEP> 2. <SEP> 32
<tb> ILE <SEP> 6.951 <SEP> 8.91
<tb> Location <SEP> 2. <SEP> 879 <SEP> 3, <SEP> 69
<tb> TYR <SEP> 1.351 <SEP> 1.71
<tb> PHE
<tb> IIIS <SEP> 0, <SEP> 615 <SEP> 0, <SEP> 79
<tb> LYS <SEP> 3. <SEP> 384 <SEP> 434
<tb> ARG <SEP> 1, <SEP> 660 <SEP> 2.
<SEP> 1J
<tb> Total <SEP> 77, <SEP> 997 <SEP> 100.00
<tb>
<Desc / Clms Page number 11>
Phenylalanine has completely disappeared from the final product, while the serine concentration reaches a high value. The yield obtained is 5% of the total starting caseins.
Example 2: Obtaining Phe-free peptides from skimmed milk and separation on a column known as "DEAE SPHERODEX" at pH 2.5.
One liter of skimmed milk is hydrolyzed by trypsin and the phosphopeptides are separated according to the method described above. A powder is obtained, the amino acid composition of which is given in Table 4. Phenylalanine is absent. The experimental yield obtained is 5% compared to casein.
Table 4. Determination of the amino acids of the tryptic phosphopeptides of skimmed milk separated on "SPHERODEX".
EMI11.1
<tb>
<tb>
Ppept
<tb> Skimmed milk <SEP>
<tb>% <SEP> M. <SEP> S. <SEP> 95. <SEP> 95
<tb>% <SEP> N / M.F. <SEP> 10.34
<tb>% <SEP> Prot./M.F. <SEP> 65.94
<tb>% <SEP> N / M. <SEP> S. <SEP> 10, <SEP> 77
<tb>% <SEP> Prot./M.s. <SEP> 68.72
<tb> With <SEP> 100 <SEP> g <SEP> M.S. <SEP> g <SEP>%
<tb> ASP <SEP> 5. <SEP> 118 <SEP> 6. <SEP> 28
<tb> THR <SEP> 1. <SEP> 906 <SEP> 2. <SEP> 34
<tb> SER <SEP> 11, <SEP> 131 <SEP> 13, <SEP> 67
<tb> GLU <SEP> 30. <SEP> 743 <SEP> 37. <SEP> 74
<tb> PRO <SEP> 3, <SEP> 339 <SEP> 4, <SEP> 10
<tb> GLY <SEP> 0.838 <SEP> 1, <SEP> 03
<tb> ALA <SEP> 2, <SEP> 610 <SEP> 3, <SEP> 20
<tb> CYS <SEP> 0, <SEP> 876 <SEP> 1, <SEP> 08
<tb> VAL <SEP> 6, <SEP> 442 <SEP> 7, <SEP> 91
<tb> MET <SEP> 2, <SEP> 589 <SEP> 3, <SEP> 18
<tb> ILE <SEP> 6.
<SEP> 956 <SEP> 8, <SEP> 54
<tb> LEU <SEP> 2, <SEP> 454 <SEP> 3, <SEP> 01
<tb> TYR <SEP> 1, <SEP> 200 <SEP> 1, <SEP> 47
<tb> PHE
<tb>! <SEP> US <SEP> 0. <SEP> 472 <SEP> 0, <SEP> 58
<tb> LYS <SEP> 3. <SEP> 339 <SEP> 4, <SEP> 10
<tb> ARG <SEP> 1, <SEP> 440 <SEP> 1, <SEP> 77
<tb> Total <SEP> 81, <SEP> 453 <SEP> 100, <SEP> 00
<tb>