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PROCEDE DE TRANSFORMATION DE CELLULES OE
BACILLUS THURINGIEUSIS
La présente invention concerne un procédé de transformation de cellules de Bacillus thuringiensis.
Les termes"transformer"et"transformation", utilises dans la presente invention, sont destinés ä concerner un mecanisme de transfert génétique dans lequel on introduit de l'ADN exogène dans une bactérie receveuse, en introduisant ainsi des modifications génétiques dans ladite bactérie receveuse.
Les Bacillus thuringiensis (BT) sont des bactéries Gram positives contenant une protéine cristalline, la 6-endo-' toxine (DET), qui est toxique vis-à-vis des larves d'un certain nombre d'insectes. Suivant les sous-espèces, BT est utilise comme pesticide biologique selectif contre différents nuisibles.
Les sous-espèces thuringiensis, alesti et dendrolimus sont, par exemple, pathogenes contre les lépido- patères ; les sous-espèces israelensis, darmstadiensis 73-E- 10-2, kyushuensis et morrisoni PG14 le sont contre les dipatères ; la sous-espèce tenebrionis l'est contre les collo- patères ; les sous-espèces kurstaki HD-l, kenyae, aizawai et colmeri le sont contre les lépidoptères et les dipteres, tandis que les sous-espèces dakota, indiana, tokokuensis et kumamotoensis ne sont pas connues pour être toxiques vis-a-vis de tous les nuisibles.
D'un point de vue industriel et écologique, il est souhaitable de disposer de pesticides biologiques additionnels ayant un spectre d'activiste différent, par exemple superieur ou plus large.
On peut, par exemple, atteindre ce but en mettant au point de nouveaux isolats ä partir de la nature, par conjugaison de bactéries ou par transformation de bacteries.
Ainsi,. on a récemment isolé de nouvelles souches de BT ayant une activite interessante (par exemple var. tenebrio-
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nis ayant une activité contre les coléoptères) et il a également été fait état de récents succès concernant la conjugaison de souches de BT.
La transformation des bacteries offre l'avantage qu'elle permet, si elle est couronnée de succès, d'introduire une information génétique spécifique dans des bactéries.
Ainsi, un gene codant pour une DET a été cloné dans divers microorganismes tels que Escherichia coli, Bacillus subtilis et Pseudomonas fluorescens, et meme dans des plantes supérieures (tabac), par des techniques d'ADN recombinant, plus spécifiquement par transformation.
Ces organismes manipulés génétiquement produisent cependant de faibles quantites de DET comparées aux quantités produites par des souches de BT naturelles. L'importance commerciale de ces organismes est donc discutable, au moins aussi longtemps qu'aucun moyen n'aura été trouve pour améliorer l'expression de l'ADN exogène encodant pour la DET.
11 semblerait donc indiqué d'essayer d'obtenir une meilleure expression de gènes exogènes (ADN) en utilisant une bactérie BT comme bactérie receveuse dans des techniques de transformation.
Les techniques de transformation connues sont essentiellement réalisées à l'aide de cellules ou de protoplastes.
La transformation de cellules implique la présence de cellules competentes, c'est-à-dire de cellules ä un état physiologique précis permettant la liaison et l'absorption d'ADN exogène. On ne dispose cependant d'aucune preuve de l'existence de cellules de BT compétentes.
On a fait état du succès de la transformation de protoplastes de BT par l'ADN avec des rendements seulement très faibles, à savoir sensiblement plus faibles que ceux obtenus avec la transformation de B. subtilis. Les rendements faibles peuvent etre dus en partie à la regeneration mediocre des protoplastes, y compris du protoplaste transformé. Bien
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que Shall et coll. (Fundamental and applied aspects of invertebrate Pathology-Aspects fondamentaux et appliques de la pathologie des invertébrés -, édité par R.A. samson, J. M. Vlak et D.
Peters, 1986, page 402) annoncent qu'ils ont optimisé la procedure employant des protoplastes et qu'ils ont mis au point des milieux de régénération améliorés pour transformer BT ou B. cereus avec le plasmide ADN, ils ne précisent pas la nature de l'optimisation ou de l'amelio- ration.
Les fréquences de transformation indiquées par Shall et coll. sont donc difficiles ä interpréter.
La présente invention a maintenant pour objet un procédé améliore de transformation de BT. 11 est base sur la découverte que les microorganismes de BT développent ce que l'on appelle un statut de compétence lorsqu'ils sont introduits dans un milieu aqueux hypertonique.
Le terme"hypertonique", tel qu'il est utilise dans la présente invention, concerne un milieu qui est hypertonique vis-a-vis des milieux de BT classiques (culture ou croissance cellulaire).
Le procédé de l'invention met en jeu les étapes qui consistent : a) ä cultiver des cellules de BT dans un milieu aqueux hypertonique, b) ä introduire dans la culture cellulaire obtenue dans l'étape a), et en presence de polyethylene-glycol, de l'ADN exogène tout en maintenant l'état hypertonique, et c) ä isoler et ä remettre en suspension les cellules de BT ainsi traitées dans un milieu aqueux hypertonique pour permettre l'expression.
En principe, on peut employer tout composé qui ne traverse pas la membrane cellulaire semi-perméable et qui n'est pas métabolisé par, ou toxique vis-à-vis de, la cellule de BT, pour obtenir l'état hypertonique recherché. En general, l'etat hypertonique recherche est avantageusement obtenu à
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l'aide de saccharides, en particulier de mono-ou de disaccharides, qui ne sont pas métabolisés par BT. Des exemples convenables de ces saccharides sont le saccharose et le lactose.
La concentration des saccharides ä employer pour obtenir l'état hypertonique recherche est avantageusement de l'ordre de 0, 4M de saccharides par litre de milieu aqueux, ou supérieure. En general, on obtiendra de bons résultats avec des concentrations essentiellement isotoniques vis-à- vis du cytoplasme de BT. Cet etat osmotique est en général obtenu avec une concentration de O, 4M à O, SM de saccharides par litre de milieu aqueux. Des concentrations supérieures en saccharides peuvent être cependant employées, mais elles n'offrent en général aucun avantage.
Le terme "hypertonique" employé ci-dessous concerne un état ou un milieu tel que défini ci-dessus.
Il est important que les conditions hypertoniques soient essentiellement maintenues d'un bout à l'autre des différentes étapes a) ä c) du procédé.
Les milieux aqueux hypertoniques doivent etre essentiellement neutres, c'est-à-dire qu'ils doivent avantageusement avoir un pH de 7 t 2, mieux encore de 7 t 1.
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En plus des saccharides (servant ä maintenir l'etat hypertonique) et des tampons eventuels (servant à maintenir un etat essentiellement neutre du milieu) d'autres ingrédients peuvent être et seront ajoutes, par exemple pour permettre la croissance et le développement de la culture de BT, le cas échéant, etc.
Ces ingrédients supplémentaires sont classiques et connus de l'homme de métier; ils comprennent, par exemple, des nutriments et des sels.
Des exemples de nutriments convenables sont, par exemple, l'extrait de boeuf, l'extrait de levure, les peptones, les tryptones, les acides amines (par exemple le tryptophane), les nucléosides comme la thymidine et ana-
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logues.
Des exemples de sels convenables sont NaCl et
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Mgd, O. Un milieu hypertonique convenable peut contenir de 0, de sels par litre. Les sels engloberont de
6Hpréférence les sels de magnesium, comme MgC12, 6H20,
La culture cellulaire de BT (produit de depart) est avantageusement préparée et cultivée dans des conditions classiques, c'est-ä-dire sous aération et ä la température ambiante, dans un milieu nutritif approprie, par exemple dans le milieu minimal décrit par J. Spizizen dans Proc.
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natl. Acad. Sei. (Wash) 44, 171-175 (1958), eventuellement supplémenté par des acides aminés, des sels, par exemple des quantités catalytiques de sel de manganese tel que MnSO etc. Il est avantageux d'employer, dans l'étape a), une culture de cellules de BT qui se trouve dans la phase de croissance exponentielle.
La culture de cellules de BT fraichement préparée est ensuite diluée dans un milieu hypertonique à une concentration cellulaire de départ essentiellement inférieure ä 109 cellules par ml, par exemple de 104 ä 106 cellules par ml, et la culture cellulaire est cultivée, dans ledit milieu hypertonique, jusqu'à ce que l'on obtienne un milieu de concentration cellulaire légèrement inférieure ä 109 cellules par ml, par exemple de 108 à 5. 108 cellules par ml.
Le milieu hypertonique employé pour diluer la culture de cellules de BT fraîchement préparée est avantageusement ä 20-40OC, par exemple à 37OC. On laisse ensuite la culture s'effectuer à cette température. 11 est bien évident qu'il faut garantir une aération poussée. Une légère quantité de silicone est avantageusement ajoutée au milieu de culture cellulaire pour empecher le moussage.
Lorsqu'on atteint la concentration cellulaire finale souhaitee (légèrement inférieure ä 109 cellules par ml), on peut traiter les cellules de BT compétentes ainsi préparées avec l'ADN, en présence de polyéthylène-glycol (PEG), selon
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l'étape b) du procédé de l'invention.
Il est toutefois avantageux de traiter les cellules de BT compétentes obtenues selon l'étape a) de l'invention avec des concentrations modérées de lysozyme dans un milieu hypertonique et d'isoler et de remettre en suspension les cellules de BT traitées au lysozyme dans un milieu hypertonique, avant de les soumettre au processus b). La quantité de lysozyme ä employer doit etre inferieure ä celle qu'on utilise normalement pour preparer des protoplastes. Cette quantité (concentration) dépendra bien entendu de divers facteurs comme la pression osmotique du milieu, sa temperature, la durée de réaction souhaitée, etc.
En général, une concentration convenable en lysozyme est de 20 à 300 Ag, par - exemple de 200 lig, par ml de milieu aqueux hypertonique (ce qui est essentiellement inférieur aux 2 ä 15 mg par ml qui seraient normalement nécessaires pour des applications concernant des protoplastes). Il faut garantir une distribution adequate du lysozyme dans le milieu de culture cellulaire. La durée de reaction dépendra donc de la concentration et de la qualité de la solution de lysozyme employée.
La durée de réaction optimale peut être déterminée par des essaie standards.
La temperature réactionnelle est avantageusement comprise entre 20 et 40OC, de préférence supérieure a la température ambiante, par exemple d'environ 37OC.
Pendant le traitement au lysozyme, il faut maintenir l'état hypertonique, tel que défini ci-dessus.
Le traitement au lysozyme est ensuiteterminé par centrifugation de la suspension cellulaire et remise en suspension des agrégats dans le milieu hypertonique, avantageusement à la température ambiante.
La culture des cellules de BT ainsi préparée - obtenue selon l'étape a), eventuellement suivie du traitement au lysozyme-est ensuite traitée avec de l'ADN, par exemple le plasmide ADN, en présence de polyéthylène-glycol (PEG). Dans
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ce but, l'ADN, ainsi que le PEG, sont employés en suspen- sions/solutions dans des solutions hypertoniques, de sorte que la pression osmotique de la suspension cellulaire demeure essentiellement inchangée après l'addition d'ADN et de PEG ä cette suspension cellulaire.
La quantité de PEG employee sera avantageusement choisie de telle sorte que sa concentration dans la culture de cellules de BT se situe dans l'Intervalle de 100 ä 400 g par litre, par exemple ä 300 g par litre de milieu de culture cellulaire.
L'étape de transformation b) peut etre essentiellement réalisée dans les conditions connues comme etant appropriée aux procédés classiques de transformation des protoplastes.
En conséquence, le choix de la quantité appropriée et du type approprié de PEG et de la quantite appropriée d'ADN à employer peut être effectue convenablement par l'homme du métier de la transformation des protoplastes.
Ainsi, un exemple de PEG utilisable dans ce procédé est le PEG 6000.
Des quantités d'ADN de 100 ng ä 20 lig pour 108 ä 109 cellules de BT donneront en general de bons resultats.
L'incubation est avantageusement réalisée sous agitation modérée à la temperature ambiante. Le temps d'incubation nécessaire est court, en general de l'ordre de quelques minutes (voir l'exemple).
La suspension comprenant les cellules transformées est ensuite traitee a l'aide de procédés connus, à condition que l'état hypertonique du solvant des cellules soit maintenu (dans le cas où elles sont en solution/suspension). Ainsi, la suspension est, par exemple, diluee dans une solution hypertonique, la suspension est mélangée, centrifugée et les agrégats remis en suspension dans le milieu hypertonique.
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La suspension resultante est ensuite incubée ä une temerature de 20 ä 40oc, par exemple ä 37OC, pour permettre l'expression. La suspension est avantageusement aérée, par
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exemple ä l'aide d'un bain marie agité . Un temps d'incu- bation approprié est de 30 minutes ä 5 heures, mieux encore compris entre 2 et 4 heures, par exemple 3 heures.
On peut ensuite placer des dilutions appropriées des cultures cellulaires ainsi obtenues dans des boites de Pétri pour déterminer les unités formant colonie (CFU). On peut déterminer la fréquence de transformation par des procédés connus employant des techniques standard, comme des boites de Pétri contenant un antibiotique, l'observation visuelle, etc.
Le procédé de la présente invention permet la transformation de cellules de BT avec des rendements élevés. La transformation permet le clonage de gênes de bibliothèques de génomes dans des cellules de BT, le clonage et l'expression de genes de DET dans BT, le clonage et l'expression de gènes de DET modifies in vitro et in vivo dans BT, la synthèse de polypeptides utiles, etc.
Lorsque les cellules de BT transformdes sont destinees ä etre utilisées comme pesticides biologiques, elles sont avantageusement employées sous forme de compositions insecticides, par exemple sous forme de suspensions concentrées ou sous forme de poudres. Ces compositions peuvent etre obtenues d'une manibre classique.
Dans l'exemple non limitatif suivant, les produits de départ (cellules de BT et plasmide ADN) sont choisis de telle sorte que les résultats ne soient pas ambigus et ne puissent etre dus ä une interaction du plasmide ; les cellules de BT utilisees comme produit de départ ne contiennent pas de plasmides, le plasmide ADN utilisé comme agent de transformation encodant pour la résistance ä la tétracy- cline.
On remarquera que d'autres cellules de BT et/ou d'ADN exogènes, en particulier un plasmide ADN, peuvent etre utilisées dans le procédé de l'invention avec des résultats analogues.
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Les températures sont exprimées en centigrades et les parties en poids, sauf indication contraire.
Exemple Produits de depart
Souche : Bacillus thurinctiensis. sous-espèce kurstaki HDl cry B (obtenue auprès de M.-M. Lecadet, Institut Pasteur, Paris), ne contenant pas de plasmides.
ADN : pBC16. 1 (Kraft. J. et coll. (1978) Molec. gen.
Genet. 162 ; 59-67), extrait de HD1 cry B (pBCl6. 1), dans lequel il a été introduit par conjugaison par adaptation cellulaire avec B. subtilis BD224 (pBC16. 1), codant pour la résistance ä la tétracycline.
Milieux
SA Trp : Milieu minimal spizizen (Spizizen J. (1958) Proc. natl. Acad. Sei. (Wash.) 44 ; 171-175) supplémenté par des Casaminoacides ä 1\ (Difco), 5 x 10-6M de MnSO4 et 20 g/ml de tryptophane.
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<tb>
<tb>
Milieu <SEP> hypertonique <SEP> (MH) <SEP> :
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 1,50 <SEP> g/l
<tb> Peptone <SEP> 5,00 <SEP> g/l
<tb> NaCl <SEP> 3, <SEP> 50 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Saccharose <SEP> 171, <SEP> 15 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Acide <SEP> maléfique <SEP> 2, <SEP> 32 <SEP> g/l <SEP>
<tb> MgCl2,6H2O <SEP> 4,07 <SEP> g/l
<tb> pH <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Milieu <SEP> Luria <SEP> (LA) <SEP> : <SEP>
<tb> Tryptone <SEP> 10 <SEP> g/l
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 5 <SEP> g/l
<tb> NaCl <SEP> 10 <SEP> g/l
<tb> Gelose <SEP> (Difco <SEP> Bacto) <SEP> 15 <SEP> g/1
<tb> Thymidine <SEP> 20 <SEP> mg/l
<tb> Antibiotiques <SEP> : <SEP> Tétracycline, <SEP> 10-100 <SEP> g/ml <SEP> sur <SEP> des
<tb> plaques <SEP> ä <SEP> milieu <SEP> Luria.
<tb>
Solutions
<tb> SMM <SEP> : <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 171, <SEP> 15 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Acide <SEP> maléique <SEP> 2, <SEP> 32 <SEP> g/l <SEP>
<tb> MgCl2,6H2O <SEP> 4,07 <SEP> g/l
<tb> pH <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP>
<tb> PEG <SEP> :
<tb> PEG <SEP> 6000 <SEP> 40 <SEP> 9
<tb> SMM <SEP> qsp <SEP> 100 <SEP> ml
<tb>
Lysozyme : 2 mg/ml dans MH, fraichement prépqaré.
Procédé
On prépare une culture d'une nuit de HD1 cry B dans 15 ml de SA Trp et on la fait croître sous aération ä 2Q C. La lendemain matin, la culture est diluée ä 50-100 fois dans un milieu MH préchauffé, jusqu'à une concentration cellulaire de depart de 7, 5 x 105 par millilitre. On ajoute 2 il de silicone pour empêcher le moussage. La culture croit 370C sous aération modérée pendant trois heures et demie, à savoir jusqu'à une concentration cellulaire de 2, 5 x 108 - 3 x 108 par ml. Le lysozyme est ajoute jusqu'à une concentration finale de 200 ug/ml et 1 ml de suspension cellulaire est incubé pendant 30 minutes ä 37OC, dans un bain marie agité (150 t/min) .
La suspension cellulaire est ensuite centrifugée pendant une minute sous 10 000 G et les agrégats sont remis en suspension dans 1 ml de MH frais à la température ambiante.
On ajoute 0, 5 ml de suspension cellulaire ä 50 l de SMM, auxquels ont té ajoutés 100 ng-10 lig de plasmide ADN.
Les cellules sont transformées par addition de 1, 5 ml de solution de PEG, agitation modérée et incubation de 2 min. à la température ambiante. On ajoute 5 ml de MH à la suspension cellulaire, que l'on mélange doucement mais ä fond et que l'on centrifuge pendant 20 minutes sous 3000 G. On remet les agrégats en suspension dans 0, 6 ml de MH et on incube pendent 3 heures ä 370C dans un bain marie agité (150 t/m:in)pour permettre l'expression. On place les dilutions appropriées dans des boites ä longue durée d'action pour dé-
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terminer les CFU et dans des boîtes à longue durée d'action contenant de la tétracycline pour la selection. de la substance transformatrice.
On obtient 1-2 x 103 substances transformatrices par ag de plasmide ADN intact, avec une fréquence de 5x10-5-10-4.
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PROCESS FOR TRANSFORMING OE CELLS
BACILLUS THURINGIEUSIS
The present invention relates to a process for transforming Bacillus thuringiensis cells.
The terms "transform" and "transformation", used in the present invention, are intended to relate to a genetic transfer mechanism in which exogenous DNA is introduced into a recipient bacterium, thereby introducing genetic modifications into said recipient bacterium.
Bacillus thuringiensis (BT) are Gram positive bacteria containing a crystalline protein, 6-endotoxin (DET), which is toxic to the larvae of a number of insects. Depending on the subspecies, BT is used as a selective biological pesticide against various pests.
The subspecies thuringiensis, alesti and dendrolimus are, for example, pathogenic against lepidopatera; the subspecies israelensis, darmstadiensis 73-E-10-2, kyushuensis and morrisoni PG14 are against dipaters; the subspecies tenebrionis is against the co-peers; the subspecies kurstaki HD-l, kenyae, aizawai and colmeri are against lepidoptera and diptera, while the subspecies dakota, indiana, tokokuensis and kumamotoensis are not known to be toxic to everyone the pests.
From an industrial and ecological point of view, it is desirable to have additional biological pesticides having a different spectrum of activists, for example higher or wider.
This can, for example, be achieved by developing new isolates from nature, by conjugation of bacteria or by transformation of bacteria.
So,. recently isolated strains of BT with interesting activity (eg var. tenebrio-
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nis with activity against beetles) and recent successes in conjugating BT strains have also been reported.
The transformation of bacteria offers the advantage that it allows, if it is successful, to introduce specific genetic information into bacteria.
Thus, a gene encoding a DET has been cloned in various microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis and Pseudomonas fluorescens, and even in higher plants (tobacco), by recombinant DNA techniques, more specifically by transformation.
These genetically engineered organisms, however, produce small amounts of DET compared to the amounts produced by natural strains of BT. The commercial importance of these organisms is therefore questionable, at least as long as no means has been found to improve the expression of exogenous DNA encoding DET.
It would therefore seem appropriate to try to obtain a better expression of exogenous genes (DNA) by using a BT bacterium as a recipient bacterium in transformation techniques.
The known transformation techniques are essentially carried out using cells or protoplasts.
The transformation of cells involves the presence of competent cells, that is to say cells in a precise physiological state allowing binding and absorption of exogenous DNA. However, there is no evidence of the existence of competent BT cells.
The success of the transformation of BT protoplasts by DNA has been reported with only very low yields, namely significantly lower than those obtained with the transformation of B. subtilis. The low yields may be due in part to poor regeneration of protoplasts, including the transformed protoplast. Good
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that Shall et al. (Fundamental and applied aspects of invertebrate Pathology-Fundamental and applied aspects of invertebrate pathology -, edited by R.A. samson, J. M. Vlak and D.
Peters, 1986, page 402) announce that they have optimized the procedure using protoplasts and that they have developed improved regeneration media to transform BT or B. cereus with the plasmid DNA, they do not specify the nature of optimization or improvement.
The transformation frequencies indicated by Shall et al. are therefore difficult to interpret.
The present invention now relates to an improved process for transforming BT. It is based on the discovery that the microorganisms of BT develop what is called a competence status when they are introduced into an aqueous hypertonic medium.
The term "hypertonic", as used in the present invention, relates to a medium which is hypertonic with respect to conventional BT media (cell culture or growth).
The process of the invention involves the steps which consist in: a) culturing BT cells in an aqueous hypertonic medium, b) introducing into the cell culture obtained in step a), and in the presence of polyethylene- glycol, exogenous DNA while maintaining the hypertonic state, and c) isolating and resuspending the BT cells so treated in a hypertonic aqueous medium to allow expression.
In principle, any compound which does not cross the semi-permeable cell membrane and which is not metabolized by, or toxic towards, the BT cell can be used to obtain the desired hypertonic state. In general, the hypertonic state sought is advantageously obtained at
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using saccharides, in particular mono- or disaccharides, which are not metabolized by BT. Suitable examples of these saccharides are sucrose and lactose.
The concentration of saccharides to be used to obtain the desired hypertonic state is advantageously of the order of 0.4 M saccharides per liter of aqueous medium, or higher. In general, good results will be obtained with essentially isotonic concentrations vis-à-vis the cytoplasm of BT. This osmotic state is generally obtained with a concentration of 0.4 M to O, MS of saccharides per liter of aqueous medium. Higher concentrations of saccharides can, however, be used, but they do not generally offer any advantage.
The term "hypertonic" used below relates to a state or a medium as defined above.
It is important that the hypertonic conditions are essentially maintained throughout the different stages a) to c) of the process.
The hypertonic aqueous media must be essentially neutral, that is to say that they must advantageously have a pH of 7 t 2, better still of 7 t 1.
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In addition to the saccharides (used to maintain the hypertonic state) and possible buffers (used to maintain an essentially neutral state of the medium) other ingredients can be and will be added, for example to allow the growth and development of the culture. BT, if applicable, etc.
These additional ingredients are conventional and known to those skilled in the art; they include, for example, nutrients and salts.
Examples of suitable nutrients are, for example, beef extract, yeast extract, peptones, tryptones, amino acids (eg tryptophan), nucleosides such as thymidine and ana-
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logues.
Examples of suitable salts are NaCl and
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Mgd, O. A suitable hypertonic medium can contain 0, salts per liter. The salts will include
6H preferably magnesium salts, such as MgC12, 6H20,
The cell culture of BT (starting product) is advantageously prepared and cultivated under conventional conditions, that is to say under aeration and at room temperature, in an appropriate nutritive medium, for example in the minimal medium described by J Spizizen in Proc.
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natl. Acad. Sei. (Wash) 44, 171-175 (1958), optionally supplemented with amino acids, salts, for example catalytic amounts of manganese salt such as MnSO etc. It is advantageous to use, in step a), a culture of BT cells which is in the exponential growth phase.
The freshly prepared BT cell culture is then diluted in hypertonic medium to a starting cell concentration essentially lower than 109 cells per ml, for example from 104 to 106 cells per ml, and the cell culture is cultured in said hypertonic medium. until a medium with a cell concentration of slightly less than 109 cells per ml, for example from 108 to 5,108 cells per ml, is obtained.
The hypertonic medium used to dilute the freshly prepared BT cell culture is advantageously 20-40 ° C, for example 37 ° C. The culture is then allowed to proceed at this temperature. It is quite obvious that it is necessary to guarantee a thorough ventilation. A slight amount of silicone is advantageously added to the cell culture medium to prevent foaming.
When the desired final cell concentration is reached (slightly less than 109 cells per ml), the competent BT cells thus prepared can be treated with DNA, in the presence of polyethylene glycol (PEG), according to
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step b) of the process of the invention.
It is however advantageous to treat the competent BT cells obtained according to step a) of the invention with moderate concentrations of lysozyme in a hypertonic medium and to isolate and resuspend the BT cells treated with lysozyme in a hypertonic medium, before submitting them to process b). The amount of lysozyme to be used should be less than that normally used to prepare protoplasts. This quantity (concentration) will of course depend on various factors such as the osmotic pressure of the medium, its temperature, the desired reaction time, etc.
In general, a suitable lysozyme concentration is 20 to 300 Ag, for example 200 µg, per ml of hypertonic aqueous medium (which is essentially less than the 2 to 15 mg per ml which would normally be required for applications involving protoplasts). Adequate distribution of lysozyme must be guaranteed in the cell culture medium. The reaction time will therefore depend on the concentration and the quality of the lysozyme solution used.
The optimal reaction time can be determined by standard tests.
The reaction temperature is advantageously between 20 and 40 ° C., preferably higher than room temperature, for example around 37 ° C.
During treatment with lysozyme, the hypertonic state, as defined above, must be maintained.
The lysozyme treatment is then terminated by centrifugation of the cell suspension and resuspension of the aggregates in the hypertonic medium, advantageously at room temperature.
The BT cell culture thus prepared - obtained according to step a), optionally followed by treatment with lysozyme - is then treated with DNA, for example the DNA plasmid, in the presence of polyethylene glycol (PEG). In
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For this purpose, DNA, as well as PEG, are used in suspensions / solutions in hypertonic solutions, so that the osmotic pressure of the cell suspension remains essentially unchanged after the addition of DNA and PEG to this cell suspension.
The amount of PEG employed will advantageously be chosen such that its concentration in the BT cell culture is in the range of 100 to 400 g per liter, for example 300 g per liter of cell culture medium.
Transformation step b) can essentially be carried out under conditions known to be suitable for conventional protoplast transformation processes.
Accordingly, the choice of the appropriate amount and type of PEG and the appropriate amount of DNA to be used can be properly made by those skilled in the art of protoplast transformation.
Thus, an example of PEG usable in this process is PEG 6000.
Amounts of DNA from 100 ng to 20 µl per 108 to 109 cells of BT will generally give good results.
The incubation is advantageously carried out with moderate shaking at room temperature. The required incubation time is short, usually on the order of a few minutes (see example).
The suspension comprising the transformed cells is then treated using known methods, provided that the hypertonic state of the solvent of the cells is maintained (in the case where they are in solution / suspension). Thus, the suspension is, for example, diluted in a hypertonic solution, the suspension is mixed, centrifuged and the aggregates resuspended in the hypertonic medium.
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The resulting suspension is then incubated at a temperature of 20 to 40oc, for example 37oc, to allow expression. The suspension is advantageously ventilated, by
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example using a stirred water bath. A suitable incubation time is 30 minutes to 5 hours, more preferably between 2 and 4 hours, for example 3 hours.
Appropriate dilutions of the cell cultures thus obtained can then be placed in Petri dishes to determine the colony forming units (CFU). The frequency of transformation can be determined by known methods employing standard techniques, such as petri dishes containing an antibiotic, visual observation, etc.
The method of the present invention allows transformation of BT cells with high yields. The transformation allows the cloning of genomes from genome libraries in BT cells, the cloning and expression of DET genes in BT, the cloning and expression of modified DET genes in vitro and in vivo in BT, the synthesis of useful polypeptides, etc.
When the transformed BT cells are intended to be used as biological pesticides, they are advantageously used in the form of insecticidal compositions, for example in the form of concentrated suspensions or in the form of powders. These compositions can be obtained in a conventional manner.
In the following nonlimiting example, the starting products (BT cells and DNA plasmid) are chosen so that the results are not ambiguous and cannot be due to an interaction of the plasmid; the BT cells used as starting material do not contain plasmids, the DNA plasmid used as a transforming agent encoding resistance to tetracycline.
It will be noted that other cells of BT and / or of exogenous DNA, in particular a DNA plasmid, can be used in the process of the invention with analogous results.
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Temperatures are expressed in centigrade and parts by weight, unless otherwise indicated.
Example Starting products
Strain: Bacillus thurinctiensis. kurstaki HDl cry B subspecies (obtained from M.-M. Lecadet, Institut Pasteur, Paris), containing no plasmids.
DNA: pBC16. 1 (Kraft. J. et al. (1978) Molec. Gen.
Broom. 162; 59-67), extract of HD1 cry B (pBC16.1), into which it was introduced by conjugation by cellular adaptation with B. subtilis BD224 (pBC16.1), coding for resistance to tetracycline.
Environments
SA Trp: Spizizen minimal medium (Spizizen J. (1958) Proc. Natl. Acad. Sci. (Wash.) 44; 171-175) supplemented with Casamino acids at 1 \ (Difco), 5 x 10-6M of MnSO4 and 20 g / ml tryptophan.
EMI9.1
<tb>
<tb>
Hypertonic <SEP> medium <SEP> (MH) <SEP>:
<tb> Extract <SEP> from <SEP> beef <SEP> 1.50 <SEP> g / l
<tb> Peptone <SEP> 5.00 <SEP> g / l
<tb> NaCl <SEP> 3, <SEP> 50 <SEP> g / l <SEP>
<tb> Sucrose <SEP> 171, <SEP> 15 <SEP> g / l <SEP>
<tb> Evil acid <SEP> <SEP> 2, <SEP> 32 <SEP> g / l <SEP>
<tb> MgCl2,6H2O <SEP> 4.07 <SEP> g / l
<tb> pH <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Middle <SEP> Luria <SEP> (LA) <SEP>: <SEP>
<tb> Tryptone <SEP> 10 <SEP> g / l
<tb> <SEP> extract from <SEP> yeast <SEP> 5 <SEP> g / l
<tb> NaCl <SEP> 10 <SEP> g / l
<tb> Gelose <SEP> (Difco <SEP> Bacto) <SEP> 15 <SEP> g / 1
<tb> Thymidine <SEP> 20 <SEP> mg / l
<tb> Antibiotics <SEP>: <SEP> Tetracycline, <SEP> 10-100 <SEP> g / ml <SEP> on <SEP> of
<tb> plates <SEP> ä <SEP> middle <SEP> Luria.
<tb>
Solutions
<tb> SMM <SEP>: <SEP>
<tb>
<Desc / Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb>
<tb> Sucrose <SEP> 171, <SEP> 15 <SEP> g / l <SEP>
<tb> Maleic acid <SEP> <SEP> 2, <SEP> 32 <SEP> g / l <SEP>
<tb> MgCl2,6H2O <SEP> 4.07 <SEP> g / l
<tb> pH <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP>
<tb> PEG <SEP>:
<tb> PEG <SEP> 6000 <SEP> 40 <SEP> 9
<tb> SMM <SEP> qsp <SEP> 100 <SEP> ml
<tb>
Lysozyme: 2 mg / ml in HD, freshly prepared.
Process
An overnight culture of HD1 cry B is prepared in 15 ml of SA Trp and it is grown under aeration at 2 ° C. The next morning, the culture is diluted 50-100 times in a preheated MH medium, until at a starting cell concentration of 7.5 x 105 per milliliter. Add 2 µl of silicone to prevent foaming. The culture believes 370C under moderate aeration for three and a half hours, namely up to a cell concentration of 2.5 × 10 8 - 3 × 108 per ml. The lysozyme is added to a final concentration of 200 ug / ml and 1 ml of cell suspension is incubated for 30 minutes at 37 ° C. in a stirred water bath (150 rpm).
The cell suspension is then centrifuged for one minute under 10,000 G and the aggregates are resuspended in 1 ml of fresh MH at room temperature.
0.5 ml of cell suspension is added to 50 l of SMM, to which 100 ng-10 μl of plasmid DNA have been added.
The cells are transformed by adding 1.5 ml of PEG solution, moderate shaking and incubation for 2 min. at room temperature. 5 ml of MH are added to the cell suspension, which is gently but thoroughly mixed and which is centrifuged for 20 minutes under 3000 G. The aggregates are resuspended in 0.6 ml of MH and incubated 3 hours at 370C in a stirred water bath (150 rpm: in) to allow expression. The appropriate dilutions are placed in long-acting boxes to
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complete CFUs and in long-acting boxes containing tetracycline for selection. of the transforming substance.
1-2 x 103 transforming substances are obtained per ag of intact DNA plasmid, with a frequency of 5x10-5-10-4.