AT525943A9

AT525943A9 - Konjugat bestehend aus oder umfassend zumindest ein ß-Glucan oder ein Mannan

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Publication number: AT525943A9
Application number: ATA50128/2022A
Authority: AT
Original assignee: Tridem Bioscience Gmbh & Co Kg
Priority date: 2022-02-28
Filing date: 2022-02-28
Publication date: 2024-07-15
Also published as: AT525943A3; AT525943A2; AT525943B1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von β -Glucanen oder Mannanen als C-Typ Lectin (CLEC) Polysaccharid-Adjuvantien für B- Zell- oder T-Zell-Epitop-Polypeptide von alpha-Synuclein.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Polysaccharid-AdJuvantien, die zur Klasse der Lektine vom Typ C (CLEC) gehören.

Die Impfung gilt als eines der wirksamsten Mittel, um Leben zu retten und die Krankheitslast zu verringern. Bei der aktiven Immunisierung wird der Impfstoff so verabreicht, dass das Immunsystem des Wirts eine unspezifische angeborene Immunantwort sowie spezifische Antikörper, B- und T-Gedächtniszellen entwickelt, die gegen das verabreichte Immunogen wirken können.

Mannan, ein aus der Hefezellwand stammendes Polysaccharid, besteht aus einem Gerüst aus überwiegend ß-(1,4)-verknüpfter Mannose mit einer geringen Anzahl von a-(1,6)-verknüpften Glucoseund Galaktose-Seitenkettenresten. Darüber hinaus wurde in herkömmlichen Mannanpräparaten ein Proteingehalt von etwa 5 % festgestellt. Als wichtiger Bestandteil von Pilzzellwänden wurde Mannan in großem Umfang als Komponente in kohlenhydratbasierten Impfstoffen gegen Candidiasis verwendet (Han und Rhew, Arch Pharm Res 2012, Vol 35, No 11, 2021-2027; Cassone, Nat Rev Microbiol. 2013 Dec;11(12):884-91; Johnson und Bundle, Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 4327). Darüber hinaus wurden verschiedene Beispiele für Impfstoffe auf der Grundlage von Mannan-Träger-Antigen-Komplexen/Konj]jugationen entwickelt, darunter die Kon]ugation von Mannan-Mucin 1 (MUC1) als Fusionsprotein für die Tumortherapie oder Konjugate aus Mannan und Modellallergenen wie Ovalbumin (OVA), Papain oder Betvl.

Mucine sind stark glykosylierte Proteine, die auf Zelloberflächen exprimiert werden. MUC1 ist ein prototypisches Mucin, das auf einer Vielzahl von Tumorzellen überexprimiert ist. In diesem Sinne wurde ein MUC1-Fusionsprotein mit 5 Tandem-Repeats von humanem MUC1 (mit dem immundominanten Epitop: APDTRPAPGSTAPPAHGVTS) und einem Peptid (Cpl3-32) hergestellt und entweder unter oxidativen oder reduktiven Bedingungen an Mannan konjugiert, was zu drastisch unterschiedlichen immunologischen Reaktionen führte: Oxidiertes Mannan-MUC1 stimulierte Thl1-Typ-Antworten, die von CD8+ T-Zellen mit IFN-vy-Sekretion und hauptsächlich einer IgG2a-Antikörperantwort vermittelt wurden, während reduziertes Mannan-MUC1 Th2-Typ-Antworten mit IL-4-Produktion und einer hohen IgGl-Antikörperantwort stimulierte. Das verwendete Fusionsprotein stellt ein einziges Protein dar, das T- und B-Zell-Epitope aufweist.

Kürzlich wurden auch Protein-Kohlenhydrat-Mannan-Komplexe aus Papain und OVA hergestellt, um deren allergenes Potenzial zu ana-

lysieren. Es wurde festgestellt, dass die Kopplung von Mannan an

die Proteinoberfläche die Bindung und Vernetzung von gegen Papain gerichteten IgE-Antikörpern verringern kann. Interessanterweise verringerte die Kopplung von Mannan, Dextran oder Maltodextrin in diesen Experimenten nur das allergene Potenzial von Papain, nicht aber von OVA, was auf die Bedeutung der Kohlenhydratauswahl für die Entwicklung von Impfstoffen hinweist (Weinberger et al. J. Control. Release 2013; 165:101-109). Diese Experimente zeigten auch, dass die Konjugation mit Mannan zur Entwicklung erhöhter IgG-Titer gegen OVA nach intradermaler Immunisierung führt.

Ähnlich wie bei dem für MUC1 verwendeten NeoglykokonjugatImpfstoff verwendeten GChochikyan et al. (DNA AND CELL BIOLOGY, Band 25, Nummer 10, 2006, S. 571-580) und Petrushina et al. (Journal of Neuroinflammation 2008, 5:42) Amyloid beta (Aß)28, ein Peptid mit 28 Aa-Resten, das kombinierte B- und T-Zell-Epitope des menschlichen Aß42-Peptids trägt, gekoppelt an Mannan, und konnten bei Mäusen geringe Anti-Aß-Reaktionen auslösen. Diese Reaktionen konnten auch die Amyloidablagerungen in den kortikalen und hippokampalen Regionen von APP-transgenen Mäusen nach subkutaner Immunisierung abschwächen. Die Immunisierung führte auch zur Induktion erhöhter Anti-Mannan-Titer bei mit Aß28-Mannan und BSA-Mannan behandelten Tieren. Die Behandlung wurde jedoch nicht weiterentwiCkelt, wahrscheinlich aufgrund des Auftretens von vermehrten Mikroblutungen im Gehirn der behandelten Tiere, die auf mögliche schädliche Wirkungen von Mannan als Auslöser unerwünschter vaskulärer Ereignisse zurückgeführt wurden, was die Bedeutung der Kohlenhydratauswahl für die Entwicklung effizienter und sicherer Impfstoffe unterstreicht.

Bisher sind keine Kon]ugate bekannt, bei denen einzelne BZell- oder T-Zell-Epitope an Mannan oder andere verwandte CLECs gekoppelt sind.

B-Glucane umfassen eine Gruppe von ß-D-Glucose-Polysacchariden. Diese Polysaccharide sind wichtige Strukturbestandteile der Zellwand von Pilzen und kommen auch in Bakterien, Hefen, Algen, Flechten und Pflanzen, wie Hafer und Gerste, vor. Je nach Quelle unterscheiden sich ß-Glucane in der Art der Verknüpfung, dem Grad der Verzweigung, dem Molekulargewicht und der Tertiärstruktur.

B-Glucane sind eine Quelle 1löslicher, fermentierbarer Ballaststoffe - auch präbiotische Ballaststoffe genannt -, die ein Substrat für die Mikrobiota im Dickdarm darstellen, die Fäkalien-

masse erhöhen und kurzkettige Fettsäuren als Nebenprodukte mit

weitreichenden physiologischen Aktivitäten produzieren. Beispielsweise senkt die tägliche Aufnahme von ß-Glucanen aus Hafer in einer Menge von mindestens 3 Gramm den Gesamtcholesterinspiegel und den Cholesterinspiegel von Lipoproteinen niedriger Dichte um 5 bis 10 % bei Menschen mit normalem oder erhöhtem Cholesterinspiegel im Blut.

Typischerweise bilden ß-Glucane ein lineares Grundgerüst mit 1-3 ßB-glykosidischen Bindungen, variieren aber in Bezug auf Molekularmasse, LöÖslichkeit, Viskosität, Verzweigungsstruktur und Geliereigenschaften. Hefe- und Pilz-ß-Glucane sind in der Regel auf einem ß-(1,3)-Grundgerüst aufgebaut und enthalten ß-(1,6)-Seitenverzweigungen, während Getreide-ß-Glucane sowohl ß-(1,3)- als auch B-(1,4)-Grundgerüstbindungen mit oder ohne Seitenverzweigungen enthalten.

ßB- Glucane werden vom angeborenen Immunsystem als pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) erkannt. Der PRR Dectin-1 hat sich als primärer Rezeptor für diese Kohlenhydrate herauskristallisiert, und die Bindung von ß-Glucan an Dectin-1 löst über den Syk/CARD9-Signalweg eine Vielzahl von zellulären Reaktionen aus, darunter Phagozytose, oxidativer Burst und die Sekretion von ZyYtokinen. Darüber hinaus wurde auch der Komplementrezeptor 3 (CR3, CD11b/CD18) als Rezeptor für ß-Glucane identifiziert. Es wurde berichtet, dass die Stimulation durch Dectin-1 Thl1-, Th17- und zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktionen auslöst.

Zu den Mitgliedern der ß-Glucanfamilie gehören:

Beta-Glucanpeptid (BGP) ist ein verzweigtes Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht (-+100 kDa), das aus dem Pilz Trametes versicolor gewonnen wird. BGP besteht aus einem stark verzweigten Glucananteil, der eine ßB-(1,4)-Hauptkette und eine ßB-(1,3)Seitenkette umfasst, wobei ß-(1,6)-Seitenketten kovalent mit einem Polypeptidanteil verbunden sind, der reich an Asparaginsäure, Glutaminsäure und anderen Aminosäuren ist.

Curdlan ist ein lineares Polymer mit hohem Molekulargewicht, das aus ßB-(1,3)-verknüpften Glukoseresten von Agrobacterium spp gewonnen wird.

Laminarin aus der Braunalge Laminaria digitata ist ein Llineares ß-(1,3)-Glucan mit ß-(1,6)-Verknüpfungen. Laminarin ist ein wasserlösliches ßB-Glucan mit niedrigem Molekulargewicht (5-7 kDa), das entweder als Dectin-1-Antagonist oder -Agonist wirken kann. Es

kann an Dectin-1 binden, ohne die nachgeschaltete Signalgebung zu

stimulieren, und ist in der Lage, die Dectin-1-Bindung von partikulären ß-(1,3)-Glucanen wie Zymosan zu blockieren.

Pustulan ist ein lineares ßB-(1,6)-verknüpftes ßB-D-Glucan mit mittlerem Molekulargewicht (20 kDa) aus der Flechte Lasallia pustulata, das auch an Dectin-1l1 als Hauptrezeptor binden und die Signalübertragung über Dectin-1 aktivieren kann.

Lichenan ist ein lineares, hochmolekulares (ca. 22-245kDa) ßB(1,3) ß-(1,4)-ßB-D-Glucan aus Cetraria islandica mit einer ähnlichen Struktur wie die ß-Glucane von Gerste und Hafer. Das Lichenan hat einen viel höheren Anteil an 1,3- bis 1,4-ß-D-Bindungen als die beiden anderen Glucane. Das Verhältnis von ß-(1,4)- zu ßB(1,3)-ßB-D-Bindungen beträgt etwa 2:1.

B-Glucan aus Hafer und Gerste sind lineare, ßB-(1,3) ßB-(1,4)ß -D-Glucane und sind mit unterschiedlichen Molekulargewichten (Fraktionen mit mittlerem Molekulargewicht von 35,6 kDa bis zu Fraktionen mit hohem Molekulargewicht von bis zu 650 kDa) im Handel erhältlich.

Schizophyllan (SPG) ist ein gel-bildendes ß-Glucan aus dem Pilz Schizophyllum commune. SPG ist ein ß-(1,3)-D-Glucan mit hohem Molekulargewicht (450 kDa), das in der Hauptkette alle drei ß(1,3)-Glucosylreste einen ßB-(1,6)-Monoglucosylzweig aufweist.

Scleroglucan ist ein Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht (>1000 kDa), das durch Fermentation des Fadenpilzes Sclerotium rolfsii hergestellt wird. Scleroglucan besteht aus einem linearen B-(1,3)-D-Glucose-Grundgerüst mit einer B-(1,6)-D-GlucoseSeitenkette alle drei Hauptreste.

Glucanpartikel (whole glucan particle, WGP) sind BetaGlucane, die sich durch ihre Fähigkeit auszeichnen, die Immunantwort zu modulieren. WGP Dispersible (WGP® Dispersible von Biothera) ist ein partikuläres ß-Glucanpräparat aus Saccharomyces cerevisiae. Es besteht aus hohlen Hefezellwand-"Geistern", die hauptsächlich aus langen ß-(1,3)-Glukosepolymeren bestehen, die nach einer Reihe von alkalischen und sauren Extraktionen aus der S. cerevisiae-Zellwand gewonnen werden. Im Gegensatz zu anderen Dectin-1-Liganden wie Zymosan besitzt WGP Dispersible keine TLRstimulierende Aktivität. Im Gegensatz dazu bindet das 1lösliche WGP Dectin-1, ohne diesen Rezeptor zu aktivieren. Und es kann die Bindung von WGP Dispersible an Makrophagen und seine immunstimu-

lierende Wirkung erheblich blockieren.

Zymosan, eine unlösliche Zubereitung aus Hefezellen, aktiviert Makrophagen über TLR2. TLR2 kooperiert bei der Reaktion auf Zymosan mit TLR6 und CD14. Zymosan wird auch von Dectin-1 erkannt, einem phagozytischen Rezeptor, der auf Makrophagen und dendritischen Zellen exprimiert wird und mit TLR2 und TLR6 zusammenarbeitet, wodurch die durch die Erkennung von Zymosan durch jeden Rezeptor ausgelösten Immunreaktionen verstärkt werden.

Als Hauptbestandteil von Pilzzellwänden wurden verschiedene B-Glucane als Antigene zur Erzeugung von Anti-Glucan-Antikörpern gegen Pilzinfektionen verwendet (z.B.: Torosantucci et al. J Exp Med. 2005 Sep 5;202(5):597-606, Bromuro et al., Vaccine 28 (2010) 2615-2623, Liao et al., Bioconjug Chem. 2015 Mar 18;26(3):466-76).

Torosantucci et al. (2005) und Bromuro et al. (2010) veröffentlichen Konjugate aus dem verzweigten ß-Glucan Laminarin und dem linearen ß-Glucan Curdlan, die an das Diphtherietoxoid CRM197 gekoppelt sind. Diese Konjugatimpfstoffe induzierten hohe IgG-Titer gegen das ß-Glucan und verliehen Mäusen einen Schutz gegen Pilzinfektionen. Darüber hinaus können mit solchen Konjugaten auch hohe Titer gegen CRM197 nachgewiesen werden (Donadei et al., Mol Pharm. 2015 May 4;12(5):1662-72). Die Autoren haben auch ß-GlucanCRM197-Impfstoffe mit synthetischen linearen ß-(1,3)-OlL1igosacchariden oder ßB-(1,6)-verzweigten ß-(1,3)-Oligosacchariden hergestellt, formuliert mit dem für den Menschen verträglichen Adjuvans MF59. Alle Kon]ugate induzierten hohe Titer von Anti-ß-(1,3)Glucan-IgG und/oder auch Anti-ß-(1,6)-Glucan-Antikörpern zusätzlich zum Anti-ß-(1,3)-Glucan-IgG, was die Immunogenität verschiedener Glucane in Kombination mit klassischen Trägerproteinen zeigt. Interessanterweise konnten Torosantucci et al. nach der Immunisierung mit CRM-Glucan-Konjugaten keine höheren Anti-CRMTiter nachweisen als mit nicht konjugierten CRM allein.

Donadei et al. (2015) analysierten auch Kon]ugate des Diphtherietoxoids CRM197, die an lineares ßB-(1,3)-Glucan Curdlan oder an synthetische ß-(1,3)-Oligosaccharide gekoppelt waren. Die KonJugate waren immunogen und führten zu vergleichbaren Antikörperreaktionen gegen CRM197. Interessanterweise zeigten die Autoren, dass CRM-Curdlan-Konjugate bei intradermaler Verabreichung im Vergleich zur intramuskulären (i.m.) Immunisierung zu höheren Antikörpertitern führten. Die intradermale Applikation von CRM-Curdlan

zeigte Jedoch keine unterschiedliche Immunogenität im Vergleich

zur subkutanen Applikation. Darüber hinaus waren die In-vivo-Effekte zwischen CRM-Curdlan und mit Alum adjuvantiertem, nicht mit Curdlan gekoppeltem CRM vergleichbar. Somit konnte in diesem System kein zusätzlicher Nutzen der CLEC-Kopplung auf die allgemeinen Immunantworten festgestellt werden.

Liao et al. (2015) stellten eine Reihe linearer ß-(1,3)-ßBGlucan-Oligosaccharide (Hexa-, Octa-, Deca- und Dodeca-ß-Glucane) vor, die an KLH gekoppelt wurden, um Glykokonjugate herzustellen. Es hat sich gezeigt, dass diese Konj]jugate robuste T-Zell-Antworten auslösen und sehr immunogen sind und hohe Anti-Glucan-Antikörperspiegel induzieren. Mäuse, die mit solchen Impfstoffen immunisiert wurden, zeigten auch schützende Immunreaktionen gegen den tödlichen Krankheitserreger C. albicans. Es wurde kein Vergleich der Anti-KLH-Titer mit nicht konjugiertem KLH durchgeführt, so dass keine Informationen über einen potenziellen Nutzen des ß-Glucans in diesem experimentellen Umfeld vorliegen.

Diese Erkenntnisse sind für die Anwendbarkeit von Neoglykokonjugaten auf Glucanbasis als neuartige Impfstoffe von großer Bedeutung: Potenzielle Anti-Glucan-Antikörper, die bei einer ersten Immunisierung mit einem Glucan-Kon]ugat induziert werden, könnten entweder zu einer schnellen Eliminierung derselben ß-Glucan-Impfstoffe bei nachfolgenden Auffrischungsimpfungen führen oder die Immunreaktionen gegen neuartige Neoglykokonjugat-Impfstoffe abschwächen, die gegen andere Indikationen gerichtet sind - ein Effekt, der von Vektorimpfstoffen bekannt ist. Das Vorhandensein oder sogar die (Re-)Stimulierung von hochgradigen AntiGlucan-Antikörpern, wie oben für Mannan und ß-Glucane gezeigt (Petrushina et al. 2008, Torosantucci et al. 2005, Bromuro et al., 2010, Liao et al., 2015), könnte dadurch potenzielle Immunreaktionen, die durch Kon]ugatimpfstoffe ausgelöst werden, reduzieren oder eliminieren. Daher wäre es für eine neuartige und nachhaltige Plattform, die CLECs, insbesondere ß-Glucane, als Grundgerüst für die Immunisierung verwendet, von entscheidender Bedeutung, dass das verwendete Poly-/Oligosaccharid eine sehr geringe oder gar keine Glucan-Antikörper induzierende Kapazität aufweist.

Glucanpartikel (GPs) sind hochgereinigte 2-4 um große hohle poröse Zellwandmikrosphären, die hauptsächlich aus ß-(1,3)-D-Glucanen mit geringen Mengen an ß-(1,6)-D-Glucanen und Chitin beste-

hen und in der Regel aus Saccharomyces cerevisiae durch eine Reihe

von heißen alkalischen, sauren und organischen Extraktionen 1soliert werden. Sie interagieren mit ihren Rezeptoren Dectin-1 und CR3 (es gibt auch Hinweise auf eine Interaktion mit Toll-l1ikeRezeptoren und CD5 als zusätzliche Faktoren für die GP-Funktion) und regulieren die Zelloberflächenpräsentation von MHC-Molekülen, führen zu einer veränderten Expression von Co-Stimulationsmolekülen und induzieren die Produktion von entzündlichen Zytokinen. Aufgrund ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften wurden GPs für die Verabreichung von Impfstoffen erforscht.

Es gibt drei allgemeine Ansätze für die Verwendung von GPs in Impfstoffen: (1) als gemeinsam verabreichtes Adjuvans mit Antigen(en), um T- und B-Zellen-vermittelte Immunantworten zu verstärken, (1i) chemisch mit Antigenen vernetzt und am häufigsten verwendet (iii) als physisches Vehikel für die Verabreichung von Antigenen, die in der hohlen GP-Kavität eingeschlossen sind, um eine gezielte Antigenverabreichung an APCs zu ermöglichen.

Zu (ii): Antigenspezifische adaptive Immunantworten können durch die gleichzeitige Verabreichung von GPs mit Antigenen verstärkt werden. Bei dieser konventionellen Adjuvans-Strategie werden sowohl angeborene als auch adaptive Immunreaktionen aktiviert, um Schutzreaktionen gegen Krankheitserreger auszulösen. Williams et al. (Int J Immunopharmacol. 1989;11(4):403-10) beispielsweise adjuvantierten einen abgetöteten Trypanosoma cruzi-Impfstoff durch gleichzeitige Verabreichung von GPs. Die mit dieser Formulierung ausgelöste Immunreaktion führte dazu, dass 85 % der mit T. cruzi infizierten Mäuse überlebten. Im Gegensatz dazu lag die Sterblichkeitsrate bei den Kontrolltieren, die nur Dextrose, Glucan oder den Impfstoff erhielten, bei 100 %,.

Zu (1i): Die Kohlenhydrat-Oberfläche von GPs kann auch kovalent modifiziert werden, und zwar durch NaI0O1s -Oxidation, Carbodiimid-Vernetzung oder 1-Cyano-4-dimethylaminopyridiniumtetrafluoroborat-vermittelte Konjugation von Antigenen an die GP-Hülle. Bei diesem Ansatz sind die Kopplungseffizienzen sehr gering (ca. 20 %, z. B. wie in Pan et al. Sci Rep 5, 10687 (2015) beschrieben), was die Anwendbarkeit und die Anzahl der Impfstoffkandidaten im Vergleich zur Antigenverkapselung in GPs oder der in diesem Antrag vorgeschlagenen Plattformtechnologie erheblich einschränkt. Solche kovalent verbundenen Antigen-GP-Konjugate wurden in Studien zur Krebsimmuntherapie und bei Infektionskrankheiten eingesetzt.

So verwendeten Pan et al. (2015) OVA, das mit Periodat-oxidierten

GPs vernetzt war, und immunisierten Mäuse subkutan mit diesem Impfstoff. Wenn Mäuse mit OVA-exprimierenden E.G7-Lymphomzellen herausgefordert wurden, wurde eine signifikante Verringerung der Tumorgröße beobachtet. GP-OVA war in DCs (CD11c MHC-II**) in Lymphknoten 12 und 36 Stunden nach der subkutanen Injektion nachweisbar. Der Tumorschutz ging einher mit einem Anstieg des gesamten AntiOva-Immunglobulin (Ig)G-Titers, einer verstärkten Expression von MHC-II und co-stimulatorischen Molekülen (CD80, CD86) sowie einer verstärkten zytotoxischen Lymphozytenreaktion.

Zu 1i1i): Der wirksamste Ansatz für die Verwendung von GPs in Impfstoffen besteht darin, sie zur Verkapselung von Impfstoffen/Antigenen in den hohlen Kern zu verwenden. GPs können ein oder mehrere Antigene/DNA/RNA/Adjuvantien/Arzneimittel/Kombinationen davon mit hoher Beladungseffizienz einkapseln, die von der Art der Nutzlast und der beabsichtigten Verabreichungsart abhängt.

Antigene können in den Hohlraum der GPs eingekapselt werden, indem Polymer-Nanokomplexierungsmethoden wie die Beladung und Komplexierung der Nutzlast mit Rinder- oder Mäuseserumalbumin und Hefe-RNA/tRNA oder die Zugabe von Alginat-Calcium- oder AlginatCalcium-Chitosan-Mischungen verwendet werden. Unter Verwendung dieser Strategien berichteten beispielsweise Huang et al. (Clin. Vaccine Immunol. 2013; 20:1585-91), dass mit GP-OVA geimpfte Mäuse eine starke CD4+ T-Zell-Lymphoproliferation, eine Thl- und Th17verzerrte T-Zell-vermittelte Immunantwort sowie hohe IgGl- und IgG2c-spezifische Antikörperreaktionen gegen Ovalbumin zeigten. Die nicht-kovalente Verkapselungsstrategie löste im Vergleich zu GPs, die zusammen mit dem Antigen verabreicht wurden, stärkere Immunreaktionen aus.

Beispiele für GP-verkapselte Untereinheiten-Impfstoffe sind GPs, die lösliche alkalische Extrakte von Cryptococcus neoformans acapsular strain (cap59) umhüllen, die Mäuse schützten, die mit tödlichen Dosen von hochvirulentem C. neoformans (60 % Überleben) infiziert wurden, indem sie eine Antigen-spezifische CD4+ T-ZellAntwort (positiv für IFN-y, IL-17A) induzierten, die die PilzKolonie-bildenden Einheiten (KBE) um mehr als das 100-fache der ursprünglichen Herausforderungsdosis reduzierte (Specht CA et al. Mbio 2015; 6: e01905- e1915. und Specht CA et al, mBio 2017; 8: e01872- el1917.). Außerdem erwies sich die Impfung von Mäusen mit GP-verkapselten Antigenen als wirksam gegen Histoplasma capsulatum (Deepe GS et al., Vaccine 2018; 36: 3359-67), F. tularensis (Whelan

AO et al, PLOS ONE 2018; 13: e0200213), Blastomyces dermatitidis (Wuthrich M et al., Cell Host Microbe 2015; 17: 452-65) und C. posadasii (Hurtgen BJ et al., Infect. Immun. 2012; 80: 3960-74).

Neben der Anwendung bei Krebs und Infektionskrankheiten wurde auch eine begrenzte Anzahl von Studien mit Selbstantigenen durchgeführt, bei denen GPs als Verkapselungsmittel für die Verabreichung von Impfstoffen eingesetzt wurden. In diesem Sinne beschreiben Rockenstein et al. (J. Neurosci., January 24, 2018 - 38(4):1000 -1014) die Anwendung von GPs, die mit rekombinantem humanem aSynuclein-Protein (das sowohl B- als auch T-Zell-Epitope enthält, die für die Induktion von Anti-aSyn-Immunantworten geeignet sind) und Rapamycin beladen sind, von dem bekannt ist, dass es antigenspezifische regulatorische T-Zellen (Tregs) in einem murinen Modell für Synucleinopathien induziert. Wie in früheren Studien, in denen aSynuclein in voller Länge als Immunogen verwendet wurde, erwartet, führt die Anwendung der aSyn-haltigen GPs zur Induktion robuster Anti-aSynuclein-Antikörpertiter und mildert die durch aSynuclein ausgelösten pathologischen Veränderungen bei den Tieren in ähnlichem Ausmaß wie in früheren Veröffentlichungen. Die Zugabe von Rapamycin induzierte effizient die Bildung von iTreg-Zellen (CD25 und FOXP3+), da die Anzahl dieser Treg-Zellen nach RapamycinExposition signifikant erhöht war. Mit dem Antigen aSynuclein und Rapamycin beladene GPs lösten somit in Mausmodellen der Synucleinopathie sowohl neuroprotektive humorale als auch iTreg-Reaktionen aus, wobei der Kombinationsimpfstoff (aSyn + Rapamycin) wirksamer war als die humorale (GP aSyn) oder zelluläre Immunisierung (GP Rapamycin) allein. Es liegen keine Informationen über die Vergleichbarkeit der Wirkungen mit einer herkömmlichen, nicht GPhaltigen aSynuclein-Immunisierung vor.

B-Glucan-Neoglykokonjugate zielen über den C-Typ-Lektinrezeptor Dectin-1 effizient auf dendritische Zellen ab und verstärken deren Immunogenität. Bestimmte ßB-Glucane wurden auch als potenzielle Träger für Impfungen mit Modellantigenen wie OVA (Xie et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 391 (2010) 958-962; Korotchenko et al. 2021;76:210-222.) oder Fusionsproteinen auf der Basis von MUC1 (Wang et al., Chem. Commun., 2019, 55, 253) verwendet.

Xie et al. und Korotchenko et al. verwendeten das verzweigte

B-Glucan Laminarin als Grundgerüst für die OVA-Kon]ugation. Diese

Gluconeokonjugate wurden dann Mäusen entweder epiktuan oder subkutan verabreicht. Xie et al. zeigten, dass Laminarin/OVA-Konjugate, nicht aber nicht konjugierte Mischungen der Verbindungen, im Vergleich zu Ovalbumin allein eine verstärkte Anti-OVA-CD4+-TZell-Reaktion auslösten. Wichtig ist, dass die gleichzeitige InJektion von nicht konjugiertem Laminarin diese Verstärkung bloCkierte, was die Funktion des Laminarin-vermittelten APC-Targetings unterstützt. Wie erwartet, stimulierten natives OVA und die Mischung aus OVA und Laminarin eine geringe Produktion von AntiOVA-Antikörpern. Im Gegensatz dazu verstärkte das OVA/LaminarinKonjugat die Antikörperreaktionen erheblich. In ähnlicher Weise wiesen Korotchenko et al. nach, dass die Konjugation von Laminarin mit OVA die Aufnahme von OVA signifikant erhöht und die Aktivierung von BMDCs sowie die Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen induziert. Diese Eigenschaften des LamOVA-Konjugats führten auch zu einer verstärkten Stimulierung von OVA-spezifischen naiven TZellen, die mit BMDCs ko-kultiviert wurden. In einem Experiment zur prophylaktischen Immunisierung konnten die Autoren bestätigen, dass die Immunisierung mit LamOVA dessen Allergenität verringerte und im Vergleich zu OVA nach zwei Immunisierungen etwa dreifach höhere IgGl-Antikörper-Titer induzierte. Dieser Effekt ging Jedoch in allen behandelten Gruppen nach der dritten Immunisierung verloren, als alle Gruppen ähnliche Antikörpertiter aufwiesen. Lam/OVA-Konjugate und OVA/Alum-Konjugate zeigten eine vergleichbare therapeutische Wirksamkeit in einem murinen Modell für allergisches Asthma. Somit konnten diese Versuche keine eindeutig überlegene Wirkung von Konjugaten auf Glucanbasis im Vergleich zu herkömmlichen Impfstoffen belegen.

Wang et al. (2019) analysierten die Auswirkungen eines auf ßGlucan basierenden MUC1-Krebsimpfstoffkandidaten. Auch hier wurde die MUC1-Tandem-Wiederholungssequenz GVTSAPDTRPAPGSTPPAH, ein gut untersuchter Krebs-Biomarker, als Peptid-Antigen gewählt, das Tund B-Zell-Epitope innerhalb der Wiederholungssequenz bereitstellt. Ein Ethylenglykol (d.h. PEG) Spacer wurde verwendet, um ßGlucan und das MUC1-Peptid mit Hefe-ßB-(1,3)-ß-Glucan-Polysaccharid unter Anwendung von 1,1'-Carbonyl-Diimidazol (CDI)-vermittelten Bedingungen zu verbinden. Die Größe der ß-Glucan-MUC1-Nanopartikel lag im Bereich von 150 nm (tatsächlicher Durchschnitt 162 nm),

während unmodifiziertes ß-Glucan Partikel von ca. 540 nm bildete.

Das ßB-Glucan-MUC1-Konjugat löste hohe Titer von Anti-MUC1-IgG-Antikörpern aus, die im Vergleich zu den Kontrollgruppen deutlich höher waren. Eine weitere Analyse der Isotypen und Subtypen der gebildeten Antikörper zeigte, dass IgG2b der wichtigste Subtyp ist, was auf die Aktivierung einer Thl-Reaktion hinweist, da das Verhältnis von IgG2b/IgG1l1 >1 ist. Die beobachtete erhebliche Menge an IgM-Antikörpern deutet auf die Beteiligung der C3-Komponente des Komplementsystems hin, die häufig Zytotoxizität induziert und problematisch für die Verwendung solcher Grundgerüste für Impfstoffe sein könnte, die die Entwicklung von Zytotoxizität vermeiden sollen, z. B. bei chronischen oder degenerativen Krankheiten.

Bisher wurden keine Berichte veröffentlicht, in denen die Konstruktion oder Verwendung einzelner B-Zell- oder T-Zell-EpitopPeptide gezeigt wurde, die an ß-Glucane, insbesondere lineare ßGlucane und/oder Pustulan mit hoher Bindungsspezifität/-fähigkeit an Dectin-1 gekoppelt wurden, wodurch neuartige Gluconeokonjugate wie die in diesem Antrag vorgeschlagenen gebildet wurden.

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, verbesserte Impfstoffe als Konjugatimpfstoffe bereitzustellen, die aus dem Impfantigen bestehen, das mit CLEC-Adjuvantien auf Kohlenhydratbasis konjugiert ist, und insbesondere Impfstoffe bereitzustellen, die im Vergleich zu den Konjugatimpfstoffen des derzeitigen Stands der Technik, insbesondere den CLEC-Peptid/Protein-Konjugatimpfstoffen auf Kohlenhydratbasis, eine verbesserte Immunantwort beim geimpften Individuum hervorrufen.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Impfstoffzusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die Immunität gegen kurze, leicht austauschbare, hochspezifische B/T-ZellEpitope unter Verwendung eines CLEC-Grundgerüsts mit bisher nicht erreichter Wirksamkeit, Spezifität und Affinität durch herkömmliche Impfstoffe verleihen.

Ein spezifisches Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Impfstoffen mit verbesserter Selektivität und/oder Spezifität eines CLEC-basierten Impfstoffs für das Hautkompartiment.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Impfstoffe bereitzustellen, die - möglichst ausschließlich - zielspezifische Immunantworten induzieren, aber keine oder nur sehr begrenzte CLEC- oder Trägerprotein-spezifische Antikörperantworten

hervorrufen.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Impfstoffzusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die Immunität gegen kurze, leicht austauschbare, hochspezifische B/T-ZellEpitope von Alpha-Synuclein unter Verwendung eines CLEC-Rückgrats mit bisher nicht erreichter Wirksamkeit, Spezifität und Affinität durch herkömmliche Impfstoffe zur angemessenen Vorbeugung und Behandlung von Synucleopathien verleihen.

Ein spezifisches Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Alpha-Synuclein-Impfstoffen mit verbesserter Selektivität und/oder Spezifität eines CLEC-basierten Impfstoffs für das Hautkompartiment.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Impfstoffe zur Verfügung zu stellen, die - möglichst ausschließlich alpha-Synuclein-spezifische Immunantworten induzieren, während sie keine oder nur sehr begrenzte CLEC- oder Trägerprotein-spezifische Antikörperantworten hervorrufen.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, PeptidImmunogen-Konstrukte des Alpha-Synuclein-Proteins (aSyn) und deren Formulierungen zur Behandlung von Synucleinopathien bereitzustellen.

Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Konjugat bereit, das aus mindestens einem ßB-Glucan oder einem Mannan und mindestens einem B-Zell- oder T-Zell-Epitop-Polypeptid besteht oder dieses umfasst, wobei das ß-Glucan oder Mannan kovalent mit dem B-Zellund/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid konjugiert ist, um ein Konjugat aus dem ß-Glucan oder Mannan und dem B-Zell- und/oder T-ZellEpitop-Polypeptid zu bilden, und wobei das B-Zell- und/oder TZell-Epitop-Polypeptid ein alpha-Synuclein-Polypeptid ist. Alternativ besteht das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung aus mindestens einem ß-Glucan oder einem Mannan und mindestens einem alpha-Synuclein-B-Zell-Epitop-Polypeptid oder umfasst dieses, wobei das ß-Glucan oder Mannan kovalent an das B-Zell-Epitop-Polypeptid konjugiert ist, um ein Konjugat aus dem ß-Glucan oder Mannan und dem B-Zell-Epitop-Polypeptid zu bilden.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem ß-Glucan um Pustulan, Lichenan, Laminarin, Curdlan, ß-Glucanpeptid (BGP), Schizophyllan, Skleroglucan, ganze Glucanpartikel (WGP), Zymosan oder Lentinan, vorzugsweise Pustulan, Laminarin, Lichenin, Lentinan, Schizophylılan oder Skleroglucan, wobei es sich bei dem ß-Glucan insbe-

sondere um Pustulan handelt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das ß-Glucan zur Verwendung als C-Typ Lectin (CLEC) Polysaccharid-Adjuvans für B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptide vorgesehen, insbesondere wobei das ß-Glucan kovalent mit dem B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid konjugiert ist, um ein Kon]ugat aus dem ß-Glucan und dem B-Zell- und/oder T-ZellEpitop-Polypeptid zu bilden, wobei das ß-Glucan ein überwiegend lineares ß-(1,6)-Glucan mit einem Verhältnis von ß-(1,6)-gekoppelten Monosaccharidanteilen zu nicht-ß-(1,6)-gekoppelten Monosaccharidanteilen von mindestens 1:1 ist, vorzugsweise mindestens 2:1, noch bevorzugter mindestens 5:1, insbesondere mindestens 10:1.

Mit der vorliegenden Erfindung werden eine oder mehrere der oben genannten Aufgaben erfolgreich gelöst. Dies war für den Fachmann unerwartet, denn bisher wurden auf dem vorliegenden Gebiet der Technik keine Berichte veröffentlicht, die den Aufbau und die Anwendbarkeit oder die Wirksamkeit von Verbindungen ähnlich den neuartigen, kleinen, modularen Gluconeokonjugaten gemäß der vorliegenden Erfindung zeigen.

Überraschenderweise wurde mit der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass durch Konjugation (d.h. durch kovalente Kopplung; hier synonym verwendet) von Peptiden/Proteinen an den ausgewählten CLEC-Träger gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Konjugation auf dem Stand der Technik beruhen kann, überlegene pharmazeutische Formulierungen zur Bewirkung von Immunantworten erhalten wurden. Im gegenwärtigen Stand der Technik steht eine erhebliche Anzahl unterschiedlicher Kopplungsmethoden zur Verfügung. Im Zuge der Ausarbeitung der vorliegenden Erfindung wurden die Hydrazonbildung oder die Kopplung über heterobifunktionelle Linker als besonders bevorzugte Methoden identifiziert. Im Allgemeinen ist eine Aktivierung der CLEC vor der Konjugation (z. B. Bildung reaktiver Aldehyde an benachbarten OH-Gruppen der Zuckereinheiten) und das Vorhandensein reaktiver Gruppen am Peptid/Protein der Wahl (z. B. N- oder C-terminale Hydrazidreste, SH-Gruppen (z. B. über N- oder C-terminale Cysteine)) erforderlich. Die Reaktion kann eine einstufige Reaktion sein (z. B. Mischen von aktivierten CLECs mit Hydrazid-Peptiden, was zur Bildung von Hydrazon führt, oder

ein mehrstufiger Prozess (z. B.: aktivierte CLEC wird mit einem

Hydrazid aus einem heterobifunktionellen Linker umgesetzt und anschließend wird das Peptid/Protein über entsprechende reaktive Gruppen gekoppelt).

Die neuartige Klasse von Kon]ugaten gemäß der vorliegenden Erfindung verleiht Immunität gegen kurze, leicht austauschbare, hochspezifische B/T-Zell-Epitope unter Verwendung des CLEC-Grundgerüsts der vorliegenden Erfindung und zeigt eine Wirksamkeit, Spezifität und Affinität, die bisher von herkömmlichen Impfstoffen nicht erreicht wurde: Tatsächlich sind die Kon]ugate gemäß der vorliegenden Erfindung die ersten Beispiele für die Verwendung kurzer B-Zell/T-Zell-Epitope in einem CLEC-basierten Impfstoff, der die Notwendigkeit vermeidet, die Alpha-Synuclein-Epitope in Form von Fusionsproteinen zu präsentieren, einschließlich der Bildung von Tandem-Wiederholungen von Epitopen oder der Fusion verschiedener Tandem-Wiederholungen zur Bildung eines stabilen und wirksamen Immunogens.

Mit der vorliegenden Erfindung kann auch die Notwendigkeit der Verwendung von Proteinen in voller Länge für die Verwendung in CLEC-Impfstoffen (d.h. Nutzlast in Glucanpartikeln (GPs)) vermieden werden. Darüber hinaus kann auch das Problem der Autoimmunreaktionen vermieden werden, die insbesondere durch (unerwünschte) T-Zell-Epitope in Immunogenen wie Selbstproteinen wie Alpha-Synuclein ausgelöst werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können erstmals kurze Epitope (B- und/oder T-Zell-Epitope, hauptsächlich Peptide, modifizierte Peptide) mit einem funktionellen CLEC-basierten Backbone durch kovalente Kopplung auf der Grundlage etablierter Chemie verbunden werden, wobei die möglichen Methoden zur Konjugation an die Erfordernisse des spezifischen Epitops auf der Grundlage von auf dem Gebiet bekannten Methoden angepasst werden können.

Die Präsentation des kurzen Peptids bzw. der kurzen Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung kann als einzeln kon]ugierte Einheiten in Kombination mit einem einzelnen fremden T-Zell-Epitop (als kurzes Peptid oder langes Protein) oder als Komplex/Konjugat mit einem größeren Trägermolekül erfolgen, das das T-Zell-Epitop für die Induktion einer nachhaltigen Immunantwort bereitstellt. Das Design der erfindungsgemäßen Impfstoffe ermöglicht die Herstellung multivalenter Konjugate als Voraussetzung für eine effiziente Induktion einer Immunantwort durch hocheffiziente B-Zell-

Rezeptor (BCR)-Vernetzung.

Darüber hinaus kann mit der vorliegenden Erfindung ein CLECbasierter Impfstoff mit einer hervorragenden Selektivität/Spezifität für das dermale Kompartiment bereitgestellt werden. Das KonJugatdesign gemäß der vorliegenden Erfindung baut auf CLECs als Träger für die zielspezifischen Alpha-Synuclein-Epitope auf, die eine hohe Bindungsspezifität für PRRs auf dermalen APCs/DCs aufweisen, insbesondere für Dectin-1 (oder MR und DC-SIGN im Fall von Mannan), um eine selektive/spezifische und rezeptorvermittelte Aufnahme durch die Haut zu ermöglichen (= gezielte Impfstoffabgabe).

Das CLEC-Polysaccharid, das gemäß der vorliegenden Erfindung als Träger verwendet wird, dient dazu, das Träger-Peptid-Konjugat in vorzugsweise dermale/kutane DCs zu fokussieren und eine Immunantwort auszulösen. Dies ist u.a. auf eine epidermale oder dermale (nicht subkutane) Spezifität zurückzuführen. Das CLEC-Grundgerüst und die effiziente Auslösung der dermalen Immunantwort gemäß der vorliegenden Erfindung tragen auch dazu bei, die obligatorische Verwendung von Adjuvantien zu vermeiden, die für herkömmliche Impfstoffe typisch sind und auch in beispielhaften CLEC-basierten Impfstoffen verwendet werden (z.B.: Verwendung von Alum, MF59, CFA, PolyI:C oder anderen Adjuvantien). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Verwendung von Adjuvantien erheblich reduziert oder weggelassen werden, z.B. in Fällen, in denen der Zusatz von Ad]juvantien nicht angezeigt ist.

In früheren Anwendungen wurden mehrere CLECs verwendet, jedoch konnte keine der vorgeschlagenen Kon]ugatstrukturen eine Hautselektivität (d. h. hohe Dectin-1-Bindungsfähigkeit, hocheffizientes dermales DC-Targeting und überlegene Immunogenität bei der dermalen Anwendung im Vergleich zu allen anderen Wegen (d. h. subkutan, intramuskulär und 1i.p.) bieten.

Die Auswahl der CLEC gemäß der vorliegenden Erfindung wurde getroffen, um eine neuartige Lösung für hautspezifische DCs und hautspezifische Immunisierung mit hoher Wirksamkeit zu bieten. Die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung üben auch in anderen klassischen Geweben für die Immunisierung wie Muskel- oder subkutanem Gewebe eine begrenzte Aktivität aus, was im Gegensatz zu früheren beschriebenen CLEC-basierten Impfstoffen/Impfstoffkandidaten steht, die i.m. oder s.c. verabreicht wurden. Als Ergebnis

der im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Experi-

mente wurden Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere solche, die Pustulan als CLEC verwenden, als überraschend selektiv für die Hautimmunisierung identifiziert.

Mit der vorliegenden Erfindung wird es möglich, sich auf die Induktion von Alpha-Synuclein-spezifischen Immunantworten zu konzentrieren, während keine oder nur sehr begrenzte CLEC- oder Trägerprotein-spezifische Antikörperantworten induziert werden. Die Konj]jugate gemäß der vorliegenden Erfindung lösen damit das Problem klassischer Konjugatimpfstoffe, die auf die Verwendung fremder Trägerproteine angewiesen sind, um eine nachhaltige Immunantwort zu induzieren. Der derzeitige Stand der Technik bei der Entwicklung von Konjugatimpfstoffen basiert stark auf Trägermolekülen wie KLH, CRM197, Tetanus-Toxoid oder anderen geeigneten Proteinen, die mit zielspezifischen Kurzantigenen komplexiert werden und das Substrat für Immunreaktionen gegen alpha-Synuclein für Synucleinopathien wie die Parkinson-Krankheit liefern.

Bevorzugte Polypeptid-Immunogenkonstrukte gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten ein B-Zell-Epitop von Alpha-Synuclein (aSyn, alpha Syn) und ein heterologes T-Helferzell-Epitop (Th), das an ein CLEC gekoppelt ist. Die vorliegende Erfindung liefert überraschend überlegene neue Konjugate, die herkömmliche Impfstoffe in Bezug auf Immunogenität, Kreuzreaktivität gegen aSyn, Selektivität für aSyn-Spezies/Aggregate, Affinität, Affinitätsreifung und Inhibitionskapazität übertreffen, verglichen mit herkömmlichen Impfstoffen.

Die kovalente Konjugation des Alpha-Synuclein-Polypeptids mit dem B-Glucan oder Mannan gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine überraschende und unerwartete Verstärkung der Immunantwort auf solche Polypeptide. Dies ist insbesondere im direkten Vergleich mit herkömmlichen Impfstoffformulierungen, wie sie von Rockenstein et al. (2018) beschrieben wurden, beeindruckend, wie auch im folgenden Beispielabschnitt gezeigt wird.

Rockenstein et al. (2018) veröffentlichen die Anwendung von Hefe-Ganzglucan-Partikeln (GPs), die nicht kovalent mit aSyn und Rapamycin komplexiert sind, als Immuntherapie für die ParkinsonKrankheit. Diese GPs wurden nach einer Reihe von Heißalkali-, organischen und wässrigen Extraktionsschritten aus Saccharomyces cerevisiae hergestellt, was zu einem Endprodukt führte, das aus hoch gereinigten Hefezellwandpräparaten mit einem Durchmesser von 3 bis

4 um besteht, die frei von zytoplasmatischem Inhalt sind und von

einer porösen, unlöslichen Hülle aus ßB-Glucanen (hauptsächlich ß813-ß-Glucane) umgeben sind.

Wichtig ist, dass die von Rockenstein et al. (J. Neurosci,., January 24, 2018 - 38(4):1000 -1014) offengelegte Impfstoffzusammensetzung aus GPs bestand, die entweder mit Ovalbumin und Mausserumalbumin (MSA), menschlichem aSyn und MSA oder menschlichem aSyn, MSA und Rapamycin nicht-kovalent komplexiert waren. Diese Komplexierungsmethode beruht auf der Co-Inkubation der verschiedenen Nutzlasten mit GPs und der anschließenden Diffusion in den GP-Hohlraum ohne kovalente Bindung und ähnelt daher einer Reihe von Impfstoffen, die in Beispiel 5 dieses Antrags offengelegt werden, wo nur eine Mischung, aber keine kovalente Bindung von Komponenten zur Formulierung eines Impfstoffs verwendet wurde und die sich im Vergleich zu den Impfstoffen gemäß der vorliegenden Erfindung als ineffizient und ungeeignet erwiesen.

1) Rockenstein et al. zeigen, dass die nicht-kovalente Vermischung von aSyn und GPs zu einer nachweisbaren Immunreaktion gegen aSyn führt, was zeigt, dass GPs als Adjuvans wirken können. Rockenstein et al. zeigen Jedoch auch, dass die nicht-kovalente Zugabe/Co-Komplexierung von Rapamycin erforderlich ist, um die Funktionalität eines solchen Impfstoffs im Vergleich zu Kontrollen signifikant zu erhöhen. Aus dieser Sicht ist eine Mischung aus verschiedenen Adjuvantien (GPs sowie der mTOR-Inhibitor Rapamycin) erforderlich, um einen voll £funktionsfähigen Impfstoff, wie die durch die vorliegende Erfindung offengelegten Impfstoffe, bereitzustellen.

2) Der von Rockenstein et al. offengelegte Impfstoff ist in diesem aSyn-Überexpressionsmodell aktiv, da er aSyn-spezifische T-Zell-Epitope (neben anderen T-Zell-Epitopen wie MSA-abgeleiteten Epitopen) bereitstellt, um seine volle Funktionalität auszuüben, nämlich die Induktion einer neuroprotektiven, gegen aSyn gerichteten zellulären (d.h.: T-Zell-vermittelten) und humoralen (d.h. Antikörper/B-Zell-basierten) Immunantwort. Dies steht in direktem Gegensatz zur Lehre der vorliegenden Erfindung, bei der es bereits ausreicht, wenn durch die ausgewählten Impfstoffe nur aSyn-spezifische B-Zell-Antworten ausgelöst werden.

3) Die Verwendung von aSyn in voller Länge birgt auch die Gefahr, autoreaktive, aSyn-spezifische T-Zellen zu induzieren, die das Potenzial haben, die zugrunde liegende Neuropathologie bei

Morbus Parkinson und anderen Synukleopathien zu verschlimmern.

Daher ist der von Rockenstein et al. vorgeschlagene GP-aSyn-Rapamycin-Impfstoff auch in dieser Hinsicht nicht für den Einsatz beim Menschen geeignet.

4) Wie in Beispiel 5 gezeigt, kann auch die nicht-kovalente Vermischung von aSyn-abgeleiteten Peptiden (z.B.: SegID2, d.h. BZell-Epitope) und promiskuitiven T-Zell-Epitopen (z.B.: Seq1ID7) mit einem ß-Glucan-Partikel (z.B.: nicht-oxidiertes Pustulan), ähnlich wie bei Rockenstein et al., eine schwache Antikörperreaktion gegen aSyn induzieren. Die erfindungsgemäßen Impfstoffe, die auf einer kovalenten Bindung solcher Peptide an ein geeignetes Glucan beruhen, führen jedoch zu einer deutlich anderen und besseren Immunantwort (siehe auch Figur 5).

Darüber hinaus zeigen solche kovalent verknüpften Impfstoffe, wie in Beispiel 6 und Figur 7 dargestellt, einen äußerst vorteilhaften Mangel an Anti-Glucan-Antikörper-Reaktionen im Vergleich zu nicht-kovalent gemischten Impfstoffen, die auf Glucanpartikeln und Peptiden aufbauen, wie sie in der vorliegenden Erfindung offenbart werden.

Die Offenbarung von Rockenstein et al. aus dem Stand der Technik deutet daher nicht auf den beanspruchten Gegenstand der vorliegenden Erfindung hin.

Jedes Alpha-Synuclein-Polypeptid, das ein B-Zell- und/oder ein T-Zell-Epitop umfasst, kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich der im Stand der Technik vorgeschlagenen Polypeptid-Impfstoffkandidaten, z. B. derjenigen, die in WO 2004/041067 A2, WO 2006/045037 A2, WO 2009/103105 A2, WO 2011/020133 Al oder in Mandler et al. (Mol. Neurodeg. 10 (2015), 10; Acta Neuropath. 127 (2014), 861-879). Dementsprechend können Alpha-Synuclein-Polypeptide mit nativer Aminosäuresequenz (gemäß menschlichem Alpha-Synuclein) oder von aSyn abgeleitete Polypeptide, die ein B-Zell- und/oder ein T-Zell-Epitop von aSyn umfassen, wie Mimics oder Mimotope davon, als Alpha-Synuclein-Polypeptidkomponente in den Kon]ugaten gemäß der vorliegenden Erfindung

verwendet werden.

Speziell bevorzugte aSyn-Polypeptide, die in der vorliegenden Erfindung kon]ugiert werden sollen, sind ausgewählt aus nativem Alpha-Synuclein oder einem Polypeptid, das die Aminosäurereste 1 bis 5, 1 bis 8, 1 bis 10, 60 bis 100, 70 bis 140, 85 bis 99, 91 bis 100, 100 bis 108, 102 bis 108, 102 bis 109, 103 bis 129, 103 bis 135, 107 bis 130, 109 bis 126, 111 bis 121, 111 bis 135, 115

bis 121, 115 bis 122, 115 bis 123, 115 bis 124, 115 bis 125, 115 bis 126, 118 bis 126, 121 bis 127, 121 bis 140 oder 126 bis 135, der Aminosäuresequenz von nativem menschlichem Alpha-Synuclein: MDVEMKGLSK AKEGVVAAAE KTKOGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQOVINVGGAV VTITGVTAVAOK TVEGAGSIAA ATGFVKKDOL GKNEEGAPOE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYODYEPEA (humanes aSyn (1-140 aa): UNIPROT-Hinterlegungsnummer P37840),

vorzugsweise ein Polypeptid, das die Aminosäurereste 1 bis 8, 91 bis 100, 100 bis 108, 103 bis 135, 107 bis 130, 115 bis 121, 115 bis 122, 115 bis 126, 118 bis 126, 121 bis 127 oder 121 bis 140 umfasst oder daraus besteht; oder Mimotope, ausgewählt aus der Gruppe DOPVLPD, DOPVLPDN, DOPVLPDNE, DOPVLPDNEA, DOPVLPDNEAY, DOPVLPDNEAYE, DSPVLPDG, DHPVHPDS, DTPVLPDS, DAPVTPDT, DAPVRPDS, und YDRPVOPDR.

Weihofen et al. (Neurobiology of Disease 124 (2019) 276-288) haben die N-terminalen Reste aal-10 (MDVFMKGLSK) als ein geeignetes aSyn-Epitop entdeckt. PRX002 (wie offengelegt in Masliah et al., (PLoS One 6:e19338); Games et al., (2014, J Neurosci 34:94419454); Schenk et al,., (Mov Disord. 2017 Feb;32(2):211-218.); Jankovic et al., (JAMA Neurol. 2018 Oct 1;75(10):1206-1214.)) ist auf die C-terminale Region aall8-126 (VDPDNEAYE) gerichtet. Schofield et al. (Neurobiol Dis. 2019 Dec;132:104582.) enthüllten das aSyn-spezifische monoklonale Ab MEDI-1341, das gegen ein ähnliches Epitop in der C-terminalen Region von aSyn (aa 103-129, NEEGAPOEGILEDMPVDPDNEAYEMP) gerichtet ist. MEDI Ab (aal21-127; DNEAYEM) wurde von Nordström et al. offengelegt (Neurobiology of Disease 161 (2021) 105543). Andere geeignete Epitope für Antikörper/Immuntherapeutika in aSyn, die dem Fachmann bekannt sind, umfassen Epitope von Autoantikörpern (wie offengelegt in Heinzel et al., (PLoS ONE 9(12): e114566.); Rabenstein et al, (Neurosci Lett. 2019 Jun 21;704:181-188); US 2014/0377271 Al und Li et al. (Acta

Neuropathologica 137, 825-836 (2019))) umfassen aa60-100, aa6095, aa73-82, aa91-100; aa74-79 und aa92-97, aal21-140 und aalll121. Darüber hinaus offenbaren Games et al. (2014) auch geeignete

Epitope aa 91-99 und aa 118 -126. In US 2005/0037013 Al werden immunogene Alpha-Synuclein-Fragmente offengelegt, die eine Immunantwort gegen ein spezifisches Epitop innerhalb der Reste aa70140 hervorrufen können. WO 2009/103105 A2 und WO 2011/020133 Al offenbaren molekulare Mimics von aal02-108 bzw. aall5-121. WO 2016/062720 Al stellt modifizierte VLPs zur Verfügung, die Th-

Zell-Epitope, die die mittlere Region (aal02-109) repräsentieren, sowie N-terminale (aal-8) Sequenzen oder C-terminale Sequenzen (d.h. aal31-140) umfassen, die eine hohe Anti-Peptid-Antwort induzieren konnten. Mittlere und C-terminale Epitope waren ebenfalls in der Lage, aSyn-spezifische Titer zu induzieren, die verschiedene aSyn-Spezies (z. B. monomer und oligomer) erkennen. Interessanterweise konnten die bereitgestellten Impfstoffe die aSyn-Belastung oder Verhaltensänderungen in In-vivo-PD-Modellen nicht verringern. US 2015/0232524 Al offenbart Polypeptid-Immunogene, insbesondere aal0-14 und aa36-69, und Epitope wurden in aa85-99, aal09-126 und aal26-140 gezeigt. Interessanterweise rufen alle Konstrukte eine Anti-aSyn-Immunreaktion hervor, jedoch scheint das Epitop aal09-126 weniger wirksam zu sein. WO 2018/232369 Al zeigt die Anwendung von zielspezifischen B-Zell-Epitopen (10-25aa, abgeleitet vom C-Terminus von aSyn; Region: aall1l1-135).

Obwohl die vorliegende Erfindung prinzipiell in der Lage ist, alle vorgeschlagenen aSyn-Impfpolypeptide zu verbessern, wurden ausgewählte Epitope speziell im Hinblick auf ihre Eignung mit der vorliegenden Plattform bewertet. So hat sich zum Beispiel gezeigt, dass aal-8 (SegID12+13) einem KLH-basierten Impfstoff überlegen ist.

Während die Art des Alpha-Synuclein-Polypeptids für die Herstellung von ß-Glucan- oder Mannan-Konjugaten nicht entscheidend ist, gibt es bevorzugte und weniger bevorzugte Alpha-SynucleinEpitope, je nachdem, welche Aufgabe das Konjugat zu lösen hat (Spezifität für Monomere oder Aggregate, Selektivität, Affinität, Erzeugung von Antikörpern usw.).

Bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die B-Zell-Epitope aa91-100, aal00-108, aal07-114 und aal31-140 aufgrund der geringeren Anti-Peptid-Reaktion und der geringeren Reaktivität gegenüber Alpha-Synuclein (aa91-100) weniger bevorzugt; geringe Kreuzreaktivität (CR) zu Alpha-Synuclein (trotz hoher Anti-Peptid-Titer), geringere Selektivität für Aggregate (aa100-108); geringere Wirksamkeit bei der Hemmung der Aggregation (aa107-114); und Änderung der Selektivität (für Monomer statt Aggregate), geringere Selektivität, geringere Wirksamkeit bei der Senkung der Alpha-Synuclein-Aggregate (aal31-140). Darüber hinaus werden Epitop-Polypeptide mit 5 oder weniger Aminosäureresten (oder mit 6 oder weniger Aminosäureresten) in der Regel auch weniger

bevorzugt, da mit solchen Kurzformen geringere Immunreaktionen

ausgelöst werden können.

Speziell bevorzugte Alpha-Synuclein-Epitope gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen die oben genannten Epitope, die die Aminosäurereste 1 bis 5, 1 bis 8, 1 bis 10, 60 bis 100, 70 bis 140, 85 bis 99, 91 bis 100, 100 bis 108, 102 bis 108, 102 bis 109, 103 bis 129, 103 bis 135, 107 bis 130, 109 bis 126, 111 bis 121, 111 bis 135, 115 bis 121, 115 bis 122, 115 bis 123, 115 bis 124, 115 bis 125, 115 bis 126, 118 bis 126, 121 bis 127, 121 bis 140 oder 126 bis 135 der Aminosäuresequenz von nativem menschlichem Alpha-Synuclein.

Zum Beispiel sind aall5-126 und die oben erwähnten kürzeren Sequenzen und Mimotope davon in Bezug auf Immunogenität, Selektivität, Aggregathemmung usw. besonders geeignet; im Allgemeinen zeigen Polypeptide mit 7 oder mehr Aminosäureresten eine gute Immunreaktion und Kreuzreaktivität zu Alpha-Synuclein; aa 115-121 (und die C-terminal verlängerten Polypeptide (z.B. bis aal26) zeigen eine ausgezeichnete Immunreaktivität und Kreuzselektivität (sogar im Gegensatz zu dem monoklonalen Antikörper LB509, der an das Epitop 115-122 bindet (Jakes et al., Neurosci Lett. 1999 Jul 2;269(1):13-6)); üÜüberraschenderweise zeigen die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung eine deutlich verbesserte Selektivität für Aggregate im Vergleich zu "klassischen Konstrukten" mit CRM197 oder KLH als Trägerprotein (während z.B. CRMbasierte Impfstoffe häufig keine Selektivität für Aggregate aufweisen oder sogar selektiv für das Monomer sind, zeigen die KonJugate gemäß der vorliegenden Erfindung eine deutliche und ausgeprägte Aktivität gegenüber Aggregaten).

Dies ist umso überraschender angesichts der veröffentlichten Experimente, in denen LB509 an Alpha-Synuclein-Aggregate bindet, aber nicht in der Lage ist, die Aggregation zu hemmen (Breydo et al. Mol Neurobiol 53, 1949-1958 (2015)), was zeigt, dass nicht Jeder Antikörper von diesem Epitop biologisch aktiv ist, wie im Fall der vorliegenden Erfindung.

Es ist in der Fachwelt allgemein anerkannt, dass MorbusParkinson-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen andere Veränderungen in ihrem T-Zell-Kompartiment aufweisen (z. B.: Bas et al., J Neuroimmunol 2001; 113:146-52 oder Gruden et al., J Neuroimmunol 2011; 233:221-7). Solche phänotypischen Veränderungen der T-Zellen bei Morbus Parkinson sind z. B.: verringerte absolute

Lymphozytenzahlen, verringerte absolute und relative Zahlen der

gesamten T-Zellen, verringerte absolute und relative Zahlen der CD4+ und manchmal auch CD8+ Lymphozyten, erhöhte Th1/Th2- und Th17/Treg-Verhältnisse und eine erhöhte Expression entzündlicher Zytokine. Die meisten dieser Veränderungen finden sich jedoch auch beim gesunden Altern, so dass es schwierig ist, die Auswirkungen einer Krankheit wie Morbus Parkinson zu erkennen, die in einem sehr breiten Spektrum (+30-90 Jahre) auftritt und unterschiedlich schnell fortschreitet. Was die absoluten Zellzahlen betrifft, so scheint es einen Konsens zu geben, dass die Zahl der CD3+CD4+ TZellen bei Morbus Parkinson abnimmt. Dieser CD4-Rückgang wird durch das beschriebene veränderte CD4:CD8-Verhältnis unterstützt.

In diesem Sinne zeigen beispielsweise Bhatia et al. (J Neuroinflammation (2021) 18:250) einen allgemeinen Rückgang der gesamten CD3+ T-Zellen bei Morbus Parkinson in Verbindung mit der Schwere der Erkrankung (z. B. gemessen anhand der H+Y-Stadien). Dies deutet auf eine fortschreitende allgemeine T-Zell-Dysfunktion bei fortschreitender Krankheit hin, die wahrscheinlich auf die kombinierte Wirkung von anhaltender Entzündung, Medikamenten und Lebensstiländerung zurückzuführen ist. Außerdem zeigen Lindestam Arlehamn et al. (2020), dass die höchste T-Zell-Aktivität bei Parkinson-Patienten im Prodromalstadium oder im frühen klinischen Stadium (<10 Jahre Dauer und H+Y-Stadien 0-2) nachweisbar ist.

Daher ist es eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Behandlung zur Erhöhung oder Erhaltung der T-ZellZahlen, insbesondere der T-Effektor-Zell-Zahlen, und der T-ZellFunktion bei einem PD-Patienten bereitzustellen. Dies umfasst vorzugsweise eine Kombination von Checkpoint-Inhibitoren oder Impfstoffen, die Anti-Immun-Checkpoint-Inhibitor-Epitope verwenden, um eine Anti-Immun-Checkpoint-Inhibitor-Immunantwort in Kombination mit zielspezifischen Impfstoffen der vorliegenden Erfindung zu induzieren, um die T-Zell-Zahlen, insbesondere die T-EffektorZell-Zahlen und die T-Zell-Funktion in einem Parkinson-Patienten zu erhöhen oder zu erhalten.

Patienten, die für die Behandlung geeignet sind, zeichnen sich durch eine allgemeine Verringerung der CD3+-Zellen, insbesondere der CD3+CD4+-Zellen aus, die für Parkinson-Patienten in allen Krankheitsstadien typisch ist. Die bevorzugten Krankheitsstadien, die die für diese Kombination geeigneten Patientengruppen definieren, sind H+Y-Stadien 1-4, bevorzugt H+Y1-3, am meisten bevorzugt H+Y 2-3.

Auch die Affinitätsreifung von zielspezifischen Reaktionen, die bei wiederholter Immunisierung mit Trägerkon]ugaten ausgelöst werden, wird durch die Überrepräsentation von trägerspezifischen Epitopen in den Kon]ugaten beeinträchtigt. Unter Affinitätsreifung versteht man in der Immunologie den Prozess, durch den Trm zellaktivierte B-Zellen im Verlauf einer Immunantwort Antikörper mit erhöhter Affinität für Antigene produzieren. Bei wiederholter Exposition gegenüber demselben Antigen produziert ein Wirt Antikörper mit sukzessive höherer Affinität. Eine sekundäre Reaktion kann Antikörper mit einer um ein Vielfaches höheren Affinität als bei einer primären Reaktion hervorrufen. Die Affinitätsreifung erfolgt in erster Linie auf den Oberflächen-Immunglobulinen der B-Zellen des Keimzentrums und als direktes Ergebnis der somatischen Hypermutation (SHM) und der Selektion durch Tr» Zellen (siehe auch: https://en.wikipedia.org/wiki/Affinity maturation). Affinitätsreifung nach dem Segen's Medical Dictionary (https://medical-dictionary.thefreedictionary.com/affinity+maturation">Affinitätsreifung) ist die erhöhte durchschnittliche Affinität von Antikörpern zu einem Antigen, die auf eine Immunisierung folgt. Die Affinitätsreifung resultiert aus einer Zunahme spezifischer und homogener IgG-Antikörper und folgt auf eine weniger spezifische und heterogenere frühe Reaktion von IgM-Molekülen.

Die derzeit verfügbaren CLEC-Impfstoffe induzieren alle hohe Titer gegen die verwendeten Trägerproteine (z. B. CRM197 oder OVA). Diese hohe Immunogenität sowie die strukturelle Komplexität und Heterogenität der Trägerproteinkomponente können jedoch dazu führen, dass hohe Mengen an träger- bzw. protein-spezifischen Antikörpern auf Kosten von zielspezifischen Reaktionen induziert werden, die daher im Vergleich zur induzierten Trägerantwort unterrepräsentiert sein könnten.

Darüber hinaus bergen hohe Antiträgerreaktionen auch das Risiko einer immunologischen Abstoßung und damit verbundene Sicherheitsprobleme.

Durch die Identifizierung wirksamer Konstrukte mit hoher Immunogenität, hoher Zielspezifität und hoher Verträglichkeit/Sicherheit bei geringer oder fehlender Trägerreaktivität (d. h. gegen den Proteinträger) gemäß der vorliegenden Erfindung wird diese Herausforderung durch innovative Lösungen erfolgreich bewältigt.

Darüber hinaus ist es für die neuartigen Impfstoffe gemäß der

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vorliegenden Erfindung von entscheidender Bedeutung, immuntherapeutische Wirkstoffe bereitzustellen, die keine/sehr schwache Immunreaktionen gegen das Zuckergerüst auslösen. Dies ist besonders wichtig, da hohe Anti-CLEC-Antikörperspiegel, die bei der Immunisierung induziert werden, die Wirksamkeit einer wiederholten Immunisierung mit demselben CLEC-basierten Impfstoff aufgrund der Neutralisierung des Impfstoffs hemmen oder verringern könnten oder sich auch negativ auf die Verwendung dieser Art von Impfstoffen für die aufeinanderfolgende Immunisierung gegen verschiedene Ziele auswirken könnten.

Die erfindungsgemäße Impfstoffplattform erfüllt auch die Anforderung, verschiedene Epitope, die auf ein oder mehrere Ziele gerichtet sind, in einer Formulierung zu kombinieren, ohne dass die Gefahr besteht, dass die Wirksamkeit aufgrund einer unbeabsichtigten Epitopausbreitung, wie sie bei klassischen Impfstoffen auftritt, verringert wird. Der modulare Aufbau der erfindungsgemäßen Plattform ermöglicht einen einfachen Austausch von B- und TZell-Epitopen ohne negative Auswirkungen einer trägerinduzierten Reaktion.

Die vorliegende Erfindung basiert auf einem CLEC, der eine

hochspezifische Bindung an den entsprechenden Rezeptor ausübt. Diese Bindung ist von entscheidender Bedeutung, und nur starke Bindemittel sind als Impfstoffträger/Backbones effizient. Die CLEC-Konjugation gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine effiziente Immunantwort mit neuartigen Eigenschaften. Die erfindungsgemäße Konjugation schließt die Bildung von AntiCLEC-Antikörpern, insbesondere für Pustulan, aus, was im Rahmen der vorliegenden Erfindung eindrucksvoll gezeigt werden konnte. Das Fehlen der Bildung von Anti-CLEC-Antikörpern ist für die Wiederverwendbarkeit und Auffrischung einzelner Impfstoffe, die mit der erfindungsgemäßen Plattform entwickelt wurden, von großer Bedeutung - sei es mit den gleichen oder anderen Antigenen.

Im Gegensatz zur konjugierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung führt ein bloßes Mischen des CLEC-PolysaccharidAdjuvans und der B-Zell- oder T-Zell-Epitop-Peptide nicht zu vergleichbaren Wirkungen in vivo. Im Falle der Konjugation hat die Orientierung des Peptids Jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Leistung der erfindungsgemäßen Verbindungen; die CLEC-Konj]ugation ist daher im Wesentlichen unabhängig von der Peptidorien-

tierung im Konstrukt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte

gezeigt werden, dass die CLEC-Konjugation, insbesondere an Pustulan, zu einer Verbesserung sowohl neuer als auch bestehender Peptid-Immunogene/Antigene von alpha-Synuclein führt: Diese Verbesserung erfolgt durch höhere, zielspezifischere und affinere Antikörperreaktionen (wie sich anhand der Antikörperselektivität und -funktionalität zeigen lässt). Dieser Effekt ist am stärksten ausgeprägt bei Pustulan oder ähnlichen ß-Glucanen, die überwiegend lineare ßB-(1,6)-Glucane mit einem Verhältnis von ß-(1,6)-gekoppelten Monosaccharidanteilen zu nicht-ß-(1,6)-gekoppelten Monosaccharidanteilen von mindestens 1:1, vorzugsweise mindestens 2:1, bevorzugter mindestens 5:1, insbesondere mindestens 10:1 sind, die überraschenderweise sogar deutlich besser als KLH oder CRM im direkten Vergleich und sogar besser als Mannan- oder Lichenan-KonJugate oder Konjugate, die Gersten-ß-Glucane enthalten, abschneiden.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "überwiegend lineare" ß-(1,6)-Glucane auf ß-(1,6)-D-Glucane, bei denen keine oder nur wenige vernetzende Zuckermonomereinheiten vorhanden sind, d. h. bei denen weniger als 1 %, vorzugsweise weniger als 0,1 %, insbesondere weniger als 0,01 % der Monosaccharideinheiten mehr als zwei kovalent gebundene Monosaccharideinheiten aufweisen.

Wie bereits oben erwähnt, ist Pustulan der bevorzugte CLEC im Sinne der vorliegenden Erfindung. Pustulan ist in der Regel frei von vernetzenden Zuckereinheiten und überwiegend ßB-(1,6)gekoppelt, so dass übliche Pustulanzubereitungen, die zur Herstellung der Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, weniger als 1 %, vorzugsweise weniger als 0.1 %, insbesondere weniger als 0,01 %, Monosaccharidanteile mit mehr als zwei kovalent gebundenen Monosaccharidanteilen enthalten und maximal 10 % Verunreinigungen mit ß-(1,3)- oder ß-(1,4)-gekoppelten Monosacchariden enthalten.

Die Tatsache, dass sich Pustulan im Rahmen der vorliegenden Erfindung als der wirksamste CLEC erwies, war unerwartet, da verschiedene Referenzen zeigen, dass Pustulan bei der Dectin-1-Bindung weniger wirksam sein sollte (z. B. Adams et al., J Pharmacol Exp Ther. 2008 Apr;325(1):115-23); in der Literatur wird berichtet, dass lineare 1,3 und verzweigte (1,3-Hauptkette und 1,6-Seitenast) die wirksamsten Dectin-1-Binder sind. Adams et al. (2008) berichteten beispielsweise, dass rekombinantes Dectin-1 aus Mäusen

nur Polymere erkannte und mit ihnen interagierte, die ein ß-(1,3)-

verknüpftes Glukoserückgrat enthielten. Dectin-1 interagierte weder mit einem Glucan, das ausschließlich aus einem ß-(1,6)-Glukoserückgrat bestand (Pustulan), noch mit Nicht-Glucan-Kohlenhydratpolymeren, wie Mannan.

Darüber hinaus zeigten die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung auch ein proportional stark erhöhtes Verhältnis von Antikörpern, die auf das Zielpolypeptid reagierten, im Vergleich zu Antikörpern die auf Trägermoleküle wie bei nicht-CLEC-, insbesondere nicht pustulanhaltigen Impfstoffen, reagierten. Dies erhöht den spezifischen Fokus der Antikörper-Immunantwort auf das Zielpolypeptid und nicht auf den Träger, was wiederum zu einer erhöhten Wirksamkeit und Spezifität der Reaktion führt.

Die CLEC-Konjugation gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere mit Pustulan, führt auch zu einer erhöhten Affinitätsreifung (AM) gegenüber Zielproteinen (AM wird stark erhöht, während KLH/CRM-Konjugate bei wiederholter Immunisierung nur eine begrenzte AM aufweisen).

Auf dem Gebiet der Impfstoffe wurden geeignete Impfstoffe mit ausschließlich B-Zell-Epitopen oder ausschließlich T-Zell-Epitopen offengelegt. Es gibt bestimmte Umstände, unter denen Impfstoffe mit ausschließlich T-Zell-Epitopen oder ausschließlich BZell-Epitopen angemessen und vorzuziehen sind. Die meisten der auf dem Markt befindlichen Impfstoffe enthalten jedoch beide Arten von Epitopen, d. h. T-Zell-Epitope und B-Zell-Epitope.

So sind beispielsweise Impfstoffe, die nur B-Zell-Epitope enthalten, in den meisten Fällen nicht sehr wirksam, auch wenn sie zu einer nachweisbaren Antikörper-Immunantwort führen. In den meisten Fällen ist diese Immunreaktion jedoch weit weniger wirksam als bei einem Impfstoff, der B- und T-Zell-Epitope enthält. Dies steht auch im Einklang mit den Beispielen im Abschnitt "Beispiele" der vorliegenden Erfindung, bei denen eine geringere Reaktion nachweisbar war.

Andererseits sind Impfstoffe, die nur T-Zell-Epitope enthalten (z. B. in Impfstoffen, bei denen eine spezifische T-ZellAntwort die aktive Komponente der Antwort wäre), für bestimmte Anwendungen besonders interessant, insbesondere für Krebs, bei denen krebsspezifische zytotoxische T-Lymphozyten- und T-Helferzell-Epitope oder nur CTL-Epitope mit der Impfstoffplattform gemäß der vorliegenden Erfindung kombiniert werden. In diesem Fall wird

ein T-Zell-Epitop mit dem CLEC-Polysaccharid-Adjuvans gemäß der

vorliegenden Erfindung nur mit dem T-Zell-Epitop versehen. Dies wird z. B. in Fällen bevorzugt, in denen somatische Mutationen in Krebserkrankungen proteinkodierende Gene betreffen, die zu potenziell therapeutischen Neoepitopen führen können. Diese Neoepitope können die Grundlage für adoptive Zelltherapien und peptid- (und RNA-) basierte Neoepitop-Impfstoffe bilden, um mit autologen zytotoxischen T-Zellen des Patienten selektiv gegen Tumorzellen vorzugehen. Die Verwendung eines Impfstoffs, der nur T-Zell-Epitope enthält, kann auch bei bestimmten Autoimmunkrankheiten von Vorteil sein. Der Behandlungseffekt des Jeweiligen Konjugats, das nur TZell-Epitope enthält, ist mit einer Verringerung der Effektor-TZellen und der Entwicklung regulatorischer T-Zell-Populationen (Treg ) verbunden, was zur Dämpfung der Jeweiligen Autoimmunerkrankung (z. B. Multiple Sklerose oder ähnliche Erkrankungen) führt.

Da die meisten der üblichen Impfstoffe sowohl B-Zell- als auch T-Zell-Epitope enthalten, umfassen auch die CLEC-Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise sowohl einzelne Bals auch T-Zell-Epitope (mindestens ein B-Zell-Epitop von AlphaSynuclein und mindestens ein T-Zell-Epitop) für eine anhaltende BZell-Immunantwort. Eine schwache Wirkung kann Jedoch bei Bedarf eine T-Zell-unabhängige Immunität demonstrieren.

Die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung sind daher in Bezug auf mögliche Impfstoffantigene nicht beschränkt. Daher können die Alpha-Synuclein-Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung zusätzlich weitere Antigene enthalten, um bi-, tri-, tetra-, penta-, hexa- (usw.) oder multispezifische Impfstoffe bereitzustellen.

Vorzugsweise haben die Impfstoffantigene (d. h. B-Zellund/oder T-Zell-Epitop-Polypeptide) eine Länge von 6 bis 50 Aminosäureresten, vorzugsweise von 7 bis 40 Aminosäureresten, insbesondere von 8 bis 30 Aminosäureresten.

Eine Quervernetzung von B-Zell-Rezeptoren ist mit den erfindungsgemäßen Impfstoffen ebenfalls möglich. Gemäß einer speziellen Ausführungsform werden die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung für eine T-Zell-unabhängige Immunisierung verwendet. TZell-unabhängige Reaktionen sind für Polysaccharid-Impfstoffe gut bekannt. Diese Impfstoffe bzw. das Polysaccharid erzeugen eine Immunantwort durch direkte Stimulierung der B-Zellen, ohne die Hilfe von T-Zellen. Die T-Zell-unabhängige Antikörperreaktion ist

von kurzer Dauer. Die Antikörperkonzentrationen für Pneumokokken-

Kapselpolysaccharide sinken Je nach Serotyp in der Regel nach 3-8 Jahren auf den Ausgangswert zurück. In der Regel kann die Impfantwort durch zusätzliche Dosen nicht verstärkt werden, da der Polysaccharid-Impfstoff kein immunologisches Gedächtnis bildet. Bei Kindern unter zwei Jahren ist der Polysaccharid-Impfstoff nur schwach immunogen. Hier könnte der Grund für die direkte Stimulation darin liegen, dass B-Zellen ein Molekül namens CR3 (Komplementrezeptor Typ 3) exprimieren. Das Makrophagen-1-Antigen oder CR3 ist ein menschlicher Zelloberflächenrezeptor, der auf B- und T-Lymphozyten, polymorphkernigen Leukozyten (vor allem Neutrophilen), NK-Zellen und mononuklearen Fresszellen wie Makrophagen zu finden ist. CR3 erkennt auch iC3b, wenn es an die Oberfläche fremder Zellen gebunden ist, und ß-Glucan, was bedeutet, dass die direkte Aufnahme des Impfstoffs durch B-Zellen über eine Pus-CR3Interaktion zur Stimulierung der Zellen und zur Entwicklung einer schwachen TI-Immunantwort führen könnte.

Die Ad]uvantien, Konjugate und Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung können Komplement binden und opsonisiert werden. Opsonisierte Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung könnten eine erhöhte B-Zell-Aktivierungsfähigkeit aufweisen, was zu höheren Antikörpertitern und Antikörperaffinitäten führen könnte. Dieser Effekt ist für C3d-Konj]jugate bekannt (Green et al., J. Virol. 77 (2003), 2046-2055) bekannt und ist überraschenderweise auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung nutzbar.

Ein weiterer unerwarteter Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die CLEC-Architektur der vorliegenden Erfindung einen modularen Aufbau des Impfstoffs ermöglicht. So können beispielsweise Epitope beliebig kombiniert werden und die Plattform ist unabhängig von herkömmlichen Trägermolekülen. Obwohl der Schwerpunkt der vorliegenden Erfindung auf reinen Peptidimpfstoffen liegt, funktioniert sie auch mit der unabhängigen Kopplung von Proteinen und Peptiden sowie mit der Kopplung von Peptid-ProteinKonj]jugaten an die CLEC-Backbones gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere an Pustulan. Wie im Beispielsabschnitt mit Pustulan gezeigt, wird mit der vorliegenden Erfindung eine signifikant bessere Immunantwort im Vergleich zu klassischen Impfstoffen erzielt.

Wie bereits oben beschrieben, können die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn sie in einem pharmazeutischen Präparat bereitgestellt werden (z. B. als Impfstoff, der dazu be-

stimmt ist, einem (menschlichen) Probanden verabreicht zu werden,

um eine Immunreaktion auf ein spezifisches Polypeptidepitop auszulösen, das an das CLEC-Grundgerüst konjugiert ist, wobei die Immunreaktion auf dieses Epitop ausgelöst werden sollte), ohne die Notwendigkeit der Verwendung (durch gemeinsame Verabreichung) eines (weiteren) Adjuvans in diesem Präparat verabreicht werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die pharmazeutische Formulierung, die das Kon]ugat gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, frei von Ad7juvantien.

Eine besonders bevorzugte Klasse von CLEC-Polysaccharid-Ad]Juvantien gemäß der vorliegenden Erfindung sind ß-Glucane, insbesondere Pustulan. Ein weiteres bevorzugtes CLEC-Polysaccharid-Ad]Juvans ist Mannan. Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung wurde Pustulan im Stand der Technik nur für Anti-Pilz-Impfstoffe verwendet (wobei Pustulan als Antigen und nicht als Träger wie in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde). Pustulan weist auch eine andere Hauptkette auf, da es nur aus ß -(1,6)-verknüpften Zuckereinheiten besteht.

Pustulan ist ein mittelgroßes lLineares ß-(1,6)-Glucan. Pustulan sowie synthetische Formen von linearem ß(1,6)-Glucan unterscheiden sich von allen anderen verwendeten Glucanen, da ßGlucane in der Regel aus verzweigten Glucanketten (vorzugsweise ßB(1,3)-Hauptketten mit ß-(1,6)-Seitenketten wie Hefeextrakte, GPs, Laminarin, Schizophyllan, Scleroglucan) oder linearen Glucanen bestehen, die nur auf ß-(1,3)-Glucanen beruhen wie synthetisches ßGlucan, Curdlan, S. cerevisiae ß-Glucan (150kDa) oder lineare ßB(1,3:1,4)-Glucane wie Gersten- und Hafer-ß-Glucan sowie Lichenan.

Wie mit der vorliegenden Erfindung erstmals gezeigt werden konnte, ist die Bindung von Glucankonjugaten an den Dectin-1-Rezeptor in vitro ein Surrogat für die spätere Wirksamkeit in vivo: Moleküle mit geringer Bindung können nur geringe Immunantworten auslösen, mittlere Binder sind besser, während hocheffiziente Binder hocheffiziente Reaktionen hervorrufen (Hafer/Gerste BG < Lichenan < Pustulan).

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die CLECs (z. B. durch Standardtechniken) an einzelne durch Standardtechniken) an einzelne Alpha-Synuclein-Polypeptide gekoppelt, um kleine Nanopartikel mit geringer Polydispersität (Bereich des hydrodynamischen Radius (HDR): 5-15nm) zu erzeugen, die nicht vernetzt sind und

nicht zu größeren Partikeln aggregieren, wie bei herkömmlichen

CLEC-Impfstoffen. ,‚ Z.B.: Glucanpartikeln (2-4um) oder ß-Glucanpartikeln (wie sie in der Literatur offengelegt sind) die in der Regel durch einen Größenbereich von >100nm charakterisiert sind (typischer Bereich:Durchmesser; 150-500nm, z. B. Wang et al. (2019) liefern Partikel mit einem Durchmesser von 160nm (bewertet durch DLS) und einer Größe von ca. 150nm, bewertet durch TEM; Jin et al. (2018) liefern ß-Glucanpartikel (Nanopartikel aus aminiertem ßB-Glucan-Ovalbumin) mit einer Größe von 180-215nm (bewertet durch DLS bzw. SEM).

Diese Kon]ugate enthalten vorzugsweise mindestens ein T-ZellEpitop, insbesondere ein promiskes, ein lineares oder ein Trägerpeptid-T-Zell-Epitop (z. B. von CRM197 oder KLH).

Definitionsgemäß ist der mit DLS gemessene hydrodynamische Radius der Radius einer hypothetischen harten Kugel, die mit der gleichen Geschwindigkeit diffundiert wie das untersuchte Teilchen. Der Radius wird aus dem Diffusionskoeffizienten berechnet, wobei die Kugelform des Moleküls/Partikels und eine bestimmte Viskosität des Puffers angenommen werden. Der HDR wird auch als Stokes-Radius bezeichnet und wird aus dem Diffusionskoeffizienten mit Hilfe der Stokes-Einstein-Gleichung berechnet (siehe https://en.wikipedia.org/wiki/Stokes radius).

Bevorzugte Größenbereiche der erfindungsgemäßen Nanopartikel können die im Stand der Technik üblichen sein, d.h. mit einer Größe von 1 bis 5000nm, vorzugsweise von 1 bis 200nm, insbesondere von 2 bis 160nm, bestimmt als hydrodynamischer Radius (HDR) durch dynamische Lichtstreuung (DLS). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Partikelgröße kleiner, z.B. von 1 bis 50nm, vorzugsweise von 1 bis 25nm, insbesondere von 2 bis 15nm, bestimmt als HDR durch DLS. Diese bevorzugten Partikel sind daher kleiner, einschließlich der reinen PeptidkonJugate (etwa 5 nm durchschnittliche HDR) und CRM-Pustulan-Konj]ugate (etwa 10-15 nm durchschnittliche HDR). Dementsprechend sind die bevorzugten Partikel gemäß der vorliegenden Erfindung kleiner als 100 nm, was uns von Wang et al. unterscheiden würde.

Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Impfstoffprodukt zur Impfung eines Individuums gegen ein spezifisches Alpha-Synuclein-Antigen, wobei das Produkt eine Verbindung umfasst, die ein ß-Glucan oder Mannan als PolysaccharidAdjuvans vom Typ C-Lectin (CLEC) umfasst, das kovalent an das

spezifische Antigen gekoppelt ist.

Vorzugsweise umfasst das Impfstoffprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung ein Kon]ugat, wie hierin offenbart oder durch ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich oder erhalten.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Impfstoffprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung ein Alpha-SynucleinAntigen, das mindestens ein Alpha-Synuclein-B-Zell-Epitop und mindestens ein T-Zell-Epitop umfasst, wobei das Antigen vorzugsweise ein Polypeptid ist, das ein oder mehrere B-Zell- und T-Zell-Epitope umfasst.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegen das kovalent gekoppelte Antigen und das CLEC-Polysaccharid-Adjuvans im erfindungsgemäßen Impfstoffprodukt als Partikel mit einer Größe von 1 bis 5000 nm, vorzugsweise von 1 bis 200 nm, insbesondere von 2 bis 160 nm, vor, bestimmt als hydrodynamischer Radius (HDR) durch dynamische Lichtstreuung (DLS). Im Folgenden sind alle Partikelgrößen Medianpartikelgrößen, wobei der Median der Wert ist, der die Hälfte der Partikel mit einer höheren Größe von der Hälfte der Partikel mit einer niedrigeren Größe trennt. Es ist die ermittelte Partikelgröße, von der die Hälfte der Partikel kleiner und die Hälfte größer ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegen das kovalent gekoppelte Antigen und das CLEC-Polysaccharid-Adjuvans in dem erfindungsgemäßen Impfstoffprodukt als Partikel mit einer Größe von 1l bis 50 nm, vorzugsweise von 1 bis 25 nm, insbesondere von 2 bis 15 nm, bestimmt als HDR durch DLS, vor.

Vorzugsweise liegen das kovalent gekoppelte Antigen und das CLEC-Polysaccharid-Adjuvans im erfindungsgemäßen Impfstoffprodukt als Partikel mit einer Größe von weniger als 100nm, 50nm, vorzugsweise weniger als 7/0nm, insbesondere weniger als 50nm, bestimmt als HDR durch DLS, vor.

Die Impfstoffprodukte nach der vorliegenden Erfindung weisen eine hohe Lagerstabilität auf. Bei Lagerung als flüssiges oder gefrorenes Material (Lagertemperatur: -80°C, -20°C, 2-8°C oder bei Raumtemperatur über längere Zeiträume, mindestens 3 Monate) findet praktisch keine Aggregation statt, da festgestellt werden kann, dass die Partikelgröße während der Lagerung nicht signifikant (d. h. um mehr als 10 %) zunimmt.

Die extrem hohe Wirksamkeit dieser kleinen Partikel, die durch

die Verwendung der mittelmolekularen Komponente Pustulan gemäß der

vorliegenden Erfindung hergestellt werden, ist überraschend: So sind nach Adams et al. (2008) die besten Dectin-1-Substrate lineares ß(1,3)-Glucanphosphat (ca. 150kda) und verzweigte Glucane (mit einer ßB(1,3)-Hauptkette und ßB(1,6)-Seitenketten) wie Scleroglucane oder Glucane aus C. albicans oder Laminarin. Darüber hinaus deuten die Daten von Adams et al. und Palma et al. (J Biol Chem. 281(9) (2006) 5771-5779) und Willment et al. (J Biol Chem. 276(47) (2001), 43818-23) darauf hin, dass Dectin-1 nicht oder nur schwach mit Pustulan interagiert und auch nicht mit Nicht-Glucan-Kohlenhydratpolymeren, wie Mannan. In der Tat wird in verschiedenen Referenzen berichtet, dass Pustulan bei der Dectin-1-Bindung weniger wirksam ist. Im Allgemeinen sind Jedoch lineare 1,3 und verzweigte (1,3-Hauptkette und 1,6-Seitenast) die effektivsten Dectin-1-Binder; Adams et al. (2008) zeigen, dass rekombinantes Dectin-1 aus Mäusen nur Polymere erkennt und mit ihnen interagiert, die ein B(1,3)-verknüpftes Glukoserückgrat enthalten. Dectin-1 interagierte nicht mit einem Glucan, das ausschließlich aus einem ß(1,6)Gerüst (wie Pustulan) bestand, noch interagierte es mit NichtGlukan-Kohlenhydratpolymeren, wie Mannan. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass Konjugate auf Pustulanbasis in der Lage sind, stark an Dectin-1 zu binden und in vitro zelluläre Reaktionen auszulösen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein ß-(1,6)-Glucan verwendet. In der Regel wird im Stand der Technik berichtet, dass große Partikel bei der Aktivierung von PRRs effektiver sind als kleine ("1ösliche") monomere Formulierungen, so dass Partikel, die große Glucane enthalten, überlegen sind (und daher bevorzugt werden) und kleine, lLösliche Glucane verwendet werden können, um die Aktivierung von DCs zu blockieren, wodurch die beabsichtigte Wirkung beeinträchtigt wird. Es ist allgemein bekannt, dass partikuläre ßB-Glucane, wie die weit verbreitete Hefezellwandfraktion Zymosan, an Dectin-1 binden und es aktivieren und dadurch zelluläre Reaktionen auslösen. Im Gegensatz dazu ist die Interaktion von löslichen ß-Glucanen mit Dectin-1 umstritten. Allgemeiner Konsens ist Jedoch, dass lösliche ßGlucane, wie das kleine, verzweigte Glucan Laminarin (ß-(1,3)- und B-(1,6)-Seitenketten), an Dectin-1 binden, aber nicht in der Lage sind, eine Signalübertragung zu initiieren und zelluläre Reaktio-

nen in den DCs auszulösen (Willment et al., J Biol Chem. 276(47)

(2001), 43818-23, Goodridge et al. Nature. 2011, 472(7344): 471475.) .

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, dass Kon]jugate mit Glucanen mit hohem Molgewicht (10-fache Größe von Pustulan; z. B. Hafer/Gerste 229kDa/Lichenan 245kDa) weniger wirksam sind als Pustulanpartikel (20kDa). Korotchenko et al. zeigen, dass OVA/Lam-Konjugate einen Durchmesser von ca. 10 nm haben, Dectin-1 binden und in vitro eine DC-Aktivierung induzieren, aber verzweigte Glucane sind, nicht hautspezifisch und in Bezug auf die Wirkung in vivo nicht besser als OVA, das in die Haut appliziert wird, oder OVA/Alum, das s.c. appliziert wird. Wang et al. liefern B-Glucanpartikel mit >100nm Größe (durchschnittliche Größe: 160nm). Jin et al. (2018) zeigen aminierte ß-Glucan-Oalbumin-Nanopartikel mit einer Größe von 180-215nm.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass Partikel auf Pustulanbasis starke Dectin-1-Binder sind, DCs in vitro aktivieren (Veränderungen der Oberflächenmarkerexpression) und eine sehr starke Immunantwort hervorrufen, die a) anderen Wegen überlegen und b) vergleichbar mit KLH/CRM-Konjugat-Impfstoffen (in der Regel auch viel größere Partikel) und C) größeren Glucanen und auch Mannan ist. Dies gilt für Peptid-Pustulan (Größe von 5nm) und für Peptid-CRM-Pustulan-Kon]ugate (Größe von 11nm).

Für eine optimale Immunantwort ist der Aktivierungsgrad der CLEC, insbesondere von Pustulan, und das aus diesem Aktivierungsgrad resultierende Peptid-Zucker-Verhältnis entscheidend. Die Aktivierung der jeweiligen CLEC wird durch milde Periodat-Oxidation erreicht. Der Grad der Oxidation wird also durch Zugabe der Periodatlösung in einem bestimmten molaren Verhältnis bestimmt: d.h. Periodat:Zuckeruntereinheit; 100% = 1 Mol Periodat pro Mol Zuckermonomere.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Konj]ugate gemäß der vorliegenden Erfindung eine CLEC, die mit einem Verhältnis von Periodat zu ß-Glucan- oder Mannan-Anteil (Monomer) von 1/5 (d.h. 20 % Aktivierung) bis 2,6/1 (d.h. 260 % Aktivierung) aktiviert ist, vorzugsweise von 60 % bis 140 %, insbesondere 70 % bis 100 %.

Der optimale Bereich des Oxidationsgrades (der direkt proportional zur Anzahl der Epitop-Polypeptide im endgültigen Konjugat ist) zwischen einem niedrigen/mittleren Oxidationsgrad und einem

hohen Oxidationsgrad kann definiert werden als die Reaktivität mit

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dem Schiff'schen Fuchsin-Reagenz, die der einer gleichen Menge des gegebenen Kohlenhydrats (z. B. Pustulan) entspricht, das mit Periodat bei einem Molverhältnis (Zuckermonomer: Periodat) von 0,20,6 (niedrig/mittel), 0,6-1,4 (optimaler Bereich) bzw. 1,4-2,6 (hoch) oxidiert wurde.

Bevorzugte Glucan-Peptid-Verhältnisse liegen im Bereich von 10 zu 1 (w/w) bis 1 zu 1 (w/w), vorzugsweise 8 zu 1 (w/w) bis 2 zu 1 (w/w), insbesondere 4 zu 1 (w/w); d. h. 24 zu 1 Molverhältnis von Zuckermonomer zu Peptid), die niedriger sind als wirksame Impfstoffe, über die anderswo berichtet wurde (z. B. Liang et al., Bromuro et al.).

Der Oxidationsgrad und die Menge an reaktiven Aldehyden, die für die Kopplung des Zuckers zur Verfügung stehen, werden mit modernen Methoden bestimmt, wie z. B.: 1) gravimetrische Messung, die die Bestimmung der Gesamtmasse der Probe ermöglicht; 2) die Anthron-Methode (nach Laurentin et al. 2003) - zur Konzentrationsbestimmung intakter, nicht oxidierter Zucker in der Probe; (in diesem Fall werden Glucane mit konzentriertem H2S01« dehydriert, um Furfural zu bilden, das mit Anthron (0,2% in H2SO1) kondensiert, um einen grünen Farbkomplex zu bilden, der kolorimetrisch bei 620nm gemessen werden kann) oder 3) Schiff's Assay: Der Oxidationsstatus der für die Konjugation verwendeten Kohlenhydrate wird mit Schiff’s Fuchsin-Sulfit-Reagenz bestimmt. Kurz gesagt, der Fuchsin-Farbstoff wird durch Schwefeldioxid entfärbt. Durch die Reaktion mit aliphatischen Aldehyden (auf Glucan) wird die violette Farbe des Fuchsins wiederhergestellt, die dann bei 570-600 nm gemessen werden kann. Die resultierende Farbreaktion ist proportional zum Oxidationsgrad (der Menge an Aldehydgruppen) des Kohlenhydrats. Andere geeignete Analysemethoden sind ebenfalls möglich. Das Peptidverhältnis kann mit geeigneten Methoden wie UVAnalyse (205nm/280nm) und Aminosäureanalyse (aa-Hydrolyse, Derivatisierung und RP-HPLC-Analyse) bestimmt werden.

Die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung können zur Induktion zielspezifischer Immunantworten verwendet werden, während sie keine oder nur sehr begrenzte CLEC- oder Trägerproteinspezifische Antikörperantworten induzieren. Die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung können ferner zur Induktion von AlphaSynuclein-spezifischen Immunantworten verwendet werden, während

sie keine oder nur sehr begrenzte CLEC- oder Trägerprotein-spezi-

fische Antikörperantworten induzieren. Wie im folgenden Beispielabschnitt gezeigt wird, ermöglicht die vorliegende Erfindung auch eine Verbesserung und Fokussierung der alpha-Synuclein-spezifischen Immunantwort, da sie die Immunantwort abseits von Reaktionen auf das Trägerprotein oder die CLEC auslöst (wie z.B. bei konventionellen Peptid-Träger-Konjugaten oder nicht-konjugierten Vergleichsversuchen, insbesondere auch unter Verwendung nicht-oxidierter CLECs, wie z.B. Pustulan).

Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich "Peptide" hier auf kürzere Polypeptidketten (mit 2 bis 50 Aminosäureresten), während "Proteine" sich auf längere Polypeptidketten (mit mehr als 50 Aminosäureresten) beziehen. Beide werden als "Polypeptide" bezeichnet. Die B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptide, die mit den CLECs gemäß der vorliegenden Erfindung kon]ugiert sind, umfassen neben den Polypeptiden mit den natürlich verwendeten Aminosäureresten der normalen Genexpression und Proteintranslation auch alle anderen Formen solcher polypeptidbasierten B-Zellund/oder T-Zell-Epitope, insbesondere natürlich oder künstlich modifizierte Formen davon, wie z.B. Glykopolypeptide und alle anderen posttranslational modifizierten Formen davon (z.B. die in den Beispielen offenbarten Pyro-Glu-Formen von Aß). Darüber hinaus sind die CLECs gemäß der vorliegenden Erfindung besonders geeignet, um konformationelle Epitope zu präsentieren, zum Beispiel konformationelle Epitope, die Teil größerer nativer Polypeptide, Mimotope, zyklischer Polypeptide oder oberflächengebundener Konstrukte sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Kon]ugat gemäß der vorliegenden Erfindung ein CLEC-Polysaccharid-Grundgerüst und ein B-Zell-Epitop. Ein "B-Zell-Epitop" ist der Teil des AlphaSynuclein-Antigens, an den Immunglobulin oder Antikörper binden. B-Zell-Epitope lassen sich in zwei Gruppen einteilen: konformationelle oder lineare Epitope. Es gibt zwei Hauptmethoden der Epitopkartierung: entweder strukturelle oder funktionelle Studien. Zu den Methoden für die strukturelle Kartierung von Epitopen gehören Röntgenkristallographie, kernmagnetische Resonanz und Elektronenmikroskopie. Bei den Methoden zur funktionellen Kartierung von Epitopen werden häufig Bindungstests wie Western Blot, Dot Blot und/oder ELISA eingesetzt, um die Antikörperbindung zu bestimmen. Mit Hilfe von Konkurrenzverfahren wird festgestellt, ob zwei mo-

noklonale Antikörper (mAbs) gleichzeitig an ein Antigen binden

können oder miteinander um die Bindung an derselben Stelle konkurrieren. Eine weitere Technik ist die Hochdurchsatz-Mutagenese, eine Epitopkartierungsstrategie, die entwickelt wurde, um die schnelle Kartierung von Konformationsepitopen auf strukturell komplexen Proteinen zu verbessern. Bei der Mutagenese werden zufällige/standortgerichtete Mutationen an einzelnen Resten verwendet, um Epitope zu kartieren. Die Kartierung von B-Zell-Epitopen kann für die Entwicklung von Antikörpertherapeutika, ppeptidbasierten Impfstoffen und immundiagnostischen Instrumenten genutzt werden (Sanchez-Trincado et al., J. Immunol. Res. 2017-2680160). Für viele Antigene sind B-Zell-Epitope bekannt und können in der vorliegenden CLEC-Plattform verwendet werden.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung ein CLEC-PolysaccharidGrundgerüst und ein promiskes T-Zell-Epitop und/oder ein MHCIIEpitop, von denen bekannt ist, dass sie mit mehreren/allen MHCAllelen einer bestimmten Spezies sowie in anderen Spezies funktionieren.

Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung der vorliegenden CLEC-Technologie zur Verbesserung bekannter T-Zell-Epitope. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung auch ein ß-Glucan oder Mannan zur Verwendung als Polysaccharid-Adjuvans vom Typ C-Lectin (CLEC) für TZell-Epitop-Polypeptide, wobei das ßB-Glucan oder Mannan kovalent mit dem T-Zell-Epitop-Polypeptid konjugiert ist, um ein Konjugat aus dem ßB-Glucan oder Mannan und dem T-Zell-Epitop-Polypeptid zu bilden.

Ein einzelnes T-Zell-Epitop, das an mehr als ein HLA-ALlel bindet, wird als "promiskes/promiskuitives T-Zell-Epitop" bezeichnet. Bevorzugte promiskuitive T-Zell-Epitope binden an 5 oder mehr, vorzugsweise 10 oder mehr, insbesondere 15 oder mehr, HLAAllele. Promiskuitive T-Zell-Epitope eignen sich für verschiedene Spezies und vor allem für mehrere MHC/HLA-Haplotypen (d. h. sowohl für MHCI- als auch für MHCII-Epitope, von denen bekannt ist, dass sie mit mehreren/allen MHC-Allelen funktionieren) einer bestimmten Spezies sowie für andere Arten. Das MHCII-Epitop PADRE (=natürliches Pan-DR-Epitop (PADRE)), auf das im Beispielabschnitt Bezug genommen wird, funktioniert beispielsweise bei mehreren menschlichen MHC-Allelen und bei der Maus (C57/B16, obwohl es bei Balb/c

weniger wirksam ist). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Konjugat der vorliegenden Erfindung ein T-Zell-Epitop, vorzugsweise ein T-Zell-Epitop mit der Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAAA (”"PADRE (Polypeptid)") oder eine PADRE (Polypeptid)-Variante.

Bevorzugte PADRE-Polypeptide oder PADRE-Polypeptidvarianten enthalten einen Linker (wie auch für andere hier verwendete Polypeptidepitope bevorzugt), wie z. B. einen Cysteinrest oder einen Linker, der einen Cysteinrest ("-C" oder "C-"; speziell für die Maleimid-Kopplung), einen NRRA-, NRRA-C- oder NRRA-NH-NH2-Linker umfasst. Zu den bevorzugten PADRE-Polypeptidvarianten gehören die im Stand der Technik offengelegten Varianten (z. B. in Alexander et al., Immunity 1 (1994), 751-761; US 9,249,187 B2, oder ), vorzugsweise eine verkürzte Variante ohne den C-terminalen A-Rest (AKFVAAWTLKAA), Varianten, bei denen der erste Rest Alanin durch einen aliphatischen Aminosäurerest ersetzt ist (z.B. Glycin, Valin, Isoleucin und Leucin), Varianten, bei denen der dritte Rest Phenylalanin durch L-Cyclohexylalanin ersetzt ist, Varianten, bei denen der dreizehnte (letzte) Aminosäurerest Alanin durch einen aliphatischen Aminosäurerest ersetzt ist (z.B. Glycin, Valin, Isoleucin und Leucin) ersetzt ist, Varianten, die Aminocapronsäure umfassen, die vorzugsweise an den C-Terminus der PADRE-Variante gekoppelt ist, oder Varianten mit der Aminosäuresequenz AXıFVAAX2TLX3AX4A, wobei X: ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus W, F, Y, H, D, E, N, O0, I und K; Xz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus F, N, Y und W besteht, X3 aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus H und K besteht, und X4 aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus A, D und E besteht (mit der Maßgabe, daß die Oligopeptidsequenz nicht AKFVAAWTLKAAA ist; US 9.249.187 B2); insbesondere wobei das T-Zell-Epitop ausgewählt ist aus AKFVAAWTLKAAANRRA- (NHNH2) , AKFVAAWTLKAAAN-C, AKFVAAWTLKAAA-C, AKFVAAWTLKAAANRRA-C, aKXVAAWTLKAAaAaZC, aKXVAAWTLKAAAaZCNRRA (SeqgqID7, 8, 87, 88, 89, 90, 91, 92), aKXVAAWTLKAAa, aKXVAAWTLKAAaANRRA, aA(X)AAAKTAAAAa, aA(X)AAATLKAAa, aA(X)VAAATLKAAa, aA(X)IAAATLKAAa, aK(X)VAAWTLKAAa, und aKFVAAWTLKAAa (Sequenzen 760.5, 760.57, 906.09, 906.11, 965.10, 1024.03 von Alexander et al, 1994), worin X L-Cyclohexylalanin ist, Z Aminocapronsäure ist und a ein aliphatischer Aminosäurerest ist, ausgewählt aus Alanin, Glycin, Valin,

Isoleucin und Leucin

T-Zeill-Epitope werden auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle präsentiert, wo sie an Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) gebunden werden. Beim Menschen sind professionelle antigenpräsentierende Zellen darauf spezialisiert, MHC-Klasse-II-Peptide zu präsentieren, während die meisten kernhaltigen somatischen Zellen MHC-Klasse-I-Peptide präsentieren. T-Zell-Epitope, die von MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert werden, sind in der Regel Peptide mit einer Länge von 8 bis 11 Aminosäuren, während MHC-Klasse-II-Moleküle längere Peptide mit einer Länge von 13 bis 17 Aminosäuren präsentieren; nicht-klassische MHC-Moleküle präsentieren auch nicht-peptidische Epitope wie Glykolipide. MHC-Klasse-I- und -II-Epitope können allein mit Hilfe von Berechnungen zuverlässig vorhergesagt werden, obwohl nicht alle Algorithmen zur In-silico-Vorhersage von T-Zell-Epitopen gleich genau sind. Es gibt zwei Hauptmethoden zur Vorhersage der Peptid-MHC-Bindung: datengesteuerte und strukturbasierte. Strukturbasierte Methoden modellieren die Peptid-MHC-Struktur und erfordern eine hohe Rechenleistung. Datengesteuerte Methoden haben eine höhere Vorhersageleistung als strukturbasierte Methoden. Datengesteuerte Methoden sagen die Peptid-MHC-Bindung auf der Grundlage von Peptidsequenzen voraus, die MHC-Moleküle binden (SanchezTrincado et al., 2017). Durch die Identifizierung von T-ZellEpitopen können Wissenschaftler T-Zellen verfolgen, phänotypisieren und stimulieren. Für viele Antigene, einschließlich AlphaSynuclein, sind T-Zell-Epitope bekannt und können in der vorliegenden CLEC-Plattform verwendet werden.

Interessanterweise haben jüngste bahnbrechende Studien gezeigt, dass Alpha-Synuclein-spezifische T-Zellen bei ParkinsonPatienten erhöht sind, wahrscheinlich in Verbindung mit HLA-Risikohaplotypen, und deuten auf eine autoimmune Beteiligung von TZellen bei Parkinson hin (Sulzer et al., Nature 2017;546:656-661 und Lindestamn Arlehamn et al., Nat Commun. 1875;2020:11). Eine kausale Rolle von Alpha-Synuclein-reaktiven T-Zellen wurde kürzlich auch durch eine Tiermodellstudie untermauert [Williams et al., Brain. 2021;144:2047-2059). Das Auftreten von Alpha-Synuclein-reaktiven T-Zellen war in einer Fallstudie bereits Jahre vor dem Auftreten der Krankheit erhöht, und ihre Häufigkeit war in einer größeren Querschnittskohorte von Morbus-Parkinson-Patienten um und kurz nach dem Auftreten der Krankheit am höchsten (Lindestam

Arlehamn et al.). Nach Beginn der Erkrankung nahm die T-Zell-

Reaktion auf Alpha-Synuclein mit zunehmender Krankheitsdauer ab. Somit sind die Anti-aSyn-T-Zell-Antworten vor oder kurz nach der Diagnose der motorischen Parkinson-Krankheit am höchsten und nehmen danach ab (d. h. die maximale Aktivität ist weniger als 10 Jahre nach der Diagnose nachweisbar; und Hoehn und Yahr (H+Y)Stadien 1 und 2 werden bevorzugt) (Lindestamn Arlehamn et al. 2020).

Dementsprechend gibt es allgemein bekannte T-Zell-Epitope, die in der Sequenz von menschlichem Alpha-Synuclein enthalten sind. Beispiele finden sich in Benner et al. (PLoS ONE 3(1): e1376.60), Sulzer et al. (2017) und Lindestam Arlehamn et al. (2020).

Benner et al. (Benner et al., (2008) PLoS ONE 3(1): e1376.) verwenden ein 60 aa langes nitriertes (an Y-Resten) Polypeptid, das den C-terminalen Teil von aSyn umfasst, emulgiert in einem gleichen Volumen von CFA, das 1 mg/ml Mycobacterium tuberculosis enthält, als Immunogen in einem Parkinson-Modell und geben das alpha synuclein T-Zell-Epitop aa71-86 (VTGVTAVAOKTVEGAGNIAAATGFVK) bekannt.

Sulzer et al. (Nature 2017;546:656-661) identifizierten zwei T-Zell-antigene Regionen in den N- und C-terminalen Regionen von Alpha-Synuclein bei menschlichen PD-Patienten. Die erste Region befindet sich in der Nähe des N-Terminus und besteht aus den MHCIIEpitopen aa31-45 (GKTKEGVLYVGSKTK) und aa32-46 (KTKEGVLYVGSKTKE), die auch das 9mer-Polypeptid aa37-45 (VLYVGSKTK) als potenzielles Epitop der MHCI-Klasse enthalten. Die zweite von Sulzer et al. entdeckte antigene Region liegt in der Nähe des C-Terminus (aall6140) und erforderte die Phosphorylierung des Aminosäurerests S129,. Die drei phosphorylierten aaSl29-Epitope aall16-130 (MPVDPDNEAYEMPSE), aal21-135 (DNEAYEMPSEEGYOD) und aal26-140 (EMPSEEGYODYEPEA) lösten bei Parkinson-Patienten deutlich höhere Reaktionen aus als bei gesunden Kontrollpersonen. Die Autoren zeigen auch, dass die natürlich vorkommenden Immunreaktionen auf AlphaSynuclein im Zusammenhang mit Morbus Parkinson sowohl auf die MHCKlasse I als auch auf die Klasse II beschränkte Komponenten aufweisen.

Darüber hinaus haben Lindestam Arlehamn et al. (Nat Commun. 1875;2020:11) das Alpha-Synuclein-Peptid aa61-75 (EQOVTNVGGAVVTGVT) als T-Zell-Epitop (MHCII) bei Parkinson-Patienten entdeckt.

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Dementsprechend gehören zu den bevorzugten T-Zell-Epitopen gemäß der vorliegenden Erfindung die Alpha-Synuclein-Polypeptide GKTKEGVLYVGSKTK (aa31-45), KTKEGVLYVGSKTKE (aa32-46), EQOVITINVGGAVVTGVT (aa61-75), VTGVTAVAOKTVEGAGNIAAATGFVK

(aa/1-86), DPDNEAYEMPSE (aall6-130), DNEAYEMPSEEGYOD

(aal121-135), und EMPSEEGYODYEPEA (aal126-140).

Die regulatorischen T-Zellen ("Treg-Zellen" oder "Tregs") sind eine Subpopulation von T-Zellen, die das Immunsystem modulieren, die Toleranz gegenüber Selbstantigenen aufrechterhalten und Autoimmunerkrankungen verhindern. Treg-Zellen sind immunsuppressiv und unterdrücken im Allgemeinen die Induktion und Proliferation von Effektor-T-Zellen oder regulieren sie herunter. Tregs, die von einem normalen Thymus produziert werden, werden als "natürlich" bezeichnet. Die Selektion natürlicher Tregs erfolgt auf strahlenresistenten, hämatopoetisch abgeleiteten MHC-Klasse-IIexprimierenden Zellen in der Medulla oder Hassal-Körperchen im Thymus. Der Prozess der Treg-Selektion wird durch die Affinität der Interaktion mit dem Selbstpeptid-MHC-Komplex bestimmt. Eine TZelle, die sehr starke Signale empfängt, wird apoptotisch abgetötet; eine Zelle, die ein schwaches Signal empfängt, wird überleben und zu einer Effektorzelle selektiert werden. Erhält eine T-Zelle ein mittleres Signal, wird sie zu einer regulatorischen Zelle. Aufgrund des stochastischen Charakters des Prozesses der T-ZellAktivierung werden alle T-Zell-Populationen mit einem bestimmten TCR in einer Mischung aus Teff und Treg enden - die relativen Anteile werden durch die Affinitäten der T-Zelle für das Selbstpeptid-MHC bestimmt. Treg, die durch Differenzierung naiver TZellen außerhalb des Thymus, d. h. in der Peripherie, oder in Zellkulturen gebildet werden, werden als "adaptive" oder "induzierte" (d. h. iTregs) bezeichnet.

Natürliche Tregs sind dadurch gekennzeichnet, dass sie sowohl den CD4-T-Zell-Korezeptor als auch CD25, einen Bestandteil des IL2-Rezeptors, exprimieren. Tregs sind also CD4+ CD25+. Die

Expression des nukleären Transkriptionsfaktors Forkhead Box P3 (FoxP3) ist die entscheidende Eigenschaft, die die natürliche Entwicklung und Funktion von Tregs bestimmt. Tregs unterdrücken die Aktivierung, Proliferation und Zytokinproduktion von CD4+ TZellen und CD8+ T-Zellen und unterdrücken vermutlich B-Zellen und

dendritische Zellen, wodurch sie Autoimmunreaktionen dämpfen.

In diesem Sinne deuten mehrere Studien darauf hin, dass die Anzahl und Funktion der Tregs bei Parkinson-Patienten reduziert ist. So zeigen z. B. Hutter Saunders et al. (J Neuroimmune Pharmacol (2012) 7:927-938) und Chen et al. (MOLECULAR MEDICINE REPORTS 12: 6105-6111, 2015), dass die Fähigkeit regulatorischer T-Zellen (Treg) von Parkinson-Patienten, die Funktion von Effektor-T-Zellen zu unterdrücken, beeinträchtigt ist und dass der Anteil von Thlund Th17-Zellen erhöht ist, während der Anteil von Th2- und TregZellen verringert ist. Thome et al. (np]j Parkinson's Disease (2021) 7:41) zeigten, dass eine abnehmende PD-Treg-Funktion mit einer zunehmenden proinflammatorischen T-Zell-Aktivierung korreliert, die direkt zu einer anschließenden Zunahme der proinflammatorischen Signalgebung durch andere Immunzellpopulationen führen kann. Die Unterdrückung der T-Zell-Proliferation durch Tregs korrelierte signifikant mit dem Phänotyp pro-inflammatorischer Immunzellen in der Peripherie. Die suppressive Kapazität von PD-Tregs auf die Proliferation von T-Effektorzellen (z. B. CD4+) nahm mit zunehmender PD-Krankheitslast unter Verwendung der H&Y-Krankheitsskala ab, wobei die Aktivität in den Stadien H+Y 1 und 2 am höchsten war. Wichtig ist, dass Lindestam Arlehamn et al. (2020) zeigten, dass die Anti-ASyn-T-Zell-Reaktionen vor oder kurz nach der Diagnose der motorischen Parkinson-Erkrankung am höchsten sind und danach abnehmen (d. h. die maximale Aktivität ist weniger als 10 Jahre nach der Diagnose nachweisbar; und die Hoehn und Yahr (H+Y)Stadien 1 und 2 werden bevorzugt) (Lindestamn Arlehamn et al,., 2020).

Daher ist die Kombination der erfindungsgemäßen Impfstoffe mit 1) Impfstoffen, die ein Alpha-Synuclein-spezifisches Treg-Epitop enthalten (z. B. ein CD4-Epitop wie die von Brenner et al., Sulzer et al. und Lindestam Arlehamn et al. (aa31-45 (GKTKEGVLYVGSKTK), aa32-46 (KTKEGVLYVGSKTKE), aa61-75 (EQOVITINVGGAVVTGVT), aa/71-86 (VTIGVTAVAOKTVEGAGNIAAATGFVK), aall16-130 (MPVDPDNEAYEMPSE), aal21135 (DNEAYEMPSEEGYOD), und aal26-140 (EMPSEEGYODYEPEA)); und/oder 2) mit Treg-induzierenden Mitteln wie Rapamycin, niedrig dosiertem IL-2, TNF-Rezeptor-2 (TNFR2)-Agonisten, Anti-CD20-Antikörpern (z. B. Rituximab), Prednisolon, Inosin-Pranobex, Glatirameracetat,

Natriumbutyrat

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in frühen Krankheitsstadien bevorzugt (d. h. weniger als 10 Jahre nach der Diagnose; bevorzugt werden die Hoehn- und Yahr-Stadien 1 und 2), um die abnehmende/reduzierte Treg-Anzahl und -Aktivität zu erhöhen und dadurch die Autoimmunreaktivität von aSyn-spezifischen T-Effektorzellen zu verringern und Autoimmunreaktionen bei Parkinson-Patienten zu dämpfen.

Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Tregs bei einer Reihe von Krankheiten, insbesondere bei chronisch degenerativen oder Autoimmunerkrankungen wie (aktivem) systemischem Lupus erythematodes (SLE, aSLE), Typ-1-Diabetes (T1D), Autoimmun-Diabetes (AID), Multipler Sklerose (MS), amyotropher Lateralsklerose (ALS) und Alzheimer-Krankheit (AD) sowie anderen degenerativen Krankheiten (ALS) vermindert und/oder dysfunktional sind: Beers et al,., JCI Insight 2, e89530 (2017); AD: Faridar et al., Brain Commun. 2, fcaall2 (2020); ALS: Beers et al., JAMA Neurol. 75, 656-658 (2018); MS: Haas et al., Eur. J. Immunol. 35, 3343-3352 (2005); T1D: Lindley et al., Diabetes 54, 92-99 (2005): AID: Putnamet al., J. Autoimmun. 24, 55-62 (2005); Autoimmunkrankheiten: Ryba-StanislawowSka et al., Expert Rev. Clin. Immunol. 15, 777-789 (2019); aSLE: Valencia et al., J. Immunol. 178, 2579-2588 (2007); MS: Vigliettaet al.ı, J. Exp. Med. 199, 971-979 (2004); SLE: Zhang et al., Clin. Exp. Immunol. 153, 182-187 (2008); AD+MS: Ciccocioppo et al., Sci. Rep. 9, 8788 (2019)).

Daher ist es auch bevorzugt, T-Zell-Epitope bereitzustellen, die als Treg-Epitope oder Treg-induzierende Wirkstoffe bei Krankheiten mit reduzierten oder dysfunktionalen Treg-Populationen in Kombination mit den Impfstoffen gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, um die abnehmende/reduzierte Treg-Anzahl und -Aktivität zu erhöhen und dadurch die Autoimmunreaktivität krankheitsspezifischer T-Effektorzellen zu reduzieren und Autoimmunreaktionen bei Patienten zu dämpfen . Geeignete Treg-Epitope sind definiert als Selbst-MHC-Epitope (MHCII-Typ), die sich durch die Fähigkeit auszeichnen, intermediäre Signale während der T-ZellSelektionsprozesse zu induzieren.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Konj]ugat gemäß der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenzen 5SedqIl1D7, 8, 22-29, 87-131, GKTKEGVLYVGSKTK, KTKEGVLYVGSKTKE, EQOVINVGGAVVTGVT, VTGVTAVAOKTVEGAGNIAAATGFVK, MPVDPDNEAYEMPSE), DNEAYEMPSEEGYOD, EMPSEEGYODYEPEA ,‚, oder Kombi-

nationen davon.

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Bevorzugte T-Zell-Epitope sind daher:

Seq1D7 AKFVAAWTLKAAANRRA- (NH-NH2) PADRE

SeqID8 AKFVAAWTLKAAAN-C PADRE

SeqID22 | AKFVAAWTLKAAA- (NH-NH2) PADRE - Original

SegID23 | KAAAVKAAFWTAL-NRRA- (NH-NH2) alternatives synthetisches

Peptid

SegID24 | DSETADNLEKTVAALSILPGHGC- (NH- | Toxin-Diphtherie (TV-TT-AusNH2) tausch)

SeqID25 | DSETADNLEKTVAALSILPGHGCNRRA- | Toxin-Diphtherie (TV-TT-Aus(NH-NH2) tausch)

SeqID26 | ISITEIKGVIVHRIETILF-(NH-NH2) | MvF5 Th (UBITh®1)

SeqID27 | ISITEIKGVIVHRIETILFNRRA-(NH- | MvF5 Th (UBITh®1)

NH2) SeqID28 | ISQAVHAAHAEINEAGR- (NH-NH2) Huhn Eizellen (323-339) SeqID29 | ISQAVHAAHAEINEAGRNRRA- (NH- Huhn Eizellen (323-339) NH2) Seqg1D87 AKFVAAWTLKAAA-C Padre (Original) für Maleimidecoupling SeqgID88 AKFVAAWTLKAAANRRA-C Tridem' Padre (Original) für Maleimid-Kopplung

Se- LKFILKRYTPNNEIDS P32 - TT qID100

Se- IREDNNTLKLDRCNN P21 - TT qgID101

Se- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE P30 - TT gID102

Se- OYIKANSKFIGITE P2 - TT qgID103

Se- LEYIPEITLPVIAALSIAES TT gID104

Se- LINSTKIYSYFPSVISKVNQ TT qgID105

Se- NYSLDKILILVDYNLOSKITLP TT gqID106

Se- PHHTALROAILCWGELMTLA HBV-Kernkapsid g1ID107

Se- FFLLTRILTIPQSLD HBV-Oberfläche AG qgID108

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Sse- YSGPLKAEIAQRLEDV MT Influenza-Matrix-Epitop qID109

Sse- FFLLTRILTIPOSL HBSAg qID110

Se- GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL Bordetella pertussis qID111

Sse- ALNIWDRFDVFCTLGATTGYLKGNS Cholera-Toxin gID112

se- OYIKANSKFIGITEL Clostridium tetani TT1 qID113

Sse- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE Clostridium tetani TT2 qgID114

Se- KFIIKRYTPNNEIDSF Clostridium tetani TT3 qgID115

Se- VSIDKFRIFCKALNPK Clostridium tetani TT4 qID116

se- WVRDIIDDFTNESSOKT Clostridium tetani2 qg1ID117

Sse- AGLTLSLLVICSYLFISRG EBV BHRF1 qgID118

Sse- PGPLRESIVCYFMVFLOTHI EBV EBNA-1 qID119

Sse- VPGLYSPCRAFFNKEELL EBV CP qID120

Sse- TGHGARTSTEPTTDY EBV GP340 qID121

Sse- KELKROYEKKLRO EBV BPLF1 qg1ID122

Sse- TVEYNIPPMPL EBV EBNA-2 qID123

Sse- DKREMWMACIKELH HCMV IE1L qg1ID124

Sse- FVFTLTVPSER Influenza MPl - 1 qg1ID125

se- PKYVKONTLKLAT Influenza Hämaglutinin qID126

Sse- EKKIAKMEKASSVENV Malaria CS: T3-Epitop qg1D127

Sse- FFLLTRILTI Hepatitis-B-Oberflächenantigen qg1ID128

se- DOSIGDLIAEAMDKVGNEG Hitzeschockprotein 65 qID129

se- OQOVHFOPLPPAVVKL Bacille CalmetteGuerin qID130

Sse- KOILINMWOEVGKAMYA HIV gpl20 qID131

worin X L-Cyclohexylalanin ist, Z Aminocapronsäure ist und a eine aliphatische Aminosäure ist, ausgewählt aus Alanin, Glycin, Valin, Isoleucin und Leucin.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung ein B-Zell-Epitop von alpha-Synuclein und ein T-Zell-Epitop, vorzugsweise ein panspezi-

fisches/vielseitiges T-Zell-Epitop, die unabhängig voneinander an

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das CLEC-Polysaccharid-Grundgerüst gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere an Pustulan, gekoppelt sind.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung ein Alpha-Synuclein-BZell-Epitop, das an ein "klassisches" Trägerprotein, wie CRM197, gekoppelt ist, wobei dieses Konstrukt ferner an einen CLEC-Träger gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere an Pustulan, gekoppelt ist.

Beispielsweise kann in einem ersten Schritt die Bildung von CRM-Konjugaten durch Aktivierung von CRM mittels GMBS oder SulfoGMBS usw. erfolgen; anschließend werden die Maleinimid-Gruppen der aktivierten CRM mit SH-Gruppen des Peptids (Cystein) umgesetzt. Die CRM-Kon]ugate werden dann mit DTT behandelt, um Disulfidbindungen zu reduzieren und SH-Gruppen an den Cysteinen zu erzeugen. Anschließend kann in einer Eintopfreaktion das reduzierte CRMKonjugat mit BMPH (N-ßB-Maleimidpropionsäurehydrazid) und aktiviertem Pustulan (oxidiert) gemischt werden, um den CLEC-basierten Impfstoff herzustellen. Der Mechanismus bei der Eintopfreaktion kann (in Bezug auf Pustulan) darin bestehen, dass oxidiertes Pustulan mit BMPH (mit den Hydrazidresten) reagiert und ein BMPHHydrazon bildet. Das reduzierte CRM-Konjugat reagiert dann über SH-Gruppen am CRM-Konjugat mit dem Maleimid des BMPH-aktivierten Pustulans.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung ein "klassisches" Trägerprotein, wie CRM197, das mehrere T-Zell-Epitope enthält. Das Konj]jugat gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst auch ein B-ZellEpitop, das kovalent an die Polysaccharideinheit gekoppelt ist. In dieser Ausführungsform sind beide Polypeptide (B-Zell-Epitop und Trägermolekül) unabhängig voneinander an einen CLEC-Träger gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere an Pustulan, gekoppelt.

Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verbesserung und/oder Optimierung von Trägerproteinen durch kovalente Kopplung des Trägerproteins (das bereits ein oder mehrere T-Zell-Antigene (als Teil seiner Polypeptidsequenz, gegebenenfalls in posttranslational modifizierter Form) enthält) an das CLEC-Polysaccharid-Adjuvans gemäß der vorliegenden Erfindung, i.d. h. dem ß-Glucan oder Mannan, vorzugsweise dem Pustulan, Lichenan, Laminarin, Curdlan, ß-Glucanpeptid (BGP), Schizophyllan,

Skleroglucan, ganzen Glucanpartikeln (WGP), Zymosan oder Lentinan.

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Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf ein ß-Glucan oder Mannan zur Verwendung als Polysaccharid-Adjuvans für B-Zellund/oder T-Zell-Epitop-alpha-Synuclein-Polypeptide vom Typ C-Lectin (CLEC), wobei das ß-Glucan oder Mannan kovalent mit dem BZell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid konj]jugiert ist, um ein Kon)jugat aus dem ß-Glucan oder Mannan und dem B-Zell- und/oder TZell-Epitop-Polypeptid zu bilden, wobei ein Trägerprotein kovalent an das ß-Glucan oder Mannan gekoppelt ist.

Diese Verbesserung/Optimierung führt zu einer deutlichen Verringerung oder Beseitigung der B-Zell-Antwort auf den CLEC und/oder das Trägerprotein und/oder zu einer Verstärkung (oder zumindest Erhaltung) der T-Zell-Antwort auf die T-Zell-Epitope des Trägerproteins. Dies ermöglicht eine Verringerung oder Eliminierung einer Antikörperreaktion auf den CLEC und/oder den Träger (der dann nur eine T-Zell-Reaktion liefert) und eine spezifische Verstärkung der Antikörperreaktion auf das eigentliche Zielpolypeptid, das mit dem Träger und dem CLEC konJ]ugiert ist.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung ein T-Zell-Epitop und sind frei von B-Zell-Epitopen, wobei das Konjugat vorzugsweise mehr als ein T-Zell-Epitop, insbesondere zwei, drei, vier oder fünf T-Zell-Epitope umfasst. Dieses Konstrukt ist speziell für Krebsimpfstoffe geeignet. Dieses Konstrukt eignet sich auch speziell für Selbstantigene, insbesondere für Autoimmunerkrankungen assoziierte Selbstantigene. Der Behandlungseffekt des jeweiligen Konjugats ist mit einer Reduktion von Effektor-T-Zellen und der Entwicklung von regulatorischen T-Zell-Populationen (Tr-eg Cell) verbunden, was zur Dämpfung der Jeweiligen Krankheit, z. B. Autoimmunerkrankung oder allergische Erkrankungen, führt, wie z. B. bei Multipler Sklerose gezeigt. Insbesondere üben diese T-Zellen eine starke Immunsuppression aus und verbessern so die durch kognitive und nicht-kognitive Autoantigene ausgelöste Krankheit.

Bevorzugte CLECs, die als Polysaccharid-Grundgerüst gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, sind Pustulan oder andere B-(1,6)-Glucane ( einschließlich synthetischer Formen solcher Glucane ); andere zu verwendende: Mannan, Mitglieder der ß-GlucanFamilie, insb. lineare ß-(1,3) ( SS. cerevisiae ß-Glucan (z.B.: 150kDa), Curdlan) oder verzweigte ßB-(1,3) und ß-(1,6) enthaltende

Glucane, z.B.: Laminarin (4,5-7kDa), Scleroglucan, Schizophyllan,

vorzugsweise lineare Glucane, (z.B.: ß(1,3): SS. cerevisiae ß-Glucan (150kd), Curdlan (75-80kDa oder größer), ß-(1,3)+ß-(1,4) Lichenan (22-250kDa) ßB-(1,6) Pustulan (20kDa). Bevorzugte CLECs gemäß der vorliegenden Erfindung sind daher Mannan und ß-Glucane, einschließlich linearer und verzweigter ßB-Glucane, die durch das Vorhandensein von ß-(1,3)-, B-(1,3)+B-(1,4)- und ß(-1,6)-Hauptketten sowie mit angehängten Seitenketten mit ß-(1,6)-Resten, bevorzugt lineare ßB-Glucane mit ß-(1,3)-, B-(1,3)+B-(1,4)- und ß(1,6)-Ketten, bevorzugt Lineare ß-(1,6)-ß-Glucane, insbesondere Pustulan, Fragmente oder synthetische Varianten davon, bestehend aus multimeren ß-(1,6)-Glucansacchariden (z.z. B. 4-mer, 5-mer, 6mer, 8-mer, 10-mer, 12-mer, 15-mer, 17-mer oder 25mer).

Vorzugsweise ist die Mindestlänge der erfindungsgemäßen CLECs ein 6-Mer, da bei kleineren Polysacchariden Oxidationsreaktionen, wie sie mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, problematisch sind (eventuell können für solche kleineren Formen andere Kopplungsmechanismen und/oder terminale Verknüpfungen mit Zugabe von reaktiven Formen verwendet werden). CLECs mit 6 oder mehr Monomereinheiten (d. h. 6-Mere und größere -mere) zeigen eine gute Dectinbindung. In der Regel ist die Dectinbindung umso besser, je länger die CLEC sind. Ein Polymerisationsgrad (d. h. die Anzahl der einzelnen Glukosemoleküle innerhalb einer Glukaneinheit, DP) von 20-25 (d. h. DP20-25) gewährleistet definitiv eine gute Bindung und In-vivo-Wirksamkeit (z. B. Laminarin ist ein typisches Beispiel mit einem DP von 20-30).

Das Molekulargewicht synthetischer CLECs kann dementsprechend auch kleiner sein, z. B. so niedrig wie 1-2 kDa, während bevorzugte Molekulargewichtsbereiche von Glucanen und Fragmenten davon zwischen 1 und 250 kDa liegen können (z. B. Laminarin, Lichenan, S. cerevisiae ß-Glucan, Pustulan, Curdlan und Gerstenglucane usw.), vorzugsweise von 4,5 bis 80 kDa (z. B. Laminarin, Pustulan, Curdlan, Lichenan mit niedrigem Molekulargewicht usw.), insbesondere 4,5 bis 30 kDa (z. B. Laminarin, Pustulan, Lichenan mit niedrigem Molekulargewicht usw.).

Mannane sind Polysaccharide, die lineare Polymere des Zuckers Mannose sind. Pflanzliche Mannane haben ß-(1,4)-Bindungen. Sie sind eine Form von Speicherpolysaccharid. Mannan-Zellwandpolysaccharide, die in Hefen vorkommen, haben ein o-(1,6)-verknüpftes

Grundgerüst und wx-(1,2)- und w-(1,3)-verknüpfte Verzweigungen. Es

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ähnelt serologisch den Strukturen, die auf Glykoproteinen von Säugetieren zu finden sind.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate müssen die CLEC, insbesondere Pustulan, aktiviert werden (z. B. durch milde periodatvermittelte Oxidation), wobei der Grad der Oxidation für die Immunantwort wichtig ist. Wie bereits oben dargelegt, liegen die praktischen Oxidationsbereiche - speziell für Pustulan - zwischen etwa 20 und 260 % Oxidation. In vielen Fällen Liegt der optimale Oxidationsbereich zwischen einer niedrigen/mittleren Oxidation (d.h. 20-60% Oxidation) und einem hohen Oxidationsgrad (d.h. 140-260% Oxidation), d.h. im Bereich von 60-140% Oxidation. Die Optimierung für andere CLECs kann von einem Fachmann leicht angepasst werden, z. B. ist für Lichenan mehr als 200 % erforderlich, um eine ähnliche Menge an Aldehydgruppen zu erhalten.

Dementsprechend können die Bereiche alternativ auch als die Reaktivität mit dem Schiff'schen Fuchsin-Reagenz definiert werden, die - am Beispiel von Pustulan - wie folgt definiert werden kann: ein niedriger/mittlerer Oxidationsgrad bei einem Molverhältnis (Zuckermonomer: Periodat) von 0,2-0,6, ein optimaler Bereich von 0,6-1,4 bzw. ein hoher Oxidationsgrad von 1,4-2,6.

In Jedem Fall sollte der Oxidationsgrad so TFfestgelegt werden, dass er dem optimalen Bereich für Jeden spezifischen CLEC entspricht. Vorzugsweise ein lineares ß-Glucan, noch bevorzugter ein B-(1,6)-Glucan, insbesondere Pustulan, Pustulanfragmente oder synthetische Varianten davon, bestehend aus multimeren ßB(1,6)Glucansacchariden (z. B. 4-Mer, 5-Mer, 6-Mer, 8-Mer, 10-Mer, 12Mer, 15-Mer, 17-Mer oder 25-Mer) das durch milde Periodat-Oxidation aktiviert wird, was zur Abspaltung von vicinalen OH-Gruppen und damit zur Bildung von reaktiven Aldehyden führt. Die milde Periodat-Oxidation bezieht sich auf die Verwendung von Natriumperiodat (NaIOı), einem bekannten milden Mittel zur effektiven Oxidation vicinaler Diole in Kohlenhydratzuckern, um reaktive Aldehydgruppen zu erzeugen. Die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung wird zwischen benachbarten Hydroxylgruppen gespalten. Durch Änderung der verwendeten Periodatmenge können Aldehyde stöchiometrisch in eine kleinere oder größere Anzahl von Zuckereinheiten eines bestimmten Polysaccharids eingeführt werden.

Andere beispielhafte Methoden zur Aktivierung von Kohlenhyd-

raten sind in der Technik wohlbekannt und umfassen die Cyanylierung

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von Hydroxylgruppen (z. B. durch Verwendung organischer Cyanylierungsreagenzien wie 1-Cyano-4- (dimethylamino)-pyridiniumtetrafluoroborat (CDAP) oder N-Cyanotriethylammoniumtetrafluoroborat (CTEA)), die reduktive Aminierung von Kohlenhydraten oder die Aktivierung und Kopplung unter Verwendung von Carbonsäure-reaktiven chemischen Gruppen wie Carbodiimiden.

Aktivierte Kohlenhydrate werden dann mit den Polypeptiden umgesetzt, die an das aktivierte CLEC gekoppelt werden sollen, und es wird ein Konjugat des CLEC mit dem B-Zell- oder T-Zell-EpitopPolypeptid gebildet.

Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zur Herstellung der Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das ß-Glucan oder Mannan durch Oxidation aktiviert wird und wobei das aktivierte ß-Glucan oder Mannan mit der B-Zelle und/oder dem T-Zell-Epitop-Polypeptid in Kontakt gebracht wird, wodurch ein Konjugat des ß-Glucans oder Mannans mit der B-Zelle und/oder dem T-Zell-Epitop-Polypeptid erhalten wird.

Vorzugsweise wird das ß-Glucan oder Mannan durch Periodatoxidation an vicinalen Hydroxylgruppen, als reduktive Aminierung oder als Cyanylierung von Hydroxylgruppen gewonnen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das ßB-Glucan oder Mannan bis zu einem Oxidationsgrad oxidiert, der als die Reaktivität mit dem Schiff'schen Fuchsin-Reagenz definiert ist, die einem Oxidationsgrad einer gleichen Menge Pustulan entspricht, das mit Periodat in einem Molverhältnis von 0,2-2,6, vorzugsweise von 0,6-1,4, insbesondere 0,7-1, oxidiert wurde.

Vorzugsweise wird das Konjugat durch Kopplung auf Hydrazonbasis zur Konjugation von Hydraziden an Carbonylgruppen (Aldehyd) oder durch Kopplung unter Verwendung heterobifunktioneller Maleimid-Hydrazid-Linker (z. B.: BMPH (N-ßB-Maleimidopropionsäurehydrazid, MPBH (4-[4-N-Maleimidophenyl]buttersäurehydrazid), EMCH (N- [£-Maleimidocapronsäure)-hydrazid) oder KMUH (N-[kK-Maleimidoundecansäure]-hydrazid), oder durch Konjugation von Sulfhydriden (z. B. Cysteinen) mit Carbonylen (Aldehyden) hergestellt.

Die an die CLECs zu koppelnden Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung sind oder umfassen mindestens ein B-Zell- oder mindestens ein T-Zell-Epitop. Vorzugsweise enthalten die an die CLECS gekoppelten Polypeptide ein einziges B- oder T-Zell-Epitop

(auch dann, wenn mehr als eine Art von Polypeptid an das CLEC-

Polysaccharid-Grundgerüst gekoppelt ist). Wie auch im Beispielabschnitt gezeigt, beträgt die bevorzugte Länge der Alpha-SynucleinPolypeptide 5 bis 29 Aminosäurereste, vorzugsweise 5 bis 25 Aminosäurereste, noch bevorzugter 7 bis 20 Aminosäurereste, noch bevorzugter 7 bis 15 Aminosäurereste, insbesondere 7 bis 13 Aminosäurereste. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu beachten, dass sich diese Längenbereiche nur auf die Epitopsequenzen beziehen, nicht aber auf Linker, einschließlich peptidischer Linker, wie Cystein oder Glycin oder bi-, tri-, tetra- (oder länger)merische Peptidgruppen, wie CG oder CG, oder Spaltstellen, wie die Cathepsin-Spaltstelle; oder Kombinationen davon (z. B. -NRRAC). Illustrative Beispiele von Epitopen wurden im Abschnitt über Beispiele getestet; aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass die Plattform gemäß der vorliegenden Erfindung nicht auf ein bestimmtes Polypeptid beschränkt ist. Daher kommen praktisch alle möglichen Epitope für die vorliegende Erfindung in Frage, einschließlich der Epitope, die auf diesem Gebiet bereits bekannt sind, und insbesondere derjenigen, die bereits als in eine Präsentationsplattform integrierbar beschrieben wurden (z. B. zusammen mit einem "klassischen" Trägermolekül oder Adjuvans).

Epitope sind besonders bevorzugt, wenn sie an aktiviertes ßGlucan gekoppelt werden können, und zwar auf der Grundlage moderner Kopplungsmethoden, einschließlich hydrazidvermittelter Kopplung, Kopplung über heterobifunktionelle Linker (z. B. BMPH, MPBH, EMCH, KMUH usw.), imidazolvermittelter Kopplung, reduktiver Aminierung, Carbodiimid-Kopplung usw. (weitere werden hinzugefügt). Die verwendeten Epitope bestehen aus einzelnen Peptiden, können in Peptiden oder Proteinen enthalten sein oder als Peptid-Protein-KonJugate vorliegen, bevor sie an CLECs gekoppelt werden.

Bevorzugte Kopplungsmethoden zur Bereitstellung der erfindungsgemäßen Konjugate sind daher Hydrazid-Kopplung oder Kopplung mittels Thioesterbildung (z.B. Maleimid-Kopplung mittels BMPH (Nß-Maleimidopropionsäurehydrazid), MPBH, EMCH, KMUH, insbesondere wenn Pustulan über Hydrazonbildung an das BMPH gekoppelt wird und das Polypeptid über Thioester gekoppelt wird.

In dieser Ausführungsform werden die Polypeptide vorzugsweise mit zwei bevorzugten Linkern versehen, wie z. B. Hydrazidpolypep-

tiden/Epitopen für die Hydrazonkopplung:

N-terminale Kopplung des Peptids: H2N-NH-CO-CH2-CH2-CO-Polypeptide-COOH; vorzugsweise in Kombination mit Bernsteinsäure oder anderen geeigneten Linkern, z.B. anderen geeigneten Dicarbonsäuren, insbesondere auch Glutarsäure als Spacer/Linker;

C-terminale Kopplung (dies ist die bevorzugte Kopplungsrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung): NH2-Polypeptid-NH-NHz2.

Alternativ können für die vorliegende Erfindung auch nicht modifizierte Alpha-Synuclein-Polypeptide/Epitope verwendet werden, z. B. Polypeptide, die einen (zusätzlichen) Cysteinrest oder eine alternative Quelle für SH-Gruppen am C- oder N-Terminus für die heterobifunktionelle Linker-vermittelte Kopplung enthalten (insbesondere BMPH, MPBH, EMCH, KMUH): NH2-Cys-Pep-COOH oder NH2Pep-Cys-COOH.

Bevorzugte B-Zell-Polypeptide, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Polypeptide mit einer Länge von 5 bis 19 Aminosäureresten, vorzugsweise 6 bis 18 Aminosäureresten, insbesondere 7 bis 15 Aminosäureresten. Bei den B-Zell-Epitopen handelt es sich vorzugsweise um kurze, lineare Polypeptide, Glykopolypeptide, Lipopolypeptide, andere posttranslational modifizierte Polypeptide (z.B.: phosphoryliert, acetyliert, nitriert, Pyroglutamatreste enthaltend, glykosyliert usw.), cyclische Polypeptide usw.

Bevorzugte T-Zell-Polypeptide, die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, haben eine Länge von 8 bis 30 Aminosäureresten, vorzugsweise von 13 bis 29 Aminosäureresten, noch bevorzugter von 13 bis 28 Aminosäureresten.

Bevorzugte Spezifitäten der in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden T-Zell-Epitope sind kurze lineare Peptide, die für die Präsentation über MHC I und II (wie dem Fachmann bekannt) geeignet sind oder von denen bekannt ist, dass sie für die Präsentation über MHC I und II geeignet sind, insbesondere MHCIIEpitope für CD4-Effektor-T-Zellen und CD4-Treg-Zellen, MHCIEpitope für zytotoxische T-Zellen (CD8+) und CD8-Treg-Zellen, die Z. B. bei Krebs-, Autoimmun- oder Infektionskrankheiten nützlich sind) mit bekannter Wirksamkeit bei Mensch oder Tier; kurze lineare Peptide, die für die Präsentation über MHC I und II geeignet sind (wie sie dem Fachmann bekannt sind), mit einer N- oder C-terminalen Hinzufügung einer 1l1ysosomalen Protease-Spaltstelle, insbesondere einer für ein Mitglied der Cathepsin-Protease-Familie spezifischen

Stelle, insbesondere einer Stelle für Cystein-Cathepsine wie

Cathepsine B, C, F, H, K, L, O, S, V, X und W, insbesondere eine Cathepsin S- oder L-Spaltstelle, am meisten bevorzugt eine Cathepsin L-Spaltstelle, die eine effiziente endo/lysosomale Freisetzung von Peptiden für die MHC-Präsentation fördert, insbesondere MHCII mit bekannter Wirksamkeit bei Menschen oder Tieren. CathepsinSpaltstellen in verschiedenen Proteinen wurden identifiziert und sind in der Fachwelt gut bekannt. Dazu gehören Offenlegungen von Sequenzen oder Methoden zur Identifizierung solcher Sequenzen: z. B.: Biniossek et al, J. Proteome Res. 2011, 10, 12, 5363-5373; Adams-Cioaba et al, Nature Comm. 2011, 2:197; Ferrall-Fairbanks PROTEIN SCIENCE 2018 VOL 27:714-724; Kleine-Weber et al, Scientific Reports (2018) 8:1659, https://en.wikipedia.org/wiki/Cathepsin _S und andere. Insbesondere die Anpassung von Peptidsequenzen unter Verwendung künstlicher Protease-Spaltstellen, wie sie in der vorliegenden Erfindung gezeigt wird, basiert auf dem überraschenden Effekt dieser Sequenzerweiterungen bei der Auslösung effizienterer Immunantworten nach dermaler Applikation der CLEC-Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn die Antigene an CLECs gekoppelt sind. Die Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung werden von DCs aufgenommen und die Peptidantigene werden anschlieBend 1ysosomal verarbeitet und an MHCs präsentiert.

Lysosomen sind intrazelluläre, membrangebundene Organellen, die sich durch ein saures Inneres auszeichnen und eine Vielzahl von hydrolytischen Enzymen beherbergen, darunter Lipasen, Proteasen und Glykosidasen, die am Zellabbau beteiligt sind. Unter der Vielzahl von Enzymen, die Lysosomen beherbergen, sind die Kathepsine eine Familie 1ysosomaler Proteasen mit einem breiten Funktionsspektrum. Alle Kathepsine gehören zu drei verschiedenen Proteasefamilien: Serinproteasen (Kathepsine A und G), Asparaginproteasen (Kathepsin D und E) und elf Cysteinkathepsine. Beim Menschen sind elf Cystein-Kathepsine bekannt, die ebenfalls eine papainähnliche Struktur aufweisen: Kathepsine B, C (J, Dipeptidylpeptidase I oder DPPI), F, H, K (02), L, O, S,y V (L2), X (P,Y,Z) und W (Lymphopain).

Die Kathepsine weisen Ähnlichkeiten in ihrer zellulären Lokalisierung und Biosynthese auf, unterscheiden sich aber in ihrem Expressionsmuster. Von allen 1ysosomalen Proteasen sind die Cathepsine L, B und D mit l1ysosomalen Konzentrationen von 1 mM am häufigsten vertreten. Die Kathepsine B, H, L, C, X, V und O werden

ubiquitär exprimiert, während die Kathepsine K, S, E und W eine

zell- oder gewebespezifische Expression aufweisen. Cathepsin K wird in Osteoklasten und in Epithelzellen exprimiert. Die Cathepsine S, E und W werden hauptsächlich in Immunzellen exprimiert.

Neben ihrer Hauptfunktion beim 1ysosomalen Proteinrecycling spielen Cathepsine eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl physiologischer Prozesse. Cathepsin S ist die wichtigste Protease, die an der Verarbeitung und Präsentation von MHC II Ag beteiligt ist. Cathepsin-S-Null-Mäuse zeigen eine deutliche Abweichung bei der Erzeugung von MHC-II-gebundenen Li-Fragmenten und der Präsentation, was auf den erheblich verminderten Li-Abbau in professionellen APCs zurückzuführen ist, in denen Cathepsin S reichlich exprimiert wird. Darüber hinaus wird exogenes Material in menschlichen DCs durch Endozytose selektiv zu Cathepsin S geleitet. Eine Anreicherung von MHC II-Molekülen in späten endozytischen Strukturen wurde auch in Milz-DCs von Mäusen mit Cathepsin S-Mangel festgestellt. Jüngste Studien deuten darauf hin, dass sowohl Cathepsin B als auch D an der MHC-II-vermittelten Ag-Präsentation beteiligt, aber nicht essentiell dafür sind. Cathepsin L spielt auch eine Rolle bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Antigenverarbeitung, der Tumorinvasion und -metastasierung, der Knochenresorption und des Umsatzes von intrazellulären und sekretierten Proteinen, die an der Wachstumsregulation beteiligt sind. Obwohl Cathepsin L gemeinhin als 1lysosomale Protease bekannt ist, wird es auch sezerniert. Diese BreitspektrumProtease ist in der Lage, verschiedene extrazelluläre Proteine (Laminine, Fibronektin, Kollagene I und IV, Elastin und andere Strukturproteine der Basalmembranen) sowie Serumproteine und zytoplasmatische und nukleäre Proteine abzubauen.

Als neuartiges Mittel zur Steigerung der Wirksamkeit von TZell-Epitopen in einem Impfstoff, insbesondere einem Impfstoff auf CLEC-Basis, wird eine N- oder C-terminale Hinzufügung einer 1l1ysosomalen Protease-Spaltstelle als bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.

Solche Spaltstellen im Sinne der vorliegenden Erfindung können wie folgt charakterisiert werden:

Cathepsin L-ähnliche Spaltstellen:

Die vorgesehene Cathepsin L-ähnliche Spaltstelle wird auf der Grundlage von Protease-Spaltstellensequenzen definiert, die dem Fachmann bekannt sind, insbesondere auch derjenigen, die in Biniossek et al. (J. Proteome Res. 2011, 10, 5363-5373) und Adams-

Cioaba et al. (Nature Comm. 2011, 2:197) offengelegt sind. Die Ausrichtung der Stelle kann N- oder C-terminal sein, bevorzugt Cterminal. Die bevorzugte Konsensussequenz für eine C-terminale Cathepsin-L-Stelle besteht aus der Formel: Xn-X1i-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8

Xna : 3-27 Aminosäuren des immunogenen Peptids X1 : Jede Aminosäure X2 : jede Aminosäure X3 : jede Aminosäure

X4a : N/D/A/0/S/R/G/L; bevorzugt N/D, stärker bevorzugt N

Xs : F/R/A/K/T/S/E; bevorzugt F oder R, stärker bevorzugt R

Xe : F/R/A/K/V/S/Y; bevorzugt F oder R, stärker bevorzugt R

X7 : beliebige Aminosäure, bevorzugt A/G/P/F, noch bevorzugter A Xa : Cystein oder Linker wie NHNH-

Bevorzugte Sequenz: Xn-X1:iX2X3NRRA-Linker

Cathepsin S-ähnliche Spaltstelle:

Die vorgesehene Cathepsin S-Spaltstelle basiert auf dem Fachmann bekannten Protease-Spaltstellensequenzen, insbesondere auch denjenigen, die in Biniossek et al. (J. Proteome Res. 2011, 10, 5363-5373) und in https://en.wikipedia.org/wiki/Cathepsin S offenbart sind, und ist durch die Konsensussequenz gekennzeichnet:

Xn-X1i-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8

Dabei ist X gekennzeichnet durch

Xna : 3-27 Aminosäuren des immunogenen Peptids X1 : Jede Aminosäure X2 : jede Aminosäure

X3 : eine beliebige Aminosäure, bevorzugt V, L, I, F, W, Y, H, noch bevorzugter V

X4a : eine beliebige Aminosäure, bevorzugt V, L, I, F, W, Y, H, noch bevorzugter V

Xs : K, R, E, D, O0, N, vorzugsweise K, R, besonders bevorzugt R Xse : jede Aminosäure

X7 : eine beliebige Aminosäure, bevorzugt A

Xs8 : bevorzugt A

Xa : Cystein oder Linker wie NHNH-

Bevorzugte Sequenz: Xn-X:X2VVRAA-Linker

Zu den in Proteinen enthaltenen T-Zell-Epitopen, die sich für die Kopplung an CLECs eignen, gehören T-Zell-Epitope von Trägerproteinen, insbesondere toxisches kreuzreaktives Material von Diphtherietoxin (CRM), insbesondere CRMıo7 , KLH, Diphtherietoxoid (DT), Tetanustoxoid (TT), Haemophilus influenzae Protein D (HipD) und dem äußeren Membranproteinkomplex von Meningokokken der Serogruppe B (OMPC), rekombinante nicht toxische Form von Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (rEPA), Flagellin, Escherichia coli hitzelabiles Enterotoxin (LT), Choleratoxin (CT), mutierte Toxine (Zz.g., LTK63 und LTR72), virusähnliche Partikel, Albuminbindungsprotein, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, ein synthetisches Peptiddendrimer, z. B. ein multiples antigenes Peptid (MAP) oder andere im Handel erhältliche Trägerproteine, vorzugsweise CRM197 und KLH, am meisten bevorzugt CRM197.

Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die CLEC-Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung (a) CLECs, die mit einzelnen B-Zell-Epitopen von Alpha-Synuclein und/oder T-Zell-Epitopen konjugiert sind, einschließlich Mischungen von B- oder T-Zell-Epitopen, insbesondere diese Epitope, gekoppelt an Pustulan; (b) CLECs, die mit Polypeptid-TrägerproteinKonj]jugaten konjugiert sind, vorzugsweise mit Polypeptid-KLH- oder Polypeptid-CRM197-Konjugaten, die an Pustulan gekoppelt sind, besonders bevorzugt mit Polypeptid-CRM197-Konjugaten, die an Pustulan gekoppelt sind; (c) CLECs, die mit einzelnen B-ZellEpitopen von Alpha-Synuclein und T-Zell-Epitopen konjugiert sind; gekoppelt an CLECs, am meisten bevorzugt an Pustulan; (d) CLECs, die einzeln gekoppelt sind ("einzeln" bedeutet hier, dass die Polypeptidketten nicht als Fusionsprotein, Tandem-Repeat-Polypeptid oder Peptid-Protein-Konjugat vorliegen, sondern als unabhängige Einheiten, d. h. ein unabhängiges B-Zell-Epitop, das an Pustulan gekoppelt ist; d. h. ein unabhängiges B-Zell-Epitop-enthaltendes Polypeptid und ein unabhängiges T-Zell-Epitop-enthaltendes Polypeptid) mit B-Zell-Epitopen und T-Zell-Epitopen, die in Polypeptiden oder Proteinen enthalten sind, z. B. Trägerproteinen, Eigenproteinen, Fremdproteinen von Pathogenen, Allergenen usw. (e) CLECs, die individuell ("individuell" hat wieder die gleiche Bedeutung wie bei (d)) mit T-Zell-Epitopen gekoppelt sind, die 1ineare MHCI- und MHCII-Epitope darstellen oder die in Proteinen

enthalten sind, z.B. in Trägerproteinen oder Zielproteinen, z.B.

zur Behandlung von neoplastischen Erkrankungen oder Autoimmunerkrankungen,.

Angesichts dieser vorteilhaften Eigenschaften der KonJ]ugate der vorliegenden Erfindung ergibt sich, dass die Kon]ugate und Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung speziell für einen aktiven Anti-alpha-Synuclein-Impfstoff zur Behandlung und Vorbeugung von Synucleopathien verwendet werden können.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein wie oben definiertes Konjugat oder einen Impfstoff und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.

Vorzugsweise ist der pharmazeutisch akzeptable Träger ein Puffer, vorzugsweise ein Puffer auf Phosphat- oder TRIS-Basis.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die pharmazeutische Zusammensetzung in einem nadelbasierten Verabreichungssystem, vorzugsweise einer Spritze, einem Mini-Nadelsystem, einem Hohlnadelsystem, einem festen Mikronadelsystem oder einem System mit Nadeladaptern, einer Ampulle, nadelfreien Injektionssystemen, vorzugsweise einem Jet-InJjektor, enthalten; ein Pflaster, ein transdermales Pflaster, ein mikrostrukturiertes transdermales System, ein Mikronadel-Array-Pflaster (MAP), vorzugsweise ein festes MAP (S-MAP), ein beschichtetes MAP (C-MAP) oder ein sich auflösendes MAP (D-MAP); ein ElektrophoreseSystem, ein Iontophorese-System, ein Laser-basiertes System, insbesondere ein Erbium-YAG-Laser-System; oder ein Gene-Gun-System.

Die Konjugate im Sinne der vorliegenden Erfindung sind nicht auf eine bestimmte Form der Herstellung, Lagerung oder Abgabe beschränkt. Alle herkömmlichen und typischen Formen sind daher an die vorliegende Erfindung anpassbar. Vorzugsweise können die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung die vorliegenden Konjugate oder Impfstoffe als Lösung oder Suspension, tiefgekühlte Lösung oder Suspension, Lyophilisat, Pulver oder Granulat enthalten. Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele

und Figuren näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Figur 1 zeigt: ConA- und DC-Rezeptor (d.h. Dectin-1) Bindungsaktivität durch CLEC-Konjugate in vitro

A)Eine höhere Bindungseffizienz an Dectin-1 wird für Pustulan (Pus) im Vergleich zu Lichenan (Lich) nachgewiesen, und B) BetaGlucane aus Hafer (oat_BG265, oat_BG391) und Gerste (Barley_BG229)

zeigten eine begrenzte Bindungseffizienz im Vergleich zu Pustulan. C) Verschiedene Glucan-Typen (d. h. Pustulan, Mannan und Gerstenglucan (229kd)) behalten nach der Glucan-Oxidation eine hohe oder mittlere Rezeptorbindungsaktivität, wie durch kompetitive Bindungstests ermittelt wurde. "20 % und 40 % oxidiert" bezeichnet den Oxidationsstatus der für die Konjugation verwendeten GlucanAnteile. Hemmung in % gibt die Hemmung der Bindung des löslichen Dectin-1-Rezeptors (Pustulan und Gerste BG229) oder von ConA (Mannan) an plattengebundenes Beta-Glucan oder Mannan in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen der getesteten CLEC an. D) PustulanKonjugate und E) Lichenan-Konjugate behalten etwa 50 % der Dectin1-Bindungskapazität im Vergleich zu ungekoppeltem Beta-Glucan bei, wie mit dem kompetitiven Bindungstest ermittelt wurde. F) Pustulan-Konjugate, die über heterobifunktionelle Linker hergestellt werden, behalten eine hohe Dectin-1-Bindungswirksamkeit bei. Die Daten sind als relative Lichteinheiten (RLU) eines 1luminometrischen ELISA dargestellt. Pus70 Conjugate 1-3 bezieht sich Jeweils auf drei verschiedene CLEC-Peptidkonjugate (SeqID2, SegID10 und SeqgID16). Pus 70% und Lich 200% bezieht sich auf Pustulan und Lichenan mit dem jeweiligen Oxidationsstatus. BMPH Pus bezieht sich auf aktiviertes Pustulan. BMPH Konjugat 2 bezieht sich auf das CLEC-SeqID10-Konjugat.

Figur. 2 zeigt: Durchflusszytometrische Analyse der Aktivierung dendritischer Zellen durch Lipopolysaccharid (LPS) und verschiedene Pustulanzubereitungen.

Unreife, aus dem Knochenmark stammende dendritische Zellen der Maus (BMDCs) wurden in vitro mit dem Granulozyten-MakrophagenKolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) erzeugt. GM-CSF-BMDCs wurden 24 Stunden lang mit LPS (äquivalente Dosis in oxidiertem Pustulan und in Pustulan-Kon]ugat-Präparaten), SeqID2+SegID7+Pustulan-Konjugaten oder nur mit oxidiertem Pustulan stimuliert. Pustulan-Kon]ugate und nur Pustulan wurden in ansteigenden Dosen verwendet, beginnend bei 62,5 ug/ml des jeweiligen Zuckers (bis zu 500 ug/ml). Die DCs wurden anhand der CD11c/CD11lb-Expression identifiziert, und die Oberflächenexpression von CD80 und des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse II durch A) und C) SeqgID2+SegID7+Pustulan-Konjugate bzw. B) und D) nur oxidiertes

Pustulan wurde durchflusszytometrisch gemessen. Die Expression von

Aktivierungsmarkern wurde mit der CytExpert Software für DCs analysiert, die mit Pustulan-Präparaten (=gemessen) und DCs, die mit

äquivalenten Mengen von LPS (=erwartet) behandelt wurden.

Figur 3 zeigt: Bestimmung der Partikelgröße von CLEC-Konjugaten durch dynamische Lichtstreuung (DLS).

Die Partikelgröße wurde durch Messung der zufälligen Änderungen der Intensität des von einer Suspension oder Lösung gestreuten Lichts mittels DLS bestimmt. Die Regularisierungsanalyse und die entsprechende Kumulantenradiusanalyse über 24 Stunden sind jeweils für A) SeqID5+SegID7+Pustulan (80 % Oxidationsstatus) Konjugate, B) SeqID6+CRM+Pustulan Konjugate und C) nicht modifiziertes Pustulan dargestellt.

Figur 4 zeigt: Vergleich der Immunogenität verschiedener CLEC-basierter Impfstoffe.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Die Proben wurden 2 Wochen nach den 3 Impfungen entnommen und auf A) die Anti-Peptid-Antwort (SeqID3) von Impfstoffen auf Mannan-, Gersten- und Pustulanbasis (SeqgID2+SeqgID7+CLEC) und B) die Anti-Peptid-Antwort (SeqID3 und SeqgIDl1l) von Impfstoffen auf Pustulan- und Lichenanbasis (SeqID2+SegID7+CLEC und SeqID10+SeqgID/+CLEC) untersucht.

Figur 5 zeigt: Vergleichende Analyse der Immunogenität von Peptid-Pustulan-Kon]ugaten und Impfstoffen, die aus unkonjugierten Peptiden und CLECs bestehen.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Die Proben wurden 2 Wochen nach der 3. Anwendung entnommen und auf Anti-Peptid-Reaktionen (SeqgID3) untersucht. Verwendete Impfstoffe: SegID2+SegID7+CLEC oder Mischungen aus unkonJugiertem SeqID2, SeqgID7 und CLEC.

Figur 6 zeigt: Vergleichende Analyse der Immunogenität von Pustulankonj]jugaten, die B- und T-Zell-Epitope enthalten, mit KonJugaten, die entweder nur das jeweilige B-Zell- oder T-Zell-Epitop enthalten.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Verwendete Impfstoffe: SeqID5+SegID/+CLEC oder SegID5+CLEC, und SeqgID7+CLEC. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf Anti-Peptid-Reaktionen (Se-

qgID6) untersucht.

Figur 7 zeigt: Vergleichende Analyse der Anti-Pustulan-Antikörperreaktionen bei Mäusen nach wiederholter Immunisierung mit Peptid-Pustulan-Kon]jugaten oder Impfstoffen, die die Jeweiligen nicht konj]jugierten Komponenten enthalten

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Aufschluss über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Prä-Plasma und tl1-t3 bezeichnen Immunreaktionen, die vor (Prä-Plasma) oder nach der ersten (tl), zweiten (t2) oder dritten (t3) Impfung nachweisbar waren. Die Proben wurden 2 Wochen nach der 3. Applikation entnommen und auf Anti-Pustulan-Reaktionen untersucht. A) Analyse der durch verschiedene Impfstoffe ausgelösten Anti-Pustulan-Reaktion. B) Kinetik der Immunantwort. C) InhibitionSs-ELISA zum Nachweis der Spezifität des ELISA-Systems. Verwendete Impfstoffe: SeqgID2+SeqgID7+CLEC oder Mischungen aus unkonj]ugiertem SeqID2, SeqgID7 und CLEC

Figur 8 zeigt: Vergleichende Analyse der durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelösten Immunreaktionen unter Verwendung der unterschiedlichen Peptidkopplungsorientierung.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Aufschluss über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Es wurden 4 verschiedene CLEC-basierte Prototyp-Impfstoff-

kandidaten (zwei verschiedene Peptide, die entweder über ihren C-

oder N-Terminus an Pustulan gekoppelt sind) getestet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der 3. Applikation entnommen und auf A) AntiPeptid- und B) Anti-aSyn-Protein-Reaktionen untersucht. Verwendete Impfstoffe: SeqID1/2/4/5+SeqID7+CLEC

Figur 9 zeigt: Vergleichende Analyse der Immunogenität von CLEC-basierten Impfstoffen unter Verwendung verschiedener promiskuitiver T-Helferzell-Epitope.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Immunantworten, die durch 9 verschiedene CLEC-basierte Impfstoffe (Impfstoff 1-9) ausgelöst wurden, die dasselbe B-ZellEpitop und verschiedene T-Helfer-Epitope (d. h. SeqID7, SeqID2229) enthalten, wurden jeweils gegen das entsprechende Peptid-KLHKonjugat (Impfstoff 10) bewertet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf A) Anti-Peptid- und B)

Anti-aSyn-Protein-Reaktionen untersucht.

Figur 10 zeigt: die vergleichende Analyse der ziel- und trägerproteinspezifischen Immunogenität, die durch CLEC-basierte und herkömmliche Peptid-Protein-Konjugat-Impfstoffe unter Verwendung des Trägerproteins KLH als Quelle für T-Helferzell-Epitope induziert wird.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale oder subkutane (s.c.) Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Aufschluss über die Kinetik der darauf folgenden Immunreaktion zu erhalten. Die Immunreaktionen, die durch zwei Peptid-Protein-Konjugat-Impfstoffe ausgelöst wurden, die KLH als Quelle für T-Helfer-Epitope in Kombination mit CLEC-Modifikationen verwenden (SeqgID3+KLH+Pustulan bzw. SeqID6+KLH+Pustulan), wurden im Vergleich zu Reaktionen bewertet, die durch herkömmliche Peptid-KLH-Konjugate (d. h. SeqID3+KLH und SeqID6+KLH) ausgelöst wurden, die entweder mit Alum/Alhydrogel s.c. oder ohne zusätzliches Adjuvans 1.d. verabreicht wurden. Die Proben wurden zwei Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und mittels ELISA auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSyn-Protein-Reaktionen und B) Anti-KLH-Re-

aktionen untersucht.

Figur 11 zeigt: die vergleichende Analyse der ziel- und trägerproteinspezifischen Immunogenität, die durch CLEC-basierte und herkömmliche Peptid-Protein-Konjugat-Impfstoffe unter Verwendung des Trägerproteins CRM197 als Quelle für T-Helferzell-Epitope induziert wird

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale oder s.c.-Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. In dieser Studie wurden 2 verschiedene CRM-basierte Impfstofftypen verwendet. SeqgID6+CRM+Pus steht für ein Peptid-CRMKonj]jugat, das anschließend an Pustulan gekoppelt wurde, während SegID5+CRM+Pus ein Konjugat darstellt, bei dem die Peptidkomponente und das Trägermolekül einzeln an das CLEC gekoppelt wurden. Die von beiden Typen ausgelösten Immunreaktionen wurden im Vergleich zu dem jeweiligen konventionellen Peptid-CRM-Konjugat (d. h. SegID6+CRM, das mit Alum/Alhydrogel adjuvantiert und s.c. appliziert wurde) bewertet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und mittels ELISA auf A) Anti-Peptidund Anti-aSyn-Protein-Reaktionen und B) Anti-CRM-Reaktionen un-

tersucht.

Figur 12 zeigt: Die vergleichende Analyse der Selektivität der durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelösten Immunreaktionen ın vivo gegen zwei verschiedene aSyn-Formen.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale oder s.c.-Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Der CLEC-basierte Impfstoff (SeqgID2+SeqgID7+Pus und SegID5+SeqgID7+Pus; 1i.d. appliziert) und der alternative CLEC-basierte Impfstoff (SegID3+KLH+Pus und SeqgID6+CRM+Pus; 1i.d. appliziert) wurden im Vergleich zum herkömmlichen PeptidkomponentenImpfstoff (SeqgID3+KLH+Alum und SeqID6+CRM+Alum, s.c. appliziert) bewertet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der 3. Applikation entnommen und einem aSyn-Selektivitätstest unterzogen (HemmungsELISA). Schwarze Linie: monomeres aSyn zur Hemmung verwendet; ge-

strichelte Linie: filamentöses aSyn zur Hemmung verwendet.

Figur 13 zeigt: eine vergleichende Analyse der Avidität der

durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelösten Immunreaktionen.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale oder s.c.-Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Der CLEC-basierte Impfstoff (SeqgID2+SeqgID7+Pus und SegID5+SeqgID7+Pus, 1i.d. appliziert) und der alternative CLEC-basierte Impfstoff (SegID3+KLH+Pus und SeqID6+CRM+Pus, 1i.d. appliziert) wurden gegenüber dem herkömmlichen Peptidkomponenten-Impfstoff (SeqgqID3+KLH+Alum und SeqID6+CRM+Alum, s.c. appliziert) bewertet. Die Proben wurden zwei Wochen nach der zweiten (T2) bzw. zwei Wochen nach der dritten Immunisierung (T3) entnommen, und die Avidität der Antikörper gegen aSyn wurde mit einem ELISA-basierten Aviditätstest bestimmt.

Figur 14 zeigt: eine vergleichende Analyse der Affinität der durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelösten Immunreaktionen.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale oder s.c.-Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Der CLEC-basierte Impfstoff (SeqgID2+SeqgID7+Pus und SegID5+SeqgID7+Pus, 1i.d. appliziert) und der alternative CLEC-basierte Impfstoff (SegID3+KLH+Pus und SeqgID6+CRM+Pus, 1i.d. appliziert) wurden im Vergleich zum herkömmlichen PeptidkomponentenImpfstoff (SeqgID3+KLH+Alum und SeqID6+CRM+Alum, s.c. appliziert) bewertet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Verabreichung entnommen, und die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (Kd) der Antikörper gegen aSyn wurde mittels eines aSyn-Verdrängungs-ELISA-

Tests bestimmt.

Figur 15 zeigt: die vergleichende Analyse der In-vitro-Funktionalität der durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelösten Immunreaktionen.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale und s.c.-Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Verabreichung entnommen und die Modulation der aSyn-Aggregation in Gegenwart von aSyn-spezifischen Antikörpern wurde mit Hilfe von ThT-Fluoreszenztests untersucht. A) aSyn wurde in Gegenwart von CLEC-Impfstoffinduzierten Abs (SeqgID2+SeqgID7/+Pus; 1i.d. appliziert), konventionellen Peptid-Komponenten-induzierten Abs (SegID3+KLH+Alum, s.c. appliziert) oder Mausplasma für 0-72 Stunden aggregiert. B) aSyn oder aSyn mit präformierten Fibrillen wurde in Gegenwart von CLECImpfstoff-induzierten Abs (SeqgID5+SegID7+Pus und SeqID6+CRM+Pus,

beide i.d. appliziert), konventionellen Peptid-Komponenten-induzierten Abs (SegID6+CRM+Alum, s.c. appliziert) oder Mausplasma 092 Stunden lang aggregiert. Die kinetischen Kurven wurden durch Normalisierung der ThT-Fluoreszenz bei t0 berechnet, und die aus der linearen Regressionsanalyse in der exponentiellen Wachstumsphase der ThT-Kinetik extrahierten Steigungswerte wurden zur Be-

rechnung der prozentualen Hemmung der aSyn-Aggregation verwendet.

Figur 16 zeigt: eine vergleichende Analyse der Auswirkungen des Immunisierungswegs auf die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelösten Immunreaktionen.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Aufschluss über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Zwei alternative Verabreichungswege - subkutan (s.c.) und intra-muskulär (i1.m.) - wurden mit der intradermalen (i.d.) Verabreichung der CLEC-basierten Impfstoffe verglichen. Pro Applikationsweg wurden drei Dosen des CLEC-basierten Impfstoffs (SeqgID2+SeqgID7+Pus) verabreicht. Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Applikation entnommen und auf A) Anti-Peptid- und B) Anti-aSyn-Protein-Reaktionen

untersucht.

Figur 17 zeigt: die vergleichende Analyse der zielproteinspezifischen Immunogenität, die durch CLEC-basierte Peptid-CRM197Kon]ugatimpfstoffe unter Verwendung verschiedener PeptidCRM197/CLEC-Verhältnisse hervorgerufen wird

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. In dieser Studie wurden 5 verschiedene Impfstoffe auf Peptid-CRM-Basis mit unterschiedlichen Peptid-CRM/Pustulan-Verhältnissen (w/w) verwendet. Alle 5 Gruppen wurden mit SegqID6+CRM+Pus-Kon]ugaten immunisiert. 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10 und 1:20 stehen für Kon]ugate mit einem w/w Peptid-CRM-Konjugat/CLECVerhältnis von 1/1, 1/2,5, 1/5, 1/10 und 1/20. Die

induzierten Immunreaktionen wurden anhand von Proben bewer-

tet, die 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und

mittels ELISA auf Anti-aSyn-Proteinreaktionen untersucht wurden.

Die Titerbestimmung basierte auf der Berechnung von ODmax/2.

Figur 18 zeigt: die vergleichende Analyse der durch CLECImpfstoffe mit B-Zell-Epitopen von aSyn (aal-8) ausgelösten Immunreaktionen.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen (i.d. und s.c.). Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Impfstoffe auf CLEC-Basis (SeqgIDl12+SeqgID7+Pustulan, i.d.) wurden mit herkömmlichen Impfstoffen auf PeptidkomponentenKon]jugatbasis (SegIDl13 kon]ugiert mit KLH und Alhydrogel (Alum), sS.C.) verglichen. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSynProtein-Reaktionen und B) aSyn-Selektivität (Hemmungs-ELISA) untersucht. Schwarze Linie: monomeres aSyn zur Hemmung verwendet;

gestrichelte Linie: filamentöses aSyn zur Hemmung verwendet.

Figur 19 zeigt die vergleichende Analyse der Immunantworten, die durch CLEC-Impfstoffe mit B-Zell-Epitopen von aSyn (aal100-108) ausgelöst wurden.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen (i.d. und s.c.). Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Impfstoffe auf CLEC-Basis (SeqID16+SeqID7 und Pustulan, i.d.) wurden mit herkömmlichen Impfstoffen auf PeptidkomponentenKon]jugatbasis (SeqgIDl17 kon]ugiert mit KLH und Alhydrogel (Alum), sS.C.) verglichen. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSyn-ProteinReaktionen und B) aSyn-Selektivität (Hemmungs-ELISA) untersucht. Schwarze Linie: monomeres aSyn zur Hemmung verwendet; gestrichelte

Linie: filamentöses aSyn zur Hemmung verwendet.

Figur 20 zeigt die vergleichende Analyse der durch CLEC-Impfstoffe mit B-Zell-Epitopen von aSyn (aa91-97) ausgelösten Immunreaktionen.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten

insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen (i.d. und s.c.). Zu

Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Impfstoffe auf CLEC-Basis (SeqIDl14+SeqID7 und Pustulan, i.d.) wurden mit herkömmlichen Impfstoffen auf PeptidkomponentenKon]jugatbasis (SeqgIDl15 kon]ugiert mit KLH und Alhydrogel (Alum), 8S.C.) verglichen. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf Anti-Peptid- und Anti-aSyn-Protein-

Reaktionen untersucht.

Figur 21 zeigt die vergleichende Analyse der durch CLEC-Impfstoffe mit B-Zell-Epitopen von aSyn (aal130-140) ausgelösten Immunreaktionen.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen (i.d. und s.c.). Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Impfstoffe auf CLEC-Basis (SeqID20+SeqID7 und Pustulan, i.d.) wurden mit herkömmlichen Impfstoffen auf PeptidkomponentenKon]jugatbasis (SeqgID21 kon]ugiert mit KLH und Alhydrogel (Alum), 8S.C.) verglichen. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSyn-ProteinReaktionen und B) aSyn-Selektivität (Hemmungs-ELISA) untersucht. Schwarze Linie: monomeres aSyn zur Hemmung verwendet; gestrichelte

Linie: filamentöses aSyn zur Hemmung verwendet.

Figur 22 zeigt die vergleichende Analyse der durch CLEC-Impfstoffe mit B-Zell-Epitopen von aSyn (aal115-122) ausgelösten Im-

munreaktionen. Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen (i.d. und s.c.). Zu

Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Impfstoffe auf CLEC-Basis (SeqID51+SeqID7 und Pustulan, i.d.) wurden gegen herkömmliche Impfstoffe auf PeptidkomponentenKon]jugatbasis (SeqgID52 kon]ugiert mit CRM und Alhydrogel (Alum), S.C.) getestet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSyn-FilamentReaktionen und B) aSyn-Selektivität (Hemmungs-ELISA) untersucht. Schwarze Linie: monomeres aSyn zur Hemmung verwendet; gestrichelte

Linie: filamentöses aSyn zur Hemmung verwendet.

Figur 23 zeigt die vergleichende Analyse der durch CLEC-Impfstoffe mit B-Zell-Epitopen von aSyn (aal115-124) ausgelösten Im-

Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Impfstoffe auf CLEC-Basis (SeqID67+SeqID7 und Pustulan, i.d.) wurden gegen herkömmliche Impfstoffe auf PeptidkomponentenKon]jugatbasis (SeqgID68 kon]ugiert mit CRM und Alhydrogel (Alum), 8S.C.) getestet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSyn-FilamentReaktionen und B) aSyn-Selektivität (Hemmungs-ELISA) untersucht. Schwarze Linie: monomeres aSyn zur Hemmung verwendet; gestrichelte

Linie: filamentöses aSyn zur Hemmung verwendet.

Figur 24 zeigt die vergleichende Analyse der durch CLEC-Impfstoffe mit B-Zell-Epitopen von aSyn (aal107-113) ausgelösten Im-

Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Impfstoffe auf CLEC-Basis (SeqID73+SeqID7 und Pustulan, i.d.) wurden gegen herkömmliche Impfstoffe auf PeptidkomponentenKon]jugatbasis (SeqgID74 kon]ugiert mit CRM und Alhydrogel (Alum), S.C.) getestet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSyn-FilamentReaktionen und B) aSyn-Selektivität (Hemmungs-ELISA) untersucht. Schwarze Linie: monomeres aSyn zur Hemmung verwendet; gestrichelte

Linie: filamentöses aSyn zur Hemmung verwendet.

Figur 25 zeigt die vergleichende Analyse der In-vitro-Funktionalität von Immunantworten, die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelöst werden.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen (i.d. und s.c.). Blutproben wurden zu Beginn und nach Jeder Impfung entnommen, um

Informationen über die Kinetik der darauf folgenden Immunantwort

zu erhalten. Die Proben wurden 2 Wochen nach der 3. Applikation entnommen und die ThT-Kinetik (d. h. die fibrilläre Fraktion von aSyn) wurde in Gegenwart von A-C) CLEC-Impfstoff-induzierten Abs (SegID67/71/73+SegID7 und Pustulan, 1i.d.) oder konventionellen Peptid-Komponenten-induzierten Abs (SeqID68/72/74 konjugiert mit CRM und Alhydrogel (Alum), s.c.), oder D) der aSyn-spezifischen,

monoklonalen Ab-LB09 oder unbehandeltem Mäuseplasma analvsiert.

Beispiele: Material und Methoden 1) Oxidation von CLEC/Glucan-Backbone

Zur Bildung von Impfstoffkonjugaten müssen Polysaccharide, insbesondere auch CLEC/ß-Glucane, chemisch modifiziert werden, um reaktive Gruppen zu erzeugen, die zur Verknüpfung von Proteinen/Peptiden verwendet werden können. Zwei häufig verwendete Methoden zur Aktivierung von Polysacchariden sind die Periodat-Oxidation an vicinalen Hydroxylgruppen sowie die Cyanylierung von Hydroxylgruppen. Weitere Methoden zur Aktivierung von Polysacchariden sind möglich und in der Technik gut bekannt. Die in diesem Abschnitt gezeigten Beispiele basieren auf einer milden PeriodatOxidation.

Je nach ihrer LöÖslichkeit werden CLECs und ß-Glucane (z.B. Mannan, Lichenan, Pustulan oder ß-Glucan aus Gerste) mittels Periodat-Oxidation in wässriger Lösung oder DMSO oxidiert.

Der Oxidationsgrad wird durch Zugabe der Periodatlösung in einem molaren Verhältnis (Periodat:Zuckeruntereinheit; 100% = 1 Mol Periodat pro Mol Zuckermonomere) von 1:5 (d.h. 20% Oxidation) bis 2,6:1 (260% Oxidationsgrad) bestimmt.

Kurz gesagt wird Natriumperiodat in einem Molverhältnis von 1:5 bis 2,6:1 (Periodat:Zuckeruntereinheit, entsprechend 20 % und 260 % Oxidationsgrad) zugegeben, um die Furanoseringe der ß-Glucane zwischen den vicinalen Diolen zu Öffnen, so dass zwei Aldehydgruppen als Substrat für die nachfolgenden Kopplungsreaktionen übrig bleiben. 10% (v/v) 2-Propanol wird als Radikalfänger zugegeben. Die Reaktion wird 4 Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler (1000 U/min) im Dunkeln inkubiert. Anschließend werden die oxidierten Glucane mit Hilfe von Slide-ALyzer" (Thermo Scientific) oder Pur-A-Lyzer"* (Sigma Aldrich) Kas-

setten mit einem Cutoff von 20 kDa dreimal gegen Wasser dialysiert,

um Natrium (per)jodat und Glucan-Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Dialysierte Glucane können direkt der Peptidkonjugationsreaktion unterzogen oder bei -20°C gelagert oder lyophilisiert und bei 4°C zur weiteren Verwendung aufbewahrt wer-

den.

2) Kon]ugation von WISIT-Impfstoffen 2a. über Hydrazonbildung

Polypeptide enthalten am N- oder C-Terminus eine Hydrazidgruppe für die Aldehydkopplung. Wenn die Kopplung über den NTerminus des ausgewählten Peptids an die Aldehydgruppen der Glucaneinheiten erfolgen soll, muss das Peptid einen geeigneten Linker/Spacer enthalten, z. B. Bernsteinsäure. Alternativ wurden auch intakte Proteine (z. B. CRM197) für die Glucan-Kopplung verwendet.

Typische Beispiele für solche Peptide: N-terminale Kopplung von Peptiden: H2N-NH-CO-CH2-CH2-CO-Polypeptid-COOH; C-terminale Kopplung: NH2 -Polypeptid-NH-NHz2

Zur Kopplung wird aktivierte Glucanlösung (d. h. oxidiertes Pustulan) mit den gelösten hydrazidmodifizierten Peptiden oder intakten Proteinen (z. B. CRM197) in Kopplungspuffer gerührt (je nach isoelektrischem Punkt des Peptids wird entweder Natriumacetatpuffer bei pH 5,4 oder DMEDA bei neutralem pH (6,8) verwendet). Die freie Hydrazidgruppe in den Peptiden reagiert mit der Aldehydgruppe zu einer Hydrazonbindung und bildet das endgültige Konjugat. Bei Proteinen beruht die Kopplung an aktiviertes Glucan auf der Reaktion der Aminogruppe der vorhandenen Lysinreste mit reaktiven Aldehyden an den Glucanteilen in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid.

Anschließend wird das Konjugat durch Zugabe von Natriumborhydrid in Boratpuffer (pH 8,5) reduziert. In diesem Schritt wird die Hydrazinbindung zu einem stabilen sekundären Amin reduziert und nicht umgesetzte Aldehydgruppen im Zuckergerüst werden in primäre Alkohole umgewandelt. Die Kohlenhydratkonzentration in den Kon]ugaten wurde mit der Anthron-Methode geschätzt und die Peptidkonzentration wurde durch UV-Spektroskopie geschätzt oder

durch Aminosäureanalyse bestimmt.

2b. Kopplung mit heterobifunktionellen Linkern

Die zweite angewandte Konjugationstechnik beruht auf hetero-bifunktionellen Linkern (z. B.: BMPH (N-ßB-Maleimidopropionsäurehydraziıd, MPBH (4-[4-N-Maleimidophenyl]-buttersäurehydrazid), EMCH (N-[s-Maleimidocapronsäure)-hydrazid) oder KMUH (N- [K-Maleimidoundecansäure]-hydrazid), kurze Maleimid-Hydrazid-Vernetzer für die Konjugation von Sulfhydriden (Cysteinen) mit Carbonylen (Aldehyden)).

Polypeptide enthalten am N- oder C-Terminus ein Cystein (Cys) für die Maleinimid-Kopplung. Typische Beispiele für solche Peptide: N-terminale Kopplung von Peptiden: Cys-Peptid-COOH; C-terminale Kopplung: NH2 -Pept-Cys-COOH.

Zur Kopplung wird aktivierte Glucanlösung (d.h. oxidiertes Pustulan) über Nacht mit BMPH umgesetzt (verwendete Verhältnisse 1:1 (w/w) bis 2:1 BMPH:Pustulan) und anschließend 3x mit PBS dialysiert. BMPH-aktiviertes Glucan wird dann mit den gelösten Cysmodifizierten Polypeptiden in Kopplungspuffer (z. B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS) gemischt. Die Maleinimidgruppe reagiert mit den Sulfhydrylgruppen der Peptide unter Bildung stabiler Thioetherbindungen und führt zusammen mit dem zwischen Linker und reaktiven Aldehyden gebildeten Hydrazon zu stabilen Konj]ugaten. Die Kohlenhydratkonzentration in den Konjugaten wurde mit der Anthron-Methode geschätzt und die Polypeptidkonzentration wurde durch Aminosäureanalyse oder mit dem Ellmann-Assay unter Verwendung des Ellman-Reagens (5,5'-Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure), DTNB) bestimmt. DINB reagiert mit Sulfhydrylgruppen unter Bildung eines farbigen Produkts und bietet eine zuverlässige Methode zur Messung reduzierter Cysteine und anderer freier Sulfhydride in Lösung durch spektrophotometrische Messung (Amax = 41l12nm; & = 14,150/M-cm).

2c) Polypeptid-KLH/CRM-Konjugation

Polypeptide (mit N- oder C-terminalen Cys-Resten, siehe oben) wurden mit Hilfe der heterobifunktionellen Vernetzungsmittel GMBS oder SMCC (Thermo Fisher) an den Träger CRM-197 (z. B. ECcoCRM, Fina Biosolutions) oder KLH (Sigma Aldrich) gekoppelt. CRM-197/KLH wurde mit einem Überschuss an GMBS oder SMCC (gemäß Herstellerprotokoll) bei Raumtemperatur gemischt, um die Aktivierung zu ermöglichen, gefolgt von der Entfernung des GMBS-Überschusses durch Zentrifugation der Entsalzungssäule. Das überschüssige Peptid

wurde dann dem aktivierten Träger zur Kopplung zugegeben (Puffer:

200mM Na-Phosphat (pH=6,8)) und anschließend 3x mit PBS dialysiert. Die Kopplungseffizienz bzw. der Peptidgehalt wurde mit Hilfe eines Ellmann-Tests (Ellmann-Reagenz: 5,5'-Dithio-bis-(2Nitrobenzoesäure) zur Quantifizierung freier Sulfhydrylgruppen in Lösung) bestimmt. Das Polypeptid CRM-197/KLH-Konjugat wurde auBerdem mit Alum (Alhydrogel® Adjuvans 2%) formuliert und den Tieren subkutan appliziert. Beim Vergleich der CRM-197/KLH-Impfstoffe mit anderen erfindungsgemäßen Impfstoffen wurden pro Maus die gleichen

Mengen an konj]jugierten Polypeptiden injiziert.

2d) Gluco-Neokonjugatbildung mit Polypeptid, KLH/CRM197 und Glucan

Polypeptid-KLH- und Polypeptid-CRM197-Kon]jugate, die wie in 2c) beschrieben hergestellt wurden, wurden auch an aktivierte Glucane mit unterschiedlichen Verhältnissen von Polypeptid-KLH und Polypeptid-CRM197 zu Glucan gekoppelt (d. h. 1/1 (w/w), 1/2 (w/w), 1/5 (w/w), 1/10 (w/w) bzw. 1/20 (w/w)). Nach der Bildung des Polypeptidkonjugats werden die Pep-KLH- oder Pep-CRM-Konjugate mit Dithiothreitol (DTT) reduziert. Die reduzierten TrägerkonJ]ugate werden in Gegenwart eines Überschusses an heterobifunktionellem Linker BMPH an aktivierte Glucane gekoppelt. Die Kopplung erfolgt über die Maleinimidgruppe von BMPH an Sulfhydrylreste des reduzierten KLH- oder CRM197-Konjugats, wodurch eine stabile Thioetherbindung entsteht, und über Aldehydgruppen im Glykan mit der Hydrazidgruppe von BMPH. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur werden die gebildeten Hydrazone durch Inkubation mit Natriumcyanoborhydrid über Nacht zu stabilen sekundären Aminen reduziert. AnschlieBend werden die Gluco-Neokon]ugate unter Verwendung von Slide-ALyzer" (Thermo Scientific) oder Pur-A-Lyzer"* (Sigma Aldrich) Kassetten dreimal gegen PBS oder Wasser dialysiert, um Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen (siehe auch:

Beispiel 23).

3) Bestimmung der biologischen Aktivität von CLEC-Konjugaten ın vitro

Die biologische Aktivität von Mannan- und Glucan-Konjugaten wurde in vitro mittels ELISA unter Verwendung eines l16öslichen murinen Fc-Dectin-la-Rezeptors (InvivoGen) oder ConA wie in Korotchenko et al. (2020) beschrieben analysiert. Kurz gesagt, ELISA-

Platten werden mit einem Referenzglucan (CLR-Agonisten, CLECs)

beschichtet, z. B. Pustulan, Lichenan oder Mannan, und mit fluoreszenzmarkiertem ConA (für Mannan) oder 1l1öslichem murinem Fcdectin-la-Rezeptor (für Pustulan und andere ß-D-Glucane) umgesetzt, was durch einen HRP-markierten Sekundärantikörper nachgewiesen werden kann. Die oxidierten Kohlenhydrate sowie die Glukokonjugate werden in einem kompetitiven ELISA getestet (steigende Konzentrationen von CLECs oder Kon]ugaten werden zu den für den Assay verwendeten lö5öslichen Rezeptoren hinzugefügt, um die Rezeptorbindung an beschichtete CLECs zu verringern), um ihre Funktionalität nachzuweisen. Die IC-Werteso werden verwendet, um die biologische Aktivität zu bestimmen (d. h. die Bindungswirksamkeit an lösliche Rezeptoren im Vergleich zu nicht oxidierten, nicht kon-

Jugierten Liganden).

4) Aktivierungsanalyse mit aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen

Aus Knochenmark gewonnene dendritische Zellen (BMDCs) wurden aus Oberschenkel- und Schienbeinknochen von Mäusen entnommen und mit 20 ng/ml murinem GM-CSF (Immunotools) inkubiert, wie in Korotchenko et al. (2020) mit geringfügigen Änderungen beschrieben. Die Auswirkungen der verschiedenen Konjugate sowie der Positivkontrollen (= LPS) auf die CD80- und MHCII-Expression wurden mittels FACS-Analyse an CD1l11c* MHCII* CD11b}"t GM-CSF-abgeleiteten DCs (GM-DCs) untersucht.

5) Bestimmung des hydrodynamıschen Radıus

Der hydrodynamische Radius der Kon]jugate wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS) analysiert. Dazu wurden die Proben (d. h. die Konjugate) 15 Minuten lang bei 10 000 g zentrifugiert (Merck Millipore, Ultrafree-MC-VV Durapore PVDF). Alle Probenvertiefungen wurden mit Silikaöl versiegelt, um eine Verdunstung zu verhindern, und die Daten wurden nacheinander über einen Zeitraum von etwa 24 Stunden erfasst. Alle Messungen wurden mit einem WYATT DynaPro PlateReader-II bei 25°C in einer 1536-Well-Platte (1536W SensoPlate, Greiner Bio-One) durchgeführt. Die Proben wurden in dreifacher Ausführung gemessen. Alle Messungen wurden auf einen Basiswert von 1,00+0,005 gefiltert, so dass nur Kurven, die zu Werten zwischen 0,995 und 1,005 zurückkehrten, für die weitere Analyse berücksichtigt wurden (z. B. Kumulantenradius und Regularisie-

rungsanalvyse). Die Analyse der Stichproben erfolgte gemäß

https://www.wyatt.com/library/application-notes/by-technique/dls.html und dem DYNAMICS User's Guide (M1406 Rev. C, Version 7.6.0), den Technical Notes TN2004 und TN2005 (alle unter:

WWW.WYatt.com)

6) Tierversuche

Weibliche BALB/c-Mäuse, n=5 Mäuse pro Gruppe, wurden entweder mit verschiedenen CLEC-Konjugaten (i.d., 1.m., sS.C.), mit PeptidCRM-197/KLH-Konjugaten (1.d.) oder an Alum adsorbierten PeptidCRM-197/KLH-Konjugaten (s.c.) sowie mit entsprechenden Kontrollen (z.B. unkonjugierte CLEC, Mischung aus CLEC und Peptiden usw.) immunisiert. Die Tiere wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft, und die Blutproben wurden regelmäßig einen Tag vor jeder Impfung und zwei Wochen nach der letzten Anwendung entnommen, Sso-

fern nicht anders angegeben.

7) Quantifizierung von impfstoffinduzierten Antikörpern in Mäuseplasma mittels ELISA

Mäusen wurde mit Heparin als Antikoagulans Vollblut entnommen, und das Plasma wurde durch Zentrifugation gewonnen. Die Plasmaproben wurden bei -80°C gelagert. Zum Nachweis von zielspezifischen Antikörpern wurden ELISA-Platten (Nunc Maxisorb) mit PeptidBSA-Kon]ugaten oder rekombinanten Proteinen/Fragmenten (übliche Konzentration 1 ug/ml) unter Verwendung von 50 mM Natriumcarbonatpuffer über Nacht bei 4 °C beschichtet. Alle in den Beispielen verwendeten Anti-Polypeptid-ELISA werden mit Pep-BSA-Kon]ugaten durchgeführt (z. B. SeqID3 (Sequenz: DOPVLPD) mit einem C-terminalen C zur Kopplung an maleimidaktiviertes BSA; Nomenklatur: Peplc (DOPVLPD-C, SeqID 3) wird als Köder für anti-Pepl-spezifische Reaktionen verwendet, die durch Peplb (SeqID2; DOPVLPD- (NHNH2 ))- und Peplc-haltige Kon]ugatimpfstoffe ausgelöst werden). Die Platten wurden mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) blockiert, und die Plasmaproben wurden in den Platten seriell verdünnt. Der Nachweis der zielspezifischen Antikörper erfolgte mit biotinyliertem Anti-Maus-IgG (Southern Biotech) und anschließender Farbreaktion mit Streptavidin-POD (Roche) und TMB. Die ECso -Werte wurden mit der GraphPad Prism-Software (Graph Pad Prism www.graphpad.com/scientific-software/prism/) nach einer nichtlinearen Regressionsana-

lyse (logistische Vier-Parameter-Fit-Funktion) berechnet.

Zielprotein Antikörper Alpha-Synuclein rekombinant (Ana- Anti-alpha-Synuclein 115-121 AB (LB509) spec) (Biolegend)

Alpha-Synucuclein-Monomer (Abcam) Anti-alpha-Synuclein 115-121 AB (LB509)

(Biolegend)

Alpha-Synuklein-Filament (Abcam) Anti-alpha-Synuclein 115-121 AB (LB509) (Biolegend)

Pustulan (Biozol)

KLH (Sigma) Anti-KLH AB (Sigma)

CRM197 (FinaBiosolution) Anti-Diphtherie AB (Abcam)

Pustulan (Biozol)

KLH (Sigma) Anti-KLH AB (Sigma)

CRM197 (FinaBiosolution) Anti-Diphtherie AB (Abcam)

8) Charakterisierung der Bindungspräferenz von aSyn-spezifischen Antikörpern durch Hemmungs-ELISA

ELISA-Platten (Nunc Maxisorb) wurden entweder mit aSyn-Monomeren (Abcam) oder aSyn-Filamenten (Abcam) beschichtet und mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Die Kontrollantikörper und die Plasmaproben wurden mit seriell verdünnten aSyn-Monomeren oder aSyn-Filamenten in ELISA-Platten mit geringer Bindungsrate inkubiert. Anschließend wurden die vorinkubierten Antikörper/Plasmaproben zu den mit Monomeren/Filamenten beschichteten Platten gegeben und die Bindung mit biotinyliertem Anti-Maus-IgG (Southern Biotech) und anschließender Farbreaktion mit Streptavidin-POD (Roche) und TMB nachgewiesen. Die 10gI1C50-Werte wurden als die Konzentration von monomerem oder filamentösem aSyn berechnet, die erforderlich ist, um die Hälfte des ELISA-Signals zu löschen, und dienten als Schätzwert für die Selektivität der Abs für das untersuchte Antigen. Die 10o0gICso -Werte wurden mit der Software GraphPad Prism (Graph Pad Prism www.graphpad.com/scientific-software/prism/) nach einer nichtlinearen Regressionsanalyse (logis-

tische Vier-Parameter-Fit-Funktion) berechnet.

9) Quantifizierung der aSyn-Aggregation

Der Proteinaggregationstest im automatisierten Format wurde in einem Reaktionsvolumen von 0,1 ml in schwarzen 96-Well-Platten mit £flachem Boden unter kontinuierlichem Schütteln in einem GENIOS

Microplate Reader (Tecan, Österreich) durchgeführt. Die Kinetik

wurde durch Ablesen der Fluoreszenzintensität alle 20 Minuten unter Verwendung von 450-nm-Anregungs- und 505-nm-Emissionsfiltern überwacht. Die Fibrillenbildung in Abwesenheit und Anwesenheit von Antikörpern (das molare Verhältnis Antikörper/Protein variierte von 6x10” bis 3x107” ) wurde durch Schütteln der aSyn-Lösung in einer Konzentration von 0,3 mg/ml (20,8 uM) in 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 uM ThT und 25 ug/ml Heparinsulfat bei 37 °C im Plattenlesegerät (Tecan, Österreich) initiiert.

Darüber hinaus wurde die Fibrillenbildung in Abwesenheit und Anwesenheit von Antikörpern auch durch die Anwesenheit von vorgeformten Fibrillen initiiert. Kurz gesagt: Vorgebildete aSyn-Fibrillen (1 uM) wurden in Gegenwart von aktivierten aSyn-Monomeren (10 uM) und 10 uM ThT in 100 ul PBS für 0-24 Stunden aggregiert.

Für die Datenanalyse wurde der Mittelwert der negativen Kontrollproben, d. h. die Hintergrundfluoreszenz von ThT, berechnet und von jeder Probe zum gegebenen Zeitpunkt abgezogen, z. B. in Microsoft Excel. Um verschiedene Bedingungen/Inhibitoren im Aggregationstest zu vergleichen, wurde jede Probe auf den zu Beginn des Tests ermittelten Fluoreszenzwert normalisiert und auf 1 gesetzt (t0=1).

Zur Auswertung der kinetischen Kurven wurde ein kinetisches Modell nach Michaelis-Menten verwendet: Die Werte für Km (Substratkonzentration, die eine halbmaximale Geschwindigkeit ergibt) und Vmax (maximale Geschwindigkeit) wurden für jede Bedingung mit der Software GraphPad Prism nach der Analyse der Enzymkinetik (Michaelis-Menten) berechnet.

Um verschiedene Bedingungen/Inhibitoren im Aggregationsassay zu vergleichen, wurde der Steigungswert in der exponentiellen Wachstumsphase der ThT-Kinetik mit der Software GraphPad Prism

durch lineare Regression berechnet.

10) Bestimmung von Affinität und Avidität

Zur Bestimmung der Avidität von Antikörpern wurde eine Variation des Standard-ELISA-Tests verwendet, bei dem Wiederholungsvertiefungen, die an Antigene gebundene Antikörper enthielten, steigenden Konzentrationen von chaotropen Thiocyanat-Ionen ausgesetzt wurden. Die Resistenz gegenüber der Thiocyanat-Elution wurde als Maß für die Avidität verwendet, und ein Index (Aviditätsindex), der 50 % der effektiven Antikörperbindung darstellt, wurde zum

Vergleich verschiedener Seren herangezogen. Das Plasma wurde 1/500

in PBS verdünnt und auf beschichtete und geblockte ELISA-Platten (Nunc Maxisorb) aufgetragen. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde wurde den Proben Natriumthiocyanat (NaSCN, SIGMA; in PBS) in Konzentrationen von 0,25 bis 3 M zugesetzt. Die Platten wurden vor dem Waschen, dem Nachweis und der anschließenden Farbreaktion mit Streptavidin-POD (Roche) und TMB 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorptionswerte in Abwesenheit von NaSCN wurden als effektive Gesamtbindung des spezifischen Antikörpers (100 % Bindung) angenommen, und die nachfolgenden Absorptionswerte in Gegenwart steigender Konzentrationen von NaSCN wurden in den entsprechenden Prozentsatz des gesamten gebundenen Antikörpers umgerechnet. Die Daten wurden an ein Diagramm aus (% Bindung) gegen (Log) Konzentration von NaSCN angepasst, und durch lineare Regressionsanalyse wurde der Aviditätsindex geschätzt, der die Konzentration von NaSCN darstellt, die erforderlich ist, um die anfängliche optische Dichte um 50 % zu verringern. Die Daten wurden zurückgewiesen, wenn der Korrelationskoeffizient für die Linienanpassung unter 0,88 lag.

Zur Bestimmung der kp, Werte (Bindungsaffinität) gegenüber aSyn-Filamenten wurden Verdrängungs-ELISAs verwendet, die eine einfache Bestimmung des kp, Wertes des Komplexes ermöglichen, der von einem Ab und seinem kompetitiven Liganden gebildet wird. Kurz gesagt, wurden Abs in gleicher Konzentration mit steigenden Konzentrationen freier aSyn-Filamente inkubiert, bevor der Titer der freien Antikörper auf Platten mit immobilisierten aSyn-Filamenten gemessen wurde. Die relative Bindung von Abs wird als Prozentsatz der maximalen Bindung ausgedrückt, die im Assay für Jede Probe beobachtet wurde; die Konkurrenzreaktionen mit aSyn-Filamenten (5 ug/ml) wurden als 0% Bindung (unspezifische Bindung) definiert, und Reaktionen ohne Konkurrenz werden als 100% (Maximum) der Bindung in den Verdrängungskurven angesehen.

Die Analyse der Wettbewerbsbindungskurven erfolgte gemäß den EinStellen-Modellen unter Verwendung der computergestützten Kurven-

anpassungssoftware von GraphPad.

Beispiel 1: Bestimmung der biologischen Aktivität von CLEC-Konjugaten in vitro PAMPs wie CLECs werden von PRRs erkannt, die in APCs vorhanden

sind. Die Bindung von CLECs an ihre korrespondierenden PRRs (z. B.

Dectin-1 für ß-Glucane) ist erforderlich, um die adaptive Immunität auf verschiedenen Ebenen zu steuern, z. B. durch die Induzierung nachgeschalteter kohlenhydratspezifischer Signalübertragung und Zellaktivierung, Reifung und Migration von Zellen zu drainierenden Lymphknoten oder durch Crosstalk mit anderen PRRs. Für die Bereitstellung einer neuartigen Impfstoff-Plattformtechnologie, wie sie in diesem Antrag vorgeschlagen wird, ist es daher von entscheidender Bedeutung, dass die verwendeten CLECs ihre PRRBindungsfähigkeit beibehalten, was die biologische Aktivität der ausgewählten CLECs sowie des Konjugats auf CLEC-Basis belegt.

Um sicherzustellen, dass 1) die Struktur der CLECs während der milden Periodat-Oxidation nicht zerstört wurde und 2) das Polysaccharid nach der Kopplung biologisch aktiv blieb, wurde die Bindung an Dectin-1 mittels ELISA untersucht. Zunächst wurden mehrere verschiedene CLECs durch milde Periodat-Oxidation oxidiert, um das reaktive Zuckergerüst der vorgeschlagenen Impfstoffe zu erzeugen. Zu diesen CLECs gehören: Mannan, Pustulan (20 kDa), Lichenan (245 kDa), Gerste ß-Glucan (229 kDa), Hafer ß-Glucan (295 kDa) und Hafer ß-Glucan (391 kDa). Anschließend wurden Impfstoffkonjugate durch Hydrazon-Kopplung unter Verwendung verschiedener B-Zell-Epitop-Peptide (SeqgqID2, SeqID10, SeqgIDl16) und SeqgID7 als THelfer-Epitop-Peptid hergestellt, die alle einen C-terminalen Hydrazid-Linker zur Kopplung enthalten. Darüber hinaus wurde auch ein Peptid-Pustulan-Konjugat verwendet, das durch Kopplung von SeqID10 über den heterobifunktionellen Linker BMPH hergestellt wurde.

Nicht oxidierte und oxidierte CLECs sowie neuartige Konjugate auf CLEC-Basis wurden anschließend mit einem kompetitiven ELISASystem, das auf der kompetitiven Bindung eines löslichen murinen Fc-Dectin-la-Rezeptors (InvivoGen) oder ConA basiert, auf ihre biologische Aktivität hin untersucht (siehe Korotchenko et al. 2020).

Ergebnisse:

Die verschiedenen getesteten CLECs zeigen eine unterschiedliche Wirksamkeit der PRR-Bindung. In einer Reihe von ELISA-Experimenten wurden die Dectin-1-Liganden Pustulan, Lichenan, GerstenB-Glucan und Hafer-ß-Glucan auf ihre Bindungswirksamkeit an Dectin-1 untersucht. Die anschließenden Experimente zeigten, dass das lineare ßB-(1,6) verknüpfte ß-D-Glucan Pustulan mit mittlerem Mo-

lekulargewicht (20 kDa) überraschenderweise eine deutlich höhere

Bindungseffizienz (ca. 3-fach) an Dectin-1 aufweist als das gröBere lineare ß-(1,3) ß-(1,4)-B-D-Glucan Lichenan (ca. 245kDa) (siehe Figur 1).

Dieser Unterschied war sogar noch ausgeprägter, wenn man Pustulan mit anderen linearen, ß-(1,3) ß-(1,4)-BßB-D-Glucanen aus Hafer und Gerste (Gersten-ßB-Glucan (229kDa), Hafer-ßB-Glucan: 265 und 391kd) vergleicht, die im Vergleich zu Pustulan nur eine begrenzte Bindungswirksamkeit aufwiesen (z.B.: ca. 30-fach geringer für Gersten-ßB-Glucan (229kDa)).

Eine milde Periodat-Oxidation ausgewählter CLECs führt zu einer Verringerung der Dectin-1-Bindung. Die Oxidation von Mannan verringerte seine Bindungskapazität an das Lektin ConA in ähnlichem Maße wie die für die oxidierte Pustulan-Dectin-1-Bindung nach Periodat-Oxidation beschriebene Verringerung. In ähnlicher Weise führt die Oxidation von Glucanen zu einer ähnlichen proportionalen Verringerung der PRR-Bindung (siehe Figur 1A).

Wichtig ist, dass die Konjugatbildung auch zu einer Verringerung der PRR-Bindungskapazität der Peptid-CLEC-Konjugate im Vergleich zu unkon]ugierten CLECs führte, wie für das Mannan-haltige Konjugat sowie für verschiedene getestete Pustulan-, Lichenan- oder Gersten-ßB-Glucan-Konjugate gezeigt wurde (siehe Figur 1B).

Die Experimente zeigten, dass Pustulan trotz seiner geringeren Größe und dem Fehlen von ß-(1,3)-glykosidischen Bindungen (zu beachten: ß-(1,3)-haltige Glucane werden als optimaler Ligand für Dectin-1 beschrieben) die höchste Bindungseffizienz aufweist, unabhängig von Oxidation oder Kon]ugation. So weisen pustulanhaltige Konjugate eine ca. 3-fach höhere Bindung auf als lichenanbasierte Konstrukte.

Figur 1A und 1B zeigen außerdem, dass die Kon]ugation von Peptiden über Hydrazonbildung oder über heterobifunktionelle Linker gleichermaßen für WISIT-Konjugate geeignet ist, da beide Arten

von Konjugaten eine hohe Dectin-1-Bindungswirksamkeit beibehalten.

Beispiel 2: Bestimmung der DC-Aktivierung nach Pustulan-Exposition iın vitro

Eine wichtige Funktion der vorgeschlagenen Impfstoffe ist ihre Fähigkeit, nach der PRR-Bindung und -Aufnahme DCs zu akti-

vieren. Um zu zeigen, dass CLEC-basierte Konjugate nicht nur an

PRRs binden, sondern auch eine biologische Funktion in ihren Zielzellen, d.h. DCs, ausüben, wurde ein DC-Aktivierungsexperiment durchgeführt.

Zunächst wurden Zellen aus dem Knochenmark von Mäusen mit MGM-CSF inkubiert, um gemäß den veröffentlichten Protokollen BMDCs zu erzeugen. Diese GM-CSF-DCs wurden dann entweder dem PeptidGlucan-Konjugat SeqID2- SeqgID7-Pustulan oder entsprechenden Mengen an oxidiertem, aber nicht kon]ugiertem Zucker ausgesetzt. In jedem Fall wurden die Konjugate/Zucker von 500 ug bis 62,5 ug/ml des Jeweiligen Zuckers titriert. Zum Vergleich wurde der starke Aktivator LPS bei einer Konzentration von 2ng/ml als Kontrolle verwendet. Wichtig ist, dass die für die Oxidation und Konjugatbildung verwendeten Pustulanzubereitungen ebenfalls geringe Mengen an LPS enthalten. Daher wurde die äquivalente Dosis von LPS verwendet, um die gemessenen Effekte zu normalisieren. Die DCs wurden dann mittels FACS-Analyse auf die Expression von Markern für die DC-

Aktivierung und -Reifung untersucht, darunter CD80 und MHCII.

Ergebnisse:

GM-CSF DCs, die in vitro mit SegqgId2-SegID7-Pustulan-Konjugaten stimuliert wurden, zeigten eine signifikant erhöhte Expression von CD80 und MHCII (siehe Figur 2). Die Werte waren signifikant höher als die Effekte, die durch äquivalente Dosen von LPS, die in den Konjugatpräparaten enthalten waren, beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu führten äquivalente Mengen oxidierten, aber nicht konjugierten Zuckers zu einer leichten Verringerung der CD80-Expression, wie aufgrund des LPS-Gehalts in der Zubereitung zu erwarten gewesen wäre, und zu einer deutlich weniger ausgeprägten Induktion von MHCII als bei den Pustulankonjugaten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Hochregulierung von MHC-II auf eine DC-Aktivierung hinweist. Darüber hinaus wird CD80 stärker hochreguliert, als durch die gleiche Menge LPS zu erwarten wäre, was stark darauf hindeutet, dass Pustulankonjugate wesentlich zur Reifung und Aktivierung von DCs beitragen (über die Wirkung hinaus, die durch die LPS-Exposition allein erklärt wird). Somit belegen die Beispiele 1 und 2 eindeutig die biologische Aktivität der Pustulan-Impfstoffe.

Beispiel 3: Bestimmung der Partikelgröße mittels DLS

Es wurden einzelne Experimente zur Analyse der Partikelgröße/des hydrodynamischen Radius verschiedener Glucan-Konjugate durchgeführt.

Für die DLS-Analyse wurden verschiedene Peptid-Glucan- bzw. Peptid-Träger-Glucan-Konjugate analysiert und mit nicht konjugiertem Pustulan verglichen. Alle Analysen wurden in dreifacher Ausführung mit einem WYATT DynaPro PlateReader-II durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen für alle getesteten Kon]ugate eine Partikelgrö-

Benverteilung mit einem Maximum im niedrigen nm-Bereich.

Getestete Konjugate:

B-Zell-Epitop T-Zell-Epitop CLEC

SeqID2 SeqI1D7 Pustulan (80%)

SeqgID3 CRM197 Pustulan (80%) Nicht OX1-

na na diertes Pustulan

Ergebnisse:

Die aktuelle Analyse zeigt einen durchschnittlichen hydrodynamischen Radius (HDR) der Hauptpartikel von ca. 5 nm für das in diesem Test verwendete Peptid-Pustulan-Konjugat SeqID2-SeqID7Pustulan. Ein kleiner zweiter Peak bei ca. 60 nm weist auf eine sehr geringe Anzahl von Aggregaten in der Formulierung hin (siehe Figur 3A). Der größte Teil der Konjugatzubereitung scheint jedoch in monomerer Form vorzuliegen. Diese Prävalenz monomerer KonJ]ugate gegenüber vernetzten oder aggregierten Konjugaten wird auch durch die Tatsache gestützt, dass monomeres Pustulan (ca. 20 kDa) bei ca. 5 nm nachweisbar ist (wie in den Kontrollproben gezeigt, siehe auch Figur 3C), was ebenfalls für die Prävalenz monomerer PustulanKonjugate spricht (angesichts einer HDR von +5 nm für monomeres Pustulan). Wie die Analyse des Kumulantenradius über 24 Stunden zeigt, sind die Konjugate auch in Bezug auf ihre HDR stabil und neigen nicht zur Aggregation, was wiederum für die Prävalenz monomerer Konjugate spricht.

Zur Charakterisierung von Impfstoffen, die auf Peptid-TrägerGlucan-Konjugaten basieren, wurde ein SeqID6-CRM197-Kon]ugat analysiert, das zusätzlich mit Pustulan konjugiert wurde. Auch hier ergab die DLS-Analyse einen durchschnittlichen HDR-Wert von 11 nm

und einen zweiten kleineren Peak von ca. 75 nm, was wiederum auf

das Vorhandensein einer geringen Anzahl von Aggregaten hinweist (siehe Figur 3B). Der leichte Anstieg auf 11 nm spiegelt höchstwahrscheinlich die Erhöhung des Molekulargewichts des resultierenden Kon]ugats wider, da CRM197 eine Größe von etwa 60 kDa hat. Es kann keine signifikante Aggregation oder Vernetzung der CRMKonjugate festgestellt werden, und die Analyse des Kumulantenradius über 24 Stunden zeigt ebenfalls, dass die Kon]ugate für ihre HDR stabil sind und nicht zur Aggregation neigen. Auch die DLSAnalyse dieses alternativen Typs von CLEC-basierten Impfstoffen bestätigt die Prävalenz monomerer Konjugate.

Kontrollproben (d. h. nicht oxidiertes Pustulan) zeigten eine viel größere HDR mit einem Durchschnitt von ca. 600 nm sowie zwei zusätzliche kleinere Peaks bei 5 nm bzw. 46 nm (siehe Figur 3C). Pustulanmonomere haben einen HDR von ca. 5 nm, was gut zu dem angenommenen MW von 20 kD passt, größere Aggregate können leicht nachgewiesen werden, und der Großteil des Glucans liegt als große Partikel mit hohem MW vor. Wichtig ist, dass die Analyse des Kumulantenradius über 24 Stunden auch zeigt, dass nicht konjugiertes Pustulan im Gegensatz zu Pustulan-Kon]ugaten dazu neigt, im Laufe der Zeit stark zu aggregieren, was zur Bildung großer Partikel führt, was mit verschiedenen Literaturberichten übereinstimmt.

In Figur 3 sind Beispielgrafiken für diese beiden Konjugate und nicht oxidierte Pustulankontrollen dargestellt.

Die in diesem Beispiel erzielten Ergebnisse zeigen die bisher einzigartigen Eigenschaften von CLEC-basierten Konjugaten im Vergleich zu bekannten Beispielen (z. B. Wang et al., 2019, Jin et al., 2018), die kleine (d. h. 5-11 nm), überwiegend monomere zuCkerbasierte Nanopartikel mit weit weniger als 150 nm HDR aufweisen, eine Größe, die im Allgemeinen als bevorzugte Größe für immuntherapeutisch aktive Kon]ugatimpfstoffe gilt. Dies ist hauptsächlich auf die PRR-Bindungs- und Aktivierungseigenschaften gröBerer Partikel, einschließlich ganzer Glucanpartikel, zurückzuführen. Es ist bekannt, dass größere Partikel (>150nm bis 2-4um) effizienter mit ihren Rezeptoren interagieren und die DC-Signaling, - Aktivierung, - Reifung und - Migration zu den drainierenden Lymphknoten initiieren können, während kleine, sogar 1ö58sliche PRR-Liganden vermutlich in der Lage sind, an ihren Rezeptor zu binden, aber die anschließende DC-Aktivierung zu blockieren (Goodridge et al., 2011). Diese Daten, zusammen mit den in den

Beispielen 1, 2 und 3 beschriebenen Daten sowie anderen unten

aufgeführten Beispielen, zeigen jedoch zum ersten Mal, dass kleine, lösliche Peptid-basierte Gluco-Neo-Kon]ugate, die auf einem monomeren ß-Glucan aufbauen, z. B.: das lineare ßB(1,6)-ßB-DGlucan Pustulan, als Grundgerüst effektiv an den PRR (Dectin-1) binden können, die entsprechenden APC (wie z.B. GM-CSF DCs) aktivieren und eine sehr hohe biologische Aktivität und Immunogenität auf hautspezifische Weise aufweisen, die auch die Wirkung klassi-

scher Kon]ugatimpfstoffe deutlich übertrifft.

Beispiel 4: In-vivo-Vergleich verschiedener Impfstoffe auf CLECBasis

Impfstoffe auf CLEC-Basis, die an ihren DC-Rezeptor (z. B. Dectin-1 oder ConA) binden können, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, nach wiederholter Verabreichung an n=5 Balb/c-Mäusen/Gruppe eine robuste und spezifische Immunantwort hervorzurufen. Typische Experimente wurden mit einem Nettopeptidgehalt von 5 ug an B-Zell-Epitop-Peptiden pro Dosis durchgeführt.

In einer ersten Reihe von Experimenten wurden drei verschiedene CLECs verglichen. In diesem Experiment wurden das von aSynuclein abgeleitete Peptid SeqID2 oder das von Amyloid ß 42 (AßB42) abgeleitete Peptid SegIDl0 und das promiskuitive T-HelferzellEpitop SeqgID7 über C-terminale Hydrazid-Linker an oxidiertes Pustulan (20 % Oxidationsgrad), Mannan (20 % Oxidationsgrad) oder

Gersten-ßB-Glucan (229 kDa, 20 % Oxidationsgrad) gekoppelt.

Verwendeter Impfstoff:

B-Zell-Epitop T-Zell-Epitop CLEC SeqID2 SeqI1D7 Pustulan (20%) SeqID2 SeqI1D7 Mannan (20%)

Gerste B-Glu-

SeqID2 SeqI1D7 can (229kDa, 20%) SeqID2 SeqI1D7 Pustulan (80%) Lichenan SeqID2 SeqI1D7 (245kDa, 200%) SeqgID10 SeqI1D7 Pustulan (80%) Lichenan SeqgID10 SeqI1D7

(245kDa, 200%)

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen (Route: 1.d.) geimpft, und die darauf folgende Immunantwort gegen die injizierten Peptide (d.h. SeqgID2 bzw. SegID10) wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen

nach der dritten Immunisierung entnommen wurde.

Ergebnisse:

Wie in Figur 4A dargestellt, konnten alle drei CLEC-Impfstoffe (SeqgID2-SeqgID7/-Mannan, SeqID2-SegID7-Pustulan (lineares B(1,6)-B-Glucan) und Gerste SeqgID2-SegID7-ß-Glucan (229kDa)) eine nachweisbare Immunantwort hervorrufen. Interessanterweise löste die Immunisierung mit dem Impfstoff auf der Basis von Gersten-ßGlucan mit hohem Molekulargewicht nur eine sehr geringe Anti-Peptid-Antwort aus (ODmax/2 Titer ca. 1/100). Im Gegensatz dazu konnten Konjugate auf Pustulan-Basis eine deutlich höhere Reaktion mit durchschnittlichen Titern von ca. 1/11000 hervorrufen. Konjugate auf Mannan-Basis zeigten eine ca. 7-fach geringere Immunogenität als Konjugate auf Pustulan-Basis, da die durchschnittlichen Titer nach der Immunisierung in diesem Experiment etwa 1/1500 erreichten.

Figur 4B zeigt die Ergebnisse einer zweiten Reihe von Experimenten zum Vergleich der Immunogenität von zwei verschiedenen Varianten von Konjugaten auf Glucanbasis, bei denen entweder das von aSynuclein abgeleitete Peptid SegID2 oder das von Amyloid ß 42 (AB42) abgeleitete Peptid SegIDl0 als B-Zell-Epitope und das TZell-Epitop SeqgID7 verwendet wurden. Bei der ersten Variante wurde wieder Pustulan als CLEC für die Konjugation verwendet, bei der zweiten Variante wurde das Lineare ß-(1,3) ßB-(1,4)-ßB-D-Glucan Lichenan (ca. 245kDa) eingesetzt. Wie in Figur 4B gezeigt, konnten beide Varianten hohe Titer von Immunantworten gegen die injizierten Peptide induzieren (d.h. SeqID2/3 (SeqgID3=SegID2 angepasst für BSA-Konjugation) und SeqID10/11 (SeqIDl1l1=SegID10 angepasst für BSA-Kon]ugation)). Peptid-Lichenan-Konjugate zeigten in diesen Experimenten jedoch eine deutlich geringere Immunogenität als Peptid-Pustulan-Kon]ugate (4-8x höhere Anti-Peptid-Titer bei einer Dosis von 5 ug), was auch mit der geringeren Dectin-1-Bindungsfähigkeit übereinstimmt, wie in Beispiel 1 gezeigt. Dies zeigt, dass die Dectin-1-Bindungseffizienz in vitro direkt mit der Immunogenität und biologischen Aktivität der Impfstoffe in vivo in Ver-

bindung gebracht werden kann. Dies führt zur Identifizierung von

Pustulan oder Fragmenten davon (d. h. lineare ß(1,6)-ß-D-Glucane) als wirksamste Glucan-Variante, wie in diesem Antrag vorgeschlagen. Die Impfstoffe sind auch mit verschiedenen Peptiden funkti-

onsfählilg, was das Plattformpotenzial dieses Impfstofftyps zeigt.

Beispiel 5: In-vivo-Vergleich von Peptid-Pustulan-Konjugaten mit unkonjugierten Peptid-Impfstoffen

Um festzustellen, ob die Konjugation von CLECs mit Peptidimmunogenen für die Induktion einer überlegenen Immunogenität der erfindungsgemäßen Impfstoffe erforderlich ist, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, in denen zwei Konjugate (SeqID2+SeqgID7/+Pustulan oder SegID2+SegID7+Mannan) mit Impfstoffpräparaten verglichen wurden, die alle Komponenten als Mischung ohne Konjugation enthielten (d. h. SeqgID2 und SeqgID7 plus entweder nicht oxidiertes Pustulan oder Mannan). Auch hier wurden n=5 weibliche Balb/c-Mäuse dreimal in zweiwöchigen Abständen 1i.d. immunisiert, und die darauf folgende Immunantwort gegen die injizierten Peptide (d.h. SeqID3) wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen wurde.

Verwendeter Impfstoff:

Konj]ugaB-Zell-Epitop T-Zell-Epitop CLEC tion Pustulan Ja SeqID2 SeqI1D7 (20%) SeqID2) SeqI1D7 Mannan Ja (20%) SeqID2 SeqI1D7 Pustulan Nicht

(nicht ak- konj]u-

tivVv- giert; ierbar) Mischen SeqID2 SeqI1D7 Nicht

Mannan

kon]u(nicht ak-

giert; tiviert)

Mischen

Ergebnisse: Figur 5 zeigt den Vergleich der spezifischen Anti-Peptid (SeqgID3)-Immunantworten, die nach drei Immunisierungen nachgewiesen

werden konnten. SegqgID2+SeqgID7+Pustulan-Konjugate (20 % Oxidation)

84 / 152

konnten in diesem Experiment viermal höhere Immunantworten auslösen als die Mischung aus den nicht konjugierten Peptiden SeqID2, SegID7 und nicht oxidiertem Pustulan (d. h. 1/12000 gegenüber 1/3000). Auch die Konjugate SeqgID2+SeqID7+Mannan (20 % Oxidation) waren bei der Auslösung peptidspezifischer Immunantworten effizienter als die Anwendung einer Mischung der Komponenten (1/7000 vs. 1/4000; 1,75-fache Steigerung). Diese Daten zeigen, dass die KonJugation von Peptid-Immunogenen mit aktivierten CLECs erforderlich ist, um eine starke und nachhaltige Immunantwort in vivo zu indu-

zieren.

Beispiel 6: In-vivo-Vergleich von SeqgID5-SegID/-Pustulan und SeqID2- oder Seq-7-Pustulan-Konjugaten

Um festzustellen, ob CLEC-basierte Impfstoffe B-Zell- und TZell-Epitope für die Induktion nachhaltiger Anti-B-Zell-Epitopspezifischer Immunantworten in vivo benötigen, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, in denen drei Konjugate verglichen wurden: SeqgID5+SegID7+Pustulan, SeqgID5S+Pustulan und SegID7+Pustulan. n=5 weibliche Balb/c-Mäuse wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen i.v. immunisiert, und die darauf folgende Immunantwort gegen die injizierten Peptide (d.h., SeqgID6) wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der dritten

Immunisierung entnommen wurde.

B-Zell-Epitop T-Zell-Epitop CLEC

SeqID5 SeqI1D7 Pustulan (80%)

SeqID5 n.a. Pustulan (80%)

n.a. SeqI1D7 Pustulan (80%) Ergebnisse:

Wie in Figur 6 dargestellt, sind die Kon]ugate SeqID5+SeqgID7/+Pustulan (80 % Oxidation) in der Lage, eine hohe und hochspezifische Immunantwort gegen die in]izierte Peptideinheit (d.h. das von aSynuclein abgeleitete Peptid SeqID6) auszulösen, die in diesen Experimenten durchschnittliche Titer von 1/36000 erreichte. Peptid-Pustulan-Konjugate, die entweder SeqID5 oder SegID7 allein enthalten und über eine Hydrazon-Kopplung an Pustulan gekoppelt sind, konnten nach drei zweiwöchentlichen Immunisierungen (Verabreichung: 1.v.) entweder eine 12-fach geringere Immunantwort im

Falle von SeqID5+Pustulan (1/3000) oder keine SeqID6-spezifische

Immunantwort (für SeqID7+Pustulan-Konjugate, Titer <1/100, unter der Nachweisgrenze) hervorrufen.

Diese Daten zeigen, dass die Kon]ugation von Peptid-Immunogenen an aktivierte CLECs erforderlich ist, um eine starke und nachhaltige Immunantwort in vivo zu induzieren. Sie zeigen jedoch auch, dass die Konjugation von Pustulan mit einzelnen kurzen BZelil-Epitopen in Abwesenheit von T-Zell-Epitopen (z. B. SeqID5 allein) die Induktion von T-Zell-unabhängigen B-Zell-Antworten in vivo ermöglicht, wenn auch mit deutlich geringerer Wirksamkeit als bei T- und B-Zell-Epitop-haltigen CLEC-Konjugaten.

Beispiel 7: In-vivo-Analyse der Anti-Pustulan/Glucan-Immunantwort nach Peptid-Pustulan-Immunisierung

Die Analyse von Anti-CLEC-Antikörpern ist in zweierlei Hinsicht wichtig für die Neuartigkeit und Wirksamkeit der vorgeschlagenen CLEC-Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung:

1) B-Glucane sind Hauptbestandteile der Zellwand verschiedener Pilze, Flechten und Pflanzen, die der Zellwand ihre typische Festigkeit gegenüber dem intrazellulären osmotischen Druck verleihen. ß-Glucane gelten daher auch als typische mikrobielle pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP) und sind ein wichtiges Ziel für hochtitrige zirkulierende natürliche Abs bei gesunden Menschen. PAMPs sind häufige und relativ unveränderliche molekulare Strukturen, die von vielen Krankheitserregern gemeinsam genutzt werden und die das Immunsystem stark aktivieren. (Chiani et al. Vaccine 27 (2009) 513-519, Noss et al. Int Arch Allergy Immunol 2012;157:98-108, Dong et al. J Immunol 2014; 192:1302-1312, Ishibashi et al. FEMS Immunology and Medical Microbiology 44 (2005) 99-109, Harada et al. Biol Pharm Bull. 2003 Aug;26(8):1225-8). IgG gegen-ßB-(1,3)- und-ßB-(1,6)-Glucane können in normalen menschlichen Seren gefunden werden, und ß-(1,6)-Glucane scheinen viel stärkere Antigene zu sein als ß-(1-3)-Varianten. Darüber hinaus wurde der B-(1>6)-ßB-Glucan-Anteil als einer der typischen mikrobiellen PAMPs identifiziert, der als Erkennungs- und Angriffspunkt für die immunologische Malignitätsüberwachung sowie für die Verteidigung gegen mikrobielle Invasion dient. Pustulan, das bevorzugte GlucanGrundgerüst für die CLEC-Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung, besteht aus linearen ßB-(1-6)-ß-Glucan-Anteilen, und es wurde von mehreren Forschergruppen berichtet, dass Anti-Pustulan-Immun-

antworten im Plasma von naiven, nicht mit Pustulan immunisierten

menschlichen Probanden nachgewiesen werden können. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, das Potenzial von CLEC-basierten Impfstoffen zur Aktivierung der Anti-Pustulan-Immunreaktivität zu untersuchen. Anti-ß-Glucan-Antikörper könnten in vivo spezifisch mit Peptid-Pustulan interagieren und durch die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen zu einer schnellen Eliminierung führen und dadurch die Induktion effizienter Immunreaktionen verhindern. Alternativ könnte die Induktion/Verstärkung einer Anti-PustulanAntikörperreaktion nach einer WISIT-Immunisierung auch die Immunogenität fördern, da eine potenzielle Kreuzpräsentation von CLECKonj]jugaten durch -pustulanspezifische IgG-Antikörper und die Aufnahme in APCs auch die Wirksamkeit der angewandten Impfstoffe erhöhen könnte.

Es wurden keine formellen Studien veröffentlicht, in denen das Vorhandensein von Anti-Pustulan-Antikörpern in naiven Mäusen untersucht wurde. Ishibashi et al. und Harada et al. konnten jedoch das Vorhandensein von ß-Glucan-IgGs gegen l15sliches Skleroglucan/ß-Glucan (d. h. 1,3/1,6-Beta-Glucane) in Seren von naiven DBA/2-Mäusen nachweisen.

2), wie zuvor berichtet (z.B. Torosantucci et al., Bromuro et al., Donadei et al., Liao et al.), wirkten CLEC-Protein-KonJ]ugate, z.B. CRM197-gekoppelt an Laminarin, Curdlan oder synthetische B(1,3) B-D-Glucane, als starke Immunogene, die nicht nur hohe AntiCRM197-Titer, sondern auch hohe Anti-Glucan-Titer in Kombination mit einem Schutz vor einer Pilzinfektion induzierten. Daher waren frühere Versuche mit solchen Konjugaten auf die Verwendung von CLECs als echte krankheits-/pilzinfektionsspezifische Immunogene gerichtet, anstatt sie als Träger und immunologisch inertes Grundgerüst zu verwenden, wie in diesem Antrag vorgeschlagen.

In diesem Sinne wurde eine umfassende Analyse der Plasmaproben von naiven und mit Peptid-CLEC-Konjugaten immunisierten Balb/c-Mäusen (n=5/Gruppe) auf das Vorhandensein von AntiPustulan-Antikörpern vor der Immunisierung bzw. nach wiederholten

Immunisierungen eingeleitet.

Verwendeter Impfstoff:

Konj]ugaB-Zell-Epitop T-Zell-Epitop CLEC tion Pustulan SeqID2 SeqI1D7 Ja

(20%)

Mannan SeqID2 SeqI1D7 Ja (20%) Pustulan Nicht (nicht ak- konj]uSeqID2 SeqI1D7 tivVv- giert; ierbar) Mischen Nicht Mannan kon]uSeqID2 SeqI1D7 (nicht akgiert; tiviert) Mischen Ergebnisse:

Daher wurden Proben von Tieren analysiert, die mit PeptidPustulan ( SegID2+SegID7 + Pustulan (20%)) und Peptid-Mannan (SegID2+SeqID7+Mannan (20%)) geimpft wurden (alle Impfstoffe: 4 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis). Zu Kontrollzwecken wurden auch Tiere verwendet, denen Impfstoffe verabreicht wurden, die aus nicht konj]ugierten Peptiden und nicht oxidierten CLECs bestanden (d. h. SegID2+SeqgID7+non-ox. Pustulan, SeqID2+SeqgID7/+non-ox. Mannan). Wie in Figur 7A dargestellt, zeigten die untersuchten Balb/c-Tiere eine bereits vorhandene Immunantwort auf niedrigem Niveau, die gegen Pustulan/ß(1,6)-ß-D-Glucan gerichtet war. Beide getesteten CLEC-Impfstoffe (SeqgID2+SegID7/+Pustulan (20 %) und SeqID2+SegID7+Mannan (20 %)) konnten in vivo keine starke de novo Immunantwort gegen das Glucan-Grundgerüst induzieren. Im Gegensatz dazu führte die wiederholte Verabreichung von nicht konjugiertem, nicht oxidiertem Pustulan in der Kontrollgruppe (die eine Mischung aus allen drei Komponenten erhielt) zur Induktion einer starken AntiGlucan-Immunreaktion, indem die Antikörperspiegel gegen Pustulan um das 18,5-fache erhöht wurden (im Vergleich zum Plasma vor der Immunisierung). Mannan-haltige Konjugate oder Mischungen waren nicht in der Lage, Anti-Pustulan-Titer zu induzieren, was auf die Spezifität der festgestellten Anti-Glucan-Reaktion hinweist. Die kinetische Analyse der Anti-Pustulan-Antikörpertiter zeigte einen stetigen Anstieg über die Zeit mit einem starken Anstieg nach der dritten Immunisierung bei Tieren, die mit nicht kon]ugiertem und nicht oxidiertem Pustulan immunisiert wurden (siehe Figur 7B). Ein kompetitiver ELISA mit zunehmenden Mengen an nativem Pustulan

zeigte ebenfalls die Spezifität der Antikörperreaktion, die in der

Gruppe, die eine Mischung der Komponenten erhielt, nachweisbar war (Figur 7C).

Zusammenfassend konnten diese Analysen zeigen, dass trotz des Vorhandenseins einer geringen Autoreaktivität gegen Pustulan (IgG) in naiven Balb/c-Mäusen keine/sehr geringe impfabhängige Zunahme der Anti-Pustulan-Immunreaktivität durch Immunisierung mit verschiedenen CLEC-Konjugaten induziert wird. Daher sind die CLECs, die als Peptid-CLEC-Konjugate gemäß dieser Erfindung verwendet werden, bei Verwendung des neuartigen Impfstoffdesigns gemäß der vorliegenden Erfindung tatsächlich immunologisch inert. Dies steht in starkem Gegensatz zu früher veröffentlichten Ergebnissen und stellt daher eine überraschende und erfinderische neue Eigenschaft des Kohlenhydratrückgrats (z. B. der ß-Glucane oder Mannane, insbesondere des Pustulanrückgrats) gemäß der vorliegenden Erfindung dar.

Darüber hinaus scheinen bereits vorhandene Anti-Pustulan-Reaktionen Immunreaktionen auf die Peptidkomponente der WISIT-Impfstoffe nicht auszuschließen, da die in]izierten Peptidreaktionen

in beiden Experimenten hohe Anti-Peptid-Titer aufwiesen.

Beispiel 8: Analyse der Immunogenität von Glucan-Konjugaten mit Noder C-terminal gekoppelten Peptid-Immunogenen

Um festzustellen, ob die für die Kopplung verwendete LinkerOrientierung die Immunogenität der Impfstoffe beeinträchtigen würde, wurden 4 verschiedene Impfstoffkandidaten hergestellt: In diesem Experiment wurden die von aSynuclein abgeleiteten Peptide SegID1/2 und SeqID4/5 entweder über N- oder C-terminale HydrazidLinker an oxidiertes Pustulan (80%) gekoppelt. Darüber hinaus trug Jeder der vier Impfstoffe das promiskuitive T-Helferzell-Epitop SegID7, das über C-terminale Hydrazid-Linker an das CLEC-Grundgerüst gekoppelt war.

Verwendeter Impfstoff:

B-Zell-Epitop T-Zell-Epitop CLEC

SeqgIl SeqI1D7 Pustulan (80%) SeqID2 SeqI1D7 Pustulan (80%) SeqID4 SeqI1D7 Pustulan (80%) SeqID5 SeqI1D7 Pustulan (80%)

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (Route: 1i.d.) und die anschließende Immunantwort, die sich sowohl gegen das in]izierte Peptid (d.h. SegID3 und SeqID6) als auch gegen das Zielprotein, d.h. rekombinantes aSynuclein, richtete, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert,

das zwei Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen wurde.

Ergebnisse:

Wie Figur 8 zeigt, konnten alle 4 CLEC-Impfstoffe, die entweder N- oder C-terminal gekoppelte B-Zell-Epitope verwenden, eine starke und hochspezifische Immunantwort sowohl gegen die in]jizierten Peptidanteile (Figur 8A) als auch gegen das Zielprotein aSynuclein (Figur 8B) hervorrufen. Interessanterweise wirkte sich die Kopplungsorientierung unterschiedlich auf die Immunogenität aus. So löste der N-terminal gekoppelte Impfstoff SeqgID1+SeqgID7+CLEC eine 7-mal geringere Reaktion gegen das injizierte Peptid und eine 10-mal geringere Immunantwort gegen rec. aSyn aus als der C-terminal gekoppelte SerqgID2-SeqID7-CLEC. Im Gegensatz dazu löste der C-terminal gekoppelte Impfstoff SeqgID5-SeqgID7-CLEC eine ca. 4-fach geringere Reaktion auf das injizierte Peptid, aber eine gleich starke Reaktion gegen aSyn aus, verglichen mit dem N-terminal gekoppelten Impfstoff SeqID4+SegID7+CLEC. Somit kann die Kopplungsausrichtung auf der Grundlage peptidspezifischer Merkmale geändert werden, ohne die Entwicklung von Hochtiter-Immunantworten zu beeinträchtigen.

Wie in Figur 8 gezeigt, kann Jedoch durch Variation der Kopplungsorientierung des immunogenen Peptids die Spezifität der sich daraus ergebenden Reaktion gegen das Zielprotein erheblich gesteigert werden, so dass neuartige und noch nie dagewesene Immunreaktionen ausgelöst werden können:

z.B.: Die Impfung mit SeqgID 1 führt zu einer 4,5-fach höheren Reaktion gegen das Peptid im Vergleich zum Zielprotein, was vergleichbar ist mit der 3,3-fach höheren Anti-Peptid-Reaktion im Vergleich zum Protein, die durch den Impfstoff SeqgID 2 ausgelöst wird.

Im Gegensatz dazu induziert der SeqID-4-Impfstoff eine 1,7fach höhere Reaktion gegen das Peptid als gegen das Protein, während der SeqID-5-Impfstoff dieses Verhältnis umkehren kann, so dass eine 2,5-fach höhere protein-spezifische Reaktion im Ver-

gleich zur injizierten Peptidreaktion nachweisbar ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Daten eindeutig zeigen, dass Impfstoffe mit beiden Kopplungsrichtungen biologisch aktiv sind und für diese Anwendung geeignet sind. Es wird auch gezeigt, dass die Kopplungsrichtung verwendet werden kann, um je nach Peptid und Ziel spezifisch bevorzugte und nicht bevorzugte

aktive Impfstoffe auszuwählen.

Beispiel 9: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konjugaten unter Verwendung verschiedener T-Helferzell-Epitope

In diesem Beispiel wurde die Immunogenität von CLEC-basierten Impfstoffen, die das nicht natürliche pan-DR-Epitop (PADRE mit einer künstlichen Cathepsin-Spaltstelle, SeqID7) enthalten, mit anderen bekannten T-Helferzell-Epitopen verglichen. Zu diesem Zweck wurden mehrere promiskuitive Epitope ausgewählt, die entweder mit einer neuartigen, künstlich eingefügten Cathepsin L-Spaltstelle für eine effiziente endo-/lysomale Freisetzung nach rezeptorvermittelter Aufnahme in APCs/DCs angepasst oder unverändert

gelassen wurden. Zu den ausgewählten Epitopen gehören:

Cathepsin Peptid Sequenz Epitop LSpaltstelle SeqI1D7 AKFVAAWTLKAAANRRA- (NH-NH )2 PADRE + SeqID22 AKFVAAWTLKAAA- (NH-NH )2 PADRE — SeqgID23 KAAAVKAAFWTAL-NRRA- (NH-NH )2 künstlich + SeqID24 DSETADNLEKTVAALSILPGHGC- (NH-NH )2 Diphtherie _ SeqgID25 DSETADNLEKTVAALSILPGHGCNRRA- (NH-NH )2 Diphtherie + Masern-ViSeqgID26 ISITEIKGVIVHRIETILF-(NH-NH )2 Frus-Fu- _ sionsprotein Masern-ViSeqg1D27 ISITEIKGVIVHRIETILFNRRA- (NH-NH )2 rus-Fu- + sionsprotein Huhn OVA SeqgID28 ISQAVHAAHAEINEAGR- (NH-NH )2 _ (323-339) Huhn OVA SeqID29 ISQAVHAAHAEINEAGRNRRA- (NH-NH )2 + (323-339)

Um festzustellen, ob Peptidimpfstoffe, die diese T-Helfer-

zell-Epitop-Peptide tragen, nach wiederholter Immunisierung hohe

Immunreaktionen hervorrufen und Immunreaktionen induzieren können, die denen herkömmlicher Konjugatimpfstoffe überlegen sind, wurden 10 verschiedene Impfstoffkandidaten getestet:

In diesem Experiment wurde das von aSyn abgeleitete Peptid SeqgID2 entweder als Peptid-CLEC-Impfstoff verwendet (d. h.: SeqgID2 in Kombination mit den verschiedenen T-Helferzell-Epitopen, die über C-terminale Hydrazid-Linker an oxidiertes Pustulan (80 %;)) gekoppelt sind, oder es wurde ein herkömmliches Peptid-Konjugat unter Verwendung von SeqID3 hergestellt, das ein C-terminales Cys-

tein zur Kopplung an GMBS-aktiviertes KLH enthält.

Verwendeter Impfstoff:

T-ZellImpfstoff B-Zell-Epitop Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route ger

Pustulan

1 SeqID2 SeqI1D7 n.a. i1.d. (80%) Pustulan

2 SeqID2 SeqgID22 n.a. i1.d. (80%) Pustulan

3 SeqID2 SeqgID23 n.a. i1.d. (80%) Pustulan

4 SeqID2 SeqgID24 n.a. i1.d. (80%) Pustulan

5 SeqID2 SeqgID25 n.a. i1.d. (80%) Pustulan

6 SeqID2 SeqID26 n.a. i1.d. (80%) Pustulan

7 SeqID2 Seqg1D27 n.a. i1.d. (80%) Pustulan

8 SeqID2 SeqgID28 n.a. i1.d. (80%) Pustulan

9 SeqID2 SeqgID29 n.a. i1.d. (80%)

10 SeqgID3 KLH n.a. Alhydrogel sS.C.

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 5 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichungsart: 1i.d. für den CLEC-basierten Impfstoff und s.c. für den KLH-basierten Impfstoff (mit Alhydrogel

adjuvantiert). Die anschließende Immunantwort, die sich sowohl

gegen das injizierte Peptid (d.h. Pepl/SeqID3) als auch gegen das Zielprotein, d.h. rekombinantes humanes aSynuclein, richtet, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der dritten

Immunisierung entnommen wurde.

Ergebnisse:

Wie in Figur 9 dargestellt, waren alle 9 CLEC-Impfstoffe, die verschiedene T-Helferzell-Epitope und das KLH-Konjugat verwendeten, in der Lage, eine starke und spezifische Immunantwort sowohl gegen die injizierten Peptidanteile (SeqgID3, Figur 9A) als auch gegen das Zielprotein, rekombinantes aSynuclein (Figur 9B), hervorzurufen.

Alle T-Helfer-Epitope konnten ähnliche oder höhere Anti-Peptid-Titer als das herkömmliche SeqID3-KLH-Kon]ugat induzieren. Impfstoff 1 (der SeqID2 und SeqID/7 gekoppelt an Pustulan enthält) konnte beispielsweise eine 60 % höhere Reaktion auslösen als die KLH-Kontrolle, während Impfstoff 8 (der SegID28, ein gut bekanntes T-Helfer-Epitop, das speziell für die Anwendung bei Balb/c-Tieren geeignet ist, SeqID2 und Pustulan enthält) eine 5,5fach höhere Reaktion als die Kontrolle auslösen konnte. Selbst das promiskuitive T-Helfer-Epitop SeqID24 (abgeleitet von DiphterieToxin, ein schwaches T-Helfer-Epitop für Balb/c-Tiere, veröffentlicht in WO 2019/21355 Al) konnte eine nachhaltige Immunantwort auslösen, wenn auch schwächer als die KLH-Kontrolle.

In ähnlicher Weise konnten alle T-Helfer-Epitope ähnliche oder höhere Anti-Protein-Titer als das herkömmliche SeqID3-KLHKonjugat hervorrufen. Wichtig ist, dass Impfstoff 1 (der SeqID2 und SeqgID7 gekoppelt an Pustulan enthält) beispielsweise eine 2,5fach höhere Reaktion auslösen konnte als die KLH-Kontrolle, und Impfstoff 8 (der SegID28, ein gut bekanntes T-Helfer-Epitop, das speziell für die Anwendung bei Balb/c-Tieren geeignet ist, SeqID2 und Pustulan enthält) eine 3-fach höhere Reaktion als die Kontrolle auslösen konnte, was wiederum die Tatsache untermauert, dass Impfstoffe auf CLEC-Basis gemäß dieser Erfindung überlegene Anti-Target-Reaktionen auslösen können.

Das Beispiel zeigt auch, dass die Einführung einer zusätzlichen Cathepsin L-Spaltstelle in die gut beschriebenen T-HelferEpitope zu einer effizienteren Induktion von Immunantworten führt als bei herkömmlichen Impfstoffen und bei CLEC-basierten Impfstof-

fen ohne diese künstliche Sequenz.

So konnte SegqgID25, die modifizierte Variante des schwachen THelfer-Epitops SeqID24, die die Spaltstelle enthält, im Vergleich zum unmodifizierten Peptid eine 7,5-fach höhere Anti-Peptid- und eine 3,6-fach höhere Anti-Protein-Reaktion auslösen (Impfstoff 5 vs. Impfstoff 4). Darüber hinaus führte diese Veränderung auch zu einem 40%igen Anstieg der Anti-Protein-Titer im Vergleich zur KLHKontrolle. SeqID27, die mit der Cathepsin-L-Spaltstelle modifizierte Variante von SeqID26 (ein vom Masernvirus-Fusionsprotein abgeleitetes Epitop, das in der WO 2019/21355 Al offengelegt ist), konnte die Titer ebenfalls signifikant erhöhen, und zwar mit einem 1,8-fachen Anstieg der Anti-Peptid- und einem 3,2-fachen Anstieg der Anti-Protein-Titer im Vergleich zum SeqID26-CLEC-Impfstoff (d. h. Impfstoff 7 gegenüber Impfstoff 6). Impfstoff 7 löste auch eine 2,2-fach höhere Anti-Peptid-Antwort und eine 1,6-fach höhere AntiProtein-Antwort aus als die KLH-Kontrolle. SeqgID7-basierte CLECImpfstoffe induzieren auch höhere Anti-Protein-Titer (20 % Anstieg) als nicht modifizierte Varianten (z. B. SeqgID22), und beide Peptide führen zu einer ungefähren Verdoppelung der Anti-SeqID2Peptid- und Anti-Syn-Titer im Vergleich zur KLH-Kontrolle.

Die Hinzufügung der Cathepsin-Spaltstelle führt zur Bildung einer Peptidvariante mit einem zusätzlichen N (z. B.: am C-Terminus, das bei der Spaltung freigesetzt wird. Z.B.: SegqgID22, PADRE, wird als AKFVAAWTLKAAA freigesetzt, während SeqID7, modifiziertes PADRE, als AKFVAAWTLKAAA-N freigesetzt wird. Dieses N könnte sich auch negativ auf die weitere Verarbeitung und MHCII-Präsentation auswirken und somit die Wirksamkeit des jeweiligen Peptids verringern. Dieses Phänomen ist am Beispiel der sehr starken, von OVA abgeleiteten Epitope SeqgID28 und SeqID29 zu sehen. Das unmodifizierte Peptid löst sehr starke Immunantworten aus, während die modifizierte Variante einen um 75 % reduzierten Anti-Peptid- und einen um 98 % reduzierten Anti-Protein-Titer im Vergleich zur un-

modifizierten Variante hervorruft.

Beispiel 10: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konj]jugaten unter Verwendung von Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope: KLH

In diesem Beispiel wurde die Immunogenität von CLEC-basierten Kon]jugatimpfstoffen, die das bekannte Trägerprotein KLH enthalten, mit herkömmlichen KLH-Impfstoffen verglichen. Zu diesem Zweck

wurden zwei von aSyn abgeleitete Epitope (SeqID3 und SeqgID6) aus-

94 / 152

gewählt, die an GMBS-aktiviertes KLH gekoppelt wurden. AnschlieBend wurden Pep-KLH-Konjugate an reaktive Aldehyde von oxidiertem Pustulan unter Verwendung des BPMH-Vernetzers gekoppelt, um CLECbasierte Kon]ugatimpfstoffe mit KLH als Quelle für T-HelferzellEpitope zu bilden, die eine nachhaltige Immunantwort auslösen.

Verwendete Impfstoffe:

B-Zell- T-ZellCLEC Adjuvans Route Epitop Epitop/Träger Pustulan SegID3 KLH n.a. i1.d. (140%) SegID3 KLH n.a. n.a. i.d SeqgID3 KLH n.a. Alhydrogel sS.C. Pustulan SeqgID6 KLH n.a. i1.d. (80%) SeqgID6 KLH n.a. n.a. i1.d. SeqID6 KLH n.a. Alhydrogel sS.C.

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 20 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: 1i.d. für den CLEC-basierten Impfstoff und für den nicht adjuvantierten KLH-basierten Impfstoff und s.c. für den mit Alhydrogel adjuvantierten KLH-basierten Impfstoff) und die anschließende Immunantwort richtete sich sowohl gegen das injizierte Peptid (i.d. h. SegID3 und SeqID6) sowie gegen das Zielprotein, d. h. rekombinantes humanes aSynuclein, gerichtet ist, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der

dritten Immunisierung entnommen wurde.

Ergebnisse:

Wie in Figur 10A dargestellt, konnten alle sechs Impfstoffe, die KLH als Quelle für T-Helfer-Epitope verwendeten, eine starke und spezifische Immunantwort sowohl gegen die injizierten Peptidanteile (SeqgID3 und SegID6) als auch gegen das Zielprotein, rekombinantes aSynuclein, hervorrufen.

Die CLEC-Modifikation der KLH-Konjugate führte zu einer hochgradig überlegenen Immunantwort unter Verwendung beider Peptide, SegID3 bzw. SeqID6. SeqgID3+KLH+Pustulan konnte eine 2,3-mal höhere Anti-Peptid-Antwort auslösen als das mit Alhydrogel adjuvantierte SeqgID3+KLH und eine 14-mal höhere Antwort als nach 1.d. Verabrei-

chung von nicht-adjuvantem SegID3+KLH. In ähnlicher Weise waren

auch die Anti-Protein-Titer 8,5-fach erhöht (im Vergleich zu Alhydrogel-adjuviertem SeqID3+KLH) und 17-fach im Vergleich zu nicht-adjuviertem Material. SeqgID6+KLH+Pustulan war auch 2- (in). Peptid) bis 4,6-mal (aSyn) wirksamer als der ad]juvantierte SegID6+KLH und 8,7-mal (in). Peptid) bzw. 11-mal (aSyn) immunogener als der nicht-adjuvantierte SeqgID6+KLH-Impfstoff.

Neben einer allgemeinen Erhöhung der Immunogenität von CLECmodifizierten Impfstoffen zeigen die Ergebnisse auch, dass die erfindungsgemäße CLEC-Modifikation zu einer signifikanten Erhöhung der relativen Menge der induzierten Antikörper führt, die sich an das Zielmolekül, d. h. das Protein, binden, wodurch die Zielspezifität der anschließenden Immunreaktion deutlich erhöht wird. Dementsprechend ist die relative Menge an Antikörpern, die aSyn nachweisen (d. h. das Verhältnis der gesamten antiinjizierten Peptidtiter im Vergleich zu den spezifischen Anti-aSyn-Titern), bei den durch SegID3+KLH+Pustulan induzierten Reaktionen 3, 7-mal höher als bei den adjuvantierten SeqgID3+KLH und 2,2-mal höher als bei den adjuvantierten Konjugaten im Fall von SeqID6+KLH+Pustulan.

In einer zweiten Versuchsreihe wurden die gleichen Impfstoffe verwendet (alle Impfstoffe: 5 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: i.d. für den CLEC-basierten Impfstoff und s.c. für den KLHbasierten Impfstoff, der mit Alhydrogel adjuvantiert wurde) auf ihre Fähigkeit hin verglichen, trägerspezifische Antikörperreaktionen zu induzieren. Wie erwartet waren die herkömmlichen Impfstoffe auf der Basis von SeqgID3+ und SeqID6+KLH in der Lage, hohe Anti-KLH-Titer zu induzieren (SeqgID3+KLH: 1/2100 und SegID6+KLH: 1/7700), während die CLEC-basierten Impfstoffe auf der Basis von SeqgID3+KLH+Pustulan und SeqID6+KLH+Pustulan grundsätzlich nicht in der Lage waren, nachhaltige Anti-Träger-Antikörper zu induzieren. Die erzielten Titer lagen mit 1/150 für SegID3+KLH+Pustulan bzw. weniger als 1/100 für SeqID6+KLH+Pustulan nahe an der Nachweisgrenze, was eine neuartige, bisher unbeschriebene Optimierungsstrategie für Peptidkonjugat-Impfstoffe zur Erhöhung der zielspezifischen Titer bei gleichzeitiger Verringerung

unerwünschter Anti-Träger-Reaktionen darstellt.

Beispiel 11: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konj]jugaten unter

Verwendung von Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope: CRM197

In diesem Beispiel wurde die Immunogenität von CLEC-basierten Konj]jugatimpfstoffen, die das bekannte Trägerprotein CRM197 enthalten, mit herkömmlichen CRM197-Impfstoffen verglichen. Zu diesem Zweck wurde das von aSyn abgeleitete Epitop SeqgID6 an das Maleimidaktivierte CRM197 gekoppelt. Anschließend wurde das Konjugat SeqgID6+CRM197 mit Hilfe des heterobifunktionellen Linkers BPMH an aktiviertes Pustulan gekoppelt, um CLEC-basierte Konjugatimpfstoffe mit CRM197 als Quelle für T-Helferzell-Epitope zu bilden, die eine nachhaltige Immunantwort auslösen. Alternativ dazu wurden SeqgID5 (NH-NH2; SeqID5) und CRM197 unabhängig voneinander an aktiviertes Pustulan gekoppelt. Dies geschah durch Reaktion des Hydraziıds am C-Terminus von SeqID5 und über die in CRM197 vorhandenen

Lysine mit reaktiven Aldehyden auf aktiviertem Pustulan.

Verwendete Impfstoffe:

T-Zell- CLEC-KopB-Zell-Epitop Epitop/Trä- CLEC plung Adjuvans Route ger Pustulan als Kon]uSeqgID6 CRM197 n.a. i1.d. (80%) gat Pustulan unabhängig SeqgID5 CRM197 n.a. i1.d. (80%) SeqID6 CRM197 n.a. n.a. Alhydrogel sS.C.

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 20 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: 1i.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den CRM197-basierten Impfstoff, der mit Alhydrogel adjuvantiert ist). Die anschließende Immunantwort, die sich sowohl gegen das injizierte Peptid (d.h. SeqgID6) als auch gegen das Zielprotein, d.h. rekombinantes humanes aSynuklein sowie aSyn-Filament, richtet, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei

Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen wurde.

Ergebnisse:

Wie in Figur 11A dargestellt, konnten alle drei Impfstoffe, die CRM197 als Quelle für T-Helfer-Epitope verwenden, eine starke und spezifische Immunantwort sowohl gegen die injizierten Peptidanteile (SeqID6) als auch gegen das Zielprotein, rekombinantes

aSynuclein, hervorrufen.

Auch hier führte die CLEC-Modifikation der CRM197-Konjugate

zu einer höchst überlegenen Immunantwort. SeqID6+CRM197+Pustulan konnte eine 28-mal höhere Anti-Peptid-Reaktion auslösen als das mit Alhydrogel adjuvierte SeqgID6+CRM197. In ähnlicher Weise waren auch die Antiprotein-Titer gegen rekombinantes aSyn 15-fach erhöht (im Vergleich zu Alhydrogel-adjuviertem SeqID6+CRM197) und die Titer gegen die aggregierte Form von aSyn, die aSyn-Filamente, 11fach erhöht. Der Impfstoff, der durch die unabhängige Kopplung von SeqID5 und CRM197 an Pustulan hergestellt wurde, induzierte ebenfalls 1,7mal höhere injizierbare Peptid-Titer als herkömmliches, mit Alhydrogel adjuviertes SeqID6+CRM197,. Die Reaktivität gegenüber rekombinantem aSyn war ebenfalls um das 6,6-fache erhöht, und die Antifilament-Reaktionen waren um das 4,25-fache gesteigert.

Der Vergleich der trägerspezifischen Antikörperreaktionen ergab, dass herkömmliche Impfstoffe auf der Basis von SeqgqID6+CRM197 hohe Anti-CRM197-Titer (1/6600) induzieren konnten, während der CLEC-basierte Impfstoff auf der Basis von SeqgID6+CRM197+Pustulan im Grunde nicht in der Lage war, nachhaltige Anti-Träger-Antikörper zu induzieren. Die erzielten Titer lagen mit weniger als 1/100 für SeqID6+CRM197+Pustulan jeweils nahe der Nachweisgrenze.

Die Experimente zeigen also, dass die CLEC-Modifikation herkömmlicher Peptid-Protein-Kon]ugate die Entwicklung einer AntiTräger-Antwort erheblich beeinträchtigt und zu einer stark verbesserten Zielspezifität der anschließenden Immunantwort führt. Dies stellt eine neuartige, noch nie dagewesene Strategie zur Optimierung der derzeitigen Konjugat-Impfstoffe dar, die auf Trägerproteinen wie KLH, CRM197 oder anderen aufbauen.

Die unabhängige Kopplung von CRM197 und SeqID5 an Pustulan führt zu einer nachhaltigen Reaktion gegen die auf CRM197 vorhandenen B-Zell-Epitope, wenn auch mit einer geringeren Rate als bei konventionellen, nicht-CLEC-modifizierten Kon]ugaten (Titer ca. 1/400). Dies zeigt, dass das CLEC-Grundgerüst gemäß der vorliegenden Erfindung auch geeignet ist, B-Zell-Epitope von CLEC-gekoppelten immunogenen Proteinen für die Verwendung als Impfstoff

bereitzustellen.

Beispiel 12: Analyse der Selektivität von Immunantworten, die

durch CLEC-basierte Impfstoffe in vivo ausgelöst werden

Die Aggregation des präsynaptischen Proteins aSyn wird als Hauptverursacher von Synucleinopathien wie der Parkinson-Krankheit angesehen, während monomeres, nicht aggregiertes aSyn wichtige neuronale Funktionen hat. Man geht daher davon aus, dass es für die Behandlung von Synucleinopathien, z. B. durch aktive oder passive Immuntherapie, von entscheidender Bedeutung ist, das aggregierte aSyn zu reduzieren bzw. zu entfernen, ohne den verfügbaren Pool an nicht-aggregierten Molekülen zu beeinträchtigen.

Zur weiteren Charakterisierung der Immunreaktionen, die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelöst werden, die die aSyn-Zielpeptide SeqID2 und SeqgID3 sowie SeqID5 und SeqID6 enthalten (im Vergleich zu herkömmlichen Impfstoffen mit Peptidträgern, d.h., SegID3+KLH und SeqID6+CRM197), wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um die Selektivität der daraus resultierenden Immunreaktion gegenüber zwei verschiedenen Formen des präsynaptischen Proteins aSyn zu untersuchen : nicht aggregiertes, haupt-

sächlich monomeres aSyn sowie aggregierte aSyn-Filamente.

Verwendete Impfstoffe:

T-ZellB-Zell-Epitop Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route ger Pustulan SeqID2 SeqI1D7 n.a. i1.d. (80%) Pustulan SegID3 KLH n.a. i1.d. (80%) SeqgID3 KLH n.a. Alhydrogel sS.C. Pustulan SeqgID5 SeqI1D7 n.a. i1.d. (80%) Pustulan SeqgID6 CRM197 n.a. i1.d. (80%) SeqID6 CRM197 n.a. Alhydrogel sS.C.

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 20 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichungsart: 1i.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den KLH- und CRM197-basierten Impfstoff, der mit Alhydrogel ad]juvantiert ist) und die anschließende Immunantwort gegen das Zielprotein, d.h. rekombinantes humanes aSynuclein

sowie aSyn-Filament, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das

zwei Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen wurde. Die Plasmaproben wurden einem aSyn-spezifischen Inhibitions-ELISA un-

terzogen und die IC50-Werte wurden bestimmt.

Ergebnisse:

Kurz gesagt, alle CLEC-basierten Kon]ugate, die in diesem Experiment verwendet wurden, zeigen im Vergleich zu den herkömmlichen Peptidkon]ugat-Impfstoffen (d. h. SeqgID3+KLH und SegID6+CRM, siehe Figur 12) eine üÜüberlegene Immunogenität und aSynuclein-Aggregat-spezifische Zielselektivität.

Herkömmliche Peptidkon]ugat-Impfstoffe können eine Antikörperreaktion mit leicht erhöhter Selektivität für aSyn-Aggregate (d.h. Filamente) im Vergleich zu monomerem/rekombinantem aSyn hervorrufen. SegID3+KLH, das mit Alhydrogel adjuvantiert wurde, löste eine Immunantwort mit 9-fach höherer Selektivität für aSyn-Aggregate im Vergleich zu rekombinantem aSyn aus. SeqID6+CRM197, das mit Alhydrogel ad]uvantiert wurde, löste eine weniger selektive Immunantwort aus, die eine 3,5-fach höhere Selektivität für Aggregate im Vergleich zu hauptsächlich monomerem, rekombinantem aSyn erreichte.

Im Gegensatz dazu zeichneten sich die durch CLEC-basierte Peptidkonjugatimpfstoffe induzierten Antikörper durch eine mehrfach höhere selektive Bindung aus als KLH- oder CRM197-Konjugatimpfstoffe. Das durch SeqID2+SegID7+Pustulan und SeqID5+SeqgID7/+Pustulan induzierte Plasma zeigt eine ca. 97-fache (d.h. 14fach höhere als SeqgID3-KLH) und 50-fache Aggregatselektivität (d.h. 14-fach höhere als der Vergleichsimpfstoff SeqID6+CRM, Alhydrogel). SeqID3+KLH+Pustulan und SeqID6+CRM197+Pustulan waren ähnlich selektiv und erreichten eine 40- (d. h. 5-fach höhere als SegID3-KLH) bzw. 50-fache (d. h. 14-fach höhere als SeqID6+CRM) höhere Selektivität für aSyn-Aggregate.

Die Experimente zeigen, dass die CLEC-Modifikation von Peptidkon]ugaten sowie von Peptid-Protein-Konjugaten zu einer stark verbesserten Zielspezifität der daraus resultierenden Immunantwort führt und somit eine neuartige, noch nie dagewesene Strategie zur Optimierung des derzeitigen Stands der Technik bei Konjugatimpfstoffen darstellt.

Beispiel 13: Analyse der Avidität und Affinität von Immunreaktio-

nen, die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelöst werden

Zur weiteren Charakterisierung der Immunreaktionen, die durch CLEC-basierte Impfstoffe mit den aSyn-Zielpeptiden SeqgID2 und SegID3 sowie SeqgID5 und SeqgID6 ausgelöst werden, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um die Avidität und Affinität der

gegen aSyn ausgelösten Antikörper zu analysieren.

Verwendete Impfstoffe:

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 20 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichungsart: 1i.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den KLH- und CRM197-basierten Impfstoff, der mit Alhydrogel adjuvantiert ist) und die darauf folgende Immunantwort gegen das Zielprotein, d.h. rekombinantes humanes aSyn sowie aSyn-Filament, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach jeder Immunisierung entnommen wurde. Um die Avidität der induzierten Abs gegenüber rekombinantem aSyn zu bestimmen, wurde eine Variation des Standard-ELISA-Tests verwendet, bei dem Wiederholungsvertiefungen, die an Antigene gebundene Antikörper enthielten, steigenden Konzentrationen von chaotropen ThiocyanatIonen ausgesetzt wurden. Die Resistenz gegenüber der ThiocyanatElution wurde als Maß für die Avidität verwendet, und ein Index (Aviditätsindex), der 50 % der effektiven Antikörperbindung darstellt, wurde zum Vergleich der Plasmaproben (sowohl zwischen den Behandlungsgruppen als auch zwischen den Zeitpunkten) verwendet. Darüber hinaus wurde der ka Wert für aSyn-Filamente (Antikör-

peraffinität zu aSyn-Filamenten) der Antikörper 2 Wochen nach der

letzten Immunisierung ebenfalls auf der Grundlage eines aSyn-Konkurrenz-ELISA bestimmt.

Ergebnisse:

Wie aus Figur 13 hervorgeht, zeigte das konventionelle Konjugat SeqID3+KLH (mit Alhydrogel adjuvantiert) nur eine begrenzte Aviditätsreifung gegenüber der aSyn-Bindung, wenn man Immunproben vergleicht, die zwei Wochen nach der zweiten (T2) oder zwei Wochen nach der dritten Immunisierung gewonnen wurden (Aviditätsreifung (AM, Vergleich der ICso Werte für T2 und T3 Proben: 1,1)). Im Gegensatz dazu konnten CLEC-basierte Impfstoffe wie SegID2+SeqgID7+Pustulan eine starke Reifung der Anti-aSyn-Antwort auslösen, was durch einen AI von 2,2 in Verbindung mit einem starken Anstieg der Avidität von T3-Proben gegenüber aSynuclein angezeigt wird. Proben von Tieren, die mit SeqgID3+KLH+Pustulan immunisiert wurden, zeigten ebenfalls eine deutlich höhere Avidität und eine leicht erhöhte Reifung im Vergleich zu SeqID3+KLH allein.

Auch die Avidität der gegen aSyn-Proteine ausgelösten Immunreaktion war bei den Impfstoffen SeqID5+SeqgID7/+Pustulan und SeqID6+CRM197+Pustulan signifikant höher als beim Referenzimpfstoff SeqID6+CRM197 (analysiert bei T3; d. h. es waren 3-3,8-mal höhere chaotrope Salzkonzentrationen erforderlich, um die Bindung zu verringern), und auch die Affinitätsreifung war beim Vergleich der T2- bzw. T3-Werte erhöht. SeqID6+CRM197 führte nicht zu einem Anstieg der Avidität gegenüber aSyn im Vergleich zwischen T2 und T3, während die beiden CLEC-basierten Impfstoffe zu einem starken Anstieg der aSyn-spezifischen Bindung im Vergleich zwischen T2 und T3 führten.

Experimente zur Quantifizierung des aSyn-Filaments k, für die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelöste Immunreaktion sowie für konventionelle Vergleichsimpfstoffe ergaben eine hochsignifikante Steigerung der Gesamtaffinität der durch CLEC-basierte Impfstoffe induzierten Antikörper für aSyn (siehe Figur 14). Die Konjugate SegID2+SegID7+Pustulan und SeqID3+KLH+Pustulan zeigten eine 6-9fach höhere Affinität (d. h., Kd: 110nM und 160nM im Vergleich zu einem k» von 1mM) als der mit Alhydrogel adjuvantierte Referenzimpfstoff SeqID3+KLH. Die Konjugate SeqID5+SeqgID7+Pustulan und SegID6+CRM+Pustulan zeigen 12-15-mal bessere Kd-Werte als die mit Alhydrogel ad]uvantierte Referenzkontrolle SeqgID6+CRM197 (d. h., Kd: 50nM und 60nM im Vergleich zu einem k), von 750nM).

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Die Experimente zeigen daher, dass die CLEC-Modifikation von Peptidkonjugaten sowie von Peptid-Protein-Kon]jugaten zu einer stark verbesserten Zielspezifität und Affinität der daraus resultierenden Immunantwort führt und somit eine neuartige, noch nie dagewesene Strategie zur Optimierung des derzeitigen Stands der

Technik bei Kon]ugatimpfstoffen darstellt.

Beispiel 14: Analyse der In-vitro-Funktionalität von Immunantworten, die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelöst werden

Um zu untersuchen, ob aSyn-spezifische Antikörper, die durch CLEC-basierte Impfstoffe (die die aSyn-Zielpeptide SeqID2/3 und SeqgID5/6 enthalten) hervorgerufen werden, biologisch aktiv sind, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, in denen die Fähigkeit der Antikörper untersucht wurde, die aSyn-Aggregation in

vitro zu hemmen.

Verwendete Impfstoffe:

T-ZellB-Zell-Epitop Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route ger Pustulan SeqId2 SeqI1D7 n.a. i1.d. (80%) SeqgID3 KLH n.a. Alhydrogel sS.C. Pustulan SeqgID5 SeqI1D7 n.a. i1.d. (80%) Pustulan SeqgID6 CRM197 n.a. i1.d. (80%) SeqID6 CRM197 n.a. Alhydrogel sS.C.

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 20 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: 1i.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den KLH- und CRM197-basierten, mit Alhydrogel adjuvierten Impfstoff). Proben von Mäuseplasma, die zwei Wochen nach Jeder Immunisierung entnommen wurden, sowie entsprechende Kontrollproben (z. B. nicht aSyn-bindende Antikörper oder vor der Immunisierung gewonnenes Plasma) wurden auf ihre Fähigkeit zur

Aggregationshemmung in vitro untersucht.

Ergebnisse:

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Wie in Figur 15A dargestellt, hatten Kontrollantikörper oder Plasma, das den Tieren vor der Immunisierung entnommen wurde, keine signifikanten Auswirkungen auf die Aggregationskinetik von aSyn, was die Spezifität des Tests bestätigt. Herkömmliche SeqID3+KLHKonjugate (mit Alhydrogel adjuvantiert) konnten die aSyn-Aggregation signifikant reduzieren, was durch einen um 40% verringerten Steigungswert angezeigt wird (nur aSyn-Monomer: 100%; KLH: 60%). Die SegID2+SeqgID7+Pustulan-impfstoffinduzierten Abs hemmten die aSyn-Aggregation stark, was durch einen um 85 % verringerten Steigungswert (nur aSyn-Monomer: 100 %; KLH: 15 %) in diesem Assay angezeigt wird, was auf eine deutlich höhere Hemmkapazität im Vergleich zu den klassischen impfstoffinduzierten Abs hinweist.

Impfstoffinduzierte Antikörper auf der Basis von SeqID5+SegID7+Pustulan und SeqgID6+CRM+Pustulan zeigen eine 86-92%ige Hemmung der Aggregatbildung ausgehend von rec. aSyn (geringer Gehalt an Aggregaten) und eine 67-82%ige Hemmung der Aggregatbildung ausgehend von vorgeformten Fibrillen (= bona fide Aggregate) im Vergleich zu 68% und 57% für den Referenzimpfstoff SeqID6+CRM, Alhydrogel-induzierte Antikörper (siehe Figur 15B).

Beispiel 15: Analyse der Auswirkungen der Art der Immunisierung auf die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelösten Immunreaktionen

Es wurde eine Reihe von Immunisierungen durchgeführt, um die i.d.-Verabreichung mit alternativen Verabreichungswegen wie sub-

kutan (s.c.) und intra-muskulär (i.m.) zu vergleichen.

Verwendete Impfstoffe:

T-ZellB-Zell-Epitop Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route ger Pustulan SeqID2 SeqI1D7 n.a. i1.d. (80%) Pustulan SeqID2 SeqI1D7 n.a. sS.C. (80%) Pustulan SeqID2 SeqI1D7 n.a. i1.m

(80%)

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 1ug, 5ug und 20ug aSyn-

Zielpeptid/Dosis) und die anschließende Immunantwort gegen das

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in])izierte Peptid und das Zielprotein, d.h. rekombinantes humanes aSynuclein sowie aSyn-Filament, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen

wurde.

Ergebnisse:

Die Tabellen 1 und 2 sowie Figur 16 zeigen, dass SegqID2SegID7-Pustulan-Impfstoffe, die i.m. oder s.c. verabreicht wurden, hohe Immunantworten sowohl gegen das injizierte Peptid (Figur 16A) als auch gegen anti-aSyn (Figur 16B) hervorrufen konnten. Die erreichten Maximaltiter waren bei allen getesteten Dosen deutlich niedriger als bei der 1.d.-Applikation. Die s.c.-Applikation zeigte ein ähnliches Dosis-Wirkungs-Verhalten wie die 1.d.-Applikation, während die i.m.-Applikation keine signifikanten Unterschiede zwischen 5 und 20 ug aufwies, was auf eine Sättigung bei diesen erreichten Dosen/Applikationsmengen hindeutet. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Reaktivität gegen monomeres bzw. aggregiertes aSyn erzielt. Diese Ergebnisse belegen die hohe Selektivität des CLEC-Grundgerüsts, wie es in dieser Erfindung für die Anwendung in der Haut im Gegensatz zu anderen Wegen/Geweben vor-

gestellt wird.

1ug SpPg 201g i.d. 16.000 83.000 140.000 s.C. 1000 2.000 12.000 i.m. 4.000 16.000 15.000

Tabelle: Anti-SegID2/3-induzierte Antikörperreaktion nach Verab-

reichung des WISIT-Impfstoffs über verschiedene Wege

1ug SpPg 201g i.d. 2.000 5.000 10.000 s.C. 100 1.000 4.000 i.m. 2.000 2.000 5.000

Tabelle: Anti-aSyn-induzierte Antikörperreaktion nach Verabrei-

chung des WISIT-Impfstoffs über verschiedene Wege Beispiel 16: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konj]jugaten mit

Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope: unterschiedliche Konj]ugat/CLEC-Verhältnisse

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In diesem Beispiel wurde die Immunogenität von CLEC-basierten Konj]jugatimpfstoffen mit dem bekannten Trägerprotein CRM197 unter Verwendung verschiedener Peptid-CRM/CLEC-Verhältnisse verglichen. Zu diesem Zweck wurde das von aSyn abgeleitete Epitop SeqgID6 an das Maleimid-aktivierte CRM197 gekoppelt. Anschließend wurde das SegID6-CRM197-Konjugat mit dem heterobifunktionellen Linker BPMH in unterschiedlichen Gewichtsverhältnissen an aktiviertes Pustulan gekoppelt, um CLEC-basierte Kon]ugatimpfstoffe mit CRM197 als Quelle für T-Helferzell-Epitope zu bilden, die eine nachhaltige

Immunantwort auslösen.

Verwendete Impfstoffe:

B-Zell- T-Zell- VerhältCLEC Adjuvans Route Epitop Epitop/Träger nis (w/w) Pustulan 1/1 SeqgID6 CRM197 n.a. i1.d. (80%) Pustulan 1/2,5 SeqgID6 CRM197 n.a. i1.d. (80%) Pustulan 1/5 SeqgID6 CRM197 n.a. i1.d. (80%) Pustulan 1/10 SeqgID6 CRM197 n.a. i1.d. (80%) Pustulan 1/20 SeqgID6 CRM197 n.a. i1.d.

(80%)

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 5ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: 1.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe) und die darauf folgende Immunantwort, die sich sowohl gegen das injizierte Peptid (d.h. SeqID6) als auch gegen das Zielprotein, d.h. rekombinantes humanes aSynuclein sowie aSyn-Filament, richtete, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der

dritten Immunisierung entnommen wurde.

Ergebnisse:

Wie Figur 17 zeigt, konnten alle fünf Impfstoffe, die CRM197 als Quelle für T-Helfer-Epitope verwenden, eine starke und spezifische Immunantwort sowohl gegen die injizierten Peptidanteile (SeqID6) als auch gegen das Zielprotein, rekombinantes

aSynuclein, hervorrufen.

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Die CLEC-Modifikation der CRM197-Konjugate führte bei allen getesteten Gew./Gew. Konjugat/CLEC-Verhältnissen zu einer hocheffizienten Immunantwort. SeqID6-CRM197-Pustulan (Gew./Gew. 1/10) lieferte im Vergleich zu den anderen getesteten Varianten die höchsten anti-aSyn-spezifischen Immunantworten. Somit sind SeqID6CRM197-Konjugate mit mittleren/hohen Konj]ugat/CLEC-Verhältnissen besonders geeignet, um optimale Immunantworten auszulösen (z. B.: 1/5, 1/10 und 1/20).

Die Experimente zeigen also, dass die CLEC-Modifikation herkömmlicher Peptid-Protein-Kon]jugate zu einer starken Zielspezifität der daraus resultierenden Immunantwort führt und damit eine neue, noch nie dagewesene Strategie zur Optimierung von KonjugatImpfstoffen bietet, die auf Trägerproteinen wie KLH, CRM197 oder

anderen basieren.

Beispiel 17: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konj]jugaten und Peptidkon]jugaten unter Verwendung von Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope - aSyn N-Terminus (aal-10)

In diesem Beispiel wurde untersucht, ob CLEC-basierte Konjugatimpfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, im Vergleich zu entsprechenden Peptidkonjugaten, die Trägerproteine nach dem Stand der Technik als Quelle für T-Zell-Epitope verwenden, bessere Immunantworten gegen aSyn-Aggregate zu induzieren.

Daher wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, bei denen zwei Konjugate verglichen wurden, die beide ein Epitop enthielten, das als aSyn-Targeting-Epitop geeignet war. Die

Experimente konnten die Immunreaktion gegen das injizierte Peptid und das aSyn-Protein sowie die Selektivität der daraufhin ausgelösten Immunreaktion gegenüber zwei verschiedenen Formen des präsynaptischen Proteins aSyn nachweisen: nicht aggregiertes, hauptsächlich monomeres aSyn sowie aggregierte aSyn-Filamente. Weihofen et al. (2019, aal-10 als Epitop von Cinpanemab) und WO2016/062720 (aal-8 als Epitop in einem VLP-basierten Immuntherapeutikum) schlagen beispielsweise die N-terminale aSyn-Sequenz, die sich von der Position aal-10 ableitet, als potenziell geeignetes Epitop für eine aSyn-gerichtete Immuntherapie vor. Um festzustellen, ob die CLEC-Modifikation tatsächlich zu einer besseren Immunantwort führt, haben wir daher einen CLEC-basierten Impfstoff, der die aSyn-Sequenz aal-8 enthält (SegID12-SeqID7/-

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Pustulan), mit dem entsprechenden konventionellen Peptid-KLH-Impfstoff (SegID13-KLH, adjuvant. mit Alum) verglichen.

Verwendete Impfstoffe:

T-ZellB-Zell- . . . Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route Epitop ger Pustulan , SeqgID12 SeqI1ID7 n.a. i1.d. (80%) SeqgID13 KLH na Alum i.d.

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 5 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: 1i.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den mit Alhydrogel adjuvantierten KLH-basierten Impfstoff) und die darauf folgende Immunantwort gegen das injizierte Peptid und das Zielprotein mittels ELISA und EC50-Werten bestimmt. Um die Selektivität der Immunantwort zu bewerten, wurden die Plasmaproben außerdem einem aSyn-spezifischen Hemmungs-ELISA unterzo-

gen und als Prozentsatz der maximalen Bindung ausgedrückt.

Ergebnisse:

Der in diesem Experiment verwendete CLEC-basierte Konjugatimpfstoff (SeqgID12-SegID7-Pus), der auf den N-Terminus von aSyn abzielt, zeigt eine bessere Immunogenität gegen das aSyn-Protein als die konventionellen Peptid-Kon]jugatimpfstoffe (d. h. SeqgID13KLH, siehe Figur 18A). Der CLEC-basierte Impfstoff induziert einen 1,8-fachen Anstieg der Anti-ASyn-Titer und gleichzeitig einen 3fachen Anstieg des Verhältnisses der Anti-Peptid- zur Anti-Protein-Reaktion im Vergleich zur Vergleichsgruppe. Dies untermauert nachdrücklich die Lehre dieser Erfindung, dass eine CLEC-Modifikation zu einer besseren Immunreaktion führt als vergleichbare konventionelle Impfstoffe.

Darüber hinaus induziert der herkömmliche Peptid-KLH-Konjugat-Impfstoff eine Antikörperreaktion mit stark erhöhter Selektivität (ca. 10-fach) für aSyn-Monomere im Vergleich zu Aggregaten (d. h. Filamenten, siehe Figur 18B). Im Gegensatz zu diesem Ergebnis und sehr überraschend führt das CLEC-basierte Konjugat zu

einer völlig anderen Selektivität: SeqgID12-SegID7-Pustulan indu-

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ziert Antikörper mit einer signifikant, ca. 10-fach höheren Selektivität für aSyn-Aggregate im Vergleich zu rekombinantem aSyn, wodurch sich das Profil der induzierten Antikörper vollständig ändert (siehe Figur 18B).

Die Experimente zeigen also, dass herkömmliche Peptidimpfstoffe mit aSyn aal-8 weniger geeignet sind, um eine effiziente und selektive Immunantwort in vivo hervorzurufen, was darauf hindeutet, dass dieses Epitop nicht für eine aggregatselektive Immuntherapie geeignet ist. Wichtig ist, dass die Ergebnisse auch zeigen, dass die CLEC-Modifikation von Peptidkonjugaten zu einer stark verbesserten Zielspezifität der daraus resultierenden Immunreaktion sowie zu einer veränderten Selektivität gegenüber Aggregaten führt, wodurch ein neuartiger, noch nie dagewesener Kon-

Jugatimpfstoff gegen aSyn entsteht.

Beispiel 18: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konj]jugaten und Peptidkon]jugaten unter Verwendung von Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope - aSyn aal100-108

Hier wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, in denen zwei Kon]ugate verglichen wurden, die beide ein Epitop enthielten, das als aSyn-Targeting-Epitop geeignet erschien. Dabei wurde die Immunantwort gegen das injizierte Peptid und das aSyn-Protein sowie die Selektivität der daraufhin ausgelösten Immunantwort gegenüber zwei verschiedenen Formen des präsynaptischen Proteins aSyn untersucht: nicht aggregiertes, hauptsächlich monomeres aSyn sowie aggregierte aSyn-Filamente.

So wird in WO 2011/020133 und WO02016/062720 die aSyn-Sequenz an der Position aal00-108/109 (entweder als native Sequenz oder als Mimotop, d. h. 100-108) als potenziell geeignetes Epitop für eine auf aSyn zielende Immuntherapie vorgeschlagen. Um festzustellen, ob die CLEC-Modifikation tatsächlich zu einer besseren Immunantwort unter Verwendung dieser Epitopregion führt, haben wir daher einen CLEC-basierten Impfstoff, der aSyn aal100-108 enthält (SegID16-SegID7-Pustulan), mit dem entsprechenden konventionellen Peptid-KLH-Impfstoff (SeqgID17-KLH, adjuvant mit Alum) verglichen.

Verwendete Impfstoffe:

T-ZellB-Zell- . . . Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route Epitop ger

109 / 152

Pustulan , SeqID16 SeqI1ID7 (802) n.a. i1.d.

SeqgID17 KLH na Alum i.d.

gen und als Prozentsatz der maximalen Bindung ausgedrückt.

Ergebnisse:

Der in diesem Experiment verwendete, auf CLEC basierende KonJugatimpfstoff gegen aSyn (SeqIDl16-SeqgID7-Pus) zeigt insgesamt eine sehr geringe Anti-aSyn-Protein-Antwort, die auch im Vergleich zu den herkömmlichen Peptid-Konjugatimpfstoffen (d. h. SeqgID13KLH, siehe Figur 19A) geringer ist. Der herkömmliche Impfstoff induziert eine Immunantwort, die durch einen 2,1-fachen Anstieg der Anti-aSyn-Titer gekennzeichnet ist, aber gleichzeitig einen 2fachen Rückgang des Verhältnisses von Anti-Peptid/Antiprotein-Titern im Vergleich zum CLEC-basierten Impfstoff. Letzteres Ergebnis unterstützt die Lehre dieser Erfindung, dass die CLEC-Modifikation zu einer überlegenen Anti-Target-Protein-Antwort führt, selbst im Falle einer insgesamt geringeren Immunogenität als bei ähnlichen konventionellen Impfstoffen.

Darüber hinaus sind beide Impfstoffe, das konventionelle Peptidkon]ugat und der CLEC-basierte Impfstoff, weniger geeignet, eine selektive Immunantwort auszulösen (siehe Figur 19B). Die vorliegenden Experimente zeigen also, dass CLEC-basierte und herkömmliche Peptidimpfstoffe, die auf die Region aal00-108 abzielen, weniger geeignet sind, um eine effiziente und selektive Immunantwort in vivo hervorzurufen, was darauf hindeutet, dass dieses Epitop möglicherweise nicht die optimale Wahl für eine aggregats-

elektive Immuntherapie gemäß dieser Erfindung ist.

Beispiel 19: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konj]jugaten und Peptidkon]jugaten unter Verwendung von Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope - aSyn aa91-100

In diesem Beispiel wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, bei denen zwei Kon]ugate verglichen wurden, die beide ein Epitop enthielten, von dem man annahm, dass es sich als aSynTargeting-Epitop eignet, indem man die Immunantwort analysierte, die gegen das injizierte Peptid und das aSyn-Protein ausgelöst wurde.

Die Studie US 2014/0377271 Al legt beispielsweise nahe, dass das Epitop aa91-99 bei Morbus-Parkinson-Patienten als Autoepitop fungiert und daher ein potenziell geeignetes Epitop für eine auf aSyn ausgerichtete Immuntherapie sein sollte. Um festzustellen, ob die CLEC-Modifikation tatsächlich zu einer besseren Immunantwort auf dieses Epitop führt, haben wir daher einen CLEC-basierten Impfstoff, der aSyn aa91-100 enthält (SeqID14-SeqgID7-Pustulan), mit dem entsprechenden konventionellen Peptid-KLH-Impfstoff (SegID15-KLH adjuvantiert mit Alum) verglichen.

Verwendete Impfstoffe:

T-ZellB-Zell- . . . Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route Epitop ger Pustulan , SeqID14 SeqI1ID7 n.a. i1.d. (80%) SeqgID15 KLH na Alum i.d.

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 5 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: 1i.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den mit Alhydrogel adjuvantierten KLH-basierten Impfstoff) und die darauf folgende Immunantwort gegen das injizierte Peptid und das Zielprotein aSyn mittels ELISA und EC50-Werten be-

stimmt.

Ergebnisse:

Überraschenderweise induzierten beide Impfstoffe relevante Anti-Peptid-Titer, waren aber weniger erfolgreich bei der Induktion nachweisbarer Anti-aSyn-Protein-Titer (siehe Figur 20).

Die vorliegenden Experimente zeigen also, dass CLEC-basierte und

herkömmliche Peptidimpfstoffe, die auf die Region aa91-100 abzielen, weniger geeignet sind, um eine effiziente und selektive Immunantwort in vivo hervorzurufen, was darauf hindeutet, dass dieses Epitop möglicherweise nicht die optimale Wahl für eine aggre-

gierte selektive Immuntherapie gemäß dieser Erfindung ist.

Beispiel 20: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konj]jugaten und Peptidkon]jugaten unter Verwendung von Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope - aSyn C-terminale Region aal31-140

In diesem Beispiel wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, bei denen zwei Kon]ugate verglichen wurden, die beide ein Epitop enthielten, von dem man annahm, dass es sich als aSynTargeting-Epitop eignet, indem man die Immunantwort analysierte, die gegen das injizierte Peptid und das aSyn-Protein ausgelöst wurde. Darüber hinaus wurde die Selektivität der daraufhin ausgelösten Immunreaktion gegenüber zwei verschiedenen Formen des präsynaptischen Proteins aSyn untersucht. So schlagen beispielsweise US 2015/0232524 A1l und WO 2016/062720 Al die C-terminale aSyn-Sequenz aus den Positionen aa126-140 und 131-140 als potenziell geeignetes Epitop für eine auf aSsyn zielende Immuntherapie vor. Um festzustellen, ob die CLECModifikation tatsächlich zu einer besseren Immunantwort führt, haben wir daher einen CLEC-basierten Impfstoff, der aSyn aal31140 enthält (SeqgID20-SegID7-Pustulan), mit dem entsprechenden konventionellen Peptid-KLH-Impfstoff (SegID21-KLH, adjuvant mit Alum)

verglichen.

Verwendete Impfstoffe:

T-ZellB-Zell- . . . Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route Epitop ger Pustulan , SeqID20 SeqI1ID7 n.a. i1.d. (80%) SeqgID21 KLH na Alum i.d.

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 5 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: 1i.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den mit Alhydrogel adjuvantierten KLH-basierten Impf-

stoff) und die darauf folgende Immunantwort gegen das injizierte

Peptid und das Zielprotein mittels ELISA und EC50-Werten bestimmt. Um die Selektivität der Immunantwort zu bewerten, wurden die Plasmaproben außerdem einem aSyn-spezifischen Hemmungs-ELISA unterzo-

gen und als Prozentsatz der maximalen Bindung ausgedrückt.

Ergebnisse:

Der in diesem Experiment verwendete CLEC-basierte Konjugatimpfstoff gegen aSyn (SeqID20-SeqgID7-Pus) zeigt eine insgesamt geringere Anti-aSyn-Protein-Antwort im Vergleich zu den herkömmlichen Peptid-Konjugatimpfstoffen (d. h. SegID21-KLH, siehe Figur 21A). Der herkömmliche Impfstoff induziert eine Immunreaktion, die durch einen 1,8-fachen Anstieg der Anti-aSyn-Titer gekennzeichnet ist, während das Verhältnis zwischen Anti-Peptid- und Anti-Protein-Titern um 45 % geringer ist als bei dem CLEC-basierten Impfstoff. Letzteres Ergebnis untermauert die Lehre dieser Erfindung, dass eine CLEC-Modifikation zu einer überlegenen Anti-ZielproteinAntwort führt, selbst wenn die Immunogenität insgesamt geringer ist als bei ähnlichen herkömmlichen Impfstoffen.

Darüber hinaus sind die herkömmlichen Peptidkon]ugate weniger geeignet, eine selektive Immunantwort auf Aggregate auszulösen (siehe Figur 4B). Im Gegensatz dazu ruft der CLEC-basierte Impfstoff Antikörper mit einer ca. 10-fach erhöhten Selektivität für monomeres aSyn auf Kosten von aggregiertem aSyn hervor (siehe Figur 21B). Die vorliegenden Experimente zeigen also, dass CLEC-basierte und herkömmliche Peptidimpfstoffe, die auf die Region aal31-140 abzielen, weniger geeignet sind, um eine effiziente und selektive Immunantwort gegen aggregiertes aSyn in vivo hervorzurufen, was darauf hindeutet, dass dieses Epitop möglicherweise nicht die optimale Wahl für eine aggregatselektive Immuntherapie gemäß der

vorliegenden Erfindung ist.

Beispiel 21: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konj]jugaten und Peptidkonjugaten unter Verwendung von Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope - aSyn C-terminale Region aal03-135

In diesem Beispiel wurde untersucht, ob CLEC-basierte Konjugatimpfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu entsprechenden Peptidkon]ugaten, die Trägerproteine nach dem Stand der Technik als Quelle für T-Zell-Epitope verwenden, bessere Im-

munantworten gegen aSyn hervorrufen können.

Daher wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, in denen verschiedene Konj]jugate verglichen wurden, die von einer Epitopregion abgeleitet wurden, die als aSyn-Zielepitop geeignet ist. Diese Experimente konnten die Immunreaktion gegen das injizierte Peptid und das aSyn-Protein sowie die Selektivität der daraufhin ausgelösten Immunreaktion gegenüber zwei verschiedenen Formen des präsynaptischen Proteins aSyn nachweisen: nicht aggregiertes, hauptsächlich monomeres aSyn sowie aggregierte aSyn-Filamente.

Mehrere Studien deuten darauf hin, dass die C-terminale aSynSequenz ab Position aal03-135 ein potenziell geeignetes Epitop für eine zielgerichtete aSyn-Immuntherapie ist, entweder als Quelle für Autoepitope, für Peptide, die die ursprüngliche Sequenz enthalten, oder für deren Mimotope. Um festzustellen, ob die CLECModifikation tatsächlich zu einer besseren Immunantwort führt, wenn diese Region innerhalb von aSyn verwendet wird, haben wir daher mehrere CLEC-basierte Impfstoffe (mit Peptiden innerhalb der Region 107-126) mit den entsprechenden herkömmlichen Peptid-CRM-

Impfstoffen (mit Alum adjuvantiert) verglichen.

Verwendete Impfstoffe:

T-ZellB-Zell-Epitop CLEC Adjuvans Route Epitop/Träger

Pustulan

SeqID56 SeqI1D7 n.a. i1.d. (80%)

Seq1ID58 CRM na Alum sS.C. Pustulan

SeqgID53 SeqI1D7 n.a. i1.d. (80%)

SeqID55 CRM na Alum sS.C. Pustulan

SeqgID51 SeqI1D7 n.a. i1.d. (80%)

SeqID52 CRM na Alum sS.C. Pustulan

SeqID65 SeqI1D7 n.a. i1.d. (80%)

SeqID66 CRM na Alum sS.C. Pustulan

SeqI1D67 SeqI1D7 n.a. i1.d. (80%)

SeqID68 CRM na Alum sS.C. Pustulan

SeqID69 SeqI1D7 n.a. i1.d. (80%)

SeqgID70 CRM na Alum sS.C.

114 / 152

Pustulan SeqgID71 SeqI1D7 n.a. i1.d. (80%)

Seqg1ID72 CRM na Alum sS.C.

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 5 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: 1i.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den mit Alhydrogel adjuvantierten KLH-basierten Impfstoff) und die darauf folgende Immunantwort gegen das injizierte Peptid und das Zielprotein mittels ELISA und EC50-Werten bestimmt. Um die Selektivität der Immunantwort zu bewerten, wurden die Plasmaproben außerdem einem aSyn-spezifischen Hemmungs-ELISA un-

terzogen und als Prozentsatz der maximalen Bindung ausgedrückt.

Ergebnisse: Impfstoff Peptid-Titer aSyn-Fiılament-Titer (x1000) (x1000) SeqD1I56+SegID7/+Pus 0,1 0,1 SeqID58+CRM+Alum 9,781 0,1 SeqD1I53+SeqgID7/+Pus 0,1 0,1 SeqID55+CRM+Alum 17,647 0,8 SeqgDI5S1+SeqgID7+Pus 19,694 1,687 SeqgID52+CRM+A1lum 13,115 1,594 SeqD165+SegID7/+Pus 9,04 3,256 SeqgID66+CRM+A1um 7,984 1,108 SeqgD167+SegID7+Pus 12,016 7,335 SeqgID68+CRM+A1lum 18,126 1,864 SeqD169+SeqgID7/+Pus 28,125 3,523 SegID70+CRM+A1lum 37,88 1,054 SeqgDI71+SeqgID7+Pus 7,783 5,788 SegID72+CRM+A1lum 14,603 2,429

Tabelle 1: Durch Impfstoffe mit aal07-126 hervorgerufene Immunre-

aktion

Sowohl CLEC- als auch CRM-basierte Impfstoffe, die 5- und 6mer Peptide enthalten, waren in diesem Experiment weniger geeig-

net, hohe Anti-aSyn-Filament-Titer zu induzieren. Die in diesem

Experiment verwendeten, vom aSyn-C-Terminus-abgeleiteten CLEC-basierten Kon]ugat-Impfstoffe (7- bis 12-mer Peptide) (siehe Tabelle 1l und Figuren 22A, 23A und 24A) zeigen alle eine überlegene Immunogenität gegen aSyn-Filamente im Vergleich zu den herkömmlichen Peptid-Kon]ugat-Impfstoffen (siehe Tabelle 1, bis zu 4-fache Steigerung). Dies untermauert die Lehre der vorliegenden Erfindung, dass die CLEC-Modifikation zu einer besseren Immunantwort führt als ähnliche konventionelle Impfstoffe, die Epitope aus 103-135, insbesondere 107-126, verwenden.

Die Analyse der Selektivität für aggregiertes aSyn unterstützt diese Lehre. Wie in den Figuren 22B und 23B gezeigt, sind CLEC-Impfstoffe, die Epitope enthalten, die von der Sequenz aall5-126 abgeleitet sind, erstaunlich wirksam bei der Auslösung hochgradig aggregierter selektiver Immunantworten. Wie in Figur 22B gezeigt, induziert der CLEC-basierte Impfstoff SeqgID51+SegID7+Pus, der ein 8-mer aSyn-Zielepitop enthält, Antikörper mit einer 10-fach höheren Selektivität für aSyn-Aggregate, während der entsprechende konventionelle Impfstoff (SeqgID52+CRM+Alum) keine aggregatselektiven Antikörper induziert. In ähnlicher Weise induziert der CLEC-basierte Impfstoff SeqID67+SeqID7/+Pus, der ein 10mer aSyn-Zielepitop enthält, eine ca. 10-fach höhere Selektivität für aSyn-Aggregate im Vergleich zu Monomeren, während der entsprechende konventionelle Impfstoff (SeqgID68+CRM+Alum) Antikörper hervorruft, die ca. 3-fach selektiver für Monomere im Vergleich zu Aggregaten sind (siehe Figur 23B).

Die Analyse der Selektivität für Impfstoffe, die das Epitop aal107-114 enthalten (SeqID/3+SegID/+Pus und SeqID7/4+CRM+Alum, siehe Figur 24B), zeigte überraschenderweise, dass trotz des Vorhandenseins hoher Anti-aSyn-Filament-Titer (d. h. Üüberdurchschnittliche Immunogenität) die durch den CLEC-basierten Impfstoff induziert wurden, weder CLEC- noch herkömmliche Impfstoffe aggregatselektive Antikörper induzieren konnten, was darauf hindeutet, dass nur hochselektierte Peptidsequenzen innerhalb von aal103-135 als Immuntherapeutika geeignet sind, die spezifisch auf aggregiertes aSyn abzielen.

Wie bereits gezeigt (siehe Figuren 18-20), eignen sich Epitope von aa91-100, aal00-108 und aal31-140 weniger gut als potenzielle immuntherapeutische Regionen, um spezifisch gegen aggregiertes

aSyn vorzugehen.

Beispiel 22: Analyse der In-vitro-Funktionalität von Immunantworten, die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelöst werden

Um zu untersuchen, ob aSyn-spezifische Antikörper, die durch CLEC-basierte Impfstoffe (die aSyn-Zielpeptide aus der Epitopregion aal03-135 enthalten) ausgelöst werden, biologisch aktiv sind, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, in denen die Fähigkeit der Antikörper untersucht wurde, die aSyn-Aggregation in

vitro zu hemmen.

Verwendete Impfstoffe:

T-ZellB-Zell- . . . Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route Epitop ger Pustulan , Seq1ID67 SeqI1ID7 n.a. i1.d. (830%) AlhydroSeqID68 CRM n.a. S.C. gel Pustulan , SeqID7/1 SeqI1ID7 n.a. i1.d. (830%) Alhydro- , SeqgID72 CRM197 n.a. i1.d. gel Pustulan , Seq1ID73 SeqI1ID7 n.a. i1.d. (830%) AlhydroSeqID74 CRM197 n.a. S.C. gel

Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 20 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: 1i.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für die mit Alhydrogel adjuvantierten CRM197-basierten Impfstoffe). Proben von Mäuseplasma, die zwei Wochen nach jeder Immunisierung entnommen wurden, sowie entsprechende Kontrollproben (z. B. der aSyn-bindende Antikörper LB509, das Epitop aall15-122 oder vor der Immunisierung gewonnenes Präimmunplasma) wurden auf

ihre Fähigkeit zur Aggregationshemmung in vitro untersucht.

Ergebnisse:

Wie in Figur 25D dargestellt, hatte das von den Tieren vor der Immunisierung entnommene Plasma keine signifikanten Auswirkungen auf die Aggregationskinetik von aSyn, was die Spezifität des Assavs bestätigt.

Die durch den Impfstoff SeqID67-SegID7-Pustulan (mit einem 10-meren aSyn-Peptid) induzierten Abs hemmten die aSyn-Aggregation stark, was sich in einer um 40 ®% verringerten Aggregation in diesem Assay im Laufe der Zeit zeigte, während der entsprechende CRMKonjugatimpfstoff nur minimale Auswirkungen zeigte, was auf eine deutlich höhere Hemmkapazität im Vergleich zu den durch den klassischen Impfstoff induzierten Abs hinweist (Figur 8A). Ein ähnliches Ergebnis konnte bei der Analyse von Antikörpern erzielt werden, die durch SeqgID71+SegID7+Pustulan (das ein 12-mer aSyn-abgeleitetes Peptid enthält) induziert wurden. Diese konnten die Aggregation sogar noch stärker reduzieren (70-80 % Hemmung) und die Hemmungskapazität von Antikörpern, die durch einen herkömmlichen CRM-Impfstoff (SegID72+CRM+Alhydrogel) induziert wurden, um das 2bis 2,5-fache übertreffen. Figur 8C zeigt, dass die durch CLECbasierte und konventionelle Impfstoffe induzierten Antikörper, die auf dem Epitop aal07-114 (das ein von aSyn abgeleitetes 8-mer Peptid enthält) aufbauen, die aSyn-Aggregation dagegen nicht hemmen konnten.

Wie in Figur 25D dargestellt, hemmt der aSyn-spezifische Antikörper LB509 die aSyn-Aggregation nicht. Im Gegenteil, in dieser Analyse kann eine leichte Zunahme der Aggregation festgestellt werden.

Dies ist ein höchst überraschender Effekt in Anbetracht der Lehren dieser Erfindung (siehe Beispiel 14 und Figur 15, in denen auch Epitope analysiert werden, die von der aSyn-Sequenz aall5126 abgeleitet sind, insbesondere auch aall5-121), sowie Tabelle 1 und Figuren 22-25, in denen Impfstoffe beschrieben werden, die die Epitope 115-126 abdecken), wie das monoklonale LB509 (Epitop aa:115-122), von dem bekannt ist, dass es an verschiedene Formen von aSyn bindet (Jakes et al. Neurosci Lett. 1999 Jul 2;269(1):136) und das gleiche Epitop wie die biologisch wirksamen Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist (siehe Figur 25D). Daraus folgt, dass die mit CLEC-basierten Impfstoffen erzielten biologisch überlegenen Wirkungen in der Tat überraschend sind und

zeigen, dass hochselektierte Peptidsequenzen, die innerhalb von

aall5-126 enthalten sind, innerhalb der Region aal03-135 als Immuntherapeutika bevorzugt werden, die spezifisch auf aggregiertes aSsyn zielen.

Auf der Grundlage dieser allgemeinen Offenbarung der vorliegenden Erfindung und dieser Beispiele werden die folgenden bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung offenbart:

1. Konj]jugat, bestehend aus oder umfassend mindestens ein ß-Glucan oder ein Mannan und mindestens ein B-Zell- oder T-Zell-EpitopPolypeptid, wobei das ß-Glucan oder Mannan kovalent mit dem BZell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid konj]jugiert ist, um ein Kon)jugat aus dem ß-Glucan oder Mannan und dem B-Zell- und/oder TZell-Epitop-Polypeptid zu bilden, wobei das B-Zell- und/oder TZell-Epitop-Polypeptid ein alpha-Synuclein-Polypeptid ist; oder ein Konjugat, das aus mindestens einem ß-Glucan oder einem Mannan und mindestens einem alpha-Synuclein-B-Zell-Epitop-Polypeptid besteht oder dieses umfasst, wobei das ß-Glucan oder Mannan kovalent an das B-Zell-Epitop-Polypeptid konjugiert ist, um ein Konjugat aus dem ßB-Glucan oder Mannan und dem B-Zell-Epitop-Polypeptid zu bilden.

2. ein Konjugat gemäß Ausführungsform 1, wobei das ß-Glucan ein überwiegend lineares ß-(1,6)-Glucan mit einem Verhältnis von (1,6)-gekoppelten Monosaccharid-Einheiten zu nicht-ß-(1,6)-gekoppelten Monosaccharid-Einheiten von mindestens 1:1, vorzugsweise mindestens 2:1, noch bevorzugter mindestens 5:1, insbesondere mindestens 10:1 ist.

3. Konjugat gemäß Ausführungsform 1 oder 2, wobei das ß-Glucan Pustulan, Lichenan, Laminarin, Curdlan, ß-Glucanpeptid (BGP), Schizophyllan, Skleroglucan, ganze Glucanpartikel (WGP), Zymosan oder Lentinan ist, vorzugsweise Pustulan, Laminarin, Lichenan, Lentinan, Schizophyllan oder Skleroglucan, insbesondere Pustulan. 4, Konjugat nach einer der Ausführungsformen 1 bis 3, wobei die Polypeptide mindestens ein B-Zell-Epitop von alpha-Synuclein und mindestens ein T-Zell-Epitop umfassen.

5. Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 4, wobei das Verhältnis von ß-Glucan oder Mannan zu B-Zell- und/oder T-ZellEpitop-Polypeptid im Kon]ugat von 10:1 (w/w) bis 1:1 (w/w), vorzugsweise von 8:1 (w/w) bis 2:1 (w/w), insbesondere 4:1 (w/w)

beträgt.

6. Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 5, wobei ein B-Zellen-Epitop und ein panspezifisches/promiskuitives T-ZellenEpitop unabhängig voneinander an das ß -Glucan gekoppelt sind.

7. Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 6, wobei das B-Zell-Epitop-Polypeptid eine Länge von 5 bis 20 Aminosäureresten, vorzugsweise von 6 bis 19 Aminosäureresten, insbesondere von 7 bis 15 Aminosäureresten aufweist; und/oder wobei das T-Zell-EpitopPolypeptid eine Länge von 8 bis 30 Aminosäureresten, vorzugsweise von 13 bis 29 Aminosäureresten, insbesondere von 13 bis 28 Aminosäureresten aufweist,

wobei das T-Zell-Epitop vorzugsweise ein Polypeptid ist, das die Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAAA umfasst, die gegebenenfalls an einen Linker, wie einen Cysteinrest oder einen Linker, der einen Cysteinrest umfasst, einen NRRA-, NRRA-C- oder NRRA-NH-NH2-Linker, gebunden ist oder eine Variante der Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAAA, wobei die Varianten die Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAA, Varianten, bei denen der erste Rest Alanin durch einen aliphatischen Aminosäurerest, wie Glycin, Valin, Isoleucin und Leucin, ersetzt ist, Varianten, bei denen der dritte Rest Phenylalanin durch L-Cyclohexylalanin ersetzt ist, Varianten, bei denen der dreizehnte Aminosäurerest Alanin durch einen aliphatischen Aminosäurerest (z.g. Glycin, Valin, Isoleucin und Leucin) ersetzt ist, Varianten, die Aminocapronsäure umfassen, vorzugsweise gekoppelt an den C-Terminus der Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAA, Varianten mit der Aminosäuresequenz AXıFVAAX2TLX3AX4A, worin X: ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus W, F, Y, H, D, E, N, ©, I und K; Xz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus F, N, Y und W, X3 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H und K, und X4 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus A, D und E, mit der Maßgabe, daß die Oligopeptidsequenz nicht AKFVAAWTLKAAA ist; insbesondere wobei das T-Zell-

Epitop ausgewählt ist aus AKFVAAWTLKAAANRRA- (NH-NH2) , AKFVAAWTLKAAAN-C, AKFVAAWTLKAAA-C, AKFVAAWTLKAAANRRA-C, aKXVAAWTLKAAaZC, aKXVAAWTLKAAaAZCNRRA, aKXVAAWTLKAAa,

aKXVAAWTLKAAaNRRA, aA(X)AAAKTAAAAa, aA(X)AAATLKAAa, aA(X)VAAATLKAAa, aA(X)IAAATLKAAa, aK(X)VAAWTLKAAa und aKFVAAWTLKAAa, worin X L-Cyclohexylalanin ist, Z Aminocapronsäure ist und a ein aliphatischer Aminosäurerest ist, ausgewählt aus Alanin, Glycin, Valin,

Isoleucin und Leucin ; und/oder

120 / 152

wobei das T-Zell-Epitop ein Alpha-Synuclein-Polypeptid ist, ausgewählt aus der Gruppe GKTKEGVLYVGSKTK (aa31-45), KTKEGVLYVGSKTKE (aa32-46), EOQOVINVGGAVVTGVT (aa61-75), VTGVTAVAOKTVEGAGNIAAATGFVK (aa/1-86), DPDNEAYEMPSE (aall16-130), DNEAYEMPSEEGYOD (aal21-135), und EMPSEEGYODYEPEA (aal26-140).

8, Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 7, wobei das Konjugat ferner ein Trägerprotein umfasst, vorzugsweise nicht-toxisches kreuzreaktives Material von Diphtherietoxin (CRM), insbesondere CRMıo7 , KLH, Diphtherietoxoid (DT), Tetanustoxoid (TT), Haemophilus influenzae Protein D (HipD), den äußeren Membranproteinkomplex von Meningokokken der Serogruppe B (OMPC), rekombinante nichttoxische Form von Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (rEPA), Flagellin, hitzelabiles Enterotoxin (LT) von Escherichia coli, Choleratoxin (CT), mutierte Toxine (z.B.: LTK63 und LTR72), virusähnliche Partikel (VLPs), Albuminbindungsprotein, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, ein synthetisches Peptiddendrimer, z. B. ein multiples antigenes Peptid (MAP), wobei insbesondere das Verhältnis von Trägerprotein zu ß-Glucan oder Mannan im Konjugat 1/1 bis 1/50, vorzugsweise 1/1 bis 1/40, noch bevorzugter 1/1 bis 1/20, insbesondere 1/5 bis 1/20 beträgt.

9, ein Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 8, wobei das Polypeptid mindestens ein alpha-Synuclein-B-Zell- oder ein TZell-Epitop-Polypeptid ist oder umfasst und wobei das Kon]ugat ferner ein Nicht-alpha-Synuclein-B-Zell- oder T-Zell-Epitop umfasst

10. Konj]jugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 8, wobei das alpha-Synuclein-Polypeptid natives alpha-Synuclein oder ein Polypeptid ist, das die Aminosäurereste 1 bis 5, 1 bis 8, 1 bis 10, 60 bis 100, 70 bis 140, 85 bis 99, 91 bis 100, 100 bis 108, 102 bis 108, 102 bis 109, 103 bis 129, 103 bis 135, 107 bis 130, 109 bis 126, 111 bis 121, 111 bis 135, 115 bis 121, 115 bis 122, 115 bis 123, 115-124, 115-125, 115 bis 126, 118 bis 126, 121 bis 127, 121 bis 140 oder 126 bis 135, der Aminosäuresequenz von nativem menschlichem Alpha-Synuclein:

MDVEMKGLSK AKEGVVAAAE KTKOGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQOVINVGGAV VTITGVTAVAOK TVEGAGSIAA ATGFVKKDOL GKNEEGAPOE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYODYEPEA (humanes aSyn (1-140 aa): UNIPROT-Hinterlegungsnummer P37840),

vorzugsweise ein Polypeptid, das die Aminosäurereste 1 bis 8, 91 bis 100, 100 bis 108, 103 bis 135, 107 bis 130, 115 bis 121, 115

bis 122, 115 bis 123, 115-124, 115-125, 115 bis 126, 118 bis 126, 121 bis 127 oder 121 bis 140 umfasst oder daraus besteht; oder Mimotope, ausgewählt aus der Gruppe DOPVLPD, DOPVLPDN, DOPVLPDNE, DOPVLPDNEA, DOPVLPDNEAY, DOPVLPDNEAYE, DSPVLPDG, DHPVHPDS, DTPVLPDS, DAPVTPDT, DAPVRPDS, und YDRPVOPDR.

10. ein Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 9, wobei das Konjugat ein T-Zell-Epitop umfasst und frei von B-Zell-Epitopen ist, wobei das Konjugat vorzugsweise mehr als ein T-ZellEpitop umfasst, insbesondere zwei, drei, vier oder fünf T-ZellEpitope.

11. Kon]ugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 10 zur Verwendung als aktiver Impfstoff zur Behandlung und Vorbeugung von Synukleopathien, vorzugsweise Parkinson-Krankheit (PD), Demenz mit Lewy-Körpern (DLB), Multiple-System-Atrophie (MSA), Parkinson-Demenz (PDD), neuroaxonale Dystrophien, Alzheimer-Krankheit mit amygdalar beschränkten Lewy-Körpern (AD/ALB).

12. Kon]ugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 11 zur Verwendung zur Induzierung zielspezifischer Immunantworten, während keine oder nur sehr begrenzte CLEC- oder Trägerprotein-spezifische Antikörperantworten induziert werden; und/oder

zur Induktion zielspezifischer Immunreaktionen, wobei keine oder nur sehr begrenzte CLEC- oder Trägerprotein-spezifische Antikörperreaktionen induziert werden; und/oder

zur Verwendung bei Krankheiten mit reduzierten oder dysfunktionalen Treg-Populationen, um die schwindende/reduzierte Treg-Anzahl und -Aktivität zu erhöhen und dadurch die Autoimmunreaktivität von krankheitsspezifischen T-Effektorzellen zu reduzieren und Autoimmunreaktionen bei Patienten zu dämpfen, wobei T-Zell-Epitope, die als Treg-Epitope geeignet sind, oder eine Kombination mit Treginduzierenden Mitteln, wie Rapamycin, niedrig dosiertes IL-2, TNFRezeptor 2 (TNFR2)-Agonist, Anti-CD20-Antikörper (wie Rituximab), Prednisolon, Inosin-Pranobex, Glatirameracetat oder Natriumbutyrat; verwendet werden; und/oder

zur Verwendung in einer Behandlung zur Erhöhung oder Erhaltung der T-Zell-Zahlen, insbesondere der T-Effektor-Zell-Zahlen, und der TZell-Funktion in einem PD-Patienten, die vorzugsweise eine Kombination von Checkpoint-Inhibitoren oder Impfstoffen unter Verwendung von Anti-Immun-Checkpoint-Inhibitor-Epitopen einschließt, um eine Anti-Immun-Checkpoint-Inhibitor-Immunantwort zu induzieren,

um die T-Zell-Zahlen zu erhöhen oder zu erhalten, insbesondere die

122 / 152

Zahl der T-Effektorzellen und die T-Zellfunktion in einem PD-Patienten, wobei der PD-Patient vorzugsweise dadurch ausgewählt wird, dass er eine Gesamtverringerung der CD3+-Zellen, insbesondere der CD3+CD4+-Zellen aufweist, die für PD-Patienten in allen Stadien der Krankheit typisch ist; vorzugsweise ein Patient in den H+Y-Stadien 1-4, noch bevorzugter H+Y1-3, am meisten bevorzugt H+Y1-2.

13. Konj]jugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 12, wobei das ß-Glucan oder Mannan zur Verwendung als C-Typ-Lectin (CLEC)Polysaccharid-Adjuvans dient, vorzugsweise zur Verstärkung der TZell-Antwort auf ein gegebenes T-Zell-Epitop-Polypeptid, insbesondere wobei das T-Zell-Epitop ein lLineares T-Zell-Epitop ist, insbesondere wobei das T-Zell-Epitop ein Polypeptid ist, das die Aminosäuresequenzen SeqID7, 8, 22-29, 87-131, GKTKEGVLYVGSKTK, KTKEGVLYVGSKTKE, EQOVINVGGAVVTGVT, VTGVTAVAOKTVEGAGNIAAATGFVK, MPVDPDNEAYEMPSE), DNEAYEMPSEEGYOD, EMPSEEGYODYEPEA oder Kombinationen davon umfasst oder daraus besteht.

14. Kon]ugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 13 zur Verwendung bei der Erhöhung der Affinitätsreifung in Bezug auf ein spezifisches alpha-Synuclein-Polypeptid-Antigen oder zur Induzierung einer verstärkten Immunantwort in Bezug auf das menschliche Selbstantigen alpha-Synuclein.

15. Konj]jugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 14, das ferner ein Trägerprotein umfasst, das T-Zell-Epitope zur Verwendung bei der Verringerung oder Beseitigung der B-Zell-Antwort auf das CLEC und/oder das Trägerprotein und/oder bei der Verstärkung der T-Zell-Antwort auf die T-Zell-Epitope des Trägerproteins umfasst, wobei das Trägerprotein vorzugsweise nicht-toxisches kreuzreaktives Material von Diphtherietoxin (CRM), insbesondere CRM197, KLH, Diphtherietoxoid (DT), Tetanustoxoid (TT), Haemophilus influenzae Protein D (HipD), und der äußere Membranproteinkomplex von Meningokokken der Serogruppe B (OMPC), eine rekombinante nicht-toxische Form von Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (rEPA), Flagellin, hitzelabiles Escherichia coli Enterotoxin (LT), Choleratoxin (CT), mutierte Toxine (z.B.: LTK63 und LTR72), virusähnliche Partikel, Albuminbindungsprotein, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, ein synthetisches Peptiddendrimer, z. B.: ein multiples antigenes Peptid (MAP) ist, insbesondere wobei die T-Zell-Epitop-Wirksamkeit in einem Impfstoff, der lineare T-Zell-Epitope umfasst, erhöht wird,

zZ. B.: durch eine N- oder C-terminale Hinzufügung einer 1ysosomalen

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Protease-Spaltstelle, wie eine Cathepsin L-ähnliche Spaltstelle oder eine Cathepsin S-ähnliche Spaltstelle , wobei die Cathepsin L-ähnliche Spaltstelle vorzugsweise durch die folgende Konsensussequenz definiert ist:

Xn-X1i-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8

X4a : N/D/A/0/S/R/G/L; bevorzugt N/D, stärker bevorzugt N

Xs : F/R/A/K/T/S/E; bevorzugt F oder R, stärker bevorzugt R

Xe : F/R/A/K/V/S/Y; bevorzugt F oder R, stärker bevorzugt R

X7 : beliebige Aminosäure, bevorzugt A/G/P/F, noch bevorzugter A

Xa : Cystein oder Linker wie NHNE: ‚,

wobei die am meisten bevorzugte Sequenz Xn-X1iX2X:NRRA-Linker ist;

und wobei die Cathepsin S-ähnliche Spaltstelle vorzugsweise durch

die folgende Konsensussequenz definiert ist: Xn-X1i-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8

X7 : eine beliebige Aminosäure, bevorzugt A

Xs8 : bevorzugt A

Xa : Cystein oder Linker wie NHNH2 , wobei die bevorzugte Sequenz Xn-X1iX2VVRAA-Linker ist

16. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 15, wobei das ß-Glucan oder Mannan durch Oxidation aktiviert wird und wobei das aktivierte ß-Glucan oder Mannan mit der B-Zelle und/oder dem T-Zellepitop-Polypeptid in Kontakt gebracht wird, wodurch ein Kon]ugat des ß-Glucans oder Mannans mit der B-Zelle und/oder dem T-Zellepitop-Polypeptid erhalten wird.

17. Verfahren gemäß Ausführungsform 16, wobei das ß-Glucan oder

Mannan durch Periodatoxidation an vicinalen Hydroxylgruppen, als

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reduktive Aminierung oder als Cyanylierung von Hydroxylgruppen erhalten wird.

18. Verfahren gemäß Ausführungsform 16 oder 17, wobei das ßB-Glucan oder Mannan bis zu einem Oxidationsgrad oxidiert wird, der als die Reaktivität mit dem Schiff'schen Fuchsin-Reagenz definiert ist, die einem Oxidationsgrad einer gleichen Menge Pustulan entspricht, das mit Periodat in einem Molverhältnis von 0,2-2,6, vorzugsweise von 0,6-1,4, insbesondere von 0,7-1, oxidiert wurde. 19. Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 16 bis 18, wobei das Kon]ugat durch Kopplung auf Hydrazonbasis zur Kon]ugation von Hydraziden an Carbonyle (Aldehyd) oder durch Kopplung unter Verwendung heterobifunktioneller Maleimid-Hydrazid-Linker (Z.B.: BMPH (N-ßB-Maleimidopropionsäurehydrazid), MPBH (4-[4-N-Maleimidophenyl]buttersäurehydrazid), EMCH (N- [£-Maleimidocapronsäure)hydrazid) oder KMUH (N-[k-Maleimidoundecansäure]-hydrazid)) zur Konjugation von Sulfhydriden (z. B. Cysteinen) mit Carbonylen (Aldehyden) erhalten wird.

20. ein Impfstoffprodukt, das zur Impfung eines Individuums gegen ein spezifisches Antigen bestimmt ist, wobei das Produkt eine Verbindung umfasst, die ein ß-Glucan oder Mannan als PolysaccharidAdjuvans vom Typ C-Lectin (CLEC) umfasst, das kovalent an das spezifische Antigen gekoppelt ist.

21. Impfstoffprodukt gemäß Ausführungsform 20, wobei das Produkt ein Kon]jugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 16 umfasst oder durch ein Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 16 bis 19 erhältlich oder erhalten ist.

22. Impfstoffprodukt gemäß Ausführungsform 20 oder 21, wobei das Antigen mindestens ein B-Zell-Epitop und mindestens ein T-ZellEpitop umfasst, vorzugsweise wobei das Antigen ein Polypeptid ist, das ein oder mehrere B-Zell- und T-Zell-Epitope umfasst.

23. Impfstoffprodukt nach einer der Ausführungsformen 20 bis 22, wobei das kovalent gekoppelte Antigen und das CLEC-PolysaccharidAdjuvans als Partikel mit einer Größe von 1 bis 5000 nm, vorzugsweise von 1 bis 200 nm, insbesondere von 2 bis 160 nm, bestimmt als hydrodynamischer Radius (HDR) durch dynamische Lichtstreuung (DLS), vorliegen.

24. Impfstoffprodukt nach einer der Ausführungsformen 20 bis 23, wobei das kovalent gekoppelte Antigen und das CLEC-Polysaccharid-

Adjuvans als Partikel mit einer Größe von 1 bis 50 nm, vorzugsweise

von 1 bis 25 nm, insbesondere von 2 bis 15 nm, bestimmt als HDR durch DLS, vorliegen.

25. Impfstoffprodukt nach einer der Ausführungsformen 20 bis 24, wobei das kovalent gekoppelte Antigen und das CLEC-PolysaccharidAdjuvans als Partikel mit einer Größe von weniger als 100 nm, vorzugsweise weniger als 70 nm, insbesondere weniger als 50 nm, bestimmt als HDR durch DLS, vorliegen.

26. pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Konjugat oder einen Impfstoff, wie in einer der Ausführungsformen 1 bis 25 definiert, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

27. pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 26, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger ein Puffer, vorzugs-

weise ein Puffer auf Phosphat- oder TRIS-Basis, ist.

28. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 26 oder 27, enthalten in einem nadelbasierten Verabreichungssystem, vorzugsweise einer Spritze, einem Mininadelsystem, einem Hohlnadelsystem, einem festen Mikronadelsystem oder einem System mit Nadeladaptern; einer Ampulle, nadelfreien Injektionssystemen, vorzugsweise einem Jet-Injektor; einem Pflaster, einem transdermalen Pflaster, einem mikrostrukturierten transdermalen System, einem Mikronadel-Array-Pflaster (MAP), vorzugsweise einem festen MAP (SMAP), einem beschichteten MAP (C-MAP) oder einem sich auflösenden MAP (D-MAP); einem Elektrophorese-System, einme Iontophorese-System, einem laserbasierten System, insbesondere einem Erbium-YAGLasersystem; oder einem Gene-Gun-System.

29. pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einer der Ausführungsformen 26 bis 28, wobei das Konjugat oder der Impfstoff als Lösung oder Suspension, tiefgefrorene Lösung oder Suspension, Lyophi-

lisat, Pulver oder Granulat enthalten ist.

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Claims

Ansprüche:

1. Konj]jugat, bestehend aus oder umfassend mindestens ein ß-Glucan oder ein Mannan und mindestens ein B-Zell- oder T-Zell-EpitopPolypeptid, wobei das ß-Glucan oder Mannan kovalent mit dem BZell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid konj]jugiert ist, um ein Kon)jugat aus dem ß-Glucan oder Mannan und dem B-Zell- und/oder TZell-Epitop-Polypeptid zu bilden, und wobei das B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid ein alpha-Synuclein-Polypeptid ist.

2. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das ß-Glucan Pustulan, Lichenan, Laminarin, Curdlan, ß-Glucanpeptid (BGP), Schizophyllan, Scleroglucan, ganze Glucanpartikel (WGP), Zymosan oder Lentinan, vorzugsweise Pustulan, Laminarin, Lichenan, Lentinan, Schizo-

phyllan oder Skleroglucan, insbesondere Pustulan, ist.

3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei das ß-Glucan ein überwiegend lineares ß-(1,6)-Glucan mit einem Verhältnis von (1, 6)-gekoppelten Monosaccharideinheiten zu nicht-ß-(1,6)-gekoppelten Monosaccharideinheiten von mindestens 1:1, vorzugsweise mindestens 2:1, noch bevorzugter mindestens 5:1, insbesondere mindestens 10:1, ist.

4, Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die alpha-

Synuclein-Polypeptide mindestens ein B-Zell-Epitop umfassen.

5. Konj]jugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ein B-ZellEpitop und ein panspezifisches/promiskuitives T-Zell-Epitop unab-

hängig voneinander an das ß-Glucan oder Mannan gekoppelt ist.

6. Konj]jugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das B-ZellEpitop-Polypeptid eine Länge von 5 bis 20 Aminosäureresten, vorzugsweise von 6 bis 19 Aminosäureresten, insbesondere von 7 bis 15

Aminosäureresten, aufweist.

7. Konj]jugat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das T-ZellEpitop-Polypeptid eine Länge von 8 bis 30 Aminosäureresten, vorzugsweise von 13 bis 29 Aminosäureresten, insbesondere von 13 bis

28 Aminosäureresten, aufweist.

8. Konj]jugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Konj]ugat weiterhin ein Trägerprotein umfasst, vorzugsweise nicht-toxisches kreuzreaktives Material von Diphtherietoxin (CRM), insbesondere CRMıo7, KLH, Diphtherietoxoid (DT), Tetanustoxoid (TT), Haemophilus influenzae Protein D (HipD) und dem äußeren Membranproteinkomplex von Meningokokken der Serogruppe B (OMPC), rekombinante nichttoxische Form von Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (rEPA), Flagellin, hitzelabiles Enterotoxin (LT) von Escherichia coli, Choleratoxin (CT), mutierte Toxine (z.g., LTK63 und LTR72), virusähnliche Partikel, albuminbindendes Protein, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, ein synthetisches Peptiddendrimer, z. B. ein multiples

antigenes Peptid (MAP).

9. Konj]jugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Polypeptid ein B-Zellen- oder ein T-Zellen-Epitop-Polypeptid ist oder umfasst, vorzugsweise wobei das Polypeptid ein B-Zellen- und ein

T-Zellen-Epitop ist oder umfasst.

10. Kon]ugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Konjugat ein T-Zell-Epitop umfasst, vorzugsweise ein T-Zell-Epitop, das die Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAAA umfasst, die gegebenenfalls mit einem Linker verbunden ist, vorzugsweise AKFVAAWTLKAAANRRA- (NHNH2), AKFVAAWTLKAAAN-C, AKFVAAWTLKAAA-C, AKFVAAWTLKAAANRRA-C; 0oder eine Variante davon, ausgewählt aus aKXVAAWTLKAAaZC, aKXVAAWTLKAAaAZCNRRA, aKXVAAWTLKAAa, aKXVAAWTLKAAaANRRA, aA(X)AAAKTAAAAa, aA(X)AAATLKAAa, aA(X)VAAATLKAAa, aA(X)IAAATLKAAa, aK(X)VAAWTLKAAa, und aKFVAAWTLKAAa, worin X L-Cyclohexylalanin ist, Z Aminocapronsäure ist und a ein aliphatischer Aminosäurerest ist, ausgewählt aus Alanin, Glycin, Valin, Iso-Leucin

und Leucin.

11. Konj]jugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Verhältnis von ß-Glucan oder Mannan zu B-Zell- und/oder T-ZellEpitop-Polypeptid im Kon]ugat von 10:1 (w/w) bis 1:1 (w/w), vorzugsweise von 8:1 (w/w) bis 2:1 (w/w), insbesondere 4:1 (w/w),

beträgt.

12. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Verwendung

als aktiver Anti-alpha-Synuclein-Impfstoff zur Behandlung und Vor-

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beugung von Synucleopathien, vorzugsweise Synucleopathien, vorzugsweise Parkinson-Krankheit (PD), Demenz mit Lewy-Körpern (DLB), Multiple-System-Atrophie (MSA), Parkinson-Krankheits-Demenz (PDD), neuroaxonale Dystrophien, Alzheimer-Krankheit mit amygdalar beschränkten Lewy-Körpern (AD/ALB).

13. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das ß-Glucan oder Mannan durch Oxidation aktiviert wird und wobei das aktivierte ß-Glucan oder Mannan mit dem B-Zell- und/oder dem T-Zell-Epitop-Polypeptid in Kontakt gebracht wird, wodurch ein Konjugat des ß-Glucans oder Mannans mit

dem B-Zell- und/oder dem T-Zell-Epitop-Polypeptid erhalten wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das ß-Glucan oder Mannan durch Periodatoxidation an vicinalen Hydroxylgruppen, als reduktive Aminierung oder als Cyanylierung von Hydroxylgruppen erhalten

wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das ß-Glucan oder Mannan bis zu einem Oxidationsgrad oxidiert wird, der als die Reaktivität mit dem Schiff'schen Fuchsin-Reagenz definiert ist, die einem Oxidationsgrad einer gleichen Menge Pustulan entspricht, das mit Periodat in einem Molverhältnis von 0,2-2,6, vorzugsweise

von 0,6-1,4, insbesondere 0,7-1, oxidiert wurde.

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Neue Ansprüche:

1. Konj]jugat, bestehend aus oder umfassend mindestens ein ß-Glucan und mindestens ein B-Zell- oder T-Zell-Epitop-Polypeptid, wobei das ß-Glucan kovalent mit dem B-Zell- und/oder T-Zell-EpitopPolypeptid konjugiert ist, um ein Konjugat aus dem ß-Glucan und dem B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid zu bilden, und wobei das B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid ein alpha-SynucleinPolypeptid ist, wobei das ß-Glucan ein überwiegend lineares ß(1,6)-Glucan mit einem Verhältnis von (1,6)-gekoppelten Monosaccharideinheiten zu nicht-ßB-(1,6)-gekoppelten Monosaccharideinhei-

ten von mindestens 1:1 ist.

2. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das ß-Glucan Pustulan ist.

3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, ,‚ wobei Verhältnis von (1,6)-gekoppelten Monosaccharideinheiten zu nicht-ß-(1,6)-gekoppelten Monosaccharideinheiten mindestens 2:1, vorzugsweise min-

destens 5:1, insbesondere mindestens 10:1, ist.

4, Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die alpha-

Synuclein-Polypeptide mindestens ein B-Zell-Epitop umfassen.

hängig voneinander an das ß-Glucan gekoppelt ist.

Aminosäureresten, aufweist.

28 Aminosäureresten, aufweist.

8. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Konjugat weiterhin ein Trägerprotein umfasst, vorzugsweise nicht-toxisches

kreuzreaktives Material von Diphtherietoxin (CRM), insbesondere

CRMıo7, KLH, Diphtherietoxoid (DT), Tetanustoxoid (TT), Haemophilus influenzae Protein D (HipD) und dem äußeren Membranproteinkomplex von Meningokokken der Serogruppe B (OMPC), rekombinante nichttoxische Form von Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (rEPA), Flagellin, hitzelabiles Enterotoxin (LT) von Escherichia coli, Choleratoxin (CT), mutierte Toxine (z.g., LTK63 und LTR72), virusähnliche Partikel, albuminbindendes Protein, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, ein synthetisches Peptiddendrimer, z. B. ein multiples

antigenes Peptid (MAP).

T-Zellen-Epitop ist oder umfasst.

10. Kon]ugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das KonJ]ugat ein T-Zell-Epitop umfasst, vorzugsweise ein T-Zell-Epitop, das die Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAAA umfasst, die gegebenenfalls mit einem Linker verbunden ist, vorzugsweise AKFVAAWTLKAAANRRA- (NHNH2), AKFVAAWTLKAAAN-C, AKFVAAWTLKAAA-C, AKFVAAWTLKAAANRRA-C; 0oder eine Variante davon, ausgewählt aus aKXVAAWTLKAAaZC, aKXVAAWTLKAAaAZCNRRA, aKXVAAWTLKAAa, aKXVAAWTLKAAaANRRA, aA(X)AAAKTAAAAa, aA(X)AAATLKAAa, aA(X)VAAATLKAAa, aA(X)IAAATLKAAa, aK(X)VAAWTLKAAa, und aKFVAAWTLKAAa, worin X L-Cyclohexylalanin ist, Z Aminocapronsäure ist und a ein aliphatischer Aminosäurerest ist, ausgewählt aus Alanin, Glycin, Valin, Iso-Leucin

und Leucin.

11. Konj]jugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Verhältnis von ß-Glucan zu B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid im Konjugat von 10:1 (w/w) bis 1:1 (w/w), vorzugsweise von 8:1

(w/w) bis 2:1 (w/w), insbesondere 4:1 (w/w), beträgt.

12. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Verwendung als aktiver Anti-alpha-Synuclein-Impfstoff zur Behandlung und Vorbeugung von Synucleopathien, vorzugsweise Synucleopathien, vorzugsweise Parkinson-Krankheit (PD), Demenz mit Lewy-Körpern (DLB), Multiple-System-Atrophie (MSA), Parkinson-Krankheits-Demenz (PDD), neuroaxonale Dystrophien, Alzheimer-Krankheit mit amygdalar beschränkten Lewy-Körpern (AD/ALB).

13. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das ß-Glucan durch Oxidation aktiviert wird und wobei das aktivierte ß-Glucan mit dem B-Zell- und/oder dem T-Zell-Epitop-Polypeptid in Kontakt gebracht wird, wodurch ein Kon)jugat des ß-Glucans mit dem B-Zell- und/oder dem T-Zell-EpitopPolypeptid erhalten wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das ß-Glucan durch Periodatoxidation an vicinalen Hydroxylgruppen, als reduktive Aminie-

rung oder als Cyanylierung von Hydroxylgruppen erhalten wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das ß-Glucan bis zu einem Oxidationsgrad oxidiert wird, der als die Reaktivität mit dem Schiff'schen Fuchsin-Reagenz definiert ist, die einem Oxidationsgrad einer gleichen Menge Pustulan entspricht, das mit Periodat in einem Molverhältnis von 0,2-2,6, vorzugsweise von 0,6-1,4,

insbesondere 0,7-1, oxidiert wurde.

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