AT525943B1 - Konjugat bestehend aus oder umfassend zumindest ein β-Glucan oder ein Mannan - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von β -Glucanen oder Mannanen als C-Typ Lectin (CLEC) Polysaccharid-Adjuvantien für B-Zell- oder T-Zell-Epitop-Polypeptide von alpha-Synuclein.

Description

Beschreibung
[0001] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Polysaccharid-Adjuvantien, die zur Klasse der Lektine vom Typ C (CLEC) gehören.
[0002] Die Impfung gilt als eines der wirksamsten Mittel, um Leben zu retten und die Krankheitslast zu verringern. Bei der aktiven Immunisierung wird der Impfstoff so verabreicht, dass das Immunsystem des Wirts eine unspezifische angeborene Immunantwort sowie spezifische Antikörper, B- und T-Gedächtniszellen entwickelt, die gegen das verabreichte Immunogen wirken können.
[0003] Mannan, ein aus der Hefezellwand stammendes Polysaccharid, besteht aus einem Gerüst aus überwiegend ß-(1,4)-verknüpfter Mannose mit einer geringen Anzahl von a-(1,6)-verknüpften Glucose- und Galaktose-Seitenkettenresten. Darüber hinaus wurde in herkömmlichen Mannanpräparaten ein Proteingehalt von etwa 5 % festgestellt. Als wichtiger Bestandteil von Pilzzellwänden wurde Mannan in großem Umfang als Komponente in kohlenhydratbasierten Impfstoffen gegen Candidiasis verwendet (Han und Rhew, Arch Pharm Res 2012, Vol 35, No 11, 2021-2027; Cassone, Nat Rev Microbiol. 2013 Dec;11(12):884-91; Johnson und Bundle, Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 4327). Darüber hinaus wurden verschiedene Beispiele für Impfstoffe auf der Grundlage von Mannan-Träger-Antigen-Komplexen/Konjugationen entwickelt, darunter die Konjugation von Mannan-Mucin 1 (MUC1) als Fusionsprotein für die Tumortherapie oder Konjugate aus Mannan und Modellallergenen wie Ovalbumin (OVA), Papain oder Betv1.
[0004] Mucine sind stark glykosylierte Proteine, die auf Zelloberflächen exprimiert werden. MUC1 ist ein prototypisches Mucin, das auf einer Vielzahl von Tumorzellen überexprimiert ist. In diesem Sinne wurde ein MUC1-Fusionsprotein mit 5 Tandem-Repeats von humanem MUC1 (mit dem immundominanten Epitop: APDTRPAPGSTAPPAHGVTS) und einem Peptid (Cpl3-32) hergestellt und entweder unter oxidativen oder reduktiven Bedingungen an Mannan konjugiert, was zu drastisch unterschiedlichen immunologischen Reaktionen führte: Oxidiertes Mannan-MUC1 stimulierte Th1-Typ-Antworten, die von CD8+ T-Zellen mit IFN-v-Sekretion und hauptsächlich einer IgG2a-Antikörperantwort vermittelt wurden, während reduziertes Mannan-MUC1 Th2-Typ-Antworten mit IL-4-Produktion und einer hohen IgG 1-Antikörperantwort stimulierte. Das verwendete Fusionsprotein stellt ein einziges Protein dar, das T- und B-Zell-Epitope aufweist.
[0005] Kürzlich wurden auch Protein-Kohlenhydrat-Mannan-Komplexe aus Papain und OVA hergestellt, um deren allergenes Potenzial zu analysieren. Es wurde festgestellt, dass die Kopplung von Mannan an die Proteinoberfläche die Bindung und Vernetzung von gegen Papain gerichteten IgE-Antikörpern verringern kann. Interessanterweise verringerte die Kopplung von Mannan, Dextran oder Maltodextrin in diesen Experimenten nur das allergene Potenzial von Papain, nicht aber von OVA, was auf die Bedeutung der Kohlenhydratauswahl für die Entwicklung von Impfstoffen hinweist (Weinberger et al. J. Control. Release 2013; 165:101-109). Diese Experimente zeigten auch, dass die Konjugation mit Mannan zur Entwicklung erhöhter IgG-Titer gegen OVA nach intradermaler Immunisierung führt.
[0006] Ähnlich wie bei dem für MUC1 verwendeten Neoglykokonjugat-Impfstoff verwendeten Ghochikyan et al. (DNA AND CELL BIOLOGY, Band 25, Nummer 10, 2006, S. 571-580) und Petrushina et al. (Journal of Neuroinflammation 2008, 5:42) Amyloid beta (Aß)28, ein Peptid mit 28 Aa-Resten, das kombinierte B- und T-Zell-Epitope des menschlichen Aß42-Peptids trägt, gekoppelt an Mannan, und konnten bei Mäusen geringe Anti-Aß-Reaktionen auslösen. Diese Reaktionen konnten auch die Amyloidablagerungen in den kortikalen und hippokampalen Regionen von APP-transgenen Mäusen nach subkutaner Immunisierung abschwächen. Die Immunisierung führte auch zur Induktion erhöhter Anti-Mannan-Titer bei mit AB28-Mannan und BSA-Mannan behandelten Tieren. Die Behandlung wurde jedoch nicht weiterentwickelt, wahrscheinlich aufgrund des Auftretens von vermehrten Mikroblutungen im Gehirn der behandelten Tiere, die auf mögliche schädliche Wirkungen von Mannan als Auslöser unerwünschter vaskulärer Ereignisse zurückgeführt wurden, was die Bedeutung der Kohlenhydratauswahl für die Entwicklung effizienter und sicherer Impfstoffe unterstreicht.
[0007] Bisher sind keine Konjugate bekannt, bei denen einzelne B-Zell- oder T-Zell-Epitope an Mannan oder andere verwandte CLECs gekoppelt sind.
[0008] B-Glucane umfassen eine Gruppe von ß-D-Glucose-Polysacchariden. Diese Polysaccharide sind wichtige Strukturbestandteile der Zellwand von Pilzen und kommen auch in Bakterien, Hefen, Algen, Flechten und Pflanzen, wie Hafer und Gerste, vor. Je nach Quelle unterscheiden sich B-Glucane in der Art der Verknüpfung, dem Grad der Verzweigung, dem Molekulargewicht und der Tertiärstruktur.
[0009] B-Glucane sind eine Quelle löslicher, fermentierbarer Ballaststoffe - auch präbiotische Ballaststoffe genannt -, die ein Substrat für die Mikrobiota im Dickdarm darstellen, die Fäkalienmasse erhöhen und kurzkettige Fettsäuren als Nebenprodukte mit weitreichenden physiologischen Aktivitäten produzieren. Beispielsweise senkt die tägliche Aufnahme von ß-Glucanen aus Hafer in einer Menge von mindestens 3 Gramm den Gesamtcholesterinspiegel und den Cholesterinspiegel von Lipoproteinen niedriger Dichte um 5 bis 10 % bei Menschen mit normalem oder erhöhtem Cholesterinspiegel im Blut.
[0010] Typischerweise bilden B-Glucane ein lineares Grundgerüst mit 1-3 B-glykosidischen Bindungen, variieren aber in Bezug auf Molekularmasse, Löslichkeit, Viskosität, Verzweigungsstruktur und Geliereigenschaften. Hefe- und Pilz-B-Glucane sind in der Regel auf einem ß-(1,3)-Grundgerüst aufgebaut und enthalten ß-(1,6)-Seiten- verzweigungen, während Getreide-B-Glucane sowohl ßB-(1,3)- als auch ß-(1,4)-Grundgerüstbindungen mit oder ohne Seitenverzweigungen enthalten.
[0011] B-Glucane werden vom angeborenen Immunsystem als pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPSs) erkannt. Der PRR Deectin-1 hat sich als primärer Rezeptor für diese Kohlenhydrate herauskristallisiert, und die Bindung von B-Glucan an Deectin-1 löst über den Syk/CARD9Signalweg eine Vielzahl von zellulären Reaktionen aus, darunter Phagozytose, oxidativer Burst und die Sekretion von Zytokinen. Darüber hinaus wurde auch der Komplementrezeptor 3 (CR3, CD11b/CD18) als Rezeptor für B-Glucane identifiziert. Es wurde berichtet, dass die Stimulation durch Deectin-1 Th1-, Th17- und zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktionen auslöst.
[0012] Zu den Mitgliedern der B-Glucanfamilie gehören:
[0013] Beta-Glucanpeptid (BGP) ist ein verzweigtes Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht (>100 kDa), das aus dem Pilz Trametes versicolor gewonnen wird. BGP besteht aus einem stark verzweigten Glucananteil, der eine ßB-(1,4)-Hauptkette und eine ß-(1,3)-Seitenkette umfasst, wobei B-(1,6)-Seitenketten kovalent mit einem Polypeptidanteil verbunden sind, der reich an Asparaginsäure, Glutaminsäure und anderen Aminosäuren ist.
[0014] Curdlan ist ein lineares Polymer mit hohem Molekulargewicht, das aus ß-(1,3)-verknüpften Glukoseresten von Agrobacterium spp gewonnen wird.
[0015] Laminarin aus der Braunalge Laminaria digitata ist ein lineares B-(1,3)-Glucan mit B-(1,6)Verknüpfungen. Laminarin ist ein wasserlösliches B-Glucan mit niedrigem Molekulargewicht (5-7 kDa), das entweder als Dectin-1-Antagonist oder -Agonist wirken kann. Es kann an Dectin-1 binden, ohne die nachgeschaltete Signalgebung zu stimulieren, und ist in der Lage, die Dectin-1Bindung von partikulären ß-(1,3)-Glucanen wie Zymosan zu blockieren.
[0016] Pustulan ist ein lineares ßB-(1,6)-verknüpftes B-D-Glucan mit mittlerem Molekulargewicht (20 kDa) aus der Flechte Lasallia pustulata, das auch an Dectin-1 als Hauptrezeptor binden und die Signalübertragung über Dectin-1 aktivieren kann.
[0017] Lichenan ist ein lineares, hochmolekulares (ca. 22-245kDa) ß-(1,3) B-(1,4)-B-D-Glucan aus Cetraria islandica mit einer ähnlichen Struktur wie die B-Glucane von Gerste und Hafer. Das Lichenan hat einen viel höheren Anteil an 1,3- bis 1,4-B-D-Bindungen als die beiden anderen Glucane. Das Verhältnis von ßB-(1,4)- zu B-(1,3)-B-D-Bindungen beträgt etwa 2:1.
[0018] B-Glucan aus Hafer und Gerste sind lineare, ßB-(1,3) B-(1,4)-B-D-Glucane und sind mit unterschiedlichen Molekulargewichten (Fraktionen mit mittlerem Molekulargewicht von 35,6 kDa bis zu Fraktionen mit hohem Molekulargewicht von bis zu 650 kDa) im Handel erhältlich.
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[0019] Schizophyllan (SPG) ist ein gel-bildendes B-Glucan aus dem Pilz Schizophyllum commune. SPG ist ein B-(1,3)-D-Glucan mit hohem Molekulargewicht (450 kDa), das in der Hauptkette alle drei ß-(1,3)-Glucosylreste einen ß-(1,6)-Monoglucosylzweig aufweist.
[0020] Scleroglucan ist ein Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht (>1000 kDa), das durch Fermentation des Fadenpilzes Sclerotium rolfsii hergestellt wird. Scleroglucan besteht aus einem linearen ß-(1,3)-D-Glucose-Grundgerüst mit einer ß-(1,6)-D-Glucose- Seitenkette alle drei Hauptreste.
[0021] Glucanpartikel (whole glucan particle, WGP) sind Beta-Glucane, die sich durch ihre Fähigkeit auszeichnen, die Immunantwort zu modulieren. WGP Dispersible (WGP® Dispersible von Biothera) ist ein partikuläres B-Glucanpräparat aus Saccharomyces cerevisiae. Es besteht aus hohlen Hefezellwand-"Geistern", die hauptsächlich aus langen ß-(1,3)-Glukosepolymeren bestehen, die nach einer Reihe von alkalischen und sauren Extraktionen aus der S. cerevisiae-Zellwand gewonnen werden. Im Gegensatz zu anderen Dectin-1-Liganden wie Zymosan besitzt WGP Dispersible keine TLR-stimulierende Aktivität. Im Gegensatz dazu bindet das lösliche WGP Dectin-1, ohne diesen Rezeptor zu aktivieren. Und es kann die Bindung von WGP Dispersible an Makrophagen und seine immunstimulierende Wirkung erheblich blockieren.
[0022] Zymosan, eine unlösliche Zubereitung aus Hefezellen, aktiviert Makrophagen über TLR2. TLR2 kooperiert bei der Reaktion auf Zymosan mit TLR6 und CD14. Zymosan wird auch von Dectin-1 erkannt, einem phagozytischen Rezeptor, der auf Makrophagen und dendritischen Zellen exprimiert wird und mit TLR2 und TLR6 zusammenarbeitet, wodurch die durch die Erkennung von Zymosan durch jeden Rezeptor ausgelösten Immunreaktionen verstärkt werden.
[0023] Als Hauptbestandteil von Pilzzellwänden wurden verschiedene ß-Glucane als Antigene zur Erzeugung von Anti-Glucan-Antikörpern gegen Pilzinfektionen verwendet (z.B.: Torosantucci et al. J Exp Med. 2005 Sep 5;202(5):597-606, Bromuro et al., Vaccine 28 (2010) 2615-2623, Liao et al., Bioconjug Chem. 2015 Mar 18;26(3):466-76).
[0024] Torosantucci et al. (2005) und Bromuro et al. (2010) veröffentlichen Konjugate aus dem verzweigten ß-Glucan Laminarin und dem linearen ßB-Glucan Curdlan, die an das Diphtherietoxoid CRM197 gekoppelt sind. Diese Konjugatimpfstoffe induzierten hohe IgG-Titer gegen das ßGlucan und verliehen Mäusen einen Schutz gegen Pilzinfektionen. Darüber hinaus können mit solchen Konjugaten auch hohe Titer gegen CRM197 nachgewiesen werden (Donadei et al., Mol Pharm. 2015 May 4;12(5):1662-72). Die Autoren haben auch ßB-Glucan-CRM197-Impfstoffe mit synthetischen linearen ß-(1,3)-Oligosacchariden oder ß-(1,6)-verzweigten ß-(1,3)-Oligosacchariden hergestellt, formuliert mit dem für den Menschen verträglichen Adjuvans MF59. Alle Konjugate induzierten hohe Titer von Anti-B-(1,3)-Glucan-IgG und/oder auch Anti-B-(1,6)-Glucan-Antikörpern zusätzlich zum Anti-B-(1,3)-Glucan-IgG, was die Immunogenität verschiedener Glucane in Kombination mit klassischen Trägerproteinen zeigt. Interessanterweise konnten Torosantucci et al. nach der Immunisierung mit CRM-Glucan-Konjugaten keine höheren Anti-CRM-Titer nachweisen als mit nicht konjugierten CRM allein.
[0025] Donadei et al. (2015) analysierten auch Konjugate des Diphtherietoxoids CRM197, die an lineares ß-(1,3)-Glucan Curdlan oder an synthetische ß-(1,3)-Oligosaccharide gekoppelt waren. Die Konjugate waren immunogen und führten zu vergleichbaren Antikörperreaktionen gegen CRM197. Interessanterweise zeigten die Autoren, dass CRM-Curdlan-Konjugate bei intradermaler Verabreichung im Vergleich zur intramuskulären (i.m.) Immunisierung zu höheren Antikörpertitern führten. Die intradermale Applikation von CRM-Curdlan zeigte jedoch keine unterschiedliche Immunogenität im Vergleich zur subkutanen Applikation. Darüber hinaus waren die In-vivoEffekte zwischen CRM-Curdlan und mit Alum adjuvantiertem, nicht mit Curdlan gekoppeltem CRM vergleichbar. Somit konnte in diesem System kein zusätzlicher Nutzen der CLEC-Kopplung auf die allgemeinen Immunantworten festgestellt werden.
[0026] Liao et al. (2015) stellten eine Reihe linearer ß-(1,3)-B-Glucan-Oligosaccharide (Hexa-, Octa-, Deca- und Dodeca-ß-Glucane) vor, die an KLH gekoppelt wurden, um Glykokonjugate herzustellen. Es hat sich gezeigt, dass diese Konjugate robuste T-Zell-Antworten auslösen und
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sehr immunogen sind und hohe Anti-Glucan-Antikörperspiegel induzieren. Mäuse, die mit solchen Impfstoffen immunisiert wurden, zeigten auch schützende Immunreaktionen gegen den tödlichen Krankheitserreger C. albicans. Es wurde kein Vergleich der Anti-KLH-Titer mit nicht konjugiertem KLH durchgeführt, so dass keine Informationen über einen potenziellen Nutzen des ßGlucans in diesem experimentellen Umfeld vorliegen.
[0027] Diese Erkenntnisse sind für die Anwendbarkeit von Neoglykokonjugaten auf Glucanbasis als neuartige Impfstoffe von großer Bedeutung: Potenzielle Anti-Glucan-Antikörper, die bei einer ersten Immunisierung mit einem Glucan-Konjugat induziert werden, könnten entweder zu einer schnellen Eliminierung derselben ß-Glucan-Impfstoffe bei nachfolgenden Auffrischungsimpfungen führen oder die Immunreaktionen gegen neuartige Neoglykokonjugat-Impfstoffe abschwächen, die gegen andere Indikationen gerichtet sind - ein Effekt, der von Vektorimpfstoffen bekannt ist. Das Vorhandensein oder sogar die (Re-)Stimulierung von hochgradigen Anti-Glucan-Antikörpern, wie oben für Mannan und ß-Glucane gezeigt (Petrushina et al. 2008, Torosantucci et al. 2005, Bromuro et al., 2010, Liao et al., 2015), könnte dadurch potenzielle Immunreaktionen, die durch Konjugatimpfstoffe ausgelöst werden, reduzieren oder eliminieren. Daher wäre es für eine neuartige und nachhaltige Plattform, die CLECs, insbesondere ß-Glucane, als Grundgerüst für die Immunisierung verwendet, von entscheidender Bedeutung, dass das verwendete Poly-/Oligosaccharid eine sehr geringe oder gar keine Glucan-Antikörper induzierende Kapazität aufweist.
[0028] Glucanpartikel (GPs) sind hochgereinigte 2-4 um große hohle poröse Zellwandmikrosphären, die hauptsächlich aus ß-(1,3)-D-Glucanen mit geringen Mengen an ß-(1,6)-D-Glucanen und Chitin bestehen und in der Regel aus Saccharomyces cerevisiae durch eine Reihe von heißen alkalischen, sauren und organischen Extraktionen isoliert werden. Sie interagieren mit ihren Rezeptoren Dectin-1 und CR3 (es gibt auch Hinweise auf eine Interaktion mit Toll-like-Rezeptoren und CD5 als zusätzliche Faktoren für die GP-Funktion) und regulieren die Zelloberflächenpräsentation von MHC-Molekülen, führen zu einer veränderten Expression von Co-Stimulationsmolekülen und induzieren die Produktion von entzündlichen Zytokinen. Aufgrund ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften wurden GPs für die Verabreichung von Impfstoffen erforscht.
[0029] Es gibt drei allgemeine Ansätze für die Verwendung von GPs in Impfstoffen: (i) als gemeinsam verabreichtes Adjuvans mit Antigen(en), um T- und B-Zellen-vermittelte Immunantworten zu verstärken, (ii) chemisch mit Antigenen vernetzt und am häufigsten verwendet (iii) als physisches Vehikel für die Verabreichung von Antigenen, die in der hohlen GP-Kavität eingeschlossen sind, um eine gezielte Antigenverabreichung an APCs zu ermöglichen.
[0030] Zu (i): Antigenspezifische adaptive Immunantworten können durch die gleichzeitige Verabreichung von GPs mit Antigenen verstärkt werden. Bei dieser konventionellen Adjuvans-Strategie werden sowohl angeborene als auch adaptive Immunreaktionen aktiviert, um Schutzreaktionen gegen Krankheitserreger auszulösen. Williams et al. (Int J Immunopharmacol. 1989;11(4): 403-10) beispielsweise adjuvantierten einen abgetöteten Trypanosoma cruzi-Impfstoff durch gleichzeitige Verabreichung von GPs. Die mit dieser Formulierung ausgelöste Immunreaktion führte dazu, dass 85 % der mit T. cruzi infizierten Mäuse überlebten. Im Gegensatz dazu lag die Sterblichkeitsrate bei den Kontrolltieren, die nur Dextrose, Glucan oder den Impfstoff erhielten, bei 100 %.
[0031] Zu (ii): Die Kohlenhydrat-Oberfläche von GPs kann auch kovalent modifiziert werden, und zwar durch NalQ«4 -Oxidation, Carbodiimid-Vernetzung oder 1-Cyano-4-dimethylaminopyridiniumtetrafluoroborat-vermittelte Konjugation von Antigenen an die GP-Hülle. Bei diesem Ansatz sind die Kopplungseffizienzen sehr gering (ca. 20 %, z. B. wie in Pan et al. Sci Rep 5, 10687 (2015) beschrieben), was die Anwendbarkeit und die Anzahl der Impfstoffkandidaten im Vergleich zur Antigenverkapselung in GPs oder der in diesem Antrag vorgeschlagenen Plattformtechnologie erheblich einschränkt. Solche kovalent verbundenen Antigen-GP-Konjugate wurden in Studien zur Krebsimmuntherapie und bei Infektionskrankheiten eingesetzt. So verwendeten Pan et al. (2015) OVA, das mit Periodat-oxidierten GPs vernetzt war, und immunisierten Mäuse subkutan mit diesem Impfstoff. Wenn Mäuse mit OVA-exprimierenden E.G7-Lymphomzellen herausgefordert wurden, wurde eine signifikante Verringerung der Tumorgröße beobachtet. GP-OVA war in
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DCs (CD11c MHC-Il**) in Lymphknoten 12 und 36 Stunden nach der subkutanen Injektion nachweisbar. Der Tumorschutz ging einher mit einem Anstieg des gesamten Anti-Ova-Immunglobulin (Ig)G-Titers, einer verstärkten Expression von MHC-II und co-stimulatorischen Molekülen (CD80, CD86) sowie einer verstärkten zytotoxischen Lymphozytenreaktion.
[0032] Zu iii): Der wirksamste Ansatz für die Verwendung von GPs in Impfstoffen besteht darin, sie zur Verkapselung von Impfstoffen/Antigenen in den hohlen Kern zu verwenden. GPs können ein oder mehrere Antigene/DNA/RNA/Adjuvantien/Arzneimittel/Kombinationen davon mit hoher Beladungseffizienz einkapseln, die von der Art der Nutzlast und der beabsichtigten Verabreichungsart abhängt.
[0033] Antigene können in den Hohlraum der GPs eingekapselt werden, indem Polymer-Nanokomplexierungsmethoden wie die Beladung und Komplexierung der Nutzlast mit Rinder- oder Mäuseserumalbumin und Hefe-RNA/tRNA oder die Zugabe von Alginat-Calcium- oder AlginatCalcium-Chitosan-Mischungen verwendet werden. Unter Verwendung dieser Strategien berichteten beispielsweise Huang et al. (Clin. Vaccine Immunol. 2013; 20:1585-91), dass mit GP-OVA geimpfte Mäuse eine starke CD4+ T-Zell-Lymphoproliferation, eine Th1- und Th17- verzerrte TZell-vermittelte Immunantwort sowie hohe IgG 1- und IgG2c-spezifische Antikörperreaktionen gegen Ovalbumin zeigten. Die nicht-kovalente Verkapselungsstrategie löste im Vergleich zu GPs, die zusammen mit dem Antigen verabreicht wurden, stärkere Immunreaktionen aus.
[0034] Beispiele für GP-verkapselte Untereinheiten-Impfstoffe sind GPs, die lösliche alkalische Extrakte von Cryptococcus neoformans acapsular strain (cap59) umhüllen, die Mäuse schützten, die mit tödlichen Dosen von hochvirulentem C. neoformans (60 % Uberleben) infiziert wurden, indem sie eine Antigen-spezifische CD4+ T-Zell-Antwort (positiv für IFN-y, IL-17A) induzierten, die die Pilz-Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) um mehr als das 100-fache der ursprünglichen Herausforderungsdosis reduzierte (Specht CA et al. Mbio 2015; 6: e01905- e1915. und Specht CA et al, mBio 2017; 8: e01872- e1917.). Außerdem erwies sich die Impfung von Mäusen mit GP-verkapselten Antigenen als wirksam gegen Histoplasma capsulatum (Deepe GS et al., Vaccine 2018; 36: 3359-67), F. tularensis (Whelan AO et al, PLOS ONE 2018; 13: e0200213), Blastomyces dermatitidis (Wuthrich M et al., Cell Host Microbe 2015; 17: 452-65) und C. posadaslii (Hurtgen BJ et al., Infect. Immun. 2012; 80: 3960-74).
[0035] Neben der Anwendung bei Krebs und Infektionskrankheiten wurde auch eine begrenzte Anzahl von Studien mit Selbstantigenen durchgeführt, bei denen GPs als Verkapselungsmittel für die Verabreichung von Impfstoffen eingesetzt wurden. In diesem Sinne beschreiben Rockenstein et al. (J. Neuroseci., January 24, 2018 - 38(4):1000 -1014) die Anwendung von GPs, die mit rekombinantem humanem aSynuclein-Protein (das sowohl B- als auch T-Zell-Epitope enthält, die für die Induktion von Anti-aSyn-Immunantworten geeignet sind) und Rapamycin beladen sind, von dem bekannt ist, dass es antigenspezifische regulatorische T-Zellen (Tregs) in einem murinen Modell für Synucleinopathien induziert. Wie in früheren Studien, in denen aSynuclein in voller Länge als Immunogen verwendet wurde, erwartet, führt die Anwendung der aSyn-haltigen GPs zur Induktion robuster Anti-aSynuclein-Antikörpertiter und mildert die durch aSynuclein ausgelösten pathologischen Veränderungen bei den Tieren in ähnlichem Ausmaß wie in früheren Veröffentlichungen. Die Zugabe von Rapamyein induzierte effizient die Bildung von ITreg-Zellen (CD25 und FOXP3+), da die Anzahl dieser Treg-Zellen nach Rapamycin- Exposition signifikant erhöht war. Mit dem Antigen aSynuclein und Rapamycin beladene GPs lösten somit in Mausmodellen der Synucleinopathie sowohl neuroprotektive humorale als auch iTreg-Reaktionen aus, wobei der Kombinationsimpfstoff (aSyn + Rapamycin) wirksamer war als die humorale (GP aSyn) oder zelluläre Immunisierung (GP Rapamycin) allein. Es liegen keine Informationen über die Vergleichbarkeit der Wirkungen mit einer herkömmlichen, nicht GP- haltigen aSynuclein-Immunisierung vor.
[0036] B-Glucan-Neoglykokonjugate zielen über den C-Typ-Lektinrezeptor Dectin-1 effizient auf dendritische Zellen ab und verstärken deren Immunogenität. Bestimmte ßB-Glucane wurden auch als potenzielle Träger für Impfungen mit Modellantigenen wie OVA (Xie et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 391 (2010) 958-962; Korotchenko et al. 2021;76:210-
222.) oder Fusionsproteinen auf der Basis von MUC1 (Wang et al., Chem. Commun., 2019, 55, 253) verwendet.
[0037] Xie et al. und Korotchenko et al. verwendeten das verzweigte B-Glucan Laminarin als Grundgerüst für die OVA-Konjugation. Diese Gluconeokonjugate wurden dann Mäusen entweder epiktuan oder subkutan verabreicht. Xie et al. zeigten, dass Laminarin/OVA-Konjugate, nicht aber nicht konjugierte Mischungen der Verbindungen, im Vergleich zu Ovalbumin allein eine verstärkte Anti-OVA-CD4+-T-Zell-Reaktion auslösten. Wichtig ist, dass die gleichzeitige Injektion von nicht konjugiertem Laminarin diese Verstärkung blockierte, was die Funktion des Laminarin-vermittelten APC-Targetings unterstützt. Wie erwartet, stimulierten natives OVA und die Mischung aus OVA und Laminarin eine geringe Produktion von Anti-OVA-Antikörpern. Im Gegensatz dazu verstärkte das OVA/Laminarin-Konjugat die Antikörperreaktionen erheblich. In ähnlicher Weise wiesen Korotchenko et al. nach, dass die Konjugation von Laminarin mit OVA die Aufnahme von OVA signifikant erhöht und die Aktivierung von BMDCs sowie die Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen induziert. Diese Eigenschaften des LamOVA-Konjugats führten auch zu einer verstärkten Stimulierung von OVA-spezifischen naiven T-Zellen, die mit BMDCs ko-kultiviert wurden. In einem Experiment zur prophylaktischen Immunisierung konnten die Autoren bestätigen, dass die Immunisierung mit LamOVA dessen Allergenität verringerte und im Vergleich zu OVA nach zwei Immunisierungen etwa dreifach höhere IgG 1-Antikörper-Titer induzierte. Dieser Effekt ging jedoch in allen behandelten Gruppen nach der dritten Immunisierung verloren, als alle Gruppen ähnliche Antikörpertiter aufwiesen. Lam/OVA-Konjugate und OVA/Alum-Konjugate zeigten eine vergleichbare therapeutische Wirksamkeit in einem murinen Modell für allergisches Asthma. Somit konnten diese Versuche keine eindeutig überlegene Wirkung von Konjugaten auf Glucanbasis im Vergleich zu herkömmlichen Impfstoffen belegen.
[0038] Wang et al. (2019) analysierten die Auswirkungen eines auf ß-Glucan basierenden MUC1-Krebsimpfstoffkandidaten. Auch hier wurde die MUC1-Tandem-Wiederholungssequenz GVTSAPDTRPAPGSTPPAKH, ein gut untersuchter Krebs-Biomarker, als Peptid-Antigen gewählt, das T- und B-Zell-Epitope innerhalb der Wiederholungssequenz bereitstellt. Ein Ethylenglykol (d.h. PEG) Spacer wurde verwendet, um ß-Glucan und das MUC1-Peptid mit Hefe-ßB-(1,3)-BGlucan-Polysaccharid unter Anwendung von 1,1'-Carbonyl-Diimidazol (CDI)-vermittelten Bedingungen zu verbinden. Die Größe der B-Glucan-MUC1-Nanopartikel lag im Bereich von 150 nm (tatsächlicher Durchschnitt 162 nm), während unmodifiziertes B-Glucan Partikel von ca. 540 nm bildete. Das B-Glucan-MUC1-Konjugat löste hohe Titer von Anti-MUC1-IgG-Antikörpern aus, die im Vergleich zu den Kontrollgruppen deutlich höher waren. Eine weitere Analyse der Isotypen und Subtypen der gebildeten Antikörper zeigte, dass IgG2b der wichtigste Subtyp ist, was auf die Aktivierung einer Th1-Reaktion hinweist, da das Verhältnis von 1gG2b/lgG1 >1 ist. Die beobachtete erhebliche Menge an IgM-Antikörpern deutet auf die Beteiligung der C3-Komponente des Komplementsystems hin, die häufig Zytotoxizität induziert und problematisch für die Verwendung solcher Grundgerüste für Impfstoffe sein könnte, die die Entwicklung von Zytotoxizität vermeiden sollen, z. B. bei chronischen oder degenerativen Krankheiten.
[0039] In der US 2009/169549 A1 werden Impfstoffe gegen a-Synuclein beschrieben, die (u.a.) Mannan und ß-Glucan umfassen.
[0040] Bisher wurden keine Berichte veröffentlicht, in denen die Konstruktion oder Verwendung einzelner B-Zell- oder T-Zell-Epitop-Peptide gezeigt wurde, die an B-Glucane, insbesondere lineare B-Glucane und/oder Pustulan mit hoher BindungsspezifitäV-fähigkeit an Dectin-1 gekoppelt wurden, wodurch neuartige Gluconeokonjugate wie die in diesem Antrag vorgeschlagenen gebildet wurden.
[0041] Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, verbesserte Impfstoffe als Konjugatimpfstoffe bereitzustellen, die aus dem Impfantigen bestehen, das mit CLEC-Adjuvantien auf Kohlenhydratbasis konjugiert ist, und insbesondere Impfstoffe bereitzustellen, die im Vergleich zu den Konjugatimpfstoffen des derzeitigen Stands der Technik, insbesondere den CLEC-Peptid/Protein-Konjugatimpfstoffen auf Kohlenhydratbasis, eine verbesserte Immunantwort beim geimpften Individuum hervorrufen.
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[0042] Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Impfstoffzusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die Immunität gegen kurze, leicht austauschbare, hochspezifische B/T-ZellEpitope unter Verwendung eines CLEC-Grundgerüsts mit bisher nicht erreichter Wirksamkeit, Spezifität und Affinität durch herkömmliche Impfstoffe verleihen.
[0043] Ein spezifisches Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Impfstoffen mit verbesserter Selektivität und/oder Spezifität eines CLEC-basierten Impfstoffs für das Hautkompartiment.
[0044] Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Impfstoffe bereitzustellen, die - möglichst ausschließlich - zielspezifische Immunantworten induzieren, aber keine oder nur sehr begrenzte CLEC- oder Trägerprotein-spezifische Antikörperantworten hervorrufen.
[0045] Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Impfstoffzusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die Immunität gegen kurze, leicht austauschbare, hochspezifische B/T-ZellEpitope von Alpha-Synuclein unter Verwendung eines CLEC-Rückgrats mit bisher nicht erreichter Wirksamkeit, Spezifität und Affinität durch herkömmliche Impfstoffe zur angemessenen Vorbeugung und Behandlung von Synucleopathien verleihen.
[0046] Ein spezifisches Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Alpha-Synuclein-Impfstoffen mit verbesserter Selektivität und/oder Spezifität eines CLEC-basierten Impfstoffs für das Hautkompartiment.
[0047] Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Impfstoffe zur Verfügung zu stellen, die - möglichst ausschließlich - alpha-Synuclein-spezifische Immunantworten induzieren, während sie keine oder nur sehr begrenzte CLEC- oder Trägerprotein-spezifische Antikörperantworten hervorrufen.
[0048] Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Peptid-Immunogen-Konstrukte des Alpha-Synuclein-Proteins (aSyn) und deren Formulierungen zur Behandlung von Synucleinopathien bereitzustellen.
[0049] Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Konjugat bereit, das aus mindestens einem ßGlucan und mindestens einem B-Zell- oder T-Zell-Epitop-Polypeptid besteht oder dieses umfasst, wobei das ßB-Glucan kovalent mit dem B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid konjugiert ist, um ein Konjugat aus dem ß-Glucan und dem B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid zu bilden, und wobei das B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid ein alpha-Synuclein-Polypeptid ist, wobei das ß-Glucan ein überwiegend lineares ß-(1,6)- Glucan mit einem Verhältnis von (1,6)-gekoppelten Monosaccharideinheiten zu nicht-B-(1,6)-gekoppelten Monosaccharideinheiten von mindestens 1:1 ist. Alternativ besteht das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung aus mindestens einem ß-Glucan und mindestens einem alpha-Synuclein-B-Zell-Epitop-Polypeptid oder umfasst dieses, wobei das ß-Glucan kovalent an das B-Zell-Epitop-Polypeptid konjugiert ist, um ein KonjJugat aus dem ß-Glucan und dem B-Zell-Epitop-Polypeptid zu bilden, wobei das ßB-Glucan ein überwiegend lineares ßB-(1,6)-Glucan mit einem Verhältnis von (1,6)-gekoppelten Monosaccharideinheiten zu nicht-B-(1,6)-gekoppelten Monosaccharideinheiten von mindestens 1:1 ist.
[0050] Vorzugsweise handelt es sich bei dem ß-Glucan um Pustulan, Lichenan, Laminarin, Curdlan, B-Glucanpeptid (BGP), Schizophyllan, Skleroglucan, ganze Glucanpartikel (WGP), Zymosan oder Lentinan, vorzugsweise Pustulan, Laminarin, Lichenin, Lentinan, Schizophyllan oder Skleroglucan, wobei es sich bei dem ßB-Glucan insbesondere um Pustulan handelt.
[0051] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das B-Glucan zur Verwendung als C-Typ Lectin (CLEC) Polysaccharid-Adjuvans für B-Zell- und/oder T-ZellEpitop-Polypeptide vorgesehen, insbesondere wobei das ß-Glucan kovalent mit dem B-Zellund/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid konjugiert ist, um ein Konjugat aus dem ß-Glucan und dem BZell- und/oder T-Zell- Epitop-Polypeptid zu bilden, wobei das ßB-Glucan ein überwiegend lineares B-(1,6)-Glucan mit einem Verhältnis von ßB-(1,6)-gekoppelten Monosaccharidanteilen zu nicht-ß(1,6)-gekoppelten Monosaccharidanteilen von mindestens 1:1 ist, vorzugsweise mindestens 2:1, noch bevorzugter mindestens 5:1, insbesondere mindestens 10:1.
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[0052] Mit der vorliegenden Erfindung werden eine oder mehrere der oben genannten Aufgaben erfolgreich gelöst. Dies war für den Fachmann unerwartet, denn bisher wurden auf dem vorliegenden Gebiet der Technik keine Berichte veröffentlicht, die den Aufbau und die Anwendbarkeit oder die Wirksamkeit von Verbindungen ähnlich den neuartigen, kleinen, modularen Gluconeokonjugaten gemäß der vorliegenden Erfindung zeigen.
[0053] Überraschenderweise wurde mit der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass durch Konjugation (d.h. durch kovalente Kopplung; hier synonym verwendet) von Peptiden/Proteinen an den ausgewählten CLEC-Träger gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Konjugation auf dem Stand der Technik beruhen kann, überlegene pharmazeutische Formulierungen zur Bewirkung von Immunantworten erhalten wurden. Im gegenwärtigen Stand der Technik steht eine erhebliche Anzahl unterschiedlicher Kopplungsmethoden zur Verfügung. Im Zuge der Ausarbeitung der vorliegenden Erfindung wurden die Hydrazonbildung oder die Kopplung über heterobifunktionelle Linker als besonders bevorzugte Methoden identifiziert. Im Allgemeinen ist eine Aktivierung der CLEC vor der Konjugation (z. B. Bildung reaktiver Aldehyde an benachbarten OH-Gruppen der Zuckereinheiten) und das Vorhandensein reaktiver Gruppen am Peptid/Protein der Wahl (z. B. N- oder C-terminale Hydrazidreste, SH-Gruppen (z. B. über N- oder C-terminale Cysteine)) erforderlich. Die Reaktion kann eine einstufige Reaktion sein (z. B. Mischen von aktivierten CLECs mit Hydrazid-Peptiden, was zur Bildung von Hydrazon führt, oder ein mehrstufiger Prozess (z. B.: aktivierte CLEC wird mit einem Hydrazid aus einem heterobifunktionellen Linker umgesetzt und anschließend wird das Peptid/Protein über entsprechende reaktive Gruppen gekoppelt).
[0054] Die neuartige Klasse von Konjugaten gemäß der vorliegenden Erfindung verleiht Immunität gegen kurze, leicht austauschbare, hochspezifische B/T-Zell-Epitope unter Verwendung des CLEC-Grundgerüsts der vorliegenden Erfindung und zeigt eine Wirksamkeit, Spezifität und Affinität, die bisher von herkömmlichen Impfstoffen nicht erreicht wurde: Tatsächlich sind die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung die ersten Beispiele für die Verwendung kurzer B-Zell/TZell-Epitope in einem CLEC-basierten Impfstoff, der die Notwendigkeit vermeidet, die AlphaSynuclein-Epitope in Form von Fusionsproteinen zu präsentieren, einschließlich der Bildung von Tandem-Wiederholungen von Epitopen oder der Fusion verschiedener Tandem-Wiederholungen zur Bildung eines stabilen und wirksamen Immunogens.
[0055] Mit der vorliegenden Erfindung kann auch die Notwendigkeit der Verwendung von Proteinen in voller Länge für die Verwendung in CLEC-Impfstoffen (d.h. Nutzlast in Glucanpartikeln (GPs)) vermieden werden. Darüber hinaus kann auch das Problem der Autoimmunreaktionen vermieden werden, die insbesondere durch (unerwünschte) T-Zell-Epitope in Immunogenen wie Selbstproteinen wie Alpha-Synuclein ausgelöst werden.
[0056] Gemäß der vorliegenden Erfindung können erstmals kurze Epitope (B- und/oder T-ZellEpitope, hauptsächlich Peptide, modifizierte Peptide) mit einem funktionellen CLEC-basierten Backbone durch kovalente Kopplung auf der Grundlage etablierter Chemie verbunden werden, wobei die möglichen Methoden zur Konjugation an die Erfordernisse des spezifischen Epitops auf der Grundlage von auf dem Gebiet bekannten Methoden angepasst werden können.
[0057] Die Präsentation des kurzen Peptids bzw. der kurzen Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung kann als einzeln konjugierte Einheiten in Kombination mit einem einzelnen fremden TZell-Epitop (als kurzes Peptid oder langes Protein) oder als Komplex/Konjugat mit einem größeren Trägermolekül erfolgen, das das T-Zell-Epitop für die Induktion einer nachhaltigen Immunantwort bereitstellt. Das Design der erfindungsgemäßen Impfstoffe ermöglicht die Herstellung multivalenter Konjugate als Voraussetzung für eine effiziente Induktion einer Immunantwort durch hocheffiziente B-Zeill-Rezeptor (BCR)-Vernetzung.
[0058] Darüber hinaus kann mit der vorliegenden Erfindung ein CLEC-basierter Impfstoff mit einer hervorragenden Selektivität/Spezifität für das dermale Kompartiment bereitgestellt werden. Das Konjugatdesign gemäß der vorliegenden Erfindung baut auf CLECs als Träger für die zielspezifischen Alpha-Synuclein-Epitope auf, die eine hohe Bindungsspezifität für PRRs auf dermalen APCs/DCs aufweisen, insbesondere für Dectin-1 (oder MR und DC-SIGN im Fall von Mannan), um eine selektive/spezifische und rezeptorvermittelte Aufnahme durch die Haut zu ermög-
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lichen (= gezielte Impfstoffabgabe).
[0059] Das CLEC-Polysaccharid, das gemäß der vorliegenden Erfindung als Träger verwendet wird, dient dazu, das Träger-Peptid-Konjugat in vorzugsweise dermale/kutane DCs zu fokussieren und eine Immunantwort auszulösen. Dies ist u.a. auf eine epidermale oder dermale (nicht subkutane) Spezifität zurückzuführen. Das CLEC-Grundgerüst und die effiziente Auslösung der dermalen Immunantwort gemäß der vorliegenden Erfindung tragen auch dazu bei, die obligatorische Verwendung von Adjuvantien zu vermeiden, die für herkömmliche Impfstoffe typisch sind und auch in beispielhaften CLEC-basierten Impfstoffen verwendet werden (z.B.: Verwendung von Alum, MF59, CFA, Polyl:C oder anderen Adjuvantien). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Verwendung von Adjuvantien erheblich reduziert oder weggelassen werden, z.B. in Fällen, in denen der Zusatz von Adjuvantien nicht angezeigt ist.
[0060] In früheren Anwendungen wurden mehrere CLECs verwendet, jedoch konnte keine der vorgeschlagenen Konjugatstrukturen eine Hautselektivität (d. h. hohe Dectin-1-Bindungsfähigkeit, hocheffizientes dermales DC-Targeting und überlegene Immunogenität bei der dermalen Anwendung im Vergleich zu allen anderen Wegen (d. h. subkutan, intramuskulär und i.p.) bieten.
[0061] Die Auswahl der CLEC gemäß der vorliegenden Erfindung wurde getroffen, um eine neuartige Lösung für hautspezifische DCs und hautspezifische Immunisierung mit hoher Wirksamkeit zu bieten. Die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung üben auch in anderen klassischen Geweben für die Immunisierung wie Muskel- oder subkutanem Gewebe eine begrenzte Aktivität aus, was im Gegensatz zu früheren beschriebenen CLEC-basierten Impfstoffen/Impfstoffkandidaten steht, die i.m. oder s.c. verabreicht wurden. Als Ergebnis der im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Experimente wurden Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere solche, die Pustulan als CLEC verwenden, als überraschend selektiv für die Hautimmunisierung identifiziert.
[0062] Mit der vorliegenden Erfindung wird es möglich, sich auf die Induktion von Alpha-Synuclein-spezifischen Immunantworten zu konzentrieren, während keine oder nur sehr begrenzte CLEC- oder Trägerprotein-spezifische Antikörperantworten induziert werden. Die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung lösen damit das Problem klassischer Konjugatimpfstoffe, die auf die Verwendung fremder Trägerproteine angewiesen sind, um eine nachhaltige Immunantwort zu induzieren. Der derzeitige Stand der Technik bei der Entwicklung von Konjugatimpfstoffen basiert stark auf Trägermolekülen wie KLH, CRM197, Tetanus-Toxoid oder anderen geeigneten Proteinen, die mit zielspezifischen Kurzantigenen komplexiert werden und das Substrat für Immunreaktionen gegen alpha-Synuclein für Synucleinopathien wie die Parkinson-Krankheit liefern.
[0063] Bevorzugte Polypeptid-Immunogenkonstrukte gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten ein B-Zell-Epitop von Alpha-Synuclein (aSyn, alpha Syn) und ein heterologes T-HelferzellEpitop (Th), das an ein CLEC gekoppelt ist. Die vorliegende Erfindung liefert überraschend überlegene neue Konjugate, die herkömmliche Impfstoffe in Bezug auf Immunogenität, Kreuzreaktivität gegen aSyn, Selektivität für aSyn-Spezies/Aggregate, Affinität, Affinitätsreifung und Inhibitionskapazität übertreffen, verglichen mit herkömmlichen Impfstoffen.
[0064] Die kovalente Konjugation des Alpha-Synuclein-Polypeptids mit dem B-Glucan oder Mannan gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine überraschende und unerwartete Verstärkung der Immunantwort auf solche Polypeptide. Dies ist insbesondere im direkten Vergleich mit herkömmlichen Impfstoffformulierungen, wie sie von Rockenstein et al. (2018) beschrieben wurden, beeindruckend, wie auch im folgenden Beispielabschnitt gezeigt wird.
[0065] Rockenstein et al. (2018) veröffentlichen die Anwendung von Hefe-Ganzglucan-Partikeln (GPs), die nicht kovalent mit aSyn und Rapamycin komplexiert sind, als Immuntherapie für die Parkinson-Krankheit. Diese GPs wurden nach einer Reihe von Heißalkali-, organischen und wässrigen Extraktionsschritten aus Saccharomyces cerevisiae hergestellt, was zu einem Endprodukt führte, das aus hoch gereinigten Hefezellwandpräparaten mit einem Durchmesser von 3 bis 4 um besteht, die frei von zytoplasmatischem Inhalt sind und von einer porösen, unlöslichen Hülle aus ßB-Glucanen (hauptsächlich B1-3-B-Glucane) umgeben sind.
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[0066] Wichtig ist, dass die von Rockenstein et al. (J. Neurosci., January 24, 2018 - 38(4):1000 1014) offengelegte Impfstoffzusammensetzung aus GPs bestand, die entweder mit Ovalbumin und Mausserumalbumin (MSA), menschlichem aSyn und MSA oder menschlichem aSyn, MSA und Rapamycin nicht-kovalent komplexiert waren. Diese Komplexierungsmethode beruht auf der Co-Inkubation der verschiedenen Nutzlasten mit GPs und der anschließenden Diffusion in den GP-Hohlraum ohne kovalente Bindung und ähnelt daher einer Reihe von Impfstoffen, die in Beispiel 5 dieses Antrags offengelegt werden, wo nur eine Mischung, aber keine kovalente Bindung von Komponenten zur Formulierung eines Impfstoffs verwendet wurde und die sich im Vergleich zu den Impfstoffen gemäß der vorliegenden Erfindung als ineffizient und ungeeignet erwiesen.
[0067] 1) Rockenstein et al. zeigen, dass die nicht-kovalente Vermischung von aSyn und GPs zu einer nachweisbaren Immunreaktion gegen aSyn führt, was zeigt, dass GPs als Adjuvans wirken können. Rockenstein et al. zeigen jedoch auch, dass die nicht-kovalente Zugabe/Co-Komplexierung von Rapamycin erforderlich ist, um die Funktionalität eines solchen Impfstoffs im Vergleich zu Kontrollen signifikant zu erhöhen. Aus dieser Sicht ist eine Mischung aus verschiedenen AdjJuvantien (GPs sowie der mTOR-Inhibitor Rapamycein) erforderlich, um einen voll funktionsfähigen Impfstoff, wie die durch die vorliegende Erfindung offengelegten Impfstoffe, bereitzustellen.
[0068] 2) Der von Rockenstein et al. offengelegte Impfstoff ist in diesem aSyn-Überexpressionsmodell aktiv, da er aSyn-spezifische T-Zell-Epitope (neben anderen T-Zell-Epitopen wie MSAabgeleiteten Epitopen) bereitstellt, um seine volle Funktionalität auszuüben, nämlich die Induktion einer neuroprotektiven, gegen aSyn gerichteten zellulären (d.h.: T-Zell-vermittelten) und humoralen (d.h. Antikörper/B-Zell-basierten) Immunantwort. Dies steht in direktem Gegensatz zur Lehre der vorliegenden Erfindung, bei der es bereits ausreicht, wenn durch die ausgewählten Impfstoffe nur aSyn-spezifische B-Zell-Antworten ausgelöst werden.
[0069] 3) Die Verwendung von aSyn in voller Länge birgt auch die Gefahr, autoreaktive, aSynspezifische T-Zellen zu induzieren, die das Potenzial haben, die zugrunde liegende Neuropathologie bei Morbus Parkinson und anderen Synukleopathien zu verschlimmern. Daher ist der von Rockenstein et al. vorgeschlagene GP-aSyn-Rapamycin-Impfstoff auch in dieser Hinsicht nicht für den Einsatz beim Menschen geeignet.
[0070] 4) Wie in Beispiel 5 gezeigt, kann auch die nicht-kovalente Vermischung von aSyn-abgeleiteten Peptiden (z.B.: SeqlD2, d.h. B-Zell-Epitope) und promiskuitiven T-Zell-Epitopen (z.B.: SeqlD7) mit einem ß-Glucan-Partikel (z.B.: nicht-oxidiertes Pustulan), ähnlich wie bei Rockenstein et al., eine schwache Antikörperreaktion gegen aSyn induzieren. Die erfindungsgemäßen Impfstoffe, die auf einer kovalenten Bindung solcher Peptide an ein geeignetes Glucan beruhen, führen jedoch zu einer deutlich anderen und besseren Immunantwort (siehe auch Figur 5).
[0071] Darüber hinaus zeigen solche kovalent verknüpften Impfstoffe, wie in Beispiel 6 und Figur 7 dargestellt, einen äußerst vorteilhaften Mangel an Anti-Glucan-Antikörper-Reaktionen im Vergleich zu nicht-kovalent gemischten Impfstoffen, die auf Glucanpartikeln und Peptiden aufbauen, wie sie In der vorliegenden Erfindung offenbart werden.
[0072] Die Offenbarung von Rockenstein et al. aus dem Stand der Technik deutet daher nicht auf den beanspruchten Gegenstand der vorliegenden Erfindung hin.
[0073] Jedes Alpha-Synuclein-Polypeptid, das ein B-Zell- und/oder ein T-Zell-Epitop umfasst, kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich der im Stand der Technik vorgeschlagenen Polypeptid-Impfstoffkandidaten, z. B. derjenigen, die in WO 2004/ 041067 A2, WO 2006/045037 A2, WO 2009/103105 A2, WO 2011/020133 A1 oder in Mandler et al. (Mol. Neurodeg. 10 (2015), 10; Acta Neuropath. 127 (2014), 861-879). Dementsprechend können Alpha-Synuclein-Polypeptide mit nativer Aminosäuresequenz (gemäß menschlichem AlphaSynuclein) oder von aSyn abgeleitete Polypeptide, die ein B-Zell- und/oder ein T-Zell-Epitop von aSyn umfassen, wie Mimics oder Mimotope davon, als Alpha-Synuclein-Polypeptidkomponente in den Konjugaten gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
[0074] Speziell bevorzugte aSyn-Polypeptide, die in der vorliegenden Erfindung konjugiert werden sollen, sind ausgewählt aus nativem Alpha-Synuclein oder einem Polypeptid, das die Ami-
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SS N SS
nosäurereste 1 bis 5, 1 bis 8, 1 bis 10, 60 bis 100, 70 bis 140, 85 bis 99, 91 bis 100, 100 bis 108, 102 bis 108, 102 bis 109, 103 bis 129, 103 bis 135, 107 bis 130, 109 bis 126, 111 bis 121, 111 bis 135, 115 bis 121, 115 bis 122, 115 bis 123, 115 bis 124, 115 bis 125, 115 bis 126, 118 bis 126, 121 bis 127, 121 bis 140 oder 126 bis 135, der Aminosäuresequenz von nativem menschlichem Alpha-Synuclein: MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDOQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDPDNEAYEMPSE EGYQDYEPEA (humanes aSyn (1-140 aa): UNIPROT-Hinterlegungsnummer P37840),
vorzugsweise ein Polypeptid, das die Aminosäurereste 1 bis 8, 91 bis 100, 100 bis 108, 103 bis 135, 107 bis 130, 115 bis 121, 115 bis 122, 115 bis 126, 118 bis 126, 121 bis 127 oder 121 bis 140 umfasst oder daraus besteht; oder Mimotope, ausgewählt aus der Gruppe DQOPVLPD, DQPVLPDN, DQPVLPDNE, DQPVLPDNEA, DQPVLPDNEAY, DQPVLPDNEAYE, DSPVLPDG, DHPVHPDS, DTPVLPDS, DAPVTPDT, DAPVRPDS, und YDRPVOPDR.
[0075] Weihofen et al. (Neurobiology of Disease 124 (2019) 276-288) haben die N-terminalen Reste aa1-10 (MDVFMKGLSK) als ein geeignetes aSyn-Epitop entdeckt. PRX002 (wie offengelegt in Masliah et al., (PLoS One 6:e19338); Games et al., (2014, J Neurosci 34:9441- 9454); Schenk et al., (Mov Disord. 2017 Feb;32(2):211-218.); Jankovic et al., (JAMA Neurol. 2018 Oct 1;75(10):1206-1214..)) ist auf die C-terminale Region aa118-126 (VDPDNEAYE) gerichtet. Schofield et al. (Neurobiol Dis. 2019 Dec;132:104582.) enthüllten das aSyn-spezifische monoklonale Ab MEDI-1341, das gegen ein ähnliches Epitop in der C-terminalen Region von aSyn (aa 103129, NEE-GAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMP) gerichtet ist. MEDI Ab (aa121-127; DNEAYEM) wurde von Nordström et al. offengelegt (Neurobiology of Disease 161 (2021) 105543). Andere geeignete Epitope für Antikörper/Immuntherapeutika in aSyn, die dem Fachmann bekannt sind, umfassen Epitope von Autoantikörpern (wie offengelegt in Heinzel et al., (PLoS ONE 9(12): e114566.); Rabenstein et al, (Neurosci Lett. 2019 Jun 21;704:181-188); US 2014/0377271 A1 und Li et al. (Acta Neuropathologica 137, 825-836 (2019))) umfassen aa60-100, aa60-95, aa7382, aa91-100; aa74-79 und aa92-97, aa121-140 und aa111-121. Darüber hinaus offenbaren Games et al. (2014) auch geeignete Epitope aa 91-99 und aa 118 -126. In US 2005/0037013 A1 werden immunogene Alpha-Synuclein-Fragmente offengelegt, die eine Immunantwort gegen ein spezifisches Epitop innerhalb der Reste aa70- 140 hervorrufen können. WO 2009/103105 A2 und WO 2011/020133 A1 offenbaren molekulare Mimics von aa102-108 bzw. aa115-121. WO 2016/062720 A1 stellt modifizierte VLPs zur Verfügung, die Th- Zell-Epitope, die die mittlere Region (aa102-109) repräsentieren, sowie N-terminale (aa1-8) Sequenzen oder C-terminale Sequenzen (d.h. aa131-140) umfassen, die eine hohe Anti-Peptid-Antwort induzieren konnten. Mittlere und C-terminale Epitope waren ebenfalls in der Lage, aSyn-spezifische Titer zu induzieren, die verschiedene aSyn-Spezies (z. B. monomer und oligomer) erkennen. Interessanterweise konnten die bereitgestellten Impfstoffe die aSyn-Belastung oder Verhaltensänderungen in In-vivoPD-Modellen nicht verringern. US 2015/0232524 A1 offenbart Polypeptid-Immunogene, insbesondere aa10-14 und aa36-69, und Epitope wurden in aa85-99, aa109-126 und aa126-140 gezeigt. Interessanterweise rufen alle Konstrukte eine Anti-aSyn-Immunreaktion hervor, jedoch scheint das Epitop aa109-126 weniger wirksam zu sein. WO 2018/232369 A1 zeigt die Anwendung von zielspezifischen B-Zell-Epitopen (10-25aa, abgeleitet vom C-Terminus von aSyn; Region: aa111-135).
[0076] Obwohl die vorliegende Erfindung prinzipiell in der Lage ist, alle vorgeschlagenen aSynImpfpolypeptide zu verbessern, wurden ausgewählte Epitope speziell im Hinblick auf ihre Eignung mit der vorliegenden Plattform bewertet. So hat sich zum Beispiel gezeigt, dass aa1-8 (SeqglD12+13) einem KLH-basierten Impfstoff überlegen ist.
[0077] Während die Art des Alpha-Synuclein-Polypeptids für die Herstellung von B-Glucan- oder Mannan-Konjugaten nicht entscheidend ist, gibt es bevorzugte und weniger bevorzugte AlphaSynuclein-Epitope, je nachdem, welche Aufgabe das Konjugat zu lösen hat (Spezifität für Monomere oder Aggregate, Selektivität, Affinität, Erzeugung von Antikörpern usw.).
[0078] Bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die B-Zell-Epitope aa91100, aa100-108, aa107-114 und aa131-140 aufgrund der geringeren Anti-Peptid-Reaktion und
der geringeren Reaktivität gegenüber Alpha-Synuclein (aa91-100) weniger bevorzugt; geringe Kreuzreaktivität (CR) zu Alpha-Synuclein (trotz hoher Anti-Peptid-Titer), geringere Selektivität für Aggregate (aa100-108); geringere Wirksamkeit bei der Hemmung der Aggregation (aa107-114); und Anderung der Selektivität (für Monomer statt Aggregate), geringere Selektivität, geringere Wirksamkeit bei der Senkung der Alpha-Synuclein-Aggregate (aa131-140). Darüber hinaus werden Epitop-Polypeptide mit 5 oder weniger Aminosäureresten (oder mit 6 oder weniger Aminosäureresten) in der Regel auch weniger bevorzugt, da mit solchen Kurzformen geringere Immunreaktionen ausgelöst werden können.
Speziell bevorzugte Alpha-Synuclein-Epitope gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen die oben genannten Epitope, die die Aminosäurereste 1 bis 5, 1 bis 8, 1 bis 10, 60 bis 100, 70 bis 140, 85 bis 99, 91 bis 100, 100 bis 108, 102 bis 108, 102 bis 109, 103 bis 129, 103 bis 135, 107 bis 130, 109 bis 126, 111 bis 121, 111 bis 135, 115 bis 121, 115 bis 122, 115 bis 123, 115 bis 124, 115 bis 125, 115 bis 126, 118 bis 126, 121 bis 127, 121 bis 140 oder 126 bis 135 der Aminosäuresequenz von nativem menschlichem Alpha-Synuclein.
[0079] Zum Beispiel sind aa115-126 und die oben erwähnten kürzeren Sequenzen und Mimotope davon in Bezug auf Immunogenität, Selektivität, Aggregathemmung usw. besonders geeignet; im Allgemeinen zeigen Polypeptide mit 7 oder mehr Aminosäureresten eine gute Immunreaktion und Kreuzreaktivität zu Alpha-Synuclein;
aa 115-121 (und die C-terminal verlängerten Polypeptide (z.B. bis aa126) zeigen eine ausgezeichnete Immunreaktivität und Kreuzselektivität (sogar im Gegensatz zu dem monoklonalen Antikörper LB509, der an das Epitop 115-122 bindet (Jakes et al., Neurosci Lett. 1999 Jul 2;269(1):13-6)); überraschenderweise zeigen die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung eine deutlich verbesserte Selektivität für Aggregate im Vergleich zu "klassischen Konstrukten" mit CRM197 oder KLH als Trägerprotein (während z.B. CRM- basierte Impfstoffe häufig keine Selektivität für Aggregate aufweisen oder sogar selektiv für das Monomer sind, zeigen die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung eine deutliche und ausgeprägte Aktivität gegenüber Aggregaten).
[0080] Dies ist umso überraschender angesichts der veröffentlichten Experimente, in denen LB509 an Alpha-Synuclein-Aggregate bindet, aber nicht in der Lage ist, die Aggregation zu hemmen (Breydo et al. Mol Neurobiol 53, 1949-1958 (2015)), was zeigt, dass nicht jeder Antikörper von diesem Epitop biologisch aktiv ist, wie im Fall der vorliegenden Erfindung.
[0081] Es ist in der Fachwelt allgemein anerkannt, dass Morbus- Parkinson-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen andere Veränderungen in ihrem T-Zell-Kompartiment aufweisen (z. B.: Bas et al., J Neuroimmunol 2001; 113:146-52 oder Gruden et al., J Neuroimmunol 2011; 233:221-7). Solche phänotypischen Veränderungen der T-Zellen bei Morbus Parkinson sind z. B.: verringerte absolute Lymphozytenzahlen, verringerte absolute und relative Zahlen der gesamten T-Zellen, verringerte absolute und relative Zahlen der CD4+ und manchmal auch CD8+ Lymphozyten, erhöhte Th1/Th2- und Th17/Treg-Verhältnisse und eine erhöhte Expression entzündlicher Zytokine. Die meisten dieser Veränderungen finden sich jedoch auch beim gesunden Altern, so dass es schwierig ist, die Auswirkungen einer Krankheit wie Morbus Parkinson zu erkennen, die in einem sehr breiten Spektrum (>30-90 Jahre) auftritt und unterschiedlich schnell fortschreitet. Was die absoluten Zellzahlen betrifft, so scheint es einen Konsens zu geben, dass die Zahl der CD3+CD4+ T-Zellen bei Morbus Parkinson abnimmt. Dieser CD4-Rückgang wird durch das beschriebene veränderte CD4:CD8-Verhältnis unterstützt.
[0082] In diesem Sinne zeigen beispielsweise Bhatia et al. (J Neuroinflammation (2021) 18:250) einen allgemeinen Rückgang der gesamten CD3+ T-Zellen bei Morbus Parkinson in Verbindung mit der Schwere der Erkrankung (z. B. gemessen anhand der H+Y-Stadien). Dies deutet auf eine fortschreitende allgemeine T-Zell-Dysfunktion bei fortschreitender Krankheit hin, die wahrscheinlich auf die kombinierte Wirkung von anhaltender Entzündung, Medikamenten und Lebensstiländerung zurückzuführen ist. Außerdem zeigen Lindestam Arlehamn et al. (2020), dass die höchste T-Zell-Aktivität bei Parkinson-Patienten im Prodromalstadium oder im frühen klinischen Stadium (<10 Jahre Dauer und H+Y-Stadien 0-2) nachweisbar ist.
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[0083] Daher ist es eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Behandlung zur Erhöhung oder Erhaltung der T-Zell- Zahlen, insbesondere der T-Effektor-Zell-Zahlen, und der T-Zell- Funktion bei einem PD-Patienten bereitzustellen. Dies umfasst vorzugsweise eine Kombination von Checkpoint-Inhibitoren oder Impfstoffen, die Anti-Immun-Checkpoint-InhibitorEpitope verwenden, um eine Anti-Immun-Checkpoint-Inhibitor-Immunantwort in Kombination mit zielspezifischen Impfstoffen der vorliegenden Erfindung zu induzieren, um die T-Zell-Zahlen, insbesondere die T-Effektor- Zell-Zahlen und die T-Zell-Funktion in einem Parkinson-Patienten zu erhöhen oder zu erhalten.
[0084] Patienten, die für die Behandlung geeignet sind, zeichnen sich durch eine allgemeine Verringerung der CD3+-Zellen, insbesondere der CD3+CD4+-Zellen aus, die für Parkinson-Patienten in allen Krankheitsstadien typisch ist. Die bevorzugten Krankheitsstadien, die die für diese Kombination geeigneten Patientengruppen definieren, sind H+Y-Stadien 1-4, bevorzugt H+Y1-3, am meisten bevorzugt H+Y 2-3.
[0085] Auch die Affinitätsreifung von zielspezifischen Reaktionen, die bei wiederholter Immunisierung mit Trägerkonjugaten ausgelöst werden, wird durch die Überrepräsentation von trägerspezifischen Epitopen in den Konjugaten beeinträchtigt. Unter Affinitätsreifung versteht man in der Immunologie den Prozess, durch den Te zellaktivierte B-Zellen im Verlauf einer Immunantwort Antikörper mit erhöhter Affinität für Antigene produzieren. Bei wiederholter Exposition gegenüber demselben Antigen produziert ein Wirt Antikörper mit sukzessive höherer Affinität. Eine sekundäre Reaktion kann Antikörper mit einer um ein Vielfaches höheren Affinität als bei einer primären Reaktion hervorrufen. Die Affinitätsreifung erfolgt in erster Linie auf den OberflächenImmunglobulinen der B-Zellen des Keimzentrums und als direktes Ergebnis der somatischen Hypermutation (SHM) und der Selektion durch Tr Zellen (siehe auch: https://en.wikipedia.org/wiki/ Affinity_maturation). Affinitätsreifung nach dem Segen’'s Medical Dietionary (https://medical-dictionary.thefreedictionary.com/affinity+maturation">Affinitätsreifung) ist die erhöhte durchschnittliche Affinität von Antikörpern zu einem Antigen, die auf eine Immunisierung folgt. Die Affinitätsreifung resultiert aus einer Zunahme spezifischer und homogener IgG-Antikörper und folgt auf eine weniger spezifische und heterogenere frühe Reaktion von IgM-Molekülen.
[0086] Die derzeit verfügbaren CLEC-Impfstoffe induzieren alle hohe Titer gegen die verwendeten Trägerproteine (z. B. CRM197 oder OVA). Diese hohe Immunogenität sowie die strukturelle Komplexität und Heterogenität der Trägerproteinkomponente können jedoch dazu führen, dass hohe Mengen an träger- bzw. protein-spezifischen Antikörpern auf Kosten von zielspezifischen Reaktionen induziert werden, die daher im Vergleich zur induzierten Trägerantwort unterrepräsentiert sein könnten.
[0087] Darüber hinaus bergen hohe Antiträgerreaktionen auch das Risiko einer immunologischen Abstoßung und damit verbundene Sicherheitsprobleme.
[0088] Durch die Identifizierung wirksamer Konstrukte mit hoher Immunogenität, hoher Zielspezifität und hoher Verträglichkeit/Sicherheit bei geringer oder fehlender Trägerreaktivität (d. h. gegen den Proteinträger) gemäß der vorliegenden Erfindung wird diese Herausforderung durch innovative Lösungen erfolgreich bewältigt. Darüber hinaus ist es für die neuartigen Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung von entscheidender Bedeutung, immuntherapeutische Wirkstoffe bereitzustellen, die keine/sehr schwache Immunreaktionen gegen das Zuckergerüst auslösen. Dies ist besonders wichtig, da hohe Anti-CLEC-Antikörperspiegel, die bei der Immunisierung induziert werden, die Wirksamkeit einer wiederholten Immunisierung mit demselben CLEC-basierten Impfstoff aufgrund der Neutralisierung des Impfstoffs hemmen oder verringern könnten oder sich auch negativ auf die Verwendung dieser Art von Impfstoffen für die aufeinanderfolgende Immunisierung gegen verschiedene Ziele auswirken könnten.
[0089] Die erfindungsgemäße Impfstoffplattform erfüllt auch die Anforderung, verschiedene Epitope, die auf ein oder mehrere Ziele gerichtet sind, in einer Formulierung zu kombinieren, ohne dass die Gefahr besteht, dass die Wirksamkeit aufgrund einer unbeabsichtigten Epitopausbreitung, wie sie bei klassischen Impfstoffen auftritt, verringert wird. Der modulare Aufbau der erfindungsgemäßen Plattform ermöglicht einen einfachen Austausch von B- und T-Zell-Epitopen ohne
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negative Auswirkungen einer trägerinduzierten Reaktion.
[0090] Die vorliegende Erfindung basiert auf einem CLEC, der eine hochspezifische Bindung an den entsprechenden Rezeptor ausübt. Diese Bindung ist von entscheidender Bedeutung, und nur starke Bindemittel sind als Impfstoffträger/Backbones effizient.
Die CLEC-Konjugation gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine effiziente Immunantwort mit neuartigen Eigenschaften. Die erfindungsgemäße Konjugation schließt die Bildung von Anti-CLEC-Antikörpern, insbesondere für Pustulan, aus, was im Rahmen der vorliegenden Erfindung eindrucksvoll gezeigt werden konnte. Das Fehlen der Bildung von Anti-CLEC-Antikörpern ist für die Wiederverwendbarkeit und Auffrischung einzelner Impfstoffe, die mit der erfindungsgemäßen Plattform entwickelt wurden, von großer Bedeutung - sei es mit den gleichen oder anderen Antigenen.
[0091] Im Gegensatz zur konjugierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung führt ein bloBes Mischen des CLEC-Polysaccharid-Adjuvans und der B-Zell- oder T-Zell-Epitop-Peptide nicht zu vergleichbaren Wirkungen in vivo. Im Falle der Konjugation hat die Orientierung des Peptids jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Leistung der erfindungsgemäßen Verbindungen; die CLEC-Konjugation ist daher im Wesentlichen unabhängig von der Peptidorientierung im Konstrukt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, dass die CLEC-Konjugation, insbesondere an Pustulan, zu einer Verbesserung sowohl neuer als auch bestehender Peptid-Immunogene/Antigene von alpha-Synuclein führt: Diese Verbesserung erfolgt durch höhere, zielspezifischere und affinere Antikörperreaktionen (wie sich anhand der Antikörperselektivität und -funktionalität zeigen lässt). Dieser Effekt ist am stärksten ausgeprägt bei Pustulan oder ähnlichen B-Glucanen, die überwiegend lineare ßB-(1,6)-Glucane mit einem Verhältnis von ßB-(1,6)gekoppelten Monosaccharidanteilen zu nicht-B-(1,6)-gekoppelten Monosaccharidanteilen von mindestens 1:1, vorzugsweise mindestens 2:1, bevorzugter mindestens 5:1, insbesondere mindestens 10:1 sind, die überraschenderweise sogar deutlich besser als KLH oder CRM im direkten Vergleich und sogar besser als Mannan- oder Lichenan-Konjugate oder Konjugate, die Gerstenß-Glucane enthalten, abschneiden.
[0092] Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "überwiegend lineare" B-(1,6)-Glucane auf B-(1,6)-D-Glucane, bei denen keine oder nur wenige vernetzende Zuckermonomereinheiten vorhanden sind, d. h. bei denen weniger als 1%, vorzugsweise weniger als 0,1 %, insbesondere weniger als 0,01 % der Monosaccharideinheiten mehr als zwei kovalent gebundene Monosaccharideinheiten aufweisen.
[0093] Wie bereits oben erwähnt, ist Pustulan der bevorzugte CLEC im Sinne der vorliegenden Erfindung. Pustulan ist in der Regel frei von vernetzenden Zuckereinheiten und überwiegend ß(1,6)-gekoppelt, so dass übliche Pustulanzubereitungen, die zur Herstellung der Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, weniger als 1 %, vorzugsweise weniger als 0.1 %, insbesondere weniger als 0,01 %, Monosaccharidanteile mit mehr als zwei kovalent gebundenen Monosaccharidanteilen enthalten und maximal 10 % Verunreinigungen mit ßB-(1,3)-oder B-(1,4)-gekoppelten Monosacchariden enthalten.
[0094] Die Tatsache, dass sich Pustulan im Rahmen der vorliegenden Erfindung als der wirksamste CLEC erwies, war unerwartet, da verschiedene Referenzen zeigen, dass Pustulan bei der Dectin-1-Bindung weniger wirksam sein sollte (z. B. Adams et al., J Pharmacol Exp Ther. 2008 Apr;325(1):115-23); in der Literatur wird berichtet, dass lineare 1,3 und verzweigte (1,3Hauptkette und 1,6-Seitenast) die wirksamsten Dectin-1-Binder sind. Adams et al. (2008) berichteten beispielsweise, dass rekombinantes Dectin-1 aus Mäusen nur Polymere erkannte und mit ihnen interagierte, die ein B-(1,3)-verknüpftes Glukoserückgrat enthielten. Dectin-1 interagierte weder mit einem Glucan, das ausschließlich aus einem ß-(1,6)-Glukoserückgrat bestand (Pustulan), noch mit Nicht-Glucan-Kohlenhydratpolymeren, wie Mannan.
[0095] Darüber hinaus zeigten die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung auch ein proportional stark erhöhtes Verhältnis von Antikörpern, die auf das Zielpolypeptid reagierten, im Vergleich zu Antikörpern die auf Trägermoleküle wie bei nicht-CLEC-, insbesondere nicht pustulanhaltigen Impfstoffen, reagierten. Dies erhöht den spezifischen Fokus der Antikörper-Immunant-
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wort auf das Zielpolypeptid und nicht auf den Träger, was wiederum zu einer erhöhten Wirksamkeit und Spezifität der Reaktion führt.
[0096] Die CLEC-Konjugation gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere mit Pustulan, führt auch zu einer erhöhten Affinitätsreifung (AM) gegenüber Zielproteinen (AM wird stark erhöht, während KLH/CRM-Konjugate bei wiederholter Immunisierung nur eine begrenzte AM aufweisen).
[0097] Auf dem Gebiet der Impfstoffe wurden geeignete Impfstoffe mit ausschließlich B-ZellEpitopen oder ausschließlich T-Zell-Epitopen offengelegt. Es gibt bestimmte Umstände, unter denen Impfstoffe mit ausschließlich T-Zell-Epitopen oder ausschließlich B-Zell-Epitopen angemessen und vorzuziehen sind. Die meisten der auf dem Markt befindlichen Impfstoffe enthalten jedoch beide Arten von Epitopen, d. h. T-Zell-Epitope und B-Zell-Epitope.
[0098] So sind beispielsweise Impfstoffe, die nur B-Zell-Epitope enthalten, in den meisten Fällen nicht sehr wirksam, auch wenn sie zu einer nachweisbaren Antikörper-Immunantwort führen. In den meisten Fällen ist diese Immunreaktion jedoch weit weniger wirksam als bei einem Impfstoff, der B- und T-Zell-Epitope enthält. Dies steht auch im Einklang mit den Beispielen im Abschnitt "Beispiele" der vorliegenden Erfindung, bei denen eine geringere Reaktion nachweisbar war.
[0099] Andererseits sind Impfstoffe, die nur T-Zell-Epitope enthalten (z. B. in Impfstoffen, bei denen eine spezifische T-Zell-Antwort die aktive Komponente der Antwort wäre), für bestimmte Anwendungen besonders interessant, insbesondere für Krebs, bei denen krebsspezifische zytotoxische T-Lymphozyten- und T-Helfer- zell-Epitope oder nur CTL-Epitope mit der Impfstoffplattform gemäß der vorliegenden Erfindung kombiniert werden. In diesem Fall wird ein T-Zell-Epitop mit dem CLEC-Polysaccharid-Adjuvans gemäß der vorliegenden Erfindung nur mit dem T-ZellEpitop versehen. Dies wird z. B. in Fällen bevorzugt, in denen somatische Mutationen in Krebserkrankungen proteinkodierende Gene betreffen, die zu potenziell therapeutischen Neoepitopen führen können. Diese Neoepitope können die Grundlage für adoptive Zelltherapien und peptid(und RNA-) basierte Neoepitop-Impfstoffe bilden, um mit autologen zytotoxischen T-Zellen des Patienten selektiv gegen Tumorzellen vorzugehen. Die Verwendung eines Impfstoffs, der nur TZell-Epitope enthält, kann auch bei bestimmten Autoimmunkrankheiten von Vorteil sein. Der Behandlungseffekt des jeweiligen Konjugats, das nur T-Zell-Epitope enthält, ist mit einer Verringerung der Effektor-T-Zellen und der Entwicklung regulatorischer T-Zell-Populationen (T,eg) verbunden, was zur Dämpfung der jeweiligen Autoimmunerkrankung (z. B. Multiple Sklerose oder ähnliche Erkrankungen) führt.
[00100] Da die meisten der üblichen Impfstoffe sowohl B-Zell- als auch T-Zell-Epitope enthalten, umfassen auch die CLEC-Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise sowohl einzelne B- als auch T-Zell-Epitope (mindestens ein B-Zell-Epitop von Alpha-Synuclein und mindestens ein T-Zell-Epitop) für eine anhaltende B- Zell-Immunantwort. Eine schwache Wirkung kann jedoch bei Bedarf eine T-Zell-unabhängige Immunität demonstrieren.
[00101] Die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung sind daher in Bezug auf mögliche Impfstoffantigene nicht beschränkt. Daher können die Alpha-Synuclein-Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung zusätzlich weitere Antigene enthalten, um bi-, tri-, tetra-, penta-, hexa- (usw.) oder multispezifische Impfstoffe bereitzustellen.
[00102] Vorzugsweise haben die Impfstoffantigene (d. h. B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptide) eine Länge von 6 bis 50 Aminosäureresten, vorzugsweise von 7 bis 40 Aminosäureresten, insbesondere von 8 bis 30 Aminosäureresten.
[00103] Eine Quervernetzung von B-Zell-Rezeptoren ist mit den erfindungsgemäßen Impfstoffen ebenfalls möglich. Gemäß einer speziellen Ausführungsform werden die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung für eine T-Zeil-unabhängige Immunisierung verwendet. T-Zell-unabhängige Reaktionen sind für Polysaccharid-Impfstoffe gut bekannt. Diese Impfstoffe bzw. das Polysaccharid erzeugen eine Immunantwort durch direkte Stimulierung der B-Zellen, ohne die Hilfe von T-Zellen. Die T-Zell-unabhängige Antikörperreaktion ist von kurzer Dauer. Die Antikörperkonzentrationen für Pneumokokken-Kapselpolysaccharide sinken je nach Serotyp in der Regel nach
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3-8 Jahren auf den Ausgangswert zurück. In der Regel kann die Impfantwort durch zusätzliche Dosen nicht verstärkt werden, da der Polysaccharid-Impfstoff kein immunologisches Gedächtnis bildet. Bei Kindern unter zwei Jahren ist der Polysaccharid-Impfstoff nur schwach immunogen. Hier könnte der Grund für die direkte Stimulation darin liegen, dass B-Zellen ein Molekül namens CR3 (Komplementrezeptor Typ 3) exprimieren. Das Makrophagen-1-Antigen oder CR3 ist ein menschlicher Zelloberflächenrezeptor, der auf B- und T-Lymphozyten, polymorphkernigen Leukozyten (vor allem Neutrophilen), NK-Zellen und mononuklearen Fresszellen wie Makrophagen zu finden ist. CR3 erkennt auch iC3b, wenn es an die Oberfläche fremder Zellen gebunden ist, und ß-Glucan, was bedeutet, dass die direkte Aufnahme des Impfstoffs durch B-Zellen über eine Pus-CR3-Interaktion zur Stimulierung der Zellen und zur Entwicklung einer schwachen TI-Immunantwort führen könnte.
[00104] Die Adjuvantien, Konjugate und Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung können Komplement binden und opsonisiert werden. Opsonisierte Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung könnten eine erhöhte B-Zell-Aktivierungsfähigkeit aufweisen, was zu höheren Antikörpertitern und Antikörperaffinitäten führen könnte. Dieser Effekt ist für C3d-Konjugate bekannt (Green et al., J. Virol. 77 (2003), 2046-2055) bekannt und ist überraschenderweise auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung nutzbar.
[00105] Ein weiterer unerwarteter Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die CLEC-Architektur der vorliegenden Erfindung einen modularen Aufbau des Impfstoffs ermöglicht. So können beispielsweise Epitope beliebig kombiniert werden und die Plattform ist unabhängig von herkömmlichen Trägermolekülen. Obwohl der Schwerpunkt der vorliegenden Erfindung auf reinen Peptidimpfstoffen liegt, funktioniert sie auch mit der unabhängigen Kopplung von Proteinen und Peptiden sowie mit der Kopplung von Peptid-Protein-Konjugaten an die CLEC-Backbones gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere an Pustulan. Wie im Beispielsabschnitt mit Pustulan gezeigt, wird mit der vorliegenden Erfindung eine signifikant bessere Immunantwort im Vergleich zu klassischen Impfstoffen erzielt.
[00106] Wie bereits oben beschrieben, können die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn sie in einem pharmazeutischen Präparat bereitgestellt werden (z. B. als Impfstoff, der dazu bestimmt ist, einem (menschlichen) Probanden verabreicht zu werden, um eine Immunreaktion auf ein spezifisches Polypeptidepitop auszulösen, das an das CLEC-Grundgerüst konjugiert ist, wobei die Immunreaktion auf dieses Epitop ausgelöst werden sollte), ohne die Notwendigkeit der Verwendung (durch gemeinsame Verabreichung) eines (weiteren) Adjuvans in diesem Präparat verabreicht werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die pharmazeutische Formulierung, die das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, frei von Adjuvantien.
[00107] Eine besonders bevorzugte Klasse von CLEC-Polysaccharid-Adjuvantien gemäß der vorliegenden Erfindung sind B-Glucane, insbesondere Pustulan. Ein weiteres bevorzugtes CLECPolysaccharid-Adjuvans ist Mannan. Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung wurde Pustulan im Stand der Technik nur für Anti-Pilz-Impfstoffe verwendet (wobei Pustulan als Antigen und nicht als Träger wie in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde). Pustulan weist auch eine andere Hauptkette auf, da es nur aus ß-(1,6)-verknüpften Zuckereinheiten besteht.
[00108] Pustulan ist ein mittelgroßes lineares ßB-(1,6)-Glucan. Pustulan sowie synthetische Formen von linearem ß(1,6)-Glucan unterscheiden sich von allen anderen verwendeten Glucanen, da ß-Glucane in der Regel aus verzweigten Glucanketten (vorzugsweise ß-(1,3)-Hauptketten mit B-(1,6)-Seitenketten wie Hefeextrakte, GPs, Laminarin, Schizophyllan, Scleroglucan) oder linearen Glucanen bestehen, die nur auf B-(1,3)-Glucanen beruhen wie synthetisches B-Glucan, Curdlan, S. cerevisiae B-Glucan (150kDa) oder lineare B-(1,3:1,4)-Glucane wie Gersten- und Hafer-ßGlucan sowie Lichenan.
[00109] Wie mit der vorliegenden Erfindung erstmals gezeigt werden konnte, ist die Bindung von Glucankonjugaten an den Dectin-1-Rezeptor in vitro ein Surrogat für die spätere Wirksamkeit in vivo: Moleküle mit geringer Bindung können nur geringe Immunantworten auslösen, mittlere Binder sind besser, während hocheffiziente Binder hocheffiziente Reaktionen hervorrufen (Hafer/
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Gerste BG < Lichenan < Pustulan).
[00110] Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die CLECs (z. B. durch Standardtechniken) an einzelne durch Standardtechniken) an einzelne Alpha-Synuclein-Polypeptide gekoppelt, um kleine Nanopartikel mit geringer Polydispersität (Bereich des hydrodynamischen Radius (HDR): 5-15nm) zu erzeugen, die nicht vernetzt sind und nicht zu größeren Partikeln aggregieren, wie bei herkömmlichen CLEC-Impfstoffen. , z.B.: Glucanpartikeln (2-4um) oder ßB-Glucanpartikeln (wie sie in der Literatur offengelegt sind) die in der Regel durch einen Größenbereich von >100nm charakterisiert sind (typischer Bereich:Durchmesser; 150-500nm, z. B. Wang et al. (2019) liefern Partikel mit einem Durchmesser von 160nm (bewertet durch DLS) und einer Größe von ca. 150nm, bewertet durch TEM; Jin et al. (2018) liefern B-Glucanpartikel (Nanopartikel aus aminiertem B-Glucan-Ovalbumin) mit einer Größe von 180-215nm (bewertet durch DLS bzw. SEM). Diese Konjugate enthalten vorzugsweise mindestens ein T-Zell-Epitop, insbesondere ein promiskes, ein lineares oder ein Trägerpeptid-T-Zell-Epitop (z. B. von CRM197 oder KLH).
[00111] Definitionsgemäß ist der mit DLS gemessene hydrodynamische Radius der Radius einer hypothetischen harten Kugel, die mit der gleichen Geschwindigkeit diffundiert wie das untersuchte Teilchen. Der Radius wird aus dem Diffusionskoeffizienten berechnet, wobei die Kugelform des Moleküls/Partikels und eine bestimmte Viskosität des Puffers angenommen werden. Der HDR wird auch als Stokes-Radius bezeichnet und wird aus dem Diffusionskoeffizienten mit Hilfe der Stokes-Einstein-Gleichung berechnet (siehe https://en.wikipedia.org/wiki/Stokes_radius).
[00112] Bevorzugte Größenbereiche der erfindungsgemäßen Nanopartikel können die im Stand der Technik üblichen sein, d.h. mit einer Größe von 1 bis 5000nm, vorzugsweise von 1 bis 200nm, insbesondere von 2 bis 160nm, bestimmt als hydrodynamischer Radius (HDR) durch dynamische Lichtstreuung (DLS). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Partikelgröße kleiner, z.B. von 1 bis 50nm, vorzugsweise von 1 bis 25nm, insbesondere von 2 bis 15nm, bestimmt als HDR durch DLS. Diese bevorzugten Partikel sind daher kleiner, einschließlich der reinen Peptidkonjugate (etwa 5 nm durchschnittliche HDR) und CRM-PustulanKonjugate (etwa 10-15 nm durchschnittliche HDR). Dementsprechend sind die bevorzugten Partikel gemäß der vorliegenden Erfindung kleiner als 100 nm, was uns von Wang et al. unterscheiden würde.
[00113] Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Impfstoffprodukt zur Impfung eines Individuums gegen ein spezifisches Alpha-Synuclein-Antigen, wobei das Produkt eine Verbindung umfasst, die ein B-Glucan oder Mannan als Polysaccharid-Adjuvans vom Typ C-Lectin (CLEC) umfasst, das kovalent an das spezifische Antigen gekoppelt ist.
[00114] Vorzugsweise umfasst das Impfstoffprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung ein Konjugat, wie hierin offenbart oder durch ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich oder erhalten.
[00115] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Impfstoffprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung ein Alpha-Synuclein-Antigen, das mindestens ein Alpha-Synuclein-BZell-Epitop und mindestens ein T-Zell-Epitop umfasst, wobei das Antigen vorzugsweise ein PoIypeptid ist, das ein oder mehrere B-Zell- und T-Zell-Epitope umfasst.
[00116] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegen das kovalent gekoppelte Antigen und das CLEC-Polysaccharid-Adjuvans im erfindungsgemäßen Impfstoffprodukt als Partikel mit einer Größe von 1 bis 5000 nm, vorzugsweise von 1 bis 200 nm, insbesondere von 2 bis 160 nm, vor, bestimmt als hydrodynamischer Radius (HDR) durch dynamische Lichtstreuung (DLS). Im Folgenden sind alle Partikelgrößen Medianpartikelgrößen, wobei der Median der Wert ist, der die Hälfte der Partikel mit einer höheren Größe von der Hälfte der Partikel mit einer niedrigeren Größe trennt. Es ist die ermittelte Partikelgröße, von der die Hälfte der Partikel kleiner und die Hälfte größer ist.
[00117] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegen das kovalent gekoppelte Antigen und das CLEG-Polysaccharid-Adjuvans in dem erfindungsgemäßen Impfstoffprodukt als Partikel mit einer Größe von 1 bis 50 nm, vorzugsweise von 1 bis 25 nm, insbesondere von 2 bis 15 nm,
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bestimmt als HDR durch DLS, vor.
[00118] Vorzugsweise liegen das kovalent gekoppelte Antigen und das CLEC-PolysaccharidAdjuvans im erfindungsgemäßen Impfstoffprodukt als Partikel mit einer Größe von weniger als 100nm, 50nm, vorzugsweise weniger als 70nm, insbesondere weniger als 50nm, bestimmt als HDR durch DLS, vor.
[00119] Die Impfstoffprodukte nach der vorliegenden Erfindung weisen eine hohe Lagerstabilität auf. Bei Lagerung als flüssiges oder gefrorenes Material (Lagertemperatur: -80°C, -20°C, 2-8°C oder bei Raumtemperatur über längere Zeiträume, mindestens 3 Monate) findet praktisch keine Aggregation statt, da festgestellt werden kann, dass die Partikelgröße während der Lagerung nicht signifikant (d. h. um mehr als 10 %) zunimmt.
[00120] Die extrem hohe Wirksamkeit dieser kleinen Partikel, die durch die Verwendung der mittelmolekularen Komponente Pustulan gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, ist überraschend: So sind nach Adams et al. (2008) die besten Dectin-1-Substrate lineares B(1,3)Glucanphosphat (ca. 150kda) und verzweigte Glucane (mit einer ß(1,3)-Hauptkette und ßB(1,6)Seitenketten) wie Scleroglucane oder Glucane aus C. albicans oder Laminarin. Darüber hinaus deuten die Daten von Adams et al. und Palma et al. (J Biol Chem. 281(9) (2006) 5771-5779) und Willment et al. (J Biol Chem. 276(47) (2001), 43818-23) darauf hin, dass Dectin-1 nicht oder nur schwach mit Pustulan interagiert und auch nicht mit Nicht-Glucan-Kohlenhydratpolymeren, wie Mannan. In der Tat wird in verschiedenen Referenzen berichtet, dass Pustulan bei der Dectin-1Bindung weniger wirksam ist. Im Allgemeinen sind jedoch lineare 1,3 und verzweigte (1,3-Hauptkette und 1,6-Seitenast) die effektivsten Dectin-1-Binder; Adams et al. (2008) zeigen, dass rekombinantes Dectin-1 aus Mäusen nur Polymere erkennt und mit ihnen interagiert, die ein B(1,3)verknüpftes Glukoserückgrat enthalten. Dectin-1 interagierte nicht mit einem Glucan, das ausschließlich aus einem ß(1,6)-Gerüst (wie Pustulan) bestand, noch interagierte es mit Nicht-Glukan-Kohlenhydratpolymeren, wie Mannan. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass Konjugate auf Pustulanbasis in der Lage sind, stark an Dectin-1 zu binden und in vitro zelluläre Reaktionen auszulösen.
[00121] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein B-(1,6)Glucan verwendet. In der Regel wird im Stand der Technik berichtet, dass große Partikel bei der Aktivierung von PRRs effektiver sind als kleine ("lösliche") monomere Formulierungen, so dass Partikel, die große Glucane enthalten, überlegen sind (und daher bevorzugt werden) und kleine, lösliche Glucane verwendet werden können, um die Aktivierung von DCs zu blockieren, wodurch die beabsichtigte Wirkung beeinträchtigt wird. Es ist allgemein bekannt, dass partikuläre ßGlucane, wie die weit verbreitete Hefezellwandfraktion Zymosan, an Dectin-1 binden und es aktivieren und dadurch zelluläre Reaktionen auslösen. Im Gegensatz dazu ist die Interaktion von löslichen B-Glucanen mit Dectin-1 umstritten. Allgemeiner Konsens ist jedoch, dass lösliche ßGlucane, wie das kleine, verzweigte Glucan Laminarin (ß-(1,3)- und ß-(1,6)-Seitenketten), an Dectin-1 binden, aber nicht in der Lage sind, eine Signalübertragung zu initiieren und zelluläre Reaktionen in den DCs auszulösen (Willment et al., J Biol Chem. 276(47) (2001), 43818-23, Goodridge et al. Nature. 2011, 472(7344): 471 475.).
[00122] Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, dass Konjugate mit Glucanen mit hohem Molgewicht (10-fache Größe von Pustulan; z. B. Hafer/Gerste 229kDa/ Lichenan 245kDa) weniger wirksam sind als Pustulanpartikel (20kDa). Korotchenko et al. zeigen, dass OVA/Lam-Konjugate einen Durchmesser von ca. 10 nm haben, Dectin-1 binden und in vitro eine DC-Aktivierung induzieren, aber verzweigte Glucane sind, nicht hautspezifisch und in Bezug auf die Wirkung in vivo nicht besser als OVA, das in die Haut appliziert wird, oder OVA/Alum, das s.c. appliziert wird. Wang et al. liefern B-Glucanpartikel mit >100nm Größe (durchschnittliche Größe: 160nm). Jin et al. (2018) zeigen aminierte B-Glucan-Oalbumin-Nanopartikel mit einer Größe von 180-215nm.
[00123] Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass Partikel auf Pustulanbasis starke Dectin-1-Binder sind, DCs in vitro aktivieren (Veränderungen der Oberflächenmarkerexpression) und eine sehr starke Immunantwort hervorrufen, die a) anderen Wegen überlegen und
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b) vergleichbar mit KLH/CRM-Konjugat-Impfstoffen (in der Regel auch viel größere Partikel) und C) größeren Glucanen und auch Mannan ist. Dies gilt für Peptid-Pustulan (Größe von 5nm) und für Peptid-CRM-Pustulan-Konjugate (Größe von 11nm).
[00124] Für eine optimale Immunantwort ist der Aktivierungsgrad der CLEC, insbesondere von Pustulan, und das aus diesem Aktivierungsgrad resultierende Peptid-Zucker-Verhältnis entscheidend. Die Aktivierung der jeweiligen CLEC wird durch milde Periodat-Oxidation erreicht. Der Grad der Oxidation wird also durch Zugabe der Periodatlösung in einem bestimmten molaren Verhältnis bestimmt: d.h. Periodat:Zuckeruntereinheit; 100% = 1 Mol Periodat pro Mol Zuckermonomere.
[00125] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung eine CLEC, die mit einem Verhältnis von Periodat zu B-Glucan- oder MannanAnteil (Monomer) von 1/5 (d.h. 20 % Aktivierung) bis 2,6/1 (d.h. 260 % Aktivierung) aktiviert ist, vorzugsweise von 60 % bis 140 %, insbesondere 70 % bis 100 %.
[00126] Der optimale Bereich des Oxidationsgrades (der direkt proportional zur Anzahl der Epitop-Polypeptide im endgültigen Konjugat ist) zwischen einem niedrigen/mittleren Oxidationsgrad und einem hohen Oxidationsgrad kann definiert werden als die Reaktivität mit dem Schiff’schen Fuchsin-Reagenz, die der einer gleichen Menge des gegebenen Kohlenhydrats (z. B. Pustulan) entspricht, das mit Periodat bei einem Molverhältnis (Zuckermonomer: Periodat) von 0,20,6 (niedrig/mittel), 0,6-1,4 (optimaler Bereich) bzw. 1,4-2,6 (hoch) oxidiert wurde.
[00127] Bevorzugte Glucan-Peptid-Verhältnisse liegen im Bereich von 10 zu 1 (w/w) bis 1 zu 1 (w/w), vorzugsweise 8 zu 1 (w/w) bis 2 zu 1 (w/w), insbesondere 4 zu 1 (w/w); d. h. 24 zu 1 Molverhältnis von Zuckermonomer zu Peptid), die niedriger sind als wirksame Impfstoffe, über die anderswo berichtet wurde (z. B. Liang et al., Bromuro et al.).
[00128] Der Oxidationsgrad und die Menge an reaktiven Aldehyden, die für die Kopplung des Zuckers zur Verfügung stehen, werden mit modernen Methoden bestimmt, wie z. B.: 1) gravimetrische Messung, die die Bestimmung der Gesamtmasse der Probe ermöglicht; 2) die AnthronMethode (nach Laurentin et al. 2003) - zur Konzentrationsbestimmung intakter, nicht oxidierter Zucker in der Probe; (in diesem Fall werden Glucane mit konzentriertem H2SO«4 dehydriert, um Furfural zu bilden, das mit Anthron (0,2% in H2SQO4) kondensiert, um einen grünen Farbkomplex zu bilden, der kolorimetrisch bei 620nm gemessen werden kann) oder 3) Schiff's Assay: Der Oxidationsstatus der für die Konjugation verwendeten Kohlenhydrate wird mit Schiff’s Fuchsin-SulfitReagenz bestimmt. Kurz gesagt, der Fuchsin-Farbstoff wird durch Schwefeldioxid entfärbt. Durch die Reaktion mit aliphatischen Aldehyden (auf Glucan) wird die violette Farbe des Fuchsins wiederhergestellt, die dann bei 570-600 nm gemessen werden kann. Die resultierende Farbreaktion ist proportional zum Oxidationsgrad (der Menge an Aldehydgruppen) des Kohlenhydrats. Andere geeignete Analysemethoden sind ebenfalls möglich. Das Peptidverhältnis kann mit geeigneten Methoden wie UV-Analyse (205nm/280nm) und Aminosäureanalyse (aa-Hydrolyse, Derivatisierung und RP-HPLC-Analyse) bestimmt werden.
[00129] Die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung können zur Induktion zielspezifischer Immunantworten verwendet werden, während sie keine oder nur sehr begrenzte CLEC- oder Trägerprotein-spezifische Antikörperantworten induzieren. Die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung können ferner zur Induktion von Alpha-Synuclein-spezifischen Immunantworten verwendet werden, während sie keine oder nur sehr begrenzte CLEC- oder Trägerprotein-spezifische Antikörperantworten induzieren. Wie im folgenden Beispielabschnitt gezeigt wird, ermöglicht die vorliegende Erfindung auch eine Verbesserung und Fokussierung der alpha-Synucleinspezifischen Immunantwort, da sie die Immunantwort abseits von Reaktionen auf das Trägerprotein oder die CLEC auslöst (wie z.B. bei konventionellen Peptid-Träger-Konjugaten oder nichtkonjugierten Vergleichsversuchen, insbesondere auch unter Verwendung nicht-oxidierter CLECs, wie z.B. Pustulan).
[00130] Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich "Peptide" hier auf kürzere Polypeptidketten (mit 2 bis 50 Aminosäureresten), während "Proteine" sich auf längere Polypeptidketten (mit mehr als 50 Aminosäureresten) beziehen. Beide werden als "Polypeptide" bezeichnet. Die B-Zell-
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und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptide, die mit den CLECs gemäß der vorliegenden Erfindung konjugiert sind, umfassen neben den Polypeptiden mit den natürlich verwendeten Aminosäureresten der normalen Genexpression und Proteintranslation auch alle anderen Formen solcher polypeptidbasierten B-Zell- und/oder T-Zell-Epitope, insbesondere natürlich oder künstlich modifizierte Formen davon, wie z.B. Glykopolypeptide und alle anderen posttranslational modifizierten Formen davon (z.B. die in den Beispielen offenbarten Pyro-Glu-Formen von Aß). Darüber hinaus sind die CLECs gemäß der vorliegenden Erfindung besonders geeignet, um konformationelle Epitope zu präsentieren, zum Beispiel konformationelle Epitope, die Teil größerer nativer PoIypeptide, Mimotope, zyklischer Polypeptide oder oberflächengebundener Konstrukte sind.
[00131] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung ein CLEC-Polysaccharid-Grundgerüst und ein B-Zell-Epitop. Ein "B-Zell-Epitop" ist der Teil des Alpha-Synuclein-Antigens, an den Immunglobulin oder Antikörper binden. B-Zell-Epitope lassen sich in zwei Gruppen einteilen: konformationelle oder lineare Epitope. Es gibt zwei Hauptmethoden der Epitopkartierung: entweder strukturelle oder funktionelle Studien. Zu den Methoden für die strukturelle Kartierung von Epitopen gehören Röntgenkristallographie, kernmagnetische Resonanz und Elektronenmikroskopie. Bei den Methoden zur funktionellen Kartierung von Epitopen werden häufig Bindungstests wie Western Blot, Dot Blot und/oder ELISA eingesetzt, um die Antikörperbindung zu bestimmen. Mit Hilfe von Konkurrenzverfahren wird festgestellt, ob zwei monoklonale Antikörper (mAbs) gleichzeitig an ein Antigen binden können oder miteinander um die Bindung an derselben Stelle konkurrieren. Eine weitere Technik ist die Hochdurchsatz-Mutagenese, eine Epitopkartierungsstrategie, die entwickelt wurde, um die schnelle Kartierung von Konformationsepitopen auf strukturell komplexen Proteinen zu verbessern. Bei der Mutagenese werden zufällige/standortgerichtete Mutationen an einzelnen Resten verwendet, um Epitope zu kartieren. Die Kartierung von B-Zell-Epitopen kann für die Entwicklung von Antikörpertherapeutika, peptidbasierten Impfstoffen und immundiagnostischen Instrumenten genutzt werden (Sanchez-Trincado et al., J. Immunol. Res. 2017-2680160). Für viele Antigene sind B-Zell-Epitope bekannt und können in der vorliegenden CLECG-Plattform verwendet werden.
[00132] Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung ein CLECG-Polysaccharid-Grundgerüst und ein promiskes T-Zell-Epitop und/oder ein MHCII-Epitop, von denen bekannt ist, dass sie mit mehreren/allen MHC-Allelen einer bestimmten Spezies sowie in anderen Spezies funktionieren.
[00133] Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung der vorliegenden CLEC-Technologie zur Verbesserung bekannter T-Zell-Epitope. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung auch ein B-Glucan oder Mannan zur Verwendung als Polysaccharid-Adjuvans vom Typ C-Lectin (CLEC) für T-Zell-Epitop-Polypeptide, wobei das ßB-Glucan oder Mannan kovalent mit dem T-Zell-Epitop-Polypeptid konjugiert ist, um ein KonjJugat aus dem ß-Glucan oder Mannan und dem T-Zell-Epitop-Polypeptid zu bilden.
[00134] Ein einzelnes T-Zell-Epitop, das an mehr als ein HLA-Allel bindet, wird als "promiskes/ promiskuitives T-Zell-Epitop" bezeichnet. Bevorzugte promiskuitive T-Zell-Epitope binden an 5 oder mehr, vorzugsweise 10 oder mehr, insbesondere 15 oder mehr, HLA-Allele. Promiskuitive T-Zell-Epitope eignen sich für verschiedene Spezies und vor allem für mehrere MHC/HLA-Haplotypen (d. h. sowohl für MHCI- als auch für MHCII-Epitope, von denen bekannt ist, dass sie mit mehreren/allen MHC-Allelen funktionieren) einer bestimmten Spezies sowie für andere Arten. Das MHCII-Epitop PADRE (=natürliches Pan-DR-Epitop (PADRE)), auf das im Beispielabschnitt Bezug genommen wird, funktioniert beispielsweise bei mehreren menschlichen MHC-Allelen und bei der Maus (C57/Bl6, obwohl es bei Balb/c weniger wirksam ist). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Konjugat der vorliegenden Erfindung ein T-Zell-Epitop, vorzugsweise ein T-Zell-Epitop mit der Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAAA ("PADRE (Polypeptid)") oder eine PADRE (Polypeptid)-Variante.
[00135] Bevorzugte PADRE-Polypeptide oder PADRE-Polypeptidvarianten enthalten einen Linker (wie auch für andere hier verwendete Polypeptidepitope bevorzugt), wie z. B. einen Cysteinrest oder einen Linker, der einen Cysteinrest ("-C" oder "C-"; speziell für die Maleimid-Kopplung),
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einen NRRA-, NRRA-C- oder NRRA-NH-NH2-Linker umfasst. Zu den bevorzugten PADRE-PoIypeptidvarianten gehören die im Stand der Technik offengelegten Varianten (z. B. in Alexander et al., Immunity 1 (1994), 751-761; US 9,249,187 B2, oder ), vorzugsweise eine verkürzte Variante ohne den C-terminalen A-Rest (AKFVAAWTLKAA), Varianten, bei denen der erste Rest Alanin durch einen aliphatischen Aminosäurerest ersetzt ist (z.B. Glycin, Valin, Isoleucin und Leucin), Varianten, bei denen der dritte Rest Phenylalanin durch L-Cyclohexylalanin ersetzt ist, Varianten, bei denen der dreizehnte (letzte) Aminosäurerest Alanin durch einen aliphatischen Aminosäurerest ersetzt ist (z.B. Glycin, Valin, Isoleucin und Leucin) ersetzt ist, Varianten, die Aminocapronsäure umfassen, die vorzugsweise an den C-Terminus der PADRE-Variante gekoppelt ist, oder Varianten mit der Aminosäuresequenz AX:FVAAX2TLX3AX4A, wobei X; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus W, F, Y, H, D, E, N, Q, I und K; X2 aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus F, N, Y und W besteht, X3 aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus H und K besteht, und X4 aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus A, D und E besteht (mit der Maßgabe, dass die Oligopeptidsequenz nicht AKFVAAWTLKAAA ist; US 9.249.187 B2); insbesondere wobei das T-ZellEpitop ausgewählt ist aus AKFVAAWTLKAAANRRA-(NH-NH2), AKFVAAWTLKAAAN-C, AKFVAAWTLKAAA-C, AKFVAAWTLKAAANRRA-C, aKXVAAWTLKAAAaZC, aKXVAAWTLKAAaZCNRRA (SeqalD7, 8, 87, 88, 89, 90, 91, 92), aKXVAAWTLKAAa, aKXVAAWTLKAAaNRRA, aA(X)AAAKTAAAAa, aA(X)AAATLKAAa, aA(X)VAAATLKAAa, aA(X)IAAATLKAAa, aK(X)VAAWTLKAAa, und aKFVAAWTLKAAa (Sequenzen 760.5, 760.57, 906.09, 906.11, 965.10, 1024.03 von Alexander et al, 1994), worin X L-Cyclohexylalanin ist, Z Aminocapronsävure ist und a ein aliphatischer Aminosäurerest ist, ausgewählt aus Alanin, Glycin, Valin, Isoleucin und Leucin.
[00136] T-Zell-Epitope werden auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle präsentiert, wo sie an Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) gebunden werden. Beim Menschen sind professionelle antigenpräsentierende Zellen darauf spezialisiert, MHC-Klasse-IlPeptide zu präsentieren, während die meisten kernhaltigen somatischen Zellen MHC-Klasse-IPeptide präsentieren. T-Zell-Epitope, die von MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert werden, sind in der Regel Peptide mit einer Länge von 8 bis 11 Aminosäuren, während MHC-Klasse-Il-Moleküle längere Peptide mit einer Länge von 13 bis 17 Aminosäuren präsentieren; nicht-klassische MHC-Moleküle präsentieren auch nicht-peptidische Epitope wie Glykolipide. MHC-Klasse-I- und -Il-Epitope können allein mit Hilfe von Berechnungen zuverlässig vorhergesagt werden, obwohl nicht alle Algorithmen zur In-silico-Vorhersage von T-Zell-Epitopen gleich genau sind. Es gibt zwei Hauptmethoden zur Vorhersage der Peptid-MHC-Bindung: datengesteuerte und strukturbasierte. Strukturbasierte Methoden modellieren die Peptid-MHC-Struktur und erfordern eine hohe Rechenleistung. Datengesteuerte Methoden haben eine höhere Vorhersageleistung als strukturbasierte Methoden. Datengesteuerte Methoden sagen die Peptid-MHC-Bindung auf der Grundlage von Peptidsequenzen voraus, die MHC-Moleküle binden (Sanchez-Trincado et al., 2017). Durch die Identifizierung von T-Zell-Epitopen können Wissenschaftler T-Zellen verfolgen, phänotypisieren und stimulieren. Für viele Antigene, einschließlich Alpha-Synuclein, sind T-Zell-Epitope bekannt und können in der vorliegenden CLEC-Plattform verwendet werden.
[00137] Interessanterweise haben jüngste bahnbrechende Studien gezeigt, dass Alpha-Synuclein-spezifische T-Zellen bei Parkinson-Patienten erhöht sind, wahrscheinlich in Verbindung mit HLA-Risikohaplotypen, und deuten auf eine autoimmune Beteiligung von T- Zellen bei Parkinson hin (Sulzer et al., Nature 2017;546:656-661 und Lindestamn Arlehamn et al., Nat Commun. 1875;2020:11). Eine kausale Rolle von Alpha-Synuclein-reaktiven T-Zellen wurde kürzlich auch durch eine Tiermodellstudie untermauert [Williams et al., Brain. 2021;144:2047-2059). Das Auftreten von Alpha-Synuclein-reaktiven T-Zellen war in einer Fallstudie bereits Jahre vor dem Auftreten der Krankheit erhöht, und ihre Häufigkeit war in einer größeren Querschnittskohorte von Morbus-Parkinson-Patienten um und kurz nach dem Auftreten der Krankheit am höchsten (Lindestam Arlehamn et al.). Nach Beginn der Erkrankung nahm die T-Zell- Reaktion auf Alpha-Synuclein mit zunehmender Krankheitsdauer ab. Somit sind die Anti-aSyn-T-Zell-Antworten vor oder kurz nach der Diagnose der motorischen Parkinson-Krankheit am höchsten und nehmen danach ab (d. h. die maximale Aktivität ist weniger als 10 Jahre nach der Diagnose nachweisbar; und Hoehn und Yahr (H+Y)- Stadien 1 und 2 werden bevorzugt) (Lindestamn Arlehamn et al. 2020).
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[00138] Dementsprechend gibt es allgemein bekannte T-Zell-Epitope, die in der Sequenz von menschlichem Alpha-Synuclein enthalten sind. Beispiele finden sich in Benner et al. (PLoS ONE 3(1): e1376.60), Sulzer et al. (2017) und Lindestam Arlehamn et al. (2020).
[00139] Benner et al. (Benner et al., (2008) PLoS ONE 3(1): e1376.) verwenden ein 60 aa langes nitriertes (an Y-Resten) Polypeptid, das den C-terminalen Teil von aSyn umfasst, emulgiert in einem gleichen Volumen von CFA, das 1 mg/ml Mycobacterium tuberculosis enthält, als Immunogen in einem Parkinson-Modell und geben das alpha synuclein T-Zell-Epitop aa71-86 (VTGVTAVAQKTVEGAGNIAAAT-GFVK) bekannt.
[00140] Sulzer et al. (Nature 2017;546:656-661) identifizierten zwei T-Zell-antigene Regionen in den N- und C-terminalen Regionen von Alpha-Synuclein bei menschlichen PD-Patienten. Die erste Region befindet sich in der Nähe des N-Terminus und besteht aus den MHCII-Epitopen aa31-45 (GKTKEGVLYVGSKTK) und aa32-46 (KTKEGVLYVGSKTKE), die auch das 9mer-PoIypeptid aa37-45 (VLYVGSKTK) als potenzielles Epitop der MHCI-Klasse enthalten. Die zweite von Sulzer et al. entdeckte antigene Region liegt in der Nähe des C-Terminus (aa116-140) und erforderte die Phosphorylierung des Aminosäurerests S129. Die drei phosphorylierten aaS129Epitope aa116-130 (MPVDPDNEAYEMPSE), aa121-135 (DNEAYEMPSEEGYOQD) und aa126140 (EMPSEEGYQDYEPEA) lösten bei Parkinson-Patienten deutlich höhere Reaktionen aus als bei gesunden Kontrollbersonen. Die Autoren zeigen auch, dass die natürlich vorkommenden Immunreaktionen auf Alpha-Synuclein im Zusammenhang mit Morbus Parkinson sowohl auf die MHC-Klasse | als auch auf die Klasse Il beschränkte Komponenten aufweisen.
[00141] Darüber hinaus haben Lindestam Arlehamn et al. (Nat Commun. 1875;2020:11) das Alpha-Synuclein-Peptid aa61-75 (EQVTNVGGAVVTGVT) als T-Zell-Epitop (MHOCII) bei ParkinsonPatienten entdeckt.
[00142] Dementsprechend gehören zu den bevorzugten T-Zell-Epitopen gemäß der vorliegenden Erfindung die Alpha-Synuclein-Polypeptide GKTKEGVLYVGSKTK (aa31-45), KTKEGVLYVGSKTKE (aa32-46), EQVTNVGGAVVTGVT (aa61-75), VTGVTAVAQKTVEGAGNIAAATGFVK
[00143] (aa71-86), DPDNEAYEMPSE (aa116-130), DNEAYEMPSEEGYQD (aa121-135), und EMPSEEGYQDYEPEA (aa126-140).
[00144] Die regulatorischen T-Zellen ("Treg-Zellen" oder "Tregs") sind eine Subpopulation von T-Zellen, die das Immunsystem modulieren, die Toleranz gegenüber Selbstantigenen aufrechterhalten und Autoimmunerkrankungen verhindern. Treg-Zellen sind immunsuppressiv und unterdrücken im Allgemeinen die Induktion und Proliferation von Effektor-T-Zellen oder regulieren sie herunter. Tregs, die von einem normalen Thymus produziert werden, werden als "natürlich" bezeichnet. Die Selektion natürlicher Tregs erfolgt auf strahlenresistenten, hämatopoetisch abgeleiteten MHC-Klasse-Il-exprimierenden Zellen in der Medulla oder Hassal-Körperchen im Thymus. Der Prozess der Treg-Selektion wird durch die Affinität der Interaktion mit dem SelbstpeptidMHC-Komplex bestimmt. Eine T-Zelle, die sehr starke Signale empfängt, wird apoptotisch abgetötet; eine Zelle, die ein schwaches Signal empfängt, wird überleben und zu einer Effektorzelle selektiert werden. Erhält eine T-Zelle ein mittleres Signal, wird sie zu einer regulatorischen Zelle. Aufgrund des stochastischen Charakters des Prozesses der T-Zell-Aktivierung werden alle TZell-Populationen mit einem bestimmten TCR in einer Mischung aus Teff und Treg enden - die relativen Anteile werden durch die Affinitäten der T-Zelle für das Selbstpeptid-MHC bestimmt. Treg, die durch Differenzierung naiver T-Zellen außerhalb des Thymus, d. h. in der Peripherie, oder in Zellkulturen gebildet werden, werden als "adaptive" oder "induzierte" (d. h. ITregs) bezeichnet.
[00145] Natürliche Tregs sind dadurch gekennzeichnet, dass sie sowohl den CD4-T-Zell-Korezeptor als auch CD25, einen Bestandteil des IL-2-Rezeptors, exprimieren. Tregs sind also CD4+ CD25+. Die Expression des nukleären Transkriptionsfaktors Forkhead Box P3 (FoxP3) ist die entscheidende Eigenschaft, die die natürliche Entwicklung und Funktion von Tregs bestimmt. Tregs unterdrücken die Aktivierung, Proliferation und Zytokinproduktion von CD4+ T-Zellen und
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CD8+ T-Zellen und unterdrücken vermutlich B-Zellen und dendritische Zellen, wodurch sie Autoimmunreaktionen dämpfen.
[00146] In diesem Sinne deuten mehrere Studien darauf hin, dass die Anzahl und Funktion der Tregs bei Parkinson-Patienten reduziert ist. So zeigen z. B. Hutter Saunders et al. (J Neuroimmune Pharmacol (2012) 7:927-938) und Chen et al. (MOLECULAR MEDICINE REPORTS 12: 6105-6111, 2015), dass die Fähigkeit regulatorischer T-Zellen (Treg) von Parkinson-Patienten, die Funktion von Effektor-T-Zellen zu unterdrücken, beeinträchtigt ist und dass der Anteil von Th1- und Th17-Zellen erhöht ist, während der Anteil von Th2- und Treg-Zellen verringert ist. Thome et al. (npj Parkinson’s Disease (2021) 7:41) zeigten, dass eine abnehmende PD-TregFunktion mit einer zunehmenden proinflammatorischen T-Zell-Aktivierung korreliert, die direkt zu einer anschließenden Zunahme der proinflammatorischen Signalgebung durch andere Immunzellpopulationen führen kann. Die Unterdrückung der T-Zell-Proliferation durch Tregs korrelierte signifikant mit dem Phänotyp pro-inflammatorischer Immunzellen in der Peripherie. Die suppressive Kapazität von PD-Tregs auf die Proliferation von T-Effektorzellen (z. B. CD4+) nahm mit zunehmender PD-Krankheitslast unter Verwendung der H&Y-Krankheitsskala ab, wobei die Aktivität in den Stadien H+Y 1 und 2 am höchsten war. Wichtig ist, dass Lindestam Arlehamn et al. (2020) zeigten, dass die Anti-ASyn-T-Zell-Reaktionen vor oder kurz nach der Diagnose der motorischen Parkinson-Erkrankung am höchsten sind und danach abnehmen (d. h. die maximale Aktivität ist weniger als 10 Jahre nach der Diagnose nachweisbar; und die Hoehn und Yahr (H+Y)Stadien 1 und 2 werden bevorzugt) (Lindestamn Arlehamn et al., 2020).
[00147] Daher ist die Kombination der erfindungsgemäßen Impfstoffe mit
1) Impfstoffen, die ein Alpha-Synuclein-spezifisches Treg-Epitop enthalten (z. B. ein CD4-Epitop wie die von Brenner et al., Sulzer et al. und Lindestam Arlehamn et al. (aa31-45 (GKTKEGVLYVGSKTK), aa32-46 (KTKEGVLYVGSKTKE), aa61-75 (EQVTNVGGAVVTGVT), aa7186 (VTGVTAVAQKTVEGAGNIAAATGFVK), aa116-130 (MPVDPDNEAYEMPSE), aa121-135 (DNEAYEMPSEEGYOQD), und aa126-140 (EMPSEEGYQDYEPEA)); und/oder
2) mit Treg-induzierenden Mitteln wie Rapamyein, niedrig dosiertem IL-2, TNF-Rezeptor-2 (TNFR2)-Agonisten, Anti-CD20-Antikörpern (z. B. Rituximab), Prednisolon, Inosin-Pranobex, Glatirameracetat, Natriumbutyrat
in frühen Krankheitsstadien bevorzugt (d. h. weniger als 10 Jahre nach der Diagnose; bevorzugt werden die Hoehn- und Yahr-Stadien 1 und 2), um die abnehmende/reduzierte Treg-Anzahl und -Aktivität zu erhöhen und dadurch die Autoimmunreaktivität von aSyn-spezifischen T-Effektorzellen zu verringern und Autoimmunreaktionen bei Parkinson-Patienten zu dämpfen.
[00148] Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Tregs bei einer Reihe von Krankheiten, insbesondere bei chronisch degenerativen oder Autoimmunerkrankungen wie (aktivem) systemischem Lupus erythematodes (SLE, aSLE), Typ-1-Diabetes (T1D), Autoimmun-Diabetes (AID), Multipler Sklerose (MS), amyotropher Lateralsklerose (ALS) und Alzheimer-Krankheit (AD) sowie anderen degenerativen Krankheiten (ALS) vermindert und/oder dysfunktional sind: Beers et al., JCI Insight 2, e89530 (2017); AD: Faridar et al., Brain Commun. 2, fcaa112 (2020); ALS: Beers et al., JAMA Neurol. 75, 656-658 (2018); MS: Haas etal., Eur. J. Immunol. 35, 3343-3352 (2005); T1D: Lindley et al., Diabetes 54, 92-99 (2005): AID: Putnamet al., J. Autoimmun. 24, 55-62 (2005); Autoimmunkrankheiten: Ryba-Stanislawowska et al., Expert Rev. Clin. Immunol. 15, 777-789 (2019); aSLE: Valencia et al., J. Immunol. 178, 2579-2588 (2007); MS: Vigliettaet al., J. Exp. Med. 199, 971-979 (2004); SLE: Zhang et al., Clin. Exp. Immunol. 153, 182-187 (2008); AD+MS: Ciccocioppo et al., Sci. Rep. 9, 8788 (2019)).
[00149] Daher ist es auch bevorzugt, T-Zell-Epitope bereitzustellen, die als Treg-Epitope oder Treg-induzierende Wirkstoffe bei Krankheiten mit reduzierten oder dysfunktionalen Treg-Populationen in Kombination mit den Impfstoffen gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, um die abnehmende/reduzierte Treg-Anzahl und -Aktivität zu erhöhen und dadurch die Autoimmunreaktivität krankheitsspezifischer T-Effektorzellen zu reduzieren und Autoimmunreaktionen bei Patienten zu dämpfen. Geeignete Treg-Epitope sind definiert als Selbst-MHC-Epitope (MHCIITyp), die sich durch die Fähigkeit auszeichnen, intermediäre Signale während der T-Zell-Selekti-
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onsprozesse zu induzieren.
[00150] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenzen SegqlD7, 8, 22-29, 87-131, GKTKEGVLYVGSKTK, KTKEGVLYVGSKTKE, EQVTNVGGAVVTGVT, VTGVTAVAQKTVEGAGNIAAATGFVK, MPVDPDNEAYEMPSE), DNEAYEMPSEEGYQD, EMPSEEGYQDYEPEA, oder Kombinationen davon.
[00151] Bevorzugte T-Zell-Epitope sind daher:
SeqlD7 AKFVAAWTLKAAANRRA-(NH-NH2) |PADRE
SeqglD8 AKFVAAWTLKAAAN-C PADRE
SegID22 |AKFVAAWTLKAAA-(NH-NH2) PADRE - Original
SeqgID23 |KAAAVKAAFWTAL-NRRA-(NH-NH2) | alternatives synthetisches Peptid
SeqglD24 |DSETADNLEKTVAALSILPGHGC- |Toxin-Diphtherie (TV-TT-Austausch) (NH-NH2)
SeqgID25 |DSETADNLEKTVAAL- Toxin-Diphtherie (TV-TT-Austausch) SILPGHGCNRRA- (NH-NH2)
SeqgID26 |ISITEIKGVIVHRIETILF-(NH-NH2) MvF5 Th (UBITH®1)
SeaglD27 |ISITEIKGVIVHRIETILFNRRA-(NH- |MvF5 Th (UBITH®1) NH2)
SeqgID28 |ISQAVHAAHAEINEAGR-(NH-NH2) Huhn Eizellen (323-339)
SeqgID29 |ISQAVHAAHAEINEAGRNRRA-(NH- | Huhn Eizellen (323-339)
NH2
SeqlD87 ) AKFVAAWTLKAAA-C Padre (Original) für Maleimidecoupling
SeqID88 AKFVAAWTLKAAANRRA-C Tridem' Padre (Original) für MaleimidKopplung
SeqgIlD89 |aKXVAAWTLKAAaZC PADRE, alternativ Aas
SeqgIDIO |aKXVAAWTLKAAaAZCNRRA PADRE, alternativ Aas
SeqgID91 |aKXVAAWTLKAAa PADRE, alternativ Aas
SeqgID92 |aKXVAAWTLKAAaNRRA PADRE, alternativ Aas
SeqgID93 |DSETADNLEKTTAALSILPG Diphterie
SeqgID94 |DSETADNLEKTTAALSILPGNRRA Diphterie
SeqgID95 |LSEIKGVIVHRLEGV MvF
SeqID9I6 |LSEIKGVIVHRHRLEGVNRRA MvF
SeqgIlD97 |KLLSLIKGVIVHRLEGVE MvF
SeqgID9I8 |KLLSLIKGVIVHRLEGVENRRA MvF
SeqID9I9 | VSIDKFRIFCKANPK P23-TT
SeqgID100 |LKFIIKRYTPNNEIDS P32-TT
SeqgIlD101 |IREDNNTLKLDRCNN P21 -TT
SeqgIlD102 | FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE P30 - TT
SeqgID103 | QYIKANSKFIGITE P2-TT
SeqgIlD104 |LEYIPEITLPVIAALSIAES TT
SeqgIlD105 |LINSTKIYSYFPSVISKVNQG TT
SeqgID106 | NYSLDKIIVDYNLOSKITLP TT
SeglD107 |PHHTALRQAILCWGELMTLA HBV-Kernkapsid
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SD N ©
SS N SS
SeqglD108 |FFLLTRILTIPOSLD HBV-Oberfläche AG SeqgIlD109 | YSGPLKAEIAQRLEDV MT Influenza-Matrix-Epitop SeglD110 |FFLLTRILTIPOSL HBsAg
SeglD111 |GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL | Bordetella pertussis
SeglD112 |ALNIWDRFDVFCTLGATTGYLKGNS | Cholera-Toxin
SeglD113 |QYIKANSKFIGITEL Clostridium tetani TT1 SeglD114 | FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE Clostridium tetani TT2 SeqglD115 |KFIIKRYTPNNEIDSF Clostridium tetani TT3 SeqglD116 | VSIDKFRIFCKALNPK Clostridium tetani TT4 SeqglD117 |WVRDIIDDFTNESSQKT Clostridium tetani2 SeglD118 |AGLTLSLLVICSYLFISRG EBV BHRF1
SeglD119 |PGPLRESIVCYFMVFLOTHI EBV EBNA-1 SeqgIlD120 | VPGLYSPCRAFFNKEELL EBV CP
SeglD121 |TGHGARTSTEPTTDY EBV GP340
SeqgIlD122 |KELKRQOYEKKLRQ EBV BPLF1
SeqglD123 |TVFYNIPPMPL EBV EBNA-2 SeqglD124 |DKREMWMACIKELH HCMV IE1
SeqglD125 |FVFTLTVPSER Influenza MP1 - 1 SeqgIlD126 |PKYVKONTLKLAT Influenza Hämaglutinin SeqglD127 | EKKIAKMEKASSVFNV Malaria CS: T3-Epitop SeqgIlD128 |FFLLTRILTI Hepatitis-B-Oberflächenantigen SeqgIlD129 | DOSIGDLIAEAMDKVGNEG Hitzeschockprotein 65 SeqgIlD130 |QVHFOPLPPAVVKL Bacille CalmetteGuerin SeglD131 |KQINMWOQEVGKAMYA HIV gp120
worin X L-Cyclohexylalanin ist, Z Aminocapronsäure ist und a eine aliphatische Aminosäure ist, ausgewählt aus Alanin, Glycin, Valin, Isoleucin und Leucin.
[00152] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung ein B-Zell-Epitop von alpha-Synuclein und ein T-Zell-Epitop, vorzugsweise ein panspezifisches/vielseitiges T-Zell-Epitop, die unabhängig voneinander an das CLECPolysaccharid-Grundgerüst gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere an Pustulan, gekoppelt sind.
[00153] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung ein Alpha-Synuclein-B-Zell-Epitop, das an ein "klassisches" Trägerprotein, wie CRM197, gekoppelt ist, wobei dieses Konstrukt ferner an einen CLEC-Träger gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere an Pustulan, gekoppelt ist.
[00154] Beispielsweise kann in einem ersten Schritt die Bildung von CRM-Konjugaten durch Aktivierung von CRM mittels GMBS oder Sulfo-GMBS usw. erfolgen; anschließend werden die Maleinimid-Gruppen der aktivierten CRM mit SH-Gruppen des Peptids (Cystein) umgesetzt. Die CRM-Konjugate werden dann mit DTT behandelt, um Disulfidbindungen zu reduzieren und SHGruppen an den Cysteinen zu erzeugen. Anschließend kann in einer Eintopfreaktion das reduzierte CRM-Konjugat mit BMPH (N-B-Maleimidpropionsäurehydrazid) und aktiviertem Pustulan (oxidiert) gemischt werden, um den CLEC-basierten Impfstoff herzustellen. Der Mechanismus bei der Eintopfreaktion kann (in Bezug auf Pustulan) darin bestehen, dass oxidiertes Pustulan mit
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BMPH (mit den Hydrazidresten) reagiert und ein BMPH- Hydrazon bildet. Das reduzierte CRMKonjugat reagiert dann über SH-Gruppen am CRM-Konjugat mit dem Maleimid des BMPH-aktivierten Pustulans.
[00155] Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung ein "klassisches" Trägerprotein, wie CRM197, das mehrere T-ZellEpitope enthält. Das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst auch ein B-Zell-Epitop, das kovalent an die Polysaccharideinheit gekoppelt ist. In dieser Ausführungsform sind beide Polypeptide (B-Zell-Epitop und Trägermolekül) unabhängig voneinander an einen CLEC-Träger gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere an Pustulan, gekoppelt.
[00156] Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verbesserung und/oder Optimierung von Trägerproteinen durch kovalente Kopplung des Trägerproteins (das bereits ein oder mehrere T-Zell-Antigene (als Teil seiner Polypeptidsequenz, gegebenenfalls in posttranslational modifizierter Form) enthält) an das CLEC-Polysaccharid-Adjuvans gemäß der vorliegenden Erfindung, i.d. h. dem ß-Glucan oder Mannan, vorzugsweise dem Pustulan, Lichenan, Laminarin, Curdlan, ß-Glucanpeptid (BGP), Schizophyllan, Skleroglucan, ganzen Glucanpartikeln (WGP), Zymosan oder Lentinan. Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf ein B-Glucan oder Mannan zur Verwendung als Polysaccharid-Adjuvans für B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-alpha-Synuclein-Polypeptide vom Typ C-Lectin (CLEC), wobei das B-Glucan oder Mannan kovalent mit dem B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid konjugiert ist, um ein Konjugat aus dem ßB-Glucan oder Mannan und dem B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid zu bilden, wobei ein Trägerprotein kovalent an das B-Glucan oder Mannan gekoppelt ist.
[00157] Diese Verbesserung/Optimierung führt zu einer deutlichen Verringerung oder Beseitigung der B-Zell-Antwort auf den CLEC und/oder das Trägerprotein und/oder zu einer Verstärkung (oder zumindest Erhaltung) der T-Zell-Antwort auf die T-Zell-Epitope des Trägerproteins. Dies ermöglicht eine Verringerung oder Eliminierung einer Antikörperreaktion auf den CLEC und/oder den Träger (der dann nur eine T-Zell-Reaktion liefert) und eine spezifische Verstärkung der Antikörperreaktion auf das eigentliche Zielpolypeptid, das mit dem Träger und dem CLEC konjugiert ist.
[00158] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung ein T-Zell-Epitop und sind frei von B-Zell-Epitopen, wobei das Konjugat vorzugsweise mehr als ein T-Zell-Epitop, insbesondere zwei, drei, vier oder fünf T-ZellEpitope umfasst. Dieses Konstrukt ist speziell für Krebsimpfstoffe geeignet. Dieses Konstrukt eignet sich auch speziell für Selbstantigene, insbesondere für Autoimmunerkrankungen assozlierte Selbstantigene. Der Behandlungseffekt des jeweiligen Konjugats ist mit einer Reduktion von Effektor-T-Zellen und der Entwicklung von regulatorischen T-Zell-Populationen (T,eg cell) verbunden, was zur Dämpfung der jeweiligen Krankheit, z. B. Autoimmunerkrankung oder allergische Erkrankungen, führt, wie z. B. bei Multipler Sklerose gezeigt. Insbesondere üben diese T-Zellen eine starke Immunsuppression aus und verbessern so die durch kognitive und nicht-kognitive Autoantigene ausgelöste Krankheit.
[00159] Bevorzugte CLECs, die als Polysaccharid-Grundgerüst gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, sind Pustulan oder andere ß-(1,6)-Glucane ( einschließlich synthetischer Formen solcher Glucane); andere zu verwendende: Mannan, Mitglieder der B-Glucan- Familie, insb. lineare ß-(1,3) (S. cerevisiae B-Glucan (z.B.: 150kDa), Curdlan) oder verzweigte ß(1,3) und ß-(1,6) enthaltende Glucane, z.B.: Laminarin (4,5-7kDa), Scleroglucan, Schizophyllan, vorzugsweise lineare Glucane, (z.B.: B(1,3): S. cerevisiae B-Glucan (150kd), Curdlan (75-80kDa oder größer), B-(1,3)+ß-(1,4) Lichenan (22-250kDa) ßB-(1,6) Pustulan (20kDa). Bevorzugte CLECs gemäß der vorliegenden Erfindung sind daher Mannan und ß-Glucane, einschließlich linearer und verzweigter B-Glucane, die durch das Vorhandensein von ß-(1,3)-, B-(1,3)+B-(1,4)- und B(-1,6)Hauptketten sowie mit angehängten Seitenketten mit ß-(1,6)-Resten, bevorzugt lineare ßGlucane mit ßB-(1,3)-, B-(1,3)+ßB-(1,4)- und ßB- (1,6)-Ketten, bevorzugt lineare B-(1,6)-B-Glucane, insbesondere Pustulan, Fragmente oder synthetische Varianten davon, bestehend aus multimeren B-(1,6)-Glucansacchariden (z.z. B. 4-mer, 5-mer, 6mer, 8-mer, 10-mer, 12-mer, 15-mer, 17-
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mer oder 25mer).
[00160] Vorzugsweise ist die Mindestlänge der erfindungsgemäßen CLECs ein 6-Mer, da bei kleineren Polysacchariden Oxidationsreaktionen, wie sie mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, problematisch sind (eventuell können für solche kleineren Formen andere Kopplungsmechanismen und/oder terminale Verknüpfungen mit Zugabe von reaktiven Formen verwendet werden). CLECs mit 6 oder mehr Monomereinheiten (d. h. 6-Mere und größere -mere) zeigen eine gute Dectinbindung. In der Regel ist die Dectinbindung umso besser, je länger die CLEC sind. Ein Polymerisationsgrad (d. h. die Anzahl der einzelnen Glukosemoleküle innerhalb einer Glukaneinheit, DP) von 20-25 (d. h. DP20-25) gewährleistet definitiv eine gute Bindung und In-vivo-Wirksamkeit (z. B. Laminarin ist ein typisches Beispiel mit einem DP von 20-30).
[00161] Das Molekulargewicht synthetischer CLECs kann dementsprechend auch kleiner sein, z. B. so niedrig wie 1-2 kDa, während bevorzugte Molekulargewichtsbereiche von Glucanen und Fragmenten davon zwischen 1 und 250 kDa liegen können (z. B. Laminarin, Lichenan, S. cerevisiae B-Glucan, Pustulan, Curdlan und Gerstenglucane usw.), vorzugsweise von 4,5 bis 80 kDa (z. B. Laminarin, Pustulan, Curdlan, Lichenan mit niedrigem Molekulargewicht usw.), insbesondere 4,5 bis 30 kDa (z. B. Laminarin, Pustulan, Lichenan mit niedrigem Molekulargewicht usw.).
[00162] Mannane sind Polysaccharide, die lineare Polymere des Zuckers Mannose sind. Pflanzliche Mannane haben ß-(1,4)-Bindungen. Sie sind eine Form von Speicherpolysaccharid. Mannan-Zellwandpolysaccharide, die in Hefen vorkommen, haben ein a-(1,6)-verknüpftes Grundgerüst und a-(1,2)- und a-(1,3)-verknüpfte Verzweigungen. Es ähnelt serologisch den Strukturen, die auf Glykoproteinen von Säugetieren zu finden sind.
[00163] Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate müssen die CLEC, insbesondere Pustulan, aktiviert werden (z. B. durch milde periodatvermittelte Oxidation), wobei der Grad der Oxidation für die Immunantwort wichtig ist. Wie bereits oben dargelegt, liegen die praktischen Oxidationsbereiche - speziell für Pustulan - zwischen etwa 20 und 260 % Oxidation. In vielen Fällen liegt der optimale Oxidationsbereich zwischen einer niedrigen/mittleren Oxidation (d.h. 2060% Oxidation) und einem hohen Oxidationsgrad (d.h. 140-260% Oxidation), d.h. im Bereich von 60-140% Oxidation. Die Optimierung für andere CLECs kann von einem Fachmann leicht angepasst werden, z. B. ist für Lichenan mehr als 200 % erforderlich, um eine ähnliche Menge an Aldehydgruppen zu erhalten.
[00164] Dementsprechend können die Bereiche alternativ auch als die Reaktivität mit dem Schiff’schen Fuchsin-Reagenz definiert werden, die - am Beispiel von Pustulan - wie folgt definiert werden kann: ein niedriger/mittlerer Oxidationsgrad bei einem Molverhältnis (Zuckermonomer: Periodat) von 0,2-0,6, ein optimaler Bereich von 0,6-1,4 bzw. ein hoher Oxidationsgrad von 1,42,6.
[00165] In jedem Fall sollte der Oxidationsgrad so festgelegt werden, dass er dem optimalen Bereich für jeden spezifischen CLEC entspricht. Vorzugsweise ein lineares B-Glucan, noch bevorzugter ein ß-(1,6)-Glucan, insbesondere Pustulan, Pustulanfragmente oder synthetische Varianten davon, bestehend aus multimeren ßB(1,6)-Glucansacchariden (z. B. 4-Mer, 5-Mer, 6-Mer, 8-Mer, 10-Mer, 12-Mer, 15-Mer, 17-Mer oder 25-Mer) das durch milde Periodat-Oxidation aktiviert wird, was zur Abspaltung von vicinalen OH-Gruppen und damit zur Bildung von reaktiven Aldehyden führt. Die milde Periodat-Oxidation bezieht sich auf die Verwendung von Natriumperiodat (NalO4), einem bekannten milden Mittel zur effektiven Oxidation vicinaler Diole in Kohlenhydratzuckern, um reaktive Aldehydgruppen zu erzeugen. Die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung wird zwischen benachbarten Hydroxylgruppen gespalten. Durch Anderung der verwendeten Periodatmenge können Aldehyde stöchiometrisch in eine kleinere oder größere Anzahl von Zuckereinheiten eines bestimmten Polysaccharids eingeführt werden.
[00166] Andere beispielhafte Methoden zur Aktivierung von Kohlenhydraten sind in der Technik wohlbekannt und umfassen die Cyanylierung von Hydroxylgruppen (z. B. durch Verwendung organischer Cyanylierungsreagenzien wie 1-Cyano-4-(dimethylamino)-pyridiniumtetrafluoroborat (CDAP) oder N-Cyanotriethylammoniumtetrafluoroborat (CTEA)), die reduktive Aminierung von
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Kohlenhydraten oder die Aktivierung und Kopplung unter Verwendung von Carbonsäure-reaktiven chemischen Gruppen wie Carbodiimiden.
Aktivierte Kohlenhydrate werden dann mit den Polypeptiden umgesetzt, die an das aktivierte CLEC gekoppelt werden sollen, und es wird ein Konjugat des CLEC mit dem B-Zell- oder T-ZellEpitop-Polypeptid gebildet.
[00167] Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zur Herstellung der Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das B-Glucan oder Mannan durch Oxidation aktiviert wird und wobei das aktivierte B-Glucan oder Mannan mit der B-Zelle und/oder dem T-Zell-Epitop-Polypeptid in Kontakt gebracht wird, wodurch ein Konjugat des ßGlucans oder Mannans mit der B-Zelle und/oder dem T-Zell-Epitop-Polypeptid erhalten wird.
[00168] Vorzugsweise wird das B-Glucan oder Mannan durch Periodatoxidation an vicinalen Hydroxylgruppen, als reduktive Aminierung oder als Cyanylierung von Hydroxylgruppen gewonnen.
[00169] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das ß-Glucan oder Mannan bis zu einem Oxidationsgrad oxidiert, der als die Reaktivität mit dem Schiff’schen Fuchsin-Reagenz definiert ist, die einem Oxidationsgrad einer gleichen Menge Pustulan entspricht, das mit Periodat in einem Molverhältnis von 0,2-2,6, vorzugsweise von 0,6-1,4, insbesondere 0,7-1, oxidiert wurde.
[00170] Vorzugsweise wird das Konjugat durch Kopplung auf Hydrazonbasis zur Konjugation von Hydraziden an Carbonylgruppen (Aldehyd) oder durch Kopplung unter Verwendung heterobifunktioneller Maleimid-Hydrazid-Linker (z. B.: BMPH (N-ß-Maleimidopropionsäurehydrazid, MPBH (4-[4-N-Maleimidophenyl]buttersäurehydrazid), EMCH (N-[e-Maleimidocapronsäure)-hydrazid) oder KMUH (N-[k-Maleimidoundecansäure]-hydrazid), oder durch Konjugation von Sulfhydriden (z. B. Cysteinen) mit Carbonylen (Aldehyden) hergestellt.
[00171] Die an die CLECs zu koppelnden Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung sind oder umfassen mindestens ein B-Zell- oder mindestens ein T-Zell-Epitop. Vorzugsweise enthalten die an die CLECs gekoppelten Polypeptide ein einziges B- oder T-Zell-Epitop (auch dann, wenn mehr als eine Art von Polypeptid an das CLEC-Polysaccharid-Grundgerüst gekoppelt ist). Wie auch im Beispielabschnitt gezeigt, beträgt die bevorzugte Länge der Alpha-Synuclein-PoIypeptide 5 bis 29 Aminosäurereste, vorzugsweise 5 bis 25 Aminosäurereste, noch bevorzugter 7 bis 20 Aminosäurereste, noch bevorzugter 7 bis 15 Aminosäurereste, insbesondere 7 bis 13 Aminosäurereste. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu beachten, dass sich diese Längenbereiche nur auf die Epitopsequenzen beziehen, nicht aber auf Linker, einschließlich peptidischer Linker, wie Cystein oder Glycin oder bi-, tri-, tetra- (oder länger)-merische Peptidgruppen, wie CG oder CG, oder Spaltstellen, wie die Cathepsin-Spaltstelle; oder Kombinationen davon (z. B. NRRAGC). Illustrative Beispiele von Epitopen wurden im Abschnitt über Beispiele getestet; aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass die Plattform gemäß der vorliegenden Erfindung nicht auf ein bestimmtes Polypeptid beschränkt ist. Daher kommen praktisch alle möglichen Epitope für die vorliegende Erfindung in Frage, einschließlich der Epitope, die auf diesem Gebiet bereits bekannt sind, und insbesondere derjenigen, die bereits als in eine Präsentationsplattform integrierbar beschrieben wurden (z. B. zusammen mit einem "klassischen" Trägermolekül oder Adjuvans).
[00172] Epitope sind besonders bevorzugt, wenn sie an aktiviertes B-Glucan gekoppelt werden können, und zwar auf der Grundlage moderner Kopplungsmethoden, einschließlich hydrazidvermittelter Kopplung, Kopplung über heterobifunktionelle Linker (z. B. BMPH, MPBH, EMCH, KMUH usw.), imidazolvermittelter Kopplung, reduktiver Aminierung, Carbodiimid-Kopplung usw. (weitere werden hinzugefügt). Die verwendeten Epitope bestehen aus einzelnen Peptiden, können in Peptiden oder Proteinen enthalten sein oder als Peptid-Protein-Konjugate vorliegen, bevor sie an CLECs gekoppelt werden.
[00173] Bevorzugte Kopplungsmethoden zur Bereitstellung der erfindungsgemäßen Konjugate sind daher Hydrazid-Kopplung oder Kopplung mittels Thioesterbildung (z.B. Maleimid-Kopplung mittels BMPH (N-B-Maleimidopropionsäurehydrazid), MPBH, EMCH, KMUH, insbesondere wenn Pustulan über Hydrazonbildung an das BMPH gekoppelt wird und das Polypeptid über Thioester
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gekoppelt wird.
[00174] In dieser Ausführungsform werden die Polypeptide vorzugsweise mit zwei bevorzugten Linkern versehen, wie z. B. Hydrazidpolypeptiden/Epitopen für die Hydrazonkopplung:
[00175] N-terminale Kopplung des Peptids: H2N-NH-CO-CH2-CH2-CO-Polypeptide-COOH; vorzugsweise in Kombination mit Bernsteinsäure oder anderen geeigneten Linkern, z.B. anderen geeigneten Dicarbonsäuren, insbesondere auch Glutarsäure als Spacer/Linker;
[00176] C-terminale Kopplung (dies ist die bevorzugte Kopplungsrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung): NH2-Polypeptid-NH-NH2.
[00177] Alternativ können für die vorliegende Erfindung auch nicht modifizierte Alpha-SynucleinPolypeptide/Epitope verwendet werden, z. B. Polypeptide, die einen (zusätzlichen) Cysteinrest oder eine alternative Quelle für SH-Gruppen am C- oder N-Terminus für die heterobifunktionelle Linker-vermittelte Kopplung enthalten (insbesondere BMPH, MPBH, EMCH, KMUH): NH2-CysPep-COOH oder NH2-Pep-Cys-COOH.
[00178] Bevorzugte B-Zell-Polypeptide, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Polypeptide mit einer Länge von 5 bis 19 Aminosäureresten, vorzugsweise 6 bis 18 Aminosäureresten, insbesondere 7 bis 15 Aminosäureresten. Bei den B-Zell-Epitopen handelt es sich vorzugsweise um kurze, lineare Polypeptide, Glykopolypeptide, Lipopolypeptide, andere posttranslational modifizierte Polypeptide (z.B.: phosphoryliert, acetyliert, nitriert, Pyroglutamatreste enthaltend, glykosyliert usw.), cyclische Polypeptide usw.
[00179] Bevorzugte T-Zell-Polypeptide, die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, haben eine Länge von 8 bis 30 Aminosäureresten, vorzugsweise von 13 bis 29 Aminosäureresten, noch bevorzugter von 13 bis 28 Aminosäureresten.
[00180] Bevorzugte Spezifitäten der in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden T-ZellEpitope sind kurze lineare Peptide, die für die Präsentation über MHC | und Il (wie dem Fachmann bekannt) geeignet sind oder von denen bekannt ist, dass sie für die Präsentation über MHC I und I! geeignet sind, insbesondere MHCII- Epitope für CD4-Effektor-T-Zellen und CD4-Treg-Zellen, MHOCI- Epitope für zytotoxische T-Zellen (CD8+) und CD8-Treg-Zellen, die z. B. bei Krebs-, Autoimmun- oder Infektionskrankheiten nützlich sind) mit bekannter Wirksamkeit bei Mensch oder Tier; kurze lineare Peptide, die für die Präsentation über MHC | und Il geeignet sind (wie sie dem Fachmann bekannt sind), mit einer N- oder C-terminalen Hinzufügung einer lysosomalen Protease-Spaltstelle, insbesondere einer für ein Mitglied der Cathepsin-Protease-Familie spezifischen Stelle, insbesondere einer Stelle für Cystein-Cathepsine wie Cathepsine B, C, F, H, K, L, O, S, V, X und W, insbesondere eine Cathepsin S- oder L-Spaltstelle, am meisten bevorzugt eine Cathepsin L-Spaltstelle, die eine effiziente endo/lysosomale Freisetzung von Peptiden für die MHC-Präsentation fördert, insbesondere MHCII mit bekannter Wirksamkeit bei Menschen oder Tieren. Cathepsin-Spaltstellen in verschiedenen Proteinen wurden identifiziert und sind in der Fachwelt gut bekannt. Dazu gehören Offenlegungen von Sequenzen oder Methoden zur Identifizierung solcher Sequenzen: z. B.: Biniossek et al, J. Proteome Res. 2011, 10, 12, 5363-5373; Adams-Cioaba et al, Nature Comm. 2011, 2:197; Ferrall-Fairbanks PROTEIN SCIENCE 2018 VOL 27:714-724; Kleine-Weber et al, Scientific Reports (2018) 8:1659, https://en.wikipedia.org/wiki/Cathepsin_S und andere. Insbesondere die Anpassung von Peptidsequenzen unter Verwendung künstlicher Protease-Spaltstellen, wie sie in der vorliegenden Erfindung gezeigt wird, basiert auf dem überraschenden Effekt dieser Sequenzerweiterungen bei der Auslösung effizienterer Immunantworten nach dermaler Applikation der CLEC-Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn die Antigene an CLECs gekoppelt sind. Die Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung werden von DCs aufgenommen und die Peptidantigene werden anschlieBend Iysosomal verarbeitet und an MHCs präsentiert.
[00181] Lysosomen sind intrazelluläre, membrangebundene Organellen, die sich durch ein saures Inneres auszeichnen und eine Vielzahl von hydrolytischen Enzymen beherbergen, darunter Lipasen, Proteasen und Glykosidasen, die am Zellabbau beteiligt sind. Unter der Vielzahl von Enzymen, die Lysosomen beherbergen, sind die Kathepsine eine Familie lysosomaler Proteasen
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mit einem breiten Funktionsspektrum. Alle Kathepsine gehören zu drei verschiedenen Proteasefamilien: Serinproteasen (Kathepsine A und G), Asparaginproteasen (Kathepsin D und E) und elf Cysteinkathepsine. Beim Menschen sind elf Cystein-Kathepsine bekannt, die ebenfalls eine papainähnliche Struktur aufweisen: Kathepsine B, C (J, Dipeptidylpeptidase | oder DPPI), F, H, K (02), L, O, S, V (L2), X (P,Y,Z) und W (Lymphopain).
[00182] Die Kathepsine weisen Ähnlichkeiten in ihrer zellulären Lokalisierung und Biosynthese auf, unterscheiden sich aber in ihrem Expressionsmuster. Von allen lysosomalen Proteasen sind die Cathepsine L, B und D mit lysosomalen Konzentrationen von 1 mM am häufigsten vertreten. Die Kathepsine B, H, L, C, X, V und O werden ubiquitär exprimiert, während die Kathepsine K, S, E und W eine zell- oder gewebespezifische Expression aufweisen. Cathepsin K wird in Osteoklasten und in Epithelzellen exprimiert. Die Cathepsine S, E und W werden hauptsächlich in Immunzellen exprimiert.
[00183] Neben ihrer Hauptfunktion beim Iysosomalen Proteinrecycling spielen Cathepsine eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl physiologischer Prozesse. Cathepsin S ist die wichtigste Protease, die an der Verarbeitung und Präsentation von MHC II Ag beteiligt ist. Cathepsin-S-NullMäuse zeigen eine deutliche Abweichung bei der Erzeugung von MHC-Il-gebundenen Li-Fragmenten und der Präsentation, was auf den erheblich verminderten Li-Abbau in professionellen APCs zurückzuführen ist, in denen Cathepsin S reichlich exprimiert wird. Darüber hinaus wird exogenes Material in menschlichen DCs durch Endozytose selektiv zu Cathepsin S geleitet. Eine Anreicherung von MHC Il-Molekülen in späten endozytischen Strukturen wurde auch in Milz-DCs von Mäusen mit Cathepsin S-Mangel festgestellt. Jüngste Studien deuten darauf hin, dass sowohl Cathepsin B als auch D an der MHC-Il-vermittelten Ag-Präsentation beteiligt, aber nicht essentiell dafür sind. Cathepsin L spielt auch eine Rolle bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Antigenverarbeitung, der Tumorinvasion und -metastasierung, der Knochenresorption und des Umsatzes von intrazellulären und sekretierten Proteinen, die an der Wachstumsregulation beteiligt sind. Obwohl Cathepsin L gemeinhin als lysosomale Protease bekannt ist, wird es auch sezerniert. Diese Breitspektrum-Protease ist in der Lage, verschiedene extrazelluläre Proteine (Laminine, Fibronektin, Kollagene | und IV, Elastin und andere Strukturproteine der Basalmembranen) sowie Serumproteine und zytoplasmatische und nukleäre Proteine abzubauen.
[00184] Als neuartiges Mittel zur Steigerung der Wirksamkeit von T- Zell-Epitopen in einem Impfstoff, insbesondere einem Impfstoff auf CLEC-Basis, wird eine N- oder C-terminale Hinzufügung einer lysosomalen Protease-Spaltstelle als bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
[00185] Solche Spaltstellen im Sinne der vorliegenden Erfindung können wie folgt charakterisiert werden:
[00186] Cathepsin L-Ähnliche Spaltstellen:
[00187] Die vorgesehene Cathepsin L-Ähnliche Spaltstelle wird auf der Grundlage von ProteaseSpaltstellensequenzen definiert, die dem Fachmann bekannt sind, insbesondere auch derjenigen, die in Biniossek et al. (J. Proteome Res. 2011, 10, 5363-5373) und Adams-Cioaba et al. (Nature Comm. 2011, 2:197) offengelegt sind. Die Ausrichtung der Stelle kann N- oder C-terminal sein, bevorzugt C- terminal. Die bevorzugte Konsensussequenz für eine C-terminale CathepsinL-Stelle besteht aus der Formel:
Xn-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Xg Xn : 3-27 Aminosäuren des immunogenen Peptids X1 : Jede Aminosäure X2 : Jede Aminosäure X3 : Jede Aminosäure Xa4 : N/D/A/Q/S/R/G/L; bevorzugt N/D, stärker bevorzugt N Xs5 : F/R/A/K/T/S/E; bevorzugt F oder R, stärker bevorzugt R Xe : F/R/A/K/V/S/Y; bevorzugt F oder R, stärker bevorzugt R X7 : beliebige Aminosäure, bevorzugt A/G/P/F, noch bevorzugter A
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SS N SS
Xs8 : Cystein oder Linker wie NHNH; Bevorzugte Sequenz: Xn-X1X2XsNRRA-Linker
[00188] Cathepsin S-ähnliche Spaltstelle:
[00189] Die vorgesehene Cathepsin S-Spaltstelle basiert auf dem Fachmann bekannten Protease-Spaltstellensequenzen, insbesondere auch denjenigen, die in Biniossek et al. (J. Proteome Res. 2011, 10, 5363-5373) und in https://en.wikipedia.org/wiki/Cathepsin_S offenbart sind, und ist durch die Konsensussequenz gekennzeichnet: Xn-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Xg Dabei ist X gekennzeichnet durch Xn : 3-27 Aminosäuren des immunogenen Peptids X1 : Jede Aminosäure X2 : Jede Aminosäure X3 : eine beliebige Aminosäure, bevorzugt V, L, I, F, W, Y, H, noch bevorzugter V X4 : eine beliebige Aminosäure, bevorzugt V, L, I, F, W, Y, H, noch bevorzugter V Xs: K, R, E, D, Q, N, vorzugsweise K, R, besonders bevorzugt R Xe : Jede Aminosäure X7 : eine beliebige Aminosäure, bevorzugt A Xs8 : bevorzugt A Xs8 : Cystein oder Linker wie NHNH; Bevorzugte Sequenz: Xn-X1;X2VVRAA-Linker
[00190] Zu den in Proteinen enthaltenen T-Zell-Epitopen, die sich für die Kopplung an CLECs eignen, gehören T-Zell-Epitope von Trägerproteinen, insbesondere toxisches kreuzreaktives Material von Diphtherietoxin (CRM), insbesondere CRM497, KLH, Diphtherietoxoid (DT), Tetanustoxoid (TT), Haemophilus influenzae Protein D (HipD) und dem äußeren Membranproteinkomplex von Meningokokken der Serogruppe B (OMPC), rekombinante nicht toxische Form von Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (rEPA), Flagellin, Escherichia coli hitzelabiles Enterotoxin (LT), Choleratoxin (CT), mutierte Toxine (z.g., LTK63 und LTR72), virusähnliche Partikel, Albuminbindungsprotein, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, ein synthetisches Peptiddendrimer, z. B. ein multiples antigenes Peptid (MAP) oder andere im Handel erhältliche Trägerproteine, vorzugsweise CRM197 und KLH, am meisten bevorzugt CRM197.
[00191] Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die CLEC-Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung (a) CLECs, die mit einzelnen B-Zell-Epitopen von Alpha-Synuclein und/oder T-Zell-Epitopen konjugiert sind, einschließlich Mischungen von B- oder T-Zell-Epitopen, insbesondere diese Epitope, gekoppelt an Pustulan; (b) CLECs, die mit Polypeptid-Trägerprotein-Konjugaten konjugiert sind, vorzugsweise mit Polypeptid-KLH- oder Polypeptid-CRM197-Konjugaten, die an Pustulan gekoppelt sind, besonders bevorzugt mit PoIypeptid-CRM197-Konjugaten, die an Pustulan gekoppelt sind; (c) CLECs, die mit einzelnen BZell-Epitopen von Alpha-Synuclein und T-Zell-Epitopen konjugiert sind; gekoppelt an CLECs, am meisten bevorzugt an Pustulan; (d) CLECs, die einzeln gekoppelt sind ("einzeln" bedeutet hier, dass die Polypeptidketten nicht als Fusionsprotein, Tandem-Repeat-Polypeptid oder Peptid-Protein-Konjugat vorliegen, sondern als unabhängige Einheiten, d. h. ein unabhängiges B-ZellEpitop, das an Pustulan gekoppelt ist; d. h. ein unabhängiges B-Zell-Epitop-enthaltendes PoIypeptid und ein unabhängiges T-Zell-Epitop-enthaltendes Polypeptid) mit B-Zell-Epitopen und TZell-Epitopen, die in Polypeptiden oder Proteinen enthalten sind, z. B. Trägerproteinen, Eigenproteinen, Fremdproteinen von Pathogenen, Allergenen usw.(e) CLECs, die individuell ("individuell" hat wieder die gleiche Bedeutung wie bei (d)) mit T-Zell-Epitopen gekoppelt sind, die lineare MHCI- und MHCII-Epitope darstellen oder die in Proteinen enthalten sind, z.B. in Trägerproteinen oder Zielproteinen, z.B. zur Behandlung von neoplastischen Erkrankungen oder Autoimmunerkrankungen.
[00192] Angesichts dieser vorteilhaften Eigenschaften der Konjugate der vorliegenden Erfindung ergibt sich, dass die Konjugate und Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung speziell für einen aktiven Anti-alpha-Synuclein-Impfstoff zur Behandlung und Vorbeugung von Synucleopa-
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thien verwendet werden können.
[00193] Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein wie oben definiertes Konjugat oder einen Impfstoff und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
[00194] Vorzugsweise ist der pharmazeutisch akzeptable Träger ein Puffer, vorzugsweise ein Puffer auf Phosphat- oder TRIS-Basis.
[00195] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die pharmazeutische Zusammensetzung in einem nadelbasierten Verabreichungssystem, vorzugsweise einer Spritze, einem Mini-Nadelsystem, einem Hohlnadelsystem, einem festen Mikronadelsystem oder einem System mit Nadeladaptern, einer Ampulle, nadelfreien Injektionssystemen, vorzugsweise einem Jet-Injektor, enthalten; ein Pflaster, ein transdermales Pflaster, ein mikrostrukturiertes transdermales System, ein Mikronadel-Array-Pflaster (MAP), vorzugsweise ein festes MAP (S-MAP), ein beschichtetes MAP (C-MAP) oder ein sich auflösendes MAP (D-MAP); ein Elektrophorese-System, ein lontophorese-System, ein Laser-basiertes System, insbesondere ein Erbium-YAG-Laser-System; oder ein Gene-Gun-System. Die Konjugate im Sinne der vorliegenden Erfindung sind nicht auf eine bestimmte Form der Herstellung, Lagerung oder Abgabe beschränkt. Alle herkömmlichen und typischen Formen sind daher an die vorliegende Erfindung anpassbar. Vorzugsweise können die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung die vorliegenden Konjugate oder Impfstoffe als Lösung oder Suspension, tiefgekühlte Lösung oder Suspension, Lyophilisat, Pulver oder Granulat enthalten. Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Figuren näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
[00196] Figur 1 zeigt: ConA- und DC-Rezeptor (d.h. Dectin-1) Bindungsaktivität durch CLECKonjugate in vitro
[00197] A) Eine höhere Bindungseffizienz an Dectin-1 wird für Pustulan (Pus) im Vergleich zu Lichenan (Lich) nachgewiesen, und B) Beta-Glucane aus Hafer (oat_BG265, oat_BG391) und Gerste (Barley_BG229) zeigten eine begrenzte Bindungseffizienz im Vergleich zu Pustulan. C) Verschiedene Glucan-Typen (d. h. Pustulan, Mannan und Gerstenglucan (229kd)) behalten nach der Glucan-Oxidation eine hohe oder mittlere Rezeptorbindungsaktivität, wie durch kompetitive Bindungstests ermittelt wurde. "20 % und 40 % oxidiert" bezeichnet den Oxidationsstatus der für die Konjugation verwendeten Glucan-Anteile. Hemmung in % gibt die Hemmung der Bindung des löslichen Dectin-1-Rezeptors (Pustulan und Gerste_BG229) oder von ConA (Mannan) an plattengebundenes Beta-Glucan oder Mannan in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen der getesteten CLEC an. D) Pustulan-Konjugate und E) Lichenan-Konjugate behalten etwa 50 % der Dectin-1-Bindungskapazität im Vergleich zu ungekoppeltem Beta-Glucan bei, wie mit dem kompetitiven Bindungstest ermittelt wurde. F) Pustulan-Konjugate, die über heterobifunktionelle Linker hergestellt werden, behalten eine hohe Dectin-1-Bindungswirksamkeit bei. Die Daten sind als relative Lichteinheiten (RLU) eines luminometrischen ELISA dargestellt. Pus70 Conjugate 1-3 bezieht sich jeweils auf drei verschiedene CLEC-Peptidkonjugate (SeqlD2, SeqgID10 und SeqglD16). Pus 70% und Lich 200% bezieht sich auf Pustulan und Lichenan mit dem jeweiligen Oxidationsstatus. BMPH Pus bezieht sich auf aktiviertes Pustulan. BMPH Konjugat 2 bezieht sich auf das CLEC-SeglD10-Konjugat.
[00198] Figur. 2 zeigt: Durchflusszytometrische Analyse der Aktivierung dendritischer Zellen durch Lipopolysaccharid (LPS) und verschiedene Pustulanzubereitungen.
[00199] Unreife, aus dem Knochenmark stammende dendritische Zellen der Maus (BMDCSs) wurden in vitro mit dem Granulozyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) erzeugt. GM-CSF-BMDCs wurden 24 Stunden lang mit LPS (äquivalente Dosis in oxidiertem Pustulan und in Pustulan-Konjugat-Präparaten), SeqgID2+SeqID7+Pustulan-Konjugaten oder nur mit oxidiertem Pustulan stimuliert. Pustulan-Konjugate und nur Pustulan wurden in ansteigenden Dosen verwendet, beginnend bei 62,5 ug/ml des jeweiligen Zuckers (bis zu 500 ug/ml). Die DCs
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wurden anhand der CD11c/CD11b-Expression identifiziert, und die Oberflächenexpression von CD80 und des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse Il durch A) und C) SeqlD2+SeqglD7+Pustulan-Konjugate bzw. B) und D) nur oxidiertes Pustulan wurde durchflusszytometrisch gemessen. Die Expression von Aktivierungsmarkern wurde mit der CytExpert Software für DCs analysiert, die mit Pustulan-Präparaten (=gemessen) und DCs, die mit äquivalenten Mengen von LPS (=erwartet) behandelt wurden.
[00200] Figur 3 zeigt: Bestimmung der Partikelgröße von CLEC-Konjugaten durch dynamische Lichtstreuung (DLS).
[00201] Die Partikelgröße wurde durch Messung der zufälligen Änderungen der Intensität des von einer Suspension oder Lösung gestreuten Lichts mittels DLS bestimmt. Die Regularisierungsanalyse und die entsprechende Kumulantenradiusanalyse über 24 Stunden sind jeweils für A) SeqID5+SeqID7+Pustulan (80 % Oxidationsstatus) Konjugate, B) SegID6+CRM+Pustulan Konjugate und C) nicht modifiziertes Pustulan dargestellt.
[00202] Figur 4 zeigt: Vergleich der Immunogenität verschiedener CLEC-basierter Impfstoffe.
[00203] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Die Proben wurden 2 Wochen nach den 3 Impfungen entnommen und auf A) die Anti-PeptidAntwort (SeqlD3) von Impfstoffen auf Mannan-, Gersten- und Pustulanbasis (SeqID2+SeqID7+ CLEC) und B) die Anti-Peptid-Antwort (SeqgIlD3 und SeqglD11) von Impfstoffen auf Pustulan- und Lichenanbasis (SeqgID2+SeqgID7+CLEC und SeqgIlD10+SeqgID7+CLEC) untersucht.
[00204] Figur 5 zeigt: Vergleichende Analyse der Immunogenität von Peptid-Pustulan-Konjugaten und Impfstoffen, die aus unkonjugierten Peptiden und CLECs bestehen.
[00205] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Die Proben wurden 2 Wochen nach der 3. Anwendung entnommen und auf Anti-Peptid-Reaktionen (SeqlD3) untersucht. Verwendete Impfstoffe: SeqgID2+SeqgID7+CLEC oder Mischungen aus unkonjugiertem SeqIlD2, SeqID7 und CLEC.
[00206] Figur 6 zeigt: Vergleichende Analyse der Immunogenität von Pustulankonjugaten, die B- und T-Zell-Epitope enthalten, mit Konjugaten, die entweder nur das jeweilige B-Zell- oder T-Zell-Epitop enthalten.
[00207] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Verwendete Impfstoffe: SeqgID5+SeqgID7+CLEC oder SeqgID5+CLEC, und SeqgID7+CLEC. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf Anti-Peptid-Reaktionen (SeqIlD6) untersucht.
[00208] Figur 7 zeigt: Vergleichende Analyse der Anti-Pustulan-Antikörperreaktionen bei Mäusen nach wiederholter Immunisierung mit Peptid-Pustulan-Konjugaten oder Impfstoffen, die die jeweiligen nicht konjugierten Komponenten enthalten
[00209] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Aufschluss über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. PräPlasma und t1-t3 bezeichnen Immunreaktionen, die vor (Prä-Plasma) oder nach der ersten (t1), zweiten (t2) oder dritten (t3) Impfung nachweisbar waren. Die Proben wurden 2 Wochen nach der 3. Applikation entnommen und auf Anti-Pustulan-Reaktionen untersucht. A) Analyse der durch verschiedene Impfstoffe ausgelösten Anti-Pustulan-Reaktion. B) Kinetik der Immunantwort.
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C) Inhibitions-ELISA zum Nachweis der Spezifität des ELISA-Systems. Verwendete Impfstoffe: SeqID2+SeqID7+CLEC oder Mischungen aus unkonjugiertem SeqglD2, SeqgIlD7 und CLEC.
[00210] Figur 8 zeigt: Vergleichende Analyse der durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelösten Immunreaktionen unter Verwendung der unterschiedlichen Peptidkopplungsorientierung.
[00211] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Aufschluss über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Es wurden 4 verschiedene CLEC-basierte Prototyp-Impfstoffkandidaten (zwei verschiedene Peptide, die entweder über ihren C- oder N-Terminus an Pustulan gekoppelt sind) getestet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der 3. Applikation entnommen und auf A) Anti-Peptid- und B) AntiaSyn-Protein-Reaktionen untersucht. Verwendete Impfstoffe: SeqgID1/2/4/5+SeqgID7+CLEC
[00212] Figur 9 zeigt: Vergleichende Analyse der Immunogenität von CLEC-basierten Impfstoffen unter Verwendung verschiedener promiskuitiver T-HelferzellEpitope.
[00213] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Immunantworten, die durch 9 verschiedene CLEC-basierte Impfstoffe (Impfstoff 1-9) ausgelöst wurden, die dasselbe B-Zell-Epitop und verschiedene T-Helfer-Epitope (d. h. SeqIlD7, SeqID2229) enthalten, wurden jeweils gegen das entsprechende Peptid-KLH-Konjugat (Impfstoff 10) bewertet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf A) AntiPeptid- und B) Anti-aSyn-Protein-Reaktionen untersucht.
[00214] Figur 10 zeigt: die vergleichende Analyse der ziel- und trägerproteinspezifischen Immunogenität, die durch CLEC-basierte und herkömmliche Peptid-ProteinKonjugat-Impfstoffe unter Verwendung des Trägerproteins KLH als Quelle für T-Helferzell-Epitope induziert wird.
[00215] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale oder subkutane (s.c.) Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Aufschluss über die Kinetik der darauf folgenden Immunreaktion zu erhalten. Die Immunreaktionen, die durch zwei Peptid-Protein-Konjugat-Impfstoffe ausgelöst wurden, die KLH als Quelle für T-Helfer-Epitope in Kombination mit CLEC-Modifikationen verwenden (SeqgID3+KLH+Pustulan bzw. SeqID6+KLH+Pustulan), wurden im Vergleich zu Reaktionen bewertet, die durch herkömmliche Peptid-KLH-Konjugate (d. h. SeqgID3+KLH und SeqgID6+KLH) ausgelöst wurden, die entweder mit Alum/Alhydrogel s.c. oder ohne zusätzliches AdjJuvans 1.d. verabreicht wurden. Die Proben wurden zwei Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und mittels ELISA auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSyn-Protein-Reaktionen und B) AntiKLH-Reaktionen untersucht.
[00216] Figur 11 zeigt: die vergleichende Analyse der ziel- und trägerproteinspezifischen Immunogenität, die durch CLEC-basierte und herkömmliche Peptid-ProteinKonjugat-Impfstoffe unter Verwendung des Trägerproteins CRM197 als Quelle für T-Helferzell-Epitope induziert wird
[00217] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale oder s.c.-Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. In dieser Studie wurden 2 verschiedene CRM-basierte Impfstofftypen verwendet. SeqgIlD6+CRM+Pus steht für ein Peptid-CRM-Konjugat, das anschließend an Pustulan gekoppelt wurde, während SeqgID5+CRM+Pus ein Konjugat darstellt, bei dem die Peptidkomponente und das Trägermolekül einzeln an das CLEC gekoppelt wurden. Die von beiden Typen ausgelösten Immunreaktionen wurden im Vergleich zu dem jeweiligen konventionellen Peptid-CRM-Konjugat (d. h. SegID6+CRM, das mit Alum/Alhydrogel adjuvantiert und s.c. appliziert wurde) bewertet. Die
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Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und mittels ELISA auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSyn-Protein-Reaktionen und B) Anti-CRM-Reaktionen untersucht.
[00218] Figur 12 zeigt: Die vergleichende Analyse der Selektivität der durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelösten Immunreaktionen in vivo gegen zwei verschiedene aSyn-Formen.
[00219] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale oder s.c.-Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Der CLEC-basierte Impfstoff (SeqID2+SeqglD7+Pus und SeqID5+SeqgID7+Pus; i.d. appliziert) und der alternative CLEC-basierte Impfstoff (SeqgID3+KLH+Pus und SeqgID6+CRM+Pus; 1.d. appliziert) wurden im Vergleich zum herkömmlichen Peptidkomponenten-Impfstoff (SeqgID3+KLH-+Alum und SeqgID6+CRM+Alum, s.c. appliziert) bewertet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der 3. Applikation entnommen und einem aSynSelektivitätstest unterzogen (Hemmungs- ELISA). Schwarze Linie: monomeres aSyn zur Hemmung verwendet; gestrichelte Linie: filamentöses aSyn zur Hemmung verwendet.
[00220] Figur 13 zeigt: eine vergleichende Analyse der Avidität der durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelösten Immunreaktionen.
[00221] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale oder s.c.-Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Der CLEC-basierte Impfstoff (SeqID2+SeqglD7+Pus und SeqID5+SeqlD7+Pus, I.d. appliziert) und der alternative CLEC-basierte Impfstoff (SegID3+KLH+Pus und SeqgID6+CRM+Pus, 1.d. appliziert) wurden gegenüber dem herkömmlichen Peptidkomponenten-Impfstoff (SegID3+KLH-+Alum und SeqgID6+CRM+Alum, s.c. appliziert) bewertet. Die Proben wurden zwei Wochen nach der zweiten (T2) bzw. zwei Wochen nach der dritten Immunisierung (T3) entnommen, und die Avidität der Antikörper gegen aSyn wurde mit einem ELISA-basierten Aviditätstest bestimmt.
[00222] Figur 14 zeigt: eine vergleichende Analyse der Affinität der durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelösten Immunreaktionen.
[00223] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale oder s.c.-Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Der CLEC-basierte Impfstoff (SeqIlD2+SeqID7+ Pus und SeqIlD5+SeqlD7+Pus, 1.d. appliziert) und der alternative CLEC-basierte Impfstoff (SeqgIlD3+KLH+Pus und SeqgID6+CRM+Pus, 1.d. appliziert) wurden im Vergleich zum herkömmlichen Peptidkomponenten-Impfstoff (SegID3+KLH+Alum und SeqgID6+CRM+Alum, s.c. appliziert) bewertet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Verabreichung entnommen, und die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (Kd) der Antikörper gegen aSyn wurde mittels eines aSynVerdrängungs-ELISA-Tests bestimmt.
[00224] Figur 15 zeigt: die vergleichende Analyse der In-vitro-Funktionalität der durch CLECbasierte Impfstoffe ausgelösten Immunreaktionen.
[00225] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale und s.c.-Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Verabreichung entnommen und die Modulation der aSyn-Aggregation in Gegenwart von aSynspezifischen Antikörpern wurde mit Hilfe von ThT-Fluoreszenztests untersucht. A) aSyn wurde in Gegenwart von CLEC-Impfstoff-induzierten Abs (SegID2+SeqgID7+Pus; 1.d. appliziert), konventionellen Peptid-Komponenten-induzierten Abs (SegID3+KLH+Alum, s.c. appliziert) oder Mausplasma für 0-72 Stunden aggregiert. B) aSyn oder aSyn mit präformierten Fibrillen wurde in Gegenwart von CLEC-Impfstoff-induzierten Abs (SeqIlD5+SeqgID7+Pus und SeqID6+CRM+Pus, beide i.d. appliziert), konventionellen Peptid-Komponenten-induzierten Abs (SeqgID6+CRM+ Alum, s.c. appliziert) oder Mausplasma 0-92 Stunden lang aggregiert. Die kinetischen Kurven wurden durch Normalisierung der ThT-Fluoreszenz bei t0 berechnet, und die aus der linearen Regressionsanalyse in der exponentiellen Wachstumsphase der ThT-Kinetik extrahierten Steigungswerte wurden zur Berechnung der prozentualen Hemmung der aSyn-Aggregation verwendet.
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[00226] Figur 16 zeigt: eine vergleichende Analyse der Auswirkungen des Immunisierungswegs auf die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelösten Immunreaktionen.
[00227] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Aufschluss über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Zwei alternative Verabreichungswege - subkutan (s.c.) und intra-muskulär (i.m.) - wurden mit der intradermalen (i.d.) Verabreichung der CLEC-basierten Impfstoffe verglichen. Pro Applikationsweg wurden drei Dosen des CLEC-basierten Impfstoffs (SeqID2+SeqIlD7+Pus) verabreicht. Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Applikation entnommen und auf A) Anti-Peptid- und B) Anti-aSyn-ProteinReaktionen untersucht.
[00228] Figur 17 zeigt: die vergleichende Analyse der zielproteinspezifischen Immunogenität, die durch CLEC-basierte Peptid-CRM197-Konjugatimpfstoffe unter Verwendung verschiedener Peptid-CRM197/CLEC-Verhältnisse hervorgerufen wird
[00229] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 intradermale Impfungen im Abstand von 2 Wochen. Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. In dieser Studie wurden 5 verschiedene Impfstoffe auf Peptid-CRM-Basis mit unterschiedlichen Peptid-CRM/Pustulan-Verhältnissen (w/w) verwendet. Alle 5 Gruppen wurden mit SegID6+CRM+ Pus-Konjugaten immunisiert. 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10 und 1:20 stehen für Konjugate mit einem w/w Peptid-CRM-Konjugat/’CLEC-Verhältnis von 1/1, 1/2,5, 1/5, 1/10 und 1/20. Die induzierten Immunreaktionen wurden anhand von Proben bewertet, die 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und mittels ELISA auf Anti-aSyn-Proteinreaktionen untersucht wurden. Die Titerbestimmung basierte auf der Berechnung von ODmax/2.
[00230] Figur 18 zeigt: die vergleichende Analyse der durch CLEC-Impfstoffe mit B-Zell-Epitopen von aSyn (aa1-8) ausgelösten Immunreaktionen.
[00231] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen (i.d. und s.c.). Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Impfstoffe auf CLEC-Basis (SeqIlD12+SeqlD7+Pustulan, 1.d.) wurden mit herkömmlichen Impfstoffen auf Peptidkomponenten-Konjugatbasis (SeqlD13 konjugiert mit KLH und Alhydrogel (Alum), s.c.) verglichen. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSyn-Protein-Reaktionen und B) aSyn-Selektivität (HemmungsELISA) untersucht. Schwarze Linie: monomeres aSyn zur Hemmung verwendet; gestrichelte Linie: filamentöses aSyn zur Hemmung verwendet.
[00232] Figur 19 zeigt die vergleichende Analyse der Immunantworten, die durch CLEC-Impfstoffe mit B-Zell-Epitopen von aSyn (aa100-108) ausgelöst wurden.
[00233] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen (i.d. und s.c.). Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Impfstoffe auf CLEC-Basis (SeqgIlD16+SeqlD7 und Pustulan, i.d.) wurden mit herkömmlichen Impfstoffen auf Peptidkomponenten-Konjugatbasis (SeqgIlD17 konjugiert mit KLH und Alhydrogel (Alum), s.c.) verglichen. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSyn-Protein- Reaktionen und B) aSyn-Selektivität (HemmungsELISA) untersucht. Schwarze Linie: monomeres aSyn zur Hemmung verwendet; gestrichelte Linie: filamentöses aSyn zur Hemmung verwendet.
[00234] Figur 20 zeigt die vergleichende Analyse der durch CLEC-Impfstoffe mit B-Zell-Epitopen von aSyn (aa91-97) ausgelösten Immunreaktionen.
[00235] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen (i.d. und s.c.). Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben
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entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Impfstoffe auf CLEC-Basis (SeqIlD14+SeqlD7 und Pustulan, i.d.) wurden mit herkömmlichen Impfstoffen auf Peptidkomponenten-Konjugatbasis (SeqgIlD15 konjugiert mit KLH und Alhydrogel (Alum), s.c.) verglichen. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf Anti-Peptid- und Anti-aSyn-Protein-Reaktionen untersucht.
[00236] Figur 21 zeigt die vergleichende Analyse der durch CLEC-Impfstoffe mit B-Zell-Epitopen von aSyn (aa130-140) ausgelösten Immunreaktionen.
[00237] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen (i.d. und s.c.). Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Impfstoffe auf CLEC-Basis (SeqgID20+SeqIlD7 und Pustulan, i.d.) wurden mit herkömmlichen Impfstoffen auf Peptidkomponenten-Konjugatbasis (SeqgID21 konjugiert mit KLH und Alhydrogel (Alum), s.c.) verglichen. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSyn-Protein-Reaktionen und B) aSyn-Selektivität (HemmungsELISA) untersucht. Schwarze Linie: monomeres aSyn zur Hemmung verwendet; gestrichelte Linie: filamentöses aSyn zur Hemmung verwendet.
[00238] Figur 22 zeigt die vergleichende Analyse der durch CLEC-Impfstoffe mit B-Zell-Epitopen von aSyn (aa115-122) ausgelösten Immunreaktionen.
[00239] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen (i.d. und s.c.). Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Impfstoffe auf CLEC-Basis (SeqglD51+SeqlD7 und Pustulan, 1.d.) wurden gegen herkömmliche Impfstoffe auf Peptidkomponenten-Konjugatbasis (SeqgID52 konjugiert mit CRM und Alhydrogel (Alum), s.c.) getestet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSyn-Filament-Reaktionen und B) aSyn-Selektivität (Hemmungs-ELISA) untersucht. Schwarze Linie: monomeres aSyn zur Hemmung verwendet; gestrichelte Linie: filamentöses aSyn zur Hemmung verwendet.
[00240] Figur 23 zeigt die vergleichende Analyse der durch CLEC-Impfstoffe mit B-Zell-Epitopen von aSyn (aa115-124) ausgelösten Immunreaktionen.
[00241] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen (i.d. und s.c.). Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Impfstoffe auf CLEC-Basis (SeqglD67+SeqlD7 und Pustulan, 1.d.) wurden gegen herkömmliche Impfstoffe auf Peptidkomponenten-Konjugatbasis (SeqID68 konjugiert mit CRM und Alhydrogel (Alum), s.c.) getestet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSyn-Filament- Reaktionen und B) aSyn-Selektivität (Hemmungs-ELISA) untersucht. Schwarze Linie: monomeres aSyn zur Hemmung verwendet; gestrichelte Linie: filamentöses aSyn zur Hemmung verwendet.
[00242] Figur 24 zeigt die vergleichende Analyse der durch CLEC-Impfstoffe mit B-Zell-Epitopen von aSyn (aa107-113) ausgelösten Immunreaktionen.
[00243] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen (i.d. und s.c.). Zu Beginn und nach jeder Impfung wurden Blutproben entnommen, um Informationen über die Kinetik der anschließenden Immunreaktion zu erhalten. Impfstoffe auf CLEC-Basis (SeqglD73+SeqlD7 und Pustulan, 1.d.) wurden gegen herkömmliche Impfstoffe auf Peptidkomponenten-Konjugatbasis (SeqgID74 konjugiert mit CRM und Alhydrogel (Alum), s.c.) getestet. Die Proben wurden 2 Wochen nach der dritten Anwendung entnommen und auf A) Anti-Peptid- und Anti-aSyn-Filament- Reaktionen und B) aSyn-Selektivität (Hemmungs-ELISA) untersucht. Schwarze Linie: monomeres aSyn zur Hemmung verwendet; gestrichelte Linie: filamentöses aSyn zur Hemmung verwendet.
[00244] Figur 25 zeigt die vergleichende Analyse der In-vitro-Funktionalität von Immunantworten, die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelöst werden.
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[00245] Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen erhielten insgesamt 3 Impfungen im Abstand von 2 Wochen (i.d. und s.c.). Blutproben wurden zu Beginn und nach jeder Impfung entnommen, um Informationen über die Kinetik der darauf folgenden Immunantwort zu erhalten. Die Proben wurden 2 Wochen nach der 3. Applikation entnommen und die ThT-Kinetik (d. h. die fibrilläre Fraktion von aSyn) wurde in Gegenwart von A-C) CLEC-Impfstoff-induzierten Abs (SeqlD67/71/73+SeqlD7 und Pustulan, i.d.) oder konventionellen Peptid-Komponenten-induzierten Abs (SeqlD68/72/74 konjugiert mit CRM und Alhydrogel (Alum), s.c.), oder D) der aSyn-spezifischen, monoklonalen Ab-LB09 oder unbehandeltem Mäuseplasma analysiert.
BEISPIELE: Material und Methoden 1) Oxidation von CLEC/Glucan-Backbone
[00246] Zur Bildung von Impfstoffkonjugaten müssen Polysaccharide, insbesondere auch CLEC/ß-Glucane, chemisch modifiziert werden, um reaktive Gruppen zu erzeugen, die zur Verknüpfung von Proteinen/Peptiden verwendet werden können. Zwei häufig verwendete Methoden zur Aktivierung von Polysacchariden sind die Periodat-Oxidation an vicinalen Hydroxylgruppen sowie die Cyanylierung von Hydroxylgruppen. Weitere Methoden zur Aktivierung von Polysacchariden sind möglich und in der Technik gut bekannt. Die in diesem Abschnitt gezeigten Beispiele basieren auf einer milden Periodat-Oxidation.
[00247] Je nach ihrer Löslichkeit werden CLECs und ß-Glucane (z.B. Mannan, Lichenan, Pustulan oder ßB-Glucan aus Gerste) mittels Periodat-Oxidation in wässriger Lösung oder DMSO oxidiert.
[00248] Der Oxidationsgrad wird durch Zugabe der Periodatlösung in einem molaren Verhältnis (Periodat:Zuckeruntereinheit; 100% = 1 Mol Periodat pro Mol Zuckermonomere) von 1:5 (d.h. 20% Oxidation) bis 2,6:1 (260% Oxidationsgrad) bestimmt.
[00249] Kurz gesagt wird Natriumperiodat in einem Molverhältnis von 1:5 bis 2,6:1 (Periodat:Zuckeruntereinheit, entsprechend 20 % und 260 % Oxidationsgrad) zugegeben, um die Furanoseringe der B-Glucane zwischen den vicinalen Diolen zu öffnen, so dass zwei Aldehydgruppen als Substrat für die nachfolgenden Kopplungsreaktionen übrig bleiben. 10% (v/v) 2-Propanol wird als Radikalfänger zugegeben. Die Reaktion wird 4 Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler (1000 U/min) im Dunkeln inkubiert. Anschließend werden die oxidierten Glucane mit Hilfe von Slide-A-Lyzer'M (Thermo Scientific) oder Pur-A-Lyzer'M (Sigma Aldrich) Kassetten mit einem Cutoff von 20 kDa dreimal gegen Wasser dialysiert, um Natrium(per)jodat und GlucanVerunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Dialysierte Glucane können direkt der Peptidkonjugationsreaktion unterzogen oder bei -20°C gelagert oder lyophilisiert und bei 4°C zur weiteren Verwendung aufbewahrt werden.
2) Konjugation von WISIT-Impfstoffen 2a. über Hydrazonbildung
[00250] Polypeptide enthalten am N- oder C-Terminus eine Hydrazidgruppe für die Aldehydkopplung. Wenn die Kopplung über den N-Terminus des ausgewählten Peptids an die Aldehydgruppen der Glucaneinheiten erfolgen soll, muss das Peptid einen geeigneten Linker/Spacer enthalten, z. B. Bernsteinsäure. Alternativ wurden auch intakte Proteine (z. B. CRM197) für die Glucan-Kopplung verwendet.
[00251] Typische Beispiele für solche Peptide: N-terminale Kopplung von Peptiden: H2N-NH-COCH2-CH2-CO-Polypeptid-COOH; C-terminale Kopplung: NH2-Polypeptid-NH-NH2.
[00252] Zur Kopplung wird aktivierte Glucanlösung (d. h. oxidiertes Pustulan) mit den gelösten hydrazidmodifizierten Peptiden oder intakten Proteinen (z. B. CRM197) in Kopplungspuffer gerührt (je nach isoelektrischem Punkt des Peptids wird entweder Natriumacetatpuffer bei pH 5,4 oder DMEDA bei neutralem pH (6,8) verwendet). Die freie Hydrazidgruppe in den Peptiden rea-
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giert mit der Aldehydgruppe zu einer Hydrazonbindung und bildet das endgültige Konjugat. Bei Proteinen beruht die Kopplung an aktiviertes Glucan auf der Reaktion der Aminogruppe der vorhandenen Lysinreste mit reaktiven Aldehyden an den Glucanteilen in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid.
[00253] Anschließend wird das Konjugat durch Zugabe von Natriumborhydrid in Boratpuffer (pH 8,5) reduziert. In diesem Schritt wird die Hydrazinbindung zu einem stabilen sekundären Amin reduziert und nicht umgesetzte Aldehydgruppen im Zuckergerüst werden in primäre Alkohole umgewandelt. Die Kohlenhydratkonzentration in den Konjugaten wurde mit der Anthron-Methode geschätzt und die Peptidkonzentration wurde durch UV-Spektroskopie geschätzt oder durch Aminosäureanalyse bestimmt.
2b. Kopplung mit heterobifunktionellen Linkern
[00254] Die zweite angewandte Konjugationstechnik beruht auf hetero-bi-funktionellen Linkern (z. B.: BMPH (N-ßB-Maleimidopropionsäurehydrazid, MPBH (4-[4-N-Maleimidophenyl]-buttersäurehydrazid), EMCH (N-[e-Maleimidocapronsäure)-hydrazid) oder KMUH (N-[k-Maleimidoundecansäure]-hydrazid), kurze Maleimid-Hydrazid-Vernetzer für die Konjugation von Sulfhydriden (Cysteinen) mit Carbonylen (Aldehyden)).
[00255] Polypeptide enthalten am N- oder C-Terminus ein Cystein (Cys) für die Maleinimid-Kopplung. Typische Beispiele für solche Peptide: N-terminale Kopplung von Peptiden: Cys-PeptidCOOH; C-terminale Kopplung: NH2-Pept-Cys-COOH.
[00256] Zur Kopplung wird aktivierte Glucanlösung (d.h. oxidiertes Pustulan) über Nacht mit BMPH umgesetzt (verwendete Verhältnisse 1:1 (w/w) bis 2:1 BMPH:Pustulan) und anschließend 3x mit PBS dialysiert. BMPH-aktiviertes Glucan wird dann mit den gelösten Cys-modifizierten Polypeptiden in Kopplungspuffer (z. B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS) gemischt. Die Maleinimidgruppe reagiert mit den Sulfhydrylgruppen der Peptide unter Bildung stabiler Thioetherbindungen und führt zusammen mit dem zwischen Linker und reaktiven Aldehyden gebildeten Hydrazon zu stabilen Konjugaten. Die Kohlenhydratkonzentration in den Konjugaten wurde mit der Anthron-Methode geschätzt und die Polypeptidkonzentration wurde durch Aminosäureanalyse oder mit dem Ellmann-Assay unter Verwendung des Ellman-Reagens (5,5'-Dithio-bis-(2nitrobenzoesäure), DTNB) bestimmt. DTNB reagiert mit Sulfhydrylgruppen unter Bildung eines farbigen Produkts und bietet eine zuverlässige Methode zur Messung reduzierter Cysteine und anderer freier Sulfhydride in Lösung durch spektrophotometrische Messung (A\max = 412nm; & = 14,150/M-cm).
2c) Polypeptid-KLH/CRM-Konjugation
[00257] Polypeptide (mit N- oder C-terminalen Cys-Resten, siehe oben) wurden mit Hilfe der heterobifunktionellen Vernetzungsmittel GMBS oder SMCC (Thermo Fisher) an den Träger CRM197 (z. B. EcoCRM, Fina Biosolutions) oder KLH (Sigma Aldrich) gekoppelt. CRM-197/KLH wurde mit einem Überschuss an GMBS oder SMCC (gemäß Herstellerprotokoll) bei Raumtemperatur gemischt, um die Aktivierung zu ermöglichen, gefolgt von der Entfernung des GMBS-Überschusses durch Zentrifugation der Entsalzungssäule. Das überschüssige Peptid wurde dann dem aktivierten Träger zur Kopplung zugegeben (Puffer: 200mM Na-Phosphat (pH=6,8)) und anschlieBend 3x mit PBS dialysiert. Die Kopplungseffizienz bzw. der Peptidgehalt wurde mit Hilfe eines Ellmann- Tests (Ellmann-Reagenz: 5,5'-Dithio-bis-(2- Nitrobenzoesäure) zur Quantifizierung freier Sulfhydrylgruppen in Lösung) bestimmt. Das Polypeptid CRM-197/KLH-Konjugat wurde außerdem mit Alum (Alhydrogel® Adjuvans 2%) formuliert und den Tieren subkutan appliziert. Beim Vergleich der CRM-197/KLH-Impfstoffe mit anderen erfindungsgemäßen Impfstoffen wurden pro Maus die gleichen Mengen an konjugierten Polypeptiden injiziert.
2d) Gluco-Neokonjugatbildung mit Polypeptid, KLH/CRM197 und Glucan
[00258] Polypeptid-KLH- und Polypeptid-CRM197-Konjugate, die wie in 2c) beschrieben hergestellt wurden, wurden auch an aktivierte Glucane mit unterschiedlichen Verhältnissen von Po-
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Iypeptid-KLH und Polypeptid-CRM197 zu Glucan gekoppelt (d. h. 1/1 (w/w), 1/2 (w/w), 1/5 (w/w), 1/10 (w/w) bzw. 1/20 (w/w)). Nach der Bildung des Polypeptidkonjugats werden die Pep-KLHoder Pep-CRM-Konjugate mit Dithiothreitol (DTT) reduziert. Die reduzierten Trägerkonjugate werden in Gegenwart eines UÜberschusses an heterobifunktionellem Linker BMPH an aktivierte Glucane gekoppelt. Die Kopplung erfolgt über die Maleinimidgruppe von BMPH an Sulfhydrylreste des reduzierten KLH- oder CRM197-Konjugats, wodurch eine stabile Thioetherbindung entsteht, und über Aldehydgruppen im Glykan mit der Hydrazidgruppe von BMPH. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur werden die gebildeten Hydrazone durch Inkubation mit Natriumcyanoborhydrid über Nacht zu stabilen sekundären Aminen reduziert. Anschließend werden die GlucoNeokonjugate unter Verwendung von Slide-A-Lyzer'M (Thermo Scientific) oder Pur-A-Lyzer'M (Sigma Aldrich) Kassetten dreimal gegen PBS oder Wasser dialysiert, um Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen (siehe auch: Beispiel 23).
3) Bestimmung der biologischen Aktivität von CLEC-Konjugaten in vitro
[00259] Die biologische Aktivität von Mannan- und Glucan-Konjugaten wurde in vitro mittels ELISA unter Verwendung eines löslichen murinen Fe-Dectin-1a-Rezeptors (InvivoGen) oder ConA wie in Korotchenko et al. (2020) beschrieben analysiert. Kurz gesagt, ELISA- Platten werden mit einem Referenzglucan (CLR-Agonisten, CLECs) beschichtet, z. B. Pustulan, Lichenan oder Mannan, und mit fluoreszenzmarkiertem ConA (für Mannan) oder löslichem murinem Fedectin-1a-Rezeptor (für Pustulan und andere ß-D-Glucane) umgesetzt, was durch einen HRPmarkierten Sekundärantikörper nachgewiesen werden kann. Die oxidierten Kohlenhydrate sowie die Glukokonjugate werden in einem kompetitiven ELISA getestet (steigende Konzentrationen von CLECs oder Konjugaten werden zu den für den Assay verwendeten löslichen Rezeptoren hinzugefügt, um die Rezeptorbindung an beschichtete CLECs zu verringern), um ihre Funktionalität nachzuweisen. Die IC-Werteso werden verwendet, um die biologische Aktivität zu bestimmen (d. h. die Bindungswirksamkeit an lösliche Rezeptoren im Vergleich zu nicht oxidierten, nicht konjugierten Liganden).
4) Aktivierungsanalyse mit aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen
[00260] Aus Knochenmark gewonnene dendritische Zellen (BMDCs) wurden aus Oberschenkelund Schienbeinknochen von Mäusen entnommen und mit 20 ng/ml murinem GM-CSF (Immunotools) inkubiert, wie in Korotchenko et al. (2020) mit geringfügigen Anderungen beschrieben. Die Auswirkungen der verschiedenen Konjugate sowie der Positivkontrollen (= LPS) auf die CD80und MHCII-Expression wurden mittels FACS-Analyse an CD11c* MHCII* CD11b'"t GM-CSF-abgeleiteten DCs (GM-DCs) untersucht.
5) Bestimmung des hydrodynamischen Radius
[00261] Der hydrodynamische Radius der Konjugate wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS) analysiert. Dazu wurden die Proben (d. h. die Konjugate) 15 Minuten lang bei 10 000 g zentrifugiert (Merck Millipore, Ultrafree-MC-VV Durapore PVDF). Alle Probenvertiefungen wurden mit Silikaöl versiegelt, um eine Verdunstung zu verhindern, und die Daten wurden nacheinander über einen Zeitraum von etwa 24 Stunden erfasst. Alle Messungen wurden mit einem WYATT DynaPro PlateReader-Il bei 25°C in einer 1536-Well-Platte (1536W SensoPlate, Greiner BioOne) durchgeführt. Die Proben wurden in dreifacher Ausführung gemessen. Alle Messungen wurden auf einen Basiswert von 1,00+0,005 gefiltert, so dass nur Kurven, die zu Werten zwischen 0,995 und 1,005 zurückkehrten, für die weitere Analyse berücksichtigt wurden (z. B. Kumulantenradius und Regularisierungsanalyse). Die Analyse der Stichproben erfolgte gemäß https://www.wyatt.com/library/application-notes/by-technique/dis.html und dem DYNAMICS User's Guide (M1406 Rev. C, Version 7.6.0), den Technical Notes TN2004 und TN2005 (alle unter: www. wyatt.com)
6) Tierversuche [00262] Weibliche BALB/c-Mäuse, n=5 Mäuse pro Gruppe, wurden entweder mit verschiedenen
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CLEC-Konjugaten (i.d., 1.m., S.c.), mit Peptid-CRM-197/KLH-Konjugaten (i.d.) oder an Alum adsorbierten Peptid-CRM-197/KLH-Konjugaten (s.c.) sowie mit entsprechenden Kontrollen (z.B. unkonjugierte CLEC, Mischung aus CLEC und Peptiden usw.) immunisiert. Die Tiere wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft, und die Blutproben wurden regelmäßig einen Tag vor jeder Impfung und zwei Wochen nach der letzten Anwendung entnommen, sofern nicht anders angegeben.
7) Quantifizierung von impfstoffinduzierten Antikörpern in Mäuseplasma mittels ELISA
[00263] Mäusen wurde mit Heparin als Antikoagulans Vollblut entnommen, und das Plasma wurde durch Zentrifugation gewonnen. Die Plasmaproben wurden bei -80°C gelagert. Zum Nachweis von zielspezifischen Antikörpern wurden ELISA-Platten (Nunc Maxisorb) mit Peptid- BSAKonjugaten oder rekombinanten Proteinen/Fragmenten (übliche Konzentration 1 ug/ml) unter Verwendung von 50 mM Natriumcarbonatpuffer über Nacht bei 4 °C beschichtet. Alle in den Beispielen verwendeten Anti-Polypeptid-ELISA werden mit Pep-BSA-Konjugaten durchgeführt (z. B. SeqlD3 (Sequenz: DQPVLPD) mit einem C-terminalen C zur Kopplung an maleimidaktiviertes BSA; Nomenklatur: Pep1c (DQPVLPD-C, SeqlD 3) wird als Köder für anti-Pep1-spezifische Reaktionen verwendet, die durch Pep1b (SeqIlD2; DOPVLPD-(NH-NH2))- und Pep1c-haltige Konjugatimpfstoffe ausgelöst werden). Die Platten wurden mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) blockiert, und die Plasmaproben wurden in den Platten seriell verdünnt. Der Nachweis der zielspezifischen Antikörper erfolgte mit biotinyliertem Anti-Maus-IgG (Southern Biotech) und anschlieBender Farbreaktion mit Streptavidin-POD (Roche) und TMB. Die ECso-Werte wurden mit der GraphPad Prism-Software (Graph Pad Prism www.graphpad.com/scientific-software/prism/) nach einer nichtlinearen Regressionsanalyse (logistische Vier-Parameter-Fit-Funktion) berechnet.
Zielprotein Antikörper
Alpha-Synuclein rekombinant (Anaspec) Anti-alpha-Synuclein 115-121 AB (LB509) (Biolegend)
Alpha-Synucuclein-Monomer (Abcam) Anti-alpha-Synuclein 115-121 AB (LB509) (Biolegend)
Alpha-Synuklein-Filament (Abcam) Anti-alpha-Synuclein 115-121 AB (LB509) (Biolegend)
Pustulan (Biozol)
KLH (Sigma) Anti-KLH AB (Sigma)
CRM197 (FinaBiosolution) Anti-Diphtherie AB (Abcam)
Pustulan (Biozol)
KLH (Sigma) Anti-KLH AB (Sigma)
CRM197 (FinaBiosolution) Anti-Diphtherie AB (Abcam)
8) Charakterisierung der Bindungspräferenz von aSyn-spezifischen Antikörpern durch Hemmungs-ELISA
[00264] ELISA-Platten (Nunc Maxisorb) wurden entweder mit aSyn-Monomeren (Abcam) oder aSyn-Filamenten (Abcam) beschichtet und mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Die Kontrollantikörper und die Plasmaproben wurden mit seriell verdünnten aSyn-Monomeren oder aSynFilamenten in ELISA-Platten mit geringer Bindungsrate inkubiert. Anschließend wurden die vorinkubierten Antikörper/Plasmaproben zu den mit Monomeren/Filamenten beschichteten Platten gegeben und die Bindung mit biotinyliertem Anti-Maus-IgG (Southern Biotech) und anschließender Farbreaktion mit Streptavidin-POD (Roche) und TMB nachgewiesen. Die logICso-Werte wurden als die Konzentration von monomerem oder filamentösem aSyn berechnet, die erforderlich ist, um die Hälfte des ELISA-Signals zu löschen, und dienten als Schätzwert für die Selektivität
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der Abs für das untersuchte Antigen. Die logI1Cso -Werte wurden mit der Software GraphPad Prism (Graph Pad Prism www.graphpad.com/scientific-software/prism/) nach einer nichtlinearen Regressionsanalyse (logistische Vier-Parameter-Fit-Funktion) berechnet.
9) Quantifizierung der aSyn-Aggregation
[00265] Der Proteinaggregationstest im automatisierten Format wurde in einem Reaktionsvolumen von 0,1 mlin schwarzen 96-Well-Platten mit flachem Boden unter kontinuierlichem Schütteln in einem GENIOS Microplate Reader (Tecan, Österreich) durchgeführt. Die Kinetik wurde durch Ablesen der Fluoreszenzintensität alle 20 Minuten unter Verwendung von 450-nm-Anregungsund 505-nm-Emissionsfiltern überwacht. Die Fibrillenbildung in Abwesenheit und Anwesenheit von Antikörpern (das molare Verhältnis Antikörper/Protein variierte von 6x10°® bis 3x10°®* ) wurde durch Schütteln der aSyn-Lösung in einer Konzentration von 0,3 mg/ml (20,8 uM) in 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 uM ThT und 25 ug/ml Heparinsulfat bei 37 °C im Plattenlesegerät (Tecan, Österreich) initiiert.
[00266] Darüber hinaus wurde die Fibrillenbildung in Abwesenheit und Anwesenheit von Antikörpern auch durch die Anwesenheit von vorgeformten Fibrillen initiiert. Kurz gesagt: Vorgebildete aSyn-Fibrillen (1 uM) wurden in Gegenwart von aktivierten aSyn-Monomeren (10 uM) und 10 uM ThT in 100 ul PBS für 0-24 Stunden aggregiert.
[00267] Für die Datenanalyse wurde der Mittelwert der negativen Kontrollproben, d. h. die Hintergrundfluoreszenz von ThT, berechnet und von jeder Probe zum gegebenen Zeitpunkt abgezogen, z. B. in Microsoft Excel. Um verschiedene Bedingungen/Inhibitoren im Aggregationstest zu vergleichen, wurde jede Probe auf den zu Beginn des Tests ermittelten Fluoreszenzwert normalisiert und auf 1 gesetzt (t0=1).
[00268] Zur Auswertung der kinetischen Kurven wurde ein kinetisches Modell nach MichaelisMenten verwendet: Die Werte für Km (Substratkonzentration, die eine halbmaximale Geschwindigkeit ergibt) und Vmax (maximale Geschwindigkeit) wurden für jede Bedingung mit der Software GraphPad Prism nach der Analyse der Enzymkinetik (Michaelis-Menten) berechnet.
[00269] Um verschiedene Bedingungen/Inhibitoren im Aggregationsassay zu vergleichen, wurde der Steigungswert in der exponentiellen Wachstumsphase der ThT-Kinetik mit der Software GraphPad Prism durch lineare Regression berechnet.
10) Bestimmung von Affinität und Avidität
[00270] Zur Bestimmung der Avidität von Antikörpern wurde eine Variation des Standard-ELISATests verwendet, bei dem Wiederholungsvertiefungen, die an Antigene gebundene Antikörper enthielten, steigenden Konzentrationen von chaotropen Thiocyanat-lonen ausgesetzt wurden. Die Resistenz gegenüber der Thiocyanat-Elution wurde als Maß für die Avidität verwendet, und ein Index (Aviditätsindex), der 50 % der effektiven Antikörperbindung darstellt, wurde zum Vergleich verschiedener Seren herangezogen. Das Plasma wurde 1/500 in PBS verdünnt und auf beschichtete und geblockte ELISA-Platten (Nunc Maxisorb) aufgetragen. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde wurde den Proben Natriumthiocyanat (NaSCN, SIGMA; in PBS) in Konzentrationen von 0,25 bis 3 M zugesetzt. Die Platten wurden vor dem Waschen, dem Nachweis und der anschließenden Farbreaktion mit Streptavidin-POD (Roche) und TMB 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorptionswerte in Abwesenheit von NaSCN wurden als effektive Gesamtbindung des spezifischen Antikörpers (100 % Bindung) angenommen, und die nachfolgenden Absorptionswerte in Gegenwart steigender Konzentrationen von NaSCN wurden in den entsprechenden Prozentsatz des gesamten gebundenen Antikörpers umgerechnet. Die Daten wurden an ein Diagramm aus (% Bindung) gegen (log) Konzentration von NaSCN angepasst, und durch lineare Regressionsanalyse wurde der Aviditätsindex geschätzt, der die Konzentration von NaSCN darstellt, die erforderlich ist, um die anfängliche optische Dichte um 50 % zu verringern. Die Daten wurden zurückgewiesen, wenn der Korrelationskoeffizient für die Linienanpassung unter 0,88 lag.
[00271] Zur Bestimmung der ko Werte (Bindungsaffinität) gegenüber aSyn-Filamenten wurden 42 / 246
Verdrängungs-ELISAs verwendet, die eine einfache Bestimmung des ko Wertes des Komplexes ermöglichen, der von einem Ab und seinem kompetitiven Liganden gebildet wird. Kurz gesagt, wurden Abs in gleicher Konzentration mit steigenden Konzentrationen freier aSyn-Filamente inkubiert, bevor der Titer der freien Antikörper auf Platten mit immobilisierten aSyn-Filamenten gemessen wurde. Die relative Bindung von Abs wird als Prozentsatz der maximalen Bindung ausgedrückt, die im Assay für jede Probe beobachtet wurde; die Konkurrenzreaktionen mit aSynFilamenten (5 ug/ml) wurden als 0% Bindung (unspezifische Bindung) definiert, und Reaktionen ohne Konkurrenz werden als 100% (Maximum) der Bindung in den Verdrängungskurven angesehen.
Die Analyse der Wettbewerbsbindungskurven erfolgte gemäß den Ein-Stellen-Modellen unter Verwendung der computergestützten Kurvenanpassungssoftware von GraphPad.
Beispiel 1: Bestimmung der biologischen Aktivität von CLEC-Konjugaten in vitro
[00272] PAMPSs wie CLECs werden von PRRs erkannt, die in APCs vorhanden sind. Die Bindung von CLECs an ihre korrespondierenden PRRs (z. B. Dectin-1 für B-Glucane) ist erforderlich, um die adaptive Immunität auf verschiedenen Ebenen zu steuern, z. B. durch die Induzierung nachgeschalteter kohlenhydratspezifischer Signalübertragung und Zellaktivierung, Reifung und Migration von Zellen zu drainierenden Lymphknoten oder durch Crosstalk mit anderen PRRs. Für die Bereitstellung einer neuartigen Impfstoff-Plattformtechnologie, wie sie In diesem Antrag vorgeschlagen wird, ist es daher von entscheidender Bedeutung, dass die verwendeten CLECs ihre PRR-Bindungsfähigkeit beibehalten, was die biologische Aktivität der ausgewählten CLECs sowie des Konjugats auf CLEC-Basis belegt.
[00273] Um sicherzustellen, dass 1) die Struktur der CLECs während der milden Periodat-Oxidation nicht zerstört wurde und 2) das Polysaccharid nach der Kopplung biologisch aktiv blieb, wurde die Bindung an Dectin-1 mittels ELISA untersucht. Zunächst wurden mehrere verschiedene CLECs durch milde Periodat-Oxidation oxidiert, um das reaktive Zuckergerüst der vorgeschlagenen Impfstoffe zu erzeugen. Zu diesen CLECs gehören: Mannan, Pustulan (20 kDa), Lichenan (245 kDa), Gerste ß-Glucan (229 kDa), Hafer B-Glucan (295 kDa) und Hafer B-Glucan (391 kDa). Anschließend wurden Impfstoffkonjugate durch Hydrazon-Kopplung unter Verwendung verschiedener B-Zell-Epitop-Peptide (SeqID2, SeqgID10, SeqID16) und SeqlD7 als T-HelferEpitop-Peptid hergestellt, die alle einen C-terminalen Hydrazid-Linker zur Kopplung enthalten. Darüber hinaus wurde auch ein Peptid-Pustulan-Konjugat verwendet, das durch Kopplung von SeqlD10 über den heterobifunktionellen Linker BMPH hergestellt wurde.
[00274] Nicht oxidierte und oxidierte CLECs sowie neuartige Konjugate auf CLEC-Basis wurden anschließend mit einem kompetitiven ELISA-System, das auf der kompetitiven Bindung eines löslichen murinen Fe-Dectin-1a-Rezeptors (InvivoGen) oder ConA basiert, auf ihre biologische Aktivität hin untersucht (siehe Korotchenko et al. 2020).
Ergebnisse:
[00275] Die verschiedenen getesteten CLECs zeigen eine unterschiedliche Wirksamkeit der PRR-Bindung. In einer Reihe von ELISA-Experimenten wurden die Dectin-1-Liganden Pustulan, Lichenan, Gersten-B-Glucan und Hafer-B-Glucan auf ihre Bindungswirksamkeit an Dectin-1 untersucht. Die anschließenden Experimente zeigten, dass das lineare ßB-(1,6) verknüpfte ß-DGlucan Pustulan mit mittlerem Molekulargewicht (20 kDa) überraschenderweise eine deutlich höhere Bindungseffizienz (ca. 3-fach) an Dectin-1 aufweist als das größere lineare ß-(1,3) B-(1,4)B-D-Glucan Lichenan (ca. 245kDa) (siehe Figur 1).
[00276] Dieser Unterschied war sogar noch ausgeprägter, wenn man Pustulan mit anderen linearen, ßB-(1,3) B-(1,4)-B-D-Glucanen aus Hafer und Gerste (Gersten-B-Glucan (229kDa), Hafer-ßGlucan: 265 und 391kd) vergleicht, die im Vergleich zu Pustulan nur eine begrenzte Bindungswirksamkeit aufwiesen (z.B.: ca. 30-fach geringer für Gersten-B-Glucan (229kDa)).
[00277] Eine milde Periodat-Oxidation ausgewählter CLECs führt zu einer Verringerung der Dectin-1-Bindung. Die Oxidation von Mannan verringerte seine Bindungskapazität an das Lektin
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ConA in ähnlichem Maße wie die für die oxidierte Pustulan-Dectin-1-Bindung nach Periodat-Oxidation beschriebene Verringerung. In ähnlicher Weise führt die Oxidation von Glucanen zu einer ähnlichen proportionalen Verringerung der PRR-Bindung (siehe Figur 1A).
[00278] Wichtig ist, dass die Konjugatbildung auch zu einer Verringerung der PRR-Bindungskapazität der Peptid-CLEC-Konjugate im Vergleich zu unkonjugierten CLECs führte, wie für das Mannan-haltige Konjugat sowie für verschiedene getestete Pustulan-, Lichenan- oder Gersten-ßGlucan-Konjugate gezeigt wurde (siehe Figur 1B).
[00279] Die Experimente zeigten, dass Pustulan trotz seiner geringeren Größe und dem Fehlen von ß-(1,3)-glykosidischen Bindungen (zu beachten: ß-(1,3)-haltige Glucane werden als optimaler Ligand für Dectin-1 beschrieben) die höchste Bindungseffizienz aufweist, unabhängig von Oxidation oder Konjugation. So weisen pustulanhaltige Konjugate eine ca. 3-fach höhere Bindung auf als lichenanbasierte Konstrukte.
[00280] Figur 1A und 1B zeigen außerdem, dass die Konjugation von Peptiden über Hydrazonbildung oder über heterobifunktionelle Linker gleichermaßen für WISIT-Konjugate geeignet ist, da beide Arten von Konjugaten eine hohe Dectin-1-Bindungswirksamkeit beibehalten.
Beispiel 2: Bestimmung der DC-Aktivierung nach Pustulan-Exposition in vitro
[00281] Eine wichtige Funktion der vorgeschlagenen Impfstoffe ist ihre Fähigkeit, nach der PRRBindung und -Aufnahme DCs zu aktivieren. Um zu zeigen, dass CLEC-basierte Konjugate nicht nur an PRRs binden, sondern auch eine biologische Funktion in ihren Zielzellen, d.h. DCs, ausüben, wurde ein DC-Aktivierungsexperiment durchgeführt.
[00282] Zunächst wurden Zellen aus dem Knochenmark von Mäusen mit mGM-CSF inkubiert, um gemäß den veröffentlichten Protokollen BMDCs zu erzeugen. Diese GM-CSF-DCs wurden dann entweder dem Peptid-Glucan-Konjugat SeqlD2-SeqgIlD7-Pustulan oder entsprechenden Mengen an oxidiertem, aber nicht konjugiertem Zucker ausgesetzt. In jedem Fall wurden die Konjugate/Zucker von 500 ug bis 62,5 ug/ml des jeweiligen Zuckers titriert. Zum Vergleich wurde der starke Aktivator LPS bei einer Konzentration von 2ng/ml als Kontrolle verwendet. Wichtig ist, dass die für die Oxidation und Konjugatbildung verwendeten Pustulanzubereitungen ebenfalls geringe Mengen an LPS enthalten. Daher wurde die äquivalente Dosis von LPS verwendet, um die gemessenen Effekte zu normalisieren. Die DCs wurden dann mittels FACS-Analyse auf die Expression von Markern für die DC- Aktivierung und -Reifung untersucht, darunter CD80 und MHOCII.
Ergebnisse:
[00283] GM-CSF DCs, die in vitro mit Segld2-SeqIlD7-Pustulan-Konjugaten stimuliert wurden, zeigten eine signifikant erhöhte Expression von CD80 und MHCII (siehe Figur 2). Die Werte waren signifikant höher als die Effekte, die durch äquivalente Dosen von LPS, die in den Konjugatpräparaten enthalten waren, beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu führten äquivalente Mengen oxidierten, aber nicht konjugierten Zuckers zu einer leichten Verringerung der CD80-Expression, wie aufgrund des LPS-Gehalts in der Zubereitung zu erwarten gewesen wäre, und zu einer deutlich weniger ausgeprägten Induktion von MHCII als bei den Pustulankonjugaten.
[00284] Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Hochregulierung von MHC-II auf eine DCAktivierung hinweist. Darüber hinaus wird CD80 stärker hochreguliert, als durch die gleiche Menge LPS zu erwarten wäre, was stark darauf hindeutet, dass Pustulankonjugate wesentlich zur Reifung und Aktivierung von DCs beitragen (über die Wirkung hinaus, die durch die LPSExposition allein erklärt wird). Somit belegen die Beispiele 1 und 2 eindeutig die biologische Aktivität der Pustulan-Impfstoffe.
Beispiel 3: Bestimmung der Partikelgröße mittels DLS
[00285] Es wurden einzelne Experimente zur Analyse der Partikelgröße/des hydrodynamischen Radius verschiedener Glucan-Konjugate durchgeführt.
[00286] Für die DLS-Analyse wurden verschiedene Peptid-Glucan- bzw. Peptid-Träger-Glucan44 / 246
Konjugate analysiert und mit nicht konjugiertem Pustulan verglichen. Alle Analysen wurden in dreifacher Ausführung mit einem WYATT DynaPro PlateReader-Il durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen für alle getesteten Konjugate eine Partikelgrößenverteilung mit einem Maximum im niedrigen nm-Bereich.
[00287] Getestete Konjugate:
B-Zeill-Epitop T-Zell-Epitop CLEC
SeqlD2 SeqlD7 Pustulan (80%)
SeqlD3 CRM197 Pustulan (80%) Nicht oxi-
na na diertes Pustulan
Ergebnisse:
[00288] Die aktuelle Analyse zeigt einen durchschnittlichen hydrodynamischen Radius (HDR) der Hauptpartikel von ca. 5 nm für das in diesem Test verwendete Peptid-Pustulan-Konjugat SeqlD2-SeqlD7- Pustulan. Ein kleiner zweiter Peak bei ca. 60 nm weist auf eine sehr geringe Anzahl von Aggregaten in der Formulierung hin (siehe Figur 3A). Der größte Teil der Konjugatzubereitung scheint jedoch in monomerer Form vorzuliegen. Diese Prävalenz monomerer Konjugate gegenüber vernetzten oder aggregierten Konjugaten wird auch durch die Tatsache gestützt, dass monomeres Pustulan (ca. 20 kDa) bei ca. 5 nm nachweisbar ist (wie in den Kontrollproben gezeigt, siehe auch Figur 3C), was ebenfalls für die Prävalenz monomerer Pustulan-Konjugate spricht (angesichts einer HDR von »5 nm für monomeres Pustulan). Wie die Analyse des Kumulantenradius über 24 Stunden zeigt, sind die Konjugate auch in Bezug auf ihre HDR stabil und neigen nicht zur Aggregation, was wiederum für die Prävalenz monomerer Konjugate spricht.
[00289] Zur Charakterisierung von Impfstoffen, die auf Peptid-Träger-Glucan-Konjugaten basieren, wurde ein SeqID6-CRM197-Konjugat analysiert, das zusätzlich mit Pustulan konjugiert wurde. Auch hier ergab die DLS-Analyse einen durchschnittlichen HDR-Wert von 11 nm und einen zweiten kleineren Peak von ca. 75 nm, was wiederum auf das Vorhandensein einer geringen Anzahl von Aggregaten hinweist (siehe Figur 3B). Der leichte Anstieg auf 11 nm spiegelt höchst wahrscheinlich die Erhöhung des Molekulargewichts des resultierenden Konjugats wider, da CRM197 eine Größe von etwa 60 kDa hat. Es kann keine signifikante Aggregation oder Vernetzung der CRM- Konjugate festgestellt werden, und die Analyse des Kumulantenradius über 24 Stunden zeigt ebenfalls, dass die Konjugate für ihre HDR stabil sind und nicht zur Aggregation neigen. Auch die DLS- Analyse dieses alternativen Typs von CLEC-basierten Impfstoffen bestätigt die Prävalenz monomerer Konjugate.
[00290] Kontrollproben (d. h. nicht oxidiertes Pustulan) zeigten eine viel größere HDR mit einem Durchschnitt von ca. 600 nm sowie zwei zusätzliche kleinere Peaks bei 5 nm bzw. 46 nm (siehe Figur 3C). Pustulanmonomere haben einen HDR von ca. 5 nm, was gut zu dem angenommenen MW von 20 kD passt, größere Aggregate können leicht nachgewiesen werden, und der Großteil des Glucans liegt als große Partikel mit hohem MW vor. Wichtig ist, dass die Analyse des Kumulantenradius über 24 Stunden auch zeigt, dass nicht konjugiertes Pustulan im Gegensatz zu Pustulan-Konjugaten dazu neigt, im Laufe der Zeit stark zu aggregieren, was zur Bildung großer Partikel führt, was mit verschiedenen Literaturberichten übereinstimmt.
[00291] In Figur 3 sind Beispielgrafiken für diese beiden Konjugate und nicht oxidierte Pustulankontrollen dargestellt.
[00292] Die in diesem Beispiel erzielten Ergebnisse zeigen die bisher einzigartigen Eigenschaften von CLEC-basierten Konjugaten im Vergleich zu bekannten Beispielen (z. B. Wang et al., 2019, Jin et al., 2018), die kleine (d. h. 5-11 nm), überwiegend monomere zuckerbasierte Nano-
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SS N SS
partikel mit weit weniger als 150 nm HDR aufweisen, eine Größe, die im Allgemeinen als bevorzugte Größe für immuntherapeutisch aktive Konjugatimpfstoffe gilt. Dies ist hauptsächlich auf die PRR-Bindungs- und Aktivierungseigenschaften größerer Partikel, einschließlich ganzer Glucanpartikel, zurückzuführen. Es ist bekannt, dass größere Partikel (>150nm bis 2-4um) effizienter mit ihren Rezeptoren interagieren und die DC-Signaling, - Aktivierung, - Reifung und - Migration zu den drainierenden Lymphknoten initiieren können, während kleine, sogar lösliche PRR-Liganden vermutlich in der Lage sind, an ihren Rezeptor zu binden, aber die anschließende DC-Aktivierung zu blockieren (Goodridge et al., 2011). Diese Daten, zusammen mit den in den Beispielen 1, 2 und 3 beschriebenen Daten sowie anderen unten aufgeführten Beispielen, zeigen jedoch zum ersten Mal, dass kleine, lösliche Peptid-basierte Gluco-Neo-Konjugate, die auf einem monomeren B-Glucan aufbauen, z. B.: das lineare ßB(1,6)-B-D-Glucan Pustulan, als Grundgerüst effektiv an den PRR (Deectin-1) binden können, die entsprechenden APC (wie z.B. GM-CSF DCs) aktivieren und eine sehr hohe biologische Aktivität und Immunogenität auf hautspezifische Weise aufweisen, die auch die Wirkung klassischer Konjugatimpfstoffe deutlich übertrifft.
Beispiel 4: In-vivo-Vergleich verschiedener Impfstoffe auf CLEC- Basis
[00293] Impfstoffe auf CLEC-Basis, die an ihren DC-Rezeptor (z. B. Dectin-1 oder ConA) binden können, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, nach wiederholter Verabreichung an n=5 Balb/c-Mäusen/Gruppe eine robuste und spezifische Immunantwort hervorzurufen. Typische Experimente wurden mit einem Nettopeptidgehalt von 5 ug an B-Zell-Epitop-Peptiden pro Dosis durchgeführt.
[00294] In einer ersten Reihe von Experimenten wurden drei verschiedene CLECs verglichen. In diesem Experiment wurden das von aSynuclein abgeleitete Peptid SeqgID2 oder das von Amyloid ß 42 (Aß42) abgeleitete Peptid SegID10 und das promiskuitive T-Helferzell- Epitop SeqglID7 über C-terminale Hydrazid-Linker an oxidiertes Pustulan (20 % Oxidationsgrad), Mannan (20 % Oxidationsgrad) oder Gersten-B-Glucan (229 kDa, 20 % Oxidationsgrad) gekoppelt.
[00295] Verwendeter Impfstoff:
B-Zeill-Epitop T-Zell-Epitop CLEC SeqlD2 SeqlD7 Pustulan (20%) SeqID2 SeqlD7 Mannan (20%) Gerste ß-Glucan ID2 ID7 Seq Seq (229kDa, 20%) SeqlD2 SeqlD7 Pustulan (80%) Lichenan ID2 ID7 Seq Seq (245kDa, 200%) SeqglD10 SeqlD7 Pustulan (80%) Lich SealD10 SealD7 1SNaN
(245kDa, 200%)
[00296] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen (Route: i.d.) geimpft, und die darauf folgende Immunantwort gegen die injizierten Peptide (d.h. SeqID2 bzw. SeqglD10) wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen wurde.
Ergebnisse:
[00297] Wie in Figur 4A dargestellt, konnten alle drei CLEC-Impfstoffe (SeqID2-SeqgID7-Mannan, SeqlD2-SeqID7-Pustulan (lineares ß(1,6)-B-Glucan) und Gerste SeqlD2-SeqIlD7-B-Glucan (229kDa)) eine nachweisbare Immunantwort hervorrufen. Interessanterweise löste die Immunisierung mit dem Impfstoff auf der Basis von Gersten-B-Glucan mit hohem Molekulargewicht nur
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eine sehr geringe Anti-Peptid-Antwort aus (ODmaxz Titer ca. 1/100). Im Gegensatz dazu konnten Konjugate auf Pustulan-Basis eine deutlich höhere Reaktion mit durchschnittlichen Titern von ca. 1/11000 hervorrufen. Konjugate auf Mannan-Basis zeigten eine ca. 7-fach geringere Immunogenität als Konjugate auf Pustulan-Basis, da die durchschnittlichen Titer nach der Immunisierung in diesem Experiment etwa 1/1500 erreichten.
[00298] Figur 4B zeigt die Ergebnisse einer zweiten Reihe von Experimenten zum Vergleich der Immunogenität von zwei verschiedenen Varianten von Konjugaten auf Glucanbasis, bei denen entweder das von aSynuclein abgeleitete Peptid SeqgID2 oder das von Amyloid ß 42 (Aß42) abgeleitete Peptid SeqgIlD10 als B-Zell-Epitope und das T-Zell-Epitop SeqID7 verwendet wurden. Bei der ersten Variante wurde wieder Pustulan als CLEC für die Konjugation verwendet, bei der zweiten Variante wurde das lineare ß-(1,3) B-(1,4)-B-D-Glucan Lichenan (ca. 245kDa) eingesetzt. Wie in Figur 4B gezeigt, konnten beide Varianten hohe Titer von Immunantworten gegen die injizierten Peptide induzieren (d.h. SeqID2/3 (SeqIlD3=SeqlD2 angepasst für BSA-Konjugation) und SeqglD10/11 (SeqID11=SeqlD10 angepasst für BSA-Konjugation)). Peptid-Lichenan-Konjugate zeigten in diesen Experimenten jedoch eine deutlich geringere Immunogenität als PeptidPustulan-Konjugate (4-8x höhere Anti-Peptid-Titer bei einer Dosis von 5 ug), was auch mit der geringeren Dectin-1-Bindungsfähigkeit übereinstimmt, wie in Beispiel 1 gezeigt. Dies zeigt, dass die Dectin-1-Bindungseffizienz in vitro direkt mit der Immunogenität und biologischen Aktivität der Impfstoffe in vivo in Verbindung gebracht werden kann. Dies führt zur Identifizierung von Pustulan oder Fragmenten davon (d. h. lineare B(1,6)-B-D-Glucane) als wirksamste Glucan-Variante, wie in diesem Antrag vorgeschlagen. Die Impfstoffe sind auch mit verschiedenen Peptiden funktionsfähig, was das Plattformpotenzial dieses Impfstofftyps zeigt.
Beispiel 5: In-vivo-Vergleich von Peptid-Pustulan-Konjugaten mit unkonjugierten Peptid-Impfstoffen
[00299] Um festzustellen, ob die Konjugation von CLECs mit Peptidimmunogenen für die Induktion einer überlegenen Immunogenität der erfindungsgemäßen Impfstoffe erforderlich ist, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, in denen zwei Konjugate (SeqIlD2+SeqlD7+Pustulan oder SeqID2+SeqID7+Mannan) mit Impfstoffpräparaten verglichen wurden, die alle Komponenten als Mischung ohne Konjugation enthielten (d. h. SeqID2 und SeqlD7 plus entweder nicht oxidiertes Pustulan oder Mannan). Auch hier wurden n=5 weibliche Balb/c-Mäuse dreimal in zweiwöchigen Abständen i.d. immunisiert, und die darauf folgende Immunantwort gegen die injizierten Peptide (d.h. SeqgID3) wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen wurde.
[00300] Verwendeter Impfstoff:
Konjuga-
B-Zell-Epitop T-Zell-Epitop CLEC on Pustulan ja
SeqID2 SeqlD7 (20%)
SeqlD2) SeqlD7 Mannan ja (20%)
SeqlD2 SeqlD7 Pustulan Nicht (nicht ak- konjutiv- giert; ierbar) Mischen
ID7 Nich
SealD2 Seq Mannan a (nicht ak- giert { tiviert) Mischen
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Ergebnisse:
[00301] Figur 5 zeigt den Vergleich der spezifischen Anti-Peptid (SeqID3)-Immunantworten, die nach drei Immunisierungen nachgewiesen werden konnten. SeqIlD2+SeqgID7+Pustulan-Konjugate (20 % Oxidation) konnten in diesem Experiment viermal höhere Immunantworten auslösen als die Mischung aus den nicht konjugierten Peptiden SeqlD2, SeqgID7 und nicht oxidiertem Pustulan (d. h. 1/12000 gegenüber 1/3000). Auch die Konjugate SeqID2+SeqID7+Mannan (20 % Oxidation) waren bei der Auslösung peptidspezifischer Immunantworten effizienter als die Anwendung einer Mischung der Komponenten (1/7000 vs. 1/4000; 1,75-fache Steigerung). Diese Daten zeigen, dass die Konjugation von Peptid-Immunogenen mit aktivierten CLECs erforderlich ist, um eine starke und nachhaltige Immunantwort in vivo zu induzieren.
Beispiel 6: In-vivo-Vergleich von SeqIlD5-SeqID7-Pustulan und SeqgID2- oder Seg-7-PustulanKonjugaten
[00302] Um festzustellen, ob CLEC-basierte Impfstoffe B-Zell- und T-Zell-Epitope für die Induktion nachhaltiger Anti-B-Zell-Epitop-spezifischer Immunantworten in vivo benötigen, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, in denen drei Konjugate verglichen wurden: SeqIlD5+SeqglD7+Pustulan, SeqID5+Pustulan und SeqgIlD7+Pustulan. n=5 weibliche Balb/c-Mäuse wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen i.v. immunisiert, und die darauf folgende Immunantwort gegen die injizierten Peptide (d.h., SeqID6) wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen wurde.
B-Zell-Epitop T-Zell-Epitop CLEC
SeqIlD5 SeqlD7 Pustulan (80%) SeqIlD5 n.a. Pustulan (80%) n.a. SeqlD7 Pustulan (80%) Ergebnisse:
[00303] Wie in Figur 6 dargestellt, sind die Konjugate SeqID5+SeqIlD7+Pustulan (80 % Oxidation) in der Lage, eine hohe und hochspezifische Immunantwort gegen die injizierte Peptideinheit (d. h. das von aSynuclein abgeleitete Peptid SeqID6) auszulösen, die in diesen Experimenten durchschnittliche Titer von 1/36000 erreichte. Peptid-Pustulan-Konjugate, die entweder SeqID5 oder SeqlD7 allein enthalten und über eine Hydrazon-Kopplung an Pustulan gekoppelt sind, konnten nach drei zweiwöchentlichen Immunisierungen (Verabreichung: i.v.) entweder eine 12fach geringere Immunantwort im Falle von SeqID5+Pustulan (1/3000) oder keine SeqID6-spezifische Immunantwort (für SeqID7+Pustulan-Konjugate, Titer <1/100, unter der Nachweisgrenze) hervorrufen.
[00304] Diese Daten zeigen, dass die Konjugation von Peptid-Immunogenen an aktivierte CLECs erforderlich ist, um eine starke und nachhaltige Immunantwort in vivo zu induzieren. Sie zeigen jedoch auch, dass die Konjugation von Pustulan mit einzelnen kurzen B-Zell-Epitopen in Abwesenheit von T-Zell-Epitopen (z. B. SeqlD5 allein) die Induktion von T-Zell-unabhängigen BZell-Antworten in vivo ermöglicht, wenn auch mit deutlich geringerer Wirksamkeit als bei T- und B-Zeil-Epitop-haltigen CLEC-Konjugaten.
Beispiel 7: In-vivo-Analyse der Anti-Pustulan/Glucan-Immunantwort nach Peptid-Pustulan-Immunisierung
[00305] Die Analyse von Anti-CLEC-Antikörpern ist in zweierlei Hinsicht wichtig für die Neuartigkeit und Wirksamkeit der vorgeschlagenen CLEC-Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung:
[00306] 1) B-Glucane sind Hauptbestandteile der Zellwand verschiedener Pilze, Flechten und Pflanzen, die der Zellwand ihre typische Festigkeit gegenüber dem intrazellulären osmotischen Druck verleihen. B-Glucane gelten daher auch als typische mikrobielle pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP) und sind ein wichtiges Ziel für hochtitrige zirkulierende natürliche Abs bei
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gesunden Menschen. PAMPSs sind häufige und relativ unveränderliche molekulare Strukturen, die von vielen Krankheitserregern gemeinsam genutzt werden und die das Immunsystem stark aktivieren. (Chiani et al. Vaccine 27 (2009) 513-519, Noss et al. Int Arch Allergy Immunol 2012; 157:98-108, Dong et al. J Immunol 2014; 192:1302-1312, Ishibashi et al. FEMS Immunology and Medical Microbiology 44 (2005) 99-109, Harada et al. Biol Pharm Bull. 2003 Aug;26(8):1225-8). IgG gegen-ßB-(1,3)- und-B-(1,6)-Glucane können in normalen menschlichen Seren gefunden werden, und ß-(1,6)-Glucane scheinen viel stärkere Antigene zu sein als ß-(1-3)-Varianten. Darüber hinaus wurde der ß-(1—6)-B-Glucan-Anteil als einer der typischen mikrobiellen PAMPSs identifiziert, der als Erkennungs- und Angriffspunkt für die immunologische Malignitätsüberwachung sowie für die Verteidigung gegen mikrobielle Invasion dient. Pustulan, das bevorzugte GlucanGrundgerüst für die CLEC-Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung, besteht aus linearen ß(1-6)-B-Glucan-Anteilen, und es wurde von mehreren Forschergruppen berichtet, dass AntiPustulan-Immunantworten im Plasma von naiven, nicht mit Pustulan immunisierten menschlichen Probanden nachgewiesen werden können. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, das Potenzial von CLECG-basierten Impfstoffen zur Aktivierung der Anti-Pustulan-Immunreaktivität zu untersuchen. Anti-B-Glucan-Antikörper könnten in vivo spezifisch mit Peptid-Pustulan interagieren und durch die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen zu einer schnellen Eliminierung führen und dadurch die Induktion effizienter Immunreaktionen verhindern. Alternativ könnte die Induktion/Verstärkung einer Anti-Pustulan-Antikörperreaktion nach einer WISIT-Immunisierung auch die Immunogenität fördern, da eine potenzielle Kreuzpräsentation von CLEC-Konjugaten durch -pustulanspezifische 1gG-Antikörper und die Aufnahme in APCs auch die Wirksamkeit der angewandten Impfstoffe erhöhen könnte.
[00307] Es wurden keine formellen Studien veröffentlicht, in denen das Vorhandensein von AntiPustulan-Antikörpern in naiven Mäusen untersucht wurde. Ishibashi et al. und Harada et al. konnten jedoch das Vorhandensein von ß-Glucan-IgGs gegen lösliches Skleroglucan/ß-Glucan (d. h. 1,3/1,6-Beta-Glucane) in Seren von naiven DBA/2-Mäusen nachweisen.
[00308] 2), wie zuvor berichtet (z.B. Torosantucci et al., Bromuro et al., Donadei et al., Liao et al.), wirkten CLEG-Protein-Konjugate, z.B. CRM197-gekoppelt an Laminarin, Curdlan oder synthetische ß(1,3) B-D-Glucane, als starke Immunogene, die nicht nur hohe Anti-CRM197-Titer, sondern auch hohe Anti-Glucan-Titer in Kombination mit einem Schutz vor einer Pilzinfektion induzierten. Daher waren frühere Versuche mit solchen Konjugaten auf die Verwendung von CLECs als echte krankheits-/pilzinfektionsspezifische Immunogene gerichtet, anstatt sie als Träger und immunologisch inertes Grundgerüst zu verwenden, wie in diesem Antrag vorgeschlagen.
[00309] In diesem Sinne wurde eine umfassende Analyse der Plasmaproben von naiven und mit Peptid-CLEC-Konjugaten immunisierten Balb/c-Mäusen (n=5/Gruppe) auf das Vorhandensein von Anti-Pustulan-Antikörpern vor der Immunisierung bzw. nach wiederholten Immunisierungen eingeleitet.
[00310] Verwendeter Impfstoff:
B-Zell-Epitop T-Zell-Epitop CLEC KOnlugaSeqlD2 SeqlD7 00 ja SealD2 SealD7 (2090 ja Pustulan KOST SeaqlD2 SealD7 (nicht giert: aktivierbar) Mischen Nicht SealD2 SealD7 Mannan konju(nicht aktiviert) giert; Mischen
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Ergebnisse:
[00311] Daher wurden Proben von Tieren analysiert, die mit Peptid-Pustulan (SeqID2+SeqlD7 + Pustulan (20%)) und Peptid-Mannan (SeqID2+SeqID7+Mannan (20%)) geimpft wurden (alle Impfstoffe: 4 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis). Zu Kontrollzwecken wurden auch Tiere verwendet, denen Impfstoffe verabreicht wurden, die aus nicht konjugierten Peptiden und nicht oxidierten CLECs bestanden (d. h. SeqgID2+SeqgID7+non-ox. Pustulan, SeqgID2+SeqIlD7+non-ox. Mannan). Wie in Figur 7A dargestellt, zeigten die untersuchten Balb/c-Tiere eine bereits vorhandene Immunantwort auf niedrigem Niveau, die gegen Pustulan/ß(1,6)-B-D-Glucan gerichtet war. Beide getesteten CLEC-Impfstoffe (SeqID2+SeqIlD7+Pustulan (20 %) und SeqID2+SeqID7+Mannan (20 %)) konnten in vivo keine starke de novo Immunantwort gegen das Glucan-Grundgerüst induzieren. Im Gegensatz dazu führte die wiederholte Verabreichung von nicht konjugiertem, nicht oxidiertem Pustulan in der Kontrollgruppe (die eine Mischung aus allen drei Komponenten erhielt) zur Induktion einer starken AntiGlucan-Immunreaktion, indem die Antikörperspiegel gegen Pustulan um das 18,5-fache erhöht wurden (im Vergleich zum Plasma vor der Immunisierung). Mannan-haltige Konjugate oder Mischungen waren nicht in der Lage, Anti-Pustulan-Titer zu induzieren, was auf die Spezifität der festgestellten Anti-Glucan-Reaktion hinweist. Die kinetische Analyse der Anti-Pustulan-Antikörpertiter zeigte einen stetigen Anstieg über die Zeit mit einem starken Anstieg nach der dritten Immunisierung bei Tieren, die mit nicht konjugiertem und nicht oxidiertem Pustulan immunisiert wurden (siehe Figur 7B). Ein kompetitiver ELISA mit zunehmenden Mengen an nativem Pustulan zeigte ebenfalls die Spezifität der Antikörperreaktion, die in der Gruppe, die eine Mischung der Komponenten erhielt, nachweisbar war (Figur 70).
[00312] Zusammenfassend konnten diese Analysen zeigen, dass trotz des Vorhandenseins einer geringen Autoreaktivität gegen Pustulan (IgG) in naiven Balb/c-Mäusen keine/sehr geringe impfabhängige Zunahme der Anti-Pustulan-Immunreaktivität durch Immunisierung mit verschiedenen CLEC-Konjugaten induziert wird. Daher sind die CLECs, die als Peptid-CLEC-Konjugate gemäß dieser Erfindung verwendet werden, bei Verwendung des neuartigen Impfstoffdesigns gemäß der vorliegenden Erfindung tatsächlich immunologisch inert. Dies steht in starkem Gegensatz zu früher veröffentlichten Ergebnissen und stellt daher eine überraschende und erfinderische neue Eigenschaft des Kohlenhydratrückgrats (z. B. der B-Glucane oder Mannane, insbesondere des Pustulanrückgrats) gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
[00313] Darüber hinaus scheinen bereits vorhandene Anti-Pustulan-Reaktionen Immunreaktionen auf die Peptidkomponente der WISIT-Impfstoffe nicht auszuschließen, da die injizierten Peptidreaktionen in beiden Experimenten hohe Anti-Peptid-Titer aufwiesen.
Beispiel 8: Analyse der Immunogenität von Glucan-Konjugaten mit N- oder C-terminal gekoppelten Peptid-Immunogenen
[00314] Um festzustellen, ob die für die Kopplung verwendete Linker-Orientierung die Immunogenität der Impfstoffe beeinträchtigen würde, wurden 4 verschiedene Impfstoffkandidaten hergestellt: In diesem Experiment wurden die von aSynuclein abgeleiteten Peptide SeqgID1/2 und SeqlD4/5 entweder über N- oder C-terminale Hydrazid-Linker an oxidiertes Pustulan (80%) gekoppelt. Darüber hinaus trug jeder der vier Impfstoffe das promiskuitive T-Helferzell-Epitop SeqlD7, das über C-terminale Hydrazid-Linker an das CLEC-Grundgerüst gekoppelt war.
[00315] Verwendeter Impfstoff:
B-Zeill-Epitop T-Zell-Epitop CLEC
Segql1 SeqlD7 Pustulan (80%) SeqlD2 SeqlD7 Pustulan (80%) SeqlD4 SeqlD7 Pustulan (80%) SeqID5 SeqlD7 Pustulan (80%)
[00316] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (Route: 1.d.) und die anschließende Immunantwort, die sich sowohl gegen das injizierte Peptid (d.h. SeqIlD3 und SeqID6) als auch gegen das Zielprotein, d.h. rekombinantes aSynuclein, rich-
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tete, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen wurde.
Ergebnisse:
[00317] Wie Figur 8 zeigt, konnten alle 4 CLEC-Impfstoffe, die entweder N- oder C-terminal gekoppelte B-Zell-Epitope verwenden, eine starke und hochspezifische Immunantwort sowohl gegen die injizierten Peptidanteile (Figur 8A) als auch gegen das Zielprotein aSynuclein (Figur 8B) hervorrufen. Interessanterweise wirkte sich die Kopplungsorientierung unterschiedlich auf die Immunogenität aus. So löste der N-terminal gekoppelte Impfstoff SeqgIlD1+SeqID7+CLEC eine 7mal geringere Reaktion gegen das injizierte Peptid und eine 10-mal geringere Immunantwort gegen rec. aSyn aus als der C-terminal gekoppelte SerqID2-SeqgID7-CLEC. Im Gegensatz dazu löste der C-terminal gekoppelte Impfstoff SeqID5-SeqgID7-CLEC eine ca. 4-fach geringere Reaktion auf das injizierte Peptid, aber eine gleich starke Reaktion gegen aSyn aus, verglichen mit dem N-terminal gekoppelten Impfstoff SeqgID4+SeqgID7+CLEC. Somit kann die Kopplungsausrichtung auf der Grundlage peptidspezifischer Merkmale geändert werden, ohne die Entwicklung von Hochtiter-Immunantworten zu beeinträchtigen.
[00318] Wie in Figur 8 gezeigt, kann jedoch durch Variation der Kopplungsorientierung des immunogenen Peptids die Spezifität der sich daraus ergebenden Reaktion gegen das Zielprotein erheblich gesteigert werden, so dass neuartige und noch nie dagewesene Immunreaktionen ausgelöst werden können:
[00319] z.B.: Die Impfung mit SeqlD 1 führt zu einer 4,5-fach höheren Reaktion gegen das Peptid im Vergleich zum Zielprotein, was vergleichbar ist mit der 3,3-fach höheren Anti-Peptid-Reaktion im Vergleich zum Protein, die durch den Impfstoff SeqgID 2 ausgelöst wird.
[00320] Im Gegensatz dazu induziert der SeqID-4-Impfstoff eine 1,7fach höhere Reaktion gegen das Peptid als gegen das Protein, während der SeqID-5-Impfstoff dieses Verhältnis umkehren kann, so dass eine 2,5-fach höhere protein-spezifische Reaktion im Vergleich zur injizierten Peptidreaktion nachweisbar ist.
[00321] Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Daten eindeutig zeigen, dass Impfstoffe mit beiden Kopplungsrichtungen biologisch aktiv sind und für diese Anwendung geeignet sind. Es wird auch gezeigt, dass die Kopplungsrichtung verwendet werden kann, um je nach Peptid und Ziel spezifisch bevorzugte und nicht bevorzugte aktive Impfstoffe auszuwählen.
Beispiel 9: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konjugaten unter Verwendung verschiedener T-Helferzell-Epitope
[00322] In diesem Beispiel wurde die Immunogenität von CLEC-basierten Impfstoffen, die das nicht natürliche pan-DR-Epitop (PADRE mit einer künstlichen Cathepsin-Spaltstelle, SeqgID7) enthalten, mit anderen bekannten T-Helferzell-Epitopen verglichen. Zu diesem Zweck wurden mehrere promiskuitive Epitope ausgewählt, die entweder mit einer neuartigen, künstlich eingefügten Cathepsin L-Spaltstelle für eine effiziente endo-/Iysomale Freisetzung nach rezeptorvermittelter Aufnahme in APCs/DCs angepasst oder unverändert gelassen wurden. Zu den ausgewählten Epitopen gehören:
Cathepsin Peptid Sequenz Epitop L-
Spaltstelle SegIlD7 AKFVAAWTLKAAANRRA-(NH-NH )2 PADRE + SeqgID22 AKFVAAWTLKAAA-(NH-NH )2 PADRE SeqgID23 KAAAVKAAFWTAL-NRRA-(NH-NH )2 künstlich + SeqgID24 DSETADNLEKTVAALSILPGHGC-(NH-NH )2 Diphtherie -
SeqgID25 DSETADNLEKTVAALSILPGHGCNRRA-(NH-NH)2 Diphtherie +
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Dr & SS
N NS
Masern-ViSeqgID26 ISITEIKGVIVHRIETILF-(NH-NH )2 rus-Fu- sionsprotein Masern-ViSeqgIlD27 ISITEIKGVIVHRIETILFNRRA-(NH-NH )2 rus-Fu- + sionsprotein Huhn OVA SeqgID28 ISQAVHAAHAEINEAGR-(NH-NH )2 (323-339) Huhn OVA SeqgID29 ISQAVHAAHAEINEAGRNRRA-(NH-NH )2 (323-339) +
[00323] Um festzustellen, ob Peptidimpfstoffe, die diese T-Helferzell-Epitop-Peptide tragen, nach wiederholter Immunisierung hohe Immunreaktionen hervorrufen und Immunreaktionen induzieren können, die denen herkömmlicher Konjugatimpfstoffe überlegen sind, wurden 10 verschiedene Impfstoffkandidaten getestet:
[00324] In diesem Experiment wurde das von aSyn abgeleitete Peptid SeqIlD2 entweder als Peptid-CLEC-Impfstoff verwendet (d. h.: SeqgID2 in Kombination mit den verschiedenen T-HelferzellEpitopen, die über C-terminale Hydrazid-Linker an oxidiertes Pustulan (80 %;)) gekoppelt sind, oder es wurde ein herkömmliches Peptid-Konjugat unter Verwendung von SeqlD3 hergestellt, das ein C-terminales Cystein zur Kopplung an GMBS-aktiviertes KLH enthält.
[00325] Verwendeter Impfstoff:
T-ZellImpfstoff B-Zell-Epitop Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route ger Pustulan 1 ID2 ID7 .a. i.d. Seq Seqg (80%) n.a i.d P | 2 SealD2 SealD22 (80%) n.a. id. Pustulan ID2 ID2 .a. i.d. 3 Seq SeqID23 (80%) n.a i.d Pustul 4 SealD2 SealD24 (80%) n.a. id. P | 5 SealD2 SealD25 (80%) na. id. 6 SeqlD2 SeqlD26 Pustulan i.d q q (80%) .a. .d. P | 7 SealD2 SealD27 (80%) n.a. id. Pustulan ID2 ID2 .a. l. 8 Seq SeqlD28 (80%) n.a i.d P | 9 SealD2 SealD29 (80%) na. i.d 10 SeqID3 KLH n.a. Alhydrogel S.C
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[00326] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 5 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichungsart: 1.d. für den CLEC-basierten Impfstoff und s.c. für den KLH-basierten Impfstoff (mit Alhydrogel adjuvantiert). Die anschließende Immunantwort, die sich sowohl gegen das injizierte Peptid (d.h. Pep1/SeqlD3) als auch gegen das Zielprotein, d.h. rekombinantes humanes aSynuclein, richtet, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen wurde.
Ergebnisse:
[00327] Wie in Figur 9 dargestellt, waren alle 9 CLEC-Impfstoffe, die verschiedene T-HelferzellEpitope und das KLH-Konjugat verwendeten, in der Lage, eine starke und spezifische Immunantwort sowohl gegen die injizierten Peptidanteile (SeqlD3, Figur 9A) als auch gegen das Zielprotein, rekombinantes aSynuclein (Figur 9B), hervorzurufen.
[00328] Alle T-Helfer-Epitope konnten ähnliche oder höhere Anti-Peptid-Titer als das herkömmliche SeqID3-KLH-Konjugat induzieren. Impfstoff 1 (der SeqgID2 und SeqIlD7 gekoppelt an Pustulan enthält) konnte beispielsweise eine 60 % höhere Reaktion auslösen als die KLH-Kontrolle, während Impfstoff 8 (der SeqlD28, ein gut bekanntes T-Helfer-Epitop, das speziell für die Anwendung bei Balb/c-Tieren geeignet ist, SeqgID2 und Pustulan enthält) eine 5,5fach höhere Reaktion als die Kontrolle auslösen konnte. Selbst das promiskuitive T-Helfer-Epitop SeqID24 (abgeleitet von Diphterie-Toxin, ein schwaches T-Helfer-Epitop für Balb/c-Tiere, veröffentlicht in WO 2019/ 21355 A1) konnte eine nachhaltige Immunantwort auslösen, wenn auch schwächer als die KLHKontrolle.
[00329] In ähnlicher Weise konnten alle T-Helfer-Epitope ähnliche oder höhere Anti-Protein-Titer als das herkömmliche SeqID3-KLH-Konjugat hervorrufen. Wichtig ist, dass Impfstoff 1 (der SeqalD2 und SeqlD7 gekoppelt an Pustulan enthält) beispielsweise eine 2,5fach höhere Reaktion auslösen konnte als die KLH-Kontrolle, und Impfstoff 8 (der SeqID28, ein gut bekanntes T-HelferEpitop, das speziell für die Anwendung bei Balb/c-Tieren geeignet ist, SeqID2 und Pustulan enthält) eine 3-fach höhere Reaktion als die Kontrolle auslösen konnte, was wiederum die Tatsache untermauert, dass Impfstoffe auf CLEC-Basis gemäß dieser Erfindung überlegene Anti-TargetReaktionen auslösen können.
[00330] Das Beispiel zeigt auch, dass die Einführung einer zusätzlichen Cathepsin L-Spaltstelle in die gut beschriebenen T-Helfer- Epitope zu einer effizienteren Induktion von Immunantworten führt als bei herkömmlichen Impfstoffen und bei CLEC-basierten Impfstoffen ohne diese künstliche Sequenz.
[00331] So konnte SeqID25, die modifizierte Variante des schwachen T-Helfer-Epitops SeqID24, die die Spaltstelle enthält, im Vergleich zum unmodifizierten Peptid eine 7,5-fach höhere AntiPeptid- und eine 3,6-fach höhere Anti-Protein-Reaktion auslösen (Impfstoff 5 vs. Impfstoff 4). Darüber hinaus führte diese Veränderung auch zu einem 40%igen Anstieg der Anti-Protein-Titer im Vergleich zur KLH- Kontrolle. SeqgIlD27, die mit der Cathepsin-L-Spaltstelle modifizierte Variante von SeqglD26 (ein vom Masernvirus-Fusionsprotein abgeleitetes Epitop, das in der WO 2019/21355 A1 offengelegt ist), konnte die Titer ebenfalls signifikant erhöhen, und zwar mit einem 1,8-fachen Anstieg der Anti-Peptid- und einem 3,2-fachen Anstieg der Anti-Protein-Titer im Vergleich zum SeqID26-CLEC-Impfstoff (d. h. Impfstoff 7 gegenüber Impfstoff 6). Impfstoff 7 löste auch eine 2,2-fach höhere Anti-Peptid-Antwort und eine 1,6-fach höhere Anti-Protein-Antwort aus als die KLH-Kontrolle. SeqID7-basierte CLEC-Impfstoffe induzieren auch höhere Anti-Protein-Titer (20 % Anstieg) als nicht modifizierte Varianten (z. B. SeqgID22), und beide Peptide führen zu einer ungefähren Verdoppelung der Anti-SeqIlD2-Peptid- und Anti-Syn-Titer im Vergleich zur KLH-Kontrolle.
[00332] Die Hinzufügung der Cathepsin-Spaltstelle führt zur Bildung einer Peptidvariante mit einem zusätzlichen N (z. B.: am C-Terminus, das bei der Spaltung freigesetzt wird. Z.B.: SeqID22, PADRE, wird als AKFVAAWTLKAAA freigesetzt, während SeqlD7, modifiziertes PADRE, als AKFVAAWTLKAAA-N freigesetzt wird. Dieses N könnte sich auch negativ auf die weitere Verarbeitung und MHCII-Präsentation auswirken und somit die Wirksamkeit des jeweiligen Peptids
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verringern. Dieses Phänomen ist am Beispiel der sehr starken, von OVA abgeleiteten Epitope SeqlD28 und SeqID29 zu sehen. Das unmodifizierte Peptid löst sehr starke Immunantworten aus, während die modifizierte Variante einen um 75 % reduzierten Anti-Peptid- und einen um 98 % reduzierten Anti-Protein-Titer im Vergleich zur unmodifizierten Variante hervorruft.
Beispiel 10: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konjugaten unter Verwendung von Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope: KLH
[00333] In diesem Beispiel wurde die Immunogenität von CLEC-basierten Konjugatimpfstoffen, die das bekannte Trägerprotein KLH enthalten, mit herkömmlichen KLH-Impfstoffen verglichen. Zu diesem Zweck wurden zwei von aSyn abgeleitete Epitope (SeqgIlD3 und SeqID6) ausgewählt, die an GMBS-aktiviertes KLH gekoppelt wurden. Anschließend wurden Pep-KLH-Konjugate an reaktive Aldehyde von oxidiertem Pustulan unter Verwendung des BPMH-Vernetzers gekoppelt, um CLEGC- basierte Konjugatimpfstoffe mit KLH als Quelle für T-Helferzell- Epitope zu bilden, die eine nachhaltige Immunantwort auslösen.
[00334] Verwendete Impfstoffe:
B-Zell T-Zell- CLEC Adjuvans Route Epitop Epitop/Träger Pustulan ID KLH ‚a. i.d. SeqlD3 (140%) n.a i.d SeqlD3 KLH n.a. n.a. i.d SeqID3 KLH n.a. Alhydrogel S.C. Pustulan ID KLH ‚a. i.d. SeqIlD6 (80%) n.a i.d SeqIlD6 KLH n.a. n.a. 1.d. SeqID6 KLH n.a. Alhydrogel S.C.
[00335] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 20 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: I.d. für den CLEC-basierten Impfstoff und für den nicht adjuvantierten KLH-basierten Impfstoff und s.c. für den mit Alhydrogel adjJuvantierten KLH-basierten Impfstoff) und die anschließende Immunantwort richtete sich sowohl gegen das injizierte Peptid (i.d. h. SeqID3 und SeqID6) sowie gegen das Zielprotein, d. h. rekombinantes humanes aSynuclein, gerichtet ist, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen wurde.
Ergebnisse:
[00336] Wie in Figur 10A dargestellt, konnten alle sechs Impfstoffe, die KLH als Quelle für THelfer-Epitope verwendeten, eine starke und spezifische Immunantwort sowohl gegen die injizierten Peptidanteile (SeqgID3 und SeqlD6) als auch gegen das Zielprotein, rekombinantes aSynuclein, hervorrufen.
[00337] Die CLEC-Modifikation der KLH-Konjugate führte zu einer hochgradig überlegenen Immunantwort unter Verwendung beider Peptide, SeqgID3 bzw. SeqlD6. SeqID3+KLH+Pustulan konnte eine 2,3-mal höhere Anti-Peptid-Antwort auslösen als das mit Alhydrogel adjuvantierte SeqID3+KLH und eine 14-mal höhere Antwort als nach i.d. Verabreichung von nicht-adjuvantem SeqID3+KLH. In ähnlicher Weise waren auch die Anti-Protein-Titer 8,5-fach erhöht (im Vergleich zu Alhydrogel-adjuviertem SeqgID3+KLH) und 17-fach im Vergleich zu nicht-adjuviertem Material. SeqID6+KLH+Pustulan war auch 2- (inj. Peptid) bis 4,6-mal (aSyn) wirksamer als der adjuvantierte SeqgID6+KLH und 8,7-mal (inj. Peptid) bzw. 11-mal (aSyn) immunogener als der nicht-adjJuvantierte SegID6+KLH-Impfstoff.
[00338] Neben einer allgemeinen Erhöhung der Immunogenität von CLEC-modifizierten Impf-
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stoffen zeigen die Ergebnisse auch, dass die erfindungsgemäße CLEC-Modifikation zu einer signifikanten Erhöhung der relativen Menge der induzierten Antikörper führt, die sich an das Zielmolekül, d. h. das Protein, binden, wodurch die Zielspezifität der anschließenden Immunreaktion deutlich erhöht wird. Dementsprechend ist die relative Menge an Antikörpern, die aSyn nachweisen (d. h. das Verhältnis der gesamten antiinjizierten Peptidtiter im Vergleich zu den spezifischen Anti-aSyn- Titern), bei den durch SeqgID3+KLH+Pustulan induzierten Reaktionen 3,7-mal höher als bei den adjuvantierten SegID3+KLH und 2,2-mal höher als bei den adjuvantierten Konjugaten im Fall von SegID6+KLH+Pustulan.
[00339] In einer zweiten Versuchsreihe wurden die gleichen Impfstoffe verwendet (alle Impfstoffe: 5 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: 1.d. für den CLEC-basierten Impfstoff und s.c. für den KLH-basierten Impfstoff, der mit Alhydrogel adjuvantiert wurde) auf ihre Fähigkeit hin verglichen, trägerspezifische Antikörperreaktionen zu induzieren. Wie erwartet waren die herkömmlichen Impfstoffe auf der Basis von SeqIlD3+ und SeqID6+KLH in der Lage, hohe Anti-KLH-Titer zu induzieren (SeqgID3+KLH: 1/2100 und SeqID6+KLH: 1/7700), während die CLEC-basierten Impfstoffe auf der Basis von SeqgID3+KLH+Pustulan und SeqgID6+KLH+Pustulan grundsätzlich nicht in der Lage waren, nachhaltige Anti-Träger-Antikörper zu induzieren. Die erzielten Titer lagen mit 1/150 für SeqgID3+KLH+Pustulan bzw. weniger als 1/100 für SegID6+KLH+Pustulan nahe an der Nachweisgrenze, was eine neuartige, bisher unbeschriebene Optimierungsstrategie für Peptidkonjugat-Impfstoffe zur Erhöhung der zielspezifischen Titer bei gleichzeitiger Verringerung unerwünschter Anti-Träger-Reaktionen darstellt.
Beispiel 11: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konjugaten unter Verwendung von Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope: CRM197
[00340] In diesem Beispiel wurde die Immunogenität von CLEC-basierten Konjugatimpfstoffen, die das bekannte Trägerprotein CRM197 enthalten, mit herkömmlichen CRM197-Impfstoffen verglichen. Zu diesem Zweck wurde das von aSyn abgeleitete Epitop SeqID6 an das Maleimidaktivierte CRM197 gekoppelt. Anschließend wurde das Konjugat SegID6+CRM197 mit Hilfe des heterobifunktionellen Linkers BPMH an aktiviertes Pustulan gekoppelt, um CLEC-basierte Konjugatimpfstoffe mit CRM197 als Quelle für T-Helferzell-Epitope zu bilden, die eine nachhaltige Immunantwort auslösen. Alternativ dazu wurden SeqID5 (NH-NH2; SeqlD5) und CRM197 unabhängig voneinander an aktiviertes Pustulan gekoppelt. Dies geschah durch Reaktion des Hydrazids am C-Terminus von SeqID5 und über die in CRM197 vorhandenen Lysine mit reaktiven Aldehyden auf aktiviertem Pustulan.
[00341] Verwendete Impfstoffe:
T-Zell- CLEC-KopB-Zeill-Epitop Epitop/Trä- CLEC plung Adjuvans Route ger Pustulan als Konju- . SeqlD6 CRM197 ‚a. .d. Sq (80%) gat a id Pustulan ID RM197 hängi ‚a. i.d. SeqID5 C 9 (80%) unabhängig n.a i.d SeqID6 CRM197 n.a. n.a. Alhydrogel S.C.
[00342] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 20 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: 1.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den CRM197-basierten Impfstoff, der mit Alhydrogel adjuvantiert ist). Die anschließende Immunantwort, die sich sowohl gegen das injizierte Peptid (d.h. SeqlD6) als auch gegen das Zielprotein, d.h. rekombinantes humanes aSynuklein sowie aSyn-Filament, richtet, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen wurde.
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Ergebnisse:
[00343] Wie in Figur 11A dargestellt, konnten alle drei Impfstoffe, die CRM197 als Quelle für THelfer-Epitope verwenden, eine starke und spezifische Immunantwort sowohl gegen die injizierten Peptidanteile (SeqID6) als auch gegen das Zielprotein, rekombinantes aSynuclein, hervorrufen.
[00344] Auch hier führte die CLEC-Modifikation der CRM197-Konjugate zu einer höchst überlegenen Immunantwort. SeqgID6+CRM197+Pustulan konnte eine 28-mal höhere Anti-Peptid-Reaktion auslösen als das mit Alhydrogel adjuvierte SeqgID6+CRM197. In ähnlicher Weise waren auch die Antiprotein-Titer gegen rekombinantes aSyn 15-fach erhöht (im Vergleich zu Alhydrogel-adjJuviertem SeqgIlD6+CRM197) und die Titer gegen die aggregierte Form von aSyn, die aSyn-Filamente, 11fach erhöht.
Der Impfstoff, der durch die unabhängige Kopplung von SeqID5 und CRM197 an Pustulan hergestellt wurde, induzierte ebenfalls 1,7mal höhere injizierbare Peptid-Titer als herkömmliches, mit Alhydrogel adjuviertes SegID6+CRM197. Die Reaktivität gegenüber rekombinantem aSyn war ebenfalls um das 6,6-fache erhöht, und die Antifilament-Reaktionen waren um das 4,25-fache gesteigert.
[00345] Der Vergleich der trägerspezifischen Antikörperreaktionen ergab, dass herkömmliche Impfstoffe auf der Basis von SegID6+CRM197 hohe Anti-CRM197-Titer (1/6600) induzieren konnten, während der CLEC-basierte Impfstoff auf der Basis von SeqID6+CRM197+Pustulan im Grunde nicht in der Lage war, nachhaltige Anti-Träger-Antikörper zu induzieren. Die erzielten Titer lagen mit weniger als 1/100 für SegID6+CRM197+Pustulan jeweils nahe der Nachweisgrenze.
[00346] Die Experimente zeigen also, dass die CLEC-Modifikation herkömmlicher Peptid-Protein-Konjugate die Entwicklung einer Anti-Träger-Antwort erheblich beeinträchtigt und zu einer stark verbesserten Zielspezifität der anschließenden Immunantwort führt. Dies stellt eine neuartige, noch nie dagewesene Strategie zur Optimierung der derzeitigen Konjugat-Impfstoffe dar, die auf Trägerproteinen wie KLH, CRM197 oder anderen aufbauen.
[00347] Die unabhängige Kopplung von CRM197 und SeqlD5 an Pustulan führt zu einer nachhaltigen Reaktion gegen die auf CRM197 vorhandenen B-Zell-Epitope, wenn auch mit einer geringeren Rate als bei konventionellen, nicht-CLEC-modifizierten Konjugaten (Titer ca. 1/400). Dies zeigt, dass das CLEC-Grundgerüst gemäß der vorliegenden Erfindung auch geeignet ist, BZell-Epitope von CLEC-gekoppelten immunogenen Proteinen für die Verwendung als Impfstoff bereitzustellen.
Beispiel 12: Analyse der Selektivität von Immunantworten, die durch CLEC-basierte Impfstoffe in vivo ausgelöst werden
[00348] Die Aggregation des präsynaptischen Proteins aSyn wird als Hauptverursacher von Synucleinopathien wie der Parkinson-Krankheit angesehen, während monomeres, nicht aggregiertes aSyn wichtige neuronale Funktionen hat. Man geht daher davon aus, dass es für die Behandlung von Synucleinopathien, z. B. durch aktive oder passive Immuntherapie, von entscheidender Bedeutung ist, das aggregierte aSyn zu reduzieren bzw. zu entfernen, ohne den verfügbaren Pool an nicht-aggregierten Molekülen zu beeinträchtigen.
[00349] Zur weiteren Charakterisierung der Immunreaktionen, die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelöst werden, die die aSyn-Zielpeptide SeqID2 und SeqID3 sowie SeqgID5 und SeqID6 enthalten (im Vergleich zu herkömmlichen Impfstoffen mit Peptidträgern, d.h., SeqgID3+KLH und SeqgID6+CRM197), wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um die Selektivität der daraus resultierenden Immunreaktion gegenüber zwei verschiedenen Formen des präsynaptischen Proteins aSyn zu untersuchen : nicht aggregiertes, hauptsächlich monomeres aSyn sowie aggregierte aSyn-Filamente.
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[00350] Verwendete Impfstoffe:
T-ZellB-Zeill-Epitop Epitop/Träger CLEC Adjuvans Route Pustulan ID7 .a. i.d. SeqlD2 Seqg (80%) n.a i.d Pustulan ID KLH .a. i.d. SeqID3 (80%) n.a i SeqID3 KLH n.a. Alhydrogel S.C. Pustulan ID7 .a. i.d. SeqID5 Seqg (80%) n.a i.d Pustulan ID CRM197 .a. i.d SeqID6 (80%) n.a i SeqglD6 CRM197 n.a. Alhydrogel S.C
[00351] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 20 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichungsart: i.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den KLH- und CRM197-basierten Impfstoff, der mit Alhydrogel adjuvantiert ist) und die anschließende Immunantwort gegen das Zielprotein, d.h. rekombinantes humanes aSynuclein sowie aSyn-Filament, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen wurde. Die Plasmaproben wurden einem aSyn-spezifischen Inhibitions-ELISA unterzogen und die IC50-Werte wurden bestimmt.
Ergebnisse:
[00352] Kurz gesagt, alle CLEC-basierten Konjugate, die in diesem Experiment verwendet wurden, zeigen im Vergleich zu den herkömmlichen Peptidkonjugat-Impfstoffen (d. h. SegID3+KLH und SeqgID6+CRM, siehe Figur 12) eine überlegene Immunogenität und aSynuclein-Aggregatspezifische Zielselektivität.
[00353] Herkömmliche Peptidkonjugat-Impfstoffe können eine Antikörperreaktion mit leicht erhöhter Selektivität für aSyn-Aggregate (d.h. Filamente) im Vergleich zu monomerem/rekombinantem aSyn hervorrufen. SegID3+KLH, das mit Alhydrogel adjuvantiert wurde, löste eine Immunantwort mit 9-fach höherer Selektivität für aSyn-Aggregate im Vergleich zu rekombinantem aSyn aus. SeqgID6+CRM197, das mit Alhydrogel adjuvantiert wurde, löste eine weniger selektive Immunantwort aus, die eine 3,5-fach höhere Selektivität für Aggregate im Vergleich zu hauptsächlich monomerem, rekombinantem aSyn erreichte.
[00354] Im Gegensatz dazu zeichneten sich die durch CLEC-basierte Peptidkonjugatimpfstoffe induzierten Antikörper durch eine mehrfach höhere selektive Bindung aus als KLH- oder CRM197-Konjugatimpfstoffe. Das durch SeqgID2+SeqIlD7+Pustulan und SeqID5+SeqID7+Pustulan induzierte Plasma zeigt eine ca. 97-fache (d.h. 14-fach höhere als SeqgID3-KLH) und 50-fache Aggregatselektivität (d.h. 14-fach höhere als der Vergleichsimpfstoff SeqgID6+CRM, Alhydrogel). SeqgID3+KLH+Pustulan und SeqgID6+CRM197+Pustulan waren ähnlich selektiv und erreichten eine 40- (d. h. 5-fach höhere als SeqID3-KLH) bzw. 50-fache (d. h. 14-fach höhere als SeqgIlD6+CRM) höhere Selektivität für aSyn-Aggregate.
[00355] Die Experimente zeigen, dass die CLEC-Modifikation von Peptidkonjugaten sowie von Peptid-Protein-Konjugaten zu einer stark verbesserten Zielspezifität der daraus resultierenden Immunantwort führt und somit eine neuartige, noch nie dagewesene Strategie zur Optimierung des derzeitigen Stands der Technik bei Konjugatimpfstoffen darstellt.
Beispiel 13: Analyse der Avidität und Affinität von Immunreaktionen, die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelöst werden
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[00356] Zur weiteren Charakterisierung der Immunreaktionen, die durch CLEC-basierte Impfstoffe mit den aSyn-Zielpeptiden SeqgID2 und SeqgID3 sowie SeqID5 und SeqlD6 ausgelöst werden, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um die Avidität und Affinität der gegen aSyn ausgelösten Antikörper zu analysieren.
[00357] Verwendete Impfstoffe:
T-ZellB-Zeill-Epitop Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route ger Pustulan ID2 ID7 .a. i.d. Seq Seqg (80%) n.a i.d Pustulan SeqlD3 KLH .a. i.d. eq (80%) n.a i.d SeqID3 KLH n.a. Alhydrogel S.C. Pustulan ID ID7 .a. i.d. SeqID5 Seqg (80%) n.a i.d Pustulan SeqlD6 CRM197 ‚a. i.d. eq (80%) n.a i.d SeqID6 CRM197 n.a. Alhydrogel S.C.
[00358] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 20 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichungsart: i.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den KLH- und CRM197-basierten Impfstoff, der mit Alhydrogel adjuvantiert ist) und die darauf folgende Immunantwort gegen das Zielprotein, d.h. rekombinantes humanes aSyn sowie aSyn-Filament, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach jeder Immunisierung entnommen wurde. Um die Avidität der induzierten Abs gegenüber rekombinantem aSyn zu bestimmen, wurde eine Variation des Standard-ELISA-Tests verwendet, bei dem Wiederholungsvertiefungen, die an Antigene gebundene Antikörper enthielten, steigenden Konzentrationen von chaotropen Thiocyanat-lonen ausgesetzt wurden. Die Resistenz gegenüber der Thiocyanat-Elution wurde als Maß für die Avidität verwendet, und ein Index (Aviditätsindex), der 50 % der effektiven Antikörperbindung darstellt, wurde zum Vergleich der Plasmaproben (sowohl zwischen den Behandlungsgruppen als auch zwischen den Zeitpunkten) verwendet. Darüber hinaus wurde der ko Wert für aSyn-Filamente (Antikörperaffinität zu aSyn-Filamenten) der Antikörper 2 Wochen nach der letzten Immunisierung ebenfalls auf der Grundlage eines aSynKonkurrenz-ELISA bestimmt.
Ergebnisse:
[00359] Wie aus Figur 13 hervorgeht, zeigte das konventionelle Konjugat SeqgID3+KLH (mit Alhydrogel adjuvantiert) nur eine begrenzte Aviditätsreifung gegenüber der aSyn-Bindung, wenn man Immunproben vergleicht, die zwei Wochen nach der zweiten (T2) oder zwei Wochen nach der dritten Immunisierung gewonnen wurden (Aviditätsreifung (AM, Vergleich der ICso Werte für T2 und T3 Proben: 1,1)). Im Gegensatz dazu konnten CLEC-basierte Impfstoffe wie SeqID2+SeqlD7+Pustulan eine starke Reifung der Anti-aSyn-Antwort auslösen, was durch einen Al von 2,2 in Verbindung mit einem starken Anstieg der Avidität von T3-Proben gegenüber aSynuclein angezeigt wird. Proben von Tieren, die mit SeqgID3+KLH+Pustulan immunisiert wurden, zeigten ebenfalls eine deutlich höhere Avidität und eine leicht erhöhte Reifung im Vergleich zu SeqIlD3+ KLH allein.
[00360] Auch die Avidität der gegen aSyn-Proteine ausgelösten Immunreaktion war bei den Impfstoffen SeqID5+SeqIlD7+Pustulan und SeqgID6+CRM197+Pustulan signifikant höher als beim Referenzimpfstoff SeqID6+CRM197 (analysiert bei T3; d. h. es waren 3-3,8-mal höhere chaotrope Salzkonzentrationen erforderlich, um die Bindung zu verringern), und auch die Affinitätsreifung
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war beim Vergleich der T2- bzw. T3-Werte erhöht. SeqgID6+CRM197 führte nicht zu einem Anstieg der Avidität gegenüber aSyn im Vergleich zwischen T2 und T3, während die beiden CLECbasierten Impfstoffe zu einem starken Anstieg der aSyn-spezifischen Bindung im Vergleich zwischen T2 und T3 führten.
[00361] Experimente zur Quantifizierung des aSyn-Filaments ko für die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelöste Immunreaktion sowie für konventionelle Vergleichsimpfstoffe ergaben eine hochsignifikante Steigerung der Gesamtaffinität der durch CLEC-basierte Impfstoffe induzierten Antikörper für aSyn (siehe Figur 14). Die Konjugate SeqgID2+SeqlD7+Pustulan und SeqIlD3+ KLH+Pustulan zeigten eine 6-9-fach höhere Affinität (d. h., Kd: 110nM und 160nM im Vergleich zu einem ko von 1mM) als der mit Alhydrogel adjuvantierte Referenzimpfstoff SegID3+KLH. Die Konjugate SeqID5+SeqgIlD7+Pustulan und SeqgID6+CRM+Pustulan zeigen 12-15-mal bessere Kd-Werte als die mit Alhydrogel adjuvantierte Referenzkontrolle SeqgID6+CRM197 (d. h., Kd: 50nM und 60nM im Vergleich zu einem ko von 750nM).
[00362] Die Experimente zeigen daher, dass die CLEC-Modifikation von Peptidkonjugaten sowie von Peptid-Protein-Konjugaten zu einer stark verbesserten Zielspezifität und Affinität der daraus resultierenden Immunantwort führt und somit eine neuartige, noch nie dagewesene Strategie zur Optimierung des derzeitigen Stands der Technik bei Konjugatimpfstoffen darstellt.
Beispiel 14: Analyse der In-vitro-Funktionalität von Immunantworten, die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelöst werden
[00363] Um zu untersuchen, ob aSyn-spezifische Antikörper, die durch CLEC-basierte Impfstoffe (die die aSyn-Zielpeptide SeqID2/3 und SeqlID5/6 enthalten) hervorgerufen werden, biologisch aktiv sind, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, in denen die Fähigkeit der Antikörper untersucht wurde, die aSyn-Aggregation in vitro zu hemmen.
[00364] Verwendete Impfstoffe:
T-ZellB-Zell-Epitop Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route ger Pustul Seald2 SealD7 (80%) n.a. id. SeqID3 KLH n.a. Alhydrogel S.C. Pustulan ID ID7 ‚a. i.d. SeqID5 Seqg (80%) n.a i.d Pustulan SeqlD6 CRM197 ‚a. i.d. eq (80%) n.a i.d SeqID6 CRM197 n.a. Alhydrogel S.C.
[00365] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 20 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: 1.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den KLH- und CRM197-basierten, mit Alhydrogel adjuvierten Impfstoff). Proben von Mäuseplasma, die zwei Wochen nach jeder Immunisierung entnommen wurden, sowie entsprechende Kontrollproben (z. B. nicht aSyn-bindende Antikörper oder vor der Immunisierung gewonnenes Plasma) wurden auf ihre Fähigkeit zur Aggregationshemmung in vitro untersucht.
Ergebnisse:
[00366] Wie in Figur 15A dargestellt, hatten Kontrollantikörper oder Plasma, das den Tieren vor der Immunisierung entnommen wurde, keine signifikanten Auswirkungen auf die Aggregationskinetik von aSyn, was die Spezifität des Tests bestätigt. Herkömmliche SeqgID3+KLH-Konjugate (mit Alhydrogel adjuvantiert) konnten die aSyn-Aggregation signifikant reduzieren, was durch einen um 40% verringerten Steigungswert angezeigt wird (nur aSyn-Monomer: 100%; KLH: 60%).
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SS N SS
Die SeqID2+SeqID7+Pustulan-impfstoffinduzierten Abs hemmten die aSyn-Aggregation stark, was durch einen um 85 % verringerten Steigungswert (nur aSyn-Monomer: 100 %; KLH: 15 %) in diesem Assay angezeigt wird, was auf eine deutlich höhere Hemmkapazität im Vergleich zu den klassischen impfstoffinduzierten Abs hinweist.
[00367] Impfstoffinduzierte Antikörper auf der Basis von SeqID5+SeqID7+Pustulan und SeqID6+ CRM+Pustulan zeigen eine 86-92%ige Hemmung der Aggregatbildung ausgehend von rec. aSyn (geringer Gehalt an Aggregaten) und eine 67-82%ige Hemmung der Aggregatbildung ausgehend von vorgeformten Fibrillen (= bona fide Aggregate) im Vergleich zu 68% und 57% für den Referenzimpfstoff SeqgID6+CRM, Alhydrogel-induzierte Antikörper (siehe Figur 15B).
Beispiel 15: Analyse der Auswirkungen der Art der Immunisierung auf die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelösten Immunreaktionen
[00368] Es wurde eine Reihe von Immunisierungen durchgeführt, um die i.d.-Verabreichung mit alternativen Verabreichungswegen wie subkutan (s.c.) und intra-muskulär (i.m.) zu vergleichen.
[00369] Verwendete Impfstoffe:
T-ZellB-Zeill-Epitop Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route ger Pustulan . SeqID2 SeqlD7 (80%) n.a. 1.d. SeqID2 SeqlD7 Pustulan n.a. S.C. (80%) SeqID2 SeqlD7 Pustulan n.a. 1.m (80%)
[00370] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 1u9, 5uUg und 20ug aSyn-Zielpeptid/Dosis) und die anschließende Immunantwort gegen das injizierte Peptid und das Zielprotein, d.h. rekombinantes humanes aSynuclein sowie aSyn-Filament, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen wurde.
Ergebnisse:
[00371] Die Tabellen 1 und 2 sowie Figur 16 zeigen, dass SeqIlD2-SeqlD7-Pustulan-Impfstoffe, die i.m. oder s.c. verabreicht wurden, hohe Immunantworten sowohl gegen das injizierte Peptid (Figur 16A) als auch gegen anti-aSyn (Figur 16B) hervorrufen konnten. Die erreichten Maximaltiter waren bei allen getesteten Dosen deutlich niedriger als bei der i.d.-Applikation. Die s.c.-Applikation zeigte ein ähnliches Dosis-Wirkungs-Verhalten wie die i.d.-Applikation, während die i.m.Applikation keine signifikanten Unterschiede zwischen 5 und 20 ug aufwies, was auf eine Sättigung bei diesen erreichten Dosen/Applikationsmengen hindeutet. Ahnliche Ergebnisse wurden für die Reaktivität gegen monomeres bzw. aggregiertes aSyn erzielt. Diese Ergebnisse belegen die hohe Selektivität des CLEC-Grundgerüsts, wie es in dieser Erfindung für die Anwendung in der Haut im Gegensatz zu anderen Wegen/Geweben vorgestellt wird.
1u9 Sg 20H9 i.d. 16.000 83.000 140.000 8.C. 1000 2.000 12.000 i.m. 4.000 16.000 15.000
Tabelle: Anti-SeqID2/3-induzierte Antikörperreaktion nach Verabreichung des WISIT-Impfstoffs über verschiedene Wege
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Dr & SS
N NS
1u9 Sg 20H9 i.d. 2.000 5.000 10.000 8.C. 100 1.000 4.000 i.m. 2.000 2.000 5.000
Tabelle: Anti-aSyn-induzierte Antikörperreaktion nach Verabreichung des WISIT-Impfstoffs über verschiedene Wege
Beispiel 16: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konjugaten mit Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope: unterschiedliche Konjugat’CLEC-Verhältnisse
[00372] In diesem Beispiel wurde die Immunogenität von CLEC-basierten Konjugatimpfstoffen mit dem bekannten Trägerprotein CRM197 unter Verwendung verschiedener Peptid-CRM/CLECVerhältnisse verglichen. Zu diesem Zweck wurde das von aSyn abgeleitete Epitop SeqgID6 an das Maleimid-aktivierte CRM197 gekoppelt. Anschließend wurde das SegID6-CRM197-Konjugat mit dem heterobifunktionellen Linker BPMH in unterschiedlichen Gewichtsverhältnissen an aktiviertes Pustulan gekoppelt, um CLEC-basierte Konjugatimpfstoffe mit CRM197 als Quelle für THelferzell-Epitope zu bilden, die eine nachhaltige Immunantwort auslösen.
[00373] Verwendete Impfstoffe:
oitap Eaton räger SLEC Hi Cu Adjuvans Route SealD6 CRM197 800 1/1 n.a. id. SealD6 CRM197 800 1/2,5 n.a. id. SealD6 CRM197 800 1/5 n.a. id. SealD6 CRM197 800 1/10 n.a. id. SealD6 CRM197 800 1/20 n.a. id.
[00374] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 5ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: i.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe) und die darauf folgende Immunantwort, die sich sowohl gegen das injizierte Peptid (d.h. SeqlD6) als auch gegen das Zielprotein, d.h. rekombinantes humanes aSynuclein sowie aSynFilament, richtete, wurde anhand von Mäuseplasma analysiert, das zwei Wochen nach der dritten Immunisierung entnommen wurde.
Ergebnisse:
[00375] Wie Figur 17 zeigt, konnten alle fünf Impfstoffe, die CRM197 als Quelle für T-HelferEpitope verwenden, eine starke und spezifische Immunantwort sowohl gegen die injizierten Peptidanteile (SeqID6) als auch gegen das Zielprotein, rekombinantes aSynuclein, hervorrufen.
[00376] Die CLEC-Modifikation der CRM197-Konjugate führte bei allen getesteten Gew./Gew. Konjugat/’CLEG-Verhältnissen zu einer hocheffizienten Immunantwort. SeqID6-CRM197-Pustulan (Gew./Gew. 1/10) lieferte im Vergleich zu den anderen getesteten Varianten die höchsten anti-aSyn-spezifischen Immunantworten. Somit sind SeqID6-CRM197-Konjugate mit mittleren/hohen KonjugaVCLEC-Verhältnissen besonders geeignet, um optimale Immunantworten auszulösen (z. B.: 1/5, 1/10 und 1/20).
[00377] Die Experimente zeigen also, dass die CLEC-Modifikation herkömmlicher Peptid-Protein-Konjugate zu einer starken Zielspezifität der daraus resultierenden Immunantwort führt und
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damit eine neue, noch nie dagewesene Strategie zur Optimierung von Konjugat-Impfstoffen bietet, die auf Trägerproteinen wie KLH, CRM197 oder anderen basieren.
Beispiel 17: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konjugaten und Peptidkonjugaten unter Verwendung von Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope - aSyn N-Terminus (aa1-10)
[00378] In diesem Beispiel wurde untersucht, ob CLEC-basierte Konjugatimpfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, im Vergleich zu entsprechenden Peptidkonjugaten, die Trägerproteine nach dem Stand der Technik als Quelle für T-Zell-Epitope verwenden, bessere Immunantworten gegen aSyn-Aggregate zu induzieren.
[00379] Daher wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, bei denen zwei Konjugate verglichen wurden, die beide ein Epitop enthielten, das als aSyn-Targeting-Epitop geeignet war. Die Experimente konnten die Immunreaktion gegen das injizierte Peptid und das aSyn-Protein sowie die Selektivität der daraufhin ausgelösten Immunreaktion gegenüber zwei verschiedenen Formen des präsynaptischen Proteins aSyn nachweisen: nicht aggregiertes, hauptsächlich monomeres aSyn sowie aggregierte aSyn-Filamente. Weihofen et al. (2019, aa1-10 als Epitop von Cinpanemab) und WO2016/062720 (aa1-8 als Epitop in einem VLP-basierten Immuntherapeutikum) schlagen beispielsweise die N-terminale aSyn-Sequenz, die sich von der Position aa1-10 ableitet, als potenziell geeignetes Epitop für eine aSyn-gerichtete Immuntherapie vor. Um festzustellen, ob die CLEC-Modifikation tatsächlich zu einer besseren Immunantwort führt, haben wir daher einen CLEC-basierten Impfstoff, der die aSyn-Sequenz aa1-8 enthält (SeqgID12-SeqlD7-Pustulan), mit dem entsprechenden konventionellen Peptid-KLH-Impfstoff (SeqgID13-KLH, adjuvant. mit Alum) verglichen.
[00380] Verwendete Impfstoffe:
B-Zell T-Zell. Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route Epitop ger Pustulan . SeqglD12 SeqlD7 (80%) n.a. 1.d. SeqglD13 KLH na Alum 1.d.
[00381] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 5 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: I.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den mit Alhydrogel adjuvantierten KLH-basierten Impfstoff) und die darauf folgende Immunantwort gegen das injizierte Peptid und das Zielprotein mittels ELISA und EC50-Werten bestimmt. Um die Selektivität der Immunantwort zu bewerten, wurden die Plasmaproben außerdem einem aSyn-spezifischen Hemmungs-ELISA unterzogen und als Prozentsatz der maximalen Bindung ausgedrückt.
Ergebnisse:
[00382] Der in diesem Experiment verwendete CLEC-basierte Konjugatimpfstoff (SeqID12-SeqlD7-Pus), der auf den N-Terminus von aSyn abzielt, zeigt eine bessere Immunogenität gegen das aSyn-Protein als die konventionellen Peptid-Konjugatimpfstoffe (d. h. SeqID13-KLH, siehe Figur 18A). Der CLEC-basierte Impfstoff induziert einen 1,8-fachen Anstieg der Anti-ASyn- Titer und gleichzeitig einen 3-fachen Anstieg des Verhältnisses der Anti-Peptid- zur Anti-Protein-Reaktion im Vergleich zur Vergleichsgruppe. Dies untermauert nachdrücklich die Lehre dieser Erfindung, dass eine CLEC-Modifikation zu einer besseren Immunreaktion führt als vergleichbare konventionelle Impfstoffe.
[00383] Darüber hinaus induziert der herkömmliche Peptid-KLH-Konjugat-Impfstoff eine Antikörperreaktion mit stark erhöhter Selektivität (ca. 10-fach) für aSyn-Monomere im Vergleich zu Aggregaten (d. h. Filamenten, siehe Figur 18B). Im Gegensatz zu diesem Ergebnis und sehr überraschend führt das CLEC-basierte Konjugat zu einer völlig anderen Selektivität: SeqlD12-Se-
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qlD7-Pustulan induziert Antikörper mit einer signifikant, ca. 10-fach höheren Selektivität für aSynAggregate im Vergleich zu rekombinantem aSyn, wodurch sich das Profil der induzierten Antikörper vollständig ändert (siehe Figur 18B).
[00384] Die Experimente zeigen also, dass herkömmliche Peptidimpfstoffe mit aSyn aa1-8 weniger geeignet sind, um eine effiziente und selektive Immunantwort in vivo hervorzurufen, was darauf hindeutet, dass dieses Epitop nicht für eine aggregatselektive Immuntherapie geeignet ist. Wichtig ist, dass die Ergebnisse auch zeigen, dass die CLEC-Modifikation von Peptidkonjugaten zu einer stark verbesserten Zielspezifität der daraus resultierenden Immunreaktion sowie zu einer veränderten Selektivität gegenüber Aggregaten führt, wodurch ein neuartiger, noch nie dagewesener Konjugatimpfstoff gegen aSyn entsteht.
Beispiel 18: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konjugaten und Peptidkonjugaten unter Verwendung von Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope - aSyn aa100-108
[00385] Hier wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, in denen zwei Konjugate verglichen wurden, die beide ein Epitop enthielten, das als aSyn-Targeting-Epitop geeignet erschien. Dabei wurde die Immunantwort gegen das injizierte Peptid und das aSyn-Protein sowie die Selektivität der daraufhin ausgelösten Immunantwort gegenüber zwei verschiedenen Formen des präsynaptischen Proteins aSyn untersucht: nicht aggregiertes, hauptsächlich monomeres aSyn sowie aggregierte aSyn-Filamente.
[00386] So wird in WO 2011/020133 und WO2016/062720 die aSyn-Sequenz an der Position aa100-108/109 (entweder als native Sequenz oder als Mimotop, d. h. 100-108) als potenziell geeignetes Epitop für eine auf aSyn zielende Immuntherapie vorgeschlagen. Um festzustellen, ob die CLEC-Modifikation tatsächlich zu einer besseren Immunantwort unter Verwendung dieser Epitopregion führt, haben wir daher einen CLEC-basierten Impfstoff, der aSyn aa100-108 enthält (SeqIlD16-SeqIlD7-Pustulan), mit dem entsprechenden konventionellen Peptid-KLH-Impfstoff (SeqID17-KLH, adjuvant mit Alum) verglichen.
[00387] Verwendete Impfstoffe:
B-Zell T-Zell. Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route Epitop ger Pustulan
ID1 ID7 .a. i.d. SeqgIlD16 Seqg (80%) n.a i SeqlD17 KLH na Alum 1.d.
[00388] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 5 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: I.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den mit Alhydrogel adjuvantierten KLH-basierten Impfstoff) und die darauf folgende Immunantwort gegen das injizierte Peptid und das Zielprotein mittels ELISA und EC50-Werten bestimmt. Um die Selektivität der Immunantwort zu bewerten, wurden die Plasmaproben außerdem einem aSyn-spezifischen Hemmungs-ELISA unterzogen und als Prozentsatz der maximalen Bindung ausgedrückt.
Ergebnisse:
[00389] Der in diesem Experiment verwendete, auf CLEC basierende Konjugatimpfstoff gegen aSyn (SeqlD16-SeqIlD7-Pus) zeigt insgesamt eine sehr geringe Anti-aSyn-Protein-Antwort, die auch im Vergleich zu den herkömmlichen Peptid-Konjugatimpfstoffen (d. h. SeqID13-KLH, siehe Figur 19A) geringer ist. Der herkömmliche Impfstoff induziert eine Immunantwort, die durch einen 2,1-fachen Anstieg der Anti-aSyn- Titer gekennzeichnet ist, aber gleichzeitig einen 2-fachen Rückgang des Verhältnisses von Anti-Peptid/Antiprotein-Titern im Vergleich zum CLEC-basierten Impfstoff. Letzteres Ergebnis unterstützt die Lehre dieser Erfindung, dass die CLEC-Modifikation
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zu einer überlegenen Anti-Target-Protein-Antwort führt, selbst im Falle einer insgesamt geringeren Immunogenität als bei ähnlichen konventionellen Impfstoffen.
[00390] Darüber hinaus sind beide Impfstoffe, das konventionelle Peptidkonjugat und der CLECbasierte Impfstoff, weniger geeignet, eine selektive Immunantwort auszulösen (siehe Figur 19B). Die vorliegenden Experimente zeigen also, dass CLEC-basierte und herkömmliche Peptidimpfstoffe, die auf die Region aa100-108 abzielen, weniger geeignet sind, um eine effiziente und selektive Immunantwort in vivo hervorzurufen, was darauf hindeutet, dass dieses Epitop möglicherweise nicht die optimale Wahl für eine aggregatselektive Immuntherapie gemäß dieser Erfindung ist.
Beispiel 19: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konjugaten und Peptidkonjugaten unter Verwendung von Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope - aSyn aa91-100
[00391] In diesem Beispiel wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, bei denen zwei Konjugate verglichen wurden, die beide ein Epitop enthielten, von dem man annahm, dass es sich als aSyn-Targeting-Epitop eignet, indem man die Immunantwort analysierte, die gegen das injizierte Peptid und das aSyn-Protein ausgelöst wurde.
[00392] Die Studie US 2014/0377271 A1 legt beispielsweise nahe, dass das Epitop aa91-99 bei Morbus-Parkinson-Patienten als Autoepitop fungiert und daher ein potenziell geeignetes Epitop für eine auf aSyn ausgerichtete Immuntherapie sein sollte. Um festzustellen, ob die CLEC-Modifikation tatsächlich zu einer besseren Immunantwort auf dieses Epitop führt, haben wir daher einen CLEC-basierten Impfstoff, der aSyn aa91-100 enthält (SeqID14-SeqIlD7-Pustulan), mit dem entsprechenden konventionellen Peptid-KLH-Impfstoff (SeqID15-KLH adjuvantiert mit Alum) verglichen.
[00393] Verwendete Impfstoffe:
B-Zell T-Zell. Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route Epitop ger Pustul SeqlD14 SeqlD7 ( 80%) 2 na. id. SeqglD15 KLH na Alum 1.d.
[00394] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 5 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: I.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den mit Alhydrogel adjuvantierten KLH-basierten Impfstoff) und die darauf folgende Immunantwort gegen das injizierte Peptid und das Zielprotein aSyn mittels ELISA und EC50Werten bestimmt.
Ergebnisse:
[00395] Überraschenderweise induzierten beide Impfstoffe relevante Anti-Peptid-Titer, waren aber weniger erfolgreich bei der Induktion nachweisbarer Anti-aSyn-Protein-Titer (siehe Figur 20). Die vorliegenden Experimente zeigen also, dass CLEC-basierte und herkömmliche Peptidimpfstoffe, die auf die Region aa91-100 abzielen, weniger geeignet sind, um eine effiziente und selektive Immunantwort in vivo hervorzurufen, was darauf hindeutet, dass dieses Epitop möglicherweise nicht die optimale Wahl für eine aggregierte selektive Immuntherapie gemäß dieser Erfindung ist.
Beispiel 20: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konjugaten und Peptidkonjugaten unter Verwendung von Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope - aSyn C-terminale Region aa131-140
[00396] In diesem Beispiel wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, bei denen zwei Konjugate verglichen wurden, die beide ein Epitop enthielten, von dem man annahm, dass es sich als aSyn-Targeting-Epitop eignet, indem man die Immunantwort analysierte, die gegen das
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injizierte Peptid und das aSyn-Protein ausgelöst wurde. Darüber hinaus wurde die Selektivität der daraufhin ausgelösten Immunreaktion gegenüber zwei verschiedenen Formen des präsynaptischen Proteins aSyn untersucht.
So schlagen beispielsweise US 2015/0232524 A1 und WO 2016/062720 A1 die C-terminale aSyn-Sequenz aus den Positionen aa-126-140 und 131-140 als potenziell geeignetes Epitop für eine auf aSyn zielende Immuntherapie vor. Um festzustellen, ob die CLEC-Modifikation tatsächlich zu einer besseren Immunantwort führt, haben wir daher einen CLEC-basierten Impfstoff, der aSyn aa131- 140 enthält (SeqID20-SeqgID7-Pustulan), mit dem entsprechenden konventionellen Peptid-KLH-Impfstoff (SeqID21-KLH, adjuvant mit Alum) verglichen.
[00397] Verwendete Impfstoffe:
B-Zell T-Zell. Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route Epitop ger Pustul SealD20 SealD7 (80%) n.a. id. SeqID21 KLH na Alum 1.d.
[00398] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 5 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: I.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den mit Alhydrogel adjuvantierten KLH-basierten Impfstoff) und die darauf folgende Immunantwort gegen das injizierte Peptid und das Zielprotein mittels ELISA und EC50-Werten bestimmt. Um die Selektivität der Immunantwort zu bewerten, wurden die Plasmaproben außerdem einem aSyn-spezifischen Hemmungs-ELISA unterzogen und als Prozentsatz der maximalen Bindung ausgedrückt.
Ergebnisse:
[00399] Der in diesem Experiment verwendete CLEC-basierte Konjugatimpfstoff gegen aSyn (SeqID20-SeqlD7-Pus) zeigt eine insgesamt geringere Anti-aSyn-Protein-Antwort im Vergleich zu den herkömmlichen Peptid-Konjugatimpfstoffen (d. h. SeqgID21-KLH, siehe Figur 21A). Der herkömmliche Impfstoff induziert eine Immunreaktion, die durch einen 1,8-fachen Anstieg der Anti-aSyn- Titer gekennzeichnet ist, während das Verhältnis zwischen Anti-Peptid- und Anti-Protein-Titern um 45 % geringer ist als bei dem CLEC-basierten Impfstoff. Letzteres Ergebnis untermauert die Lehre dieser Erfindung, dass eine CLEC-Modifikation zu einer überlegenen Anti-Zielprotein-Antwort führt, selbst wenn die Immunogenität insgesamt geringer ist als bei ähnlichen herkömmlichen Impfstoffen.
[00400] Darüber hinaus sind die herkömmlichen Peptidkonjugate weniger geeignet, eine selektive Immunantwort auf Aggregate auszulösen (siehe Figur 4B). Im Gegensatz dazu ruft der CLECbasierte Impfstoff Antikörper mit einer ca. 10-fach erhöhten Selektivität für monomeres aSyn auf Kosten von aggregiertem aSyn hervor (siehe Figur 21B). Die vorliegenden Experimente zeigen also, dass CLEC-basierte und herkömmliche Peptidimpfstoffe, die auf die Region aa131-140 abzielen, weniger geeignet sind, um eine effiziente und selektive Immunantwort gegen aggregiertes aSyn in vivo hervorzurufen, was darauf hindeutet, dass dieses Epitop möglicherweise nicht die optimale Wahl für eine aggregatselektive Immuntherapie gemäß der vorliegenden Erfindung ist.
Beispiel 21: Analyse der Immunogenität von CLEC-Konjugaten und Peptidkonjugaten unter Verwendung von Trägerproteinen als T-Helferzell-Epitope - aSyn C-terminale Region aa103-135
[00401] In diesem Beispiel wurde untersucht, ob CLEC-basierte Konjugatimpfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu entsprechenden Peptidkonjugaten, die Trägerproteine nach dem Stand der Technik als Quelle für T-Zell-Epitope verwenden, bessere Immunantworten gegen aSyn hervorrufen können.
[00402] Daher wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, in denen verschiedene Konju65 / 246
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gate verglichen wurden, die von einer Epitopregion abgeleitet wurden, die als aSyn-Zielepitop geeignet ist. Diese Experimente konnten die Immunreaktion gegen das injizierte Peptid und das aSyn-Protein sowie die Selektivität der daraufhin ausgelösten Immunreaktion gegenüber zwei verschiedenen Formen des präsynaptischen Proteins aSyn nachweisen: nicht aggregiertes, hauptsächlich monomeres aSyn sowie aggregierte aSyn-Filamente.
[00403] Mehrere Studien deuten darauf hin, dass die C-terminale aSyn-Sequenz ab Position aa103-135 ein potenziell geeignetes Epitop für eine zielgerichtete aSyn-Immuntherapie ist, entweder als Quelle für Autoepitope, für Peptide, die die ursprüngliche Sequenz enthalten, oder für deren Mimotope. Um festzustellen, ob die CLEC-Modifikation tatsächlich zu einer besseren Immunantwort führt, wenn diese Region innerhalb von aSyn verwendet wird, haben wir daher mehrere CLEC-basierte Impfstoffe (mit Peptiden innerhalb der Region 107-126) mit den entsprechenden herkömmlichen Peptid-CRM-Impfstoffen (mit Alum adjuvantiert) verglichen.
[00404] Verwendete Impfstoffe:
T-ZellB-Zell-Epi L j ell-Epitop Epitop/Träger CLEC Adjuvans Route Pustul SealD56 SealD7 (80%) n.a. id. SeqID58 CRM na Alum S.C. Pustulan ID ID7 .a. i.d. SeqID53 Seqg (80%) n.a i.d SeqID55 CRM na Alum S.C. P | SealD51 SealD7 80%) n.a. id. SeqID52 CRM na Alum S.C. Pustulan ID ID7 .a. i.d. SeqID65 Seqg (80%) n.a i.d SeqID66 CRM na Alum S.C. P | SealD67 SealD7 80%) n.a. id. SeqlD68 CRM na Alum S.C. Pustul SealD69 SealD7 (80%) n.a. id. SeqlD70 CRM na Alum S.C. Pustulan ID71 ID7 .a. i.d. Seq Seqg (80%) n.a i.d SeqlD72 CRM na Alum S.C.
[00405] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 5 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: I.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für den mit Alhydrogel adjuvantierten KLH-basierten Impfstoff) und die darauf folgende Immunantwort gegen das injizierte Peptid und das Zielprotein mittels ELISA und EC50-Werten bestimmt. Um die Selektivität der Immunantwort zu bewerten, wurden die Plasmaproben außerdem einem aSyn-spezifischen Hemmungs-ELISA unterzogen und als Prozentsatz der maximalen Bindung ausgedrückt.
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Ergebnisse: Impfstoff Peptid-Titer aSyn-Filament- Titer (x1000) (x1000)
SeqDI56+SeqID7+Pus 0,1 0,1
SeqI1D58+C RM+Alum 9,781 0,1
SeqDI53+SeqgID7+Pus 0,1 0,1
SeqI1D55+C RM+Alum 17,647 0,8
SeqDI51+SeqgIlD7+Pus 19,694 1,687 SeqgIlD52+CRM+Alum 13,115 1,594 SeqDI65+SeqgIlD7+Pus 9,04 3,256 SeqID66+CRM+Alum 7,984 1,108 SeqDI67+SeqgIlD7+Pus 12,016 7,335 SeqI1D68+C RM+Alum 18,126 1,864 SeqDI69+SeqIlD7+Pus 28,125 3,523 SeqI1D70+CRM+Alum 37,88 1,054 SeqDI71+SeqID7+Pus 7,783 5,788 SeqgIlD72+CRM+Alum 14,603 2,429
Tabelle 1: Durch Impfstoffe mit aa107-126 hervorgerufene Immunreaktion
[00406] Sowohl CLEC- als auch CRM-basierte Impfstoffe, die 5- und 6-mer Peptide enthalten, waren in diesem Experiment weniger geeignet, hohe Anti-aSyn-Filament-Titer zu induzieren. Die in diesem Experiment verwendeten, vom aSyn-C-Terminus-abgeleiteten CLEC-basierten Konjugat-Impfstoffe (7- bis 12-mer Peptide) (siehe Tabelle 1 und Figuren 22A, 23A und 24A) zeigen alle eine überlegene Immunogenität gegen aSyn-Filamente im Vergleich zu den herkömmlichen Peptid-Konjugat-Impfstoffen (siehe Tabelle 1, bis zu 4-fache Steigerung). Dies untermauert die Lehre der vorliegenden Erfindung, dass die CLEC-Modifikation zu einer besseren Immunantwort führt als ähnliche konventionelle Impfstoffe, die Epitope aus 103-135, insbesondere 107-126, verwenden.
[00407] Die Analyse der Selektivität für aggregiertes aSyn unterstützt diese Lehre. Wie in den Figuren 22B und 23B gezeigt, sind CLEC-Impfstoffe, die Epitope enthalten, die von der Sequenz aa115-126 abgeleitet sind, erstaunlich wirksam bei der Auslösung hochgradig aggregierter selektiver Immunantworten. Wie in Figur 22B gezeigt, induziert der CLEC-basierte Impfstoff SeqlD51+SeqID7+Pus, der ein 8-mer aSyn-Zielepitop enthält, Antikörper mit einer 10-fach höheren Selektivität für aSyn-Aggregate, während der entsprechende konventionelle Impfstoff (SeqgIlD52+CRM+Alum) keine aggregatselektiven Antikörper induziert. In ähnlicher Weise induziert der CLEC-basierte Impfstoff SeqID67+SeqID7+Pus, der ein 10-mer aSyn-Zielepitop enthält, eine ca. 10-fach höhere Selektivität für aSyn-Aggregate im Vergleich zu Monomeren, während der entsprechende konventionelle Impfstoff (SeqgID68+CRM+Alum) Antikörper hervorruft, die ca. 3fach selektiver für Monomere im Vergleich zu Aggregaten sind (siehe Figur 23B).
[00408] Die Analyse der Selektivität für Impfstoffe, die das Epitop aa107-114 enthalten (SeqglD73+SeqgID7+Pus und SeqID74+CRM+Alum, siehe Figur 24B), zeigte überraschenderweise, dass trotz des Vorhandenseins hoher Anti-aSyn-Filament-Titer (d. h. überdurchschnittliche Immunogenität) die durch den CLEC-basierten Impfstoff induziert wurden, weder CLEC- noch herkömmliche Impfstoffe aggregatselektive Antikörper induzieren konnten, was darauf hindeutet, dass nur hochselektierte Peptidsequenzen innerhalb von aa103-135 als Immuntherapeutika geeignet sind, die spezifisch auf aggregiertes aSyn abzielen.
[00409] Wie bereits gezeigt (siehe Figuren 18-20), eignen sich Epitope von aa91-100, aa100108 und aa131-140 weniger gut als potenzielle immuntherapeutische Regionen, um spezifisch
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gegen aggregiertes aSyn vorzugehen.
Beispiel 22: Analyse der In-vitro-Funktionalität von Immunantworten, die durch CLEC-basierte Impfstoffe ausgelöst werden
[00410] Um zu untersuchen, ob aSyn-spezifische Antikörper, die durch CLEC-basierte Impfstoffe (die aSyn-Zielpeptide aus der Epitopregion aa103-135 enthalten) ausgelöst werden, biologisch aktiv sind, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, in denen die Fähigkeit der Antikörper untersucht wurde, die aSyn-Aggregation in vitro zu hemmen.
[00411] Verwendete Impfstoffe:
B-Zell T-Zell. Epitop/Trä- CLEC Adjuvans Route Epitop ger Pustulan 1D67 ID7 .a. i.d. SeqID6 Seqg (80%) n.a i.d SeqID68 CRM n.a. Alhydrogel S.C. P | SealD71 SealD7 80%) n.a. id. SeqlD72 CRM197 n.a. Alhydrogel 1.d. Pustulan ID7 ID7 .a. i.d. SeqIlD73 Seqg (80%) n.a i.d SeqlD74 CRM197 n.a. Alhydrogel S.C.
[00412] Die Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen geimpft (alle Impfstoffe: 20 ug aSyn-Zielpeptid/Dosis; Verabreichung: 1.d. für die CLEC-basierten Impfstoffe und s.c. für die mit Alhydrogel adjuvantierten CRM197-basierten Impfstoffe). Proben von Mäuseplasma, die zwei Wochen nach jeder Immunisierung entnommen wurden, sowie entsprechende Kontrollproben (z. B. der aSyn-bindende Antikörper LB509, das Epitop aa115-122 oder vor der Immunisierung gewonnenes Präimmunplasma) wurden auf ihre Fähigkeit zur Aggregationshemmung in vitro untersucht.
Ergebnisse:
[00413] Wie in Figur 25D dargestellt, hatte das von den Tieren vor der Immunisierung entnommene Plasma keine signifikanten Auswirkungen auf die Aggregationskinetik von aSyn, was die Spezifität des Assays bestätigt.
[00414] Die durch den Impfstoff SeqID67-SeqID7-Pustulan (mit einem 10-meren aSyn-Peptid) induzierten Abs hemmten die aSyn-Aggregation stark, was sich in einer um 40 % verringerten Aggregation in diesem Assay im Laufe der Zeit zeigte, während der entsprechende CRM-Konjugatimpfstoff nur minimale Auswirkungen zeigte, was auf eine deutlich höhere Hemmkapazität im Vergleich zu den durch den klassischen Impfstoff induzierten Abs hinweist (Figur 8A). Ein ähnliches Ergebnis konnte bei der Analyse von Antikörpern erzielt werden, die durch SeqIlD71+SeqlD7+Pustulan (das ein 12-mer aSyn-abgeleitetes Peptid enthält) induziert wurden. Diese konnten die Aggregation sogar noch stärker reduzieren (70-80 % Hemmung) und die Hemmungskapazität von Antikörpern, die durch einen herkömmlichen CRM-Impfstoff (SeqgID72+CRM+Alhydrogel) induziert wurden, um das 2- bis 2,5-fache übertreffen. Figur 8C zeigt, dass die durch CLECbasierte und konventionelle Impfstoffe induzierten Antikörper, die auf dem Epitop aa107-114 (das ein von aSyn abgeleitetes 8-mer Peptid enthält) aufbauen, die aSyn-Aggregation dagegen nicht hemmen konnten.
[00415] Wie in Figur 25D dargestellt, hemmt der aSyn-spezifische Antikörper LB509 die aSynAggregation nicht. Im Gegenteil, in dieser Analyse kann eine leichte Zunahme der Aggregation
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festgestellt werden.
[00416] Dies ist ein höchst überraschender Effekt in Anbetracht der Lehren dieser Erfindung (siehe Beispiel 14 und Figur 15, in denen auch Epitope analysiert werden, die von der aSynSequenz aa115-126 abgeleitet sind, insbesondere auch aa115-121), sowie Tabelle 1 und Figuren 22-25, in denen Impfstoffe beschrieben werden, die die Epitope 115-126 abdecken), wie das monoklonale LB509 (Epitop aa:115-122), von dem bekannt ist, dass es an verschiedene Formen von aSyn bindet (Jakes et al. Neurosci Lett. 1999 Jul 2;269(1):13- 6) und das gleiche Epitop wie die biologisch wirksamen Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist (siehe Figur 25D). Daraus folgt, dass die mit CLEC-basierten Impfstoffen erzielten biologisch überlegenen Wirkungen in der Tat überraschend sind und zeigen, dass hochselektierte Peptidsequenzen, die innerhalb von aa115-126 enthalten sind, innerhalb der Region aa103-135 als Immuntherapeutika bevorzugt werden, die spezifisch auf aggregiertes aSyn zielen.
[00417] Auf der Grundlage dieser allgemeinen Offenbarung der vorliegenden Erfindung und dieser Beispiele werden die folgenden bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung offenbart:
1. Konjugat, bestehend aus oder umfassend mindestens ein B-Glucan oder ein Mannan und mindestens ein B-Zell- oder T-Zell-Epitop- Polypeptid, wobei das B-Glucan oder Mannan kovalent mit dem B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid konjugiert ist, um ein Konjugat aus dem ßBGlucan oder Mannan und dem B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid zu bilden, wobei das BZell- und/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid ein alpha-Synuclein-Polypeptid ist; oder ein Konjugat, das aus mindestens einem ß-Glucan oder einem Mannan und mindestens einem alpha-Synuclein-BZell-Epitop-Polypeptid besteht oder dieses umfasst, wobei das ß-Glucan oder Mannan kovalent an das B-Zell-Epitop-Polypeptid konjugiert ist, um ein Konjugat aus dem ß-Glucan oder Mannan und dem B-Zell-Epitop-Polypeptid zu bilden.
2. ein Konjugat gemäß Ausführungsform 1, wobei das ß-Glucan ein überwiegend lineares B-(1,6)Glucan mit einem Verhältnis von (1,6)-gekoppelten Monosaccharid-Einheiten zu nicht-B-(1,6)gekoppelten Monosaccharid-Einheiten von mindestens 1:1, vorzugsweise mindestens 2:1, noch bevorzugter mindestens 5:1, insbesondere mindestens 10:1 ist.
3. Konjugat gemäß Ausführungsform 1 oder 2, wobei das ßB-Glucan Pustulan, Lichenan, Laminarin, Curdlan, B-Glucanpeptid (BGP), Schizophyllan, Skleroglucan, ganze Glucanpartikel (WGP), Zymosan oder Lentinan ist, vorzugsweise Pustulan, Laminarin, Lichenan, Lentinan, Schizophyllan oder Skleroglucan, insbesondere Pustulan.
4. Konjugat nach einer der Ausführungsformen 1 bis 3, wobei die Polypeptide mindestens ein BZell-Epitop von alpha-Synuclein und mindestens ein T-Zell-Epitop umfassen.
5. Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 4, wobei das Verhältnis von B-Glucan oder Mannan zu B-Zell- und/oder T-Zell- Epitop-Polypeptid im Konjugat von 10:1 (w/w) bis 1:1 (w/w), vorzugsweise von 8:1 (w/w) bis 2:1 (w/w), insbesondere 4:1 (w/w) beträgt.
6. Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 5, wobei ein B-Zellen-Epitop und ein panspezifisches/promiskuitives T-Zellen-Epitop unabhängig voneinander an das ßB-Glucan gekoppelt sind.
7. Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 6, wobei das B-Zell-Epitop-Polypeptid eine Länge von 5 bis 20 Aminosäureresten, vorzugsweise von 6 bis 19 Aminosäureresten, insbesondere von 7 bis 15 Aminosäureresten aufweist; und/oder wobei das T-Zell-Epitop- Polypeptid eine Länge von 8 bis 30 Aminosäureresten, vorzugsweise von 13 bis 29 Aminosäureresten, insbesondere von 13 bis 28 Aminosäureresten aufweist,
wobei das T-Zell-Epitop vorzugsweise ein Polypeptid ist, das die Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAAA umfasst, die gegebenenfalls an einen Linker, wie einen Cysteinrest oder einen Linker, der einen Cysteinrest umfasst, einen NRRA-, NRRA-C- oder NRRA-NH-NH2-Linker, gebunden ist oder eine Variante der Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAAA, wobei die Varianten die Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAA, Varianten, bei denen der erste Rest Alanin durch einen aliphatischen Aminosäurerest, wie Glycin, Valin, Isoleucin und Leucin, ersetzt ist, Varianten, bei denen der dritte Rest Phenylalanin durch L-Cyclohexylalanin ersetzt ist, Varianten, bei denen der dreizehnte Aminosäurerest Alanin durch einen aliphatischen Aminosäurerest (z.g. Glycin, Valin, Isoleucin und Leucin) ersetzt ist, Varianten, die Aminocapronsäure umfassen, vorzugs-
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SS N SS
weise gekoppelt an den C-Terminus der Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAA, Varianten mit der Aminosäuresequenz AX:FVAAXTLX:AX4A, worin X+ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus W, F, Y, H, D, E, N, Q, I und K; X2 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus F, N, Y und W, X3 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H und K, und X4 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus A, D und E, mit der Maßgabe, dass die Oligopeptidsequenz nicht AKFVAAWTLKAAA ist; insbesondere wobei das T-Zell-Epitop ausgewählt ist aus AKFVAAWTLKAAANRRA-(NH-NH2), AKFVAAWTLKAAAN-C, AKFVAAWTLKAAA-C, AKFVAAWTLKAAANRRA-C, aKXVAAWTLKAAAaZC, aKXVAAWTLKAAaZCNRRA, aKXVAAWTLKAAa, aKXVAAWTLKAAaNRRA, aA(X)AAAKTAAAAa, aA(X)AAATLKAAa, aA(X)VAAATLKAAa, aA(X)IAAATLKAAa, aK(X)VAAWTLKAAa und aKFVAAWTLKAAa, worin X L-Cyclohexylalanin ist, Z Aminocapronsäure ist und a ein aliphatischer Aminosäurerest ist, ausgewählt aus Alanin, Glycin, Valin, Isoleucin und Leucin ; und/oder
wobei das T-Zell-Epitop ein Alpha-Synuclein-Polypeptid ist, ausgewählt aus der Gruppe GKTKEGVLYVGSKTK (aa31-45), KTKEGVLYVGSKTKE (aa32-46), EQVTITNVGGAVVTGVT (aa61-75), VTGVTAVAQKTVEGAGNIAAATGFVK (aa71-86), DPDNEAYEMPSE (aa116-130), DNEAYEMPSEEGYOD (aa121-135), und EMPSEEGYQDYEPEA (aa126-140).
8. Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 7, wobei das Konjugat ferner ein Trägerprotein umfasst, vorzugsweise nicht-toxisches kreuzreaktives Material von Diphtherietoxin (CRM), insbesondere CRM497, KLH, Diphtherietoxoid (DT), Tetanustoxoid (TT), Haemophilus influenzae Protein D (HipD), den äußeren Membranproteinkomplex von Meningokokken der Serogruppe B (OMPC), rekombinante nichttoxische Form von Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (rEPA), Flagellin, hitzelabiles Enterotoxin (LT) von Escherichia coli, Choleratoxin (CT), mutierte Toxine (z.B.: LTK63 und LTR72), virusähnliche Partikel (VLPs), Albuminbindungsprotein, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, ein synthetisches Peptiddendrimer, z. B. ein multiples antigenes Peptid (MAP), wobei insbesondere das Verhältnis von Trägerprotein zu B-Glucan oder Mannan im Konjugat 1/1 bis 1/50, vorzugsweise 1/1 bis 1/40, noch bevorzugter 1/1 bis 1/20, insbesondere 1/5 bis 1/20 beträgt.
9. ein Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 8, wobei das Polypeptid mindestens ein alpha-Synuclein-B-Zell- oder ein T-Zell-Epitop-Polypeptid ist oder umfasst und wobei das Konjugat ferner ein Nicht-alpha-Synuclein-B-Zell- oder T-Zell-Epitop umfasst.
10. Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 8, wobei das alpha-Synuclein-Polypeptid natives alpha-Synuclein oder ein Polypeptid ist, das die Aminosäurereste 1 bis 5, 1 bis 8, 1 bis 10, 60 bis 100, 70 bis 140, 85 bis 99, 91 bis 100, 100 bis 108, 102 bis 108, 102 bis 109, 103 bis 129, 103 bis 135, 107 bis 130, 109 bis 126, 111 bis 121, 111 bis 135, 115 bis 121, 115 bis 122, 115 bis 123, 115-124, 115-125, 115 bis 126, 118 bis 126, 121 bis 127, 121 bis 140 oder 126 bis 135, der Aminosäuresequenz von nativem menschlichem Alpha-Synuclein:
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAOQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDOL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA (humanes aSyn (1-140 aa): UNIPROT-Hinterlegungsnummer P37840), vorzugsweise ein Polypeptid, das die Aminosäurereste 1 bis 8, 91 bis 100, 100 bis 108, 103 bis 135, 107 bis 130, 115 bis 121, 115 bis 122, 115 bis 123, 115-124, 115-125, 115 bis 126, 118 bis 126, 121 bis 127 oder 121 bis 140 umfasst oder daraus besteht; oder Mimotope, ausgewählt aus der Gruppe DQPVLPD, DOQPVLPDN, DOQPVLPDNE, DOQPVLPDNEA, DQPVLPDNEAY, DOQPVLPDNEAYE, DSPVLPDG, DHPVHPDS, DTPVLPDS, DAPVTPDT, DAPVRPDS, und YDRPVQOPDR.
10. ein Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 9, wobei das Konjugat ein T-ZellEpitop umfasst und frei von B-Zell-Epitopen ist, wobei das Konjugat vorzugsweise mehr als ein T-Zell-Epitop umfasst, insbesondere zwei, drei, vier oder fünf T-Zell-Epitope.
11. Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 10 zur Verwendung als aktiver Impfstoff zur Behandlung und Vorbeugung von Synukleopathien, vorzugsweise Parkinson-Krankheit (PD), Demenz mit Lewy-Körpern (DLB), Multiple-System-Atrophie (MSA), Parkinson-Demenz (PDD), neuroaxonale Dystrophien, Alzheimer-Krankheit mit amygdalar beschränkten Lewy-Körpern (AD/ALB).
12. Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 11 zur Verwendung zur Induzierung zielspezifischer Immunantworten, während keine oder nur sehr begrenzte CLEC- oder Trägerprotein-
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spezifische Antikörperantworten induziert werden; und/oder zur Induktion zielspezifischer Immunreaktionen, wobei keine oder nur sehr begrenzte CLEC- oder Trägerprotein-spezifische Antikörperreaktionen induziert werden; und/oder zur Verwendung bei Krankheiten mit reduzierten oder dysfunktionalen Treg-Populationen, um die schwindende/reduzierte Treg-Anzahl und -Aktivität zu erhöhen und dadurch die Autoimmunreaktivität von krankheitsspezifischen T-Effektorzellen zu reduzieren und Autoimmunreaktionen bei Patienten zu dämpfen, wobei T-Zell-Epitope, die als Treg-Epitope geeignet sind, oder eine Kombination mit Treg-induzierenden Mitteln, wie Rapamycin, niedrig dosiertes IL-2, TNF- Rezeptor 2 (TNFR2)-Agonist, Anti-CD20-Antikörper (wie Rituximab), Prednisolon, Inosin-Pranobex, Glatirameracetat oder Natriumbutyrat; verwendet werden; und/oder zur Verwendung in einer Behandlung zur Erhöhung oder Erhaltung der T-Zell-Zahlen, insbesondere der T-Effektor-Zell-Zahlen, und der T-Zell-Funktion in einem PD-Patienten, die vorzugsweise eine Kombination von Checkpoint-Inhibitoren oder Impfstoffen unter Verwendung von Anti-Immun-Checkpoint-Inhibitor-Epitopen einschließt, um eine Anti-Immun-Checkpoint-Inhibitor-Immunantwort zu induzieren, um die T-Zell-Zahlen zu erhöhen oder zu erhalten, insbesondere die Zahl der T-Effektorzellen und die T-Zellfunktion in einem PD-Patienten, wobei der PD-Patient vorzugsweise dadurch ausgewählt wird, dass er eine Gesamtverringerung der CD3+-Zellen, insbesondere der CD3+CD4+-Zellen aufweist, die für PD-Patienten in allen Stadien der Krankheit typisch ist; vorzugsweise ein Patient in den H+Y-Stadien 1-4, noch bevorzugter H+Y1-3, am meisten bevorzugt H+Y1-2. 13. Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 12, wobei das B-Glucan oder Mannan zur Verwendung als C-Typ-Lectin (CLEC)-Polysaccharid-Adjuvans dient, vorzugsweise zur Verstärkung der T-Zell-Antwort auf ein gegebenes T-Zell-Epitop-Polypeptid, insbesondere wobei das T-Zell-Epitop ein lineares T-Zell-Epitop ist, insbesondere wobei das T-Zell-Epitop ein Polypeptid ist, das die Aminosäuresequenzen SeqlD7, 8, 22-29, 87-131, GKTKEGVLYVGSKTK, KTKEGVLYVGSKTKE, EQVTNVGGAVVTGVT, VTGVTAVAQKTVEGAGNIAAATGFVK, MPVDPDNEAYEMPSE), DNEAYEMPSEEGYQD, EMPSEEGYQDYEPEA oder Kombinationen davon umfasst oder daraus besteht. 14. Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 13 zur Verwendung bei der Erhöhung der Affinitätsreifung in Bezug auf ein spezifisches alpha-Synuclein-Polypeptid-Antigen oder zur Induzierung einer verstärkten Immunantwort in Bezug auf das menschliche Selbstantigen alphaSynuclein. 15. Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 14, das ferner ein Trägerprotein umfasst, das T-Zell-Epitope zur Verwendung bei der Verringerung oder Beseitigung der B-Zell-Antwort auf das CLEC und/oder das Trägerprotein und/oder bei der Verstärkung der T-Zell-Antwort auf die T-Zell-Epitope des Trägerproteins umfasst, wobei das Trägerprotein vorzugsweise nicht-toxisches kreuzreaktives Material von Diphtherietoxin (CRM), insbesondere CRM197, KLH, Diphtherietoxoid (DT), Tetanustoxoid (TT), Haemophilus influenzae Protein D (HipD), und der äußere Membranproteinkomplex von Meningokokken der Serogruppe B (OMPC), eine rekombinante nicht-toxische Form von Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (rEPA), Flagellin, hitzelabiles Escherichia coli Enterotoxin (LT), Choleratoxin (CT), mutierte Toxine (z.B.: LTK63 und LTR72), virusähnliche Partikel, Albuminbindungsprotein, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, ein synthetisches Peptiddendrimer, z. B.: ein multiples antigenes Peptid (MAP) ist, insbesondere wobei die T-Zell-Epitop-Wirksamkeit in einem Impfstoff, der lineare T-Zell-Epitope umfasst, erhöht wird, z. B.: durch eine N- oder C-terminale Hinzufügung einer lysosomalen Protease-Spaltstelle, wie eine Cathepsin L-Äähnliche Spaltstelle oder eine Cathepsin S-ähnliche Spaltstelle, wobei die Cathepsin L-Äähnliche Spaltstelle vorzugsweise durch die folgende Konsensussequenz definiert ist: Xn-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Xg Xn : 3-27 Aminosäuren des immunogenen Peptids X1 : Jede Aminosäure X2 : Jede Aminosäure X3 : Jede Aminosäure Xa4 : N/D/A/Q/S/R/G/L; bevorzugt N/D, stärker bevorzugt N Xs5 : F/R/A/K/T/S/E; bevorzugt F oder R, stärker bevorzugt R Xe : F/R/A/K/V/S/Y; bevorzugt F oder R, stärker bevorzugt R
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X7 : beliebige Aminosäure, bevorzugt A/G/P/F, noch bevorzugter A Xs : Cystein oder Linker wie NHNHz, wobei die am meisten bevorzugte Sequenz X--X;X2X3NRRA-Linker ist; und wobei die Cathepsin S-Äähnliche Spaltstelle vorzugsweise durch die folgende Konsensussequenz definiert ist:
Xn-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Xg Xn : 3-27 Aminosäuren des immunogenen Peptids X1 : Jede Aminosäure X2 : Jede Aminosäure X3 : eine beliebige Aminosäure, bevorzugt V, L, I, F, W, Y, H, noch bevorzugter V X4 : eine beliebige Aminosäure, bevorzugt V, L, I, F, W, Y, H, noch bevorzugter V Xs: K, R, E, D, Q, N, vorzugsweise K, R, besonders bevorzugt R Xe : Jede Aminosäure X7 : eine beliebige Aminosäure, bevorzugt A Xs8 : bevorzugt A Xs8 : Cystein oder Linker wie NHNHz, wobei die bevorzugte Sequenz Xn-X:X2VVRAA-Linker ist 16. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 15, wobei das ßB-Glucan oder Mannan durch Oxidation aktiviert wird und wobei das aktivierte ßGlucan oder Mannan mit der B-Zelle und/oder dem T-Zellepitop-Polypeptid in Kontakt gebracht wird, wodurch ein Konjugat des B-Glucans oder Mannans mit der B-Zelle und/oder dem T-Zellepitop-Polypeptid erhalten wird. 17. Verfahren gemäß Ausführungsform 16, wobei das B-Glucan oder Mannan durch Periodatoxidation an vicinalen Hydroxylgruppen, als reduktive Aminierung oder als Cyanylierung von Hydroxylgruppen erhalten wird. 18. Verfahren gemäß Ausführungsform 16 oder 17, wobei das ßB-Glucan oder Mannan bis zu einem Oxidationsgrad oxidiert wird, der als die Reaktivität mit dem Schiff’schen Fuchsin-Reagenz definiert ist, die einem Oxidationsgrad einer gleichen Menge Pustulan entspricht, das mit Periodat in einem Molverhältnis von 0,2-2,6, vorzugsweise von 0,6-1,4, insbesondere von 0,7-1, oxidiert wurde. 19. Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 16 bis 18, wobei das Konjugat durch Kopplung auf Hydrazonbasis zur Konjugation von Hydraziden an Carbonyle (Aldehyd) oder durch Kopplung unter Verwendung heterobifunktioneller Maleimid-Hydrazid-Linker (z.B.: BMPH (N-ßBMaleimidopropionsäurehydrazid), MPBH (4-[4-N-Maleimidophenyl]buttersäurehydrazid), EMCH (N-[e-Maleimidocapronsäure)-hydrazid) oder KMUH (N-[k-Maleimidoundecansäure]-hydrazid)) zur Konjugation von Sulfhydriden (z. B. Cysteinen) mit Carbonylen (Aldehyden) erhalten wird. 20. ein Impfstoffprodukt, das zur Impfung eines Individuums gegen ein spezifisches Antigen bestimmt ist, wobei das Produkt eine Verbindung umfasst, die ein B-Glucan oder Mannan als PolysaccharidAdjuvans vom Typ C-Lectin (CLEC) umfasst, das kovalent an das spezifische Antigen gekoppelt ist. 21. Impfstoffprodukt gemäß Ausführungsform 20, wobei das Produkt ein Konjugat gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 16 umfasst oder durch ein Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 16 bis 19 erhältlich oder erhalten ist. 22. Impfstoffprodukt gemäß Ausführungsform 20 oder 21, wobei das Antigen mindestens ein BZell-Epitop und mindestens ein T-Zell- Epitop umfasst, vorzugsweise wobei das Antigen ein PoIypeptid ist, das ein oder mehrere B-Zell- und T-Zell-Epitope umfasst. 23. Impfstoffprodukt nach einer der Ausführungsformen 20 bis 22, wobei das kovalent gekoppelte Antigen und das CLEC-Polysaccharid- Adjuvans als Partikel mit einer Größe von 1 bis 5000 nm, vorzugsweise von 1 bis 200 nm, insbesondere von 2 bis 160 nm, bestimmt als hydrodynamischer Radius (HDR) durch dynamische Lichtstreuung (DLS), vorliegen. 24. Impfstoffprodukt nach einer der Ausführungsformen 20 bis 23, wobei das kovalent gekoppelte Antigen und das CLEC-Polysaccharid- Adjuvans als Partikel mit einer Größe von 1 bis 50 nm, vorzugsweise von 1 bis 25 nm, insbesondere von 2 bis 15 nm, bestimmt als HDR durch DLS, vorliegen. 25. Impfstoffprodukt nach einer der Ausführungsformen 20 bis 24, wobei das kovalent gekoppelte Antigen und das CLEC-Polysaccharid- Adjuvans als Partikel mit einer Größe von weniger als 100
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Ss N 8
nm, vorzugsweise weniger als 70 nm, insbesondere weniger als 50 nm, bestimmt als HDR durch DLS, vorliegen.
26. pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Konjugat oder einen Impfstoff, wie in einer der Ausführungsformen 1 bis 25 definiert, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. 27. pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 26, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger ein Puffer, vorzugsweise ein Puffer auf Phosphat- oder TRIS-Basis, ist.
28. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 26 oder 27, enthalten in einem nadelbasierten Verabreichungssystem, vorzugsweise einer Spritze, einem Mininadelsystem, einem Hohlnadelsystem, einem festen Mikronadelsystem oder einem System mit Nadeladaptern; einer Ampulle, nadelfreien Injektionssystemen, vorzugsweise einem Jet-Injektor; einem Pflaster, einem transdermalen Pflaster, einem mikrostrukturierten transdermalen System, einem Mikronadel-Array-Pflaster (MAP), vorzugsweise einem festen MAP (S-MAP), einem beschichteten MAP (C-MAP) oder einem sich auflösenden MAP (D-MAP); einem ElektrophoreseSystem, einem lontophorese-System, einem laserbasierten System, insbesondere einem Erbium-YAG-Lasersystem; oder einem Gene-Gun-System.
29. pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einer der Ausführungsformen 26 bis 28, wobei das Konjugat oder der Impfstoff als Lösung oder Suspension, tiefgefrorene Lösung oder Suspension, Lyophilisat, Pulver oder Granulat enthalten ist.
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SEQUENCE LISTING <110> Tridem Bioscience GmbH & Co KG <120> A conjugate consisting of or comprising at least a B-glucan or a mannan <130> R 79549
<140> AT501282022 <141> 2022-02-28
<160> 540 <170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
«2115 7
<212> PRT
<213% Artificial Sequence
<228> <2237 peptide
<400> 1 Asp Gln Pro Val Leu Pro Asp % 5
<2180> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 2 Asp Gln Pro Val Leu Pro Asp 1 5
<210> 3
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 3
Cys Asp Gin Pro Val Leu Pro Asp 3 5
<210> 4
<2112 7
74 / 246
<212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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1 5
<210> 5
<2134> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 5 Asp Met Pro Val Asp Pro Asp 1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 6 Cys Asp Met Pro Val Asp Pro Asp 1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 7
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asrı Arg ÄArg 1 5 10 15
Ala
<210> 8
15 <212> PRT <213> Artificial Sequence 75 / 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
75 / 246
<220> <223> peptide
<400> 8 Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asn Cys 1 5 10 15
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<211> 6
<212> PRF
<213> Artificial Sequence
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 11 Asp Ala Glu Phe Arg His Cys 1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
76 / 246
<400> 12
Met Asp Val Phe Met Lys GLy Leu 1 5
<2180> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 13 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Cys 1 5
<710> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 14 Ala Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln Leu 1 5 18
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 15 Ala Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp Gin Leu Cys 1 5 18
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 16 Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro 1 5
77 / 246
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 17 Leu Gly Lys Asn GIu Glu Giy Ala Pro Cys 1 5 10
<218> 18
AZU1> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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<220> <223> peptide
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78 / 246
SS SS 8
<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 23
iys Ala Ala Ala Val Lys Ala Ala Phe Trp Thr Ala Leu Asn Arg Arg 1 5 18 15
Ala
<210> 24 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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<210> 25
27 <212> PRT 79 / 246
79 / 246
SS N 8
<213> Artificial Sequence
<220> <223> yveptide
<400> 25 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asrı Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 1 5 18 15 Ile Leu Pro Gly His Gly Cys Asn Arg Arg Ala 20 25
<2187> 26 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 26
Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys 6ly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 18 15
Ile Leu Phe
<218> 27
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 27 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Giy Val Ile Val His Argp Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Asn Arg Arg Ala 28
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> yeptide
<400> 28
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asrı Glu Ala Gly 1 5 10 15
Arg
80 / 246
<210> 29
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> VARIANT <222> 1 <4223> pyroglutamate 81 / 246
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<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<4223> pyroglutamate
81 / 246
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> pyroglutamate
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<211> 6
<212> PRT
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<220>
82 / 246
SS SS 8
<223> peptide
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<211% 19
<212> PRT
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<400> 37
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Asp Tyr Cys
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<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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Trp Asp Pro Giy Met Leu Gin Ser Glu Leu Ile Gln Lys Glu Phe Gly 1 5 18 15
Asp Tyr
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<211> ©
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<213> Artificial Sequence
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84 / 246
1 5 10
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<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 48
Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys 1 5 10
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85 / 246
SS N 8”
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<220>
<223> peptide
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Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu ÄArg 1 5 10 15
Ala Glu Leu
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
4223> peptide
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6 86 / 246
86 / 246
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
87 / 246
SS N 8
<220> <223> peptide
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
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<211> 6
<212> PRT
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88 / 246
Cys Asp Gln Pro Val Leu Pro Cys 1 5
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<211> 6
<212> PRT
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<211> 9
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<213> Artificlial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 65
Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asrı Glu 1 5
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89 / 246
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<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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£211> 11
<212> PRT
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
90 / 246
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<210> 71
<2411> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<211> 8
<212> PRT
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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91 / 246
<400> 74
Ala Pro Gin Glu Gly Ile Leu Glu Cys 1 5
<210> 75
<211> 33
4212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 75
GLy Gly Ser Ala Gin Ser Glan Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His
1 5 19 15
Ser Gly 6ln Gln Gin Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gliy Gly Ser Val Pro 206 25 30
Cys
<210> 76 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 76 Ala Val Ser Val Asrn Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gin Ser Gin 1 5 18 15 Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gin Gin Gly Leu 28 25 30 Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro Cys 35 40 <210> 77 <211> 140 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 77
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 19 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 49 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gin Val Thr 50 55 60
92 / 246
As Val Gly Glvy Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 8O YThr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 98 95 LySs Asp Gln Leu Gly Lys Asrı Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 185 118 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
138 135 148
<210> 78 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 78 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 1 5 18 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 46
<210> 79
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 79 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 1 5 18 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 38 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 46
<210> 80 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 80 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asrı Leu Ala
93 / 246
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Fhe Phe Leu Leu Phe Ile Pro 28 25 30 Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gin Pro Ala Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly 58 55 60 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gin Ala Asp Ser Gln 65 78 75 80 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met G1ly Asrnı Glu Leu Thr 85 98 95 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Giy Asn Gln Val 180 105 110 Asrı Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gin Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gily Leu Phe Phe 155 176 175 Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys 180 185 190 Arg Ser Pra Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu 195 208 205 Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 218 215 220
<210> 81
<211> 441
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<408> 81 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 18 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gin Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gin Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 59 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 78 75 830 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gin Pro His Thr Glu 85 99 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gin Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 136 135 140
94 / 246
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gliy Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160
Gly Gin Lys Gly Gln Ala Asrn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pra Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 228 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asrı Val 245 250 255 iys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro GlIy Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asrı Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gin 275 288 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asrnı Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gin Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asrn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 iys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 iys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Gliu Asrn Ala Lys Ala 378 375 380 iys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asrı Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gliy Leu 435 440
<210> 82
<211> 290
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 82
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 18 15
Asrn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
29 25 30
Gly Ser Asrn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asrı Ile
95 / 246
50 55 60 Ile Gin Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gin Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gin Zle Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 106 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asrı Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu 61y Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 178 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asrı Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asrı 180 185 1960 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 2406 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 278 Gly Ile 6Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 2908
<210> 83 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 83
Met Gin Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 19 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gliy Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45 Asrn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 68
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 98 95
Val Thr Gin Leu Pro Asrn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arp
190 105 110
96 / 246
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gin Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 156 155 168
Arg Pro Ala Gly Gin Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175 Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Giy Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gin Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 248
Cys Val Pro Glu Gin Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser 6ly
245 250 255 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 84 2211> 534 2212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 84
Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Giy Met Gly Val His Val Gly Ala 1 5 10 15
Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln
28 25 30 Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu 35 40 45 Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Giy Phe Ser Leu Ala Gln Leu As 50 55 60 Leu Ile Trp Gin Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala 55 70 75 80 Glu Giy Gin Asp Gin Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe 85 99 95 Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asrnı Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val 100 105 110 Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp 115 1206 125 Phe Giy Ser Ala Ala Val Ser Leu Gin Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys 130 135 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gin Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
97 / 246
165 170 175 Phe Trp Gin Asp G1Ly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asrı Val Thr Thr 180 185 198 Ser Gin Met Ala Asn Glu Gin 61ly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu 195 20 205 Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asnı 210 215 220 Pro Val Leu Gin Gin Asp Ala His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln 225 230 235 240 Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val 245 250 255 Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro 260 265 270 Gliu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asrı Leu Ile Trp G6ln Leu Thr 275 280 285 Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly 299 295 300 Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gin 305 310 315 320 Gly As Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly 325 330 335 Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val 340 345 350 Ser Leu Gin Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu 355 360 365 Pro Asrı Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser 379 375 380 Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gin 385 398 395 400 Gliy Val Pro Leu Thr Gly Asrı Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu 405 418 415 Gin GIy Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu GLy Ala 420 425 430 Asn Gliy Thr Tyr Ser Cvys Leu Val Arg Asrı Pro Val Leu Gln Gin Asp 435 440 445 Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro 450 455 460 Giu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu 465 470 475 480 Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys 485 490 495 Giu Glu Glu Asrn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly 500 505 510 Ser Lys Thr Ala Leu GLiIn Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp 515 528 525 Asp Gly Gin Glu Ile Ala 530
<210> 85
<211> 282
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
€220> <223>7 peptide
98 / 246
<400> 85
Met Ala Ser Leu GLy Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile 1 5 10 15 Ile Ile Leu AÄAla Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Iie Ser 20 25 30 Gly ÄArg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile 35 40 45 Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ele Lys Leu 58 55 60 Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val 65 79 75 80 His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gin Asp Giu Met 85 98 95 Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn 100 105 110 Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asrı Val Gin Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr 115 128 125 Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asrı Ala Asrı Leu Glu 138 135 140 Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asrn Val Asp Tyr Asn 145 156 155 1608 Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gin 165 178 175 Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gin Val Asp Gln Gly Ala Asrı Phe Ser 180 185 190 Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asrn Ser Glu Asrı Val Thr Met 195 200 205 Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asrnı Asrn Thr Tyr Ser 218 215 220 Cys Met Ile Glu Asrı Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val 225 230 235 240 Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser 245 250 255 Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile Ser Trp Ala Leu 260 265 270 Leu Pro Leu Ser Pro Tyr Leu Met Leu Lys 275 280
<210> 86 <211> 525 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 86
Mer Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gin Pro Leu Trp 1 5 108 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
28 25 30 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile 35 40 45 Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gin
99 / 246
56 55 60 His Gin Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu 65 78 75 80 Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pra Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro 85 98 95 Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gliy Pro G1Ly Gly Leu Arg Ser GLy 100 195 110 Arg Leu Pro Leu Gin Pro Arg Val Gin Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln 1315 120 125 Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140 Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala 5er Pro Pro 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asrı Cys Ser Phe Ser 189 185 1908 Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln 1895 200 205 Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser 210 215 220 Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp GlLy 225 230 235 240 Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asrı Val Ser Ile Met Tyr Asnı 245 250 255 Leu Thr Val Leu Giy Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala 2608 265 270 Gly Ala Gliy Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val 275 280 285 Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asrnı Giy Asp Phe Thr Leu Arg Leu 305 310 315 328 Glu Asp Val Ser Gin Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His 325 330 335 Leu Gln Glu Gin Gin Leu Asrnı Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr 340 345 350 Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Giy Ser Leu Gly Lys Leu Leu 355 3560 365 Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gin Giu Arg Phe Val Trp Ser Ser 379 375 380 Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala 385 390 395 400 Gln Glu Ala Gin Leu Leu Ser Gin Pro Trp Gin Cys Gln Leu Tyr Gln 405 410 415 Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser 420 425 430 Pro Gly Ala Gin Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly 435 440 445 His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Giy Val Leu Ser Leu Ley Leu Leu 450 455 460 Val Thr Gliy Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro 465 470 475 480 Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gin Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln 485 490 495 Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gin Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro
100 / 246
500 505 518 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Giu Pro Glu Gln Leu 515 520 525 <210> 87 <211> 14 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 87
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Cys 1 5 10
<210> 88
18 2212 PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 88 Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asn Arg AÄArg 1 5 19 15 Ala CysS <718> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <2207% <223> peptide <228> <221> VARIANT <222> 1,33 <223> aliphatic aming acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> L-cCyclohexylalanine 4220> <221> VARLANT <222> 14 <223> aminocaproic acid 101 / 246
2212 PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 88
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asn Arg AÄArg 1 5 19 15
Ala CysS
<718> 89
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<2207% <223> peptide
<228>
<221> VARIANT
<222> 1,33
<223> aliphatic aming acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> L-cCyclohexylalanine
4220>
<221> VARLANT
<222> 14
<223> aminocaproic acid
101 / 246
<400> 89 Xaa Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Xaa Xaa Cys 1 5 18 15
<210> 980
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 1,13
<223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> L-cyclohexylalanine
<220>
VARIANT <222> 14 <223> aminocaproic acid <400> 90 Xaa Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Xaa Xaa Cys Asn 1 5 10 15 Arg Arg Ala <210> 91 313 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <2235> peptide <220> <221> VARIANT <222> 1,13 <223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> L-cyclohexylalanine 102 / 246
<222> 14
<223> aminocaproic acid
<400> 90
Xaa Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Xaa Xaa Cys Asn 1 5 10 15
Arg Arg Ala
<210> 91
313 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <2235> peptide <220> <221> VARIANT <222> 1,13 <223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> L-cyclohexylalanine 102 / 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <2235> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 1,13
<223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> L-cyclohexylalanine
102 / 246
SS N 8
<400> 91 Xaa Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu LysS Ala Ala Xaa 1 5 19
4210> 92 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<2227 1,13
<223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine
<220>
<221> VÄRIANT
<222> 3
<223> L-cyclohexylalanine
<400> 92
Xaa Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Xaa Asrnı Arg Arg 1 5 18 15
Ala
<210> 93 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 93 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asrn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Leu Pro Gly 28
<210> 94 <211> 24
<212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<4Q0> 94
103 / 246
Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asrn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser
1 5 16 15 Ile Leu Pro Gly Asnı Arg Arg Ala 28 <210> 95 <211> 15 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 95 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 1 5 10 15
<210> 96 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 956
Leu Ser Glu Ile Lys Gliy Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Asn 1 5 18 15
Arg Arg Ala
<210> 97 <211> 18 <212> PRT <2137 Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 97
iys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly 1 5 10 15
Val Glu
<210> 98 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
104 / 246
<400> 98 Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Glu Asrnı Arg Arg Ala 20
<210> 99
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<4080> 99 Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Asrnı Pro Lys 1 5 10 15
<210> 100 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 100 Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asrnı Asrı Glu Ile Asp Ser 1 5 19 15
<210> 161
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 101 Ile Arg Glu Asp Asn Asn Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn 1 5 10 15
<210> 102 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
105 / 246
<4008> 102 Phe Asn Asrnı Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20
<210> 103 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 103 Gin Tyr Ile Lys Ala Asrn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10
<210> 104
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 104 Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Ala Glu Ser 20
<210> 105 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 105 Leu Ile Asrı Ser Thr Lys Ile Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser 1 5 10 15 Lys Val Asrı Gln 20
<210> 106 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
106 / 246
SS N 8”
<220> <223> peptide
<400> 106 Asrn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile Ile Val Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lyss 1 5 10 15 Ile Thr Leu Pro 20
<210> 107 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 107 Pro Kis His Thr Ala Leu Arg Gin Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu 1 5 19 15 Met Thr Leu Ala 26
<210> 108
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 108 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Xle Pro Gln Ser Leu Asp 1 5 16 15
<216> 189 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 109 Tyr Ser Gly Fro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gin Arg Leu Glu Asp Val 1 5 10 15
<210> 110 <211> 14 <212> PRT €213> Artificial Sequence
107 / 246
<220> <223> peptide
<400> 110 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gin Ser Leu 1 5 10
<219> 111 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 111 Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro As Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 Glu Leu Arg Gly Asrı Ala Glu Leu 20
<210> 112
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<460> 112 Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cvys Thr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser 20 25
<210> 113
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 113
Gln Tyr Ile Lys Ala Asrn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Gliu Leu 1 5 10 15 <210> 114
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
108 / 246
<220> <223> peptide
<400> 114 Phe Asrı As Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 16 15 Ala Ser His Leu Glu 20
<210> 115 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 115 Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asnı Asrı Glu Ile Asp 5er Phe 1 5 18 15
<210> 116 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 116 Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asrı Pro Lys 1 5 16 15
<210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificlal Sequence
<220> <223> peptide
<400> 117
Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asrn Glu Ser Ser Gln Lys 1 5 106 15
Thr
109 / 246
SS N 8”
<210> 118 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 118
Ala Gly Leu Thr Leu Ser Leu Leu Vai Ile Cys Ser Tyr Leu Phe Ile 3 5 16 15
Ser Arg Gly
<210> 116 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 119 Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu 1 5 16 15 Gin Thr His Ile 20
<210> 120
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 120
Val Pro Gly Leu Tyr Ser Pro Cys Arg Ala Phe Phe Asrı Lys Glu Glu 1 5 19 15
Leu Leu
<218> 121
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 121 Thr Gly His Giy Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr Asp Tyr
110 / 246
1 5 10 15
<210> 122
<211> 13
42212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 122 iys Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Glu Lys Lys Leu Arg Gln 1 5 10
<210> 123 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<408> 123 Thr Val Phe Tyr Asrn Ile Pro Pro Met Pro Leu 1 5 10
<210> 124 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 124 Asp LyS Arg Glu Met Trp Met Ala Cys Ile Lys Glu Leu His 1 5 19
<210> 125
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 125
Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg 1 5 10 <210> 126
<211> 13
SS N 8
<212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 126 Pro Lys TyrP Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10
<210> 127 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 127 Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val 1 5 19 15
<210> 128 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial 5equence
<220> <223> peptide
<408> 128 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile 1 5 10
<210> 129 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 129
Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly 1 5 10 15
Asrn Glu Gly
<210> 130 <211+* 14
112 / 246
<212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> penptide
<400> 130 Gin Val His Phe Gin Pro Leu Pro Pro Ala Val Val Lys Leu 1 5 10
<210> 131
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 131 Lys Gln Ile Ile Asrı Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 1 5 19 15
<218> 132 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 132 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 1 5 10 15 Gly Val Thr Ser 20
<210> 133 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 133
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Pro 1 5 10 15
Pro Ala His
113 / 246
<210> 134
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 134
Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser 1 5 18 15
Ärg Thr Pro
<210> 135 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial 5Sequence
<220> <223> peptide
<400> 135 Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr 1 5 10
<210> 136
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 136 Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser 1 5 10 15
<210> 137 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 4,13
<223> pyroglutamate
114 / 246
SS N 8
<400> 137
Val Tyr Lys Xaa Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Xaa Ser Pro Ärg 1 5 18 15
His Leu
<210> 138
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 18,27
<223> pyroglutamate
<400> 138
Arg Glu Asrnı Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr
1 5 18 15
Lys Xaa Ser Pro Val Val Ser Gliy Asp Thr Xaa Ser Pro Arg His Leu 20 25 38
<210> 139
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARKANT
<222> 3
<223> pyroglutamate
<400> 139 Ile Gly Xaa Ser Thr Glu 1 5
<210> 140 <211> 12 <212> PRFT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 140
Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 5er 1 5 10
<210> 141 <211> 368 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 141 Pro Asp Leu Lys Asrn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asrn Leu 1 5 18 15 Lys His Gin Pro Gly Giy Gly Lys Val Gin Ile Ile Asnı Lys 20 25 308
<210> 142 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 142 Val Lys Ser Lys Ile Gliy Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly 1 5 18 15 Giy Gly Lys Val Gln Zie Ile Asrı Lys Lys Leu Asp Leu Ser 20 25 30
<210> 143 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<2202% <223>» peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> pyroglutamate
<400> 143 Val Lys Ser Lys Ile Giy Xaa Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Gly Lys Val Gin Ile Ile Asrı Lys Lys Leu Asp Leu Ser 28 25 30
£210> 144
<211> 30 <2127 PRT
116 / 246
SS N 8
<213> Artificial Sequence
€220> <223> peptide
<400> 144 Lys Zle Gly Ser Thr Glu Asrı Leu Lys Mis 6Gln Pro Gly Giy GIy Lys 3 5 18 15 val Gin Ile Ile Asrı Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asrı Val Gin 20 25 30
<210> 145 <211> 38 <212> PRT <2137 Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 145 Val Gin Ile Ile Asrı Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asrn Val Gin Ser Lys 1 5 16 15 Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 20 25 30
<210> 146
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> €223> peptide
<220>
<221> VARTANT
<222> 17
<223> pyroglutamate
<400> 146
Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro
1 5 16 15
Xaa Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg 20 25 30
<210> 147
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
117 / 246
SS N 8
<221> VARIANT <222> 18 <223> pyroglutamate
<400> 147
Arg Glu Asrnı Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr
1 5 10 15
Lys Xaa Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Pro Ser Pro Arg His Leu 20 25 30
<210> 148
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARILANT
<222> 22,26
<223> pyroglutamate
<400> 148
Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly
1 5 10 15
Tyr Ser Ser Pro Gly Xaa Ser Pro Gly Xaa Thr Pro Giy Ser Arg Ser 20 25 30
<210> 149 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<2202 <223» peptide
<400> 1409
val Pro Gliy Gly Gly Ser Val Gin Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu 1 5 19 15
Ser Lys
<216> 150
<211> 7
PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
118 / 246
<400> 150
Lys His Gin Pro Gly Gly Gly 1 5
<210> 151
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 151 Lys His Val Pro Gly Gly Gly 1 5
<210> 152
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 152 His His Val Pro Gly Gly Gly 1 5
<210> 153
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 153 Thr His Val Pro Gly Gly G1ly 1 5
<210> 154 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide <220>
<221> VARIANT <222> 3,7
119 / 246
<223> pyroglutamate
<400> 154 Pro Gly Xaa Ser Pro Gly Xaa Thr Pro Gly 1 5 18
<210> 155
4211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 155 Pro Gly Asp Pro Gly Glu Pro Gly 1 5
<210> 156
9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 156 Ser Pro Gly Asp Pra G1ly Glu Pro Gly 1 5 <210> 157 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> VARIANT <222> 3,6 <223> pyroglutamate <400> 157 Ser Arg Xaa Thr Pro Xaa Ser Leu Pro Thr Pro 1 5 18 <210> 158 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence 120 / 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 156 Ser Pro Gly Asp Pra G1ly Glu Pro Gly 1 5
<210> 157 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 3,6
<223> pyroglutamate
<400> 157 Ser Arg Xaa Thr Pro Xaa Ser Leu Pro Thr Pro 1 5 18
<210> 158
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
120 / 246
SS N 8
42205 <223> peptide
<400> 158 Ser Arg Glu Pro Asp Leu Pro Thr Pro 1 5
<210> 159
<211> 7
<212> PRT
Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 159 Ser Arg Glu Pro Asp Leu Pro 1 5
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 5
<223> pyroglutamate
<400> 160 Pro Ser Leu Pro Xaa Thr Pro Pro Thr Arg 1 5 16
<210> 161
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 2,6
<223> pyroglutamate
<400> 161
Pro Xaa Ser Leu Pro Xaa Thr Pro Pro Thr Arg 1 5 18
121 / 246
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<406> 162 Pro Ser Leu Pro Glu Pro Pro Thr Arg 1 5
<210> 163
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 163 Pro Asp Leu Pro Glu Pro Pro Thr Arg 1 5
<210> 164
<711> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 4
<223> pyroglutamate
<400> 164 Val Tyr Lys Xaa Ser Pro Val Val Ser Gly Asp 1 5 10
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> ÄArtificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 165
Val Tyr Lys Asp Pro Val Val Ser Giy 1 5
122 / 246
SS N 8
<210> 166 <211>7 16 <212> PRT <213> Ärtificial Sequence
<228> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 4,13
<223> pyroglutamate
<400> 166 Val Tyr Lys Kaa Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Xaa Ser Pro Arg 1 5 19 15
<210> 167 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 167 Val Tyr Lys Asp Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Asp Pro Arg 1 5 10
<216> 168 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223%> pyroglutamate
<400> 168 Pro Pro Ala Pro Lys Xaa Thr Pro Pro Ser Ser Gly 1 5 18
<219> 169 <211> 11 4212> PRT <213> Artificial Sequence
123 / 246
SS SS 8
<220> <223> peptide
<400> 169 Pro Pro Ala Pro Lys Glu Pro Pro Ser Ser Gly 1 5 10
<210> 1706
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> pyroglutamate
<400> 170 Lys Val Ala Val Val Arg Xaa Thr Pro Pro Lys 1 5 10
<2180> 171
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 171 Lys Val Ala Val Val Arg Glu Pro Pro Lys Ser 1 5 10
<210> 172 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide <220> <221> VARIANT
<222> 18,27 <223> pyroglutamate
<400> 172 Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr
124 / 246
1 5 10 15
Lys Xaa Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Xaa Ser Pro Arg His Leu 20 25 30
<210> 173
<211> 30
<212> PRT
<213> Ärtificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 173 Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr 1 5 10 15 Lys Asp Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Asp Pro Arg His Leu 20 25 30
<219> 174
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223>+ peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 8,17
<223> pyroglutamate
<400> 174 Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Xaa Ser Pro Val Val Ser Giy Asp Thr 1 5 10 15 Xaa Ser Pro Arg His Leu 20
<210> 175 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequernce
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 6,15
<223> pyroglutamate
<400> 175
125 / 246
Glu Ile Val Tyr Lys Xaa Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Xaa Ser
1 5 10 15 Pro Arg Mis Leu 20 <218> 176 <211> 260 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223>% peptide
<400> 176 Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Asp Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Asp 1 5 18 15 Pro Arg His Leu 28
<210> 177 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223* peptide
<400> 177
Glu Ile Val Tyr Lys Asp Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Asp Pro Arg 1 5 10 15
His Leu
<210> 178 <211> 16€ <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 5
<223> pyroglutamate
<400> 178 Asp Met Val Asp Xaa Ser Pro Gln Leu Ala 1 5 10
<210> 179
<211> 9 <212> DRT
126 / 246
SS N 8
<213> Artificial Sequence
<2208> <223> peptide
<4060> 179 Asp Met Val Asp Asp Pro GlIn Leu Ala 1 5
<216> 180
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> pyroglutamate
<400> 180 Val Asp Xaa Ser Pro Gln Leu Ala 1 5
<210> 181
7 4212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 4223> peptide <400> 181 Val Asp Asp Pro Gln Leu Ala 1 5 <210> 182 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 4400> 182 His Val Pro Gly Gly Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly 1 5 10 15 Asrn Lys Lys Ile Glu 20 127 / 246
4212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 4223> peptide
<400> 181 Val Asp Asp Pro Gln Leu Ala 1 5
<210> 182 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
4400> 182
His Val Pro Gly Gly Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly 1 5 10 15
Asrn Lys Lys Ile Glu
20
127 / 246
SS N 8
<2180> 183
<211> 5
<212> PRFT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 183 His Val Pro Gly Gly 1 5
<210> 184
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 184 ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala 1 5 10
<210> 185 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 185 Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu 1 5 10
<210> 186
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide <400> 186 Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser 1 5 18 15 Leu Leu Pro Asp Ser Pro 20 «210> 187 <211> 17
128 / 246
SS N 8
<212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223>7 peptide
<400> 187
Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu 6ln 1 5 10 15
Pro
<210> 188 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 188 Giy Glu Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala 1 5 18 15 Ser Leu Leu Gly Leu Ser Glan Leu Leu Gin Pro 20 25
<210> 189 <211> 19 <2312> PRT <213> Artificial Sequence
<220>
peptide
<400> 189
Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro 1 5 16 15
Ser Gln Pro
<210> 190
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 190
Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro 1 5
129 / 246
<21080> 191
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 191 Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala 1 5
<210> 192
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 192 Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser 1 5 10 15 Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly 268 25 30 Leu Ser Gin Leu Leu Gln Pro 35
<210> 193
<211> 6
€212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 193 Leu Leu Pro Asp Ser Pro 1 5
<210> 194
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 194
Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr G6ly Glu Pro Ser Leu Leu Pro Asp 1 5 19 15
Ser Pro Val Ala Gin Leu His Ala Ser Leu Leu Gly
130 / 246
20 25
<210> 195 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 195
Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser
1 5 19 15
Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu Leu GLy 20 25 30
<210> 196
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223>7 peptide
<400> 196 Gln Pro Glu Gly His His Trp 1 5
<210> 197 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 197 Leu Pro Asp Ser Pro Val Giy Gin Leu Mis Ala Ser Leu Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ser Gln Leu Leu Gin 20
<210> 198 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 131 / 246
<220> <223> peptide
131 / 246
SS N 8
<400> 198 Gin Cys 6l1n Gln Leu Ser Gin Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala 1 5 10 15 His Pro Leu Val 20
<210> 199 <211> 14 <212> PRT <2437 Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 199 Gly His Met Asp Leu Arg Gliu Glu Gly Asp Glu Glu Thr Thr 1 5 10
<210> 200 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 200
Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val 6G1ly 6ln Leu His Ala Ser Leu Leu GLy 1 5 19 15
Leu Ser Gln
<210> 201 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <2237 peptide
<400> 201 Leu Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val 1 5 10 15 Ala Ala Arg Val 20
<210> 202 <211> 16
<212> PRT <213> Artificial Sequence
<220>
132 / 246
SS N 8
<223> peptide
<460» 202 Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser 1 5 18 15
<210> 203
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 203 Gly His His Trp Glu Thr Gin Gin Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gin 1 5 10 15 Pro Trp Gln Arg Leu 20
<210> 204 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 204 Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln 1 5 10
<210> 205
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 205 Thr Gin Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln 1 5 18
<210> 206 <211> 19
<212> PRT <213> Artificial Sequence
<220>
133 / 246
<223> peptide
<400> 266 Gin Pro Glu Gly HMis Mis Trp Glu Thr Gln Gin Ile Pro Ser Leu Ser 1 5 18 15
Pro Ser Gln
<210> 207 <211> 218 <212> PRT <2132 Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 207
Gin Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln Gin Ile Pro Ser Leu Ser 1 5 18 15
Pro Ser
<210> 208
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 208 Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu 1 5 10 15 Lys Asp Gin Lys Glu Pro Lys Asrı Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu 20 25 30
<210> 209
<211> 211
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 209 Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gliy 1 5 18
<210> 210 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence
134 / 246
<220> <223> peptide
<400> 210 Met Cys His Gin Gin Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 29 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gliy Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gin 50 55 60 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 75 BO Glu Phe Gly Asp Ala G1ly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 85 99 95 Leu 5er His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gin Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 1415 120 125 Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 130 135 140 Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser 165 170 175 Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asrı Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu 139 1835 190 Cys Gin Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 195 200 205 Glu Val Met Val Asp Ala Val His LysSs Leu Lys Tyr Glu Asnı Tyr Thr 210 215 220 Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 225 230 235 240 Leu Gin Leu Lys Pro Leu Lys Asrı Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp 245 250 255 Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr 260 265 2768 Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg 275 280 285 Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asıy Ala 290 295 306 Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser 305 319 315 320 Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 325
<210> 211 <211> 21 z2212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
135 / 246
<400> 211 Ser Val Asrı Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala 1 5 10 15 Pro Asp Arg Val Leu 28
<218> 212 <211> 335 <212% PRT <213> Artificial Sequence
4220> <223> peptide
<400> 212 Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asrı Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Giu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln 50 55 60 Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu TYhr Ile Thr Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gin Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr 85 98 95 Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asrı Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asrn Lys Thr Phe Leu Lys Cys 115 1206 125 Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln 130 135 140 Arg As Met Asp Leu Lys Phe Asrn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro 145 150 155 160 Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys 165 170 175 Val Thr Leu Asp Gin Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln 180 185 199 Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu 195 200 2085 Ala Leu Glu Ala Arg Gin Gin Asrı Lys Tyr Glu Asa Tyr Ser Thr Ser 218 215 220 Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln 225 238 235 240 Met Lys Pro Leu Lys Asrı Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro 245 250 255 Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val 260 265 270 Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys 275 280 285 Asn Gin Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln 290 295 300 Cys Lys Gly Gly Asrn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asrı
136 / 246
305 310 315 320 Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser
325 330 335 <210> 213 <211> 20 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 213 His Ser Gly Gin Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val 1 5 10 15 Pro His Pro Arg 20
<210> 214
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 214 Giy Ala Gly Arg Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro 1 5 10
<210> 215 <2211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 215 Ala Val Ser Val Asrı Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gin 1 5 10 15 Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gin Gin Gln Gly Leu 20 25 30 Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro 35 40 <210> 216 <211> 4 <212> PRT
<2313> Artificial Sequence
<220>
137 / 246
SS SS 8
<223> peptide
<480> 216 Ser Val Asrnı Pro 1
<210> 217
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 4/223> peptide
<400> 217 Gin Gin Gin Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly 1 5 10
<210> 218 <211> 11 4212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 218 Gin Gin Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly 1 5 16
<210> 219
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
22205 <223> peptide
<400> 219
Gin Gin Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu Gly 1 5 10 <210> 220
<211> 11
<212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 220 Gin Gin Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu Gly
138 / 246
1 5 19
<210> 221
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 221 Gin Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly 1 5 18
<210> 222
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 222 Gin Gin Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly 1 5 10
<210> 223
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 223 Gin Gin Gin Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu 1 5 19
<210> 224
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 224 Gin Gin Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu 1 5 18 <210> 225 <211> 14
139 / 246
<212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 225 His Ser Gly Gln Gin Gin Gly Leu Pro Arg Ala Ala GlLy Gly 1 5 10
<210> 226 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<4008> 226 His Ser Gly Gln Gln Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly 1 5 16
<210> 227 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 227 His Ser Gly Gln Gin Gin Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu Gly L 5 310
<210> 228 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 228 His Ser Gly Gln Gln Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu Gly 1 5 ig
<210> 229 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
140 / 246
<220> <223> neptide
<400;> 229 Gin Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly 1 5 10
<210> 230
13 <212> DPRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 230 Gly Ser Ala Gin Ser Gin Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu 1 5 10 <210> 231 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <408> 231 Trp Pro Gly Pro Pro Glu Leu Asp Val 1 5 <210> 232 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 232 Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asrı Thr Asp Thr Phe Glu Ser 1 5 10 15 Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Giy Ala Ser Cys Val 20 25 30 233 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 141 / 246
<212> DPRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 230 Gly Ser Ala Gin Ser Gin Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu 1 5 10
<210> 231
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<408> 231 Trp Pro Gly Pro Pro Glu Leu Asp Val 1 5
<210> 232
31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 232 Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asrı Thr Asp Thr Phe Glu Ser 1 5 10 15 Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Giy Ala Ser Cys Val 20 25 30 233 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 141 / 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 232 Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asrı Thr Asp Thr Phe Glu Ser 1 5 10 15 Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Giy Ala Ser Cys Val 20 25 30
233 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
141 / 246
<400> 233 Ala Cys Pro Tyr As Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu 1 5 18 15 Val Cys Pro Leu His Asrn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln 20 25 30 Arg Cys Glu Lys 35
<210> 234
<211> 19
<212> DRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 234
Cys Pro Leu His Asrn Gin Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Glin Arg 1 5 10 15
Cys Glu Lys
<210> 235 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 235
Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly 1 5 10 15
Val Glu
<210> 236
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 236
Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asrn Thr Thr Pro Val Thr 1 5 10 15
Gly Ala
<2108> 237 <211> 14
142 / 246
SS N 8
<212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 237 Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asrı Pro Gln Leu Cys 1 5 108
<210> 238 <211> 21 <212> PRT <213> Artificlial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 238 Tyr Asrı Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asrı Pro Glu Gly Arg Tyr 1 5 10 15 Thr Phe Gly Ala Ser 20
<210> 239 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 239 Pro Glu Ser Phe Asp Giy Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gin 1 5 10 15 Pro G6lu Gin Leu Gln 20
<210> 240
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 240
Pro His Gin Ala Leu Leu His Thr Ala Asrı Arg Pro Glu Asp Glu 1 5 10 15
<210> 241 <211> 17
143 / 246
<212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 241
Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala ÄArg His 1 5 10 15
Cys
<210> 242 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223% peptide
<400> 242 Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys 1 5 18
<7210> 243 <211> 18 <2125> PRT <213> Artificial Sequence
< 2202 <223> peptide
<400> 243
Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln 1 5 18 15
Pro Cys
<210> 244 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 244
Arg Val Leu Gin Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asrı Ala Arg His Cys 21 5 10 15
144 / 246
SS N 8”
<210> 245 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 245 Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys 1 5 18
4210> 246 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 246
Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gin 1 5 16 15
Pro
<210> 247 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 247 Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys 1 5 18
<210> 248 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220>
<223* peptide
<400> 248
Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asrn Thr Ala Pro Leu Gin 1 5 10 15
Pro Arg Val Leu Gin Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asrn Ala Arg His
20 25 30 ser Leu Pro Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala
145 / 246
SS N 8”
35 40 45 Cys
<216> 249 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 249 Arg Val Leu Gln Giy Leu Pro Arg Giu Tyr Val Asrn Ala Arg His Ser 1 5 10 15 Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asrı Thr Ala Pro Leu Gin 20 25 30 Pro Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Gilu Gly Ala Cys 35 40 45 <210> 250 <211> 12 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 258 Cys Gin Met Trp Ala Pro Gin Trp Gly Pro Asp Cys 1 5 18
<216> 251 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<4006> 251 Cys Lys Leu Tyr Trp Ala Asp Gly Glu Leu Thr Cys 1 5 10
<210> 252
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
146 / 246
<400> 252 Cys Val Asp Tyr His Tyr Glu Giy Thr Ile Thr Cys 1 5 10
<210> 253 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 253 Cys Gln Met Trp Ala Pro Gin Trp Giy Pro Asp Cys 1 5 10
<210> 254
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 254 Cys Lys Leu Tyr Trp Ala Asp G1iy Glu Leu Thr Cys 1 5 10
<210> 255 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 255 Cys Lys Leu Tyr Trp Ala Asp Giy Glu Phe Thr Cys 1 5 10
<210> 256
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide <400> 256
Cys Val Asp Tyr His Tyr Glu Giy Thr Ile Thr Cys 1 5 18
147 / 246
SS SS 8
<210> 257 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence
A220 <223> peptide
<400> 257 Cys Val Asp Tyr His Tyr Glu Gly Ala Ile Thr Cys 1 5 18
<210> 258
<211> 215
<212> PRT
<213> ÄArtificial Sequence
<220> £223> peptide
<400> 258 Arg Leu Val Pro Val Gly Leu Glu Arg Gly Thr Val Asp Trp Val 1 5 10 15
<210> 259 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> £223> peptide
<400> 259 Thr Arg Trp Gln Lys Gly Leu Ala Leu Gly Ser Gly Asp Met Ala 1 5 18 15
<210> 260
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<409> 260 Gin Val Ser His Trp Val Ser Gly Leu Ala Glu Gly Ser Phe Gly 1 5 18 15
<210> 2561
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
148 / 246
<220> <223> peptide
<400> 261 Leu Ser His Thr Ser Gly Arg Val Glu Gly Ser Val Ser Leu Leu 1 5 10 15
<210> 262
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 262 Leu Asp Ser Thr Ser Leu Ala Gly Gly Pro Tyr Glu Ala Ile Glu 1 5 19 15
<210> 263
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 263 His Val Val Met Asn Trp Met Arg Glu Glu Phe Val Glu Glu Phe 1 5 10 15
<210> 264
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 264 Ser Trp Ala Ser Gly Met Ala Val Gly Ser Val Ser Phe Glu Glu 1 5 10 15
<210> 265 <211> 15 <212> PRT <213> ÄArtificial Sequence
<220> <223> peptide
149 / 246
SS N 8
<400> 265 Gin Val Ser His Trp Val Ser GLy Leu Ala Glu Gly Ser Phe Gly 1 5 10 15
<210> 266
<211> 15
<2127 PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 266 Leu Ser His Thr Ser Gly Arg Val Glu Gly Ser Val Ser Ley Leu 2 5 18 15
<210> 267 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 267 Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asr 3 5 18 15 Pro Gln Leu Cys 20
<210> 268 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 26B Val Leu Ile Gin Arg Asrı Pro Gin Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu 1 5 10 15 Trp Lys Asp Ile 20
<210> 269 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
150 / 246
SS N 8
<400> 269 Yyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asrı Asrı Gln 1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr 20
<210> 270 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 270 Phe His Lys Asrn Asrı Gin Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asrı Arg 1 5 10 15 Ser Ärg Ala Cys 20
<216> 271 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 271 Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arp Ala Cys His Pro Cys Ser Met Pro 1 5 10 15 Cys Lys Gly Ser 20
<210> 272 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 272 His Pro Cys Ser Met Pro Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser 1 5 18 15 Ser Glu Asp Cvs 20
<216> 273 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence
151 / 246
<220> <223> peptide
<400> 273 Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp CySs Gln Ser Leu Thr Arg Thr 1 5 10 15 Val Cys Ala Gly 20
<210> 274 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 274 Gln 5er Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys 1 5 10 15 Gly Pro Leu Pro 20
<210> 275 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 275 Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu % 5 10 15 Gln Cys Ala Ala 20
<210> 276 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 276
Thr Asp Cys Cys His Giu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys 1 5 16 15
His Ser Asp Cys
26
152 / 246
<210> 277 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 277 Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe
1 5 10 15 Asrı His Ser Gly 29 <210> 278 <211> 20 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
4220> <223> peptide
<400> 278 Leu Ala Cys Leu His Phe Asrı His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys 1 5 10 15 Pro Ala Leu Val 20
<210> 279 <711> 20 <212> PRT <213> ÄArtificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 279 Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asrı Thr Asp Thr 1 5 10 15 Phe Glu Ser Met 20
<216> 280 <211> 20 <212> PRT Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 280 Thr Tyr Asıı Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
153 / 246
SS N 8
1 5 18 15 Tyr Thr Phe Gly 20 <210> 281 <211> 20 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 281 Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala 1 5 18 15 Cys Pro Tyr Asrı 208
<210> 282 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 282
Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr As Tyr Leu Ser Thr Asp 1 5 18 15
Val Gly Ser
<210> 283 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 283 Pro Tyr Asrı Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys 1 5 16 15 Pro Leu His Asrı Gin Glu 28
<210> 284
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
154 / 246
<223> peptide
<400> 284 Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gin Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly 1 5 10 15
The Gln Arg
<210> 285 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence
4220> <223> peptide
<400> 285 Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gin Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro 1 5 10 15 Cys Ala Arg Val 20
4210> 286 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 286 Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met 1 5 18 15 Glu His Leu Arg 20
<210> 287 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence
4223> peptide <400> 287 Tyr 6ly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Yal Thr Ser 1 5 10 15 Ala Asn Ile <210> 288 <211> 19 <212> PRT 155 / 246
<400> 287
Tyr 6ly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Yal Thr Ser 1 5 10 15
Ala Asn Ile
<210> 288 <211> 19 <212> PRT
155 / 246
SS N 8”
<213> Artificial Sequence
<228> <223> peptide
<400> 2BB
Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gin Glu Phe Ala Gly Cys 1 5 16 35
iys Lys Ile
<210> 289
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
2400> 289 iys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe 1 5
<210> 2090
4211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
4220> <223> peptide
<4090> 290 Gly Ser Leu Ala FPhe Leu Pro Glu Ser 1 5
<210> 291 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 291 Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser 1 5 19
4210> 292 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence
156 / 246
<220> <223> peptide
<400> 292 Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp 1 5 10
<210> 293 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 293
Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu 1 5 10 15
Ser Phe Asp
<210> 294
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 294 Gin Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu 1 5 10 15 Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp 20
<210> 295 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 295 Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys % 5 10
<210> 296 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence
157 / 246
<220> <223> peptide
<400> 296 Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg 1 5 108 15
Ala Glu Leu
<210> 207
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<4090> 297 Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asrn Pro Pro 1 5 16 15
<210> 298
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
z400> 208 Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asrnı Pro Pro Thr Phe Ser 1 5 10 15
<210> 299 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 299
Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 S 18
<210> 300
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
158 / 246
SS N 8”
<2323> peptide
<400> 300 Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala 1 5 10 15
<210> 301 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 361
Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu Asrn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro 1 5 10 15
LyS Asp Leu
<210> 302 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 3082
Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg 1 5 10 15
Ala Glu Leu
<210> 363 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 303 As Tyr Ser Leu Asp Lys Ile Ile Val Asp Tyr As Leu Gln Ser Lys
1 5 10 15 Ile Thr Leu Pro 20 <210> 304 <211> 208 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
159 / 246
<220> <223> peptide
<400> 304 Leu Ile Asrnı Ser Thr Lys Ile Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser 1 5 19 15 Lys Val Asn Gin 20
<210> 305 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 305 Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu Ser 1 5 18 15 Ile Ala Glu Ser 20
<210> 306
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 306 Asp Lys Glu Leu Ärg Ile 1 5
<210> 307
<2141> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 307 Asp Lys Glu Leu Arg Ile Asp 1 5
<210> 308
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
160 / 246
<220> <223> peptide
<400> 308 Asp Lys Glu Leu Ärg Ile Asp Ser 1 5
<210> 309
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <2237> peptide
<400> 309 Asp Lys Glu Leu Arg Ile Asp 5er Gly 1 5
<210> 310 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 310 Asp Lys Glu Leu Arg Ile Asp Ser Gly Tyr 1 5 18
<21080> 311
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 311 Ser Trp Glu Phe Ärg Thr 1 5
<218> 312
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
161 / 246
SS N 8
<400> 312 Ser Trp Glu Phe Arg Thr Asp 1 5
<210> 313
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 4223> peptide
<400> 313 Ser Trp Glu Phe Arg Thr Asp Ser 1 5
<210> 314
<211> 9
4212> PRT
<213> Artificial Sequence
4220> <223> peptide
<400> 314 5er Trp Glu Phe Arg Thr Asp Ser Gly 1 5
<210> 315 <211> 18 42125 PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 315 Ser Trp Glu Phe ÄArg Thr Asp Ser Gly Tyr 1 5 10
<210> 316
<211> 7
<212> PRT
<213% Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 316
Thr Leu His Glu Phe ÄArg His 1 5
162 / 246
SS N 8
<210> 317
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 317 Thr Leu His Glu Phe Lys His 1 5
<210> 318
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 318 Thr His Thr Asp Phe Arg His 1 5
<210> 319
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 319 Thr His Thr Asp Phe Lys His 1 5
<210> 320
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>» <223> peptide
<400> 320 Ala Glu Phe Lys His Asp 1 5
<210> 321
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
163 / 246
<220> <223> peptide
<400> 321 Ala Glu Phe Lys His Gly 1 5
<210> 322
<211> 6
<212> FPRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 322 Ser Glu Phe Arg His Asp 1 5
<210> 323
<211> 6
<2312> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 323 Ser Glu Phe Arg His Gly 1 5
<210> 324
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 324 Ser Glu Phe Lys His Asp 1 5
<2310> 325
<211> 6
<212% PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
164 / 246
<400> 325 Ser Glu Phe Lys His Gly 1 5
<210> 326
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 326 Ile Leu Phe Ärg His Gly 1 5
<210> 327
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 327 Ile Leu Phe Arg His Asp 1 5
<210> 328
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 328 Ile Leu Phe Lys His Giy 1 5
<210> 329
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 329
Ile Leu Phe Lys His Asp 1 5
165 / 246
<210> 330
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 330 Ile Arg Trp Asp Thr Pro 1 5
<210> 331
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 331 Ile Arg Tyr Asp Ala Pro Leu 1 5
<210> 332
<211> 7
<212>» PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 332 Ile Arg Tyr Asp Met Ala Gly 1 5
<210> 333 <211> 146 z212> PRT <213> Artificlial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 333 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45
166 / 246
SS N 8”
Val His Giy Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Gilu Gln Val Thr 50 55 60 Asrn Val Giy Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 79 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr G61y Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gin Leu Gly Lys Asrnı Glu G6Glu Gly Ala Pro Gin Glu Gly Ile 106 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asrnı Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 128 125 Ser Glu Giu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 136 135 140
<210> 334
7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 334 Asp Gln Pro Val Leu Pro Asp 1 5 <218> 335 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <4006> 335 Asp Gln Pro Val Leu Pro Asp Asn 1 5 <210> 336 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>% <223> peptide <400> 336 Asp Gln Pro Val Leu Pro Asp Asrnı Glu 1 5 <218>» 337 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence 167 / 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 334 Asp Gln Pro Val Leu Pro Asp 1 5
<218> 335
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<4006> 335 Asp Gln Pro Val Leu Pro Asp Asn 1 5
<210> 336
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>% <223> peptide
<400> 336 Asp Gln Pro Val Leu Pro Asp Asrnı Glu 1 5
<218>» 337 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence
167 / 246
<220> <223> peptide
<400> 337 Asp Gin Pro Val Leu Pro Asp Asn Glu Ala 1 5 18
<210> 338
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 338 Asp Gin Pro Val Leu Pro Asp Asrı Glu Ala Tyr 1 5 18
<210> 339 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 339 Asp Gin Pro Val Leu Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu 1 5 18
<210> 340
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 340 Asp Ser Pro Val Leu Pro Asp Gly 1 5
<210> 341
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
168 / 246
<400> 341 Asp His Pro Val His Pro Asp Ser 1 5
<210> 342
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 342 Asp Thr Pro Val Leu Pro Asp Ser 1 5
<210> 343
<211> 8
<212>* PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 343 Asp Ala Pro Val Thr Pro Asp Thr 1 5
<210> 344
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 344 Asp Ala Pro Val Arg Pro Asp Ser 1 5
<210> 345
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 345
Tyr Asp Arg Pro Val Gln Pro Asp Ärg 1 5
169 / 246
<210> 346
<2311> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>% <223> peptide
<400> 346 Gly Lys Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly 5er Lys Thr Lys 1 5 10 15
<210> 347
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 347 Lys Thr Lys Glu GlLy Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu 1 5 18 15
<210> 348 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220>% <223> peptide
<400> 348 Glu Gin Val Thr Asrn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr 1 5 18 15
<210> 349 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 349 Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gin Lys Thr Val Glu Gly Ala Gly 1 5 10 15 Asrn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 20 25
<210> 3560
170 / 246
SS N 8
<211> 15 <212% PRT <213> ÄArtificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 350 Met Pro Val Asp Pro Asp Asrı Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu 1 5 18 15
<210> 351
<211> 15
<212% PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 351 Asp Asrn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp 1 5 18 15
<210> 352
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 352 Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 1 5 18 15
<210> 353
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIÄANT
<222> 1
<223> 3-27 amino acids from the immunogenic peptide
<220>
<221>% VARTANT
<222> 2,3,4
<223> any amino acid
171 / 246
SS N 8”
<220>
4221> VARIANT
<222> 5
<223> N/D/A/Q/S5/R/G/L; preferred N/D, more preferred N
<220>
<221> VARETANT
<222> 6
<223> F/R/A/K/T/S/E; preferred F or R, more preferred R
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> F/R/A/K/V/S/Y; preferred F or R, more preferred R
<220>
<221> VAREANT
<222> 8
<223> any amino acid, preferred A/G/P/F, more preferred A
<220>
<221> VARIANT
<222> 9
<223> Eysteine or linker like NHNH2
<400> 353 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5
<210> 354
<211> 9
4212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VAREANT
<222> 1
<223> 3-27 amino acids from the immunogenic peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 2,3,7
<223> any amino acid
<220> <221> VARIANT
<222> 4,5 <223> any amino acid, preferred V,L,I,F,W,Y,H, more preferred V
<220> <221> VARIZANT
172 / 246
SS SS 8
<222> 6 <223> K,R, E, D, Q, N, preferabiy K, R more preferably R
<220>
<221> VARIANT
<222> 8
<223> any amino acid, preferred A
<220>
<221> VARIANT <222> 9
<223> preferred A
<400> 354 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5
<210> 355
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> 3-27 amino acids from the immunogenic peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 2,3
<223> any amino acid
<400> 355 Xaa Xaa Xaa Val Val Arg Ala Ala 1 5
<210> 356 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide <400> 356 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 1 5 16 15 Gly Val Thr Ser 20 <210> 357
173 / 246
SS N 8
<2141> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> 4223> peptide
<400> 357
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Pro 1 5 18 15
Pro Ala His
<210> 358
<214> 21
4212> PRT
<213> Artificial Sequence
4220> <223> peptide
<400> 358 Ser Ala Gln Ser Gin Arg Ala Pro Asp Arg Val 1 5 10
<210> 359 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 359 Ala Val Ser Val Asrı Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gin 1 5 10 15 Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gin Gly Leu 20 25 30 Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro 35 40 <210> 360 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 360 Gin Gin Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly 1 5 10
174 / 246
<210> 361 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 361 Gin 6ln Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly 1 5 18
<210> 362
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 362 Gin 6Gln 6ln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu Gly 1 5 18
<210> 363 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 363 Gin Gin Leu GLy Leu Pro Arg Ala Ala Glu Gly 1 5 16
<210> 364
<211> 19
<212> PRT
<213;> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 364 Gin Gin G6ln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly 1 5 10
<210x 365
<211> 10 <212> PRT
175 / 246
SS N 8”
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 365 Gin Gin Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Giy 1 5 18
<210> 366 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 366 Gin Gin Gin Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu 1 5 10
<210> 367 <211> 24 <212> PRT €213> Artificial Sequence
<220> <223>» peptide
<400> 367 Gin Gin Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu His Ser Gly Gln Gin Gln 1 5 18 15 Giy Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly 20
<210> 368 <2117% 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 368 His Ser Gly 6ln Gln Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly i 5 10
<2109> 369 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
176 / 246
<220> <223> peptide
<400> 369 His 5er Gly Gin Gln Gin Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu Gly 1 5 18
<210> 3708 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 370 His Ser Gly Gln Gin Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala GIu Gly 1 5 18
<210> 371 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 371 Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly 1 5 160
<210> 372 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 372 Gly Ser Ala Gin Ser Gin Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu 1 5 10 <210> 373 <211> 9 212% PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 177 / 246
<220> <223> peptide
<400> 372 Gly Ser Ala Gin Ser Gin Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu 1 5 10
<210> 373
<211> 9
212% PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
177 / 246
<400> 373 Trp Pro Gly Pro Pro Glu Leu Asp Val 1 5
<210> 374
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 374 Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asrı Thr Asp Thr Phe Glu Ser 1 5 10 15 Met Pro Asrn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val 28 25 36
<210> 375 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide <400> 375 Ala Cys Pro Tyr Asrı Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu 1 5 19 15 Val Cys Pro Leu His As Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr G1ln 20 25 30 Arg Cys GIlu LysS 35 <218> 376 <2Z11> 19 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400Q> 376
Cys Pro Leu His Asrı Gln Glüu Val Thr Ala Giu Asp Gly Thr Gln ÄArg 1 5 18 15
Cys Glu Lys
<210> 377 4211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence
178 / 246
<220> <223> peptide
<400> 377
Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Giy 1 5 10 15
Val Glu
<210> 378 <211> 1255 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 378 Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 18 15 Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 20 25 30 Leu Arg Leu Pro Ala 5er Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 35 40 45 Leu Tyr G1ln Gly Cys Gln Val Val Gin Gly Asrn Leu Glu Leu Thr Tyr 56 55 6Q Leu Pro Thr Asın Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val 65 76 75 20 Gin Gly Tyr Val Leu Ile Ala His As Gln Val Arg Gln Val Pro Leu 85 90 95 Gin Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gin Leu Phe Glu Asp Ast Tyr 190 105 11€ Ala Leu Ala Val Leu Asp Asrı Gly Asp Pro Leu Asrnı Asrı Thr Thr Pro 115 120 125 Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser 130 135 140 Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Zle Gln Arg Asn Pro Gin 145 150 155 160 Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn 165 170 175 Asn Gin Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asnı Arg Ser Arg Ala Cys 180 185 190 His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser 195 200 205 Ser Glu Asp Cys Gin Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys 2168 215 220 Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys 225 230 235 240 Ala Ala G1ly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu 245 250 255 His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val 260 265 278 Thr Tyr As Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asrn Pro Glu Gly Arg 275 280 285
179 / 246
Typ Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asırı Tyr Leu 290 295 300 Ser Thr Asp Val Gliy Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln 305 310 315 320 Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gin Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys 325 330 335 Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr 6ly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu 340 345 350 Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys LysS 355 360 365 Lys Ile Phe Gly 5er Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp 370 375 380 Pro Ala Ser Asrnı Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gin Val Phe 385 390 395 400 Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro 405 410 415 Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asrn Leu Gin Val Ile Ärg 420 425 430 Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gin Gly Leu 435 440 445 Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly 456 455 460 Leu Ala Leu Ile His His Asrı Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val 465 470 475 480 Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asrı Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr 485 490 495 Ala As Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His 500 505 510 G6ln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gin Cys 515 520 525 Val Asrn Cys Ser Gin Phe Leu Arg Gly Gin Glu Cys Val Glu Glu Cys 530 535 540 Arg Val Leu G6ln Giy Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asrnı Ala Arg His Cys 545 550 555 560 Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asrı Gly Ser Val Thr Cys 565 570 575 Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp 580 585 590 Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu 595 600 605 Ser Typ Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln 6106 615 620 Pro Cys Pro Ile Asrn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys 625 530 635 640 Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser 645 650 655 Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly 660 665 670 Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Mer Arg 675 580 685 Arg Leu Leu Gln Gliu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly 690 695 700 Ala Met Pro Asrn Gin Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu 705 710 715 720 ÄArg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys 725 730 735
180 / 246
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asrı Val Lys Ile Pro Val Ala Ile 740 745 750 Lys Val Leu Arg Glu Asrı Thr Ser Pro Lys Ala Asrnı Lys Glu Ile Leu 755 760 765 Asp Glu Ala Tyr Val Mer Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg 770 775 780 Ley Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gin Leu Val Thr Gin Leu 785 790 795 800 Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Ärg 305 810 815 Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly 820 825 830 Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala 835 840 345 Arg Asrı Val Leu Val Lys Ser Pro Asrı His Val Lvys Ile Thr Asp Phe 850 855 8360 Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp 865 870 875 880 Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg 885 890 895 Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val 908 905 910 iTrp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala 915 920 925 Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu ÄArg Leu Pro Gln Pro 930 935 940 Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met 945 o50 055 960 Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe 965 970 975 Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln As Glu 980 985 996 Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu 995 19060 1005 Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu 1918 1815 1920 Val Pro Gin Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala GlLy 1025 10930 1035 1940 Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly 1045 1056 1055 Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg 1060 18065 1076 Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly 1675 10980 1085 Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His 1990 1995 1189 Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu 1105 1110 1115 1120 Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln 1125 11306 1135 Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro 1140 1145 1158 Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu 1155 1160 1165 Arg Pra Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asrn Gly Val Val Lvys Asp Val 1170 1175 1188
181 / 246
SS N 8
Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val GlLu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln
1185 1199 1195 1200 Gly Giy Ala Ala Pro Gin Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala 1205 1218 1215 Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala 1220 1225 1236 Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asrı Pro Glu Tyr 1235 1240 1245 Leu Giy Leu Asp Val Pro Val 1250 1255 <210> 379 <211> 18 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 379
Ala Val Leu Asp Asrn Gly Asp Pro Leu Asrnı Asrn Thr Thr Pro Val Thr 1 5 19 15
Gly Ala
<218> 380 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 380 Leu Lys Gly GlLy Val Leu Ile Gin Arg Asrn Pro Gin Leu Cys 1 5 10
<2180> 381
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide <400> 381 Tyr Asrn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asrı Pro Glu Gly Arg Tyr 1 5 10 15 Thr Phe Gly Ala Ser 20 <210> 382 <211> 21
182 / 246
SS N 8
<212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 382 Pro Gilu Ser Phe Asp 6&ly Asp Pro Ala Ser Asrı Thr Ala Pro Leu Gin 1 5 10 15 Pro Glu Gin Leu Gin 20
<210> 383
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 383 Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asrı Arg Pro Glu Asp Glu 1 5 10 15
<210> 384 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 384
Cys Arg Val Leu Gin Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His 1 5 10 15
CySs
<210> 385 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 385
Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys 1 5 18
<210> 386 <211> 18
183 / 246
<212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 386
Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asrn Thr Ala Pro Leu Gin 1 5 18 15
Pro Cys
<210> 387 <211* 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 387 Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val As Ala Arg His Cys 1 5 19 15
<210> 388 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 388 Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys 1 5 10
<210> 389
<211> 17
PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 389
Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asrı Thr Ala Pro Leu Gln 1 5 19 15
Pro
184 / 246
<210> 396 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 390 Arg Val Leu Gln Giy Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asrnı Ala Arg His Cys 1 5 19 15
<218> 391 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 391 Yyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys 1 5 19
<210> 392 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 392
Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gin
1 5 10 15
Pro Arg Val Leu Gin Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His
20 25 30
Ser Leu Pro Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala 35 40 45
Cys
<210> 393
<211> 47
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
185 / 246
SS N 8
<400> 393 Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asrnı Ala Arg His Ser 1 5 10 15 Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gin 20 25 30 Pro Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys 35 40 45 <210> 394 <211> 23 <212> PRT
<313> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 394 Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gin Arg Asn 1 5 18 15 Pro Gln Leu Cys Ask Asx Asx 20
<210> 395
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <2237 peptide
<400> 395 Val Leu Ile Gin Arg Asrı Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Iie Leu 1 5 10 15 Trp Lys Asp Ile Asx Asx Asx 20
<210> 396
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 396 Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asrn Gin 1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Asx Asx Asx 26
<2180> 397
<211> 23 <212> PRT
186 / 246
SS N 8
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<4008> 397 Phe His Lys Asn Asrn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asrnı Arg 1 5 18 15 Ser Arg Ala Cys Asx Ask Asx 28
<210> 398
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 398 Leu Ile Asp Thr Asrnı Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Met Pro 1 5 18 15 Cys Lys Giy Ser ASX AsX Asx 20
<210> 390
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Seguence
<220> <223> pepkide
<400> 399 His Pro Cys Ser Met Pro Cys Lys Giy Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser 1 5 18 15 Ser Glu Asp Cys Asx Asx Asx 28
<210> 400
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 400
Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr 1 5 10 315
Val Cys Ala Gly Asx Asx Asx
20
187 / 246
<210> 481
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> veptide
<400> 401 Gin Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala G6Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys 1 5 10 15 Gly Pro Leu Pro Asx Asx Asx 20
<210> 402 <211> 23 PRT <213> Artificial Sequence
4220> <223> peptide <400> 402 Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu 1 5 19 15 Gin Cys Ala Ala Asx Asx Asx 20 <210> 403 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> peptide <400> 403 Thr Asp Cys Cys His Glu Gin Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lyss 1 5 18 15 His Ser Asp Cys Ask AsxX Asx 20 <210> 404 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 404 188 / 246
<213> Artificial Sequence <220> <223> peptide
<400> 404
188 / 246
Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe
1 5 10 15 Asn His Ser Gly Asx Ask Asx 28 <210> 405 <211> 23 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 405 Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys 1 5 18 15 Pro Ala Leu Val Asx Asx Asx 20
<210> 406
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223>7 peptide
<400> 406 Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asrı Thr Asp Thr 1 5 10 15 Phe Giu Ser Met Asx Asx Asx 26
<216> 407
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 407 Thr Tyr Asrnı Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly ÄArg 1 5 10 15 Tyr Thr Phe Gly Asx ASsx Asx 20
<210> 408
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
189 / 246
SS N 8
<220> <4223> peptide
<400> 408 Pro Asrn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala 1 5 10 15 Cys Pro Tyr Asn Asx Asx Asx Giy Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro 29 25 30 Tyr Asrı Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Asx AsSx Asx 35 40 45
<2180> 409
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
4220> <223> peptide
<408> 409 Pro Tyr Asrn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys 1 5 19 15 Pro Leu His Asrı Gin Glu Asx ASsx Asx 20 25
<210> 410 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 410 Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asrn Gin Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly 1 5 10 15 Thr Gin Arg Asx Asx Asx 20
<210> 411 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 411
Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gin Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro 1 5 10 15
Cys Ala Arg Val Ask AsxX Ask
29
190 / 246
SS N 8
<210> 412
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
4220> 4223> peptide
<400> 412 Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gliy Met 1 5 19 15 Glu His Leu Arg Asx ÄAsx Asx 208
<210> 413
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 413 Tyr Gliy Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser 1 5 19 15 Ala Asrı Ile Asx Asx Ask 28
<210> 414
<211> 22
€212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 414 Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gliy Cys 1 5 19 15 Lys Lys Ile Asx Asx Asx 28
<210> 415
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 415 Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe
191 / 246
<210> 416
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 416 Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Gliu Ser 1 5
<210> 417 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 417 Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser 1 5 18
<210> 418 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 418 Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp 1 5 10
<210> 419
19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 419 Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu 1 5 16 15 Ser Phe Asp 192 / 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 419
Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu 1 5 16 15
Ser Phe Asp
192 / 246
<210> 420
<211> 23
<212> PRT
Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 420 Gin Gilu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu 1 5 19 15 Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp 20
<210> 421 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 421 Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp 1 5 19
<210> 422
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 422
Giy Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg 1 5 10 15
Ala Glu Leu
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> pentide <400> 423
Giy Pro Ser Leu 1
193 / 246
SS N 8”
<210> 424 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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<220> <223* peptide
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194 / 246
260 265 270
Glu Val Glu Glu Pro Asrn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gin
275 280 285 Gin Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro
290 295 300
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<213> Artificial Sequence
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<400> 426
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Ala Glu Leu
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<211> 15
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<213> Artificial Sequence
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<211> 15
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<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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<220> <223> peptide
195 / 246
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<211> 19
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Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu Äsn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro 1 5 18 15
Lys Asp Leu
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<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gin Ile Lys Glu Ser Leu Arg 1 5 10 15
Ala Glu Leu
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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196 / 246
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Ile Leu Phe
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<211> 17
«212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 434
Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Ile 1 5 20 15
Asp
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197 / 246
SS N 8
4220> <223> peptide
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<212> PRT
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<220>
198 / 246
SS N 8
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<220>
199 / 246
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200 / 246
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201 / 246
SS N 8
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€212> PRT
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<220>
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<213> Artificial Sequence
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202 / 246
SS N 8
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<220>
<221> VARIANT
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<212> PRT
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203 / 246
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<212> PRT
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7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 465 His His Gln Lys Leu Val Phe 1 5 <210> 466 <211> © <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 204 / 246
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<211> ©
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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204 / 246
SS SS 8
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
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<220>
<223> veptide
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His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp 1 5 18
205 / 246
SS N 8
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€212> PRT
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206 / 246
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
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208 / 246
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209 / 246
SS N 8
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<213> Artificial Sequence
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<211> 6
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<213> Artificial Sequence
<220>
210 / 246
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 495 Ser Glu Phe Lys His Asp 1 5 <210> 496 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 496 Ser Glu Phe Lys His Gly
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 496 Ser Glu Phe Lys His Gly
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 496 Ser Glu Phe Lys His Gly
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 500
Ile Leu Phe Lys His Asp 1 5
<210> 501
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212 / 246
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<220> <223> peptide
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
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<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
213 / 246
SS N 8”
<220> <223> peptide
<220>
£221> VARIANT
<222> 2
<223> W, F, Yı H, D, E, N, Qor I
<220>
<221> VÄRTIANT <222> 7
<223> F, N, Yor W
<220>
<221> VARIANT <222> 10 <223> Hor K
<220>
<221> VARIANT
4222> 12
<223> A, D, or E (With the proviso that the oligoepeptide sequence is not AKFVAANTLKAAA)
<4090> 505 Ala Xaa Phe Val Ala Ala Xaa Thr Leu Xaa Ala Xaa Ala 1 5 18
<210> 506 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 1,13
<223> aliphatic aminog acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> L-cyclohexylalanine
<400> 506 Xaa Ala Xaa Ala Ala Ala Lys Thr Ala Ala Ala Ala Xaa 1 5 10
<210> 507 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence
214 / 246
<220> <223> peptide
<220>
VARIANT <222> 1,12 <223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine <400> 507 Xaa Ala Ala Ala Ala Lys Thr Ala Ala Ala Ala Xaa 1 5 18 <210> 508 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> VARIANT <222> 1,12 <223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> L-cyclohexylalanine <400> 508 Xaa Ala Xaa Ala Ala Ala Thr Leu Lys Ala Ala Xaa 1 5 10 <210> 509 <211> 11 <212> PRT 4213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> VARIANT <222> 1,11 <223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine <4006> 509 215 / 246
<222> 1,12
<223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine
<400> 507 Xaa Ala Ala Ala Ala Lys Thr Ala Ala Ala Ala Xaa 1 5 18
<210> 508
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 1,12
<223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> L-cyclohexylalanine
<400> 508 Xaa Ala Xaa Ala Ala Ala Thr Leu Lys Ala Ala Xaa 1 5 10
<210> 509
<211> 11
<212> PRT
4213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 1,11
<223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine
<4006> 509
215 / 246
SS N 8
Xaa Ala Ala Ala Ala Thr Leu Lys Ala Ala Xaa 1 5 108
<210> 510
<211> 23
<212> PRT
<2213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 21,13
<223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> L-cyclohexylalanine
<400> 510 Xaa Ala Xaa Val Ala Ala Ala Thr Leu Lys Ala Ala Xaa 1 5 10
<210> 511
€211> 212
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
€220> <223> peptide
<220>
<221> VARTIANT
<222> 1,12
<223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine
<400> 511 Xaa Ala Val Ala Ala Ala Thr Leu Lys Ala Ala Xaa 1 5 16
<210> 512 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
216 / 246
SS N 8
<2202
<221> VARIANT
<222> 1,13
<223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isocleucine and leucine
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> L-cycliohexylalanine
<468> 512 Xaa Ala Xasa Ile Ala Ala Ala Thr Leu Lys Ala Ala Xaa 1 5 10
<210> 513 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 1,12
<223> a is an aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine
<400> 513 Xaa Ala Ile Ala Ala Ala Thr Leu Lys Ala Ala Xaa 1 5 10
<210> 514
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 1,13
<223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isogleucine and leucine
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> L-CycClohexylalanine
<400> 514
217 / 246
SS SS 8
Xaa Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Xaa 1 5 10
<210> 515 <211> 12 z212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VAÄRIANT
<222> 1,32
<223> aliıphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and LlLeucine
<400> 515
Xaa Lys Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Xaa 1 5 19
<210> 516
<211> 13
4212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
1,13 <223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine <400> 516 Xaa Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala XKaa 1 5 10 <210> 517 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 517 Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys 1 5 218 / 246
<223> aliphatic amino acid residue selected from alanine, glycine, valine, isoleucine and leucine
<400> 516 Xaa Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala XKaa 1 5 10
<210> 517
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide <400> 517
Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys 1 5
218 / 246
SS N 8”
<210> 518
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 518 Met Pro Val Asp Pro Asp Asrn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu 1 5 10 15
<210> 519
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 519 Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp 1 5 19 15
<210> 520
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> €223> peptide
<400> 520 Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 1 5 19 15
<210> 521
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 521 Gly Lys Thr Lys Glu GIy Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys 1 5 10 15
<210> 522
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
219 / 246
<220> <223> peptide
<400> 522 Lys Thr Lys Giu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu 1 5 10 15
<210> 523
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 523 Glu Gln Val Thr Asrı Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr 1 5 19 15
<210> 524
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 524 Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Gly Ala Gly 1 5 10 15 Ast Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 20 25
<210> 525
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 525 Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu 1 5 10
<2108> 526
<211> 15
<212> FPRT
<213> Artificial Sequence
220 / 246
SS N 8
<2205> <223> peptide
<409> 526 Asp As Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp 1 5 10 15
<210> 527
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 527 Giu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gin Asp Tyr Gliu Pro Glu Ala 1 5 10 15
<210> 528 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 528 Glu Gln Val Thr Asrı Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr 1 5 10 15
<216> 529
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>% <223> peptide
<400> 529 Giy Lys Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys 1 5 10 15
<210> 530 <211> 15
<212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 530
221 / 246
Lys Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu 1 5 10 15
<210> 531
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 531 Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr 1 5 10 315
<210> 532 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<4006> 532 Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gin Lys Thr Val Glu Gly Ala Gly 1 5 18 15 Asrn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 28 25
<210> 533
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 533 Met Pro Val Asp Pro Asp Asrı Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu 1 5 18 15
<210> 534 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 534
Asp Asrı Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp 1 5 10 15
222 / 246
<210> 535 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 535 Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 1 5 16 15
<210> 536 <211> 14 <212> PRT <2137> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 536 Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asrı 1 5 10
<210> 537
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> 3-27 amino acids From the immunogenic peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 2,3,4
<223> any amino acid
<400> 537 Xaa Xaa Kaa Xaa Asn Arg Arg Ala 1 5
<210> 538
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
223 / 246
<220> <223> peptide
<400> 538 Val Asp Pro Asp Asrn Glu Ala Tyr Glu 1 5
4210> 539 <211> 26 4212> PRT <213> Artificial Sequence
4220> <223> peptide
<400> 539 Ast Glu Glu Gly Ala Pro Gin Glu Gly Ile Leu Glu Asp Met Pro Val 1 5 19 15 Asp Pro Asp Asrnı Glu Ala Tyr Glu Met Pro 28 25
<210> 540
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> peptide
<400> 540 Asp Asrı Glu Ala Tyr Glu Met 1 5
224 / 246

Claims (15)

SS SS Patentansprüche
1. Konjugat, bestehend aus oder umfassend mindestens ein B-Glucan und mindestens ein BZell- oder T-Zell-Epitop-Polypeptid, wobei das B-Glucan kovalent mit dem B-Zell- und/oder T-Zell-Epitop- Polypeptid konjugiert ist, um ein Konjugat aus dem ß-Glucan und dem B-Zellund/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid zu bilden, und wobei das B-Zell- und/oder T-Zell-EpitopPolypeptid ein alpha-Synuclein- Polypeptid ist, wobei das ßB-Glucan ein überwiegend lineares B-(1,6)-Glucan mit einem Verhältnis von (1,6)-gekoppelten Monosaccharideinheiten zu nichtB-(1,6)-gekoppelten Monosaccharideinheiten von mindestens 1:1 ist.
2, Konjugat nach Anspruch 1, wobei das ß-Glucan Pustulan ist.
3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei Verhältnis von (1,6)-gekoppelten Monosaccharideinheiten zu nicht-B-(1,6)-gekoppelten Monosaccharideinheiten mindestens 2:1, vorzugsweise mindestens 5:1, insbesondere mindestens 10:1, ist.
4. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die alpha-Synuclein-Polypeptide mindestens ein B-Zell-Epitop umfassen.
5. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ein B-Zell-Epitop und ein panspezifisches/promiskuitives T-Zell-Epitop unabhängig voneinander an das ß-Glucan gekoppelt ist.
6. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das B-Zell-Epitop-Polypeptid eine Länge von 5 bis 20 Aminosäureresten, vorzugsweise von 6 bis 19 Aminosäureresten, insbesondere von 7 bis 15 Aminosäureresten, aufweist.
7. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das T-Zell-Epitop-Polypeptid eine Länge von 8 bis 30 Aminosäureresten, vorzugsweise von 13 bis 29 Aminosäureresten, insbesondere von 13 bis 28 Aminosäureresten, aufweist.
8. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Konjugat weiterhin ein Trägerprotein umfasst, vorzugsweise nicht-toxisches kreuzreaktives Material von Diphtherietoxin (CRM), insbesondere CRM} 497, KLH, Diphtherietoxoid (DT), Tetanustoxoid (TT), Haemophilus influenzae Protein D (HipD) und dem äußeren Membranproteinkomplex von Meningokokken der Serogruppe B (OMPC), rekombinante nichttoxische Form von Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (rEPA), Flagellin, hitzelabiles Enterotoxin (LT) von Escherichia coli, Choleratoxin (CT), mutierte Toxine (z.g., LTK63 und LTR72), virusähnliche Partikel, albuminbindendes Protein, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, ein synthetisches Peptiddendrimer, z. B. ein multiples antigenes Peptid (MAP).
9. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Polypeptid ein B-Zellen- oder ein TZellen-Epitop-Polypeptid ist oder umfasst, vorzugsweise wobei das Polypeptid ein B-Zellenund ein T-Zellen-Epitop ist oder umfasst.
10. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Konjugat ein T-Zell-Epitop umfasst, vorzugsweise ein T-Zell-Epitop, das die Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAAA umfasst, die gegebenenfalls mit einem Linker verbunden ist, vorzugsweise AKFVAAWTLKAAANRRA-(NH-NH2), AKFVAAWTLKAAAN-C, AKFVAAWTLKAAA-C, AKFVAAWTLKAAANRRA-C; oder eine Variante davon, ausgewählt aus aKXVAAWTLKAAaZC, aKXVAAWTLKAAaZCNRRA, aKXVAAWTLKAAa, aKXVAAWTLKAAaNRRA, aA(X)AAAKTAAAAa, aA(X)AAATLKAAa, aA(X)VAAATLKAAa, aA(X)IAAATLKAAa, aK(X)VAAWTLKAAa, und aKFVAAWTLKAAa, worin X L-Cyclohexylalanin ist, Z Aminocapronsäure ist und a ein aliphatischer Aminosäurerest ist, ausgewählt aus Alanin, Glycin, Valin, Iso-Leucin und Leucin.
11. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Verhältnis von B-Glucan zu B-Zellund/oder T-Zell-Epitop-Polypeptid im Konjugat von 10:1 (w/w) bis 1:1 (w/w), vorzugsweise von 8:1 (w/w) bis 2:1 (w/w), insbesondere 4:1 (w/w), beträgt.
12. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Verwendung als aktiver Anti-alpha-Synuclein-Impfstoff zur Behandlung und Vorbeugung von Synucleopathien, vorzugsweise Parkin-
225 / 246
son-Krankheit (PD), Demenz mit Lewy-Körpern (DLB), Multiple-System-Atrophie (MSA), Parkinson-Krankheits-Demenz (PDD), neuroaxonale Dystrophien, Alzheimer-Krankheit mit amygdalar beschränkten Lewy-Körpern (AD/ALB).
13. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das B-Glucan durch Oxidation aktiviert wird und wobei das aktivierte B-Glucan mit dem B-Zellund/oder dem T-Zell-Epitop-Polypeptid in Kontakt gebracht wird, wodurch ein Konjugat des B-Glucans mit dem B-Zell- und/oder dem T-Zell-Epitop-Polypeptid erhalten wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das ß-Glucan durch Periodatoxidation an vicinalen Hydroxylgruppen, als reduktive Aminierung oder als Cyanylierung von Hydroxylgruppen erhalten wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das ß-Glucan bis zu einem Oxidationsgrad oxidiert wird, der als die Reaktivität mit dem Schiff’schen Fuchsin-Reagenz definiert ist, die einem Oxidationsgrad einer gleichen Menge Pustulan entspricht, das mit Periodat in einem Molverhältnis von 0,2-2,6, vorzugsweise von 0,6-1,4, insbesondere 0,7-1, oxidiert wurde.
Hierzu 20 Blatt Zeichnungen
226 / 246
ATA50128/2022A 2022-02-28 2022-02-28 Konjugat bestehend aus oder umfassend zumindest ein β-Glucan oder ein Mannan AT525943B1 (de)

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