AT520055A1 - Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Polyphenolen in biologischen Fluiden - Google Patents

Abstract

Bei einem Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Polyphenolen in bio­ logischen Fluids, bei welchem das biologische Fluid mit Folin-Ciocalteu-Reagenz (FCR) zum Ausbilden einer Farbreaktion umgesetzt wird und die gebildete Farbreaktion kolori­ metrisch durch Vergleich mit einem Standard quantitativ ausgewertet wird, umfasst es die Schritte: Vorlegen des biologischen Fluids, Zusetzen von Verdünnungsmittel bis eine wenigstens 7-fache Verdünnung erreicht wird, Entnehmen einer Menge des Fluids aus den Vertiefungen und Vorlegen dieser Menge in einer Versuchsplatte, sowie Vorle­ gen in weiteren Vertiefungen der Versuchsplatte des Standards sowie eines Vergleichs, Zugabe von Verdünnungsmittel, Zusetzen einer Menge an 0,2 M FCR, Mischen sämt­ licher Bestandteile, lnkubieren lassen bei Raumtemperatur für einen Zeitraum zwischen 1 und 24 Stunden, kolorimetrische Bestimmung der gebildeten Farbreaktion bei Wellen­ längen zwischen 600 und 766 nm, Korrigieren eines erhaltenen Ergebnisses von in dem biologischen Fluid enthaltenen Polyphenolen und quantitative Bestimmung des Phenol­ gehalts im biologischen Fluid durch Vergleich mit der Farbreaktion des Standards sowie Verwendung.

Description

(19) l>

österreichisches

Patentamt (10) AT 520055 A1 2018-12-15 (12) Österreichische Patentanmeldung (21) Anmeldenummer: A 250/2017 (22) Anmeldetag: 12.06.2017 (43) Veröffentlicht am: 15.12.2018 (51) Int. Cl.: G01N33/52 (2006.01)

AT 520055 A1 2018-12-15

(56) Entgegenhaltungen:	(71)	Patentanmelder:
RU 2519767 C1 CN 106324241 A CN 103585498 B CN 105021608 A		Omnignostica Forschungs GmbH & Co KG 3421 Höflein an der Donau (AT)
Agbor, Gabriel & Vinson, Joe & E. Donnelly, Patrick. (2014). Folin-Ciocalteau Reagent for Polyphenolic Assay. Int J Food Sei Nutr Diet. 3(8), pp 147-156. DOI 10.19070/2326-3350-1400028	(74)	Vertreter: Cunow Patentanwalts KG 1180 Wien (AT)

(54) Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Polyphenolen in biologischen Fluiden (57) Bei einem Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Polyphenolen in biologischen Fluids, bei welchem das biologische Fluid mit FolinCiocalteu-Reagenz (FCR) zum Ausbilden einer Farbreaktion umgesetzt wird und die gebildete Farbreaktion kolori- metrisch durch Vergleich mit einem Standard quantitativ ausgewertet wird, umfasst es die Schritte: Vorlegen des biologischen Fluids, Zusetzen von

Verdünnungsmittel bis eine wenigstens 7-fache Verdünnung erreicht wird, Entnehmen einer Menge des Fluids aus den Vertiefungen und Vorlegen dieser Menge in einer Versuchsplatte, sowie Vorlegen in weiteren Vertiefungen der Versuchsplatte des Standards sowie eines Vergleichs, Zugabe von Verdünnungsmittel, Zusetzen einer Menge an 0,2 M FCR, Mischen sämtlicher Bestandteile, Inkubieren lassen bei Raumtemperatur für einen Zeitraum zwischen 1 und 24 Stunden, kolorimetrische Bestimmung der gebildeten Farbreaktion bei Wellenlängen zwischen 600 und 766 nm, Korrigieren eines erhaltenen Ergebnisses von in dem biologischen Fluid enthaltenen Polyphenolen und quantitative Bestimmung des Phenolgehalts im biologischen Fluid durch Vergleich mit der Farbreaktion des Standards sowie Verwendung.

Zusammenfassung:

Bei einem Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Polyphenolen in biologischen Fluids, bei welchem das biologische Fluid mit Folin-Ciocalteu-Reagenz (FCR) zum Ausbilden einer Farbreaktion umgesetzt wird und die gebildete Farbreaktion kolorimetrisch durch Vergleich mit einem Standard quantitativ ausgewertet wird, umfasst es die Schritte: Vorlegen des biologischen Fluids, Zusetzen von Verdünnungsmittel bis eine wenigstens 7-fache Verdünnung erreicht wird, Entnehmen einer Menge des Fluids aus den Vertiefungen und Vorlegen dieser Menge in einer Versuchsplatte, sowie Vorlegen in weiteren Vertiefungen der Versuchsplatte des Standards sowie eines Vergleichs, Zugabe von Verdünnungsmittel, Zusetzen einer Menge an 0,2 M FCR, Mischen sämtlicher Bestandteile, Inkubieren lassen bei Raumtemperatur für einen Zeitraum zwischen 1 und 24 Stunden, kolorimetrische Bestimmung der gebildeten Farbreaktion bei Wellenlängen zwischen 600 und 766 nm, Korrigieren eines erhaltenen Ergebnisses von in dem biologischen Fluid enthaltenen Polyphenolen und quantitative Bestimmung des Phenolgehalts im biologischen Fluid durch Vergleich mit der Farbreaktion des Standards sowie Verwendung.

/ 16

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Polyphenolen in biologischen Fluiden, bei welchem das biologische Fluid mit Folin-Ciocalteu-Reagenz (FCR) zum Ausbilden einer Farbreaktion umgesetzt wird und die gebildete Farbreaktion kolorimetrisch durch Vergleich mit einem Standard quantitativ ausgewertet wird sowie die Verwendung desselben.

In lebenden Organismen besteht üblicherweise ein Gleichgewicht zwischen prooxidativen und anti-oxidativen Substanzen. Dieses Gleichgewicht kann aus unterschiedlichsten Gründen gestört werden, wie z.B. eine übermäßig große Aufnahme von Antioxidantien, Erkrankungen, welche durch freie Radikale gefördert bzw. mediatisiert sind oder auch Störungen, welche die Aufnahme von Antioxidantien behindern bzw. erschweren. Es ist seit langem bekannt, dass das Vorhandensein hoher Mengen an Polyphenolen anzeigt, dass ausreichende Niveaus an schützenden Antioxidantien in biologischen Proben und insbesondere auch lebenden Organismen vorhanden sind. Diese Antioxidantien haben einen günstigen Effekt und auch protektive Effekte auf durch freie Radikale hervorgerufene Erkrankungen. Da Antioxidantien unter anderem auch als Radikalfänger dienen können, wird angenommen, dass sie diesen Erkrankungen gegebenenfalls sogar vorbeugen können und jedenfalls positiv auf diese einwirken können.

Selbstverständlich ist es für einen Fachmann auch offensichtlich, dass übermäßig hohe Konzentrationen an Polyphenolen auch gefährliche Effekte besitzen können, sodass im Prinzip ein Gleichgewicht oder ein möglichst stabiles Niveau in lebenden Organismen derselben aufrechterhalten werden sollte. Um ein derartiges gleichmäßiges Niveau aufrechterhalten zu können ist es einerseits wichtig, den Polyphenolgehalt in Nahrungsmitteln, welche von den einzelnen Probanden aufgenommen werden, zu kennen bzw. bestimmen zu können und andererseits auch den Polyphenolgehalt in biologischen Proben aus menschlichen oder tierischen Organismen einfach und zuverlässig bestimmen zu können.

Ein Verfahren zur Bestimmung von Tyrosin und Tryptophan in Proteinen mittels eines phenolischen Reagenz wurde bereits von O. Folin und V. Ciocalteu in the Journal of Biological Chemistry, Vol. LXXIII, Nr. 2, Seite 627 ff beschrieben. Durch dieses kolorimetrische Verfahren ist es gelungen, das Trübungsproblem, welches in noch älteren Verfahren eine halbwegs ordentliche Messung verhindert hat, zu lösen. Um diese Reaktion durchführen zu können haben Folin und Ciocalteu ein Phenolreagenz entwickelt, welches als Folin und Ciocalteu-Reagenz in die Analytik Eingang gefunden hat und welches Reagenz insbesondere darauf beruht, dass Polyphenole mit Übergangsmetallen / 16 im vorliegenden Fall mit Wolframat und Molybdat in Phosphorsäure einen dunkelblau gefärbten Komplex bilden, welcher photometrisch bzw. kolorimetrisch messbar ist. Je nach Art der erhaltenen Probe werden diese Messungen bei unterschiedlichen Wellenlängen, höchstens jedoch 766 nm durchgeführt.

Nachteilig an diesem alten Verfahren von Folin und Ciocalteu ist die Tatsache, dass für eine halbwegs exakte Bestimmung der Phenolgehalte riesige Probenmengen verarbeitet werden müssen, wodurch sich dieses alte Verfahren heute nicht mehr als wirtschaftlich erweist.

Das ursprüngliche Verfahren von Folin und Ciocalteu wurde von Andrew Waterhouse, Department of Viticulture & Enology, University of California, Davis, weiterentwickelt. Bei diesem Verfahren ist es gelungen, die Volumina der Reagenzien deutlich abzusenken und insbesondere einen Überschuss an Reagenz weitestgehend zu vermeiden. Trotz dieser Miniaturisierung des Verfahrens wird immer noch im Milliliter-Maßstab gearbeitet, sodass große Mengen an Reagenzien zum Einsatz gelangen müssen, was den Nachweis wirtschaftlich macht.

Das für den Nachweis von Polyphenolen verwendete Folin-Ciocalteu-Reagenz, welches käuflich von beispielsweise Sigma-Aldrich erwerbbar ist, ist im Wesentlichen eine Lösung aus Molybdatophosphorsäure und Wolframatphosphorsäure und seine Herstellung wurde beispielsweise von Singleton und Rossi, AJEV 1965, 16: 144-158 beschrieben. Der Einsatz des Folin-Ciocalteu-Reagenz zum Nachweis von Phenolen liefert in verschiedensten Fluiden, auch biologischen und pflanzlichen Fluiden, exzellente Ergebnisse, ist jedoch bis dato nicht erfolgreich auf tierische und menschliche Proben anwendbar, da durch diese biologischen Fluiden aufgrund der Wechselwirkung von verschiedensten anderen Substanzen, welche in den Fluiden enthalten sind, teilweise heftige Nebenreaktionen stattfinden. Insbesondere schäumen biologische Fluide bei Versetzen mit Folin-Ciocalteu-Serum extrem stark, sodass eine sinnvolle Messung des Phenolgehalts in diesen Fluiden aufgrund der störenden Effekte und insbesondere aufgrund des Verlustes, welcher bei einem übermäßigen Schäumen zu befürchten ist, nicht möglich erschien und somit dieses Verfahren bis heute nicht auf derartige Proben angewandt werden kann.

Die vorliegende Erfindung zielt nun darauf ab, dass bekannte Nachweisverfahren für Polyphenole mit Hilfe des Folin-Ciocalteu-Reagenz dahingehend weiterzubilden, dass es auf biologische und insbesondere humane und veterinäre Fluide bedenkenlos anwendbar ist und reproduzierbare, quantitative Ergebnisse erhalten werden können.

/ 16

Zur Lösung dieser Aufgabe ist das erfindungsgemäße Verfahren im Wesentlichen dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

a. Vorlegen des gegebenenfalls vorab gereinigten biologischen Fluids in Vertiefungen einer Verdünnungsplatte,

b. Zusetzen von Verdünnungsmittel bis eine wenigstens 7-fache Verdünnung, insbesondere wenigstens 10-fache Verdünnung des biologischen Fluids erreicht wird,

c. Entnehmen einer Menge des verdünnten biologischen Fluids aus den Vertiefungen der Verdünnungsplatte und Vorlegen dieser Menge in Vertiefungen einer Versuchsplatte, sowie Vorlegen in weiteren Vertiefungen der Versuchsplatte des Standards sowie eines Vergleichs,

d. Zugabe von Verdünnungsmittel zu dem verdünnten biologischen Fluid, dem Standard und dem Vergleich,

e. Zusetzen einer Menge an 0,2 M FCR, die einer 3- bis 7-fachen Menge, insbesondere 5-fachen Menge des verdünnten biologischen Fluids entspricht,

f. Zusetzen eines Verstärkungsreagenz,

g. Mischen sämtlicher Bestandteile, insbesondere durch Rütteln auf einem horizontalen Rüttler,

h. Inkubieren lassen bei Temperaturen zwischen 20 °C und 25 °C für einen Zeitraum zwischen 1 und 24 Stunden, vorzugsweise 2 bis 4 Stunden,

i. kolorimetrische Bestimmung der gebildeten Farbreaktion bei Wellenlängen zwischen 600 und 766 nm,

j. Korrigieren eines erhaltenen Ergebnisses von in dem biologischen Fluid enthaltenen Polyphenolen durch Multiplikation mit dem Wert der in Schritt b. gewählten Verdünnung und

k. quantitative Bestimmung des Phenolgehalts im biologischen Fluid durch Vergleich mit der Farbreaktion des Standards.

Dadurch, dass vor dem Versetzen mit dem Folin-Ciocalteu-Reagenz das biologische Fluid auf eine wenigstens siebenfache, insbesondere zehnfache Verdünnung, mit einem Verdünnungsmittel verdünnt wird, gelingt es überraschenderweise das beim Umsetzen mit dem FCR-Reagenz üblicherweise auftretende Schäumen der biologischen Proben zu unterbinden und dadurch bei der Umsetzung mit dem FCR-Reagenz einen reproduzierbaren Farbwert zu erhalten, welcher in der Folge kolorimetrisch bestimmt werden kann. Für eine quantitative Bestimmung des Phenolgehalts in biologischen Fluids ist es bei einer derartigen Verfahrensführung zusätzlich erforderlich, das erhalte / 16 ne Ergebnis durch Multiplikation mit dem Wert der gewählten Verdünnung zu multiplizieren, um die Menge der in den biologischen Fluiden enthaltenen Polyphenole zu quantifizieren. Eine derartigen Verfahrensführung ist im eindeutigen Widerspruch mit der ursprünglichen Ansicht von Folin und Ciocalteu, die der Ansicht waren, dass eine zu starke Verdünnung zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen führen würde, und somit für einen Nachweis des Phenolgehalts nicht verwendbar wäre.

Überraschenderweise konnte mit einer Verfahrensführung gemäß der vorliegenden Erfindung eine Mehrzahl von Problemen gelöst werden. Einerseits konnte durch das Vorverdünnen der biologischen Fluide, wie beispielsweise Patientenseren aus Pflanzen oder Tieren isolierten Fluiden exakt reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden, indem das Serum vor dem Versetzen mit FCR einer Verdünnung, insbesondere einer wenigstens siebenfachen, vorzugsweise zehnfachen Verdünnung, unterworfen wurde. Weiterhin wurde auch das Folin-Ciocalteu-Reagenz nicht als 2 M Reagenz eingesetzt, sondern als 0,2 M, wodurch nicht nur Reagenz gespart wird sondern das Problem der unerwünschten Gasbildung vollständig unterdrückt werden konnte. Die Befürchtung von Folin und Ciocalteu, dass aufgrund der starken Verdünnung ein reproduzierbares Ergebnis nicht mehr erreicht werden kann, erwies sich hierbei als unbegründet und es konnte in allen untersuchten Proben klar detektierbare Mengen an Polyphenolen aufgefunden werden. Insbesondere in Fällen, wo das Ergebnis gegebenenfalls nicht hundertprozentig schlüssig ist, konnte eine Vergleichsprobe mit unverdünntem Reagenz durchgeführt werden, welche wiederum bestätigt hat, dass durch die Verdünnung ein reproduzierbares und quantifizierbares Ergebnis erreichbar war.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung wird das erfindungsgemäßen Verfahren so geführt, dass vor dem Einsatz bzw. vor dem Verdünnen und Versetzen mit FCR das biologische Fluid durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren gereinigt wird. Ein derartiger Schritt hat sich insbesondere dann als vorteilhaft erwiesen, wenn sichtbare Mengen an Cryoproteinen in den Proben enthalten sind, welche durch Zentrifugieren abgetrennt werden können, so dass eine klare Lösung erhalten wird, welche der weiteren Untersuchung zugrunde gelegt werden kann und in der Folge eindeutige Ergebnisse liefert. Auch hämolytische Proben sollten aus den Versuchen entfernt werden, da diese die Ergebnisse beeinflussen können. Schließlich können auch mikrobielle Verunreinigungen und andere möglicherweise in den Proben enthaltene Schwebstoffe die Ergebnisse beeinflussen, sodass ein Abtrennen von derartigen Substanzen und Stoffen durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren vor der Verdünnung günstig ist.

/ 16

Besonders gut reproduzierbare Ergebnisse können dadurch erreicht werden, dass als Verdünnungsmittel Wasser, insbesondere destilliertes Wasser oder deionisiertes Wasser eingesetzt wird. Als günstige und einfach reproduzierbare Verfahrensführung hat sich hierbei die Verfahrensführung in wässriger Lösung erwiesen, wobei als Verdünnungsmittel Wasser sowohl als destilliertes Wasser als auch deionisiertes Wasser einsetzbar ist Die Wahl des Verdünnungsmittels richtet sich hierbei nicht zuletzt nach der Herkunft des zu untersuchenden biologischen Fluids und insbesondere dem Alkoholgehalt in der Probe, welcher Alkohol gegebenenfalls aus der erforderlichen vorherigen Extraktion stammt.

Um insbesondere eine verbesserte bzw. verstärkte Farbreaktion und insbesondere einen deutlichere Färbung der Probe zu erzielen, ist das erfindungsgemäße Verfahren dahingehend weitergebildet, dass als Verstärkungsagens wenigstens eines oder ein Gemisch von Verstärkungsagentien, gewählt aus der Gruppe der Basen, wie Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydrocarbonat und dgl. eingesetzt wird. Durch Einsatz eines basischen Verstärkungsagens gelingt es, die Farbreaktion so weit zu verstärken und eine deutlichere Färbung zu erzielen, sodass nicht nur ein reproduzierbares Ergebnis erreicht werden kann sondern insbesondere eine Quantifizierung der in dem untersuchten biologischen Fluid enthaltenen Polyphenole möglich wird.

Insbesondere wenn nicht bekannt ist, welche Polyphenole in einer zu untersuchenden Probe zu erwarten sind, wird versucht, einen Standard zu wählen, welcher für eine Mehrzahl von Polyphenolen einsetzbar ist bzw. als Ersatz für eine Reihe von Polyphenolen dienen kann, wie beispielsweise Gallussäure oder Ascorbinsäure, wie dies im Stand der Technik bereits beschrieben wurde. Wenn eine Vermutung besteht, welches Polyphenol in dem zu untersuchenden Fluid enthalten sein könnte, ist es allerdings ratsam, den Standard mittels einer Serienverdünnung des in dem biologischen Fluid erwarteten Polyphenols zu erstellen, da dann die Ungenauigkeit in der Quantifizierung weiter minimiert werden kann.

Wenn, wie dies in der Praxis häufig der Fall ist, feste bzw. breiförmige Substanzen vorliegen, aus welchen das biologische Fluid nicht unmittelbar gewonnen werden kann, ist das erfindungsgemäße Verfahren dahingehend weiteregebildet, dass zum Erhalt des biologischen Fluids zugrunde zu legende biologische Proben, insbesondere pflanzliche biologische Proben wenigstens einer Vorbehandlung gewählt aus Trocknen, Mahlen, Extrahieren mit einem Alkohol, wie Ethanol und/oder Isopropanol, Filtrieren, / 16

- 6 Zentrifugieren und/oder Sieben unterworfen werden. Insbesondere bei pflanzlichen biologischen Proben, welche bekanntermaßen einen relativ hohen Phenolgehalt aufweisen, wie beispielsweise Weintrauben, dunkle gefärbte Früchte wie Kirschen, Heidelbeeren, Brombeeren, aber auch Kaffee, Kakao, Spargel und dgl. kann das pflanzliche Produkt nicht unmittelbar einer Untersuchung zugrunde gelegt werden, in welchem Fall es vorher aufbereitet werden muss, um die in den pflanzlichen Produkten enthaltenen bzw. pflanzlichen biologischen Proben enthaltenen Polyphenole einer Untersuchung zugängig zu machen. Hier kommen die üblichen bekannten Verfahren, wie Trocknen, Mahlen, Extrahieren mit Alkohol, insbesondere pharmakologisch unbedenklichen Alkoholen, wie Ethanol, Isopropanol und dgl., Filtrieren, Zentrifugieren oder auch Sieben zum Einsatz, um die Früchte einer Zerkleinerung und Extraktion des gewonnenen Fluids und Reinigung desselben vor einer Untersuchung zu unterwerfen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt zur Bestimmung des Polyphenolgehalts in pflanzlichen oder tierischen, insbesondere humanen Fluiden, verwendet Eine Verwendung von dem Folin-Ciocalteu-Reagenz zur Bestimmung des Polyphenolgehalts in humanen Proben oder auch tierischen Proben war bis dato kaum möglich bzw. nur bei Einsatz extrem großer Volumina der Seren möglich, da aufgrund des starken Schäumens während der Umsetzung ein reproduzierbares Ergebnis nicht erzielbar war. Durch die erfindungsgemäße Verfahrensführung, bei welcher das biologische Fluid vor seinem Einsatz um wenigstens das Siebenfache, insbesondere das zehnfache, verdünnt wird, ist es gelungen, das Schäumen bei der Umsetzung vollständig zu unterdrücken und trotzdem quantifizierbare Ergebnisse zu erreichen, sodass das erfindungsgemäße Verfahren nunmehr bei tierischen und humanen Fluiden eingesetzt und verwendet werden kann.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass eine weitere Minimierung der Einsatzmengen an Substrat und Reagenz erreicht werden konnte, sodass nunmehr eine Umsetzung in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte bzw. einer Mikroversuchsplatte durchgeführt werden kann, was zu wesentlichen Einsparungen an Reagenz und Reagenzien ebenso wie an Probenmaterial führt, wodurch nicht nur eine Kosteneinsparung sondern insbesondere auch eine bedeutend umfassendere Einsatzmöglichkeit des an sich bekannten Nachweisverfahrens möglich wird.

Schließlich wird bei kaum bzw. schwach gefärbten Proben die photometrische bzw. kolorimetrische Messung bei Wellenlängen zwischen 600 nm und 650 nm durch / 16 geführt, wobei stark gefärbte Proben, wie dies an sich bekannt ist, bei 766 nm vermessen werden.

Schließlich kann, falls dies erforderlich ist und eine höhere Empfindlichkeit als mit einem vorhandenen Fluid erzielbar ist, gewünscht wird, so vorgegangen werden, dass das Probenvolumen vergrößert wird und stattdessen die Verdünnung im zweiten Verdünnungsschritt etwas verringert wird, worauf die Empfindlichkeit als Nachweis erhöht werden kann. Der Vergleich mit dem Standard erfolgt in diesem Fall in einer entsprechenden Verdünnung.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Versuch 1

Untersuchung von Spargel in Bezug auf den Polyphenolgehalt

Ca. 5 g weißer und grüner Spargel wurden eingewogen und mit einem dem Gewicht in Gramm entsprechenden Volumen in Milliliter einer Mischung aus Extraktionsmitteln und Verdünnungsmittel (je 50% Ethanol und destilliertes Wasser) versetzt. Der Ansatz wurde mittels Pürierstab homogenisiert und 24 Stunden auf einer 3D-Mischplattform (Heidolph) bei Raumtemperatur von 20+/-2 °C inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Ansätze durch Zentrifugieren (15 Minuten 2000xg, Heraeus-Zentrifuge) in eine feste und eine flüssige Phase getrennt. War die flüssige Phase nicht klar, wurde durch einen weiteren Zentrifugierschritt für 5 Minuten bei 10000xg eine Klärung erreicht. Vom klaren Überstand wurden 20 pl mit 180 μΙ Aqua dest versetzt (Verdünnung 1:10). Durch die Verdünnung wurde ein Ethanol-Gehalt der Probe unter 5% erreicht, welcher die Messung der Polyphenole nicht beeinflusst. Von dieser Verdünnung wurden 20 μΙ im Polyphenol Test in der Mikrotiterplatte eingesetzt. Dazu wurden weitere 50 μΙ destilliertes Wasser (Aqua dest) pipettiert und 100 μΙ 0,2 M FCR zu jedem Reaktionsansatz, d.h. jeder Vertiefung hinzupipettiert. Schließlich wurde jedes Reaktionsgemisch noch mit 30 μΙ Verstärkungsreagens bestehend aus 7% Natriumcarbonat-Lösung, darin enthalten 10% Isopropanol versetzt Die Platte wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und danach bei 766 nm photometriert. Als Standard wurden serielle Verdünnungen der Gallussäure von 3 mM bis 0 mM verwendet. Der bei einer Photometrie erhaltene Standardwert in mM wurde mit 10 multipliziert, woraus sich der exakte Phenolgehalt in der Probe ergibt.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden vier verschiedenen Spargelproben untersucht und die Konzentration an Polyphenolen in den Spargelproben ermittelt / 16

Es wurden Konzentrationswerte an Polyphenolen in Spargel zwischen 2,74 und 3,09 mM aufgefunden. Wesentlich bei Erhalt dieser Untersuchungsergebnisse ist weiterhin, dass bei Herstellung des biologischen Fluids darauf geachtet werden muss, dass ausreichend lange extrahiert wird, da die Extraktion der Polyphenole aus der biologischen Probe relativ langsam erfolgte und erst nach einer Extraktionszeit von 3 Stunden die ermittelten Konzentrationswerte für Polyphenole im Spargel konstant blieben.

Ein weiteres Ergebnis dieser Studie zeigte, dass Spargel messbare Mengen an Polyphenolen enthält, diese jedoch in nicht unerwarteter Weise deutlich niedriger waren als die Polyphenolgehalte in Fruchtsäften, roter Beeren, Kaffee oder dgl.

Versuch 2

Untersuchung von Pressrückständen roter Weintrauben

Pressrückstände roter Weintrauben wurden bei 60°C in einem regulierbaren Backrohr für 48 Stunden getrocknet und durch Sieben in Fraktionen getrennt, von denen die eine im Wesentlichen die Kerne (TK) und die andere im Wesentlichen die Schalen (TS) enthielt. Beide Fraktionen wurden mittels Schlagwerk-Mühle homogenisiert. Die Homogenisate wurden zu je 2-3 g eingewogen und mit dem 10-fachen dem Gewicht in g entsprechenden Volumen in ml an Extraktionsmittel versetzt. (Aqua dest und Ethanol jeweils von 0 bis 100 %). Die Ansätze wurden 24, 48, 72, 96, 120 und 144 Stunden bei einer Raumtemperatur von 23 ± 2 °C unter ständigem Bewegen auf einem Heidolph 3D-Schüttler extrahiert. Jeweils zum Ende der Extraktionszeit wurden die entsprechenden Ansätze 15 Minuten bei 2000xg zentrifugiert und die klaren Überstände in der Polyphenol-Bestimmung eingesetzt. Dazu wurden sie 1:10 in Aqua dest vorverdünnt, auch um störende Einflüsse von Ethanol zu minimieren. Von den Verdünnungen wurden 20 pl in die entsprechenden Vertiefungen einer Mikrotiterplatte pipettiert und jeweils 250 pl Aqua dest hinzupipettiert. In einem weiteren Pipettierschritt erfolgte die Zugabe von 100 μΙ FCR (0,2 M) zu jedem Ansatz. Die Herstellung des Reaktionsgemisches wurde durch Zugabe von 30 μΙ Verstärkungsreagens bestehend aus 7% Natriumcarbonat-Lösung, darin enthalten 10% Isopropanol abgeschlossen. Die Reaktionsansätze wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend bei 766 nm photometriert.

Auch bei einer Untersuchung von Kaffee zeigte sich, dass die Extraktionsausbeuten proportional zur Extraktionszeit zunehmen und dass somit darauf geachtet werden muss, ausreichend lange zu extrahieren, um die Polyphenole möglichst quantitativ / 16 aus der pflanzlichen Probe vor ihrer Bestimmung zu extrahieren. Weiterhin zeigte sich, dass die Polyphenolkonzentrationen auch von der Alkoholkonzentration des Extraktionsmittels abhängen, sodass weiterhin Proben durchgeführt wurden, mit welchen Extraktionsmitteln die höchsten Polyphenolkonzentrationen erzielt wurden. Hierbei zeigte sich, dass halbkonzentrierte Extraktionsmittel, d.h. 50 % Wasser und 50 % Alkohol die höchsten Gehalte ergaben. In einem 1 % Kaffeeextrakt wurden hierbei 3,77 mM Polyphenole aufgefunden.

Bei den an Spargeln und Kaffee durchgeführten Untersuchungen ergaben sich Abweichungen zum Standard während der Messung in der Größenordnung von 2 bis 5 %, was für eine Quantifizierung des Verfahrens ausreichend erscheint und insbesondere ein unerwartet exaktes Ergebnis liefert.

Versuch 3:

Polyphenole in menschlichen Proben

Blut wurde aus der Armvene der Probandinnen durch Punktion gewonnen und nach Koagulation zentrifugiert. Der klare Überstand wurde aliquotiert und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert. Je 20 pl des Serums wurden mit 180 μΙ Aqua dest verdünnt (1:10). Je 20 μΙ dieser Verdünnung wurden zur Polyphenol Bestimmung verwendet. Zu diesem Zweck wurden 50 μΙ Aqua dest und 100 μΙ 0,2 M FCR zu den verdünnten Seren hinzupipettiert. Die Reaktionsansätze wurden durch Zugabe von 30 μΙ Verstärkungsreagens bestehend aus 7% wässrige Natriumcarbonat-Lösung, darin enthalten 10% Isopropanol vervollständigt. Nach mindestens 2 Stunden Inkubation der Ansätze bei Raumtemperatur wurden die Ansätze bei 766 nm photometriert. Als Standard wurde eine serielle Verdünnung von Gallus-Säure verwendet. (0-3 mM).

Mit dem oben beschriebenen Verfahren wurden 16 Patienten jeweils zwei Untersuchungen im Abstand von einer Woche gemäß dem obigen Verfahren unterzogen und die Sera der Untersuchung auf Polyphenole unterworfen.

Hierbei zeigte sich, dass keiner der Patienten über die Zeit gleichbleibende Werte an Polyphenolen im Serum aufwies, dass jedoch jedes Serum problemlos messbare Mengen an Polyphenolen enthielt. Als niedrigster Wert wurde hierbei 3,53 mM Polyphenol detektiert, als höchster Wert 8,40 mM Polyphenol, im Durchschnitt lagen die Werte bei über 5 mM und unter 8 mM Polyphenol im Serum, wobei von den 32 untersuchten Proben lediglich eine Probe ein sinnvolles Ergebnis nicht lieferte, sodass zusammenfassend festgehalten werden kann, dass auch untersuchte menschliche Seren und Plasma / 16 aus der eingesetzten 1:7, insbesondere 1:10 Verdünnung problemlos messbare Mengen an Polyphenolen lieferten.

/ 16

Claims (7)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Polyphenolen in biologischen Fluids, bei welchem das biologische Fluid mit Folin-Ciocalteu-Reagenz (FCR) zum Ausbilden einer Farbreaktion umgesetzt wird und die gebildete Farbreaktion kolorimetrisch durch Vergleich mit einem Standard quantitativ ausgewertet wird, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

   a) Vorlegen des gegebenenfalls vorab gereinigten biologischen Fluids in Vertiefungen einer Verdünnungsplatte,

   b) Zusetzen von Verdünnungsmittel bis eine wenigstens 7-fache Verdünnung, insbesondere wenigstens 10-fache Verdünnung des biologischen Fluids erreicht wird,

   c) Entnehmen einer Menge des verdünnten biologischen Fluids aus den Vertiefungen der Verdünnungsplatte und Vorlegen dieser Menge in Vertiefungen einer Versuchsplatte, sowie Vorlegen in weiteren Vertiefungen der Versuchsplatte des Standards sowie eines Vergleichs,

   d) Zugabe von Verdünnungsmittel zu dem verdünnten biologischen Fluid, dem Standard und dem Vergleich,

   e) Zusetzen einer Menge an 0,2 M FCR, die einer 3 bis 7-fachen Menge, insbesondere 5-fachen Menge des verdünnten biologischen Fluids entspricht,

   f) Zusetzen eines Verstärkungsreagenz,

   g) Mischen sämtlicher Bestandteile, insbesondere durch Rütteln auf einem horizontalen Rüttler,

   h) Inkubieren lassen bei Temperaturen zwischen 20 °C und 25 °C für einen Zeitraum zwischen 1 und 24 Stunden, vorzugsweise 2 bis 4 Stunden,

   i) kolorimetrische Bestimmung der gebildeten Farbreaktion bei Wellenlängen zwischen 600 und 766 nm,

   j) Korrigieren eines erhaltenen Ergebnisses von in dem biologischen Fluid enthaltenen Polyphenolen durch Multiplikation mit dem Wert der in Schritt b. gewählten Verdünnung und

   k) quantitative Bestimmung des Phenolgehalts im biologischen Fluid durch Vergleich mit der Farbreaktion des Standards.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Fluid durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren gereinigt wird.

   12 / 16
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Verdünnungsmittel Wasser, insbesondere destilliertes Wasser oder deionisiertes Wasser eingesetzt wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Verstärkungsagens wenigstens eines oder ein Gemisch von Verstärkungsagentien gewählt aus der Gruppe der Basen, wie Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat, Kaliumhydrogencarbonat eingesetzt wird.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Standard eine Serienverdünnung eines in dem biologischen Fluid erwarteten Polyphenols, insbesondere eine Serienverdünnung einer organischen Säure, wie Gallussäure oder Ascorbinsäure eingesetzt wird.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zum Erhalt des biologischen Fluids zu untersuchende biologische Proben, insbesondere pflanzliche biologische Proben wenigstens einer Vorbehandlung gewählt aus Trocknen, Mahlen, Extrahieren mit einem Alkohol, wie Ethanol und/oder Isopropanol, Filtrieren, Zentrifugieren und/oder Sieben unterworfen werden.
7. 7. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Bestimmung des Polyphenolgehaltes in pflanzlichen oder tierischen, insbesondere humanen Fluids.

   ^Wien’ 12. JUNI 2017

   Omnignostica durch: CUNOW Pa

   

   H & Co KG alts KG

   13 / 16