AT507363B1 - Verfahren zur herstellung eines zusatzstoffes für den enzymatischen abbau von mykotoxinen sowie zusatzstoff und verwendung desselben - Google Patents

Abstract

Bei einem Verfahren zur Herstellung eines Zusatzstoffes für den enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, ist vorgesehen, dass wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Genen entsprechend Sequenz ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 vorgelegt wird, die wenigstens eine Nukleinsäuresequenz in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen exprimiert wird und wenigstens ein dadurch hergestelltes Enzym entsprechend Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder wenigstens ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus sowie gegebenenfalls gemeinsam mit einem Cosubstrat in einem pflanzlichen Rohstoff eingesetzt werden.

Description

österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15

Beschreibung [0001] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Zusatzstoffes für den enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, in einem pflanzlichen Rohstoff, einen Zusatzstoff zum enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, in einem pflanzlichen Rohstoff und Mischungen, die pflanzliche Rohstoffe enthalten, sowie eine Verwendung des Zusatzstoffes.

[0002] Mykotoxine treten auf landwirtschaftlichen, pflanzlichen Produkten sehr häufig auf und verursachen je nach Art der Mykotoxine schwere wirtschaftliche Schäden, insbesondere in den aus den landwirtschaftlichen Produkten hergestellten Nahrungsmitteln und auch bei mit derartigen Nahrungsmitteln ernährten Tieren und Menschen, wobei derartige Schäden äußerst vielfältig sind. Es wurden bereits zahlreiche Methoden entwickelt, mit welchen versucht wird, derartige Mykotoxine zu entgiften bzw. abzubauen oder unschädlich zu machen, um durch die Mykotoxine verursachte Schäden in den Bereichen von tierischer und menschlicher Ernährung, der Tierzucht, Verarbeitung von Futter- und Lebensmitteln und dgl. hintanzuhalten.

[0003] Unter den bekannten Mykotoxinen existiert eine Vielzahl von untereinander strukturell verwandten Mykotoxinen, wie beispielsweise die Fumonisine, von welchen Fumonisin B1 das am häufigsten vorkommende Toxin der Gruppe ist. Jedoch sind zahlreiche Derivate und verwandte Moleküle bekannt, welche ebenfalls giftige Wirkungen bei Menschen und Tieren aufweisen. So ist es bekannt, dass die Fumonisine den Sphingolipidstoffwechsel durch eine Wechselwirkung mit dem Enzym Ceramidsynthase behindern. Sphingolipide sind nicht nur Bestandteil von Zellmembranen, sondern spielen auch eine wichtige Rolle als Signal- und Botenmoleküle in vielen elementaren, zellulären Prozessen, wie dem Zellwachstum, der Zellwanderung und Zellanbindung, bei entzündlichen Prozessen und intrazellulären Transportvorgängen. Aufgrund dieser Behinderung des Sphingolipidstoffwechsels werden Fumonisine für die giftige Wirkung auf unterschiedlichste Tierarten und auch für den Menschen verantwortlich gemacht. So konnte nachgewiesen werden, dass Fumonisine bei Nagetieren krebserregend wirken, und sie wurden durch epidemiologische Daten mit Speiseröhrenkrebs und dem Neuralrohrdefekt bei Menschen in Zusammenhang gebracht. Bei verschiedenen Tierarten, wie beispielsweise Schweinen, werden sie für die typische Toxikose durch Lungenödeme verantwortlich gemacht. Fumonisine sind in diesem Zusammenhang eine nahezu allgegenwärtige Kontamination auf verschiedensten Getreidearten und insbesondere auf Mais sowie auf Nüssen und Gemüse sind, ist dieser stark negative Effekt in bezug auf die Gesundheit von Menschen und Tieren nicht vernachlässigbar.

[0004] Der mikrobielle Abbau von Fumonisinen wurde bereits in der EP-A 1 860 954 bzw. der Wo 2006/053357 beschrieben, gemäß welcher Mikroorganismen zur Entgiftung von Fumonisinen und Fumonisinderivaten eingesetzt werden, bei welchen die detoxifizierenden Bakterien oder Hefen, gewählt aus genau definierten Stämmen zur Entgiftung von Fumonisinen, Futtermitteln zugesetzt werden.

[0005] Auch wurden bereits katabolische Stoffwechselwege für den biologischen Abbau von Fumonisinen und die hiefür verantwortlichen Gene und Enzyme beschrieben. So beschreibt beispielsweise die EP 0 988 383 Fumonisin entgiftende Zusammensetzungen und Verfahren, wobei die eingesetzten, Fumonisin abbauenden Enzyme in erster Linie in transgenen Pflanzen produziert werden, bei welchen die Entgiftung von Fumonisinen mit Hilfe einer Aminooxidase, welche für ihre enzymatische Aktivität molekularen Sauerstoff benötigt, erfolgt.

[0006] Des Weiteren beschreibt die WO 2004/085624 Transaminasen, Deaminasen und Ami-nomutasen und Zusammensetzungen und Verfahren zur enzymatischen Detoxifizierung, wobei insbesondere aminierte Toxine, beispielsweise Fumonisine, entgiftet werden. In diesem Zusammenhang werden Polypeptide, welche eine Deaminaseaktivität besitzen, zur Entgiftung eingesetzt.

[0007] Bisher bekannten Verfahren ist jedoch gemeinsam, dass sie für eine Detoxifizierung der 1/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15

Mykotoxine molekularen Sauerstoff für die beschriebenen, katabolischen Stoffwechselwege benötigen, wobei die insbesondere erforderlichen Aminooxidasen unter Sauerstoff unabhängigen Bedingungen nicht arbeiten können. Ein Einsatz von derartigen Genen und Enzymen zur Detoxifizierung von Futtermitteln, beispielsweise im Verdauungstrakt von Tieren, ist aufgrund des im Wesentlichen sauerstofffreien Milieus in dem Verdauungstrakt von Tieren nicht möglich bzw. zeigen die bekannten Gene und Enzyme keinerlei Wirkung.

[0008] Die Erfindung zielt nun darauf ab, ein Verfahren zur Fierstellung eines Zusatzstoffes für den enzymatischen Abbau von Mykotoxinen zur Verfügung zu stellen, mit welchem es gelingt, Mykotoxine und insbesondere Fumonisine sicher und zuverlässig zu toxikologisch unbedenklichen Substanzen abzubauen bzw. zu entgiften.

[0009] Zur Lösung dieser Aufgaben ist das erfindungsgemäße Verfahren derart geführt, dass wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Genen entsprechend Sequenz ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20, 22 und 24 vorgelegt wird, die wenigstens eine Nukleinsäuresequenz in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen exprimiert wird und wenigstens ein dadurch hergestelltes Enzym entsprechend Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11,13,15,17,19, 21, 23 und 25 oder wenigstens ein kompletter, diese Sequenzen enthaltender, rekombinanter Wirtsorganismus sowie gegebenenfalls gemeinsam mit einem Cosubstrat in einem pflanzlichen Rohstoff eingesetzt werden. Dadurch, dass wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Genen entsprechend den nachfolgenden Sequenz ID-Nr. 1,2, 4, 6, 8,10,12,14,16,18, 20, 22 und 24 vorgelegt wird, gelingt es, spezifische, Fumonisine bzw. Mykotoxine abbauende Gene zu klonieren und zu exprimieren, wobei beispielsweise die Expression in E. coli und Pichia pastoris unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt wird, bei welcher Expression Enzyme entsprechend den Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13,15, 17, 19, 21,23 und 25 oder auch ein kompletter, diese Sequenzen enthaltender, rekombinanter Wirtsorganismus gewonnen werden können, wobei das wenigstens eine Enzym gegebenenfalls gemeinsam mit einem Cosubstrat auf einem zu behandelnden Rohmaterial eingesetzt wird. Mit einem nach einem derartigen Verfahren hergestellten Zusatzstoff gelingt es, einerseits beispielsweise Mykotoxine direkt auf dem Rohmaterial vollständig und zuverlässig abzubauen, wobei die spezifischen bei diesem Verfahren produzierten Enzyme den Abbau von Fumonisinen und von Zwischenprodukten des Abbauweges katalysieren, und andererseits Mykotoxine beispielsweise auch direkt bei der Bioethanolherstellung in der Maische für die Alkoholherstellung abzubauen oder auch bei der Fierstellung von Nahrungsmitteln direkt in dem Fierstellverfahren abzubauen bzw. unschädlich zu machen.

[0010] Als pflanzliche Rohstoffe werden hiebei Getreide bzw. Getreideprodukte, Gräser, Obst oder Gemüse sowie Zwischenprodukte welche diese Stoffe zu Fierstellung von Nahrungs- oder Futtermittel enthalten, wie beispielsweise Silage, Obstmaische oder dgl. verstanden.

[0011] Als Zusatzstoffe werden vor allem Futtermittelzusätze, Nahrungsmittelzusätze sowie Zusätze zur Bioethanolherstellung verstanden.

[0012] Mit einem derartigen Verfahren gelingt es weiterhin, den Sphingolipidstoffwechsel, der durch eine Wechselwirkung der Fumonisine mit dem Enzym Ceramidsynthase behindert wird, aufrecht zu erhalten und gleichzeitig die Fumonisine biologisch zu nicht toxischen Substanzen abzubauen. Schließlich können technologische Anwendungen der Detoxifizierung erzielt werden, da dieses Verfahren auch im größeren technischen Maßstab anwendbar ist, so dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sicher und zuverlässig mykotoxinfreie Produkte hergestellt werden können.

[0013] Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Nukleinsäuresequenzen bzw. die mittels dieser Nukleinsäuresequenzen in prokaryotischen und eukaryotischen Wirtszellen exprimierten, in sauerstoffunabhängigem Milieu katalytisch wirkenden Enzyme sind nachfolgend aufgelistet. 2/65 österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15

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GCCTATCGCATCGCGACCGGCTCGGCGCCCATCCGTTCGCTCGGACAACCGGACACGCCAAAATGGTCGaCCAACTTCCAGGCGCGA tattcgaccgacgattgggcgcttctcgtgcagcagcgcttcatcgcagcatcggtgttcaatgccgacaatgtggagggcgtcgat acgaatttgaaccacgctccggcggtttggtacaccgacgcgacattgaccttcgacatcgcggcttttggccagaagcagcagctg tttctatcggtcaataatttgttcgaccgagatccgccaatagcgacgaacgaccccagcagtttttccagcccgaccagctctgcc tatgatccggtcggccgctattttaatgtcggggtccgtttccggatctga >Seq ID 22 (fumK) nicht vollständig atgcgcctcacgggcggagaattattggcacgatgtttggccgtcgaaggcgtccggtatgtcttcggcctcatgtcgccggaggtg gatccgctcctggctgcgctcgaagacaatgggatattgttcgtcccggtgcggcacgaggccgccgcagcctatatggccgagggc atttacaagaccaccggacaggtcgccgcgattgtcacgaatccgggtcccggtacggcaaaccttctgcctggagtcgtgacggca cgccacgaaggggttcccttcgtcgcaataacgtcccagcatcaacttggtgtcgtttatccctgcacgccaaaaacctttcaggga caagaccagatcgacctctttcgacccgcggttaaatggggcgcacccatcttcgcctggaaccggattgtcgaaatcacccatatg gcgttccgggaaatgtgggccggcaggccgggacccgttcagttggaaatcccgargtctgtgatgtatgktgtgggcgaacgagga ccacggtagaagtttacrgatcgccgaca. . . 8/65 österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15 >Seq ID 24 atggaattgagccgccaacgagaccaggccttgagggagcgcgcccaagcggtgatcccgggcgggatgtacggtcacgagtcgacc

TATCTGATGCCCGAGGGCACGCCACAGTTCTTCAGTCGCGGCAAAGGCGCCCGACTTTGGGACGCCGäCGGCAACGAGTATGTCGAT

TACATGTGCGCCTATGGCCCCAACCTGCTGGGTTACGGCTTCGAACCCGTCQAAGCGGCCGCCGCAGCCCAGCAAGCCCGGGGCGAT accctgaccgggccgtcggaggtgatggtgcagttggcggaagacttcgtcgcgcaaatcagccacgcggactgggccatgttctgc aagaacggcacagacgccacctcaatggcgatggtcatcgcgcgcgcacacaccggccggaagacgatcctctgcgcgäaaggcgcc tatcatggggccgcgccttggtgcacgccgatcctggccggaacgctaccggaggatcgcgcctttgtagtctactacgactacaat gacgcccaaagcctcgtcgacgccttcgaggcccatcaggacgacgtcgcggcgatcttcgocacccctcaccgtcacgaggtqttc

AGCGACCAGATCGATCCTGATCCGGAATATGCGGCCAGCGTGCGGGCGCTCTGCGACAAGAGCGGCGCCCTGCTCGTCGTCGACGAA

GTTCGAGCCGGGTTCAGGATCGCGCGCGACTGCAGCTGGGCCAAGATCGGCGTCGCTCCGGATCTGAGCACCTGGGGCAAGTGCTTC

GCCAACGGCTATCCGATCTCGGCGGTCCTAGGGGGCGAAAAGGTGCGCAGCGCGGCAAAGGCCGTCTACGTCACCGGCTCGTTCTGG ttctcggccacgcccatggccgcagccgtcgaaaccctgaagcaaatccgcgagaccgactatctcgagcggatcaacgcggccggg acccgcctgcgcgagggcctgcagcagcaggctgctcacaacggctttacgttgcgccaaacggggcccgtctccatgccccaagtc ctcttcgaggaagatcccgattttcgggtcggctacggctgggttcgcgaatgcctgaagcgaggggtgtacttcagcccctaccat aacatgttcctgtcggcggcccatagcgaggcggacctggccaagacccttgcggctaccggcgacgccttcgtcgagctacgcgcc aagcttccgagcctagaaatccaccaacccctcctcgccctgagagcggcctaa

Enzyme

Sequenzen: >Seq ID 3 (FumA)

MRNV SDKAP PHETLTVWAAMIVGTAALMVLGIQPILLGALVEEGRIPAEGLGSAATVEI LAIAAGTCIGPVLMKTGYLRAKCAALCLMLAAINFGLTLPGFDLPIVACRAAAGALEGLS LSAAILIMTHNRRPDRLSGIFLGAQTIPQVISAYLLPTEIIPRWGSAGGFTILGILAAIA AIAALCLVDRVELDPTTVNDDLQWSPAAIVISMAAFVQFSGVGAAWSYLERLAAQHGFSG ETIGIAISGSLLCQVGGAWLAAWIGGRVGYRFALIAGSLLQAGNVIALAVADQPSWFISA SCAFGLFWLAMQPFQIRFAIAIDNSRQLAVLLTPIALVGLSAGPLLLSRFAGATDLRWIF VGSSTLLLASALLYLCASLFQPRGKVIAETVDV >Seq ID 5 (FumB)

MTSQVKLRSAAKRPRSPKSERGLARYESLLDATDRLLVDLDPDQVGLYQIAEEAGASPSS

VYHFFPTKEVÄHLALMRRYLEGLRNLDAMEVDIGQLESWQDLMKLDQIRARDYYNSHPPA

LKLLFGGYGGVEARKLDERYSEEIVSSMYGRYNGIFHMPQMENEALMFTICFAILDAVWA

VSFRRFGEITSDFLREGQAACIAYCRHYLPERTPSA >Seq ID 7 (FumC)

VASKFNCELLDLRSFVAVYETRSFSHAARLLNQSQPALSRRIQRLESLVGGPLFERTSRS LAETALGKELLPVAHRALELVDTSLFASPNVREFRWTDITIACVQTAAFHVLPRAARLYM DQNPRVRLRILDVPAVEAADLVASGEAEFGISIE SLLPS SLRFDALHEDPFGLACHRSHP LASLEILEWTQLKGESLIAVHRASRNRTLLDAELARNNIALEWRYEVAHLTTALGLIDAQ LGVAVMPRMVMPRSGRSEWWRPWAPWQRTIGIVQRRTGSMHPAAQQLLARLRAAWSS ANLGDIASREDGAS >Seq ID 9 (FumD)

VKEHQCRGGRASPAAPATWLARISVSRGASAIAWTFMLGATAIPVAAQTDDPKLVRHTQS

GAVEGVEGDVETFLGIPFAAPPVGDLRWRPPAPPRAWAGTRDGRRFAPDCIGNERLREGS

RAAGTSEDCLYLNIWSPKQVGKGGLPVMIWVYGGGFSGGSGAVPYYDGSALAQKGWWT

FNYRAGILGFLAHPALSKESPNGVSGNYGLLDMLAAFKWVQNNIREFGGDPNRVTVFGES

AGASALGLLLTSPLSESAFNQAILQSPGLARPLATLSESEANGLELGADISALRRADAGE

LTKIAQSRIPMSRQFTKPRPMGPILDGYVLRTLDVDAFAKGAFRKIPVLVGGNADEGRAF

TDRLPVKTVLEYRAYLTEQFGDEADAWERCYPANSDADVPAAVARLFGDSQFNNGIELLS

AAFAKWRTPLWRYRFTGIPGAGRRPATHGDEIPYVFANLGPSSVSMFGSLEGGAGASDIK

LATEMSAAWVSFAVHGVPDQGTKSHWPRFERRGEIMTFGSQVGSGEGLGVSPSKACQPSK 9/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 >Seq ID 11 (FumE)

LEFRRAKPANPQNSARPVRASARRPALRATGCALCLEGSKLRYDVAIIGGGNAALTAAVT AREAGASVLVIEHAPRAMRGGNSRHTRNMRTMHERPLSPLTGEYSADEYWNDLVRVTGGR TDEELARLVIRNTTDAIPFMTRCGVRFQPSLSGTLSLSRTNAFFLGGGKALVNAYYATAE RLGVDILYDSEVTEINLQQGWQRLQLRSRGFPVEVEAKAAIASSGGFQANLDWLSSAWG PAAANFIVRGTPYATGTVLKNLLEQGVASVGDPTQCHAVAIDGRAPKYDGGIVTRLDCVP FSIVVNKDALRFYDEGEDVWPKRYAIWGRLVAQQPDQIAFSIIDRQAEDLFMPSVFPPVQ ADTIAGLAEKLGLNPVTLERTVAE FNAACVPGE FGGQDLDDLHTEGIEPKKSNWARPIIV PPFSAYPLRPGITFTYLGVKVDSRARVIMETGEPTKNLFASGEIMAGSILGQGYLAGFGM AIGTVFGRIAGWEAARHAGF >Seq ID 13 (FumF)

MQDFDLVKMLSDLPSAPELEARRVMEVCNACRYCEGFCAVFPAMTLQRHFASGDLSHLAN LCHSCQGCYYACQYAPPHEFGINVPKALSELRLESYEQHAWPRPVAALYRKNALIISILS AACITGVLLLAAIFNGDALFAKHASVPGGGFYNVIP YQAMIAVAATTFL Y S ALALAIS LV RFSRTIGLGIKVLYQHVPVLRALRDAATLRYLGGSDGEGCNDADETFSTTRRKFHHALAY GFGLCFAATATGTIYDHMFGWPAPYALFSLPWLGTVGGIGMWGAIGLLWLKLAGEDAP RSPALLGPDVALLVLLLAIAATGLLLLAVRSTEVMGVALAVHLGWLAFFLVMPYSKFVH GIFRLTALVRHHADREASNGFASSPPTKKG >Seq ID 15 (FumG)

MEHMKSVRDRSSVMQIVRVASGNCLEQYDFFVYGFYAAYIARSFFPTGDNATSLMLSLAT

FGAGFLMRPLGAIFLGSYIDRVGRRKGLIVTLAIMAVGTLTIAMTPSYEAIGLLAPVIVL

VGRLLQGFSAGAESGGVSVYLAEIASPKSRGFFTSWQSASQQVAVMIAAAIGLALQSTLS

PEQMNDWGWRVPLLIGCLIIPVILWLRRSLPETKAYLHMEHKAHSIGESLRELQQSWGLI

LTGMAMSILTTTTFYMITAYTPTFGEKALGLSPQDVLLVTIMVGVSNFLWLPIGGALSDR

IGRTPILLWPVTVLAIAFPLMSWLVAAPTFGALAAVLLTFSACFGLYNGALIARLTEIM

PPAIRTLGFSLAFSLATSLFGGFTPLVSTALIHATGSNSAPAIWLCFAAFISFVGVAAST

RLSRPIAEGAR >Seq ID 17 (FumH)

MRAWYRNGELVLGAYADPIPAAGQVLVKTRACGICGSDLHFCDHAQAFTNLASRAGIAS MEVDLCRDIVLGHEFCGEIMEFGPSADRRFKPGQLVCSLPLAIGPTGARTIGYSDEYPGG LGEYMVLTEALLLPVPNGLPATCAALTEPMAVGWHAVEIAQVQPHHIPWIGCGPVGLAV VAALKHKQVAPIIASDPSPDRRALALRMGADAWDPREESPFRQAEKIARPVGQGGALSS SLLSKSQMIFECVGVPGMLRHAMDGASDGSEIMWGACMQPDAIEPMIGMFKALTIKFSR TYTGEE FAAVLHMIGEGALDVS PLVTD VIGLSDVP SAFEALRS PGAQAKVIVDPWR >Seq ID 19 (FumI)

MANGTRQKDLRERAERVIPGGMYGHESTRLLPPEFPQFFRRALGARIWDADEQPYIDYMC AYGPNLLGYRQSEIEAAADAQRLLGDTMTGPSEIMVNLAEAFVGMVRHADWAMFCKNGSD ATSTAMVLARAHTGRKTILCAKGAYHGASPWNTPHTAGILASDRVHVAYYTYNDAQSLSD AFKAHDGDIAAVFATPFRHEVFEDQALAQLEFARTARKCCDETGALLWDDVRAGFRVAR DCSWTHLGIEPDLSCWGKCFANGYPISALLGSNKARDAARDIFVTGSFWFSAVPMAAAIE TLRIIRETP YLETLIASGAALRAGLEAQSQRHGLELKQTGPAQMPQIFFADDPDFRIGYA WAAACLKGGVYVHPYHNMFLSAAHTVDDVTETLEATDRAFSAVLRDFASLQPHPILMQLA GA >Seq ID 21 (FumJ)

MYRKFRIEKPGKANSLLGAVALGTLAFPVSASAQDSDPASIGQPDEADTDRGTSEIWTG

SRLQNGFNSPTPVTAVSSEQLKEASPTNLADALNQLPVFNDSLKTSNPGTTPGTGNSGQN 10/65 österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15

LLNMRGLGSNRNLVLLNGNRFVATNFTGSVDINVLPQALVKRVDWTGGASAAYGSDAVS GVINFVLDEDLEGIRAELQSGVSTRGDLPSYGGSIAFGTSFÄDDRLHLLGSFEYFRQDGI RADEATGRRWFDIAAGQYPVPGATTGVTWPDIRSSRGSYGGLVTSGPLKGIAFLPGGVL GTFDYGNFTSSSFQSGGDGPRVNIGFAPDQLRYNAFLRAAYDVSDTVQVYAEGTYAYSHT NLGAFVISHVGGSNNFRIFRDNAFLPAPLATLMDRNAQASIWGRFSSDFPLVEIENFAK VYRGAAGFRADIGNGWKLDGSASFGLTDLELRENNLTINRNLYAAVDAVRDPAGNIVCRS TLAGLDQDCVPLNLFGTGSPSASAIDYVTADGVAQLRLEQYVAGLTISGDLGDSLSFGAG PVSVAAGIEYRKEKARQETDAISQATTSITGIRGAPAAQAGRPGGFNLYNPLPFSGSYDI KEGFVEIGVPILKDSALGRSLNLNGAVRYADYSQSGGVTTWKLGGEYEPIDGLRFRATRS RDIRGPSLVELFDPGRQATLNSIYGGQAVQTRFFTAGNADLRPEKADVLTFGAVLRPAFV PGFQFSVDRYWKVKGAIDFLLPQQEIDACDAGNTFFCDLITENPDGTITVTGPNLNLAV QKAAGIDFEAYYSRPVGGGTFSLRALATHHTSAYRIATGSAPIRSLGQPDTPKWSANFQA RY S TDDWALLVQQRFI AAS VFNADNVEGVDTNLNHAPAVWYTDATLTFDIAAFGQKQQLF LSVNNLFDRDPPIATNDPSSFSSPTSSAYDPVGRYFNVGVRFRI >Seq ID 23 (FumK) nicht vollständig MRLTGGELLARCLAVEGVRYVFGLMSPEVDPLLAALEDNGILFVPVRHEAAAAYMAEGIY KTTGQVAAIVTNPGPGTANLLPGWTARHEGVPFVAITSQHQLGWYPCTPKTFQGQDQI DLFRPAVKWGAPIFAWNRI VE ITHMAFREMWAGRPGPVQLEIPXSVMYWGERGPR - KFX DRR____ >Seq ID 25

MELSRQRDQALRERAQAVIPGGMYGHESTYLMPEGTPQFFSRGKGARLWDADGNEYVDYM

CAYGPNLLGYGFEPVEAAAAAQQARGDTLTGPSEVMVQLAEDFVAQISHADWAMFCKNGT

DATSMAMVIARAHTGRKTILCAKGAYHGAAPWCTPILAGTLPEDRAFWYYDYNDAQSLV

DAFEAHQDDVAAIFATPHRHEVFSDQIDPDPEYAASVRALCDKSGALLWDEVRAGFRIA

RDCSWAKIGVAPDLSTWGKCFANGYPISAVLGGEKVRSAAKAVYVTGSFWFSATPMAAAV

ETLKQIRETDYLERINAAGTRLREGLQQQAAHNGFTLRQTGPVSMPQVLFEEDPDFRVGY

GWVRECLKRGVYFSPYHNMFLSAAHSEADLAKTLAATGDAFVELRAKLPSLEIHQPLLAL RAA- [0014] Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung wird das erfindungsgemäße Verfahren so geführt, dass die Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, sauerstoffunabhängig bzw. anaerob abgebaut werden. Dadurch, dass die Mykotoxine, insbesondere Fumonisine sauerstoffunabhängig abgebaut werden, gelingt es, das erfindungsgemäße Verfahren so weiterzubilden, dass die Nukleinsäuresequenzen von Genen bzw. Enzyme ohne Zusatz von molekularem Sauerstoff sicher und zuverlässig die Abbaureaktionen durchführen, wodurch der so hergestellte Zusatzstoff in sämtlichen sauerstoffunabhängigen bzw. anaeroben Medien, wo Mykotoxine möglicherweise abgebaut werden müssen, zum Einsatz gelangen kann, wie beispielsweise in Nahrungsmitteln für Menschen und Tiere, der Bioethanolherstellung, aber auch zur Herstellung bzw. Produktion von gentechnisch veränderten, landwirtschaftlichen Nutzpflanzen.

[0015] Gemäß einer Weiterbildung wird das erfindungsgemäße Verfahren so geführt, dass das jeweilige Enzym mittels molekulargenetischer Methoden, Mutagenese oder molekularer Evolution verändert wird, und dass es wenigstens 90 % Sequenzidentität mit wenigstens einem der Enzyme der Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9,11,13,15, 17,19, 21, 25 oder der Acetolat-Synthase, welche die Sequenz ID-Nr. 23 umfasst, aufweist. Indem das Verfahren so geführt wird, dass das jeweilige Enzym vor seinem Einsatz in dem pflanzlichen Ausgangsmaterial mittels molekulargenetischer Methoden, Mutagenese oder molekularer Evolution verändert wird, gelingt es, die Enzyme in noch stabilerer und an den späteren Einsatzzweck angepasster Form herzustellen, wodurch der Sauerstoffunabhängige Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, 11 /65 österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15 noch weiter verbessert bzw. vervollständigt werden kann. Indem das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt so geführt wird, dass ein Enzym eingesetzt wird, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit wenigstens einem der Enzyme Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9,11,13,15,17,19, 21, 23 oder 25 aufweist, kann ein noch vollständigerer Abbau der Fumonisine sichergestellt werden, wobei gleichzeitig nicht nur Fumonisine, sondern auch verwandte bzw. strukturell ähnliche Mykotoxine vollständig insbesondere im anaeroben bzw. sauerstoffunabhängigen Milieu entgiftet werden können, wie zum Beispiel das AAL Toxin.

[0016] Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird das Verfahren so geführt, dass die Enzyme isoliert werden. Durch eine derartige Verfahrensführung können insbesondere Fumonisine vollständig und sauerstoffunabhängig abgebaut werden.

[0017] Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird das Verfahren so geführt, dass die Enzyme in einer Schutzhülle verkapselt werden. Durch Verkapseln der Enzyme in einer Schutzhülle gelingt es, die Enzyme ohne Veränderung, insbesondere ohne Abbau und Schädigung an ihren Einsatzort, insbesondere beispielsweise in den Verdauungstrakt, zu transportieren, so dass erst nach Auflösung der Schutzhülle, beispielsweise im Magen-Darm-Trakt von Menschen oder Tieren, die Enzyme zu wirken beginnen, wodurch ein noch gezielterer, rascherer und vollständiger Abbau der Mykotoxine im sauerstoffunabhängigen Milieu des Magen-Darm-Trakts erzielt werden kann, und gleichzeitig Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, daran gehindert werden können, ihre schädliche Wirkung auf diejenigen Lebewesen auszuüben, welche diese mit der Nahrung aufgenommen haben.

[0018] Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung wird das erfindungsgemäße Verfahren so geführt, dass die Enzyme aus Permease mit der Sequenz ID-Nr. 3, Carboxylesterase mit der Sequenz ID-Nr. 9, Tricarballylat-Dehydrogenase mit der Sequenz ID-Nr. 11, Citratverwertungsprotein mit der Sequenz ID-Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase mit der Sequenz ID-Nr. 17, Aminotransferase mit der Sequenz ID-Nr. 19 oder 25 und/oder Acetolactat-Synthase mit der Sequenz ID-Nr. 23 gewählt werden. Durch eine derartige Verfahrensführung können insbesondere Fumonisine glatt und vollständig im sauerstoffunabhängigen Milieu abgebaut werden. In diesem Fall wird bei den aus dem Gencluster der Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz ID-Nr. 1, welche aus einem prokaryotischen Stamm mit der Hinterlegungsnummer DSM 16254 stammt, isolierten Fum-Genclustern die Transkription der offenen Leserahmen durch einen bidirektionalen Promotor gesteuert bzw. geregelt, der zwischen FumA und Fuml, wie dies der nachfolgenden Tabelle 1 entnehmbar ist, angeordnet ist. Die Cluster codieren für Proteine, welche in der Regulierung der Genexpression, wie beispielsweise FumB und FumC, bei der Substratabtastung und dem Transport, wie beispielsweise FumA, FumJ, FumG und in dem Substratkatabolismus, wie beispielsweise FumD, FumE, FumF, FumH, Fuml, FumK involviert sind. Aus diesen Nukleinsäuresequenzen, welche für spezielle Gene bzw. Enzyme codieren, wurden gemäß einer bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens gemäß der Erfindung die Gene ausgewählt, welche für den Substratkatabolismus verantwortlich sind, wodurch die entsprechenden gebildeten Enzyme das Substrat, nämlich Fumonisine vollständig katabolisieren können.

[0019] In diesem Fall werden beispielsweise aus dem Gencluster der Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz ID-Nr. 1 ausgewählte, offene Leserahmen in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen zur Expression gebracht. Im bakteriellen Stamm mit der Hinterlegungsnummer DSM 16254 erfolgt die Transkription der im Gencluster mit der Sequenz ID-Nr. 1 enthaltenen, offenen Leserahmen, gesteuert bzw. geregelt durch einen bidirektionalen Promotor, der zwischen fumA und fuml, wie dies der nachfolgenden Fig. 1 entnehmbar ist, angeordnet ist. Die Gene codieren für Proteine, welche in der Regulierung der Genexpression, wie beispielsweise FumB und FumC, bei der Substraterkennung und dem Transport, wie beispielsweise FumA, FumJ, FumG, und im Substratkatabolismus, wie beispielsweise FumD, FumE, FumF, FumH, Fuml und FumK, involviert sind.

[0020] In der nachfolgenden Tabelle 1 ist die Bezeichnung der Gene des fumonisinkataboli-schen Genclusters aufgeführt, wobei O die Orientierung, nämlich f forward und r reverse, be-12/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 deuten. TABELLE 1

Gen Sequenz ID O Start Ende Länge Bezeichnung fumA 2 f 5214 6395 1182 Permease fumB 4 f 6418 7068 651 tetR-artiger Transkriptionsregulator fumC 6 f 7232 8176 945 lysR-artiger T ranskriptionsregulator fumD 8 f 8294 9916 1623 Carboxylesterase fumE 10 f 9876 11378 1503 T ricarballylatdehydrogenase fumF 12 f 11494 12537 1044 Citratverwertungsprotein B fumG 14 f 12541 13836 1296 T ricarballylatprotonensymport fumH 16 f 13957 15027 1071 Alkoholdehydrogenase fuml 18 r 5063 3795 1269 Aminotransferase fuiaJ 20 r 3513 679 2835 TonB-abhängiger Rezeptor fumK 22 r 551 ? ? Acetolactatsynthase (teilweise) [0021] Indem das Verfahren bevorzugt so geführt wird, das bei Einsatz von Aminotransferase mit der Sequenz ID-Nr. 19 oder der Sequenz ID-Nr. 25 als Cosubstrat ein Keton, insbesondere eine α-Ketosäure, eingesetzt wird, kann insbesondere beim Abbau der Aminogruppe von Fu-monisin und gleichzeitigem Einsatz von einer α-Ketosäure, wie beispielsweise Brenztraubensäure, die Aminogruppe an dem Fumonisinmolekül durch eine Ketogruppe ersetzt werden, wobei als Nebenprodukt dieser Reaktion Alanin entsteht, welches vollständig unschädlich ist, so dass ein vollständiger Abbau von Fumonisinen zu unschädlichen Substanzen sichergestellt ist.

[0022] Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung kann das erfindungsgemäße Verfahren auch so geführt werden, dass bei Einsatz von Carboxylesterase mit der Sequenz ID-Nr. 9 zusätzlich wenigstens ein Adsorbens, insbesondere gewählt aus Tonmineralien, eingesetzt wird. Indem bei Einsatz von Carboxylesterase mit der Sequenz ID-Nr. 9 zusätzlich wenigstens ein Adsorbens, insbesondere gewählt aus Tonmineralien, eingesetzt wird, kann auch ohne Zusatz von weiteren Enzymen ein vollständiges Unschädlichmachen der Mykotoxine, insbesondere Fumo-nisine erzielt werden, indem in einem ersten Schritt durch die Carboxylesterase aus dem Fumonisinmolekül die zwei Tricarballylsäure-Seitenketten abgespalten werden und sogenanntes hydrolysiertes Fumonisin gebildet wird. Hydrolysiertes Fumonisin, welches ein im Wesentlichen kettenförmiges Molekül ist, kann in weiterer Folge beispielsweise an Tonerdemineralien adsorbiert werden, so dass auch in einem einstufigen, enzymatischen Abbauverfahren ein vollständiges Unschädlichmachen der Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, erzielt werden kann.

[0023] Gemäß einer Weiterbildung wird das erfindungsgemäße Verfahren so geführt, dass der damit hergestellte Zusatzstoff in einem zu vergärenden, pflanzlichen Ausgangsmaterial bzw. in einer Maische zur Bioethanolherstellung eingesetzt wird. Indem der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Zusatzstoff in einem zu vergärenden, pflanzlichen Ausgangsmaterial bzw. in einer Maische zur Bioethanolherstellung eingesetzt wird, gelingt es, dass bei der Ethanolherstellung anfallende Coprodukte, nämlich den Trester, d.h. die getrockneten Körnerreste und unlösliche Bestandteile oder die Trockenschlempe (Dried Distiller's Grains with Solubles -DDGS), von Fumonisinen bzw. Mykotoxinen insbesondere in einem sauerstoffunabhängigen Milieu zu befreien.

[0024] Die Erfindung zielt weiterhin auf einen Zusatzstoff zum enzymatischen Abbau von Myko- 13/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 toxinen, insbesondere Fumonisinen, ab, mit welchem es sicher und zuverlässig gelingt, derartige Mykotoxine insbesondere sauerstoffunabhängig abzubauen bzw. zu detoxifizieren.

[0025] Zur Lösung dieser Aufgaben ist ein derartiger Zusatzstoff dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Enzym der Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11,13, 15,17, 19, 21 und 25 sowie eine Acetolat-Synthase, welche die Sequenz ID-Nr. 23 umfasst, oder wenigstens ein kompletter, diese Synthese enthaltender, rekombinanter Wirtsorganismus zur Expression dieser Enzymgensequenzen sowie gegebenenfalls zusätzlich wenigstens ein Cosubstrat für wenigstens eines bzw. einige der eingesetzten Enzyme und ein inerter Träger enthalten sind.

[0026] Ein derartiger Zusatzstoff, in dem wenigstens ein Enzym oder ein kompletter, diese Sequenzen enthaltender, rekombinanter Wirtsorganismus zur Expression dieser Enzymsequenzen sowie gegebenenfalls zusätzlich wenigstens ein Cosubstrat für wenigstens eines bzw. einige der eingesetzten Enzyme und ein inerter Träger enthalten sind, zeichnet sich dadurch aus, dass er zielgerichtet Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, abbaut und somit detoxifi-ziert. Durch den Einsatz eines erfindungsgemäßen Zusatzstoffes, welcher im Wesentlichen aus isolierten Enzymen sowie gegebenenfalls deren Cosubstraten und Trägern besteht, ergibt sich der Vorteil, dass diese ihre katalytische Aktivität in einer Umgebung und unter Bedingungen beibehalten, in welchem beispielsweise komplette Mikroorganismen nicht oder nur wenig aktiv wären, wobei gleichzeitig eine bedeutend höhere, spezifische Aktivität erzielt werden kann, sowie definierte Reaktionen unter Vermeidung von unerwünschten Nebenreaktionen katalysiert werden können.

[0027] Darüber hinaus können Probleme, welche gemäß dem Stand der Technik durch den Einsatz vermehrungsfähiger Keime auf landwirtschaftlichen Rohprodukten entstanden sind, mit Sicherheit hintangehalten werden und überdies weisen Zusatzstoffe, welche nur isolierte Enzyme enthalten, sowohl eine bessere Eignung zur Formulierung für eine gezielte und kontrollierte Aktivierung, d.h. beispielsweise an einer bestimmten Stelle des Verdauungstrakts, als auch die Vermeidung von unerwünschtem, erhöhtem Substratverbrauch auf. Um die Spezifität noch weiter zu erhöhen, ist der Zusatzstoff gemäß der vorliegenden Erfindung dahingehend bevorzugt weitergebildet, dass durch molekulargenetische Methoden, Mutagenese oder molekulare Evolution veränderte Enzyme eingesetzt sind.

[0028] Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung ist der Zusatzstoff so ausgebildet, dass ein Enzym eingesetzt ist, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit einem Enzym der Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21 oder 25 sowie der Acetolt-Synthase, welche die Sequenz ID-Nr. 23 umfasst, aufweist. Wenn ein Enzym eingesetzt ist bzw. wird, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit einem Enzym mit der Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9,11,13,15,17, 19, 21 oder 25 sowie der Acetolat-Synthase, welche die Sequenz ID-Nr. 23 umfasst, aufweist, gelingt es, neben den bevorzugt abzubauenden Fumonisinen auch weitere Mykotoxine sicher und zuverlässig sauerstoffunabhängig abzubauen, wodurch eine weitgehende Entgiftung der beispielsweise auf pflanzlichen Rohprodukten vorhandenen Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, erzielt werden kann.

[0029] Indem der Zusatzstoff so ausgebildet ist, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung entspricht, dass die Enzyme, veränderten Enzyme und/oder zu wenigstens 90 % identen Enzyme mit einer Schutzhülle ummantelt eingesetzt sind, kann sichergestellt werden, dass die Enzyme, die zu wenigstens 90 % identen Enzyme oder veränderten Enzyme vor einem vorzeitigen Aktivitätsverlust gesichert sind und sicher und zuverlässig an der vorgesehenen Stelle beispielsweise im Magen-Darm-Trakt ihre Wirkung entfalten.

[0030] Indem der Zusatzstoff bevorzugt so weitergebildet ist, dass die Enzyme aus einer Car-boxylesterase mit der Sequenz ID-Nr. 9, Tricarballylat-Dehydrogenase mit der Sequenz ID-Nr. 11, einem Citratverwendungsprotein mit der Sequenz ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase mit der Sequenz ID-Nr. 17, Aminotransferase mit der Sequenz ID-Nr. 19 und/oder ID-Nr. mit der Sequenz ID-Nr. 25 und/oder Acetolactat-Synthase mit der Sequenz ID-Nr. 23 gewählt sind, werden im Wesentlichen die zum Substratkatabolismus befähigten Enzyme zum Einsatz gebracht, so dass neben einer geringeren Menge an einzusetzenden Enzymen auch sichergestellt wer-14/65 österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15 den kann, dass keine unerwünschten Nebenreaktionen bei Einsatz der Enzyme auftreten.

[0031] Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist der Zusatzstoff so ausgebildet, dass eine Carboxylesterase mit der Sequenz ID-Nr. 9, eine Aminotransferase mit der Sequenz ID-Nr. 19 oder mit der Sequenz ID-Nr. 25, eine α-Ketosäure als Cosubstrat und ein inerter Träger enthalten sind. Indem der Zusatzstoff eine Carboxylesterase, eine Aminotransferase und eine α-Ketosäure als Cosubstrat neben einem inerten Träger aufweist, gelingt es insbesondere, Fumonisine, welche in Nahrungsmitteln enthalten sind, zuerst zu hydrolysieren, indem von den Fumonisinen Tricarballylsäurereste mit Hilfe einer Carboxylesterase abgespalten werden, und das so gebildete hydrolysierte Fumonisin in weiterer Folge unter Einwirkung der Aminotransferase und der α-Ketosäure als Cosubstrat, im vorliegenden Fall bevorzugt Brenztraubensäure, weiter umzusetzen, indem eine Aminogruppe von dem hydrolysierten Fu-monisinmolekül durch eine Ketogruppe ersetzt wird, so dass ein für beispielsweise Säuger völlig ungefährliches 2-Keto-hydrolysiertes Fumonisin entsteht, welches unverändert ausgeschieden werden kann, und als Nebenprodukt Alanin gebildet wird, welches ebenfalls keinerlei negative Eigenschaften beispielsweise auf einen Organismus ausübt bzw. aufweist.

[0032] Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist der Zusatzstoff derart weitergebildet, dass eine Carboxylesterase ID-Nr. 9, wenigstens ein Adsorbens, insbesondere wenigstens ein Tonmineral, sowie gegebenenfalls ein inerter Träger enthalten sind. Bei Einsatz von lediglich einer Carboxylesterase mit der Sequenz ID-Nr. 9 und wenigstens ein Adsorbens kann die Detoxifizierung der Fumonisine auch so geführt werden, dass lediglich die Tricarballylsäurereste abgespalten werden und das so gebildete, hydrolysierte Fumonisin an dem Adsorbens adsorbiert wird. Indem die Tricarballylsäurereste durch den Einsatz der Carboxylesterase abgespalten werden, entsteht ein im Wesentlichen langkettiges Molekül, welches leicht und zuverlässig adsorbiert werden kann, so dass lediglich durch einen gezielten Einsatz eines einzigen Enzyms eine vollständige Detoxifizierung durch insbesondere sauerstoffunabhängigen Abbau des Fumonisins und anschließende Adsorption sichergestellt werden kann.

[0033] Eine weitere Verwendung ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylesterase, wenigstens ein Adsorbens, insbesondere Tonmineral, sowie gegebenenfalls ein inerter Träger eingesetzt werden. Unter Verwendung einer Carboxylesterase und wenigstens eines Adsorbens gelingt es, Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, sicher und zuverlässig durch lediglich den Einsatz eines einzigen Enzyms zu entgiften, indem mit diesem Enzym bzw. mit Hilfe dieses Enzyms die Tricarballylsäure-Seitenreste von dem Fumonisin abgespalten werden und das dabei gebildete, langkettige, hydrolysierte Fumonisin in der Folge an dem Adsorbens adsorbiert wird, wodurch das Toxin sicher und zuverlässig unschädlich gemacht wurde.

[0034] Gemäß einer bevorzugten Verwendung wird der Zusatzstoff gemäß der Erfindung zur sauerstoffunabhängigen bzw. anaeroben Behandlung eines pflanzlichen Ausgangsmaterials bzw. einer Maische in der Bioethanolherstellung eingesetzt. In diesem Fall gelingt es, die in dem pflanzlichen Ausgangsmaterial bzw. Rohstoff enthaltenen Mykotoxine während der Bioethanolherstellung im sauerstoffunabhängigen Milieu sicher und zuverlässig unschädlich zu machen, so dass der Rückstand aus der Ethanolproduktion, nämlich der Trester oder die Trockenschlempe, nachfolgend entweder direkt oder nach Trocknung und Pelletierung ohne weitere Verarbeitung, insbesondere Detoxifizierung, als Futtermittel, welches frei von Mykotoxinen bzw. insbesondere Fumonisinen ist, eingesetzt werden kann.

[0035] Indem gemäß einer Weiterbildung der Erfindung der Zusatzstoff bei der Bioethanolherstellung in einem zu vergärenden, pflanzlichen Rohstoff bzw. in der Maische eingesetzt ist, wobei der Zusatzstoff so gewählt ist, dass die darin enthaltenen Enzyme vollständig aus Bakterien stammen, die den Katabolismus von Fumonisinen über einen hochspezifischen Abbauweg katalysieren, gelingt es, sie mit hoher Spezifität, Aktivität und Effizienz einzusetzen, wodurch der Zusatzstoff auch in einem sauerstoffunabhängigen Milieu technologisch angewandt werden kann.

[0036] Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen sowie Figuren näher dargestellt. In diesen zeigt: 15/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 [0037] Fig. 1 den Fumonisin-katabolischen Gencluster, [0038] Fig. 2 die Michaelis-Menten-Kurve für Fumonisin-Carboxylesterase FumD, [0039] Fig. 3 eine Abbaukurve von hydrolysiertem Fumonisin B15 [0040] Fig. 4 die Umwandlung von Fumonisin FB1 in hydrolysiertes Fumonisin HFB 1 nach

Zugabe von Carboxylesterase mit der Sequenz ID-Nr. 9 zeigt, und [0041] Fig. 5 den Abbau von hydrolysiertem Fumonisin HFB1 durch Zusatz von Aminotransfe- rase mit der Sequenz ID-Nr. 19.

[0042] In Fig. 1 ist ein Fumonisin katabolischer Gencluster als Teilsequenz von 15420 Basenpaaren eines mikrobiellen Stammes mit der Hinterlegungsnummer DSM 16254 dargestellt. In dem fum-Gencluster des prokaryotischen Stammes DSM 16254 wird die Transkription der offenen Leserahmen durch einen bidirektionalen Promotor gesteuert bzw. geregelt, welcher zwischen fumA und fuml angeordnet ist. Der Cluster codiert Proteine, welche in der Regulierung der Genexpression, wie beispielsweise FumB und FumC, in der Substraterkennung und dem Transport, wie beispielsweise FumJ, FumA und FumG und in einem Substratkatabolismus, wie beispielsweise FumD, FumE, FumF, FumH, Fuml und FumK involviert sind.

BEISPIELE BEISPIEL 1: DIE ENZYMKINETIK VON FUMONISINCARBOXYLESTERASE.

[0043] Das fumD Gen (Sequenz ID-Nr. 8), welches eine Fumonisincarboxylesterase codiert, wurde kloniert und in Pichia pastoris unter Verwendung von Standardverfahren exprimiert. Das his-getaggte Enzym wurde rückgewonnen und aus der überstehenden Lösung der Kultur durch Affinitätschromatographie gereinigt. Die Enzymkonzentration wurde bestimmt und die enzymkinetischen Parameter wurden mit sieben unterschiedlichen Substratkonzentrationen im Bereich zwischen 50 pg bis 25 mg FB-ι pro Liter und einer Enzymkonzentration von 0,33 ng/ml bestimmt. Die Reaktionen wurden in 20 mM Tris-Cl (pH 8,0) Puffer mit 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin gepuffert und bei 30 °C inkubiert. Proben wurden nach 0, 30, 60 120 und 240 Minuten Inkubation genommen und durch HPLC-MS/MS analysiert. Fumonisin B] (FB^ und hydrolysiertes Fumonisin B^ wurden quantifiziert basierend auf einer Kalibrierung mit den gereinigten Referenzsubstanzen und einem vollständig 13C markierten, internen FB1 Standard.

[0044] Fig. 2 zeigt die Michaelis-Menten-Kurve für die Hydrolyse von Fumonisin B1 (FB1) durch Fumonisin-Carboxylesterase FumD, welcher bei einer Enzymkonzentration von 0,33 ng/ml in Tris-Cl-Puffer (pH 8,0) bestimmt wurde, wobei anfängliche Enzymgeschwindigkeiten gegen die Substratkonzentration aufgetragen wurden. Die Michaelis-Menten-Kurve zeigt einen Abfall bei höheren Substratkonzentrationen, da die Enzymgeschwindigkeit basierend auf dem Produkt, d.h. hydrolysierter FBrBildung berechnet wurde. Da hydrolysiertes FB! aus FB^ in einer zweistufigen Reaktion über partiell hydrolysiertes FB-ι mit lediglich einer Tricarballylsäure-Seitenkette, die zurückbehalten wurde, und einer Seitenkette ausgebildet wird, die abgespalten wurde, war die Endproduktbildung bei hohen Substratkonzentrationen verzögert. Die Michaelis-Men-ten-Konstante KM wurde als 0,90 pmol/l berechnet, was 650 ppb äquivalent ist, und die Umwandlungszahl war 900 pro Sekunde.

[0045] Aus Fig. 2 ergibt sich, daß Fumonisine mit der Carboxylesterase in den relevanten Konzentrationsbereichen rasch und vollständig hydrolysiert werden können.

BEISPIEL 2: DIE KATALYTISCHE AKTIVITÄT VON HFB1 (HYDROLYSIERTES FUMONISIN B1) AMINOTRANSFERASE

[0046] Sequenzen ID-Nr. 18 und 24 wurden unter Verwendung von Standardverfahren kloniert und in E. coli exprimiert unter Steuerung bzw. Regelung eines Bakteriophagen T7 Promotors. Die Bakterienzellen wurden gesammelt in 50 mM Natriumphosphatpuffer, neuerlich suspendiert und durch Ultraschall lysiert. Hydrolysiertes Fumonisin wurde hinzugefügt und die Proben wur-16/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 den bei 25°C inkubiert. Proben wurden in Zeitintervallen genommen und durch HPLC-MS/MS analysiert. Es wurde keine Reduktion der hydrolysierten FB-ι Konzentration beobachtet. Wenn ein Cosubstrat, wie beispielsweise eine α-Ketosäure, wie Brenztraubensäure oder Oxalacetat, zu der Reaktion hinzugefügt wurde, konnte ein vollständiger Abbau des hydrolysierten Fumoni-sins zu 2-Keto-HFBi beobachtet werden, wie dies in Fig. 3 dargestellt ist. Diese Substanz ist für Säuger vollständig unschädlich.

BEISPIEL 3: ENZYMAKTIVITÄT IN DARMMILIEU

[0047] Zur Überprüfung der enzymatischen Aktivität von FUM-Carboxylesterase im Verdauungstrakt wurden schlachtfrische Schweinedärme verwendet und unter Ausschluß von Sauerstoff ins Labor transportiert und in einer anaeroben Sterilwerkbank untersucht. Etwa 10 cm lange Stücke von Duodenum und Jejunum wurden abgebunden und herausgeschnitten. Mit Kanülen wurde Fumonisin B1 in konzentrierter wäßriger Lösung auf eine Endkonzentration von etwa 10 ppm verdünnt eingespritzt und mit Darminhalt vermischt. Anschließend wurden 5 pg Fumonisin-Carboxylesterase in wäßriger Lösung, bzw. dasselbe Volumen Wasser in den Negativkontrollen, eingespritzt und eingemischt. Die Darmabschnitte wurden bei 3 9 °C inkubiert. Mit Hilfe von Kanülen wurden Proben gezogen und durch HPLC-MS/MS analysiert. Dabei zeigte sich, dass Fumonisin B1 im Duodenum und Jejunum zum Zeitpunkt der ersten Probenahme nach zwei Stunden bereits vollständig hydrolysiert war.

BEISPIEL 4: ERMITTLUNG DES TEMPERATURBEREICHS DER AKTIVITÄT VON FUMONISIN-CARBOXYLESTERASE

[0048] Zur Ermittlung des Temperaturbereichs, in dem Fumonisin-Carboxylesterase aktiv ist, wurden 1,6 ng/ml FUM-Carboxylesterase in 20 mM Tris-Cl Puffer, pH 7,0, mit 0,1 mg/ml BSA und 10 ppm Fumonisin B1 bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert. Dabei zeigte sich, dass das Temperaturoptimum für das Enzym bei 30°C lag. Auch bei 40°C und sogar 50°C wurde enzymatische Aktivität noch eindeutig festgestellt. Somit ist diese FUM-Carboxylesterase zur Anwendung unter den Temperaturbedingungen wie im Verdauungstrakt, oder im Zuge von Prozeßschritten der Lebens- oder Futtermittelherstellung, die bei erhöhter Temperatur stattfinden, geeignet.

BEISPIEL 5: BESTIMMUNG DES PH-BEREICHS DER AKTIVITÄT VON FUMONISIN- CAR-BOXYLESTERASE

[0049] Zur Bestimmung des pH-Bereichs, in dem Fumonisin-Carboxylesterase aktiv ist, wurde Teorell-Stenhagen-Puffer verwendet. Dieser Puffer lässt sich durch die Kombination von Citrat, Phosphat und Borat über einen Bereich von 10 pH Einheiten mit gleicher Pufferkapazität einstellen. FUM-Carboxylesterase wurde in einer Konzentration von 3,3 ng/ml mit 10 ppm Fumonisin B1 bei verschiedenen pH-Werten in diesem Puffer bei 25 °C inkubiert. Die höchste Aktivität zeigte sich bei pH 8,0, aber es konnte im gesamten Bereich von pH 5 bis pH 10 Aktivität festgestellt werden. Durch die Aktivität in diesem breiten pH-Bereich wird die technologische Anwendung des Enzyms als Futtermittelzusatz bzw. im Zuge der Verarbeitung von Lebens- und Futtermitteln ermöglicht.

BEISPIEL 6: FÜTTERUNGSVERSUCH MIT FERKELN

[0050] Der Versuch wurde in einem Versuchsstall mit 12 Buchten für jeweils 10 Tiere durchgeführt. Der Stall war ausgestattet mit Spaltenboden, Schalentränkern und einem computergesteuerten Fütterungssystem. Die Automaten waren entlang der Buchtenwände angeordnet. Das Stallklima wurde täglich automatisch aufgezeichnet und die Temperatur nach den Standardempfehlungen zur Ferkelaufzucht eingestellt.

[0051] 120 gemischt-geschlechtliche Absetzferkel (Alter: ca. 4 Wochen, durchschnittliches Einstellgewicht 8,21 kg) wurden für diesen Versuch eingesetzt. Jedes Ferkel wurde mit einer Ohrmarke versehen und einzeln gewogen. Die 120 Ferkel wurden auf 12 Buchten zufällig ver-17/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 teilt. Alle Ferkel entstammten dem österreichischen Zuchtprogramm ÖHYB (= (Edelschwein x Landrasse) x Pietrain).

[0052] Direkt nach dem Absetzen wurden die Ferkel für 2 Tage mit einem Starterfutter gefüttert, nach dieser Eingewöhnungsphase erfolgte die Umstellung auf das Versuchsfutter. Die Fütterung erfolgte 2-phasig: Absetzphase Tag 1-14, Aufzuchtphase Tag 15 -42. Das Versuchsfutter wurde buchtenindividuell über die Spotmix-Fütterungsanlage gemischt und je nach Anzahl der Ferkel, Gewichtsentwicklung und Futterverzehr zweimal täglich trocken zugeteilt. Wasser stand zur Aufnahme ad libitum zur Verfügung. Die 12 Buchten wurden in vier verschiedene Applikationsgruppen zu je drei Wiederholungen geteilt und erhielten die folgenden Einmischungen ins oben beschriebene Futter:

Gruppe Negativ-Kontrolle Keine Toxine, kein Enzymzusatz Positiv-Kontrolle 4-5,5 ppm Fumonisin B1 Versuchsgruppe 1 4 - 5,5 ppm Fumonisin B1 + Enzymmix 1 (Carboxylesterase, Aminotransferase, Pyruvat) 0,5 kg/t Futter Versuchsgruppe 2 4 - 5,5 ppm Fumonisin B1 + Enzymmix 1 (Carboxylesterase, Aminotransferase, Pyruvat, inerter Carrier) 1 kg/t Futter [0053] In der Positiv-Kontrolle wurden bei fast der Hälfte der Tiere respiratorische Probleme beobachtet, wobei es auch zu einem Ausfall kam. Alle anderen Gruppen erschienen gesund.

LEISTUNGSDATEN

Gruppe Anzahl der Tiere Anfangsgewicht (Durchschnitt, kg) Endgewicht (Durchschnitt, kg) Ausfälle Negativ-Kontrolle 30 8,34 26,82 Positiv-Kontrolle 30 8,17 24,77 1 Versuchsgruppe 1 30 8,08 26,69 Versuchsgruppe 2 30 8,25 27,03

BEISPIEL 7: ENZYMATISCHER ABBAU VON FUMONISINEN IN DER BIOETHANOLMAISCHE

[0054] Proben von Maismaische zur Bioethanolherstellung wurden genommen und bei 3 0 bis 65 °C unter Rühren inkubiert, wobei der Abbau von Fumonisin B1 nach Zugabe von 770 Units Carboxylesterase mit der Sequenz ID-Nr. 9 pro Kubikmeter Maische unter Rühren (Rührzeit in Minuten) untersucht wurde. Proben wurden nach der Probennahme durch Aufkochen inaktiviert und danach für die Analytik abzentrifugiert und ein Aliquot des Überstandes abgedampft. Der Rückstand wurde in 200 μΙ Probenpuffer, der C13-markierten, internen Fumonisin-Standard enthielt, aufgenommen, 1,5 min geschüttelt, abzentrifugiert und dann einer LC-MS-Analyse unterzogen. Hieraus ergibt sich, dass, wie dies in Fig. 4 dargestellt ist, Fumonisin FB1 vollständig in hydrolysiertes Fumonisin HFB1 umgewandelt wird. Nach Zusatz von Aminotransferase ID-Nr. 19 wird das hydrolysierte Fumonisin HFB1 vollständig zu unschädlichen Bestandteilen abgebaut, wie dies in Fig. 5 dargestellt ist. BEISPIEL 8: ABBAU VON FUMONISINEN UND IHREN DERIVATEN IN MAISTOR-TILLABREI UND CORNFLAKESBREI.

[0055] Die Wirksamkeit der Fumonisin-abbauenden Enzyme wurde in Maisbreiproben ("com 18/65 österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15 grits") für die Maistortilla- und Cornflakes-Herstellung untersucht. Fumonisin-kontaminierter Mais (ca. 1 ppm) wurde zu Maismehl vermählen, mit Wasser versetzt und aufgekocht. Für die Tortilla-Herstellung wurde der auf ca. 50 bis 60 °C abgekühlten Maisbrei mit einer Mischung von Proteinasen in alkalischer Lösung versetzt. Nach 30 bis 180 min, wenn der pH unter 9, vorzugsweise unter pH 8, gefallen ist, wurde eine Mischung aus Carboxylesterase und Aminotrans-ferase (jeweils 500 - 1000 Units/m3) hinzugefügt und für weitere 30 bis 60 min inkubiert. Im Falle der Cornflakes-Herstellung wurde ein Maisbrei aus gemahlenem Mais und Gerstenmalz für ca. eine Stunde im Druckgefäß aufgekocht; nach Abkühlung unter 60 °C (vorzugsweise 50 °C) wurde eine Enzymmischung, bestehend aus Carboxylesterase und Aminotransferase (jeweils 500 - 1000 Units/m3), hinzugefügt und für weitere 30 bis 60 min inkubiert. Aus dieser Mischung wurden dann Proben gezogen und auf FB1- bzw. HFB1-Rückstände wie in Beispiel 7 untersucht. HFB1-Levels waren in sämtlichen Proben unter 80 ppb, offensichtlich wurde das aus FB1 entstandene HFB1 kontinuierlich weiter umgesetzt. Die gemessenen Werte für FB1 sind in der u.a. Tabelle angeführt. TABELLE: ENZYMATISCHER ABBAU VON FB1 UND HFB1 IN MAISBREI; FUMO-NISINKONZENTRATION IN PPB (pG/KG)

Behandlungszeit mit Enzymmix (min) Tortillabrei (40 °C, 500 Units) Tortillabrei (50 °C, 1000 Units) Cornflakesbrei (35 °C, 500 Units) Cornflakesbrei (40 °C, 1000 Units) 0 852 866 912 1053 10 116 134 51 97 30 32 71 17 37 19/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15

SEQUENZPROTOKOLL <110> Erber Aktiengesellschaft <120> Verfahren zur Herstellung eines Zusatzstoffes für den enzymatischen Abbau von Mykotoxinen sowie Zusatzstoff und Verwendung desselben <130> P04227 <140> A8024/2009 <141> 2009-09-18 <160> 25 <170> Patentin version 3.3

<210> 1 <211> 15420 <212> DNA <213> Sphingopyxis sp. <220> <221> Seq ID 1 (fum) <222> (1)..(15420) <300> <308> FJ426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(15420) <40Q> 1 tgtcggcgat crgtaaactt ctaccgtggt cctcgttcgc ccacakcata catcacagac 60 rtcgggattt ccaactgaac gggtcccggc ctgccggccc acatttcccg gaacgccata 120 tgggtgattt cgacaatccg gttccaggcg aagatgggtg cgccccattt aaccgcgggt 180 cgaaagaggt cgatctggtc ttgtccctga aaggtttttg gcgtgcaggg ataaacgaca 240 ccaagttgat gctgggacgt tattgcgacg aagggaaccc cttcgtggcg tgccgtcacg 300 actccaggca gaaggtttgc cgtaccggga cccggattcg tgacaatcgc ggcgacctgt 360 ccggtggtct tgtaaatgcc ctcggccata taggctgcgg cggcctcgtg ccgcaccggg 420 acgaacaata tcccattgtc ttcgagcgca gccaggagcg gatccacctc cggcgacatg 480 aggccgaaga cataccggac gccttcgacg gccaaacatc gtgccaataa ttctccgccc 540 gtgaggcgca tgacgatctc cagtacgaaa ggtgagtgcc caggttccgg cacattcgct 600 gtggttagtt gatgcgctga tcggccaacc gactgagtgg agttggatgg ccgcacctta 660 ccctgtcgcg cataactctc agatccggaa acggaccccg acattaaaat agcggccgac 720 cggatcatag gcagagctgg tcgggctgga aaaactgctg gggtcgttcg tcgctattgg 780 cggatctcgg tcgaacaaat tattgaccga tagaaacagc tgctgcttct ggccaaaagc 840 cgcgatgtcg aaggtcaatg tcgcgtcggt gtaccaaacc gccggagcgt ggttcaaatt 900 cgtatcgacg ccctccacat tgtcggcatt gaacaccgat gctgcgatga agcgctgctg 960 cacgagaagc gcccaatcgt cggtcgaata tcgcgcctgg aagttggccg accattttgg 1020 cgtgtccggt tgtccgagcg aacggatggg cgccgagccg gtcgcgatgc gataggcaga 1080

Seite 1 20/65 österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15 ggtatggtgc gttgccagcg cacgaagact ataggcctcg aagtcaattc ccgccgcttt cactgtgatg gtgccgtccg gattctccgt atcgcacgcg tcgatttcct gctggggaag cacatagcga tcgaccgaaa actgaaaccc gaatgtaagg acgtccgcct tttcagggcg cgtctgcaca gcctgtccgc cataaattga tagctcgaca aggcttggcc cgcggatatc gtcgatcggc tcatattctc cgcccagctt atcggcatat cggacggcgc cgtttaagtt aatcgggacg ccgatttcga caaaaccttc tgggttgtag agattgaagc ctccaggccg tcccgtgatc gaggtcgtcg cctgcgatat gcgatattcg ataccagcgg cgaccgagac gaggtcgccg gaaatcgtga gtcccgccac atcagcggtg acatagtcga tggccgacgc cggcacgcaa tcttggtcga ggccggccag atcgcggacc gcatcgacgg cggcgtagag aagctcgagg tccgtaaggc caaaggaggc gtctgcccgg aagccggcag cgccgcggta gggaaagtcg cttgagaagc gaccgacaac cgtcgcgagt ggagccggaa ggaaggcgtt accgacatgc gatattacga atgcacccag cgcatacacc tgcacagtgt cggacacatc aagctgatcc ggggcgaagc cgatattcac cgagctcgta aaattcccgt agtcgaaggt gcctttcaga gggccggacg tgacaagtcc gggcacgacc gtgacgcctg tcgtagcgcc gaaccagcgg cgacccgttg cttcatcggc gctgccgagc aagtgcaacc ggtcgtcggc gtaggacggg aggtcgccgc gggttgaaac cagatcttcg tcgagcacga agttgatgac cgaggcgccg cccgtcacga catcgacgcg atcgaccgag cctgtgaaat tggtcgcgac gaacgtgccg ccgccgacgg ggcgtgagta ctggacagcc aggttgagat tgggacccgt tatgaggtcg cagaagaagg tgtttcctgc gaggaaatcg atcgcgccct tcaccttcac cggcacgaag gcggggcgta gcaccgcgcc caaatccgcg ttgccggcgg taaagaaccg attgagcgtc gcctgacggc cggggtcgaa tcgcgaacgg gtcgcgcgga acctgaggcc ccaggttgtt actccaccgg actggctgta cagcgaacgt cccagcgcgc tgtccttcag cttgatgtca tagcttcccg agaagggaag acctgcctgc gccgccggag cccccctgat cgcgtcggtt tcctgccggg ccttctcctt cgggcccgcg ccgaacgaca ggctatcgcc atattgctca agcctcagct gagcgacgcc gctcggcgag cctgtgccga agagattgag tgttgaacgg cagacgatat tgcccgcggg attgcggttg atggtgagat tgttttcacg cgagccatcg agtttccagc cattgccaat gacctttgcg aaattctcga tttcgaccaa gatcgaagcc tgggcatttc tgtccatgag atcacggaag atccggaaat tattcgagcc gttggtgtgg gaataagcat aggtgccctc atatgcggcg cgtaggaacg cgttgtagcg gcgcggtcca tcgccgccgc tctggaacga ccctaggact cctccgggca aaaacgcgat gccgtaggat ccgcgagaac tgcgaatatc gggcacggga tattggccgg cggcgatgtc ccggattccg tcctgtcgaa aatattcgaa aaacgaagtg ccgaaggcga tcgaaccgcc acccgactgg agctcggccc tgatgccttc gcccgaaacg gcatcggaac cgtaggcggc cttgaccaac gcctgcggca gcacgttgat gaaacggttg ccgttcagca ggacgaggtt Seite 2 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 21/65

österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15 ccggtttgac ccgaggccgc gcatgttgag caggttctga ccgctgttcc ccgttccggg 3180 tgtcgtgcca gggttggagg tcttcaagct gtcgttgaac acgggcagct ggttgagtgc 3240 gtcggcaagg ttggtcggag atgcctcctt caactgctcg ctggatacgg ctgtaaccgg 3300 cgtcggcgaa ttgaagccgt tctggaggcg gctgccggtc acgacgattt cgctcgttcc 3360 ccggtccgtg tccgcttcgt ccggctgacc tatcgatgcg ggatcgctat cctgagcact 3420 ggcagagaca ggaaatgcga gggtgccgag cgctactgcg ccgagcaaac tatttgcctt 3480 gccgggcttt tcgattctga acttccgata catctgcagt ccctcccgaa ttgataggga 3540 ctccgtttga gtccccttgt ttcttgacgc cgccgtcgct caccacggtc cggtcggagg 3600 ctaagcgtcg ggcctaagga cccgcaattt gaacatcaaa tgcaatgatc ggaggcttca 3660 ttgcacttcg cgcatagacc ggcgcggtag ctgaaagtgc caataatcag ggattttgct 3720 gaacagttgc ggcatgacgt ccggcatcgg ccacgcggtt ggcggcatcg acgtggcttt 3780 cgcgtcgccg cccctcaagc accggcgagt tgcattaaaa tgggatgagg ctggagagac 3840 gcaaaatctc tgaggaccgc gctgaacgcg cgatccgtcg cctcgagggt ctccgttaca 3900 tcgtcaactg tatgggccgc agagagaaac atattgtgat agggatgaac atagacgccg 3960 cccttcaggc acgccgcggc ccacgcatag ccgatccgaa aatcgggatc gtccgcaaag 4020 aatatttgcg gcatctgcgc cgggcccgtc tgcttcaact caagaccatg gcgctgagac 4080 tgtgcctcca ggcctgcccg cagggcggcg ccgctggcga tcagcgtttc gagataaggc 4140 gtctctcgaa tgatcctgag ggtttcgatc gcggccgcca tcggtaccgc agagaaccag 4200 aaggagccgg tcacaaatat atcccgcgcc gcatcgcgcg ccttgttcga gcccagcagg 4260 gcggagatcg gatagccatt cgcaaagcat tttccccagc aactgagatc gggttcgata 4320 cccaaatgcg tccagctgca atcgcgcgcc acccggaaac ctgcgcgcac atcgtcaacg 4380 accagaagcg caccggtctc gtcacaacat tttcgagcgg tgcgcgcgaa ctcaagctgg 4440 gcgagggcct ggtcctcaaa tacttcgtgt cggaaaggtg tggcaaagac agccgcaata 4500 tcgccatcgt gcgccttgaa cgcgtccgat aagctttggg cgtcgttata ggtataatat 4560 gcgacatgca cgcgatcgga agcgagaatc ccggcagtat gcggagtgtt ccacggggaa 4620 gcgccatgat aggcgccttt ggcgcataat atggttttgc gccccgtatg ggcacgcgcg 4680 agaaccatcg ccgttgaggt ggcatcgctg ccatttttgc agaacatcgc ccaatccgca 4740 tgacggacca tgcccacaaa ggcttcggcg aggttgacca tgatctccga aggaccggtc 4800 atggtgtcgc cgagaagtcg ctgcgcatca gccgcggctt cgatttcgga ttgccggtaa 4860 ccgagcaaat ttggcccata cgcgcacata tagtcgatat agggctgctc gtcggcgtcc 4920 caaattcgtg cccccagcgc gcgcctgaag aactggggga attctggcgg cagcaaccgt 4980 gtcgactcgt ggccgtacat cccgcccgga atgacccgtt cggcgcgttc tctgagatct 5040 ttctgccttg ttccgttcgc cataatgcac ctctcgcgat aaataatggg taaaaatcca 5100 cgaaattcaa cgattcgtga tctgaaagag atatatcttg Seite 3 taatatactg I tataattata 5160 22/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 cacaatgcgc aateggaega cgggatagcg gggcagggag gacggggaaa tetatgegga 5220 acgtcagcga caaggcgccg ccccacgaga cgctcaccgt agtegtegeg geaatgateg 5280 ttggcacggc egeettgatg gtgcttggaa tacagcccat ccttctcggc gcccttgtag 5340 aggaggggcg tattcccgcc gaggggttgg gateggegge aacggtggaa atactggcga 5400 tcgcggcggg aacatgcatc ggacccgttc ttatgaagac gggatatctg cgggcgaaat 5460 gcgcggcact ctgcttaatg ctcgccgcaa teaaettegg attgacgttg ccgggtttcg 5520 atttgcccat cgtggcttgc egageggeag cgggagccct ggaaggtett tcgctcagcg 5580 cggcgatcct gatcatgact cataatcggc ggccggaccg getgagegga atatttetgg 5640 gcgcgcagac gataeegeag gtaatatctg ettatttget cccgacggag attatteege 5700 gctgggggag cgcaggcggc ttcacgatcc tgggcattct cgcggcgatc gccgcgatcg 5760 eggetctgtg cctcgtcgat egegttgage tcgatccgac gaeegttaae gaegaettge 5820 agtggtcacc cgcggcgatc gteatttega tggeggeatt cgttcaattc tcgggggtcg 5880 gtgccgcatg gagetatetg gagcgactgg ctgcgcagca eggatttteg ggagaaacga 5940 teggtatege catttccggg agtttgcttt gccaggtagg cggggcttgg ctggccgctt 6000 ggatcggtgg gegggtegga tategetteg ccttaatcgc tgggagcctg cttcaggcgg 6060 geaaegtgat cgcattggcg gtggccgatc agccaagctg gtttatttcc gcttcctgtg 6120 ctttcggcct gttctggttg gegatgeage ccttccaaat ccgcttcgcg ategegatag 6180 ataacagccg geagettget gtactgctga cgccgatcgc cctcgtcggg ttgagegegg 6240 ggcccttgtt gctctctcgc tttgccgggg cgaccgactt gegetggate tttgtgggga 6300 gttcgacctt gttgctggcc agcgcgcttc tgtatctttg cgcttctctg tttcaaccgc 6360 geggaaaggt gategetgaa acggtggacg tatgaaaaag aeggateggg gttcgcgatg 6420 acatcgcagg teaagetteg tagegeggea aagcggccgc gcagtcctaa aagegagega 6480 ggtcttgctc gttaegagte ettgettgat gcgaccgaca ggctgttggt egatetagae 6540 cccgatcagg teggteteta teagattgea gaggaagegg gtgcctcacc gtcgtccgtc 6600 tatcatttct ttccgaccaa ggaagtggct catctcgctc tgatgegeeg etatetggag 6660 gggeteegga atctcgacgc gatggaagte gacatcggcc agetegaaag ctggcaggac 6720 ctgatgaagt tggatcagat eagggegega gactattata atagccaccc gcccgccctc 6780 aagettetgt teggeggata tggcggggtc gaggccagaa agettgaega gcgatactcc 6840 gaggaaateg tgagctccat gtatggcaga tacaacggca ttttccatat gccgcaaatg 6900 gagaatgagg ctctcatgtt cacgatctgc ttegeaatte tegaegeggt atgggccgtc 6960 tcctttcgcc ggttcggtga aattaegteg gattttette gggaggggca ageggettge 7020 attgcctatt gccgacacta tctgcccgag cgaacgccat eagegtgaat ccgttcaacg 7080 atatgeagga atgtccgttg cgttgagttc ggttctgagt teggteggtt aggaggcccc 7140 gcgataaacc aacgctcttc tgtcgaaggg atgtcgcctg gttcgaccag gccctgcgaa 7200

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österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 gtcagccgca atcaacgagg cagatgtcaa cgtggccagc aagttcaact gtgagttact 7260 cgatctgcga tcatttgttg cggtgtatga aacgcgaagt tttagccacg ccgcgcggct 7320 tctgaatcaa tcgcagcccg cgctcagccg gagaatccag cgcctcgaga gtctcgtggg 7380 cggtccgttg ttcgagcgga ccagtcggtc gcttgccgaa acggcgctcg gcaaagagtt 7440 gctcccggtc gcccaccgag cgttggaact tgtcgatacg tcgctgtttg cgtcgcccaa 7500 tgtccgggag ttccgctgga cagacatcac gattgcctgt gtacagaccg ccgccttcca 7560 tgttctcccg cgagctgcgc gcttgtacat ggatcaaaat ccgagggtcc gactccgcat 7620 ccttgacgtg ccggcggtcg aggctgcgga cctggttgcg agcggcgagg cggagttcgg 7680 catcagcatt gagagcctgt tgccatcaag cctgcggttc gatgcgctcc acgaggaccc 7740 gttcggcctg gcatgccacc gaagccatcc gctggcgtcg ctcgagatcc ttgaatggac 7800 gcaattgaaa ggtgaaagcc tgatcgccgt tcaccgtgcg agccggaacc gcacgttgct 7860 cgatgccgaa ctcgcgcgca acaatatcgc gctggaatgg cggtatgagg tcgcgcatct 7920 gacgacggcg ctgggattga tcgatgcgca attgggtgtc gctgttatgc cccgcatggt 7980 tatgccccgc tcgggtcggt cggaggtcgt ctggcgcccc gtcgtcgcgc cggtcgtcca 8040 acgcacgatc ggcatcgttc agcgccgcac cggctcgatg caccctgccg cacagcaatt 8100 gcttgcgcgg ctccgcgcgg cctggtcgtc cgccaatctg ggcgacatcg cgtctcgcga 8160 agatggggca tcgtgacacg cgttctatgc gcctgcagca tcgatgctca cgatcattgc 8220 atttgctgag agacgaacgc gaagataccg ctgggtcaca ggatatcagt ccatcgaggc 8280 gggagagaaa tgtgtgaaag agcaccaatg ccgtggcggc cgggcgtccc ccgctgcgcc 8340 cgccacgtgg cttgcgcgga tcagcgtttc ccggggggcc tccgccatcg cctggacctt 8400 catgcttggc gcaactgcca ttcccgtggc tgcgcaaact gacgatccga agctcgttcg 8460 tcatacccag tcgggcgccg tcgagggcgt cgagggcgac gtcgagactt ttttgggaat 8520 acccttcgcg gctccgccgg tcggcgacct gcgatggcgg ccgccggctc cgccgagggc 8580 gtgggcgggc accagggacg gccgccgctt tgcgcccgat tgcatcggga acgagcggct 8640 tagagagggg agccgggctg ccgggacgag cgaagactgc ctctatctga atatctggtc 8700 tcccaaacag gtcggtaagg gggggctccc cgtcatgatc tgggtttacg gcggtgggtt 8760 tagcggcggt tctggcgcgg tgccatatta tgacggctct gcgctcgcgc agaagggcgt 8820 ggtggtcgtc acgttcaact atcgcgccgg gattctgggc tttcttgccc atccggcgct 8880 ttcaaaggaa agtccgaatg gcgtgtcggg caactatggt cttctcgaca tgctcgcggc 8940 gttcaaatgg gttcagaaca acataaggga gttcggcgga gacccgaacc gtgtcacggt 9000 ctttggcgag tccgccggcg cgagcgcgct cggactgctc ctgacctcgc cgctcagtga 9060 gagcgccttc aatcaggcga tactgcaaag tccgggtctg gccaggccgc tcgccacgct 9120 ttctgaaagc gaagcgaatg ggctggagct gggagccgat atttctgctc tacggcgtgc 9180 cgatgcgggc gaattgacga agatcgcgca atcgcgaata Seite 5 cccatgtcgc gccagttcac 9240 24/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 caagccgcgg ccgatgggtc cgattctgga cggctatgtt ttgcgcaccc ttgacgtcga 9300 tgccttcgcc aagggggcct tccgcaagat acccgttctg gtcggcggaa acgccgacga 9360 agggcgcgct tttacggatc gcctgccggt caaaacggtc cttgaatatc gagcctatct 9420 cacagaacaa tttggtgacg aggcggacgc atgggagcgt tgttatcccg cgaactccga 9480 cgccgacgtc cccgccgccg ttgcccgtct ttttggggat agtcagttca acaacgggat 9540 cgagctgctc tcggcagcct tcgcgaaatg gcgaacgccg ctttggagat atcgctttac 9600 gggcattcca ggagccggcc gtcgccccgc cacgcatgga gacgaaattc cctatgtctt 9660 cgcaaatctg gggccgtcgt ccgtatctat gtttgggtcg ctcgaaggcg gcgccggggc 9720 gtcggacatc aaacttgcga ccgaaatgtc cgcggcctgg gtgagcttcg cggtgcacgg 9780 ggtccccgat cagggcacga aatcgcactg gccgcgcttc gagcggcgag gggagatcat 9840 gacttttggt tcgcaggttg gctctgggga aggtcttgga gtttcgccga gcaaagcctg 9900 ccaaccctca aaatagcgcc cggcctgtgc gtgcttcagc acgccgtccc gctttgcggg 9960 cgacgggctg tgccctctgc ctagaaggaa gtaagttgcg ctacgacgtc gcgataattg 10020 gaggtggcaa cgctgcattg acggcagccg tgacggcgcg tgaagcgggg gcctcggttc 10080 ttgtgatcga gcatgcgccg cgcgccatgc gcggcggcaa cagtcgtcac acacgcaata 10140 tgcgtacgat gcacgaacgt cccctgtcgc cgttgaccgg tgaatattcg gcggacgaat 10200 attggaatga tcttgtccgc gtcacggggg ggcgcaccga cgaagaactc gcgcggctcg 10260 ttatccgcaa caccaccgac gctattccct tcatgacgcg ctgcggtgtg cgtttccagc 10320 cctcgctgtc gggcacgctg agtttatcgc gaaccaacgc attcttcctt ggcggcggga 10380 aggcgcttgt aaacgcatat tacgccacgg ccgaacggct aggcgtcgat attctctatg 10440 attctgaggt gaccgagatc aaccttcagc aaggcgtcgt gcagcgtctg caattgcgca 10500 gccggggatt ccctgtcgaa gtggaagcca aggctgccat cgcctcgtcc ggaggattcc 10560 aggcaaatct tgactggctc tcaagcgcat gggggcctgc tgcggcgaac ttcatcgtac 10620 ggggcacgcc atatgcgact ggcacggtgc tcaagaacct gttggagcaa ggcgtcgcct 10680 cggtgggaga tccaacccaa tgccatgctg tcgcgatcga tgggcgagcg cccaaatacg 10740 acggcggcat cgtcacacga ctggactgcg ttcccttctc gatcgtcgtc aacaaggacg 10800 ccttgcgctt ctacgatgaa ggcgaagatg tgtggccgaa gcgttacgcc atatggggtc 10860 gcttggtggc acagcagcct gatcagatcg ctttcagcat aatcgatcgg caggccgaag 10920 acctcttcat gccgtcagtg ttcccccccg tgcaagcgga cacgatcgcg ggtctggccg 10980 agaaactcgg tctgaatccc gtaaccctgg aacgcacggt ggccgaattc aacgccgcat 11040 gcgtgcccgg cgaattcggc ggccaagatc tcgacgacct ccacaccgag ggaatcgaac 11100 caaagaaatc caactgggcc cgaccgatta ttgtgccccc gttcagcgcc tatcctctcc 11160 ggcccgggat caccttcacc tatctcggcg tcaaggtaga cagccgtgcg cgggtcatca 11220 tggagacagg tgagccgaca aaaaacctgt ttgcttcggg ggaaataatg gcgggcagca 11280

Seite 6 25/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 ttctcggcca aggttatctc gctggatttg tcgcgggttg ggaggccgca cgtcatgcag ttgccgtcgg cgccggagct ggaagccagg tattgcgaag ggttctgcgc ggtatttcct ggcgatctca gccacctcgc caatctctgc caatacgccc ctccgcatga gttcggaata ctcgagagct acgagcagca tgcttggccc gcgctcatca tttccatctt gtcggcggca atcttcaacg gggatgcact tttcgcgaaa aacgttattc cttatcaggc gatgattgcc ctggcgctgg cgatcagtct cgttcgcttt ctttatcagc acgtgccggt tcttcgggcg ggcggcagcg acggcgaggg gtgtaacgac aaatttcatc acgeccttgc ctatggettc acgatctacg atcatatgtt cggctggccg gtcctaggga ccgttggggg gatcggaatg aagctggecg gcgaagacgc tcctcgatca ttggtgcttc tgcttgccat agcggcaacg gaagtcatgg gcgtcgcgct cgccgtccat atgecataca gcaaatttgt ccacggtatc gctgaccgcg aggcaagtaa tggcttcgcc atggaacata tgaagtccgt tcgcgatcgc agtggcaact gtctcgagca atatgatttc gcgagaagct tttttccgac cggcgataac tttggcgctg gtttcctcat gaggcccttg cgcgtcgggc gtcggaaagg cctgatcgtg accattgcga tgactccaag ctatgaggca gtcgggcgac ttttgcaggg tttttccgct ttggcggaaa ttgcgtcgcc caaatcgaga cagcaggtgg ccgtcatgat cgccgccgcg ccggagcaaa tgaacgactg gggatggcgg cccgtgatac tctggctgcg ccggtctctc cacaaggcgc attcgatcgg cgaatccctc ttgacgggca tggcgatgtc gatcctcacg gaatggcgat tggtaccgta ttcggccgca gattttgatc tegtaaaaat gctgtctgac cgcgttatgg aggtgtgcaa cgcgtgccgc gcaatgacct tgcagcgtca tttcgccagc cactcgtgcc aaggttgcta ttacgcctgc aacgttccaa aggcgctgtc ggagttgcgg cggccggtcg ccgctctcta tcgcaagaat tgcataaccg gcgtccttct gcttgccgcc cacgcatcgg tgcccggcgg cgggttttac gtcgcggcga ccacatttct ttattccgcg tcgcggacga tcggtctggg aattaaggtt ctacgcgatg cggcgactct gcgatatctc gcggacgaga cattttcgac gacccggcga ggactttgtt tcgcggccac agccacgggc gcgccctatg cgcttttcag cttgccggtc gtcgtgggcg cgatcggcct actctggctc ccggcactgc ttgggccgga tgttgccctg ggcctcctcc ttttagcggt ccgcagcacc ctcggcgtcg tcttggcctt ctttttggtg ttcaggctca cggctctcgt gcgccatcat tccagccctc ccacgaaaaa gggttaaaca agtagcgtca tgcagatcgt gagagtggcg ttcgtttacg gcttctatgc ggcatatatt gcgacatcgc tcatgctttc attggccact ggggcgattt ttctcgggtc ctacatcgat acactcgcga tcatggccgt cggaaccctc attggattac tcgcaccggt tatcgtgctc ggagcagagt cgggtggcgt ctcagtgtac ggcttcttca cctcgtggca gtctgccagc atcggtcttg cgctgcaatc aacgctttca gtgcccttgt tgatcggatg cttgattatc ccggaaacga aagcctatct ccacatggag cgcgaattgc aacagagctg ggggctgatc acgaccacct tttacatgat taccgcctat Seite 7 11340 11400 11460 11520 11580 11640 11700 11760 11820 11880 11940 12000 12060 12120 12180 12240 12300 12360 12420 12480 12540 12600 12660 12720 12780 12840 12900 12960 13020 13080 13140 13200 13260 13320 26/65 österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15 acgccgacat ttggcgagaa agcactcgga ctgagcccgc aagatgtcct gctggttacc 13380 atcatggtcg gcgtgtcgaa cttcctgtgg cttccgatcg ggggtgctct ctcggatcgt 13440 atcggtagaa ccccgatcct actggtcgtg ccggtcaccg ttctcgccat cgcctttccc 13500 ctgatgagct ggctcgtcgc ggcaccgaca ttcggagcgc ttgcagctgt tctgctgact 13560 ttctccgcat gctttggact ctataatggg gcgctcatcg cgagactcac cgagattatg 13620 cctcccgcca ttagaaccct tggcttctcg ctggcgttca gtctcgcgac ctcgctgttc 13680 ggcggcttca ccccattggt aagtacggcg ctaatccacg cgacgggcag caattccgcg 13740 cctgcaatct ggctctgttt tgcggctttc atcagcttcg tcggtgtggc cgcatcgacc 13800 cggctgagcc ggccaatcgc cgaaggcgcc agataggaca atcagagaat gcccgtgcgg 13860 caatgaagcg agattcgggc ggtaggtgcg ctggcggcac ttcgcgaaga gccgttgcgg 13920 acggctgaaa cgatgatggt atgaatgggc taagacatga gagcagtagt ttaccgaaat 13980 ggcgaacttg tcctgggggc ctatgctgat ccgatacccg ccgccgggca ggtgctcgtc 14040 aagaccagag catgcggcat ctgcggatct gaccttcatt tttgcgatca tgcgcaggcg 14100 tttacgaacc ttgcatcgcg ggcgggtatc gcctctatgg aagttgattt gtgtcgagac 14160 atcgttctgg ggcatgaatt ctgtggcgag attatggagt tcgggccctc tgcggatcgt 14220 cgcttcaaac ccggacagct tgtgtgctcg ctgccgctgg cgatcggtcc gaccggagcg 14280 cggacgattg gctactcgga tgagtatccc ggcgggctcg gcgaatatat ggtCCtcacg 14340 gaagcgctct tgctgcctgt tccgaacggc cttccggcga cctgcgcggc gttgacggag 14400 ccgatggcgg tgggatggca tgccgtcgag atcgcgcagg ttcaaccaca tcacatccct 14460 gtggtgatcg ggtgcggacc ggtcgggttg gcagtcgtcg ctgccctgaa acataagcaa 14520 gttgctccga ttattgcgtc ggatccatcg cccgatcggc gtgctcttgc tctgcggatg 14580 ggcgccgacg ccgttgtcga tccgcgcgaa gaatcaccct ttcgccaggc cgagaagatc 14640 gcacgeccgg tcggacaagg tggggccctg tccagctcat tgctgtcaaa gtctcaaatg 14700 atattcgaat gcgtaggggt gccgggcatg cttcggcatg cgatggacgg cgcgtccgac 14760 gggtccgaga tcatggtcgt tggcgcatgc atgcagccgg acgcgatcga gcccatgatc 14820 gggatgttta aagcgctcac gatcaaattc tcgcgaactt acacgggtga ggaattcgcc 14880 gcggtgcttc acatgatagg tgagggcgca ctcgacgtat ctecgctcgt taecgatgtg 14940 attggcctgt ccgatgtccc gtccgcgttt gaggctctac ggagtecagg cgcccaagca 15000 aaagtgattg tggacccttg gcgctgagcc tgaggatgcc aagggtgcga cgttgggcat 15060 cgtcaaagaa ggcgacgttg acccggtatg tgaacatccc catattcttc cgcagctgaa 15120 gcagttggta aacatgccaa aatatgaact gtagtattgc gtcggggttc tcattgtggg 15180 gtttgccatt gtcatcgctc gcacccggcg acaaagatta gatgtacttc cgataatccg 15240 tgctetcgac ctggccttcc ttcatatatt tcaggacctc tccgaccatg cgtgcggcgc 15300 ggatcgggat cggcaggcgt tggttcatct gggtcgagtt ccagttgatc ttcgtaagag 15360 Seite 8 27/65 österreichisches patentmt AT 507 363 B1 2011-05-15 agaacacctc ctcggctaac tgcgccgcgg tactatcgca ggatcgtctc gagcgtycgc 15420

<210> 2 <211> 1182 <212> DNA <213> sphingopyxis sp. <220> <221> Seq ID 2 (fumA) <222> CD(1182) <300> <308> FD426269 <309> 2009-06-11 <313> CI).. (H82) <400> 2 atgcggaacg tcagcgacaa ggcgccgccc cacgagacgc tcaccgtagt cgtcgcggca 60 atgatcgttg gcacggccgc cttgatggtg cttggaatac agcccatcct tctcggcgcc 120 cttgtagagg aggggcgtat tcccgccgag gggttgggat cggcggcaac ggtggaaata 180 ctggcgatcg cggcgggaac atgcatcgga cccgttctta tgaagacggg atatctgcgg 240 gcgaaatgcg cggcactctg cttaatgctc gccgcaatca acttcggatt gacgttgccg 300 ggtttcgatt tgcccatcgt ggcttgccga gcggcagcgg gagccctgga aggtctttcg 360 ctcagcgcgg cgatcctgat catgactcat aatcggcggc cggaccggct gagcggaata 420 tttctgggcg cgcagacgat accgcaggta atatctgctt atttgctccc gacggagatt 480 attccgcgct gggggagcgc aggcggcttc acgatcctgg gcattctcgc ggcgatcgcc 540 gcgatcgcgg ctctgtgcct cgtcgatcgc gttgagctcg atccgacgac cgttaacgac 600 gacttgcagt ggtcacccgc ggcgatcgtc atttcgatgg cggcattcgt tcaattctcg 660 ggggtcggtg ccgcatggag ctatctggag cgactggctg cgcagcacgg attttcggga 720 gaaacgatcg gtatcgccat ttccgggagt ttgctttgcc aggtaggcgg ggcttggctg 780 gccgcttgga tcggtgggcg ggtcggatat cgcttcgcct taatcgctgg gagcctgctt 840 caggcgggca acgtgatcgc attggcggtg gccgatcagc caagctggtt tatttccgct 900 tcctgtgctt tcggcctgtt ctggttggcg atgcagccct tccaaatccg cttcgcgatc 960 gcgatagata acagccggca gcttgctgta ctgctgacgc cgatcgccct cgtcgggttg 1020 agcgcggggc ccttgttgct ctctcgcttt gccggggcga ccgacttgcg ctggatcttt 1080 gtggggagtt cgaccttgtt gctggccagc gcgcttctgt atctttgcgc ttctctgttt 1140 caaccgcgcg gaaaggtgat cgctgaaacg gtggacgtat ga 1182

<210> 3 <211> 393 <212> PRT <213> Sphingopyxis sp.

Seite 9 28/65 <220> österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 <221> Seq id 3 (FumA) <222> CD · (393) <300> <308> FJ426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(393) <400> 3

Met Arg Asn val Ser Asp Lys Ala Pro Pro His Glu Thr Leu Thr Val 1 5 10 15 val val Ala Ala Met Ile val Gly Thr Ala Ala Leu Met val Leu Gly 20 25 30 Ile Gin Pro Ile Leu Leu Gly Ala Leu val Glu Glu Gly Arg ile Pro 35 40 45 Ala Glu Gly Leu Gly Ser Ala Ala Thr val Glu Ile Leu Al a II e Ala 50 55 60 Ala Gly Thr Cys Ile Gly pro val Leu Met Lys Thr Gly Tyr Leu Arg 65 70 75 80 Ala Lys cys Ala Ala 85 Leu Cys Leu Met Leu 90 Ala Ala ile Asn Phe 95 Gly Leu Thr Leu Pro Gly Phe Asp Leu Pro ile val Ala Cys Arg Ala Ala 100 105 110 Ala Gly Ala Leu Glu Gly Leu Ser Leu Ser Ala Ala Ile Leu Ile Met 115 120 125 Thr His Asn Arg Arg Pro Asp Arg Leu Ser Gly ile phe Leu Gly Ala 130 135 140 Gin Thr Ile Pro Gin val Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Pro Thr Glu Ile 145 150 155 160 Ile Pro Arg Trp Gly ser Ala Gly Gly Phe Thr ile Leu Gly ile Leu 165 170 175 Ala Ala Ile Ala Ala Ile Ala Ala Leu cys Leu val Asp Arg Val Glu 180 185 190 Leu Asp pro Thr Thr val Asn Asp Asp Leu Gin Trp Ser Pro Ala Ala 195 200 205 Ile val Ile Ser Met Ala Ala phe val Gin Phe Ser Gly val Gly Ala 210 215 220 Ala Trp Ser Tyr Leu Glu Arg Leu Ala Ala Gin His Gly Phe Ser Gly 225 230 235 240

Seite 10 29/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15

Glu Thr Ile Gly ile Ala Ile ser Gly ser Leu Leu Cys Gin val Gly 245 250 255 Gly Ala Trp Leu Ala Ala Trp ile Gly Gly Arg val Gly Tyr Arg Phe 260 265 270 Ala Leu rle Ala Gly Ser Leu Leu Gin Ala Gly Asn val ile Ala Leu 275 280 285 Ala Val Ala Asp Gin pro ser Trp Phe Ile Ser Ala Ser Cys Ala Phe 290 295 300 Gly Leu Phe Trp Leu Ala Met Gin Pro Phe Gin Ile Arg Phe Ala Ile 305 310 315 320 Ala ile Asp Asn Ser Arg Gin Leu Ala val Leu Leu Thr Pro ile Ala 325 330 335 Leu Val Gly Leu ser Ala Gly Pro Leu Leu Leu Ser Arg Phe Ala Gly 340 345 350 Ala Thr Asp Leu Arg Trp Ile Phe val Gly Ser Ser Thr Leu Leu Leu 355 360 365 Al a Ser Ala Leu Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Leu Phe Gin Pro Arg Gly 370 375 380 Lys Val ile Ala Glu Thr val ASp Val 385 390

<210> 4 <211> 651 <212> DNA <213> sphingopyxis sp. <220> <221> Seq ID 4 (firniß) <222> (1)..(651) <300> <308> F3426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(651) <400> 4 atgacatcgc aggtcaagct tcgtagcgcg gcaaagcggc cgcgcagtcc taaaagcgag 60 cgaggtcttg ctcgttacga gtccttgctt gatgcgaccg acaggctgtt ggtcgatcta 120 gaccccgatc aggtcggtct ctatcagatt gcagaggaag cgggtgcctc accgtcgtcc 180 gtctatcatt tctttccgac caaggaagtg gctcatctcg ctctgatgcg ccgctatctg 240 gaggggctcc ggaatctcga cgcgatggaa gtcgacatcg gccagctcga aagctggcag 300

Seite 11 30/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 gacctgatga agttggatca gatcagggcg cgagactatt ataatagcca cccgcccgcc 360 ctcaagcttc tgttcggcgg atatggcggg gtcgaggcca gaaagcttga cgagcgatac 420 tccgaggaaa tcgtgagctc catgtatggc agatacaacg gcattttcca tatgccgcaa 480 atggagaatg aggctctcat gttcacgatc tgcttcgcaa ttctcgacgc ggtatgggcc 540 gtctcctttc gccggttcgg tgaaattacg tcggattttc ttcgggaggg gcaagcggct 600 tgcattgcct attgccgaca ctatctgccc gagcgaacgc catcagcgtg a 651

<210> 5 <211> 216 <212> PRT <213> sphingopyxis sp. <220> <221> Seq ID 5 (FUUlB) <222> (1)..(216) <300> <308> FJ426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(216) <400> 5

Met Thr Ser Gin Val Lys Leu Arg Ser Ala Ala Lys Arg Pro Arg Ser 15 10 15

Pro Lys ser Glu Arg Gly Leu Ala Arg Tyr Glu ser Leu Leu Asp Ala 20 25 30

Thr Asp Arg Leu Leu Val Asp Leu Asp Pro Asp Gin Val Gly Leu Tyr 35 40 45

Gin Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala ser pro ser Ser Val Tyr His Phe 50 55 60

Phe Pro Thr Lys Glu Val Ala His Leu Ala Leu Met Arg Arg Tyr Leu 65 70 75 80

Glu Gly Leu Arg Asn Leu Asp Ala Met Glu val Asp ile Gly Gin Leu 85 90 95

Glu ser Trp Gin Asp Leu Met Lys Leu Asp Gin Ile Arg Ala Arg asd 100 105 HO

Tyr Tyr Asn Ser His Pro Pro Ala Leu Lys Leu Leu Phe Gly Gly Tvr 115 120 125

Gly Gly val Glu Ala Arg Lys Leu Asp Glu Arg Tyr ser Glu Glu Ile 130 135 140 val Ser Ser Met Tyr Gly Arg Tyr Asn Gly ile Phe His Met Pro Gin 145 150 155 160

Seite 12 31/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15

Met Glu Asn Glu Ala Leu Met Phe Thr Ile Cys Phe Ala xle Leu Asp 165 170 175

Ala val Trp Ala Val Ser Phe Arg Arg Phe Gly Glu Ile Thr Ser Asp 180 185 190 phe Leu Arg Glu Gly Gin Ala Ala Cys Ile Ala Tyr Cys Arg His Tyr 195 200 205

Leu Pro Glu Arg Tljr Pro Ser Ala 210 215

<210> 6 <211> 945 <212> DNA <213> Sphingopyxis sp. <220> <221> seq ID 6 (futnc) <222> (1) .. (945) <300> <308> FJ426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(945) <400> 6 gtggccagca agttcaactg tgagttactc gatctgcgat catttgttgc ggtgtatgaa 60 acgcgaagtt ttagccacgc cgcgcggctt ctgaatcaat egcagcccgc gctcagccgg 120 agaatccagc gcctcgagag tctcgtgggc ggtccgttgt tcgagcggac cagtcggtcg 180 cttgccgaaa cggcgctcgg caaagagttg ctcccggtcg cccaccgagc gttggaactt 240 gtcgatacgt cgctgtttgc gtcgcccaat gtccgggagt tccgetggac agacatcacg 300 attgcctgtg tacagaccgc cgccttccat gttcteccgc gagctgcgcg cttgtacatg 360 gatcaaaatc cgagggtccg actccgcatc cttgacgtgc cggcggtcga ggctgcggac 420 ctggttgcga gcggcgaggc ggagttcggc atcagcattg agagcctgtt gccatcaagc 480 ctgcggttcg atgcgctcca cgaggacccg ttcggcctgg catgccaccg aagccatccg 540 ctggcgtcgc tcgagatcct tgaatggacg caattgaaag gtgaaagcct gatcgccgtt 600 caccgtgcga gccggaaccg cacgttgctc gatgccgaac tcgcgcgcaa caatatcgcg 660 ctggaatggc ggtatgaggt cgcgcatctg acgacggcgc tgggattgat cgatgcgcaa 720 ttgggtgtcg ctgttatgcc ccgcatggtt atgccccgct cgggtcggtc ggaggtcgtc 780 tggcgccccg tcgtcgcgcc ggtcgtccaa cgcacgatcg gcatcgttca gcgccgcacc 840 ggctcgatgc accctgccgc acagcaattg cttgcgcggc tccgcgcggc ctggtcgtcc 900 gccaatctgg gcgacatcgc gtctcgcgaa gatggggcat cgtga 945 <210> 7

Seite 13 32/65 AT 507 363 B1 2011-05-15 österreichisches

Patentamt <211> 314 <212> PRT <213> sphingopyxis sp. <220> <221> seq ID 7 (FumC) <222> (1).. (314) <300> <308> FJ426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(314) <400> 7 val Ala Ser Lys phe Asn Cys Glu Leu Leu Asp Leu Arg Ser Phe val 1 5 10 15 Ala Val Tyr Glu Thr Arg Ser Phe Ser His Ala Ala Arg Leu Leu Asn 20 25 30 Gin Ser Gin Pro Ala Leu Ser Arg Arg Ile Gin Arg Leu Glu Ser Leu 35 40 45 Val Gly Gly Pro 50 Leu Phe Glu 55 Arg Thr ser Arg ser 60 Leu Ala Glu Thr Ala Leu Gly Lys Glu Leu Leu pro Val Ala His Arg Ala Leu Glu Leu 65 70 75 80 val Asp Thr ser Leu phe Ala Ser pro Asn val Arg Glu Phe Arg Trp 85 90 95 Thr Asp Ile Thr He Ala cys Val Gin Thr Ala Ala Phe His Val Leu 100 105 110 pro Arg Ala Ala Arg Leu Tyr Met ASP Gin Asn Pro Arg val Arg Leu 115 120 125 Arg Ile Leu Asp Val Pro Ala Val Glu Ala Ala Asp Leu val Ala Ser 130 135 140 Gly Glu Ala Glu phe Gly Ile ser Ile Glu Ser Leu Leu Pro Ser ser 145 150 155 160 Leu Arg Phe Asp Ala Leu His Glu Asp Pro Phe Gly Leu Ala cys His 165 170 175 Arg ser His Pro Leu Ala Ser Leu Glu Ile Leu Glu Trp Thr Gin Leu 180 185 190 Lys Gly Glu Ser Leu Ile Ala val His Arg Ala Ser Arg Asn Arg Thr 195 200 205

Seite 14 33/65 AT 507 363 B1 2011-05-15 österreichisches

Patentamt

Leu Leu Asp Ala Glu Leu Ala Arg Asn Asn ile Ala Leu Glu Trp Arg 210 215 220 Tyr Glu Val Ala His Leu Thr Thr Ala Leu Gly Leu ile ASp Ala Gin 225 230 235 240 Leu Gly Val Ala val 245 Met Pro Arg Met val 250 Met Pro Arg ser Gly 255 Arg ser Glu Val Val Trp Arg Pro Val Val Ala Pro Val val Gin Arg Thr 260 265 270 He Gly Ile val Gin Arg Arg Thr Gly Ser Met His Pro Ala Ala Gin 275 280 285 Gin Leu Leu Ala Arg Leu Arg Ala Ala Trp Ser Ser Ala Asn Leu Gly 290 295 300 Asp Ile Ala ser Arg Glu ASp Gly Ala Ser 305 310

<210> 8 <211> 1623 <212> DNA <213> Sphingopyxis sp. <220> <221> seq ID 8 (fumD) <222> (1)..(1623) <300> <308> FD426269 <309> 2009-06-11 <313> ¢1)..(1623) <400> 8 gtgaaagagc accaatgccg tggcggccgg gcgtcccccg ctgcgcccgc cacgtggctt 60 gcgcggatca gcgtttcccg gggggcctcc gccatcgcct ggaccttcat gcttggcgca 120 actgccattc ccgtggctgc gcaaactgac gatccgaagc tcgttcgtca tacccagtcg 180 ggcgccgtcg agggcgtcga gggcgacgtc gagacttttt tgggaatacc cttcgcggct 240 ccgccggtcg gcgacctgcg atggcggccg ccggctccgc cgagggcgtg ggcgggcacc 300 agggacggcc gccgctttgc gcccgattgc atcgggaacg agcggcttag agaggggagc 360 cgggctgccg ggacgagcga agactgcctc tatctgaata tctggtctcc caaacaggtc 420 ggtaaggggg ggctccccgt catgatctgg gtttacggcg gtgggtttag cggcggttct 480 ggcgcggtgc catattatga cggctctgcg ctcgcgcaga agggcgtggt ggtcgtcacg 540 ttcaactatc gcgccgggat tctgggcttt cttgcccate cggcgctttc aaaggaaagt 600 ccgaatggcg tgtcgggcaa ctatggtctt ctcgacatgc tcgcggcgtt caaatgggtt 660 cagaacaaca taagggagtt cggcggagac ccgaaccgtg tcacggtctt tggcgagtcc 720

Seite 15 34/65 österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15 gccggcgcga caggcgatac gcgaatgggc ttgacgaaga atgggtccga ggggccttcc acggatcgcc ggtgacgagg gccgccgttg gcagccttcg gccggccgtc ccgtcgtccg cttgcgaccg ggcacgaaat caggttggct tag gcgcgctcgg tgcaaagtcc tggagctggg tcgcgcaatc ttctggacgg gcaagatacc tgccggtcaa cggacgcatg cccgtctttt cgaaatggcg gccccgccac tatctatgtt aaatgtccgc cgcactggcc ctggggaagg actgctcctg gggtctggcc agccgatatt gcgaataccc ctatgttttg cgttctggtc aacggtcctt ggagcgttgt tggggatagt aacgccgctt gcatggagac tgggtcgctc ggcctgggtg gcgcttcgag tcttggagtt acctcgccgc aggccgctcg tctgctctac atgtcgcgcc cgcacccttg ggcggaaacg gaatatcgag tatcccgcga cagttcaaca tggagatatc gaaattccct gaaggcggcg agcttcgcgg cggcgagggg tcgccgagca tcagtgagag ccacgctttc ggcgtgccga agttcaccaa acgtcgatgc ccgacgaagg cctatctcac actccgacgc acgggatcga gctttacggg atgtcttcgc ccggggcgtc tgcacggggt agatcatgac aagcctgcca cgccttcaat tgaaagcgaa tgcgggcgaa gccgcggccg cttcgccaag gcgcgctttt agaacaattt cgacgtcccc gctgctctcg cattccagga aaatctgggg ggacatcaaa ccccgatcag ttttggttcg accctcaaaa 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1623

<21Q> 9 <211> 540 <212> PRT <213> Sphingopyxis sp. <220> <221> Seq ID 9 (FumD) <222> (1)..(540) <300> <308> FJ426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(540) <400> 9

Val Lys Glu His Gin Cys Arg Gly Gly Arg Ala ser Pro Ala Ala Pro 15 10 15

Ala Thr Trp Leu Ala Arg ile Ser Val Ser Arg Gly Ala ser Ala Ile 20 25 30

Ala Trp Thr Phe Met Leu Gly. Ala Thr Ala ile Pro Val Ala Ala Gin 35 40 45

Thr Asp Asp pro Lys Leu val Arg His Thr Gin ser Gly Ala val Glu 50 55 60

Gly Val Glu Gly Asp Val Glu Thr Phe Leu Gly ile Pro phe Ala Ala 65 70 75 80

Seite 16 35/65

österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15

Pro pro val Gly Asp 85 Leu Arg Trp Arg pro 90 pro Ala Pro pro Arg 95 Ala Trp Ala Gly Thr Arg Asp Gly Arg Arg Phe Ala pro Asp Cys Ile Gly 100 105 110 Asn Glu Arg 115 Leu Arg Glu Gly Ser 120 Arg Ala Ala Gly Thr 125 Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Ser Pro Lys Gin val Gly Lys Gly Gly 130 135 140 Leu Pro val Met Ile Trp val Tyr Gly Gly Gly phe Ser Gly Gly ser 145 150 155 160 Gly Ala Val Pro Tyr Tyr ASp Gly Ser Ala Leu Ala Gin Lys Gly Val 165 170 175 val val val Thr 180 Phe Asn Tyr Arg Ala 185 Gly Ile Leu Gly Phe 190 Leu Ala His pro Ala 195 Leu ser Lys Glu ser 200 Pro Asn Gly Val ser 205 Gly Asn Tyr Gly Leu Leu Asp Met Leu Ala Ala Phe Lys Trp val Gin Asn Asn Ile 210 215 220 Arg 225 Glu Phe Gly Gly Asp 230 Pro Asn Arg val Thr 235 val Phe Gly Glu Ser 240 Ala Gly Ala Ser Al a Leu Gly Leu Leu Leu Thr Ser Pro Leu Ser Glu 245 250 255 Ser Ala Phe Asn Gin Ala ile Leu Gin Ser pro Gly Leu Ala Arg Pro 260 265 270 Leu Ala Thr Leu ser Glu ser Glu Ala Asn Gly Leu Glu Leu Gly Ala 275 280 285 Asp ile ser Ala Leu Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Leu Thr Lys Ile 290 295 300 Ala Gin Ser Arg ile Pro Met Ser Arg Gin Phe Thr Lys Pro Arg Pro 305 310 315 320 Met Gly Pro Ile Leu 325 Asp Gly Tyr val Leu 330 Arg Thr Leu Asp Val 335 ASp Ala Phe Ala Lys Gly Ala Phe Arg Lys ile pro Val Leu val Gly Gly 340 345 350

Seite 17 36/65 AT507 363B1 2011-05-15 österreichisches

Patentamt

Asn Ala ASP Glu Gly Arg Ala Phe Thr Asp Arg Leu Pro val Lys Thr 355 360 365 Val Leu Glu Tyr Arg Ala Tyr Leu Thr Glu Gin Phe Gly ASp GlU Ala 370 375 380 ASp Ala Trp Glu Arg Cys Tyr pro Ala Asn Ser Asp Ala Asp val Pro 385 390 395 400 Ala Ala val Ala Arg Leu Phe Gly Asp ser Gin phe Asn Asn Gly Ile 405 410 415 Glu Leu Leu Ser Ala Ala Phe Ala Lys Trp Arg Thr Pro Leu Trp Arg 420 425 430 Tyr Arg phe Thr Gly Ile Pro Gly Ala Gly Arg Arg pro Ala Thr His 435 440 445 Gly Asp 450 Glu Ile Pro Tyr Val 455 Phe Ala Asn Leu Gly 460 Pro ser Ser Val ser Met Phe Gly Ser Leu Glu Gly Gly Ala Gly Ala Ser Asp Ile Lys 465 470 475 480 Leu Ala Thr Glu Met Ser Ala Ala Trp Val ser Phe Ala val His Gly 485 490 495 val pro ASp Gin Gly Thr Lys Ser His Trp Pro Arg Phe Glu Arg Arg 500 505 510 Gly Glu ile Met Thr Phe Gly ser Gin val Gly Ser Gly Glu Gly Leu 515 520 525 Gly val Ser Pro ser Lys Ala Cys Gin pro Ser Lys 530 535 540

<210> 10 <211> 1503 <212> DNA <213> sphingopyxis sp. <220> <221> Seq ID 10 (furaE) <222> (1)..(1503) <300> <308> FD426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(1503) ttggagtttc gccgagcaaa gcctgccaac cctcaaaata gcgcccggcc tgtgcgtgct

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österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1503 tcagcacgcc gtcccgcttt gcgggcgacg ggctgtgccc tctgcctaga aggaagtaag ttgcgctacg acgtcgcgat aattggaggt ggcaacgctg cattgacggc agccgtgacg gcgcgtgaag cgggggcctc ggttcttgtg atcgagcatg cgccgcgcgc catgcgcggc ggcaacagtc gtcacacacg caatatgcgt acgatgcacg aacgtcccct gtcgccgttg accggtgaat attcggcgga cgaatattgg aatgatcttg tccgcgtcac gggggggcgc accgacgaag aactcgcgcg gctcgttatc cgcaacacca ccgacgctat tcccttcatg acgcgctgcg gtgtgcgttt ccagccctcg ctgtcgggca cgctgagttt atcgcgaacc aacgcattct tccttggcgg cgggaaggcg cttgtaaacg catattacgc cacggccgaa cggctaggcg tcgatattct ctatgattct gaggtgaccg agatcaacct tcagcaaggc gtcgtgcagc gtctgcaatt gcgcagccgg ggattccctg tcgaagtgga agccaaggct gccatcgcct cgtccggagg attccaggca aatcttgact ggctctcaag cgcatggggg cctgctgcgg cgaacttcat cgtacggggc acgccatatg cgactggcac ggtgctcaag aacctgttgg agcaaggcgt cgcctcggtg ggagatccaa cccaatgcca tgctgtcgcg atcgatgggc gagcgcccaa atacgacggc ggcatcgtca cacgactgga ctgcgttccc ttctcgatcg tcgtcaacaa ggacgccttg cgcttctacg atgaaggcga agatgtgtgg ccgaagcgtt acgccatatg gggtcgcttg gtggcacagc agcctgatca gatcgctttc agcataatcg atcggcaggc cgaagacctc ttcatgccgt cagtgttccc ccccgtgcaa gcggacacga tcgcgggtct ggccgagaaa ctcggtctga atcccgtaac cctggaacgc acggtggccg aattcaacgc cgcatgcgtg cccggcgaat tcggcggcca agatctcgac gacctccaca ccgagggaat cgaaccaaag aaatccaact gggcccgacc gattattgtg cccccgttca gcgcctatcc tctccggccc gggatcacct tcacctatct cggcgtcaag gtagacagcc gtgcgcgggt catcatggag acaggtgagc cgacaaaaaa cctgtttgct tcgggggaaa taatggcggg cagcattctc ggccaaggtt atctcgctgg atttggaatg gcgattggta ccgtattcgg ccgcatcgcg ggttgggagg ccgcacgtca tgcaggattt tga

<210> 11 <211> 500 <212> PRT <213> sphingopyxis sp. <220> <221> Seq id 11 (FumE) <222> (1)..C500) <300> <308> FJ426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(500) <400> 11

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AT507 363B1 2011-05-15 österreichisches

Patentamt

Leu Glu Phe Arg Arg Ala Lys pro Ala 1 5 Pro Val Arg Ala 5er Ala Arg Arg Pro 20 25 Ala Leu cys 35 Leu Glu Gly Ser Lys 40 Leu Gly Gly Gly Asn Ala Ala Leu Thr Ala 50 55 Gly Ala Ser Val Leu Val Ile Glu His 65 70 Gly Asn ser Arg His 85 Thr Arg Asn Met Leu Ser pro Leu Thr Gly Glu Tyr ser 100 105 Leu Val Arg Val Thr Gly Gly Arg Thr 115 120 Val Ile Arg Asn Thr Thr Asp Ala Ile 130 135 val Arg Phe Gin Pro Ser Leu Ser Gly 145 150 Asn Ala Phe phe Leu Gly Gly Gly Lys 165 Ala Thr Ala Glu Arg Leu Gly val Asp 180 185 Thr Glu Ile Asn Leu Gin Gin Gly val 195 200 ser Arg Gly phe Pro val Glu val Glu 210 215 Ser Gly Gly phe Gin Ala Asn Leu Asp 225 230 Pro Ala Ala Ala Asn 245 Phe Ile val Arg Thr val Leu Lys Asn Leu Leu Glu Gin 260 265

Asn Pro Gin Asn Ser Ala Arg 10 15 Ala Leu Arg Ala Thr Gly cys 30 Arg Tyr Asp val Ala Ile Ile 45 Ala Val Thr Ala Arg Glu Ala 60 Ala Pro Arg Ala Met Arg Gly 75 80 Arg Thr Met His Glu Arg pro 90 95 Ala Asp Glu Tyr Trp Asn Asp 110 Asp Glu Glu Leu 125 Ala Arg Leu Pro phe Met 140 Thr Arg Cys Gly Thr Leu Ser Leu ser Arg Thr 155 160 Ala Leu Val Asn Ala Tyr Tyr 170 175 Ile Leu Tyr Asp Ser Glu val 190 Val Gin Arg Leu 205 Gin Leu Arg Ala Lys Ala Ala Ile Ala Ser 220 Trp Leu ser Ser Ala Trp Gly 235 240 Gly Thr pro Tyr Ala Thr Gly 250 255 Gly val Ala Ser val Gly ASP 270

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österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 pro Thr Gin cys His Ala val Ala Ile Asp Gly Arg Ala Pro Lys Tyr 275 280 285 Asp Gly Gly ile Val Thr Arg Leu Asp Cys val pro Phe Ser He val 290 295 300 Val Asn Lys Asp Ala Leu Arg Phe Tyr Asp Glu Gly Glu Asp val Trp 305 310 315 320 Pro Lys Arg Tyr Ala 325 Ile Trp Gly Arg Leu 330 Val Ala Gin Gin Pro 335 Asp Gin Ile Ala Phe ser Ile Ile ASp Arg Gin Ala Glu Asp Leu Phe Met 340 345 350 Pro Ser Val Phe pro Pro val Gin Ala Asp Thr Ile Ala Gly Leu Ala 355 360 365 Glu Lys Leu Gly Leu Asn pro val Thr Leu Glu Arg Thr val Ala Glu 370 375 380 Phe Asn Ala Ala Cys Val Pro Gly Glu Phe Gly Gly Gin Asp Leu Asp 385 390 395 400 Asp Leu His Thr Glu Gly Ile Glu Pro Lys Lys Ser Asn Trp Ala Arg 405 410 415 Pro He Ile val pro Pro Phe Ser Ala Tyr Pro Leu Arg Pro Gly Ile 420 425 430 Thr Phe Thr Tyr Leu Gly val Lys Val Asp Ser Arg Ala Arg val Ile 435 440 445 Met Glu Thr Gly Glu pro Thr Lys Asn Leu Phe Ala Ser Gly Glu ile 450 455 460 Met Ala Gly Ser ile Leu Gly Gin Gly Tyr Leu Ala Gly Phe Gly Met 465 470 475 480 Ala Ile Gly Thr val phe Gly Arg Ile Ala Gly Trp Glu Ala Ala Arg 485 490 495

His Ala Gly Phe 500

<210> 12 <211> 1173 <212> DNA <213> Sphingopyxis sp. <22Q> <221> Seq ID 12 (fumF)

Seite 21 40/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 <222> CD -·(1173) <300> <308> FJ426269 <309> 2009-06-11 <313> CD.. (1173) <400> 12 atgcaggatt ttgatctcgt aaaaatgctg tctgacttgc cgtcggcgcc ggagctggaa 60 gccaggcgcg ttatggaggt gtgcaacgcg tgccgctatt gcgaagggtt ctgcgcggta 120 tttcctgcaa tgaccttgca gcgtcatttc gccagcggcg atctcagcca cctcgccaat 180 ctctgccact cgtgccaagg ttgctattac gcctgccaat acgcccctcc gcatgagttc 240 ggaataaacg ttccaaaggc gctgtcggag ttgcggctcg agagctacga gcagcatgct 300 tggccccggc cggtcgccgc tctctatcgc aagaatgcgc tcatcatttc catcttgtcg 360 gcggcatgca taaccggcgt ccttctgctt gccgccatct tcaacgggga tgcacttttc 420 gcgaaacacg catcggtgcc cggcggcggg ttttacaacg ttattcctta tcaggcgatg 480 attgccgtcg cggcgaccac atttctttat tccgcgctgg cgctggcgat cagtctcgtt 540 cgcttttcgc ggacgatcgg tctgggaatt aaggttcttt atcagcacgt gccggttctt 600 cgggcgctac gcgatgcggc gactctgcga tatctcggcg gcagcgacgg cgaggggtgt 660 aacgacgcgg acgagacatt ttcgacgacc cggcgaaaat ttcatcacgc ccttgcctat 720 ggcttcggac tttgtttcgc ggccacagcc acgggcacga tctacgatca tatgttcggc 780 tggccggcgc cctatgcgct tttcagcttg ccggtcgtcc tagggaccgt tggggggatc 840 ggaatggtcg tgggcgcgat cggcctactc tggctcaagc tggccggcga agacgctcct 900 cgatcaccgg cactgcttgg gccggatgtt gccctgttgg tgcttctgct tgccatagcg 960 gcaacgggcc tcctcctttt agcggtccgc agcaccgaag tcatgggcgt cgcgctcgcc 1020 gtccatctcg gcgtcgtctt ggccttcttt ttggtgatgc catacagcaa atttgtccac 1080 ggtatcttca ggctcacggc tctcgtgcgc catcatgctg accgcgaggc aagtaatggc 1140 ttcgcctcca gccctcccac gaaaaagggt taa 1173

<210> 13 <211> 390 <212> PRT <213> Sphingopyxis sp. <220> <221> Seq id 13 (FumF) <222> (1).. (390) c300> <308> F3426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(390) <400> 13

Met Gin Asp Phe Asp Leu val Lys Met Leu Ser Asp Leu Pro Ser Ala 15 10 15

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AT507 363B1 2011-05-15

Pro Glu Leu Glu Ala Arg Arg val Met Glu Val cys Asn Ala Cys Arg 20 25 30 Tyr Cys Glu Gly Phe cys Ala val Phe pro Ala Met Thr Leu Gin Arg 35 40 45 His Phe Ala Ser Gly Asp Leu Ser His Leu Ala Asn Leu cys His ser 50 55 60 cys Gin Gly Cys Tyr Tyr Ala cys Gin Tyr Ala pro Pro His GlU Phe 65 70 75 80 Gly Ile Asn Val Pro Lys Ala Leu Ser Glu Leu Arg Leu Glu Ser Tyr 85 90 95 Glu Gin His Ala Trp Pro Arg pro val Ala Ala Leu Tyr Arg Lys Asn 100 105 110 Ala Leu Ile Ile Ser Ile Leu ser Ala Ala Cys Ile Thr Gly Val Leu 115 120 125 Leu Leu Ala Ala Ile Phe Asn Gly Asp Ala Leu Phe Ala Lys His Ala 130 135 140 Ser Val Pro Gly Gly Gly Phe Tyr Asn val Ile pro Tyr Gin Ala Met 145 150 155 160 Ile Ala val Ala Ala Thr Thr Phe Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Ala 165 170 175 Ile Ser Leu val Arg Phe ser Arg Thr Ile Gly Leu Gly Ile Lys val 180 185 190 Leu Tyr Gin His val Pro val Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ala Ala Thr 195 200 205 Leu Arg Tyr Leu Gly Gly Ser Asp Gly Glu Gly Cys Asn Asp Ala Asp 210 215 220 GlU Thr Phe Ser Thr Thr Arg Arg Lys Phe His His Ala Leu Ala Tyr 225 230 235 240 Gly Phe Gly Leu Cys Phe Ala Ala Thr Ala Thr Gly Thr Ile Tyr Asp 245 250 255 His Met Phe Gly Trp Pro Ala Pro Tyr Ala Leu Phe Ser Leu Pro val 260 265 270 Val Leu Gly Thr val Gly Gly He Gly Met Val Val Gly Ala He Gly 275 280 285

Seite 23 42/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15

Leu Leu Trp Leu Lys Leu Ala Gly Glu Asp Ala Pro Arg Ser Pro Ala 290 295 300 Leu Leu Gly Pro ASp val Ala Leu Leu Val Leu Leu Leu Ala Ile Ala 305 310 315 320 Ala Thr Gly Leu Leu 325 Leu Leu Ala val Arg 330 Ser Thr Glu val Met 335 Gly Val Ala Leu Ala Val His Leu Gly Val val Leu Ala Phe Phe Leu Val 340 345 350 Met Pro Tyr Ser Lys phe val His Gly Ile Phe Arg Leu Thr Ala Leu 355 360 365 val Ara His His Ala Asp Arg Glu Ala Ser Asn Gly Phe Ala ser Ser 370 375 380

Pro Pro Thr Lys Lys Gly 385 390 <210> 14 <211> 1296 <212> DNA <213> Sphingopyxis sp. <220> <221> Seq ID 14 (fumG) <222> (!)..(1296) <300> <308> F3426269 <309> 2009-06-11 <313> CD .. (1296) <400> 14 atggaacata tgaagtccgt tcgcgatcgc agtagcgtca tgcagatcgt gagagtggcg 60 agtggcaact gtctcgagca atatgatttc ttcgtttacg gcttctatgc ggcatatatt 120 gcgagaagct tttttccgac cggcgataac gcgacatcgc tcatgctttc attggccact 180 tttggcgctg gtttcctcat gaggcccttg ggggcgattt ttctcgggtc ctacatcgat 240 cgcgtcgggc gtcggaaagg cctgatcgtg acactcgcga tcatggccgt cggaaccctc 300 accattgcga tgactccaag ctatgaggca attggattac tcgcaccggt tatcgtgctc 360 gtcgggcgac ttttgcaggg tttttccgct ggagcagagt cgggtggcgt ctcagtgtac 420 ttggcggaaa ttgcgtcgcc caaatcgaga ggcttcttca cctcgtggca gtctgccagc 480 cagcaggtgg ccgtcatgat cgccgccgcg atcggtcttg cgctgcaatc aacgctttca 540 ccggagcaaa tgaacgactg gggatggcgg gtgcccttgt tgatcggatg cttgattatc 600 cccgtgatac tctggctgcg ccggtctctc ccggaaacga aagcctatct ccacatggag 660

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österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15 cacaaggcgc attcgatcgg cgaatccctc cgcgaattge aacagagctg ggggctgatc 720 ttgacgggca tggcgatgtc gatcctcacg acgaccacct tttacatgat taccgcctat 780 acgccgacat ttggcgagaa agcactcgga ctgagcccgc aagatgtcct gctggttacc 840 atcatggtcg gcgtgtcgaa cttcctgtgg cttccgatcg ggggtgctct ctcggatcgt 900 atcggtagaa ccccgatcct actggtcgtg ccggtcaccg ttctcgccat cgcctttccc 960 ctgatgagct ggctcgtcgc ggcaccgaca ttcggagcgc ttgcagctgt tctgctgact 1020 ttctccgcat gctttggact ctataatggg gcgctcatcg cgagactcac cgagattatg 1080 cctcccgcca ttagaaccct tggcttctcg ctggcgttca gtctcgcgac ctcgctgttc 1140 ggcggcttca ccccattggt aagtacggcg ctaatccacg cgacgggcag caattccgcg 1200 cctgcaatct ggctctgttt tgcggctttc atcagcttcg tcggtgtggc cgcatcgacc 1260 cggctgagcc ggccaatcgc cgaaggcgcc agatag 1296

<210> 15 <211> 431 <212> PRT <213> Sphingopyxis sp. <220> <221> Seq ID 15 (FumG) <222> (1) .. (431) <300> <308> FJ426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(431) <400> 15

Met Glu His Met Lys Ser Val Arg Asp Arg ser Ser val Met Gin Ile 1 5 10 15 val Arg val Ala Ser Gly Asn cys Leu Glu Gin Tyr Asp Phe Phe val 20 25 30

Tyr Gly Phe Tyr Ala Ala Tyr Ile Ala Arg Ser Phe Phe Pro Thr Gly 35 40 45

Asp Asn Ala Thr ser Leu Met Leu ser Leu Ala Thr phe Gly Ala Gly 50 55 60

Phe Leu Met Arg Pro Leu Gly Ala Ile Phe Leu Gly Ser Tyr Ile Asp 65 70 75 80

Arg Val Gly Arg Arg Lys Gly Leu ile Val Thr Leu Ala Ile Met Ala 85 90 95 val Gly Thr Leu Thr Ile Ala Met Thr Pro ser Tyr Glu Ala Ile Gly 100 105 110

Seite 25 44/65 . österreichisches AT 507 363 1 patentamt Leu Leu Ala Pro val Ile val Leu Val Gly Arg Leu Leu Gin Gly phe 115 120 125 ser Ala Gly Ala Glu ser Gly Gly val Ser Val Tyr Leu Ala Glu ile 130 135 140 Ala Ser Pro Lys ser Arg Gly Phe Phe Thr ser Trp Gin Ser Ala ser 145 150 155 160 Gin Gin Val Ala val Met He Ala Ala Ala ile Gly Leu Ala Leu Gin 165 170 175 Ser Thr Leu Ser 180 Pro Glu Gin Met Asn 185 Asp Trp Gly Trp Arg 190 Val pro Leu Leu Ile Gly cys Leu Ile Ile Pro val ile Leu Trp Leu Arg Arg 195 200 205 Ser Leu Pro Glu Thr Lys Ala Tyr Leu His Met Glu His Lys Ala His 210 215 220 Ser Ile Gly Glu ser Leu Arg Glu Leu Gin Gin ser Trp Gly Leu ile 225 230 235 240 Leu Thr Gly Met Ala Met Ser Ile Leu Thr Thr Thr Thr Phe Tyr Met 245 250 255 Ile Thr Ala Tyr Thr pro Thr Phe Gly Glu Lys Ala Leu Gly Leu Ser 260 265 270 Pro Gin ASp Val Leu Leu val Thr ile Met Val Gly val Ser Asn phe 275 280 285 Leu Trp Leu Pro ile Gly Gly Ala Leu Ser ASp Arg Ile Gly Arg Thr 290 295 300 Pro Ile Leu Leu Val val Pro Val Thr val Leu Ala Ile Ala phe Pro 305 310 315 320 Leu Met ser Trp Leu val Ala Ala Pro Thr Phe Gly Ala Leu Ala Ala 325 330 335 Val Leu Leu Thr Phe Ser Ala cys Phe Gly Leu Tyr Asn Gly Ala Leu 340 345 350 Ile Ala Arg Leu Thr Glu ile Met Pro pro Ala Ile Arg Thr Leu Gly 355 360 365 Phe Ser Leu Ala Phe Ser Leu Ala Thr ser Leu Phe Gly Gly Phe Thr 370 375 380

Seite 26 45/65 AT 507 363 B1 2011-05-15 österreichisches

Patentamt

Pro Leu Val Ser Thr Ala Leu Ile His Ala Thr Gly Ser Asn Ser Ala 385 390 395 400 Pro Ala Ile Trp Leu Cys Phe Ala Ala Phe Ile Ser Phe Val Gly val 405 410 415 Ala Ala Ser Thr Arg Leu ser Arg pro Ile Ala Glu Gly Ala Arg 420 425 430

<210> 16 <211> 1071 <212> DNA <213> Sphingopyxis sp. <220> <221> Seq ID 16 (fumH) <222> (1)..(1071) <300> <308> FJ426263 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(1071) 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 <40Q> 16 atgagagcag tagtttaccg aaatggcgaa cttgtcctgg gggcctatgc tgatccgata cccgccgccg ggcaggtgct cgtcaagacc agagcatgcg gcatctgcgg atctgacctt catttttgcg atcatgcgca ggcgtttacg aaccttgcat cgcgggcggg tatcgcctct atggaagttg atttgtgtcg agacatcgtt ctggggcatg aattctgtgg cgagattatg gagttcgggc cctctgcgga tcgtcgcttc aaacccggac agcttgtgtg ctcgctgccg ctggcgatcg gtccgaccgg agcgcggacg attggctact cggatgagta tcccggcggg ctcggcgaat atatggtcct cacggaagcg ctcttgctgc ctgttccgaa cggccttccg gcgacctgcg cggcgttgac ggagccgatg gcggtgggat ggcatgccgt cgagatcgcg caggttcaac cacatcacat ccctgtggtg atcgggtgcg gaccggtcgg gttggcagtc gtcgctgccc tgaaacataa gcaagttgct ccgattattg cgtcggatcc atcgcccgat cggcgtgctc ttgctctgcg gatgggcgcc gacgccgttg tcgatccgcg cgaagaatca ccctttcgcc aggccgagaa gatcgcacgc ccggtcggac aaggtggggc cctgtccagc tcattgctgt caaagtctca aatgatattc gaatgcgtag gggtgccggg catgcttcgg catgcgatgg acggcgcgtc cgacgggtcc gagatcatgg tcgttggcgc atgcatgcag ccggacgcga tcgagcccat gatcgggatg tttaaagcgc tcacgatcaa attctcgcga acttacacgg gtgaggaatt cgccgcggtg cttcacatga taggtgaggg cgcactcgac gtatctccgc tcgttaccga tgtgattggc ctgtccgatg tcccgtccgc gtttgaggct ctacggagtc caggcgccca agcaaaagtg attgtggacc cttggcgctg a

<210> 17 <211> 356 <212> PRT

Seite 27 46/65 1071 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 <213> Sphingopyxis sp. <220> <221> Seq ID 17 (FumH) <222> (1)..(356) <300> <308> FJ426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(356) <400> 17

Met Arg Ala val Val Tyr Arg Asn Gly Glu Leu Val Leu Gly Ala Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Pro ile Pro Ala Ala Gly Gin Val Leu Val Lys Thr Arg Ala 20 25 30 cys Gly ile Cys Gly Ser ASP Leu His Phe Cys Asp His Ala Gin Ala 35 40 45 Phe Thr Asn Leu Ala Ser Arg Ala Gly Ile Ala Ser Met Glu val Asp 50 55 60 Leu Cys Arg Asp Ile Val Leu Gly His Glu Phe Cys Gly Glu Ile Met 65 70 75 80 Glu Phe Gly pro Ser Ala Asp Arg Arg Phe Lys Pro Gly Gin Leu val 85 90 95 Cys Ser Leu Pro Leu Ala Ile Gly Pro Thr Gly Ala Arg Thr Ile Gly 100 105 110 Tyr Ser Asp 115 Glu Tyr Pro Gly Gly 120 Leu Gly Glu Tyr Met 125 val Leu Thr Glu Ala Leu Leu Leu pro Val pro Asn Gly Leu Pro Ala Thr cys Ala 130 135 140 Ala Leu Thr Glu pro Met Ala val Gly Trp His Ala val Glu ile Ala 145 150 155 160 Gin Val Gin Pro His His Ile Pro val val Ile Gly cys Gly Pro Val 165 170 175 61 y Leu Ala Val Val Ala Ala Leu Lys His Lys Gin val Ala Pro ile 180 185 190 Ile Ala Ser Asp Pro Ser Pro ASp Arg Arg Ala Leu Ala Leu Arg Met 195 200 205 Gly Ala Asp Ala Val val Asp Pro Arg Glu Glu Ser Pro Phe Arg Gin 210 215 220 Seite 28 47/65 . österreichisches ' Patentamt AT507 363B1 2011-05-15

Ala Glu Lys Ile Ala Arg Pro val Gly Gin Gly Gly Ala Leu Ser Ser 225 230 235 240 Ser Leu Leu ser Lys Ser Gin Met Ile phe Glu Cys val Gly val pro 245 250 255 Gly Met Leu Arg His Ala Met Asp Gly Ala Ser Asp Gly Ser Glu ile 260 265 270 Met val val Gly Ala cys Met Gin Pro ASP Ala Ile Glu Pro Met Ile 275 280 285 Gly Met 290 Phe Lys Ala Leu Thr 295 Ile Lys Phe ser Arg 300 Thr Tyr Thr Gly Glu Glu Phe Ala Ala val Leu His Met Ile Gly Glu Gly Ala Leu Asp 305 310 315 320 val Ser Pro Leu val Thr Asp Val Ile Gly Leu ser Asp Val pro Ser 325 330 335 Ala Phe Glu Ala Leu Arg Ser pro Gly Ala Gin Ala Lys val Ile Val 340 345 350 Asp Pro Trp Arg 355

<210> 18 <211> 1269 <212> DNA <213> sphingopyxis sp. <220> <221> Seq ID 18 (fuml) <222> (1)..(1269) <300> <308> fJ426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(1269) agagaacgcg ccgaacgggt cattccgggc 60 ctgccgccag aattccccca gttcttcagg 120 gacgagcagc cctatatcga ctatatgtgc 180 caatccgaaa tcgaagccgc ggctgatgcg 240 ccttcggaga tcatggtcaa cctcgccgaa 300 tgggcgatgt tctgcaaaaa tggcagcgat 360 gcccatacgg ggcgcaaaac catattatgc 420 Seite 29 <400> 18 atggcgaacg gaacaaggca gaaagatctc gggatgtacg gccacgagtc gacacggttg cgcgcgctgg gggcacgaat ttgggacgcc gcgtatgggc caaatttgct cggttaccgg cagcgacttc tcggcgacac catgaccggt gcctttgtgg gcatggtccg tcatgcggat gccacctcaa cggcgatggt tctcgcgcgt 48/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 gccaaaggcg cctatcatgg cgcttccccg tggaacactc cgcatactgc cgggattctc 480 gcttccgatc gcgtgcatgt cgcatattat acctataacg acgcccaaag cttatcggac 540 gcgttcaagg cgcacgatgg cgatattgcg gctgtctttg ccacaccttt ccgacacgaa 600 gtatttgagg accaggccct cgcccagctt gagttcgcgc gcaccgctcg aaaatgttgt 660 gacgagaccg gtgcgcttct ggtcgttgac gatgtgcgcg caggtttccg ggtggcgcgc 720 gattgcagct ggacgcattt gggtatcgaa cccgatctca gttgctgggg aaaatgcttt 780 gcgaatggct atccgatctc cgccctgctg ggctcgaaca aggcgcgcga tgcggcgcgg 840 gatatatttg tgaccggctc cttctggttc tctgcggtac cgatggcggc cgcgatcgaa 900 accctcagga tcattcgaga gacgccttat ctcgaaacgc tgatcgccag cggcgccgcc 960 ctgcgggcag gcctggaggc acagtctcag cgccatggtc ttgagttgaa gcagacgggc 1020 ccggcgcaga tgccgcaaat attctttgcg gacgatcccg attttcggat cggctatgcg 1080 tgggccgcgg cgtgcctgaa gggcggcgtc tatgttcatc cctatcacaa tatgtttctc 1140 tctgcggccc atacagttga cgatgtaacg gagaccctcg aggcgacgga tcgcgcgttc 1200 agcgcggtcc tcagagattt tgcgtctctc cagectcatc ccattttaat gcaactcgcc 1260 ggtgcttga 1269

<210> 19 <211> 422 <212> PRT <213> sphingopyxis sp. <220> <221> Seq ID 19 (Fumi) <222> (1)..(422) <300> <308> F3426269 <309> 2009-06-11 <313> CI)-.(422) <400> 19

Met Ala Asn Gly Thr Arg Gin Lys Asp Leu Arg Glu Arg Ala Glu Arg 15 10 15 val ile Pro Gly Gly Met Tyr Gly His Glu Ser Thr Arg Leu Leu Pro 20 25 30 pro Glu Phe Pro Gin Phe Phe Arg Arg Ala Leu Gly Ala Arg Ile Trp 35 40 45

Asp Ala Asp Glu Gin Pro Tyr Ile Asp Tyr Met cys Ala Tyr Gly Pro 50 55 W

Asn Leu Leu Gly Tyr Arg Gin Ser Glu Ile Glu Ala Ala Ala Asp Ala 65 70 75 80

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AT 507 363 B1 2011-05-15 österreichisches

Patentamt

Gin Arg Leu Leu Gly ASP Thr Met Thr Gly Pro Ser Glu He Met val 85 90 95 Asn Leu Ala Glu Ala Phe Val Gly Met val Arg His Ala Asp Trp Ala 100 105 110 Met Phe cys Lys Asn Gly Ser ASP Ala Thr Ser Thr Ala Met val Leu 115 120 125 Ala Arg 130 Ala His Thr Gly Arg 135 Lys Thr Ile Leu cys 140 Ala Lys Gly Ala Tyr His Gly Ala Ser Pro Trp Asn Thr Pro His Thr Ala Gly Ile Leu 145 150 155 160 Ala Ser Asp Arg val His Val Ala Tyr Tyr Thr Tyr Asn Asp Ala Gin 165 170 175 Ser Leu ser Asp Ala Phe Lys Ala His A5p Gly Asp Ile Ala Ala Val 180 185 190 Phe Ala Thr Pro Phe Arg His Glu val Phe Glu Asp Gin Ala Leu Ala 195 200 205 Gin Leu Glu Phe Ala Arg Thr Ala Arg Lys Cys Cys Asp Glu Thr Gly 210 215 220 Ala Leu Leu Val Val Asp Asp val Arg Ala Gly Phe Arg Val Ala Arg 225 230 235 240 Asp cys Ser Trp Thr 245 His Leu Gly Ile Glu 250 Pro Asp Leu ser Cys 255 Trp Gly Lys cys Phe Ala Asn Gly Tyr Pro Ile Ser Ala Leu Leu Gly Ser 260 265 270 Asn Lys Ala Arg Asp Ala Ala Arg ASP Ile Phe val Thr Gly ser Phe 275 280 285 Trp Phe Ser Ala val Pro Met Ala Ala Ala Ile Glu Thr Leu Arg Ile 290 295 300 Ile Arg Glu Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Leu Ile Ala Ser Gly Ala Ala 305 310 315 320 Leu Arg Ala Gly Leu Glu Ala Gin Ser Gin Arg His Gly Leu Glu Leu 325 330 335 Lys Gin Thr Gly pro Ala Gin Met Pro Gin Ile Phe Phe Ala Asp Α5Ρ 340 345 350

Seite 31 50/65 österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15

Pro Asp Phe Arg Ile Gly Tyr Ala Trp Ala Ala 355 360

Gly Val Tyr Val His Pro Tyr His Asn Met Phe 370 375

Thr Val Asp Asp Val Thr Glu Thr Leu Glu Ala 385 390 395 ser Ala Val Leu Arg Asp Phe Ala Ser Leu Gin 405 410

Ala cys 365 Leu Lys Gly Leu ser Ala Ala His 380 Thr Asp Arg Ala Phe 400 pro His pro He Leu 415

Met Gin Leu Ala Gly Ala 420 <210> 20 <211> 2835 <212> DNA <213> sphingopyxis sp. <22Q> <221> seq id 20 (fumJ) <222> CI).·(2835) <3O0> <308> FJ426269 <309> 2009-06-11 <313> ¢1)..(2835) <400> 20 atgtatcgga agttcagaat gcgctcggca ccctcgcatt ataggtcagc cggacgaagc agccgcctcc agaacggctt ttgaaggagg catctccgac gacagcttga agacctccaa ctgctcaaca tgcgcggcct ttcgtcgcga ccaatttcac aagcgcgtcg atgtcgtgac ggcgtcatca acttcgtgct ggtgtttcaa cccgcggcga tttgccgacg accggttgca cgggccgatg aagcaacggg cccggcgcta cgacaggcgt ggcggacttg tcacgtccgg gggaccttcg actacgggaa cgaaaagccc ggcaaggcaa tcctgtctct gccagtgctc ggacacggac cggggaacga caattcgccg acgccggtta caaccttgcc gacgcactca ccctggcacg acacccggaa cgggtcaaac cggaacctcg aggctcggtc gatatcaacg gggcggcgcc tcggccgcct cgacgaagat ctggaaggca cctcccgtcc tacggcggtt cttgctcggc agcttcgaat tcgccgctgg ttcgacatcg cacggtcgtg cccgatattc cectctgaaa ggcatcgcgt ttttacgagc tcgtcgttcc Seite 32 atagtttgct cggcgcagta aggatagcga tcccgcatcg gcgaaatcgt cgtgaccggc cagccgtatc cagcgagcag accagctgcc cgtgttcaac cggggaacag cggtcagaac tcctgctgaa cggcaaccgt tgctgccgca ggcgttggtc acggttccga tgccgtttcg tcagggccga gctccagtcg cgatcgcctt cggcacttcg attttcgaca ggacggaatc ccgccggcca atatcccgtg gcagttctcg cggatcctac ttttgcccgg aggagtccta agagcggcgg cgatggaccg 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 51/65 960

AT507 363B1 2011-05-15 österreichisches

Patentamt cgcgtgaata tcggcttcgc cccggatcag cttcgctaca acgcgttcct acgcgccgca 1020 tatgatgtgt ccgacactgt gcaggtgtat gcggagggca cctatgctta ttcccacacc 1080 aacctgggtg cattcgtaat ategeatgte ggtggctcga ataattteeg gatetteegt 1140 gataacgcct tccttccggc tccactcgcg acgctcatgg acagaaatgc ccaggcttcg 1200 atcgttgtcg gtcgcttctc aagcgacttt cccttggtcg aaatcgagaa tttcgcaaag 1260 gtctaccgcg gcgctgccgg cttccgggca gacattggca atggctggaa actcgatggc 1320 tcggcctcct ttggccttac ggacctcgag cttcgtgaaa acaatctcac catcaaccgc 1380 aatctctacg ccgccgtcga tgcggtccgc gatcccgcgg geaatategt ctgccgttca 1440 acactggccg gcctcgacca agattgegtg ccgctcaatc tcttcggcac aggctcgccg 1500 agcgcgtcgg ccatcgacta tgtcaccgct gatggegteg ctcagctgag gcttgagcaa 1560 tatgtggcgg gactcacgat ttccggcgac eteggegata gcctgtcgtt cggcgcgggc 1620 ccggtctcgg tcgccgctgg tategaatat egeaaggaga aggcccggca ggaaaccgac 1680 gcgatatcgc aggegaegae ctcgatcacg ggaatcaggg gggctccggc ggcgcaggca 1740 ggtcggcctg gaggcttcaa tctctacaac ccacttccct tetegggaag ctatgacatc 1800 aaggaaggtt ttgtcgaaat cggcgtcccg attetgaagg acagcgcgct gggacgttcg 1860 ctgaacttaa acggcgccgt ccgatatgcc gattacagcc agtccggtgg agtaacaacc 1920 tggaagctgg geggagaata tgageegate gacggcctea ggttccgcgc gacccgttcg 1980 cgagatatcc gcgggccaag ccttgtcgag ctattcgacc ccggccgtca ggcgacgctc 2040 aattcaattt atggcggaca ggctgtgcag aegeggttet ttaccgccgg caacgcggat 2100 ttgcgccctg aaaaggcgga cgtccttaca tteggegegg tgctacgccc cgccttcgtg 2160 ccggggtttc agtttteggt egategetat gtggtgaagg tgaagggcgc gategattte 2220 ctccttcccc agcaggaaat cgacgcgtgc gatgeaggaa acaccttctt ctgcgacctc 2280 ataacggaga ateeggaegg caccatcaca gtgacgggtc ccaatctcaa cctggctgtc 2340 cagaaagcgg cgggaattga cttcgaggcc tattactcac gccccgtcgg cggcggcacg 2400 ttcagtcttc gtgcgctggc aacgcaccat acctctgcct atcgcatcgc gaccggctcg 2460 gcgcccatcc gttegetegg acaaccggac acgccaaaat ggtcggccaa cttccaggcg 2520 cgatattcga ccgacgattg ggcgcttctc gtgcagcagc gcttcatcgc ageateggtg 2580 ttcaatgccg acaatgtgga gggegtegat aegaatttga accacgctce ggcggtttgg 2640 tacaccgacg cgacattgac cttcgacatc geggettttg gccagaagca gcagctgttt 2700 etateggtca ataatttgtt egaeegagat ccgccaatag egaegaaega ccccagcagt 2760 ttttccagcc cgaccagctc tgcctatgat ccggtcggcc getattttaa tgtcggggtc 2820 egttteegga tetga 2835

<210> 21 <211> 944 <212> PRT

Seite 33 52/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 <213> Sphingopyxis sp. <220> <22l> Seq ID 21 (Fund) <222> (1).-(944) <300> <308> FJ426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(944) <400> 21

Met Tyr Arg Lys Phe Arg Ile Glu Lys Pro Gly Lys Ala Asn Ser Leu 1 5 10 15 Leu Gly Ala Val Ala Leu Gly Thr Leu Ala Phe Pro Val Ser Ala Ser 20 25 30 Ala Gin A5p Ser Asp Pro Ala 5er Ile Gly Gin Pro Asp Glu Ala Asp 35 40 45 Thr ASP Arg Gly Thr ser Glu Ile val val Thr Gly Ser Arg Leu Gin 50 55 60 Asn Gly Phe Asn ser pro Thr Pro val Thr Ala val ser Ser Glu Gin 65 70 75 80 Leu Lys Glu Ala Ser Pro Thr Asn Leu Ala ASp Ala Leu Asn Gin Leu 85 90 95 pro Val Phe Asn Asp ser Leu Lys Thr ser Asn pro Gly Thr Thr Pro 100 105 110 Gly Thr Gly Asn Ser Gly Gin Asn Leu Leu Asn Met Arg Gly Leu Gly 115 120 125 Ser Asn Arg Asn Leu val Leu Leu Asn Gly Asn Arg Phe Val Ala Thr 130 135 140 Asn Phe Thr Gly Ser val ASp Ile Asn val Leu Pro Gin Ala Leu val 145 150 155 160 Lys Arg val Asp Val val Thr Gly Gly Ala Ser Ala Ala Tyr Gly Ser 165 170 175 Asp Ala val Ser Gly val Ile Asn Phe val Leu Asp GlU Asp Leu Glu 180 185 190 Gly Ile Arg Ala Glu Leu Gin Ser Gly val ser Thr Arg Gly Asp Leu 195 200 205 Pro Ser Tyr Gly Gly Ser Ile Ala Phe Gly Thr ser Phe Ala ASp Asp 210 215 220 Seite 34 53/65

österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15

Arg Leu His Leu Leu Gly Ser Phe Glu Tyr Phe Arg Gin Asp Gly He 225 230 235 240 Arg Ala Asp Glu Ala 245 Thr Gly Arg Arg Trp 250 Phe Asp Ile Ala Ala 255 Gly Gin Tyr Pro val Pro Gly Ala Thr Thr Gly val Thr val val Pro Asp 260 265 270 Ile Arg Ser ser Arg Gly Ser Tyr Gly Gly Leu val Thr ser Gly Pro 275 280 285 Leu bys Gly Ile Ala Phe Leu Pro Gly Gly Val Leu Gly Thr Phe Asp 290 295 300 Tyr 305 Gly Asn Phe Thr Ser 310 Ser Ser Phe Gin ser 315 Gly Gly ASp Gly Pro 320 Arg val Asn Ile Gly Phe Ala Pro Asp Gin Leu Arg Tyr Asn Ala Phe 325 330 335 Leu Arg Ala Ala 340 Tyr Asp Val Ser Asp 345 Thr val Gin Val Tyr 350 Ala Glu Gly Thr Tyr Ala Tyr Ser His Thr Asn Leu Gly Ala Phe Val Ile ser 355 360 365 His Val Gly Gly Ser Asn Asn Phe Arg Ile Phe Arg ASp Asn Ala Phe 370 375 380 Leu Pro Ala Pro Leu Ala Thr Leu Met Asp Arg Asn Ala Gin Ala ser 385 390 395 400 Ile val val Gly Arg Phe Ser Ser Asp Phe Pro Leu val Glu Ile Glu 405 410 415 Asn Phe Ala Lys Val Tyr Arg Gly Ala Ala Gly Phe Arg Ala ASp Ile 420 425 430 Gly Asn Gly Trp Lys Leu ASp Gly Ser Ala ser Phe Gly Leu Thr ASP 435 440 445 Leu Glu Leu Arg Glu Asn Asn Leu Thr Ile Asn Arg Asn Leu Tyr Ala 450 455 460 Ala val Asp Ala Val Arg ASP pro Ala Gly Asn Ile Val cys Arg Ser 465 470 475 480 Thr Leu Ala Gly Leu ASp Gin Asp Cys val pro Leu Asn Leu Phe Gly 485 490 495

Seite 35 54/65

österreichisches patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15

Thr Gly Ser Pro ser Ala Ser Ala Ile 500 505 Val Ala Gin Leu Arg Leu Glu Gin Tyr 515 520 Gly Asp Leu Gly Asp ser Leu Ser Phe 530 535 Ala Ala Gly ile Glu Tyr Arg Lys Glu 545 550 Ala Ile ser Gin Ala Thr Thr Ser Ile 565 Ala Ala Gin Ala Gly Arg Pro Gly Gly 580 585 pro Phe Ser Gly Ser Tyr ASp Ile Lys 595 600 val Pro Ile Leu Lys Asp Ser Ala Leu 610 615 Gly 625 Ala Val Arg Tyr Ala 630 ASp Tyr ser Trp Lys Leu Gly Gly Glu Tyr Glu Pro 645

Ala Thr Arg Ser 660 Arg ASp ile Arg Gly 665 Asp Pro Gly Arg Gin Ala Thr Leu Asn 675 680 val Gin Thr Arg Phe Phe Thr Ala Gly 690 695 Lys Ala Asp Val Leu Thr Phe Gly Ala 705 710 Pro Gly Phe Gin Phe 725 ser val Asp Arg Ala He Asp Phe Leu Leu Pro Gin Gin 740 745 Gly Asn Thr Phe phe cys Asp Leu Ile 755 760 ASp Tyr val Thr Ala 510 Asp Gly Val Ala Gly Leu Thr ile Ser 525 Gly Ala Gly Pro val Ser Val 540 Lys Ala Arg Gin Glu Thr Asp 555 560 Thr Gly ile Arg Gly Ala pro 570 575 Phe Asn Leu Tyr Α5Π Pro Leu 590 Glu Gly Phe val Glu ile Gly 605 Gly Arg Ser Leu ASO Leu Asn 620 Gin ser Gly Gly val Thr Thr 635 640 ile Asp Gly Leu Arg Phe Arg 650 655 Pro Ser Leu Val Glu Leu Phe 670 Ser Ile Tyr Gly Gly Gin Ala 685 Asn Ala ASp 700 Leu Arg pro Glu Val Leu Arg Pro Ala Phe val 715 720 Tyr Val Val Lys val Lys ciy 730 735 Glu Ile Asp Ala cys 750 Asp Ala Thr Glu Asn Pro Asp Gly Thr 765 Seite 36 55/65 österreichisches AT 507 363 B1 2011 -05-15

Ile Thr val Thr Gly Pro Asn Leu Asn Leu Ala val Gin Lys Ala Ala 770 775 780 oiy Ile Asp Phe Glu Ala Tyr Tyr ser Arg pro Val Gly Gly Gly Thr 785 790 795 800 Phe Ser Leu Arg Ala Leu Ala Thr H1S His Thr Ser Ala Tyr Arg Ile 805 810 815 Ala Thr Gly Ser Ala Pro Ile Arg ser Leu Gly Gin pro Asp Thr pro 820 825 830 Lys Trp Ser Ala Asn Phe Gin Ala Arg Tyr Ser Thr Asp Asp Trp Ala 835 840 845 Leu Leu Val Gin Gin Arg phe Ile Ala Ala ser val Phe Asn Ala ASP 850 855 860 Asn Val Glu Gly Val Asp Thr Asn Leu Asn His Ala Pro Ala Val Trp 865 870 875 880 Tyr Thr Asp Ala Thr Leu Thr Phe Asp Ile Ala Ala Phe Gly Gin Lys 885 890 895 Gin Gin Leu phe Leu ser Val Asn Asn Leu Phe Asp Arg Asp Pro Pro 900 905 910 ile Ala Thr Asn Asp Pro Ser ser phe ser Ser Pro Thr Ser 5er Ala 915 920 925 Tyr ASp pro Val Gly Arg Tyr Phe Asn val Gly Val Arg Phe Arg He 930 935 940

<210> 22 <211> 417 <212> DNA <213> Sphingopyxis sp. <220> <221> seq ID 22 (fumK) <222> (1)..(417) <300> <308> FD426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(417) <400> 22 atgcgcctca cgggcggaga attattggca cgatgtttgg ccgtcgaagg cgtccggtat 60 gtcttcggcc tcatgtcgcc ggaggtggat ccgctcctgg ctgcgctcga agacaatggg 120 atattgttcg tcccggtgcg gcacgaggcc gccgcagcct atatggccga gggcatttac 180

Seite 37 56/65 österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15 gtcccggtac ggcaaacctt 240 tcgtcgcaat aacgtcccag 300 ttcagggaca agaccagatc 360 tcgcctggaa ccggatt 417

Ala Arg n *< VI Leu Ala Val Glu 10 15 Ser Pro Glu val Asp 30 Pro Leu Leu Phe val pro val Arg His 45 Gly He Tyr Lys Thr Thr Gly 60 Gly pro Gly Thr Ala Asn Leu 75 80 Glu Gly val Pro Phe Val Ala 90 95 Val Tyr pro cys Thr Pro Lys 110 Leu Phe Arg Pro Ala Val Lys 125 Arg He aagaccaccg gacaggtcgc cgcgattgtc acgaatccgg ctgcctggag tcgtgacggc acgccacgaa ggggttccct catcaacttg gtgtcgttta tccctgcacg ccaaaaacct gacctctttc gacccgcggt taaatggggc gcacccatct

<21Q> 23 <211> 139 <212> PRT <213> Sphingopyxis sp. <220> <221> Seq IO 23 (FumK) <222> CI) ¢139) <300> <308> Fl426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(139) <400> 23

Met 1 Arg Leu Thr Gly 5 Gly Glu Leu Leu Gly Val Arg Tyr 20 Val Phe Gly Leu Met 25 Leu Ala Ala Leu Glu Asp Asn Gly Ile 35 40 Glu Ala Ala Ala Ala Tyr Met Ala Glu 50 55 Gin Val Ala Ala Ile Val Thr Asn Pro 65 70 Leu Pro Gly val Val Thr Ala Arg His 85 Ile Thr Ser Gin His Gin Leu Gly Val 100 105 Thr Phe Gin Gly Gin Asp Gin He ASp 115 120 Trp Gly Ala Pro ile Phe Ala Trp Asn 130 135 <210> 24

<211> 1272 <212> DNA <213> Caulobacter sp.

Seite 38 57/65 Österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 <220> <221> Seq ID 24 <222> (1)..(1272) <300> <308> FJ426269 <309> 2009-06-11 <313> (1)..(1272) <400> 24 atggaattga gccgccaacg agaccaggcc ttgagggagc gcgcccaagc ggtgatcccg 60 ggcgggatgt acggtcacga gtcgacctat ctgatgcccg agggcacgcc acagttcttc 120 agtcgcggca aaggcgcccg actttgggac gccgacggca acgagtatgt cgattacatg 180 tgcgcctatg gccccaacct gctgggttac ggcttcgaac ccgtcgaagc ggccgccgca 240 gcccagcaag cccggggcga taccctgacc gggccgtcgg aggtgatggt gcagttggcg 300 gaagacttcg tcgcgcaaat cagccacgcg gactgggcca tgttctgcaa gaacggcaca 360 gacgccacct caatggcgat ggtcatcgcg cgcgcacaca ccggccggaa gacgatcctc 420 tgcgcgaaag gcgcctatca tggggccgcg ccttggtgca cgccgatcct ggccggaacg 480 ctaccggagg atcgcgcctt tgtagtctac tacgactaca atgacgccca aagcctegtc 540 gacgccttcg aggcccatca ggacgacgtc gcggcgatct tcgccacccc tcaccgtcac 600 gaggtgttca gcgaccagat cgatcctgat ccggaatatg cggccagcgt gcgggcgctc 660 tgcgacaaga gcggcgccct gctcgtcgtc gacgaagttc gagccgggtt caggatcgcg 720 cgcgactgca gctgggccaa gatcggcgtc gctccggatc tgagcacctg gggcaagtgc 780 ttcgccaacg gctatccgat ctcggcggtc ctagggggcg aaaaggtgcg cagcgcggca 840 aaggccgtct acgtcaccgg ctcgttctgg ttctcggcca cgcccatggc cgcagccgtc 900 gaaaccctga agcaaatccg cgagaccgac tatctcgagc ggatcaacgc ggccgggacc 960 cgcctgcgcg agggcctgca gcagcaggct gctcacaacg gctttacgtt gcgccaaacg 1020 gggcccgtct ccatgcccca agtcctcttc gaggaagatc ccgattttcg ggtcggctac 1080 ggctgggttc gcgaatgcct gaagcgaggg gtgtacttca gcccctacca taacatgttc 1140 ctgtcggcgg cccatagcga ggcggacctg gccaagaccc ttgcggctac cggcgacgcc 1200 ttcgtcgagc tacgcgccaa gcttccgagc ctagaaatcc accaacccct cctcgccctg 1260 agagcggcct aa 1272

<21Q> 25 <211> 423 <212> PRT <213> Caulobacter sp. <220> <221> seq ID 25 <222> (1)..(423) <300> <308> FJ42 62 69 <309> 2009-06-11

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österreichisches patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15 <313> (1)..(423) <400> 25

Met Glu Leu ser Arg Gin Arg Asp Gin Ala Leu Arg Glu Arg Ala Gin 1 5 10 15 Ala Val Ile pro Gly Gly Met Tyr Gly His Glu Ser Thr Tyr Leu Met 20 25 30 Pro Glu Gly 35 Thr pro Gin phe Phe 40 Ser Arg Gly Lys Gly 45 Ala Arg Leu Trp Asp Ala Asp Gly Asn Glu Tyr Val Asp Tyr Met cys Ala Tyr Gly 50 55 60 Pro Asn Leu Leu Gly Tyr Gly phe Glu Pro val Glu Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala Gin Gin Ala Arg Gly Asp Thr Leu Thr Gly Pro ser Glu val Met 85 90 95 Val Gin Leu Ala Glu Asp Phe val Ala Gin Ile ser His Ala Asp Trp 100 105 110 Ala Met phe Cys Lys Asn Gly Thr Asp Ala Thr ser Met Ala Met val 115 120 125 Ile Ala Arg Ala His Thr Gly Arg Lys Thr Ile Leu Cys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Tyr His Gly Ala Ala pro Trp cys Thr Pro Ile Leu Ala Gly Thr 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asp Arg Ala Phe Val val Tyr Tyr Asp Tyr Asn as p Ala 165 170 175 Gin Ser Leu val ASp Ala Phe Glu Ala His Gin ASp Asp val Ala Ala 180 185 190 Ile Phe Ala Thr pro His Arg His Glu val Phe Ser ASp Gin ile Asp 195 200 205 Pro Asp Pro Glu Tyr Ala Ala ser Val Arg Ala Leu Cys Asp Lys Ser 210 215 220 Gly Ala Leu Leu Val val Asp Glu val Arg Ala Gly Phe Arg ile Ala 225 230 235 240 Arg Asp cys Ser Trp Ala Lys Ile Gly val Ala Pro Asp Leu ser Thr 245 250 255

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österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15

Trp Gly Lys cys Phe Ala Asn Gly Tyr Pro Ile ser Ala Val Leu Gly 260 265 270 Gly Glu Lys Val Arg Ser Ala Ala Lys Ala Val Tyr val Thr Gly Ser 275 280 285 Phe Trp Phe Ser Ala Thr Pro Met Ala Ala Ala val Glu Thr Leu Lys 290 295 300 Gin Ile Arg Glu Thr Asp Tyr Leu Glu Arg Ile Asn Ala Ala Gly Thr 305 310 315 320 Arg Leu Arg Glu Gly Leu Gin Gin Gin Ala Ala His Asn Gly Phe Thr 325 330 335 Leu Arg Gin Thr Gly Pro val Ser Met Pro Gin Val Leu Phe Glu Glu 340 345 350 Asp Pro Asp Phe Arg val Gly Tyr Gly Trp val Arg Glu Cys Leu Lys 355 360 365 Arg Gly Val Tyr Phe Ser Pro Tyr His Asn Met Phe Leu Ser Ala Ala 370 375 380 His ser Glu Ala Asp Leu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Thr Gly Asp Ala 385 390 395 400 Phe Val Glu Leu Arg Ala Lys Leu Pro Ser Leu Glu Ile His Gin Pro 405 410 415 Leu Leu Ala Leu Arg Ala Ala 420

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Claims (15)

1. österreichisches Patentamt AT507 363B1 2011-05-15 Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung eines Zusatzstoffes für den enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen in einem pflanzlichen Rohstoff, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Genen entsprechend Sequenz ID-Nr. 1,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20, 22 und 24 vorgelegt wird, die wenigstens eine Nukleinsäuresequenz in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtsorganismen exprimiert wird, wenigstens ein Enzym entsprechend Sequenz ID-Nr. 3,5,7,9,11,13,15,17,19,21 und 25 sowie der Acetolat-Synthase, welche die Sequenz ID-Nr. 23 umfasst, oder wenigstens ein kompletter, diese Sequenzen enthaltender, rekombinanter Wirtsorganismus hergestellt wird und gegebenenfalls mit einem Cosubstrat vermischt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das jeweilige Enzym mittels molekulargenetischer Methoden, Mutagenese oder molekularer Evolution verändert wird, und dass es wenigstens 90 % Sequenzidentität mit wenigstens einem der Enzyme der Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9,11,13,15,17,19,21,25 oder der Acetolat-Synthase, welche die Sequenz ID-Nr. 23 umfasst, aufweist.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme isoliert werden.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme in einer Schutzhülle verkapselt werden.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme aus Permease mit der Sequenz ID-Nr. 3, Carboxylesterase mit der Sequenz ID-Nr. 9, Tri-carballylat-Dehydrogenase mit der Sequenz ID-Nr. 11, Citratverwertungsprotein mit der Sequenz ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase mit der Sequenz ID-Nr. 17, Aminotransferase mit der Sequenz ID-Nr. 19 oder 25 oder Acetolactat-Synthase, welche die Sequenz ID-Nr. 23 umfasst, gewählt werden.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Aminotransferase mit der Sequenz ID-Nr. 19 oder mit der Sequenz ID-Nr. 25 mit einem Keton, insbesondere einer α-Ketosäure als Cosubstrat, vermischt wird.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Carboxylesterase mit der Sequenz ID-Nr. 9 zusätzlich mit wenigstens einem Adsorbens, insbesondere gewählt aus Tonmineralien, vermischt wird.
8. 8. Zusatzstoff zum enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Enzym der Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9,11, 13.15.17.19.21 und 25 sowie eine Acetolat-Syntase, welche die Sequenz ID-Nr. 23 umfaßt, oder wenigstens ein kompletter, diese Sequenzen enthaltender, rekombinanter Wirtsorganismus zur Expression dieser Enzymgensequenzen sowie gegebenenfalls zusätzlich wenigstens ein Cosubstrat für wenigstens eines der eingesetzten Enzyme und ein inerter Träger enthalten sind.
9. 9. Zusatzstoff nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzym enthalten ist, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit einem Enzym der Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9.11.13.15.19.21 oder 25 sowie der Acetolat-Synthase, welche die Sequenz ID-Nr. 23 umfasst, aufweist.
10. 10. Zusatzstoff nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme durch molekulargenetische Methoden, Mutagenese, molekulare Evolution veränderten Enzyme und/oder zu wenigstens 90 % identen Enzyme mit einer Schutzhülle ummantelt enthalten sind. 61/65 österreichisches Patentamt AT 507 363 B1 2011-05-15
11. 11. Zusatzstoff nach einem der Ansprüche 8, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzyme eine Carboxylesterase mit der Sequenz ID-Nr. 9, Tricarballylat-Dehydrogenase mit der Sequenz ID-Nr. 11, einem Citratverwertungsprotein mit der Sequenz ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase mit der Sequenz ID-Nr. 17, Aminotransferase mit der Sequenz ID-Nr. 19 oder mit der Sequenz ID-Nr. 25 und/oder Acetolactat-Synthase, welche die Sequenz mit der ID-Nr. 23 umfasst, enthalten sind.
12. 12. Zusatzstoff nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylesterase mit der Sequenz ID-Nr. 9, wenigstens eine Aminotransferase mit der Sequenz ID-Nr. 19 oder mit der Sequenz ID-Nr. 25, eine α-Ketosäure als Cosubstrat und ein inerter Träger enthalten sind.
13. 13. Zusatzstoff nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylesterase mit der Sequenz ID-Nr. 9, wenigstens ein Adsorbens, insbesondere wenigstens ein Tonmineral, sowie gegebenenfalls ein inerter Träger enthalten sind.
14. 14. Verwendung eines Zusatzstoffes gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14 zum sauerstoffunabhängigen bzw. anaeroben Abbau von Mycotoxinen, insbesondere Fumonisinen.
15. 15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Zusatzstoff in einem zu vergärenden, pflanzlichen Rohstoff bzw. in einer Maische zur Bioethanolherstellung eingesetzt wird. Hierzu 3 Blatt Zeichnungen 62/65