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Die Erfindung betrifft eine Verwendung von Dithiocarbamat-Verbindungen sowie ein Verfahren zur Desinfektion von Oberflächen, Medien bzw. Zellkulturen.
Es gibt eine Vielzahl von Viren, die zu Erkrankungen im (menschlichen) respiratorischen Trakt führen. Obgleich diese respiratorisch pathogenen Viren strukturell unterschiedlich sein können und verschiedenen Virus-Familien zugehören, so ist allen diesen Viren gemein, dass sie in der Lage sind, in den Körpern durch den respiratorischen Trakt einzudringen, indem sie z. B. spezifische Zellen dieses Traktes befallen können, z. B. die epitheliale Zellschicht im respiratorischen Trakt, Alveolen-Zellen, Lungenzellen,.... Allen gemein sind zu dies viele der klassischen Symptome des grippalen Infektes, der durch lokale Inflammation und Krankheitserscheinungen im respiratorischen Trakt (wie Schnupfen, Heiserkeit, Husten, Halsweh) gekennzeichnet ist.
Virale Infektionen, vor allem im respiratorischen Trakt verursachen pathologische Veränderungen in den betroffenen Zellen, insbesondere in Epithelzellen, die durch oxidativen Stress bedingt sind. Reaktive Sauerstoff-Zwischenprodukte (reactive oxygen intermediates ; ROis), die z. B. durch Leukozyten, epitheliale Lungenzellen oder Xanthin-Oxidasen produziert werden, gelten als Mediatoren dieser Virus-induzierten Zellschäden. Im Zuge dieses oxidativen Stresses kann es zur Aktivierung des Oxidantien-spezifischen Transkriptionsfaktors NF-B (nuciear factor- B) kommen. NFKB wurde in verschiedensten Zelltypen gefunden und wurde in Zusammenhang mit der Genaktivi erung für Entzündungs- und Immunantworten gebracht.
Antioxidantien können die Aktivierung von NF-KB blockieren, indem die ROls, die sonst zu dieser Aktivierung führen, abgefangen werden. Daher wurde die Verwendung von Antioxidantien vor allem bei der Behandlung von Infektionen mit latenten Viren vorgeschlagen ; es zeigte sich aber, dass eine effektive Behandlung dieser latenten Infektionen mit einzelnen Antioxidantien alleine nicht möglich ist, sondern-wenn überhaupt-nur durch eine kombinierte Therapie mittels einer Mischung aus verschiedenen (d. h. verschieden wirkenden) Antioxidantien und anderen virushemmenden Mitteln (US 5, 686, 436 A). Eine Inhibierung der traten Replikation oder gar der Virusinfektion durch Antioxidantien konnte bislang aber nicht erreicht werden, insbesondere nicht für Infektionen mit Influenza- oder Picornaviren. Knobil et al. Am. J.
Physiol. 274 (1) (1998) Seiten 134-142 stellt explizit fest, dass Pyrrolidin-Dithiocarbamat (PDTC) bzw. N-Acetylcystein (NAC) eine Influeza-Virusinfektion bzw. -replikation nicht inhibieren.
Auf der anderen Seite sind auch die verschiedenen für die Bekämpfung von Virusinfektionen vorgeschlagenen Antioxidantien h Bezug auf ihre antioxidative Aktivität sehr verschieden. So dienen L-Ascorbinsäure und Vitamin E zum Schutz vor Glutathion ; die Vitamine K, A und E wirken als Antagonisten von Peroxynitrit und anderen starken Oxidantien im Körper. Anti-inflammatorische Steroide, Nicht-Glukokortikoide Lazaroide, Dithiocarbamate oder N-Acetyl-L-Cystein sind als Inhibitoren der NF-KB-Aktivierung beschrieben worden.
Viren können je nach ihrem Träger der genetischen Informationen eingeteilt werden in DNA und RNA-Viren, wobei de Nukleinsäure einzelsträngig oder doppelsträngig vorliegt und von einer Proteinhülle umgeben ist.
Die einzelsträngige RNA dieser RNA-Viren liegt dabei entweder als Plus-Strang (mRNA) oder Minus-Strang vor. Weiters kann diese genetische Information des Virus auch in mehreren Stücken vorhanden sein, wie zum Beispiel im Falle des Influenzavirus.
Die zu den Picornaviren zählenden humanen Rhinoviren (HRV) sind die Hauptursache für die weltweit vorkommende Erkältung. Das häufige Auftreten von HRV, das Risiko von schwerwiegenden Sekundärinfektionen und der wirtschaftliche Einfluss hinsichtlich medizinischer Kosten, Arztbesuche, Krankenstände von Angestellten machen HRV zu wichtigen, ernstzunehmenden Krankheitserregern. Trotz des häufigen Vorkommens gibt es zur Zeit keine sichere Bekämpfung dieser Viruserkrankung, abgesehen von einer Behandlung der Symptome. Auf der anderen Seite sind die Folgen z. B. einer Rhinovirus-Infektion nicht so schwerwiegend oder gar lebensbedrohend, dass die Einnahme von Arzneimitteln, die ein hohes Nebenwirkungsrisiko haben, in Kauf genommen werden darf. Mittel, die gegen derartige Viren eingesetzt werden sollen, dürfen daher nur geringe bzw. keine Nebenwirkungen aufweisen.
Zur Gruppe der tierischen Picornaviren zählt das Equine Rhinitis A Virus (ERAV), das ebenso wie das Maul-und Klauenseuche (MKS)-Virus zum Genus der Aphthoviren gehört.
Weitere wichtige Virus-Familien, die für Erkrankungen im respiratorischen Trakt verantwortlich sind, sind die Orthomyxo- und Paramyxoviridae mit dem humanen Influenza-Virus als wichtigsten
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Vertreter.
Das Auftreten von neuen pandemischen Influenza-Stämmen ist üblicherweise auf neue Subtypen, die ein neues Hämagglutinin bzw. das Neuraminidase Gen enthalten, zurückzuführen. Diese neuen Viren unterscheiden ich von bisher zirkulierenden Influenza Viren immunologisch. Um infektiös zu sein benötigen Influenza A und B Viren 8 RNA-Segmente, Influenza C Viren hingegen nur 7. Influenza A, B and C Viren können in vivo homotypische Reassortanten bilden, aber nicht zwischen den Typen. Theoretisch könnte aus den jeweils 8 Segmenten von zwei Influenza A Viren 256 Reassortanten entstehen. Diese zufällige Segregation findet aber nicht statt, weil auf der Protein-Ebene einige Proteine ihren stammspezifischen Partner brauchen.
Dies wurde im speziellen klar gezeigt für das Avian Influenza Virus A/chicken/Germany/34 (H7N1) FPV Rostock HA, welches vom Segment 4 codiert wird, das nur spezifisch mit seinem stammspezifischen M2 Protein, welches vom Segment 7 codiert wird, ein funktionelles Virus bilden kann. (Grambas S, Hay AJ.
Maturation of Influenza A virus hemagglutinin-estimates of the pH encountered during transport and its regulation by the M2 protein. Virology 1992 ; 190 : 11-18) (Grambas S, Bennet HS, Hay AJ.
Influence of amantadine resistance mutations on the pH regulator function of the M2 protein of influenza A viruses. Virology 1992 ; 191 : 541-549). Eine der Haupt-Strategien gegen die jährliche Influenza-Virusinfektion in der Bevölkerung stellt die jährliche Influenza-Impfung dar. Dennoch bleibt trotz breiten Impfprogrammen Influenza ein Grund für die Morbidität und Mortalität auf der Welt und ein Hauptgrund für Erkrankung und Tod bei Patienten mit Immunschwächen bzw. bei älteren Personen. Die antivirale Aktivität von Amantadin und Rimantadin verringert zwar die Dauer der Symptome von klinischer Influenza, doch wurden wichtige Nebeneffekte und das Auftreten von resistenten Mutanten beschrieben (FIELDS et al., Virology, 3.
Edition (1995) Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, Vol.1, p. 434-436). Zur Zeit ist eine neue Gruppe von antiviralen Agentien am Markt, die die Influenzavirus-Neuraminidase inhibiert. Zanamivir und Oseltamivir sind beispielsweise Inhibitoren der Influenza A und B-Virus Neuraminidase ; diese Medikamente verringern jedoch lediglich die Dauer der Symptome.
In der US 5 686 436 A wird ein Verfahren zur Unterdrückung der Vermehrung von Retroviren und latenten Viren in Menschen und Tieren, wie beispielsweise HIV beschrieben, wobei ein Medikament umfassend unter anderem Antioxidantien und NF-KB-Induktionsinhibitoren verabreicht wird. Demgegenüber muss zu einer effektiven Bekämpfung von Infektionen mit respiratorischen Viren das Virus bereits in der akuten Infektionsphase wirksam bekämpft werden ; eine Behandlung, die nur auf Ebene der latenten Viren eingesetzt werden kann, ist ungeeignet zur Verhinderung oder Behandlung von viralen Akut-Infektionen im respiratorischen Trakt.
Es besteht somit das Bedürfnis nach einem hoch effektiven Wirkstoff gegen Virus-Infektionen im respiratorischen Trakt, insbesondere im Menschen, der keine oder nur geringe Nebenwirkungen auslöst, kostengünstig und in grossen Mengen herstellbar ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelöst durch die Verwendung von Dithiocarbamat-Verbindungen der Strukturformel R2NCS2H, worin R und Rz unabhängig voneinander ein gerades oder verzweigtes Q-C4-Alkyl darstellen oder mit dem Stickstoffatom einen aliphatischen Ring mit 4 bis 6 GAtomen bilden, wobei R, R ? oder der aliphatische Ring gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten ausgewählt aus OH, N02, NH2, COOH, SH, F, Cl, Br, l, Methyl oder Ethyl substituiert ist, und durch Oxidation erhaltene Disulfidformen hievon sowie pharmazeutisch akzeptable Salze hievon, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung bzw.
Verhinderung einer Infektion durch Viren, die den respiratorischen Trakt befallen und dort eine Erkrankung auslösen. Unter respiratorischem Trakt werden erfindungsgemäss sämtliche Organe und Bereiche ausgehend von den Körperöffnungen (Nase, Mund, Augen (inklusive Tränenkanal) und Ohren) zu den Lungenbläschen verstanden. Die pharmazeutisch akzeptablen Salze sind dabei insbesonders Na, K, Ca, Mg, NH4 und Zn. Es wurde nun erstmals überraschenderweise gefunden, dass die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen wirkungsvoll gegen Infektionen durch Viren, die den respiratorischen Trakt befallen und dort eine Erkrankung auslösen, im Folgenden"respiratorische Virus-Infektionen" oder "respiratorische Viren" genannt, eingesetzt werden können.
Entgegen den oben genannten Beobachtungen von Knobil et al. konnte im Rahmen der vorliegenden Erfindung eindeutig eine antivirale Wirkung von den erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen bezüglich Infektionen durch Viren, die den respiratorischen Trakt befallen und dort eine Erkrankung auslösen, insbesondere HRV und Influenza-Infektionen, gezeigt werden. Dies ist umso überra-
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schender, als andere Antioxidantien diese anti-virale Wirkung gegenüber respiratorischen Viren nicht aufweisen und die Änderung des Redox-Potentials nicht ausschliesslich verantwortlich ist für die antivirale Wirkung von den erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen.
Beispielsweise kann erfindungsgemäss klar gezeigt werden, dass die Antioxidantien Vitamin C, Vitamin E, 2 Mercaptoethanol und N-Acetyl-L-Cystein keinerlei Wirkung gegen respiratorische Virus-Infektionen haben. Weiters ist die Effizienz von den erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen gegen respiratorische Virus-Infektionen und Vermehrung dieser Viren nicht alleine auf die Inhibition der NF-KB-Aktivierung zurückzuführen, sondern es zeigte sich, dass mit den erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen, wobei im Rahmen der vorliegenden Anmeldung auch die durch Oxidation erhaltenen Disulfidformen darunter zu verstehen sind, gezielt die Vermehrung von Viren, die den respiratorischen Trakt befallen und dort eine Erkrankung auslösen, unterbunden wird.
Erfindungsgemäss wird so der Infektion bereits in einer sehr frühen Phase entgegengetreten, noch bevor es zu weitgehenden Zellschäden oder gar Zelltod kommt.
Auch ist die erfindungsgemässe antivirale Wirkung der erfindungsgemässen DithiocarbamatVerbindungen nicht abhängig von einer Kombination von bestimmten Stoffen. Die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen können alleine, unabhängig von den weiteren Zusatzstoffen, insbesondere Antioxidantien, wie dies gemäss der US 5, 686, 436 A für eine anti-Retrovirus Wirkung von NF-KB-Aktivierungs-Inhibitoren absolut unerlässlich ist, angewendet werden, weil überraschenderweise die antivirale Wirkung sich nicht nur auf die Bekämpfung des oxidativen Stresses bezieht, sondern die Infektion/Replikation durch die erfindungsgemässen DithiocarbamatVerbindungen inhibiert werden kann.
Es konnte gezeigt werden, dass die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen Gene induzieren, die als Antioxidans induzierte Transkriptionsfaktoren wirken (Meyer et al., EMBO J. 12, 2005-2015,1993). Der heterodimere Transkriptionsfaktor AP1 kann durch NAC und die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen induziert werden, was zu DNA-Bindung und Tranaktivierung führt. Die Aktivierung von AP1 durch die erfindungsgemässen DithiocarbamatVerbindungen ist von der Proteinsynthese abhängig und beinhaltet die Transkription von c-jun und c-fos-Genen. Die Aktivierung von AP1 alleine ist jedoch nicht für die starke erfindungsgemässe Inhibierung der Viren verantwortlich.
Pyrrolidin Dithiocarbamat (PDTC) ist bereits bekannt als Pro- und Antioxidans, Inhibitor der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-KB, Zink-Ionophor und Metall Chelatierungs-Agens. In Sherman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 191 (3) : 1301-1308, 1993, ist PDTC als Inhibitor der NF-KB-Aktivierung sowie der NO-Synthase beschrieben. Die WO 01/00193 A2 betrifft Zusammensetzungen umfassend Diethyidithiocarbamat im picomolaren und nanomolaren Bereich, welche eine starke Wirkung gegen Apoptose aufweisen.
Die DE 1 963 223 A betrifft ein Mittel zur Behandlung von Virusinfektionen im Gehirn, wobei das Mittel einen Hemmstoff für die Biosynthese der Monoamine Noradrenalin, Dopamin und 5 Hydroxytryptamin umfassen soll. Das in dieser Schrift angegebene Beispiel zeigt die Wirkung von a-Methyltyrosinmethylester auf Herpes simplex-infizierte Mäuse. Der in dieser Schrift beschriebene Mechanismus der Hemmung der Biosynthese von speziellen Monoaminen ist somit lediglich für die Behandlung von Virusinfektionen im Gehirn anwendbar. Die erfinderische Behandlung von respiratorischen Virus-Infektionen funktioniert nach einem anderen Prinzip und ist nicht auf Virusinfektionen im Gehirn anwendbar, wie die Negativbeispiele zu FSME (Beispiel 13) und EMC (Beispiel 14) zeigen.
Damit betrifft die DE 1963223 A ein anderes Anwendungsgebiet und ist mit der erfinderischen Anwendung nicht zu vergleichen und legt diese somit auch nicht nahe.
In Calvert J. G., Interferon Research 1990 (10), Seiten 13-23 wird die Wirkung von Diethyldithiocarbamat (DDTC) auf Mengoviren beschrieben, wobei festgestellt wird, dass DDTC MengovirusVirionen inaktiviert. Mengoviren sind jedoch Erreger einer schweren Enzephalomyocarditis und befallen nicht den respiratorischen Trakt und lösen dort eine Erkrankung aus.
Die WO 95/03792 A 1 betrifft die Verwendung von Thiolverbindungen für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung Virus-induzierter Erkrankungen, wobei in Virusproteinen vorhandene Disulfidbrücken durch die Thiolverbindung zerstört werden. In diesem Dokumente werden unter zahlreichen Viren auch RNA-Viren, u. a. Picornaviridae genannt. Weiters werden auch zahlreiche Beispiele von Thiolverbindungen angegeben, u. a. ganz allgemein Dithiocarbamat.
Aus diesen vielen verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten werden lediglich folgende
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Beispiele gezeigt : als Thiolverbindungen N-Acetylcystein (NAC), Cystein, Cysteinhydrochlorid und N, S-Diacetylcystein-ethylester (DACEE), als Viruserkrankung sind lediglich Hepatitis B und Vaccinia-Virus gezeigt.
Somit wurden nicht nur für den Grossteil der Verbindungen und Viruserkrankungen keine Beispiele gezeigt, aber es hat sich auch herausgestellt, dass die in dieser Schrift offenbarte Behandlung nicht in dem Umfang funktioniert, wie sie beschrieben ist : Manche Picornaviren (solche die nicht den respiratorischen Trakt sondern Nervenzellen befallen) werden von PDTC nicht inhibiert oder in ihrer Vermehrung reduziert. Somit sind nicht alle Kombinationen von Virus-induzierten Erkrankungen und Thiolverbindungen zielführend, und die Verwendung der erfindungsgemässen ausgewählten Dithiocarbamatverbindungen - die in der WO 95/03792 A1 nicht offenbart sind-zur Behandlung oder Verhinderung einer respiratorischen Virus-Infektion ist nicht nahegelegt.
Die GB 861 043 A betrifft Zusammensetzungen, die u. a. als Schutz gegen Viren eingesetzt werden. Diese Zusammensetzungen umfassen beispielsweise Dithiocarbamate, spezifische Viren werden hier jedoch nicht offenbart. Wie in Beispiel 7 des nachfolgenden Beispielteil gezeigt wird, ist NAC für erfindungsgemässe Viren unwirksam.
Knobil et al., Am. J. Physio. (1998), S. 134-142, betrifft, wie oben bereits angeführt, eine Studie zu Oxidantien und deren Einfluss auf Virus-induzierte Genexpression. Hier wird jedoch explizit festgestellt, dass weder NAC noch PDTC eine Influenzavirus-Infektion oder Replikation inhibiert.
In der DE 2555730 A wird ein antimikrobielles Mittel umfassend eine Dimethyldithiocarbamat- verbindung beschrieben, wobei diese Verbindung ein 8-0xychinolinat-Metall-N. Ndimethyidithiocarbamat-Komplex ist. Jedoch wird lediglich die fungizide und antibakterielle Wirkung in dieser Schrift offenbart.
Die WO 99/66918 A1 betrifft die Verwendung von Disulfidderivaten von Dithiocarbamaten zur Reduktion von Stickstoffoxiden in einem Patienten bzw. zur Inhibierung von NFKB. Es wird jedoch in dieser Schrift eine ausgesprochen grosse Anzahl von Erkrankungen angegeben, wobei die viralen Erkrankungen nicht näher beschrieben werden.
Flory E. et al., J. Biol. Chem., 24. 03. 2000, 275 (12), S. 8307-8314 betrifft eine Studie des Einflusses verschiedener Influenza A-Virusproteine auf die Aktivierung der NFKB abhängigen Expression.
Tai 0. 1. et al., Hepatology, März 2000, 31 (3), S. 785-787 betrifft eine Studie über die Inhibierung der NFKB-Aktivierung durch PDTC, wobei angenommen wird, dass eine HCV-Infektion eine Anti-Apoptose durch Aktivierung von NFKB hervorrufen könnte.
Es konnte nun erfindungsgemäss gezeigt werden, dass die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen eine starke Wirkung gegen respiratorische Virus-Infektionen sowohl in vitro als auch in vivo aufweisen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter Infektionen durch Viren, die den respiratorischen Trakt befallen und dort eine Erkrankung auslösen, jegliche Art menschlicher und tierischer Viren verstanden, die den respiratorischen Trakt, also Atemwege und Lunge, befallen und in den Körper eindringen. Offensichtlich sind sich die biologischen Prozesse, die sich bei dieser Infektion ereignen, so ähnlich, dass die Wirkung der erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen in analoger Weise effizient wirkt-trotz der biologischen Heterogenität dieser Gruppe von Viren. Ungekehrt hat sich aber auch gezeigt, dass bei anderen Viren, die über andere Infektionswege in den Körper gelangen und andere biologische Zyklen durchlaufen (z.
B. als latentes Virus in das Wirtsgenom integriert werden können), die Wirkung der erfindungsgemässen DithiocarbamatVerbindungen alleine zur erfolgreichen Bekämpfung einer Virusinfektion nicht ausreicht.
In diesem Zusammenhang konnte mittlerweile gezeigt werden, dass bei der Behandlung von AIDS-Patienten mit Dithiocarbamaten keine Verbesserung oder Heilung für die Patienten erzielt wird. (Multicenter, randomized, placebo-controlled study of ditiocarb (Imuthiol) in human immunodeficiency virus-infected asymptomatic and minimally symptomatic patients. The HIV87 Study Group. AIDS Res Hum Retroviruses 1993 Jan ; 9 (1) : 83-9) Aufgrund dieser Ergebnisse wurden keine weiteren klinischen Studien bei latenten Viren durchgeführt (vgl. US 5 686 436 A).
Ihre besondere Wirksamkeit entfalten die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen gemäss der vorliegenden Erfindung vor allem in einer frühen Phase der viralen Infektion bzw. wenn es vor der Infektion eingenommen wird. So können die erfindungsgemässen DithiocarbamatVerbindungen den Ausbruch einer Virus-Infektion verhindern, wenn es prophylaktisch eingenom-
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men wird, z. B. in Gegenden zu Zeitpunkten, bei welchen ein Risiko oder gar ein erhöhtes Risiko für respiratorische Virus-Infektionen besteht, etwa in Regionen mit Epidemien oder von Kältewellen. Bevorzugterweise werden dabei die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen zur Verhinderung der Virus-Infektion verwendet.
Ganz besonders bevorzugt ist die erfindungsgemässe Virusinhibierung aber vor allem in der Frühphase einer bereits erfolgten respiratorischen Virus-Infektion. Dabei werden die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen gezielt zur Inhibierung der Replikation der Viren eingesetzt, also zu einem Zeitpunkt bevor noch nachhaltige Schäden im infizierten Individuum aufgetreten sind. Damit können nicht nur die Folgen einer fortschreitenden Virus-Infektion im betroffenen Individuum selbst verhindert werden, sondern auch die Verbreitung weiterer infektiöser Viren auf andere Individuen ; die weitere Ansteckungsgefahr wird minimiert, was besonders bei menschli- chem Influenza-Virus eine grosse allgemein gesundheitspolitische Wirkung und Bedeutung hat.
Insbesondere gelten als "respiratorische Viren" im Rahmen der vorliegenden Erfindung : Rhinoviren, Coxsackieviren, Echoviren, Coronaviren, Enteroviren, humane Orthomyxoviren (z. B. Influenza Virus (A, B und C)), Paramyxoviren (z. B. Parainfluenza-virus), respiratorische Syncytialvirus (RSV), Adenovirus und respiratorische Picornaviren. All diesen Viren gemeinsam ist die Infektion von epithelialen Zellen des oberen oder unteren respiratorischen Trakts. Die dadurch verursachte lokale Inflammation im respiratorischen Trakt gilt als die Hauptursache für die Entstehung der typischen Symptome eines grippalen Infekt, wie Schnupfen, Halsweh, Heiserkeit, Husten bzw. häufig Fieber.
Auch das häufige Auftreten von Sekundärinfektionen im immungeschwächten Indivi- duum wird durch die Infektion mit all diesen respiratorischen Viren begünstigt.
Unter "Infektion" wird im Rahmen der vorliegenden Anmeldung jeglicher Angriff eines respiratorischen Virus auf Zellen verstanden, der beispielsweise einen der folgenden Schritte umfasst : Beginnend mit dem Andocken des Viruspartikel an eine Zelle, und in einem späteren Stadium das Einführen der genetischen Information des Virus in die Zelle sowie die Produktion von neuen Viruspartikelteilen und die Expression von infektiösen Viruspartikel.
Es ist weiters auch möglich, durch Oxidation erhaltene Disulfidformen dieser Verbindung zu verwenden, da diese wie an sich bekannt im Organismus rasch zur reduzierten Form metabolisiert werden. Ein bevorzugtes Beispiel einer solchen oxidierten Disulfidform stellt das Disulfiram dar, das auch unter dem Namen "Antabus" oder "Abstinyl" bekannt ist und ein Tetraethylthiuramdisulfid (C10H20N2S4) ist. Das Disulfiram an sich ist bereits bekannt, wobei es insbesondere zur Behandlung von Alkoholikern verwendet wird : Disulfiram wirkt als Mediator bei Oxidoreduktionen und inaktiviert die Aldehyd Dehydrogenase.
Durch die Einnahme von Ethanol kommt es zur Anreicherung von Acetaldehyd im Körper, was eine ausgesprochen negative Wirkung auf das allgemeine Wohlbefinden ausübt : Bei gleichzeitiger Einnahme von Disulfiram und Alkohol kommt es zu Angstzuständen, Übelkeit, Sehverlusten, Brustschmerzen, Kopfschmerzen etc., wobei diese Symptome 3-4 Tage bzw. auch eine Woche lang anhalten. Aus diesem Grund wird Disulfiram Alkoholkern als Therapie verabreicht, da jeglicher nachfolgende Alkoholkonsum auf Grund dieser starken negativen Effekte vermieden werden sollte.
Andere bekannte Wirkungen von Disulfiram sind die Inhibierung von Enzymen wie beispielsweise Fructose, 1, 6-Diphosphat Dehydrogenase, Xanthin Oxidase, Hexokinase, Aldehyd Oxidase und Dopamin ss Hydroxylase.
Weiters wird Disulfiram zur Behandlung von Pediculosis und Scabies sowie auch zur Behandlung von Nickel Dermatitis eingesetzt.
Der Metabolismus von Disulfiram wurde bereits eingehend analysiert, s. beispielsweise Doller, C. 1999, Therapeutic Drugs, Second Edition, vol. 1 Churchill Livingstone, Edinburgh. Es ist beschrieben, dass Diethyldithiocarbamat den Hauptmetabolit von Disulfiram im Körper darstellt, wobei diese Umwandlung sehr rasch vor sich geht.
Die durch Oxidation erhaltene Disulfidform der erfindungsgemässen DithiocarbamatVerbindungen ist gut fettlöslich und kann beispielsweise als oral zu verabreichendes Mittel vorgesehen werden, wobei de Verbindungen im Magen resorbiert werden. Die Verbindungen könnten dabei insbesondere auch als Pulverspray vorgesehen werden. Weiters können die oxidierten Form der erfindungsgemässen Verbindungen mit Hydroxylgruppen versehen werden, um die Wasserlöslichkeit zu erhöhen, um es in Form eines Aerosols zur Verfügung zu stellen.
Werden die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen in der durch Oxidation erhaltenen Disulfidform
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vorgesehen, wird eine Depotwirkung dieses Mittels erzielt, d. h. die erfindungsgemässe Dithiocarbamat-Verbindungen werden über eine bestimmte Zeit hinweg allmählich an den Körper abgegeben und von diesem resorbiert. Für diese Depotwirkung können die oxidierten DithiocarbamatVerbindungen auch in den zu behandelnden Körper wie an sich bekannt implantiert werden.
Eine bevorzugte erfindungsgemässe Verbindung ist dadurch gekennzeichnet, dass R1 und % unabhängig voneinander ein Q-Cs-Aikyi darstellen oder mit dem Stickstoffatom einen aliphatischen Ring mit 4 bis 6 C-Atomen bilden. Diese haben sich als besonders vorteilhaft für die Behandlung oder Verhinderung einer respiratorischen Virusinfektion herausgestellt.
Vorzugsweise ist die Dithiocarbamat-Verbindung ausgewählt aus Pyrrolidin-Dithiocarbamat (PDTC) und N, N-Diethyl-Dithiocarbamat (DDTC). Diese Verbindungen weisen eine ausgesprochen starke Aktivität gegen respiratorische Virusinfektionen auf.
Besonders bevorzugt ist eine Infektion mit Picornavirus, Orthomyxo- oder Paramyxovirus. Die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen sind besonders aktiv gegen diese VirusInfektionen.
Von Vorteil ist dabei, wenn das Orthomyxovirus ein humanes Influenzavirus ist, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Influenza A, Influenza B, Influenza C bzw. das Paramyxovirus ein Parainfluenzavirus ist, bzw. wenn das Picornavirus Rhinovirus, insbesondere humanes Rhinovirus, Enterovirus, insbesondere Enterovirus 70 und Coxsackievirus, bzw. Aphthovirus, insbesondere das Maul- und Klauenseuche-Virus, ist. Vorzugsweise ist das Orthomyxovirus ein Säugetier Influenza A Virus. Diese Virusinfektionen werden besonders effizient mit der erfindunggemässen Verbindung behandelt bzw. verhindert.
Die Familie der Picornaviridae umfasst eine Reihe von kleinen RNA-Viren unter anderem Rhinoviren (z. B. das humane Rhinovirus), Enteroviren (z. B. Enterovirus 70, Coxsackievirus, das beispielsweise ein Erreger der Hand-, Fuss- und Mundkrankheit ist) und Aphthoviren (z. B. das Maul- und Klauenseuche-Virus). Orthomyxo- und Paramyxoviren sind eine Unterteilung der früheren Sammelbezeichnung für Influenzaviren und anderen ähnlichen Viren. Beim Menschen rufen Paramyxoviren beispielsweise Masern, Mumps und respiratorische Erkrankungen hervor. Zu den Paramyxoviren gehören unter anderem das Parainfluenzavirus, Mumpsvirus, Newcastle DiseaseVirus, das respiratorische Syncytialvirus (RSV), das Masernvirus und das Rinderpestvirus.
Zu den Orthomyxoviren gehören unter anderem das Influenzavirus A, B und C, die die Erreger der Grippe beim Menschen sind.
Die Influenzaviren vom Typ A sind verantwortlich für die Mehrzahl der Grippeepidemien sowie für alle Pandemien. Influenza A-Viren kommen zwar auch bei Pferden und Schweinen sowie auch bei Vögeln, beispielsweise als Erreger der klassischen Geflügelpest, vor, jedoch können nur die menschlichen Influenza-Viren und die Influenza-Viren von Säugetieren, z. B. Pferd, als respiratorische Viren im eigentlichen Sinn gelten, da sich die Biologie vom Vögel-Influenza-Virus (Avian Influenza Virus (Al)) völlig vom menschlichen Influenza-Virus unterscheidet. Daher kann gerade das AI-Virus nicht als respiratorisches Virus angesehen werden. In Enten repliziert das AI-Virus primär im Intestinaltrakt, was beim Menschen nicht der Fall ist. Als Konsequenz können Ai-Viren auch aus den Faeces von Vögeln isoliert werden.
(Hinshaw et al 1980 Canad. J. microbiol. 26, 622- 9). Weiters ist die Nukleotid-Variationsrate von Al Viren niedriger als jene bei Viren, die von Säugetieren isoliert werden können. Die Evolution der viralen Proteine in anderen Organismen als Vögeln zeigt typischerweise eine rapide Akkumulation von Mutationen, die bei At-Viren nicht vorkommen. (Gorman et al. 1991, J. Virol. 65 : 3704-14 ; Ludwig et al. 1995, Virology 212 : 555-61). Die Rezeptorspezifität variiert zwischen verschiedenen Influenza Viren. Die meisten Al Viren binden vorzugsweise an den alpha2-3-Galactose-Sialinsäurerezeptor.
Im Gegensatz dazu binden humane Influenza Viren primär an den alpha2-6-Galactose-Sialinsäurerezeptor (Rogers+Paulson, 1983 Virology 127, 361-73 ; Baum + Paulson 1990 Acta Histochem Suppl 40 : 35-8)
Da die erfindungsgemässen Viren bei Mensch und Säugetieren zu einer Anzahl von weit verbreiteten Krankheiten führen, ist die antivirale Wirkung der erfindungsgemässen DithiocarbamatVerbindungen im Hinblick auf diese Viren besonders wichtig. Da die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen ausgesprochen wirksam gegen diese Viren sind, eignen sich die erfin- dungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen insbesondere zur Herstellung von einer Reihe von Mitteln zur Behandlung bzw. Prävention dieser Virus-Infektionen.
Die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen sind leicht und kostengünstig in grossen Mengen herstellbar und wirken
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auch in höheren Konzentrationen kaum toxisch auf die zu behandelnden Zellen.
Gemäss einer vorteilhaften Ausführungsform ist die erfindungsgemässe DithiocarbamatVerbindung in dem Mittel in einer Konzentration von 0, 01 bis 5000 mM, vorzugsweise 1 bis 300 mM, besonders bevorzugt 10 bis 100 mM, vorgesehen. In diesen Konzentrationen sind die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen besonders wirksam gegen Virusinfektionen im respiratorischen Trakt und weisen kaum bzw. keine Nebeneffekte auf. Die einzusetzende Konzentration wird je nach der zu behandelnden Virus-Infektion, je nach Stärke der Virus-Infektion bzw. je nach dem zu behandelnden Organismus, etwa ob Tier oder Mensch bzw. in Abhängigkeit des Alters, ausgewählt.
Besonders günstig ist es, wenn die erfindungsgemässe Dithiocarbamat-Verbindung in dem Mittel in einer Konzentration von 10mM bis 1M vorgesehen ist. In diesem Fall liegen die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen in hoch konzentrierter Form vor und das Mittel kann vor der Behandlung je nach gewünschter Konzentration verdünnt werden.
Vorzugsweise umfasst das Mittel weiters einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Dabei kann jeder dem Fachmann auf dem Gebiet der Pharmazie bekannte pharmazeutisch akzeptable Träger eingesetzt werden, wie zum Beispiel Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) oder anders gepufferte Kochsalzlösungen bzw. Liposomen-hältige Formulierungen, wobei hier wiederum der Träger je nach Behandlungsart, Virus-Infektion bzw. dem zu behandelnden Organismus ausgewählt wird.
Vorzugsweise ist das Mittel ein oral, intranasal, intravenös, parenteral, rektal bzw. als Augenoder Ohrentropfen, Gurgellösung oder Aerosol zu verabreichendes Mittel. Dabei hängt die Art der Verabreichung insbesondere von der zu behandelnden Virus-Infektion ab. Beispielsweise wird eine respiratorische Infektion durch ein intranasal zu verabreichendes Mittel, z. B. in Form eines Aerosols umfassend die Dithiocarbamat-Verbindungen, behandelt werden, da die Virus-Infektion gleich am Ort des Virusangriffs behandelt wird. Je nach Art der Verabreichung liegen die DithiocarbamatVerbindungen in einer bestimmten Konzentration vor bzw. umfasst das Mittel zusätzliche für diese Verabreichungsform günstige Substanzen.
Es ist selbstverständlich möglich, das Mittel etwa in getrockneter Form vorzusehen, wobei es vor der Behandlung mit einem geeigneten Lösungsmittel verdünnt wird.
Eine besonders vorteilhafte Verwendung ist gegeben, wenn das Mittel weitere antivirale Substanzen umfasst. Auf diese Weise kann die Virus-Infektion im respiratorischen Trakt von mehreren Seiten her bekämpft werden bzw. es kann gleichzeitig eine ganze Palette von verschiedenen Viren abgeschwächt bzw. vollständig ausgeschaltet werden. Solche weiteren antiviralen Substanzen sind etwa Substanzen, die die Replikation hemmen, immun-stimulierende Substanzen, neutralisierende Antikörper etc., aber auch gegebenenfalls Substanzen, die das Immunsystem generell unterstützen können.
Vorzugsweise umfasst das Mittel eine Kombination von zumindest zwei verschiedenen erfindungsgemässen Dithiocarbamaten, insbesondere eine Mischung aus PDTC und DDTC. Die erfindungsgemässen Dithiocarbamat-Verbindungen üben pro-und anti-oxidative Funktionen in Zellen aus. Ihre anti-oxidative Wirkung umfasst die Eliminierung von Wasserstoffperoxid, Entfernen von Superoxid-Radikalen, Peroxynitriten, Hydroxylradikalen und Lipid-Peroxidationsprodukten. Durch diese Eliminationen werden die Dithiocarbamate zu Thiuram-Disulfid oxidiert. Thiuram-Disulfide sind verantwortlich für die pro-oxidativen Wirkungen von Dithiocarbamaten, wobei in manchen Fällen die Bildung von Thiuramen abhängig von der Gegenwart von Metallen ist.
Es wurde beschrieben, dass die anti-apoptotischen Aktivitäten von Dithiocarbamaten möglicherweise in Verbindung mit der Inaktivierung von Kaspasen durch Thiol-Oxidation stehen.
Besonders bevorzugt umfasst das erfindungsgemässe Mittel weiters Substanzen, ausgewählt aus Antibiotika, Impfstoffen, Immunsuppressiva, Stabilisatoren, immunstimulierenden Substanzen, Blutprodukten oder Mischungen davon. Werden zusätzlich Antibiotika eingesetzt, können neben den respiratorischen Viren weiters Bakterien-Infektionen bekämpft werden, die in Form einer Zweitinfektion in dem geschwächten Körper auftreten können. Umfasst das Mittel zusätzliche Impfstoffe, wobei hierunter sowohl passive als auch aktive Impfstoffe zu verstehen sind, d. h. beispielsweise Antigene, Antikörper oder Fragmente hievon, werden gleichzeitig mit der erfindungsgemässen Behandlung bzw. Prävention der Virus-Infektion auch bestimmte andere weitere VirusInfektionen verhindert, die den geschwächten Organismus leicht infizieren können.
Zusätzlich
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können zur Erhöhung der Lagerungsstabilität bzw. Lebensdauer weiters Stabilisatoren zugesetzt werden. Beispielsweise können die erfindungsgemässen Dithiocarbonat-Verbindungen Präparationen zur Impfung gegen respiratorische Viren zugesetzt werden, um in einer ungeschützten Zeitspanne, in der der Impfstoff seine Wirkung noch nicht entfaltet, den geimpften Organismus vor respiratorischen Virusinfekten zu schützen. Je nach Situation, Organismus und Behandlungsart kann der Fachmann Immunsuppressiva, immunstimulierende Substanzen und Blutprodukte auswählen, die er zu dem Präparat umfassend die erfindungsgemässe Dithiocarbonat-Verbindung zusetzt, bzw. zu der er die erfindungsgemässe Dithiocarbonat-Verbindung zusetzt. Blutprodukte sind beispielsweise Gerinnungsfaktoren, Serum, Plasma und Ähnliches.
Stabilisatoren können weiters zugesetzt werden, um die Lagerstabilität des erfindungsgemässen Mittels zu erhöhen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung bzw.
Verhinderung einer Infektion von Oberflächen, Medien bzw. Zellkulturen durch Viren, die den respiratorischen Trakt befallen und dort eine Erkrankung auslösen, wobei ein Desinfektionsmittel, umfassend zumindest eine Dithiocarbamat-Verbindung, wie oben definiert, auf die Oberfläche bzw.
Zellkultur aufgebracht bzw. in das Medium eingebracht wird. Zur Desinfektion einer Oberfläche genügt es beispielsweise, die Oberfläche mit dem Desinfektionsmittel zu reinigen. Im Fall von Medien und Zellkulturen kann das Desinfektionsmittel über längere Zeit hinweg einwirken, wobei die Konzentration des Desinfektionsmittels je nach Zweck variiert werden kann. Hierbei gelten wiederum die oben angeführten Definitionen und vorteilhaften Ausführungsformen.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der nachstehenden Beispiele und Figuren näher erläutert, auf die sie jedoch nicht beschränkt ist.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die die inhibitorische Wirkung von PDTC auf die HRVReplikation in Zellkulturen zeigt ; Fig. 2 zeigt die Inhibition von durch Rhinoviren induzierten cytopathischen Effekte durch PDTC ; Fig. 3 zeigt die Erhöhung der Zelllebensfähigkeit durch PDTC und DDTC ; Fig. 4 A/B zeigen die Wirkung einer PDTC-Behandlung in Abhängigkeit von der Zeit ; Fig. 5 zeigt die Spaltung von e) F4G) ; Fig. 6 zeigt eine Western Blot Analyse zur Bestimmung der Expression von Rhinovirus-Kapsidproteinen ; Fig. 7 A-D zeigen den Effekt von anderen Antioxidantien auf die HRV -Infektion ; Fig. 8 und 9 zeigen den Effekt von PDTC auf die Influenzavirus Replikation ;
Fig. 10 zeigt die Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von PDTC auf mit Influenza Viren infizierte Verozellen ; Fig. 11 A und 11 B zeigen die Wirkung von PDTC auf mit Influenza-Virus infizierte Mäuse ; Fig. 12 zeigt die Wirksamkeit von PDTC gegen ERAV ; Fig. 13 A/B zeigen die Wirksamkeit von PDTC gegen MKS ; und Fig. 14 zeigt die fehlende Wirkung von PDTC gegen EMCV in vivo.
Beispiele
Beispiel 1 : Reduktion der Produktion von infektiösen Rhinovirus-Partikeln durch PDTC
Um die Wirksamkeit während Infektionen von HRV zu testen, wurde PDTC nach Infektion von Zellen mit unterschiedlichen HRV-Serotypen zugesetzt.
HeLa-Zellen wurden mit HRV -Serotypen 1A, 2,14 und 16 mit 20 TCIDso (tissue-culture- infectious-dose 50) pro Zelle infiziert. Gleichzeitig wurde PDTC in einer Konzentration von 125 uM dem Medium zugesetzt. Überschüssiges Virus wurde 4h nach Infektion entfernt, während PDTC erneut dem frischen Medium zugegeben wurde. 24 Stunden (Fig. 1, oben) und 48 Stunden. (Fig. 1, unten) nach der Infektion (pu.) wurden die Überstände gesammelt und die Menge der Virusnachkommen durch TCiD5o-Tests bestimmt. Die Behandlung von Zellen mit PDTC verringert den Virustiter (vt) um 103 nach 24h (Fig. 1, oben). Die Überstände von PDTC behandelten Zellen, die 48 Stunden nach der Infektion gesammelt wurden, zeigen ebenfalls eine signifikante Reduktion des Virustiters (Fig. 1, unten).
Diese Tests zeigen, dass PDTC stark antiviral gegen verschiedene HRV-Serotypen wirkt.
Beispiel 2 : PDTC inhibiert HRV-induzierte cytopathische Effekte und erhöht die Lebensfähigkeit von infizierten Zellen
In den späten Stadien einer rhinoviralen Infektion treten morphologische Änderungen der Zeilen auf, bekannt als "cytopathische Effekte" (CPE). Diese durch HRV induzierten CPE sind charak-
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terisiert als Zellrundung, Schrumpfen, Deformation des Kerns und Chromatin-Kondensation. Bei einer Infektion von HeLa-Zellen mit HRV2, HRV14, HRV1A und HRV16 mit 100 TCID50 pro Zelle ist ein eindeutiger cytopathischer Effekt nach 8 h p. 1. sichtbar. Der Zusatz von PDTC während der Infektion inhibiert das Auftreten dieser cytopathischen Effekte.
In Fig. 2 ist gezeigt, dass die Morphologie der Zellen 8 h nach der Infektion in Gegenwart von 125 uM PDTC (s. rechte untere Figur) nicht zu unterscheiden ist von der Morphologie von nicht-infizierten (n. i.) Zellen (s. die zwei oberen Figuren).
Die Behandlung mit PDTC führt somit zu einer Bekämpfung der Virus-Infektion in einem sehr frühen Stadium, so dass weitergehende Zellschäden verhindert werden.
Beispiel 3 : Erhöhung der Lebensfähigkeit von infizierten Zellen durch PDTC und DDTC
Ein Zellen-Proliferations-Assay wurde durchgeführt, um den Effekt von PDTC oder DDTC auf die Lebensfähigkeit der Zellen während einer viralen Infektion zu testen.
Dazu wurde ein Zell-Titer z Aqueous Non-radioactive Cell Proliferation Assay (Promega ; Madison, Wisconsin, U. S. A) gemäss der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Einen Tag vor der Infektion wurden Zellen in 96-well-Platten gesetzt. Diese Zellen wurden mit verschiedenen HRVSerotypen mit 20 TCtDgo/Zette infiziert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Zusetzen einer Tetrazoliumsubstanz, 2h Inkubation bei 37 C und Messen der Absorption bei 492nm bestimmt.
24 h nach der Infektion mit HRV2 zeigten HeLa-Zellen im Vergleich zu nicht-infizierten HeLaZellen (mock infection medium = MIM) einen vollständigen Verlust ihrer metabolische Aktivität. In Fig. 3 (oben DDTC ; unten PDTC) ist ersichtlich, dass die Lebensfähigkeit der Zellen selbst bei Zusatz von geringen Konzentrationen von PDTC oder DDTC signifikant erhöht ist. PDTC oder DDTC alleine hat nur geringe Auswirkungen auf nicht infizierte Zellen. Die Konzentrationen, die zur Inhibition der viralen Infektionen eingesetzt werden, zeigten jedoch keine Toxizität ("-"bedeutet ohne).
Beispiel 4 : Wirksamkeit von PDTC in Abhängigkeit von der Zeit
Um zu testen, in weichem Stadium des viralen Lebenszyklus PDTC eingreift, wurde PDTC zu verschiedenen Zeitpunkten nach Virus-Infektion mit 20 TCtDso pro Zelle zugesetzt und es wurden Proliferation-Assays durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass der Zusatz von PDTC (125 uM) innerhalb der ersten sechs Stunden nach Infektion ("-"bedeutet ohne) den besten Schutz vor Virus-induziertem Verlust der Proliferation bietet (Fig. 4A). Auch dieser Effekt ist nicht spezifisch für einen einzigen Serotyp, da HRV-Serotypen 1A, 2,14 und 16 verwendet wurden. Erst die PDTCBehandlung (125 uM) von Zellen zu einem Zeitpunkt später als 8 Stunden nach Infektion verringerte die Schutzwirkung.
Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die viralen Titer (vt) in den Überständen von infizierten und PDTC-behandelten Zellen bestimmt wurden (s. Fig. 4B). Der Zusatz von PDTC bis zu vier Stunden nach Infektion reduzierte die Titer von produziertem HRV2 um 103. Selbst wenn die PDTC-Behandlung erst 6 Stunden nach Infektion begonnen wurde, wurden die produzierten viralen Titer signifikant verringert. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Zusatz von PDTC auch dann einen antralen Effekt hat, wenn dies zu späteren Stadien während der Infektion geschieht, wobei sowohl die Lebensfähigkeit der Zellen erhöht wird, als auch die Menge an infektiösen Viren dramatisch verringert wird.
Damit wurde gezeigt, dass die antivirale Wirkung nicht nur in den frühen Stadien des viralen Lebenszyklus auftritt, beispielsweise während der Rezeptorbindung bzw. dem Eintritt in die Zelle.
Beispiel 5 : Untersuchung des HRV-Infektionsverlaufes in Anwesenheit von PDTC
Um den Verlauf einer rhinoviralen Infektion in Gegenwart und Abwesenheit von PDTC zu überprüfen, wurden verschiedene proteolytische Aktivitäten analysiert. Eine charakteristische proteolytische Aktivität, die im Lauf von Infektionen mit Rhino-und Enteroviren auftritt, ist das enzymatische
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elF4G-Proteine bereits in einem frühen Stadium einer Infektion gespalten. Eine weitere, erst kürzlich beschriebene Spaltungsaktivität während einer rhinoralen Infektion ist das Spalten des intermediären Filament-Proteins Cytokeratin 8. Auch diese Spaltung ist abhängig von der 2A-Protease, tritt aber zu einem späten Stadium während der Infektion auf.
Um den Einfluss einer PDTCBehandlung auf den Verlauf einer Virus-Infektion zu testen, wurde eine Western-Blot-Analyse durchgeführt, um diese 2A-Protease-Substrate zu analysieren.
Für die Western Blot Analyse wurde zu den angezeigten Zeitpunkten Medium entfernt. Die Zellen wurden durch Zusatz von 100ul Protein-Puffer (8% Natrium-Dodecylsulfat, 20% ss-Mercaptoethanol, 20% Glycerol, 0, 04% Bromphenolblau) Iysiert. 20 1.. Proteinextrakt wurden pro Spur mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDF-Membrane geblottet. Die Inkubation mit Antikörpern wurde mit 0, 1% Tween 20 und 5% Magermilchpulver in TBS durchgeführt. Für die. Immunodetektion wurden polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen elF4GI eingesetzt. Als sekundäre Antikörper wurden Anti-Kaninchen Immunglobuline konjugiert mit alkalischer Phosphatase verwendet.
Die Färbung wurde durch die alkalische Phosphatasereaktion durchgeführt, die molekularen Grössen wurden mit Hilfe eines vorgefärbten Markers SDS-7B (Sigma) bestimmt.
In HRV2-infizierten HeLa Zellen (100 TCtD5o pro Zelle) kann das Spalten von elF4GI 4 Stunden nach Infektion detektiert werden (cp steht für Spaltprodukt"cleavage product"), die vollständige Spaltung ist 8 Stunden nach der Infektion erreicht (Fig. 5). Zu diesen Zeitpunkten ist in infizierten Zellen in Gegenwart von PDTC keine Spaltung des elF4GI detektierbar. Zu späteren Zeitpunkten, etwa 24 Stunden nach Infektion kann auch in PDTC behandelten Zellen eine leichte eIF4GI- Spaltung detektiert werden.
Dies zeigt, dass entweder die Protease-Funktion blockiert ist oder die Menge an viralen Proteinen stark reduziert ist.
Beispiel 6 : Detektion von viralen Hüllproteine
Um den Einfluss von PDTC auf die Expression von viralen Proteinen zu testen, wurden KapsidProteine von HRV2 in Protein-Extrakten von HRV2-infizierten HeLa-Zellen (100 TCtDso pro Zelle) durch Western Blot Analyse detektiert (s. Fig. 6). Die Western Blot Analyse wurde wie oben unter Beispiel 5 beschrieben durchgeführt, wobei ein polyklonales Kaninchen-Antiserum gegen HRV2 verwendet wurde. Signifikante Mengen der rhinoviralen Proteine VP1, VP2 und VP3 wurden in unbehandelten Zellen zu einem Zeitpunkt von 6 Stunden nach Infektion detektiert. Eine PDTCBehandlung verhindert die Expression dieser Kapsid-Proteine innerhalb der ersten 8 Stunden nach Infektion. Die schwache Expression von VP1, VP2 und VP3 wurde erst zu einem späten Zeitpunkt von etwa 24 Stunden nach Infektion detektiert.
Damit ist gezeigt, dass PDTC zu einer verspäteten Produktion von viralen Proteinen führt, was die anti-rhinovirale Wirkung von PDTC als auch dessen Schutzwirkung auf Zellen erklärt.
Beispiel 7 : Bestimmung der Abhängigkeit der antiviralen Wirkung vom Redox-Potential
Es wurden weitere Antioxidantien auf ihre Inhibitor-Wirkung während einer HRV2-lnfektion von HeLa-Zellen getestet (Fig. 7). HeLa Zellen wurden in einer 6-well Platte mit HRV2 (100 TCI050 pro Zelle) infiziert ("n. i." bedeutet nicht infiziert). 1 h nach der Infektion wurde das Medium entfernt und frisches Medium bzw. Medium mit PDTC oder NAC in verschiedenen Konzentrationen zugegeben.
Nach 24h wurde der Zellrasen mit PBS gewaschen und mit Kristallviolett gefärbt. In Fig. 7A ist ersichtlich, dass die Infektion mit HRV2 den Zellrasen zerstört, PDTC kann diesen Effekt verhindern, nicht aber NAC. Die Wirkungsweise von Vitamin C, Trolox und ss-Mercaptoethanol (2-ME) wurde wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmt (Fig. 7 B, C, D). Es konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass all diese antioxidativen Substanzen keinerlei Schutzwirkung während viraler Vermehrung hatten. Als Kontrolle wurden die toxischen Effekte der Substanzen h Abwesenheit von Virus getestet. Eine hohe Dosis von Vitamin C (100pg/ml) inhibierte das Zellenwachsturn stark.
Damit wurde gezeigt, dass die antivirale Wirkung von PDTC nicht auf dessen antioxidative Wirkung zurückzuführen ist, sondern offensichtlich mit anderen Eigenschaften zusammenhängt.
Beispiel 8 : Wirkung von PDTC auf die Influenza-Virus-Replikation
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5x10s Verozellen wurden mit Influenzavirus A/PR8/34 oder Vienna/47/96 mit einer m. o. i. von 0, 01 infiziert und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschliessend wurde das Inokulum entfernt und
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sen. Wie in Fig. 8 gezeigt, wurde der Virustiter von A/PR8/34 in Gegenwart von PDTC um mehr als 2 log Stufen verringert gegenüber der Kontrollprobe (c).
Um die Wirksamkeit des PDTC zu testen wurde ein TCID50 (50% tissue culture infective dose) Assay mit und ohne PDTC durchgeführt. TCIDso wurde gemäss der Methode von Kaerber bei jeder Konzentration berechnet : 96 Wells Microtiterplatten wurden mit 2fachen Verdünnungsreihen des angegebenen Virus infiziert, 1 h nach der Infektion wurde der Überstand entfernt und Medium umfassend die angegebenen Konzentrationen von PDTC zugegeben. Die Anzahl der infizierten Wells wurde nach 4 Tagen bestimmt. In Fig. 9 ist gezeigt, dass bei einer Konzentration von 300 uM
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4%Inhibierung von über 99, 9% wurde für beide Viren bei einer Konzentration von 1200 uM erreicht.
Beispiel 9 : Bestimmung der wirksamen Konzentration von PDTC
Mittels eines CPE (cytopathic effect) Reduktions Assays wurde die wirksame Konzentration von PDTC bestimmt : Verozellen wurden in 96 Well Mikrotiterplatten kultiviert und mit 5 TCiDso pro Well und 50 TCiD5o pro Well Influenza A/PR8/34 sowie 5 TCIDso pro Well Influenza ANienna/47/96 infiziert. 1 h nach der Infektion wurde der Überstand entfernt und Medium mit 5 pg/ml Trypsin und einer 2fachen Verdünnungsreihe von PDTC beginnend bei einer Konzentration von 1200 uM zugegeben. Die Platten wurden während der darauffolgenden 4 Tage visuell auf cytopathische Effekte untersucht. Die % Inhibierung des Erscheinens von cytopathischen Effekten im Verhältnis zur Kontrollprobe wurde für jede Konzentration berechnet.
In Fig. 10 ist ersichtlich, dass eine 50% Reduktion von positiven Wells bei Konzentrationen zwischen 50 und 100 uM PDTC erreicht wurde, eine 100% Reduktion der positiven Wells wurde bei einer Konzentration von 600 uM PDTC für alle Viren erreicht.
Beispiel 10 : Bestimmung der PDTC Wirkung in vivo
10 C57/BL6 Mäuse wurden intranasal mit einer letalen Dosis (50 pl 107 pfU) des A/PR8/34 Virus inokuliert. 1 h danach wurden sie intranasal mit 25 ui 600 mM PDTC bzw. 25 ui PBS behandelt.
Die Mäuse wurden während der ersten 48h alle 12h, anschliessend alle 24h untersucht und behan- delt. Das Gewicht der Mäuse wurde gemessen und in % des ursprünglichen Gewichts angegeben (% w) (Fig. 11A). In Fig. 11B ist gezeigt, dass alle mit PDTC behandelten Mäuse (Quadrat) die Virusinfektion überlebten und 7 Tage nach Infektion Gewicht zunahmen. Alle mit PBS behandelten Mäuse (Rauten) starben innerhalb von 12 Tagen nach der Infektion (% s = % Überlebende).
Damit ist gezeigt, dass PDTC alleine eine starke Wirksamkeit gegen Influenza Virus Infektionen in vitro und in vivo aufweist.
Beispiel 11 : Antivirale Aktivität von PDTC gegen Equines Rhinitis A Virus (ERAV)
Die Reduktion der viralen Multiplikation von ERAV durch Zugabe von PDTC wurde wie folgt untersucht : Vero-Zellen wurden mit 10 TCiDso pro Zelle ERAV infiziert. Gleichzeitig wurden unterschiedliche Konzentrationen PDTC zugegeben (1mM-50 pm). 4h nach der Infektion wurde das Inokulum entfernt und frisches Medium mit PDTC zugegeben. 24h nach der Infektion wurden die Überstände entnommen und der virale Titer in einem Standard-Plattenassay bestimmt.
Fig. 12 zeigt, dass der Virustiter (vt) im Überstand im Vergleich zu unbehandelten Zellen (-) abnimmt.
Beispiel 12 : Wirkung von PDTC auf die Vermehrung von Maul- und Klauen-Seuche Virus (MKS) in Zellkultur
Mittels eines CPE ("cytopathic effect") Reduktions Assays wurde die wirksame Konzentration
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von PDTC auf die durch MKS-Virus bedingte Zellzerstörung ermittelt.
IB-RS-2 Zellen wurden in 96-Well Mikrotiterplatten kultiviert und mit MKS-Virus 0-Manisa mit 0, 1 TCIDgo pro Zelle infiziert und 1 h bei 37 C inkubiert. Anschliessend wurde das Inokulum entfernt und Infektionsmedium mit den angegebenen Konzentrationen von PDTC (10uM bis 1200pM) zugegeben. Die Anzahl der infizierten Wells wurde durch mikroskopische Beobachtung des cytopathischen Effekts nach 24h bestimmt.
In Fig. 13A ist gezeigt, dass die Anzahl der infizierten Wells (% pos. ) nach 24h von der PDTC Konzentration abhängig ist. 600pM PDTC schützen die Zellen zu 100% vor virusbedingtem cytopathischen Effekt. Eine 50% Reduktion von infizierten Wells wird im Konzentrationsbereich zwischen 75 uM und 150 uM erreicht.
Um die Wirkung von PDTC auf die MKS-Virus-Replikation zu testen, wurden IB -RS -2 Zellen in T25cm2 Zellkultur-Flaschen mit MKS-Virus O-Manisa mit 0. 001 TCIOso pro Zelle infiziert und 1h bei 370C inkubiert. Anschliessend wurde das Inokulum entfernt und Infektionsmedium mit den angegebenen Konzentrationen PDTC (OuM bis 200uM) zugegeben. 24h nach der Infektion wurden die Überstände entnommen und der virale Titer (TCID) in einem Standard-Plattenassay bestimmt.
Wie in Fig. 13B gezeigt, wird der Virustiter von MKS-Virus OManisa in Gegenwart von PDTC im Vergleich mit der Kontrollprobe (0) um mehr als 2 log. Stufen verringert. Der Kontrollprobe wurde kein PDTC zugesetzt.
Beispiel 13 : Wirkung von PDTC auf die Vermehrung von FSME in Zellkultur
FSME-Viren gehören weder zu den Picornaviren noch lösen sie eine Erkrankung im respiratorischen Trakt aus.
Konfluente Monolayers von BHK-21-Zellen (ATCC) wurden mit 10 pfu/Zelle FSME-Virus (Neudörfel) in Gegenwart von folgenden Konzentrationen PDTC infiziert : 1000 pM, 500 pM, 250 uM, 125 uM, 62,5 M, 31,25 M, 15,6 M, 7,8 M, 3,9 M, 1,95 M, 0,975 M.
Anschliessend wurden die Zellen 4 Tage bei 37 C inkubiert und der Zellmonolayer mikroskopisch analysiert. Die Virusvermehrung wurde durch Verwendung eines Enzymimmunoassays bestimmt. Die mikroskopische Analyse zeigt keine Hnweise auf toxische Effekte von PDTC. Eine Quantiflzierung der Virusvermehrung zeigt, dass PDTC in keiner der getesteten Konzentrationen in der Lage ist, die Virusvermehrung zu reduzieren.
In Analogie wurde untersucht, ob PDTC in Zellen in Suspension die Virusvermehrung beeinflussen kann : Es wurden dieselben Konzentrationen wie oben getestet. Auch in diesem Versuch kann kein Hinweis auf eine Reduzierung der Virusvermehrung durch PCTC gefunden werden.
Beispiel 14 : Wirkung von PDTC auf EMC-infizierte Mäuse
C57B16-Mäuse wurden mit 10 TCID50 EMC-Virus intraperitoneal infiziert. Die Kontrollgruppe wurde anschliessend ein Mal täglich mit 50 u) PBS intraperitoneal behandelt. Zwei weitere Gruppen wurden mit 50 ui 50 mM PDTC pro Tag behandelt, wobei bei einer Gruppe die Behandlung gleichzeitig mit der Infektion begonnen wurde (PDTC), bei der anderen Gruppe erst 24 h nach der Infektion (PDTC 24hpi).
In Figur 14 ist die Veränderung des Mausgewichts nach Beginn der Infektion gezeigt. Es ist klar ersichtlich, dass sich behandelte und unbehandelte Tiere nicht unterscheiden. Im Mittel tritt in den infizierten Mäusen der Tod in allen Gruppen in 5, 5 Tagen ein.
Damit ist gezeigt, dass PDTC keine Wirkung auf eine EMC-Infektion, das zwar zu den Picornaviren zählt, jedoch keine Erkrankung im respiratorischen Trakt sondern in Nervenzellen auslöst, hat.
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