ES2250692T3 - Utilizacion de un tipo de compuesto antivirico para la fabricacion de un producto para el tratamiento o prevencion de una infeccion virica en las vias respiratorias. - Google Patents

Abstract

Utilización de compuestos de ditiocarbomato con la fórmula estructural R1R2NCS2H, en la que R1 y R2 son independientemente entre si un grupo C1-C4 alquilo de cadena recta o ramificada o que constituyen con el átomo de nitrógeno un anillo alifático con 4-6 átomos de carbono, de manera que R1, R2 o el anillo alifático en su caso está sustituido con uno o varios sustituyentes escogidos entre OH, NO2, NH2, COOH, SH, F, Cl, Br, I, metilo o etilo y formas oxidadas de estos compuestos, en especial dímeros de los mismos, así como sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o reducción de una infección por virus de RNA que afectan las vías respiratorias en humanos y mamíferos, produciendo enfermedades en las mismas.

Description

Utilización de un tipo de compuesto antivírico para la fabricación de un producto para el tratamiento o prevención de una infección vírica en las vías respiratorias.

La presente invención se refiere a la utilización de compuestos de ditiocarbamato, así como a un medio de desinfección y a un procedimiento para la desinfección de superficies, medios o cultivos celulares.

Existe una serie de virus que conducen a enfermedades en las vías respiratorias de humano y de mamíferos. A pesar de que estos virus patógenos respiratorios pueden ser estructuralmente distintos y pertenecen a diferentes familias de virus, todos estos virus tienen en común que se encuentran en situación de entrar en el cuerpo a través de las vías respiratorias, de manera que puedan atacar células específicas de dichas vías, por ejemplo, la capa celular epitelial de las vías respiratorias, las células alveolares, células pulmonares, etc. Todas en conjunto constituyen los síntomas clásicos de las infecciones gripales que se caracterizan por inflamación local y manifestaciones de enfermedad en las vías respiratorias (tales como catarros, ronquera, tos, enfriamientos, dolor de garganta).

Las infecciones víricas, sobretodo en las vías respiratorias, producen alteraciones patológicas en las células afectadas, en especial, en las células epiteliales que se caracterizan por Stress oxidante. Se producen productos intermedios de oxígeno reactivo (intermediarios de oxígeno reactivo; ROI) que son producidos, por ejemplo, por leucocitos, células pulmonares epiteliales o bien xantina-oxidasa, que actúan como mediadores de las alteraciones celulares producidas por estos virus. Dentro del ámbito de estos tres oxidantes, puede tener lugar la activación del factor de transcripción oxidante-específico NFkB (factor nuclear-kB). El NFKB ha sido encontrado en diferentes tipos de células y ha sido citado en relación con la activación de genes para la inflamación y respuesta inmune.

Los antioxidantes pueden bloquear la activación de NFkB, de manera que se puede luchar contra los ROI que, por el contrario, conducen a esta activación. Para ello, se ha recomendado la utilización de antioxidantes, en especial en el tratamiento de infecciones con virus latentes; no obstante, se ha observado que un tratamiento efectivo de estas infecciones latentes no es posible con antioxidantes únicamente sino, en caso de que sea posible, solamente por una terapia combinada mediante una mezcla de diferentes antioxidantes (es decir, con diferentes efectos) y otros medios de lucha contra los virus (USA 5.686.436). No obstante, no se ha podido alcanzar hasta el momento la inhibición de la replicación vírica o la infección vírica por antioxidantes, en especial, ello no ha sido posible para infecciones con gripe o picornavirus (Knobil y otros. Am. J. Physiol. 274 (1) (1998) (134-142)).

Por otra parte, los diferentes antioxidantes recomendados para la lucha contra las infecciones y el virus son muy distintos en cuanto a su actividad antioxidante. Así pues, el ácido L-ascórbico y la vitamina E actúan como protección contra glutation, las vitaminas K, A y E actúan como antagonistas de peroxinitrito y otros fuertes oxidantes en el cuerpo. Se han recomendado como inhibidores de la activación de NFkB antiinflamatorios esteroides no glucocorticoides lazaroides, ditiocarbamato o N-acetil-L-cisteína.

Los virus pueden ser divididos según su soporte de informaciones genéticas en virus DNA y RNA, de manera que los ácidos nucleicos son de una sola hebra o de doble hebra, siendo rodeados por un recubrimiento de proteínas.

El RNA de una sola hebra de estos virus RNA se encuentra o bien en forma de hebra plus (mRNA) o bien hebra menos. Además, esta información genética del virus puede encontrarse en diferentes partes tal como, por ejemplo, en el caso del virus de la gripe.

Los rinovirus humanos (HRV), que forman parte de los picornavirus, son la causa principal para los resfriados a escala mundial. La frecuente aparición de HRV, el riego de infecciones secundarias que pueden ser graves y la influencia económica con respecto a los costes médicos, visitas médicas, períodos de enfermedad de empleados, hacen del HRV un generador de enfermedades que debe ser tenido en cuenta. A pesar de su frecuente aparición, no se tiene a disposición, en la actualidad, un medio seguro de lucha contra esta enfermedad vírica del tratamiento de los síntomas. Por otra parte, las consecuencias, por ejemplo, de una infección por rinovirus no son tan graves o peligrosas para la vida razón por la que deba considerarse la toma de productos farmacéuticos que tienen elevados riesgos de efectos secundarios. Los productos que se deben tomar contra estos tipos de virus deben presentar, por lo tanto, solamente pequeños o ningún efecto secundario. Al grupo de los picornavirus animales se cuentan el A-virus de rinitis equina (ERAV), e igual que el virus de la fiebre bucal y de la fiebre aftosa (MKS) pertenecen al género de los aftovirus.

Otras importantes familias de virus que son responsables de enfermedades en las vías respiratorias son los ortomixovirus y los paramixovirus, con el virus de la gripe humana como representante más importante.

La aparición de nuevas cepas de gripe de tipo pandémico se debe atribuir a nuevos subtipos que contienen una nueva hemaglutinina o bien el gen neuraminidasa. Estos nuevos virus se diferencian de los virus de la gripe circulantes hasta el momento desde el punto de vista inmunológico. Para que sean infecciosos, los virus A y B de la gripe necesitan 8 segmentos de RNA, por el contrario, los virus C de la gripe, solamente 7. Los virus de gripe A, B y C pueden constituir, in vivo, reactivamente homotípicos, pero no entre los tipos. Teóricamente, se podrían generar 256 reactivantes a base de los 8 segmentos de dos virus de gripe A. Esta segregación, no obstante, no tiene lugar porque en el plano de las proteínas, algunas proteínas requieren su asociado específico de origen. Esto quedó claramente demostrado en especial para el virus de la gripe aviar/del pollo/Alemania/34 (H7N1) FPV Rostock HA, el cual es codificado del segmento 4, que puede constituir un virus funcional solamente de modo específico con su proteína M2 específica de origen, la cual es codificada por el segmento 7. (Grambas S, Hay AJ. Maturation of Influenza A virus hemagglutinin-estimates of the pH encountered during transport and its regulation by the M2 protein. Virology 1992; 190; 11-18) (Grambas S, Bennet HS, Hay AJ. Influence of amantadine resistance mutations on the pH regulatory function of the M2 protein of influenza A viruses. Virology 1992; 191:541-549). Una de las estrategias principales contra la infección anual por virus de la gripe en la población humana está constituida por la vacunación contra la gripe. No obstante, sigue existiendo, a pesar de amplios programas de vacunación, una base para la morbilidad y mortalidad a escala mundial y continúa siendo una causa principal de enfermedad y muerte con debilidad inmunológica y en personas mayores. La actividad antivírica de la amantadina y la rimantadina reduce la duración de los síntomas de gripe clínica pero se han descrito importantes efectos secundarios y la aparición de mutantes resistentes (FIELDS y otros, Virology, 3ª edición (1995) Lippincott-Raven Publ., Filadelfia, Vol. 1, páginas 434-436). Actualmente, existe un nuevo grupo de agentes antivíricos en el mercado, que inhibe la neurominidasa de virus de gripe. El zanamivir y el oseltamivir son, por ejemplo, inhibidores de la neuraminidasa de los virus de la gripe A y B; estos medicamentos, no obstante, reducen básicamente la duración de los síntomas.

En la patente USA 5 686 436 se ha descrito un procedimiento para la reducción del aumento de los retrovirus y de los virus latentes en el hombre y en animales, tales como, por ejemplo, HIV, para lo que se administra un medicamento que comprende, entre otros, antioxidantes e inhibidores de inducción de NFkB. Por el contrario, para una lucha efectiva contra las infecciones por virus respiratorios, se debe luchar ya en la fase de infección aguda de modo efectivo; un tratamiento que se pueda utilizar solamente en el campo de los virus latentes no es apropiado para evitar o tratar infecciones agudas de tipo vírico en las vías respiratorias.

Existe, por lo tanto, la necesidad de un producto altamente efectivo contra las infecciones por virus en las vías respiratorias, en especial en humanos, que no provoque ningún efecto secundario o solamente efectos muy reducidos, que tenga un coste reducido y que pueda ser fabricado en grandes cantidades.

El objetivo de la presente invención se consigue mediante la utilización de compuestos de ditiocarbamato con la fórmula estructural R_{1}R_{2}NCS_{2}H, en la que R_{1} y R_{2}, con independencia entre sí, forman una cadena de C_{1}-C_{4}-alquilo recta o ramificada, o que constituyen con el átomo de nitrógeno un anillo alifático con 4 a 6 átomos de C, de manera que R_{1} y R_{2} o bien el anillo alifático esté sustituido, en caso preciso, con uno o varios sustituyentes escogidos entre OH, NO_{2}, NH_{2}, COOH, SH, F, Cl, Br, I, metilo o etil, y formas oxidadas de estos compuestos, en especial, sus dímeros, así como sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, para la fabricación de un producto para el tratamiento, o bien reducción de infecciones por virus RNA que se encuentran en las vías respiratorias y generan enfermedades en las mismas. Por el término "vías respiratorias" se considerarán, de acuerdo con la presente invención, órganos y zonas que proceden de las aberturas corporales (nariz, boca, ojos (incluso los canales lacrimales y oídos)) que conducen a los bronquios de los pulmones.

Las sales farmacéuticamente aceptables son, en este caso, especialmente, las de Na, K, Ca, Mg, NH_{4} y Zn. Se ha descubierto, de manera sorprendente, que los compuestos de ditiocarbamato, según la invención, pueden ser utilizados de manera eficaz contra infecciones por virus de RNA, que se encuentran en las vías respiratorias y generan enfermedades en las mismas, que en el ámbito de la presente solicitud se designarán como "Virus de RNA respiratorios". Contrariamente a las observaciones de Knobil y otros (Am. J. Physiol. (1998), Seiten 134-142), se pudo demostrar, dentro del ámbito de la presente invención, de manera apropiada, un efecto antivírico por los compuestos de ditiocarbamato, según la presente invención, con respecto a infecciones con virus de RNA respiratorios, por ejemplo, infecciones por HRV y por gripe. Ello es tanto o más sorprendente cuanto que otros antioxidantes no presentan este efecto antivírico contra virus de RNA respiratorios, y la variación del potencial Redox no es exclusivamente responsable para el efecto antivírico de los compuestos de ditiocarbamato, según la invención. Por ejemplo, se puede mostrar claramente, según la invención, que los antioxidantes Vitamina C, Vitamina E, 2-mercaptoetanol y N-acetil-L-Cisteína no tienen, en modo alguno, efecto contra los virus de RNA respiratorios. Además, la eficacia de los compuestos de ditiocarbamato, según la invención, contra infecciones por virus de RNA respiratorios y la reproducción de estos virus no se pueden atribuir solamente a la inhibición de la activación NFKB, sino que se muestra que, con los compuestos de ditiocarbamato, según la invención, entre los cuales se debe comprender, en el ámbito de la presente solicitud de patente, también las formas oxidadas, en especial los dímeros, se produce, de manera selectiva, la inhibición de la reproducción de los virus de RNA respiratorios.

El documento DE 1963223 A se refiere a un medio para el tratamiento de infecciones de virus en el cerebro, de manera que el medio de tratamiento debe comprender un material reductor de la biosíntesis de la Monoamina Noradrenalina, Dopamina y 5-hidroxitriptamina. El ejemplo que se facilita en dicho documento muestra el efecto de \alpha-metiltirosinmetiléster contra ratones infectados por Herpes símplex. El mecanismo, descrito en dicho documento, de reducción de la biosíntesis de Monoaminas especiales es utilizable, por lo tanto, de manera básica, para el tratamiento de infecciones de virus de DNA en el cerebro. El tratamiento, según la invención, de virus de RNA respiratorios funciona según otro principio y no es utilizable en infecciones por virus en el cerebro, tal como muestran los ejemplos negativos con respecto a FSME (Ejemplo 13) y EMC (Ejemplo 14). Por lo tanto, el documento DE 1963223 A se refiere a otra área de utilización y no se puede comparar con la utilización de la invención, no estando relacionada con esta última.

En la publicación de Calvert J.G., Interferon Research 1990 (10), páginas 13-23, se describe el efecto del dietilditiocarbamato sobre Mengovirus, de manera que se comprueba que inactiva los viriones de Mengovirus DDTC. Los Mengovirus son, no obstante, generadores de una grave Encefalomiocarditis y no se encuentran en las vías respiratorias ni producen enfermedad alguna en las mismas.

El documento WO 95/03792 A1 se refiere a la utilización de compuestos de Tiol para la fabricación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de enfermedades inducidas por virus, de manera que se destruyen los puentes de bisulfuro en las proteínas de virus sometidas a tratamiento por el compuesto de Tiol. En dicho documento, se citan numerosos virus, también designados virus de RNA, entre otros, los Picornaviridae. Además, se facilitan también numerosos ejemplos de compuestos de Tiol, entre otros, y de manera específica, el Ditiocarbamato. De estas múltiples posibilidades de combinación distintas, se muestran básicamente los ejemplos siguientes: como compuestos de Tiol N-acetilcisteína (NAC), cisteína, clorhidrato de cisteína y N,S-diacetilcisteín-etiléster (DACEE), como enfermedades víricas, se muestran básicamente, la Hepatitis B y los virus de Vaccinia.

Por lo tanto, no se han mostrado ejemplos para la mayor parte de compuestos y enfermedades por virus, pero también se ha demostrado que el tratamiento, que se da a conocer en dicho documento, no funciona en el ámbito que se describe: muchos Picornavirus (los que no se encuentran en las vías respiratorias sino en las células nerviosas) no son inhibidos por PDTC ni se reducen en su reproducción. Por lo tanto, no todas las combinaciones de enfermedades inducidas por virus y compuestos de Tiol conducen al objetivo buscado, y no se hace referencia alguna a la utilización de los compuestos de Ditiocarbamato escogidos, según la invención, los cuales no se citan en el documento WO 95/03792 A1, para el tratamiento de una infección producida por virus de RNA respiratorios o para la prevención de la misma.

El documento GB 861 043 A se refiere a compuestos que, entre otros objetivos, se utilizan como protección contra virus. Estos compuestos comprenden, por ejemplo, ditiocarbamato, no citándose en dicho documento virus específicos.

Knobil y otros, Am. J. Physiol. (1998), páginas 134-142, se refieren a un estudio de oxidantes y su influencia en la expresión de genes inducidos por virus. En este caso, se explica, no obstante, de manera explícita, que ni NAC ni PDTC inhiben infecciones por virus de gripe o replicación de los mismos.

En el documento DE 2555730 A, se describe un medio antimicrobiano que comprende un compuesto de dimetilditiocarbamato, de manera que dicho compuesto es un 8-oxichinolinato-metal-N.N-dimetilditiocarbamato complejo. No obstante, en dicho documento se hace referencia, básicamente, al efecto fungicida y antibacteriano.

El documento WO 99/66918 A1 hace referencia a la utilización de derivados de bisulfuro de ditiocarbamatos para la reducción de óxidos de nitrógeno en un paciente, por ejemplo, para la inhibición de NFKB. No obstante, se describe, en dicho documento, un importante número de enfermedades, entre las que no se describen las enfermedades víricas.

Flory E. y otros., J. Biol. Chem., 24.03.2000, 275(12), páginas 8307-8314, hacen referencia a un estudio de la influencia de diferentes proteínas de virus A de gripe sobre la inactivación de la expresión dependiente de NFKB.

Tai D.I. y otros., Hepatology, Marzo 2000, 31(3), páginas 785-787, se refieren a un estudio sobre la inhibición de la activación de NFKB mediante PDTC, en el que se acepta que una infección por HCV podría producir una anti-apoptosis por la activación de NFKB.

Schwarz y otros., 1998 (J. Virol; Vol. 72(7), páginas 5654-5660) han investigado la influencia del NFKB sobre la multiplicación del virus de encefalomiocarditis (EMCV), relacionada con el rinovirus humano. En células sin el NFKB (knockout p50-/- o p65-/-), que no han sido infectadas con EMCV, la multiplicación del virus es ciertamente reducida, pero se refuerza la muerte celular apoptósica. Ello es claramente contrario a los datos que se facilitan en el presente documento: estos ejemplos pueden mostrar claramente que los compuestos de ditiocarbamato, según la invención, no solamente dificultan la replicación de los rinovirus relacionados, sino que impiden también la muerte celular inducida por los virus. Por lo tanto, la inhibición de la NFKB no es el factor decisivo de la eficacia de los compuestos de ditiocarbamato, según la invención.

Tampoco depende el efecto antivírico, según la invención, de los compuestos de ditiocarbamato previstos en la misma, de una combinación de sustancias determinadas. Los compuestos de ditiocarbamato, según la invención, pueden ser utilizados exclusivamente por sí mismos, con independencia de otras sustancias añadidas, en especial antioxidantes, tal como se demuestra, de manera innegable, de acuerdo con el documento US 5.686.436, para el efecto antiretrovirus de inhibidores de activación de NFKB, porque, de manera sorprendente, el efecto antivírico no se refiere solamente a la lucha de los estrés oxidantes sino a la infección/replicación, que puede ser inhibida por los compuestos de ditiocarbamato, según la invención.

Se puede demostrar que los compuestos de ditiocarbamato, según la invención, inducen genes que actúan como factores de transcripción inducidos como antioxidantes (Meyer y otros,. EMBO J. 12, 2005-2015, 1993). El factor de transcripción heterodímero AP1 puede ser inducido por NAC y los compuestos de ditiocarbamato, según la invención, lo cual conduce a la unión de DNA y a la transactivación. La activación de AP1 por medio de los compuestos de ditiocarbamato, según la invención, depende de la síntesis de proteínas y contiene la transcripción de los genes c-jun y c-fos. La activación de AP1, no obstante, no es solamente responsable de la fuerte inhibición de virus, según la invención.

El pirrolidín-ditiocarbamato (PDTC) es conocido ya como pro- y antioxidante, inhibidor de la activación del factor de transcripción NFKB, ionoforo de zinc y agente quelatante de metales. En la publicación de Sherman y otros, Biochem. Biophys. Res. Comm., 191 (3):1301-1308, 1993, se describe el PDTC como inhibidor de la activación de NFKB, así como, de la NO-Sintasa. El documento WO 01/00193 A2 se refiere a compuestos que comprenden dietilditiocarbamato en cantidades picomolares y nanomolares que presentan un fuerte efecto contra apoptosis.

De acuerdo con la invención, se ha demostrado que los compuestos de ditiocarbamato, según la misma, muestran un fuerte efecto contra el virus de RNA, que se encuentran en las vías respiratorias, y que generan enfermedades en las mismas, los llamados "virus de RNA respiratorios", tanto in vitro como también in vivo.

De acuerdo con la invención, la infección es contrarrestada ya en una fase muy anticipada, antes de que se produzcan daños importantes en las células o muerte celular.

Dentro del ámbito de la presente invención, se comprenden como virus de RNA respiratorios, aquellos virus de humanos y mamíferos que se encuentran en las vías respiratorias, es decir, tracto respiratorio y pulmones, y que penetran en el cuerpo, de manera que generan enfermedades en las vías respiratorias. Aparentemente, los procesos biológicos que se generan en estas infecciones son tan parecidos que el efecto de los compuestos de ditiocarbamato, según la invención, actúan con análoga eficiencia a pesar de la heterogeneidad biológica de estos grupos de virus. De modo inverso, se ha demostrado, no obstante, que en otros virus que entran en el cuerpo por otros caminos infectivos y que muestran otros ciclos biológicos (por ejemplo, pueden ser integrados en el genoma como virus latentes), o bien que producen enfermedades en otros órganos, por ejemplo, en el cerebro, el efecto de los compuestos de ditiocarbamato, según la invención, por sí mismos, no es suficiente para la lucha satisfactoria contra una infección
vírica.

En relación con este punto, se ha demostrado que, en el tratamiento de pacientes de SIDA con dithiocarbamatos, no se ha conseguido mejora o curación de los pacientes (Multi-center, randomized, placebo-controlled study of dithiocarb (Imu-tiol) in human immunodeficiency virus-infected asymptomatic and minimally symptomatic patients. The HIV87 Study Group. AIDS Res. Hum. Retroviruses Enero 1993; 9(1): 83-9). En base a estos resultados, no se realizaron otros estudios clínicos en virus latentes (ver US 5 686 436).

Los compuestos de ditiocarbamato, según la presente invención, desarrollan su especial eficacia, de acuerdo con la presente invención, ante todo, en una fase previa de la infección vírica, o bien cuando se toman antes de la infección. De esta forma, los compuestos de ditiocarbamato según la invención pueden evitar la aparición de una infección por virus cuando han sido tomados de forma profiláctica, por ejemplo, en zonas y momentos determinados en los que existe riesgo o incluso un riesgo más elevado de infecciones por virus respiratorios, especialmente en zonas con epidemias o bien durante horas de frío. De manera preferente, se utilizaron, en este caso, los compuestos de ditiocarbamato según la invención para evitar la infección por virus.

Es especialmente preferente la inhibición de virus de acuerdo con la invención, pero sobretodo en la fase previa de una infección por virus de RNA respiratorios que ya ha empezado. En este caso, los compuestos de ditiocarbamato según la invención serán dirigidos a la inhibición de la replicación de los virus, es decir, en un momento anterior en que hayan aparecido sensibles alteraciones en un individuo infectado. De este modo, no solamente se pueden impedir las consecuencias de una infección por virus en un individuo afectado, sino que también se puede minimizar la extensión de otros virus infecciosos a otros individuos; el peligro de contagio adicional se minimizará, lo que es de gran significación y eficacia desde el punto de vista político y sanitario general en un virus de gripe humano.

En particular, se consideran como virus de RNA respiratorios dentro del marco de la presente invención: rinovirus, coxsaquivirus, ecovirus, coranavirus, enterovirus, ortomixovirus humano, (por ejemplo, virus de gripe (A, B y C)), paramixovirus (por ejemplo, virus de parainfluenza y neumovirus), virus sincitial respiratorio (RSV) y otros virus RNA, siempre que produzcan enfermedades (como mínimo) en las vías respiratorias. Los virus o cepas de virus, que no produzcan enfermedades en las vías respiratorias sino en otros órganos, por ejemplo, en el cerebro, por ejemplo, virus de meningitis, virus de encefalomiocarditis, poliovirus, cardiovirus, etc., no están comprendidos dentro de la presente solicitud de patente. Los virus de RNA respiratorios, según la invención, son iguales en la infección de células epiteliales de las vías respiratorias superiores o inferiores. Además, pueden estar afectados adicionalmente otros órganos. La inflamación local provocada en las vías respiratorias se considera como la causa principal de la producción de los síntomas típicos de infecciones gripales, tales como constipados, dolores de garganta, ronquera, tos, murmullo vesicular o bien fiebre frecuente. También la aparición frecuente de infecciones secundarias en individuos con debilidad inmunitaria es favorecida por la infección con estos virus respiratorios.

Dentro del ámbito de la presente invención, se comprenderán bajo el término picornavirus todos los picornavirus "puros", de acuerdo con la clasificación válida en el momento de los picornaviridae, en base al trabajo de King y otros, ("Picornaviridae" en "Virus Taxonomy, Seventh Report of the International Commitee for the Taxonomy of Viruses" (2000), Eds. Van Regenmortel y otros, Academic Press 657-673), siempre que se encuentren en las vías respiratorias y produzcan enfermedad en las mismas, es decir, de los géneros enterovirus, rinovirus, aftovirus, parecovirus, erbovirus, kobuvirus y tescovirus. Estos virus de la familia de picornaviridae se caracterizan por una estructura genética común, composición proteínica, características de cultivo o propiedades de resistencia contra la temperatura o contra productos virucidas.

Se ha demostrado que la presente invención actúa de manera especialmente apropiada para la lucha contra los representantes patógenos en humanos y animales de los picornaviridae respiratorios puros, en especial los del género enterovirus (enterovirus 70, 71, coxsaquivirus) y rinovirus (por ejemplo, rinovirus humano) y aftovirus (por ejemplo, virus bucal y virus de la fiebre aftosa), mientras que, por el contrario, para otros virus incluyendo los picornavirus que generan infecciones latentes tales como, por ejemplo, HAV, no se pudieron conseguir las ventajas de la presente invención. Esto se debe atribuir probablemente a que el grupo de los picornavirus respiratorios "puros" es, por su parte, tan homogéneo y que los procesos patofisiológicos que aparecen dentro del ámbito de las infecciones son tan parecidos que manifiestan un análogo efecto a los compuestos de ditiocarbamato según la invención.

Bajo el término "infección por virus" se comprenderá, en el ámbito de la siguiente solicitud de patente, los ataques de virus respiratorios sobre las células, que comprenden, por ejemplo, una de las fases siguientes: se empieza con la colocación de las partículas de virus en una célula y, en un estadio posterior, la introducción de la información genética del virus en la célula, así como la producción de nuevas partículas de virus y la expresión de partículas de virus infecciosas.

Es además posible utilizar formas oxidadas de estos compuestos, puesto que estas formas, tal como es conocido, son metabolizadas rápidamente en forma reducida. Dentro del ámbito de la presente solicitud de patente, dichos compuestos se deben comprender como "formas oxidadas", cuyo residuo (S) ("S-Rest") está oxidado. Un ejemplo preferente de una forma dímera oxidada de este tipo está constituida por el disulfiram, que también es conocida bajo los nombres "Antabus" o "Abstinyl" y que es un bisulfuro de tetraetiltiuram (C_{10}H_{20}N_{2}S_{4}). El disulfirán por sí mismo es ya conocido, siendo utilizado en especial para el tratamiento de alcohólicos: el disulfiram actúa como mediador en las óxidoreducciones e inactiva la aldehído-dehidrogenasa. Por la toma de etanol, se produce el aumento de acetaldehído en el cuerpo, lo cual tiene un efecto notablemente negativo en el estado general: en caso de toma simultánea de disulfirám y alcohol, se producen situaciones de ansiedad, malestar, pérdidas de visión, dolores en el pecho, dolores en la cabeza, etc., de manera que estos síntomas duran 3-4 días o incluso una semana. Sobre esta base, se administra el disulfiram a los alcohólicos como terapia ya quedeberá evitar el consumo posterior de alcohol por los fuertes efectos negativos citados.

Otros efectos conocidos del disulfiram son la inhibición de encimas tal como, por ejemplo, fructuosa, 1,6 difosfato-dehidrogenasa, xantin-oxidasa, hexokinasa, aldehído-oxidasa y dopamina-\beta-hidroxilasa.

Además, el disulfiram es utilizado para el tratamiento de pediculosis y "scabies", así como para el tratamiento de dermatitis producida por níquel.

El metabolismo del disulfiram ha sido ya analizado, por ejemplo, en el trabajo de Dollery, C. 1999, Therapeutic Drugs, Second Edition, Vol.1, Churchill Livingstone, Edinburgo. Se ha descrito que el dietilditiocarbamato manifiesta el metabolito principal del disulfiram en el cuerpo, de manera que esta transformación tiene lugar de manera muy rápida.

La forma oxidada de los compuestos de ditiocarbamato según la invención se disuelve bien en las grasas y puede ser prevista, por ejemplo, como producto de administración oral de manera que los compuestos son reabsorbidos en el estómago. Los compuestos se podrían prever también, en especial, en forma de dispositivo de pulverización. Además, se pueden prever las formas oxidadas de los compuestos según la invención con grupos de hidróxilo para aumentar la capacidad de disolución en agua para su preparación en forma de un aerosol. En caso de que los compuestos de diotiocarbamato según la invención adopten forma de productos oxidados, en especial, dímeros, se consigue un efecto de depósito de estos productos, es decir, los compuestos de ditiocarbamato según la invención serán administrados a lo largo de un tiempo determinado de forma continuada al cuerpo y serán reabsorbidos por éste. Para este funcionamiento como depósito, los compuestos de ditiocarbamato oxidados pueden ser también implantados de manera conocida en el cuerpo a tratar.

Un compuesto preferente de acuerdo con la invención se caracteriza por lo tanto porque R_{1} y R_{2}, con independencia entre sí, constituyen un C_{1}-C_{3}-Alquilo o que con el átomo de nitrógeno constituyen una anillo alifático con 4 a 6 átomos de carbono. Éstos se han demostrado especialmente ventajosos para el tratamiento de infecciones víricas de RNA respiratorias o para impedir las mismas.

Preferentemente, el compuesto de ditiocarbamato se escoge entre pirrolidin-ditiocarbamato (PDTC) y en N, N-Dietil-ditiocarbamato (DDTC). Estos compuestos presentan una actividad extraordinariamente enérgica contra las infecciones por virus de RNA respiratorias.

De modo predominante, la infección por virus es una infección con picornavirus, ortomixo- o paramixovirus. Los compuestos de ditiocarbamato según la invención son especialmente activos contra estas infecciones de virus.

Es ventajoso para ello, cuando el ortomixovirus es un virus de gripe humana, en especial escogido entre el grupo de gripe A, gripe B, gripe C o bien el paramixovirus es un virus de paragripe o bien neumovirus. Preferentemente, el ortomixovirus es un virus A de gripe de mamíferos y el picornavirus es un rinovirus, en especial rinovirus de caballo o humano, un enterovius, en especial el enterovius 70, 71 o bien un coxaquivirus, o bien un aftovirus, en especial el virus de afección bucal y de fiebre aftosa o virus de rinitis equina A. En este caso, tal como se ha explicado anteriormente, se consideran virus o cepas de virus que no provocan enfermedades en las vías respiratorias, sino en el cerebro o en las células nerviosas, por ejemplo, cardiovirus o poliovirus, que pertenecen al tipo de los picornavirus. Estas infecciones víricas se tratan o se evitan, de manera especialmente eficiente, con el compuesto según la invención.

La familia de los Picornaviridae comprende una serie de pequeños virus RNA, entre otros los Rinovirus (por ejemplo, el Rinovirus humano), Enterovirus (por ejemplo, Enterovirus 70, 71, Coxsackievirus, que es, por ejemplo, un causante de la enfermedad de manos, pies y boca), Aftovirus (por ejemplo, el virus de la fiebre aftosa, en la que se provoca una enfermedad de la boca, así como el virus de Rinitis equina A). Con respecto, por ejemplo, a la cepa de la fiebre aftosa es especialmente interesante, con ayuda del compuesto según la invención, el cubrir el periodo de tiempo entre la inoculación y la entrada en eficacia del producto inoculado con la vacuna (aproximadamente 10-12 días), puesto que durante este tiempo los animales que han sido vacunados no están protegidos y en ciertas circunstancias después de una infección se expulsan grandes cantidades de virus sin llegar a la enfermedad propia. Por lo tanto, el compuesto según la invención podría ser suministrado simultáneamente con la vacuna y, eventualmente, después de unas 2 semanas.

Los Ortomixovirus y los Paramixovirus son una subdivisión de la designación general anterior de virus de gripe y otros virus similares. En el hombre los Paramixovirus producen sarampión, paperas, enfermedades respiratorias y neurológicas. Pertenecen a los Paramixovirus, entre otros, los virus de Parainfluenza, virus de paperas, virus de la enfermedad de Newcastle, el virus Sincitial respiratorio (RSV), el virus del sarampión y el virus de la peste bovina. Pertenecen a los Ortomixovirus, entre otros, los virus de la gripe A, B y C que provocan la gripe en humanos.

Los virus de la gripe de tipo A son responsables de la mayoría de epidemias de gripe, así como de todas las pandemias. Los virus de la gripe A se presentan también en caballos y cerdos, y por lo demás también en aves, por ejemplo, provocando la clásica peste aviar pero, no obstante, se pueden considerar solamente los virus de la gripe humana y los virus de gripe de mamíferos, por ejemplo caballos, como virus respiratorios propiamente dichos, puesto que la biología del virus de la gripe aviar (Avian Influenza Virus (AI)) se diferencia por completo del virus de la gripe humana. Por lo tanto, el virus AI no puede ser considerado como virus respiratorio. En los patos se replica el virus AI básicamente en el tracto intestinal, lo cual no es el caso en el hombre. Como consecuencia, se pueden aislar también virus AI de las heces de pájaros. (Hinshaw y otros, 1980, Canad. J. Microbiol 26, 622-9). Además, la tasa de variación de nucleótidos de los virus AI es más reducida que en virus que se pueden aislar de mamíferos. La evolución de las proteínas víricas en otros organismos distintos a los pájaros muestra de manera típica una rápida acumulación de mutaciones que no se producen en virus AI. (Gorman y otros, 1991, J. Virol. 65: 3704-14; Ludwig y otros, 1995, Virology 212: 555-61). La especificidad de los receptores varía entre diferentes virus de la gripe. La mayoría de virus AI se unen preferentemente al receptor de alfa2-3-galactosa-ácido siálico. Al contrario de ello, los virus de la gripe humana se unen primariamente al receptor alfa2-6-galactosa-ácido siálico (Rogers + Paulson, 1983, Virology 127, 361-73; Baum + Paulson, 1990, Acta Histochem. Suppl. 40: 35-8).

Dado que los virus, según la invención, conducen en el hombre y en los mamíferos a un amplio número de enfermedades muy extendidas, el efecto antivírico de los compuestos de ditiocarbamato según la invención es importante especialmente con respecto a estos virus. Dado que los compuestos de ditiocarbamato según la invención son extraordinariamente efectivos contra estos virus, los compuestos de ditiocarbamato según la invención son especialmente apropiados para la fabricación de una serie de medicamentos para el tratamiento o bien la prevención de estas infecciones por virus. Los compuestos de ditiocarbamato según la invención son fáciles y económicos de fabricar en grandes cantidades y actúan en elevadas concentraciones prácticamente sin toxicidad sobre las células a tratar.

Según una forma de realización preferente, los compuestos de ditiocarbamato según la invención se prevén en el medio de administración en una concentración de 0,01 a 5000 mM, preferentemente de 1 a 300 mM, de manera especialmente preferente de 10 a 100 mM. En estas concentraciones, los compuestos de ditiocarbamato según la invención son especialmente eficaces contra las infecciones por virus de RNA de tipo respiratorio y no presentan prácticamente efectos secundarios. La concentración a utilizar se escogerá según la infección de virus a tratar, según la intensidad de la infección de los virus o bien según el organismo a tratar según sean animales o humanos o bien con dependencia de la edad.

Es especialmente favorable que los compuestos de ditiocarbamato según la invención se prevean en el medio de administración en una concentración de 10 mM hasta un 1 M. En este caso, los compuestos de ditiocarbamato según la invención se encuentran en forma muy concentrada y el medicamento a administrar se puede diluir antes del tratamiento para conseguir la concentración deseada.

Preferentemente, el medicamento a administrar comprende, además, un soporte farmacéuticamente aceptable. En este sentido, se pueden escoger por el experto en la rama de farmacia soportes conocidos farmacéuticamente aceptables que comprendan, por ejemplo, soluciones salinas con tampón de fosfato (PBS) u otras soluciones de sal común con otros tampones, por ejemplo, formulaciones que contienen liposomas, de manera que nuevamente el portador podrá ser escogido según forma de tratamiento, infección de virus o bien el organismo a tratar.

Preferentemente, el medicamento a administrar es un medicamento por vía oral, intranasal, intravenosa, parenteral, rectal o bien como gotas para los ojos o los oídos, soluciones bucales o aerosoles. En este caso, el tipo de administración depende, en especial, de la infección de virus a tratar. Por ejemplo, una infección en las vías respiratorias será tratada mediante un medicamento de administración intranasal, por ejemplo, en forma de un aerosol que comprende los compuestos de ditiocarbamato, puesto que la infección por virus será tratada exactamente en el lugar del ataque vírico. Según el tipo de administración, los compuestos de ditiocarbamato se encuentran en una concentración determinada o bien el producto medicamentoso comprende adicionalmente para esta forma de administración sustancias apropiadas. Como se puede comprender, es asimismo posible el disponer el medio medicamentoso en forma seca, de manera que para el tratamiento será diluido con un diluyente apropiado.

Una utilización especialmente ventajosa se consigue cuando el producto medicamentoso comprende otras sustancias antivíricas. De esta manera, la infección en las vías respiratorias puede ser combatida desde múltiples rutas o bien simultáneamente se podrá debilitar o eliminar por completo una gama de diferentes virus. Estas sustancias antivíricas adicionales son sustancias que reducen la replicación, sustancias inmunoestimuladoras, anticuerpos neutralizantes, etc. y en caso deseado asimismo sustancias que puedan reforzar de manera general el sistema inmune.

Preferentemente, el medio medicamentoso comprende una combinación de, como mínimo, dos ditiocarbamato según la invención, en especial una mezcla de PDTC y DDTC. Los compuestos de ditiocarbamato según la invención producen funciones pro y anti oxidantes en las células. Su efecto antioxidante comprende la eliminación del peróxido de hidrógeno, eliminación de radicales superóxidos, peroxinitritos, radicales hidroxilo y productos de peroxitación de lípidos. Por estas eliminaciones, los ditiocarbamatos se oxidan a tiuram-bisulfuros. Los tiuram-bisulfuros son responsables de los efectos pro-oxidantes de ditiocarbamatos, de manera que en muchos casos la generación de los tiuram depende de la existencia de metales. Se ha descrito que las actividades antiapoptóticas de los ditiocarbamatos tienen lugar posiblemente en relación con la inactivación de caspasas por la oxidación de tiol.

De manera especialmente preferente, el medio medicamentoso según la invención comprende, además, sustancias escogidas entre antibióticos, vacunas, inmunosupresores, estabilizadores, sustancias inmunoestimulantes, productos de la sangre o mezclas de los mismos. En caso de que se utilicen adicionalmente antibióticos, se pueden combatir, además de virus respiratorios, otras infecciones bacterianas. Si el medio medicamentoso comprende vacunas adicionales, en cuyo término se deben comprender tanto vacunas pasivas como activas, se pueden impedir también, simultáneamente con el tratamiento según la invención o bien con la prevención de infección por virus, otras infecciones adicionales por virus que pueden infectar fácilmente el organismo debilitado. Adicionalmente, se pueden añadir para el aumento de la estabilidad de almacenamiento o bien para la duración de vida otros estabilizadores. Los productos de la sangre son, por ejemplo, plasma, glóbulos de la sangre, factores de coagulación, etc., con dependencia del tipo de tratamiento al que se va a someter al paciente.

De manera favorable, el medio medicamentoso se utiliza para la inhibición de la multiplicación de los virus. De esta manera, se asegura que una infección que ya se ha iniciado no se extienda sino que, por el contrario, sea tratada de manera muy rápida.

Según otro aspecto adicional de la presente invención, ésta se refiere también a un medicamento para de desinfección que comprende como mínimo un compuesto de ditiocarbamato según la invención, tal como se ha descrito anteriormente. Con el término "medicamento para desinfección" se comprenderá, dentro del ámbito de la presente invención, cualquier medicamento que se utilice en el exterior del organismo humano o de animales para combatir virus, por ejemplo, sobre superficies externas, en medicamentos en especial medios o para cultivos celulares. Estos medicamentos de desinfección pueden ser utilizados en especial cuando la sustancia a tratar es sensible con respecto a otros materiales antivíricos agresivos. Por ejemplo, los medios de desinfección que comprenden los compuestos de ditiocarbamato según la invención son apropiados como aditivo para medios o bien para el tratamiento de células o cultivos celulares que reaccionan a otros medios de desinfección o sustancias antivíricas más agresivas. Los compuestos de ditiocarbamato según la invención se han mostrado especialmente efectivos en el tratamiento o en la prevención de infecciones respiratorias por virus de RNA de células respiratorias y cultivos
celulares.

Es especialmente eficaz el medio de desinfección cuando comprende los compuestos de ditiocarbamato, según la invención, con una concentración de 10 \muM a 5 M, en especial desde 30 \muM hasta 1 M. Estas concentraciones son eficaces, por un lado, contra infecciones por virus de RNA respiratorios y, por otro lado, un medio de desinfección de este tipo es extraordinariamente favorable, por ejemplo, cuando se utiliza como sustancia antivírica para cultivos celulares. La concentración depende en estos casos del tipo de infección de virus o del estadio de desarrollo de los mismos o bien de la sustancia de tratamiento utilizada, por ejemplo, del tipo y sensibilidad de las células. Como se puede comprender, es también posible el prever el medio de desinfección como concentrado, de manera que antes de la utilización será llevado mediante un medio de dilución a la concentración deseada de los compuestos de ditiocarbamato según la invención.

Preferentemente, el medio de desinfección comprende además otros materiales desinfectantes, especialmente antivíricos. Estas sustancias conocidas por los expertos de la rama de microbiología son añadidas, en especial, cuando se deben combatir simultáneamente otros virus, por ejemplo, virus de DNA. Como se puede comprender, se pueden añadir, además, otras sustancias antibacterianas, en particular antibióticos.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la desinfección de superficies, medios, por ejemplo cultivos celulares, de manera que un medio de desinfección según la invención, tal como se ha descrito anteriormente, es aplicado a la superficie o bien a un cultivo celular o bien en el medio de tratamiento. Para la desinfección de una superficie es suficiente limpiar, por ejemplo, dicha superficie con el medio de desinfección. En caso de medios de tratamiento y cultivos celulares, el medicamento de desinfección puede actuar a lo largo de un tiempo más prolongado, de manera que la concentración del medicamento de desinfección se variará, tal como se ha descrito anteriormente, según el objetivo perseguido.

Según otro aspecto adicional de la presente invención, ésta se refiere al tratamiento o prevención de infecciones respiratorias por virus de RNA con los compuestos de ditiocarbamato según la invención. En este caso, se administrará un medicamento que comprenda los compuestos de ditiocarbamato según la invención, tal como se han descrito anteriormente, en forma y concentraciones apropiadas para su aplicación a humanos o animales.

La presente invención se explicará, a continuación, en base a los ejemplos y figuras adjuntos que, no obstante, no son limitativos.

La figura 1 es una representación gráfica que muestra el efecto inhibidor de PDTC sobre la replicación de HRV en cultivos celulares;

la figura 2 muestra la inhibición de efectos citopáticos inducidos por rinovirus por PDTC;

la figura 3 muestra el aumento de la probabilidad de vida de las células por la acción de PDTC y DDTC;

la figura 4 muestra el efecto de un tratamiento de PDTC con dependencia del tiempo;

la figura 5 muestra el desdoblamiento de eIF4GI;

la figura 6 muestra un análisis Western Blot para la determinación de la expresión de kapsidoproteínas de rinovirus;

la figura 7 muestra el efecto de otros antioxidantes sobre una infección por HRV;

las figuras 8 y 9 muestran el efecto de PDTC sobre la replicación de virus de gripe;

la figura 10 muestra la dependencia de la concentración del efecto de PDTC sobre verocélulas ("verozellen") infectadas con virus de gripe;

las figuras 11A y 11B muestran el efecto de PDTC sobre ratones infectados con virus de gripe;

la figura 12 muestra la eficacia de PDTC contra ERAV;

las figuras 13A y 13B muestran la eficacia de PDTC contra MKS; y

la figura 14 muestra la falta de efecto de PDTC contra EMCV.

Ejemplos Ejemplo 1 Reducción de la producción de partículas infecciosas de rinovirus por la acción de PDTC

Para comprobar la eficacia durante las infecciones por HRV, se añadió PDTC después de infección de células con diferentes serotipos de HRV.

Se infectaron células HeLa con serotipos de HRV (1A), (2), (14) y (16) con 20 TCID_{50} (dosis infecciosa de cultivo de tejidos 50) por célula. Simultáneamente, se añadió PDTC con una concentración de 125 \muM al medio. Los virus sobrantes fueron retirados 4 h después de la infección, mientras se añadió nuevamente PDTC al medio reciente. A las 24 h (figura 1, parte superior) y 48 h (figura 1, parte inferior) después de la infección (p.I.) Se reunieron los sobrantes y se determinaron las cantidades de supervivencia de virus mediante pruebas TCID_{50}. El tratamiento de células con PDTC disminuye la concentración de virus (vt) en 10^{3} después de 24 h (figura 1, parte superior). Los restos de células tratadas con PDTC, que fueron reunidas 48 h después de la infección, muestran, de manera correspondiente, una reducción significativa de la concentración de virus (figura 1, parte inferior). Estas pruebas muestran que el PDTC actúa de forma antivírica fuerte contra diferentes serotipos de HRV.

Ejemplo 2 El PDTC inhibe los efectos citopáticos inducidos por HRV y aumenta la viabilidad de células infectadas

En los estadios posteriores de una infección rinovírica se presentan variaciones morfológicas de las células que se conocen como "efectos citopáticos" (CPE). Estos CPE inducidos por HRV se caracterizan por redondeamiento de las células, contracción, deformación del núcleo y condensación de cromatina. En una infección de células HeLa con HRV2, HRV14, HRV1A y HRV16 con 100 TCID_{50} por célula, se puede apreciar claramente un efecto citopático después de 8 h p.I. La añadidura de PDTC durante la infección inhibe la aparición de estos efectos citopáticos. En la figura 2 se muestra que la morfología de las células, 8 h después de la infección en presencia de 125 \muM PDTC (ver figura inferior derecha), no se diferencia de la morfología de las células no infectadas (n.i.) (ver las dos figuras superiores).

El tratamiento con PDTC conduce, por lo tanto, a combatir la infección de virus en un estadio muy anticipado, de manera que se impiden otros daños de las células.

Ejemplo 3 Aumento de la viabilidad de células infectadas con PDTC y DDTC

Se llevó a cabo un ensayo de proliferación de células para probar el efecto de PDTC o DDTC sobre la viabilidad de las células durante una infección vírica.

Además, se llevó a cabo un ensayo de proliferación de células no radiactivo de concentración celular 96® Aqeous (Promega; Madison, Wisconsin, U.S.A.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un día antes de la infección se colocaron células en placas de 96 pocillos. Estas células fueron infectadas con diferentes serotipos de HRV con 20 TCID_{50}/célula. La viabilidad de las células se determinó después de la añadidura de una sustancia de tetrazolio, 2 h de incubación a 37ºC y medición de la absorción en 492 nm.

24 h después de la infección con HRV2, las células HeLa mostraron, en comparación con células HeLa no infectadas (falso medio de infección = MIM), una pérdida completa de su actividad metabólica. En la figura 3 se puede apreciar (parte superior: DDTC, parte inferior PDTC) que la viabilidad de las células aumenta significativamente incluso para la añadidura de pequeñas concentraciones de PDTC o DDTC. El PDTC o DDTC solos tienen solamente un efecto reducido sobre las células no infectadas. Las concentraciones que se utilizan para la inhibición de infecciones víricas no mostraron, no obstante, toxicidad alguna ("-" significa ausencia).

Ejemplo 4 Eficacia de PDTC con dependencia del tiempo

Para comprobar en qué estadio del ciclo de vida vírico actúa el PDTC se añadieron, en diferentes momentos de tiempo, PDTC después de infección por virus con 20 TCID_{50} por célula y se llevaron a cabo ensayos de proliferación. Se pudo demostrar que la añadidura de PDTC (125 \muM) dentro de las primeras 6 h después de infección ("-" significa ausencia) facilita la mejor protección ante pérdida de proliferación inducida por virus (figura 4A). Tampoco este efecto es específico para un único serotipo, puesto que se utilizan los serotipos de HRV (1A), (2), (14) y (16). Solamente el tratamiento con PDTC (125 \muM) de células, en un momento de tiempo posterior a las 8 h después de la infección, disminuyó el efecto de protección.

Se consiguieron resultados similares cuando la concentración vírica (vt) se determinó en los residuos de células infectadas y tratadas con PDTC (figura 4B). La añadidura de PDTC hasta 4 h después de la infección redujo la concentración de HRV2 producido en 10^{3}. Incluso cuando el tratamiento con PDTC tuvo lugar 6 h después de la infección, se disminuyeron de manera significativa las concentraciones víricas producidas. Estos resultados muestran que la añadidura de PDTC tiene efecto antivírico cuando tiene lugar incluso en estadios más avanzados de la infección de manera que, por un lado, se aumenta la viabilidad de las células y, por otro, se disminuye fuertemente la cantidad de virus infecciosos.

De este modo, se demostró que el efecto antivírico se presenta no solamente en los estadios iniciales del ciclo de vida vírico, por ejemplo durante la unión con el receptor o bien la entrada en las células.

Ejemplo 5 Investigación del proceso de infección por HRV en presencia de PDTC

Para comprobar el proceso de una infección rinovírica en presencia y ausencia de PDTC, se analizaron diferentes actividades proteolíticas. Una actividad proteolítica característica que se presenta en el transcurso de infecciones con rinovirus y enterovirus es el desdoblamiento de factores de traslación-iniciación celular 4GI (eIF4GI) y 4GII con la 2A proteinasa vírica, de manera que se termina la síntesis de proteínas de las células huésped. Según el estereotipo de HRV, las proteínas eIF4G se desdoblan ya en un estadio previo de una infección. Una actividad de desdoblamiento adicional descrita solo brevemente, durante una infección rinovírica, es el desdoblamiento de la proteína filamentosa intermedia citoqueratina (8). También este desdoblamiento depende de la 2A proteasa, pero se produce solamente en un estadio posterior durante la infección. Para comprobar la influencia de un tratamiento con PDTC sobre el proceso de una infección vírica, se llevó a cabo un análisis Western Blot para analizar este sustrato de 2A proteasa.

Para el análisis Western Blot se retiró medio en los momentos de tiempo indicados. Las células fueron sometidas a lisis por añadidura de 100 \mul de tampón de proteínas (8% de dodecilsulfato sódico, 20% de \beta-mercaptoetanol, 20% de glicerol, 0,04% de azul de bromofenol). Se separaron 20 \mul de extracto de proteínas por cada banda mediante SDS-PAGE y se aplicaron por tinción sobre membranas de PVDF. La incubación con anticuerpos se llevó a cabo con 0,1% Tween (20) y 5% de leche en polvo desnatada en TBS. Para la inmunodetección se utilizaron anticuerpos de conejo policlonales contra eIF4GI. Como anticuerpos secundarios se utilizaron inmunoglobulinas de anticonejo conjugadas con fosfatasa alcalina. La coloración se llevó a cabo por la reacción de fosfatasa alcalina, determinándose las magnitudes moleculares con ayuda de un marcador previamente coloreado SDS-7B (Sigma).

En células HeLa infectadas con HRV2 (100 TCID_{50} por célula) se puede detectar la división de eIF4GI 4 h después de la infección (cp significa producto de división ("cleavage product"), llegando a la subdivisión completa 8 h después de la infección (figura 5). En este momento de tiempo no se puede observar en las células infectadas en presencia de PDTC ninguna división de eIF4GI. En momentos de tiempo posteriores, aproximadamente 24 h después de la infección, se puede detectar incluso en células tratadas con PDTC una ligera subdivisión de eIF4GI.

Esto muestra que la función de proteasa está bloqueada o que la cantidad de proteínas víricas es fuertemente reducida.

Ejemplo 6 Detección de proteínas de la envolvente vírica

Para comprobar la influencia de PDTC sobre la expresión de proteínas víricas, se detectaron proteínas de kápsidas de HRV2 en extractos de proteínas de células GeLa infectadas con HRV2 (100 TCID_{50} por célula) mediante análisis Western Blot (figura 6). El análisis Western Blot fue llevado a cabo tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 5, de manera que se utilizó un antisuero de conejo policlonado contra HRV2. Se detectaron cantidades significativas de proteínas rinovíricas VP1, VP2 y VP3 en células sin tratamiento 6 h después de la infección. El tratamiento con PDTC impidió la expresión de estas proteínas de kápsidas dentro de las primeras 8 h después de la infección. La débil expresión de VP1, VP2 y VP3 fue detectada solamente en un punto de tiempo posterior de unas 24 h después de la infección.

De esta manera, se demuestra que el PDTC conduce a una producción retrasada de proteínas víricas, lo que aclara el efecto antivírico de PDTC y también su efecto de protección sobre las células.

Ejemplo 7 Determinación de la dependencia del efecto antivírico con respecto al potencial Redox

Se comprobaron otros antioxidantes en cuanto a su efecto inhibidor durante una infección por HRV2 en células HeLa (figura 7). Se infectaron células HeLa en una placa de 6 pocillos con HRV2 (100 TCID_{50} por célula) ("n.i." significa no infectada). 1 h después de la infección se retiró el medio y se facilitó un medio reciente o bien medio dotado de PDTC o NAC en diferentes concentraciones.

Después de 24 horas la pradera de células fue lavada con PBS y teñida con violeta cristalino. En la figura 7A se puede apreciar que la infección que con HRV2 destruye la pradera de células, el PDTC puede evitar este efecto pero no el NAC. El efecto de la vitamina C, Trolox y \beta-Mercaptoetanol (2-ME) se determinó igual a como se ha descrito en el ejemplo 3 (Fig. 7 B, C, D). Se demostró de manera sorprendente que ninguna de estas sustancias antioxidantes tenía efecto protector durante la multiplicación vírica. Como controles se comprobaron los efectos tóxicos de las sustancias en la ausencia de virus. Una elevada dosis de vitamina C (100 \mug/ml) inhibía fuertemente el crecimiento celular.

De esta manera se demostró que el efecto antivírico del PDTC no se debe atribuir a su efecto antioxidante, sino que aparentemente depende de otras características.

Ejemplo 8 Efecto del PDTC sobre la replicación de virus de gripe

Se infectaron 5x10^{5} de las células con virus de gripe A/PR8/34 o Vienna/47/96 con un m.o.i.(multiplicidad de infección) de 0,01 y se incubaron una hora a temperatura ambiente. A continuación el inoculo se separó y se añadió un medio de infección con 5 \mug/ml Trypsina y 600 \muM PDTC. El residuo fue retirado después de 48 horas y de 72 horas y se midió la concentración de virus en el residuo mediante un ensayo de plaquitas estándar. Tal como se muestra en la figura 8, la concentración de virus de A/PR8/34 en presencia de PDTC disminuyó en más de dos órdenes logarítmicos con respecto a la sonda de control (c).

Para comprobar la eficacia del PDTC se llevó a cabo un ensayo TCID_{50} (dosis infectiva de cultivo de tejidos 50%) con o sin PDTC. Se calculó el TCID_{50} de acuerdo con los métodos de Kaerber para cada concentración: placas de microtitulación de 96 pocillos se infectaron dos veces con las líneas de dilución del virus determinado, una hora después de la infección el residuo fue retirado y se añadió un medio que comprendía las concentraciones indicadas de PDTC. El número de pocillos infectados se determinó después de cuatro días. En la figura 9 se ha mostrado que para una concentración de 300 \muM PDTC el TCID_{50} se reducía en 76,4% o bien 82,2% para A/PR8/34 o bien A/Vienna/47/96. Se alcanzó una inhibición de más de 99,9% para ambos virus para una concentración de 1200 \muM.

Ejemplo 9 Determinación de la concentración efectiva de PDTC

Mediante un ensayo de reducción de CPE (efecto citopático) se determinó la concentración efectiva de PDTC: se cultivaron verocélulas en placas de microtitulación de 96 pocillos y se infectaron con 5 TCID_{50} por pocillo y 50 TCID_{50} por pocillo de virus de gripe A/PR8/34, así como 5TCID_{50} por pocillo de virus de gripe A/Vienna/47/96. Una hora después de la infección el residuo fue retirado y el medio recibió 5 \mug/ml de tripsina y una línea de dilución de dos veces de PDTC empezando con una concentración de 1200 \muM. Las placas fueron investigadas en los cuatro días siguientes de forma visual con respecto al efecto citopático. La aparición de efectos citopáticos en relación con la sonda de control se calculó para cada una de las concentraciones. El 100% positivo significa la lisis completa en todos los pocillos. En la figura 10 se puede apreciar que se alcanzó una reducción de 50% de pocillos positivos para concentraciones comprendidas entre 50 y 100 \muM PDTC, una amortiguación completa del efecto citopático se alcanzó para una concentración de 600 \muM PDTC para todos los virus.

Ejemplo 10 Determinación del efecto de PDTC de in vivo

Se inocularon ratones 10 C57/BL6 por vía intranasal con una dosis letal (50 \mul 10^{7}pfU) del virus A/PR8/34. Una hora después fueron tratados por vía intranasal con 25 \mul 600 mM PDTC o bien 25 \mul PBS. Los ratones fueron observados y tratados durante las primeras 48 horas, cada 12 horas y finalmente cada 24 horas. El peso de los ratones se midió y se indicó en % del peso original (%w) (Fig. 11A). En la figura 11 se muestra que todos los ratones tratados con PDTC (cuadrado) sobrevivieron a la infección de los virus y siete días después de la infección aumentaron su peso. Todos los ratones tratados con PBS (Rauten) murieron dentro de los 12 días después de la infección (% s = % sobrevivientes).

De esta manera se demuestra que el PDTC solo muestra una fuerte efectividad contra infecciones por virus de gripe, in vitro e in vivo.

Ejemplo 11 Actividad antivírica de PDTC contra el virus de rinitis equina A (ERAV)

La reducción de la multiplicación vírica de ERAV mediante la administración de PDTC se investigó del modo siguiente: se infectaron verocélulas con 10 TCID_{50} por célula de ERAV. Simultáneamente se administraron diferentes concentraciones de PDTC (1 mM-50 \mum). Cuatro horas después de la infección se retiró el inoculo y se administró un medio nuevo con PDTC. 24 horas después de la infección se retiraron los residuos y se realizó la determinación de la concentración vírica en un ensayo de placas normal.

La figura 12 muestra que la concentración de virus (Vt) en el residuo disminuye en comparación con las células sin tratamiento (-).

Ejemplo 12 Efecto del PDTC sobre la multiplicación de la cepa de virus de la fiebre aftosa (MKS) en cultivo celular

Se calculó, mediante un ensayo de reducción CPE ("efecto citopático"), la concentración efectiva de PDTC sobre la destrucción de células condicionada por el virus MKS.

Se cultivaron células IB-RS-2 en placas de microtitulación de 96 pocillos y se infectaron con virus MKS O-manisa con 0,1 TCID_{50} por célula y se encubaron durante una hora a 37ºC. A continuación se retiró el inoculo y se administró medio de infección con las concentraciones indicadas de PDTC (10 \muM hasta 1200 \muM). Se determinó el número de pocillos infectados mediante inspección microscópica del efecto citopático después de 24 horas.

En la figura 13A se ha mostrado que el número de pocillos infectados (%pos.) después de 24 horas depende de la concentración de PDTC. 600 \muM PDTC protegen las células al 100% con respecto al efecto citopático condicionado por el virus. Se consigue una reducción de 50% de pocillos infectados en la zona de concentraciones comprendida entre 75 \muM y 150 \muM.

Para comprobar el efecto de PDTC sobre la replicación de virus de MKS se infectaron células IB-RS-2 Zellen en recipientes de cultivo celular T25 cm^{2} con virus de MKS O-manisa con 0,001 TCID_{50} por célula y se incubaron durante una hora a 37ºC. A continuación se retiró el inoculo y se administró el medio de infección con las concentraciones indicadas PDTC (0 \muM hasta 200 \muM). 24 horas después de la infección los residuos fueron retirados y se determinó la concentración vírica (TCID) en un ensayo de placas estándar.

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Tal como se muestra en la figura 13B, la concentración de virus de MKS O-manisa en presencia de PDTC disminuye en comparación con la sonda de control (O) en más de dos órdenes logarítmicos. La sonda de control no recibió PDTC alguno.

Ejemplo 13 Efecto de PDTC sobre la multiplicación de FSME en cultivo celular

Los virus de FSME no pertenecen a los picornavirus ni producen enfermedades en las vías respiratorias.

Monocapas confluyentes de células BHK-21 (ATCC) se infectaron con 10 pfu/células de virus de FSME (Neudörfel) en presencia de las siguientes concentraciones de PDTC: 1000 \muM, 500 \muM, 250 \muM, 125 \muM, 62,5 \muM, 31,25 \muM, 15,6 \muM, 7,8 \muM, 3,9 \muM, 1,95 \muM, 0,975 \muM.

A continuación se incubaron las células durante cuatro días a 37ºC y se analizó microscópicamente la monocapa celular. La multiplicación vírica se determinó por utilización de inmuno ensayos enzimáticos. El análisis microscópico no mostró indicación alguna de efectos tóxicos de PDTC. La cuantificación de la multiplicación vírica muestra que el PDTC en ninguna de las concentraciones objeto de prueba se encuentra en condiciones de reducir la multiplicación vírica.

De forma análoga se investigó si el PDTC puede influir, en células en suspensión, sobre la multiplicación vírica: se comprobaron las mismas concentraciones anteriormente indicadas. Tampoco en esta investigación se pudo encontrar indicación alguna de reducción de la multiplicación vírica por la acción de PDTC.

Ejemplo 14 Efecto de PDTC sobre ratones infectados por EMC

Ratones C57B16 fueron infectados con virus 10 TCID50 EMC por vía intraperitoneal. El grupo de control fue tratado a continuación una vez al día con 50 \mul PBS por día intraperitoneal. Se trataron otros dos grupos con 50 \mul 50 mM PDTC al día, de manera que en un grupo el tratamiento fue empezado simultáneamente con la infección (PDTC) y en el otro grupo se empezó 24 horas después de la infección (PDTC 24 hpi).

En la figura 14 se puede apreciar la variación del peso de los ratones después del inicio de la infección. Es visible claramente que no hay diferencias entre los animales tratados y los animales sin tratar. Como promedio tiene lugar la muerte en los ratones infectados en todos los grupos a los 5,5 días.

De esta manera se demuestra que el PDTC no tiene ningún efecto sobre la infección por EMC que se incluye entre los picornavirus, pero no obstante no produce ninguna enfermedad en las vías respiratorias, sino en las células nerviosas.

Claims (15)

1. Utilización de compuestos de ditiocarbomato con la fórmula estructural R_{1}R_{2}NCS_{2}H, en la que R_{1} y R_{2} son independientemente entre si un grupo C_{1}-C_{4} alquilo de cadena recta o ramificada o que constituyen con el átomo de nitrógeno un anillo alifático con 4-6 átomos de carbono, de manera que R_{1},R_{2} o el anillo alifático en su caso está sustituido con uno o varios sustituyentes escogidos entre OH, NO_{2}, NH_{2}, COOH, SH, F, Cl, Br, I, metilo o etilo y formas oxidadas de estos compuestos, en especial dímeros de los mismos, así como sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o reducción de una infección por virus de RNA que afectan las vías respiratorias en humanos y mamíferos, produciendo enfermedades en las mismas.

2. Utilización, según la reivindicación 1, caracterizada porque R_{1}, y R_{2} presentan con independencia entre si un grupo C_{1}C_{3} alquilo o forman con el átomo de nitrógeno un anillo alifático con cuatro a seis átomos de carbono.

3. Utilización, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el compuesto de ditiocarbamato es escogido entre el pirrolidin ditiocarbamato y N,N-dietil ditiocarbamato.

4. Utilización, según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la infección por virus es una infección con picornavirus, otormixovirus o paramixovirus.

5. Utilización, según la reivindicación 4, caracterizada porque el ortomixovirus es un virus de la gripe humana, escogido en especial entre el grupo que comprende gripe A, gripe B, gripe C, o bien el paramixoviros es un virus de paragripe o virus de neumovirus.

6. Utilización, según la reivindicación 4, caracterizada porque el ortomixovirus es virus de gripe A de mamíferos.

7. Utilización, según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el picornavirus es un rinovirus, en especial rinovirus humano o equino, un enterovirus, en especial rodirus de pato 70, 71, o coxaquivirus o bien un aftovirus, en especial el virus de la fiebre aftosa o virus de rinitis equina A.

8. Utilización, según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el compuesto de litio carbonato se utiliza en el medicamento con una concentración de 0,01 hasta 5000 mM, preferentemente de 1 a 300 mM, especialmente preferente de 10 a 100 mM.

9. Utilización, según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque los compuestos de ditiocarbamato se utilizan en el medicamento en una concentración de 10 mM a 1 M.

10. Utilización, según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el medicamento comprende, además, un soporte farmacéuticamente aceptable.

11. Utilización, según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque el medicamento es un medicamento para administración oral, intranasal, intravenosa, rectal, parenteral o como gotas para ojos y oídos, como solución para gargarismos o aerosol.

12. Utilización, según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque el medicamento comprende otras sustancias antivíricas.

13. Utilización, según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque el medicamento comprende una combinación de, como mínimo, diferentes compuestos de ditiocarbamato.

14. Utilización, según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque el medicamento comprende otras sustancias escogidas entre antibióticos, vacunas, inmunosupresores, estabilizadores, sustancias inmunoestimulantes, productos de sangre o mezclas de los mismos.

15. Utilización, según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque el medicamento es utilizado para la inhibición de la multiplicación vírica.