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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Ringpeptids Cyclosporin C der Formel
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Cyclosporin C ist verwendbar zur Herstellung von Dihydro-Cyclosporin C. Letztere Verbindung zeichnet sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittelwirkstoff verwendet werden.
Erfindungsgemäss gelangt man zum Cyclosporin C, indem man den Stamm NRRL 5760 der Pilzspecies Cylindrocarpon lucidum Booth züchtet und Cyclosporin C aus der Kulturbrühe isoliert. Die Züchtung erfolgt auf an sich bekannte Weise (s. z. B. DE-OS 2455859). Eine Kultur dieses Stammes ist beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, 111., U. S. A., deponiert. Cyclosporin C kann auf chromatographischem Wege isoliert werden als ein gegen Aspergillus niger aktives Produkt mit polarerer Wirkung als Cyclosporin A und B (in der DE-OS 2455859 werden Cyclosporin A und B als S 7481/F-l und S 7481/F-2 bezeichnet).
In dem nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel :
Eine durch Züchtung von Cylindrocarpon lucidum Booth (NRRL 5760) erhaltene Kulturbrühe (400 l ; s. Beispiel 2 von DE-OS 2455859) wurde mit 400 1 n-Butylacetat ausgerührt. Nach Auftrennung in einem Westfalia-Separator wurde die organische Phase im Vakuum konzentriert, und der Rohextrakt durch 3stufige Verteilung zwischen Petroläther und Methanol/Wasser (9 : 1) entfettet.
Das anfallende Material löste man in Choroform und chromatographierte an 4, 5 kg Kieselgel 60 "Merck" - (Korn grösse 0, 2 bis 0, 5 mm), wobei Chloroform mit steigenden Anteilen Methanol als Elutionsmittel diente. Die mit Chloroform + 1, 5% Methanol erhaltenen Fraktionen enthielten vorwiegend Cyclosporin A und B, die späteren, mit Chloroform + 3% Methanol eluierten Anteile vorwiegend Cyclosporin C. Ihr Nachweis in den Eluatfraktionen erfolgt mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie, wobei sie einen wesentlich niedrigeren RF-Wert aufweist als die beiden erstgenannten Substanzen, z. B. auf Silicagel-Fertigfolien "Polygram" (hergestellt durch Fa.
Marcherey und Nagel, Düren, BRD) mit
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matographischen Prüfung ganz oder vorwiegend aus Cyclosporin C bestehen, wird die chromatographische Reinigung wiederholt. Die Eluatfraktionen werden wie oben im Dünnschichtchromatogramm auf ihre Zusammensetzung geprüft und diejenigen von ihnen, die ganz aus Cyclosporin C bestehen, vereinigt und im Vakuum bei 20 bis 40 zur Trockne verdampft. Den Rückstand behandelt man nach Lösen in der 10fachen Menge Alkohol mit 5 Gew.-% Aktivkohle, dampft nach dem Abfiltrieren der Kohle das Filtrat bei 20 bis 400 im Vakuum ein und trocknet den Rückstand im Hochvakuum bei 55 .
Der letzte Reinigungsschritt besteht darin, dass man den Rückstand in der 5fachen Menge Äther löst und durch langsames Zufügen der 30fachen Menge Hexan unter Schütteln die feste Substanz ausfällt und sie nach Abkühlen des Gemisches auf 0 bis 50 abfiltriert, mit kaltem Hexan wäscht und im Hochvakuum bei 550 trocknet. Aus der 2, 5fachen Menge Aceton werden bei-15 farblose, prismatische Nadeln von kristallinem Cyclosporin C erhalten.
Smp. 152 bis 155 .
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The invention relates to a process for the preparation of the new ring peptide cyclosporin C of the formula
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Cyclosporin C can be used for the production of dihydro-cyclosporin C. The latter compound is characterized by interesting chemotherapeutic and pharmacological properties and can therefore be used as an active ingredient in medicinal products.
According to the invention, cyclosporin C is obtained by cultivating strain NRRL 5760 of the fungal species Cylindrocarpon lucidum Booth and isolating cyclosporin C from the culture broth. The cultivation is carried out in a manner known per se (see, for example, DE-OS 2455859). A culture of this strain is deposited with the United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, 111., U.S.A. Cyclosporin C can be isolated chromatographically as an Aspergillus niger active product with a more polar effect than Cyclosporin A and B (in DE-OS 2455859 Cyclosporin A and B are referred to as S 7481 / F-1 and S 7481 / F-2).
In the following example, which explains the invention in more detail but is not intended to restrict its scope in any way, all the temperatures are given in degrees Celsius.
For example:
A culture broth (400 l; see Example 2 of DE-OS 2455859) obtained by culturing Cylindrocarpon lucidum Booth (NRRL 5760) was stirred with 400 1 n-butyl acetate. After separation in a Westfalia separator, the organic phase was concentrated in vacuo and the crude extract was degreased by 3-stage distribution between petroleum ether and methanol / water (9: 1).
The resulting material was dissolved in choroform and chromatographed on 4.5 kg of silica gel 60 "Merck" - (grain size 0.2 to 0.5 mm), chloroform being used as the eluent with increasing proportions of methanol. The fractions obtained with chloroform + 1.5% methanol contained predominantly cyclosporin A and B, the later fractions predominantly cyclosporin C eluted with chloroform + 3% methanol. Their detection in the eluate fractions is carried out with the aid of thin layer chromatography, with a significantly lower RF -Value has as the first two substances, z. B. on silica gel ready-made films "Polygram" (manufactured by Fa.
Marcherey and Nagel, Düren, FRG) with
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If the matographic test consists entirely or predominantly of cyclosporin C, the chromatographic cleaning is repeated. The eluate fractions are checked for their composition as in the thin-layer chromatogram and those of them which consist entirely of cyclosporin C are combined and evaporated to dryness in vacuo at 20 to 40. After being dissolved in 10 times the amount of alcohol, the residue is treated with 5% by weight of activated carbon, and after the carbon has been filtered off, the filtrate is evaporated in vacuo at 20 to 400 and the residue is dried in a high vacuum at 55.
The last purification step consists in dissolving the residue in 5 times the amount of ether and slowly adding 30 times the amount of hexane while shaking. The solid substance precipitates and, after the mixture has cooled to 0 to 50, it is filtered off, washed with cold hexane and in a high vacuum 550 dries. Colorless, prismatic needles of crystalline cyclosporin C are obtained from the 2.5 times the amount of acetone at -15.
Mp 152-155.
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