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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums und seiner Salze
EMI1.1
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EMI2.1
Das Antibiotikum ZN-6 ist in Wasser und Hexan schwer bzw. kaum löslich, dagegen in Äthanol,
Aceton, Methylbutylketon, Amylacetat, Chloroform und ähnlichen Lösungsmitteln löslich.
Bei der Papierchromatographie unter Verwendung der von Bush beschriebenen Systeme (Biochemical Journal, Bd. 50 [1952], S. 370) hat das Antibiotikum ZN-6 Rf-Werte von 0,38 und 0,73 im B (1)-bzw.
B (5)-System.
Mit Benzol bildet es ein kristallines Benzolsolvat, das in heissem Benzol löslich ist, jedoch von kal- tem Benzol nur in geringem Umfang gelöst wird. Das genannte Solvat hat einen Fp von 189 bis 189, 50C.
Nach dem Trocknen des Solvates bei einer Temperatur von 500C und einem absoluten Druck von
0,01 mm Hg bis zur Gewichtskonstanz wird ein reines Produkt erhalten, das von Benzol frei ist und einen
EMI2.2
bei 220 mit einen molaren Extinktionskoeffizienten von 8000 in Äthanol und keine charakteristischen Absorptionsbanden oberhalb dieser Wellenlänge aufweist.
Das reine Antibiotikum ZN-6 ist ferner durch sein Spektrum im UR-Bereich, wie es in der Zeichnung gezeigt ist, gekennzeichnet, aus der sich ergibt, dass es charakteristische Absorptionsbanden bei den in reziproken Zentimetern ausgedrückten Frequenzen v = 1265, 1385,1695, 1730 und 3450 cm -1 aufweist, wenn diese Bestimmung unter Anwendung der Kaliumbromid-Methode erfolgt.
Bei bakteriologischen Untersuchungen hat sich erwiesen, dass das Antibiotikum ZN-6 gegen eine Anzahl von pathogenen Mikroorganismen, insbesondere Staphylococcus aureus, Neisseria gonorhoeae einschliesslich der penicillinresistenten Stämme, Neisseria meiiingitides, Mycobacterium tuberculoses und die gegen Streptomycin, Isonicotinsäurehydrazid und p-Aminosalicylsäure resistenten Stämme dieses Organismus und Corynebacterium diphtheriae wirksam ist.
Die besondere spezifische fungizide und antibakterielle Aktivität des Antibiotikums gemäss der Erfindung ist aus der folgenden Tabelle ersichtlich, in welcher die Aktivität als die Menge des Natriumsalzes des Antibiotikums ZN -6 in mgXl angegeben ist, die eine age Hemmung des in Frage stehenden Organismus nach der angegebenen Zeitdauer (in Stunden) verursacht :
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<tb>
<tb> Organismus <SEP> Nährmedium <SEP> Zeit <SEP> 50% <SEP> Hemmkonzentration
<tb> (Stunden) <SEP> (mg/l)
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> 0,063
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus, <SEP> Pencillinase <SEP> bildender <SEP> Stamm <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 050
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus, <SEP> penicillinresistenter <SEP> Laboratoriumsstamm,
<tb> der <SEP> nicht <SEP> Penicillinase <SEP> bildet <SEP> Bouillon <SEP> 48 <SEP> 0,16
<tb> Neisseria <SEP> gonorhoeae <SEP> Blutascitesagar <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP>
<tb> Neisseria <SEP> gonorhoeae, <SEP> penicillinresistenter <SEP> Stamm <SEP> Blutascitesagar <SEP> 24 <SEP> 0,63
<tb>
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<tb>
<tb> Organismus <SEP> Nährmedium <SEP> Zeit <SEP> 50% <SEP> Hemmkonzentration
<tb> (Stunden) <SEP> (mg/l)
<tb> Neisseria <SEP> meningitides <SEP> Blutascitesagar <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP>
<tb> Haemophilus <SEP> influenzae <SEP> Blutascitesagar <SEP> 24 <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> Bouillon <SEP> mit <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 16, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Serum
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> Bouillon <SEP> mit <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Serum
<tb> Streptococcus <SEP> zooepidemicus <SEP> Bouillon <SEP> mit <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Serum
<tb> Streptococcus <SEP> agalactiae <SEP> Bouillon <SEP> mit <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 16, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Serum
<tb> Streptococcus <SEP> lactis <SEP> Bouillon <SEP> mit <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 13, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Serum
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> Bouillon <SEP> mit <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 5,
<SEP> 0 <SEP>
<tb> Serum
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> > <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Vibrio <SEP> comma <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> > <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Alcaligenes <SEP> faecalis <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> 13, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> > <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> > <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> > <SEP> 30,0
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> > <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> > <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis, <SEP> Dubos <SEP> 144 <SEP> 0, <SEP> 79 <SEP>
<tb> var.
<SEP> hum.
<tb>
Mycobacterium <SEP> tuberculosis,
<tb> var. <SEP> hum.
<tb> streptomycinresistenter <SEP> Stamm <SEP> Dubos <SEP> 144 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis,
<tb> var. <SEP> hum.
<tb>
Stamm <SEP> resistent <SEP> gegen <SEP> p-Aminosalicylsäure <SEP> Dubos <SEP> 144 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis,
<tb> var. <SEP> hum.
<tb>
Stamm <SEP> resistent <SEP> gegen <SEP> Isonicotinsäurehydrazid <SEP> Dubos <SEP> 240 <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> Sabouraud <SEP> 24 <SEP> 100,0
<tb> Tricophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> Sabouraud <SEP> 72 <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> Sabouraud <SEP> 72 <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Clostridium <SEP> perfringens <SEP> Thioglykolat-Medium <SEP> 48 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> Organismus <SEP> Nährmedium <SEP> Zeit <SEP> 501o <SEP> Hemmkonzentration
<tb> (Stunden) <SEP> (mg/l)
<tb> Clostridium <SEP> tetani <SEP> Thioglykolat-Medium <SEP> 48 <SEP> 0, <SEP> 02
<tb> Aetinomyces <SEP> bovis <SEP> Thioglykolat-Medium <SEP> 48 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Corynebacterium <SEP> Fleischwasser <SEP> mit <SEP> 24 <SEP> 0,
<SEP> 05 <SEP>
<tb> 10% <SEP> Serum
<tb>
Klinische Versuche, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt worden sind, haben gezeigt, dass das Antibiotikum ZN-6 und gewisse seiner Salze den Anforderungen für phar- mazeutisch verwendbare Antibiotika entsprechen, da sie für die Behandlung von Infektionskrankheiten brauchbar und insbesondere bei der Behandlung jener Krankheiten wertvoll sind, die durch verschiedene
Stämme von Staphylococcen, einschliesslich der penicillinresistenten Stämme, hervorgerufen werden.
Für pharmazeutische Zwecke kann das Antibiotikum ZN-6 als solches oder in Form seiner mehr oder weniger wasserlöslichen Salze mit nichttoxischen anorganischen oder organischen Basen verwendet werden.
Wässerige Lösungen von Salzen des Antibiotikums ZN-6 können zwar parenteral angewandt werden, doch werden die Salze vorzugsweise oral verabreicht, da sie leicht vom Magen-Darm-Trakt in die Kör- perflüssigkeiten gelangen, in welchen eine angemessene Konzentration des Antibiotikums über einen be- friedigend langen Zeitraum nachweisbar ist.
Dies wurde bei einem Resorptionsversuch festgestellt, bei dem acht Personen jeweils oral einer ein- maligen Behandlung unterzogen wurden, bei der zwei Kapseln, von welchen jede 0, 250 g des Natrium- salzes des Antibiotikums ZN-6 enthielt, verabreicht wurden, worauf die Plasmakonzentrationen in fest- gelegten Intervallen nach der Einnahme bestimmt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II wiedergegeben, in der die Zahlen die angeführte Plasmakonzentration, ausgedrückt in y/ml Plasma, eine und mehrere Stunden nach der Einnahme angeben.
Tabelle II
EMI4.2
<tb>
<tb> Plasmakonzentrationen <SEP> in <SEP> y/ml
<tb> Versuchsperson <SEP> Stunden
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 7 <SEP> 9 <SEP> 12
<tb> Gruppe <SEP> I
<tb> A <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 9, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 2 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 9 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP>
<tb> B <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> 3, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP>
<tb> C <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 5, <SEP> 2 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP>
<tb> D <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP> 8, <SEP> 5 <SEP> 9, <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 2 <SEP> 4, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Gruppe <SEP> Il
<tb> E <SEP> 1,6 <SEP> 6,6 <SEP> 8,1 <SEP> 6,6 <SEP> 4,0 <SEP> 3,2 <SEP> 2,4
<tb> F <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 6,
<SEP> 1 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP>
<tb> G <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 12, <SEP> 3 <SEP> 8, <SEP> 6 <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP>
<tb>
In Gruppe I erhielten die Versuchspersonen das Mittel auf nüchternen Magen, wogegen es den Personen der Gruppe II nach Einnahme einer Mahlzeit verabreicht wurde.
Bei einem ähnlichen Versuch betrug die Durchschnittskonzentration des Plasmas, die 24 h nach der Einnahme der gleichen Menge des Mittels festgestellt wurde, 0, 75 y/ml, wodurch die ausserordentlich langsame Ausscheidung des Stoffes aus dem Körper angezeigt wird.
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Bei Tierversuchen unter Verwendung von Mäusen als Versuchstiere wurde eine ausreichend niedrige akute Toxizität des Antibiotikums ZN-6 beobachtet. Es wurden die folgenden Werte für DD , ausgedrückt in mg/kg Körpergewicht, gefunden :
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<tb>
<tb> a) <SEP> Natriumsalz <SEP> von <SEP> Antibiotikum <SEP> ZN-6 <SEP> 200 <SEP> - <SEP> 250 <SEP>
<tb> intravenös <SEP> verabreicht
<tb> b) <SEP> Natriumsalz <SEP> von <SEP> Antibiotikum <SEP> ZN-6 <SEP> 400
<tb> subkutan <SEP> verabreicht
<tb> c) <SEP> Benzolsolvat <SEP> von <SEP> Antibiotikum <SEP> ZN-6 <SEP> > <SEP> 1500
<tb> peroral <SEP> verabreicht
<tb>
Ferner wurden bei fortgesetzten toxikologischen Versuchen, bei welchen die Tiere, männliche und weibliche Ratten, sechs Tage wöchentlich mit dem Natriumsalz des Antibiotikums ZN-6 in Dosen von
0,
400 g/kg des Körpergewichtes oral behandelt wurden, weder bedeutsame Unterschiede im Gewicht zwi- schen den Versuchstieren und den Kontrolltiere, noch irgendwelche durch dieses Mittel verursachte pa- thologische Änderungen beobachtet, woraus sich das Fehlen einer chronischen Toxizität ergibt.
Die einzigartigen Eigenschaften des Antibiotikums ZN-6 zeigten sich in einem noch eindrucksvolle- ren Ausmass bei einer kontrollierten klinischen Verwendung des Natriumsalzes des Antibiotikums ZN-6 in
Form einer geeigneten, in Gelatinekapseln eingeschlossenen Zusammensetzung bei Patienten, die an Fu- runkulose, Osteomyelitis und Endokarditis litten.
Nach einer oralen Behandlung der Patienten in täglichen oder ähnlichen Abständen, wie sie für eine praktische Verwendung über einen ausreichenden Zeitraum zweckmässig sind, zeigte sich, dass die Kuren zu 100% ohne Auftreten von Nebenerscheinungen oder toxischen Reaktionen verliefen, und selbst nach längeren Beobachtungszeiten wurden keine Rückfälle festgestellt.
Bei klinischen Behandlungen können diewasserlöslichen Salze des Antibiotikums ZN-6 und insbeson- dere dessen Natriumsalz verwendet werden.
Anderseits können auch schwach wasserlösliche Salze des Antibiotikums ZN-6 oder sogar die freie
Säure für eine orale Verabreichung benutzt werden, wobei die Absorptionsgeschwindigkeit des Wirkstof- fes abnimmt, so dass er seine Aktivität vorzugsweise im Magen-Darm-Trakt selbst ausübt, was bei der
Behandlung von gewissen Krankheiten wünschenswert sein kann.
Ferner können die schwach wasserlöslichen Salze des Antibiotikums ZN-6 in Form einer Suspension des Salzes in einem geeigneten Medium injiziert werden, um Blutspiegel des Antibiotikums zu erzeugen, die sogar noch länger andauern als die oben beschriebenen.
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Proteine, und geeignete Mengen der anorganischen Salze und andern Stoffe, die für die Ernährung des
Pilzes erforderlich sind, enthält, und die Fermentation wird so lange fortgesetzt, bis die genannte Lösung eine wesentliche antibiotische Aktivität erreicht hat ; hierauf wird das auf diese Weise gebildete Antibio- tikum ZN-6 gewonnen, konzentriert und in reiner Form isoliert oder mit pharmazeutisch annehmbaren bzw. erwünschten Basen mit Hilfe bekannter Reaktionen in eines seiner Salze übergeführt.
Bei der Ausführung des Verfahrens gemäss der Erfindung wird die Bildungsgeschwindigkeit des Antibiotikums ZN-6 während der Fermentation durch routinemässige Auswertung bzw. Bestimmung der Aktivität der filtrierten Kultur bestimmt, wobei für diesen Zweck die Agarplattenmethode angewandt werden kann, indem beispielsweise Staphylococcus aureus als Testorganismus benutzt wird.
Gemäss den bei der Herstellung von Antibiotikum ZN-6 in technischem Umfang erhaltenen Ergebnissen wurde die optimale Ausbeute an dem Stoff im Verlauf von 80 bis 100 h erhalten, wenn der Fermentationsprozess bei einer Temperatur zwischen 20 und 300C und vorzugsweise zwischen 24 und 280C durchgeführt wurde.
Die angeführten Temperaturbereiche stellen jedoch keine Begrenzung dar, da die für den Erhalt der genannten Ausbeuten erforderliche Zeitdauer in einem gewissen Umfang von der Konstruktion des Fermentationsgefässes und der Type des verwendeten Rührers bzw. Rührwerkes in mechanischer Hinsicht abhängt.
Es soll in diesem Zusammenhang erwähnt werden, dass die verwendeten Gefässe Einheiten von der üblichen Grösse mit einem Inhalt von 10 bis 30 m3 an Kulturmedium waren und nicht spezifisch für die Herstellung von Antibiotikum ZN-6 bestimmt waren.
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Eine grosse Anzahl der bekannten Kulturmedien hat sich für die Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung als Kulturmedium als brauchbar erwiesen, doch werden jene Medien, die als Proteinquelle
Maisquellwasser oder Sojabohnenmehl und als Kohlehydratquelle Glucose oder Saccharose enthalten, be- vorzugt.
Als andere Bestandteile eines geeigneten Kulturmediums können beispielsweise Hefeextrakt, Glyce- rin, Maltose, Fructose, Fettsäuren, Caseinhydrolysate, bestimmte Aminosäuren und wasserlösliche Vit- amine genannt werden.
Wenn die Erzeugung des Antibiotikums ZN-6 beim Fermentationsprozess aufhört oder wenn bereits eine zufriedenstellende Ausbeute erreicht worden ist, kann die antibiotisch wirksame Substanz nach einer grossen Anzahl von Verfahren gewonnen werden.
Vorteilhafterweise besteht die erste Stufe des Verfahrens in einer Abtrennung des Mycels von der Kul- turflüssigkeit, beispielsweise durch Filtration. Das Antibiotikum ZN-6 kann durch Behandeln des Kultur- lösung mit einem festen Adsorptionsmittel und Eluieren der Substanz aus diesem Adsorptionsmittel kon- zentriert werden, wobei für diesen Zweck als Adsorptionsmittel beispielsweise Aktivkohle oder lonenaus- tauschharze verwendet werden können ; oder aber, und dies vorzugsweise, die Kulturlösung wird mit einem geeigneten Lösungsmittel oder einer geeigneten Lösungsmittelmischung, gegebenenfalls nach Einstellen des wässerigen, das Antibiotikum ZN-6 enthaltenden Mediums auf einen geeigneten pH-Wert, extrahiert.
Als geeignete Lösungsmittel können Ester, Ketone oder halogenierte Kohlenwasserstoffe genannt wer- den. Bei einer in technischem Umfang erfolgenden Herstellung haben sich jedoch insbesondere Methyl- isobutylketon, Amylacetat und Butylacetat für die Extraktion der Fermentationslauge als geeignet erwie- sen.
Wenn die aktive Substanz aus der Fermentationslösung extrahiert ist, kann sie durch Eindampfen der organischen Phase auf ein kleines Volumen, aus welchem das Antibiotikum ZN-6 beim Kühlen ausge- fällt oder durch Zusatz einer Komponente, welche die Löslichkeit des Antibiotikums ZN-6 vermindert, ausgefällt werden kann, und vorzugsweise durch Eindampfen der organischen Phase zur Trockne und Zu- satz von Benzol zwecks Erhalt des leicht kristallisierbaren, oben erwähnten Benzolsolvates gewonnen werden.
Anderseits ermöglichen die sauren Eigenschaften des Antibiotikums ZN-6 die Durchführung einer anschliessenden Extraktion der organischen Phase mit einer wässerigen alkalischen Lösung oder einer wäs- serigen Suspension einer alkalischen Verbindung, wobei mehr oder weniger konzentrierte wässerige Lö- sungen von Salzen des Antibiotikums ZN-6 erhalten werden.
Durch Ansäuern von solchen Lösungen kann das'Antibiotikum ZN-6 ausgefällt werden oder das Salz von Antibiotikum ZN-6, das darin enthalten ist, kann, wenn dies gewünscht wird, als solches isoliert werden.
Gemäss einer zweckmässigen Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung wird das leicht kri- stallisierbare Benzolsolvat direkt aus der genannten wässerigen Lösung eines Salzes des Antibiotikums ZN-6 hergestellt, gegebenenfalls nachdem ein Teil des Wassers durch Eindampfen, z.
B. in einem Vakuumein- dampfer, entfernt worden ist, indem der wässerigen konzentrierten Lösung eine zur Bildung des Solvats ausreichende Menge Benzol zugesetzt und die Lösung dann angesäuert wird, um das Antibiotikum ZN-6 in Form des genannten Solvates auszufällen, das nach der Isolierung und dem Trocknen entweder das rei- ne Benzolsolvat oder das Antibiotikum ZN-6 selbst ergibt, in Abhängigkeit von den Trocknungsbedingungen und der Temperatur, die angewendet werden, da bei erhöhten Temperaturen das Benzol aus dem Solvat in Freiheit gesetzt wird.
In Hinblick auf die Reinigung des Antibiotikums ZN-6 ist seine Fähigkeit zur Bildung von Solvaten mit bestimmten Lösungsmitteln ein wichtiges Merkmal. So wird z. B. bei einer andern geeigneten Ausführungsform der Erfindung das rohe Antibiotikum ZN-6 in einem kleinen Volumen von heissem Methanol gelöst, aus welchem beim Kühlen das Methanolsolvat in einer überraschend reinen Form auskristallisiert, so dass aus diesem Grunde diese Verfahrensweise besonders für den Erhalt einer pharmazeutisch anwendbaren Qualität der Substanz geeignet ist. Das erwähnte Methanolsolvat hat einen Fp von 179 bis 179, 50C.
Wenn Salze des Antibiotikums ZN-6 gewünscht werden, dann können diese durch einfache Neutralisation des Antibiotikums ZN-6 oder eines seiner Solvate mit der in Frage stehenden Base in Gegenwart eines geeigneten Reaktionsmediums, das die Umsetzung erleichtert und aus welchem das Salz ausfallen kann oder erforderlichenfalls durch Zusatz einer geeigneten Komponente zur Herabsetzung der Löslichkeit des gewünschten Salzes ausgefällt werden kann, hergestellt werden oder das Salz kann durch Eindampfen der Reaktionsmischung isoliert werden.
Anderseits kann ein von vornherein hergestelltes Salz des Antibiotikums ZN-6 mit der in Betracht
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kommenden Base umgesetzt werden, oder das gewünschte Salz von Antibiotikum ZN-6 kann durch eine doppelte Umsetzung eines vorher gewonnenen Salzes von Antibiotikum ZN-6 mit einem andern Salz, welches das gewünschte Metallion bzw. die gewünschte Base enthält, hergestellt werden.
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Procainsalze.
Als andere Salze, die nach dem Verfahren gemäss der Erfindung hergestellt werden können, können beispielsweise jene genannt werden, die als Basenkomponente Pyrrolidin, Piperazin, Guanidin, Methylamin, Äthylamin, Benzylamin oder ähnliche unsubstituierte oder substituierte Amine, ferner quaternäre
Amine, wie Cholin und seine Derivate, oder andere antibiotische Stoffe mit basischen Eigenschaften, wie
Streptomycin, enthalten, erwähnt werden.
Die Erfindung wird nun an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel l : Benzolsolvat von Antibiotikum ZN-6.
In einen Fermentationstank aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsraum von 1, 5 m3, der mit einem
Rührer ausgestattet war, wurde 1, 00 ni eines Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung einge- bracht :
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<tb>
<tb> Glukose <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> kg <SEP>
<tb> Fleisch- <SEP> und <SEP> Knochenmehl <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> kg
<tb> Maisquellwasser,
<tb> 50% <SEP> Trockensubstanz <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> kg
<tb> Glycerin <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> kg <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> kg <SEP>
<tb> MgSO4 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> kg <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> 1000 <SEP> l <SEP>
<tb>
Das Kulturmedium hatte einen pH-Wert von 6, 1, der durch Zugabe einer verdünnten Lösung von NaOH auf 6,5 eingestellt wurde, worauf das Medium durch Erhitzen sterilisiert wurde.
Nach dem Kühlen wurde es mit 3 l einer Kultur von Fusidium coccineum Fuck K. Tubaki, die 48 h lang in einem Schüttelgefäss bei einer Temperatur von 280C gezüchtet worden war, beimpft. Der Inhalt des Tankes wurde gerührt und in einem Ausmass von 0,6 m3 Luft pro Stunde bei einer Temperatur von 280C 96 h lang belüftet. Während dieses Zeitraumes war es nicht erforderlich, den PH-Wert zur Aufrechterhaltung des oben genannten Wertes von 6,5 einzuregeln.
Nach der erwähnten Fermentationszeit zeigte sich bei einer Bestimmung der antibiotischen Aktivität des Kulturmediums nach dem üblichen Agar-Schalentest mit Staphylococcus aureus, dass diese Aktivität einem Gehalt von 70 mg an Antibiotikum ZN-6 pro Liter entspricht, wenn sie mit der Aktivität dieses Stoffes, nach der gleichen Methode bestimmt, verglichen wird.
Das Mycel wurde von dem Kulturmedium durch Filtration abgetrennt ; die Menge des Filtrates betrug 700 l. Der PH-Wert des Filtrates wurde durch Zusatz einer 25%gen Lösung von Schwefelsäure auf 3, 3 eingestellt und das Filtrat wurde in einem Podbielniak-Extraktor im Gegenstrom mit 230 1 Butylacetat
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Lösung von NaOH bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 10, Oder wässerigen Phase zugesetzt worden war, extrahiert und dann wurde die wässerige Phase von der Butylacetatphase getrennt. Der pH-Wert der wässerigen Phase wurde durch Zusatz einer 25"lagen Lösung von Schwefelsäure auf 3, 2 eingestellt und die erhaltene Lösung mit 40 1 Methylisobutylketon extrahiert.
Die Methylisobutylketonphase wurde von der wässerigen Phase abgetrennt, mit 40 g Aktivkohle behandelt und anschliessend im Vakuum bei einer Siedetemperatur von 25 C zur Trockne verdampft. Der Rückstand wurde in 500 ml Benzol gelöst und die Lösung über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Dabei kristallisierte das Benzolsolvat von Antibiotikum ZN-6 aus. Es wurde abfiltriert und aus Benzol umkristallisiert, wobei 12,0 g der reinen Sub-
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500 mg des auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellten Benzolsolvats wurden in 20 ml Wasser suspendiert und der Suspension wurde 0, 5n-wässeriges NaOH bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 9, 0 zugesetzt.
Die Lösung wurde filtriert, und zu dem Filtrat wurden 50 ml n-Butanol zugesetzt, worauf der Wasseranteil der Lösung durch azeotrope Destillation im Vakuum entfernt wurde. Aus dem Rückstand wurde durch Zusatz von Äther das gewünschte Natriumsalz ausgefällt. Es wurde abfiltriert, mit
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Äther gewaschen und getrocknet. Durch Umkristallisieren aus Äthanol/Aceton wurden 360 mg des reinen, kristallinen Natriumsalzes erhalten.
Beispiel3 :HerstellungvonAntibiotikumZN-6.
Sporen von Fusidium coccineum Fuck K. Tubaki wurden von einer Agarplatte in 3 1 eines sterilen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung eingebracht :
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<tb>
<tb> Glycerin <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Glukose <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> MgSC. <SEP> 7Hp <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> FeS04. <SEP> HO <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> g/l <SEP>
<tb> CUS04. <SEP> 5 <SEP> H2O <SEP> 0,004g/l
<tb>
Die Kultur wurde unter aeroben Bedingungen bei 270C 40 - 60 h lang in einer hin-und hergehenden Schüttelvorrichtung bebrütet.
Das auf diese Weise gewonnene Keimmaterial kann direkt als Impfmittel für einen Fermenter in technischem Massstab verwendet werden ; in diesem Falle wurde das Material jedoch in ein Gefäss mit einem Fassungsraum von 700 1, das ein Kulturmedium von der gleichen Zusammensetzung wie der Fermenter in technischem Massstab enthielt, eingebracht und bei einer Temperatur von 260C während eines Zeitraumes von 40 bis 48 h bebrütet, um die Entwicklung des vegetativen Wachstums des Pilzes vor dem Animpfen des Hauptfermenters zu bewirken.
Anschliessend wurden 16 000 1 eines Kulturmediums der Zusammensetzung
EMI8.2
<tb>
<tb> Glukose <SEP> 30 <SEP> g/l
<tb> Glycerin <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> KH. <SEP> 2H2O <SEP> 5g/l
<tb> NaNO <SEP> 6 <SEP> g/l
<tb> KC1 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> MgS04. <SEP> 7H2O <SEP> 0,5g/l
<tb> ZnSO4. <SEP> 6H2O <SEP> 1 <SEP> mg/l
<tb> Hefeextrakt <SEP> (Difco) <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> g/l,
<tb>
das vor der Sterilisation auf einen PH-Wert von 7, 2 eingestellt worden war, in dem Hauptfermenter bei einer Temperatur von 120 C 1/2 h lang sterilisiert und das Medium wurde nach dem Kühlen mit einer der beiden Formen von Impfmaterial, die oben erwähnt sind, beimpft.
Unter Rühren und Einpressen von Luft durch eine Einlassöffnung bzw. ein Abbrennkontaktstück in einem Ausmass von 0, 05 1 pro Liter Kulturflüssigkeit pro Minute wurde das Mycel gebildet und die Fermentation bei einer Temperatur von 260C 4 Tage lang fortgesetzt.
Während der Fermentation wurde die Aktivität von Proben der abfiltrierten Kultur durch Messung der Hemmungszone, die bei der Agar-Schalenmethode unter Verwendung von Staphylococcus aureus als Testorganismus hervorgerufen wurde, bestimmt. Sobald das Verfahren beendet war, entsprach die erhaltene Aktivität einer Konzentration von 150 y Antibiotikum ZN-6 pro ml in dem Kulturmedium.
Beispiel 4 : Herstellung von Antibiotikum ZN-6.
160001 eines Kulturmediums der Zusammensetzung
EMI8.3
<tb>
<tb> Maisquellwasser, <SEP> 50% <SEP> 2,5g/l
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> oder
<tb> Fleischmehl <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Saccharose <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,5g/l
<tb> MgSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 0,5g/l,
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
das vor der Sterilisation auf einen PH-Wert von 6, 80 eingestellt worden war, wurden in dem Fermenter bei einer Temperatur von 1200C 1/2 h lang sterilisiert.
Nach dem Kühlen wurde das Medium mit dem in Beispiel 3 erwähnten Impfstoff beimpft und die Fermentation wurde 100 h lang fortgesetzt, wobei in dem Kulturmedium eine Konzentration an Antibiotikum ZN-6 erhalten wurde, die einem Gehalt von 260 y gemäss der Agar-Schalenmethode entsprach.
Beispiel 5 : Herstellung von Antibiotikum ZN -6.
16 000 l eines Kulturmediums der Zusammensetzung
EMI9.1
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 60, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Maisquellwasser, <SEP> 50% <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> KH2PO <SEP> 4 <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> MgS04.7 <SEP> HO <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/l, <SEP>
<tb>
EMI9.2
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb>
<tb>
Base <SEP> Umkristallisiert <SEP> aus <SEP> Fp <SEP> in <SEP> C
<tb> Triäthylamin <SEP> Aceton <SEP> 143 <SEP> - <SEP> 144 <SEP>
<tb> Piperidin <SEP> Aceton <SEP> 155 <SEP> - <SEP> 156 <SEP>
<tb> Morpholin <SEP> Aceton <SEP> 112 <SEP> - <SEP> 114 <SEP>
<tb> Cyclohexylamin <SEP> Aceton <SEP> 180 <SEP> - <SEP> 182 <SEP>
<tb> Dibenzyl-äthylendiamin <SEP> +) <SEP> Äthylacetat <SEP> 112 <SEP> - <SEP> 113 <SEP>
<tb> Benzyl- <SEP> B <SEP> -phenyläthylamin <SEP> +) <SEP> Aceton <SEP> -Hexan <SEP> 103 <SEP> - <SEP> 105 <SEP>
<tb> Monoäthanolamin <SEP> Aceton-Hexan <SEP> 130-132 <SEP>
<tb> Procain <SEP> +) <SEP> amorph
<tb>
+) Schwer löslich in Wasser.
Beispiel 8 : Gewinnung von Antibiotikum ZN-6 aus der Fermentationslösung.
200 ml des Anionenaustauschharzes Amberlite IRA 401 S (OH) wurden 1 h lang mit drei 2 1-Portio- nen einer geklärten Fermentationslösung mit einem Gehalt von 110 y an Antibiotikum ZN-6 pro ml ge- rührt. Während des Rührens wurde der pH-Wert durch Zusatz von 2n-wässerigem Natriumhydroxyd auf 9, 5 gehalten.
Analysen des Filtrates ergaben, dass 85% des Antibiotikums ZN-6 von dem Harz absorbiert worden waren. Nach dem Filtrieren wurde das Harz mit drei 1,5 l-Portionen Wasser gewaschen und hierauf in
500 ml Aceton suspendiert. Unter Rühren wurde während eines Zeitraumes von 3 h durch Zusatz von 6n-
Salzsäure der PH-Wert auf 3, 6 erniedrigt und dann wurde das Harz abfiltriertund mit Aceton (zweimal
100 ml) gewaschen.
Die vereinigten Filtrate und Waschlaugen enthielten 375 mg Antibiotikum ZN-6, was 57% der in der
Fermentationslösung vorhandenen Menge entspricht.
Beispiel 9 : Gewinnung von Antibiotikum ZN-6 aus der Fermentationslösung.
1 l der geklärten Fermentationslösung mit einem Gehalt von 500 mg Antibiotikum ZN-6 wurde 1 h lang mit 5 g Entfärbungskohle (S. B. C. A. III) gerührt. Nach dem Filtrieren wurde das Filtrat analysiert und es wurde festgestellt, dass es weniger als 25 mg Antibiotikum ZN-6 enthielt. Der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen und anschliessend mit 100 ml Methanol 2 h lang unter Rückfluss erhitzt, hierauf gekühlt und filtriert. Das Filtrat enthielt etwa 150 mg Antibiotikum ZN-6.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung des neuen, als Antibiotikum ZN-6 bezeichneten Antibiotikums und seiner Salze, dadurch gekennzeichnet, dass der Pilz Fusidium coccineum Fuck K. Tubaki (hinterlegt im Centralbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland) unter aeroben Bedingungen in einem Fermentationsmedium gezüchtet wird, das Kohlehydrate, Stickstoffquellen und geeignete Mengen der anorganischen Salze und andern Stoffe, die für die Ernährung des Pilzes erforderlich sind, enthält, und die Fermentation so lange fortgesetzt wird, bis die Fermentationslösung eine wesentliche antibiotische Aktivität aufweist, und dass dann das auf diese Weise gebildete Antibiotikum ZN-6 gewonnen, konzentriert und in reiner Form isoliert oder mit Hilfe an sich bekannter Umsetzungen in eines seiner Salze umgewandelt wird.
<Desc / Clms Page number 1>
Process for the production of a new antibiotic and its salts
EMI1.1
<Desc / Clms Page number 2>
EMI2.1
The antibiotic ZN-6 is difficult or hardly soluble in water and hexane, but in ethanol,
Acetone, methyl butyl ketone, amyl acetate, chloroform and similar solvents are soluble.
In paper chromatography using the systems described by Bush (Biochemical Journal, Vol. 50 [1952], p. 370), the antibiotic ZN-6 has Rf values of 0.38 and 0.73 in the B (1) and
B (5) system.
With benzene it forms a crystalline benzene solvate, which is soluble in hot benzene, but is only dissolved to a small extent by cold benzene. The solvate mentioned has an mp of 189 to 189.50C.
After drying the solvate at a temperature of 500C and an absolute pressure of
0.01 mm Hg to constant weight, a pure product is obtained which is free from benzene and has a
EMI2.2
at 220 with a molar extinction coefficient of 8000 in ethanol and no characteristic absorption bands above this wavelength.
The pure antibiotic ZN-6 is also characterized by its spectrum in the UR range, as shown in the drawing, from which it can be seen that it has characteristic absorption bands at the frequencies v = 1265, 1385, 1695, expressed in reciprocal centimeters, 1730 and 3450 cm -1 when this determination is made using the potassium bromide method.
Bacteriological investigations have shown that the antibiotic ZN-6 is effective against a number of pathogenic microorganisms, in particular Staphylococcus aureus, Neisseria gonorhoeae including the penicillin-resistant strains, Neisseria meiiingitides, Mycobacterium tuberculoses and the aminosidism-resistant staphylocidic acid, isonicylotinic acid, which is resistant to streptomycin and Corynebacterium diphtheriae is effective.
The particular specific fungicidal and antibacterial activity of the antibiotic according to the invention can be seen from the following table, in which the activity is given as the amount of the sodium salt of the antibiotic ZN -6 in mgXl, which is an age inhibition of the organism in question after the given Duration (in hours) causes:
EMI2.3
<tb>
<tb> organism <SEP> culture medium <SEP> time <SEP> 50% <SEP> inhibitory concentration
<tb> (hours) <SEP> (mg / l)
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> broth <SEP> 24 <SEP> 0.063
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus, <SEP> pencillinase <SEP> producing <SEP> strain <SEP> broth <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 050
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus, <SEP> penicillin-resistant <SEP> laboratory strain,
<tb> the <SEP> not <SEP> penicillinase <SEP> forms <SEP> broth <SEP> 48 <SEP> 0.16
<tb> Neisseria <SEP> gonorhoeae <SEP> blood ascites agar <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP>
<tb> Neisseria <SEP> gonorhoeae, <SEP> penicillin-resistant <SEP> strain <SEP> blood ascites agar <SEP> 24 <SEP> 0.63
<tb>
<Desc / Clms Page number 3>
EMI3.1
<tb>
<tb> organism <SEP> culture medium <SEP> time <SEP> 50% <SEP> inhibitory concentration
<tb> (hours) <SEP> (mg / l)
<tb> Neisseria <SEP> meningitides <SEP> blood ascites agar <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP>
<tb> Haemophilus <SEP> influenzae <SEP> blood ascites agar <SEP> 24 <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> broth <SEP> with <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 16, <SEP> 0 <SEP>
<tb> serum
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> broth <SEP> with <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP>
<tb> serum
<tb> Streptococcus <SEP> zooepidemicus <SEP> Broth <SEP> with <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> serum
<tb> Streptococcus <SEP> agalactiae <SEP> Broth <SEP> with <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 16, <SEP> 0 <SEP>
<tb> serum
<tb> Streptococcus <SEP> lactis <SEP> broth <SEP> with <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 13, <SEP> 0 <SEP>
<tb> serum
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> broth <SEP> with <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 5,
<SEP> 0 <SEP>
<tb> serum
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> broth <SEP> 24 <SEP>> <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Vibrio <SEP> comma <SEP> Broth <SEP> 24 <SEP>> <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Alcaligenes <SEP> faecalis <SEP> broth <SEP> 24 <SEP> 13, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> broth <SEP> 24 <SEP>> <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> broth <SEP> 24 <SEP>> <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP> Broth <SEP> 24 <SEP>> <SEP> 30.0
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> broth <SEP> 24 <SEP>> <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> broth <SEP> 24 <SEP>> <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> broth <SEP> 24 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis, <SEP> Dubos <SEP> 144 <SEP> 0, <SEP> 79 <SEP>
<tb> var.
<SEP> hum.
<tb>
Mycobacterium <SEP> tuberculosis,
<tb> var. <SEP> hum.
<tb> streptomycin-resistant <SEP> strain <SEP> Dubos <SEP> 144 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis,
<tb> var. <SEP> hum.
<tb>
Strain <SEP> resistant <SEP> to <SEP> p-aminosalicylic acid <SEP> Dubos <SEP> 144 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis,
<tb> var. <SEP> hum.
<tb>
Strain <SEP> resistant <SEP> to <SEP> isonicotinic acid hydrazide <SEP> Dubos <SEP> 240 <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> Sabouraud <SEP> 24 <SEP> 100.0
<tb> Tricophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> Sabouraud <SEP> 72 <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> Sabouraud <SEP> 72 <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Clostridium <SEP> perfringens <SEP> thioglycolate medium <SEP> 48 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb>
<Desc / Clms Page number 4>
EMI4.1
<tb>
<tb> Organism <SEP> Culture medium <SEP> Time <SEP> 501o <SEP> Inhibitory concentration
<tb> (hours) <SEP> (mg / l)
<tb> Clostridium <SEP> tetani <SEP> thioglycolate medium <SEP> 48 <SEP> 0, <SEP> 02
<tb> Aetinomyces <SEP> bovis <SEP> thioglycolate medium <SEP> 48 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Corynebacterium <SEP> meat water <SEP> with <SEP> 24 <SEP> 0,
<SEP> 05 <SEP>
<tb> 10% <SEP> serum
<tb>
Clinical tests that have been carried out in connection with the present invention have shown that the antibiotic ZN-6 and certain of its salts meet the requirements for pharmaceutically acceptable antibiotics, since they are useful for the treatment of infectious diseases and especially in treatment those diseases are valuable due to various
Strains of staphylococci, including the penicillin-resistant strains.
For pharmaceutical purposes, the antibiotic ZN-6 can be used as such or in the form of its more or less water-soluble salts with non-toxic inorganic or organic bases.
Aqueous solutions of salts of the antibiotic ZN-6 can be used parenterally, but the salts are preferably administered orally, as they easily get from the gastrointestinal tract into the body fluids, in which an appropriate concentration of the antibiotic can be reached via a can be demonstrated for a satisfactory long period.
This was found in an absorption experiment in which eight people were each subjected to a single oral treatment, in which two capsules, each of which contained 0.250 g of the sodium salt of the antibiotic ZN-6, were administered, followed by the plasma concentrations determined at fixed intervals after ingestion. The results obtained are shown in Table II, in which the numbers indicate the indicated plasma concentration, expressed in y / ml plasma, one and several hours after ingestion.
Table II
EMI4.2
<tb>
<tb> plasma concentrations <SEP> in <SEP> y / ml
<tb> Subject <SEP> hours
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 7 <SEP> 9 <SEP> 12
<tb> Group <SEP> I
<tb> A <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 9, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 2 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 9 < SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP>
<tb> B <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> 3, <SEP> 6 < SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP>
<tb> C <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 5, <SEP> 2 < SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP>
<tb> D <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP> 8, <SEP> 5 <SEP> 9, <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 2 < SEP> 4, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Group <SEP> Il
<tb> E <SEP> 1.6 <SEP> 6.6 <SEP> 8.1 <SEP> 6.6 <SEP> 4.0 <SEP> 3.2 <SEP> 2.4
<tb> F <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 6,
<SEP> 1 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP>
<tb> G <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 12, <SEP> 3 <SEP> 8, <SEP> 6 <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> 3, <SEP> 5 < SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP>
<tb>
In group I, the test subjects received the agent on an empty stomach, whereas it was given to subjects in group II after eating a meal.
In a similar experiment, the mean concentration of the plasma, which was determined 24 hours after the ingestion of the same amount of the agent, was 0.75 μg / ml, which indicates the extremely slow excretion of the substance from the body.
<Desc / Clms Page number 5>
In animal experiments using mice as test animals, a sufficiently low acute toxicity of the antibiotic ZN-6 was observed. The following values for DD, expressed in mg / kg body weight, were found:
EMI5.1
<tb>
<tb> a) <SEP> sodium salt <SEP> of <SEP> antibiotic <SEP> ZN-6 <SEP> 200 <SEP> - <SEP> 250 <SEP>
<tb> administered intravenously <SEP>
<tb> b) <SEP> sodium salt <SEP> of <SEP> antibiotic <SEP> ZN-6 <SEP> 400
<tb> administered subcutaneously <SEP>
<tb> c) <SEP> benzene solvate <SEP> from <SEP> antibiotic <SEP> ZN-6 <SEP>> <SEP> 1500
<tb> administered orally <SEP>
<tb>
Furthermore, in continued toxicological experiments in which the animals, male and female rats, were given the sodium salt of the antibiotic ZN-6 in doses of six days a week
0,
400 g / kg of body weight were treated orally, neither significant differences in weight between the test animals and the control animals, nor any pathological changes caused by this agent were observed, which indicates the absence of chronic toxicity.
The unique properties of the antibiotic ZN-6 were shown to an even more impressive extent in the controlled clinical use of the sodium salt of the antibiotic ZN-6 in
Form of a suitable composition enclosed in gelatin capsules for patients suffering from furunculosis, osteomyelitis and endocarditis.
After oral treatment of the patients at daily or similar intervals as they are appropriate for practical use over a sufficient period of time, it was found that the cures were 100% without the occurrence of side effects or toxic reactions, and even after longer observation periods there were none Relapses noted.
The water-soluble salts of the antibiotic ZN-6 and in particular its sodium salt can be used in clinical treatments.
On the other hand, slightly water-soluble salts of the antibiotic ZN-6 or even the free
Acid can be used for oral administration, with the rate of absorption of the active substance decreasing, so that it exerts its activity preferentially in the gastrointestinal tract itself, which is the case with the
Treatment of certain diseases may be desirable.
Furthermore, the slightly water-soluble salts of the antibiotic ZN-6 can be injected in the form of a suspension of the salt in a suitable medium in order to produce blood levels of the antibiotic which last even longer than those described above.
EMI5.2
Proteins, and appropriate amounts of inorganic salts and other substances necessary for the nutrition of the
Fungus are required, and fermentation is continued until the said solution has achieved substantial antibiotic activity; then the antibiotic ZN-6 formed in this way is obtained, concentrated and isolated in pure form or converted into one of its salts with pharmaceutically acceptable or desired bases with the aid of known reactions.
When carrying out the method according to the invention, the rate of formation of the antibiotic ZN-6 during fermentation is determined by routine evaluation or determination of the activity of the filtered culture, for which purpose the agar plate method can be used, for example by using Staphylococcus aureus as the test organism .
According to the results obtained in the production of antibiotic ZN-6 on an industrial scale, the optimum yield of the substance was obtained in the course of 80 to 100 hours when the fermentation process was carried out at a temperature between 20 and 30 ° C and preferably between 24 and 280 ° C.
However, the specified temperature ranges are not a limitation, since the time required to obtain the stated yields depends to a certain extent on the construction of the fermentation vessel and the type of stirrer or stirrer used.
It should be mentioned in this context that the vessels used were units of the usual size with a content of 10 to 30 m3 of culture medium and were not specifically intended for the production of antibiotic ZN-6.
<Desc / Clms Page number 6>
A large number of the known culture media have proven to be useful as culture media for carrying out the method according to the invention, but those media which are used as a protein source
Corn steeple or soybean meal and contain glucose or sucrose as a source of carbohydrates, preferably.
Yeast extract, glycerine, maltose, fructose, fatty acids, casein hydrolysates, certain amino acids and water-soluble vitamins can be named as other components of a suitable culture medium.
When the production of the antibiotic ZN-6 stops in the fermentation process or when a satisfactory yield has already been achieved, the antibiotic substance can be obtained by a large number of processes.
The first stage of the process advantageously consists in separating the mycelium from the culture fluid, for example by filtration. The antibiotic ZN-6 can be concentrated by treating the culture solution with a solid adsorbent and eluting the substance from this adsorbent, in which case activated carbon or ion exchange resins can be used as adsorbents for this purpose; or else, and this preferably, the culture solution is extracted with a suitable solvent or a suitable solvent mixture, optionally after adjusting the aqueous medium containing the antibiotic ZN-6 to a suitable pH.
Esters, ketones or halogenated hydrocarbons can be mentioned as suitable solvents. In the case of production on a technical scale, however, methyl isobutyl ketone, amyl acetate and butyl acetate in particular have proven to be suitable for the extraction of the fermentation liquor.
When the active substance has been extracted from the fermentation solution, it can be removed by evaporation of the organic phase to a small volume from which the antibiotic ZN-6 precipitates when cooling or by adding a component that reduces the solubility of the antibiotic ZN-6, can be precipitated, and preferably obtained by evaporating the organic phase to dryness and adding benzene in order to obtain the easily crystallizable, abovementioned benzene solvate.
On the other hand, the acidic properties of the antibiotic ZN-6 make it possible to carry out a subsequent extraction of the organic phase with an aqueous alkaline solution or an aqueous suspension of an alkaline compound, with more or less concentrated aqueous solutions of salts of the antibiotic ZN-6 being obtained will.
By acidifying such solutions, the antibiotic ZN-6 can be precipitated or the salt of antibiotic ZN-6 contained therein can, if so desired, be isolated as such.
According to an expedient embodiment of the process according to the invention, the easily crystallizable benzene solvate is prepared directly from the mentioned aqueous solution of a salt of the antibiotic ZN-6, optionally after some of the water has been evaporated, e.g.
B. in a vacuum evaporator, has been removed by the aqueous concentrated solution a sufficient amount of benzene to form the solvate and the solution is then acidified to precipitate the antibiotic ZN-6 in the form of the solvate mentioned, which after isolation and drying yields either the pure benzene solvate or the antibiotic ZN-6 itself, depending on the drying conditions and the temperature used, since at elevated temperatures the benzene is released from the solvate.
With regard to the purification of the antibiotic ZN-6, its ability to form solvates with certain solvents is an important characteristic. So z. B. in another suitable embodiment of the invention, the crude antibiotic ZN-6 dissolved in a small volume of hot methanol, from which the methanol solvate crystallizes out in a surprisingly pure form on cooling, so that for this reason this procedure is particularly useful for obtaining a pharmaceutical applicable quality of the substance is suitable. The methanol solvate mentioned has a melting point of 179 to 179.50 ° C.
If salts of the antibiotic ZN-6 are desired, then these can be achieved by simply neutralizing the antibiotic ZN-6 or one of its solvates with the base in question in the presence of a suitable reaction medium which facilitates the reaction and from which the salt can precipitate or if necessary can be precipitated by adding a suitable component to reduce the solubility of the desired salt, or the salt can be isolated by evaporating the reaction mixture.
On the other hand, a salt of the antibiotic ZN-6 prepared in advance can be used with the
<Desc / Clms Page number 7>
Coming base are reacted, or the desired salt of antibiotic ZN-6 can be prepared by double reaction of a previously obtained salt of antibiotic ZN-6 with another salt which contains the desired metal ion or the desired base.
EMI7.1
Procaine salts.
As other salts that can be prepared by the process according to the invention, for example, those can be mentioned, the base component pyrrolidine, piperazine, guanidine, methylamine, ethylamine, benzylamine or similar unsubstituted or substituted amines, further quaternary
Amines, such as choline and its derivatives, or other antibiotic substances with basic properties, such as
Streptomycin, may be mentioned.
The invention will now be explained in more detail with reference to the following examples.
Example 1: Benzene Solvate of Antibiotic ZN-6.
In a fermentation tank made of stainless steel with a capacity of 1.5 m3, which is equipped with a
Was equipped with a stirrer, 1.00 ni of a culture medium of the following composition was introduced:
EMI7.2
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> kg <SEP>
<tb> Meat <SEP> and <SEP> bone meal <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> kg
<tb> Corn spring water,
<tb> 50% <SEP> dry matter <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> kg
<tb> Glycerin <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> kg <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> kg <SEP>
<tb> MgSO4 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> kg <SEP>
<tb> tap water <SEP> to <SEP> to <SEP> 1000 <SEP> l <SEP>
<tb>
The culture medium had a pH of 6.1 which was adjusted to 6.5 by adding a dilute solution of NaOH, and the medium was sterilized by heating.
After cooling, it was inoculated with 3 liters of a culture of Fusidium coccineum Fuck K. Tubaki which had been grown in a shaker at a temperature of 280 ° C. for 48 hours. The contents of the tank were stirred and aerated at a rate of 0.6 m3 of air per hour at a temperature of 280C for 96 hours. During this period, it was not necessary to adjust the pH to maintain the above-mentioned value of 6.5.
After the fermentation time mentioned, a determination of the antibiotic activity of the culture medium according to the usual agar shell test with Staphylococcus aureus showed that this activity corresponds to a content of 70 mg of antibiotic ZN-6 per liter when compared with the activity of this substance the same method is determined, compared.
The mycelium was separated from the culture medium by filtration; the amount of the filtrate was 700 l. The pH of the filtrate was adjusted to 3.3 by adding a 25% solution of sulfuric acid and the filtrate was countercurrently with 230 l of butyl acetate in a Podbielniak extractor
EMI7.3
Solution of NaOH had been added until a pH of 10, or the aqueous phase had been added, and then the aqueous phase was separated from the butyl acetate phase. The pH of the aqueous phase was adjusted to 3.2 by adding a 25 "solution of sulfuric acid and the resulting solution was extracted with 40 l of methyl isobutyl ketone.
The methyl isobutyl ketone phase was separated off from the aqueous phase, treated with 40 g of activated charcoal and then evaporated to dryness in vacuo at a boiling temperature of 25 ° C. The residue was dissolved in 500 ml of benzene and the solution was allowed to stand in a refrigerator overnight. The benzene solvate of antibiotic ZN-6 crystallized out. It was filtered off and recrystallized from benzene, 12.0 g of the pure sub-
EMI7.4
500 mg of the benzene solvate prepared in the manner described in Example 1 were suspended in 20 ml of water and 0.5N aqueous NaOH was added to the suspension until a pH of 9.0 was reached.
The solution was filtered and 50 ml of n-butanol were added to the filtrate, whereupon the water content of the solution was removed by azeotropic distillation in vacuo. The desired sodium salt was precipitated from the residue by adding ether. It was filtered off with
<Desc / Clms Page number 8>
Ether washed and dried. Recrystallization from ethanol / acetone gave 360 mg of the pure, crystalline sodium salt.
Example 3: Preparation of antibiotic ZN-6.
Fusidium coccineum Fuck K. Tubaki spores were introduced from an agar plate into 3 liters of a sterile nutrient medium of the following composition:
EMI8.1
<tb>
<tb> Glycerin <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g / l <SEP>
<tb> Corn spring water <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g / l <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g / l <SEP>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> g / l <SEP>
<tb> soybean meal <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> g / l <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> g / l <SEP>
<tb> MgSC. <SEP> 7Hp <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g / l <SEP>
<tb> FeS04. <SEP> HO <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> g / l <SEP>
<tb> CUS04. <SEP> 5 <SEP> H2O <SEP> 0.004g / l
<tb>
The culture was incubated under aerobic conditions at 270 ° C. for 40-60 hours in a reciprocating shaker.
The germinal material obtained in this way can be used directly as an inoculant for a fermenter on an industrial scale; In this case, however, the material was placed in a vessel with a capacity of 700 l, which contained a culture medium of the same composition as the fermenter on an industrial scale, and incubated at a temperature of 260C for a period of 40 to 48 hours to cause the development of the vegetative growth of the fungus prior to inoculating the main fermenter.
This was followed by 16,000 liters of a culture medium of the composition
EMI8.2
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 30 <SEP> g / l
<tb> Glycerin <SEP> 5 <SEP> g / l <SEP>
<tb> KH. <SEP> 2H2O <SEP> 5g / l
<tb> NaNO <SEP> 6 <SEP> g / l
<tb> KC1 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g / l <SEP>
<tb> MgS04. <SEP> 7H2O <SEP> 0.5g / l
<tb> ZnSO4. <SEP> 6H2O <SEP> 1 <SEP> mg / l
<tb> yeast extract <SEP> (Difco) <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> g / l,
<tb>
which had been adjusted to a pH value of 7.2 before sterilization was sterilized in the main fermenter at a temperature of 120 ° C. for 1/2 hour and the medium was after cooling with one of the two forms of inoculum mentioned above are inoculated.
While stirring and forcing in air through an inlet opening or a burning contact piece at a rate of 0.05 1 per liter of culture liquid per minute, the mycelium was formed and the fermentation was continued at a temperature of 260C for 4 days.
During the fermentation, the activity of samples of the filtered culture was determined by measuring the zone of inhibition produced by the agar plate method using Staphylococcus aureus as the test organism. As soon as the process was finished, the activity obtained corresponded to a concentration of 150 μg of antibiotic ZN-6 per ml in the culture medium.
Example 4: Preparation of antibiotic ZN-6.
160001 of a culture medium of the composition
EMI8.3
<tb>
<tb> Corn spring water, <SEP> 50% <SEP> 2.5g / l
<tb> soybean meal <SEP> or
<tb> Meat meal <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g / l <SEP>
<tb> sucrose <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP> g / l <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g / l <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> g / l <SEP>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0.5g / l
<tb> MgSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 0.5g / l,
<tb>
<Desc / Clms Page number 9>
which had been adjusted to a pH of 6.80 before the sterilization were sterilized in the fermenter at a temperature of 1200 ° C. for 1/2 hour.
After cooling, the medium was inoculated with the vaccine mentioned in Example 3, and fermentation was continued for 100 hours, whereby a concentration of antibiotic ZN-6 corresponding to a content of 260 μ by the agar dish method was obtained in the culture medium.
Example 5: Production of antibiotic ZN -6.
16,000 liters of a culture medium of the composition
EMI9.1
<tb>
<tb> sucrose <SEP> 60, <SEP> 0 <SEP> g / l <SEP>
<tb> Corn spring water, <SEP> 50% <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> g / l <SEP>
<tb> KH2PO <SEP> 4 <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g / l <SEP>
<tb> MgS04.7 <SEP> HO <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g / l, <SEP>
<tb>
EMI9.2
<Desc / Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb>
<tb>
Base <SEP> Recrystallizes <SEP> from <SEP> Fp <SEP> in <SEP> C
<tb> Triethylamine <SEP> Acetone <SEP> 143 <SEP> - <SEP> 144 <SEP>
<tb> Piperidine <SEP> Acetone <SEP> 155 <SEP> - <SEP> 156 <SEP>
<tb> Morpholine <SEP> Acetone <SEP> 112 <SEP> - <SEP> 114 <SEP>
<tb> Cyclohexylamine <SEP> Acetone <SEP> 180 <SEP> - <SEP> 182 <SEP>
<tb> Dibenzyl-ethylenediamine <SEP> +) <SEP> Ethyl acetate <SEP> 112 <SEP> - <SEP> 113 <SEP>
<tb> Benzyl- <SEP> B <SEP> -phenylethylamine <SEP> +) <SEP> Acetone <SEP> -hexane <SEP> 103 <SEP> - <SEP> 105 <SEP>
<tb> Monoethanolamine <SEP> Acetone-Hexane <SEP> 130-132 <SEP>
<tb> Procaine <SEP> +) <SEP> amorphous
<tb>
+) Slightly soluble in water.
Example 8: Obtaining antibiotic ZN-6 from the fermentation solution.
200 ml of the anion exchange resin Amberlite IRA 401 S (OH) were stirred for 1 hour with three 21 servings of a clarified fermentation solution with a content of 110 μg of antibiotic ZN-6 per ml. While stirring, the pH was kept at 9.5 by adding 2N aqueous sodium hydroxide.
Analyzes of the filtrate indicated that 85% of the antibiotic ZN-6 had been absorbed by the resin. After filtering, the resin was washed with three 1.5 liter portions of water and then in
500 ml of acetone suspended. While stirring, the addition of 6n-
Hydrochloric acid, the pH was lowered to 3.6 and then the resin was filtered off and washed with acetone (twice
100 ml).
The combined filtrates and wash liquors contained 375 mg of antibiotic ZN-6, which was 57% of that in the
Fermentation solution corresponds to the amount present.
Example 9: Obtaining antibiotic ZN-6 from the fermentation solution.
1 l of the clarified fermentation solution containing 500 mg of antibiotic ZN-6 was stirred with 5 g of decolorizing charcoal (S. B. C. A. III) for 1 hour. After filtering, the filtrate was analyzed and found to contain less than 25 mg of antibiotic ZN-6. The filter cake was washed with water and then refluxed with 100 ml of methanol for 2 hours, then cooled and filtered. The filtrate contained approximately 150 mg of antibiotic ZN-6.
PATENT CLAIMS:
1. A method for the production of the new antibiotic called antibiotic ZN-6 and its salts, characterized in that the fungus Fusidium coccineum Fuck K. Tubaki (deposited in the Centralbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland) is grown under aerobic conditions in a fermentation medium containing carbohydrates, nitrogen sources and appropriate amounts of the inorganic salts and other substances necessary for the nutrition of the fungus, and fermentation is continued until the fermentation broth exhibits substantial antibiotic activity, and then in this way formed antibiotic ZN-6 is obtained, concentrated and isolated in pure form or converted into one of its salts with the help of known reactions.