UA143229U

UA143229U - Метод екстракорпорального запліднення з відстроченням перенесення ембріона і використанням мононуклеарних клітин периферичної крові

Info

Publication number: UA143229U
Application number: UAA201407100U
Authority: UA
Inventors: Олександр Фесков; Александр Фесков; Ірина Фескова; Ирина Фескова; Євгенія Жилкова; Евгения Жилкова; Станіслав Жилков; Станислав Жилков
Original assignee: Мезадата Медікал Іп Холдінг Ллп; Мезадата Медикал Ип Холдинг Ллп
Priority date: 2011-11-23
Filing date: 2012-11-21
Publication date: 2020-07-27
Also published as: EP2782993A1; AU2018203649B2; MD4526B1; WO2013078312A1; MD20140060A2; US20220039834A1; AU2012340647A1; IL276077A; EA201490996A1; CA3079719A1; CA2856860A1; CA2856860C; ZA201404498B; EP2782993A4; US11957384B2; US20190110813A1; KR20140113917A; CN110295143A; IL232784A0; US20130172666A1

Abstract

Спосіб екстракорпорального запліднення пацієнтки включає наступні етапи: (a) ініціювання овуляції у пацієнтки для отримання щонайменше одного ооциту, (b) взяття проби крові пацієнтки у проміжок часу від 2 до 4 днів до кінця заздалегідь встановленої відстрочки, що становить щонайменше 2 місяці після дії яких-небудь терапевтичних препаратів на організм або іншого впливу на організм, який робить значний вплив на імунну або ендокринну систему, або репродуктивну функцію пацієнтки, (c) виділення порції МКПК із зазначеної порції крові пацієнтки, (d) культивування зазначеної порції МКПК у поживному середовищі у присутності хоріонічного гонадотропіну людини, (е) введення МКПК у матку пацієнтки після заздалегідь встановленої відстрочки після етапу (а), причому заздалегідь встановлена відстрочка на етапі (е) дорівнює щонайменше двом менструальним циклам або двом циклам овуляції зазначеної пацієнтки, а також (f) введення ембріона у матку пацієнтки після етапу (е) для ініціювання імплантації ембріона в матці, причому зазначений ембріон отриманий шляхом запліднення ооциту, отриманого від зазначеної пацієнтки на етапі (а).

Description

Корисна модель належить до галузі екстракорпорального запліднення, зокрема жінок з пониженою внаслідок аутоїіммунних реакцій репродуктивною функцією. У цьому документі описується метод, який використовується для збільшення частоти настання і стабільності виникнення вагітності шляхом комбінування методів екстракорпорального запліднення, в деяких випадках з тривалою кріоконсервацією ооцитів або ембріонів, отриманих методом ЕКУ, і контрольованої підготовки ендометрія в матці за допомогою мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК), що передує перенесенню ембріона.

Згідно з даними Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я, щороку, більше 15 95 жінок у всьому світі зазнають труднощів із заплідненням і звертаються за медичною допомогою (ВООЗ, 1997), що складало від 60 до 80 мільйонів жінок у всьому світі десять років тому. Згідно із загальним визначенням Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я, безпліддям є відсутність вагітності після факультативного терміну тривалістю за допомогою (ВООЗ, 1997), що складало від 60 до 80 мільйонів жінок у всьому світі десять років тому. Згідно із загальним визначенням

Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я, безпліддям є відсутність вагітності після факультативного терміну тривалістю в дванадцять місяців. Проте, багато пар декілька років намагаються зачати дитину природним шляхом, перш ніж звернутися по медичну допомогу в спробі завагітніти. Зниження репродуктивної функції пов'язане як з медичними, так і з немедичними факторами. Наприклад, було виявлено, що вік жінки є основним прямим фактором, що впливає на середній час, необхідний для запліднення. Було встановлено, що передчасне згасання функції яєчників відбувається у 1 жінки з 1000 у віці до 30 років; у однієї жінки з 250 до 35 років; і у однієї жінки з 100 у віці до 40 років. Таким чином, найвищі показники народжуваності належать до вікової групи від 25 до 30 років і різко знижуються у віці після 35 років. Нині безпліддя є однією з найбільш поширених проблем із здоров'ям, з якими стикається населення у віці від 25 до 45 років. Таким чином, існує величезний інтерес і потреба в підвищенні дітородної функції у здорових жінок з можливістю усунення вікових бар'єрів до дітонародження, а також у жінок, які не можуть завагітніти природними способами. Хоча безпліддя, саме по собі, не може загрожувати фізичному здоров'ю, воно часто серйозно впливає на емоційне, психічне і душевне благополуччя жінок і подружніх пар.

Допоміжні репродуктивні технології є процедурами, які полягають в екстракорпоральній

Зо обробці як жіночих яйцеклітин (ооцитів або яйцеклітин) і чоловічих спермій (сперматозоїдів), так і ембріонів для здійснення запліднення у пацієнтів жіночої статі. Такі процедури включають, але не обмежуються, такими: екстракорпоральне запліднення ("ЕКЗ"), у тому числі перенесення ембріонів, перенесення гамет в маткові труби, перенесення зигот в маткові труби, перенесення ембріонів в маткові труби, кріоконсервація гамет і ембріонів, донорство ооцитів і ембріонів і сурогатне материнство. Екстракорпоральне запліднення ("ЕКЗ") стало основним методом лікування безпліддя або недостатності репродуктивної функції у випадках, коли інші методи допоміжних репродуктивних технологій не дали результату. У найширшому сенсі цей процес включає вилучення жіночої яйцеклітини і запліднення яйцеклітини спермою поза організмом ("іп міїго"). Вказаний процес включає моніторинг процесу овуляції у жінки, вилучення декількох яйцеклітин з яєчників жінки і запліднення яйцеклітини спермою в рідкому середовищі в лабораторії. Яйцеклітини, як правило, вилучають шляхом трансвагінального вилучення ооцитів за допомогою пункції вагінальної стінки для отримання доступу до яєчників під контролем ультразвукового апарата. За допомогою пункції фолікули можуть бути аспіровані, і фолікулярна рідина передається до ЕКЗ лабораторії для виявлення і діагностування яйцеклітини. У нормі вилучається від десяти до тридцяти яйцеклітин з організму кожної пацієнтки. Потім запліднену яйцеклітину, (ембріон), або, як правило, декілька ембріонів, переносять до матки пацієнтки для здійснення успішного запліднення. Дивіться, наприклад, патент США Мо 7781207.

Метод екстракорпорального запліднення був уперше розроблений в 1970 році і до теперішнього моменту став ефективною формою надання допомоги значній частині жіночого населення. Як повідомляється, нині 1,3 95 усіх випадків народження живих дітей в Європі

ІМуадгеп еї аї. 20011 і 1,7 95 усіх випадків народження живих дітей в Австралії |Нитгвї єї аї. 2001.) відбувається в результаті використання ЕКЗ. В результаті використання циклів допоміжних репродуктивних технологій ЕКЗ в Сполучених Штатах Америки, яке почалося в 2006 році, мали місце 41 343 випадки пологів (54 656 новонароджених), що склало трохи більше 1,0 95 від загальної кількості випадків народжень в США у вказаному році. У 2010 році Роберт Здварде здобув Нобелівську Премію по фізіології або Медицині за розробку методу екстракорпорального запліднення. Наступним кроком став метод заморожування, а потім розморожування і перенесення ембріонів, яке вперше було розроблене Карлом Вудом, що значно поліпшило можливість практичної реалізації методу ЕКЗ.

Згідно з рядом зареєстрованих досліджень показники усереднених випадків запліднення, що були досягнуті з використанням методу ЕКЗ, залишаються відносно низькими і знаходяться в діапазоні від 1595 до 2595. Працівники сфери охорони здоров'я визнають, що найбільш значимим обмежуючим чинником, що впливає на запліднення, є нездатність ембріонів імплантуватись до ендометрія - слизової оболонки матки. Відповідно до доповіді Блейка із співавт. перенесення 80-85 95 ембріонів за допомогою ЕКЗ не призводить в результаті до настання вагітності, що становить дуже великий рівень втрати ембріонів. Доповідь Симона із співавт. показала, що у жінок, що приходять ЕКЗ цикли, запліднення було зареєстроване в 60 95 циклів, отже 40 95 усіх ембріонів, перенесених в процесі ЕКЗ, не приживаються.

Одною з можливих причин низького рівня імплантації при використанні методу ЕКЗ, є те, що ембріони переносять до матки через два дні після запліднення, на стадії 4-8 клітин. Існує думка, що, можливо, було б бажано використати ембріони на стадії бластоцисти, яка досягається на 5- 7 день культивації. Перевагами запропонованої можливості є поліпшення синхронізації між ембріоном і маткою, а також можливість відбору ембріонів кращої якості в процесі продовженого періоду культивації.

Перенесення бластоцисти також може допомогти зменшити число багатоплідних пологів в результаті ЕКЗ шляхом відбору меншої кількості високопродуктивних ембріонів для одного перенесення. В процесі здійснення процедури ЕКЗ до матки, як правило, переносять від двох до п'яти ембріонів для збільшення вірогідності імплантації що призводить до ризику багатоплідної вагітності. Таким чином, більше половини дітей, що народжуються в Сполучених

Штатах Америки в результаті використання методу ЕКЗ, з'являються в результаті багатоплідної вагітності. Бувають випадки, коли в матці відбувається багатоплідна імплантація і ембріони продовжують рости і розвиватися в утробі матері, що не в змозі виносити більше одного або двох плодів за один термін. У такому разі приймається важке рішення про припинення такої вагітності і вилучення додаткового плоду або плодів з утроби матері. Вищезгаданий процес називається вилученням ембріона або плоду і є процедурою, що спрямована на зменшення кількості життєздатних ембріонів або плодів при багатоплідній вагітності. Такі рішення призводять як до етичних наслідків, так і до частих психологічних травм. Розробка лабораторних методів, які могли б збільшити вірогідність і реальність імплантації кожного

Зо ембріона, як і раніше є бажаною з ряду вищезгаданих причин.

У процесі, що носить назву природного циклу екстракорпорального запліднення, запліднення здійснюється шляхом вилучення у пацієнтки однієї або більше яйцеклітини, що були отримані природним чином в процесі природного менструального циклу жінки без використання яких-небудь препаратів. У модифікованому природному циклі ЕКЗ застосовуються препарати для лікування безпліддя впродовж двох-чотирьох днів під час природного жіночого циклу для уникнення спонтанної овуляції і отримання успішнішого результату процедур. "Помірне ЕКЗ" є методом, при якому впродовж короткого періоду часу використовується невелика доза препаратів для стимулювання яєчників в процесі природного циклу жінки для отримання 2-7 яйцеклітин і створення здорових ембріонів. Цей метод призводить до скорочення ускладнень і побічних ефектів у жінок, а також націлений на якість, а не кількість яйцеклітин і ембріонів. Проте, цей метод призводить до дуже низького рівня успішної вагітності.

Тому, для збільшення вірогідності настання вагітності зазвичай використовуються додаткові методи. Найбільш поширеним методом є гіперстимуляція яєчників або суперовуляція, що використовується для стимулювання яєчників для отримання декількох яйцеклітин, які потім вилучають з організму пацієнтки. Довгий протокол зазвичай включає десенсибілізацію (пригнічення або виснаження) осі яєчник-гіпофіз шляхом тривалого використання агоніста гонадотропін-вивільнючого гормону (ГнВГ). Подальша гіперстимуляція яєчників, яка, як правило, здійснюється шляхом використання фолікулостимулюючого гормону (ФСГ), починається після закінчення процесу десенсибілізації, зазвичай через 10-14 днів. Цикл ЕКЗ з використанням цього протоколу відомий як традиційне екстракорпоральне запліднення.

Процедура короткого протоколу не включає десенсибілізацію, і складається з режиму прийому препаратів, що сприяють заплідненню для стимулювання росту множинних фолікулів в яєчниках. Під час інших процедур використовують агоніст гонадотропін-вивільнючого гормону (ГнВГ), що зменшує необхідність здійснення контролю шляхом запобігання передчасній овуляції, а останнім часом використовують антагоністи гонадотропін-вивільнючого гормону (ант-

ГнВГ), які виконують аналогічну функцію. У більшості пацієнтів ін'єкційні гонадотропіни (зазвичай аналоги ФСГ) використовуються під суворим контролем. Під час здійснення такого контролю у пацієнток часто перевіряють рівень естрадіолу, а також рівень фолікулярного росту бо за допомогою гінекологічного УЗД. Як правило, потрібно приблизно десятиденний курс ін'єкцій.

Стимуляція яєчників несе ризик надмірної стимуляції яка призводить до синдрому гіперстимуляції яєчників (СГСЯ), - потенційно небезпечному для життя ускладненню, яке полягає в здутті живота, збільшенні яєчників, а також респіраторних, гемодинамічних і метаболічних ускладненнях. Крім того, останнім часом також було продемонстровано, що препарати, що сприяють заплідненню і використовуються для стимуляції овуляції у пацієнток, які проходять процедуру ЕКЗ, сприяють зниженій сприйнятливості імплантації ембріона в матці і призводять до зниження частоти настання вагітності. (Епгеїйа еї аї. 20011.

На жіночу репродуктивну функцію можуть вплинути дисфункції відтворювального тракту, а також дисфункції нейроендокринної або імунної систем. Деякі пацієнтки з онкологічним діагнозом ризикують втратити репродуктивну функцію внаслідок застосування деяких видів хіміотерапії, а також деяких видів променевої терапії, які можуть призвести до передчасної менопаузи і, відповідно, безпліддя. У Західній Європі і Північній Америці ендокринна дисфункція виявляється приблизно у 10-20 95 жінок, що страждають на безпліддя |Стозідпапі еї аї. 2000.

Проте, в 10-20 95 випадків причина безпліддя залишається невідомою. Допускається, що у багатьох таких жінок аутоїммунні реакції організму можуть бути причиною безпліддя.

Репродуктивна аутоїммунна, недостатність і дефекти можуть бути пов'язані із загальною активацією імунної системи або з реакціями імунної системи, які спрямовані безпосередньо проти оваріальних антигенів.

Халлер-Кіккатало пояснює, що для запобігання виникненню самозахисних запальних реакцій в організмі людини на багато сторонніх повітряно-краплинних і харчових антигенів, що зустрічаються на поверхні слизових оболонок організму, потрібні активні механізми толерантності. Проте, найважливішим аспектом толерантності є аутотолерантність, яка запобігає імунній агресії власних тканин організму, що є профілактикою аутоїммунних реакцій.

Аутоімунітет пов'язаний з дисбалансом різних компонентів імунної реакції, а також з розвитком аутоїммунних антитіл, спрямованих проти звичайних антигенів клітини-хазяїна. Жіноча репродуктивна функція регулюється серією високоскоординованих і синхронізованих взаємодій в гіпоталамо-гіпофізарно-наднирковій осі. Синдром репродуктивних аутоїммунних втрат спочатку був описаний Гляйхером в співавт. у жінок, що страждають ендометріозом, безпліддям і збільшеною кількістю аутоантитіл. Попри те, що вплив певних аутоантитіл на патогенез

Зо безпліддя ще не був уніфіковано вивчений, аутоїммунні механізми і підвищене продукування множинних аутоантитіл беруть участь в таких пов'язаних з безпліддям порушеннях, як передчасне згасання функції яєчників (ПЗФЯ), субклінічної недостатності яєчників, невиношування вагітності, ендометріоз, синдром полікистозних яєчників (СПКЯ), безпліддя неясного генезу, неодноразових невдалих спроб ЕКЗ і мимовільних абортів. Деякі дослідження продемонстрували меншу роль специфічних антитіл і підкреслили ключову роль загальної активації імунної системи при зниженій фертильності. (М. СПеїсНнег, 2001; Ютомувкі єї аї!., 1995.

Одна група досліджень була зосереджена на розробці підходів до подолання іммуннологічного безпліддя. Першим і найчастіше використовуваним підходом є використання препаратів, які спрямовані на пригнічення аутоїммунної реакції у пацієнта для забезпечення успішного настання вагітності. Наприклад, для поліпшення частоти настання вагітності у пацієнток з рецидивуючими невдалими спробами завагітніти при використанні ЕКЗ були запропоновані низькі дозування преднізолону в процесі оральної терапії. Проте, існують суперечливі дані, які вказують на те, що певні антитіла ушкоджують ембріони, заважають процесу імплантації або процесу утворення плаценти. Це ускладнює прогнозування успішності терапії при використанні цих певних іммуносупресивних препаратів. Були розроблені методи помірнішої попередньої терапії з використанням ацетилсаліцилової кислоти або гепарину.

Проте, попри те, що такий вид терапії став універсальним, частота настання вагітності в результаті використання такого підходу залишається відносно низькою. |Маднгабу еї а!., 2007).

Нещодавно був розроблений другий підхід. Процедура складається з підготовки як ендометрія, так і середовища, що його оточує, при використанні мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК). ІРц| мага еї а!., КозакКа еї а!., Мо5піокКа еї а! Мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК) дозволяють ендометрію матки рости до достатніх розмірів до моменту імплантації ембріона, а також виступати будівельними блоками в організмі для вирощування ембріона(нів) після їх імплантації до матки жінки. На думку прихильників вказаного підходу, МКПК були визначені як мультипотентні клітини. Мультипотентні клітини виробляють клітини певного типу або близькоспоріднені клітини. Було показано, що вони мають здатність перетворюватися на будь-який вид людської тканини природним чином. Мультипотентні клітини є цінним матеріалом для проведення наукових досліджень і виконання лікувальних процедур.

Останні досягнення в біоінженерії є дуже перспективними в галузі відновлення, будівництва, бо культивації, регенерації, отримання і вирощування тканин.

Заявка на Європейський патент ЕР1581637 описує дорослі моноцитарні стовбурові клітини, які були виділені з периферичної крові ссавців, а також методи підготовки, поширення і використання таких стовбурових клітин. Автори патенту США Мо 7,795,018, М. Кувана і хХ.

Кодамо описують моноцитарні мультипотентні клітини (ММК), які можуть диференціюватися в ендотеліальні клітини в поживному середовищі в умовах, що стимулюють диференціювання в ендотелій. Далі описується спосіб отриманні ММК, який включає культивацію МКПК екстракорпоральним способом на фібронектин і відбір, фібробластоподібних клітин. Було показано, що при культивуванні в ЕБС-2 середовищі, середовищі підтримки ендотеліальних клітин, впродовж семи днів, ММК диференціюються в ендотеліальні клітини зі зміною морфології клітин від форми шпинделя в морфологію, що має безліч проекцій (див. патент

США; Мо 7795018). Дослідники цього винаходу припустили, що використання МКПК може, таким чином, відігравати важливу роль в репродуктивному процесі, і включили використання МКПК до нової техніки екстракорпорального запліднення, що представлена в цьому документі.

Була розроблена група різних препаратів для запліднення, які можуть застосовуватися окремо або в сукупності під час проведення ЕКЗ, в цілях сприяння прийняттю ембріона імунною системою жінки. Одним з таких препаратів є розчинний людський лейкоцитарний антиген с (рлЛлЛА-С), застосування якого представляється перспективним. Клас молекул рЛЛА був визнаний таким, що приймає участь в імунологічній реакції і в модуляції трансплацентарних імунних стосунків під час вагітності. У патентній заявці США Мо 10/829081 Шер із співавт. описують процес ізоляції РЛЛА-с з поживного середовища, яке оточує об'єднані ембріони, що розвиваються, і бластоцисти. Вони відмітили, що відсутність РЛЛА-С в супернатанті, що оточує групи ембріонів при культивуванні, пов'язано зі значно нижчою частотою імплантації при ЕКЗ і настанні вагітності. Вони припустили, що додавання рЛЛА-Сї до середовища, в якому ембріони культивуються і/або доставляються в утробне середовище матки шляхом перенесення ембріонів, збільшить ступінь імплантації і можливості настання вагітності при використанні таких ембріонів. Незважаючи на корисність методу ані цей, ані будь-який інший підхід сам по собі не розв'язав проблему аутоїммунного безпліддя. У цьому документі пропонується використати препарати для запліднення в сукупності з процедурою винаходу, що описується тут, для збільшення вірогідності і успішності настання вагітності.

Зо Нарешті, було продемонстровано, що сконструйовані гліколіпідоподібні молекулярні конструкції здатні модифікувати ембріони і підвищувати взаємодію між ембріоном і тканиною- мішенню - ендометрієм. Створення макромолекулярної матриці на зовнішній поверхні ембріона і завантаження вказаної матриці певними препаратами для стимуляції настання вагітності є методами, які, на думку прихільників такого підходу, матимуть дуже широке застосування в процесі використання методу ЕКЗ в майбутньому. Шляхом використання цього конструктивного підходу модифікація ембріонів не лише була успішно продемонстрована в системі культивації іп міо, але і призвела до народження тваринами здорового потомства, отриманого з таких модифікованих ембріонів. Проте цей підхід ще не пройшов випробування в процесі клінічних випробувань, і розглядати його як сучасний медичний метод доки передчасно.

Безліч досліджень були присвячені процедурам підвищення вірогідності настання успішної вагітності і народження дитини. Незважаючи на значну кількість проведених досліджень, на технічні досягнення і варіативність процедур, частота успішного настання вагітності з використанням методу ЕКЗ, як і раніше, залишається на рівні в середньому від 15 до 25 95 за цикл. Дослідники цього методу спробували вирішувати проблему імплантації ембріона і понизити ризик реакцій аутоїммунної системи, представивши рішення, що орієнтується на стабілізацію взаємодії між жіночою імунною системою і ембріоном.

У найширшому сенсі корисна модель пропонує метод штучного запліднення пацієнтки, який включає стадії введення в порожнину матки ефективної кількості суміші, що містить мононуклеарні клітини периферичної крові, і перенесення щонайменше одного ембріона до матки пацієнтки після заздалегідь визначеного відстрочення початку екстракорпорального запліднення вказаної пацієнтки; цей метод приводить до збільшення вірогідності імплантації ембріона в матці з успішним настанням вагітності в порівнянні з методами екстракорпорального запліднення, що не включають таких стадій. Зумовлене тимчасове відстрочення є періодом часу, достатнім для зменшення аутоіїммунного відторгнення ембріона або ризику аутоіїммунної реакції пацієнтки. Переважна тривалість відстрочення, передуючого перенесенню ембріонів складає не менше двох менструальних циклів або двох циклів овуляції пацієнтки, при цьому тривалість відстрочення варіюватиметься від пацієнтки до пацієнтки, а також залежно від видів, гібридів і порід тварин. Переважна тривалість відстрочення у пацієнта-людини складає від трьох до дванадцяти місяців.

Ще одним аспектом корисної моделі є те, що до кінця періоду часу відстрочення, ендометрій жінки підготовлений так, щоб оптимізувати прийняття ембріона в порожнину матки. Згідно з корисною моделлю, це досягається шляхом внутрішньоматкового введення мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК), які, найприйнятніше, були отримані від пацієнтки. Цей документ відмічає, що даний метод підвищує вірогідність успішного настання вагітності і розвитку вагітності на ранньому терміні. Тимчасове відстрочення імплантації у поєднанні з кріоконсерваціею ембріонів і підготовкою ендометрія жінки за допомогою МКПК є основою корисної моделі.

Зокрема, описуваний спосіб екстракорпорального запліднення пацієнтки включає стадії: (а) отримання, щонайменше одного ооциту, і запліднення ооциту за допомогою сперматозоїдів для утворення зиготи; (б) розвиток зиготи поза організмом до стадії ембріона; (с) кріоконсервація ембріона; (4) очікування заданого періоду часу, достатнього для зниження ризику аутоїммунної реакції пацієнтки; (є) вилучення першої частини мононуклеарних клітин периферичної крові з крові пацієнтки за 2-4 днів до закінчення періоду очікування; (ї) культивація вказаної першої частини МКПК у відповідному поживному середовищі; (9) вилучення другої свіжої порції МКПК з крові пацієнтки в останній день періоду очікування; (п) об'єднання культивованої першої частини МКПК зі свіжою другою частиною МКПК для отримання суміші, що містить свіжі і культивовані МКПК; (ї) введення суміші МКПК до матки пацієнтки; () виведення ембріона із стану кріоконсервації; і (к) перенесення щонайменше одного ембріона, що був:розморожений, до матки пацієнтки для стимулювання вагітності.

Додатковим аспектом корисної моделі є суміш, що містить МКПК, метод отримання такої суміші, застосування суміші МКПК в процесі екстракорпорального запліднення, а також для вирощування і відтворення певної тканини-мішені в організмі, найприйнятніше ендометрія матки жінки. Такий спосіб передбачає вилучення МКПК з крові пацієнтки; репродукування частини вилучених МКПК у 4,8 95-6,0 9о розчині двоокису вуглецю (СО2) при температурі від 36,7 до 37,37 С у живильному середовищі, що містить () середу ВРМІ 1640 з І-глутаміном і бікарбонатом натрію (ії) рекомбінантний людський альбумін і (ії) стимулюючу речовину, що дозволяє підвищити здатність МКІПК до поліпшення росту тканин, таку як хоріонічний гонадотропін людини (ХГЛ); та об'єднання свіжих і культивованих частин МКПК для отриманні

Зо зазначеного складу.

Суть корисної моделі можна зрозуміти чіткіше шляхом визначення деяких термінів, які використовуються в описі і специфікації. "Бластоциста" - це ембріон на п'ятий-шостий день після запліднення, який має внутрішню клітинну масу, зовнішній шар клітин, що називається трофектодермою, і заповнену рідиною сегментаційну порожнину, яка містить внутрішню клітинну масу, з якої розвивається весь ембріон. Трофектодерма є попередницею плаценти. Бластоциста оточена вітеліновим шаром, який згодом виводиться при "дозріванні" бластоцисти. Вітеліновий шар, що складається з глікопротеїнового покриття, оточує яйцеклітину з одноклітинної стадії до стадії розвитку бластоцисти. Перед прикріпленням і імплантацією ембріона вітеліновий шар виводиться з ембріона декількома способами, включаючи протеолітичний розпад. Первинною функцією вітелінового шару є запобігання попаданню в яйцеклітину більш ніж одного сперматозоїда, а потім запобігання передчасному прикріпленню ембріона до його попадання до матки. "Кріогенне ЕКЗ" є процесом запліднення, в якому відбувається кріоконсервація ембріона, який потім розморожується до моменту його перенесення, або процесом, в якому для запліднення використовують ооцит, який раніше був заморожений, а потім розморожений. "Свіже ЕКЗ" є процесом штучного запліднення, в якому ембріон не заморожують до його перенесення до порожнини матки, при якому ооцити, які використовуються для отримання ембріона, раніше не були заморожені. "Ембріон" є продуктом ділення зиготи до закінчення ембріональної стадії, після восьми (8) тижнів, що наступають за заплідненням. Стадія дроблення ембріона триває впродовж перших трьох днів культивації. "Перенесення ембріонів" є процедурою, при якій один або більше ембріонів і/або бластоцисту поміщають до порожнини матки або фаллопієвих труб. Як такі, терміни "бластоциста" і "зародок" використовують тут взаємозамінно для цілей визначення терміну "перенесення ембріонів" і при застосуванні терміну "перенесення ембріонів" у рамках сфери і застосування корисної моделі відповідно до опису.

Термін "ендометрій", що використовується, належить до тканини, яка вистилає внутрішню поверхню матки і складається з шару епітеліальних клітин. Ембріон спочатку вступає в контакт із слизовою оболонкою і позаклітинним матриксом ("слизом") для імплантації. Шар епітеліальних і підстилаючих стромальних клітин товщає циклічно, виділяє слиз і виводиться з бо організму під гормональним впливом менструального циклу. Під терміном "імплантація" слід розуміти приєднання і подальше проникнення бластоцисти (після виведення його вітелінового шару), як правило, в ендометрій. Приєднання до шару ендометрія може відбуватися шляхом взаємодії між приєднувальними молекулами і одним або більше компонентами ендометрія, у тому числі мембран епітеліальних клітин, слизу, муцинових компонентів слизу або компонента матки, що був введений екзогенно. "Запліднення" означає проникнення сперматозоїдів в яйцеклітину і комбінування їх генетичного матеріалу, що приводить до утворення зиготи. Термін "початок екстракорпорального запліднення", що використовується в цьому документі, означає початок контрольованої стимуляції яєчників пацієнтки, що включає фармакологічне лікування, при якому у жінок відбувається стимуляція розвитку множинних фолікулів яєчника для отримання декількох ооцитів в процесі фолікулярної аспірації.

Термін "матка", що часто називається утробою, є основним жіночим гормонально-активним репродуктивним статевим органом більшості ссавців, включаючи людину, який має шийку матки на одному кінці, а інший з'єднується з однією або обома фалопієвими трубами, залежно від виду. Репродуктивна функція матки полягає в прийнятті заплідненої яйцеклітини, яка проходить через матково-трубне співвустя з фалопієвої труби. Вона імплантується в ендометрій і отримує живлення з кровоносних судин, які розвиваються виключно для цієї мети. Запліднена яйцеклітина стає ембріоном, приєднується до стінки матки, створює плаценту і розвивається в плід в процесі вагітності до моменту пологів. У тому значенні, яке він має в цьому документі, термін "матка" включає фалопіеві труби для цілей перенесення ембріона. Термін "матка" також використовується взаємозамінно з терміном "порожнина матки", який означає порожнину тіла матки.

У процесі ЕКЗ відбувається стимульоване продукування і дозрівання ооцитів, що впливає на імунну систему жінки. Перенесення ембріона культивованого за допомогою ЕКЗ, до порожнини матки відразу після вилучення ооцитів може викликати надмірну реакцію імунної системи. Така надмірна реакція імунної системи може стати причиною нездатності організму імплантувати ембріон і призвести до аутоїммунного безпліддя. Перший аспект корисної моделі представляє відстрочення введення ембріона до матки для надання можливості імунній системі жінки стабілізуватися і відновити свій природний гормональний баланс. За час відстрочення, ооцити

Зо або ембріони пацієнтки можуть, на розсуд дослідників, зберігатися за допомогою кріоконсервації.

Період відстрочення, що використовується в корисній моделі, виражається у періоді часу, що був заздалегідь встановлений для кожного конкретного пацієнта. Для людей тимчасове відстрочення може складати будь-який відрізок часу що дорівнює принаймні двом місяцям або двом циклам овуляції. У переважному варіанті заздалегідь встановлене відстрочення дорівнює трьом циклам овуляції, що зазвичай відповідає трьом місяцям. У більшості жінок один цикл овуляції відбувається кожні 28 днів. Слід розуміти, проте, що, оскільки цикли овуляції варіюються від жінки до жінки, число фактичних днів відстрочення змінюється від пацієнтки до пацієнтки в процесі використання ЕКЗ цієї корисної моделі. Цілююм можливо, що пацієнтка матиме тільки два цикли овуляції впродовж трьох місяців, або, так само, що жінка може мати більше трьох циклів овуляції впродовж трьох місяців. У деяких випадках можливо, що у пацієнтки не буде додаткової овуляції після первинної овуляції, що відбувається після початку використання процедури ЕКЗ. Тривалість періоду відстрочення може у подальшому перевищувати три місяці, але переважно повинна дорівнювати періоду від трьох місяців до одного року. Ця заявка демонструє, що заздалегідь встановлений час відстрочення істотно знижує ризик аутоіїммунного безпліддя і, отже, значно підвищує вірогідність успішного настання вагітності.

У рамках корисної моделі присутні варіанти, при яких ооцити або ембріони, що були отримані від жінки або жінок, відмінних від пацієнтки, використовуються для запліднення і носять назву "донорських яйцеклітин" або "донорських ембріонів", відповідно. Це трапляється в ситуаціях, коли в пацієнтки немає овуляції або вона не може продукувати життєздатні яйцеклітини, або в яких ембріони, які отримують шляхом штучного запліднення власних яйцеклітин пацієнтки, мають недостатність для перенесення або мають низьку вірогідність виживання згідно з морфологічним або генетичним тестуванням.

В процесі звичайної процедури ЕКЗ жінкам потрібні гормональні ін'єкції для стимуляції розвитку фолікулів і множинних яйцеклітин. Такий процес стимуляції зазвичай вимагає первинного використання агоніста гонадотропін-вивільнюючого гормону (ГнВГ) для пригнічення функції яєчників для запобігання овуляції до настання бажаного моменту. Найчастіше використовується препарат під назвою цитрат кломіфена (СіотідФ), рецептора естрогену, який бо підвищує вироблення гонадотропінів шляхом інгібірування негативного зворотного зв'язку від естрогену до гіпоталамуса, що є селективним модулятором. Така індукція остаточного дозрівання і виділення ооцитів часто провокується введенням лютеїнізуючого гормону.

Протоколи для цих ін'єкцій добре відомі, встановлені в цій галузі техніки і використовуються у будь-якому з варіантів заявленого способу.

Відповідно до способу корисної моделі незапліднені яйцеклітини відбирають-ї вилучають з організму пацієнтки способами, що є відомими в цій галузі техніки. Такі способи включають введення спеціально розробленої голки до яйцевого фолікула і вилучення рідини, яка містить яйцеклітини. Після вилучення фолікулярної рідини з фолікула яйцеклітини можуть бути перевірені мікроскопічним способом і продіагностовані для спостереження за їх морфологічними особливостями. Один із способів отримання ооцитів для реалізації методу ЕКЗ розкривається в патенті США Мо 4,725,579. У відповідність з цим методом у пацієнтки вилучають шість ооцитів, хоча переважним є отримання чотирьох ооцитів. Після цього яйцеклітини поміщаються до інкубатора. Для запліднення яйцеклітин звертаються до традиційного способу інсемінації або інтрацитоплазматичної ін'єкції сперматозоїда (ІКСІ). Спосіб запліднення, що застосовується, часто оснований на параметрах чоловічої сперми або інших чинниках, таких як тип аналізу, який є необхідним для ембріона. В процесі традиційного запліднення сперматозоїди змішують з яйцеклітинами в чашці для культивації та інкубують впродовж ночі для здійснення запліднення. В процесі інтрацитоплазматичної ін'єкції один сперматозоїд вводиться безпосередньо в одну яйцеклітину. При використанні будь-якого методу, наступного дня проводиться спостереження за яйцеклітиною для оцінки клітинного ділення. Запліднені яйцеклітини, що називаються тепер ембріонами, потім поміщають в певне поживне середовище, що сприяє росту і розвитку.

Відповідно до корисної моделі, ооцити або ембріони, які були отримані в результаті застосування методу ЕКЗ, вирощують у відповідному поживному середовищі. Доступні поживні середовища намагаються забезпечити поживні речовини, необхідні для росту і розвитку клітини, і прагнуть максимально відтворювати умови, які зазвичай існують в жіночій репродуктивній системі. У процесі, що описується, можуть використовуватися поживні середовища, відомі в цій галузі і які Є придатними для екстракорпоральної підтримки розвитку і росту клітин в лабораторних процедурах. Приклади включають, але не обмежуються, людською трубною рідиною (ЛТР) (Ігмпе Зсієпійіс), М-2-гідроксіетилпіперазин-Н'-2-етанове (НЕРЕ5) середовище (Ігуіпе бсієпійіс), ІМЕ-50 (Зсападапаміап ІМЕ 5сієпсеє), 52 (Зсападапаміап ІМЕ 5сіепсе),

С1 їі 22 (Зсападапаміап ІМЕ Зсіепсеє), ОпіїМЕ, ІЗМ-1, ВіазіАввівї, середовище ОТМ (що продається як МЕСІСО ТФ середовище Огідіо А/5), модифіковане середовище Віттена, тб середовище

Віттингема, Е 10 середовище Хема, розчин Ерла. Як правило, пропонуються буферні системи, такі як 4-морфолінопропансульфокислота (МОРБ). Ці процедури добре викладені Трусоном в співавт. (Тгоизоп 6ї аї.) (1980 і 1982 рр.) а також Куінном в співавт. (Оціпп еї а!.) (1985).

Середовища культивації тканини зазвичай є складними системами, що містять безліч амінокислот, вітамінів і інших складових. Деякі середовища складаються зі збалансованих сольових розчинів з додаванням вуглеводних джерел енергії, таких як глюкоза, пірувата і лактата. Середовища також можуть доповнюватися незамінними амінокислотами. Компоненти середовищ часто отримують з джерел нелюдського і нетваринного походження, таких як рекомбінантні мікроорганізми. Бажано вживати заходи для зменшення можливості зараження, такі, як належне очищення і методи підготовки, що практикуються в цій галузі техніки. Крім того, середовища можуть включати антибіотики, такі як пеніцилін або стрептоміцин для знищення бактерій, які можуть вводитися в середовище в процесі збору ооцитів.

В процесі інтракорпорального розвитку в межах жіночої репродуктивної системи; ооцит зароджується усередині, виходить з яєчника під час овуляції і рухається через яйцепровід до матки. Рідина яйцепроводу містить ряд компонентів, що забезпечують живлення такого ооциту і купчастих клітин, які його оточують. Після того, як відбувається запліднення, зигота, що виникає в результаті цього, проходить вниз по яйцепроводу і виходить до матки приблизно через три дні, пройшовши внутрішню трансформацію і відчуває зміни оточуючого середовища. В процесі росту зиготи/ембріона/бластоцисти відбуваються істотні зміни розвитку. Склад рідини, яка оточує ембріон, що розвивається в матці, адаптується до цих змінюваних потреб.

Жодне з середовищ не є настільки ж оптимальним для підтримки гамети, запліднення, дозрівання зиготи і розвитку ембріона, як природне середовище жіночої репродуктивної системи. Таким чином, для застосування на різних стадіях розвитку ембріона був розроблений ряд спеціалізованих середовищ. Наприклад, середовища С1 і 22 були спеціально розроблені для задоволення фізіологічних потреб стадії дроблення ембріона і зародка на 8-ми клітинній стадії аж до стадії бластоцисти. Патент США Мо 6,605,468 ІКобретгізоп вї а! описує середовище бо для розмноження ембріонів на ранніх стадіях аж до стадії бластоцисти. Середовище містить ефективну кількість гранулоцитарно-макрофагальних колонієстимулючих чинників (ГМКЧ) для збільшення процентного співвідношення передбластоцистних ембріонів, які розвиваються до стадії бластоцисти, які готові до перенесення. Описуваний метод також використовується для вирощування людських ембріонів до стадії бластоцисти, які готові до перенесення. В результаті цього методу велика частина ембріонів може бути вирощена до стадії бластоцисти і використана для імплантації в процесі реалізації методу ЕКЗ. Був проведений ряд досліджень з використанням методів культивації, в результаті яких ембріони вирощують спільно з поживними клітинами. |Мепео еї аї., 1990; Ріапсної еї а! 1995| Для стимулювання росту ембріона до середовища можуть бути додані інші стимулюючі фактори, такі як цитокіни, фактор інгібуючий лейкемію (ГІР), див., наприклад, патент США Мо 5,418,159 СоцоН єї аїЇЇ. Фактор інгібуючий "лейкемію, є потужним гормоном, що має загальну корисність в галузі екстракорпорального запліднення, наприклад, при підтримці ліній ембріональних стовбурових клітин і підвищенні ефективності перенесення ембріонів.

Патент США Мо 6,838,235, |Сагапег єї а! передбачає, що замість занурення репродуктивних клітин людини до одного поживного середовища впродовж усього процесу ЕКЗ, репродуктивні клітини можуть бути поміщені в послідовність різних поживних середовищ, в процесі проведення процедури ЕКЗ. Один склад поживного середовища спеціально розробляють для забезпечення фізичного середовища, аналогічного тому, яке існує в жіночому репродуктивному тракті і сприяє росту і розвитку ембріонів. Опис припускає, що спеціалізовані середовища можуть використовувати для вилучення і обробки ооцитів; дозрівання ооцитів; звичайного запліднення; спостереження і біопсії ооцитів, зиготи і ембріонів; ембріонального розвитку до 8- ми клітинної стадії; ембріонального розвитку до стадії бластоцисти; перенесення ембріонів; і кріоконсервації. На додаток до використання загальнодоступних поживних середовищ для підготовки ембріонів, спосіб за корисною моделлю можна комбінувати з іншими методами для збільшення вірогідності і успішності настання вагітності. Був розроблений ряд методів, в яких ембріон яким-небудь чином модифікують до моменту його перенесення до порожнини матки.

Наприклад, Європейський патент ЕР 1765987 (МО 2005121322 АТ) описує ферментативну модифікацію клітинної поверхні Н-антигену шляхом додавання однієї або декількох моносахаридних одиниць, які генерують клітини, що є серологічно еквівалентними А або В

Зо антигенам еритроцитів. Дослідження демонструють, що ембріони мають рецептори, які зв'язуються з гіалуронатом, а також, що на ендометрії матки матері є рецептори гіалуронату.

Вважається, що гіалуронат діє як біологічний клей, який допомагає ембріонові зв'язуватися з ендометрієм і, відповідно, сприяє імплантації. Патент США. Мо 8,183,214 |Сапег єї а! описує спосіб локалізації гіалуронової кислоти на поверхні клітини або багатоклітинної структури (ембріона) для використання в процедурах ЕКЗ. Описуваний метод передбачає вуглеводно- ліпідні конструкції, які міцно вбудовуються в ліпідний подвійний шар або мембрану клітин або ембріонів, міняючи його біологічну активність для поліпшення певних характеристик; таких як характеристики росту, зберігання і виживання ембріона, а також вірогідність імплантації ембріона після його перенесення до матки. Аналогічно, в патенті США Мо 7,819,796 |Віаке еї. а!. описується інша екзогенна підготовлена конструкція для підвищення приєднання і імплантації ембріона. Ембріон модифікують за допомогою гліколіпідів, що мають ліпідні відростки, які вставляються в клітинну мембрану ембріона або вітеліновий шар, в якому гліколіпід був модифікований для впровадження зв'язуючої частини, тоді як зв'язуюча частина адаптується для зв'язування з приєднувальною молекулою. Приєднання ембріона до ендометрія може відбуватися безпосередньо через приєднувальні елементи або через сполучаючі молекули. Ще один метод, протеїнове фарбування, є способам модифікації зовнішніх антигенів клітинних мембран без перенесення генів. Специфікація міжнародної заявки РСТ/О598/15124 (публікація

МО 99/05255) описує поліпшення імплантації шляхом встановлення зв'язку ембріона з ліпідно- модифікованою адгезивною молекулою для модифікації розвитку ембріона. Патент США Мо 13/067,021 описує інший нетрансгенний метод для здійснення ефективних якісних і/або кількісних змін в поверхневих антигенах, виражених клітиною. Синтетичні молекулярні конструкції, що були описані дослідниками, вбудовуються в ліпідний подвійний шар клітини, і передбачається, що таке вбудовування є термодинамічно прийнятнішим. Вказана вище підготовка ембріона, а також інші способи, що практикуються в цій галузі техніки, розглядають в межах корисної моделі, що описується в цій заявці.

В процесі традиційної процедури ЕКЗ ембріони переносять до порожнини матки через два дні після запліднення, коли кожен ембріон знаходиться на 4-риклітинній стадії або через три дні після запліднення, коли ембріон знаходиться на 8-миклітинній стадії. Було визнано, що, можливо, бажано використати ембріони на стадії бластоцисти, яка досягається на п'ятий- 60 сьомий день культивації. Метод ЕКЗ, що описується в корисній моделі, дозволяє переносити ембріон у будь-який момент із спектра розвитку ембріона/бластоцисти. Шляхом візуального спостереження, наприклад, з використанням мікроскопії, бластоцисти або ембріони вважаються готовими до перенесения до матки, коли бластоцільна порожнина чітко видна і складає більше 50 95 обсягу ембріона. У природних умовах, цей етап зазвичай досягається через чотири-п'ять днів після запліднення-незабаром після того, коли ембріон проходить маткову трубу і дістається матки.

Згідно з другим аспектом корисної моделі, винахідники виявили, що введення суміші, яка містить мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК), до матки пацієнтки до перенесення ембріона під час проведення ЕКЗ, поза сумнівом збільшує вірогідність успішної імплантації ембріона до ендометрія матки, що призводить до виникнення життєздатної вагітності. Не переслідуючи мети бути пов'язаними науковою теорією, вважається, що МКПК зміцнюють здоров'я і життєздатність ендометрія жінки і ембріона, який переносять.

МКПК є мультипотентними прогеніторними клітинами, які мають здатність давати потенціал для розвитку клітин з множинної, хоча і обмеженої, кількості клітинних ліній. У кінці довгої серії клітинних ділень, що формують ембріон, утворюються клітини, які є остаточно диференційованими, або які, як вважається, постійно націлені на виконання певної функції.

Завдяки експериментам із стовбуровими клітинами, стовбурові клітини крові можуть виконувати функцію нейронів або клітин мозку - процес, відомий під назвою трансдиференціація.

Використання плюрипотентних стовбурових клітин, узятих з ембріонів, пуповини або ембріональних тканин, що були отримані з яйцеклітин, запліднених методом екстракорпорального запліднення, піднімає етичні і правові питання у випадку з людським матеріалом, створює ризик передачі інфекції і/або може виявитися неефективним, оскільки такі клітини можуть бути відхилені імунною системою реципієнта. Можна стверджувати, що використання МКПК піднімає менше етичних і правових проблем, тому що МКПК є клітинами, які отримують з крові і які не є стовбуровими клітинами, які в той же час все ж мають здатність диференціюватися.

У тому значенні, в якому термін периферична мононуклеарна клітина крові (МКПК) використовується в цій заявці, він означає мультипотентну клітину, яку виділяють, збирають, отримують, ізолюють або іншим чином вилучають з крові пацієнтки. МКПК є клітиною крові, що

Зо має кругле ядро. Клас МКІПК включає, але не обмежується, лімфоцитами, моноцитами і макрофагами. Ці клітини крові є найважливішим компонентом в імунних системах організмів, які використовуються у боротьбі з інфекціями, а також у роботі інших функцій, пов'язаних з імунною системою. Популяція лімфоцитів складається з Т-клітин (204 і СО8 позитивних - 75 95), В- клітин і МК-клітин (7 25 95 комбіновані). Популяція МКПК також включає базофільні і дендритні клітини.

МКПК можуть бути виділені з периферичної крові людини за допомогою поширених методів, відомих в цій галузі. Клітини можуть бути вилучені з цільної крові за допомогою технології

РІСОЇІ Ф (СЕ Неайнсаге Віо-б5сівєпсез АВ, ТОВ, Швеція), гідрофільного полісахариду, який розділяє шари крові на верхній шар плазми, за яким йде шар МКПК і нижня Фракція лейкоцитів, еритроцитів і поліморфно-ядерних клітин (таких як нейтрофіли, еозинофіли). Крім того, поліморфно-ядерні клітини можуть бути далі виділені за допомогою лізису еритроцитів. Рісої! Ф є частиною Рісої-Радие Ф (ЗЕ Неайсаге Віо-5сієпсез АВ, ТОВ, Швеція). РісоІ-Радиє Ф, як правило, розміщують у нижній частині конічної трубки, і кров потім повільно нашаровується згори на РісоїІ-Радие Ф. Після центрифугування, в конічній трубці можна побачити декілька шарів, зверху вниз: плазма і інші компоненти, шар мононуклеарних клітин, МКПК що містить,

ЕісоїІ-Радие ФУ, а також еритроцити і гранулоцити, що присутні у формі гранул. Таке розділення дозволяє легко зібрати МКПК. У шарі МКПК або РісоїІ-Раїдне Ф може відбутися захоплення деяких еритроцитів (наявність еритроцитів і гранулоцитів). У шарі МКПК може іноді відбуватися значне згортання крові. В цілях запобігання згортанню РісоїІ-Радие Ф зазвичай використовують у поєднанні з етилен діамін тетраоцтовою кислотою (ЕДТА) і гепарином. З тієї причини, що нашарування Рісої-РаїдиеФ є дуже повільним процесом, були розроблені пристрої, які допомагають в процесі нашарування, що вимагає найбільшої кількості часу. Одним з таких продуктів є зерМаїе м- 50 (ЄїетсСеї! Тесппоіоду Іпс., Канада), який є спеціалізованою трубкою, що містить пористий вкладень, що утворює фізичний бар'єр між РісоіІ-Радиеф і зразком крові.

Це дозволяє помістити зразок крові, за допомогою піпетки на вставку, усуваючи необхідність у викладенні його безпосередньо на РісоїІ-Радие?Ф. Вкладень берМаїє"М також зменшує тривалість стадії розділення в центрифузі, і після такого розділення, верхній шар, що містить плазму і МКПК, може бути злитий в окремий контейнер. До інших приладів належить стовпчик, що містить пористий поліетиленовий бар'єр високої щільності або "фриту". Ці прилади бо дозволяють крові нашаровуватися набагато швидше без змішування полісахариду і крові.

Прикладом такого продукту є система Ассивріп бузіет Нівіорадие-1077, що продається компанією бідта Аїапсн. Крім того, можна користуватися розподільною системою РісоїІ-Радиеф, що входить до пробірки з вакуумом і використовується для збору крові. Такі пробірки з вакуумом підвищують зручність і безпеку збору препаратів крові, проте є набагато дорожчими в порівнянні із звичайними вакуумними пробірками. Іншим варіантом такої продукції є Ріоайіев "М, який, як було продемонстровано, дозволяє ефективно нашаровувати кров або клітинну суспензію на РісоїФ за допомогою спеціального складу полімерних гранул або кульок. Ця продукція є недорогою, знижує залежність дослідників від устаткування і, насправді, прискорює процес нашарування. Будь-який з вищезгаданих методів, у тому числі інші методи, що використовуються або використовуватимуться в процесі збору, виділення, вилучення, взяття, розподілу, видалення або отримання МКПК з крові організму, людини або тварини, будь-яким іншим способом, розглядаються у рамках варіантів використання корисної моделі.

Одним з аспектів корисної моделі є спосіб культивації клітин МКПК. Цей спосіб полягає в культивуванні клітин на пластинах, що покриті фібронектином в зволоженому середовищі, що містить від 4,8 95 до 6,0 95 двоокису вуглецю (СО2) при температурі в діапазоні від 36,77 С до 37,37 С при щільності від 104 до 107/мл. Переважним є спосіб, при якому МКПК культивують впродовж періоду часу в інтервалі від 46 до 72 годин. Найпереважнішим є культивація МКПК на пластинах, покритих фібронектином в 5,0 95 СО2 середовищі при температурі 37,17 С впродовж 48 годин.

Поживне середовище, що застосовується в цьому методі для розведення вилучених МКПК, є середовищем Меморіального Інституту Розуелла Парка, що є широко відомим як середовище

ВРМІ, яке можна отримати з декількох джерел. Середовище ВРМІ часто використовують для культивації клітин і тканин. Середовище АРМІ 1640 традиційно використовують для росту безсироваткових людських лімфоїдних клітин, клітин кісткового мозку і клітин гібридоми.

Середовище АРМІ 1640 використовує систему буферизації бікарбонату і відрізняється від більшості клітинних поживних середовищ ссавців своїм рН8 складом. Переважне середовище відповідно до способу за корисною моделлю є поживним середовищем АРМІ 1640, що містить -глутамін і бікарбонат натрію.

Відповідно до іншого аспекту корисної моделі, рекомбінантний людський альбумін (РЛА) додають до поживного середовища. РЛА є відомим білком-носієм, присутнім у високій концентрації в плазмі з циркулярним напіврозпадом, що дорівнює, приблизно, 19 добам. Він бере участь в переміщенні жирних кислот до тканин, стабілізації білків, зв'язуванні іонів металів з поверхнями, а також в антиоксидантному ефекті В плазмі. РЛА широко доступний і може бути отриманий від декількох постачальників, наприклад, таких як Момогутевз, Іпс. чи бідта-Аагтісн, б. Додавання РЛА в процесі реалізації способу до поживного середовища має ефект харчової добавки, яка покращує ріст МКПК.

Ще одним аспектом корисної моделі є метод додавання хоріонічного гонадотропіну людини (ХГЛ) в поживне середовище АРМІ 1640. Хоріонічний гонадотропін людини (ХГЛ) вивільнюється в організмі в кровотоку матері під час вагітності за допомогою плацентарних синцитіотрофобласт. Було показано, що вказаний гормон має імуномодулюючу властивість і повідомлено, що введення хГЛ збільшує успішність вагітності, а антисироватки до хГЛ інгібують внутрішньоутробну імплантацію. ХГЛ взаємодіє з певними рецепторами (рецептори лутропін хоріогонадотропіну) і - сприяє підтримці жовтого тіла на початку вагітності, примушуючи його виробляти гормон прогестерон. Прогестерон збагачує матку товстою оболонкою кровоносних судин і капілярів, щоб вона могла витримати ріст ембріона і плоду. Завдяки своєму високому негативному заряду хГЛ здатний відштовхувати імунні клітини матері, захищаючи плід впродовж першого триместру. Також припускають, що хГЛ може служити плацентарною ланкою для розвитку місцевої материнської імунологічної толерантності. Наприклад. хГЛ-оброблені клітини ендометрія викликають збільшення апоптозу Т-клітин (розчинення Т-клітин). Ці результати демонструють, що хГЛ може служити ланкою в розвитку перитрофобластичної імунної толерантності і може сприяти інвазії трофобласта, який відомий своєю здатністю прискорювати розвиток плоду в ендометрії. І(Кауївії співавт., 20031. Крім того, було висловлене припущення, що рівні ХГЛ пов'язані з тяжкістю уранішньої нудоти у вагітних жінок. Мінімальна концентрація ХГЛ в поживному середовищі, що описується у корисній моделі, складає не менше 5 МЕ/мл. В цілях ясності за допомогою цього дослідження було виявлено, що хГЛ в поживному середовищі, який отримують відповідно до корисної моделі, функціонує як активуючий агент, який покращує здатність МКПК посилювати ріст тканин, зокрема ріст ендометрія в процесі методу ЕКЗ корисної моделі. Склади культивованих МКПК і/або поєднань культивованих і свіжих МКПК мають можливість змінювати розмір і сприйнятливість ендометріальної тканини бо пацієнтки при використанні складів МКПК, що передбачаються корисною моделлю. Це приводить до збільшення розміру, зокрема збільшення товщини слизової оболонки матки, а також підвищеній здатності ендометрія зв'язуватися з ембріоном після імплантації.

Метод екстракорпорального запліднення, що описується у корисній моделі, забезпечує використання МКПК, які були отримані описаним способом культивації, для поліпшення процесу настання вагітності. Після отримання ооцитів у пацієнтки, частину МКПК вилучають з крові такої пацієнтки. Цю частину МКІПК потім культивують у відповідному поживному середовищі відповідно до вищевказаного методу для отримання бажаної кількості і якості МКПК. Після певного періоду очікування або відстрочення, що описуються в цій заявці, у пацієнтки вилучають додаткову порції крові, а також свіжу порцію МКПК з крові. Крім того, порція крові, яка була отримана у пацієнтки спочатку, може бути розділена на різні частини, що містять МКПК, з яких одну або декілька культивують, а одну або декілька порцій залишають свіжими. Свіжу порцію переважно отримують в останній день заздалегідь встановленого періоду очікування.

Декілька або усі свіжі МКПК потім об'єднуються з декількома або усіма порціями культивованих

МКПК для отримання суміші, що містить як свіжі, так і культивовані МКПК. Відповідно до корисної моделі переважна концентрація МКПК у суміші МКПК складає від 4 до 5 мільйонів клітин на мілілітр кожної суміші; проте, для роботи в межах обсягу корисної моделі допустимі концентрації до 8 млн. клітин/мл суміші. Суміші можуть додатково змішувати або перемішувати, а також обробляти будь-яким іншим бажаним способом для об'єднання МКПК без їх ушкодження. Ця суміш МКПК потім вводиться, як правило, ін'єкційним шляхом за допомогою катетера, до порожнини матки пацієнтки. Відповідно до корисної моделі, після 20-72 годин, найприйнятніше 24 годин, один або більше ембріонів переносять до матки для імплантації для ініціації вагітності. Дослідниками корисної моделі було продемонстровано, що цей метод дозволяє організму використовувати МКПК як будівельні блоки для збільшення товщини шару ендометрія в матці і, таким чином, зменшення ризику невдалого запліднення.

Важливим є те, щоб МКПК вилучались безпосередньо у пацієнтки в ході реалізації ЕКЗ, що описується в цій заявці. Хоча, діапазон корисної моделі передбачає культивацію частини МКПК, що була відібрана у іншої особи, а не у пацієнтки, що проходить процедуру перенесення ембріонів в процесі реалізації екстракорпорального запліднення. - У такому випадку свіжу порцію МКПК, переважно, отримують у пацієнтки, що проходить перенесення ембріона для

Зо впливу на аутоїммунну реакцію такої пацієнтки.

Діагностика передімплантації як ембріонів, так і репродуктивної системи пацієнтки, є ще одним аспектом корисної моделі. Після проведення діагностики пацієнтки товщина ендометрія, яка зазвичай може вимірюється за допомогою ультразвуку, повинна знаходитися переважно в діапазоні від 9 мм до 11 мм у момент перенесення ембріона.

Зазвичай також проводиться діагностика постімплантації. Наприклад, після двох тижнів, що слідують за перенесенням, проводиться тестування з використанням аналізу крові на ХГЛ (хоріонічний гонадотропін людини) для визначення імплантації одного або більше ембріонів в ендометрій, тобто перевірка результативності процедури на успішність запліднення, а також інші процедури, що відомі в цій галузі техніки. ХГЛ має важливе значення при діагностиці вагітності і умов, що з нею пов'язані, таких як позаматкова вагітність, мимовільний аборт, трисомії 21, молярна вагітність і хоріокарцинома. "Біохімічна вагітність" відбувається тоді, коли вагітність діагностується внаслідок виявлення ХГЛ в сироватці або сечі пацієнтки, але яка не розвивається в клінічну вагітність. Патент США Мо 4,315,908 |(7ег єї а.) описує спосіб виявлення

ХГЛ в сечі за допомогою радіоіїмунологічного аналізу. Патент США. Патент США Мо 8,163,508 (ІО'Соппог вї а!.| надає спосіб і набір інструментів для прогнозування вагітності у пацієнток за допомогою методу ХГЛ через визначення в зразку кількості ізоформи ХГЛ, що пов'язана з ранньою вагітністю. Такі і інші методи діагностики є корисними у межах обсягу корисної моделі.

В цілях здійснення успішного перенесення клінічні дослідники прагнуть виділити ті ембріони, перенесення яких, найімовірніше, приведе до життєздатної вагітності. У деяких варіантах реалізації корисна модель передбачає морфологічне, генетичне і кінетичне тестування ооцитів, бластоцист або ембріонів, що були отримані від пацієнтки і підготовлені екстракорпоральним способом. Методи діагностики включають мікроскопічний фізичний аналіз ембріона для виявлення тих ембріонів, які розвиваються нормальним способом через спостереження морфологічних особливостей ембріона і його генетичного тестування. За допомогою генетичної "передімплантаційоної діагностики" визначають наявність у ембріона генетичних, структурних мМабо хромосомних змін або відхилень шляхом проведення аналізу полярних тілець, бластомерів або трофектодерми. "Передімплантаційний генетичний скринінг" включає аналіз полярних тілець, бластомерів або трофектодерми ембріонів в цілях виявлення анеуплоїдії, мутації і/або реаранжировки ДНК. У цій галузі для діагностики ембріонів відомі, принаймні три 60 основні методи вивільнення ембріона і біопсії. Ці методи включають механічне нанесення розрізу в зоні пелюцида ембріона за допомогою спеціалізованого мікрохірургічного ножа або скляної голки; хімічної дії на частину зони пелюцида кислотою, такої як розчин Тироде; а також видалення зони пелюцида за допомогою лазера, для розділення бластоцисти.

У переважному варіанті реалізації візуальне спостереження за ембріоном за допомогою мікроскопії (наприклад, мікроскоп Мікоп Есіїрзе ТЕ 2000-5) повинне демонструвати певні фізичні або морфологічні особливості ембріона безпосередньо перед його імплантацією до матки. У відповідності з класифікацією Гарднера |Сагапег єї аЇ. 1994), що включається до цієї заявки, міра зрілості бластоцисти встановлюється в діапазоні І АВ-МІ АА, на підставі чого класифікується внутрішньоклітинна маса і товщина шару трофектодерми. Рівень МІ АВ представляє найвищу міру дозрівання бластоцисти, що відповідає сформованій бластоцисті, яка вилуплюється із зони пелюцида.

Генетична діагностика ембріонів може бути виконана за допомогою будь-яких методів, відомих в цій галузі, таких як традиційний метод бактерійних штучних хромосом (БШК) матриксної порівняльної геномної гібридизації і інших подібних до нього методів.

Мікроматичний аналіз, відомий також під назвою мікрочипний аналіз, мікроматриця або мікрочип, став широко використовуватися для експресії генів і інших геномних досліджень, і надає технічні переваги для БШК. Мікроматриця, як правило, виготовляється шляхом нанесення або синтезу нуклеїнової кислоти, комплементарної до відомих послідовностей в геномі на поверхню. Гібридизація ампліфікованої флуоресцентно міченої ДНК (дезоксирибонуклеїнової кислоти) на чипі дозволяє провести оцінку усього генома організму або його частин. Патент США Мо 12/587,406, що повністю включений сюди за допомогою посилання, описує способи екстракорпорального запліднення, при яких генетична діагностика передімплантації усіх 24 хромосом ембріона при ЕКЗ, здійснюється шляхом ампліфікації усього геному і мікрочипового аналізу поліморфізмів. Такий метод включає біопсію ембріона при ЕКЗ, для видалення однієї або декількох клітин, а також вилучення нуклеїнової кислоти з клітин.

Виконання ампліфікації геному в подальшому дозволяє збирати генетичну інформацію про ембріон для прогнозування генетичного здоров'я ембріона на основі отриманої генетичної інформації. Цей метод також дає можливість визначити каріотип ембріона. Після здійснення аналізу ембріонів, останні сортуються за принципом придатності потенційної імплантації до

Зо матки. У різних варіантах здійснення цього методу, при якому здійснюється генетичний аналіз ембріонів, на основі генетичних прогнозів відбирають один або більше придатних ембріонів для імплантації до матки.

Кінетична діагностика ембріона є ще однією важливою процедурою, що є доступною для відбору найбільш здорових і придатних для перенесення ембріонів. Одним з доступних інструментів є цифрова покадрова система моніторингу ембріонів Ргіто Мівіоп (Мітоїїе АВ, м.

Гетеборг, Швеція). Ргіто Мівіоп є системою, що укладається з камери і комп'ютера, призначених для запису зображень ембріонів, що використовуються в процесі циклів екстракорпорального запліднення, в процесі їхнього росту в інкубаторі. Зображення, зроблені камерою, в процесі розвитку ембріонів в чашці для культивації, відображаються на екрані комп'ютера в лабораторії.

Комп'ютерна система забезпечує не лише зображення ембріонів, але і інформацію про характер їх росту. Ця інформація дозволяє ембріологам і лікарям спостерігати за здоровим розвитком ембріонів і виявляти будь-які проблеми з термінами ділення клітин, які можуть виникнути на ранніх стадіях росту. Додатковою перевагою системи Р'іїто Мівзіоп є те, що вона дозволяє робити такі спостереження без вилучення ембріонів з інкубатора. Це дозволяє ембріонам залишатися в контрольованому середовищі, де вони мають тенденцію до швидшого росту. Відповідно до корисної моделі, найбільш придатні ембріони, що підлягають відбору в цілях перенесення, повинні відповідати наступним кінетичним критеріям: коефіцієнт часу рівний 5-12 годинам для ділення з 2-х клітинною до 3-х клітинної стадії; наявність З клітин після 35-40 годин, що ідуть за стадією зиготи; 5 клітин після 48-56 годин, що ідуть за стадією зиготи; 8 клітин до початку третього дня розвитку. Усі клітини мають бути переважно однакового або як можна більше схожого розміру, а рівень фрагментації не повинен перевищувати 5-10 95.

Відповідно до корисної моделі, ооцити, що були отримані від пацієнтки або запліднені ооцити, що розвинулися до стадії придатності ембріона для перенесення, зберігаються впродовж періоду до моменту, коли імунна система пацієнтки стає досить готовою до прийняття ембріона в цілях запліднення, упродовж періоду часу, необхідного для пригнічення аутоїммунної реакції пацієнтки. Більшість пацієнток, по можливості, бажають зачати своє власне потомство, і, отже, хочуть використати свої власні ооцити або ембріони. Тому у більшості поширених випадків, необхідно зберігати ооцити або ембріони конкретної пацієнтки.

У певній групі жінок, що страждають на безпліддя, пацієнтка не здатна продукувати бо яйцеклітини або овулювати, або пацієнтка, що зазнає ановуляцію або олігоовуляцію, отримує донорську яйцеклітину(ни) або ембріон(ни) від іншої пацієнтки в процесі здійснення процедури екстракорпорального запліднення. У такий спосіб передбачається, що у рамках певних варіантів здійснення способу корисної моделі, пацієнтці переносять ембріон, який не був отриманий від неї самої, а був вилучений у іншої пацієнтки, таким чином що пацієнтці переносять донорський ооцит або ембріон в цілях ініціації вагітності.

Також в межах меж обсягу корисної моделі представлені варіанти, коли яйцеклітини або ембріони одного виду переносять іншим видам, які відрізняються від тих, від яких виводяться яйцеклітина або ембріон. Наприклад, ембріон від осла може бути імплантований до матки кобили.

Проте, найбільш поширеним необхідним випадком залишатиметься консервація ооцитів або ембріонів (зазвичай отриманих від самої пацієнтки, але, можливо, і з іншого джерела).

Консервація може забезпечуватися шляхом дії она яйцеклітини або ембріони низькотемпературних умов, наприклад охолодження за допомогою низьких температур, швидкого заморожування і вітрифікації. На відміну від сперми, яка може заморожуватися і успішно використовуватися впродовж багатьох років, яйцеклітини містять велику кількість води, що ускладнює процес заморожування. У разі заморожування яйцеклітин у них усередині можуть утворюватися крижані кристали, здатні зруйнувати клітинну структуру. Для зменшення кількості кристалів льоду, учені видаляють деяку кількість води в процесі повільного заморожування яйцеклітини. Патент США Мо 10/777,149 описує спосіб центрифугування ооцитів або ембріонів (наприклад, собак, кішок, свиней, рогатої худоби, мишей, щурів і мавп) для поляризації цитоплазматичних ліпідів поза ооцитом або ембріональними клітинами, піддаючи ооцити або ембріони низьким температурам у присутності кріопротекторів, що призводить до заморожування ооцитів або ембріонів до моменту ліпідної деполяризації, а потім низькотемпературного зберігання заморожених ооцитів або ембріонів. Проте, раніше було встановлено, що здійснити видалення усієї води неможливо, і, таким чином, формування внутрішньо- і позаклітинного кристалів льоду не може бути відвернене шляхом повільного заморожування. Таким чином, у разі розморожування можливість запліднення ооцитів, підтримка життєздатності ембріона і вірогідність запліднення, з використанням таких повільно заморожених яйцеклітин, є низькою.

Зо Була зроблена спроба швидкого заморожування з використанням кріопротекторів.

Кріопротектором є речовина, яка використовується для захисту біологічних тканин від пошкодження, яке відбувається в результаті заморожування і виникає внаслідок утворення льоду. Кріопротектори діють за допомогою збільшення концентрації розчиненої речовини в клітинах. Для збереження біологічної життєздатності кріопротектори повинні легко проникати до клітин і не бути до них токсичними. Звичайні кріопротектори є гліколями, такими як етилгліколь, пропіленгліколь, гліцерин; 2-Метил-2,4-пентандіол. (МПД); диметилсульфоксид (ДМСО) і сахароза. Гліцерин і ДМСО використовуються кріобіологами упродовж десятиліть для зниження утворення льоду в спермі і ембріонах, які зберігаються за допомогою заморожування в рідкому азоті. Було виявлено, що суміші кріопротекторів мають меншу токсичність і ефективніші, ніж однокомпонентні кріопротектори. Упродовж багатьох років суміш формаміду з ДМСО, пропіленгліколем і колоїдом вважали найбільш ефективним з усіх штучно створених кріопротекторів. Багато кріопротекторів також діють шляхом утворення водневих зв'язків з біологічними молекулами у міру витіснення молекул води. Утворення водневих зв'язків у водних розчинах важливе для правильного функціонування білка і ДНК. Таким чином, у міру того, як кріопротектори заміщають молекули води, біологічний матеріал зберігає свою природну фізіологічну структуру і функцію, попри те, що вони більше не занурюються у водне середовище.

Останнім часом, для збереження ооцитів і ембріонів, біологічних тканин і органів в цілях трансплантації і кріоконсервації застосовується вітрифікація - процес заморожування |і твердіння без утворення кристалів льоду. Деякі кріопротектори функціонують шляхом пониження температури вітрифікації розчину або матеріалу. Таким чином, кріопротектори запобігають фактичному замерзанню, і розчин зберігає деяку гнучкість на етапі вітрифікації.

Попри те, що методи повільного і швидкого заморожування є застосовними, вітрифікація є переважним способом збереження ооцитів або ембріонів відповідно до способу корисної моделі. У процесі вітрифікації яйцеклітина або ембріон заморожується досить швидко так, що кристали льоду не устигають сформуватися. Будь-який відомий спосіб вітрифікації може бути використаний в межах способу корисної моделі для консервації і зберігання. Як правило, ооцит або ембріон спочатку поміщають до резервуара з меншою концентрацією антифризу разом з сахарозою для вилучення води з ооциту або ембріона. Потім ооцит поміщають до резервуара з бо висококонцентрованим антифризом на період, що не перевищує; однієї хвилини для негайного заморожування. Одним з прикладів процесу вітрифікації, що є придатним до використання в межах способу корисної моделі є занурення підтримуваних ембріонів в середовище МедісСий є при 37 "С, а потім в середовище при 22-24 "С, з подальшим зануренням їх в кріотоп або кріоліф контейнері в рідкий азот.

Відповідно до способу ЕКЗ корисної моделі пацієнтка вважається готовою до перенесення ембріона, коли встановлено, що аутоїммунна система пацієнтки відновила гормональний баланс. У такий момент кріоконсервація яйцеклітин або ембріонів, що були отримані в результаті ЕКЗ, припиняється. Відбувається видалення ооциту(тів) або ембріона(нів) з розчину антифризу і їх розморожування. Після розморожування незапліднені яйцеклітини можуть бути запліднені будь-яким з вищеописаних способів за допомогою допоміжних репродуктивних технологій, при яких сперма вводиться безпосередньо до яйцеклітини. Розморожування ембріона відбувається шляхом виведення його з рідкого розчину азоту, занурення в розчин, що має температуру приблизно 37" С, промивання при кімнатній температурі, зворотного поміщення його в розчин при 37 "С. розміщення в поживному середовищі, з подальшим розміщенням в інкубаторі, що підтримує температуру, аналогічну внутрішній температурі жіночої порожнини матки, від 36,8 до 37,2 "С на термін від 5 до 24 годин, найприйнятніше при температурі 37 "С на термін від 5 до 7 години.

Кінцева стадія корисної моделі є процедурою, за допомогою якої один або більше ембріонів вводять до організму пацієнтки для ініціації вагітності. Ця процедура носить назву "перенесення ембріонів" і включає перенесення ембріона до матки, до порожнини матки або фаллопієвих труб. Перенесення ембріонів зазвичай полягає у введенні вилучених ембріонів через шийку матки до порожнини матки пацієнтки з використанням маленького м'якого катетера, що направляється за допомогою ультразвукового зонда. Як вказано вище, відповідно до способу корисної моделі, ендометрій матки пацієнтки готують шляхом введення композиції МКПК до порожнини матки за допомогою відповідного катетера, переважно, щонайменше за 24 години до перенесення ембріона. Ембріон зазвичай міститься в середовищі для перенесення ембріона, наприклад середовищі МедісшцкетМ, і може містити НА5, рекомбінантний людський інсулін, гентаміцин.

Додатковим аспектом корисної моделі є те, що запліднення додатково підтримується

Зо шляхом введення антигенів гістосумісності, таких як розчинний людський лейкоцитарний антиген класу Сх (РЛЛА-С) до системи, що функціонує за принципом комунікаторів "свій-чужий", для допущення позитивного розпізнавання і прийняття ембріона імунною системою жінки. ЛЛА-

С, попередник його розчинної форми, рЛлЛЛА-С, був виявлений дослідниками на передімплантаційних ембріонах і оточуючих поживних середовищах, що були отримані в ході досліджень ЕКЗ. Ці відкриття сформували припущення, що ЛЛА-( є присутнім, починаючи з ранніх стадій вагітності. Також було висунуто припущення про наявність потенціалу ЛЛА-С як індикатора якості ембріонів |Мепісиссі еї а). 1999). Одне з досліджень припускає, що рівні рРЛЛА-

С в передімплантаційній надосадовій рідині ембріонів, можуть представляти і служити доказом наявності позитивних результатів вірогідності ініціації вагітності, діючи як корисний індикатор якості ембріонів, які можуть використовуватися у поєднанні з морфологічним тестуванням критеріїв відбору ембріонів для збільшення вірогідності успішного початку вагітності. У одному із способів проведення процедури, РЛЛА-Сї додають до середовища перенесення ембріона, з переважним виміром концентрації в середовищі перенесення ембріона в діапазоні від 0,175 до 0,350 оптичної щільності (ОЩ), де ОЩ означає оптичну щільність, що вимірюється при довжині хвилі в діапазоні від 400 до 450 нм, зокрема при довжині хвилі 405 нм. Процедура визначення концентрації РЧЛА шляхом виміру оптичної щільності усебічно описується у ряді публікацій

Ідив., наприклад, 5. Маг вї аї!., 20071. рлЛА-С додають до середовища перенесення ембріона, після чого ембріон культивується у вказаному середовищі протягом від 5 до 20 хвилин, прийнятніше протягом приблизно 10 хвилин, безпосередньо перед перенесенням ембріона до матки.

Пов'язаним аспектом корисної моделі є спосіб вирощування, відновлення, регенерації або будь-якої іншої обробки тканини-мішені пацієнтки шляхом вирощування тканини-мішені у присутності суміші МКПК відповідно до процедури, викладеної в цій заявці. Тканину вирощують, поміщуючи тканину у середовище культивованих МКІПК або шляхом культивації із використанням комбінованої суміші свіжих і культивованих МКПК.

Розглядаються процеси, що виконуються як в природних, так і екстракорпоральних умовах.

Одним з варіантів здійснення такого способу є використання ендометрія матки пацієнтки як тканини-мішені. Проте, в патентах США Мо. 7,795,018 і 8,216,838 (Кимапа еї а/!.), показано, що

МКПК визнають мультипотентні клітини, які значною мірою підходять для трансплантації клітин бо в цілях регенерації органів, у тому числі кісток, хрящів, скелетних м'язів, жиру, серцевого м'яза,

судин, ендотеліалію і нейронів. Таким чином, застосування процедури, поживного середовища і суміші відповідно до корисної моделі, що включають сукупність як культивованих, так і свіжих

МКПК за корисною моделлю, може бути значно розширене поза межі здійснення ЕКЗ і процедур з ендометрієм в заявках, що стосуються вирощування, відновлення і регенерації інших тканин, схильних до дії методів з використанням МКПК.

Тут слід зазначити, що концепція і здійснення корисної моделі є найбільш значимими відносно пацієнтів людського роду, проте, можуть застосовуватись і до імплантації ембріонів у найрізноманітніших видів тварин. Корисна модель не обмежується екстракорпоральним заплідненням пацієнток-жінок або імплантацією ембріонів з використанням відстрочення аутоїммунної системи у сукупності з МКПК сумішами. Наприклад, метод може бути використаний для тварин, таких як представники сімейства мишачих, включаючи рудих щурів і домашніх мишей; домашніх тварин, включаючи собак і кішок; а також сільськогосподарської худоби, такої як свині, коні, осли, кози, вівці лами і альпаки, в цілях підвищення живонародження таких тварин. Таке збільшення матиме значні фінансові наслідки в тваринницькій галузі, а також соціальні наслідки в галузі наукових і медичних досліджень і розробок.

Тоді як корисна модель представлена вище в усій своїй повноті, фахівці в цій галузі техніки оцінюють, що він не обмежується вищезгаданим і включає варіанти реалізації, при яких наступні приклади надають подальший опис. Слід розуміти, що в межах обсягу техніки корисної моделі можуть вноситися інші специфічні функціональні модифікації без відхилення від обсягу корисної моделі. Наступні приклади демонструють переваги корисної моделі за допомогою ілюстрації методів і складу корисної моделі, що призначені виключно для демонстрації принципів і способів застосування корисної моделі і таких, що не розглядаються як приклади, які обмежують її обсяг.

Приклади

Наведені нижче приклади пояснюють корисну модель. Для вивчення і зіставлення двох процедур ЕКЗ було проведено дослідження. Перша процедура була названа методом "ЕКЗ з використанням свіжих зразків", а друга процедура отримала назву метод "ЕКЗ з використанням заморожених зразків". Для вивчення ефекту частоти настання вагітності у жінок з безпліддям

Зо або ефекту відстрочення імплантації ембріона або бластоцисти до порожнини матки, після вилучення ооцитів було проведено статистичне порівняння клінічних результатів. Терміни "частота настання вагітності", "клінічна частота настання вагітності" ії "частота імплантації" використовуються тут взаємозамінно, і належать до клінічних вагітностей, виражених у пропорції до 100 циклів перенесення ембріонів. Додатково проводилося дослідження впливу введення внутрішньоматкових мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК) на частоту настання вагітності як для процедури "ЕКЗ з використанням свіжих зразків", так і для процедури "ЕКЗ з використанням заморожених зразків".

Учасники: Було проведено дослідження в цілому ста вісімдесяти (180) жінок, які страждають на безпліддя. До моменту участі в цьому дослідженні кожна з пацієнток раніше проходила дві або більше невдалі процедури "ЕКЗ з використанням свіжих зразків", і принаймні одну невдалу процедуру "ЕКЗ з використанням заморожених зразків". Пацієнтки були розділені на 2 групи по 90 жінок в кожній. Середній вік жінок в першій групі був 35,5243,4 роки. Середній вік пацієнток в другій групі склав 36,5-45,5 років. Стосовно пацієнток були проведені наступні підготовчі процедури:

Процедура ЕКЗ: До пацієнток в обох групах був застосований стандартний протокол ЕКЗ з використанням-ГНВГ (гонадотропін-вивільнюючого гормону) для контрольованої стимуляції яєчників. Період яєчникової стимуляції для кожної пацієнтки дорівнював 10-12 дням. У момент здійснення трансвагінальної пункції середній розмір фолікулів при вимірі дорівнював приблизно 18 мм. Для підтримки лютеїнової фази пацієнтки обох груп отримували Гонал, Менопур і

Хорагон. У кожної пацієнтки було в середньому відібрано від 10 до 12 яйцеклітин. Не менше 80 95 отриманих ооцитів були досить зрілими для здійснення запліднення (етап дозрівання МІЇ відповідно до класифікації Гарднера).

Після здійснення відбору, ооцити культивують в ЕКЗ середовищі Опімегза! (МедіСике, яке можна придбати у ОВІСІО А/5 Согрогаїйоп, Данія), що має концентрацію СО2 в діапазоні 5,5- 5,7 96 при температурі 36,8-37,1 "С. Ооцити потім запліднюють як за допомогою процедури ІКСІ, так за допомогою традиційної процедури ЕКЗ. Метод був вибраний з урахуванням індексу концентрації фертильної сперми, віку пацієнтки, досвіду попередньої невдалої спроби застосування ЕКЗ. У випадках застосування традиційної процедури ЕКЗ, сперматозоїди вводили до ооцитів в середовищі ОпіїМЕ. Зиготи, що утворилися наступного дня, поміщали в бо середу ІЗМ-1. У тих випадках, коли ооцити виходили шляхом трансвагінальної пункції, їх поміщали до середовища ОпіїМЕ. Після запліднення за допомогою процедури ІКСІ, яйцеклітини негайно переносилися в середу ІЗМ-1. Ембріони культивували в ЕКЗ середовищі

МеадібикеОпімегза! впродовж перших трьох днів для дроблення ембріона, а також в середовищі

МеадіСижеВіавіАв5ізїї під час четвертого і п'ятого дня культивації до моменту утворення бластоцисти. Перенесення ембріонів проводилося з використанням середовища Меаібике тм.

Вітрифікація: вітрифікацію застосовували до бластоцист або ембріонів на 5-й день розвитку з використанням стандартного методу МедісСий Ф. Ембріони поміщали у вказані розчини для видалення як можна більшої кількості води. Ембріони, що містяться в кріотоп контейнері, поміщали в рідкий азот. У один контейнер поміщали не більше двох ембріонів. Заморожені ембріони зберігали впродовж періоду від З (трьох) місяців до одного року.

Підготовка МКПК: Мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК) були відібрані у кожної пацієнтки. Перша частина МКПК була відібрана у пацієнтки в день отримання ооцитів відповідно до протоколів методу "ЕКЗ з використанням свіжих зразків" або трьома днями раніше строку перенесення ембріонів до матки відповідно до протоколів "ЕКЗ з використанням заморожених зразків". Спочатку у кожної пацієнтки було отримано 10 мл периферичної крові. Всю кількість (10 мл) периферичної крові змішували з 10 мл середовища Медібий Ф АРМІ 1640 з 1- глутаміном і бікарбонатом натрію, утримуючи сумарний обсяг розбавленої крові, що дорівнював мл. Для виділення МКПК з крові використовували середовище для фракціонування 20 лімфоцитів (градієнт щільності середовища). Обсяг розбавленої крові, що дорівнював 7 мл, наносили на 3 мл середовища градієнта щільності. Після здійснення такого нашарування здійснювали центрифугування нашарованої крові із швидкістю 1500 обертів за хвилину впродовж 30-35 хв для отримання вказаних МКПК. Отримані таким чином МКПК промивали двічі в середовищі ВРМІ шляхом центрифугування впродовж 10 хв із швидкістю 1600 обертів за хвилину при температурі 4 "С. Промиті МКПК переносили до поживного середовища. Поживне середовище складалось з середовища АРМІ 1640 з І-глутаміном і бікарбонатом натрію з додаванням хоріонічного гонадотроціну людини (ХГЛ) і людського рекомбінантного альбуміну (від бідта-АЇдгісй Со, 11). Умови культивації підтримувалися на рівні 5,095 С02 при температурі 37 "С. Період культивації МКПК складав 48-52 години. Після 48-52 годин у тієї ж

Зо пацієнтки відбирали додаткову порцію цільної крові. За допомогою того ж методу відбирали додаткові МКПК. Другу партію МКПК змішували з культивованими МКПК і суміш переносили до порожнини матки пацієнтки за допомогою катетера. Процедура проводиться упродовж короткою періоду часу, що в цілому не перевищує 10-15 хвилин. Обсяг загального складу МКПК для внутрішньоматкового застосування для кожної пацієнтки знаходиться в діапазоні 0,2-0,3 мл.

Розморожування і перенесення ембріонів: У кожної пацієнтки відбирали дві бластоцисти для здійснення перенесення ембріонів. Розморожування проводилося з використанням стандартного протоколу МедіСийе. Ембріони видаляли з рідкого азоту і поміщали у розчин при температурі 37 "С, промивали декількома розчинами при кімнатній температурі, наново поміщали у розчин при температурі 37 "С, а потім поміщали до поживного середовища в інкубатор при температурі 37,1 "С на 6 годин Ембріони культивували в середовищі ВіавзіАввіві

МеаіСие або упродовж 3-4 годин після розмороження. Потім ембріони поміщали до середовища МедібикеШтТМ приблизно на 15 хвилин. Перенесення ембріонів проводили з використанням середовища Медібике.тТМ за допомогою медичних катетерів УЗД контролю компанії СоокКФ).

Процедура ЕКЗ: В обох групах жінок застосовувався метод ЕКЗ. Процедура ЕКЗ:, застосовувана до 1-ої групи жінок, не включала використання МКПК; тоді як процедура ЕКЗ, застосовувана до 2-ої групи, проводилася з використанням МКПК. Курс процедур для кожної з груп жінок складався з двох етапів: - циклу "ЕКЗ з використанням свіжих зразків" і циклу "ЕКЗ з використанням заморожених зразків", як описуються в цій заявці; В день перенесення ембріонів, вимірювана товщина ендометрія знаходилася в межах 9-11 мм у обох груп пацієнток.

Після перенесення ембріонів, усім пацієнткам вводили прогестерон, що є стандартним в процесі ЕКЗ в цілях підготовки ендометрія до імплантації ембріона. Імплантація ембріона була підтверджена проведеними аналізами крові на ХГЛ, які проводять за два тижні після перенесення ембріонів. Клінічна вагітність була підтверджена УЗД через три тижні після перенесення ембріонів.

Обидві групи жінок проходили один цикл "ЕКЗ з використанням свіжих зразків" з перенесенням двох бластоцист. Кожна пацієнтка була досліджена на факт вагітності.

Відсутність запліднення підтверджувалася, коли дослідження демонстрували відсутність клінічної або біохімічної вагітності. У тих випадках, коли цикл "ЕКЗ з використанням свіжих бо зразків" не зміг привести до успішної імплантації ембріона, здійснювався цикл "ЕКЗ з використанням заморожених зразків", при якому заморожені ембріони вводили до порожнини матки пацієнтки після періоду відстрочення в межах 2-3 менструальних циклів після здійснення безрезультатного циклу "ЕКЗ з використанням свіжих зразків", що приблизно дорівнювало трьом (3) місяцям з дати вилучення ооцитів з яєчників пацієнток.

Жінки в 1-ій групі не проходили процедури з використанням МКПК; жінки в 2-ій групі проходили процедури з використанням МКПК відразу після закінчення періоду очікування. В процесі здійснення циклів "ЕКЗ з використанням свіжих зразків", МКПК вводили до матки кожної пацієнтки на другий день культивації ембріонів на 48-52 годину після відбору яйцеклітин. В процесі здійснення циклів "ЕКЗ з використанням заморожених зразків", МКПК вводилися до матки приблизно за 24 години до перенесення ембріонів.

Результати: Застосування методу без використання МКПК в групі пацієнток, що пройшли "ЕКЗ з використанням свіжих зразків", привело до рівня імплантації, що склав 22,2 95 (20 клінічних вагітностей після 90 ПЕ). Використання МКПК під час виконання методу "ЕКЗ з використанням свіжих зразків" привело до збільшення рівня імплантації, що склав 31,1 95 (28 клінічних вагітностей після 90 ПЕ). Застосування методу без внутрішньоматкового перенесення

МКПК в групі пацієнток, що пройшли "ЕКЗ з використанням заморожених зразків" (термін відстрочення, принаймні, З місяці як для групи 71, так і для групи 2), призвело до рівня імплантації, що дорівнював 21,4 95 (15 клінічних вагітностей після 70 ПЕ), тоді як після застосування МКПК, рівень імплантації був майже в два рази вищий і дорівнював 41,9 95 (26 клінічних вагітностей після 62 ПЕ): Загальний показник ефективності для групи 1 (90 пацієнтів без застосування МКІПК) склав 38,995 (35 клінічних вагітностей). Загальний показник ефективності для групи 2 (90 пацієнтів із застосуванням МКІК) склав 60,0 95 (54 клінічні вагітності). Клінічні результати цього дослідження представлені в таблиці 1, що наводиться нижче; Скорочення "ПЕ" означає "Перенесення Ембріонів".

Таблиця 1

Рівень імплантація при здійсненні циклів "ЕКЗ з використанням свіжих зразків" і "ЕКЗ з використанням заморожених зразків", з і без використання МКПК у пацієнток. 0 дата ва КНТ ос вання МКК «ЕКЗ з використанням свіжих! 22,2 90 (20 вагітностей після 90 ПЕ) | 31,1 95 (28 вагітностей після 90 ПЕ) зразків» «ЕКЗ з використанням 21,4 95 (15 вагітностей після 70 ПЕ) | 41,9 95 (26 вагітностей після 62 ПЕ) заморожених зразків» пацієнток) пацієнток)

Таблиця 1 демонструє підвищену частоту настання вагітності, що була досягнута в порівнянні з використанням традиційного методу ЕКЗ із використання власних ПКМК пацієнток при підготовці матки до перенесення ембріонів. Крім того, було доведено, що поєднання

Зо відстрочення або методики "ЕКЗ з використанням заморожених зразків" разом з підготовкою матки пацієнтки до запліднення шляхом введення власних МКПК пацієнтки під час процесу екстракорпорального запліднення, призводить до значного збільшення частоти настання вагітності у жінок, що страждають на безпліддя, в порівнянні з раніше відомими методами ЕКЗ, можливо, в результаті комбінації процедури, яка дозволяє аутоїммунній системі пацієнтки відновити гормональний баланс, а також здійснювати процес в порожнині матки, що має підвищену здатність до імплантації ембріона.

Будь-яке посилання, що застосовується в цьому описі, на "один з варіантів реалізації", "варіант реалізації", "зразковий варіант реалізації" і так далі означає, що конкретна ознака, структура або характеристика, що описуються у зв'язку з варіантом реалізації, включають принаймні один з варіантів реалізації корисної моделі. Використання таких фраз в різних місцях опису не обов'язково належить до одного і того ж варіанта реалізації. Крім того, у разі, коли конкретна ознака, структура або характеристика описуються у зв'язку з будь-яким з варіантів реалізації, стверджується, що вони підпадають під компетенцію фахівця в цій галузі техніки для реалізації такої ознаки, структури або характеристики у зв'язку з іншими ознаками, структурами або характеристиками варіантів реалізації.

Попри те, що варіанти реалізації були описані з посиланням на ряд їх ілюстративних варіантів реалізації, слід розуміти, що численні інші модифікації і варіанти реалізації можуть бути розроблені фахівцями в цій галузі техніки, яка належить до суті і діапазону принципів цього опису. Зокрема, можливе внесення різних змін і модифікацій до складових частин і/або форм комбінації ознак в межах діапазону корисної моделі і формули корисної моделі, що додаються.

На додаток до варіантів і модифікацій в складових частинах і/або формах, альтернативні варіанти використання також є зрозумілими фахівцям в цій галузі техніки.

Claims

ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ

1. Спосіб екстракорпорального запліднення пацієнтки, який включає наступні етапи: (а) ініціювання овуляції у пацієнтки для отримання щонайменше одного ооциту, (5) взяття проби крові пацієнтки у проміжок часу від 2 до 4 днів до кінця заздалегідь встановленої відстрочки, що становить щонайменше 2 місяці після дії яких-небудь терапевтичних препаратів на організм або іншого впливу на організм, який робить значний вплив на імунну або ендокринну систему, або репродуктивну функцію пацієнтки, (с) виділення порції МКПК із зазначеної порції крові пацієнтки, (а) культивування зазначеної порції МКПК у поживному середовищі у присутності хоріонічного гонадотропіну людини, (є) введення МКПК у матку пацієнтки після заздалегідь встановленої відстрочки після етапу (а), причому заздалегідь встановлена відстрочка на етапі (е) дорівнює щонайменше двом менструальним циклам або двом циклам овуляції зазначеної пацієнтки, а також (ЇЇ введення ембріона у матку пацієнтки після етапу (є) для ініціювання імплантації ембріона в матці, причому зазначений ембріон отриманий шляхом запліднення ооциту, отриманого від зазначеної пацієнтки на етапі (а).

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений вплив на організм являє собою контрольовану стимуляцію яєчників.

3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що додатково включає перед введенням МКПК у матку пацієнтки після заздалегідь встановленої відстрочки згідно з етапом (є) етап: () змішування частини МКПК, отриманих із крові пацієнтки на етапі (с), з культивованою порцією МКПК, отриманою на етапі (4), для отримання композиції, що містить свіжі та культивовані

МКК.

4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що додатково включає перед введенням МКПК у матку пацієнтки після заздалегідь встановленої відстрочки згідно з етапом (е) наступні етапи: () забезпечення щонайменше однієї додаткової порції МКПК, вилучених із крові пацієнтки протягом останнього дня заздалегідь встановленої відстрочки, (ї) змішування культивованої порції МКПК зі свіжою порцією МКПК для отримання композиції, що містить свіжі та культивовані МКПК. (ії) факультативне повторення етапу (с) протягом періоду часу, достатнього для отримання бажаної кількості культивованих МКПК, і (ім) факультативне повторення етапу (Її) і (ії).

5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що пацієнтка на етапі (а) відрізняється від пацієнтки на етапі (1).

6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений хоріонічний гонадотропін людини присутній у поживному середовищі для культивування МКПК у мінімальній концентрації 5 МО/мл.

7. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначену першу частину МКПК на етапі (а) культивують у присутності 4,8-6,0 95 розчину двоокису вуглецю (СОг) при температурі 36,7-37,3 С, і придатне поживне середовище містить () середовище АРМІ 1640 з І-глутаміном і бікарбонатом натрію, (ії) рекомбінантний людський альбумін і (їїї) хоріонічний гонадотропін людини (ХГЛ), при цьому мінімальна концентрація ХГЛ у поживному середовищі становить не менше 5 МО/мл.

8. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що першу порцію МКПК на етапі (4) культивують протягом періоду часу в діапазоні від 48 до 72 годин.

9. Спосіб за будь-яким із пп. 3-7, який відрізняється тим, що концентрація МКПК знаходиться в діапазоні від 4 до 8 мільйонів клітин на мілілітр зазначеної композиції.

10. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що температура на етапі (4) становить 37 "С.

11. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вміст двоокису вуглецю на етапі (4) становить бо 5 95 СО».

12. Спосіб за будь-яким із пп. 3-11, який відрізняється тим, що зазначена відстрочка для пацієнтки, яка являє собою людину, становить від З до 12 місяців.

13. Спосіб за будь-яким із пп. 3-12, який відрізняється тим, що об'єм композиції, що вводиться у порожнину матки, знаходиться в діапазоні від 0,1 до 0,3 мл.