KR20140113917A - 배아 이식의 지연이 있는 체외 수정 방법 및 말초 혈액 단핵 세포의 용도 - Google Patents
배아 이식의 지연이 있는 체외 수정 방법 및 말초 혈액 단핵 세포의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
환자의 자가면역계에 의한 배아의 자가면역 거부 효과를 감소시키고 임신의 확률과 성공률을 증가시키기 위하여 난자를 환자로부터 회수하고 적어도 2개월, 바람직하게는 3 내지 12개월 후에 배아를 여성 환자의 자궁 내로 이식하며, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 자궁으로 도입함으로써 배아 착상 이전에 배아 착상을 위하여 자궁 내막을 준비하는, 체외 수정의 방법. 본 절차는 냉동보관 기술과 결합하여 환자의 난자 또는 IVF-생산 배아를 보존한다.
Description
연방 정부가 지원한 연구 또는 개발과 관련한 진술
본 발명은 어떠한 연방 정부 자금을 사용하여 개발된 것이 아니고, 열거된 발명자들에 의해 독립적으로 개발되었다.
선출원
본 출원은, 선출원된 미국 가특허 출원 일련번호 제61/629,651호(출원일: 2011년 11월 23일)의 이익을 주장하는, 선출원된 미국 특허 출원 일련번호 제13/655,257호(출원일: 2012년 10월 18일)의 이익을 주장하며, 이의 주제는 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다.
본 발명의
기술분야
본 발명은, 구체적으로 자가면역 반응의 결과로서 수태력이 감소된 여성에서의 체외 수정(in vitro fertilization) 분야에 관한 것이다. 배아 이식 이전에 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC)에 의하여 자궁 내막의 제어된 준비와 함께, 체외 수정 기술을 선택적으로 난모세포 또는 IVF-생산 배아의 장기 냉동보존과 결합함으로써 임신 개시의 비율과 안정성을 향상시키는데 사용되는 방법을 개시한다.
세계보건기구는 매년 전 세계적으로 여성의 15% 이상은 임신하는데 어려움을 겪고 있으며 의사를 찾는 것을 보고하는데(WHO 1997), 이는 10년 전에 전 세계적으로 6천만 내지 8천만명의 여성인 것으로 추정된다. 불임은 일반적으로 12개월의 임의의 기간 후 임신이 되지 않은 것으로 세계보건기구는 정의한다. 그러나, 많은 커플은 임신하기 위하여 의사를 찾기 전에 자연적으로 임신하기 위하여 여러 해 동안 노력한다. 출산율의 감소는 의료적 및 비의료적 요인과 연관되어 있다. 예를 들어, 여성의 연령은 임신하는데 필요한 평균 시간의 직접적인 주요 결정 요인인 것으로 나타났다. 조기 폐경이 30세 이전 여성에서 1:1000으로 일어나고; 35세 여성에서 1:250; 40세에 1:100으로 일어나는 것으로 나타났다. 그러므로, 25 내지 30세의 연령 그룹에서 출산율이 가장 높고 35세 이후에 급격하게 감소한다. 불임은 현재 25 내지 45세 인구가 직면하는 가증 빈번한 건강 관심사 중 하나이다. 따라서, 건강한 여성에서 출산을 연장하여, 가능한 출산에 대하여 연령과 관련된 장벽을 없애는 방법, 및 자연적인 방법을 통하여 임신할 수 없는 여성에 대하여 많은 관심과 필요성이 존재한다. 불임 그 자체는 신체 건강을 위협하지 않을 수 있지만, 종종 여성 및 커플의 정서적, 정신적 및 영적 안녕에 심각한 영행을 미친다.
보조 생식 기술은 인간의 난자(egg)(난모세포(oocyte) 또는 난자(ova)) 및 정자(sperm, spermatozoa) 모두, 그리고 여성 피험체에 임신시키기 위한 목적으로 배아를 체외에서 취급하는 것을 수반하는 절차이다. 이러한 절차는, 배아 이식, 생식 세포 난관 이식, 접합체 난관 이식, 배아 나팔관 이식, 생식 세포 및 배아 냉동보존, 난모세포 및 배아 기증, 및 인공수정자를 비롯한 체외 수정("IVF")를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 체외 수정("IVF")는 보조 생식 기술의 다른 방법이 실패하였을 때 불임 또는 난임에 대한 주요 치료법으로서 발전하였다. 가장 기본적인 의미에서, 이 방법은 여성으로부터 여성의 난자를 추출하는 단계 및 신체 밖("시험관내")에서 난자를 정자로 수정시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 여성의 배란 과정을 모니터링하는 단계, 여성의 난소에서 다수의 난자를 분리하는 단계 및 실험실의 유체 배지 중에서 정자가 난자를 수정하게 하는 단계를 포함한다. 난자는 보통 난소에 도달하도록 질 벽을 관통하는 초음파 유도 바늘을 수반하는 질경유 난모세포 채취에 의해 환자로부터 회수된다. 이 바늘을 통해, 여포가 흡입될 수 있으며, 여포액은 난자를 식별하고 진단하기 위해 IVF 실험실로 넘겨진다. 각각의 환자에서 10 내지 30개의 난자를 분리하는 것이 일반적이다. 그 다음, 수정란, (배아), 또는 일반적으로 다수의 배아는 성공적으로 임신시키기 위한 의도로 환자의 자궁으로 이식된다. 예를 들어, 미국 특허 제7,781,207호를 참조한다.
1970년대 처음 개발된 체외 수정은 지금까지 대부분의 여성을 위한 효과적인 형태의 지원을 제공하여 왔다. 현재, IVF는 유럽에서 모든 정상 출산의 1.3%를 차지하고[Nygren 등 2001], 오스트랄라시아에서 모든 정상 출산의 1.7%를 차지하는 것[Hurst 등 2001]으로 보고된다. 미국에서, 2006년에 시작된 보조 생식 기술 IVF 주기는 41,343건의 출산(54,656명의 유아)을 가져왔으며, 이는 그 해 전체 미국 출산의 1.0%를 약간 초과하였다. 2010년에, Robert Edwards는 논문 [Physiology or Medicine for the development of in vitro fertilization]으로 노벨상을 수상하였다. 다음 단계는 배아를 냉동시키고, 그 후 해동하며, 이식하는 능력이었고, 이는 처음에 Carl Wood에 의해 개척되었으며, 이는 IVF 시술의 실현가능성을 상당하게 개선하였다.
체외 수정 기술 이전에 얻은 전형적인 성공적 임신율은 보고된 연구 수에 기초하여, 15% 내지 25%의 범위로 비교적 낮은 상태이다. 수정에 대한 가장 중요한 제한 요인은 자궁의 내벽인 자궁내막으로의 배아의 착상 실패인 것으로 보건 전문가는 널리 인정한다. Blake 등은 배아의 80 내지 85%가 IVF 환자로 이식 후 임신하는데 실패하고, 이는 배아의 엄청난 낭비를 가져온다고 보고한다. Simon 등은 IVF 주기를 겪는 여성에 있어서, 착상은 주기의 60%로 발견되었고, 그러므로 IVF 동안 이식된 모든 배아에 있어서 40%가 착상하지 못하였음을 입증하였다.
IVF 동안 낮은 착상률에 대한 한 가지 가능한 이유는 배아가 4 내지 8 세포 단계에서 수정하고 2일 후에 자궁으로 이식되는 것이다. 하나의 견해는 배양 5 내지 7일째 도달된 배반포 단계에서 배아를 사용하는 것이 더 바람직할 수 있다는 것이다. 제안된 이점은 배아와 자궁 사이에서의 동기화의 개선, 및 더 긴 배양 기간에 걸쳐서 더 나은 품질의 배아를 선택할 수 있는 능력을 포함한다. 배반포 이식은 또한 이식 당 더 적은 수의 매우 수용성(competent)인 배아를 선택하게 함으로써 IVF로부터 생기는 다태 수를 감소시키는 것을 도울 수 있다. 전형적으로 IVF 절차 동안, 착상 가능성을 증가시키기 위하여 2 내지 5개 배아가 자궁으로 이식되는데, 이는 다태 임신의 위험을 만든다. 결과적으로, IVF 시술 후 미국에서 태어난 모든 아기의 절반 이상은 다태 임신으로 생겼다. 때때로 다중 착상이 자궁에서 일어나며, 배아가 계속 성장하고 자궁 내에서 발달하므로 환자는 하나 또는 둘 이상의 태아를 출산 예정일까지 임신하고 있을 수 없는 경우가 있다. 그 때, 이러한 임신을 종료시키고 자궁에서 추가적인 태아 또는 태아들을 꺼내는(이 과정은 배아 또는 태아 감소라고 불리며, 다태 임신에서 생존 가능한 배아 또는 태아의 수를 감소시키는 절차) 어려운 결정이 이루어진다. 이와 같은 결정은 이와 함께 윤리적이면서 종종 심리적 외상성 영향 모두를 수반한다. 각각의 배아의 착상 확률과 확실성을 증가시킬 실험실 기술의 개발은 상기 언급한 많은 이유로 여전히 요구된다.
자연주기 체외 수정라 불리는 과정에서, 수정은 어떠한 약물을 사용하지 않고 여성의 자연적인 월경 주기 동안 환자로부터 하나 이상의 자연적으로 선택된 난자를 수집함으로써 실행된다. 변형된 자연주기 IVF에서, 자연 배란을 방지하고 시술이 더 성공적으로 이루어지도록 불임치료 약제가 여성의 자연주기 중 2 내지 4일 동안 사용된다. "저자극 IVF"는 2 내지 7개의 난자를 생산하고 건강한 배아를 만드는 것을 목표로 하여 여성의 자연주기 중 단기간 동안 적은 용량의 난소 자극 약물을 사용하는 방법이다. 이 방법은 여성에 대하여 합병증과 부작용을 감소시키는 것으로 보이며, 난자와 배아의 양이 아닌 질에 목표를 둔다. 그러나, 이 방법은 임신의 매우 낮은 성공률을 가져온다.
그러므로 임신의 가능성을 증가시키기 위하여 추가적인 기술이 통상적으로 사용된다. 난소를 자극하여 다수의 난자를 생산하고 그 다음 다수의 난자를 환자로부터 회수하기 위하여 사용되는 난소 과자극 또는 과잉 배란이 가장 일반적이다. 장기 프로토콜은 전형적으로 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotropin releasing hormone; GnRH) 작용제의 장기간 사용에 의한 뇌하수체 난소계(pituitary ovarian axis)의 하향 조절(억제 또는 고갈)을 포함한다. 일단 일반적으로 10 내지 14일 후에 하향 조절 과정이 완료되면, 전형적으로 여포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone; FSH)을 사용하여 후속 난소 과자극이 시작된다. 이 프로토콜을 사용하는 IVF 주기는 종래의 체외 수정로 알려져 있다. 단기 프로토콜은 하향 조절 절차를 생략하고, 난소의 다수의 여포 발달을 자극하는 불임치료 약제 요법으로 이루어진다. 다른 절차는 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 작용제(GnRHA)를 사용하는데, 이는 조기 배란을 예방함으로써 모니터링에 대한 필요성을 감소시키며, 더 최근에는 유사한 작용을 가지는 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 길항제(GnRH Ant)가 사용되어 왔다. 대부분의 환자에서, 주사가능한 성선 자극 호르몬(일반적으로 FSH 유사체)은 밀접한 모니터링 하에서 사용된다. 이와 같은 모니터링은 환자의 에스트라디올 수준, 및 부인과 초음파에 의해 여포 성장을 자주 확인한다. 전형적으로 주사하고 대략 10일이 필요하다. 난소 자극은 난소 과자극 증후군(ovarian hyperstimulation syndrome; OHSS)으로 이어지는 과도한 자극, 잠재적으로 생명을 위협하는 합병증인 복부 팽만, 난소 비대, 및 호흡, 혈역학적 그리고 신진대사 합병증의 위험을 가진다. 추가적으로, 최근에는 또한 IVF 시술을 받은 환자의 배란 자극에 사용된 불임치료 약물이 자궁에서 배아의 착상 수용성 약화에 기여하고, 임신 개시 비율의 감소로 이어진다는 것이 입증된 바 있다[Ertzeid 등 2001].
여성의 수태력은 생식관, 신경 내분비계, 또는 면역계의 기능 장애에 의해 영향을 받을 수 있다. 특정 종류의 화학 요법 치료, 및 특정 유형의 방사선 치료가 일부 여성 암 환자를 불임으로 만드는 조기 폐경을 가져올 수 있기 때문에 상기 일부 여성 암 환자는 수태력을 상실할 위험이 있다. 서유럽과 북미에서, 내분비 기능 장애는 불임을 나타내는 여성의 약 10 내지 20%로 확인된다[Crosignani 등 2000]. 또한, 약 10 내지 20%의 경우에서, 불임의 원인은 알려져 있지 않다. 신체의 자가면역 반응은 많은 이와 같은 여성에서 불임의 원인이 될 수 있는 것으로 가정된다. 생식 자가면역 기능 부전 및 결함은 면역계의 전반적인 활성화 또는 구체적으로 난소 항원에 대하여 지시되는 면역계 반응과 연관될 수 있다.
Haller-Kikkatalo는 활성적인 관용 매커니즘이 신체의 점막 표면에서 접하는 다수의 외래 공기 매개성 및 식품 항원에 대한 신체 내 자기 방어적 면역 반응을 방지하는데 필요하다고 설명한다. 그러나, 관용의 가장 중요한 측면은 자기 관용인데, 이는 자신의 조직에 대하여 신체가 공격을 개시하고 면역 공격을 하는 것을 예방하며 - 곧, 이는 자가면역 반응의 예방이다. 자가면역은 면역 반응의 다양한 요소의 불균형 및 정상적인 숙주 항원에 대하여 지시되는 자기 항체의 발생과 연관되어 있다. 여성 수태력은 시상하부-뇌하수체-난소계에서 일련의 매우 조직화되고 동기화된 상호 작용에 의해 조절된다. 생식 자가면역 기능 부전 증후군은 원래 자궁내막증, 불임 및 자가 항체의 증가가 있는 여성에 있어서 Gleicher 등에 의해 설명되었다. 불임의 발생에 대한 특정 자가 항체의 영향은 아직 균일하게 이해되지 않지만, 자가면역 메커니즘뿐만 아니라 다수의 자가 항체의 생성 증가가 조기 폐경(premature ovarian failure; POF), 무증상 난소 부전, 습관성 유산, 자궁내막증, 다낭성 난소 증후군(polycystic ovary syndrome; PCOS), 원인 불명의 불임, 반복적으로 성공하지 못한 IVF 시도, 및 자연 유산으로서 이와 같은 불임 장애에 수반된다. 일부 연구는 특이적 항체의 중요성이 더 낮은 것을 시사하였으며, 생식력의 감소에 있어서 면역계의 전반적인 활성화의 중요한 역할을 강조하였다[N. Gleicher, 2001; Dmowski 등, 1995].
연구 그룹은 면역 관련 불임을 극복하는 접근법의 개발에 초점을 맞추었다. 처음이면서 가장 일반적으로 사용된 접근법은 임신의 개시를 가능하게 하기 위하여 환자에서 자가면역 반응을 억제하는 것을 목표로 하는 약제의 사용이다. 예를 들어, 저용량 경구 프레드니솔론 치료는 반복적으로 IVF를 실패한 환자에서 임신율을 개선시기기 위해 제안되었다. 그러나, 특정 항체가 배아를 손상시키고, 착상 공정을 방해하거나 태반의 형성을 방해하는 것을 나타내는 모순되는 데이터가 존재한다. 이는 이러한 특정 면역 억제 약제를 사용하는 치료의 성공을 예상하는 것을 어렵게 한다. 아세틸살리실산 또는 헤파린을 이용한 더 가벼운 전처리를 사용하는 방법이 개발되었다. 그러나, 이러한 처치(treatment)가 일반적으로 보편적인 것으로 되었지만, 이러한 접근법을 사용하는 임신율은 비교적 낮게 유지된다[Maghraby 등, 2007].
2번째 접근법은 최근에 발표되었다. 절차는 자궁내막과 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)에 의한 자궁내막의 주위 환경 모두의 제조를 포함한다[Fujiwara 등, Kosaka 등, Yoshioka 등]. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 자궁의 내막이 배아 착상 전에 충분한 크기로 성장하게 할 수 있으며, 또한 여성의 자궁 내에서 배아의 착상 후 배아(들)이 성장하기 위하여 신체에 의한 빌딩 블록으로서 작용한다. 제안자들에 따르면, PBMC는 다분화능 세포로서 확인되었다. 다분화능 세포는 특정 계통 또는 밀접하게 관련된 군의 세포를 생산한다. 다분화성 세포는 임의의 종류의 인간 조직으로 자연적으로 형질전환될 능력을 가지는 것으로 밝혀졌다. 다분화능 세포는 연구 및 치료적 처치를 위한 귀중한 자원이다. 생명 공학에 있어서 최근의 발전은 조직의 보수, 형성, 조작(engineering), 재생, 생성 및 성장에서 매우 유망하다.
유럽 특허 출원 EP 제1581637호는 포유동물의 말초 혈액으로부터 단리된 단핵백혈구 유래 성체 줄기 세포 및 이들 줄기 세포를 제조, 증식 및 사용하는 방법을 개시한다. 미국 특허 제7,795,018호의 발명자인 M. Kuwana 및 H. Kodamo는, 내피로 분화를 유도하는 조건 하에서 배지 배양에 의해 내피 세포로 분화할 수 있는 단핵백혈구-유래 다분화능 세포(monocyte-derived multipotent cell; MOMC)를 개시한다. 피브로넥틴 상에서 PBMC를 시험관내 배양하는 단계와 섬유아세포 유사 세포를 수집하는 단계를 포함하는 MOMC를 제조하는 방법이 추가로 개시된다. 7일 동안 내피 세포의 보존 배지인 EBM-2 배지에서의 배양에 의하여, MOMC는 방추형으로부터 다수의 돌기를 가지는 형태로 세포 형태를 변화시키는 내피 세포로 분화하는 것이 입증되었다(미국 특허 제7,795,018호 참조). 본 발명의 연구자들은 그러므로 PBMC의 사용이 생식 과정 동안 중요할 수 있음을 가정하였고, PBMC의 사용을 본 명세서에서 제공되는 체외 수정의 신규한 기술로 통합시켰다.
다양한 개시제의 군이 개발되었으며, 이는 여성의 면역계에 의한 배아의 수용을 촉진시키기 위하여 IVF 시술 동안 개별적으로 또는 조합하여 적용될 수 있다. 이러한 제제들 중에서 가용성 인간 백혈구 항원 G(sHLA-G)가 유망한 것으로 보인다. 분자의 s-HLA 부류는 임신 동안 모체-태아 면역 관계의 조절 및 면역 반응에 수반되는 것으로 인식되어 왔다. 미국 특허 출원 제10/829,081호에서 Sher 등은 모아진 발달 중의 배아 및 배반포를 둘러싸는 배양 배지로부터 sHLA-G를 단리하는 것을 개시한다. 이들은 배양 중 배아의 군을 둘러싸는 상청액 중 sHLA-G의 부재 시 상당하게 감소된 IVF 착상 및 임신율과 연관되어 있는 것을 관찰하였다. 이들은 배아가 배양되고/배양되거나 배아 이식을 통하여 자궁 환경으로 전달되는 배지에 sHLA-G를 첨가하는 것이 배아의 착상과 임신 잠재력을 향상시킬 것임을 제안하였다. 기술이 유용하긴 하지만, 이러한 접근법도 임의의 다른 접근법도 단독으로는 자가면역 불임의 문제점을 해결하지 않았다. 본 명세서에서 이와 같은 개시제는 임신 개시의 가능성과 성공을 개선하기 위하여 본 명세서에서 본 발명의 절차와 함께 사용될 수 있음을 제안한다.
마지막으로, 조작된 당지질-유사 분자 구조체는 배아를 변형시키고 배아와 표적 조직인 자궁내막 사이의 상호 작용을 향상시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 배아의 외부 표면 상에서 거대-분자 기질의 형성 및 임신 개시의 자극을 위한 임의의 제제와 상기 기질의 로딩은 제안자에 따라서 장래에 IVF 시술에 있어서 매우 광범위한 적용을 가질 기술이다. 이러한 구조적 접근법에 의한 배아의 변형이 시험관내 배양 시스템에서 성공적으로 입증되었을 뿐만 아니라, 동물은 이와 같은 변형된 배아로부터 유래된 건강한 새끼를 출산하였다. 그러나, 이러한 접근법은 임상 시험에서 아직 시험되지 않았으며 현재 의학적 도구 중에서 고려될 조산 상태가 남아 있다.
많은 연구는 성공적인 임신 및 아이 출산의 확률을 개선하기 위한 절차들로 지시되었다. 절차에서 상당한 연구, 기술적 진보 및 변화에도 불구하고, IVF 시술을 이용한 성공적인 임신율은 여전히 평균적으로 주기당 약 15 내지 25%이다. 본 명세서에서 연구자들은, 여성 면역계와 배아의 상호작용을 안정화시키는데 초점을 맞춘 해결책을 제시함으로써 자가면역계 반응의 위험을 감소시키고 배아 착상의 도전을 해결하도록 시도하였다.
본 발명의 가장 넓은 의미에서, 여성 환자에 대한 체외 수정 방법이 제공되며, 상기 방법은 말초 혈액 단핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 자궁 내로 도입하는 단계, 및 상기 환자의 체외 수정 개시 다음 소정의 지연 후 환자의 자궁 내로 적어도 하나의 배아를 이식하는 단계를 포함하되; 상기 방법은 이와 같은 단계가 없는 체외 수정 방법과 비교할 때 임신의 성공적인 개시와 함께 자궁 내 배아 착상의 확률을 증가시킨다. 시간의 소정의 지연은 배아의 자가면역 거부 또는 환자의 자가면역 반응의 위험을 감소시키는데 충분한 시간이다. 배아 이식 전 시간의 지연은 환자에 따라서, 그리고 동물의 종, 잡종 및 품종 사이에서 다를 것이지만, 배아 이식 전 바람직한 시간의 지연은 환자의 적어도 2회의 월경 주기 또는 배란 2회 주기이다. 인간 환자에서 바람직한 시간의 지연은 3 내지 12개월이다.
본 발명의 다른 양태는 시간-지연 기간의 종료 무렵, 자궁강에 의한 배아의 수용을 최적화하도록 하는 방법으로 여성의 자궁내막이 제조되는 것이다. 본 발명에 따라서, 이는, 가장 바람직하게 환자로부터 획득되는, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 자궁 내 주입에 의해 이루어진다. 본 발명은 성공적인 임신 개시 및 초기 임신 발달의 확률을 증가시키는 것이 본 명세서에서 관찰되었다. 배아의 냉동보존과 함께 착상의 시간 지연과 여성의 자궁내막의 PBMC 제조물을 결합시키는 것이 본 발명의 토대이다.
보다 구체적으로, (a) 적어도 하나의 난모세포를 획득하고 상기 난모세포를 정자로 수정하여 접합체를 형성하는 단계; (b) 시험관내에서 상기 접합체를 배아 단계로 발달시키는 단계; (c) 상기 배아를 냉동보존하는 단계; (d) 환자의 자가면역 반응의 위험을 감소시키는 데 충분한 소정의 시간 동안 대기하는 단계; (e) 대기 기간의 종료 2 내지 4일 전에 환자의 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 제1 부분을 추출하는 단계; (f) 적당한 배양 배지 c에서 상기 PBMC의 제1 부분을 배양하는 단계; (g) 대기 기간의 마지막 날에 환자의 혈액으로부터 PBMC의 신선한 제2 부분을 추출하는 단계; (h) PBMC의 배양된 제1 부분을 PBMC의 신선한 제2 부분과 합쳐서 신선한 PBMC와 배양된 PBMC를 포함하는 조성물을 획득하는 단계; (i) 상기 PBMC의 조성물을 환자의 자궁 내로 도입하는 단계; (j) 상기 배아를 냉동보존된 상태로부터 해동시키는 단계; 및 (k) 적어도 하나의 해동된 배아를 환자의 자궁 내로 이식하여 임신을 유발하는 단계를 포함하는 여성 환자에 대한 체외 수정 방법이 개시된다.
본 발명의 다른 양태는 PBMC를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 생성하고 IVF 시술에서 상기 PBMC 조성물을 적용하는 방법, 및 기관의 특정 표적 조직, 가장 바람직하게는 여성 자궁의 자궁내막을 성장시키고 조작하는 방법이다. 이와 같은 방법은 환자의 혈액으로부터 PBMC를 추출하는 단계; (i) L-글루타민과 탄산수소나트륨을 포함하는 RPMI 1640 배지, (ii) 인간 재조합 알부민 및 (iii) PBMC의 능력을 개선시켜 조직 성장을 향상시킬 수 있는 촉진제, 예를 들어 인간 융모성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG)을 포함하는 배양 배지 중에서 4.8 내지 6.0% 이산화탄소(CO2)의 존재 하 36.7 내지 37.3℃에서 상기 추출된 PBMC의 부분을 증식시키는 단계; 및 상기 PBMC의 신선한 부분과 배양된 부분을 합쳐서 상기 조성물을 획득하는 단계를 포함한다.
본 발명은 명세서 전반에 걸쳐서 사용되고 의존되는 특정 용어를 정의함으로써 보다 명확하게 이해될 것이다.
"배반포"는 내부 세포 덩어리, 영양외배엽이라 불리는 외부 세포층, 및 배아의 전체가 유래되는 내부 세포 덩어리를 포함하는 유체로 채워진 포배강을 가지는, 수정하고 5 또는 6일 후의 배아이다. 영양외배엽은 태반의 전구체이다. 배반포는, 배반포가 "부화"할 때 후에 없어지는 투명대로 둘러싸여있다. 당단백질 코트로 구성된 투명대는 1세포기로부터 배반포의 발달 단계까지 난모세포를 둘러싼다. 배아 부착 및 착상 전에, 투명대는 단백질 분해를 비롯한 다수의 메커니즘에 의해 배아로부터 제거된다. 투명대는 초기에 하나 초과의 정자가 난모세포 내로 들어가는 것을 방지하고, 이후에 배아가 자궁 내에 도착하기 전 배아의 조기 부착을 방지하는 기능을 한다.
"냉동-IVF(Cryo-IVF)"는 배아가 냉동보존된 다음 배아 이식 전에 해동된 체외 수정 방법, 또는 수정에 사용된 난모세포가 이전에 냉동된 다음 해동된 방법을 말한다. "신선-IVF"는 배아가 자궁강 내로 이식되기 전 냉동되지 않고 배아를 제조하는데 사용되는 난모세포가 이전에 냉동되지 않은 체외 수정 방법을 말한다.
"배아"는 수정하고 팔(8)주 후 배아기의 종료까지 접합체의 분열의 산물이다. 배아의 분열 단계는 배양의 처음 3일 동안 일어난다. "배아 이식"은 하나 이상의 배아 및/또는 배반포를 자궁 또는 나팔관에 배치하는 절차이다. 이와 같이, 용어 "배반포" 및 "배아"는 용어 "배아 이식"을 정의하기 위하여 그리고 기재되고 청구하는 바와 같이 본 발명의 범주 및 출원 내에서 용어 "배아 이식"의 적용시 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
"자궁내막"은 자궁의 내부 표면을 가리는 조직을 말하며, 이는 상피 세포의 층으로 구성된다. 배아는 처음에 착상을 위하여 자궁내막 및 세포외 기질("점액")과 접촉하게 된다. 상피 및 기저 기질 세포층은 주기적으로 두꺼워지고, 점액을 분비하며, 월경 주기의 호르몬 영향 하에서 신체로부터 없어진다. 본 명세서에서 용어 "착상"은 배반포에 의한 부착 및 이후 (투명대의 제거 후) 일반적으로 자궁내막으로의 통과를 의미한다. 자궁내막 내벽으로의 부착은 부착 분자와 자궁내막의 하나 이상의 성분(상피 세포의 막, 점액, 점액의 뮤신 성분, 또는 자궁의 외인성 도입 성분을 포함함) 사이의 상호 작용에 의해 일어날 수 있다.
"수정"은 정자 및 자신의 유전 물질의 조합이 난자를 침투하여 접합체를 형성하게 되는 것을 말한다. 본 명세서에서 사용된 "체외 수정의 개시"는 여성 환자의 제어된 난소 자극의 개시를 의미하며, 이는 여성이 자극되어 다수의 난소 여포의 발달을 유도하여 여포 흡입 시 다수의 난모세포를 획득하는 약리적 시술을 포함한다.
일반적으로 자궁(womb)이라고 말하는 "자궁(uterus)"은 한쪽 말단에 자궁 경부를 포함하는 한편, 다른 쪽 말단은 종에 따라서 하나 또는 2개의 나팔관에 연결되어 있는, 인간을 비롯한 대부분의 포유동물의 주요한 여성 호르몬-반응 생식 성기이다. 자궁의 생식 기능은 나팔관으로부터 자궁-난관 경계를 통과하는 수정된 난자를 받아들이는 것이다. 상기 수정된 난자는 자궁내막 내로 착상하고, 이를 위하여 배타적으로 발달한 혈관으로부터 영양분을 도출한다. 수정된 난자가 배아가 되고, 자궁의 벽에 부착하며, 태반을 형성하고, 분만 때까지 임신 동안 태아로 발달한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "자궁"은 배아 이식을 위한 나팔관을 포함한다. 용어 "자궁"은 또한 본 명세서에서 용어 "자궁강"(자궁의 중심부의 내부 공간)과 상호교환적으로 사용된다.
IVF 시술 동안, 여성의 면역계는 자극 생산 및 난모세포의 전달을 겪는다. IVF-생산 배아가 난모세포의 추출 후 즉시 자궁강으로 이식되면, 면역계는 과잉 반응을 생성할 수 있다. 면역계의 이와 같은 과잉 반응은 배아를 착상하지 못하고 자가면역 불임으로 이어지는 신체 불능의 원인이 될 수 있다. 제1 양태에서, 본 발명은 여성의 면역계가 정착하고 적절한 호르몬 균형을 되찾게 하기 위하여 자궁으로의 배아 도입을 지연시키는 것을 제시한다. 시간-지연 동안, 여성 환자의 난모세포 또는 배아는 선택적으로 냉동보존을 통해 보존된다.
본 명세서에서 본 발명의 방법에 유용한 시간-지연은 각각의 특정 환자에 대한 소정 양의 시간이다. 인간 환자에 있어서, 시간 지연은 대략 적어도 2개월 또는 배란 2주기의 시간 길이일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 소정의 지연은 배란 3주기이며, 이는 전형적으로 3개월에 해당한다. 대부분의 여성은 28일마다 배란 1주기를 겪는다. 그러나, 배란 주기는 여성마다 다르므로, 지연의 실제 일 수는 본 발명의 IVF 절차의 시술 동안 각각의 환자에 따라 다를 것임이 이해되어야 한다. 여성 환자는 3개월의 기간 이내에 배란 2주기만을 겪거나, 또는 마찬가지로 여성은 3개월 기간 이내에 배란 3주기 초과를 겪을 수 있는 것이 가능하다. 일부 경우에서, IVF 시술의 개시 후 초기 배란 후 환자는 임의의 추가적인 배란을 겪지 않을 것이 가능하다. 시간 지연은 또한 3개월 초과의 기간일 수 있지만, 바람직하게는 3개월 이내에서 1년까지일 것이다. 본 명세서에서 소정의 시간-지연은 자가면역 불임의 위험을 상당하게 감소시키며, 따라서 성공적인 임신의 확률을 상당하게 증가시키는 것이 입증되었다.
환자 이외의 여성 또는 여성들로부터 유래된 난모세포 또는 배아가 임신 개시에 사용되는(각각, "공여체 난자" 또는 "공여체 배아"로 불림) 실시형태가 본 발명의 범주 내에 속한다. 이는 여성 환자가 배란할 수 없거나 생존가능한 난자를 생성할 수 없는 경우에, 또는 환자 자신의 난자를 수정함으로써 유래되는 배아가 배아 이식을 위해서는 너무 부족하거나 형태 또는 유전자 시험에 기반하여 생존 확률이 낮은 경우에 일어날 것이다.
이의 일반적인 기술에서, IVF를 받은 여성은 여포 발달 및 다수의 난자 생산을 자극하기 위한 호르몬 주사를 필요로 한다. 이러한 자극 과정은 난소 기능을 억제하는 보통 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH) 작용제의 초기 사용을 필요로 하며, 이는 원하는 시점까지 배란을 방지한다. 가장 일반적으로 사용되는 약제는 시상하부 상의 에스트로겐으로부터 부적 피드백을 억제함으로써 성선 자극 호르몬의 생성을 증가시키는 선택적인 에스트로겐 수용체 조절제인 클로미펜 시트레이트(클로미드(Clomid(등록상표)))이다. 난모세포의 최종 성숙 및 방출 유도는 종종 황체 형성 호르몬의 투여에 의해 유도된다. 이러한 주사를 위한 프로토콜은 당업계에 익히 공지되어 있고 확립되어 있으며, 본 발명의 방법의 실시형태의 임의의 것에서 이용된다.
본 발명의 방법에 따라서, 미수정 난자는 당업계에 공지된 기술에 의해 여성 환자로부터 수확하고 회수된다. 이와 같은 기술은 난소 여포에 특수하게 설계된 바늘을 놓고 난자를 포함하는 유체를 제거하는 단계를 포함한다. 일단 여포액이 여포로부터 제거되면, 난자는 현미경으로 검사되고 진단되어 형태 특성을 관찰한다. IVF를 위하여 난모세포를 얻기 위한 한 가지 방법이 미국 특허 제4,725,579호에 개시되어 있다. 본 명세서에서의 방법에서, 6개의 난모세포를 환자로부터 모으는데, 바람직하게는 4개를 획득한다. 그 다음, 난자를 인큐베이터에 넣는다. 종래의 인공 수정 또는 세포질 내 정자 주입술(intracytoplasmic sperm injection: ICSI)이 난자를 수정하는데 사용된다. 사용된 수정 유형은 종종 남성의 정액 변수 또는 다른 인자, 예를 들어 필요할 수 있는 배아의 분석 유형에 기초한다. 종래의 인공 수정 동안, 정자는 배양 접시에서 난자와 혼합되고 밤새 배양하여 수정 과정을 거친다. 세포질 내 정자 주입술 동안, 하나의 정자가 하나의 난자로 직접 주입된다. 어느 하나의 기술을 이용하여, 난자를 그 다음 날에 관찰하여 세포 분열에 대하여 평가한다. 수정된 난자(이제, 배아라 함)는 그 다음 성장 및 발달을 촉진시키는 특이적인 배양 배지에 놓는다.
본 발명에 따라서, IVF-유래 난모세포 또는 배아는 적당한 배양 배지에서 성장한다. 이용가능한 배양 배지는 세포가 성장하고 발달하는데 필요한 영양소를 제공하도록 시도하고 여성 생식계 내에서 정상적으로 일어나는 조건을 가능한 한 많이 복제하도록 추구한다. 실험실 절차에서 세포 발달 및 성장의 시험관내 지지를 위한 사용에 적당한 당업계에 공지된 배양 배지가 본원에서 사용될 수 있다. 예는 인간 난관 유체(human tubal fluid: HTF)(어바인 사이언티픽(Irvine Scientific)), N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄(HEPES) 배지(어바인 사이언티픽), IVF-50(스칸다나비안 IVF 사이언스(Scandanavian IVF Science)), S2(스칸다나비안 IVF 사이언스), G1 및 G2(스칸다나비안 IVF 사이언스), UniIVF, ISM-1, 블라스트어시스트(BlastAssist), UTM 배지(오리지오 에이에스(Origio A/S)에 의해 메디컬트(MEDICULT(등록상표)) 배지로 판매됨), 변형된 화이텐스 배지(Modified Whittens medium), 위팅엄스 T6 배지(Wittinghams T6 media), 햄스 F-10 배지(Ham's F-10 media), 얼스 용액(Earle's solution)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 완충 시스템, 예를 들어 4-몰폴린프로판설폰산(4-morpholinepropanesulfonic acid: MOPS)이 전형적으로 제공된다. 절차는 문헌[Trouson 등 (1980 및 1982)] 및 [Quinn 등 (1985)]에 잘 제시되어 있다.
조직 배양 배지는 일반적으로 아미노산, 비타민 및 다른 구성성분의 배열을 포함하는, 복잡한 시스템이다. 일부 배지는 탄수화물 에너지 공급원, 예를 들어 글루코스, 피루빈산 및 젖산이 보충된 평형 염 용액으로 이루어진다. 상기 배지는 또한 비필수 아미노산이 보충될 수 있다. 배지 내 성분은 종종 비-인간 및 비-동물 공급원, 예를 들어 재조합 미생물로부터 유래된다. 오염의 가능성을 감소시키는 조치, 예를 들어 당업계에서 실행되는 적절한 정제 및 제조 기술을 취하는 것이 바람직하다. 추가적으로, 배지는 항생제, 예를 들어 페니실린 또는 스트렙토마이신을 포함하여 난모세포 수집의 과정 동안 배지로 도입될 수 있는 박테리아를 파괴할 수 있다.
여성의 생식계 내에서 생체내 발달 동안, 난모세포는 배란 동안 난소 내에서 유래되고 난소로부터 방출되며 자궁을 향해 난관을 통해 진행한다. 난관의 유체는 난모세포 및 이를 둘러싸는 난구세포에 영양분을 제공하는 다수의 성분을 포함한다. 일단 수정이 일어나면, 생성된 접합체는 난관을 따라서 이동하고 대략 3일 후에 자궁에 들어가며, 내부 형질전환을 겪고 변화하는 환경을 경험한다. 접합체/배아/배반포가 발달하면서 상당한 발달 변화가 일어난다. 자궁에서 발달 중인 배아를 둘러싸는 유체의 조성은 변화하는 요구에 맞게 조정된다.
여성 생식계의 자연적인 환경과 비교하여 어떠한 단일 배지도 생식 세포, 수정, 접합체 성숙, 및 배아 발달을 지지하는데 최적화되지 않는다. 따라서, 다수의 특수 배지가 배아 발달의 다양한 단계를 다루는데 이용가능하게 되었다. 예를 들어, G1 및 G2 배지는 구체적으로 분열 단계 배아 및 발달의 배반포 단계를 통한 8세포기 배아의 생리학적 필요성을 충족시키도록 제형화되었다. 미국 특허 제6,605,468호(Robertson 등)는 초기 단계 배아로부터 배반포 단계까지 증식을 위한 배지를 개시한다. 배지는 유효량의 과립구-대식세포 콜로니-자극인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; GM-CSF)를 포함하여 이식이 준비된 배반포로 발달하는 사전 배반포 배아의 백분율을 증가시킨다. 또한 초기 단계 인간 배아를 이식이 준비된 배반포로 성장시키는 방법을 개시한다. 결과는 더 큰 비율의 배아가 배반포 단계로 성장하고 IVF 프로그램에서 착상에 사용될 수 있다는 것이다. 많은 연구들이 배아가 배양보조 세포와 공동 배양되는 배양 기술을 사용하여 이루어졌다[Menezo 등, 1990; Planchot 등, 1995]. 사이토카인과 같은 다른 자극 인자들, 예를 들어 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor; LIF)가 배아 성장을 증식시키는 배지로 첨가될 수 있으며, 예를 들어 미국 특허 제5,418,159호(Gough 등)를 참조한다. 백혈병 억제 인자는 시험관내 발생학의 분야에서, 예를 들어 배아 줄기 세포주를 유지하고 배아 이식의 효율을 증가시키는데 있어서 일반적인 유용성을 가지는 강력한 호르몬이다.
미국 특허 제6,838,235호에서 Gardner 등은 IVF 과정 전체에 걸쳐서 단일 배양 단계 배지 중 인간 생식 세포를 침지시키는 것 대신에, 다양한 IVF 절차가 수행되므로 생식 세포가 별개의 배양 배지의 서열을 통하여 이동될 수 있다는 것을 제공한다. 하나의 제형에서, 배양 배지는 구체적으로 여성 생식 기관 내에서 발견되고 배아의 성장과 발달에 좋은 것과 유사한 물리적 환경을 제공하도록 제형화된다. 개시 내용은 특수 배지가 난모세포의 회수 및 취급; 난모세포 성숙; 일반적인 수정; 난모세포, 접합체 및 배아 검사 및 조직 검사; 8세포기 단계로의 배아 발달; 배반포 단계로의 배아 발달; 배아 이식; 및 냉동보존을 위해 제공될 수 있다.
배아 제조를 위해 일반적으로 이용가능한 배양 배지의 사용에 더하여, 본 발명의 방법은 임신 개시의 확률 및 성공을 증가시키기 위하여 다른 기술과 조합될 수 있다. 자궁강으로의 이식 전 일부 방식으로 배아가 변형되는 다수의 방법이 개발되었다. 예를 들어, 유럽 특허 출원 EP 제1765987호(WO 제2005121322호 A1)는, A 또는 B 항원 적혈구 세포와 혈청학적으로 동등한 세포를 생성하는 하나 이상의 단당류 단위의 첨가에 의해 세포-표면 H 항원의 효소적 변형을 개시한다. 연구는 히알루론산염에 대하여 배아 상에 수용체가 있고, 또한 모체의 자궁의 내막 상에 히알루론산염에 대한 수용체가 있다는 것을 나타낸다. 히알루론산염은 자궁내막에 결합하는데 있어서 배아를 돕는, 따라서 착상을 지원하는 생물학적 풀과 같이 작용하는 것으로 생각된다. 미국 특허 제8,183,214호(Carter 등)는 IVF 절차에서의 사용을 위하여 히알루론산을 세포 또는 다세포 구조(배아)의 표면으로 국재화시키는 방법을 개시한다. 개시 내용은, 임의의 특징, 예를 들어 성장 특징, 저장 특징, 및 배아의 생존 및 자궁으로의 이식 후 배아의 실행 가능성을 개선시키기 위하여, 생물학적 활성을 변화시키는 세포 또는 배아의 지질 이중층 또는 막으로 안정적으로 통합하는 탄수화물-지질 구조체를 제공한다. 유사하게, 미국 특허 제7,819,796호(Blake 등)는 배아의 부착 및 착상을 향상시키기 위한 다른 외인적으로 제조된 구조체이다. 배아는 배아의 세포막으로 또는 투명대로 삽입되는 지질 꼬리를 가지는 당지질로 변형되는데, 여기서 당지질은 결합 부분이 부착 분자에 부착할 수 있게 맞추어지는 결합 부분을 포함하도록 변형되었다. 자궁내막으로 배아의 부착은 가교 분자를 통하여 또는 직접적으로 결합 부분을 통해 일어날 수 있다. 다른 방법인 단백질 페인팅(protein painting)은 유전자 이식이 없이 세포막의 외부 항원을 변형시키기 위한 방법이다. 국제 출원 PCT/US98/15124호(공개 WO 제99/05255호)에 대한 명세서는 배아의 발달을 변형시키기 위하여 배아를 지질-변형 접착 분자와 접촉시킴에 의핸 이행의 향상을 기재한다. 미국 특허 출원 제13/067,021호는 세포에 의해 발현된 표면 항원에서 효과적인 질적 및/또는 정량적 변화를 위한 다른 비형질전환 방법을 기재한다. 연구자들에 의해 개시된 합성 분자 구조체는 세포의 지질 이중층으로 통합하고, 이와 같은 삽입은 열역학적으로 바람직한 것으로 제안된다. 배아 제조의 상기한 방법뿐만 아니라, 당업계에서 실행되는 다른 방법도 본 명세서에서 본 발명의 범주 내인 것으로 고려된다.
전통적인 IVF 과정에서, 배아는 각각의 배아가 사(4) 세포기에 있는 수정 2일 후 또는 배아가 팔(8) 세포기에 있는 수정 3일 후에 자궁강으로 이식된다. 배양 후 제5일 내지 제7일에 도달된 배반포기에서 배아를 사용하는 것이 바람직할 수 있음이 인식되었다. 본 명세서에서 본 발명의 IVF 방법은 배아가 배아/배반포 발달의 스펙트럼을 따른 임의의 시간에 이식할 수 있게 한다. 시각적 관찰, 예를 들어 현미경의 사용에 의한 관찰을 통하여, 포배강이 분명하고 배아 부피의 50% 초과를 구성할 때 배반포 또는 배아는 자궁으로 이식될 준비가 된 것으로 고려된다. 생체내 환경에서, 이러한 단계는 정상적으로, 배아가 나팔관을 가로질러서 자궁에 도착한 직후인 수정 4 내지 5일 후에 달성될 것이다.
본 발명의 제2 양태에 따르면, IVF 시술 동안 배아 이식 이전에 여성 환자의 자궁 내로 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함하는 조성물을 도입하는 것이 자궁의 내막으로 성공적인 배아 착상의 확률을 증가시키고, 이에 의하여 성공가능한 임신으로 이어진다는 것이 본원에서 발명자에 의해 발견되었다. 구체적인 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, PBMC는 여성의 자궁내막 및 이식된 배아의 건강과 생존력을 촉진하는 것으로 생각된다.
PBMC는 다양하지만 제한된 수의 계통으로부터의 세포에서 생기는 잠재력을 가지는 다분화능 전구체 세포이다. 배아를 형성하는 긴 시리즈의 세포 분열의 말에, 종말에 분해되거나 영구적으로 특정 기능에 전념하는 것으로 고려되는 세포이다. 줄기 세포 실험은 뉴런 또는 뇌세포와 같이 거동하는(전환분화로서 알려진 과정임) 혈액 줄기 세포를 지시할 수 있었다. 시험관에서 수정된 난자로부터 유래된 태아, 탯줄 또는 배아 조직으로부터의 전능 줄기 세포의 사용은 인간의 물질인 경우 윤리적 및 법적 문제를 일으키고, 감염을 전염시킬 위험을 제기하고/제기하거나 상기 줄기 세포는 수용체의 면역계에 의해 거부될 수 있으므로 비효율적일 수 있다. 주장하건대, PBMC는 혈액으로부터 획득하고 줄기 세포를 구성하지 않지만, 여전히 분화할 수 있는 세포이므로, PBMC의 사용은 윤리적 및 법적 문제를 덜 일으킨다.
본 명세서에서 사용된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 피험체의 혈액으로부터 추출, 수확, 유래, 단리 또는 그렇지 않으면 이로부터 획득한 다분화능 세포이다. PBMC는 혈액 세포이며, 둥근 모양의 핵을 가진다. PBMC 부류는 림프구, 단핵백혈구 및 대식세포를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 혈액 세포는 감염과 싸우고 면역계를 포함한 다른 기능을 작동하는데 있어서 이용되는 유기체의 면역계에서 중요한 요소이다. 림프구 집단은 T 세포(CD4 및 CD8 양성 약 75%), B 세포 및 NK 세포(총 약 25%)로 이루어진다. PBMC 집단은 또한 호염구 및 수지상 세포를 포함한다.
PBMC는 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해 인간 말초 혈액으로부터 단리된다. 상기 세포는 혈액의 층을 분리한 친수성 다당류인 피콜(FICOLL(등록상표)(지이 헬스케어 바이오사이언스 에이비 엘엘씨(GE Healthcare Bio-Sciences AB LLC), 스웨덴)을 사용하여 전혈로부터 추출될 수 있는데, 상기 피콜은 혈액을 최상부층인 혈장, 그 다음 PBMC의 층, 그리고 백혈구, 적혈구 및 다형핵 세포(예를 들어, 호중구, 호산구)의 하부 분획으로 나눌 것이다. 다형핵 세포는 적혈구를 용해함으로써 추가로 단리될 수 있다. 피콜(등록상표)은 피콜-파크(Ficoll-Paque(등록상표))(지이 헬스케어 바이오사이언스 에이비 엘엘씨, 스웨덴)의 부분이다. 피콜-파크(등록상표)는 보통 코니컬 튜브의 하부에 위치하며, 그 다음 혈액이 피콜-파크(등록상표) 위로 천천히 적층한다. 원심분리된 후, 상부에서 하부로 몇 개의 층이 코니컬 튜브에서 보이게 될 것이며: 이는 혈장 및 다른 성분, PBMC를 포함하는 단핵 세포 층, 피콜-파크(등록상표), 및 적혈구 및 과립구(이들은 펠렛 형태로 존재함)이다. 이러한 분리는 PBMC의 회수를 용이하게 할 수 있다. 일부 적혈구 트래핑(적혈구 및 과립구의 존재)이 PBMC 또는 피콜-파크(등록상표) 층에서 일어날 수 있다. 대부분의 혈액 응고는 때때로 PBMC 층에서 일어날 수 있다. 에틸렌 디아민 테트라-아세테이트(Ethylene diamine tetra-acetate; EDTA) 및 헤파린이 응고를 막기 위하여 피콜-파크(등록상표)와 함께 일반적으로 사용된다. 피콜-파크(등록상표) 층형성은 매우 천천히 일어나는 과정이므로, 가장 많은 시간을 소요하는 단계를 도와주는 장치가 개발되었다. 이와 같은 하나의 제품이 피콜-파크(등록상표)와 혈액 샘플 사이에 물리적인 장벽을 형성하는 다공성 삽입물을 포함하는 특수 튜브인 셉메이트(SepMate(상표명))-50(스템셀 테크놀로지 인코포레이션(StemCell Technology Inc.), 캐나다)이다. 이는 혈액 샘플이 삽입물 상으로 빠르게 피펫팅될 수 있게 하여, 피콜-파크(등록상표) 상에 직접적으로 혈액 샘플이 놓여질 필요성을 피할 수 있게 한다. 셉메이트(상표명) 삽입물은 또한 원심분리 단계의 기간을 감소시키며, 원심분리 후 혈장과 PBMC를 포함하는 상부 층은 별도의 용기로 부어질 수 있다. 다른 장치는 다공성 고밀도 폴리에틸렌 장벽 또는 "프리트"를 포함하는 컬럼을 포함한다. 이러한 제품은 다당류와 혈액을 혼합하지 않으면서 혈액이 훨씬 더 빠르게 적층될 수 있게 한다. 이와 같은 제품의 예로는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)에 의해 판매되는 "아쿠스핀 시스템 히스토파크(Accuspin System Histopaque)-1077"이 있다. 진공 채혈기 혈액 수집관에 포함된 피콜-파크(등록상표) 분리 시스템을 가지는 것이 가능하다. 이와 같은 진공 채혈기는 혈액 생성물을 수집하는 것의 편의성 및 안전성을 증가시키지만, 기본적인 진공 채혈기보다 훨씬 더 비싸다. 다른 이와 같은 제품인 플로에이티즈(Floaties(상표명))는 중합체 비드 또는 펠렛의 특수 혼합물을 사용하여 피콜(등록상표) 상에 혈액 또는 세포 현탁물을 효과적으로 쌓는 것으로 나타났다. 이러한 생성물은 비싸지 않으며, 기술에 대한 연구자의 의존도를 감소시키고, 실제로 쌓는 공정의 속도를 높인다. 유기체, 인간 또는 동물의 혈액으로부터 PBMC를 수집, 단리, 추출, 수확, 분리, 제거, 또는 임의의 다른 방법으로 획득하는 기술로 실행되거나 실행될 것인 다른 기술을 비롯하여 상기한 기술 중 임의의 것은 본 명세서에서 본 발명의 실시형태의 범주 내에 속하는 것으로 고려된다.
본 발명의 양태 중 하나에서, PBMC 세포를 배양하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 상기 방법은 36.7℃ 내지 37.3℃ 범위의 온도에서 104 내지 107/㎖의 밀도로 4.8% 내지 6.0%의 이산화탄소(CO2)를 포함하는 습한 대기에서 피브로넥틴-코팅 플레이트 상에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 본 방법의 바람직한 실시형태에서, PBMC는 46시간 내지 72시간의 범위의 시간 동안 배양된다. 가장 바람직한 실시형태에서, PBMC는 5.0%의 CO2의 대기 중 37.1℃의 온도에서 48시간 동안 피브로넥틴-코팅 플레이트에서 배양된다.
추출된 PBMC를 증식시키기 위해 본 명세서에서 사용되는 배양 배지는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 배지(일반적으로 RPMI 배지로 알려져 있으며, 다수의 공급원으로부터 이용가능함)이다. RPMI 배지는 종종 세포 및 조직 배양에 사용된다. RPMI 1640 배지는 전통적으로 무혈청 인간 림프구 세포, 골수 세포 및 혼성세포의 성장에 사용되어 왔다. RPMI 1640 배지는 탄산수소염 완충 시스템을 사용하고 pH가 8인 제형이라는 점에서 대부분의 포유동물 세포 배양 배지와 다르다. 본 발명의 방법에 따른 바람직한 배지는 L-글루타민과 탄산수소나트륨을 포함하는 RPMI 1640 배양 배지를 이용한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 인간 재조합 알부민(human recombinant albumin: HRA)이 배양 배지에 첨가된다. HRA는 순환반감기가 대략 19일인 혈장에서 고농도로 존재하는 잘 알려진 담체 단백질이다. 이는 조직으로의 지방산 수송, 단백질 안정화, 금속 이온과 표면의 결합, 및 혈장 중 항산화 효과에서 작용한다. HRA는 다수의 공급자(예를 들어, 노보자임 인코포레이션(Novozymes, Inc.) 또는 시그마-알드리치, 엘엘씨(Sigma-Aldrich, LLC))로부터 널리 이용가능하다. 본 발명의 방법 동안 배양 배지에 HRA를 첨가하는 것은 PBMC의 성장을 개선시키는 식품 보충제로서 작용한다.
본 발명의 추가 양태에서, 본 명세서에서 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG)은 RPMI 1640 배양 배지에 첨가되었다. 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG)은 임신 동안 태반 합포체영양세포에 의해 신체에서 모체 혈액 내로 방출된다. 이는 면역-조절 호르몬인 것으로 밝혀졌으며, hCG의 투여는 임신 성공률을 증가시키고 hCG에 대한 항혈청은 태아 착상을 억제하는 것으로 보고되었다. hCG는 특정 수용체(LHCG 수용체)와 상호작용하고, 임신의 개시 동안 황체의 유지를 촉진하는데, 황체는 프로게스테론 호르몬의 방출을 야기한다. 프로게스테론은 자궁이 혈관과 모세혈관으로 두텁게 대어져 있게 하여, 배아와 태아가 계속 성장할 수 있게 한다. 고도의 음 전하로 인하여, hCG는 모체의 면역 세포를 접근하지 못하게 할 수 있으며, 이는 임신 제1삼분기 동안 태아를 보호한다. 또한 hCG는 국재적 모체 면역관용의 발달을 위한 태반 연결고리가 될 수 있음이 가정되었다. 예를 들어, hCG-처리 자궁내막 세포는 T 세포 아폽토시스(T 세포의 소멸)에서의 증가를 유도한다. 이러한 결과는 hCG가 말단 영양막(peritrophoblastic) 면역 관용의 발달에 있어서 연결고리가 될 수 있으며, 영양막 침입을 용이하게 할 수 있다(이는 자궁내막에서 태아의 발달을 촉진시키는 것으로 알려져 있음)는 것을 시사한다[Kayisli 등, 2003]. 또한 hCG 수준은 임신한 여성에서 입덧의 중증도와 연관되어 있음이 제안된 바 있다. 본 발명의 배양 배지 중 hCG의 최소 농도는 5 IU/㎖ 이상이다. 명확하게 하기 위하여, 본 발명의 방법에 따라 제조된 배양 배지 중 hCG는 본 발명의 IVF 공정 동안 조직 성장, 구체적으로 자궁내막의 성장을 향상시키는 PBMC의 능력을 개선시키는 촉진제로서 기능하는 것이 본원에서 밝혀졌다. 배양된 PBMC 및/또는 합하여진 배양된 PBMC와 신선한 PBMC 조성물은 본 발명의 PBMC 조성물로 처치될 때 환자의 자궁내막 조직의 크기와 수용성을 변화시키는 능력을 가진다. 이는 크기에서의 증가, 구체적으로 자궁내막의 두께에서의 증가를 가져올 뿐만 아니라, 착상 시 배아에 결합하는 자궁내막의 능력 향상을 가져온다.
본 발명의 체외 수정 방법은 자궁 개시를 개선시키기 위하여 상기 배양 기술에 의해 획득한 PBMC의 사용을 제공한다. 여성 환자로부터 난모세포를 획득한 후, PBMC의 부분은 환자의 혈액으로부터 추출된다. 이러한 PBMC 부분은 그 다음 상기 개시된 방법에 따라서 적당한 배양 배지에서 배양되어 바람직한 양과 질의 PBMC를 획득한다. 본 명세서에서 논의된 소정의 대기 또는 지연 기간 후, 추가적인 혈액 부분을 환자로부터 획득하고 PBMC의 신선한 부분을 혈액으로부터 추출한다. 대안적으로, 환자로부터 처음 획득한 다량의 혈액을 PBMC를 포함하는 다양한 부분으로 나눌 수 있으며, 이의 하나 또는 일부는 배양하고, 하나 또는 일부는 신선한 상태로 유지한다. 신선한 부분은 바람직하게 소정의 대기 기간 마지막 날에 획득한다. 그 다음 신선한 PCMB의 일부 또는 전부는 PBMC의 일부 또는 전체 배양된 부분과 합쳐져서 신선한 PBMC와 배양된 PBMC를 모두 포함하는 조성물을 획득하였다. 본 발명의 PBMC의 바람직한 조성물 중 PBMC의 농도는 조성물의 밀리리터 당 4백만 내지 5백만개 세포의 범위이지만; 조성물의 ㎖당 최대 8백만개 세포의 농도가 본 발명의 범주에서 사용될 수 있다. 상기 조성물은 혼합되거나 추가로 배합되거나 또는 임의의 바람직한 방법으로 가공되어 세포 손상이 없는 PBMC를 합친다. 그 다음 PBMC의 이러한 조성물을 전형적으로 카테터 주입을 통하여 환자의 자궁강 내로 도입한다. 본 발명에 따르면, 20 내지 72시간 후, 가장 바람직하게는 24시간 후, 하나 이상의 배아가 착상을 위하여 자궁으로 이동하여 임신을 유발한다. 본원에서 연구자들은, 이러한 기술은 신체가 빌딩 블록으로서 PBMC를 이용할 수 있게 하여 자궁 내의 자궁내막의 층의 두께를 증가시키고 이에 의하여 임신 개시의 실패 위험을 감소시킬 수 있음을 입증하였다.
PBMC는 본 발명의 IVF 시술 동안 환자 자신으로부터 추출된 것임이 중요하다. 그러나, PBMC의 배양된 부분은 시험관내 배아 이식을 받은 환자 이외의 개체로부터 유래된 것일 수 있음이 본 발명의 범주 내에서 구현된다. 이와 같은 경우에, PBMC의 신선한 부분은 바람직하게 환자의 자가면역 반응에 대처하기 위하여 배아 이식을 받은 환자로부터 획득한다.
배아 및 환자의 생식계 모두의 착상 전 진단은 본 발명의 다른 양태이다. 환자의 진단 시, 자궁내막의 두께(전형적으로 초음파로 측정될 수 있음)는 배아 이식 때 9㎜ 내지 11㎜의 범위에 있는 것이 바람직하다.
착상 후 진단이 또한 전형적으로 실행된다. 하나 이상의 배아가 자궁내막에 착상되었는지 여부, 즉 절차가 성공적인 임신 개시로 이어졌는지 여부를 결정하기 위한 시험은, 예를 들어 b-hCG(인간 융모성 성선 자극 호르몬) 상에서의 혈액 테스트 및 당업계에 일반적으로 공지된 기술을 사용하여 이식하고 2주 후에 실행된다. hCG는 임신 진단 및 임신 관련 상태, 예를 들어 자궁 외 임신, 자연유산, 3염색체성 21, 포상기태 및 융모암의 진단에 있어서 필수적이다. 임신이 임상적 임신으로 발달하지 않은 혈청 또는 소변 중 hCG의 검출에 의해 진단될 때, "생화학적 임신" 사건이 일어난다. 미국 특허 제4,315,908호(Zer 등)는 방사성면역측정법에 의해 소변 중 hCG를 검출하는 방법을 제시한다. 미국 특허 제8,163,508호(O'Connor 등)는 샘플 중 hCG의 조기 임신 관련 동형 단백질의 양을 측정함으로써 hCG 방법에 의해 피험체에서 임신을 예측하는 방법 및 키트를 제공한다. 이와 같은 진단 방법 및 다른 방법들은 본 발명의 범주 내에서 유용하다.
임상의는 성공가능한 임신을 달성하는데 가장 가능성이 높은 이식을 위한 배아를 확인하기 위해 분투한다. 임의의 실시형태에서, 본 발명은 환자로부터 회수하고 시험관내에서 제조한 난모세포, 배반포 또는 배아의 형태학적, 유전적 및 운동 테스트를 제공한다. 진단 방법은 보통 배아의 형태학적 특성의 관찰에 의해 발달중인 것으로 나타나는 배아를 확인하는 배아의 미시적 물리적 분석 및 배아의 유전적 테스트를 포함한다. "착상전 유전적 진단"은 극체, 난할구, 또는 영양외배엽의 분석에 의하여 배아가 유전적, 구조적, 및/또는 염색체 변화 또는 이상을 포함하는지 여부를 확인한다. "착상전 유전적 스크리닝"은 염색체 이수성, 돌연변이 및/또는 DNA 재배열의 검출을 위한 극체, 난할구 또는 배아의 영양외배엽의 분석을 포함한다. 배아를 진단하기 위한 적어도 3가지의 기본적인 보조 부화 및 생검 기술이 당업계에 공지되어 있다. 이들 기술은 특수한 현미 외과 수술 칼 또는 유리 바늘을 사용하여 배아의 투명대에서 절개를 기계적으로 만드는 것; 산, 예를 들어 타이로드용액으로 투명대의 일부를 화학적으로 분해하는 것; 또는 배반포의 분리를 돕는 레이저를 사용하여 투명대를 제거하는 것을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 현미경(예를 들어, 니콘 이클립스 티이 2000-에스 현미경(Nikon Eclipse TE 2000-S microscope))을 사용한 배아의 시각적 관찰에 의해, 배아는 자궁 내로 이식되기 전에 임의의 결정된 물리적 또는 형태학적 특성을 동시에 나타낼 것이다. 배반포 성숙 상태는 [Gardner et al, 1994](이는 본 명세서에 참조로 포함되며, 이에 의하여 세포내 덩어리와 영양외배엽 층의 두께가 분류됨)의 분류에 따른 범위 II AB 내지 VI AA일 것이다. 레벨 VI AB는 배반포 성숙의 가장 높은 상태를 나타내며, 이는 투명대로부터 부화하여 형성된 배반포에 해당한다.
배아의 유전적 진단은 당업계에 공지된 임의의 기술, 예를 들어 전통적인 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome: BAC) 배열 CGH 등에 의해 실행될 수 있다. 마이크로어레이(또한 마이크로칩 어레이라고도 지칭됨), 어레이 또는 바이오칩은 유전자 발현 및 다른 게놈 연구에 널리 사용되어 왔으며, BAC에 대하여 기술적인 이점을 제공한다. 마이크로어레이는 일반적으로 게놈 중 공지된 서열에 상보적인 핵산을 표면 상에 페인팅 또는 합성함으로써 만들어진다. 유기체 또는 이의 부분의 전체 게놈은 증폭되고 형광 표지화된 DNA(데옥시리보핵산)를 어레이에 혼성화함으로써 평가된다. 미국 특허 제12/587,406호(이는 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨)는 체외 수정 방법을 개시하는데, 여기서 IVF 배아의 모든 24개 염색체의 착상전 유전적 진단은 전체 게놈 증폭 및 다형성의 마이크로어레이 분석에 의해 실행된다. 본 방법은 IVF 배아를 생검하여 하나 이상의 세포를 제거하는 단계 및 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함한다. 그 다음 게놈 증폭을 실행하는 것은 획득한 유전 정보에 기초하여 배아의 유전적 정상 상태를 예측하기 위하여 배아의 유전 정보를 수집하게 할 수 있다. 이러한 기술은 또한 배아의 핵형을 결정하는 것을 가능하게 한다. 배아가 분석된 후, 상기 배아는 자궁 내로 잠재적인 착상을 위해 평가된다. 배아가 유전적으로 분석된 실시형태에서, 자궁 내로의 착상을 위한 하나 이상의 바람직한 배아는 유전적 예측에 기반하여 선택된다.
배아의 운동 진단은 배아 이식을 위하여 가장 바람직하고, 가장 건강한 배아를 선택하기 위하여 이용가능한 다른 중요한 절차이다. 이용가능한 하나의 도구는 프리모 비전(Primo Vision) 타임-랩스 배아 모니터링 시스템(비트로라이프 에이비(Vitrolife AB), 스웨텐 예테보리 소재). 프리마 비전(Prima Vision)은, 배아가 인큐베이터에서 성장함에 따라서, 체외 수정 주기에서 사용되는 배아의 영상을 포착하도록 설계된 카메라 및 컴퓨터 시스템이다. 배아가 배앙 접시에서 발달함에 따라 카메라로 찍힌 영상은 실험실의 컴퓨터 스크린에 전시된다. 컴퓨터 시스템은 배아의 영상을 제공할 뿐만 아니라, 배아의 성장 패턴에 관한 정보도 제공한다. 이러한 정보는 발생학자 및 임상의가 배아에서 건강한 발달을 관찰하고 성장 초기 단계 동안 일어날 수 있는 세포 분열 시기 중 임의의 문제점을 검출할 수 있게 한다. 프리모 비전의 추가 이익은 인큐베이터로부터 배아를 꺼내지 않고서 이들 관찰을 할 수 있게 한다는 점이다. 이는, 배아가 더 빨리 성장하는 경향이 있는 제어된 환경에 배아가 계속 있을 수 있게 한다. 본 발명에 따라서, 배아 이식을 위하여 선택될 가장 바람직한 배아는 다음의 운동 기준: 2세포기에서 3세포기로 분열 동안 5 내지 12시간의 시간 인자를 나타내어야 하고; 접합체 단계 후 35 내지 40시간째 3개의 세포; 접합체 단계 후 48 내지 56시간째 5개 세포; 발달의 제3일의 시작까지 8개 세포를 가져야 한다. 모든 세포는 바람직하게 동일한 크기이어야 하거나, 가능한 한 비슷하여야 하고, 단편화 수준은 5 내지 10%를 이하이어야 한다.
본 발명에 따라서, 환자로부터 유래된 난모세포 또는 이식-준비 배아 단계로 발달한 수정된 난모세포는 환자의 면역계가 임신을 위하여 배아를 수용하도록 충분하게 준비될 때까지 환자의 자가면역 반응을 억제하는데 필요한 필수 기간 동안 보존된다. 그러므로, 가장 일반적인 상황에서, 환자의 난모세포 또는 배아가 보존될 필요가 있다.
불임을 나타내는 여성의 임의의 부분에서, 난자를 생산 또는 배란하지 못하거나, 또는 무배란 또는 희발배란을 겪으므로, 다른 여성 개체로부터 얻은 공여 난모세포(들) 또는 공여 배아(들)이 시험관내 절차에 제공된다. 그러므로, 환자가 환자 자신으로부터 유래하지 않았지만, 상이한 개체로부터 유래된 배아로 임신을 개시할 것이고, 따라서 공여 난모세포 또는 공여 배아는 임신 개시를 위하여 환자에 이식된다는 것이 본 발명의 임의의 실시형태의 범주 내에 속하는 것으로 고려된다.
또한, 하나의 종 유래의 난자 또는 배아가 난자 또는 배아가 유래된 것과 상이한 종으로 이식되는 실시형태도 본 발명의 범주 내에 속한다. 예를 들어, 당나귀 유래의 배아는 말의 자궁 내로 이식될 수 있다.
그러나, 난모세포 또는 배아(보통은 환자로부터 유래된 것이지만, 가능하다면 다른 공급원 유래의 것)의 보전이 필요할 가장 일반적인 경우는 여전히 남아 있을 것이다. 보존은 난모세포 또는 배아를 저온 상태, 예를 들어 서랭, 급속 동결 및 유리화를 거치게 함으로써 제공될 수 있다. 몇 년 동안 성공적으로 동결되어 사용되는 정자와 달리, 난자는 다량의 수분을 포함하고 있어 동결을 더 어렵게 만든다. 난자가 동결될 때, 얼음 결정이 난자 내에 형성될 수 있다. 이러한 얼음 결정은 세포의 구조를 파괴할 수 있다. 얼음 결정의 양을 최소화하는 것을 돕기 위하여, 과학자들은 난자를 서서히 동결시키면서 약간의 물을 제거할 것이다. 미국 특허 출원 제10/777,149호는 (예를 들어, 개, 고양이, 돼지, 가축, 마우스, 래트 및 원숭이의) 난모세포 또는 배아를 원심분리하여 난모세포 또는 배아 세포 외부의 세포질 지질을 극성화하는 단계, 난모세포 또는 배아가 지질 탈분극 이전에 난모세포 또는 배아의 동결을 가져오는 동해방지제의 존재 하에서 저온 상태로 있게 한 다음, 동결된 난모세포 또는 배아를 저온 저장하는 단계를 포함하는 방법을 기재한다. 그러나, 이전에는 물을 전부 제거하는 것이 불가능하고, 따라서 세포내 및 세포외 얼음 결정 형성이 완만 동결에 의해 방지될 수 없음이 밝혀졌다. 따라서, 난모세포의 수정, 배아의 생존력 및 이들 완만 동결된 난자에 있어서의 임신 개시는 일단 해동되면 낮다.
급속 동결은 동해방지제의 사용으로 시도되었다. 동해방지제는 생물학적 조직을 얼음의 형성으로 생기는 동결 위험으로부터 방지하는데 사용되는 물질이다. 동해방지제는 세포내에서 용질 농도를 증가시킴으로써 작용한다. 생물학적으로 실현가능하도록, 동해방지제는 세포를 용이하게 관통하여야 하고, 세포에 독성이어서는 안된다. 종래의 동해방지제는 글라이콜, 예를 들어 에틸렌 글라이콜, 프로필렌 글라이콜, 및 글라이세롤; 2-메틸-2,4-펜탄다이올(2-methyl-2,4-pentanediol: MPD); 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide: DMSO) 및 수크로스이다. 글라이세롤 및 DMSO는 저온 생물학자에 의해 액체 질소에서 냉동-보관된 정자 및 배아에서의 얼음 형성을 감소시키는데 수 십년 동안 사용되어 왔다. 동해방지제의 혼합물이 독성이 더 적고 단일 제제의 동해방지제보다 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 폼아미드와 DMSO, 프로필렌 글라이콜, 및 콜로이드의 혼합물은 모든 인공적으로 형성된 동해방지제 중에서 수 년 동안 가장 효과적이었다. 많은 동해방지제는 또한 물 분자가 대체되면서 생물학적 분자와 수소 결합을 형성함으로써 작용한다. 수용액 중 수소 결합은 적절한 단백질 및 DNA 기능에 있어서 중요하다. 따라서, 동해방지제가 물 분자를 대체하면서, 더 이상 수성 환경에 침지되어 있지 않더라도 생물학적 물질은 원래의 생리학적 구조 및 기능을 유지한다.
보다 최근에, 얼음 결정 형성 없이 동결 및 응고하는 공정인 유리화 공정이 이식 및 냉동 보존술을 위한 난모세포 및 배아, 생물학적 조직, 및 기관을 보존하는데 적용되어 왔다. 일부 동해방지제는 용액 또는 물질의 유리 전이 온도를 낮춤으로써 작용한다. 이러한 방법으로, 동해방지제는 실제적인 동결을 방지하고, 용액은 유리질 상태로 일부 유연성을 유지한다. 완만 동결 및 급속 동결이 이용가능하지만, 유리화가 본 발명의 방법에 따른 난모세포 또는 배아의 보존의 바람직한 방법이다. 유리화 동안, 난모세포 또는 배아는 얼음 결정이 형성될 시간을 가지지 않을 정도로 충분히 빠르게 냉동된다. 임의의 공지된 유리화 기술은 보존 및 저장을 위한 본 발명의 방법 내에서 이용될 수 있다. 일반적으로, 난모세포 또는 배아는 먼저 저농도의 부동액이 있는 조(bath)에 수크로스와 함께 놓아서 난모세포 또는 배아의 밖으로 물을 빼낸다. 그 다음 난모세포를 즉시 냉동시키면서 1분 미만 동안 고농도의 부동액 조에 놓는다. 본 발명의 공정 내에서 이용가능한 유리화 과정의 하나의 예는 37℃에서 메디컬트(등록상표) 배지 중에 유지된 배아를 놓고, 그 다음 22 내지 24℃에서 배지 내로 배아를 놓는 것으로 포함하며, 그 다음 특수 크라이오탑(cryotop) 또는 크라이오리프(cryoleaf) 담체 중에서 액체 질소 내로 배치된다.
본 발명의 IVF 방법에 따르면, 환자의 자가면역계가 호르몬 균형을 되찾은 것으로 결정될 때, 여성 환자는 배아 이식이 계속될 준비가 된다. 이 때, 난자 또는 IVF-유래 배아의 냉동보존이 종료된다. 난모세포(들) 또는 배아(들)은 부동액 용액으로부터 제거되고 해동된다. 일단 해동되면, 비수정 난자는 정자를 난자로 직접 주입하는 보조 생식 기술에 의해 상기 기술된 기술 중 임의의 것에 의해 수정될 수 있다. 배아는 액체 질소 용액으로부터 회수됨으로써 해동되고, 대략 37℃ 온도의 용액에 놓이며, 실온에서 세척하고, 다시 37℃의 용액에 놓이고, 배양 배지에 놓이며, 그 다음 36.8 내지 37.2℃의 여성 자궁강의 내부 온도와 유사한 온도로 유지되는 인큐베이터에 5 내지 24시간 동안, 가장 바람직하게는 37.1℃의 온도에서 5 내지 7시간 동안 놓인다.
본 발명의 방법의 마지막 단계는 임신을 일으키기 위하여 하나 이상의 배아가 환자 내로 도입되는 절차이다. 이러한 절차는 "배아 이식"으로 불리며, 자궁, 자궁강 또는 나팔관 내로 배아의 이식을 포함한다. 전형적으로 배아 이식은, 작고 부드러우면서 초음파 탐침에 의해 유도되는 카테터를 사용하여 자궁 경부를 통하여 여성 환자의 자궁강 내로 선택된 배아를 배치하는 것을 포함한다. 상기에서 제공된 바와 같이, 본 발명의 방법에 따르면, 바람직하게는 배아 이식 전 적어도 24시간, 환자의 자궁의 내막은 전달용의 적절한 카테터를 사용하여 자궁강 내로 PBMC의 조성물을 주입함으로써 준비된다. 배아는 전형적으로 배아 이식 배지, 예를 들어 메디컬트(등록상표) UTM 배지 내에서 유지되며, HAS, 재조합 인간 인슐린, 겐타미신을 포함할 수 있다.
임신 개시가 조직 적합성 항원, 예를 들어 가용성 인간 백혈구 항원 G(sHLA-G)를 "적아군 전달자"로서 작용하는 시스템 내로 도입함으로써 추가로 촉진되어 여성의 면역계에 의한 배아의 양성 인식 및 수용성을 가능하게 하는 것이 본 발명의 추가적인 양태이다. 가용성 형태에 대한 전구체인 HLA-G, sHLA-G는 착상전 배아 상에서 그리고 IVF 연구 동안 획득한 주위 배양 배지에서 연구자들에 의해 검출되었다. 이러한 결과는 임신의 초기 단계로부터 sHLA-G가 관여한다는 것을 시사한다. 또한, sHLA-G의 잠재력은 배아 품질의 지시자로서 작용한다는 것을 시사한다. [Menicucci 등 1999]. 하나의 연구는 착상전 배아 상청액 중 sHLA-G 수준이 수치화되고, 성공적인 착상의 확률을 증가시키는 배아 선택 기준에서 형태학적 시험과 함께 사용될 수 있는 배아 품질의 유용한 지시자로서 작용함으로써 임신 가능성과 함께 양성 결과를 제안할 수 있다는 것을 시사한다. 하나의 실시형태에서, s-HLA-G는 배아 이식 배지로 첨가되는데, 이 때 배아 이식 배지 중 바람직한 농도 측정값은 0.175 내지 0.350 광학밀도(OD)이고, OD는 400 내지 450㎚의 범위의 파장에서, 더 구체적으로는 405㎚의 파장에서 측정된 광학밀도를 의미한다. 광학밀도의 측정을 통한 sHLA의 농도를 결정하기 위한 절차는 다수의 간행물에 철저하게 기재되어 있다. [예를 들어, S. Marti 등, 2007 참조]. s-HLA-G는 배아 이식 배지로 첨가되고, 그 다음 배아는 상기 배지에서 배아의 자궁 내로의 이식 직전에 5 내지 20분 동안, 더 바람직하게는 대략 10분 동안 배양된다.
본 발명의 관련 양태는 본 개시 내용에 제시된 방법에 따른 PBMC 조성물의 존재 하에서 표적 조직을 성장시킴으로써 환자의 표적 조직을 성장, 보수, 조작, 회복, 또는 그렇지 않으면 처치하는 방법을 제공한다. 조직은 배양된 PBMC의 존재 하에서 조직을 도입함으로써 또는 배양된 PBMC와 신선한 PBMC의 합쳐진 PBMC 조성물의 사용하면서 배양함으로써 성장된다. 생체내 및 시험관내 공정 모두 고려된다. 이와 같은 방법 중 하나의 실시형태는 표적 조직이 여성 환자의 자궁의 내막인 것이다. 그러나, 미국 특허 제7,795,018호 및 제8,216,838호(Kuwana 등)에 개시된 바와 같이, PBMC는 예를 들어 뼈, 연골, 골격근, 지방, 심근, 혈관, 내피 및 뉴론을 비롯한 기관 재생을 위한 세포 이식에 매우 적당한 다분화능 세포로서 인식된다. 그러므로, 본 발명의 배양된 PBMC와 신선한 PBMC의 조합물을 포함하는 본 발명의 방법, 배양 배지 및 조성물은 IVF 시술과 PBMC에 이해 치료될 수 있는 다른 조직의 성장, 보수 및 조작을 포함하는 적용에 대한 자궁내막의 처치의 경계를 넘어 확장할 수 있다.
본 명세서에서 본 발명의 개념 및 실시는 인간에게 가장 관련이 있지만, 매우 다양한 동물에서의 배아 착상에 적용가능하다는 것에 주목해야 한다. 본 발명은 PBMC의 사용에 의한 자가면역계 지연을 사용하는 인간 체외 수정 또는 배아 착상에 한정되지 않는다. 예를 들어, 기술은 쥣과 동물과 같은 동물(예를 들어, 시궁쥐(brown rat) 및 집쥐(household mouse)를 포함함); 반려 동물(예를 들어, 개 및 고양이를 포함함); 및 가축 동물, 예를 들어 특히 돼지, 말, 당나귀, 염소, 양, 라마 및 알파카와 함께 사용되어 이와 같은 동물의 정상 출산 비율을 증가시킬 수 있다. 이와 같은 증가는 가축 산업, 과학 및 의료 연구 개발 분야에서의 사회적 의미에 상당한 재정적 영향을 미칠 것이다.
본 발명은 일반적으로 상기한 바와 같이 정의되지만, 당업자는 본 발명이 하기 실시예가 추가 설명을 제공하는 구체예를 포함하고 이에 한정되지 않음을 이해할 것이다. 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 당 기술의 범주 내에서 다른 구체적인 기능적 변형이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다. 본 발명의 이점은 하기 실시예에 의해 입증되며, 이는 본 발명의 방법 및 조성물을 예시하기 위해 제시된 것이고 본 발명의 원리 및 적용을 단지 예시하는 것으로 의도되며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 보아서는 안 된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 예시한다. 연구를 실행하여 2가지의 IVF 절차를 시험하고 비교하였다. 첫 번째 절차는 "신선한-IVF" 방법으로 불리며, 두 번째 절차는 "냉동-IVF" 방법으로 불린다. 임상 결과의 통계적 비교를 실행하여 난모세포 회수 후 여성의 자궁강으로 배아 또는 배반포 착상을 지연시킨 불임을 나타내는 여성에 대한 임신율에서의 효과를 시험하였다. 용어 "임신율","임상적 임신율" 및 "착상율"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 배아 이식 100주기 당 표현된 임상적 임신의 수를 말한다. "신선한-IVF" 및 "냉동-IVF" 절차 둘 다에 대한 임신율에 대한 자궁 내 말초 단핵 혈액 세포(PBMC) 투여의 효과를 추가로 조사하였다.
피험체: 전체 180명의 불임을 나타내는 여성을 시험하였다. 본 연구 전에, 환자 각각은 2번 이상의 성공하지 못한 "신선한-IVF" 시술을 받았고, 본 명세서의 연구에 참여하기 전에 적어도 1번 "냉동-IVF"를 실패하였다. 여성을 그룹 당 90명인 2개의 그룹으로 나누었다. 그룹 1에서 여성의 평균 연령은 35.5 ± 3.4세였다. 그룹 2에서 환자의 평균 연령은 36.5 ± 5.5세이었다. 피험체는 다음과 같이 준비하였다:
IVF 절차: 제어된 난소 자극을 위하여 a-GnRH(성선 자극 호르몬 방출 호르몬)를 사용하는 표준 IVF 프로토콜을 모든 그룹의 환자에게 적용하였다. 모든 환자에 있어서 난소 자극 기간은 10 내지 12일이었다. 여포의 평균 크기는 경질용 천자를 하는 순간 대략 18㎜인 것으로 측정되었다. 고날(Gonal), 메노푸어(Menopur), 쇼라곤(Choragon)을 황체기를 유지하는 동안 모든 그룹의 환자에게 적용하였다. 일반적으로, 10 내지 12개 난자가 각 환자로부터 회수되었다. 획득한 난모세포의 80% 이상은 수정에 충분할 정도로 성숙하였다(Gardner의 분류에 의해 결정된 성숙 MII의 단계).
난모세포의 회수 후, 난모세포를 CO2 농도가 5.5 내지 5.7%의 범위인 유니버설 IVF 배지(오리지오 에이에스 코포레이션(덴마크 소재)로부터 이용가능한 메디컬트(등록상표)) 중에서 36.8 내지 37.1℃의 온도에서 배양하였다. 그 다음 난모세포를 ICSI와 표준 IVF 절차 모두를 통하여 수정하였다. 기술은 정자 지수, 환자 연령, 부정적인 결과가 있은 이전의 IVF 시도 경험을 고려하여 선택하였다. 표준 IVF 절차의 경우에, 정자는 UniIVF 배지 중 난모세포에 첨가하였다. 다음날 발달된 접합체를 ISM-1 배지에 놓았다. 난모세포를 경질용 천자에 의해 획득한 경우, 난모세포를 UniIVF 배지에 놓았다. ICSI 절차에 의해 수정한 후, 난자를 즉시 ISM-1에 놓았다. 배아를 분열 배아 발달을 위하여 처음 3일 동안은 메디컬트(등록상표) 유니버설 IVF 배지에서 배양하였고, 배반포 형성시까지 배양의 제4일 및 제5일 동안은 메디컬트(등록상표) 블라스트어시스트 배지에서 배양하였다. 배아 이식은 메디컬트(등록상표) UTM 배지를 사용하여 실행하였다.
유리화: 유리화는 표준 메디컬트(등록상표) 방법을 이용하여 발달 제5일째에 배반포 또는 배아에 적용하였다. 배아를 명시된 용액에 놓아서 가능한 많은 양의 물을 제거하였다. 배아를 크라이오탑 담체 상에서 액체 질소 중에 놓았다. 2개 이사의 배아를 하나의 담체 상에 놓았다. 동결된 배아를 삼(3)개월 내지 1년의 대기 기간 동안 저장하였다.
PBMC 준비: 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 각각의 환자로부터 추출하였다. PBMC의 제1 부분을 난모세포가 "신선한-IVF" 프로토콜을 받은 날 또는 3일 전에 환자로부터 취한 다음, 배아를 "냉동-IVF" 프로토콜로 자궁으로 이식한다. 초기에, 말초 혈액 10㎖를 각각의 환자로부터 취하였다. 말초 혈액 전체 양(10㎖)을 L-글루타민과 탄산수소나트륨을 포함하는 메디컬트(등록상표) RPMI 1640 배지 10㎖와 혼합하여 합하여진 부피가 20㎖인 희석된 혈액을 형성하였다. 그 다음, 림프구 분리 배지(밀도 경사 배지)를 혈액으로부터 PBMC를 분리하는데 사용하였다. 부피 7㎖의 희석된 혈액으로 밀도 경사 배지 3㎖ 상에서 층을 형성하였다. 층을 형성한 후, 층이 형성된 혈액의 원심분리를 분당 1500라운드의 속도로 30 내지 35분 동안 실행하여 PBMC를 획득하였다. 이렇게 얻은 PBMC를 4℃에서 분당 1600라운드의 속도로 10분 동안 원심분리에 의해 RPMI로 2회 세척하였다. 세척된 PBMC를 배양 배지로 옮겼다. 배양 배지는 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG)과 인간 재조합 알부민(시그마-알드리치 컴퍼니, 엘엘씨 제품)의 첨가가 있는, L-글루타민과 탄산수소나트륨을 포함하는 RPMI 1640 배지의 혼합물로 구성되었다. 배양 조건은 5.0% CO2 및 37℃에서 유지하였다. PBMC 배양 기간은 48 내지 52시간이었다. 48 내지 52시간 후, 전혈의 추가적인 부분을 동일한 환자로부터 취하였다. 추가적인 PBMC를 동일한 방법으로 추출하였다. PBMC의 제2 배치를 배양된 PBMC와 혼합하고, 혼합물을 카테터를 통하여 환자의 자궁으로 이식하였다. 절차를 총 10 내지 15분 내 빠르게 수행한다. 각각의 환자에 있어서 자궁내 적용을 위한 전체 PCMB의 부피는 0.2 내지 0.3㎖였다.
배아 해동 및 이식: 각각의 환자에 있어서, 배아 이식을 위하여 2개의 배반포를 선택하였다. 표준 메디컬트(등록상표) 프로토콜을 사용하여 해동을 실행하였다. 배아를 액체 질소로부터 제거하고 37℃의 용액 내로 넣은 다음, 실온에서 여러 가지 용액으로 세척하고, 다시 37℃에서 용액 내로 넣은 다음, 37.1℃의 온도에서 6시간 동안 인큐베이터 내 배양 배지 중에 넣었다. 배아를 블라스트어시스트 메디컬트(등록상표) 배지 중에서 또는 해동 후 3 내지 4시간 배양하였다. 그 다음 배아를 대략 15분 동안 메디컬트(등록상표) UTM 배지 내로 넣었다. 쿡(Cook(등록상표)) 메디컬 초음파 제어 카테터를 통해 메디컬트(등록상표) UTM의 사용으로 배아 이식을 실행하였다.
IVF 절차: 모든 그룹의 여성들은 IVF 시술을 받았다. 그룹 1에서 실행된 IVF 절차는 PCMB의 사용을 포함하지 않은 반면; 그룹 2에 대한 IVF 절차는 PBMC의 사용으로 수행하였다. 각각의 그룹의 여성에 대한 시술 과정은 본 명세서에 기재된 바와 같이 "신선한-IVF" 주기 및 "냉동-IVF"의 2단계를 포함한다. 배아 이식한 날에, 자궁내막 크기는 환자의 모든 그룹에서 9 내지 11㎜로 측정되었다. 배아 이식 후, 배아 착상을 위한 자궁내막을 준비하기 위하여 IVF 시술 동안 표준인 프로게스테론을 모든 환자에 투여하였다. 배아의 착상은 배아 이식하고 2주 후에 실행된 b-hCG 상에서 혈액 검사에 의해 확인하였다. 임상적 임신은 배아 이식하고 3주 후에 초음파 검사에 의해 확인하였다.
모든 그룹의 여성은 2개의 배반포 이식과 함께 1회의 "신선한-IVF" 주기를 겪었다. 각각의 환자는 임신에 대하여 시험을 받았다. 시험이 임상적 또는 생화학적 임신이 없는 것으로 나타났을 때 결과는 실패한 것이었다. "신선한-IVF" 주기가 배아의 성공적인 착상으로 이어지지 않은 경우, 동결한 배아를 부정적인 "신선한-IVF" 주기 후 2 내지 3 월경 주기 사이의 시간-지연 기간 후 환자의 자궁강으로 도입하여 "냉동-IVF" 주기를 실행하였으며, 이는 난모세포가 환자의 난소로부터 회수되고 약 3개월 후에 측정되었다.
그룹 1의 여성은 어떠한 PCMB 적용을 받지 않았고; 그룹 2의 여성은 대기 기간의 종료 후 즉시 PBMC의 처치를 받았다. "신선한-IVF" 동안, PBMC를 난자 회수하고 48 내지 52시간 후 배아 배양의 2일째에 각각의 피험체의 자궁 내로 투여하였다. "냉동-IVF" 주기 동안, PBMC를 배아 이식하기 약 24시간 전에 자궁으로 투여하였다.
결과: PBMC없이 신선한-IVF 시술을 받은 환자의 그룹은 착상률이 22.2%(90명의 ET 후 20명의 임상적 임신)가 되었다. "신선한-IVF" 방법 동안 PMBC의 사용은 최대 31.1%(90명의 ET 후 28명의 임상적 임신)까지의 착상률 증가를 야기하였다. "냉동-IVF" 시술을 통한 시도를 겪은 여성의 그룹에서(시간 지연은 그룹 1 및 그룹 2 모두에 있어서 적어도 3개월을 지속함), PBMC의 자궁내 적용이 없는 경우의 착상률은 21.4%(70명의 ET 후 15명의 임상적 임신)인 반면, PBMC의 적용후 착상률은 거의 2배로 높은 41.9%(62명의 ET 후 26명의 임상적 임신)이었다. 그룹 1(PBMC의 적용이 없는 90명의 환자)에 대한 전체 성공률은 38.9%(35명의 임상적 임신)이었다. 그룹 2(PBMC이 적용이 있는 90명의 환자)에 대한 전체 성공률은 60.0%(54명의 임상적 임신)이었다. 본 연구의 임상적 결과는 하기 표 1에 제시되어 있다. 약어 "ET"는 "배아 이식"을 나타낸다.
| 환자에 대하여 PBMC 의 투여가 있고 없는 “신선한- IVF ” 및 “냉동- IVF ”에서의 착상률 | ||
| 임상적 임신율 | ||
| 그룹 1( PBMC 없음) | 그룹 2( PBMC 가 있음) | |
| 신선한- IVF | 22.2%(90명의 ET 후 20명 임신) | 31.1%(90명의 ET 후 28명 임신) |
| 냉동- IVF | 21.4%(70명의 ET 후 15명 임신) | 41.9%(62명의 ET 후 26명 임신) |
| 전체 | 38.9%(90명이 환자에 대하여 35명 임신) | 60.0%(90명의 환자에 대하여 54명 임신) |
표 1은 배아 이식 전 자궁의 준비를 통하여 여성 자신의 PBMC의 사용을 통한 전통적인 IVF와 비교할 때 증가된 임신율을 얻었음을 입증한다. 지연된 또는 "냉동-IVF" 기술을 체외 수정 공정 동안 여성 자신의 PBMC의 투여에 의해 환자의 자궁의 개시를 위한 준비와 결합하는 것은 이미 공지된 IVF 절차와 비교하여 불임 여성의 임신율에 있어서 상당한 증가를 생성하며, 아마도 상승 결과로서 여성 환자의 자가면역계가 호르몬 균형을 되찾을 수 있게 하고 개시 공정은 배아 착상을 위한 향상된 능력을 가지는 자궁강에서 실현될 수 있게 한다는 것을 추가로 입증한다.
본 명세서에서 "하나의 실시형태", "일 실시형태", "예시적인 실시형태" 등에 대한 임의의 언급은 실시형태와 함께 기술된 특정한 특성, 구조, 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 본 명세서에서의 다양한 곳에서 이와 같은 어구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시형태를 말할 필요는 없다. 또한, 특정한 특성, 구조 또는 특징이 임의의 실시형태와 함께 기술되어 있을 때, 실시형태의 다른 것과 함께 이와 같은 특성, 구조, 또는 특징을 초래하는 것이 당업자의 견지 내에 있음이 제안된다.
실시형태가 다수의 실시형태와 관련하여 기술되었지만, 다수의 다른 변형 및 실시형태가 당업자에 의해 고안될 수 있음이 본 개시 내용이 원리의 사상 및 범주 내에 속할 것임이 이해되어야 한다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용, 도면 및 첨부된 특허청구범위의 범주 내의 주제 조합 배열의 구성 부품 및/또는 배열에서 다양한 변이 및 변형이 가능하다. 구성 부품 및/또는 배열에서의 변이 및 변형에 더하여, 대안품의 사용이 또한 당업자에게 명백할 것이다.
Claims (32)
- 여성 환자에 대한 체외 수정(in vitro fertilization) 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 말초 혈액 단핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 자궁 내로 도입하는 단계, 및
(b) 상기 환자의 체외 수정 개시 다음 소정의 지연 후 환자의 자궁 내로 적어도 하나의 배아를 이식하는 단계를 포함하되;
상기 방법은 이러한 단계들이 없는 체외 수정 방법과 비교할 때 임신의 성공적인 개시와 함께 자궁에서 배아 착상의 확률 증가를 가져오는 것인, 체외 수정 방법. - 제1항에 있어서, 상기 소정의 지연은 환자의 자가면역 반응의 위험을 감소시키는데 충분한 시간의 양인 것인 체외 수정 방법.
- 제1항에 있어서, 배아 이식 전 시간의 지연은 환자의 적어도 2회의 월경 주기 또는 배란 2회 주기인 것인 체외 수정 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 말초 혈액 단핵 세포는 환자의 혈액으로부터 획득한 것인 체외 수정 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 배아는 배아 이식 배지 내에서 자궁으로 이식되며, 상기 배아 이식 배지는 개시-촉진제를 포함하는 것인 체외 수정 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 환자는 사람이고, 상기 개시-촉진제는 가용성 사람 백혈구 항원 G(sHLA-G)이며, 배아 이식 배지 중 sHLA-G의 농도는 0.175 내지 0.350 OD의 범위에 있되, OD는 400 내지 450㎚의 범위의 파장에서 측정되는 광학 밀도를 의미하는 것인 체외 수정 방법.
- 제6항에 있어서, 자궁 내로 배아 이식 직전 5분 내지 20분의 범위의 시간 동안 상기 배아 이식 배지에서 배아를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 여성 환자에 대한 체외 수정 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 상기 환자에서 배란을 개시하여 적어도 하나의 난모세포를 획득하는 단계,
(b) 상기 환자로부터 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC)를 획득하는 단계,
(c) 단계 (a) 후 소정의 지연 후에 환자의 자궁 내로 상기 환자의 PBMC를 도입하는 단계, 및
(d) 단계 (c) 후 상기 여성 환자의 자궁 내로 배아를 도입하여 자궁에서 배아의 착상을 유발시키는 단계를 포함하는, 체외 수정 방법. - 제8항에 있어서, 상기 환자는 사람이고, 상기 배아는 단계 (a)에서 상기 환자로부터 획득한 난모세포의 수정에 의해 유래된 것이며; 단계 (c)의 소정의 지연은 상기 환자의 적어도 2회의 월경 주기 또는 배란 2회 주기와 동일하고; 단계 (d)에서 상기 배아는 단계 (c)의 20 내지 24시간 후 상기 환자의 자궁 내로 도입되는 것인 체외 수정 방법
- 여성 환자에 대한 체외 수정 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 체외 수정을 개시하는 단계;
(b) 상기 환자의 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 제1 부분을 획득하는 단계;
(c) 적당한 배양 배지에서 상기 PBMC의 제1 부분을 배양하는 단계;
(d) 환자의 혈액으로부터 PBMC의 신선한 제2 부분을 획득하는 단계;
(e) 상기 PBMC의 배양한 제1 부분을 PBMC의 신선한 제2 부분과 합치는 단계;
(f) 배아 이식 전에 상기 환자의 자궁으로 합한 PBMC를 도입하는 단계; 및
(g) 상기 환자의 자궁 내로 적어도 하나의 배아를 이식하여 임신을 유발하는 단계를 포함하는 체외 수정 방법. - 제11항에 있어서, 상기 단계 (c)의 적당한 배양 배지는 L-글루타민, 탄산수소나트륨, 인간 재조합 알부민 및 인간 융모성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin: hCG)을 포함하는 RPMI 1640 배지를 포함하며; 상기 hCG의 농도는 배양 배지의 밀리리터 당 5IU 이상인 것인 체외 수정 방법.
- 여성 환자에 대한 체외 수정 방법으로서,
(a) 적어도 하나의 난모세포를 환자로부터 획득하는 단계;
(b) 상기 난모세포를 정자로 수정하여 접합체를 형성하고 시험관내에서 상기 접합체를 배아 단계로 발달시키는 단계;
(c) 상기 배아를 냉동보존하는 단계;
(d) 환자의 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 제1 부분을 추출하는 단계;
(e) 적당한 배양 배지에서 상기 PBMC의 제1 부분을 배양하는 단계;
(f) 환자의 자가면역 반응의 위험을 감소시키는 데 충분한 소정의 시간 동안 대기하는 단계;
(g) 단계 (f)의 대기 기간의 마지막 날에 환자의 혈액으로부터 PBMC의 신선한 제2 부분을 추출하는 단계;
(h) PBMC의 배양된 제1 부분을 PBMC의 신선한 제2 부분과 합쳐서 신선한 PBMC와 배양된 PBMC를 포함하는 조성물을 획득하는 단계;
(i) 상기 PBMC의 조성물을 환자의 자궁 내로 도입하는 단계;
(j) 상기 배아를 냉동보존된 상태로부터 해동시키는 단계; 및
(k) 적어도 하나의 해동된 배아를 환자의 자궁 내로 이식하여 임신을 유발하는 단계를 포함하는 체외 수정 방법. - 제12항에 있어서, 상기 소정의 시간은 단계 (a)에서 시작하여 측정되고, 상기 기간은 환자의 적어도 2회의 월경 주기 또는 배란 2회 주기인 것인 체외 수정 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 배아는 유리화에 의해 냉동보존된 것인 체외 수정 방법.
- 제12항에 있어서, 배아 이식 전 상기 배아의 유전자 시험을 실행하는 단계를 더 포함하는, 체외 수정 방법.
- 제12항에 있어서, 시험관내 발달의 적어도 일부 동안 상기 배아의 운동을 진단하는 단계를 더 포함하는, 체외 수정 방법.
- 제12항에 있어서, 배아 이식 전 상기 배아의 형태학적 특성을 진단하는 단계를 더 포함하는, 체외 수정 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 배아 이식은 배아가 Gardner의 분류에 따라서 결정된 바와 같은 II AB 내지 V AA의 범위로 배반포 성숙의 상태를 가지는 것인 체외 수정 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 환자의 자궁의 내막을 측정하는 단계를 더 포함하되, 배아 이식시 자궁내막의 두께는 9 내지 11㎜의 범위인 것인 체외 수정 방법.
- 제12항에 있어서, PBMC의 상기 제1 부분은 4.8 내지 6.0% 이산화탄소(CO2)의 존재 하 36.7 내지 37.3℃에서 배양되고, 상기 적당한 배양 배지는 (i) RPMI 1640 배지, L-글루타민, 탄산수소나트륨, (ii) 인간 재조합 알부민 및 (iii) 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG))을 포함하며; 상기 배양 배지 중 hCG의 최소 농도는 5 IU/㎖ 이상인 것인 체외 수정 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 PBMC의 제1 부분은 48 내지 72시간 범위의 시간 동안 배양되는 것인 체외 수정 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 단계 (i)의 조성물 중 PBMC의 농도는 상기 조성물의 밀리리터 당 4백만 내지 8백만개 세포의 범위인 것인 체외 수정 방법.
- 제12항에 있어서, 단계 (i)에서 자궁으로 도입되는 조성물의 부피는 0.1 내지 0.3㎖의 범위인 것인 체외 수정 방법.
- 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 배양하는 방법으로서,
(a) 환자의 혈액으로부터 획득한 PBMC의 부분을 제공하는 단계, 및
(b) (i) L-글루타민과 탄산수소나트륨을 포함하는 RPMI 1640 배지, (ii) 인간 재조합 알부민 및 (iii) PBMC의 능력을 개선시켜 조직 성장을 향상시킬 수 있는 촉진제를 포함하는 배양 배지 중에서 4.8 내지 6.0% 이산화탄소(CO2)의 존재 하 36.7 내지 37.3℃에서 상기 PBMC의 부분을 증식시키는 단계를 포함하는, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 배양 방법. - 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 배양하는 방법으로서,
(a) 환자의 혈액으로부터 PBMC를 추출하는 단계,
(b) (i) L-글루타민과 탄산수소나트륨을 포함하는 RPMI 1640 배지, (ii) 인간 재조합 알부민 및 (iii) PBMC의 능력을 개선시켜 조직 성장을 향상시킬 수 있는 촉진제를 포함하는 배양 배지 중에서 4.8 내지 6.0% 이산화탄소(CO2)의 존재 하 36.7 내지 37.3℃에서 상기 추출된 PBMC의 부분을 증식시키는 단계, 및
(c) 단계 (a)에서 획득한 신선한 PBMC를 단계 (b)에서 획득한 PBMC의 배양된 부분과 합쳐서 신선한 PBMC와 배양된 PBMC를 포함하는 조성물을 획득하는 단계를 포함하는, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 배양 방법. - 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 배양하는 방법으로서,
(a) 환자의 혈액으로부터 획득한 PBMC의 부분을 제공하는 단계,
(b) (i) L-글루타민과 탄산수소나트륨을 포함하는 RPMI 1640 배지, (ii) 인간 재조합 알부민 및 (iii) PBMC의 능력을 개선시켜 조직 성장을 향상시킬 수 있는 촉진제를 포함하는 배양 배지 중에서 4.8 내지 6.0% 이산화탄소(CO2)의 존재 하 36.7 내지 37.3℃에서 상기 PBMC의 부분을 증식시키는 단계,
(c) 환자의 혈액으로부터 PBMC의 적어도 하나의 추가적인 신선한 부분을 추출하는 단계,
(d) PBMC의 배양된 부분을 PBMC의 신선한 부분과 합쳐서 신선한 PBMC와 배양된 PBMC를 포함하는 조성물을 생성하는 단계,
(e) 선택적으로, 원하는 양의 배양된 PBMC를 획득하는데 충분한 시간 동안 단계 (b)를 반복하는 단계, 및
(f) 선택적으로 단계 (c) 및 단계 (d)를 반복하는 단계를 포함하는, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 배양 방법. - 제26항에 있어서, 상기 단계 (a)의 환자는 단계 (c)의 환자와 상이한 것인, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 배양 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 촉진제는 PBMC 배양 배지 중 최소 농도가 5 IU/㎖인 인간 융모성 성선 자극 호르몬인 것인, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 배양 방법.
- 환자의 조직을 보수, 조작(engineering), 회복 또는 처치(treating)하는 방법으로서, 상기 방법은 제26항의 조성물의 존재 하에서 조직을 성장시키는 단계를 포함하는, 환자의 조직의 보수, 조작, 회복 또는 처치 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 조직은 환자의 자궁의 내막인 것인, 환자의 조직의 보수, 조작, 회복 또는 처치 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 환자는 인간, 쥣과 동물 또는 가축 동물 기원인 것인 체외 수정 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 배아는 여성 환자 동물의 종, 잡종 및 품종과 상이한 동물의 환자, 종, 잡종 또는 품종으로부터 획득한 난모세포의 수정에 의해 유래된 것인 체외 수정 방법.
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