JP2005529609A - 体外受精 - Google Patents

Abstract

本発明は、従来技術の方法より品質の良い哺乳類前胚および幹細胞を製造するための方法および系に関する。該系は、哺乳類卵母細胞を得る手段、哺乳類精子を得る手段、および1チャンバーの酸素圧を他のチャンバーの酸素圧と独立して変化させることができる少なくとも2の分離した気密性チャンバー(ここで、該少なくとも2の分離した気密性チャンバーはメインチャンバーと少なくとも1のレジデンスチャンバーを構成する)を有する装置を含む。以下の工程を含む哺乳類前胚のin vitro製造方法：a1)哺乳類卵母細胞を得、a2)哺乳類精子を得、b)該卵母細胞と該精子を培養し、c)該卵母細胞を該精子で受精させて受精卵を得、d)受精卵を細胞分割させて多細胞前胚を得る(ここで、工程a1)またはa2)の少なくとも1は15%以下の酸素圧で行われる)、またはe)該受精卵母細胞を細胞分割させて多細胞前胚を得る(ここで、該培養は細胞を培養できる酸素圧で行い、該工程の少なくとも1は酸素圧の変化を含む)。幹細胞を多細胞前胚から製造する。

Description

本発明は、培養条件が全培養期間の酸素圧の低下もしくは培養期間中のある期間の酸素圧の低下を含むか、または培養条件が培養期間を通した酸素圧の変化もしくは培養期間のある期間における酸素圧の変化を含む、卵母細胞および精子のin vitro同時培養、体外(in vitro)受精(IVF)、および受精配偶子のin vitro培養に関する。さらに本発明は、未成熟卵母細胞または精子の体外(in vitro)成熟(IVM)、成熟卵母細胞を精子細胞と同時培養して卵を受精させることに関する。

自然界では、受精は精子細胞が温血動物種(ヒトを含む)の雌に注入され、次いで卵母細胞に結合し、融合することにより生じる。次いでこの受精卵母細胞は分割して胚を形成する。最近数十年間に、科学者および臨床医が生殖補助技術を使用してある個体の不妊治療のためこれら事象に介入し、他の場所または日時に用いるために精子、卵母細胞、または胚を保存することが可能になってきた。体外受精(IVF)は、例えば腹腔鏡検査法により卵を回収し、次いで卵を精子と混合し、胚を培養し、次いでそれを雌の子宮腔に移植して発育を継続させることを含む。最近の革新により、精子を卵細胞質内にマイクロインジェクションする細胞質内精子注射(ICSI)が導入された。

該方法の各段階で、in vitro介入は精子、卵母細胞、および胚の正常な生存および機能を低下させる。多くの研究がこの方法の改良に向けて行われたが、全体的な成功はまだ限られている。例えば、IVFを試みて子供が誕生するのは20%以下である。卵母細胞および胚も培養後に著しく機能が損なわれる。このように、数十年間にわたる研究にも関わらず、生殖補助技術の分野、特に配偶子および胚の操作、培養、および保存の分野の改良には大きな余地がある。

哺乳類卵母細胞および胚を支持する培養条件の改良は特に必要である。体外で受精し、移植される胚の高い割合が早期に発育を止める。これは家畜およびヒトの両レベルで感じられる。ヒトの多くの不妊治療プログラムが卵母細胞または胚の体外受精または移植に関するものである。ヒトの不妊治療の成功率は高くない。成功率の低さはかなりの経済的および感情的負担をかける。成功率の漸進的改良でもかなりの利益があり得る。全体的成功率の低さの多くの原因の一つは、胚がin vitroで適切に成長および発育できないことが多いことである。胚の成長をよりよく支持する培養条件の改良は、不妊治療の成功率を高めることができるのみならず、皮肉なことに該治療による多胎妊娠の割合も減らすことができる。現在の方法の全体的成功率が低いため、施術者は妊娠の確率を増大させるため、多数の胚を移植することが多い。多数の胚の移植は多胎妊娠の確率も増大させる。各個々の胚が生存する可能性が高ければ、多数の胚を移植する必要性の認識も同時に減少し、多胎妊娠率も低下するだろう。

従来技術は異なる培養条件を記載している。US 6,140,121には、一酸化窒素が、in vitro、特に同時培養系において卵母細胞および胚のような細胞の生存および発育に悪影響を与える。そのような系にヘモグロビンのような一酸化窒素阻害剤を加えるとこの毒性作用を排除され、in vitroでの哺乳類卵母細胞、胚、または他の細胞の成長を促進する。

米国出願20010028878は、未成熟ヒト卵母細胞を細胞培養液中で10〜30時間培養することによるヒト卵母細胞の体外成熟方法を記載している。成熟の終点は、分裂中期IIである。

US 6,140,121は、生殖細胞および胚の生存および機能を改善する方法および組成物を記載している。精子、卵母細胞、および胚の生存および機能は、アラビノース、ガラクトース、および/またはヘキスロン酸を含む多糖を用いることによりin vivoまたはin vitroで改善される。特に、そのような多糖(例えばアラビアゴム、ペクチン、またはガラクツロン酸)を含む非殺精子潤滑剤は、性交、人工授精、または精子回収時の精子の受精可能性を増大させる。同様に、アラビノース、ガラクトース、および/またはヘキスロン酸を含む多糖を含む凍結媒質は精子、卵母細胞、または胚の生存性を増大させる。

US 6,110,741は、胚培養のための性腺刺激ホルモン放出ホルモン含有組成物および体外受精方法を記載している。添加した外因性性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)含有組成物存在下の霊長類胚のin vitro培養は、胚の生存性および付着の増大に関連した絨毛性性腺刺激ホルモン産生の増大を生じる。体外受精胚のGnRHによる処置を用いて着床を改善することができる。GnRHのアゴニストは、胚の付着能力を低下させるため、受精後避妊薬として有用である。

US 6,050,935は、膣内受精およびメインチャンバーおよびマイクロチャンバーを含む培養容器を記載している。

US 5,882,928は、哺乳類卵母細胞の体外成熟および受精について記載している。哺体外受精方法は、卵母細胞成熟阻害剤含有培養中で哺乳動物の月経周期の非常に初期の哺乳類卵巣から得た乳類未成熟卵母細胞を培養し、該阻害剤を除去し、卵母細胞を成熟させ、受精させて次の子宮移植用の胚を得ることを含む。好ましくは、該阻害剤はdbcAMPである。

US 5,837,543は、雌由来の卵母細胞を単層培養ヒト卵管上皮細胞と接触させ、該卵母細胞を受精させ、胚を該雌に移植し戻すヒト胚同時培養系を記載している。

US 5,730,777は、i)雰囲気(ガス雰囲気)を含む第一チャンバーを規定する第一チャンバー壁、およびii)第一チャンバーを実質的に取り囲む第二チャンバー(ここで、第二チャンバーは第一および第二チャンバー壁間に雰囲気を含む)を規定する第二チャンバー壁を含む筐体中で操作を行うことを含む、閉鎖チャンバー中ガス雰囲気下で操作を行うための装置を記載している。

US 4,892,830は、該インキュベーターチャンバーの筐体が、短波長光の毒性作用からチャンバー内の生物学的物質を保護するために約500nm以下の波長を有する光の通過を強力に減衰させる、環境的に調節されたインキュベーターを記載している。該インキュベーターは、チャンバー内に酸素および二酸化炭素濃度を測定するためのセンサー、および所望する二酸化炭素および酸素レベルを維持するために該チャンバー内の周囲ガスに二酸化炭素、窒素、または酸素を加える手段も含む。空気中の正常酸素濃度(21%)はマウス接合体および前胚に毒性であることがわかっている。しかしながら、酸素レベルを5〜10%に減少させると、この阻害は観察されず胚は発育し続ける。

W09830676は、in vitroで発育するための高度に安定な物理および化学的環境を必要とする、温度調節液体バスに浸漬するか、またはその中に沈めた閉鎖容器中で培養する、細胞および組織、特に感受性細胞および組織、例えば卵母細胞、受精卵母細胞、および前移植胚のための方法およびインキュベーターを記載している(ここで、該容器は例えば適切なレベルの二酸化炭素、酸素、および湿度を含む適切な内部雰囲気を提供する)。

W09967364は、初期胚の胚盤胞期までの増殖用の培地を記載している。該培地は、移植準備が整った胚盤胞に発育する前胚盤胞胚の比率を増大させるための有効量のヒトGM-CSFを含む。初期ヒト胚を移植準備が整った胚盤胞に成長させる方法も記載している。該方法は、移植準備が整った胚盤胞の割合が増加する条件下で、一定時間有効量のヒトGM-CSFを含む培養液中で該胚をin vitroでインキュベーションする工程を含む。初期精子ヒト胚を移植準備が整った胚盤胞に成長させる方法を含むIVFプログラムも記載している。

W00032140は以下のことを記載している。すなわち、IVFに用いる種々の方法を通して単一培養液にヒト生殖細胞を浸漬する代わりに、種々のIVF方法を実施するときに生殖細胞が一連の別個の培養液を移動することができる方法を提供する。
(発明の要約)

本発明は、従来技術の方法より品質のよい哺乳類前胚を製造するための方法および系に関するものであり、本発明方法により得られる前胚を用いる体外受精により妊娠の成功確率が増加する。本発明方法により得られる前胚を用いることにより品質のよい幹細胞を得ることもできる。

哺乳類前胚のin vitro製造系は、
・哺乳類卵母細胞を得る手段、
・哺乳類精子を得る手段、および
・1チャンバーの酸素圧を他のチャンバーの酸素圧と独立して変化させることができる少なくとも2の分離した気密性チャンバー(ここで、該少なくとも2の分離した気密性チャンバーはメインチャンバーと少なくとも1のレジデンスチャンバーを構成する)を有する装置であって、
・哺乳類卵母細胞および/または哺乳類精子を得る手段と連絡することができる少なくとも1のエントランスポート、および
・前胚を回収するエグジットポート、ならびに
・該少なくとも2のチャンバー間に、チャンバー間の卵母細胞、精子、および/または前胚の移動を可能にする連絡ポートを含む装置を含む。

ある局面において、該系は細胞培養の培養に用いる。原則として、すべての細胞培養は該系中で培養することができ、配偶子、胚、胚盤胞、幹細胞、および幹細胞株の培養に該系を用いるのが好ましい。

該系は細胞培養を培養するための異なる方法に用いることができる。ある局面において、哺乳類前胚のin vitro製造方法は以下の工程を含む：
a1) 哺乳類卵母細胞を得、
a2) 哺乳類精子を得、
b) 該卵母細胞と該精子を培養し、
c) 該卵母細胞を該精子で受精させて受精卵を得、
d) 受精卵を細胞分割させて多細胞前胚を得る
(ここで、工程a1)またはa2)の少なくとも1は15%以下の酸素圧で行われる)。

別の局面において、哺乳類前胚のin vitro製造方法は以下の工程を含む：
a) 哺乳類卵母細胞および哺乳類精子から選ばれる配偶子を得、
b) 該卵母細胞および精子を培養し、
c) 該卵母細胞を精子で受精させて受精卵母細胞を得、
e) 該受精卵母細胞を細胞分割させて多細胞前胚を得る、
ここで、該培養は細胞を培養できる酸素圧で行い、該工程の少なくとも1は酸素圧の変化を含む。

ある局面において、本発明は本明細書にさらに記載のごとく卵母細胞および精子を培養し、得られる前胚を哺乳類雌の子宮に移植することを含む前胚の移植方法を含む。

さらに、高品質の前胚を胚性幹細胞の製造に用いることもできよう。高品質胚は、内部細胞塊の量が増大した細胞を有し、増加した数の幹細胞の発育をもたらす。

幹細胞の製造方法は、
a) 本明細書に記載の多細胞前胚を得、
b) a)の多細胞前胚を単離し、
c) b)の前胚の内部細胞塊から細胞を単離し、
d) マトリックスゲル中で内部細胞塊由来の該単離細胞を培養し、
e) 幹細胞を得ることを含む。

ある局面において、本明細書に記載の方法により得られる多細胞前胚から得られる幹細胞が得られる。

ある局面は、該細胞の染色体または細胞表面の抗原性に突然変異や他の遺伝的変化が生じないという意味で安定である幹細胞である。

幹細胞は、1またはそれ以上の幹細胞株に発育することができる。ある局面において、幹細胞株は本明細書に記載の方法により製造される幹細胞から得られる。

幹細胞株は、異なる分化細胞の生成を誘導することができる。すなわち、幹細胞株の起源および該幹細胞株の培養の培養条件を知ることが重要であり得る。

ある局面は、本明細書に記載の多細胞前胚から発育した幹細胞、幹細胞および該幹細胞が得られる細胞培養の培養条件を記載する証明書を含む幹細胞パッケージである。
(定義)

本発明の文脈において、用語「アポトーシス」は、DNAスタンドブレイク(stand-break)により予測される細胞自身がその核DNAを破壊する調節された細胞死と理解すべきである。

本発明の文脈において、用語「ブラストマー(blastomer)」は胚の分割(卵割)後の胚に生じるより小さな細胞である。

本発明の文脈において、用語「胚盤胞」および「多細胞前胚」は互換性に用い、胎盤を形成する潜在能力がある外部細胞と胚を形成する潜在能力がある内部細胞塊からなる胚を説明するのに用いる。

本発明の文脈において、用語「酸素圧の変化」は、酸素圧が低下または増加する状態を意味する。該変化は、可視的または画像判定に基づくかまたは細胞培養の発育の時間枠に対する知識に基づき、または前胚の代謝の変化に基づいて細胞の発育期によって行われる。

本発明の文脈において、用語「胚」は、2つの前核を有する1細胞を構成する受精卵、または2細胞から細胞塊までを構成する細胞分割を受けた受精卵である。

本発明の文脈において、用語「配偶子」は、雌由来の未受精卵または雄由来の精子である。

本発明の文脈において、用語「着床(移植、implantation)」は雌の子宮に胚が移植されることを意味する。

本発明の文脈において、用語「IVM」は「体外成熟」を意味する。

本発明の文脈において、用語「IVF」は「体外受精」を意味する。

本発明の文脈において、用語「低下した酸素圧(酸素圧の低下)」は、酸素圧15%以下を意味する。

本発明の文脈において、用語「MF-II」は、第二減数細胞分裂の分裂中期の卵母細胞である。MF-II卵母細胞は、1極体を有し、卵丘複合体が膨化し、最終的に卵核胞の崩壊を経る。

本発明の文脈において、用語「卵母細胞」は雌から得られる配偶子である。該配偶子は未成熟でも成熟でもよい。

本発明の文脈において、用語「酸素圧」は、組織のガス相内または細胞培養系周囲の酸素濃度である。

本発明の文脈において、用語「酸素圧単位」は、酸素圧の変化を説明するのに用い、例えば3%〜5%の変化が2単位の変化である。

本発明の文脈において、用語「一次卵母細胞」は未成熟卵母細胞である。該卵母細胞は第一減数分裂が終了するまで未成熟である。

本発明の文脈において、用語「前期II」は、第二減数分裂の前期の段階である。

本発明の文脈において、用語「精子」は、雄由来の配偶子である。精子は未成熟でも成熟でもよく、後者の段階では侵入により卵母細胞を受精させることができる。

本発明の文脈において、用語「幹細胞」は胚盤胞の内部細胞塊から得られる未分化な多能性または全能性細胞である。

本発明の文脈において、用語「幹細胞株」は、幹細胞から得られる細胞培養であり、幹細胞株は一定期間変化を受けずに培養することができる意味で安定である。幹細胞株は、部分的に分化または未分化でありうる。すなわち、動物体内のすべての細胞種ではなくあるものに発育することができる意味で多能性であるか、または全能性すなわちすべての細胞種に分化することができる。

本発明の文脈において、用語「接合体」は受精卵または1細胞胚である。

本発明の文脈において、用語「透明帯」は胚の殻(鞘)である。
(図面の説明)

図1はVan Abbelらに基づく胚スコアリングシステムを示す。
図2は累積胚スコアリング(CES)システムを示す。
図3はインキュベーターを示す。
(発明の詳細な説明)

以下の説明は、
a) 哺乳類卵母細胞および哺乳類精子から選ばれる配偶子を得、
b) 該卵母細胞および精子を培養し、
c) 該卵母細胞を精子で受精させて受精卵母細胞を得、そして
d) 受精卵母細胞を細胞分裂させて多細胞前胚を得る(ここで工程a)またはb)の少なくとも1は酸素圧15%以下で行われる)か、もしくは
e) 該受精卵母細胞を細胞分裂させて多細胞前胚を得る(ここで、培養は細胞を培養できる酸素圧で行い、工程の少なくとも1は酸素圧の変化を含む)工程を含む哺乳類前胚のin vitro製造方法を開示する。酸素圧の該変化は単一工程内で少なくとも2の異なる酸素圧で細胞培養を培養することを含む。酸素圧の変化は本明細書の他の場所に記載の細胞培養の発育期にしたがって行われる。特に、雰囲気の酸素圧での細胞培養の操作または観察では酸素圧の変化がなく、本発明の意図するところである。

IVF手順のある工程の酸素圧を変化または低下させるか、またはIVFの全工程の酸素圧を変化または低下させることにより、配偶子および胚の品質の改善が得られる。

酸素濃度20〜21%の雰囲気を含む条件での哺乳類配偶子、体外受精卵母細胞、または胚の培養は、配偶子および卵を阻害すると考えられる。工程a)、b)、c)、およびe)の1つまたはすべてにおける酸素圧の変化、および酸素レベルの1%〜15%レベルへの低下または酸素レベルの1%〜19%レベルへの低下は、より多量の胚が胚盤胞期に達することができることを意図する。ヒト体外成熟またはヒト体外受精技術の問題の一つは、精子調製および体外受精中に補充される高酸素圧から予め生じる遊離反応性酸素種の活性化および濃度であると考えられる。卵母細胞および精子の同時培養と組み合わせ、低下したまたは変化した酸素圧で配偶子および胚を操作および培養することによりIVF法の改良が得られ、驚くべきことにIVF法の改良はフィーダー細胞との同時培養を利用せずに得られた。

上記本発明において、工程a)、b)、c)、およびd)の1またはそれ以上を低下した酸素圧で行うことができるが、上記のように本発明において、工程a)、b)、c)、およびe)の1またはそれ以上を低下または増加した酸素圧で行うことができよう。

本発明の好ましい態様は、工程a)の少なくとも部分および他の工程の少なくとも1が酸素圧15%以下で行われる記載したin vitro培養方法である。ある態様において、工程a)およびb)は、低下した酸素圧で行われる。さらに好ましい態様は、工程a)、b)、c)、およびd)の少なくとも3は酸素圧15%以下で行われる該方法である。本発明の別の態様において、工程a)、b)、およびc)は低下した酸素圧で行われる。本発明のさらに別の態様において、工程b)、c)、およびd)は低下した酸素圧で行われる。さらなる態様において、工程a)、c)、およびd)は低下した酸素圧で行われる。さらなる態様において、工程a)、b)、c)、およびd)すべてが低下した酸素圧で行われる。

該方法の別の好ましい態様では、工程d)の酸素圧が他の工程b)およびc)のいずれかの酸素圧に比べて高い。
該方法のさらに好ましい態様では、工程a)、b)、c)、およびd)のすべておよび胚の子宮への移植が、酸素圧20%以下、例えば15%以下、例えば13%以下、例えば11%以下、例えば10%以下、例えば9%以下、例えば8%以下、例えば7%以下、例えば6%以下、例えば5%以下、例えば4%以下、例えば3%以下、例えば2%以下、例えば1%以下で行われる。

本発明の好ましい態様は、酸素圧の変化が工程a)で行われる本明細書に記載のin vitro培養方法である。本発明の他の好ましい態様は、酸素圧の変化が工程b)で行われる本明細書に記載のin vitro培養方法である。発明のさらに好ましい態様は、酸素圧の変化が工程c)で行われる本明細書に記載のin vitro培養方法である。本発明のさらに好ましい態様は、酸素圧の変化が工程e)で行われる本明細書に記載のin vitro培養方法である。

本発明の好ましい態様は、酸素圧の変化を工程a)および工程b)で行う本明細書に記載のin vitro培養方法である。本発明の別の好ましい態様は、酸素圧の変化を工程a)および工程c)で行う本明細書に記載のin vitro培養方法である。本発明のさらに好ましい態様は、酸素圧の変化を工程a)および工程e)で行う本明細書に記載のin vitro培養方法である。本発明のさらに好ましい態様は、酸素圧の変化を工程b)および工程c)で行う本明細書に記載のin vitro培養方法である。本発明の他のさらに好ましい態様は、酸素圧の変化を工程b)および工程e)で行う本明細書に記載のin vitro培養方法である。本発明のさらに好ましい態様は、酸素圧の変化を工程c)および工程e)で行う本明細書に記載のin vitro培養方法である。

特に、卵母細胞の成熟に関して酸素圧の上昇が好ましい。

本発明のある態様は、酸素圧の変化が工程a)、b)、およびc)で行われる本明細書に記載のin vitro培養方法である。本発明の他の好ましい態様は、酸素圧の変化が工程a)、b)、およびe)で行われる本明細書に記載のin vitro培養方法である。本発明のさらに好ましい態様は、酸素圧の変化が工程a)、c)、およびe)で行われる本明細書に記載のin vitro培養方法である。本発明のさらに好ましい態様は、酸素圧の変化が工程b)、c)、およびe)で行われる本明細書に記載のin vitro培養方法である。

本発明の好ましい態様は、酸素圧の変化が工程a)、b)、c)、およびe)すべてで行われる本明細書に記載のin vitro培養方法である。

ある態様において、培養条件は、最初に1%〜21%のレベルに選択される酸素圧を含む。

ある態様において、酸素圧の変化は、20%以下、例えば19%以下、例えば18%以下、例えば17%以下、例えば16%以下、例えば15%以下、例えば14%以下、例えば13%以下、例えば12%以下、例えば11%以下、例えば10%以下、例えば9%以下、例えば8%以下、例えば7%以下、例えば6%以下、例えば5%以下、例えば4%以下、例えば3%以下、例えば2%以下、例えば1%以下の酸素圧の変化である。

別の態様において、酸素圧の変化は、少なくとも1単位、例えば少なくとも2単位、例えば少なくとも3単位、例えば少なくとも4単位、例えば少なくとも5単位、例えば少なくとも6単位、例えば少なくとも7単位、例えば少なくとも8単位、例えば少なくとも9単位、例えば少なくとも10単位、例えば少なくとも11単位、例えば少なくとも12単位、例えば少なくとも13単位、例えば少なくとも14単位、例えば少なくとも15単位、例えば少なくとも16単位、例えば少なくとも17単位、例えば少なくとも18単位、例えば少なくとも19単位低下する酸素圧の変化である。

さらに別の態様において、酸素圧の変化は、1〜19単位、例えば1〜18単位、例えば1〜17単位、例えば1〜16単位、例えば1〜15単位、例えば1〜14単位、例えば1〜13単位、例えば1〜12単位、例えば1〜11単位、例えば1〜10単位、例えば1〜9単位、例えば1〜8単位、例えば1〜7単位、例えば1〜6単位、例えば1〜5単位、例えば1〜4単位、例えば1〜3単位、例えば1〜2低下する酸素圧の変化である。

ある態様において、酸素圧の変化は、2%以上、例えば3%以上、例えば4%以上、例えば5%以上、例えば6%以上、例えば7%以上、例えば8%以上、例えば9%以上、例えば10%以上、例えば11%以上、例えば12%以上、例えば13%以上、例えば14%以上、例えば15%以上、例えば16%以上、例えば17%以上、例えば18%以上、例えば19%以上、例えば20%以上、例えば21%以上の酸素圧の変化である。

別の態様において、酸素圧の変化は、少なくとも1単位、例えば少なくとも2単位、例えば少なくとも3単位、例えば少なくとも4単位、例えば少なくとも5単位、例えば少なくとも6単位、例えば少なくとも7単位、例えば少なくとも8単位、例えば少なくとも9単位、例えば少なくとも10単位、例えば少なくとも11単位、例えば少なくとも12単位、例えば少なくとも13単位、例えば少なくとも14単位、例えば少なくとも15単位、例えば少なくとも16単位、例えば少なくとも17単位、例えば少なくとも18単位、例えば少なくとも19単位増加させる酸素圧の変化である。

さらに別の態様において、酸素圧の変化は、1〜3単位、例えば2〜5単位、例えば3〜7単位、例えば4〜9単位、例えば5〜11単位、例えば6〜13単位、例えば8〜15単位、例えば10〜18単位、例えば12〜20単位増加する酸素圧の変化である。

好ましい態様において、上記変化後の酸素圧は、上記初期酸素圧に比べて高いかまたは低いレベルに制御される。すなわち、変化後の酸素圧は1%〜21%のレベルに制御することができる。

酸素圧のモニタリングおよび制御は当業者に知られたあらゆる方法で行うことができよう。

該方法のさらに別の好ましい態様では、該条件は酸素圧の上昇、次いで酸素圧の低下を含む。酸素圧の該上昇は少なくとも2単位であり、酸素圧の該上昇は少なくとも30分間維持される。ある態様において、酸素圧は少なくとも0,5%、最大20%である。特に卵母細胞を成熟させる時は酸素圧の上昇が好ましい。

別の態様において、酸素圧の変化は、少なくとも1分間、例えば少なくとも2分間、例えば少なくとも3分間、例えば少なくとも4分間、例えば少なくとも5分間、例えば少なくとも6分間、例えば少なくとも7分間、例えば少なくとも8分間、例えば少なくとも9分間、例えば少なくとも10分間、例えば少なくとも11分間、例えば少なくとも12分間、例えば少なくとも13分間、例えば少なくとも14分間、例えば少なくとも15分間、例えば少なくとも16分間、例えば少なくとも20分間、例えば少なくとも30分間、例えば少なくとも45分間、例えば少なくとも1時間、例えば少なくとも1.5時間、例えば少なくとも2時間、例えば少なくとも2.5時間、例えば少なくとも3時間、例えば少なくとも4時間、例えば少なくとも5時間、例えば少なくとも6時間、例えば少なくとも7時間、例えば少なくとも8時間、例えば少なくとも9時間、例えば少なくとも10時間行われる。

好ましい態様において、酸素圧の変化は、各工程a)、b)、c)、およびe)に示した組み合わせで上記の継続期間で1回またはそれ以上行うことができる。

ある態様において、上記変化の継続期間は、1またはそれ以上の工程における酸素濃度の変化を伴う工程a)、b)、c)、およびe)の示した各組み合わせに適用される。

該方法のさらに別の好ましい態様では、酸素圧は細胞または細胞構造の相または期、および卵母細胞または胚の条件または品質に応じて制御される。

ある態様において、本明細書に記載の細胞培養には本発明の工程b)において雌および雌の配偶子を同時培養することが含まれる。該同時培養は、少なくとも1分間、例えば少なくとも2分間、例えば少なくとも5分間、例えば少なくとも10分間、例えば少なくとも30分間、例えば少なくとも1時間、例えば少なくとも2時間、例えば少なくとも3時間、例えば少なくとも4時間、例えば少なくとも5時間、例えば少なくとも10時間、例えば少なくとも15時間、例えば少なくとも20時間、例えば少なくとも25時間、例えば少なくとも30時間、例えば少なくとも35時間、例えば少なくとも40時間、例えば少なくとも45時間、例えば少なくとも50時間行うことができよう。

別の態様において、酸素圧の変化は、少なくとも1分間、例えば少なくとも2分間、例えば少なくとも3分間、例えば少なくとも4分間、例えば少なくとも5分間、例えば少なくとも6分間、例えば少なくとも7分間、例えば少なくとも8分間、例えば少なくとも9分間、例えば少なくとも10分間、例えば少なくとも11分間、例えば少なくとも12分間、例えば少なくとも13分間、例えば少なくとも14分間、例えば少なくとも15分間、例えば少なくとも16分間、例えば少なくとも20分間、例えば少なくとも30分間、例えば少なくとも45分間、例えば少なくとも1時間、例えば少なくとも1.5時間、例えば少なくとも2時間、例えば少なくとも2.5時間、例えば少なくとも3時間、例えば少なくとも4時間、例えば少なくとも5時間、例えば少なくとも6時間、例えば少なくとも7時間、例えば少なくとも8時間、例えば少なくとも9時間、例えば少なくとも10時間行う。

好ましい態様において、酸素圧の変化は、各工程a)、b)、c)、およびe)に示した組み合わせで上記の継続期間で1回またはそれ以上行うことができる。

ある態様において、上記変化の継続期間は、1またはそれ以上の工程における酸素濃度の変化を伴う工程a)、b)、c)、およびe)の示した各組み合わせに適用される。

卵母細胞および精子の同時培養の目的は、精子による卵母細胞の受精を改善することである。さらに、培養条件は卵母細胞および精子で同じであり、これも受精を改善するものと思われる。
配偶子

上記本発明は、胚の形成に参加できるあらゆる種類の細胞を用いて実施することができ、そのような細胞の例には哺乳動物の卵母細胞および精子細胞が含まれる。哺乳類卵母細胞および哺乳類精子は、哺乳動物のそれぞれ雌および雄から得られる配偶子である。これら哺乳動物は、限定されるものではないが、ヒト、畜産動物、例えば乳牛、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、シカ、他の種類の家畜、例えばイヌ、ネコ、実験動物、例えばウサギ、ラット、マウス、サル、または限定されるものではないがトラ、ライオン、パンダ、ゴリラ、クジラを含む絶滅の危険性がある動物品種または絶滅危惧種、または限定されるものではないが畜産動物の繁殖、家畜の繁殖、または特に近親交配のあらゆる危険性を避けるために動物が雄をみつける可能性を妨げる条件下で生きている動物、例えば動物園で生きている動物の交尾を含むペア形成がヒトにより調節されている他の動物であり得る。

好ましい態様において、哺乳類卵母細胞および哺乳類精子は、乳牛から得られる配偶子である。別の好ましい態様において、哺乳類卵母細胞および哺乳類精子はブタから得られる配偶子である。さらに別の好ましい態様において、哺乳類卵母細胞および哺乳類精子はウマから得られる配偶子である。最も好ましい態様において、哺乳類卵母細胞および哺乳類精子はヒトから得られる配偶子である。
卵母細胞

多くの場合、上記卵母細胞は妊娠を望む雌患者から得られ、精子細胞はその夫と思われる雄から得られるか、または配偶子はカップルを構成する雌および雄から得られる。しかしながら、ある場合には雌または雄いずれかのドナー由来の細胞を用いるのが好ましいかもしれない。

好ましい態様において、卵母細胞は雌卵巣由来の未成熟卵母細胞として得られる。卵母細胞は卵巣から取り出される直後まで未成熟である。雌胎児の卵巣において、一次卵母細胞は第一減数分裂の前期を開始し、この段階では、周囲上皮細胞が発生し、原始卵胞を形成する。第一減数分裂の前期〜分裂中期のディクチオテン(dictyotene)期の卵母細胞を有する原始卵胞は、出生前から少なくとも思春期までまたは原始卵胞が第一減数分裂期に再び入るまで静止期を構成する。まだディクチオテン期の一次卵母細胞は、サイズの増加が始まり、周囲卵胞細胞は一次卵胞の段階に入るにつれて平面から立方形に変化し、次いで卵母細胞と卵胞細胞の間に透明帯が発生する。厚い細胞層が卵母細胞と透明帯の周囲に発生し始め、この細胞層の内側に液体が充満した空間が出現し、この空間が融合すると腔が形成される。腔が最大サイズに達すると、卵胞は成熟し(三次卵胞、グラーフ卵胞、または胞状卵胞とも呼ばれる)、直径6〜12mmに達した。卵胞が成熟するとすぐに一次卵母細胞は第一減数分裂を再開し、排卵直前に第一減数分裂が生じる。第一減数分裂の直後に第二減数分裂が始まり、二次卵母細胞が紡錘体形成を示すとすぐに排卵が起き、卵母細胞が卵巣から離脱する。排卵直前の成熟卵胞は直径約15mmである。二次減数分裂は卵母細胞が受精する場合にのみ完結する。

別の好ましい態様において、卵母細胞は一次卵胞、二次卵胞、前胞状卵胞、初期胞状卵胞、または胞状卵胞から得られる。本発明の好ましい態様において、後期原始期または一次期の卵胞からディクチオテン期の卵母細胞が得られる。

正常に排卵する女性は各月経周期につき上記未成熟卵母細胞を約300個補充するであろう。この補充は実際の周期の前に生じる。生理日にまだ約20〜30個の未成熟卵母細胞が存在するだろう。通常、アポトーシスのプロセスで排卵前に1個を残してすべての卵母細胞が死滅するだろう。第5〜10日で約10〜15個の未成熟卵母細胞が直径10〜12mmの小胞中に存在するだろう。あるものはまだ成長し、あるものはアポトーシスプロセスを受け始める。本発明の中で用いる配偶子は所望により直径約8〜12mmの卵胞から誘導される。そのような小胞の利点はそれが厳しいホルモン処理を受けずにかなりの数で存在し、超音波でみることができ、該胞の超音波誘導経膣穿刺を行って卵母細胞を回収することができる。

卵母細胞を針内への吸引により卵巣から得ることができる。卵母細胞の回収は通常2つの一般的方法の1つにより達成される。第一の超音波誘導吸引は静脈内鎮痛で行うことができる軽い外科的方法である。通常、超音波プローブを膣を通して挿入する。プローブは高周波の音波を放射し、これを骨盤臓器の画像に変換し、モニタースクリーンに示す。成熟卵胞を同定し、専門家が膣を通して針を胞内に誘導する。卵を吸引装置により針で取り出す。これを吸引とよぶ。針は腹壁または膀胱を通して卵胞内に誘導してもよい。これらアプローチは卵巣およびその卵胞に膣を通して導入した針で接近できない場合に必要なことがある。腹腔鏡検査法は通常全身麻酔が必要な外科的方法である。手術室内で外科医が望遠鏡に似た長く細いチューブの腹腔鏡を女性のへその中または下の切開部を通して挿入する。腹腔鏡を通して見ながら外科医は腹壁を通して卵胞内に針を誘導する。次に、卵および卵胞液を吸引する。

本発明の別の好ましい態様において、卵母細胞は一次、二次、または胞状卵胞を含む卵巣組織の部分またはすべてを除去し、該卵巣組織由来の含有一次、二次、または胞状卵胞を得ることにより卵巣から得られる。卵母細胞を雌から卵巣組織を除去した直後の卵巣組織から得、次いで受精の段階まで成熟させることができる。卵母細胞を卵巣組織から単離後に冷却または凍結し、次いで受精の段階まで成熟させることもできる。雌から除去した卵巣組織を卵母細胞を組織から単離する前に冷却または凍結することができる。

好ましい態様において、卵母細胞を回収するのに用いる針はシリンジの部分であり、該針および該シリンジ内の酸素圧は調節される。該針およびシリンジは、酸素圧を調節装置に接続して規定の圧に維持することができる、操作しやすい独立した単位を構成する。卵母細胞を入れたシリンジは卵母細胞を培養液に移す無菌条件に移す。無菌条件は層流空気流ベンチまたはインキュベーターの作業領域を構成することができる。卵巣はシリンジの針をインキュベーターの膜に貫通させ、次いで卵母細胞をインキュベーターを開けずに培養容器に移す方法で培養容器に移すこともできる。針およびシリンジを直接インキュベーターに接続することもできる。このようにして卵母細胞をインキュベーター内の培養容器に針およびチューブを通して卵巣から直接輸送する。したがって、方法に関わらず得られた卵母細胞を低下した酸素圧下に移すことが好ましい。

ある態様において、卵母細胞は卵母細胞を成熟させることができるホルモンで哺乳動物を処理した後の該哺乳動物から得られる。一般に、卵母細胞の回収は2回ある。女性をホルモンで処理することによる複数の成熟卵母細胞の回収、または女性ホルモン処理なしに未成熟卵母細胞を回収し、次いで卵母細胞を体外成熟。ホルモン処理に基づく方法は以下の通りである。排卵増強時に、薬剤を用いて通常各月に生じる1個の卵より数個の成熟卵の成長を患者の卵巣に誘導する。この段階はしばしば増強卵胞補充または排卵誘発と呼ばれる。プログラムおよび患者に応じて薬剤の種類や用量が異なる。薬剤を7〜10日間にわたり投与することが最も多い。現在用いられている薬剤には、限定されるものではないが、クエン酸クロミフェン、ヒト閉経期尿性性腺刺激ホルモン(hCG)、およびロイプロリドと呼ばれる性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)類似体が含まれる。これら薬剤のほとんどは単独または他と組み合わせて用いることができよう。

卵母細胞を回収する時が近づくと、卵が成長する液体で満たされた嚢である卵胞の発達を卵巣を超音波で頻繁にスキャンする方法でモニターする。血液試料を採取し、エストロゲンおよび時に黄体ホルモン(LH)の血清濃度を測定する。エストロゲンの産生は卵胞の発育につれて増加する。LHは排卵を誘発する。超音波検査および血液検査の結果を解釈することにより、卵を回収または取り出す一番よい時を決定する。卵胞がほぼ成熟すると(通常排卵の約1日半前に生じる)、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)の注射を行う。排卵は約36時間後に起きるはずであるから、hCGの使用は排卵の発生を調節することができる。hCGは通常排卵を誘発する女性の天然LHサージをまねる。このサージは、後で精子が導入されたときに受精するように卵子の変化も起こす。

また、未成熟卵母細胞を回収し、IVFに利用することができる。未成熟配偶子で出発する利点はいくつかある。不妊治療中の女性は通常体外受精のために十分な数の成熟前期II卵母細胞を得るために多くの日数にわたり複雑なホルモン治療を受ける。このホルモン治療は痛み、不快感、ストレス、および患者と医師が恐れる病状である卵巣過剰刺激症候群の危険性を含む。このホルモン療法は、そうしなければアポトーシスを起こす未成熟卵母細胞を助けるために行われる。すなわち、これらホルモンは卵巣内で未成熟卵母細胞をIVFに必要な十分数成熟させるのに必須である。ホルモンを投与しなければ正常に排卵する女性に見られるように卵母細胞が1個だけ成熟するだろう。アポトーシスプロセスが始まる前に卵巣からこの未成熟卵母細胞を放出させ、さらに臨床的合成培地中で成熟させることにより女性はホルモン治療に伴う危険性や不快感を避け、次のIVF治療のために十分な数の成熟分裂中期II(MF-II)卵母細胞を得ることができる。

好ましい態様において、上記ホルモン治療は性腺刺激ホルモンを用いて行う。すなわち、該治療は外因性または内因性ホルモン、およびFSHまたはLHレセプターに作用する他の物質を含むことができよう。別の好ましい態様において、該ホルモンは卵胞刺激ホルモン(FSH)である。さらに別の好ましい態様において、該ホルモンは黄体ホルモン(LH)である。さらなる態様において、該ホルモンはFSHもしくはLHまたは内因性関連ホルモンの誘導体である。
凍結保存

本発明のある態様において、上記で得られる卵母細胞は後で用いるために保存され、この保存は凍結保存である。上記のごとく卵母細胞を回収するときは複数の卵母細胞が得られ、これら卵母細胞はすべて速やかに受精工程に付されるわけではない。ある態様において、卵母細胞は温度20℃以下、例えば10℃以下、例えば5℃以下の保存処理で冷却される。別の態様において、卵母細胞は温度0℃以下、例えば約-40℃、例えば約-80℃の保存処理で凍結される。

IVFサイクルの終了時に、移植に利用可能な複数の胚が存在することが多く、これら胚の残りを上記のごとく保存することができる。4以上の胚の移植は多胎妊娠のかなりの危険性があり、単生児妊娠率は比例的に増加しないことがわかった。凍結保存の利点は、複数の刺激サイクルおよび卵母細胞回収を必要とせずに妊娠する機会が増加するかもしれないことである。

凍結保存用に選ばれた胚は、新鮮胚移植の日または翌日〜4日後に凍結することができる。胚を凍結保存用培地に入れ、段階的方法で凍結することができる。凍結保存手順の最後に胚を液体窒素に保存することができる。
精子

上記IVF手順において、精子が卵母細胞を受精させる必要がある。本発明に用いるために得られた精子は、未成熟精子、例えば精子細胞、一次精母細胞、二次精母細胞、または成熟精子であってよい。1個の一次精母細胞から第一および第二減数分裂を含む減数分裂を通して4個の精子を得ることができる。

本発明のある態様において、精子は、利用する培養条件に従って決定される酸素圧中で雄から得られる。雄由来の精子細胞または精液細胞または精子はマスターベーションにより得られることが多い。精子細胞を回収する別の方法は、針を男性の精巣に誘導し、精子細胞を針のなかに吸引する外科的方法である。さらに別の方法は、射精を促進し精子溶液を回収する機械により精子を得ることである。精子を洗浄する既知の方法で精子を精漿から分離することができる。この方法では精子を試験管中で水ベースの溶液と混合する。次に、試験管を遠心器に入れ高回転で遠心する。遠心力により重い精子は液層の下にペレットを形成する。液層を注意深く除去し、新鮮溶液で置換する。次の1時間位の間に運動性の精子のいくらかは液層中に泳ぎ出る。これら精子を卵の受精に用いることができる。

重症の雄の不妊症にかかった雄の精子の回収では、未成熟精子細胞を針生検または微細手術技術により回収することができる。未成熟精子細胞およびその周囲のセルトリ細胞は培地中で抗アポトーシス活性があるため有益であり、精子を成熟させることができる。精巣におけるアポトーシスは特に不妊男性において精子機能を損なう主要因子であることが知られている。雄において、尾を有するすべての精子前駆体はすべての細胞質がはぎ取られ、最終の正常精子が認識されるまで未成熟として認識されるだろう。未成熟精子細胞はヒトまたは動物の死んだ雄から得ることもできる。さらに、患者が癌と診断された場合、凍結組織から後で未成熟配偶子を抽出するため、細胞増殖抑制または放射線治療のような不妊をもたらすことがある治療の開始前に精巣または卵巣組織を解剖して取り出し、凍結することができる。次に、これら未成熟配偶子を合成培地中で最終的に成熟させることができる。

ある態様において、精子細胞は受精処置に用いる前に冷却されている。別の態様において、精子細胞は、受精処置に用いる前に凍結されている。冷却および冷凍処理は精子を後で用いる機会をもたらす保存条件である。
IVM

本発明の態様はIVFおよびIVMに関する(定義は上記参照)。好ましい態様において、本発明はIVMに関する。ヒト配偶子の体外成熟により、未成熟ヒト配偶子を細胞培養液中で培養する。すなわち、ヒト配偶子は未成熟精子細胞として雄から、または未成熟卵母細胞として雌から生じるかもしれない。卵巣または精巣組織からこれら配偶子を吸引および抽出することにより不妊治療中の女性または男性から未成熟ヒト配偶子を得ることができる。

卵母細胞は、異なる期の一つにある時に回収し、次いで体外成熟(IVM)させることができる。ある態様において、未成熟配偶子は卵胞から得られる。ある態様において、該卵胞は直径が1〜25mm、例えば2〜18mm、例えば3〜13mm、例えば5〜12mm、例えば7〜11mm、例えば8〜10mmである。

別の態様において、未成熟配偶子は一次卵母細胞である。さらに別の態様において、未成熟配偶子は第一減数分裂の前期にある。さらなる態様において、未成熟配偶子は第一減数分裂のディクチオテン期にある。さらなる態様において、未成熟配偶子は第一減数分裂中期の後期にある。別の態様において、該卵母細胞は一次卵胞から得られる。さらに別の態様において、卵母細胞は成熟卵胞から得られる。

さらに別の態様において、未成熟配偶子は原始卵原細胞または後期卵母細胞から選ばれる。

本発明のある態様において、女性の卵巣由来の未成熟卵母細胞は、固い卵丘塊を有する、極体がないかまたは卵核胞が視認できる卵母細胞として認識されるだろう。

好ましい態様において、回収した未成熟配偶子を培養し、同調卵丘、細胞質、および核成熟に関連する分裂中期IIまで成熟させる。卵母細胞の成熟は、受精および胚の発育に備える卵母細胞発育の最終段階である。卵母細胞の成熟は2つの一般的プロセス、核成熟と細胞質成熟に分けることができる。核成熟は、減数分裂の再開およびMF-IIへの進行と定義され、細胞質成熟は卵の活性化、前核形成、および初期胚形成に備えるゲノム外(extragenomic)変化と定義される。すなわち、未成熟雌配偶子は成熟精子細胞と接触して減数分裂を完結させず、精子細胞および受精細胞由来の遺伝子物質を受け入れない卵子と理解される。MF-IIは、最終的に卵核胚の崩壊が完結した、1極体、膨化卵丘複合体を有する卵母細胞と理解される。これら卵母細胞はIVF用の卵母細胞を普通に取り扱うルチーン技術者により容易に認識される。ヒトでは、核成熟がMF-IIまで進行しているが、着床前の発育を完結させる能力がない卵母細胞を生じる可能性があった。前期から分裂中期IIまで未成熟配偶子を培養する体外成熟は20〜30時間以内で完結させることができる。

本発明において、細胞期を決定する基準は核および細胞質の成熟段階および卵丘膨化(expansion)である。本発明の別の特別な特徴は、成熟プロセスがより速やかに終了することである。すなわち、前期からMF-IIまでの未成熟配偶子の培養は10〜30時間(例えば24〜30時間、すなわち24〜26時間)以内で完結する。この速やかな成熟は卵丘膨化の失敗および細胞質障害の危険性を最小にすることができる。さらに、それは卵母細胞を必要以上に長いin vitro培養時間に暴露するのを最小にする。

合成細胞培養液を上記成熟プロセスに用いる。用語「合成培地」は、生物学的に抽出された血清物質を含まず、すべての成分とその濃度が知られており、記載されている培地を表す。用語「生物学的に抽出された血清物質」には免疫グロブリンのような物質が含まれる。成長ホルモンや性腺刺激ホルモンのようなホルモンは血清から抽出されるとは考えられない。ホルモンまたは血清由来物質を培地に加える場合は、組換えホルモンまたは血清由来物質が好ましい。

生物学的に抽出された血清物質を含まない培地を用いる利点は、ウイルスまたは他の病原体もしくは有害粒子が培地、次いで胚に伝達される危険性が実質的に減少し、または存在しないことである。さらに、おそらく血清は卵丘膨化および核、細胞質の同調成熟を阻害する現在未知の因子を含む。

すなわち、本発明のある局面は、受精可能でない配偶子を感染性物質を少なくとも潜在的に含む供給源由来の成分を含まない培地中で培養することにより、該配偶子の既知および/または未知感染性物質(例えばプリオン、ウイロイド、ウイルス、マイコプラズマ、細菌、真菌)による感染または汚染を避ける方法に関する。該局面の好ましい態様において、該方法は、毒性、催奇性、発癌性、または変異原性成分による汚染を避けることに関する。

本発明での使用に適した培地の例には、核、細胞質、卵丘細胞の成熟を同調させることができる少なくとも1の因子を含む培地がある。好ましい態様において、該培地は合成脂質または脂質前駆体、例えばステロールまたはその代謝的に許容される誘導体を含む。これはコルチゾンかもしれない。これら化合物を用いる利点は、細胞膜を安定化させ、膜構築のための前駆体および卵丘卵母細胞複合体内の局所的ステロイド産生に関与する物質を提供することである。コルチゾンまたは誘導体は、これら未成熟卵母細胞の最終成熟の促進および同調に直接関与することもできる。

基礎培養液は卵母細胞とその卵丘細胞の両方を支持することができるものでなければならない。性腺刺激ホルモンおよび/またはステロイド、例えばE2を成熟培地に加えると例えばウシ、サル、およびヒト卵母細胞の受精能および/または発育能力が増大することがよく知られている。性腺刺激ホルモン(FSHおよびhCG)のヒトIVM培地への添加は広く用いられているが、精子の最適濃度(または真の必要性)は完全には特徴づけられていない。卵丘細胞はC-培養の1タイプであると考えることができ、他のタイプの体細胞と同様一般に中程度に高い培地中タンパク質レベルが必要である。Ca++オスシレーションを発現させるために卵母細胞をエストロゲンでプライムする必要があることが示唆された。したがって、本発明の培地は好ましくは濃度0.1〜10mu.g/mLのエストラジオール17-β、例えば0.3〜3mu.g/mLのエストラジオール17-β、好ましくは1mu.g/mLのエストラジオール17-βを含む。

本発明のより好ましい態様において、該合成培地は他の因子に抗アポトーシス剤としてATA(Aurinトリカルボン酸)を含む。ATAの利点は、そうしなければ卵母細胞の成熟を損なうアポトーシスプロセスを阻害する最適条件を提供する可能性があることである。ATAが存在する別の利点は、血清由来生成物、例えばHSAまたはBSAの濃度を下げて該血清由来生成物の濃度をゼロにすることである。

抗アポトーシス剤の使用は、すでに回収された卵母細胞が卵丘塊中でアポトーシスプロセスに入り得ることから好ましい。卵母細胞-卵丘複合体においてアポトーシスが始まるとこれが成熟の開始の合図となるだろう。

しかしながら、このプロセスは正常卵巣中で進行するので卵母細胞にアポトーシスを誘導するだろう。成熟の開始を誘導するアポトーシスシグナルの開始後に卵母細胞を卵巣から除去することによりさらなるアポトーシスを停止させる例えばATAを含む合成培地中で完全な発育が生じるだろう。

該培地はPCT/EP97/06721に記載の培地であるかもしれない(この内容は本明細書の一部を構成する)。培地に対する添加剤として、EP1090300またはW09967365に記載の添加剤を使用し、これらはMedi-Cult SSR 4x、Medi-Cult SSR 4xa、Medi-Cult SSR 4xb、Medi-Cult SSR1、またはMedi-Cult SSR2を意味する。基礎培地として好ましい培地は、EP1090300に記載のMedi-Cult BBEMである。

該培地の該内容物以外に他の因子がin vitro培養時に受精可能な卵母細胞を得るのに重要である。これら因子は、卵母細胞吸引の時期および吸引時までの卵胞のサイズを含む。卵胞成長における初期アポトーシス期または人工的プラトー期は発育能力のある最終排卵前卵胞成熟期によく似ているかもしれない。

哺乳類卵母細胞の体外成熟は卵母細胞の成長、および卵胞および卵母細胞のサイズに関連する。ヒト卵母細胞は、減数分裂を再開し成熟を完結させるサイズ依存性能力を有するようである。卵胞<8mmから得られる卵母細胞の成熟速度と卵割速度の減少がみられた。これらの結果は、ヒト卵母細胞の成熟能力が卵胞成熟と密接に関連することを示唆する。上記のように回収した成熟卵母細胞は早期アポトーシス期にある。したがって、卵母細胞のサイズが増すにつれ、死細胞に近い後期アポトーシス期の卵母細胞が得られる危険性が増す。この経験に基づいて回収する好ましい卵母細胞のサイズは12mm以下である。

本発明のある態様において、体外成熟は、酸素圧20%以下、例えば15%以下、例えば13%以下、例えば11%以下、例えば10%以下、例えば9%以下、例えば8%以下、例えば7%以下、例えば6%以下、例えば5%以下、例えば4%以下、例えば3%以下、例えば2%以下、例えば1%以下、または本明細書の他の箇所に記載の条件下で行われる。

本発明の別の態様において、体外成熟は上記低下した酸素圧で行われる。ある培養条件ではさらに酸素圧を一時的に上昇させ、該上昇は少なくとも1単位、例えば少なくとも2単位、例えば少なくとも3単位、例えば少なくとも4単位、例えば少なくとも5単位、例えば少なくとも6単位、例えば少なくとも7単位、例えば少なくとも8単位、例えば少なくとも9単位、例えば少なくとも10単位、例えば少なくとも11単位、例えば少なくとも12単位、例えば少なくとも13単位、例えば少なくとも14単位、例えば少なくとも15単位の酸素圧の上昇である。

さらに別の態様において、酸素圧の上昇は最大15単位、例えば最大14単位、例えば最大12単位、例えば最大11単位、例えば最大10単位、例えば最大9単位、例えば最大8単位、例えば最大7単位、例えば最大6単位、例えば最大5単位、例えば最大4単位、例えば最大3単位、例えば最大2単位、例えば最大1単位である。

さらなる態様において、酸素圧の上昇は、1〜15単位、例えば1〜12単位、例えば1〜10単位、例えば1〜8単位、例えば1〜7単位、例えば1〜6単位、例えば1〜5単位、例えば1〜4単位、例えば1〜3単位、例えば1〜2単位である。

一般に、酸素圧の上昇は少なくとも5分間、例えば少なくとも10分間、例えば少なくとも20分間、例えば少なくとも30分間、例えば少なくとも45分間、例えば少なくとも1時間、例えば少なくとも1.5時間、例えば少なくとも2時間、例えば少なくとも2.5時間、例えば少なくとも3時間、例えば少なくとも4時間、例えば少なくとも5時間、例えば少なくとも6時間、例えば少なくとも7時間、例えば少なくとも8時間、例えば少なくとも9時間、例えば少なくとも10時間行われる。

上記培地は精巣由来の未成熟精子前駆細胞の培養にも用いてよい。

IVMはさらにWO 9967365およびUS出願20010028878に記載されている。

ある態様において、未成熟精子は成熟するまで培養する。この精子の体外成熟は、酸素圧20%以下、例えば15%以下、例えば13%以下、例えば11%以下、例えば10%以下、例えば9%以下、例えば8%以下、例えば7%以下、例えば6%以下、例えば5%以下、例えば4%以下、例えば3%以下、例えば2%以下、例えば1%以下で行われる。

本発明の別の態様において、精子の体外成熟は上記低下した酸素圧で行われる。ある培養条件ではさらに酸素圧を一時的に上昇させ、該上昇は少なくとも1単位、例えば少なくとも2単位、例えば少なくとも3単位、例えば少なくとも4単位、例えば少なくとも5単位、例えば少なくとも6単位、例えば少なくとも7単位の酸素圧の上昇であり、酸素圧の上昇は少なくとも5分間、例えば少なくとも10分間、例えば少なくとも20分間、例えば少なくとも30分間、例えば少なくとも45分間、例えば少なくとも1時間、例えば少なくとも1.5時間、例えば少なくとも2時間、例えば少なくとも2.5時間、例えば少なくとも3時間行われる。
受精

卵母細胞を回収する時は、卵母細胞を上記のごとく体外成熟させるか、一定期間培養し、または速やかに受精させることができる。本発明のある態様において、これら培養は酸素圧20%以下、例えば15%以下、例えば13%以下、例えば11%以下、例えば10%以下、例えば9%以下、例えば8%以下、例えば7%以下、例えば6%以下、例えば5%以下、例えば4%以下、例えば3%以下、例えば2%以下、例えば%以下で行われる。

本発明の別の態様において、培養は上記の低下した酸素圧で行われる。

酸素圧の上記変化の例は、酸素圧5%で培養し、酸素圧を一定期間15%に増加させ、次いで12%に低下させる卵母細胞である。

回収した卵は実験室内で検査し、それぞれの成熟度を下記のように等級付ける。卵の成熟は精子を卵に加えるとき(受精)に試験する。受精は回収直後、数時間後、翌日、または未成熟卵母細胞の成熟後に行うことができる。

本発明の好ましい態様において、卵母細胞と精子を同時培養する(すなわち、培養皿中で一緒に培養する)。別の態様において、同時培養はフィーダー細胞と共に行うことができる。このフィーダー細胞存在下または非存在下の同時培養は、酸素圧20%以下、例えば15%以下、例えば13%以下、例えば11%以下、例えば10%以下、例えば9%以下、例えば8%以下、例えば7%以下、例えば6%以下、例えば5%以下、例えば4%以下、例えば3%以下、例えば2%以下、例えば1%以下で行うことができる。

本発明のある態様において、低下した酸素圧で行うフィーダー細胞存在下または非存在下の同時培養はさらに一時的な酸素圧の上昇を含み、該上昇は少なくとも1単位、例えば少なくとも2単位、例えば少なくとも3単位、例えば少なくとも4単位、例えば少なくとも5単位、例えば少なくとも6単位、例えば少なくとも7単位の酸素圧の上昇であり、酸素圧の上昇は少なくとも30分間、例えば少なくとも45分間、例えば少なくとも1時間、例えば少なくとも1.5時間、例えば少なくとも2時間、例えば少なくとも2.5時間、例えば少なくとも3時間行われる。

卵1個当たり5,000〜500,000個の精子を同時培養する。受精が完結するまで約18時間培養することができ、約12時間後受精細胞または前胚は2細胞に分割する。48時間後、前胚が通常それぞれ2〜4細胞からなるとき女性の子宮内に移植する準備が整う。この手順は胚移植として知られている。

好ましい態様において、受精は酸素圧20%以下、例えば15%以下、例えば13%以下、例えば11%以下、例えば10%以下、例えば9%以下、例えば8%以下、例えば7%以下、例えば6%以下、例えば5%以下、例えば4%以下、例えば3%以下、例えば2%以下、例えば1%以下で行われる。

本発明のある態様において、低下した酸素圧で行う受精はさらに一時的な酸素圧の上昇を含み、該上昇は少なくとも1単位、例えば少なくとも2単位、例えば少なくとも3単位、例えば少なくとも4単位、例えば少なくとも5単位、例えば少なくとも6単位、例えば少なくとも7単位の酸素圧の上昇であり、酸素圧の上昇は少なくとも30分間、例えば少なくとも45分間、例えば少なくとも1時間、例えば少なくとも1.5時間、例えば少なくとも2時間、例えば少なくとも2.5時間、例えば少なくとも3時間行われる。

好ましい態様において、卵母細胞および精子の培養は、卵母細胞が成熟する条件下で該未成熟卵母細胞を培養する工程を含む。該条件は、酸素圧15%以下、例えば13%以下、例えば11%以下、例えば10%以下、例えば9%以下、例えば8%以下、例えば7%以下、例えば6%以下、例えば5%以下、例えば4%以下、例えば3%以下、例えば2%以下、例えば1%以下を含む。酸素圧は最適in vitro条件および卵母細胞の期(段階)および質(品質)に従って選択および変化させる。

IVF法は卵母細胞から胚までの胚形成の段階を考慮する。

卵母細胞は未受精卵である。卵母細胞は卵管に移動する卵自身を保護するように働く卵胞細胞塊の中央にある。卵に達するには精子は最初この塊(卵丘と呼ばれる)を貫通し、次いで卵を直接取り囲む弾性のある皮膜に穴を開けなければならない。

受精卵は接合体または1細胞胚とも呼ばれる。該卵は透明帯で包まれている。該卵内には2つの小さな窪んでみえる球状物があり、これらはそれぞれ一方またはその他の親がもたらした親DNAを含む「前核」である。透明帯内には「極体」と呼ばれる球状物を観察することができる。極体は母遺伝子物質の第二部分を含む受精後の卵から適切に押し出される。

第一細胞分割は、受精1日後に生じ、2細胞胚を生じる。胚形成の1細胞期から胚盤胞期のずっと先まで、該胚は栄養の供給源なしに自由に浮遊し、透明帯内に物理的に拘束される。したがってこの全期間にわたり胚は同じサイズに維持される。

再度胚内の各細胞は分割し、4細胞胚を生じる。この段階ではまだ個々の細胞は完全なヒトになることができる。この段階で胚がその4細胞に分割すると、4個の同一の四子が誕生するかもしれない。希ではあるが多く知られた例がある。

8細胞胚では分化はまだ生じていない。各細胞は完全なヒトに(理論上)なるかもしれない。したがって、この段階では残りの胚の発育にいかなる影響も及ぼさずにあらゆる細胞を遺伝子診断用に取り出すことができる。

該胚盤胞では胚はもう約64細胞を有する。該細胞はもはや等価ではない。胚は今や液体が充満した腔を有し、内部細胞塊と呼ばれる胚の部分が該腔の側面に横たわる。内部細胞塊の半ダースの細胞のみが胎児および子供を発育させるのに用いられる。残る細胞の栄養外胚葉と呼ばれる外部細胞もしくは表面細胞は胎盤形成を助ける。
ICSI

本発明のある態様において、卵母細胞を細胞質内精子注射(ICSI)により精子で受精させる。細胞質内精子注射は卵母細胞の細胞質内への精子の直接注射方法(DISCO)としても知られ、この方法はヒト患者の受精を助けるために適用することができる。該技術は体外受精とマイクロインジェクション技術を組み合わせる。雌卵母細胞(卵)を回収し、適切に調製し、単一精子を調製した試料からマイクロインジェクション針中に単離し、次いで単一精子を卵母細胞の卵質内に注射する。細胞質内精子注射(ICSI)方法では、成熟細胞を特殊な保持ピペットで保持する。次に、非常に精巧で鋭利な中空針を用いて単一精子を固定して取り出す。精子を細胞質内に注射し、針を注意深く除去する。卵が正常に受精したか翌日に確認する。

発育能力の細胞質調節の重要性は未成熟サル卵母細胞で説明されている。顕微操作を用いて卵母細胞をMF-II卵母細胞から除去し、前期I卵母細胞内に注射する。細胞質注入された卵母細胞を移植したサルは卵質注射をしなかった卵母細胞に比べて妊娠率が7倍増加した。

本発明のある態様において、ICSIにより受精した卵母細胞は酸素圧20%以下、例えば15%以下、例えば13%以下、例えば11%以下、例えば10%以下、例えば9%以下、例えば8%以下、例えば7%以下、例えば6%以下、例えば5%以下、例えば4%以下、例えば3%以下、例えば2%以下、例えば1%以下で培養した。
胚期

本発明のある態様において、受精卵母細胞は雌子宮に移植する準備が整う胚期まで培養する。これは卵母細胞の受精後少なくとも1/2日培養後、少なくとも1日間、例えば少なくとも2日間、例えば少なくとも3日間、例えば少なくとも4日間、例えば少なくとも5日間、例えば少なくとも6日間、例えば少なくとも7日間、例えば少なくとも8日間、例えば少なくとも9日間後に得られる。

子宮への移植準備が整った胚は、2細胞期、4細胞期、6細胞期、8細胞期、桑実胚期、胚盤胞期、透明帯が消失している胚盤胞期、または該胚の透明帯(胚の殻)が子宮内に着床する前に卵のハッチングを助けるように開孔している期であり得る。これらの各期において、細胞デブリスの断片(フラグメント)を該胚から除去して胚の品質を改善することができる。

最終的に完全胚およびその関連組織を生じる3胚細胞タイプがあり、着床直前の非常に初期の胚および着床時に存在するこれら3細胞タイプは、
・自己再開するか、または胚のすべての細胞タイプに分化することができる幹細胞であるエピブラスト(胚盤葉上層)細胞、
・胚(卵黄嚢)周囲に保護膜を生じるハイポブラスト(胚盤葉下層)細胞、および
・自己複製し、ほぼ胎盤を形成するある範囲の特殊化細胞を生じることができる細胞リザーバー内に最初に生じる栄養外胚葉細胞である。

好ましい態様において、受精卵母細胞は上記のごとく雌子宮に移植する準備が整う胚期まで培養し、該培養は酸素圧20%以下、例えば15%以下、例えば13%以下、例えば11%以下、例えば10%以下、例えば9%以下、例えば8%以下、例えば7%以下、例えば6%以下、例えば5%以下、例えば4%以下、例えば3%以下、例えば2%以下、例えば1%以下で行う。

好ましい態様において、受精卵母細胞は13%以下の酸素圧または1%〜21%の変化する酸素圧で2〜3日間、4細胞の段階まで培養し、次いで雌子宮に移植する。

本発明のある態様において、透明帯を胚を雌子宮に移植する前にレーザー、機械的力、または酸タイロードを用いてハッチングを助けることにより開孔させる。

胚の「品質(質)」は、種々のスコアリングシステムにしたがって評価することができる。スコアリングは、細胞数、細胞の規則性(サイズの規則性)、およびフラグメンテーションの程度により決定される。胚出現について留意する他の事柄、例えば多核細胞(multi-nucleation)、小胞の出現、粒状性、胚周囲の殻の厚さなどもある。特に胚盤胞の総細胞数は品質スコアである。

あるスコアリングシステムにおいて、「品質」の決定は卵の受精後約48時間(またはそれ以後)までなされない。48時間(「第2日」)までに、胚の少なくともいくつかが少なくとも3細胞、好ましくは4細胞またはそれ以上であることが好ましい。それまでに胚は少なくとも2細胞でなければならず、もしくはそれらは基本的に「停止(arrested)」している。72時間(「第3日」)までに、胚のいくつかが少なくとも6細胞、好ましくは少なくとも数個の胚が7細胞またはそれ以上を有することが好ましい。成功するには速い発育は必要ではなく、第3日で4細胞であるほどに遅い胚由来の新生児が観察されたが、妊娠の機会は細胞数が増加すると大きく増加する。

細胞数がより多く、規則的に見える細胞(ブラストマー)を有し、フラグメンテーションがないかまたはほとんどない胚は、細胞が少なく、より不規則性であり、フラグメンテーションもより多いその対応物より着床の全体的チャンスが高い。

IVF Iabで顕微鏡下でみられる胚の品質は、胚移植からの妊娠の機会を予測するためのいくつかの妥当な能力を与える。しかしながら、測定できない多くの他の関与因子が関連しているので、これら一般化は常に適用されるわけではない。いくつかのサイクルは3個の完全に見える胚の移植後にうまくいかず、低等級の胚を移植後にすばらしい新生児の誕生がみられた。発育し続ける胚の真に遺伝的潜在性ならびに子宮ライニングの品質と受容力は実際には測定不能である。

見落とされ得る別の重要な変数は胚移植技術自身である。子宮内膜のライニングへの外傷のないスムーズな移植は胚が正常に発育し続ける最高の機会を与えるのに必須である。

最終的に、胚品質の唯一の真の試験はそれが着床し、正常に発育し、最終的に母親と一緒に病院から帰宅するかどうかである。言い換えれば、胚の等級づけシステムは非常に不完全であり、顕微鏡で明らかにすることができるよりさらに「品質」について述べるには通常妊娠試験が必要である。

ほとんどのIVFクリニックは、各胚を多くのスコアリングシステムの1つを用いて「等級付け」しており。本発明にしたがって用いることができるそのうちのいくつかを以下に示す。

異なる発育期を異なる手順などに利用することができるという事実により先端的不妊治療時にはヒト胚、受精卵、および分割胚を評価および分類することが重要である。本発明に利用することができるある胚スコアシステムは、Van Abbelら(1992)およびZiebeら(1997)のスコアシステムに従う。

この等級付けシステムでは、胚を分割期(=ブラストマー数)にしたがって評価し、無核断片の量を形態学的基準によりスコア付けする。2細胞期の胚は桑実胚期まで下記形態学的基準にしたがってスコアを得ることができる。
スコア1.0： 等しいサイズの対称的ブラストマー、核フラグメントなし、
スコア2.0： 不規則なサイズのブラストマー、核フラグメントなし、
スコア2.1： 10%フラグメンテーション以下の胚、
スコア2.2： 10〜20%ブラストマーフラグメンテーションの胚、
スコア3.0： 20〜50%ブラストマーフラグメンテーションの胚、
スコア3.2： ブラストマーフラグメンテーションが50%以上の胚、
スコア4.0： 完全にフラグメント化、
スコア5.0： 受精、非分離、
スコア6.0： 非受精、非分離。
M： 桑実胚、
B1： 早期胚盤胞、
B2： 膨化中の(Expanding)胚盤胞、
B3： 膨化(Expanded)胚盤胞、
Bn1： 正常腔、正常細胞、
Bn2： 正常腔、粒状または暗細胞、
Bn3： 異常腔、
HB1： ハッチング胚盤胞、
HB2： ハッチド胚盤胞。

本発明のある態様において、胚の培養は3〜5ブラストマーの1.0、2.0、2.1、および2.2から選ばれるスコアを有する胚を生じる。本発明の別の態様において、該胚の培養は4ブラストマーの1.0、2.0、および2.1から選ばれるスコアを有する胚を生じる。

胚の選択には胚の段階だけでなくフラグメンテーションの程度も重要であることが示唆された。以下も考慮すべきである：1)透明帯の厚さと厚さの変動性。胚の問題はin vitro条件により透明帯が固くなるだけではない。透明帯の薄さまたは薄さの変動が妊娠の機会をよくするのに関連するかもしれない。これはおそらく栄養膜細胞がハッチング時の薄い透明帯、次いで厚い固い透明帯をよりよく貫通することができるからである。2)フラグメントのタイプと分布。胚中のフラグメントの均一な分布はすべてのブラストマー間のいくつかの接合を阻害し、胚の機能を脅かすかもしれない。フラグメントがある領域に集まると、この胚の阻害は重度ではない。3)胚の分割のタイミング。最も速く正常に分割する胚も子孫をもたらす最もよい機会を持つかもしれない。これにしたがって、移植用の最良の胚は、移植時期にしたがって正常に分割しており(すなわち、受精後第2日での移植用に4細胞) Van Abbelによるスコアが最も低く透明帯の厚さが変化する胚であろう。また、フラグメントが存在する場合はフラグメントが局在化した胚を選ぶ。

別のスコアリングシステムにおいて、雌子宮に移植した胚は累積的胚スコア(CES)(Joesburyら、1998)を得る。このスコアリングシステムでは、胚は受精後第2日と移植直前に等級付けされる。等級付けは、ブラストマーの粒状性および対称性、フラグメンテーション、および発育速度に基づく。仮に完全な胚は最大4.0ポイントに等級付けされ、各形態学的パラメーターについて最適からの偏差の度合いに従って0.5または0.1ポイント低下させる。
接合体は1ポイントに等級付けられる。
同じサイズの対称的ブラストマーを有する胚は4ポイントに等級付けられる。
サイズの不均一なブラストマーを有するフラグメンテーション10%以下の胚は3ポイントに等級付けられる。
10〜50%フラグメンテーションの胚は2ポイントに等級付けられる。
フラグメンテーション50%以上の胚は1ポイントに等級付けられる。

各胚のスコアは、移植用に選ばれた各胚の等級を該胚のブラストマー数とかけて得る。「理想的」成長速度より速く発育する胚は、「正常」成長パターンを示す胚より妊娠成績が悪くなりうる。速く発育する胚の潜在的劣等性を説明するため、CESの計算を5細胞期の胚の細胞数に3ポイントを与え、6、7、および8細胞胚には細胞数に2ポイントを与えることにより行う。最も高いスコアの胚が子宮移植用に選ばれる。移植用に選ばれた胚の全体的品質は選ばれた各胚のスコアをかける累積胚スコア(CES)に基づく。本発明のある態様において、胚を10〜50%フラグメンテーションの3〜5細胞期まで培養し、該胚には6〜7ポイントが与えられる。

本発明の別の態様において、胚をフラグメンテーション10%以下で3〜5細胞期まで培養し、該胚には7〜8ポイントが与えられる。

本発明の好ましい態様において、胚をフラグメンテーション10%以下で4細胞期まで培養し、該胚には8ポイントが与えられる。

第三スコアリングシステムにおいて、Graduated Embryo Score(段階的胚スコア)(GES)を各胚について得る(Fischら、2001)。GESシステムは、受精後16〜18、25〜27、および64〜67時間における3評価に基づき総可能スコア100ポイントを与える。
第一評価、16〜18h:
前核軸に沿って一列に並んだ核小体にはスコア20を与える。
第二評価、25〜27h:
卵割の規則性および対称性にはスコア30を与える。
フラグメンテーションなしにはスコア30を与える。
フラグメンテーション20%以下にはスコア25を与える。
フラグメンテーション20%以上はスコア0である。
第三評価、64〜67h：
7細胞、グレードIまたは8細胞、グレードIまたは8細胞、グレードIIまたは9細胞、グレードIにはスコア20を与える。
7細胞、グレードIIまたは9細胞、グレードIIまたは10細胞、グレードIまたは11細胞、グレードIまたは胚細胞緊密化(compacting)、グレードIにはスコア10を与える。
グレードIは、対称的ブラストマーおよび無フラグメンテーションであり、グレードIIはわずかに不均一なブラストマーおよびフラグメンテーション20%以下である。
胚が該胚の総スコアを得るために各評価時間のスコアをかける。胚の最高スコアは100である。

本発明のある態様において、胚を受精後64〜67時間、7〜9細胞の胚まで培養し、GESスコアリングシステムにしたがってスコア60〜100を得る。

本発明の別の態様において、胚を受精後64〜67時間、7細胞、グレードIまたは8細胞、グレードIまたは8細胞、グレードIIまたは9細胞、グレードIの胚まで培養し、GESスコアリングシステムに従ってスコア70〜100を得る。

本発明の好ましい態様において胚を受精後64〜67時間、7細胞、グレードIまたは8細胞、グレードIまたは8細胞、グレードIIまたは9細胞、グレードIの胚まで培養し、GESスコアリングシステムに従ってスコア80〜100を得る。

妊娠までの胚品質に関連するあらゆる他のスコアリングシステムを胚品質を決定するために用いることができよう。

胚の発育において、胚盤胞の段階に達する。胚盤胞は受精後5〜7日間発育した胚である。この時点で、胚は2つの異なる細胞タイプおよび中心腔を有する。該胚は分化を始めたところである。栄養外胚葉と呼ばれる表面細胞は胎盤になり、内部細胞塊と呼ばれる内部細胞は胎児になる。健康な胚盤胞は、第6日の終わりまでに透明帯と呼ばれる外側の殻からハッチングを始めるはずである。ハッチング後約24時間以内に、胚は母親の子宮のライニング内に着床し始めるはずである。

卵母細胞の顕微鏡検査により空胞変性、細胞質封入体、および細胞小器官のクラスタリングのような異常を検出することができよう。これら卵母細胞は、正常な潜在能力を有する胚を生じる確率が低いだろう。卵母細胞は臨床環境において光学顕微鏡で見ることができない核または細胞質の異常を有するかもしれないことが知られている。最も一般的な遺伝的卵母細胞異常は第一減数分裂における染色分体の分離のエラーにより生じる。低品質の卵母細胞は廃棄され、品質のよい卵母細胞を培養する。
胚移植

ほとんどの体外受精プログラムにおいて、胚は受精の2日後(4〜8細胞)子宮に移植される。ある見解では、この早期の胚の使用はIVFプログラムの低い妊娠成績の大きな原因になり得、培養第5〜7日目で胚盤胞期に達した胚を用いるのがより好ましい。示唆された利点には胚と子宮間の改良された同調およびより長い培養期間にわたりより品質のよい胚を選択する能力が含まれる。胚盤胞期移植は、1移植あたりより少ない数の高能力の胚を選ぶことができるためIVFから生じる多子出産の数を減らすのを助けるかもしれない。

すなわち、子宮壁内への胚の着床は、受精後2〜10日間で生じる。着床内で胚は母親の血流供給と連絡し、成長することができる。着床で女性の身体は初めて妊娠となる。着床前には該身体は未受精卵(その解決手段において)または発育胚の違いを検出することができない。

培養液の1滴に浮遊させた1またはそれ以上の前胚を移植カテーテルに吸い込み、液を子宮腔内に入れる。1またはそれ以上の胚をこの手順で移植することができよう。

胚盤胞培養および体外受精用の移植手順は、母親の子宮に胚を移植するための別の方法である。胚盤胞胚移植により多胎妊娠の危険性を下げながら全体の妊娠率を高く保ったままでより少ない数の胚を移植することができる。

体外受精(IVF)および胚培養の最終目標は、正常に発育し続けることができ、生児出産をもたらすことができる高品質の胚を得ることである。しかしながら、標準的IVF培養条件下ではヒト胚の約20〜40%だけが5日間培養後に胚盤胞期に進むだろう。この胚発育率の低さは胚の培養環境が最適に達しないためである。この理由のため、胚は通常2〜3日間だけ培養した後に子宮に移植されてきた。

これを用いる1つの問題は、2〜3日齢の胚は通常子宮ではなく卵管中にみいだされることである。胚は最初に排卵後約80時間で子宮内に移動する。着床プロセスは約3日後(胚盤胞形成およびハッチングが生じた後)に始まる。したがって、in vitro培養条件が胚盤胞がより高率に形成されるように改良されれば、胚が胚盤胞期に(より「自然な」時期および着床が生じる直前に)子宮に置かれるであろう。

IVF後の胚盤胞の移植は別の利点(多胎妊娠の可能性の低下)も提供する。2または3日齢の胚のあるものは高品質の胚盤胞になる能力がなく、生存可能な妊娠にならない。しかしながら、培養第2または3日に胚が長期生存可能であることを決定する信頼できる方法がない。胚を胚盤胞期まで培養することにより移植に最も適したものを選ぶ機会が増えた。したがって、より少数の胚を移植することができ、高いオーダー(三つ子またはそれ以上)の多胎妊娠の危険性の低くして高い妊娠率を得ることができる。

ある態様において、工程a)は酸素圧15%以下および上記他の条件で行われる。

ある態様において、工程b)は酸素圧15%以下および上記他の条件で行われる。

ある態様において、工程a)およびb)は酸素圧15%以下および上記他の条件で行われる。

ある態様において、工程a)およびc)は酸素圧15%以下および上記他の条件で行われる。

ある態様において、工程a)およびd)は酸素圧15%以下および上記他の条件で行われる。

ある態様において、工程b)およびc)は酸素圧15%以下および上記他の条件で行われる。

ある態様において、工程b)およびd)は酸素圧15%以下および上記他の条件で行われる。

ある態様において、工程a)、b)およびc)は酸素圧15%以下および上記他の条件で行われる。

ある態様において、工程a)、b)およびd)は酸素圧15%以下および上記他の条件で行われる。

ある態様において、工程a)、c)およびd)は酸素圧15%以下および上記他の条件で行われる。

ある態様において、工程b)、c)およびd)は酸素圧15%以下および上記他の条件で行われる。

ある態様において、工程a)、b)、c)およびd)は酸素圧15%以下および上記他の条件で行われる。
培養条件

工程a)、b)、c)およびd)またはe)を含むin vitro培養法および上記の子宮への胚の移植は無菌条件下で行う。培地および器具は使用前に滅菌する。

酸素圧は前記のように低下させることができ、培養は酸素圧20%以下、例えば15%以下、例えば13%以下、例えば11%以下、例えば10%以下、例えば9%以下、例えば8%以下、例えば7%以下、例えば6%以下、例えば5%以下、例えば4%以下、例えば3%以下、例えば2%以下、例えば1%以下で行うことができる。酸素圧は、in vitro培養環境に酸素、窒素、二酸化炭素、ヘリウムまたは他の不活性ガスまたはこれらガスの2またはそれ以上の混合物を加えることにより制御される。

本発明の好ましい態様は、温度30〜45℃、例えば32〜42℃、例えば34〜40℃、例えば36〜38℃、例えば36,5〜37,5℃、例えば約37℃を含む卵母細胞、精子、および胚の培養条件である。好ましい態様において、卵母細胞、精子、および胚の培養条件は約37℃である。

残念なことに、標準的培養液において大多数の胚(約75%)は4〜8細胞期を超えて発育することができない。ある種の臨床的示唆があるにも関わらず、ヒト胚の着床は胚盤胞に発育する胚の割合が低いにも関わらず胚盤胞期で行われる。ある研究では胚をフィーダー細胞、例えばVero(ベロ)細胞と同時培養する、2倍以上の胚盤胞を形成することができる同時培養技術を用いる。特に以前に繰り返し着床に失敗した女性において胚盤胞移植後の着床率の改善がみられたこれら同時培養技術を用いる多くの研究がある。

生殖補助医療における困難さのいくつかは、精子、卵母細胞、および胚を細胞フィーダー層と同時培養することにより克服することができる。しかしながら、同時培養は品質および信頼性が変動しやすく、生動物またはヒトに移植し戻される配偶子または胚へのフィーダー細胞からの病原体伝搬の危険性が加わる。好ましい態様において、卵母細胞および精子はフィーダー細胞層を用いることなく同時培養される。

小規模in vitro生成、すなわち感受性細胞および組織の成熟、受精、成長、増殖などは通常、培養液および必要な初期細胞または組織を入れた容器、例えば小培養フラスコ、ペトリ皿またはウェル皿中で行われる。次に該容器を該特定細胞または組織の発育および/または維持に必要なガスを含む環境雰囲気および選択した一定温度をもたらすインキュベーターに入れる。具体的には、必要なガスは特定割合およびレベルの湿度(すなわち水蒸気)、遊離酸素(O₂)および二酸化炭素(CO₂)を含む。

環境温度とCO₂含有量を調節することにより、培養液のpHを一定時間内に安定させることができる。安定なCO₂含有量と安定な温度は安定なpHをもたらす。

本発明のある態様において、卵母細胞および精子は当業者に知られた培地中で培養する。これは卵母細胞または精子の期に応じて単一培地または異なる培地であってよい。卵母細胞および精子はより低い酸素圧の条件に修飾した培地中で培養してもよい。修飾は物理的または化学的であってよく、後者は酸素分子担体またはカタラーゼを利用することによる。

本発明のある態様は、胚の内部細胞数の増加を形成する卵母細胞および胚の培養条件を適用することである。内部細胞数の増加はより品質のよい胚を構成する。

本発明の別の態様は、卵母細胞および精子を培養し、得られる前胚を哺乳類雌の子宮、より正確には雌の子宮の卵管に移植することである。雌のホルモン処置後に該移植を行っても良い。該移植が雌の認識をもたらすこと期待する。

記載した方法は妊娠頻度の増加とともに雌子宮への胚移植の成功頻度を改善する。

卵母細胞および精子の同時培養を酸素圧15%以下で行うとよりよい品質の配偶子と前胚が生じる。15%以下の可変酸素圧での卵母細胞と精子の同時培養もよりよい品質の配偶子と前胚を生じる。よりよい品質の配偶子と前胚は無子治療を改善する。

卵母細胞と精子の同時培養を可変酸素圧で行うとよりよい品質の配偶子と前胚が生じる。

該方法を用いる可能性は、卵母細胞と精子の同時培養を所望により15%以下の可変酸素圧で行い、よりよい品質の配偶子と前胚を得、内部細胞数を改善し、幹細胞の培養を最適化することである。

ある態様において、細胞培養を増加する酸素圧で培養し、配偶子については最低の酸素圧で出発し、胚および胚盤胞の培養を通して増加させる。胚盤胞のような単一構造を構成する細胞が増えれば、より高い酸素圧が必要である。

ある態様において、細胞培養を増加する酸素圧で培養し、配偶子については最低の酸素圧で出発し、胚および胚盤胞の培養を通して増加させる。また、酸素圧を短時間10〜12%に増加させ、卵母細胞の成熟プロセスを促進する。

上記のごとく培養するとき胚の品質改善は、胚移植の成功を約20%から少なくとも25%、例えば少なくとも30%、例えば少なくとも35%、例えば少なくとも40%に増加させることができよう。
インキュベーター

上記の卵母細胞、精子、および胚または他の生物学的物質の培養、例えば細胞培養または組織培養はインキュベーター中で行うことができる。

本発明のインキュベーターは、培養、実験、および操作中の細胞培養、例えば卵母細胞、精子、および胚をin vitroで維持するための調節された環境を提供する。より具体的には、インキュベーターは細胞培養系を損なうかまたは毒性があるかもしれない条件を排除することができる。

本発明の態様は、in vitroで哺乳類前胚を製造することができる系であって、哺乳類卵母細胞を得る手段、および哺乳類精子を得る手段、および1チャンバーの酸素圧を他のチャンバーの酸素圧と独立して変化させることができる少なくとも2の分離した気密性チャンバー(ここで、該チャンバーの1つはメインチャンバーを構成し、該チャンバーのもう1つは少なくとも1のレジデンスチャンバーを構成する)を有する装置であって、哺乳類卵母細胞および/または哺乳類精子を得る手段と連絡することができる少なくとも1のエントランスポート、および前胚を回収するエグジットポート、ならびに該少なくとも2のチャンバー間に、チャンバー間の卵母細胞、精子、および/または前胚の移動を可能にする連絡ポートを含む装置を含む系を包含する。

メインチャンバーは細胞培養を操作するための作業領域を含む。メインチャンバーは例えば培養液を入れた容器を操作する細胞培養用の装置を含む。メインチャンバーはさらに例えば顕微鏡、ICSI装置を操作する細胞培養用の装置も含むことができる。メインチャンバーからエントランスチャンバーまたはエグジットポートへの接続部がある。具体的にはメインチャンバーはエントランスチャンバーではない。具体的にはメインチャンバーはレジデンスチャンバーではない。

レジデンスチャンバーは1またはそれ以上の培養容器のためのチャンバーであり、培養容器自身がレジデンスチャンバーであり得る。レジデンスチャンバーはメインチャンバーと接続しているかまたはメインチャンバー内に置かれている。具体的には、レジデンスチャンバーはエントランスチャンバーまたはエグジットポートではない。

本発明のある態様において、インキュベーターは温度、湿度、およびO₂濃度を調節する手段を提供する。インキュベーターは必要に応じ層流を用いて環境由来の微生物を排除し、インキュベーター内の無菌条件を得る。

チャンバー内の酸素圧または酸素濃度を調節することができる。酸素圧は検出手段により決定することができる。さらにガス、例えば酸素、窒素、二酸化炭素、ヘリウムまたは他の不活性ガス、またはこれらガスの2またはそれ以上の混合物を加えることによりチャンバー内の酸素圧を持続または変化させることができる。すなわち、インキュベーターは該ガスを加える手段に寄与する。酸素圧の調節、持続、および変化において、チャンバー内の該酸素圧は0.1〜少なくとも21%のレベルで各チャンバー内で独立して得ることができる。好ましい酸素圧は0.5〜15%のレベルであり得る。チャンバーの温度および湿度は予め決定されたガス、温度、および湿度それぞれの最小レベルと最大レベルに従って測定手段および供給手段により測定および制御することができる。供給手段はガスまたは水を含むガス(湿度)の吸入をもたらす手段を構成することができるが、供給手段は加熱器または冷却器を構成することもできる。

該系のある態様において、インキュベーターのあらゆるチャンバーに導くガスはインキュベーターのチャンバーに入る前に加湿器を通して循環させることにより加湿される。該ガスはインキュベーターのチャンバーに入る前に加熱器または冷却器で加熱または冷却することもできる。

ある態様は、哺乳類卵母細胞を得るための手段が気密条件下で針から該装置に輸送する手段(そのような輸送手段は所望によりチューブと連結したシリンジを含む)と連絡した針を有する系である系である。

本発明の別の態様は哺乳類精子を得る手段が酸素圧を調節することができる系である。該系は所望により気密性のさらに所望によりチューブと連結したシリンジであり得る。

酸素圧の調節と組み合わせて上記針を用いる本発明の実施により卵母細胞を上記の低下した酸素圧を含む条件で回収することができる。

該系のある態様において、各チャンバーの温度は独立して制御することができる。

該系の別の態様において、各チャンバーの酸素圧は、チャンバー内側の雰囲気圧がインキュベーター外側の雰囲気と一致するようにチャンバーからガスを除去すると同時に酸素、窒素、二酸化炭素、ヘリウムまたは他の不活性ガス、またはこれらガスの2またはそれ以上の混合物を加えることにより独立して制御される。

さらに該系の別の態様において、チャンバー内側のガス圧はメインチャンバー周囲の雰囲気圧よりわずかに高い。

細胞培養、例えば卵母細胞、精子、および胚を培養または維持する培養液の過剰な蒸発を防ぐためチャンバー内に高湿度が必要である。該系の好ましい態様は、各チャンバー内の湿度が50%〜100%、例えば60%〜99%、例えば70%〜98%、より好ましくは80%〜97%、例えば70%〜96%、例えば80%〜95.5%、最も好ましくは90%〜95%のレベルに独立して制御されるインキュベーターである。

生物学的物質のほとんどの培養は温度10〜50℃で維持される。本発明の好ましい態様において、インキュベーターの温度は卵母細胞、精子、胚、および幹細胞株を含む幹細胞を培養するために制御され、30〜45℃、例えば32〜42℃、例えば34〜40℃、例えば36〜38℃、例えば36,5〜37,5℃、例えば約37℃の予め選ばれた温度が含まれる。好ましい態様において、卵母細胞、精子、胚、および幹細胞株を含む幹細胞の培養条件は温度約37℃を含む。

別の態様において、インキュベーターの各チャンバーの温度は、温度が予め選択した温度より例えば0.2℃以上低ければ加熱器がオンになるように上記温度に従って独立して調節および制御される。温度が予め選択した温度より例えば0.2℃以上高ければ冷却器がオンになるだろう。実際のチャンバー内が予め選択した温度に達すると加熱器または冷却器をオフにする。

該系の好ましい態様において、エントランスポートおよびエグジットポートは単一の開口手段、例えばドアと組み合わされる。

該系のより好ましい態様において、エントランスポートおよびエグジットポートは細胞培養手段および装置を外部チャンバーへそしてそれから輸送する手段と組み合わされる。エントランスポートおよびエグジットポートの該組み合わせがエアロックである系が好ましい。エントランスポートがエアロックの内部ドアを構成し、エグジットポートがエアロックの外部ドアを構成する系がより好ましい。該エアロックが小気密チャンバーを構成する内部ドアと外部ドアの間の壁を含む系も好ましい。

該系のある態様において、エアロックの内部ドアおよび外部ドアは、1つのドアだけが一度に開くことができ、1つのドアの開口が外部ドアが完全に閉まった時にのみ生じ得るように、一度に1つだけ開くことができる。外部ドアが開いている時はエアロックにおけるガスの吸入は行うことができない。

該系のある態様において、エアロックの雰囲気は酸素、窒素、二酸化炭素、ヘリウムまたは別の不活性ガスの含有量、温度、および湿度を含めて調節及び調整することができる。エアロックの雰囲気は酸素、窒素、二酸化炭素、ヘリウムまたは他の不活性ガスまたはこれらガスの2またはそれ以上の混合物を加えることにより制御手段を通して制御することができる。エアロックの温度および湿度も加熱器または冷却器を作動させまたは湿度を供給する制御手段により制御することができる。ガス濃度、温度、および湿度の制御は、エアロック中に位置する測定手段により行う測定値に従って行うことができる。示したガスの供給は予め決定したレベルに従って行うことができ、温度および湿度も予め決定したレベルに従って制御することができる。好ましい態様において、エアロックの雰囲気はガス濃度、温度、および湿度に従ってメインチャンバーの雰囲気と同様に制御される。

該系のある態様において、温度、湿度、および酸素含有量を含む条件がエアロックが内側に位置する該チャンバー内側の条件に等しいときにのみエアロックの内部ドアを開くことができる。

該系のある態様において、トレイがエアロック中に置かれている。該トレイは容器、操作対象、および他の装置の搬入および搬出をより容易にする。

インキュベーターの作業領域とインキュベーターの外側の間にエアロックが位置し、作業領域および挿入領域の条件(温度、湿度、O₂濃度)が変化する危険性を減少させる。エアロックとインキュベーターの外側の間にエアロックの外部ドアがあり、エアロックとインキュベーターの作業領域の間にエアロックの内部ドアがある。外側から作業領域に輸送されたすべての対象および培地はエアロックの内部ドアが閉じ、エアロックの外部ドアが開き、対象がエアロック中に置かれ、エアロックが閉じられるような方法でエアロックを通過することができる。エアロックの環境は作業領域と同様の条件に調整され、該条件が得られる時、エアロックの内部ドアを開くことができ、対象を作業領域に輸送することができる。作業領域からインキュベーターの外側への対象の輸送は、エアロックの外部ドアを閉じ、エアロックを作業領域と同様の条件に調整することにより行い、該条件が得られる時エアロックの内部ドアを開くことができ、対象を作業領域からエアロックに輸送することができ、エアロックの内部ドアが閉じ、エアロックの外部ドアが開き、対象がインキュベーターの外側に輸送される。調節手段はエアロックの1つのドアのみが一度に開くことを可能にする。ランプの点滅および音を含むアラームはエアロックの内部がまさに開こうとし、エアロックの条件が作業領域の条件と同様でない時に知らせるだろう。

該系の別の態様において、顕微鏡を置き、卵母細胞、精子、胚、および幹細胞株を含む幹細胞を操作する時に用いることができる。顕微鏡は双眼顕微鏡であってよい。モニターする培養皿をのせる顕微鏡の作業領域はメインチャンバーの内側に位置する。顕微鏡は、好ましくはインキュベーター内部でユーザーが快適に細胞培養を行えるようにメインチャンバーの先端の間隙を通して延長され、所望によりモニター画面に接続される。該間隙は、メインチャンバー先端と顕微鏡の間の環を密封する密封手段を含み、これによりメインチャンバーとインキュベーター外部間の漏れを避けるかまたは最小限にする。該密封手段は柔軟なプラスチックカフであるかもしれない。

顕微鏡は、予め決定された間隔で手動または自動で培養中の細胞または細胞(複数)の画像を得るように調整することができるカメラと接続してよい。該画像は保存され、好ましくはコンピュータに電子的に保存される。画像は以下のごとく用いることができる。

該系の好ましい態様において、作業領域はメインチャンバー内に得られ、作業領域は顕微鏡で観察される培養細胞構造を含む培養手段のための場所を含み、該作業領域は操作手段のための空間を含む。

該系の別の好ましい態様において、メインチャンバーはチャンバー内側の装置や細胞培養を操作するためのヒトの手を入れることができる手用開口部または開口手段もしくは間隙を含む。

該系のある態様において、該開口手段もしくは間隙または手用開口部には手袋または指のない手袋がついている。これら手袋または指のない手袋は、ヒトの手が手袋または指のない手袋にフィットし、該チャンバー内側の装置や細胞培養を操作できるように取り付けられる。手袋またはインキュベーターと手袋または指のない手袋の間の締め付け領域は、インキュベーターの外側から内側(またはその逆)へのあらゆる微生物、ウイルス、真菌、および細菌の侵入を許さないか、または少なくともこれらの開口部または間隙を通してのガスの侵入を手袋とメインチャンバー壁の間に密封手段を取り付けることにより最小限にする。インキュベーター内側のペトリ皿の操作は手袋または指のない手袋内側に手を突き出すことにより行う。必要であればインキュベーター内部に位置する該手袋の表面を使用前に滅菌する。

別の態様において、開口手段はインキュベーターから離れる方向に向かうかまたは開口手段を含む壁と平行方向のガス流を得ることができる間隙を含む。ガスは空気、窒素などであり得る。間隙を使用しないときはガスを切り、間隙をロックにより閉じることができる。ガス流は空気がインキュベーター内に入るのを防ぐ。

開口手段または間隙に光ファイバーで操作することができるスティック、バー、または装置を取り付けることができ、さらに操作する細胞培養または装置を該スティック、バー、または装置により操作することができる。

該系のある態様において、インキュベーターはメインチャンバー後部にメインチャンバー内に顕微鏡のようなより大きい物を挿入することができるドアを有する。少なくとも1つのレジデンスチャンバーは、メインチャンバーの開口が少なくとも1つのレジデンスチャンバー内側の培養条件に影響を及ぼさないようにそれぞれ個々に調節される。

該系のある態様において、メインチャンバーはその表面に針が貫通することができ、針を除去するときは膜が針が貫通した領域を満たし、針が膜を貫通するかまたは針が膜を貫通していない時は膜を通してガスや粒子が拡散することができない構造を有する膜で置換された少なくとも1つの小部分を有する。

該系のある態様において、少なくとも2つの分離したチャンバーはメインチャンバーおよび1またはそれ以上のより小さな気密性レジデンスチャンバーとして配置される。該より小さなレジデンスチャンバーはメインチャンバーの内側に位置するか、またはメインチャンバーに取り付けられていることが好ましい。レジデンスチャンバーが気密性であり、温度、湿度、および酸素、窒素、および二酸化炭素の含有量に応じて互いに独立して、およびメインチャンバーと独立して調節することができる系も好ましい。レジデンスチャンバーが卵母細胞、精子、胚、および幹細胞株を含む幹細胞の細胞培養を含む培養容器用のボックスを構成する系がより好ましい。該ボックスは細胞培養用の培養チャンバーまたは保存チャンバーを構成する。各ボックスが細胞培養を含む1つの培養容器を受け入れるのに適している系も好ましい。別の好ましい系はボックス数が細胞培養の発育期の数に対応している系である。

ある態様において、細胞培養を行う系は少なくとも未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞、未成熟精子、成熟精子、受精卵母細胞、2細胞胚、4細胞胚、8細胞胚、桑実胚、胚盤胞、幹細胞株を含む幹細胞の発育期を含む。

該系のある態様において、各レジデンスチャンバーの酸素圧および圧力は、該チャンバーまたは該気密性ボックス中の胚の画像を取り出すことによりコンピュータで制御することができる。画像はカメラで取り出される。カメラは各気密性ボックスに手動で接続するか、カメラをボックスからボックスに自動的に移動させるか、またはカメラを各ボックスに恒久的に接続するか、または気密性ボックスを該ボックスを回転トレーに取り付けるかまたは該ボックスをボックスが例えばレール系の周りを移動する系に取り付けるような方法でカメラまで移動させる。各細胞培養容器に恒久的に接続したカメラは例えばチップ、CCDカメラまたはホイル中の小型カメラであり得る。

別の態様において、培養の画像は、少なくとも1分間、例えば少なくとも5分間、例えば少なくとも10分間、例えば少なくとも20分間、例えば少なくとも40分間、例えば少なくとも1時間、例えば少なくとも2時間、例えば少なくとも4時間、例えば少なくとも6時間、例えば少なくとも8時間、例えば少なくとも12時間、例えば少なくとも18時間、例えば少なくとも24時間の間隔でコンピュータに送られる。

該画像は、高品質、中程度の品質、低品質の胚盤胞および/または幹細胞および/または幹細胞株を生じる経路、および細胞死を生じる経路を含む異なる発育経路の一種の映画を一緒に含む一連の予め保存された画像と比較することができよう。予め保存された画像は培養条件を含む情報と関連したコンピュータプログラムによる。培養中の配偶子または細胞の画像を予め保存された画像と比較することによりコンピュータプログラムで培養条件を、得ることができる最高品質または予め決定された品質の胚盤胞、幹細胞、または幹細胞株を得るために変更すべきかどうかを決定することができる。

例えば温度および酸素圧を含む培養条件の変更は手動または自動で行うことができよう。培養条件を手動で変更するために、モニター画面の閃光または強調ラインのような表示でコンピュータプログラムが培養条件を変更すべきレジデンスチャンバーをみいだしたことを示すかもしれない。例えば酸素圧の変更は、細胞の発育を引き起こすために低下または増加した酸素圧で短時間であるかまたは特定の培養条件を得るための酸素圧の長期的変化であってよい。

本発明のある態様において、培養液の組成を含むさらなる培養条件は、培養中の細胞の画像を上記の予め保存された画像と組み合わせた時の反応により手動または自動で変化させることができる。

培地は配偶子から胚盤胞までの過程で1〜4回交換するのが好ましい。1〜3回の培地交換がより好ましい。1〜2回の培地交換が最も好ましい。

本発明のある態様において、予め保存された画像および上記の異なる発育経路はコンピュータの環境調節プログラムを含む。該プログラムは、培養中の細胞の画像を予め保存された画像と組み合わせることにより他の箇所に記載の温度、ガス、および/または培地を含む環境を調節する。

ある態様において、環境調節プログラムは細胞培養を開始する時に用いる。環境調節プログラムは細胞の発育段階を手動でタイピングすることにより作動させるか、または細胞の画像が環境調節プログラムを作動させる。

ある態様において、培養容器中の培養室は、他の箇所に記載したように画像を得、この画像を利用する際にカメラの焦点を最適化するために小さい底中の培養細胞が制限された領域内にあるように開口部より小さい底を有するボウル状をしている。

ある態様において、培養容器はボウル状培養室に取り付けた少なくとも1本のチューブを含む。ガスまたは培地を交換することができる該少なくとも1本のチューブを通して、装置、例えば温度計、または他の測定値、例えば培地の化合物濃度または培地の浸透圧を得るための装置を接続することができる。各培養室のふたはカメラでありうるか、またはカメラをふたの中に組み込むかまたはふたに直接取り付けることができる。該ふたはカメラを正しい位置に導く操縦手段も含むことができる。該操縦手段は限定されるものではないがカメラまたはカメラの付属品を締め付けるV字型の刻み目を有することがある少なくとも1本の垂直スティックまたは水平スティックであり得る。

ある態様において、培養容器および/または培養室は細胞を光から保護する物質からなる。該物質が光を排除すれば、ふたは細胞を観察するための顕微鏡またはカメラを用いる可能性を保証するため光感受性物質からなることができる。該物質が光を排除しなければ、培養容器を光を排除するレジデンスチャンバーにより光から保護することができるか、または培養容器をあらゆる阻害手段によりインキュベーターの光またはインキュベーター外部からの光から保護することができる。

ある態様において、培養容器はレジデンスチャンバーを含み、本明細書の他の箇所に記載のレジデンスチャンバーおよび気密性ボックスの特徴を含む。

ある態様において、インキュベーターは本明細書の他の箇所に記載のICSIを実施するためのICSI系を含む。

該系のある態様において、レジデンスチャンバーはポータブルの(持ち運びできる)気密性ボックスである。該装置から除去するときに温度、湿度、および酸素、窒素、および二酸化炭素含有量を調節する手段と接続することができる気密性ボックスを有する系が好ましい。温度、湿度、および酸素、窒素、および二酸化炭素含有量を調節する手段がポータブルである系も好ましい。気密性ボックスの壁が膜を含む系がさらに好ましい。気密性ボックスが1またはそれ以上の細胞培養容器を固定するための固定手段を含む系がさらに好ましい。細胞培養容器の壁が無菌膜を含む系も好ましい。該系のある態様において、気密性ボックスは少なくとも6日間輸送することができる。

該系のある態様において、メインチャンバーの寸法は、1cm〜2m、例えば20〜50cm、例えば50〜70cm、例えば70〜90cm、例えば90〜110cm、例えば110〜130cm、例えば130〜150cm、例えば150〜170cm、例えば170〜200cmである。深さ50〜110cm、例えば50〜70cm、例えば70〜90cm、例えば90〜110cm、および長さ50〜200cm、例えば50〜70cm、例えば70〜90cm、例えば90〜110cm、例えば110〜130cm、例えば130〜150cm、例えば150〜170cm、例えば170〜200cm、高さ50〜110cm、例えば50〜70cm、例えば70〜90cm、例えば90〜110cmの縦型チャンバーが好ましい。
幹細胞

別の局面において、本発明は胚性幹細胞組成物に関する。該方法は胚盤胞の内部細胞塊の数および品質を改善し、さらに内部細胞塊由来の幹細胞の数および品質を改善する。

ある態様において、該幹細胞は好都合な幹細胞より安定である。幹細胞は未分化期のある期間に得ることができる。ある態様において、幹細胞の該未分化期は酸素圧15%以下を含む培養条件により維持される。
ある態様は幹細胞を製造する方法であり、該方法は
a) 本明細書の他の箇所に記載の多細胞前胚を得、
b) a)の多細胞前胚を単離し、
c) b)の該前胚の内部細胞塊由来の細胞を単離し、
d) マトリックスゲル中の内部細胞塊由来の該単離細胞を培養し、
e) 幹細胞を得ることを含む。

ある態様において、工程b)、c)、d)、およびe)の少なくとも1つは酸素圧15%以下で行われる。別の態様において、工程b)、c)、d)、およびe)の少なくとも2つは酸素圧15%以下で行われる。さらなる態様において、工程b)、c)、d)、およびe)の少なくとも3つは酸素圧15%以下で行われる。さらなる態様において、工程b)、c)、d)、およびe)はすべて酸素圧15%以下で行われる。

別の局面は上記細胞培養から得られる幹細胞である。該幹細胞から幹細胞株を得ることができる。

ある態様において、幹細胞を未分化期に維持する期間は少なくとも4時間、例えば少なくとも8時間、例えば少なくとも12時間、例えば少なくとも24時間、例えば少なくとも2日間、例えば少なくとも3日間、例えば少なくとも4日間、例えば少なくとも5日間、例えば少なくとも7日間、例えば少なくとも9日間、例えば少なくとも11日間、例えば少なくとも13日間、例えば少なくとも15日間、例えば少なくとも20日間、例えば少なくとも25日間、例えば少なくとも30日間である。

ある態様において、幹細胞を未分化期に維持する期間は、少なくとも1ヶ月間、例えば少なくとも1.5ヶ月間、例えば少なくとも2ヶ月間、例えば少なくとも3ヶ月間、例えば少なくとも4ヶ月間、例えば少なくとも5ヶ月間、例えば少なくとも6ヶ月間、例えば少なくとも7ヶ月間、例えば少なくとも8ヶ月間、例えば少なくとも9ヶ月間、例えば少なくとも10ヶ月間、例えば少なくとも11ヶ月間、例えば少なくとも12ヶ月間である。

ある態様において、幹細胞を未分化期に維持する期間は、少なくとも1年間、例えば少なくとも1.5年間、例えば少なくとも2年間、例えば少なくとも2.5年間、例えば少なくとも3年間、例えば少なくとも3.5年間、例えば少なくとも4年間、例えば少なくとも4.5年間、例えば少なくとも5年間、例えば少なくとも6年間、例えば少なくとも7年間、例えば少なくとも8年間、例えば少なくとも9年間、例えば少なくとも10年間、例えば少なくとも1年間、例えば少なくとも12年間、例えば少なくとも13年間、例えば少なくとも14年間、例えば少なくとも15年間、例えば少なくとも20年間である。

幹細胞は、突然変異や他の遺伝子的変化が染色体または細胞表面の抗原性に生じない意味において未分化期に維持される期間安定である。幹細胞は病原体を有さず、ヒト供給源が知られており、配偶子および/または胚および/または胚盤胞の培養条件が知られているようによく特徴づけられている。

ある態様において、幹細胞および/または幹細胞株はマトリックスゲルおよび/またはフィーダー細胞を用いて増殖させる。細胞外マトリックスは合成または動物/ヒト物質由来であり得、該マトリックス内の成分または添加物によって幹細胞の固着、分裂を支持し、脱分化、分化両方を保証し、またはそれらを未分化に維持する目的を有する。

幹細胞から製造される幹細胞株は染色体内または細胞表面の抗原性に突然変異や他の遺伝子的変化が生じないという意味で安定である。該幹細胞株は病原体を有さず、ヒト供給源が知られており、配偶子および/または胚および/または胚盤胞の培養条件が知られているようによく特徴づけられている。

各幹細胞株は細胞株の起源、該細胞表面の抗原のタイプを含む細胞株の特徴、および細胞株を分化細胞へのさらなる発育を調節する方法を示す証明書と共に提供される。

別の局面は、
・上記幹細胞、
・幹細胞および該幹細胞が得られる細胞培養の培養条件を記載する証明書
を含む幹細胞パッケージである。

具体的には、該証明書には多細胞前胚を製造するために上記工程a)〜e)の少なくとも部分で該細胞を酸素圧15%以下で培養することが記載されている。上記のごとく低下した酸素圧が好ましい。証明書には細胞系の分化細胞へのさらなる発育を調節する方法も含むことができる。
(図面の詳細な説明)

図1は胚スコアリングシステムを示す。胚の発育を上端から示す。発育のスコアは以下の通りである。
スコア1.0： 等しいサイズの対称的ブラストマー、核フラグメントなし、
スコア2.0： 不規則なサイズのブラストマー、核フラグメントなし、
スコア2.1： 10%フラグメンテーション以下の胚、
スコア2.2： 10〜20%ブラストマーフラグメンテーションの胚、
スコア3.0： 20〜50%ブラストマーフラグメンテーションの胚、
スコア3.2： ブラストマーフラグメンテーションが50%以上の胚、
スコア4.0： 完全にフラグメント化、
スコア5.0： 受精、非分離、
スコア6.0： 非受精、非分離。
M： 桑実胚、
B1： 早期胚盤胞、
B2： 膨化中の胚盤胞、
B3： 膨化胚盤胞、
Bn1： 正常腔、正常細胞、
Bn2： 正常腔、粒状または暗細胞、
Bn3： 異常腔、
HB1： ハッチング胚盤胞、
HB2： ハッチド胚盤胞。

図2は累積胚スコアリング(CES)システムを示す。これは異なる発育期の胚に与えられるポイントの例である。図2aは、形成されたブラストマー数が等しく、フラグメントのない胚であり、4ポイントが与えられる。図2bはフラグメント10%以下のブラストマー数が不均一な胚であり、3ポイントが与えられる。図2cは10〜50%フラグメンテーションの、異種ブラストマー数の不均一な胚である。図2dは>50%フラグメンテーションの、ブラストマーがほとんど認識できない胚であり、1ポイントが与えられる。

図3はインキュベーターを示す。インキュベーターはエアロック、酸素、窒素、二酸化炭素、および他のガス、ならびに温度の調節器を備えている。インキュベーター中に顕微鏡および気密性ボックスが置かれる。

体外成熟、体外受精、および胚発育時における卵母細胞の品質、ヒト卵の胚性発育に対する低酸素圧の効果
以下の実施例は、現在1年間に500以上のIVFサイクル、200以上のIVMサイクルが実施されているHerlev University Hospitalの生殖生物学の部門で行われる。ヒト体外受精治療の2つの局面に対する研究が行われる。
1) 低酸素圧はルチーンIVFに有益か、
2) 低酸素圧はIVM治療に有益か。

卵母細胞回収時から胚移植までのすべての配偶子および胚の培養および操作は通常のルチーン実験室およびインキュベーター、またはその期間培養ボックス中で行われる(下記参照)。
培養ボックス：

培養ボックスは、in vitro培養の操作に用いる多機能丸窓システムを有する密封培養ボックスを含む。雰囲気は加湿雰囲気中5%CO₅および5%O₂にする。温度を37.2℃、雰囲気とボックスを無菌にする。エアロックをつけるべきである。そのようなシステムを用いることにより酸素圧および二酸化炭素の変化を避けることができ、すでに公表されたデータに従ってよりよい培養結果が期待できよう。
試験の構成
試験1：

200のルチーンIVFサイクルを5%CO₂中5%酸素圧の培養ボックスまたは20%酸素および5%CO₂の本発明者らのルチーンインキュベーターを用いる培養に無作為に振り分ける。

これは各群で約600個の胚をもたらし、以下のデータを回収する。
受精卵数、
分割卵数、
胚品質、
移植可能胚数、
凍結胚数、
妊娠数、
着床率。
試験2：

100のIVMサイクルを5%CO₂中5%酸素圧の培養ボックスまたは20%酸素および5%CO₂の本発明者らのルチーンインキュベーターを用いる培養に無作為に振り分ける。

これは各群で約100個の胚をもたらし、以下のデータを回収する。
GVBDの卵数、
MFII卵母細胞数、
受精卵数、
分割卵数、
胚品質、
移植可能胚数、
凍結胚数、
妊娠数、
着床率。
結果

試験の参入基準を満たすすべての患者に対し診療所での不妊治療中にインフォームドコンセントを求める。インフォームドコンセントを得た後、患者を、胚を20%酸素の常套的手順で培養するかまたは5%酸素の試験手順に無作為化する。卵母細胞をシリンジで卵巣から取り出し、卵巣の正常酸素圧を得る。
胚の5%培養：

胚を回収する前日に培養液を低酸素環境下でインキュベーションして調製する。

胚の回収日に精子を調製し、直後に後の受精のために平衡化するために速やかにインキュベーションする。

胚を回収後、胚を確認し、インキュベーションした培地に速やかに入れ、5%酸素環境でインキュベーションする。

午後に胚を受精し、次いで別の培養皿に取り出す。

受精胚は移植し戻すべきと思われるまで低酸素環境下にとどめる。移植前にすべての胚をスコア付けし、移植に最適な胚を選択する。
結果：

(参考文献)

Fisch, J. D., H. Rodriguez, R. Ross, G. Overgy & G. Sher. The Graduated embryo score(GES) predicts blastocyte formation and pregnancy rate from cleavage-stage embryos. Human Reproduction vol 16, no. 9, pp.1970-1975, 2001。
Joesbury, K. A., W. R. Edirisinghe, M. R. Philips & J. L. Yovich. Evidence that male smoking affects the likelihood of a pregnancy following IVF treatment: application of the modified cumulative embryo score. Human Reproduction vol 13 no. 6, pp.1506-1513, 1998。
Van Abbelら、Human Reproduction, vol 7, no.1, pp.117-119, 1992。
Ziebe, S., K. Petersen, S. Lindenberg, A.-G. Andersen, A. Gabrielsen & A. Nyboe Andersen. Embryo morphology or cleavage stage: how to select the best embryos for transfer after in-vitro fertilisation. Human Reproduction vol. 12, no. 7, pp. 1545-1549,1997。

胚スコアリングシステムを示す。 累積胚スコアリング(CES)システムを示す。 インキュベーターを示す。

Claims (226)

1. 哺乳類前胚のin vitro製造系であって、
   ・哺乳類卵母細胞を得る手段、
   ・哺乳類精子を得る手段、
   ・1チャンバーの酸素圧を他のチャンバーの酸素圧と独立して変化させることができる少なくとも2の分離した気密性チャンバー(ここで、該少なくとも2の分離した気密性チャンバーはメインチャンバーと少なくとも1のレジデンスチャンバーを構成する)を有する装置であって、
   ・哺乳類卵母細胞および/または哺乳類精子を得る手段と連絡することができる少なくとも1のエントランスポート、および
   ・前胚を回収するエグジットポート、ならびに
   ・該少なくとも2のチャンバー間に、チャンバー間の卵母細胞、精子、および/または前胚の輸送を可能にする連絡ポートを含む装置
   を含む系。
2. 哺乳類卵母細胞を得る手段が、シリンジとチューブを含む、針から該装置への輸送手段と気密条件下で連絡する針を有する系である請求項1記載の系。
3. 哺乳類精子を得る手段が酸素圧を調節することができる系である請求項1記載の系。
4. チャンバー内の雰囲気が無菌に保たれる請求項1記載の系。
5. 各チャンバーの温度が独立して制御される請求項1記載の系。
6. 各チャンバーの酸素圧が、空気圧が該雰囲気と一致するようにチャンバーからガスを除去すると同時に酸素、窒素、二酸化炭素、ヘリウム、または他の不活性ガス、またはこれらガスの2またはそれ以上の混合物を加えることにより独立して制御される請求項1記載の系。
7. チャンバー内のガス圧がメインチャンバー周囲の雰囲気圧よりわずかに高い請求項6記載の系。
8. 各チャンバーの湿度を50〜100%のレベルに調節および制御することができる請求項1〜7に記載の系。
9. 該エントランスポートおよびエグジットポートが単一開口手段、例えばドアと組み合わさっている請求項1記載の系。
10. 該エントランスポートおよびエグジットポートが、細胞培養手段および装置を外部チャンバーにそしてそれから輸送する手段と組み合わさっている請求項1記載の系。
11. 該エントランスポートおよびエグジットポートの該組み合わせがエアロックである請求項10記載の系。
12. 該エントランスポートが該エアロックの内部ドアを構成し、該エグジットポートが該エアロックの外部ドアを構成する請求項11記載の系。
13. 該エアロックが小気密性チャンバーを構成する該内部ドアおよび該外部ドア間の壁を含む請求項12記載の系。
14. 該内部ドアおよび該外部ドアが、一度に1つのドアのみが開くことができ、1ドアの開口が他のドアが完全に閉じた時にのみ生じうるように一度に１つだけ開くことができる請求項13記載の系。
15. 酸素、窒素、二酸化炭素、ヘリウム、または別の不活性ガスの含有量、温度、および湿度を含む該エアロックの雰囲気を調節および制御することができる請求項14記載の系。
16. 該内部ドアおよび該外部ドアが、温度、湿度、および酸素含有量を含む条件が該エアロックが内側に位置するチャンバーの内側の条件と等しいときのみ開くことができる請求項15記載の系。
17. 顕微鏡を置き、卵母細胞、精子、および胚の操作時に用いることができる請求項1記載の系。
18. 作業領域が該メインチャンバー内に得られ、該作業領域が顕微鏡で観察される培養細胞構造を含む培養手段のための場所を含み、また該作業領域が操作手段のための空間を含む請求項1〜17記載の系。
19. ミクロ受精装置がメインチャンバー内に置かれる請求項1〜17記載の系。
20. メインチャンバーがチャンバー内の細胞培養または装置を操作するヒトが入ることができる開口手段を含む請求項1〜19に記載の系。
21. 該開口手段にグローブがついており、これらグローブがヒトの手がグローブにフィットし、チャンバー内の細胞培養または装置を操作することができるように取り付けられている請求項20記載の系。
22. 該開口手段に、光ファイバーにより操作するスティック、バー、または装置がついており、これにより細胞培養または装置を操作することができる請求項20記載の系。
23. メインチャンバー表面の少なくとも1の小部分が、無菌であり、それを通して針が貫通でき針を除去するときに針が貫通した領域を満たすことができ、針が膜を貫通した時または針が膜を貫通していない時にガスや粒子が膜を通じて拡散することができない構造を有する膜で置換されている請求項1記載の系。
24. 少なくとも2の分離したチャンバーがメインチャンバーと1またはそれ以上のより小さい気密性レジデンスチャンバーとして配置されている請求項1〜23記載の系。
25. 該より小さいレジデンスチャンバーがメインチャンバーの内側に位置しているか、またはメインチャンバーに取り付けられている請求項24記載の系。
26. 該レジデンスチャンバーが、気密性であり、温度、湿度、および酸素、窒素および二酸化炭素含有量に応じて互いに独立して、およびメインチャンバーと独立して調節することができる請求項25記載の系。
27. 該レジデンスチャンバーが、卵母細胞、精子、胚、および幹細胞株を含む幹細胞の細胞培養を含む培養容器のためのボックスを構成する請求項26記載の系。
28. 各ボックスが、卵母細胞、精子、胚、および幹細胞株を含む幹細胞の細胞培養を含む1つの培養容器を受けるのに適合している請求項27記載の系。
29. 各ボックスの数が、卵母細胞、精子、胚、および幹細胞株を含む幹細胞の発育期(段階)の数に対応している請求項28記載の系。
30. 該発育期が、少なくとも未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞、精子、受精卵、4細胞胚、8細胞胚、桑実胚、胚盤胞、および幹細胞株を含む幹細胞を含む請求項29記載の系。
31. 各チャンバーまたは気密性ボックスの酸素圧および圧力を該チャンバーまたは該気密性ボックス中の胚の画像を取り出すことによりコンピューターで制御することができる請求項1〜30記載の系。
32. 該気密性ボックスがポータブルである請求項24記載の系。
33. 該気密性ボックスを、該装置から取り外したときに温度、湿度、および酸素、窒素、および二酸化炭素含有量の調節手段と接続することができる請求項32記載の系。
34. 温度、湿度、および酸素、窒素、および二酸化炭素含有量の該調節手段がポータブルである請求項33記載の系。
35. 該ボックスの壁が膜を含む請求項32〜34記載の系。
36. 小ボックスが1またはそれ以上の細胞培養容器をファスティング(fasting)するためのファスティング手段を含む請求項32〜35に記載の系。
37. 該細胞培養容器の壁が無菌膜を含む請求項36に記載の系。
38. 小ボックスを少なくとも6日間移動させることができる請求項32〜37に記載の系。
39. メインチャンバーのサイズが各壁が1cm〜2mの部屋を構成する請求項1記載の系。
40. 細胞培養を培養するための請求項1〜39記載の系の使用。
41. 配偶子、胚、胚盤胞、幹細胞、幹細胞株を培養するための請求項1〜39記載の系の使用。
42. 以下の工程を含む哺乳類前胚のin vitro製造方法：
    a1) 哺乳類卵母細胞を得、
    a2) 哺乳類精子を得、
    b) 該卵母細胞と該精子を培養し、
    c) 該卵母細胞を該精子で受精させて受精卵を得、
    d) 受精卵を細胞分割させて多細胞前胚を得る
    (ここで、工程a1)またはa2)の少なくとも1は15%以下の酸素圧で行われる)。
43. 該哺乳類卵母細胞および哺乳動物精子がそれぞれ哺乳動物、例えば乳牛、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、トラ、ライオン、パンダ、ゴリラ、クジラ、およびヒトの雄および雌から得られる配偶子である請求項42記載の方法。
44. 該哺乳類卵母細胞および哺乳動物精子が乳牛由来の配偶子である請求項1記載の方法。
45. 該哺乳類卵母細胞および哺乳動物精子がブタ由来の配偶子である請求項1記載の方法。
46. 該哺乳類卵母細胞および哺乳動物精子がウマ由来の配偶子である請求項1記載の方法。
47. 該哺乳類卵母細胞および哺乳動物精子がヒト由来の配偶子である請求項1記載の方法。
48. 該卵母細胞が卵巣から得られる先の請求項1〜47のいずれかに記載の方法。
49. 該卵母細胞が一次卵胞、二次卵胞、前胞状卵胞、初期胞状卵胞、または胞状卵胞から得られる請求項48記載の方法。
50. 該卵母細胞が針への吸引により卵巣から得られる請求項48〜49に記載の方法。
51. 一次、二次、または胞状卵胞を含む部分または全卵巣組織を除去し、該卵巣組織由来の含有一次、二次、または胞状卵胞を得ることにより該卵母細胞を卵巣から得る請求項48〜50に記載の方法。
52. 除去された部分または全卵巣組織が凍結されている請求項51記載の方法。
53. 該針がシリンジの部分であり、該針および該シリンジ内の酸素圧が15%以下である請求項50記載の方法。
54. 該卵母細胞が卵母細胞を成熟させることができるホルモンで哺乳動物を処理した後に該哺乳動物から得られる先の請求項1〜53のいずれかに記載の方法。
55. 該ホルモンが卵胞刺激ホルモン(FSH)である請求項54記載の方法。
56. 該ホルモンが黄体ホルモン(LH)である請求項54記載の方法。
57. 該卵母細胞が冷却されている請求項1〜56に記載の方法。
58. 該卵母細胞が冷凍されている請求項1〜56に記載の方法。
59. 精子が精子細胞または精母細胞を含む未成熟精子または成熟精子である請求項1〜47記載の方法。
60. 未成熟または成熟精子が酸素圧15%以下の条件下で雄から得られる請求項59記載の方法。
61. 精子が雄から除去した精巣組織から得られる請求項59〜60に記載の方法。
62. 精巣細胞が冷凍されている請求項61記載の方法。
63. 精子が精液または精巣組織から得られる請求項59〜62記載の方法。
64. 精子が冷却されている請求項59〜63に記載の方法。
65. 精子が冷凍されている請求項59〜63に記載の方法。
66. 卵母細胞が未成熟卵母細胞である請求項1〜58に記載の方法。
67. 該未成熟卵母細胞が卵胞から得られる請求項66記載の方法。
68. 該卵胞が直径1〜25mm、例えば2〜18mm、例えば3〜13mm、例えば5〜12mm、例えば7〜11mm、例えば8〜10mmである請求項67記載の方法。
69. 未成熟卵母細胞が一次卵母細胞である請求項66記載の方法。
70. 未成熟配偶子が第一減数分裂の前期にある請求項66記載の方法。
71. 未成熟配偶子が第一減数分裂のディクチオテン(dictyotene)期にある請求項66記載の方法。
72. 未成熟配偶子が第一減数分裂の後期にある請求項66記載の方法。
73. 分裂中期IIまでの未成熟配偶子の培養が同調卵丘、細胞質、および核成熟に関連している請求項66〜72記載の方法。
74. 分裂中期IIまでの未成熟配偶子の培養が20〜30時間内に完結する請求項66〜73のいずれかに記載の方法。
75. 工程b)が卵母細胞が成熟する条件下で該未成熟卵母細胞を培養する工程を含む請求項66〜74記載の方法。
76. 該条件が酸素圧15%以下を含む請求項75記載の方法。
77. 酸素圧が、13%以下、例えば11%以下、例えば10%以下、例えば9%以下、例えば8%以下、例えば7%以下、例えば6%以下、例えば5%以下、例えば4%以下、例えば3%以下、例えば2%以下、例えば1%以下である請求項1〜76のいずれかに記載の方法。
78. 工程b)が卵母細胞と精子の同時培養を含む請求項1記載の方法。
79. 卵母細胞および精子が、少なくとも1分間、例えば少なくとも2分間、例えば少なくとも5分間、例えば少なくとも10分間、例えば少なくとも30分間、例えば少なくとも1時間、例えば少なくとも2時間、例えば少なくとも3時間、例えば少なくとも4時間、例えば少なくとも5時間、例えば少なくとも10時間、例えば少なくとも15時間、例えば少なくとも20時間、例えば少なくとも25時間、例えば少なくとも30時間、例えば少なくとも35時間、例えば少なくとも40時間、例えば少なくとも45時間、例えば少なくとも50時間同時培養される請求項78記載の方法。
80. 卵母細胞および精子がフィーダー細胞と同時培養される請求項78〜79に記載の方法。
81. 卵母細胞と精子の同時培養が卵母細胞の精子による熟成をもたらす請求項78〜80に記載の方法。
82. 卵母細胞が細胞質内精子注射(ICSI)により精子で受精される請求項1〜77に記載の方法。
83. 受精卵母細胞を雌子宮に移植する準備が整う胚期まで培養する先の請求項1〜82のいずれかに記載の方法。
84. 該胚を移植するための期(段階)が卵母細胞の受精後最小1/2日培養、例えば少なくとも1日間、例えば少なくとも2日間、例えば少なくとも3日間、例えば少なくとも4日間、例えば少なくとも5日間、例えば少なくとも6日間、例えば少なくとも7日間、例えば少なくとも8日間、例えば少なくとも9日間で得られる請求項83記載の方法。
85. 該胚期が2細胞期である請求項83〜84記載の方法。
86. 該胚期が4細胞期である請求項83〜84記載の方法。
87. 該胚期が6細胞期である請求項83〜84記載の方法。
88. 該胚期が8細胞期である請求項83〜84記載の方法。
89. 該胚期が桑実胚期である請求項83〜84記載の方法。
90. 該胚期が胚盤胞期である請求項83〜84記載の方法。
91. 該胚期が透明帯が消失している胚盤胞期である請求項83〜84記載の方法。
92. 該胚の透明帯が子宮内に移植する前の胚のハッチ(hatch)を助けるように開かれる請求項85〜91に記載の方法。
93. 該透明帯がレーザー、機械的力、または酸タイロードを用いてハッチングを助けることにより開かれる請求項92記載の方法。
94. 細胞デブリスが該胚から除去される請求項83〜93記載の方法。
95. 工程a)の少なくとも部分、および他の工程の少なくとも1が酸素圧15%以下で行われる先の請求項1〜94のいずれかに記載の方法。
96. 工程a)、b)、c)、およびd)の少なくとも3が酸素圧15%以下で行われる先の請求項1〜95のいずれかに記載の方法。
97. 工程a)、b)、c)、およびd)のすべてが酸素圧15%以下で行われる先の請求項1〜96のいずれかに記載の方法。
98. 工程d)の酸素圧が他の工程b)およびc)のいずれかの酸素圧に比べて高い先の請求項1〜97のいずれかに記載の方法。
99. 卵母細胞を成熟させる条件が酸素圧を上昇させ、次いで酸素圧を低下させることを含む請求項66〜76の方法。
100. 酸素圧の上昇が、少なくとも1単位、例えば少なくとも2単位、例えば少なくとも3単位、例えば少なくとも4単位、例えば少なくとも5単位、例えば少なくとも6単位、例えば少なくとも7単位、例えば少なくとも8単位、例えば少なくとも9単位、例えば少なくとも10単位である請求項99の方法。
101. 酸素圧が少なくとも0,5%および最大21%である先の請求項1〜100のいずれかに記載の方法。
102. 酸素圧の上昇が、少なくとも5分間、例えば少なくとも10分間、例えば少なくとも20分間、例えば少なくとも30分間、例えば少なくとも45分間、例えば少なくとも1時間、例えば少なくとも1.5時間、例えば少なくとも2時間、例えば少なくとも2.5時間、例えば少なくとも3時間、例えば少なくとも4時間、例えば少なくとも5時間、例えば少なくとも6時間、例えば少なくとも7時間、例えば少なくとも8時間、例えば少なくとも9時間、例えば少なくとも10時間維持される請求項99〜100の方法。
103. 酸素圧が卵母細胞または胚の相および条件にしたがって制御される先の請求項1〜102のいずれかに記載の方法。
104. 卵母細胞、精子、および胚の培養条件が温度30〜45℃、例えば32〜42℃、例えば34〜40℃、例えば36〜38℃、例えば36,5〜37,5℃、例えば約37℃を含む先の請求項1〜103のいずれかに記載の方法。
105. 卵母細胞、精子、および胚の培養条件が温度約37℃を含む先の請求項1〜104のいずれかに記載の方法。
106. 培養の酸素圧を、酸素、窒素、二酸化炭素、ヘリウム、または他の不活性ガス、または2またはそれ以上のこれらガスの混合物をin vitro培養環境に加えることにより制御する先の請求項1〜105のいずれかに記載の方法。
107. 工程a)、b)、c)、およびd)のすべて、および胚の子宮への移植が、酸素圧20%以下、例えば15%以下、例えば13%以下、例えば11%以下、例えば10%以下、例えば9%以下、例えば8%以下、例えば7%以下、例えば6%以下、例えば5%以下、例えば4%以下、例えば3%以下、例えば2%以下、例えば1%以下で行われる先の請求項1〜107のいずれかに記載の方法。
108. 工程a)、b)、c)、およびd)のすべて、および胚の子宮への移植が無菌条件下で行われる先の請求項1〜108のいずれかに記載の方法。
109. 培地が脂質または脂質前駆体、例えばステロールもしくはその機能的に等価な誘導体を含む先の請求項1〜108のいずれかに記載の方法。
110. 培地が他の因子にATA(Aurinトリカルボン酸)を含む先の請求項1〜109のいずれかに記載の方法。
111. 添加剤が、Medi-Cult SSR 4x、Medi-Cult SSR 4xa、Medi-Cult SSR 4xb、Medi-Cult SSR2、またはMedi-Cult SSR3である先の請求項1〜110のいずれかに記載の方法。
112. 卵母細胞または精子の各発育期のための培養液が当業者に知られた培地を含む先の請求項1〜111のいずれかに記載の方法。
113. 該培地が低酸素圧の条件に修飾される請求項112記載の方法(ここで該修飾は物理的または化学的であってよく、後者の場合は酸素分子担体またはカタラーゼを利用することによる)。
114. 培養条件が胚の内部細胞数の増加の形成をもたらす請求項1〜113のいずれかに記載の方法。
115. 胚の培養が3〜5ブラストマー(blastomer)および1.0、2.0、2.1、および2.2から選ばれるスコアを有する胚を生じる請求項1〜114のいずれかに記載の方法。
116. 胚の培養が4ブラストマーおよび1.0、2.0、および2.1から選ばれるスコアを有する胚を生じる請求項1〜114のいずれかに記載の方法。
117. 胚の培養が10〜50%フラグメンテーションの3〜5細胞期の胚を生じ、該胚がCESスコアリングシステムで6〜7ポイントを与えられる請求項1〜114のいずれかに記載の方法。
118. 胚の培養が10%フラグメンテーション以下の3〜5細胞期の胚を生じ、該胚がCESスコアリングシステムで7〜8ポイントを与えられる請求項1〜114のいずれかに記載の方法。
119. 胚の培養が10%フラグメンテーション以下の4細胞期の胚を生じ、該胚がCESスコアリングシステムで8ポイントを与えられる請求項1〜114のいずれかに記載の方法。
120. 胚の培養が受精後64〜67時間で7〜9細胞の胚を生じ、GESスコアリングシステムで60〜100のスコアが得られる請求項1〜114のいずれかに記載の方法。
121. 胚の培養が受精後64〜67時間で7細胞、グレードIまたは8細胞、グレードIまたは8細胞、グレードIIまたは9細胞、グレードIの胚を生じ、GESスコアリングシステムで70〜100のスコアが得られる請求項1〜114のいずれかに記載の方法。
122. 胚の培養が受精後64〜67時間で7細胞、グレードIまたは8細胞、グレードIまたは8細胞、グレードIIまたは9細胞、グレードIの胚を生じ、GESスコアリングシステムで80〜100のスコアが得られる請求項1〜114のいずれかに記載の方法。
123. 請求項1〜122のいずれかに記載の卵母細胞および精子を培養し、得られた前胚を哺乳類の雌の子宮に移植することを含む前胚の移植方法。
124. 該胚が雌の子宮の卵管に移植される請求項123に記載の方法。
125. 該胚が雌のホルモン処置後に雌の子宮に移植される請求項123〜124に記載の方法。
126. 以下の工程を含む哺乳類前胚のin vitro製造方法：
     a) 哺乳類卵母細胞および哺乳類精子から選ばれる配偶子を得、
     b) 該卵母細胞および精子を培養し、
     c) 該卵母細胞を精子で受精させて受精卵母細胞を得、
     e) 該受精卵母細胞を細胞分割させて多細胞前胚を得る、
     ここで、該培養は細胞を培養できる酸素圧で行い、該工程の少なくとも1は酸素圧の変化を含む。
127. 哺乳類卵母細胞および哺乳類精子が哺乳動物、例えば乳牛、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、トラ、ライオン、パンダ、ゴリラ、クジラ、およびヒトのそれぞれ雌および雄から得られる配偶子である請求項126記載の方法。
128. 哺乳類卵母細胞および哺乳類精子が乳牛から得られる配偶子である請求項126記載の方法。
129. 哺乳類卵母細胞および哺乳類精子がブタから得られる配偶子である請求項126記載の方法。
130. 哺乳類卵母細胞および哺乳類精子がウマから得られる配偶子である請求項126記載の方法。
131. 哺乳類卵母細胞および哺乳類精子がヒトから得られる配偶子である請求項126記載の方法。
132. 卵母細胞が卵巣から得られる先の請求項126〜131のいずれかに記載の方法。
133. 卵母細胞が一次卵胞、二次卵胞、前胞状卵胞、初期胞状卵胞、または胞状卵胞から得られる請求項132記載の方法。
134. 卵母細胞が針内への吸引により卵巣から得られる請求項132〜133記載の方法。
135. 一次、二次、または胞状卵胞を含む部分または全卵巣組織を除去し、該卵巣組織由来の含有一次、二次、または胞状卵胞を得ることにより卵母細胞を卵巣から得る請求項132〜134記載の方法。
136. 該除去された部分または全卵巣組織が凍結されている請求項135記載の方法。
137. 該針がシリンジの部分であり、該針および該シリンジ内の酸素圧が15%以下である請求項134記載の方法。
138. 該卵母細胞が卵母細胞を成熟させることができるホルモンで哺乳動物を処理した後に該哺乳動物から得られる先の請求項126〜137のいずれかに記載の方法。
139. 該ホルモンが卵胞刺激ホルモン(FSH)である請求項138記載の方法。
140. 該ホルモンが黄体ホルモン(LH)である請求項138記載の方法。
141. 該卵母細胞が冷却されている請求項126〜140に記載の方法。
142. 該卵母細胞が冷凍されている請求項126〜140に記載の方法。
143. 精子が精子細胞または精母細胞を含む未成熟精子または成熟精子である請求項126〜131記載の方法。
144. 未成熟または成熟精子が酸素圧15%以下の条件下で雄から得られる請求項143記載の方法。
145. 精子が雄から除去した精巣組織から得られる請求項143〜144に記載の方法。
146. 精巣細胞が冷凍されている請求項145記載の方法。
147. 精子が精液または精巣組織から得られる請求項143〜146記載の方法。
148. 精子が冷却されている請求項143〜147に記載の方法。
149. 精子が冷凍されている請求項143〜147に記載の方法。
150. 卵母細胞が未成熟卵母細胞である請求項126〜142に記載の方法。
151. 該未成熟卵母細胞が卵胞から得られる請求項150記載の方法。
152. 該卵胞が直径1〜25mm、例えば2〜18mm、例えば3〜13mm、例えば5〜12mm、例えば7〜11mm、例えば8〜10mmである請求項151記載の方法。
153. 未成熟卵母細胞が一次卵母細胞である請求項150記載の方法。
154. 未成熟配偶子が第一減数分裂の前期にある請求項150記載の方法。
155. 未成熟配偶子が第一減数分裂のディクチオテン(dictyotene)期にある請求項150記載の方法。
156. 未成熟配偶子が第一減数分裂の後期にある請求項150記載の方法。
157. 分裂中期IIまでの未成熟配偶子の培養が同調卵丘、細胞質、および核成熟に関連している請求項150〜156記載の方法。
158. 分裂中期IIまでの未成熟配偶子の培養が20〜30時間内に完結する請求項150〜157のいずれかに記載の方法。
159. 酸素圧の低下が、卵母細胞または精子が成熟する条件下で工程a)、b)、c)、またはe)の1で行われる請求項126〜158記載の方法。
160. 酸素圧の低下が、卵母細胞または精子が成熟する条件下で工程a)、b)、c)、またはe)の2で行われる請求項126〜158記載の方法。
161. 酸素圧の低下が、卵母細胞または精子が成熟する条件下で工程a)、b)、c)、またはe)の3で行われる請求項126〜158記載の方法。
162. 酸素圧の低下が、卵母細胞または精子が成熟する条件下で工程a)、b)、c)、またはe)のすべてで行われる請求項126〜158記載の方法。
163. 酸素圧の上昇が、卵母細胞または精子が成熟する条件下で工程a)、b)、c)、またはe)の1で行われる請求項126〜158記載の方法。
164. 酸素圧の上昇が、卵母細胞または精子が成熟する条件下で工程a)、b)、c)、またはe)の2で行われる請求項126〜158記載の方法。
165. 酸素圧の上昇が、卵母細胞または精子が成熟する条件下で工程a)、b)、c)、またはe)の3で行われる請求項126〜158記載の方法。
166. 酸素圧の上昇が、卵母細胞または精子が成熟する条件下で工程a)、b)、c)、またはe)のすべてで行われる請求項126〜158記載の方法。
167. 培養の初期酸素圧が1%〜21%のレベルで選ばれる先の請求項126〜166のいずれかに記載の方法。
168. 酸素圧の変化が、20%以下、例えば19%以下、例えば18%以下、例えば17%以下、例えば16%以下、例えば15%以下、例えば14%以下、例えば13%以下、例えば12%以下、例えば11%以下、例えば10%以下、例えば9%以下、例えば8%以下、例えば7%以下、例えば6%以下、例えば5%以下、例えば4%以下、例えば3%以下、例えば2%以下、例えば1%以下の酸素圧の変化である先の請求項126〜167のいずれかに記載の方法。
169. 酸素圧の変化が、少なくとも1単位、例えば少なくとも2単位、例えば少なくとも3単位、例えば少なくとも4単位、例えば少なくとも5単位、例えば少なくとも6単位、例えば少なくとも7単位、例えば少なくとも8単位、例えば少なくとも9単位、例えば少なくとも10単位、例えば少なくとも11単位、例えば少なくとも12単位、例えば少なくとも13単位、例えば少なくとも14単位、例えば少なくとも15単位、例えば少なくとも16単位、例えば少なくとも17単位、例えば少なくとも18単位、例えば少なくとも19単位低下する酸素圧の変化である先の請求項126〜168のいずれかに記載の方法。
170. 酸素圧の変化が、1〜19単位、例えば1〜18単位、例えば1〜17単位、例えば1〜16単位、例えば1〜15単位、例えば1〜14単位、例えば1〜13単位、例えば1〜12単位、例えば1〜11単位、例えば1〜10単位、例えば1〜9単位、例えば1〜8単位、例えば1〜7単位、例えば1〜6単位、例えば1〜5単位、例えば1〜4単位、例えば1〜3単位、例えば1〜2単位低下する酸素圧の変化である先の請求項126〜169のいずれかに記載の方法。
171. 酸素圧の変化が、2%以上、例えば3%以上、例えば4%以上、例えば5%以上、例えば6%以上、例えば7%以上、例えば8%以上、9%以上、例えば10%以上、例えば11%以上、例えば12%以上、例えば13%以上、例えば14%以上、例えば15%以上、例えば16%以上、例えば17%以上、例えば18%以上、例えば19%以上、例えば20%以上、例えば21%以上の酸素圧の変化である先の請求項126〜170のいずれかに記載の方法。
172. 酸素圧の変化が、少なくとも1単位、例えば少なくとも2単位、例えば少なくとも3単位、例えば少なくとも4単位、例えば少なくとも5単位、例えば少なくとも6単位、例えば少なくとも7単位、例えば少なくとも8単位、例えば少なくとも9単位、例えば少なくとも10単位、例えば少なくとも11単位、例えば少なくとも12単位、例えば少なくとも13単位、例えば少なくとも14単位、例えば少なくとも15単位、例えば少なくとも16単位、例えば少なくとも17単位、例えば少なくとも18単位、例えば少なくとも19単位増加する酸素圧の変化である先の請求項126〜171のいずれかに記載の方法。
173. 酸素圧の変化が、1〜3単位、例えば2〜5単位、例えば3〜7単位、例えば4〜9単位、例えば5〜11単位、例えば6〜13単位、例えば8〜15単位、例えば10〜18単位、例えば12〜20単位の増加を構成する先の請求項126〜172のいずれかに記載の方法。
174. 変化後の酸素圧が、初期酸素圧に比べて高いまたは低いレベルに制御される先の請求項126〜173のいずれかに記載の方法。
175. 変化後の酸素圧を1%〜21%のレベルに制御することができる請求項174記載の方法。
176. 酸素圧の変化が、少なくとも1分間、例えば少なくとも2分間、例えば少なくとも3分間、例えば少なくとも4分間、例えば少なくとも5分間、例えば少なくとも6分間、例えば少なくとも7分間、例えば少なくとも8分間、例えば少なくとも9分間、例えば少なくとも10分間、例えば少なくとも11分間、例えば少なくとも12分間、例えば少なくとも13分間、例えば少なくとも14分間、例えば少なくとも15分間、例えば少なくとも16分間、例えば少なくとも20分間、例えば少なくとも30分間、例えば少なくとも45分間、例えば少なくとも1時間、例えば少なくとも1.5時間、例えば少なくとも2時間、例えば少なくとも2.5時間、例えば少なくとも3時間、例えば少なくとも4時間、例えば少なくとも5時間、例えば少なくとも6時間、例えば少なくとも7時間、例えば少なくとも8時間、例えば少なくとも9時間、例えば少なくとも10時間行われる先の請求項126〜175のいずれかに記載の方法。
177. 工程b)が卵母細胞と精子の同時培養を含む先の請求項126〜176のいずれかに記載の方法。
178. 卵母細胞および精子が、少なくとも1分間、例えば少なくとも2分間、例えば少なくとも5分間、例えば少なくとも10分間、例えば少なくとも30分間、例えば少なくとも1時間、例えば少なくとも2時間、例えば少なくとも3時間、例えば少なくとも4時間、例えば少なくとも5時間、例えば少なくとも10時間、例えば少なくとも15時間、例えば少なくとも20時間、例えば少なくとも25時間、例えば少なくとも30時間、例えば少なくとも35時間、例えば少なくとも40時間、例えば少なくとも45時間、例えば少なくとも50時間同時培養される請求項177に記載の方法。
179. 卵母細胞および精子がフィーダー細胞と同時培養される請求項177〜178に記載の方法。
180. 卵母細胞と精子の同時培養が卵母細胞の精子による受精をもたらす請求項177〜179に記載の方法。
181. 卵母細胞が細胞質内精子注射(ICSI)により精子で受精される請求項126〜176に記載の方法。
182. 受精卵母細胞を雌子宮に移植する準備が整う胚期まで培養する先の請求項126〜181のいずれかに記載の方法。
183. 該胚を移植するための期(段階)が卵母細胞の受精後最小1/2日培養、例えば少なくとも1日間、例えば少なくとも2日間、例えば少なくとも3日間、例えば少なくとも4日間、例えば少なくとも5日間、例えば少なくとも6日間、例えば少なくとも7日間、例えば少なくとも8日間、例えば少なくとも9日間で得られる請求項182記載の方法。
184. 該胚期が2細胞期である請求項182〜183記載の方法。
185. 該胚期が4細胞期である請求項182〜183記載の方法。
186. 該胚期が6細胞期である請求項182〜183記載の方法。
187. 該胚期が8細胞期である請求項182〜183記載の方法。
188. 該胚期が桑実胚期である請求項182〜183記載の方法。
189. 該胚期が胚盤胞期である請求項182〜183記載の方法。
190. 該胚期が透明帯が消失している胚盤胞期である請求項182〜183記載の方法。
191. 該胚の透明帯が子宮内に着床する前の胚のハッチ(hatch)を助けるように開かれる請求項184〜190に記載の方法。
192. 該透明帯がレーザー、機械的力、または酸タイロードを用いてハッチングを助けることにより開かれる請求項191記載の方法。
193. 細胞デブリスが該胚から除去される請求項182〜192記載の方法。
194. 酸素圧が少なくとも0,5%および最大21%である先の請求項126〜193のいずれかに記載の方法。
195. 酸素圧が卵母細胞または胚の期および条件にしたがって制御される先の請求項126〜194のいずれかに記載の方法。
196. 卵母細胞、精子、および胚の培養条件が温度30〜45℃、例えば32〜42℃、例えば34〜40℃、例えば36〜38℃、例えば36,5〜37,5℃、例えば約37℃を含む先の請求項126〜195のいずれかに記載の方法。
197. 卵母細胞、精子、および胚の培養条件が温度約37℃を含む先の請求項126〜196のいずれかに記載の方法。
198. 培養の酸素圧を、酸素、窒素、二酸化炭素、ヘリウム、または他の不活性ガス、または2またはそれ以上のこれらガスの混合物をin vitro培養環境に加えることにより制御する先の請求項126〜197のいずれかに記載の方法。
199. 工程a)、b)、c)、およびe)のすべて、および胚の子宮への移植が無菌条件下で行われる先の請求項126〜198のいずれかに記載の方法。
200. 培地が脂質または脂質前駆体、例えばステロールもしくはその機能的に等価な誘導体を含む先の請求項126〜199のいずれかに記載の方法。
201. 培地が他の因子にATA(Aurinトリカルボン酸)を含む先の請求項126〜200のいずれかに記載の方法。
202. 添加剤が、Medi-Cult SSR 4x、Medi-Cult SSR 4xa、Medi-Cult SSR 4xb、Medi-Cult SSR2、またはMedi-Cult SSR3である先の請求項126〜201のいずれかに記載の方法。
203. 卵母細胞または精子の各発育期のための培養液が当業者に知られた培地を含む先の請求項126〜202のいずれかに記載の方法。
204. 該培地が低酸素圧の条件に修飾される請求項203記載の方法(ここで、該修飾は物理的または化学的であってよく、後者の場合は酸素分子担体またはカタラーゼを利用することによる)。
205. 培養条件が胚の内部細胞数の増加の形成をもたらす請求項126〜204のいずれかに記載の方法。
206. 胚の培養が3〜5ブラストマー(blastomer)および1.0、2.0、2.1、および2.2から選ばれるスコアを有する胚を生じる請求項126〜205のいずれかに記載の方法。
207. 胚の培養が4ブラストマーおよび1.0、2.0、および2.1から選ばれるスコアを有する胚を生じる請求項126〜205のいずれかに記載の方法。
208. 胚の培養が10〜50%分裂の3〜5細胞期の胚を生じ、該胚がCESスコアリングシステムで6〜7ポイントを与えられる請求項126〜205のいずれかに記載の方法。
209. 胚の培養が10%分裂以下の3〜5細胞期の胚を生じ、該胚がCESスコアリングシステムで7〜8ポイントを与えられる請求項126〜205のいずれかに記載の方法。
210. 胚の培養が10%分裂以下の4細胞期の胚を生じ、該胚がCESスコアリングシステムで8ポイントを与えられる請求項126〜205のいずれかに記載の方法。
211. 胚の培養が受精後64〜67時間で7〜9細胞の胚を生じ、GESスコアリングシステムで60〜100のスコアが得られる請求項126〜205のいずれかに記載の方法。
212. 胚の培養が受精後64〜67時間で7細胞、グレードIまたは8細胞、グレードIまたは8細胞、グレードIIまたは9細胞、グレードIの胚を生じ、GESスコアリングシステムで70〜100のスコアが得られる請求項126〜205のいずれかに記載の方法。
213. 胚の培養が受精後64〜67時間で7細胞、グレードIまたは8細胞、グレードIまたは8細胞、グレードIIまたは9細胞、グレードIの胚を生じ、GESスコアリングシステムで80〜100のスコアが得られる請求項126〜205のいずれかに記載の方法。
214. 請求項126〜213のいずれかに記載の卵母細胞および精子を培養し、得られた前胚を哺乳類の雌の子宮に移植することを含む前胚の移植方法。
215. 該胚が雌の子宮の卵管に移植される請求項215に記載の方法。
216. 該胚が雌のホルモン処置後に雌の子宮に移植される請求項215〜216に記載の方法。
217. 幹細胞の製造方法であって、
     a) 請求項42〜213のいずれかに記載の多細胞前胚を得、
     b) a)の多細胞前胚を単離し、
     c) b)の前胚の内部細胞塊から細胞を単離し、
     d) マトリックスゲル中で内部細胞塊由来の該単離細胞を培養し、
     e) 幹細胞を得ることを含む方法。
218. 工程b)、c)、d)、およびe)の少なくとも1が酸素圧15%以下で行われる請求項217記載の方法。
219. 工程b)、c)、d)、およびe)の少なくとも2が酸素圧15%以下で行われる請求項217記載の方法。
220. 工程b)、c)、d)、およびe)の少なくとも3が酸素圧15%以下で行われる請求項217記載の方法。
221. 工程b)、c)、d)、およびe)のすべてが酸素圧15%以下で行われる請求項217記載の方法。
222. 請求項217〜221のいずれかの方法から得られる幹細胞。
223. 該細胞の染色体または細胞表面の抗原性に突然変異や他の遺伝的変化が生じないという意味で安定である請求項222記載の幹細胞。
224. 請求項217〜221の幹細胞から得られる幹細胞株。
225. 幹細胞株を製造するための請求項217〜221の方法から得られる幹細胞の使用。
226. 請求項217〜221のいずれかに記載の幹細胞、幹細胞および該幹細胞が得られる細胞培養の培養条件を記載する証明書を含む幹細胞パッケージ。

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