JP2003517276A - 体外受精のための系及び連続的培養液 - Google Patents

体外受精のための系及び連続的培養液

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Abstract

(57)【要約】 ＩＶＦにおいて用いられる様々な処置全体を通じてヒト生殖細胞を単一培養液に液浸する代わりに、種々のＩＶＦ処置が実施される時に生殖細胞を別個の培養液のシーケンスを通して移動させることができるプロセスを提供する。１つの実施態様では、培養液は、女性生殖路内で認められるものと同様の、ＩＶＦプロセスの種々の段階においてヒト生殖細胞の成長と発生を導く物理的環境を提供するように特異的に製剤される。これに関して、特異的に製剤された培養液は、次の処置の１つ又はそれ以上において生殖細胞を支持するために適用できる：卵母細胞の回収とハンドリング；卵成熟；通常の受精；卵母細胞、接合子及び胚の検査と生検；８細胞期までの胚発生；胚盤胞までの胚発生；受精卵移植；及び凍結保存。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、一般にヒト体外受精（ＩＶＦ）、特に卵母細胞の回収、ハンドリン
グ及び成熟、精子の調製、受精、胚の発生と受精卵の移植、及び凍結保存におい
て使用される連続的培養液系及びプロセスに関する。本発明は、配偶子、接合子
及び発生中の胚をそれらの生理的要求に適した物理的環境と共に提供し、それに
よって体外でのそれらの正常な成長と発育を支持し、妊娠が成功する可能性を高
める。
【０００２】 発明の背景 体外受精は、主として、卵母細胞の発生、受精及び初期胚発生に必要な、女性
生殖系内で正常に生じる条件とプロセスを複製することを追求している。臨床及
び研究室において、ＩＶＦは、母体の卵巣からの卵母細胞の採集、精子の調製、
受精、そしてひとたび受精卵が確認されれば、初期胚発生の期間、さらにその後
母体の子宮への受精卵の移植といったいくつかの分離した手順を含む。これらの
ステップはそれぞれ長い期間にわたることがあり、その間、個々の該細胞は継続
的に栄養分を必要とし、また臨床操作や環境条件の変化の結果として大きなスト
レスを受ける。
【０００３】 ＩＶＦの際に、培養液は通常、配偶子、接合子及び発生中の胚を取り巻く女性
生殖路によって分泌される液体の代替物として使用される。ＩＶＦを実施する研
究室のほとんどが、様々な手順全体を通じて単一の培養液を使用している。一部
の研究室では、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０のようなＩＶＦ処置のための組織培養培地
を使用する傾向があったが、この培地は配偶子あるいは胚細胞増殖ではなく体細
胞増殖を支持するように処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）されている。組織培養
培地は一般に、一連のアミノ酸、ビタミン及び他の成分を含む複雑な系である。
それらの培地は、移植後の胚の発生と生活能力を大きく損なう成分を含みうる。
さらに、組織培養培地は一般に配偶子及び胚が必要とする成分をある程度まで含
むが、健常な配偶子及び胚の発生を支持するための適切なレベルの成分を提供す
るようには処方されていない。
【０００４】 また一部の研究室では、グルコース、ピルビン酸塩及び乳酸塩のような炭水化
物エネルギー源を補足した平衡塩類溶液から成る簡単な培養液が使用されてきた
。その例としてはＥａｒｌｅ’ｓ Ｔ−６、及びヒト卵管液（ＨＴＦ）が含まれ
る。これらの培養液は一般に、可欠アミノ酸のような女性生殖路において認めら
れる、鍵となる一部の成分を欠いており、またそれらの成分は、発生の様々な段
階での配偶子及び発生中の胚の個々の変化する要求を満たす濃度では処方されて
いない。
【０００５】 ＩＶＦのために一般的に使用される２種類の培養液は、概して８細胞期までの
胚発生を支持することができるだけである。そのような培養液は通常、上皮を伴
う完全な生育可能胚盤胞期の胚と、応答能を備えた内部細胞塊を支持し、産生す
ることができない。従って、母体の子宮に受精卵をもどす受精卵移植は、通常４
細胞期頃（２日目）又は８細胞期頃（３日目）に行われる。これは、もし体内で
受精が起きていなければ、４細胞又は８細胞胚は典型的には母体の子宮に到達で
きない時点である。この時点での受精卵移植は、卵割期の胚を、胚盤胞期胚を対
象とした環境に置くことになる。卵割期の胚はその後さらに、胚が子宮内層に着
床することができる栄養外胚葉細胞を持つ胚盤胞期に達するまで、非対応環境で
の発生を経なければならない。
【０００６】 最近の研究とヒト臨床試験で、２つの新しい培養液、Ｇ１とＧ２が開発される
に至った。これらは、卵割期の胚及び発生の８細胞期から胚盤胞期までの胚の生
理的要求に培養液を適合させるという大きな進歩を表わしている。これらの培養
液は次の文献中に記述されている：Ｂａｒｎｅｓ，Ｃｒｏｍｂｉｅ，Ｇａｒｄｎ
ｅｒら、ヒト一次卵母細胞の体外成熟後の胚盤胞の発生と誕生、細胞質内精子注
入と孵化補助（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｂｉ
ｒｔｈ Ａｆｔｅｒ Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍ
ａｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｏｏｃｙｔｅｓ，Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ
Ｓｐｅｒｍ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｈａｔｃｈｉｎ
ｇ），Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、第１０巻、Ｎｏ．１２、ｐ．３
２４３−４７（１９９５年１２月）；ＧａｒｄｎｅｒとＬａｎｅ、生育可能胚盤
胞の培養と選択：ヒトＩＶＦにとっての実施可能な提案か？（Ｃｕｌｔｕｒｅ
ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉａｂｌｅ Ｂｌａｓｏｃｙｓｔｓ：Ａ
Ｆｅａｓｉｂｌｅ Ｐｒｏｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ＩＶＦ？
）、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｐｄａｔｅ、第３巻、Ｎｏ．４
、ｐ．３６７−８２（１９９７）；Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｖｅｌｌａ，Ｌａｎｅら、
ヒト胚盤胞の培養と移植は着床率を高め、多数の受精卵移植の必要性を低下させ
る（Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂｌａｓ
ｔｏｃｙｓｔｓ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｒａｔｅｓ
ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｈｅ Ｎｅｅｄ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｅ
ｍｂｒｙｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒｓ）、Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉ
ｌｉｔｙ、第６９巻、Ｎｏ．１、ｐ．８４−８８（１９８８年１月）。これらの
培養液、特にＧ２培養液の使用は、体外での生育可能な胚盤胞期胚の成長と発育
を支持する。従って、これらの培養液の開発は、胚が子宮環境において生存する
のに最も適しており、着床が起こるために必要な発達した構造と能力を有する時
期である胚盤胞期に子宮への受精卵移植を行うための新しいアプローチを切り開
くものである。Ｇ１及びＧ２培養液を用いた研究、及び胚盤胞期の受精卵移植は
、これらの培養液がより高い妊娠率に寄与し、また多数の受精卵移植の必要性と
多生児の危険度を低下させることを示唆している。しかしながら、これらの培養
液はいずれも、配偶子、卵成熟、あるいは受精を支持するために至適化されては
いない。
【０００７】 発明の要旨 ＩＶＦプロセスは、ＩＶＦプロセスの様々な段階に対応して配偶子、接合子及
び発生中の胚を支持するための特異的培養液及び培養液のシーケンスを提供する
ことによって改善されうることが認識されてきた。ある点では、そのような培養
液とシーケンスは体内発生をよりよく反映する。女性生殖系においては、卵母細
胞は卵巣内で発生し、排卵の際に卵巣から放出されて、卵管を通って子宮へと進
んでいく。この移動の間、卵母細胞は動的な物理的環境を経験する。卵管の液体
は、卵母細胞とその周囲の卵丘細胞に栄養を供給し、また同時に卵母細胞及びそ
の卵丘細胞と相互作用して発生を刺激すると思われる多くの成分を含む。同様に
、女性生殖路の液体は卵管を通って移動する精子にも栄養を与え、受精に必要な
精子のある種の変化も刺激する。ひとたび受精が起これば、生じた接合子は卵管
を下っておよそ３日後に子宮に入り、内的トランスフォーメーションを受けて環
境の変化を経験する。
【０００８】 接合子が移動するとき、重要な発生上の変化と共に、細胞分裂あるいは卵割が
起こる。初期胚発生の細胞は、着床前の後期胚発生の細胞とは異なる能力と栄養
上の要求を持つ。接合子及び卵割期の胚（８細胞期まで）は、低いレベルの生合
成、低い呼吸速度、グルコースを代謝するごく限られた能力、ならびにピルビン
酸塩を利用する能力を特徴とする。胚が発生し、ゲノムの活性化が起こると共に
、胚はグルコースを利用する高い能力を獲得する。受精卵が子宮に入って、そこ
に存在する時期である発生の胚盤胞期には、胚の代謝系が発達し、胚はグルコー
スを使用する実質的により大きな能力を得て、より多くのグルコースを要求し、
ピルビン酸塩の需要は低下する。女性生殖路において発生中の胚を取り巻く液体
の組成は、これらの変化する要求に合わせて調整されると思われる：卵母細胞と
発生中の胚が存在する時期の卵管においては、比較的低いレベルのグルコースが
認められ、一方ピルビン酸塩の濃度は高い；胚が子宮に入る時期には、グルコー
スはその最高レベルに達し、ピルビン酸濃度は比較的低い。卵母細胞のような卵
割期の胚は、そのような要素の濃度が低い環境に取り囲まれたとき、その細胞膜
を通してアミノ酸を喪失しやすい。そのような内部アミノ酸の喪失は荒廃化作用
を持ちうる。やはり、モル浸透圧濃度（ｏｓｍｏｌｙｔｅ）感受性卵母細胞及び
卵割期胚のこれらの要求に応答するかのように、女性生殖路は、典型的には卵母
細胞及び卵割期胚で認められるものと非常に類似した高レベルの特異的アミノ酸
を有している。
【０００９】 上記に鑑みて、本発明の重要な目的は、体外でのヒト生殖細胞の培養をさらに
改善し、強化することである。本発明は、ＩＶＦプロセスの様々な段階での配偶
子、接合子及び胚の健康と生活能力を増進し、それによってＩＶＦプロセスの全
体的効率を改善し、妊娠率を高めることを意図する。
【００１０】 一般に、本発明は、発生の様々な段階にある配偶子、接合子及び／又は発生中
の胚の生理的要求を満たし、体外での受精と胚発生を実現するのに必要なプロセ
スを支持するために、個々に処方された別個の培養液の適用に関する。本発明は
また一般に、使用する別個の培養液が統合された処方を持ち、ＩＶＦプロセスに
おいて生殖細胞を１つの培養液からもう１つの培養液に移すときに生殖細胞への
外傷を最小限に抑えることを意図した、連続培養液系を想定する。
【００１１】 本発明の１つの態様では、母体から卵母細胞を回収する臨床手技において使用
するための卵母細胞の回収とハンドリングの培養液が提供される。かかる培養液
は、母体の卵巣から卵母細胞を取り出す工程において卵母細胞を洗い出し、洗浄
し、保持するため、及び卵母細胞を受精前の一定期間貯蔵するために使用できる
。本発明が想定する培養液の選択的用途は、受精が起きたかどうかを調べるため
の卵母細胞の検査、あるいはその発生の進行を調べるための胚の検査のような、
卵母細胞、接合子、あるいは胚の取り扱い又は操作を必要とする処置に関してで
ある。本発明は、水、イオン性成分及び緩衝液から成る卵母細胞の回収及びハン
ドリング培養液の使用を含む。好ましくは、培養液中で使用する緩衝液は、４−
モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）又はＮ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）である。さらに、培養液に
は炭水化物としてグルコース、乳酸塩及びピルビン酸塩を補足してもよい。培養
液に可欠アミノ酸を補足することもできる。生検手技においてはカルシウム及び
マグネシウムを含まない選択的処方の培養液が使用できる。もう１つの選択的処
方の培養液は、卵母細胞採集工程の間に培養液に入り込むことがある細菌を死滅
させるために、ペニシリン及び／又はストレプトマイシンのような抗生物質を含
む。
【００１２】 本発明のもう１つの態様は、例えば卵母細胞が成熟する前にそれを母体から取
り出す場合に、卵母細胞の成熟培養液を提供し、使用することを含む。この培養
液の適用が望ましいと考えられる状況の例として、母体がホルモンに不耐性であ
るために、母体から採取した卵母細胞を体外でそのようなホルモンによって処理
する必要がある場合が挙げられる。本発明は、受精に先立つ発生を促進するため
に、卵母細胞の採集後の一定期間卵母細胞を成熟培養液に保持することを考慮し
ている。選択的には本発明に従った成熟培養液を採集のために使用できるが、最
もコスト効果的なアプローチは通常、最初の洗い出し、洗浄、採集及び貯蔵のた
めに回収とハンドリングの培養液を使用し、その後受精前の長期間には成熟培養
液に移すことである。本発明は、水、イオン性成分及び緩衝液から成る成熟培養
液の使用を想定している。好ましくは、成熟培養液に炭水化物のグルコース、乳
酸塩及びピルビン酸塩を補足する。本発明に従った特定処方は、次のものの１つ
又はそれ以上による培養液の連続的補足を含みうる：可欠アミノ酸、必須アミノ
酸、システアミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びヒアルロン酸塩、インス
リントランスフェリンセレン（ＩＴＳ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）及び
表皮成長因子（ＥＧＦ）のような１つ又はそれ以上の成長因子、ならびに卵胞刺
激ホルモン（ＦＳＨ）及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のようなホルモ
ン。
【００１３】 本発明のもう１つの態様は、精子の調製と受精の培養液を提供し、使用するこ
とを含む。この培養液は、精子を洗浄し、調製し、貯蔵するため、受精前の期間
卵母細胞を貯蔵するため、及び精子と卵母細胞を一緒にして、受精を生じさせる
培養液として用いるために適用できる。本発明は、水、イオン性成分及び緩衝液
を含む、精子調製と受精の培養液の使用を想定している。好ましくは、該培養液
は、精子の機能と受精を増進するために、卵母細胞の回収及びハンドリング培養
液と比較して高い濃度のナトリウムを含む。さらに、培養液には、卵母細胞回収
及びハンドリング培養液と比較して高いリン酸塩濃度を補足することができる。
さらに一層好ましくは、培養液に炭水化物としてグルコース、乳酸塩及びピルビ
ン酸塩を補足する。特定処方は、重炭酸塩、精子頭部の脱圧縮（ｄｅｃｏｎｄｅ
ｎｓａｔｉｏｎ）を促進するためのグルタチオン、可欠アミノ酸、ＨＳＡ及びヒ
アルロン酸塩、ならびにペニシリンやストレプトマイシンのような抗生物質の１
つ又はそれ以上による培養液の補足を含みうる。
【００１４】 本発明のさらなる態様は、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）のための培養液及び
関連する方法に関する。ＩＣＳＩ処置は、精子頭部の貫入を妨げる卵母細胞上の
肥厚した透明帯のような、正常な受精にとっての障害が存在する場合に必要とな
りうる。ＩＣＳＩは、卵丘細胞の除去と、通常はガラスピペットを通しての卵母
細胞内への精子の注入を含む。本発明は、精子をＩＣＳＩ培養液に取り、精子を
含む培養液をピペット中に吸い取ることによって精子を捕獲し、培養液と精子の
入ったピペットを卵母細胞に挿入して、卵母細胞への挿入後、精子を含む培養液
をピペットから卵母細胞に移入することを想定する。本発明において使用するＩ
ＣＳＩ培養液は、成分として水、イオン性成分及び緩衝液を含む。好ましくは、
本発明においては培養液はリン酸塩を含まない。より好ましくは、培養液におい
て使用する緩衝液はＭＯＰＳ又はＨＥＰＥＳである。それに加えて、培養液に炭
水化物の乳酸塩及びピルビン酸塩を補足してもよく、またさらに、卵母細胞中に
最も豊富な可欠アミノ酸：グルタミン、グリシン、プロリン、セリン及びタウリ
ンを補足することもできる。１つの処方では、使用するＩＣＳＩ培養液は、ＩＣ
ＳＩ処置のためにピペットで精子を捕獲できるように、精子を減速又は不動化す
るためのヒアルロン酸塩又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が補足される。さ
らに、本発明において使用する露出培養液（ｄｅｎｕｄｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）
と称されるＩＣＳＩ培養液の代替的処方はヒアルロニダーゼを含有し、これはＩ
ＣＳＩ処置の前に卵母細胞を露出させるために使用する培養液の一部に含まれる
。
【００１５】 本発明のもう１つの態様は、受精後の初期細胞卵割と胚発生を支持するための
培養液を提供し、使用することを含み、ここではかかる培養液をＧ１．２と称す
る。本発明は、授精された卵母細胞と接合子を培養液中で洗浄し、およそ８細胞
期までの細胞卵割と発生を支持するために約４８時間にわたって接合子を培養液
中に置くことを考慮している。本発明は、成分として水、イオン性成分及び緩衝
液を含む培養液の使用を含む。好ましくは、培養液に炭水化物のグルコース、乳
酸塩及びピルビン酸塩を補足する。培養液はまた、可欠アミノ酸を補足すること
もできる。本発明に従った特定処方は次の補足物の１つ又はそれ以上を含みうる
：ＥＤＴＡ、ＨＳＡ及びヒアルロン酸塩。培養液において使用するグルタミンの
形態は好ましくはアラニル−グルタミンであり、これは特に安定であって、発生
中の胚にとって有毒な老廃物であるアンモニウムに分解しにくい。
【００１６】 本発明のさらなる態様は、ここではＧ２．２と称する胚発生のための第二培養
液を提供し、使用することを含む。本発明は、好ましくは８細胞期に又は８細胞
期後に約４８時間にわたって胚をＧ２．２培養液中に置き、発生の胚盤胞期を通
して受精卵移植の時点まで継続することを想定している。この培養液は、初期胚
発生のためのＧ１．２の使用と並んで、８細胞期から着床が起こる時点までの胚
の支持に特に適しており、それを好ましい用途とする。本発明は、水、イオン性
成分及び緩衝液を含むＧ２．２培養液を包含する。好ましくは、培養液に炭水化
物のグルコース、乳酸塩及びピルビン酸塩を補足する。より好ましくは、Ｇ１．
２と比較して、Ｇ２．２培養液には低いレベルの乳酸塩とピルビン酸塩、そして
高いレベルのグルコースを補足する。さらに、培養液にはタウリンを除く可欠ア
ミノ酸を補足してもよい。本発明に従った特定処方は、培養液に次のものの１つ
又はそれ以上を補足することを含む：胚盤胞の内部細胞塊の発生を刺激する必須
アミノ酸；胚盤胞の機能をさらに促進するビタミン；ＨＳＡ；及びヒアルロン酸
塩。すべての処方において、Ｇ２．２培養液の重要な態様はＥＤＴＡが存在しな
いことである。
【００１７】 本発明のもう１つの態様は、受精卵移植培養液を提供し、使用することである
。本発明は、この培養液を受精卵を母体内にもどすときの担体として使用するこ
とを想定している。本発明は、Ｇ２．２培養液に関して使用するのと同じ処方の
受精卵移植培養液を包含しうる。しかし受精卵移植のためにより好ましくは、Ｇ
２．２の処方には、母体の子宮における受精卵の着床を支持する、より高い濃度
のヒアルロン酸塩を補足する。
【００１８】 本発明のさらなる態様は、胚及び／又は卵母細胞の凍結保存のための培養液を
提供し、使用することである。本発明は、１細胞期から８細胞期まで、若しくは
８細胞期から胚盤胞期まで胚を培養液中に置き、その後培養液中で凍結して保存
する。本発明はまた、該培養液を卵母細胞の凍結保存のために使用することも考
慮している。凍結保存培養液はイオン性成分及び緩衝液を含む。好ましくは、Ｍ
ＯＰＳ又はＨＥＰＥＳ緩衝液を含む。より好ましくは、凍結保存培養液は炭水化
物の乳酸塩、ピルビン酸塩及びグルコースを含む。さらに一層好ましくは、ＨＳ
Ａを含む。最も好ましくは、該培養液は、グリセロール、エチレングリコール、
ＤＭＳＯ及び／又はスクロースのようないくつかの添加物を含有する。
【００１９】 本発明のさらなる態様に従えば、卵母細胞の採集と成熟、精子の調製、受精、
胚発生及び／又は受精卵移植のように、ＩＶＦ処置の２つの異なる期には異なる
培養液を使用する。１つの関連するプロセスは、第一培養液から配偶子を取り、
配偶子を第一培養液とは異なる第二培養液に導入することを含み、この場合第二
培養液中で受精が起こる。第一培養液から配偶子を得るステップは、上述したよ
うな卵母細胞採集培養液又は卵成熟培養液から卵母細胞を抽出することを含みう
る。さらに又は代替的に、かかる入手ステップは、上述したような精子調製及び
受精培養液から精子を抽出することを含みうるが、かかる培養液は卵母細胞培養
液と異なっていてもよい。配偶子を第二培養液に導入するステップは、精子及び
／又は卵母細胞を受精培養液に導入する、若しくは精子を第二培養液中に含まれ
る卵母細胞に注入することを含みうる。種々の培養液は、生殖細胞への外傷を最
小限に抑えるための統合された処方を有しうる。
【００２０】 本発明に従ったもう１つの関連プロセスは、受精が生じた第一培養液から接合
子又は受精卵を取り、第一培養液とは異なる、第一成長期のための第二培養液に
それを導入することを含む。第一培養液は上述したような受精培養液であり、第
二培養液は上述したようなＧ１．２培養液でありうる。第二培養液は、初期細胞
卵割と胚発生を支持するために使用できる。かかる方法はさらに、生じた胚を第
二培養液から第二成長期のための第三培養液に移すことを含みうる。第三培養液
は上述したようなＧ２．２培養液でありうる。
【００２１】 本発明に従ったさらなる関連プロセスは、第一培養液から受精卵を取り、受精
卵を着床のために母体に移植するための、第一培養液とは異なる第二培養液に受
精卵を導入することを含む。第一培養液は上述したようなＧ２．２培養液であり
、第二培養液は上述したような受精卵移植培養液でありうる。
【００２２】 図面の簡単な説明 本発明とそのさらなる利点をよりよく理解するために、次のような図面と組み
合わせて下記の詳細な説明を参照されたい： 図１は、本発明に従ったＩＶＦプロセスを例示するフローチャートである。
【００２３】 発明の詳細な説明 下記の説明は、ＩＶＦに関する使用に特に適した、本発明に従った種々の培養
液の組成物を開示する。これらの培養液はそれぞれ、生殖過程のキーポイントに
おいて配偶子、接合子及び発生中の胚の生理的要求を満たすように特異的に製剤
されている。また連続的な培養液系も開示する。別個の培養液の各々を独立して
使用することができるが、かかる培養液は系として一緒に製剤することもでき、
卵母細胞及び生じる接合子と胚を１つの培養液からもう１つの培養液に移すとき
にそれらへの外傷を最小限に抑えるという目的と共に、イオン性成分及び可欠ア
ミノ酸成分のコアグループを共有する。下記の説明はまた、ＩＶＦを実施する様
々な臨床及び研究室での処置において該培養液及び連続的培養液系を使用する方
法ならびに該培養液を作製する方法も開示する。
【００２４】 Ａ．連続的培養液の組成物 １．卵母細胞の回収及びハンドリング培養液 好ましい卵母細胞の回収及びハンドリング培養液は、卵母細胞にストレスを与
えない浸透圧環境を維持するためのナトリウム、カリウム、リン、マグネシウム
、重炭酸及びカルシウムイオン性成分、及び培養液のｐＨを７．３から７．４の
生理的範囲内に維持するための緩衝系、好ましくはＭＯＰＳ又はＨＥＰＥＳから
成る水溶液である。イオン性成分は、表１のＡ欄に示す好ましい量で含有され、
表１のＢ欄に示す範囲内の量で含まれうる。
【００２５】
【表１】 表１及びこの章で提示する他の表はまた、実際にそれぞれの培養液を作製する
ために使用される成分の好ましい形態も示している。ＭＯＰＳ緩衝液は以前には
ＩＶＦ処置において使用されていなかったが、生殖細胞に毒性作用を示さないこ
とが知られており、培養液上のＣＯ２大気の維持を必要としないため、好ましい
。ＨＥＰＥＳも使用しうるが、一部の研究は生殖細胞への毒性の可能性を指摘し
ている。表１はＭＯＰＳ又はＨＥＰＥＳ緩衝液の好ましい量及び範囲を示すが、
他の緩衝系も使用しうるであろう。例えば、重炭酸系はヒト生殖細胞と適合性で
あるので、使用しうる。そのような系は、培養液を取り巻く大気中にＣＯ２の高
いレベルの維持を必要とするため、通常、卵母細胞の採集に関しては実用的でな
いであろう。そのようなＣＯ２レベルの維持は通常、３％−１０％ＣＯ２大気を
維持するガスインキュベーター系を使用して実現される。卵母細胞の採集は臨床
的処置であり、典型的には高いＣＯ２大気を維持することは不可能である。ｈｕ
ｍｉｄｉｃｒｉｂが使用可能であるような一部の臨床環境においては、高いＣＯ ２ 大気中で卵母細胞の採集を実施することが可能であると考えられ、従って重炭
酸緩衝液が使用できる。本発明に従えば、使用するいかなる緩衝系も、好ましく
は培養液が大気に接触する間その緩衝能力を維持し、同じく好ましくはヒト生殖
細胞と適合性であって、ヒト生殖細胞に対して毒性がない。
【００２６】 卵母細胞の回収及びハンドリング培養液はまた、対応する排卵時点で女性生殖
路において認められるのと同様のレベルで、炭水化物のグルコース、乳酸塩及び
ピルビン酸塩を含む。これらが培養液において存在する好ましい量と範囲は表１
に示されている。さらに、好ましい培養液は、イーグル可欠アミノ酸（すなわち
培養中での体細胞の発生に必要ではないもの）、アラニン、アスパラギン酸塩、
アスパラギン、グルタミン酸塩、グリシン、プロリン、セリン及びタウリン、加
えてアラニル−グルタミンの形態のグルタミンを、女性生殖系及び卵母細胞にお
いて認められるのと同様のレベルで含有する。好ましい量と範囲は表１に示され
ている。培養液中に可欠アミノ酸とアラニル−グルタミンを含むことは浸透圧シ
ョックを防ぐ上で重要である；これらの成分を欠く培養液は、卵母細胞にそのア
ミノ酸の内部プールを枯渇させ、重要な細胞内損傷をもたらしうる。生検手順に
おいて使用しうる培養液の選択的処方は、カルシウムとマグネシウムを省く。培
養液のもう１つの選択的処方は、卵母細胞の周囲に存在しうる、又は卵母細胞採
集の臨床処置を通して侵入しうる細菌を死滅させるために、ペニシリンやストレ
プトマイシンのような１つ又はそれ以上の抗生物質を含みうる。
【００２７】 ２．卵成熟培養液 卵成熟培養液は未熟卵母細胞に関する使用に適する。卵成熟は、典型的にはＩ
ＶＦにおいて通常用いられるホルモン治療を耐容することができない母体に関し
て使用される。卵成熟は一般に、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及びヒト絨毛性ゴ
ナドトロピン（ｈＣＧ）を母体に注入する代わりに、試験管内の未熟卵母細胞を
これらのホルモンで処理することを含む。好ましい培養液は、卵母細胞の回収及
びハンドリング培養液において使用されるのと同様のイオン性成分を同様の濃度
で含む水溶液であるが、マグネシウム対カルシウム濃度を２：１に維持するよう
に、マグネシウムレベルを高くし、カルシウムレベルを低下させる。好ましい培
養液においては、生理的ｐＨを維持するために緩衝液が含まれる。卵成熟は通常
、高いＣＯ２大気を維持することができるインキュベーター又はイソレット（ｉ
ｓｏｌｅｔｔｅ）内で起こるので、重炭酸緩衝系が好ましい。卵母細胞及び培養
液の他の成分と適合性であることを条件として、他の緩衝液も使用することがで
きる。表２は、これらの成分の各々の最も好ましい量ならびにこれらの成分の好
ましい範囲を示す。
【００２８】
【表２】 好ましい成熟培養液には炭水化物のグルコース、乳酸塩及びピルビン酸塩も含
まれる。発生中の卵母細胞を取り巻く卵丘細胞の存在とその重要性ゆえに、グル
コース、乳酸塩及びピルビン酸塩のレベルは卵丘細胞の要求に適合させる。卵母
細胞に栄養分を供給し、卵母細胞に浸透圧ストレスを与えるのを避けるため、好
ましくは可欠アミノ酸を培養液に含める。必須アミノ酸及びビタミンも、卵丘細
胞に栄養分を供給するために含めることができる。培養液はまた、高分子のソー
スとして働く、ＨＳＡ及びヒアルロン酸塩も含有する。インスリントランスフェ
リンセレン（ＩＴＳ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）及び表皮成長因子（Ｅ
ＧＦ）は卵丘細胞の機能を支持するために含まれ、卵母細胞に栄養を与え、刺激
する。ＦＳＨ及びｈＣＧは、卵丘細胞及び卵母細胞を刺激して、生体内での排卵
に関連する変化を生じさせるために加える。成熟培養液を調製するとき、ＩＴＳ
、ＩＧＦ、ＥＧＦ及びＦＳＨとｈＣＧは、好ましくは最後に加える成分であるこ
とに留意しなければならない。これらの成分の好ましい量と範囲は表２に示され
ている。
【００２９】 ３．精子の調製と受精の培養液 現在の体外受精の方法は、胚発生に使用するのと同じ培養液を精子の調製及び
受精に用いる。受精過程を促進し、受精が起こったときに形成される接合子を支
持するために、卵母細胞の貯蔵と支持にも適する精子調製用の別個の培養液を開
発するという試みは為されていなかった。多くの研究室では、２−３時間から約
１６−１８時間までにわたる長い時間をかけて受精プロセスを行う。この期間中
、卵母細胞、精子及び生み出された接合子は多大の栄養を要求する。さらに、精
子の機能と受精は、周囲を取り巻く液体がある種の成分を含むとき増進される傾
向にある。本発明の精子調製と受精の培養液はこれらの問題に適応するように処
方されている。
【００３０】 本発明に従った好ましい精子調製と受精培養液は、卵母細胞回収とハンドリン
グ培養液と実質的に同じイオン及び可欠アミノ酸の組成物を含む。これらの培養
液が同様のイオン及びアミノ酸組成物を共有するという事実から、卵母細胞を回
収とハンドリング培養液から取り出して精子調製培養液に入れたとき、卵母細胞
が受けるストレスが最小限に抑えられる。表３は、イオン及び可欠アミノ酸成分
の好ましい量と範囲を示す。
【００３１】
【表３】 表からわかるように、精子調製培養液は卵母細胞回収・ハンドリング培養液で
認められるレベルよりも高い濃度のナトリウムを含む。この高濃度のナトリウム
は、卵母細胞に余分な浸透圧ストレスをかけずに精子の機能と受精を促進する。
また、卵母細胞回収・ハンドリング培養液と比較するとリン酸塩の濃度も高い。
精子調製・受精の培養液のグルコース濃度は、グルコースが精子と卵の周囲の卵
丘細胞にとって主要な栄養素であることから、卵母細胞の回収とハンドリング培
養液よりも高くなっている。精子調製と受精の培養液の乳酸塩濃度は、精子細胞
と卵丘細胞が老廃物として乳酸を生じる傾向があるのを相殺するため、卵母細胞
回収・ハンドリング培養液で認められるよりも低い。緩衝系は生理的ｐＨを維持
するために使用され、精子の調製と受精は、主として高いＣＯ２大気を維持する
ことができるインキュベーター内で行われるため、重炭酸緩衝液が好ましい。精
子頭部の脱圧縮のプロセスを助けるため、グルタチオン（卵母細胞回収・ハンド
リング培養液には存在しない）が含まれる。アラニル−グルタミン（卵母細胞回
収−ハンドリング培養液には存在する）は、精子の機能を損ない、受精を低下さ
せることがあるので、この培養液からは除外する。胚発生培養液中に存在する（
下記で論じるように）、キレート化剤ＥＤＴＡについても同様である。ファロー
ピウス管及び子宮において最も豊富な高分子であるＨＳＡは、精子と胚の機能を
支持するために含まれる。精子の運動性を増進し、ＨＳＡと同様に働くヒアルロ
ン酸塩も含まれる。精子は高レベルの細菌を含有しやすいため、１つ又はそれ以
上の抗生物質も含まれる。ペニシリン、ストレプトマイシン及び／又はゲンタマ
イシンが好ましい抗生物質である。表３は、これらの様々な成分に関する好まし
い量と範囲を示している。
【００３２】 ４．ＩＣＳＩ培養液 卵母細胞を取り巻く透明帯の肥厚のために精子が卵母細胞に受精することがで
きない場合、あるいは精子が男性因子（ｍａｌｅ−ｆａｃｔｏｒ）の患者からの
ものである場合のように、精子と卵母細胞の自然相互作用以外によって受精が行
われることが望ましい状況では、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）と呼ばれる手法
によって精子を卵母細胞内に輸送することができる。ＩＣＳＩ手法を用いるとき
には、卵母細胞から卵丘細胞を取り除き、ガラスピペットを使用して卵母細胞の
内部に精子を注入する。本発明は、卵母細胞を浸し、同時に精子を注入によって
卵母細胞内に輸送するときの精子の担体としても役立つ単一培養液の使用を考慮
している。かかる培養液は、それ故、好ましくは卵母細胞の内部及び外部と高度
に適合性である。好ましい培養液中のイオン性成分は、代謝と恒常性のストレス
を避けるためにリン酸塩を省き、マグネシウム対カルシウムの比率を２：１とし
ていることを除いて、卵母細胞回収とハンドリング培養液で認められるものと同
様である。マグネシウムとカルシウムのこの比率は卵母細胞にとって極めて有益
であると考えられる。ＩＣＳＩはインキュベーターの外で行われる臨床手技であ
るので、通常の大気中で有効な緩衝系が使用される。従ってこの培養液に関して
は、ＭＯＰＳ及びＨＥＰＥＳが好ましい緩衝液である。卵丘細胞は卵母細胞から
除去されており、精子はその独立した生存の最終期にあるので、卵丘細胞と精子
にとっての主たるエネルギー源である（卵母細胞にとってはそうでない）グルコ
ースはこの培養液から除外される。ピルビン酸塩と乳酸塩は卵母細胞にとっての
主要エネルギー源であるため、これらのレベルは高い。卵母細胞への浸透圧及び
ｐＨのストレスを避け、卵母細胞に栄養分を与えるため、卵母細胞中で最も豊富
な可欠アミノ酸−グリシン、プロリン、セリン及びタウリン−とグルタミン（ア
ラニル−グルタミンの安定形態で）だけが培養液中に保持される。好ましくは、
ＩＣＳＩ培養液はまた、精子をＩＣＳＩピペットに捕獲できるように精子を不動
化する又は減速するため、ヒアルロン酸塩又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）
を含む。表４は、ＩＣＳＩ培養液におけるこれらの成分の好ましい量と範囲を示
す。さらに、ＩＣＳＩ培養液の代替的な処方はヒアルロニダーゼを含み、かかる
代替処方は、卵母細胞を前処理して、卵母細胞の周囲の卵丘細胞を保持するヒア
ルロン酸ゲルを分解するために使用される。この培養液は上記で露出培養液と称
したものであり、ヒアルロン酸塩とＰＶＰを含まず、ヒアルロニダーゼを含有す
る。露出培養液の組成物は、表４に示されている好ましい量と範囲のＩＣＳＩ培
養液（ヒアルロン酸塩とＰＶＰを除く）の成分に加えて、約４０ＩＵ／ｍｌの好
ましい量とＯｃｔ−８０の好ましい範囲のヒアルロニダーゼを含む。任意に、５
ｍＭの好ましい量と１．０−１０ｍＭの好ましい範囲でＨＳＡを露出培養液に含
めてもよい。
【００３３】
【表４】 ５．胚発生培養液Ｇ１．２ 本発明は胚発生培養液Ｇ１．２を含む。この培養液の好ましい適用は、初期の
１−８細胞胚の発生を支持することである。表５に示すように、好ましい培養液
は、卵母細胞の回収とハンドリング培養液で認められるのと同様のイオン性成分
及び可欠アミノ酸のバックボーンを持つ。卵母細胞回収・ハンドリング培養液と
異なって、Ｇ１．２培養液はＥＤＴＡ成分を含み、ＥＤＴＡは胚発生を支持し、
初期胚に有害な作用を及ぼしうる毒素に結合して無力化しすると考えられ、また
解糖作用を抑制する。さらに、この培養液は、初期胚の発生を支持すると思われ
る濃度でＨＳＡとヒアルロン酸塩を含有する。
【００３４】 培養液Ｇ１．２の好ましい処方は、これまでに公表されている培養液Ｇ１とは
いくつかの重要な点で異なる。まず第一に、高いリン酸塩濃度は発生中の胚の成
長にとって至適条件を提供しないであろうことが研究で示された。それ故、リン
酸塩濃度を低下した。第二に、ＨＳＡと平行して働くようにヒアルロン酸塩を加
えた。第三に、グルタミンをアラニル−グルタミンに置き換えた。アミノ酸によ
る胚培養にとっての重大な問題は、アミノ酸がアンモニウムに自然分解すること
であり、ＩＶＦ処置において使用される生理的温度（３７℃）のようなより高い
温度ではかかる分解が加速される。アンモニウムは胚にとって有毒となりうる。
さらに、グルタミンは特に溶液中でアンモニウムに分解しやすい。胚は一般に約
４８時間までの長期間にわたってＧ１又はＧ１．２培養液中で培養されるので、
培養液中で重要な量のアンモニウムが発生し、胚発生の重大な阻害因子となりう
る。従って、アラニル−グルタミンの使用は実質的な利益を提供する；これはグ
ルタミンの特に安定な形態であり、溶液中で分解しにくい。また、Ｇ１．２中の
アラニル−グルタミン濃度を０．５ｍＭに低下した。これらの３つの変更により
、Ｇ１．２はＧ１培養液に比べて初期胚発生のための有意に改善された培養液と
なっている。Ｇ１．２培養液の成分の最も好ましい量と好ましい範囲を表５に示
す。
【００３５】
【表５】 ６．胚発生培養液Ｇ２．２ 培養液Ｇ２．２も胚発生を支持するように処方されている。その好ましい用途
は、８細胞から胚盤胞期（約１００細胞）、約１００細胞期までの胚に関してで
ある。培養液Ｇ２．２において認められるイオン性成分と可欠アミノ酸の好まし
いバックボーンは、アラニル−グルタミンの濃度が高いことを除いて、基本的に
Ｇ１．２培養液で使用されるのと同じである。これは、胚をＧ１．２培養液から
Ｇ２．２培養液に移すとき、胚に浸透圧ストレスを与える危険性を低下させる。
タウリンは、その胚への恩恵がコンパクションまでの期間に限定されると思われ
るため除外する。グルコース、乳酸塩及びピルビン酸塩は炭水化物として包含す
るが、但しＧ１．２培養液と比較するとグルコースの濃度が高く、乳酸塩とピル
ビン酸塩の濃度は低い。この炭水化物レベルの変化は、発生中の胚がグルコース
をエネルギー源として代謝する能力の上昇に対応したものであり、また同時に女
性生殖路で認められる組成物を反映している。イーグル必須アミノ酸は胚盤胞の
内部細胞塊の成長を刺激するのに必要であるため、Ｇ２．２培養液に含まれる。
ビタミンは、動物試験において胚盤胞腔における液体の蓄積を含めて胚盤胞の機
能を促進する傾向があることから、１つの群として加える。重要な点として、こ
の培養液はＥＤＴＡを含まない。Ｇ２．２培養液の成分の好ましい量と範囲を表
６に示す。
【００３６】
【表６】 ７．受精卵移植培養液 好ましい受精卵移植培養液は、はるかに高い濃度のヒアルロン酸塩を含むこと
を除いてＧ２．２培養液と同じ処方の成分を含む。ヒト生殖系においては、胚に
ヒアルロン酸塩に関するレセプタが存在すること、そしてまた母体の子宮内膜に
もヒアルロン酸塩のレセプタが存在することが研究で示唆されている。ヒアルロ
ン酸塩は、胚が子宮内膜に結合するのを助け、従って着床を支持する、生物学的
にかわのように働くと思われる。受精卵移植培養液の成分の好ましい量と範囲を
表７に示す。
【００３７】
【表７】 ８．凍結保存培養液 本発明は、卵母細胞及び胚の凍結保存において使用するための別個の培養液に
関する。使用する好ましい処方は、イオン性成分と緩衝液、好ましくはＭＯＰＳ
又はＨＥＰＥＳ、ならびに炭水化物として乳酸塩、ピルビン酸塩及びグルコース
を含む。任意に、ＨＳＡを含めてもよい。さらに、培養液はいくつかの添加物、
グリセロール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ、プロパンジオール、及び／又は
スクロースを含みうる。凍結保存培養液の成分の好ましい量と範囲を表８に示す
。
【００３８】
【表８】 Ｂ．連続培養液プロセス ＩＶＦにおいて使用される様々な手順全体を通じてヒト生殖細胞を単一培養液
に浸す代わりに、本発明は、種々のＩＶＦ手順を実施するときに生殖細胞を一連
の異なる培養液に移すことができるプロセスに関する。本発明の１つの態様では
、培養液は特に、女性生殖路において認められるものと同様の、ＩＶＦプロセス
の様々な段階においてヒト生殖細胞の成長と発育を導く物理的環境を提供するよ
うに処方される。本発明のさらなる態様では、特異的に処方された培養液を、次
の手順の１つ又はそれ以上において生殖細胞を支持するために適用できる：卵母
細胞の回収とハンドリング；卵成熟；通常の受精；卵母細胞、接合子及び胚の検
査と生検；８細胞期までの胚発生；胚盤胞期までの胚発生；受精卵移植；及び凍
結保存。より好ましくは、培養液は、該培養液が適合されているＩＶＦプロセス
の各々の適切な期に連続的に適用される。ＩＶＦプロセスにおける主要ステップ
の各々を実現するために使用される装置及び特定手法に関して、臨床と研究室で
は大きな変動があることに留意しなければならない。本発明は、ここで述べた連
続培養液とプロセスは、ＩＶＦの実施において用いられる広い範囲の装置及び手
技に関して使用しうる及び／又は使用に容易に適合させうると想定する。下記は
、ＩＶＦ及び関連方法における培養液の例示的適用をより詳細に論じるものであ
る。
【００３９】 １．卵母細胞の回収とハンドリング：胚のハンドリング 図１を参照すると、例示したＩＶＦプロセスにおける最初の手順１００は、母
体の卵巣からの卵母細胞の採取又は回収（１０２）である。これは典型的には、
経膣超音波プローブに取り付けられた、それによって誘導される微細な針を用い
て膣において実施される。針には通常細いテフロン（登録商標）管が接続してい
て、そこから真空調節器によって制御される吸引調節器へと連結される。吸引液
は、培養液の入った試験管又は他の適切な容器に収集される。培養液を使用して
、針と管及び手順において使用する他の装置をあらかじめ洗浄しておいてもよい
。ある種の臨床環境では、卵胞を洗い出し、卵母細胞の採取を助けるように特に
適合させた針に関しても培養液が使用できる。培養液、使用する装置及び吸引液
は、可能な限り、３７℃に保持する。培養液において重炭酸緩衝系を使用する場
合は、処置は通常、３％−１０％ＣＯ２大気を維持するガス充填ｈｕｍｉｄｉｃ
ｒｉｂ又はイソレット内で実施される。そのような大気制御が行われない場合に
は、培養液はＭＯＰＳ又はＨＥＰＥＰＳ緩衝系を含有しなければならない。
【００４０】 本発明の例示したプロセス１００は、卵母細胞の回収とハンドリング培養液を
回収プロセスの各々の段階で使用しうると想定している。卵母細胞回収及びハン
ドリング培養液を用いる工程は、卵巣からの採取の間卵母細胞と接触する可能性
があり、採取と収集の工程中卵母細胞を吸引し、洗い出す及び／又は洗浄するた
めに使用される装置を洗浄することを含みうる。卵巣からの採取後、卵母細胞を
培養液で洗浄してもよい。任意に、卵母細胞を培養液中で一定期間貯蔵すること
ができる。
【００４１】 さらに、卵母細胞を操作する又は取り扱う他の臨床又は検査手順の際に、又は
胚を操作する又は取り扱う手順において、特にこれらがイソレットの外で行われ
る場合に、培養液を使用しうることが考慮されている。例として、母体からの回
収後の卵母細胞の検査、受精処置後の卵母細胞の検査、及び受精卵が８細胞期に
発育したかどうか調べるための胚の検査が含まれるであろう。これらの例の各々
において、卵母細胞／胚をピペットで培養皿又は試験から回収して培養液に浸し
、顕微鏡又は他の装置による検査の間培養液に液浸したままにしておく。例示し
た本発明の実施態様はまた、カルシウム及びマグネシウムを含まないこの培養液
の代替的処方が、生検手順において使用しうることを想定している。
【００４２】 ２．卵成熟 収集した卵母細胞が未熟である場合、例示プロセス１００は、第二培養液を使
用して成熟の間卵母細胞を支持し、発生を促進することを想定している（１０６
）。卵成熟培養液は通常、卵母細胞回収・ハンドリング培養液を使用して卵巣か
ら卵母細胞を回収する収集手順後に、卵母細胞を処置して成熟させるために使用
される。回収及びハンドリング培養液と成熟培養液は、イオン性成分及びアミノ
酸及びグルタミンの非常に類似したバックボーンを持つので、卵母細胞を一方の
培養液からもう１つの培養液に移すとき、卵母細胞が経験するイオン性ショック
はごくわずかである。例示プロセス１００は、卵母細胞及び周囲の卵丘細胞を約
３０−４８時間又は卵細胞が成熟するまで、成熟培養液に液浸することを含む。
例示プロセス１００はさらに、卵母細胞を成熟培養液から取り出して、それを受
精のために精子調製・受精培養液又はＩＣＳＩ培養液のいずれかに液浸すること
を考慮している。
【００４３】 本発明に従えば、卵成熟培養液は、ここで述べた卵母細胞回収及びハンドリン
グ培養液の代わりに、卵母細胞回収工程（１０２）に適用することができる。さ
らに、ＨＥＰＥＳ緩衝液を含む又は含まない、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１００又はＴＣ
Ｍ−１９９培養液のような従来の培養液を用いて未熟卵母細胞を回収・ハンドリ
ングした後、卵母細胞を本発明の成熟培養液に液浸してもよい。ひとたび成熟が
完了すれば、卵母細胞を通常のＩＶＦ受精手順のために培養液に浸す（１１０）
か、又はＩＣＳＩ処置を通して補助授精するための準備としてＩＣＳＩ培養液に
浸す（１１２）。
【００４４】 ３．精子の調製及び受精 例示したプロセス１００は、収集した卵母細胞を通常、精子調製及び授精培養
液の最初のポーションで洗浄し、その中に液浸して、プレインキュベーション培
養の期間その中におくことを想定している。このプレインキュベーション培養の
期間（１０４）は約６時間持続しうる。プレインキュベーション培養の期間を経
た卵母細胞は、典型的には受精率が高くなる。
【００４５】 プロセス１００はまた、細菌や存在しうる他の夾雑物を除去するために精子調
製及び受精培養液の第二のポーションで別途に洗浄し、その中に貯蔵することも
想定している。精子の調製（１０８）は、培養液で精液を希釈し、遠心分離して
、濃縮精子を培養液の新たなポーションに再懸濁することを含みうる。精子調製
の「泳動（ｓｗｉｍ ｕｐ）」法では、精子を含む培養液を遠心分離し、培養液
を排出して、培養液の新しいポーションを遠心分離で生じた精子ペレットに注ぎ
入れる。精子が新鮮培養液中に泳動するための期間をおく。より運動性の高い精
子を含む新鮮培養液の層を流出させ、遠心分離して、プロセスを反復する。本発
明のもうひとつの態様では、精子調製及び受精培養液は、パーコル法のような１
つまたはそれ以上の分離手順において使用しうる。本発明は、該精子調製及び受
精培養液を、ＩＶＦのために使用される精子調製手順のいずれかにおける培養液
として使用することを想定している。
【００４６】 ひとたび精子が調製されれば（１０８）、培養液中で精子を検査し、計数して
、所望する量を卵母細胞の入った培養液のポーションに加える。精子と卵母細胞
を数時間まで、一部の研究室でははるかに長い期間、約１６から１８時間にもわ
たって、培養液中で一緒にした状態で放置する。本発明はさらに、精子と共に培
養液に液浸した期間後、卵母細胞を取り出して、受精（１１０）が起きたかどう
かを検査する（１１４）。検査のために取り出す際、イソレットにおいて検査を
実施することができる場合には、卵母細胞は引き続き精子調製及び受精培養液中
に浸したままにする。そうでない場合は、上述したように、卵母細胞のハンドリ
ングと検査のために卵母細胞回収及びハンドリング培養液を使用することができ
る。
【００４７】 ４．卵母細胞への精子の直接注入による受精（ＩＣＳＩ手法） ＩＣＳＩプロセスでは、非常に微細なピペット又は針を通して精子を直接卵母
細胞の細胞質内に注入することができる。プロセス１００は、ヒアルロン酸塩及
び／又はＰＶＰを含むＩＣＳＩ培養液のポーションで精子を洗浄し、その後精子
を培養液に入れることを想定している。プロセス１００はさらに、精子を含むマ
イクロ容量の培養液をピペットに引き入れ、培養液を精子を卵母細胞の内部に注
入することを含む。
【００４８】 例示プロセス１００はさらに、ＩＣＳＩプロセスの間卵母細胞をＩＣＳＩ培養
液の別のポーションに浸しうることを想定している。ＩＣＳＩプロセスの前に卵
母細胞を露出させる前処置（１０５）のために、ヒアルロニダーゼを補足した代
替的処方のＩＣＳＩ培養液が使用できる。前処置は、卵母細胞の周囲の卵丘細胞
の全部又は大部分が除去されて卵母細胞が露出するまでの期間、ヒアルロニダー
ゼを補足したＩＣＳＩ培養液に卵母細胞を液浸することを含む。前処置後、上述
したようにＩＣＳＩピペットを使用して、培養液の別のポーションに入った精子
を卵母細胞に注入する。
【００４９】 ＩＣＳＩ注入工程（１１２）が完了した後、受精が有効であったかどうかなら
びに卵母細胞が無傷で健康であるかどうかを評価するために卵母細胞を検査する
（１１４）ことが必要となりうる。検査は、卵母細胞を浸しているＩＣＳＩ培養
液中で、若しくは上述したような卵母細胞回収及びハンドリング培養液中で実施
することができる。
【００５０】 ５．８細胞期までの胚発生 接合子の形成後、培養液Ｇ１．２を初期胚に適用する。接合子を同定した後、
培養液Ｇ１．２で洗い、次に約４８時間までの培養期間（１１６）Ｇ１．２培養
液に浸す。この期間中、胚を１細胞からおよそ８細胞期まで発達させ、ほぼ８細
胞期で取り出す。胚の検査（１１８）は、Ｇ１．２培養液中で、若しくは上述し
たような卵母細胞回収及びハンドリング培養液中で実施することができる。
【００５１】 ６．胚盤胞期までの胚発生 例示プロセス１００は、Ｇ２．２培養液を使用して発育胚を胚盤胞期まで、好
ましくは約８細胞期から約１００細胞期まで培養する（１２０）ことを想定して
いる。プロセス１００はまた、ひとたび胚が胚盤胞期に達すれば、また胚が検査
（１２４）で生育可能と判定されると仮定して、Ｇ２．２培養液から取り出して
子宮内への移植のために準備する。一部の研究室では、Ｇ２．２培養液を、任意
に、胚移植にも使用することができる。胚の検査（１２４）は、Ｇ１．２培養液
中で、若しくは上述したような卵母細胞回収及びハンドリング培養液中で実施す
ることができる。
【００５２】 ７．受精卵移植 プロセス１００は、受精卵移植培養液を、受精卵を母体に移植する（１２６）
ときの受精卵の担体として使用することを想定している。受精卵を移植培養液に
浸漬し、受精卵の入った培養液を移植カテーテルに引き入れて、超音波プローブ
で誘導してカテーテルを母体の子宮内に挿入し、受精卵の入った培養液を子宮に
注入する。
【００５３】 ８．凍結保存 凍結保存培養液は、受精の前に、卵母細胞を貯蔵し、凍結し、解凍し、透化し
、あたためるために使用しうる。卵割期の胚ならびに８から１００細胞期の胚を
貯蔵し、凍結し、解凍し、透化し、あたためるためにも同じ培養液が使用できる
。
【００５４】 本発明を１つの実施態様に関して説明したが、本発明が数多くの追加実施態様
及び手順において使用しうることは明白であろう。そのような追加実施態様及び
手順は、下記の特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の範囲内であ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明に従ったＩＶＦプロセスを例示するフローチャートである。
【手続補正書】特許協力条約第１９条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年６月１９日（２０００．６．１９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ ，ＺＷ (72)発明者 レイン，ミツシエル アメリカ合衆国、コロラド・80120、リト ルトン、ナンバー・324、ウエスト・カナ ル・サークル・1661 Ｆターム(参考） 4B065 AA93X BB03 BB06 BB08 BB12 BB18 BB19 BB21 BB34 BC13 CA44

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 プロセスが、卵母細胞の回収（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）とハン
    ドリング；卵成熟；精子の調製；受精；卵母細胞、接合子及び胚の検査と生検；
    胚発生；受精卵移植；及び凍結保存の段階の一部又は全部を含み、該方法が： 前記段階の第一段階の間、コアグループの塩を含む第一支持培養液に生殖細胞
    を支持し、そして 前記段階の第二段階の間、前記第一支持培養液と実質的に同じコアグループの
    塩を含む、前記第一支持培養液とは異なる第二支持培養液に生殖細胞を保持し、
    かかるコアグループの塩は前記第一及び第二支持培養液の両方において利用され
    、それによって第一から第二支持培養液への移動に付随する生殖細胞へのストレ
    ス及び外傷を最小限に抑える ステップを含み、 前記第一及び第二段階の１つだけが前記胚発生段階及び前記受精卵移植段階の
    １つである、 ＩＶＦプロセスにおいて使用するための方法。
  2. 【請求項２】 前記第一段階が胚検査及び卵母細胞の回収とハンドリングの
    うちの１つである、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記第一支持培養液が水、イオン性成分及び緩衝液を含む、
    請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記第一支持培養液が、４−モルホリンプロパンスルホン酸
    （ＭＯＰＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ１−２−エタンスルホ
    ン酸（ＨＥＰＥＳ）又は重炭酸塩のうちの１つを含む、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記第一支持培養液が炭水化物を含む、請求項２に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 前記第一支持培養液が可欠アミノ酸を含む、請求項２に記載
    の方法。
  7. 【請求項７】 前記第一支持培養液がグルタミンを含む、請求項２に記載の
    方法。
  8. 【請求項８】 前記第一支持培養液が抗生物質を含む、請求項２に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】 前記第一支持培養液がカルシウムとマグネシウムを含まず、
    かかる第一保持培地を生検手順において使用する、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記第一段階が卵成熟を含む、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 第一支持培養液中に生殖細胞を支持する前記ステップが、
    卵母細胞の採集後、受精前に発生を促進するための期間、卵母細胞を前記第一支
    持培養液に支持することを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記第一支持培養液が、水溶液中に分散したマグネシウム
    とカルシウムを含む、請求項１０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記第一支持培養液が、可欠アミノ酸、必須アミノ酸、シ
    ステアミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びヒアルロン酸塩の１つ又はそれ
    以上を含む、請求項１０に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記第一支持培養液が、インスリントランスフェリンセレ
    ン（ＩＴＳ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）及び表皮成長因子（ＥＧＦ）の
    ような１つ又はそれ以上の成長因子を含む、請求項１０に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記第一支持培養液が、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び
    ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のような１つ又はそれ以上のホルモンを含
    む、請求項１０に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記第一段階が、精子の調製及び受精のうちの１つを含む
    、請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記第一支持培養液が炭水化物を含む、請求項１６に記載
    の方法。
  18. 【請求項１８】 前記第一支持培養液が、重炭酸塩、グルタチオン、ＨＳＡ
    及びヒアルロン酸塩の１つ又はそれ以上を含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記第一支持培養液が抗体を含む、請求項１６に記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】 前記第一支持培養液が可欠アミノ酸を含む、請求項１６に
    記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記第一支持培養液がＥＤＴＡを含まない、請求項１６に
    記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記第一段階が卵母細胞の回収とハンドリングを含み、前
    記第二段階が精子の調製及び受精のうちの１つを含む、請求項１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記第二支持培養液が、前記第一保持培養液と比較して高
    いナトリウム濃度を有する、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記第二支持培養液が、前記第一保持培養液と比較して高
    いリン酸塩濃度を有する、請求項２２に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記第一支持培養液を用いる前記第一段階が、細胞質内精
    子注入（ＩＣＳＩ）のプロセスの一部である、請求項１に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記ＩＣＳＩプロセスが、卵母細胞から卵丘細胞を取り除
    き、精子をインキュベーションして、かかる精子を前記卵母細胞内に注入するこ
    とを含み、そして 該方法が、精子を注入した卵母細胞を前記第二支持培養液に加えるステップをさ
    らに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記ＩＣＳＩプロセスにおいて使用される前記第一支持培
    養液がリン酸塩を含まない、請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記ＩＣＳＩプロセスにおいて使用される前記第一支持培
    養液が、ＭＯＰＳプロセス、ＨＥＰＥＳ及び重炭酸塩のうちの１つを含む、請求
    項２５に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記ＩＣＳＩプロセスにおいて使用される前記第一支持培
    養液が炭水化物を含む、請求項２５に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記ＩＣＳＩプロセスにおいて使用される前記第一支持培
    養液がグルコースを含まない、請求項２５に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記ＩＣＳＩプロセスにおいて使用される前記第一支持培
    養液が可欠アミノ酸を含む、請求項２５に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記ＩＣＳＩプロセスにおいて使用される前記第一支持培
    養液がグルタミンを含む、請求項２５に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記第一支持培養液が、前記ＩＣＳＩプロセスの一部とし
    て前記精子を支持するために使用され、且つヒアルロン酸塩又はポリビニルピロ
    リドン（ＰＶＰ）のうちの１つを含む、請求項２６に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記第一支持培養液がマグネシウムとカルシウムの水溶液
    を含む、請求項２５に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記第一段階が卵母細胞を露出させることを含み、前記第
    一支持培養液がヒアルロニダーゼを含む、請求項２５に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記第一段階が胚発生を含む、請求項１に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 第一支持培養液中に生殖細胞を支持する前記ステップが、
    少なくとも４８時間又は少なくとも８細胞期を通じてのいずれかの期間、接合子
    を前記第一支持培養液に保持することを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記第一支持培養液が炭水化物を含む、請求項３６に記載
    の方法。
  39. 【請求項３９】 前記第一支持培養液が可欠アミノ酸を含む、請求項３６に
    記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記第一支持培養液が１つ又はそれ以上のＨＳＡ及びヒア
    ルロン酸塩を含む、請求項３６に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記第一支持培養液がグルタミンを含む、請求項３６に記
    載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記グルタミンがアラニル−グルタミンを含む、請求項４
    １に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記段階の第三段階の間、生殖細胞を前記第一及び第二支
    持培養液とは異なる第三支持培養液に支持するステップをさらに含む、請求項１
    に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記第二段階と前記第三段階の両方が胚発生と受精卵移植
    を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記第三支持培養液を前記第二支持培養液に続いて使用し
    、かかる第三支持培養液が、前記第二支持培養液に比べて乳酸塩及びピルビン酸
    塩のいずれかの低い濃度を有する、請求項４３に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記第三支持培養液を前記第二支持培養液に続いて使用し
    、かかる第三支持培養液が前記第二支持培養液に比べて高いグルコース濃度を有
    する、請求項４３に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 第一支持培養液中に生殖細胞を支持する前記ステップが、
    少なくとも約４８から９６時間及びほぼ８細胞期からほぼ１００細胞期までのい
    ずれかの期間、胚を前記第一支持培養液に支持することを含む、請求項３６に記
    載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記第一支持培養液が可欠アミノ酸を含み、タウリンを含
    まない、請求項３６に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記第一支持培養液が必須アミノ酸を含む、請求項３６に
    記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記第一支持培養液がビタミンを含む、請求項３６に記載
    の方法。
  51. 【請求項５１】 前記第一支持培養液がＨＳＡを含む、請求項３６に記載の
    方法。
  52. 【請求項５２】 前記第一支持培養液がＥＤＴＡを含まない、請求項３６に
    記載の方法。
  53. 【請求項５３】 受精卵移植のために前記第一支持培養液にヒアルロン酸塩
    を加える、請求項３６に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記第一段階が凍結保存を含む、請求項１に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記第一支持培養液がＭＯＰＳ又はＨＥＰＥＳのいずれか
    を含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 前記第一支持培養液が炭水化物を含む、請求項５４に記載
    の方法。
  57. 【請求項５７】 前記第一支持培養液がＨＳＡを含む、請求項５４に記載の
    方法。
  58. 【請求項５８】 前記第一支持培養液がグリセロール、エチレングリコール
    、ＤＭＳＯ、プロパンジオール及びスクロースの１つ又はそれ以上を含む、請求
    項５４に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 前記第一支持培養液がＥＤＴＡを含む、請求項３６に記載
    の方法。
  60. 【請求項６０】 前記第一支持培養液が可欠アミノ酸を含む、請求項５４に
    記載の方法。
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