RU2630296C2 - Антитела к биотину и способы их применения - Google Patents

Антитела к биотину и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
RU2630296C2
RU2630296C2 RU2015102069A RU2015102069A RU2630296C2 RU 2630296 C2 RU2630296 C2 RU 2630296C2 RU 2015102069 A RU2015102069 A RU 2015102069A RU 2015102069 A RU2015102069 A RU 2015102069A RU 2630296 C2 RU2630296 C2 RU 2630296C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibody
biotin
amino acid
seq
hvr
Prior art date
Application number
RU2015102069A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2015102069A (ru
Inventor
Ульрих БРИНКМАНН
Ги ЖОРЖ
Майкл ГРОТЕ
Айке ХОФФМАНН
Original Assignee
Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Publication of RU2015102069A publication Critical patent/RU2015102069A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2630296C2 publication Critical patent/RU2630296C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биохимии. Описано гуманизированное антитело к биотину или его фрагмент, связывающий биотин, включающее: HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09, HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13. Также описано гуманизированное антитело к биотину или его фрагмент, связывающий биотин, содержащее VH-последовательность SEQ ID NO: 12 и VL последовательность SEQ ID NO: 16. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 9 пр.

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к антителам к биотину, производным антител к биотину и способам их применения. Предшествующий уровень техники
Гаптен-связывающие антитела могут быть применены в качестве захватывающих модулей для терапевтических и диагностических применений. Например, гаптен-связанные соединения, такие как флуорофоры, хелатообразующие реагенты, пептиды, нуклеиновые кислоты, белки, липиды, наночастицы и многие другие агенты могут реагировать с гаптен-связывающими антителами и производными антитела. Это делает возможным эффективную детекцию таких «нагрузок», а также захватывание, аккумуляцию в желаемых положениях, перекрестную сшивку и другие эффекты, опосредованные антителами. Поскольку свойства и композиция гаптенов могут влиять на композицию и «поведение» гаптен-связанных соединений (включая размер, растворимость, активность, биофизические свойства, фармакокинетику, биологические эффекты и более), крайне желательно разработать ряд различных гаптен-связывающих соединений. Поэтому, возможно совместить выбранный гаптен с заданной нагрузкой для получения оптимизированных гаптеновых конъюгатов. Впоследствии, оптимальные гаптен-связывающие соединения могут быть скомбинированы с упомянутыми конъюгатами для получения оптимальных сочетаний антитело-гаптен-нагрузка. В дальнейшем желательно иметь гаптен-связывающие соединения, такие как производные антител, которые гуманизированы. Это делает возможным применения со значительно сниженным риском интерференции, таким как иммунногеность при терапевтических применениях. Антитела, описанные в данном документе, связывают производные биотина (но не немодифицированный биотин). Данные антитела названы в данном документе «биотин-связывающими» антителами или «антителами к биотину».
В WO 00/50088 описаны комплексы биотинилированный хемокин-антитело.
Kohen, F., et al., сообщает о получении и свойствах антител к биотину (Methods Enzymol. 279 (1997) 451-463. Bagci, H., et al. сообщают, что моноклональные антитела к биотину имитируют авидность в распознавании биотина (FEBS Lett. 322 (1993) 47-50). Cao, Y., et al., сообщают о разработке биспецифичных моноклональных антител в качестве универсальной иммунопробы для детекции биотинилированных макромолекул (J. Immunol. Meth. 220 (1998) 85-91).
В WO 01/34651 описаны антитела, связывающие энантиомер неестественного происхождения (L-Биотин) и их другое применение в качестве направляющих агентов.
Dakshinamurti et al. сообщают о продукции и характеристике моноклонального антитела к биотину (Biochem. J. 237 (1986) 477-482). Сравнение присоединения биотина и биотинилированных макромолекулярных лигандов к моноклональному антителу к биотину и к стрептовидину описано Vincent, P., et al. (J. Immunol. Meth. 165 (1993) 177-182). Berger, M., et al. (Biochem. 14 (1975) 2338-2342) сообщают о продукции антител, связывающих биотин и ингибирующих ферменты, содержащие биотин.
Краткое описание изобретения
Данное изобретение предлагает антитела к биотину и антитела к производным биотина, а также способы их применения.
Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой гуманизированное антитело к биотину, где антитело включает (a) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (b) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и (с) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. Данное антитело специфически связывается с биотином.
В одном воплощении антитело дополнительно включает (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09, (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (с) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
В одном воплощении антитело дополнительно включает (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и (с) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.
В одном воплощении антитело включает в позиции 24 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток серина или/и включает в позиции 73 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток треонина.
В одном воплощении антитело включает в позиции 60 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток аланина и в позиции 61 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток глутамина.
В одном воплощении антитело (1) включает в позиции 24 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток серина или/и включает в позиции 73 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток треонина, (2) включает в позиции 60 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток аланина, и (3) включает в позиции 61 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток глутамина.
В одном воплощении антитело включает (a) VH-последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12; (b) VL-последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; или (с) VH-последовательность как в (а) и VL-последовательность как в (b), где аминокислотный остаток в позиции 24 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, представляет собой серии или/и аминокислотный остаток в позиции 73 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, представляет собой треонин, и аминокислотный остаток в позиции 60 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, представляет собой аланин, и аминокислотный остаток в позиции 61 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, представляет собой глутамин.
В одном воплощении антитело включает VH-последовательность SEQ ID NO: 12.
В одном воплощении антитело включает VL-последовательность SEQ ID NO: 16.
Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой антитело, включающее VH-последовательность SEQ ID NO: 12 и VL последовательность SEQ ID NO: 16.
В одном воплощении антитело представляет собой полноразмерное антитело IgG1 или полноразмерное антитело IgG4.
В одном воплощении антитело представляет собой моноклональное антитело.
В одном воплощении антитело представляет собой фрагмент антитела, который связывается с биотином.
Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой фармацевтический препарат, включающий антитело, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.
Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой антитело, как описано в данном документе, для применения в качестве лекарственного препарата.
Один аспект настоящего изобретения, как описано в данном документе, представляет собой применение антитела, как описано в данном документе, при производстве лекарственного препарата.
Краткое описание графических материалов
Фигура 1: экспрессия гуманизированного антитела, связывающего биотин и производные биотина, с и без мутации cys для ковалентного присоединения нагрузки: восстанавливающий и невосстанавливающий ДСН-ПААГ-электрофорез демонстрирует композицию и гомогенность гуманизированных антител после очистки при помощи белка А и гель-фильтрационной хроматографии. H-цепи антитела (более высокий бэнд 50 кДа) и L-цепи (более низкий бэнд 25 кДа) детектируемы в качестве уникальных бэндов во фракциях очищенных при помощи гель-фильтрационной хроматографии обоих производных антител без присутствия видимых количеств контаминаций дополнительным белком.
Фигура 2: белковую структуру мышиного Fab-фрагмента антитела к биотину определяли в комплексе с биоцитинамидом: комплексированный гаптен расположен в непосредственной близости от отрицательно заряженного кластера аминокислот; биотин которого - в качестве гаптена - является производным присоединения нагрузки и его карбоксильная группа связывается с хорошей эффективностью, поскольку в данном положении отсутствует отталкивание зарядов (из-за утраты COOH-группы); для сравнения, свободный (обычный) биотин не может эффективно связываться с антителом, поскольку его карбоксильная группа будет в непосредственной близости от данного отрицательно заряженного кластера, и таким образом будет отталкиваться.
Детальное описание воплощения изобретения
I. Определения
"Акцепторный человеческий каркас" для целей данного документа представляет собой каркас, включающий аминокислотную последовательность каркаса вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH), полученный из каркаса иммуноглобулина человека или человеческого консенсусного каркаса, как определено ниже. Акцепторный человеческий каркас, "полученный из" каркаса иммуноглобулина человека или человеческого консенсусного каркаса может включать его аминокислотную последовательность или может включать изменения в аминокислотной последовательности. В некоторых воплощениях, число аминокислотных замен составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее. В некоторых воплощениях VL-последовательность акцепторного человеческого каркаса является идентичной VL-последовательности каркаса иммуноглобулина человека или последовательности человеческого консенсусного каркаса.
«Аффинность» относится к силе общего количества нековалентных взаимодействий между единственным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, как употреблено в данном документе, «аффинность связывания» относится к истинной аффинности связывания, отражающей 1:1 взаимодействия между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X для ее партнера Y обычно может быть представлена при помощи константны диссоциации (Kd). Аффинность может быть измерена обычными способами, хорошо известными в области техники, включая таковые, описанные в данном документе. Конкретные иллюстративные и типичные воплощения для оценки аффинности связывания описаны в далее.
Антитело с «созревшей аффинностью» относится к антителу с одним или более изменением в одном или более гипервариабельном участке (HVR), по сравнению с родительским антителом, которое не обладает такими изменениями, такие изменения приводят к улучшению аффинности антитела для антигена.
Термины «антитело к биотину» и «антитело, связывающееся с биотином» относятся к антителу, способному к связыванию с биотином с достаточной аффинностью, такой, что антитело полезно в качестве диагностического и/или терапевтического агента при нацеливании на биотин. В одном воплощении степень связывания антитела к биотину с неродственным небиотиновым белком, составляет менее приблизительно 10% связывания антитела с биотином, как измерено, например, посредством радиоиммунологического анализа (РИА). В конкретных воплощениях антитело, которое связывается с биотином, обладает константой диссоциации (Kd) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10-8 М или менее, например, от 10-8 M до 10-13 М, например, от 10-9 М до 10-13 М).
Термин «антитело» в данном документе применяют в самом широком смысле, и он охватывает различные структуры антител, включая, но не ограничено, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую антиген-связывающую активность.
«Фрагмент антитела» относится к молекуле другой нежели интактное антитело, которая включает часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, который связывается с интактным антителом. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничены, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; диантитела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител (например, scFv); и мультиспецифичные антитела, полученные из фрагментов антител.
«Антитело, связывающееся с таким же эпитопом», что и референсное антитело, относится к антителу, которое блокирует связывание референсного антитела с антигеном в анализе конкурентного связывания на 50% или более, или наоборот, референсное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в анализе конкурентного связывания на 50% или более. Пример анализа конкурентного связывания предложен в данном документе.
Термин «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из отдельного источника или вида, в то время как оставшаяся часть тяжелой или легкой цепи получена из другого источника или вида.
«Класс» антитела относится к типу константного домена или константного участка содержащей его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IGA2. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов называют α, δ, ε, γ и μ соответственно.
Термин «цитотоксический агент», как употреблено в данном документе, относится к веществу, ингибирующему или предотвращающему клеточную функцию и/или вызывающему гибель клетки или деструкцию. Цитотоксические агенты включают, но не ограничены, радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu); хемотерапевтические агенты или лекарственные средства (например, метотриксат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мельфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); агенты ингибирующие рост; их ферменты и фрагменты, такие как нуклеотидные ферменты; антибиотики; токсины, такие как небольшие молекулы токсинов или ферментативно активные токсины бактерий, грибов, растений или животных, включая фрагменты и/или их варианты; и различные противоопухолевые и противораковые агенты, раскрытые ниже.
«Эффекторные функции» относятся к таковым биологическим активностям, свойственным Fc-участку антитела, которые варьируют в зависимости от класса антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: C1q связывание и комплемент зависимую цитотоксичность (CDC); Fc-рецепторное связывание; антитело-зависимую клеточное-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию поверхностных клеточных рецепторов (например, В-клеточного рецептора); и В-клеточную активацию.
«Эффективное количество» агента, например, фармацевтического препарата относится к количеству эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического и профилактического результата.
Термин «Fc-участок» в данном документе употребляют для определения C-концевого участка тяжелой цепи иммуноглобулина, которая включает по меньшей мере часть константного участка. Термин включает природную последовательность Fc-участков и вариантные Fc-участки. В одном воплощении Fc-участок тяжелой цепи IgG простирается от Cys226, или от Pro230, до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако C-концевой лизин (Lys447) Fc-участка может присутствовать или нет. Если не указано иное, в данном документе нумерация аминокислотных остатков в Fc-участке или константном участке соответствует европейской системе нумерации, также называемой EU index, как описано в Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th éd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.
«Каркас» или «FR» относится к остаткам вариабельного домена иным нежели чем остаткам гипервариабельного домена (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно последовательности HVR и FR обычно представлены в следующей последовательности в VH (или VL): FR1-Н1 (L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «целое антитело» применяют в данном документе взаимозаменяемо в отношении антитела, имеющего структуру в значительной степени сходную со структурой нативного антитела или имеющего тяжелые цепи, которые включают Fc-участок как определено в данном документе.
Термины «хозяйская клетка», «хозяйская клеточная линия» и «хозяйская клеточная культура» употребляют взаимозаменяемо и в отношении клеток, в которые введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомков таких клеток. Хозяйские клетки включают «трансформантов» и «трансформированные клетки», которые включают первично трансформированную клетку и потомство, полученное от нее, без относительно числа пассажей. Потомство может быть не полностью идентичным по нуклеокислотному составу родительской клетке, и могут содержать мутации. Мутантное потомство, обладающее такой же функцией или биологической активностью в виде скринированных или выбранных в исходно трансформированной клетке включены в данный документ.
«Человеческое антитело» представляет собой антитело, обладающее аминокислотной последовательностью, соответствующей таковой антитела, продуцированного человеком или человеческой клеткой, или полученное из источника, не являющегося человеком, который использует спектры человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела. Данное определение человеческого антитела определенно не включает гуманизированное антитело, включающее нечеловеческие антиген-связывающие остатки.
«Человеческий консенсусный каркас" представляет собой каркас, который содержит наиболее распространенные при селекции каркасных последовательностей VL или VH человеческого иммунноглобулина. Обычно селекцию последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека проводят из подгруппы последовательностей вариабельного домена. Обычно подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу как в Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3. В одном воплощении, для VL, подгруппа представляет собой подгруппу каппа I как в Kabat et al., выше. В одном воплощении для VH, подгруппа представляет собой подгруппу III как в Kabat et al., выше.
«Гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, включающему аминокислотные остатки нечеловеческого антитела HVRs и аминокислотные остатки человеческих FRs. В определенных воплощениях, гуманизированное антитело будет включать практически все из по меньшей мере одного и обычно двух, вариабельных доменов, в которых все или практически все HVRs (например, CDRs) соответствуют таковым нечеловеческого антитела и все или практически все FRs соответствуют таковым человеческого антитела. Гуманизированное антитело может включать по меньшей мере часть константного участка антитела, полученного из человеческого антитела. «Гуманизированная форма» антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое было подвергнуто гуманизации.
Термины «гипервариабельный участок» или «HVR», как употреблено в данном документе, относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, который является гипервариабельным в последовательности и/или формирует структурно определенные петли («гипервариабельные петли»). Обычно нативные четырехцепочечные антитела включают шесть HVR; три в VH (Н1, Н2, Н3), и три в VL (L1, L2, L3). HVR обычно включают аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или из «участков, определяющих комплементарность» (CDRs), последние являются наиболее вариабельными и/или вовлечены в распознавание антигена. Например, гипервариабельные петли, возникают в аминокислотных остатках 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3). (Chothia, С. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). Например, CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) возникают в аминокислотных остатках 24-34 L1, 50-56 L2, 89-97 L3, 31-35В Н1, 50-65 Н2 и 95-102 Н3. (Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.). За исключением CDR1 в VH, CDR обычно включают аминокислотные остатки, которые формируют гипервариабельные петли. CDR также включают «остатки, определяющие специфичность» или «SDR», которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR заключены внутри участков CDR, называемых укороченные-CDRs, или a-CDR. Например, a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) возникают в аминокислотных остатках 31-34 L1, 50-55 L2, 89-96 L3, 31-35 В Н1, 50-58 Н2 и 95-102 H3. (См. Almagro, J.С. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). Если не указано иное, HVR остатки и другие остатки в вариабельном домене (например, FR остатки) пронумерованы в данном документе согласно Kabat et al., выше.
«Иммунноконъюгат» представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более гетерологичной молекулой(ми), включая, но не ограничено, цитотоксический агент.
«Индивидуум» или «субъект» представляет собой млекопитающее. Млекопитающее включает, но не ограничено, одомашненных животных (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматов (например, люди и приматы, не являющиеся человеком, такие как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мыши и крысы). В конкретных воплощениях, индивидуум или субъект представляет собой человека.
«Изолированное» антитело представляет собой таковое, отделенное от компонента его естественного окружения. В некоторых воплощениях, антитело очищают до свыше 95% или 99% чистоты, как определено, например, электрофоретически (например, ДСН-ПААГ-электрофорез, изоэлектрическое фокусирование (IEF), капиллярный электрофорез) или хроматографически (например, ионнообменная или обратнофазовая ВЭЖХ). Для обзора способов оценки чистоты антитела, см., например, Flatman, S., et al., J. Chrom. В 848 (2007) 79-87.
«Изолированная» нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, отделенной от компонента ее естественного окружения. Изолированная нуклеиновая кислота включает молекулу, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно и в участке хромосомы, отличном от ее естественного расположения.
«Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к биотину» относится к одной или более молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую и легкую цепи антитела (или их фрагменты, включая такую молекулу(ы) нуклеиновой кислоты в единственном векторе или в различных векторах и такая молекула(ы) нуклеиновой кислоты присутствует в одном или более участке в хозяйской клетке.
Термин «моноклональное антитело», как употреблено в данном документе относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. популяции, содержащей отдельные антитела, которые идентичны и/или связывают один и тотже эпитоп, исключая возможные варианты антител, например, содержащие естественные мутации или мутации, возникающие в течение продукции препарата моноклональных антител, такие варианты обычно присутствуют в минорных количествах. По сравнению с препаратами поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопы), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител специфично к единственной детерминанте на антигене. Таким образом, модификатор «моноклональное» означает характер антитела в качестве полученных из по существу гомогенной популяции антител, и не рассматриваются как требующие продукции антител каким-либо особым способом. Например, моноклональные антитела, подлежащие применению согласно настоящему изобретению, могут быть получены посредством ряда техник, включая, но не ограничено гибридомный способ, способы рекомбинантной ДНК, способы фагового отображения и способы с применением трансгенных животных, содержащие все или часть локусов иммуноглобулина человека, такие способы и другие примерные способы получения моноклональных антител описаны в данном документе.
«Голые антитела» относятся к антителу, которое не конъюгировано с гетерологичной группой (например, цитотоксичная группа) или радиоактивно меченной. Голое антитело может присутствовать в фармацевтическом препарате.
«Нативные антитела» относятся к молекулам иммунноглобулина естественного происхождения с различными структурами. Например, нативные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые дисульфидно связаны. От N- к С-концу, каждая тяжелая цепь имеет вариабельный участок (VH), также называемый тяжелым вариабельным доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, с последующими тремя константными доменами (СН1, СН2 и СН3). Аналогично, от N- к С-концу, каждая легкая цепь имеет вариабельный участок (VL), также называемый вариабельный легкий домен или вариабельный домен легкой цепи, с последующим константным легким доменом (CL). Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному или двум типам, называемым каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности его константного домена.
Термин «аннотация» употреблен в данном документе в отношении инструкций, обычно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию об обозначениях, применениях, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или опасности применения таких терапевтических продуктов.
«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» в отношении референсной полипептидной последовательности определяют в качестве процента аминокислотных остатков в интересующей последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в референсной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения пропусков, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности, и без рассмотрения каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения идентичности аминокислотной последовательности может быть проведено различными путями, известными специалистам в области техники, например, с применением общедоступного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST-2, ALIGN или программного обеспечения Megalign (DNASTAR). Специалисты в области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине последовательностей. Подлежащих сравнению. Для целей данного документа, однако значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают при помощи компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Авторские права на компьютерную программу ALIGN-2 принадлежат Genentech, Inc., и программный код зарегистрирован при помощи пользовательской документации в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован под U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Программа ALIGN-2 общедоступна от Genentech, Inc., South San Francisco, California, или может быть составлена при помощи программного кода. Программа ALIGN-2 должна быть составлена для применения на операционной системе UNIX, включая Digital UNIX V4.0D. все параметры сравнения последовательностей установлены программой ALIGN-2 и неизменны.
В ситуациях, когда ALIGN-2 применяют для сравнений аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотной последовательности заданной аминокислотной последовательности А по отношению к, с или против заданной аминокислотной последовательности В (которая альтернативно может быть сформулирована в качестве заданной аминокислотной последовательности А, которая обладает или включает определенный % идентичности аминокислотной последовательности в отношении к, с или против заданной аминокислотной последовательности В) вычисляют следующим образом:
100 × дробь X/Y
где X представляет собой число аминокислотных остатков, оцененное в качестве идентичных пар посредством программы для сравнения последовательностей ALIGN-2, в которой программное выравнивание А и В, и где Y представляет собой общее число аминокислотных остатков в B. Следует понимать, что в случае, когда длина аминокислотной последовательности А не эквивалентна длине аминокислотной последовательности В, % идентичности аминокислотной последовательности А к В не будет эквивалентен % идентичности аминокислотной последовательности В к А. Если специально не указано иное, все значения % идентичности аминокислотной последовательности, употребленные в данном документе, получены в качестве описанных в непосредственно предшествующем абзаце при помощи компьютерной программы ALIGN-2.
Термин «фармацевтический препарат» относится к препарату, который присутствует в форме, делающей биологическую активность, содержащегося в нем активного ингредиента эффективной, и который не содержит дополнительных компонентов, неприемлемо токсичных для субъекта, которому вводят препарат.
«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтическом препарате, другому нежели активный ингредиент, нетоксичный для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничен, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.
Термин «биотин», как употреблено в данном документе, означает 5-[(3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1Н-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил]пентановую кислоту. Биотин также известен как витамин H или коэнзим R.
Как употреблено в данном документе «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «лечение») относятся к клиническому вмешательству в попытке изменить естественное развитие индивидуума, подлежащего лечению, и может быть выполнено или для профилактики или в течение развития клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают, но не ограничены, предотвращение возникновения или рецидива заболевания, облегчение симптомов, уменьшение каких-либо прямых или непрямых патологических следствий заболевания, предотвращение метастазирования, снижение скорости прогресса заболевания, ослабление или временное улучшение состояния заболевания, и ремиссию или улучшенный прогноз. В некоторых воплощениях, антитела по изобретению применяют для приостановки развития заболевания или замедления прогресса заболевания.
Термин «вариабельный участок» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, вовлеченному в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, с каждым доменом, включающим четыре консервативных каркасных участка (FRs) и три гипервариабельных региона (HVRs). (См., например, Kindt, T.J., et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91). Одного VH или VL домена может быть достаточно для обеспечения антиген-связывающей специфичности. Более того, антитела, которые связывают конкретный антиген, могут быть изолированы при помощи VH или VL домена из антитела, связывающего антиген для скрининга библиотеки комплементарности VL или VH доменов, соответственно. См., например, Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628).
Термин «вектор», как употреблено в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной распространять другую аминокислоту, с которой связан. Термин включает вектор в качестве самореплицирующийся нуклеокислотной структуры, а также вектор, встроенный в геном хозяйской клетки, в которую он был введен. Определенные вектора способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие вектора относят в данном документе к «экспрессионным векторам».
Термин «гаптен» означает небольшую молекулу, которая может вызывать иммунный ответ только будучи прикрепленной к большому носителю, такому как белок. Примеры гаптенов представляют собой анилин, о-, m- и п-аминобензойную кислоту, хинон, гидралазин, галотан, флуоресцеин, биотин, дигоскигенин, теофиллин и динитрофенол. В одном воплощении гаптен представляет собой биотин или дигоксигенин или теофиллин или карборан.
Термин «гаптен, конъюгированный с» или «гаптенилированное соединение» означает гаптен, ковалентно связанный с дополнительной группой, такой как полипептид или метка. Активированные производные гаптена часто применяют в качестве исходных материалов для образования таких конъюгатов. В одном воплощении гаптен представляет собой дигоксигенин и конъюгирован (в одном воплощении через его 3-гидрокси группу) с группой через линкер. В одном воплощении линкер содержит а) один или более (в одном воплощении три-шесть) метилен-карбокси-метильных групп (-СН2-C(O)-), и/или b) от 1 до 10 (в одном воплощении от 1 до 5) аминокислотных остатков (в одном воплощении, выбранных из глицина, серина, глутамата, β-аланина, γ-аминобутировой кислоты, ε-аминокопроновой кислоты или лизина), и/или с) один или более (в одном воплощении один или два) соединения, обладающих структурной формулой NH2-[(CH2)nO]xCH2-CH2-COOH, в которой n представляет собой 2 или 3 и x представляет собой 1-10, в одном воплощении 1-7. Последний элемент дает (по меньшей мере частично) линкер (часть) формулы -ΝΗ-[(СН2)nO]хСН2-CH2-С(O)-. Одним из примеров такого соединения является, например, 12-амино-4,7,10-триоксадодекановая кислота (дает TEG (триэтиленгликолевый) линкер). В одном воплощении линкер дополнительно включает мальимидо группу. Линкер обладает стабилизирующим и солюбилизирующим эффектом, поскольку содержит заряды или/и может формировать водородные мостики. Кроме того, он может пространственно облегчать связывание антитела к гаптену с гаптен-конъюгированным полипептидом. В одном воплощении линкер локализован в боково цепи аминокислоты полипептида (например, конъюгирован с боковой цепью лизина или цистеина через амино или тиольную группу). В одном воплощении линкер локализован в амино конце или карбокси конце полипептида. Позицию линкера на полипептиде обычно выбирают в участке, не оказывающем влияние на биологическую активность полипептида. Поэтому позиция прикрепления линкера зависит от природы полипептида и соответствующих структурных элементов, которые ответственны за биологическую активность. Биологическаяя активность полипептида, к которому прикреплен гаптен, может быть протестирована в исследовании in vitro.
Термин «ковалентный комплексный препарат» означает, что после образования нековалентного комплекса, например, между антителом к теофиллину и теофиллином, образуется ковалентная связь между двумя партнерами в комплексе. Образование ковалентной связи происходит без необходимости добавления дополнительных реагентов.
II. Композиции и способы
В одном аспекте изобретение основано на антителах, которые связываются с биотином. Данные антитела предложены в данном документе. Антитела по изобретению полезны, например, в качестве моноспецифичных антител для связывания биотинилированных соединений и в качестве мультиспецифичных антител для диагностики и лечения всех типов заболеваний за счет специфичности связывания с биотинилированным соединением в качестве характеристики нагрузки антитела.
А. Примерные антитела к биотину
В одном аспекте, изобретение предлагает изолированные антитела, которые связываются с биотином. В конкретных воплощениях антитела к биотину представляют собой гуманизированные антитела. В конкретных воплощениях, антитела к биотину, как описано в данном документе, связываются с биотинилированными соединениями без интерференции с биологической активностью соединения, которое конъюгировано с биотином и специфично связывается антителом через биотиновый остаток. Поэтому эти антитела могут быть применены для улучшения фармакокинетических свойств соединений, конъюгированных с биотином (биотинилированное соединение), если (биотинилированное соединение), если антитело представляет собой моноспецифичное антитело. Также данные антитела могут быть применены для целевой доставки биотинилированного соединения, если антитело представляет собой би-или мультиспецифичное антитело, поскольку одна специфичность связывания направлена против биотина и может быть применена в качестве универсальной специфичности нагрузки, в связи с тем, что вторая специфичность связывания определенно связывается, например, с клеточной поверхностью молекулы и обеспечивает характеристику нацеливания/компонент би- или мультиспецифичному антителу.
В одном аспекте изобретение предлагает антитело к биотину, включающее по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVRs, выбранных из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02; (с) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:03; (d) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05; (е) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06; и (f) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07.
В одном аспекте изобретение предлагает антитело к биотину, включающее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три VH HVR последовательности, выбранные из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02; и (с) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03. В одном воплощении антитело включает HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03. В другом воплощении антитело включает HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03 и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07. В дополнительном воплощении антитело включает HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03, HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02. В дальнейшем воплощении антитело включает (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02; и (с) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03.
В другом аспекте изобретение предлагает антитело к биотину, включающее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три VL HVR последовательности, выбранные из (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05; (b) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06; и (с) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07. В одном воплощении антитело включает (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06; и (с) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07.
В другом аспекте антитело к биотину по изобретению включает (а) VH домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три VH HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01, (ii) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02, и (iii) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03; и (b) VL домен, включающий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три VL HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05, (ii) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06, и (с) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07.
В другом аспекте изобретение предлагает антитело к биотину, включающее (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02; (с) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03; (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05; (е) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06; и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 07.
В одном воплощении антитело к биотину является гуманизированным.
В одном аспекте, изобретение предлагает гуманизированное антитело к биотину, включающее по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVRs, выбранных из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; (с) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11; (d) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; (e) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и (f) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.
В одном аспекте изобретение предлагает гуманизированное антитело к биотину, включающее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три VH HVR последовательности, выбранные из (a) HVR-Н1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (с) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В одном воплощении антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В другом воплощении антитело включает HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. В дальнейшем воплощении антитело включает HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В дальнейшем воплощении антитело включает (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (с) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
В другом воплощении изобретение предлагает гуманизированное антитело к биотину, включающее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три VL HVR последовательности, выбранные из (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; (b) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и (с) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. В одном воплощении антитело включает (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и (с) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.
В другом аспекте антитело по изобретению включает (a) VH домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три VH HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09, (ii) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (iii) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; и (b) VL домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три VL HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (с) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательностью SEQ ID NO:15.
В другом аспекте изобретение предлагает гуманизированное антитело к биотину, включающее (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательностью SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; (с) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; (е) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15.
В другом аспекте изобретение предлагает гуманизированное антитело к биотину, включающее (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02; (с) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03; (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05; (е) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06; и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 07, где аминокислотный остаток в позиции 60 в HVR-H2 представляет собой А, и аминокислотный остаток в позиции 61 в HVR-H2 представляет собой Q.
Гуманизированное антитело к биотину включает в позиции Kabat 60 Айв позиции Kabat 61 Q. Эти изменения (прямая мутация) введены для повышения связующей способности гуманизированного антитела к биотину.
В одном воплощении гуманизированное антитело к биотину включает HVR как в любом из вышеупомянутых воплощений, и дополнительно включает акцепторный человеческий каркас, например, каркас иммунноглобулина человека или консенснусный каркас человека. В одном воплощении гуманизированное антитело к биотину включает VH, содержащий HVR-H как в любом из вышеупомянутых воплощений, и дополнительно включает один или более из следующих
- S в позиции 24, и/или
- Τ в позиции 73.
Позиция Kabat 24 соответствует остатку номер 24 SEQ ID NO: 04, 12 и 20.
Позиция Kabat 60 соответствует остатку номер 61 SEQ ID NO: 04, 12 и 20.
Позиция Kabat 61 соответствует остатку номер 62 SEQ ID NO: 04, 12 и 20.
Позиция Kabat 71 соответствует остатку номер 72 SEQ ID NO: 04, 12 и 20.
Данные изменения (прямые мутации) вводят для повышения связывающей способности гуманизированного антитела к биотину.
В другом аспекте антитело к биотину включает последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 04. В конкретных воплощениях VH последовательность, обладающая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью, включает замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референсной последовательности, но антитело к биотину, включающему такую последовательность, сохраняет способность связываться с биотином. В конкретных воплощениях, всего 1-10 аминокислот замещены, инсерцированы и/или делетированы в SEQ ID NO: 04. В конкретных воплощениях, замены, инсерции или делеции возникают в участках вне HVR (т.е. в FR). Возможно, антитело к биотину включает VH последовательность SEQ ID NO: 04, включая посттрансляционные модификации такой последовательности. В конкретном воплощении VH включает один, два или три HVR, выбранных из: (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01, (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02, и (с) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03.
В другом аспекте, предложено антитело к биотину, где антитело включает вариабельный домен легкой цепи (VL), последовательность которого по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 08. В конкретных воплощениях VL последовательность, обладающая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референсной последовательности, но антитело к биотину, включающее такую последовательность сохраняет способность связываться с биотином. В конкретных воплощениях, всего 1-10 аминокислот замещены, инсерцированы и/или делетированы, в SEQ ID NO: 08. В конкретных воплощениях замены, инсерции или делеции возникают в участках вне HVR (т.е. в FR). Возможно, антитело к биотину включает VL последовательность в SEQ ID NO: 08, включая посттрансляционные модификации такой последовательности. В конкретном воплощении VL включает один, два или три HVR, выбранных из (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05; (b) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06; и (с) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07.
В другом аспекте предложено антитело к биотину, где антитело включает VH как в любом из воплощений, предложенных выше, и VL как в любом из воплощений, предложенных выше. В одном воплощении, антитело включает VH- и VL-последовательности в SEQ ID NO: 04 и SEQ ID NO: 08, соответственно, включая посттрансляционные модификации таких последовательностей.
В другом аспекте гуманизированное антитело к биотину включает последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12. В конкретных воплощениях, последовательность VH, обладающая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичностью, включает замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референсной последовательности, но антитело к биотину, содержащее такую последовательность сохраняет способность связываться с биотином. В конкретных воплощениях все из 1-10 аминокислот замещены и/или делетированы в SEQ ID NO: 12. В определенных воплощениях замены, инсерции или делеции возникают в участках вне HVR (т.е. в FR). Возможно, антитело к биотину содержит последовательность VH в SEQ ID NO: 12, включая посттрансляционные модификации такой последовательности. В отдельном воплощении VH содержит один, два или три HVR, выбранных из: (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09, (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (с) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
В другом аспекте предложено гуманизированное антитело к биотину, где антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), обладающий последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16. В определенных воплощениях, последовательность VL, обладающая по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референсной последовательности, но антитело к биотину, содержащее такую последовательность, сохраняет способность связываться с биотином. В определенных воплощениях все из 1-10 аминокислот замещены, инсерцированы и/или делетированы в SEQ ID NO: 16. В определенных воплощениях замены, инсерции или делеции возникают в участках вне HVR (т.е. в FR). Возможно, антитело к биотину содержит последовательность VL в SEQ ID NO: 16, включая посттрансляционные модификации такой последовательности. В конкретном воплощении VL содержит один, два или три HVR, выбранных из (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; (b) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и (с) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.
В другом аспекте предложено гуманизированное антитело к биотину, где антитело выключает VH как в одном из воплощений предложенных выше, и VL как в любом из воплощений предложенных выше. В одном воплощении антитело содержит VH- и VL-последовательности в SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 16, соответственно, включая посттрансляционные модификации данных последовательностей.
В дальнейшем аспекте изобретения антитело к биотину согласно любому из вышеупомянутых воплощений представляет собой моноклональное антитело, включая химерное, гуманизированное или человеческое антитело. В одном воплощении антитело к биотину представляет собой фрагмент антитела, например, Fv, Fab, Fab', scFv, диантитело или фрагмент F(ab')2. В другом воплощении антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, интактное антитело IgG1 или IgG4 или антитело другого класса или изотипа как определено в данном документе.
В дальнейшем аспекте антитело к биотину согласно любому из вышеупомянутых воплощений может включать черты, одни или в сочетании, как описано в разделах 1-5 ниже:
1. Аффинность антитела
В определенных воплощениях предложенное в данном документе антитело обладает константой диссоциации (Kd) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10-8 M или менее, например, от 10-8 ММ до 10-13 М, например, от 10-9 M до 10-13 М).
В одном воплощении Kd измеряют посредством исследования с радиоактивно меченным антигеном (RIA), выполненном при помощи Fab варианта интересующего антитела и его антитела, как описано посредством следующего исследования. Аффинность связывания раствора FAB для антигена измеряют за счет уравновешивания Fab с минимальной концентрацией (125I)-меченого антигена в присутствии серии титрования немеченного антигена, затем связывания антигена с планшетом, покрытым антителом к Fab (см., например, Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Для установления условий испытания, MICROTITER® многолуночные планшеты (Thermo Scientific) покрывают в течение ночи 5 мкг/мл захватывающего антитела к Fab (Cappel Labs) в 50 мМ карбонате натрия (рН 9,6), и последующим блокированием при помощи 2% (м/о) бычьего сывороточного альбумина в PBS в течение от двух до пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°C). В неадсорбционном планшете (Nunc #269620), 100 пкМ или 26 пкМ [125I]-антиген смешивают с серийными разведениями интересующих Fab (например, в соответствии с оценкой антитела к ФРЭС, Fab-12, в Presta, L.G., et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599). Интересующий Fab затем инкубируют в течение ночи; однако, инкубация может продолжаться в течение более длительного периода (например, приблизительно 65 часов) до достижения равновесия. Затем, смеси переносят в захватывающий планшет для инкубации при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем раствор удаляют, и планшет промывают восемь раз 0,1% полисорбатом 20 (TWEEN-20®) в PBS. При высушивании планшетов, добавляют 150 мкл/лунку сцинтиллятора (MICROSCINT-20™; Packard) и планшеты подсчитывают на счетчике гамма-излучения TOPCOUNT™ (Packard) в течение десяти минут.Концентрации каждого Fab, дающие менее или эквивалентные 20% максимального связывания выбирают для применения в конкурентно-связывающем анализе.
Согласно другому воплощению, Kd измеряют при помощи поверхностного плазмонного резонанса при помощи BIACORE®-2000 или BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C при помощи СМ5 чипов с иммобилизованными антигенами при ~10 единицах ответа (ЕО). Вкратце, карбоксиметилированные декстрановые биосенсорные чипы (СМ5, BIACORE, Inc.) активируют N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид гидрохлоридом (ЭДХ) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) согласно прилагаемой инструкции. Антиген разбавляют 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инъекцией со скоростью тока 5 мкл/мин для достижения приблизительно 10 единиц ответа (ЕО) сопряженного белка. Вслед за инъекцией антигена 1 M этаноламин вводят, чтобы заблокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения Fab (0,78 нМ -500 нМ) инъецируют в PBS с поверхностно-активным веществом 0,05% полисорбатом 20 (TWEEN-20™) (PBST) при 25°C со скоростью тока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (kon) и скорости диссоциации (koff) вычисляют при помощи простой модели связывания Лэнгмюра «один к одному» (BIACORE® Evaluation Software version 3.2) за счет одновременной подгонки сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) вычисляют в качестве соотношения koff/kon. См., например, Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881. Если скорость ассоциации превышает 106 M-1 сек-1 посредством вышеупомянутого поверхностного плазмонного резонанса, то скорость диссоциации может быть определена при помощи техники флуоресцентного тушения, которая измеряет увеличение или уменьшение интенсивности испускания флуоресценции (возбуждение = 295 нм; испускание = 340 нм, 16 нм полоса пропускания) при 25°C 20 нМ антитело к антигену (Fab форма) в PBS, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена измеряют на спектрофотометре, таком как оборудованный останавливаемой струей спектрофотометр (Aviv Instruments) или спектрофотометре серий 8000 SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) со встряхиваемой кюветой.
2. Фрагменты антитела
В определенных воплощениях, антитело, предложенное в данном документе, представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антитела включают, но не ограничены, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, и scFv фрагменты и другие фрагменты, описанные ниже. Для обзора конкретных фрагментов антител см. Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Для обзора scFv-фрагментов см., например, Plueckthun, Α., In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp.269-315; также см. WO 93/16185; и US 5,571,894 и US 5,587,458. Для обсуждения Fab- и F(ab')2-фрагментов, содержащих остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации и имеющие увеличенное время полужизни in vivo, смотри US 5,869,046.
Диантитела представляют собой фрагменты антител с двумя антиген-связывающими сайтами, которые могут быть бивалентны или биспецифичны. См., например, ЕР 0404097; WO 1993/01161; Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; и Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. Триантитела и тетраантитела также описаны в Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134).
Антитела с одним доменом представляют собой фрагменты антител, включающие весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В конкретных воплощениях, антитело с одним доменом представляет собой человеческое антитело с одним доменом (Domantis, Inc., Waltham, MA; см., например, US 6,248,516 В1).
Фрагменты антител могут быть получены различными способами, включая, но не ограничено, протеолиз интактного антитела, а также продукцию рекомбинантными хозяйскими клетками (например, Е. coli или фаг), как описано в данном документе.
3. Химерные и гуманизированные антитела
В конкретных воплощениях, антитело, предложенное в данном документе, представляет собой химерное антитело. Конкретные химерные антитела описаны, например, в US 4,816,567; и Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). В одном примере химерное антитело включает нечеловеческий вариабельный участок (например, вариабельный участок, полученный от мыши, крысы, хомяка, кролика или примата, не являющегося человеком, такого как обезьяна) и человеческий константный участок. В дальнейшем примере, химерное антитело представляет собой антитело с переключением классов, в котором класс или подкласс отличен от такового родительского антитела. Химерные антитела включают их антиген-связывающие фрагменты.
В конкретных воплощениях химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Обычно, нечеловеческое антитело гуманизируют для уменьшения иммуногенности к человеку, в тоже время сохраняя специфичность и аффинность родительского нечеловеческого антитела. В целом, гуманизированное антитело включает один или более вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR, (или их части) получают из нечеловеческого антитела, и FR (или их части) получают из последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело возможно также включает по меньшей мере часть человеческого константного участка. В некоторых воплощениях, некоторые FR-остатки в гуманизированном антителе замещены соответствующими остатками нечеловеческого антитела (например, антитело, из которого получают HVR-остатки), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.
Гуманизированные антитела и способы их получения описаны, например, в Almagro, J.С. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, и в дальнейшем описаны, например, в Riechmann, I., et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, С, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5,821,337; US 7,527,791; US 6,982,321; US 7,087,409; Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34 (описывающий SDR (a-CDR)-графтинг); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (описывающий "изменение поверхности"); Dall'Acqua, W.F., et al., Methods 36 (2005) 43-60 (описывающий "FR-перетасовку"); and Osbourn, J., et al., Methods 36 (2005) 61-68 и Klimka, Α., et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (описывающий подход "направленной селекции" для FR-перетасовки).
Человеческие каркасные участки, которые могут быть применены для гуманизации, включают, но не ограничены: каркасные участки, выбранные при помощи способа «максимального соответствия» (см., например, Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; каркасные участки, полученные из консенснусной последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепи человеческих антител особой подгруппы (см., например, Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; и Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); человеческие зрелые (соматически мутированные) каркасные участки или человеческие зародышевые каркасные участки (см., например, Almagro, J.С. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); и каркасные участки, полученные из скрининга FR-библиотек (см., например, Baca, M., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 и Rosok, M.J., et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618).
4. Мультиспецифичные антитела
В конкретных воплощениях антитело, предложенное в данном документе, представляет собой мультиспецифичное антитело, например, биспецифичное антитело. Мультиспецифичные антитела представляют собой моноклональные антитела, обладающие специфичностью связывания для по меньшей мере двух различных участков. В конкретных воплощениях, одна из специфичностей связывания представляет собой связывание с биотином и другая представляет собой связывание с любым другим антигеном. В конкретных воплощениях, биспецифичные антитела могут связываться с двумя различными эпитопами биотина. Биспецифичные антитела также могут быть применены для локализации цитотоксических агентов на клетках, экспрессирующих биотин. Биспецифичные антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.
Способы получения мультиспецифичных антител включают, но не ограничены, рекомбинантную соэкспрессию двух пар тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, обладающих различными специфичностями (см., например, Milstein, С. and Cuello, А.С., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, и Traunecker, Α., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), и "knob-in-hole" инженирование (см., например, US 5,731,168). Мультиспецифичные антитела также могут быть получены посредством конструирования с использованием эффекта электростатического взаимодействия для получения Fc-гетеродимерных молекул антитела (WO 2009/089004); перекрестное связывание двух или более антител или фрагментов (см., например, US 4,676,980, и Brennan, M., et al., Science 229 (1985) 81-83); при помощи «лециновых» молний для получения биспецифичных антител (см., например, Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; при помощи технологии «диантитела» для получения фрагментов биспецифичных антител (см., например, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); и при помощи одноцепочечных Fv (sFv) димеров (см., например, Gruber, M., et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); и получения триспецифичных антител, как описано, например, в Tutt, Α., et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).
Сконструированные антитела с тремя или более функциональными антигенсвязывающими сайтами, включая «антитела-осьминоги» также включены в данный документ (см., например, US 2006/0025576).
Антитело или фрагмент в данном документе также включает «Fab двойного действия» или «DAF», включающий антиген связывающий сайт, который связывается с биотином. А также с другим отличным антигеном (см., например, US 2008/0069820).
Антитело или фрагмент в данном документе также включает мультиспецифичные антитела, описанные в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2010/145793.
5. Варианты антител
В конкретных воплощениях предусмотрены варианты аминокислотной последовательности антител, предложенных в данном документе. Например, может быть желательно улучшить аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела могут быть получены посредством введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или посредством пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или инсерции и/или замены остатков внутри аминокислотной последовательности антитела. Любые комбинации делеции, инсерции и замены могут быть получены для получения конечного конструкта, при условии, что конечный конструкт обладает желаемыми характеристиками, например, антиген-связывающей.
а) Варианты замен, инсерций и делеций
В конкретных воплощениях предложены варианты антител, обладающие одной или более аминокислотными заменами. Интересующие участки для замещающего мутагенеза включают HVR и FR. Консервативные замены приведены в таблице 1 под заголовком «предпочтительные замены». Более существенные изменения приведены в таблице 1 под заголовком «типичные замены» и в виде в дальнейшем описанных ниже в соответствии с классами аминокислотной боковой цепи. Аминокислотные замены могут быть введены в интересующее антитело, и продукты скринируют на предмет желаемой активности, например, сохраненного/улучшенного связывания с антигеном, сниженной иммуногенности или улучшенной ADCC или CDC.
Figure 00000001
Аминокислоты могут быть сгруппированы согласно общим свойствам боковой цепи:
(1) гидрофобность: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральная гидрофильность: Gys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) кислотность: Asp, Glu;
(4) основность: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматичность: Trp, Tyr, Phe.
Неконсервативные замены приводят к замене члена одного из данных классов на другой класс.
Один тип замещающего варианта включает замещение одного или более остатка гипервариабельного участка родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Обычно конечный вариант(ы), выбранный для дальнейшего исследования, будет иметь модификации (например, улучшения) в определенных биологических свойствах (например, повышенную аффинность, сниженную иммуногенность) относительно родительского антитела и/или у них по существу будут сохранены определенные биологические свойства родительского антитела. Типичные замещающие варианты представляют собой антитело с созревшей аффинностью, которое может быть удобно получено при помощи способов созревания аффинности, основанных на фаговом дисплее, таких как описанные в данном документе. Вкратце один или более HVR остатков мутированы и вариантные антитела, фаг-представлены и их скринируют в отношении конкретной биологической активности (например, аффинности связывания).
Изменения (например, замены) могут быть внесены в HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Такие изменения могут быть внесены в HVR «горячие точки», т.е. остатки, кодируемые кодонами, которые подвержены мутациям с высокой частотой в течение соматического процесса созревания (см., например, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), и/или SDRs (a-CDRs), с конечным вариантом VH или VL, тестируемыми на аффинность связывания. Созревание аффинности за счет конструирования и реселекции из вторичных библиотек описано, например, в Hoogenboom, H.R., et al. in Methods в Molecular Biology 178 (2002) 1-37. В некоторых воплощениях созревания аффинности, разнообразие вносят в вариабельные гены, выбранные для созревания посредством любого из ряда способов (например, ПЦР с внесением ошибок, перетасовка цепи, или олигонуклеотид-направленный мутагенез). Затем создают вторичную библиотеку. Затем библиотеку скринируют для идентификации любых вариантов антител с желаемой аффинностью. Другой способ введения разнообразия включает HVR-направленные подходы. В которых некоторые остатки HVR (например, 4-6 остатки) рандомизированы. HVR остатки, включенные в антигенное связывание могут быть специально идентифицированы, например, при помощи сканирующего аланином мутагенеза или моделирования. CDR-H3 и CDR-L3 в частности часто служат мишенями.
В определенных воплощениях, замены, инсерции или делеции могут возникать внутри одного или более HVR, поскольку такие изменения существенно не снижают способность антитела связывать антиген. Например, консервативные изменения (например, консервативные замены, как предложено в данном документе), которые существенно не снижают аффинность связывания, могут быть внесены в HVR. Такие изменения могут быть вне HVR «горячих точек» SDR. В определенных воплощениях вариант VH- и VL-последовательностей, предложенных выше, каждый HVR или не изменен или содержит не более чем одну, две или три аминокислотные замены.
Полезный способ для идентификации остатков или участков антитела, которые могут быть мишенью для мутагенеза, называют «сканирующий аланином мутагенез», как описано Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. В данном способе остаток или группу мишенных остатков (например, заряженные остатки такие как arg, asp, his, lys и glu) идентифицируют и замещают нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланин или полиаланин) для определения будет ли это влиять на взаимодействие антитела с антигеном. Дальнейшие замены могут быть внесены в позиции аминокислот, демонстрирующие функциональную чувствительность к начальным заменам. Альтернативно или дополнительно в кристаллической структуре комплекса антиген-антитело идентифицируют точки контакта между антителом и антигеном. Такие остатки в местах контакта или соседние остатки могут быть мишенями или быть элиминированы в качестве кандидатов для замещения. Варианты могут быть скринированы для определения будут ли они иметь желаемые свойства.
Инсерции в аминокислотной последовательности включают слияния на амино- и/или карбоксил-терминальном конце, варьирующие в длину от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также инсерции внутри последовательности единичных или мультиаминокислотных остатков. Примеры терминальных инсерций включают антитело с N-терминальным остатком метионила. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние N- или С-конца антитела с ферментом (например, для ADEPT) или полипептидом, который повышает период полужизни антитела в сыворотке.
Один предпочтительный вариант представляет собой единичный цистеиновый вариант, где аминокислотный остаток в позиции 53 согласно Kabat в вариабельном домене тяжелой цепи, представляет собой цистеин.
b) варианты гликозилирования
В определенных воплощениях антитело, предложенное в данном документе, изменяют для увеличения или уменьшения степени гликозилирования антитела. Добавление или делеция сайтов гликозилирования к антителу могут быть обычно выполнены за счет изменения аминокислотной последовательности, такой что один или более сайтов гликозилирования создают или удаляют.
В случае, если антитело включает Fc-участок, углеводород, прикрепленный к нему может быть изменен. Нативные антитела, продуцированные клетками млекопитающих, обычно включают разветвленный биантенарный олигосахарид, который обычно прикреплен посредством N-связи к Asn297 СН2-домена Fc-участка. См., например, Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32. Олигосахарид может включать различные углеводороды, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу, и сиаловую кислоту, а также фукозу, прикрепленную к GlcNAc в «стволе» биантенарной олигосахаридной структуры. В некоторых воплощениях модификации олигосахарида в антителе по изобретению могут быть сделаны с целью создания вариантов антитела с определенными улучшенными свойствами.
В одном воплощении предложены варианты антител, имеющие углеводородную структуру, которая утратила фукозу, прикрепленную (непосредственно или опосредованно) к Fc-участку. Например, количество фукозы в таком антител может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество фукозы определяют посредством вычисления среднего количества фукозы внутри сахарной цепи при Asn297, относительно суммы всех гл и костру ктур, прикрепленных к Asn 297 (например, комплексные, гибридные и высоко маннозные структуры) как измерено посредством MALDI-TOF масс-спектрометрии, как описано в WO 2008/077546, например. Asn297 относится к остатку аспарагина, локализованному в позиции приблизительно 297 в Fc-участке (EU нумерация остатков Fc-участка); однако Asn297 также может быть локализован приблизительно ±3 аминокислоты выше или ниже позиции 297, т.е. между позициями 294 и 300, из-за минорных вариаций последовательности в антителах. Такие варианты фукозилирования могут обладать улучшенной ADCC функцией. См., например, US 2003/0157108; US 2004/0093621. Примеры публикаций, связанные с «дефукозилированными» или «фукозодефицитными» вариантами антитела включают: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, Α., et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, Ν., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Примеры клеточных линий, способных продуцировать дефукозилированные антитела, включают Lec13 СНО клетки, дефицитные по фукозилированию белков (Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; и WO 2004/056312, в частности при примере 11), и нокаутные клеточные линии, такие как клетки СНО, нокаутные по гену альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki, Ν., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; и WO 2003/085107).
Варианты антител в дальнейшем предложены с бисекционными олигосахаридами, например, в которых биантенарный олигосахарид, прикрепленный к Fc-участку антитела, разделен напополам посредством GlcNAc. Такие варианты антител могут быть менее фукозилированы и/или обладать улучшенной ADCC функцией. Примеры таких вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878; US 6,602,684; и US 2005/0123546. Также предложены варианты антител с по меньше мере одним остатком галактозы в олигосахариде, прикрепленном к Fc-участку. Такие варианты антител могут обладать улучшенной CDC функцией. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087; WO 1998/58964; и WO 1999/22764.
с) варианты Fc-участка
В определенных воплощениях, одна или более аминокислотных модификаций могут быть введены в Fc-участок антитела, предложенного в данном документе, таким образом, получая вариант Fc-участка. Вариант Fc-участка может включать последовательность Fc-участка человека (например, Fc-участок IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), включающая аминокислотную модификацию (например, замену) в одной или более позиций аминокислот.
В определенных воплощениях изобретение предполагает вариант антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, которые делают его желательным кандидатом для применений, в которых период полужизни антитела in vivo является важным, а определенные эффекторные функции (такие как взаимодествие с системой комплемента и ADCC) являются лишними или вредными. In vitro и/или in vivo исследования цитотоксичности могут быть выполнены для подтверждения снижения/истощения CDC и/или ADCC активностей. Например, исследование связывания Fc-рецептора (FcR) может быть выполнено для уверенности в том, что антитело утратило FcγR связывание (таким образом, подобно утрате ADCC активности), но сохранило FcRn связующую способность. Первичные для опосредования ADCC клетки, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в свою очередь моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. FcR экспрессия на гематопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на странице 464 Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Неограничивающий пример in vitro исследований для оценки ADCC активности интересующей молекулы описан в US 5,500,362 (см, например, Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; и Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); US 5,821,337 (см., Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). Альтернативно могут быть применены способы нерадиоактивного исследования (см., например, ACTI™ нерадиоактивное исследование цитотоксичности для проточной цитометрии (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; и CytoTox 96® нерадиоактивное исследование цитотоксичности (Promega, Madison, WI). Полезные эффекторные клетки для таких исследований включают мононуклеарные клетки переферической крови (МКПК) и клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно ADCC активность интересующей молекулы может быть оценена in vivo, например, в животной модели, такой как раскрыта в Clynes, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. C1q исследования связывания также могут быть проведены для подтверждения того, что антитело не способно связываться с C1q и таким образом утратило CDC активность. См., например, C1q и С3с связывание ELISA в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента CDC может быть выполнено исследование (см., например, Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; и Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). FcRn-связывание и in vivo определения клиренса/периода полужизни также могут быть выполнены при помощи способов известных в области техники (см., например, Petkova, S.В., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769).
Антитела со сниженной эффекторной функцией включают таковые с заменами одного или более остатков Fc-участка 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (US 6,737,056). Такие Fc-мутантны включают Fc-мутанты с заменами в двух или более аминокислотных позициях 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый "DANA" Fc-мутант с заменой остатков 265 и 297 на аланин (US 7,332,581).
Определенные варианты антител с улучшенным или уменьшенным связыванием с FcRs описаны, (см, например, US 6,737,056; WO 2004/056312 и Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).
В конкретных воплощениях вариант антитела включает Fc-участок с одной или более аминокислотными заменами, которые улучшают ADCC, например, замены в позициях 298, 333 и 334 Fc-участка (EU нумерация остатков).
В некоторых воплощениях изменения введены в Fc-участок, что приводит к измененному (т.е. или улучшенному или уменьшенному) C1q связыванию и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в US 6,194,551, WO 99/51642, и Idusogie, Ε.Ε., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.
Антитела с повышенными периодами полужизни и улучшенным связыванием с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), ответственным за перенос материнских IgG к зародышу (Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, and Kim, J.K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), описаны в US 2005/0014934. Данные антитела включают Fc-участок с одной или более заменами, которые в данном случае улучшают связывание Fc-участка с FcRn. Такие Fc-варианты включают таковые с заменами одного или более остатков Fc-участка: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, остатка 434 Fc-участка (US 7,371,826).
См., также Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; и WO 94/29351, описывающих другие примеры вариантов Fc-участка.
d) варианты антитела сконструированных с цистеином
В определенных воплощениях может быть желательно создать антитела сконструированные с цистеином, например, «thioMAbs», в которых один ли более остаток антитела замещен остатками цистеина. В отдельных воплощениях замещенные остатки возникают в доступных сайтах антитела. Посредством замещения данных остатков цистеином реактивные тиольные группы таким образом расположены в доступных сайтах антитела и могут быть применены для конъюгирования антитела с другими группами, такими как лекарственные группы или линкерные группы лекарственного средства, для создания иммунноконъюгата, как описано далее в данном документе. В определенных воплощениях любой один или более из следующих остатков может быть замещен цистеином: V205 (Kabat нумерация) легкой цепи; А118 (EU нумерация) тяжелой цепи; и S400 (EU нумерация) тяжелой цепи Fc-участка. Антитела сконструированные с цистеином, могут быть получены как описано, например, в US 7,521,541.
е) Производные антител
В определенных воплощениях антитело, предложенное в данном документе, может быть в дальнейшем модифицировано для включения дополнительных небелковых групп, известных в области техники и общедоступных. Группы для дериватизации антитела включают, но не ограничены, водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, но не ограничены, полиэтилен гликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (или гомополимеры или случайные сополимеры), и декстран или поли(н-винил пирролидон)полиэтиленгликоль, пропропиленгликолевые гомополимеры, сополимеры полипропилен оксида и этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерол), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликоль пропиональдегид может обладать преимуществами при производстве из-за их стабильности в воде. Полимер может быть любой молекулярной массы и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, прикрепленных к антителу, может варьировать и в случае, если прикреплен более чем один полимер, они могут представлять собой одинаковые или различные молекулы. Обычно, число и/или тип полимеров, применяемых для дериватизации, может быть определено на основании рассмотрения, включая, но не ограничено, отдельные свойства или функции антитела, которые должны быть улучшены, в случае если производное антитела будут применять в терапии при определенных условиях и т.д.
В другом воплощении предложены конъюгаты антитела и небелковой группы, которые могут быть селективно нагреты за счет подвергания излучению. В одном воплощении небелковая группа представляет собой углеродную нанотрубку (Kam, N.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). Излучение может быть любой длиной волны и включает, но не ограничено, длины волн, которые не причиняют вреда обычным клеткам, но которые нагревают небелковую группу до температуры, при которой клетки близкие к антителу-небелковой группе погибают.
В. Рекомбинантные способы и композиции
Антитела могут быть получены при помощи рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в US 4,816,567. В одном воплощении, предложена изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к биотину, описанное в данном документе. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, включающую VL и/или аминокислотную последовательность, включающую VH антитела (например, легкие и/или тяжелые цепи антитела). В дальнейшем воплощении предложены один или более векторов (например, экспрессионные вектора), включающие такую нуклеиновую кислоту. В дальнейшем воплощении предложена хозяйская клетка, включающая такую нуклеиновую кислоту. В одном таком воплощении хозяйская клетка включает (например, трансформированная при помощи): (1) вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, включающую VL антитела и аминокислотную последовательность, включающую VH антитела, или (2) первый вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, включающую VL антитела и второй вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, включающую VH антитела. В одном воплощении хозяйская клетка является эукариотической, например, клеткой яичника китайского хомячка (CHO) или лимфоидная клетка (пример, клетка Y0, NS0, Sp20). В одном воплощении предложен способ получения антитела к биотину, где способ включает культивирование хозяйской клетки, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, как предложено выше, при условиях приемлемых для экспрессии антитела, и возможно, при условиях приемлемых для экспрессии антитела, и возможно восстановление антитела из хозяйской клетки (или культуральной среды хозяйской клетки).
Для рекомбинантной продукции антитела к биотину, нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, как описано выше, изолируют и встраивают в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в хозяйской клетке. Такая нуклеиновая кислота может быть быстро изолирована и секвенирована при помощи обычных способов (например, при помощи олигонуклеотидных проб, способных специфично связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела).
Приемлемые хозяйские клетки для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают прокариотические или эукариотические клетки, описанные в данном документе. Например, антитела могут быть получены в бактериях, в частности, когда нет необходимости в гликозилировании и Fc-эффекторной функции. Для экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях, см., например, US 5,648,237, US 5,789,199 и US 5,840,523. (См., также Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol.248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp.245-254, описывающий экспрессию фрагментов антитела в Ε. coll.). После экспрессии антитело изолируют из бактериальной клеточной массы в растворимую фракцию и в дальнейшем оно может быть очищено.
В дополнение к прокариотам эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи приемлемы в качестве хозяев для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включая штаммы грибов и дрожжей, чьи пути гликозилирования «гуманизированы», что приводит к продукции антитела с частично или полностью человеческим паттерном гликозилирования. См. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; и Li, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.
Приемлемые хозяйские клетки для экспрессии гликозилированного антитела также получают из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Идентифицировано множество бакуловирусных штаммов, которые могут быть применены вместе с клетками насекомых, в частности для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
В качестве хозяев также могут быть применены культуры растительных клеток. См., например, US 5,959,177; US 6,040,498; US 6,420,548; US 7,125,978; US 6,417,429 (описывающие PLANTIBODIES™ технологию получения антител в трансгенных растениях).
Клетки позвоночных также могут быть использованы в качестве хозяев. Например, могут быть полезны клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы к росту в суспензии. Другие примеры полезных хозяйских клеточных линий млекопитающих представляют собой линию почки мартышки CV1, трансформированную SV40 (COS-7); линию почки человеческого эмбриона (293 или 293 клетки как описано, например в Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); клетки почки новорожденного хомячка (ВНК); клетки Сертолли мыши (ТМ4 клетки как описано, например, в Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки Африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени серой крысы (BRL 3А); клетки легких человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); опухоль молочной железы мыши (ММТ 060562); TRI клетки, как описано, например, в Mather, J.P., et al., Annals Ν.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; MRC 5 клетки; и FS4 клетки. Другие приемлемые хозяйские клеточные линии млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая DHFR- СНО клетки (Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Для обзора конкретных хозяйских клеточных линий млекопитающих, приемлемых для продукции антитела, см. например, Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol.248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp.255-268.
С. Исследования
Антитела к биотину, предложенные в данном документе, могут быть идентифицированы, скринированы или охарактеризованы в отношении их физико-химических свойств и/или биологических активностей различными анализами, известными в области техники.
Анализ связывания и другие анализы
В одном аспекте антитело по изобретению тестируют в отношении его антигенсвязывающей активности. Например, при помощи известных способов, таких как ELISA, Вестерн-блот и т.д.
В другом аспекте конкурентные анализы применяли для идентификации антитела, которое конкурирует с антителами, как описано в данном документе для связывания с биотином.
В типичном конкурентном анализе иммобилизованный биотин инкубируют в растворе, включающем первое меченное антитело, которое связывается с биотином, и второе немеченное антитело, которое подлежит тестированию в отношении его способности конкурировать с первым антителом для связывания с биотином. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридома. В качестве контроля иммобилизованный биотин инкубируют в растворе, включающем первое меченое антитело, но не второе меченое антитело. После инкубации при условиях благоприятных для связывания первого антитела с биотином, излишек несвязавшегося антитела удаляют, и измеряют количество метки, ассоциированной с иммобилизованным биотином. Если количество метки, ассоциированной с иммобилизованным существенно снижено в тестируемом образце относительно контрольного образца, это указывает, что второе антитело является конкурирующим с первым антителом за связывание с биотином. См., Harlow, Ε. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988).
D. Иммуноконъюгаты
Изобретение также предлагает иммунноконъюгаты, включающие антитело к биотину в данном документе конъюгированное с одним или более цитотоксическими агентами, такими как хемотерапевтические агенты или лекарственные средства, агенты, ингибирующие рост, токсины (например, белковые токсины, ферментативноактивные токсины бактерий, грибов, растений или животных или их фрагмменты) или радиоактивные изотопы.
В одном воплощении иммунноконъюгат представляет собой конъюгат антитела и лекарственного средства (ADC), в котором антитело конъюгировано с одним или более лекарственными средствами, включая, но не ограничено, майтанзиноид (см. US 5,208,020, US 5,416,064 и ЕР 0425235 В1); ауристатин, такой как лекарственные группы монометил ауристатина DE и DF (ММАЕ и MMAF) (см. US 5,635,483, US 5,780,588 и US 7,498,298); доластатин; калихимицин или его производное (см. US 5,712,374, US 5,714,586, US 5,739,116, US 5,767,285, US 5,770,701, US 5,770,710, US 5,773,001 и US 5,877,296; Hinman, L.M., et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; и Lode, H.N., et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928); антрациклин, такой как дауномицин или доксорубицин (см. Kratz, F., et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y., et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, Α., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M., et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D., et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343; и US 6,630,579); метотрексат; виндезин; таксан, такой как доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тезетаксел и ортатаксел; трихотецин; и СС1065.
В другом воплощении иммунноконъюгат включает антитело, как описано в данном документе, конъюгированном с ферментативно активным токсином или его фрагментом, включая, но не ограничено А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, A-цепь экзотоксина (от Pseudomonas aeruginosa), A-цепь рицина, A-цепь абрина, A-цепь модессина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновый белок, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин и трикотецены.
В другом воплощении иммуноконъюгат включает антитело, как описано в данном документе, конъюгированное с радиоактивным атомом для образования радиоконъюгата. Ряд радиоактивных изотопов доступен для получения радиоконъюгатов. Примеры включают At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu. В случае применения радиоконъюгата для детекции, он может включать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, TC99m или I123, или спиновую метку для ядерномагнитного резонансного исследования (ЯМР) (также известного как магнитно-резонансое исследование, МРИ), такую как йод-123, йод-131, йод-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
Конъюгаты антитела и цитотоксического агента могут быть получены при помощи ряда бифункциональных белок связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио) пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (таких как диметил адипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидил суберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо соединения (такие как бис (п-азидобензоил) гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол 2,6-диизоцианат), и биоактивные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, рициновый иммунотоксин может быть получен как описано в Vitetta, E.S., et al., Science 238 (1987) 1098-1104. Углерод-14-меченая 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилен триамин пентауксусная кислота (MX-DTPA) является типичным хелатирующим агентом для конъюгации радионуклеотида с антителом. См. WO 94/11026. Линкер может представлять собой «расщепляемый линкер», способствующий высвобождению лекарственного средства в клетке. Например, может быть применен кислотолабильный линкер, пептидазочувствительный линкер, фотолабильный линкер, диметильный линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari, R.V., et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; US 5,208,020).
Иммуноконъюгаты или ADC в данном документе явно предполагаются, но не ограничены такими конъюгатами, полученными при помощи перекрестно-сшивающих реагентов, включая но не ограничено BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC, и сульфо-SMPB, и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые коммерчески доступны (например, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A).
Ε. Способы и композиции для диагностики и детекции
Термин «детектирование» как употреблено в данном документе охватывает качественную или количественную детекцию.
В одном воплощении предложено антитело к биотину для применения в способе диагностики или детекции. Такой способ может представлять собой способ in vitro или in vivo.
В определенных воплощениях предложены меченые антитела к биотину. Метки включают, но не ограничены, метки и группы, которые непосредственно детектируют (такие как флуоресцентные, хромофорные, электроноплотные, хемилюминисцентные и радиоактивные метки), а также группы, такие как ферменты или лиганды, которые детектируют опосредовано, например, посредством ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия. Типичные метки включают, но не ограничены, радиоизотопы 32Р, 14С, 125I, 3Н и 131I, флуорофоры, такие как редкоземельные хелаты или флуоресцеин и их производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люцефиразы, например, люцифераза светлячков (US 4,737,456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфотаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, сахаридоксидазы, например, глюкооксидаза, галактооксидаза и глюко-6-фосфат дегидрогеназа, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантиноксидаза, соединенные с ферментом, который использует пероксид водорода для оксиления предшественника красителя, такого как HRP, лактопероксидаза, или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы и т.п.
F. Фармацевтические препараты
Фармацевтические препараты антитела к биотину, как описано в данном документе, получают посредством смешивания такого антитела, имеющего желаемую степень чистоты с одним или более фармацевтически приемлемых носителей (Osol, A. (ed.) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980)), в виде лиофилизированных препаратов или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители обычно нетоксичны для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях, и включают, но не ограничены: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецил диметилбензил аммония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкильные парабены, такие как метил или пропил парабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и m-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (менее чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поли(винилпирролидон); аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводороды, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннитол, трегалоза или сорбитол; солеобразующиие противоионы, тайке как натрий; комплексы металлы (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Типичные фармацевтически приемлемые носители в данном окументе в дальнейшем включают агенты для диспергирвоания лекарственного средства в межклеточном пространстве, такие как растворимые нейтрально-активные гиалуронидазные гликопротеины (sHASEGP), например, человеческие растворимые РН-20 гиалуронидазные гликопротеины, такие как rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Конкретные типичные sHASEGPs и способы применения, включая rhuPH20, описаны в US 2005/0260186 и US 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP комбинируют с одним или более дополнительными глюкозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.
Типичные лиофилизированные препараты антитела описаны в US 6,267,958. Водные препараты антител включают таковые описанные в US 6,171,586 и WO 2006/044908, последние препараты, включающие гистидин-ацетатный буфер.
В данном документе препарат также может включать более чем один активный ингредиент в зависимости от необходимого для конкретного симптома, подлежащего лечению, предпочтительно таковой с комплементарными активностями, которые отрицательно не влияют друг на друга. Например, это может быть желательно для дальнейшего предложения [[список лекарственных средств, которые могут быть скомбинированы с антителом к биотину]]. Такие активные ингредиенты приемлемо присутствуют в комбинации с количествами, которые эффективны для предполагаемой цели.
Активные ингредиенты могут быть помещены в получаемые микрокапсулы, например, посредством технологий коацервации или посредством межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозы или желатиновых микрокапсул и поли-(метилметакрилатных) микрокапсул, соответственно, в коллоидной системе доставки лекарственного средства (например, липосомах, альбуминовых микросферах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие техники раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.)(1980).
Могут быть получены препараты с замедленным высвобождением. Приемлемые примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, включая антитело, матрицы которого представляют собой оформленные изделия, например, пленки или микрокапсулы.
Препараты, применяемые для введения in vivo обычно стерильные. Стерильность может быть легко достигнута, например, за счет фильтрования через стерильные фильтрационные мембраны.
G. Терапевтические способы и композиции
Любое из антител к биотину, предложенных в данном документе, может быть применено в терапевтических способах.
В одном аспекте предложено антитело к биотину для применения в качестве лекарственного препарата.
В дальнейшем аспекте изобретения предложено применение антитела к биотину при производстве и получении лекарственного препарата.
В дальнейшем аспекте изобретения предложены фармацевтические композиции, включающие антитела к биотину, предложенные в данном документе. В одном воплощении фармацевтический препарат включает любое из антител к биотину, предложенных в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.
Антитела по изобретению могут быть применены или сами по себе или в комбинации с другими агентами в терапии. Например, антитело по изобретению может быть введено совместно с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом.
Такие комбинированные терапии, указанные выше, охватывают комбинированное введение (где два или более терапевтических агента включены в один и тот же или разные препараты), и раздельное введение, в случае которого введение антитела по изобретение может быть проведено до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или адъюванта. Антитела по изобретению также могут быть применены в сочетании с радиационной терапией.
Антитело по изобретению (и любой дополнительный терапевтический агент) может быть введено посредством приемлемых способов, включая парентеральное, внутрилегочное, интраназальное и при желании местного лечения внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутриперитонеальное или подкожное введение. Дозирование может быть выполнено любым приемлемым способом, например, при помощи инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, отчасти в зависимости от того должно ли быть введение кратким или систематическим. Различные режимы дозирования, включая, но не ограничено, однократные или множественные введения через различные временные интервалы, болюсное введение и прерывистые инфузии предполагаются в данном документе.
Антитела по изобретению будут получены, дозированы и введены способом, соответствующим хорошей медицинской практике. Факторы для рассмотрения в данном контексте включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, сайт доставки агента, способ введения, планирование введения, и другие факторы, известные клиницистам. Антитело не обязательно, но возможно получают с одним или более агентами, в настоящее время применяемыми для профилактики или лечения данного нарушения. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела присутствующего в препарате, типа нарушения или лечения и других факторов, обсуждаемых выше. Их обычно применяют в одинаковых дозах и при помощи путей введения, описанных в данном документе, или приблизительно от 1 до 99% доз, описанных в данном документе, или в любой дозе и любым путем, который эмпирически/клинически определяют как приемлемый.
Для предотвращения или лечения заболевания приемлемая доза антитела по изобретению (в случае применения самого по себе или в комбинации с одним или более другими дополнительными терапевтическими агентами) будет зависеть от типа заболевания подлежащего лечению, типа антитела, серьезности и течения заболевания, от того будут антитело вводить в профилактических или терапевтических целях, предшествующей терапии, клинической истории пациента или реакции на антитело, и решения лечащего врача. Антитело приемлемо для введения пациенту за один раз или целого ряда лечений. В зависимости от типа и серьезности заболевания приблизительно 1 мкг/кг - 15 мг/кг (например, 0,5 мг/кг - 10 мг/кг) антитела могут представлять собой начальную возможную дозу для введения пациенту, или например, посредством одного или более отдельных введений, или посредством длительной инфузии. Одна типичная ежедневная доза может варьировать от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. Для повторных введений свыше нескольких дней или более, в зависимости от состояния, лечение обычно продляют до желаемого подавления возникновения симптомов заболевания. Одна типичная доза антитела варьирует от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Таким образом, одна или более дозы приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или их любая комбинация) могут быть введены пациенту. Такие дозы могут быть введены периодически, например, каждую неделю или каждые три недели (например, так, что пациент принимает от приблизительно двух до приблизительно двадцати, или например, приблизительно шесть доз антитела). Начальная более высокая нагрузочная доза с последующей одной или более низкими дозами может быть введена. Прогресс данной терапии быстро мониторируют посредством обычных техник и исследований.
Следует понимать, что любой из вышеупомянутых препаратов или терапевтических способов может быть осуществлен при помощи иммуноконъюгата по изобретению вместо или помимо антитела к биотину.
III. Изделия производства
В другом аспекте изобретения предложено изделие производства, включающее материалы, полезные для лечения, предупреждения и/или диагностики нарушений, описанных выше. Изделия производства включают контейнер и метку или упаковку, встроенную или ассоциированную с контейнером. Приемлемые контейнеры включают, например, бутылки, сосуды, шприцы, мешки с инфузионным раствором и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер удерживает композицию, которая присутствует сама по себе или в комбинации с другой композицией эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностики состояния и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой мешок для внутривенного раствора или сосуд, имеющий пробку, прокалываемую при помощи иглы для подкожной инъекции). По меньшей мере один активный ингредиент в композиции представляет собой антитело по изобретению. Метка или листок вкладыш показывают, что композицию применяют для лечения предпочтительного состояния. Более того, изделие производства может включать (а) первый контейнер с композицией, содержащейся в нем, где композиция включает антитело по изобретению; и (b) второй контейнер с содержащейся в нем композицией. Где композиция включает дополнительный цитотоксический или иной терапевтический агент. Изделие производства в данном воплощении изобретения может дополнительно включать листок-вкладыш, показывающий, что композиции могут быть применены для лечения отдельных состояний. Альтернативно или дополнительно изделие производства может дополнительно включать второй (или третий) контейнер, включающий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и декстрозный раствор. Он может дополнительно включать другие материалы, желательные с точки зрения коммерции и потребителя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Следует понимать, что любое из вышеупомянутых изделий производства может включать иммуноконъюгат по изобретению вместо или помимо антитела к биотину.
IV. ПРИМЕРЫ
Следующее представляет собой примеры способов и композиций по изобретению. Следует понимать, что различные другие воплощения могут быть применены на практике, учитывая общее описание, приведенное выше.
Пример 1
Изоляция и характеристика кДНК, кодирующих VH и VL домены мышиного антитела к биотину класса IgG1 с каппа-легкой цепью из мышиного гибридома
Информацию о белковой и (ДНК) последовательности доменов VH и VL мышиного антитела гаптен-биотин получали непосредственно из гибридомных клонов. Последовательные этапы эксперимента: (i) изоляция РНК из гибридомных клеток, продуцирующих антитело, (ii) превращение данной РНК в кДНК, перенос в VH- и VL-содержащие ПЦР-фрагменты, и (iii) интеграцию данных ПЦР-фрагментов в плазмидные вектора для размножения в E. coli и определения их последовательности ДНК (и предполагаемого белка).
Получение РНК из гибридомных клеток
РНК получали из 5×106 гибридомных клеток, экспрессирующих антитело, при помощи RNeasy-Kit (Qiagen). Вкратце, осажденные клетки промывали один раз в PBS и осаждали с последующим ресуспендированием для лизиса в 500 мкл RLT-Puffer (+β-ΜΕ). Клетки полностью лизировали посредством пропускания через Qiashredder (Qiagen) и затем подвергали процедуре матрица-опосредованной очистке (ЕТОН, RNeasy columns) согласно инструкции производителя. После последнего этапа промывания РНК элюировали с колонок 50 мкл воды свободной от РНКаз. Концентрацию выделенной РНК количественно определяли при А260 и А280 на разведениях образцов 1:20. Целостность (качество, степень деградации) выделенных образцов РНК анализировали посредством денатурирующего гель-электрофореза РНК в агарозном геле с применением формамида (см. Maniatis Manual). Отдельные бенды, представляющие интактные 18s и 28s рибосомальные РНК были получены и интактность (и приблизительное соотношение интенсивности 2:1) данных бендов свидетельствовала о хорошем качестве препаратов РНК. Выделенные из гибридома РНК замораживали и хранили в аликвотах при -80°C.
Получение фрагментов ДНК, кодирующих VH и VH, при помощи ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (RACE-PCR), клонирование данных ДНК фрагментов в плазмиды и определение их ДНК- и аминокислотных последовательностей:
кДНК для последующих (RACE)-ПЦР реакций получали из препаратов РНК при помощи технологий, описанных в международной заявке на патент РСТ/ЕР 2011/074273. Затем, VH и VL-кодирующие ПЦР-фрагменты выделяли при помощи экстракции из агарозного геля и последующей очистки стандартными молекулярно-биологическими способами. Очищенные ПЦР-фрагменты (PWO-полимераза) встраивали в вектор pCR bluntll topo при помощи pCR bluntll topo Kit (Invitrogen) точно следуя инструкциям производителя. Торо-лигирующей смесью трансформировали Торо10-one-shot компетентные клетки Е. coli. Впоследствии клоны Е. coli, включающие вектора с или VL- или VH-содержащими вставками, идентифицировали в качестве колоний на чашках с LB-агаром, содержащим канамицин. Из этих колоний получали плазмиды, и присутствие желаемой вставки в векторе подтверждали при помощи рестрикции EcoRI. Поскольку последовательность вектора включает сайты рестрикции EcoRI, фланкирующие каждую сторону вставки, плазмиды несущие вставку определяли как плазмиды, дающие EcoRI-высвобождаемые вставки размером приблизительно 800 п. н. (для VL) или 600 п. н. (для VH). Последовательность ДНК и последовательность VL и VH предполагаемого белка определяли автоматическим ДНК-секвенированием VH и VL на множестве клонов.
Мышиная последовательность VL антитела к биотину приведена в SEQ ID NO: 08. Мышиная последовательность VH антитела к биотину приведена в SEQ ID NO: 04.
Пример 2
Гуманизация доменов УН и VL мышиного антитела к биотину
Мышиное биотин-связывающее антитело muM33 гуманизировали следующим образом:
Получение и характеристика кодирующих последовательностей и аминокислотных последовательностей, включающих домены VH и VL мышиного антитела к биотину класса IgG1 с каппа-легкой цепью их мышиного гибридома описаны в WO 2011/003557 и WO 2011/003780. На основании данной информации, получали соответствующее гуманизированное антитело к биотину (huM33) основываясь на комбинации человеческого зародышевого каркаса IGHV1-69-02 и IGKV1-27-01. Для VL, не было необходимости во введении какой-либо обратной мутации в каркас человеческого IGKV1-27-01 и человеческого J элемента IGKJ2-01 зародыша. Гуманизированный VH основан на человеческом IGHV1-69-02 зародыша и человеческого J элемента IGHJ4-01-3 зародыша. Были введены две обратные мутации в позиции 24 каркасного участка 1 (A24S) и позиции 73 каркасного участка 3 (K73T). Аминокислотная последовательность гуманизированного VH приведена в SEQ ID NO: 12 и аминокислотная последовательность гуманизированного VL приведена в SEQ ID NO: 16.
Пример 3
Кристаллизация и определение рентгеновской структуры связывающего участка Fv участка мышиного антитела к биотину в присутствии биотина
Определяли структуру мышиного антитела к биотину. Поэтому Fab-фрагменты получали при помощи протеолиза IgG и последующей очистки, применяя хорошо известные способы области техники (разрушение папаином).
Для кристаллизации apo-Fab-фрагмент (очищенные Fab) в 20 мМ His-HCl, 140 мМ NaCl, рН 6,0 концентрировали до 13 мг/мл. Кристаллизационные капли создавали при 21°C за счет смешивания 0,2 мкл раствора белка с 0,2 мкл резервуарного раствора в экспериментах по диффузии паров в сидячей капле. Кристаллы появлялись из 0,1 M Tris pH 8,5, 0,01 M хлорида кобальта, 20% поливинилпирролидона K15 в течение 5 дней и росли до конечного размера 0,3 мм × 0,06 мм × 0,03 мм в течение 8 дней.
Кристаллы собирали при помощи 15% глицерола в качестве криопротектора и затем быстро замораживали в жидком азоте. Дифракционные изображения получали при помощи детектора Pilatus 6М при температуре 100К при оси пучка X10SA Swiss Light Source и обрабатывали при помощи программ XDS [Kabsch, W., J. Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800] и масштабировали при помощи SCALA [полученной от BRUKER AXS], доводя данные до разрешения 2.22Å. Данный кристалл Fab-фрагмента относится к моноклинной пространственной группе Р21 с размером решетки a=90,23Å b=118,45Å c=96,79Å и β=117,53° и включает четыре Fab-молекулы на кристаллографическую ассиметричную единицу (см. Таблицу 2).
Стандартные кристаллографические программы из программного пакета ССР4 применяли для решения структуры посредством молекулярного замещения при помощи базы данных структуры белков (PDB) и банка белковых структур (3PQP) в качестве модели исследования, для вычисления электронной плотности и усовершенствования рентгеновской структуры [ССР4 (Collaborative Computational Project, N. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. D (1994) 760-763]. Структурные модели выстраивали в отношении электронной плотности при помощи COOT (Emsley, P., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60 (2010) 486-501). Координаты определяли при помощи REFMAC5 (Murshudov, G.Ν., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53 (1997) 240-255) и при помощи autoBUSTER (Global Phasing Ltd.).
Figure 00000002
Figure 00000003
Для кристаллизации Fab-фрагмента в комплексе с производным биотина апо-кристаллы Fab-фрагмента, примененные для экспериментов по выдержке, получали из 0,8 M янтарной кислоты в течение не более 3 дней после скрининга и выращивали до конечного размера 0,25 мм × 0,04 мм × 0,04 мм в течение не более 5 дней. Биоцитинамид растворяли до 100 мМ в воде. Затем соединение разбавляли до 10 мМ рабочей концентрации в кристаллизационный раствор и наносили на кристаллы в кристаллизационных каплях. Кристаллы промывали три раза 2 мкл 10 мМ раствора соединения и окончательно инкубировали в течение 16 ч с биоцитинамидом при 21°C.
Кристаллы собирали при помощи 15% глицерола в качестве криопротектора и затем быстро замораживали в жидком азоте. Дифракционные картины получали при помощи детектора Pilatus 6М при температуре 100 К при пучке излучения X10SA Swiss Light Source и обрабатывали при помощи программ XDS [Kabsch, W., J. Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800] и масштабировали при помощи SCALA [obtained from BRUKER AXS], доводя данные до разрешения 2,35Å. Данный кристалл Fab-фрагмента относится к моноклинной пространственной группе Р21 с рзмерами решетки а=89,09Å b=119,62Å с=96,18Å и β=117,15° и содержит четыре Fab-моелуклы на кристаллографическую ассиметричную единицу (см. таблицу 3).
Стандартные кристаллографические программы из программного пакета ССР4 применяли для решения структуры посредством молекулярного замещения в системе координат ano-Fab-фрагмента в качестве модели исследования, для вычисления электронной плотности, и для улучшения рентгеновской структуры до разрешения 2,5Å [ССР4 (Collaborative Computational Project)]. Структурные модели были восстановлены по электронной плотности припомощи COOT (Emsley, P., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60 (2010) 486-501). Координаты уточняли при помощи REFMAC5 (Murshudov, G.Ν., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53 (1997) 240-255) и при помощи autoBUSTER (Global Phasing Ltd.).
Figure 00000004
Figure 00000005
Кристаллическая форма комплекса, включающего четыре независимых комплекса биоцитинамид:Fab к биотину в ассиметричной единице, с биоцтинамидом, связываемым всеми Fab-молекулам. Биоцитидинамид связан в кармане, сформированном CDR 1 и 3 тяжелой цепи и всеми 3 CDR легкой цепи. Связывающий карман лиганда определен остатками ASN29, ASP31, THR32, PHE33, GLN35, TRP99 и TRP106 тяжелой цепи и ASN31, TYR32, LEU33, SER34, TYR49, SER50, PHE91 и TYR96 из легкой цепи. Концевая группа биотина образует водородные связи с остатками CDR2 и CDR1 в одном конце карман: N3 биоцитинамида взаимодействует с гидроксильным кислородом Ser50, при этом O22 контактирует с амидным азотом остова этого же остатка. Кроме того, O22 биоцитинамида также является водородсвязанным с кислородом гидроксильной группы Ser34. Кроме того, гидрофобные взаимодействия наблюдают между биоцитинамидом и ароматическими боковыми цепями, тянущимися вдоль связывающего кармана. Амидная связь в конце (CH2)4 алифатического хвоста биотина контактирует с PHE33 CDR1 тяжелой цепи и стабилизирована за счет дополнительной водородной связи с амидным азотом остова PHE33 и с Asp31. Данные позиции амидного азота, который представляет собой сайт связывания активного соединения, в результате чего атомы, следующие после азота, ориентированы от связывающего кармана по направлению к растворителю.
Результаты экспериментального разделения связывающего участка при разрешении 2,5Å позволяют охарактеризовать способ связи лиганда с его антителом, что является предпосылкой для детального моделирования и дальнейшего улучшения за счет белкового конструирования рекомбинантных биотинсвязывающих модулей.
Пример 4
Композиция, экспрессия и очистка рекомбинантных антител к биотину
Вариабельные участки мышиного и гуманизированного антитела к биотину комбинировали с константными участками человеческого происхождения для формирования моно- и биспецифичных химерных и гуманизированных антител.
Получение моноспецифичных гуманизированных антител к биотину и биспецифичных гуманизированных антител к биотину, которые специфично связывают биотин, а также различные небиотиновые мишени (например, рецептор тирозинкиназы или IGF-1R) требовало (i) дизайна и определения амино- и нуклеотидных последовательностей таких молекул, (ii) экспрессии данных молекул в трансфецированных культивированных клетках млекопитающих, и (iii) очистку данных молекул из супернатанта трансфецированных клеток. Данные этапы проводили, как описано ранее в РСТ/ЕР 2011/074273.
В целом, для получения гуманизированного антитела класса IgG, которое обладает специфичностью связывания (исходной) мышиного антитела к биотину, гуманизированную VH-последовательность сливали в рамке с N-концом СН1-петля-СН2-CH3 Fc-участка человека подкласса IgG1. Аналогично, гуманизированную VL-последовательность сливали в рамке с N-концом человеческого CL-каппа константного участка.
Для получения производных биспецифичного антитела, обладающих специфичностью к биотину, а также специфичностями к другим мишеням, антитело к биотину, cFv или Fab-фрагмент сливали в рамке с С-концом тяжелой цепи ранее описанных антител. Во многих случаях, примененный scFv к гаптену в дальнейшем стабилизировали за счет введения VH44-VL100 дисульфидной связи, описанной ранее (например, Reiter, Y., et al., Nature biotechnology 14 (1996) 1239-1245).
Экспрессионные плазмиды:
Экспрессионные плазмиды, содержащие экспрессионные кассеты для экспрессии тяжелых и легких цепей создавали по отдельности в экспрессионных векторах клеток млекопитающих.
Таким образом, генные сегменты, кодирующие отдельные элементы, соединяли в соответствии с вышесказанным.
Общая информация, касающаяся нуклеотидных последовательностей легкой и тяжелой цепей человека, исходя из которой определена частота использования кодона, приведена в: Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication No 91-3242.
Транскрипционная единица к-легкой цепи состоит из следующих элементов:
- предранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека (hCMV),
- синтетическая последовательность Козака, включающая 5'-UT,
- сигнальная последовательность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, включающая интрон сигнальной последовательности,
- клонированная кДНК вариабельной легкой цепи, аранжированная уникальным сайтом рестрикции Bsml на 5'-конце и донорным сайтом сплайсинга и уникальным сайтом рестрикции Notl на 3'-конце,
- геномный κ-ген константного участка человека, включающий интрон 2 мышиного lg-κ энхансера (Picard, D., and Schaffner, W. Nature 307 (1984) 80-82), и
- сигнальная последовательность κ-полиаденилирования ("poly А") человеческого иммуноглобулина.
Транскрипционная единица γI-тяжелой цепи состоит из следующих элементов:
- предранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека (hCMV),
- синтетическая последовательность Козака, включающая 5'-UT,
- модифицированная сигнальная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, включая интрон сигнальной последовательности,
- клонированная кДНК моноспецифичной вариабельной тяжелой цепи или клонированная кДНК биспецифичной слитой scFv-вариабельной тяжелой цепи, аранжированная уникальным сайтом рестрикции Bsml в 5' и донорным сайтом сплайсинга и уникальным сайтом рестрикции NotI в 3'-конце,
- геномный γΙ-ген константного участка тяжелой цепи человека, включая мышиный Ig μ-энхансер (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378), и
- сигнальная последовательность полиаденилирования("ро1уА") человеческого γI-иммуноглобулина.
Рядом с экспрессионной кассетой κ-легкой цепи или γ1-тяжелой цепи данные плазмиды содержат
- ген устойчивости к гигромицину,
- ориджин репликации, oriP, вируса Эбштейн-Барра (EBV),
- ориджин репликации вектора pUC18, делающей возможной репликацию данной плазмиды в Е. coli, и
- ген β-лактамазы, придающий Е. coli устойчивость к ампициллину.
Техники рекомбинантной ДНК
Клонирование проводили при помощи стандартных способов клонирования, как описано в Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Все молекулярно-биологические реагенты коммерчески доступны (если не указано иное) и применены согласно инструкциям производителя.
ДНК, содержащая кодирующие последовательности, мутации или дополнительные генетические элементы, синтезировали Geneart AG, Regensburg.
ДНК последовательности определяли при помощи двуцепочечного секвенирования, выполненного на SequiServe (SequiServe GmbH, Германия).
Анализ последовательности ДНК и белка и обработка данных:
Vector NTI Advance suite version 9.0 применяли для создания, картирования, анализа, описания и иллюстрации последовательности.
Экспрессия антител к биотину и производных:
Антитела к биотину экспрессировали при помощи временной трансфекции клеток человеческой эмбриональной почки 293 (HEK293) в суспензии. Для этого, легкие и тяжелые цепи соответствующих моно- и биспецифичных антител конструировали в экспрессионных векторах, несущих прокариотические и эукариотические селекционные маркеры, как описано ранее. Данные плазмиды амплифицировали в E. coli, очищали и последовательно применяли для временной трансфекции. Стандартные способы культивирования клеток применяли для обращения с клетками, как описано в Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.В., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. Клетки культивировали в соответствующей экспрессионной среде при 37°C/8% CO2. В день трансфекции клетки засевали в свежую среду до 1-2×106 живых клеток/мл. ДНК-комплексы с реагентами для трансфекции получали в Opti-MEM I среде (Invitrogen, США), содержащей 250 мкг плазмидной ДНК, кодирующей тяжелую и легкую цепи в молярном соотношении 1:1 для конечного объема трансфецрующей смеси 250 мл. Супернатанты клеточных культур, содержащие моноспецифичное или биспецфичное антитело очищали спустя 7 дней после трансфекции посредством центрифугирования при 14000 об/мин в течение 30 мин и фильтрования через стерильный фильтр (0,22 мкм). Супернатанты хранили при -20°C до очистки.
Для определения концентрации антител и производных в супернатантах клеточных культур, применяли аффинную ВЭЖХ. Для этого супернатант клеточной культуры, содержащий моно- и биспецифичное антитело или его производное, которое связывало белок-А, наносили на колонку Applied Biosystems Poros А/20 в растворе, содержащем 200 мМ KH2PO4, 100 мМ цитрат натрия с рН 7,4. Элюцию хроматографического аметриала проводили при помощи нанесения раствора, содержащего 200 мМ NaCl, 100 мМ лимонную кислоту, с рН 2,5. Применяли систему ВЭЖХ UltiMate 3000 (Dionex). Количество элюированного белка определяли при помощи УФ-абсорбции и интеграции областей пиков.
Очищенное антитело IgG1 служило стандартом.
Очистка антител к биотину:
Спустя семь дней после трансфекции собирали супернатанты клеток НЕК 293. Рекомбинантное антитело содержащееся в них очищали от супернатанта в два этапа при помощи аффинной хроматографии с применением белок-A-Sepharose™ аффинной хроматографии (GE Healthcare, Швеция) и Superdex200 эксклюзионной хроматографии. Вкратце, антитело, содержащее очищенные супернатанты культуры наносили на колонку MabSelectSuRe Protein А (5-50 мл), уравновешенную PBS-буфером (10 мМ Na2HPO4, 1 мм KH2PO4, 137 мМ NaCl и 2,7 мМ KCl, рН 7,4). Несвязанные белки промывали равновесным буфером. Антитела (или производные антител) элюировали 50 мМ цитратным буфером, рН 3,2. Белок-содержащие фракции нейтрализовали при помощи 0,1 мл 2 M Трис-буфера, рН 9,0. Затем элюированные белковые фракции объединяли, концентрировали при помощи центрифужного фильтра Amicon Ultra (MWCO: 30 K, Millipore) и загружали в колонку для гель-хроматографии Superdex200 HiLoad 26/60 (GE Healthcare, Швеция), уравновешенную 20 мМ гистидином, 140 мМ NaCl, с рН 6,0. Белковую концентрацию очищенных антител и производных определяли по оптической плотности (ОП) при 280 нм с корректировкой ОП при 320 нм, при помощи молярного коэффициента поглощения, вычисленного на основании аминокислотной последовательности согласно Расе, et al., Protein Science 4 (1995) 2411-2423. Фракции мономерных антител собирали, быстро замораживали и хранили при -80°C. Часть образцов применяли для последующего анализа и характеристики белка.
Гомогенность антител подтверждали при помощи SDS-PAGE в присутствии и отсутствии восстановителя (5 мМ 1,4-дитиотреитол) и окрашивания Кумасси бриллиантовым голубым. NuPAGE® Pre-Cast gel system (Invitrogen, США) применяли согласно инструкции производителя (4-20% Tris-глициновые гели).
В восстановительных условиях полипептидные цепи, относящиеся к IgG, демонстрировали на SDS-PAGE предполагаемые молекулярные размеры, аналогичные вычисленным молекулярным массам. Экспрессионные уровни всех конструктов анализировали при помощи белка-А. Средние выходы белка составили 6-35 мг очищенного белка на литр супернатантна клеточной культуры в таких неоптимизированных экспериментах по временной трансфекции.
Фигура 1 показывает результаты экспрессии и очистки гуманизированного антитела, которое связывает биотин и производные биотина. Восстанавливающий и невосстанавливающий ДСН-ПААГ-электрофорез показывает композицию и гомогенность гуманизированных антител с и без цистеина в позиции 53 согласно Kabat после очистки при помощи белка A (MabSelect) и эксклюзионной хроматографии. Маркер молекулярной массы присутствует в неотмеченных дорожках. Н-цепи антитела (бэнд выше 50 кДа) и L-цепи антитела (бэнд ниже 25 кДа) детектируемы при восстанавливающих условиях в качестве отдельных бэндов без присутствия видимых количеств примесей дополнительных белков.
Пример 5
Связывание рекомбинантного гуманизированного антитела к биотину с биотин-меченным соединением (биотинилированным соединением)
Связывающие свойства рекомбинантного химерного и гуманизированного антитела к биотину и его варианта, включающего цистеин в позиции 53 в HVR-H2 согласно нумерации Kabat, анализировали при помощи биослойной интерферометрии (BLI) при помощи прибора Octet QK (Fortebio Inc.). Данная система отработана для изучения молекулярных взаимодействий. BLi-технология основана на измерении интерферограмм белого света, отраженного от поверхности конца биосенсора и внутреннего стандарта. Связывание молекул с концом биосенсора приводит к сдвигу интерферограммы, который может быть измерен. Для анализа того, приведет ли процедура гуманизации, описанная выше, к снижению способности антитела к биотину связываться с биотином, свойства химерных гуманизированных вариантов антитела в их способности связываться с биотинилированным белком сравнивали непосредственно. Исследования связывания выполняли при помощи захватывающего антитела к биотину при помощи anti-huIgG Fc antibody Capture (AHC) Biosensors (Fortebio Inc.). Во-первых, биосенсоры инкубировали, в растворе антитела с концентрацией 0,5 мг/мл в 20 мМ гистидине, 140 мМ NaCl, рН 6,0 в течение 1 мин. Затем биосенсоры инкубировали в течение 1 мин в 1x PBS рН 7,4 для достижения стабильной базовой линии. Связывание измеряли за счет инкубирования биосенсоров, покрытых антителом в растворе, содержащем биотинилированный белок с концентрацией 0,06 мг/мл в 20 мМ гистидине, 140 мМ NaCl, pH 6,0 в течение 5 мин. Диссоциацию наблюдали в течение 5 мин в 1х PBS рН 7,4. Итоговые кривые связывания для химерных и гуманизированных антител сравнивали непосредственно.
Гуманизированный вариант антитела проявлял эквивалентное или даже лучшее связывание биотинилированного антигена, чем химерное антитело. Тоже наблюдалось для гуманизированного антитела с Cys-мутацией в позиции VH53 согласно Kabat. Биотинилированный белок проявлял остаточное неспецифичное связывание с биосенсорами, что было снижено в случае с биосенсорами, покрытыми герцептином, который не связывается с биотином. Таким образом, функциональность антитела к биотину была сохранена в его гуманизированном варианте (который определен последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 12 и 16, SEQ ID NO: 20 и 24).
Поверхностный плазмонный резонанс:
Измерение поверхностно-плазмонного резонанса проводили на приборе BIAcore® Т200 (GE Healthcare Biosciences AB, Швеция) при 25°C приблизительно 4300 резонансных единиц (RU) захватывающей системы (10 мкг/мл захватывающего антитела к человеку (IgG Fe) из Human Antibody Capture Kit, BR-1008-39, GE Healthcare Biosciences AB, Швеция) иммобилизовали на СМ3 чипе (GE Healthcare, BR-1005-36) при pH 5,0 за счет первичных аминогрупп посредством применения стандартного Amine coupling kit, поставляемого GE Healthcare (BR-1000-50). Подвижный буфер для аминного присоединения представлял собой HBS-N (10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, GE Healthcare, BR-1006-70). Подвижный буфер и буфер для разведения для следующего исследования связывания представлял собой PBS-T (10 мМ фосфатно-буферный солевой раствор, включающий 0,05% Tween 20) рН 7,4. Гуманизированное антитело к биотину захватывалось за счет введения 2 нМ раствора в течение 60 с со скоростью тока 5 мкл/мин. Биотинилированную миРНК разводили при помощи PBS-T при концентрациях 0,14-100 нМ (серии разведений 1:3). Связывание измеряли посредством введения каждой концентрации в течение 180 с со скоростью тока 30 мкл/мин, время диссоциации 600 с. Поверхность регенерировали посредством 30 с промывания при помощи 3 M раствора MgCl2 со скоростью 5 мкл/мин. Данные оценивали при помощи программного обеспечения BIAevaluation (GE Healthcare Biosciences AB, Швеция). Различия величины показателя преломления корректировали посредством вычитания ответа, полученного от поверхности IgG Fe к человеку. Введения контроля также вычитали (= двойная ссылка). Для вычисления KD и кинетических параметров применяли модель Ленгмюра 1:1.
Анализ кинетического связывания посредством поверхностного плазмонного резонанса (ППР) выполняли для гуманизированного антитела к биотину SEQ ID NO: 12 и 16 и гуманизированного антитела к биотину VH53C SEQ ID NO: 20 и 24. Антитела к биотину в концентрации 2 нМ захватывались антитела Fe IgG к человеку, которое связывается с СМ3 сенсорного типа. Связывание биотинилированной миРНК (Mw: 13868 Да) регистрировали в концентрациях 0,41, 1,23, 3,7, 11,1, 33,3, 100 и 300 нМ. Измерения проводили в двух повторностях. Вычисленные KD для гуманизированного антитела к биотину и гуманизированного антитела к биотину VH53C составляли 0,633 нМ и 0,654 нМ соответственно.
Пример 6
Получение нековалентных комплексов биотинилированных соединений с антителами к биотину
Обычный способ
Получение комплексов антител к биотину с биотинилированными соединениями (= биотин конъюгированный с нагрузкой) должны давать определенные комплексы и необходимо убедиться, что соединение (= нагрузка) в данных комплексах сохраняет их активность. Для получения комплексов биотинилированных соединений с антителом к биотину биотинилированное соединение растворяли в H2O до конечной концентрации 1 мг/мл. Антитело концентрировали до конечной концентрации 1 мг/мл (4,85 мкМ) в 20 мМ гистидинового буфера, 140 мМ NaCl, рН 6,0. Биотинилированную нагрузку и антитело смешивали в молярном соотношении 2:1 (соединение к антителу) посредством пипетирования и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре.
Альтернативно биотинилированное соединение растворяли в 100% ДМФ до конечной концентрации 10 мг/мл. Антитело концентрировали до конечной концентрации 10 мг/мл в 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,2. Биотинилированное соединение и антитело смешивали в молярном соотношении 2,5:1 (соединение к антителу) посредством пипетирования и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре и 350 об/мин.
Типичный способ формирования комплексов биотинилированных флуоресцентных красителей и антител к биотину - комплекса биотин-Су5/химерное антитело к биотину (человеческое подкласса IgG):
Для получения комплексов биотин-производное-Су5 (биотин-Цис-Су5) содержащих цистеинилированный линкер, 0,16 мг биотин-цис-Су5 растворяли в 100% ДМФ до концентрации 10 мг/мл. 1 мг антитела применяли в концентрации 10,1 мг/мл (приблизительно 69 мкм) в буфере, состоящем из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,2. Биотин-цис-Су5 и антитело смешивали в молярном соотношении 2,5:1 (биотин-цис-Су5 к антителу) и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре, перемешивали при 350 об/мин. Полученный конъюгат анализировали посредством ДСН-ПААГ-электрофореза, как описано в примере 7. Детекцию флуоресценции проводили как описано в примере 7.
Типичный способ получения комплексов биотинилированных флуоресцентных красителей и антител к биотину - биотин-цис-Су5/гуманизированное антитело к биотину:
Для получения комплексов биотин-производное-Су5 (биотин-цис-Су5), содержащих цистеинилированный линкер, 0,16 мг биотин-цис-Су5 растворяли в 100% ДМФ до концентрации 10 мг/мл. 1 мг антитела применяли в концентрации 5,5 мг/мл (приблизительно 38 мкМ) в буфере, состоящем из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,2. Биотин-цис-Су5 и антитело смешивали в молярном соотношении 2,5:1 (биотин-цис-Су5 к антителу) и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре, перемешивали при 350 об/мин. Полученный конъюгат анализировали посредством ДСН-ПААГ-электрофореза, как описано в примере 7. Детекцию иммунофлуоресценции проводили как описано в примере 7.
Обычный способ получения комплексов биотинилированных полипептидов и антител биотину - комплекс Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-биотин/химерное антитело к биотину:
Для получения нековалентных комплексов биотинилированного-PYY-полипептид, содержащий цистеинилированный линкер, 0,19 мг Ас-PYY-PEG3-цис-β-Ala-биотин растворяли в 100% ДМФ до концентрации 10 мг/мл. Антитело применяли в концентрации 10,7 мг/мл (приблизительно 73 мкМ) в буфере, состоящем из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,2. Ac-PYY-PEG3-цис-β-Ala-биотин и антитело смешивали в молярном соотношении 2,5:1 (Ac-PYY-PEG3-цис-β-Ala-биотин к антителу) и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре и 350 об/мин. Полученный комплекс определяли в качестве мономерной IgG-подобной молекулы за счет появление единственного пика в эксклюзионной хроматографии (95% мономер).
Полученный комплекс в дальнейшем анализировал посредством ДСН-ПААГ-электрофореза и последующего Вестерн-Блот-анализа. 10 мкг комплекса смешивали с 4х LDS буфера для образцов (Invitrogen) и инкубировали при 95°С в течение 5 мин. Образец наносили в 4-12% Бис-Трис полиакриламидный гель (NuPAGE, Invitrogen), который «прогоняли» в течение 35 мин при 200 В и 120 мА. Молекулы, которые отделяли в полиакриламидном геле переносили на ПВДФ мембрану (размер пор 0,2 мкм, Invitrogen) в течение 40 мин при 25 В и 160 мА. Мембрану блокировали при помощи 1% (м/о) обезжиренного молока в 1х PBST (1х PBS + 0,1% Tween20) в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембрану промывали 3х в течение 5 мин 1х PBST и затем инкубировали при помощи стрептавидин-POD-конъюгата (2900 Ед/мл, Roche), который применяли в разведении 1:2000. Детекцию стрептавидин-POD, связанного на мембране проводили при помощи Lumi-Light субстрата для Вестерн-Блота (Roche).
Типичный способ получения комплексов биотинилированных полипептидов и антител к биотину - комплекс Ac-PYY-PEG3-цис-PEG2-биотин/химерное антитело к биотину:
Для получения нековалентных комплексов биотинилированного-PYY-полипептида, содержащего цистеинилированный линкер, 0,16 мг Ас-PYY-PEG3-цис-PEG2-биотин растворяли в 100% ДМФ до концентрации 10 мг/мл. Антитело применяли в концентрации 10,7 мг/мл (приблизительно 73 мкМ) в буфере, состоящем из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,2. Ac-PYY-PEG3-цис-PEG2-биотин и антитело смешивали в молярном соотношении 2,5:1 (Ac-PYY-PEG3-цис-PEG2-биотин к антителу) и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре и 350 об/мин. Полученный комплекс определяли в качестве 63% мономерной IgG-подобной молекулы и 37% димерных растворимых агрегатов посредством эксклюзионной хроматографии. Полученный комплекс в дальнейшем анализировали посредством ДСН-ПААГ-электрофореза и последующего Вестерн-Блот-анализа. 10 мкг комплекса смешивали с 4х LDS буфером для образцов (Invitrogen) и инкубировали при 95°C в течение 5 мин. Образец наносили на 4-12% Бис-Трис-полиакриламидный гель (NuPAGE, Invitrogen), который «прогоняли» в течение 35 мин при 200 В и 120 мА. Молекулы, которые разделяли в полиакриламидном геле, переносили на ПВДФ мембрану (размер пор 0,2 мкм, Invitrogen) в течение 40 мин при 25 В и 160 мА. Мембрану блокировали в 1% (м/о) обезжиренном молоке в 1х PBST (1х PBS + 0,1% Tween20) в течение 1 ч при комнатной температуре.
Мембрану промывали 3х в течение 5 мин в 1х PBST и затем инкубировали со стрептавилин-POD-конъюгатом (2900 ед/мл Roche), который применяли в разведении 1:2000. Детекцию стрептавидин-POD, связанного с биотином на мембране, проводили при помощи субстрата для Вестерн-блотинга Lumi-Light (Roche). Получение определенных ковалентных конъюгатов гаптенилированных красителей и полипептидов с антителом к гаптену VH53C в отсутствии окислительно-востановительного агента.
Для получения ковалентного дисульфидсвязанного конъюгата антитела к биотину/биотинилированного пептида или биотинилированного красителя необходимо: (i) присоединение биотин посредством приемлемых линкеров, содержащих функциональную группу (такой как, например, цистеин, малеимид) к полипептиду или красителю, который позволяет полипептиду быть выставленным выше поверхности антитела и таким образом сохранить его активность и (ii) получить ковалентные сайт-специфичные конъюгаты биотинилированных полипептидов с антителом к биотину с цистеиновой мутацией (=антитело VH52bC/VH53C), в котором биологическая активность полипептида сохранена, и (iii) для выполнения реакции в отсутствии окислительно-востановительного агента, чтобы избежать восстановления дисульфидных мостиков между цепями антитела.
Обычный способ:
Получение конъюгатов антител к биотину с биотинилированными соединениями должно приводить к конъюгатам с определенной стехиометрией и должно быть подтверждено, что соединение данных конъюгатов сохраняют свою активность. Для получения конъюгатов биотинилированных соединений с антителом к биотину биотинилированное соединение растворяли в 100% ДМФ до конечной концентрации 10 мг/мл. антитело к биотину VH52bC/VH53C доводили до концентрации 10 мг/мл в 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,2. Биотинилированное соединение и антитело к биотину VH52bC/VH53C смешивали в молярном соотношении 2,5:1 (соединение к антителу) посредством пипетирования и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре и 350 об/мин.
Полипептид, конъюгированный с биотином через линкер, содержащий цистеин, называют биотин-цис-полипептид или полипептид-цис-биотин далее. Полипептид может или иметь свободный N-конец или замкнутый N-конец, например, при помощи ацетильной группы (Ас-плипептид-цис-биотин) или PEG-остаток (PEG-полипептид-цис-биотин). Флуоресцентный краситель, конъюгированный с биотином, через линкер, содержащий цистеин, называют краситель-цис-биотин или биотин-цис-краситель далее.
Типичный способ получения конъюгатов биотинилированных флуоресцентных красителей и антител к биотину - биотин-Сер-Су5/гуманизированное антитело к биотину:
Для получения комплексов биотин-производное-Су5 (биотин-Сер-Су5), содержащего остаток серина внутри линкера, 0,61 мг биотин-Сер-Су5 растворяли в 20 мМ гистидине, 140 мМ NaCl, рН 6,0 до концентрации 10 мг/мл. 18,5 мг гуманизированного антитела к биотину применяли в концентрации 10 мг/мл (приблизительно 69 мкМ) в буфере, состоящем из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,2. Биотин-Сер-Су5 и антитело смешивали в молярном соотношении 2,5:1 (биотин-сер-Су5 к антителу) и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре, перемешивали при 350 об/мин. Затем образец подвергали эксклюзионной хроматографии при помощи Superdex 200 16/60 препаративных колонок высокой нагрузки (GE Healthcare) со скоростью тока 1,5 мл/мин и 20 мМ гистидине, 140 мм NaCl, рН 6,0 в качестве мобильной фазы. Фракции пиков собирали и анализировали посредством ДСН-ПААГ-электрофореза на чистоту. Соотношения красителя и антитела вычисляли посредством (1) измерения абсорбции образцов при длине волны 280 нм (белок) и 650 нм (Су5); (2) при помощи формулы: А650 меченный белок/ε(Су5)*белок концентрацию (М) = моли красителя на моль белка, где ε(Су5)=250000 М-1 см-1, А650 комплекса = 47,0 и концентрация белка составляет 86,67 мкМ. Конечное соотношение красителя к молекуле антитела составило 2,17, что подтверждает, что все паратопы антитела насыщены молекулами биотин-Су5.
Типичный способ получения конъюгатов биотинилированных флуоресцентных красителей и антител к биотину - биотин-цис-Су5/химерное антитело к биотину VH53C:
Для получения конъюгатов биотин-производное-Су5, содержащих цистеинилированный линкер, 0,16 мг биотин-цис-Су5 растворяли в 100% ДМФ до концентрации 10 мг/мл. 1 мг антитело к биотину VH53C применяли в концентрации 9,7 мг/мл (приблизительно 68 мкМ) в буфере, состоящем из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,2. Биотин-цис-Су5 и антитело смешивали в молярном соотношении 2,5:1 (Ас-биотин-цис-Су5 к антителу) и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре, перемешивали при 350 об/мин. Конечный конъюгат анализировали при помощи ДСН-ПААГ-электрофореза как описано в примере 7. Детекцию флуоресценции проводили как описано в примере 7.
Типичный способ получения конъюгатов биотинилированных красителей и антител к биотину - биотин-цис-Су5/гуманизированное антитело к биотину VH53C:
Для получения конъюгатов биотин-производного-Су5, содержащего цистеинилированный линкер, 0,16 мг биотин-цис-Су5 растворяли в 100% ДМФ до концентрации 10 мг/мл. 1 мг гуманизированного антитела к биотину VH53C применяли в концентрации 7,4 мг/мл (приблизительно 51 мкМ) в буфере. Состоящем из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,2. Биотин-цис-Су5 и антитело смешивали в молярном соотношении 2,5:1 (Ас-биотин-цис-Су5 к антителу) и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре, перемешивали при 350 об/мин. Полученный конъюгат анализировали при помощи ДСН-ПААГ-электрофореза как описано в примере 7. Детекцию флуоресценции проводили как описано в примере 7.
Типичный способ получения конъюгатов биотинилированных полипептидов и антител к биотину - Ас-PYY(PEG3-цис-βAla-биотину)/химерное антитело к биотину VH53C:
Для получения конъюгатов биотин-производное-PYY-полипептид, содержащих цистеинилированный линкер, 0,19 мг Ac-PYY(PEG3-цис-βAla-биотин) растворяли в 100% ДМФ до концентрации 10 мг/мл. 1 мг химерное антитело к биотину VH53C применяли в концентрации 9,7 мг/мл (приблизительно 67 мкМ) в буфере. Состоящем из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,2. Ac-PYY(PEG3-цис-βAla-биотин) и антитело смешивали в молярном соотношении 2,5:1 (Ас-PYY(PEG3-цис-βAla-биотин) к антителу) и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре, перемешивают при 350 об/мин. Полученный конъюгат анализировали при помощи масс-спектрометрии 87,7% детектированных видов были идентифицированы в качестве антител, соединенных с 2 пептидными молекулами, 12,3% были идентифицированы в качестве антитела, соединенного с 1 пептидной молекулой.
Типичный способ получения конъюгатов биотинилированных полипептидов и антител к биотину - Ac-PYY(PEG3-цис-PEG2-биотин)/химерное антитело к биотину VH53C:
Для получения конъюгатов биотин-производное-PYY-полипептид, содержащих цистеинилированный линкер, 0,16 мг Ac-PYY(PEG3-цис-PEG2-биотин) растворяли в 100% ДМФ до концентрации 10 мг/мл. 1 мг химерного антитела к биотину VH53C применяли в концентрации 9,9 мг/мл (приблизительно 68 мкМ) в буфере, состоящем из 50 мм Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,2. Ac-PYY(PEG3-цис-PEG2-биотин) и антитело смешивали в молярном соотношении 2,5:1 (Ac-PYY(PEG3-цис-PEG2-биотин) к антителу) и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре, перемешивали при 350 об/мин. Полученный конъюгат анализировали при помощи масс-спектрометрии. 100% детектированных видов идентифицировали в качестве антитела, соединенного с 2 пептидными молекулами.
Типичный способ получения конъюгатов биотинилированных полипептидов и антител к биотину - Ac-PYY(PEG3-цис-βAla-биотин)/гуманизированное антитело к биотину VH53C:
Для получения конъюгатов биотин-производных-PYY-полипептид, содержащих цистеинилированный линкер, 0,06 мг Ac-PYY(PEG3-цис-βAla-биотин) растворяли в 100% ДМФ до концентрации 10 мг/мл. 0,8 мг гуманизированное антитело к биотину VH53C применяли в концентрации 9 мг/мл (приблизительно 62 мкМ) в буфере, состоящем из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,2. Ас-PYY(PEG3-цис-βAla-биотин) и антитело смешивали в молярном соотношении 2,5:1 (Ас-PYY(PEG3-цис-βAla-биотин) к антителу) и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре, перемешивали при 350 об/мин. Полученный конъюгат анализировали при помощи масс-спектрометрии. 62,2% детектированных видов идентифицировали в качестве антитела, соединенных с 2 пептидным молекулам, 33,9% идентифицировали в качестве антител, соединенных с 1 пептидной молекулой и 3,9% идентифицировали в качестве несоединенных антител.
Типичный способ получения конъюгатов биотинилированных полипептидов и антител к биотину - Ac-PYY(PEG3-цис-PEG2-биотин)/гуманизированное антитело к биотину VH53C
Для получения конъюгатов биотин-производное-PYY-полипептид, содержащих цистеинилированный линкер, 0,08 мг Ac-PYY(PEG3-цис-PEG2-биотин) растворяли в 100% ДМФ до концентрации 10 мг/мл. 0,8 мг гуманизированное антитело к биотину VH53C применяли в концентрации 9 мг/мл (приблизительно 62 мкМ) в буфере, состоящем из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,2. Ac-PYY(PEG3-цис-PEG2-биотин) и антитело смешивали в молярном соотношении 2,5:1 (Ac-PYY(PEG3-цис-PEG2-биотин) к антителу) и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре, перемешивали при 350 об/мин. Полученный конъюгат анализировали при помощи масс-спектрометрии. 71,4% детектируемых видов идентифицировали в качестве антитела, соединенного с 2 пептидными молекулами. 26% идентифицировали в качестве антитела, соединенного с 1 пептидной молекулой и 2,5% идентифицировали в качестве несоединенных антител.
Пример 7
Способы детекции
SDS-гель-электроФорез:
Для SDS-гель-электрофореза, 4х LDS буфер для образцов (Invitrogen) добавляли к образцам. Для каждого образца также получали уменьшенный вариант за счет добавления восстанавливающего агента для образца 10х NuPAGE (Invitrogen). Все образцы инкубировали при 70°C в течение 5 мин до элеткрофореза на 4-12% бис-Трис полиакриламидном геле (NuPAGE, Invitrogen) с 1х MOPS буфером (Invitrogen).
Флуоресцентная детекция:
Су5-опосредованную флуоресценцию детектировали при помощи устройства Lumilmager F1 (Roche) при длине волны возбуждения 645 нм. После детекции флуоресценции, гель окрашивали при помощи SimplyBlue SafeStain (Invitrogen).
Пример 8
Стабильность в сыворотке
Стабильность в сыворотке комплексов биотинилированного Су5 с гуманизированным антителом к биотину в сравнении с ковалентными конъюгатами биотинилированный Су5 с гуманизированным антителом к биотину VH53C.
Целью описанной модификации пептида является улучшение терапевттической применимости пептидов. Основные узкие места для терапевтического применения пептидов существенно ограниченная стабильность in vivo и/или короткий период жизни в сыворотке и высокий клиренс. Фармакокинетические параметры конъюгатов антитела флуорофоров определяли in vivo и сравнивали с PK нековалентными комплексами антитело-флуорофор.
Таким образом, (i) антитело к биотину VH53C ковалентно конъюгировали с биотинилированным флуорофором Биот-цис-Су5, (ii) получали нековалентный комплекс антитела к биотину с билтинилированным флуорофором Биот-Су5, (iii) анализировали ковалентно конъюгированные и нековалентно комплексированные соединения применяли на животных и (iv) сывороточные концентрации соединений спустя время в этих животных.
Процедура эксперимента:
Для анализа влияния на фармако-кинетические параметры антитело-комплексообразования небольшого флуоресцентного субстрата, 13 нмоль дисульфид-связанного конъюгата Су5-биотин/гуманизированное антитело к биотину или соответствующего антитело-нековалентно комплексированного соединения в 20 мМ гистидине /140 мМ NaCl, pH 6,0 применяли на шести самках мышах (штамм NRMI) для каждой субстанции. Приблизительно 0,1 мл образцов крови собирали после следующих временных точек: 0,08 ч, 8 ч и 48 ч для мыши 1 и 2 и 0,08 ч, 24 ч и 48 ч для мыши 3 и 4 и 0,08 ч, 36 ч и 48 ч для мыши 5 и 6. Образцы сыворотки по меньшей мере 40 мкл получали после 1 ч при комнатной температуре посредством центрифугирования (9,300 × g, 3 мин, 4°C). Образцы сыворотки хранили при -80°C.
Для определения количества соединения в сыворотке при заданных временных точках применяли флуоресцентные свойства Су5: Субопосредованную флуоресценцию образцов в сыворотке измеряли в 120 мкл кварцевых кюветах при комнатной температуре при помощи флуорисцентного спектрофотометра Cary Eclipse (Varían). Длина волны возбуждения составляла 649 нм, Эмиссию измеряли при 670 нм. Образцы сыворотки разводили в 1x PBS до достижения соответствующего диапазона интенсивности излучения. Сыворотку крови необработанной мыши также разводили в 1x PBS, соответствующий образец применяли в качестве бланк-пробы.
Хотя вышеупомянутое изобретение описано в некоторых деталях при помощи иллюстраций и примеров в целях ясности и понимания, описания и примеры не должны трактоваться в качестве ограничивающих объем изобретения. Раскрытие всего патента и научной литературы, процитированные в данном документе, определенно включены во всей их полноте посредством ссылки.
Пример 9
Определение рентгеноструктуры мышиных Fab-фрагментов антитела к биотину в комплексе с биоцитинамидом
Белковую структуру мышиного Fab-фрагмента антитела к биотину определяли в комплексе с биоцитинамидом. Поэтому кристаллы Fab-фрагмента выращивали в 0,8 M янтарной кислоте, с последующей загрузкой кристаллов антитела при помощи биоцитидинамида (разбавленным до 10 мМ рабочей концентрации в кристаллизационном растворе, наносимом на кристаллы в кристаллизационной капле). Кристаллы промывали три раза 2 мкл 10 мМ раствора биоцитидинамида и окончательно инкубировали в течение 16 часов с биоцитидинамидом при 21°С, собирали при помощи 15% глицерола в качестве криопротектора и быстро замораживали в жидком азоте. Обработанные дифракционные картины давали белковую структуру при разрешении 2,5Å. Структура и композиция загрузки биотин-связывающего вариабельного участка приведена на фигуре 2: биотин связывается в поверхностном кармане, фланкированном заряженными участками, состоящими из аминокислот из участков CDR. Комплексированный гаптен расположен в непосредственной близости от отрицательно заряженного кластера аминокислот. Биотин которого - в качестве гаптена - является производным для соединения нагрузки с его карбоксильной группой, связывается с хорошей эффективностью, поскольку в данной позиции нет отталкивания зарядов (из-за утраты COOH-группы). Для сравнения, свободный (нормальный) биотин не может связываться эффективно с антителом, поскольку его карбоксильная группа будет находиться в непосредственной близости от отрицательно заряженного кластера и таким образом будет отталкиваться.

Claims (19)

1. Гуманизированное антитело к биотину или его фрагмент, связывающий биотин, включающее:
(a) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11,
(b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10,
(c) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09,
(d) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15,
(e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и
(f) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.
2. Антитело по п. 1, содержащее в позиции 24 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток серина и/или содержащее в позиции 73 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток треонина.
3. Антитело согласно п. 1, содержащее
(a) VH-последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12;
(b) VL-последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; или
(c) VH-последовательность, как определено в (а), и VL-последовательность, как определено в (b),
где аминокислотный остаток в позиции 24 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, представляет собой серин, и/или аминокислотный остаток в позиции 73 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, представляет собой треонин.
4. Антитело по п. 2, содержащее VH-последовательность SEQ ID NO: 12.
5. Антитело по любому из пп. 2 или 4, содержащее VL последовательность SEQ ID NO: 16.
6. Гуманизированное антитело к биотину или его фрагмент, связывающий биотин, содержащее VH-последовательность SEQ ID NO: 12 и VL последовательность SEQ ID NO: 16.
7. Антитело по п. 1, являющееся полноразмерным антителом lgG1 или полноразмерным антителом lgG4.
8. Антитело по п. 1 или 6, являющееся моноклональным антителом.
9. Антитело по п. 1 или 6, представляющее собой фрагмент антитела, связывающий биотин.
RU2015102069A 2012-07-04 2013-07-04 Антитела к биотину и способы их применения RU2630296C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12174957 2012-07-04
EP12174957.6 2012-07-04
PCT/EP2013/064099 WO2014006123A1 (en) 2012-07-04 2013-07-04 Anti-biotin antibodies and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015102069A RU2015102069A (ru) 2016-08-20
RU2630296C2 true RU2630296C2 (ru) 2017-09-06

Family

ID=48771418

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015102069A RU2630296C2 (ru) 2012-07-04 2013-07-04 Антитела к биотину и способы их применения
RU2017128882A RU2017128882A (ru) 2012-07-04 2017-08-14 Антитела к биотину и способы их применения

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017128882A RU2017128882A (ru) 2012-07-04 2017-08-14 Антитела к биотину и способы их применения

Country Status (11)

Country Link
US (1) US9765153B2 (ru)
EP (2) EP2870180A1 (ru)
JP (2) JP6247287B2 (ru)
KR (1) KR20150030755A (ru)
CN (1) CN104411725B (ru)
BR (1) BR112014030844A2 (ru)
CA (1) CA2872192A1 (ru)
HK (1) HK1208235A1 (ru)
MX (1) MX354303B (ru)
RU (2) RU2630296C2 (ru)
WO (1) WO2014006123A1 (ru)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112014029403A2 (pt) 2012-07-04 2018-10-09 F. Hoffmann-La Roche Ag conjugados, anticorpo e formulação farmacêutica
ES2600154T3 (es) 2012-07-04 2017-02-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos antiteofilina y métodos de uso
CN105899540B (zh) 2014-01-03 2020-02-07 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗-半抗原/抗-血脑屏障受体的抗体、其复合物及它们作为血脑屏障穿梭物的应用
CN105873615B (zh) 2014-01-03 2020-12-25 豪夫迈·罗氏有限公司 共价连接的helicar-抗helicar抗体缀合物及其用途
RU2682754C2 (ru) 2014-01-03 2019-03-21 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Конъюгаты полипептидного токсина и антитела, соединенных ковалентной связью
MX2016015280A (es) 2014-06-26 2017-03-03 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-bromodesoxiuridina(brdu) y metodos de uso.
CA2976005A1 (en) 2015-02-06 2016-08-11 Cell Idx, Inc. Antigen-coupled immunoreagents
US11041850B2 (en) 2015-07-07 2021-06-22 The Regents Of The University Of California Method for detecting protein-specific glycosylation
KR20210123427A (ko) * 2016-12-27 2021-10-13 에프. 호프만-라 로슈 아게 신규한 비오틴-특이적 단일클론 항체 및 그 용도
JP6901562B2 (ja) * 2016-12-27 2021-07-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 新規のビオチン特異的モノクローナル抗体およびその使用
WO2018122205A2 (en) * 2016-12-27 2018-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel biotin-specific monoclonal antibody and use thereof
CN107085111B (zh) * 2017-04-14 2019-02-01 江苏福隆生物技术有限公司 乙型肝炎病毒前s1抗原的板式化学发光法检测试剂盒及制备方法
CN111171154B (zh) * 2020-02-25 2021-05-11 杭州百凌生物科技有限公司 一种抗生物素抗体及其应用
WO2024061058A1 (zh) * 2022-09-20 2024-03-28 重庆艾生斯生物工程有限公司 一种抗生物素抗体或其功能性片段及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000050088A2 (en) * 1999-02-22 2000-08-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Biotinylated-chemokine antibody complexes
RU2219949C2 (ru) * 1996-01-11 2003-12-27 Перигрин Фармасьютикалс Инк. Антитела с уменьшенным суммарным положительным зарядом

Family Cites Families (161)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4533493A (en) 1981-08-27 1985-08-06 Miles Laboratories, Inc. Theophylline immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4524025A (en) 1982-06-30 1985-06-18 E. I. Du Pont De Nemours And Company Hybridoma cell lines and monoclonal antibodies to theophylline
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5342606A (en) 1984-10-18 1994-08-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Polyazamacrocyclic compounds for complexation of metal ions
US5316757A (en) 1984-10-18 1994-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Synthesis of polyazamacrocycles with more than one type of side-chain chelating groups
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4855226A (en) 1985-06-07 1989-08-08 Beckman Instruments, Inc. Novel competitive assay for theophylline and reagent for use therein
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US6881536B1 (en) 1986-04-30 2005-04-19 Bioveris Corporation Particle based electrochemiluminescent assays
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
GB8706503D0 (en) 1987-03-19 1987-04-23 British Petroleum Co Plc Aromatic hydrocarbons
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
DE3836656A1 (de) 1988-10-27 1990-05-03 Boehringer Mannheim Gmbh Neue digoxigenin-derivate und ihre verwendung
ATE102631T1 (de) 1988-11-11 1994-03-15 Medical Res Council Klonierung von immunglobulin sequenzen aus den variabelen domaenen.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
PT95809A (pt) 1989-11-07 1991-09-13 Bristol Myers Squibb Co Processo para a preparacao de imunoglobulinas oligomericas, nomeadamente anticorpos monoclonais oligomericos
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2090317A1 (en) 1990-08-31 1992-03-01 Edith A. Wolff Homoconjugated immunoglobulins
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US6511663B1 (en) 1991-06-11 2003-01-28 Celltech R&D Limited Tri- and tetra-valent monospecific antigen-binding proteins
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
EP0861893A3 (en) 1991-09-19 1999-11-10 Genentech, Inc. High level expression of immunoglobulin polypeptides
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5480990A (en) 1991-12-10 1996-01-02 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclocarboxylic acid complexes for use as contrast agents
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
US5739294A (en) 1991-12-10 1998-04-14 The Dow Chemical Company Bicyclopol yazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as contrast agents
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
ATE196606T1 (de) 1992-11-13 2000-10-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörpern, die gegen ein differenzierung-antigen gerichtet sind, dessen expression auf menschliche b lymphozyt beschränkt ist, für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5462725A (en) 1993-05-06 1995-10-31 The Dow Chemical Company 2-pyridylmethylenepolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US5385893A (en) 1993-05-06 1995-01-31 The Dow Chemical Company Tricyclopolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US6476198B1 (en) 1993-07-13 2002-11-05 The Scripps Research Institute Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
CA2172144C (en) 1994-07-25 2001-02-06 Eva Hoss Hapten-marked peptides
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US5834456A (en) 1996-02-23 1998-11-10 The Dow Chemical Company Polyazamacrocyclofluoromonoalkylphosphonic acids, and their complexes, for use as contrast agents
WO1998050431A2 (en) 1997-05-02 1998-11-12 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
AU9262598A (en) 1997-08-18 1999-03-08 Innogenetics N.V. Interferon-gamma-binding molecules for treating septic shock, cachexia, immune diseases and skin disorders
DE69840412D1 (de) 1997-10-31 2009-02-12 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
EP1034298B1 (en) 1997-12-05 2011-11-02 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
US20030175884A1 (en) 2001-08-03 2003-09-18 Pablo Umana Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
BR0008758A (pt) 1999-01-15 2001-12-04 Genentech Inc Variantes de polipeptìdeos parentais com funçãoefetora alterada, polipeptìdeos, composição ácidonucleico isolado, vetor, célula hospedeira,método para produzir uma variante depolipeptìdeo, método para o tratamento de umadesordem em mamìferos e método para produziruma região fc variante
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
PT1222292E (pt) 1999-10-04 2005-11-30 Medicago Inc Metodo para regulacao da transcricao de genes exogenos na presenca de azoto
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
GB9926529D0 (en) 1999-11-09 2000-01-12 Ks Biomedix Ltd Targeting agents
IL149809A0 (en) 1999-12-15 2002-11-10 Genentech Inc Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
NZ518764A (en) 1999-12-29 2004-02-27 Immunogen Inc Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
MXPA02010011A (es) 2000-04-11 2003-04-25 Genentech Inc Anticuerpos multivalentes y usos para los mismos.
EP3263702A1 (en) 2000-10-06 2018-01-03 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cells producing antibody compositions
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ATE378403T1 (de) 2000-11-30 2007-11-15 Medarex Inc Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humänen antikörpern
EP1293514B1 (en) 2001-09-14 2006-11-29 Affimed Therapeutics AG Multimeric single chain tandem Fv-antibodies
KR100988949B1 (ko) 2001-10-25 2010-10-20 제넨테크, 인크. 당단백질 조성물
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
JP4832719B2 (ja) 2002-04-09 2011-12-07 協和発酵キリン株式会社 ＦｃγＲＩＩＩａ多型患者に適応する抗体組成物含有医薬
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
CN1930288B (zh) 2002-04-09 2012-08-08 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
WO2003085102A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellule avec inhibition ou suppression de l'activite de la proteine participant au transport du gdp-fucose
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1560596A1 (en) 2002-11-15 2005-08-10 Immunomedics, Inc. Use of multi-specific, non-covalent complexes for targeted delivery of therapeutics
EP3263596A1 (en) 2002-12-16 2018-01-03 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
EP1585767A2 (en) 2003-01-16 2005-10-19 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2004065569A2 (en) 2003-01-23 2004-08-05 The Regents Of The University Of California Multi-functional antibodies
US20050026263A1 (en) 2003-07-31 2005-02-03 The Regents Of The University Of California Multi-functional antibodies
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7214545B2 (en) 2003-04-28 2007-05-08 The Regents Of The University Of California Element-coded affinity tags
US20050163782A1 (en) 2003-06-27 2005-07-28 Biogen Idec Ma Inc. Modified binding molecules comprising connecting peptides
EP1638510B1 (en) 2003-07-01 2015-09-02 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
WO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 融合蛋白質組成物
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
EA025962B1 (ru) 2003-11-05 2017-02-28 Роше Гликарт Аг АНТИТЕЛА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ К СВЯЗЫВАНИЮ С Fc-РЕЦЕПТОРОМ И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
EP1725249B1 (en) 2003-11-06 2014-01-08 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
ZA200608130B (en) 2004-03-31 2008-12-31 Genentech Inc Humanized anti-TGF-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
BR122019012028B1 (pt) 2004-04-13 2023-09-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticorpos anti-p-selectina, molécula de ácido nucléico, vetor, e composição
JP2008512352A (ja) 2004-07-17 2008-04-24 イムクローン システムズ インコーポレイティド 新規な四価の二重特異性抗体
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
ES2669510T3 (es) 2004-09-23 2018-05-28 Genentech, Inc. Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
ES2592271T3 (es) 2005-03-31 2016-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Métodos de producción de polipéptidos mediante la regulación de la asociación de los polipéptidos
AU2006283532B2 (en) 2005-08-19 2012-04-26 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
US8679490B2 (en) 2005-11-07 2014-03-25 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
KR101059602B1 (ko) 2005-12-07 2011-08-25 에프. 호프만-라 로슈 아게 신경펩타이드 2 수용체 작용물질
NZ591252A (en) 2006-03-17 2012-06-29 Biogen Idec Inc Methods of designing antibody or antigen binding fragments thereof with substituted non-covarying amino acids
WO2007131242A2 (en) 2006-05-05 2007-11-15 The Regents Of The University Of California Streptavidin-biotin-link antibody-hapten system
WO2007134050A2 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
AU2007329759B2 (en) 2006-10-27 2013-05-30 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding sphingosine-1-phosphate
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
EP2581445B1 (en) 2007-08-15 2015-04-08 Yeda Research And Development Co. Ltd. Regulators of MMP-9 and uses thereof
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
DE102008048796A1 (de) 2008-09-24 2010-03-25 Emitec Gesellschaft Für Emissionstechnologie Mbh Abgasreinigungssystem für Dieselmotoren
WO2010045388A2 (en) 2008-10-14 2010-04-22 Dyax Corp. Use of mmp-9 and mmp-12 binding proteins for the treatment and prevention of systemic sclerosis
WO2010056893A1 (en) * 2008-11-13 2010-05-20 Imclone Llc Humanization and affinity-optimization of antibodies
US7816856B2 (en) 2009-02-25 2010-10-19 Global Oled Technology Llc Flexible oled display with chiplets
WO2010112193A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
ES2537100T3 (es) 2009-04-07 2015-06-02 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecíficos trivalentes
CN102459335B (zh) 2009-04-17 2015-11-25 伊缪纳斯制药株式会社 特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其用途
WO2010136172A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
SG177560A1 (en) * 2009-07-06 2012-03-29 Hoffmann La Roche Bi-specific digoxigenin binding antibodies
AU2010292069B2 (en) 2009-09-11 2015-08-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Improved Pseudomonas Exotoxin A with reduced immunogenicity
KR20130113493A (ko) 2011-01-03 2013-10-15 에프. 호프만-라 로슈 아게 항―ｄｉｇ 항체 및 펩티드에 접합되어 있는 디그옥시게닌의 복합체의 약학적 조성물
WO2013174873A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
BR112014029403A2 (pt) 2012-07-04 2018-10-09 F. Hoffmann-La Roche Ag conjugados, anticorpo e formulação farmacêutica
ES2600154T3 (es) 2012-07-04 2017-02-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos antiteofilina y métodos de uso
CN105873615B (zh) 2014-01-03 2020-12-25 豪夫迈·罗氏有限公司 共价连接的helicar-抗helicar抗体缀合物及其用途
RU2682754C2 (ru) 2014-01-03 2019-03-21 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Конъюгаты полипептидного токсина и антитела, соединенных ковалентной связью

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2219949C2 (ru) * 1996-01-11 2003-12-27 Перигрин Фармасьютикалс Инк. Антитела с уменьшенным суммарным положительным зарядом
WO2000050088A2 (en) * 1999-02-22 2000-08-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Biotinylated-chemokine antibody complexes

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OHNO et al. Antigen-binding specificities of antibodies are primarily determined by seven residues of VH, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol.82, . RUDIKOFF S. et al. Single amino acid substitution altering antigen-binding specificity, Proc. Natl. Acad. Sci., 1982, 79(6), . *
OHNO et al. Antigen-binding specificities of antibodies are primarily determined by seven residues of VH, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol.82, реферат. RUDIKOFF S. et al. Single amino acid substitution altering antigen-binding specificity, Proc. Natl. Acad. Sci., 1982, 79(6), реферат. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104411725B (zh) 2018-09-28
EP2870180A1 (en) 2015-05-13
JP2018090567A (ja) 2018-06-14
US20150232577A1 (en) 2015-08-20
RU2017128882A (ru) 2019-03-01
JP6247287B2 (ja) 2017-12-13
JP6470384B2 (ja) 2019-02-13
MX2014014376A (es) 2015-02-05
RU2015102069A (ru) 2016-08-20
MX354303B (es) 2018-02-23
HK1208235A1 (en) 2016-02-26
CA2872192A1 (en) 2014-01-09
WO2014006123A1 (en) 2014-01-09
US9765153B2 (en) 2017-09-19
CN104411725A (zh) 2015-03-11
KR20150030755A (ko) 2015-03-20
JP2015527984A (ja) 2015-09-24
BR112014030844A2 (pt) 2019-10-15
EP3339328A1 (en) 2018-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2630296C2 (ru) Антитела к биотину и способы их применения
AU2017201958B2 (en) Covalently linked antigen-antibody conjugates
JP6549278B2 (ja) 抗テオフィリン抗体および使用方法
JP7248761B2 (ja) 抗ｂｒｄｕ抗体および使用方法
LGGLLGGGGGG kk da kkS kkkk da 3) DEMANDE DE BREVET CANADIEN

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20200705