JP2008512352A - 新規な四価の二重特異性抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、好ましくは二重特異性である、新規な四価の抗体に関する。四価の二重特異性抗体は、原核生物細胞及び真核生物細胞中で効率的に発現することができ、治療的及び診断的方法で有用である。本発明は、腫瘍成長及び/又は脈管形成を阻害するための、単独での、又は抗血管新生又は抗新生物剤と組み合わせた、抗体の投与を更に記載する。

Description

発明の分野
本発明は、新規な四価の抗体、好ましくは四価の二重特異性抗体に関する。四価の二重特異性抗体は、原核細胞及び真核細胞中で効率的に発現することができ、治療的及び診断的方法に有用である。本発明は、抗血管新生剤又は抗新生物剤と共に当該抗体を用いる併用療法に更に関する。
背景
二重特異性抗体（BsAb）は、同一又は別個の抗原上の2種の異なったエピトープに結合するイムノグロブリン（Ig）-系部分子である。研究室的研究及び初期の臨床的研究はいずれも、BsAbが細胞傷害性剤例えばエフェクター細胞、放射性核種、薬物及び毒素で腫瘍細胞を標的にすることにより（Weiner他 (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45: 190-2; van Spriel他 (2000) Immuol. Today 21: 391-7; Segal他 (2000) J. Immunol. Methods 248: 1-6）、又は、又は個々の抗体療法の生物活性を増強するために2種の異なった腫瘍標的（又はエピトープ）を同時に標的にすることによって(Lu他 (1999) J. Immunol. Methods 230: 159-71; Lu他 (2001) Cancer Res. 61: 7002-8; Lu他 (2002) J. Immunol. Methods 267: 213-26)、癌療法での重要な用途を有することがある、ことを証明してきた。BsAb-系治療薬の開発における主な障害は、関節症性乾癬及び化学的複合化を含む古典的な方法による臨床的研究に十分な量及び質で原料を製造する点で、困難性を有していた（Carter他 (1995) J. Hematotherapy 4: 463-70)。ハイブリッド型ハイブリドーマにおけるIgG軽鎖及び重鎖の2種の異なったセットの共発現は、最高10の軽-及び重-鎖対であって、これらの対の1つのみが機能性二重特異性ヘテロダイマーである対を産生することがある (Suresh他 (1986) Methods Enzymol. 121: 210-28)。一方、2種のIgG又はそれらの断片の化学的架橋は効率が悪いことが多く、抗体活性の喪失をもたらし得る (Zhu 他(1994) Cancer Lett. 86:127-34)。いずれの方法においても、非-機能性種、例えばハイブリッド型ハイブリドーマによって産生される非-同系Ig軽鎖及び重鎖のホモダイマー及びミスペア（mispaired）ヘテロダイマー、及び化学的複合化から生じる多重結合の集合体からの、BsAbの精製は、困難なことが多く、しかも通常低収率である（Cao他 (1998) Bioconj. Chem. 9: 635-44)。
効率を改善するために、抗体断片(Carter 他(1995); Pluckthun他 (1997) rmmunotechology 3: 83-105; Todorovska他 (2001) J. Immunol. Methods 248: 47-66) 及び完全長IgG型 (Carter (2001) J. Immunol. Methods 248: 7-15)としての、BsAbの効率的な産生のための様々な組換え法が開発されている。例えば、均一な完全長IgG-様BsAbの産生は、いわゆる、効率的なIg CH3ドメインヘテロ二量化用の「knobs-into-holes」工学によって (Ridgway他 (1996) Protein Eng. 9: 617-21; Merchant他 (1998) Nat. Biotech. 16: 677-81)、及び完全長IgG分子のN-末端上又はC-末端上のいずれかに異なった特異性の2つの単一鎖Fv (scFv)を融合することによって (Zhuang他 (2000) Protein Eng. 13: 361-7; Coloma and Morrison (1997) Nat. Biotechnol. 15: 159-63) 達成されている。BsAbは、二量化装置例えばロイシンジッパー（Kostelny他 (1992) J. Immunol. 148: 1547-53; de Kruif他 (1996) J. Biol. Chem. 271: 7630-4）及びIg CL/CH1ドメインによって（Muller他 (1998) FEBS Lett. 422: 259-64)、柔軟なリンカー (Mallender他 (1994) J. Biol. Chem. 269: 199-206; Mack他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 7021-5; Zapata他 (1995) Protein Eng. 8: 1057-62）を用いて又は用いずに、2つの単一鎖Fv (scFv)又はFab断片を遺伝子学的に融合することによって；ダイアボディ（Holliger他 (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 90: 6444-8; Zhu 他(1996) Bio/Technology (NY) 14: 192-6) によって；Fab-scFv融合（Lu他 (2002) Schoonjans 他(2000) J. Immunol. 165: 7050-7) によって; 及び、ミニ抗体フォーマット (Pack他 (1992) Biochemistry 31: 1579-84; Pack他 (1993) Bio/Technology 11: 1271-7) によっても構築されている。ほとんどの場合には、これらの組換え法は、その標的抗原の各々に対して一価である、二価の二重特異性抗体分子の産生をもたらす。
ダイアボディは、可変重（VH）ドメインと可変軽（VL）ドメインとの間の短いリンカー（5〜10のアミノ酸基）で構築したscFvダイマーの1形態である。この短いリンカーは、VHドメイン及びVLドメインの鎖内ペアリングを抑制するが、約55〜60 kDaの分子量の二価抗体断片が形成されるように、VHドメイン及びVLドメインの鎖間ペアリングを可能にする (Holliger他(1993); Whitlow他 (1994) Protein Eng. 7: 1017-26; Zhu 他(1996))。二重特異性ダイアボディは2つの結合部位の各々についてのVHドメイン及びVLドメインが、異なったポリペプチド鎖状に存在する、2つの「クロス-オーバー」scFv断片の共発現によって産生できる (Holliger 他(1993); Zhu 他(1996))。2つの「クロス-オーバー」ポリペプチド鎖の鎖間ペアリングは、その標的抗原の各々に対して一価である二価の抗体分子である、scFvダイマー又は二重特異性抗体の形成をもたらす。
発明の概要
本発明は、新規な四価の二重特異性抗体(BsAb)分子を提供する。BsAbは、2つの同一のダイアボディ（DAB）を含み、各々は、2つの抗体結合部位、好ましくは非-同一の抗体結合部位を有する。ダイアボディ鎖の1つは、免疫グロブリンのヒンジ領域、及び自己会合してダイマー (例えば、CH2及び/又はCH3ドメイン)を形成できる少なくとも1つの重鎖定常ドメインを含む。
これらの新規なタンパク質は、「ジ-ダイアボディ(di-diabodies)」と称され、先に記載の (BsAb) に比べていくつかの利点を提供する。二重特異性でかつ二価のジ-ダイアボディが製造できる。ジ-ダイアボディは、抗原-結合部位の選択に関して何の制限もなく、Fc定常ドメイン及び関連機能が維持され得る。タンパク質は実質的に均一であり、更なるプロセシングなしで、細菌、哺乳動物又は他の細胞から製造できる。特筆すべきことに、2種の異なった抗原の各々に対する二重特異性ジ-ダイアボディの結合特性は、各々の抗原に対する自然抗体（すなわち、宿主によって自然に産生される完全な単一特異的な二価IgG分子）の結合特性に匹敵するので、単一の医薬ジ-ダイアボディ調製物は、2つの単一特異性抗体の組合せの代わりに使用できる。ジ-ダイアボディも単一特異的でよい（すなわち、4つの同一抗体結合部位）。更に、本発明のジ-ダイアボディは、哺乳動物細胞中で効率的に産生され、単一ステップで慣用的なプロティンAクロマトグラフィーによって精製できる。
本発明のジ-ダイアボディは、自己会合ができる少なくとも1つのIgG定常ドメイン、例えばIgG、IgAもしくはIgDのCH2又はCH3、あるいはIgEもしくはIgMのCH2、CH3又はCH4、を含む。従って、ジ-ダイアボディは、存在するそのようなドメインと関連する免疫学的機能、例えばFc受容体結合、補体依存性細胞傷害活性（CMC）又は抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）、を有する。
ある実施態様では、本発明のジ-ダイアボディは、例えばVEGFR-1、VEGFR-2、EGFR又はIGFRに限定されない成長因子受容体に結合し、成長因子受容体の活性化を抑制する、他の実施態様では、ジ-ダイアボディは、同時に、標的細胞上の成長因子受容体に結合し、免疫系エフェクター細胞の細胞表面抗原に結合することができる。
本発明のジ-ダイアボディは、成長因子受容体を中和し、そしてかかる受容体の活性化に関連した腫瘍成長を減少させ及び/又は血管新生を阻害するために用いられる。更に、ジ-ダイアボディは、抗体-新生物剤例えば化学療法剤又は放射線と共に投与できる。
発明の詳細な説明
本発明は、2つの同一のダイアボディを含む四価のBsAb分子である抗原-結合タンパク質を提供する。各々のダイアボディは、2つのポリペプチド鎖のヘテロダイマーであり、好ましくは二重特異性である。本発明によれば、当該ダイアボディのポリペプチドの1つは、安定な自己会合ができる免疫グロブリン定常ドメインのN-末端に、ヒンジ領域を介して融合される (例えば、IgG1であるならば、CH2及び/又はCH3)。単一の宿主内での2つのポリペプチド鎖の共発現は、二重特異性ダイアボディ-定常ドメイン融合の形成をもたらし、次いでヒンジドメイン及び定常ドメインを介して二量化し、二重特異性な四価タンパク質（「ジ-ダイアボディ」）を形成する。ジ-ダイアボディは、大腸菌及び哺乳動物細胞中で効率的に発現することができ、対応するダイアボディよりも、その標的への結合の点及び標的-関連生物活性の抑制の点で、より効率的である。
抗体特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を意味する。自然抗体は、例えば、単一特異的である。二重特異性抗体（BsAb）は、2種の異なった抗原-結合特異性又は抗原-結合部位を有する抗体である。抗原-結合タンパク質は2以上の特異性を有する場合には、認識されたエピトープは、単一抗原又は2以上の抗原に会合することがある。
自然抗体分子は、2つの同一の重鎖及び2つの同一の軽鎖からなる。各軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって重鎖に共通結合的に連結する。2つの重鎖は、ヒンジ領域の複数のジスルフィド結合によって互いに更に連結される。個々の鎖は、類似の大きさ（約110〜125アミノ酸）及び構造を有するが異なった機能を有するドメインに折り畳まれる。軽鎖は、1つの可変ドメイン (VL) 及び1つの定常ドメイン（CL）を含む。重鎖は、1つの可変ドメイン (VH) を含み、抗体のクラス又はアイソタイプによって、3又は4つの[定常ドメイン（CH1、CH2、CH3及びCH4) を含む。ネズミ及びヒトでは、アイソタイプは、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMであり、IgA及びIgGは更にサブクラス又はサブタイプに再分割される。VL及びVHからなる抗体の部分は「Fv」と称され、抗原-結合部位を構成する。単一鎖Fv（scFv）は、1つのポリペプチド鎖状にVLドメイン及びVHドメインを含む改変タンパク質であり、1つのドメインのN-末端及び他のドメインのC-末端は、柔軟性リンカーによって結合される。「Fab」は、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる抗体の部分を意味する。
可変ドメインは、1つの抗体から次の抗体特に抗原結合部位の位置の抗体までの相当のアミノ酸配列可変性を示す。3つの領域は、「超可変」又は「相補性-決定領域」（CDR）と称され、VL及びVHの各々で見出される。
「Fc」は、対になった重鎖定常ドメインを含む抗体の部分の名称である。IgG抗体では、例えば、FcはCH2及びCH3ドメインを含む。IgA又はIgM抗体のFcは、CH4ドメインを更に含む。Fcは、Fc受容体結合、補体-依存性細胞傷害活性の活性化及び抗体-依存性細胞傷害活性と関連する。複数のIgG様タンパク質の複合体であるIgA及びIgM等の自然抗体では、複合体形成はFc定常ドメインを必要とする。
最後に、「ヒンジ」領域は抗体のFab及びFc部分を分離し、相互のFabの移動性及びFcに対するFabの移動性を提供し、並びに2つの重鎖の共有結合のための複数のジスルフィド結合を含む。
ダイアボディは、会合する場合には2つの抗体結合部位を形成する2つのポリペプチド鎖を含む。各ポリペプチド鎖は、短いペプチドリンカー（5〜10アミノ酸）で結合された、免疫グロブリン重鎖可変（VH）ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変（VL）ドメインを含む。特筆すべきことに、1つのポリペプチド鎖のVHドメイン及びVLドメインの順序は、その他（すなわち、VH-リンカー-VL及びVL-リンカー-VH）形成に関して維持される。2つの非-同一鎖のヘテロダイマーの形成は、鎖内VH-CL会合を阻害する短いペプチドリンカーと、2つのポリペプチドの可変ドメインの順序との組合せによって促進される。よって、ヘテロダイマーにおいて、第一ポリペプチドのVHは、第二ポリペプチドのVLと対を形成し、第二ポリペプチドのVHは、第一ポリペプチドのVLと対を形成する。VHドメインが同一であり、かつVLドメインが同一である場合には、2つのヘテロダイマーは、2つの同一の結合部位を含む。あるいは、2種の異なったVHドメイン及び2種の異なった対応するVLドメインは、ヘテロダイマーが2種の異なった結合部位を含みかつ二重特異性であるように (すなわち、VH1-リンカー-VL2及びVL1-リンカー-VH2；図1を参照されたい)、採用することができる。2つのこのような二重特異性ダイアボディを結合することから生じる二重特異性なジ-ダイアボディは、2種の異なった結合部位の各々に対して二価である。
二重特異性である本発明のジ-ダイアボディは、所望の特徴の組合せを有する。先ず、それらは、本質的に均質である。設計によれば、抗体の重鎖及び軽鎖のミスペアリングは、大幅に減少し又は削減される。例えば、典型的な二重特異性抗体は、2つの特異性を与えるための2種の異なった重鎖の使用を必要とする。重鎖がIgG型分子に編成される場合には、4つの組合せが可能である。これらの内の2つは、生成物が単一特異的であるようなミスペア重鎖からなる。反対に、本発明のタンパク質において、ミスペアリングは実質的に除かれる。ヘテロ二量化による2つのダイアボディポリペプチドのペアリングが好ましく、二重特異性ダイアボディの二量化は異なった相互作用によるものである。従って、生成物は二重特異性である。
ジ-ダイアボディの第二の利点は、各々の結合特異性に対して二価である、ということである。二量性BsAbから欠落している自然抗体の特徴は、自然抗体が、それが含む抗体結合部位について二価である、ということである。二量性BsAbは、それが含む2つの結合部位の各々について一価である。これは、二価性は、結合協同性及び単一抗原-結合部位を含む分子に関する結合活性の有意な増加を可能にするので、抗体機能に重要である。
ジ-ダイアボディの第三の利点は、自然抗体のFc領域（例えば、IgG1分子のCH2及び/又はCH3）を構成し、他の抗体機能を提供する重鎖定常ドメインが存在し得る、ことである。更に、定常ドメインによって提供される機能が限定されないように、定常ドメインから複数の結合ドメインが分離される。定常ドメイン機能は、ある補助的分子（例えば、細胞表面に結合し溶解性のFc受容体、IgA及びIgMに対するJ鎖会合、IgAに対するSタンパク質会合）への結合、補体経路（補体依存性細胞傷害活性（CMC））の活性化、いくつかの異なった白血球集団による標的細胞に結合された抗体の認識（抗体-依存性細胞障害活性（ADCC））、及びオプソニン作用（食作用の亢進）を含む。また、Fc重鎖定常ドメインは、血清半減期の増加をもたらす。
本発明のタンパク質の第四の利点は、完全な生成物を取得するためにin vitroで処理する必要性がない、ことである。人工的な方法で再構成したにもかかわらず、ドメインの各々は、生物系で発現できる性質を有する。例えば、ジ-ダイアボディは、真核生物発現系及び原核生物発現系で発現できる。産生されるタンパク質は実質的に二重特異性である。二重特異性なジ-ダイアボディの多量体形態はある程度発現することがあるが（実施例参照）、必要ならばクロマトグラフィーにより調製物から簡便に除かれる。
本発明は、単一特異性の四価抗原-結合タンパク質の産生にも適用できる。かかるタンパク質では、ジ-ダイアボディの全ての4つの結合部位は同一の特異性を有する。
ジ-ダイアボディでの使用のための抗原結合部位は、様々な方法によって得られる。選択される結合ドメインのVH及びVL部分のアミノ酸配列は、自然抗体に対応し、又は所望の免疫原性もしくは結合特性を得るために選択され又は修飾される。例えば、VH及びVLドメインは、所望の結合特性を有するモノクローナル抗体から直接得られる。あるいは、VH及びVLドメインは、選ばれた哺乳動物由来のV遺伝子配列のライブラリーから得られる。かかるライブラリーの要素は、VH及びVLドメインの無作為な組合せを表し、所望の結合特性を有するそのような要素を特定するために任意の所望の抗原で選別される。特に、ヒトV遺伝子ライブラリーが好ましい。かかるスクリーニングの方法は当業者に公知である。選択された非-ヒト起源由来のVH及びVLドメインが、キメラジ-ダイアボディに組み込まれてもよい。例えば、ヒトへの投与では、1以上の機能性ヒト定常ドメインを有するジ-ダイアボディであって、VH及びVLドメインが非-ヒト起源から選択されてきたものを用いるのが好ましい。定常ドメイン関連機能を最大限に発揮させ又は抗体の免疫原性を減少させるために、ヒト定常ドメインが好ましい。
あるいは、「ヒト化した」ジ-ダイアボディが製造できる。ヒト化可変ドメインが構築され、そこでは、非-ヒト起源の1以上の相補性決定領域（CDR）を含むアミノ酸配列がヒトフレームワーク領域（FR）に移植される（grafted)。例えば、以下を参照されたい：Jones, P. T.他, (1996) Nature 321, 522-525; Riechman, L.他, (1988) Nature 332, 323-327; Queen 他の米国特許第 5,530,101号明細書。ヒト化構築物は、特に、逆の免疫原性特性の除去に特に有用であり、例えば非-ヒト起源由来の抗原結合ドメインがヒトでの治療に使用されることが望ましい場合に有用である。可変ドメインは、CDR及びFRに対応する可変ドメイン内のアミノ酸残基の簡便な同定を可能にする、高度の構造的ホモロジーを有する。例えば、Kabat, E.A., 他 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. 第5版. National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health, Bethesda, MDを参照されたい。よって、抗原結合に関与するアミノ酸は容易に特定される。加えて、移植されたCDRを含むヒト化結合ドメインの抗原に対する親和性を維持する又は増加させるためにいくつかの方法が開発されている。1つの方法は、レシピエントの可変ドメイン内に、CDR領域の構造に影響を与える外来フレームワーク残基を含むことである。第二の方法は、外来可変領域に最も類似のホモロジーを有するヒト可変ドメイン上にCDRを移植することである。Queen, C.他, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033。所望のCDR配列を含むオーバーラッピングプライマーを用いて個々のFR配列を先ず増幅し、次いで次の増幅反応で得られる遺伝子断片を結合することによって、CDRは異なったFR上に最も簡便に移植される。異なった可変ドメイン上へのCDRの移植は、アミノ酸配列内でCDRに隣接している、又はCDRの構造に影響を与える折り畳まれた可変ドメイン構造内のCDRに集中される（packed）、アミノ酸残基の置換を更に含む。従って、本発明のヒト化可変ドメインは、1つ以上の非-ヒトCDRを含むヒトドメイン、及び追加の置換又は交換が結合特性を維持するか又は増加させるようなドメインを含む。
本発明のジ-ダイアボディは、ジ-ダイアボディをそれ自身免疫系であるように思わせるために、表面-曝露残基を置換することによって免疫原性をより減少させた可変ドメインを採用してもよい (Padlan, E.A. (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498)。抗体は、親和性を喪失することなく、このプロセスによって修飾されてきた (Roguska 他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 969-973)。抗原結合部位付近のアミノ酸残基の内部パッキングは不変であるため、親和性が維持される。減少した免疫原性の目的の本発明に従う表面-曝露残基の置換は、結合特性に影響を与えるCDR残基又は隣接残基の置換を意味しない。
本発明は、本質的にヒトである結合ドメインを企画する。ヒト結合ドメインは、ファージディスプレイライブラリーから得られ、ヒト重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの組合せが線状ファージの表面に出現する（例えば、McCafferty 他(1990) Nature 348, 552-554; Aujame 他(1997) Human Antibodies 8, 155-168参照)。554; Aujame 他(1997) Human Antibodies 8, 155-168)。可変ドメインの組合せは、Fab又はscFvの形態で線状ファージ上に典型的に出現する。ライブラリーは、所望の抗原結合特性を有する可変ドメインの組合せを有するファージについて選別される。好ましい可変ドメインの組合せは、選択された抗原に対して高親和性を示し、他の関連抗原に対して交差反応性をほとんど示さない。抗体断片の非常に大きなレパートリーを選別することによって（例えば、Griffiths 他(1994) EMBO J. 13, 3245-3260参照されたい）、多様性のある高親和性Mabが単離され、多くは、所望の抗原に対してナノモル濃度以下の親和性を有すると予想される。
あるいは、ヒト結合ドメインは、非再編成ヒトIg遺伝子断片が導入された、かつ内生マウスIg遺伝子が不活性化されたトランスジェニック動物から得られる (Bruggemann and Taussig (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 455-458を参照されたい)。好ましいトランスジェニック動物は、1 Mbを越えるサイズの非常に大きな隣接Ig遺伝子断片を含むが(Mendez 他(1997) Nature Genet. 15, 146-156)、中程度の親和性のヒトMabは、より小さな遺伝子座を含むトランスジェニック動物から得られる（例えば、Wagner 他(1994) Eur. J. Immunol. 42, 2672-2681; Green 他(1994) Nature Genet. 7, 13-21参照)。
生理的な免疫反応において、発現された抗体遺伝子の変異及び選択は、その標的抗原に対する高親和性を有する抗体の産生をもたらす。本発明のジ-ダイアボディに組み込まれるVH及びVLドメインは、同様に、高親和性変異体を得るための、in vitroでの変異及びスクリーニング方法に供せられる。よって、本発明の結合ドメインは、結合特性が直接的変異によって及び親和性成熟の方法によって改善されてきたドメインを含む。親和性及び特異性は、CDRを変異させ、所望の性質を有する抗原結合部位を選別することによって改変又は改善することができる（例えば、Yang 他(1995) J. Mol. Bio. 254, 392-403参照)。CDRは様々な方法で変異される。1方法は、別の同一の抗原結合部位の集団中で、全ての20種のアミノ酸又はそのサブセットが特定の位置に見出されるように、個々の残基又は残基の組合せをランダム化することである。あるいは、エラープローンPCR法によってCDR残基の範囲に渡って変異が誘導される (例えば、Hawkins 他(1992) J. MoI. Bio. 226, 889-896参照）。重及び軽鎖可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターは、大腸菌の突然変異誘発遺伝子株で増殖される（例えば、Low 他(1996) J. MoI. Bio. 250, 359-368参照）。これらの突然変異誘発法は、当業者に公知の多くの方法を例証する。
本発明の抗体の各可変ドメインは、完全な免疫グロブリンの重又は軽鎖可変ドメインでもよく、又は天然ドメインの機能性等価体、変異体もしくは誘導体でよく、又は例えば、ある方法例えばWO 93/11236（Medical Research Council/ Griffiths他）に記載の方法を用いてin vitroで構築される合成ドメインでもよい。例えば、1以上のアミノ酸を欠いた抗体可変ドメインに対応するドメインを組み込むことができる。重要な特徴は、補体可変ドメインに会合して抗原結合部位を形成する各々の可変ドメインの能力である。
本発明の抗原-結合タンパク質は、任意のエピトープ、抗原部位又はタンパク質に対する結合部位を有する。疾患の治療に有用であるジ-ダイアボディは特に興味深い。好ましいジ-ダイアボディは、受容体タンパク質、例えば血管新生及び/又は腫瘍形成に関連する受容体を中和する。受容体を中和することは、シグナルを変換する受容体の固有のキナーゼ活性を不活性化することを意味する。受容体中和の信頼性のあるアッセイは、受容体リン酸化反応の阻害である。本発明は、受容体中和の任意の特定のメカニズムによって限定されない。いくつかの可能なメカニズムは、受容体の細胞外結合ドメインへのリガンドの結合を阻害すること、及び受容体の二量化又はオリゴマー化を阻害することを含む。しかしながら、他のメカニズムも度外視できない。
内皮又は非-内皮細胞、例えば腫瘍細胞、の試料中の受容体の活性化の中和は、in vitro又はin vivoで達成できる。受容体発現細胞の試料中の受容体の活性化の中和は、当該細胞を、本発明の抗体と接触させることを含む。In vitroにおいて、VEGFを細胞試料に添加する前、添加と同時に又は添加後に、細胞は抗体を接触する。In vivoにおいて、本発明の抗体は、哺乳動物への投与によって受容体と接触する。哺乳動物への投与方法は、例えば経口、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内投与を含む。
かかる受容体の例は、VEGF受容体 (例えば、VEGFR-2/KDR/Flk-1、VEGFR2/F1M、VEGFR3/Flt-4)、表皮性成長因子受容体 (EGFR)、インシュリン様成長因子受容体（IGFR)等を含むが特に限定されない。受容体チロシンキナーゼの追加の非限定例は、Flt-4、HER2/neu、Tek及びTie2を含む。
In vivoでの血管新生及び/又は腫瘍成長の可能なレギュレーターとして関連する他の因子は、線維芽細胞増殖因子（FGF）、血小板由来成長因子（PDGF）及び神経成長因子（NGF）を含む。対応する受容体は、線維芽細胞増殖因子受容体 (FGF-R)、血小板由来成長因子受容体（PDGF-R）及び神経成長因子受容体（NGF-R）である。細胞移動、形態変化及び侵襲に関連する別の受容体は、マクロファージ-刺激タンパク質受容体（「MSP-R」又は「RON」)である。所定の受容体は、ヒトタンパク質及び他の哺乳動物由来の相同体を含む。
ジ-ダイアボディは、任意の起源由来の免疫グロブリン結合ドメインを組み込むことができる。例えば、抗体は、上記の受容体については知られており、本発明のジ-ダイアボディでの使用のためのVH及びVLドメインの起源である。KDRに特異的な結合ドメインの例は、IMC-1C11 (VHの塩基配列及びアミノ酸配列：配列番号1及び2; VLの塩基配列及びアミノ酸配列：配列番号3及び4）(WO 00/44777参照)、EVIC-2C6 (VHの塩基配列及びアミノ酸配列：配列番号5及び6; VLの塩基配列及びアミノ酸配列：配列番号7及び8）(WO 03/075840参照)、及びIMC-1121 (VHの塩基配列及びアミノ酸配列：配列番号5及び6; VLの塩基配列及びアミノ酸配列：配列番号9及び10）(WO 03/075840参照）を含む。F1t-1に特異的な結合ドメインの例は、6.12（VHの塩基配列及びアミノ酸配列: 配列番号11及び12; VLの塩基配列及びアミノ酸配列: 配列番号13及び14)、及びIMC-18F1 (VHの塩基配列及びアミノ酸配列: 配列番号27及び28; VLの塩基配列及びアミノ酸配列: 配列番号29及び30）を含む。
EGFRに特異的な結合ドメインは、例えば、WO 96/40210に開示されている、ERBITUX（登録商標）(Cetuximab; IMC-C225) (VHの塩基配列及びアミノ酸配列: 配列番号15及び16; VLの塩基配列及びアミノ酸配列: 配列番号17及び18）、及びIMC11F8 (VHの塩基配列及びアミノ酸配列: 配列番号19及び20; VLの塩基配列及びアミノ酸配列: 配列番号21及び22)を含む。IGFRに特異的な結合ドメインの例は、IMC-A12 (VHの塩基配列及びアミノ酸配列: 配列番号23及び24; VLの塩基配列及びアミノ酸配列: 配列番号25及び26）である。FGF受容体に結合する抗体は、例えば、FR1-H7、FR1-A1及びFR1-4Hである (WO 2005/037235)。PDGFRαに結合する抗体は、例えば、3G3及び7G11を含む (Loizos他, 2005, Mol. Cancer Ther. 4: 369)。RON又はMSP-Rに結合する抗体は、IMC-41A10及びIMC-41A12を含む（Pereira, 国際出願, 2005年5月13日出願)。
更に、上記の結合ドメインの部分例えばCDR領域は、本明細書に記載の結合タンパク質を製造するために用いられる結合ドメインに組み込まれてもよい。
ある好ましいダイアボディは、上記の受容体の内の2つに結合する。1つの好ましい実施態様では、かかる二重特異性抗原-結合タンパク質は、KDR及びFLT-1に結合する。かかる抗原結合タンパク質の例は、次の例で提供する2つのポリペプチド鎖を有する（塩基配列及びアミノ酸配列: 第一ポリペプチド−配列番号51及び52; 第二ポリペプチド−配列番号53及び54)。各々のポリペプチドについて、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間のリンカーはGly-Gly-Gly-Gly-Serであるが、任意のアミノ酸配列を有する0〜10のアミノ酸のリンカーが使用できる。抗原-結合タンパク質は、CH3ドメインを組み込むが、CH2ドメインを組み込まない。リンカー (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2は、ヒンジ領域とIgG1 CH3度メインとの間に組み込まれるが、任意のアミノ酸配列を有する0〜30アミノ酸のリンカーが使用できる。
第二の好ましい実施態様では、本発明の抗原-結合タンパク質は、HER2及びEGFRに結合する。更に他の好ましい実施態様では、本発明のジ-ダイアボディは、EGFR及びIGFRに結合する。EGFR及びIGFRに結合する抗原結合タンパク質の例は、次の例で提供される（塩基配列及びアミノ酸配列：第一ポリペプチド−配列番号55及び56；第二ポリペプチド−配列番号57及び58）。この例では、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間のリンカーは、Arg-Thr-Val-Ala-Alaである。抗原-結合タンパク質は、CH2及びCH3定常ドメインを組み込み、ヒンジ領域と定常ドメインとの間にはリンカーは使用されない。
別の実施態様では、本発明の抗原-結合タンパク質は、EGFR及びVEGFRに結合する。好ましい実施態様では、VEGFRはVEGFR2である。かかる抗体は、EGFR及びVEGFRを介するシグナル変換を妨害することによって血管上皮細胞の刺激を阻害するために有用である。これは、血管新生が腫瘍細胞によって分泌されるEGFRリガンド、特にTGRαに反応して起こる場合に特に有用である。
本発明のジ-ダイアボディは、標的細胞上の抗原を、免疫系エフェクター細胞上の抗原と架橋するために用いられる。これは、例えば、細胞表面上に所定の特定の抗原を有する細胞に対する免疫反応を促進するために有用であり得る。本発明によれば、免疫系エフェクター細胞は、抗原特異的細胞、例えば細胞性免疫反応を活性化するT細胞、及び非特異的細胞、例えば細胞性免疫反応を仲介するマクロファージ、好中球及びナチュラルキラー（NK）細胞、を含む。
本発明のジ-ダイアボディは、免疫系エフェクター細胞の任意の細胞表面抗原の結合部位を有することができる。かかる細胞表面抗原は、例えば、サイトカイン及びリンフォカイン受容体、Fc受容体、CD3、CD16、CD28、CD32及びCD64を含む。一般的に、抗原結合部位は、上記の抗原に対する抗体から得られかつ当業者に周知であるscFvによって提供される。サイトカイン及びリンフォカイン受容体に特異的な本発明の抗原-結合部位は、受容体に対する天然リガンドの全て又は部分に対応するアミノ酸配列でもよい。例えば、細胞-表面抗原がIL-2受容体である場合には、本発明の抗原-結合タンパク質は、IL-2に対応するアミノ酸配列を含む抗原-結合部位を有する。他のサイトカイン及びリンフォカインは、例えば、インターロイキン例えばインターロイキン-4（IL-4）及びインターロイキン-5（IL-5）及びコロニー-刺激因子（CSF）例えば顆粒球-マクロファージCSF（GM-CSF）及び顆粒球CSF（G-CSF）を含む。
ホ発明のジ-ダイアボディは、2つのダイアボディ鎖を発現することによって製造され、その内の1つは、二量化することができる少なくとも1つの重鎖定常ドメインに結合される（例えばCH2及び/又はCH3）。ジ-ダイアボディは、各ポリペプチド鎖の開始に細菌性分泌シグナル配列を含むDNA構築物を用いて、大腸菌内で一般的に産生される。様々な細菌性シグナル配列は当業者に公知である。好ましいシグナル配列は、Erwinia carotovoraのpelB遺伝子由来である。ダイアボディをコードするDNA断片は、例えば、ヒトサイトメガウイルス (HCMV) プロモーター、哺乳動物細胞内での高レベル発現のためのエンハンサー、例えばCHO、NSO、COS-7及びPER.C6細胞、及びリンパ起源の細胞株、例えばリンパ腫、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞を用いて、ベクターにクローン化することができる（例えば、Bendig他, 米国特許第5,840,299号明細書; Maeda他(1991) Hum. Antibod. Hybridomas 2, 124-134を参照)。
選択可能なマーカーは、選択的培養培地内で増殖する形質転換された宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である。典型的な選択可能なマーカーは、(a) 抗生物質又は他の毒素例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート又はテトラサイクリンに対する耐性を与え、(b) 栄養素要求株の欠損を補充し、又は(c) 複合培地から得られない重要な栄養素、例えばバチルス用のD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給する、タンパク質をコードする。特に有用な選択可能なマーカーは、メトトレキサートへの抵抗性を与える。例えば、DHFR選択遺伝子で形質転換した細胞は、DHFRの競争的アンタゴニストであるメトトレキサート（Mtx）を含む培養媒体中で形質転換体の全てを培養することによって最初に同定される。野生型DHFRが採用される場合には好適な宿主細胞は、DHFR活性が喪失したチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株であり、Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. ScL USA 11, 4216によって記載されているようにして調製され増幅される。次いで、形質転換された細胞は、増加したレベルのメトトレキサートの増加に曝露される。これは、DHFR遺伝子の複数のコピーの合成、これに伴って、発現ベクター例えば抗体又は抗体断片をコードするDNAを含む他のDNAの複数のコピーの合成をもたらす。
酵母中で遺伝子構築物を発現させることが望ましい場合には、酵母中での使用のための好適な選択遺伝子の例は、酵母プラスミドYRp7中に存在するtrpl遺伝子である。Stinchcomb 他(1979) Nature, 282, 39; Kingsman 他(1979) Gene 1, 141。Trpl遺伝子は、トリプトファンでの増殖能力を欠いた酵母の変異株例えばATCC受入番号44076又はPEP4-1の選択マーカーを提供する。Jones (1977) Genetics 85, 12。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中のtrpl損傷の存在は、トリプトファンの非存在下での成長による形質転換を検出する効果的な環境を提供する。同様に、Leu-2-欠損酵母株（ATCC 20,622又は38,626) は、Leu2遺伝子を有する公知のプラスミドによって企画される。
形質転換された宿主細胞は、炭素を吸収する起源、例えば糖類例えばグルコース又はラクトース、例えばアミノ酸、ペプチド、タンパク質又はそれらの分解生成物例えばペプトン、アンモニウム塩等、及び無機塩例えば硫酸塩、リン酸塩及び/又はナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの炭酸塩、を含む液体媒体中で、当該分野で公知の方法によって培養される。
成長因子受容体に結合するジ-ダイアボディは、好ましくは受容体チロシンキナーゼ（RTK）活性の活性化を阻害することができる。チロシンキナーゼ阻害は、周知の方法を用いて、例えば組換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベル及び/又は天然もしくは合成基質のリン酸化を測定することによって決定できる。従って、リン酸化アッセイは、本発明のRTKアンタゴニストを決定する点で有用である。リン酸化は、例えば、ELISAアッセイ又はウェスタンブロットでリン酸化チロシンに特異的な抗体を用いて検出できる。チロシンキナーゼ活性のいくつかのアッセイについては、Panek他, J. Pharmacol. Exp. Thera. (1997) 283:1433-44 and Batley他, Life Sci. (1998) 62: 143-50に記載されている。
加えて、タンパク質発現の検出方法は、測定されるべきタンパク質の発現がRTKによって介在される、RTKアンタゴニストを決定するために利用できる。これらの方法は、タンパク質発現の検出のための免疫組織化学（IHC）、遺伝子増幅の検出のための蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）、競争的放射性リガンド結合アッセイ、固体マトリックスブロッティング法例えばノーザン及びサザンブロット、逆転写酵素ポリメラーゼポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）及びELISAを含む。例えば、Grandis 他, Cancer, (1996) 78: 1284-92; Shimizu 他, Japan J. Cancer Res., (1994) 85: 567-71; Sauter 他, Am. J. Path., (1996) 148: 1047-53; Collins, Glia, (1995) 15: 289-96; Radinsky 他, Clin. Cancer Res, (1995) 1: 19-31; Petrides 他, Cancer Res, (1990) 50: 3934-39; Hoffmann 他, Anticancer Res, (1997) 17: 4419-26; Wikstrand 他, Cancer Res, (1995) 55: 3140-48。
リガンド結合を阻害するジ-ダイアボディの能力は、例えばin vitro競争的アッセイによって測定できる。かかるアッセイでは、リガンド又はRTK（例えばEGF又はEGFR）は固定され、結合アッセイは、固定されたリガンドへのRTKの結合を競争的に阻害するジ-ダイアボディの有効性を決定するために実行される。
In vivoアッセイは、RTKアンタゴニストを決定するために利用することもできる。例えば、受容体チロシンキナーゼ阻害は、阻害剤の存在及び非存在下に受容体リガンドで刺激された細胞株を用いる、マイトジェンアッセイによって観察される。例えば、EGFで刺激されたA431細胞 (American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD)は、EGFR阻害をアッセイするために用いられる。別のアッセイは、例えばマウスに注射されたヒト腫瘍細胞を用いる、EGFR-発現腫瘍細胞の成長を阻害するための試験を含む。米国特許第6,365,157号明細書 (Rockwell他)参照。
本発明の好ましいジ-ダイアボディは、二重特異性を有し、2種の異なった抗原に同時に結合できる。異なった抗原は、異なった細胞又は同一の細胞上に位置してよい。抗原の架橋結合は、例えば、第一抗原が結合された固体表面を提供し、当該第一抗原に特異的な二重特異性抗体及び結合タンパク質も特異的である第二抗原を添加し、そして結合された第二抗原の存在を検出することによって、in vitroで見出される。
本発明の好ましい二重特異性ジ-ダイアボディは、2つの受容体とそれらの各々のリガンドとの間の相互作用を阻害することができる。例えば、KDR及びFIt-1に特異的なジ-ダイアボディは、VEGF誘導細胞移動及びPIGF誘導細胞移動を阻害する。二重特異性ジ-ダイアボディにおける2つの受容体結合特異性の組合せは、個々の親抗体よりも細胞移動を阻害する点でより有効である（例えば、WO 2004/003211; Zhu参照)。
単一特異的である抗体に比べて、二重特異性ジ-ダイアボディは、細胞機能のより強力な阻害剤であり得る。例えば、VEGF-刺激細胞機能、例えば、皮細胞の増殖、及びヒト白血球のVEGF-及びPIGF-誘導移動は、特に2つの標的抗原の内の1つ又は両方に対する親和性が減少する場合には、二重特異性ジ-ダイアボディによってより有効に阻害される。例えば、KDR及びFlt-1の特異的なダイアボディ（一価）は、標的抗原のいずれかに対する単一特異的なscFvよりも、VEGF又はPIGF誘導細胞移動を阻害するためにより有効である（WO 2004/003211)。
別の実施例では、両方の受容体に結合することができ、それらの特異的リガンドとの相互作用を阻害することができるEGFR及びIGFRに二重特異性を有するジ-ダイアボディは、EFF及びIGF-刺激受容体活性、及びダウンストリームシグナル変換を中和するために使用される。EGFR又はIGFRのいずれかの刺激は、程度は異なっても、Akt及びp44/42を含む一般的なダウンストリームシグナル変換分子のリン酸化を生じる。ある腫瘍細胞では、EGFR機能の阻害は、他の成長因子受容体シグナル経路のアップレギュレーション、特にIGFR刺激によって、補填される。1つの受容体に結合し、Akt又はp44/42のいずれかのリン酸化を完全に妨害しない抗体による処置に対して、EGFR及びIGFRに結合する抗体による腫瘍細胞のインキュベーションは、Akt及び44/42のリン酸化を妨害する。よって、IGFRシグナリングの阻害は、腫瘍成長の阻害及びある治療剤への腫瘍細胞の増加した感度をもたらす。
かかる一般的なシグナル変換カスケード成分のリン酸化の阻害は、他のRTKに結合する抗体例えばRONでも観察される。従って、抗原-結合タンパク質は、一般的に、細胞成長及び複数のシグナル変換経路の活性化から生じる形質転換によって特徴付けられる新生物疾患を治療するために有用である。
本発明の抗原-結合タンパク質は、様々な増殖性疾患の治療に有用である。例えば、本発明は、2つ以上の受容体チロシンキナーゼによって発現し、刺激される腫瘍の治療を提供する。2つ以上の受容体による刺激は、各々の受容体のみの阻害に対して非感受性である制御されない成長をもたらすことができる。あるいは、第二受容体の刺激は、第一受容体による刺激に反応して観察される活性化に付加することができる。あるいは、個々の受容体からの寄与は、乗法的でもよい。上記の例の各々では、腫瘍成長の著しく改善された阻害は、受容体の両方を阻害する抗原-結合タンパク質の存在下で観察される。
本発明の抗原-結合タンパク質は、受容体刺激がEGFR傍分泌及び/又は自己分泌のループを介する疾患を治療するために有用である。例えば、EGFR発現腫瘍は、それらの環境に存在するEGFに特徴的に感受性であり、腫瘍産生EGF又はTGF-αによって更に刺激することができる。任意の特定のメカニズムに拘束されるものではないが、本方法によって治療され又は予防される疾患は、例えば、そこで腫瘍成長が刺激される疾患を含む。本方法は、そのため、血管が新生していない又は未だ実質的に血管が新生していない固形腫瘍を治療するために効果的である。
本発明のある抗原-結合タンパク質は、異常に増殖性の疾患に関連する脈管形成を阻害するために有用である。例えば、腫瘍関連脈管形成を阻害することによって、腫瘍成長を阻害することができる。1つの実施態様では、抗原-結合タンパク質は、腫瘍関連RTKに結合し、血管由来のリガンド(例えばVEGF)の産生を腫瘍によって阻害し、脈管構造の細胞に関連するVEGF受容体にも結合し、かかる細胞の増殖を阻害する。異なった実施態様では、VEGF又はVEGFR (例えばPIGF) リガンドの他のリガンドが、2以上の種類のVEGF受容体に結合しないように、抗原-結合タンパク質は、複数のVEGF受容体に結合する。
処置することができる腫瘍は、原発性腫瘍及び転移性腫瘍、並びに難治性腫瘍を含む。難治性腫瘍は、化学療法剤のみ、抗体のみ、放射線のみ又はそれらの組合せによる処置に対して反応しないか又は抵抗性である腫瘍を含む。難治性腫瘍は、かかる薬剤による処置によって予防されるように見えるが、処置が中止されてから最高5年、時には最高10年又はより長い期間までに再発する腫瘍も含む。腫瘍は、通常のレベルでEGFR又は他のRTKを発現してもよく、あるいは例えば通常のレベルの少なくとも10、100又は1000倍のレベルでRTKを過剰発現してもよい。
EGFRを発現し、EGFRのリガンドによって刺激される腫瘍の例は、悪性腫瘍、神経膠腫、肉腫、腺癌、腺肉腫及び腺腫を含む。かかる腫瘍は、ほとんど身体の全ての部分、例えば胸、心臓、肺、小腸、直腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部及び頚部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、頸部又は肝臓、に起こり得る。本発明に従って処置される、EGFRを過剰発現することが観察される腫瘍の中には、特に限定されないが、結腸直腸癌及び頭部及び頚部腫瘍、特に頭部及び頚部の扁平上皮細胞癌、脳腫瘍例えばグリア芽腫、及び肺、胸、膵臓、食道、精巣、腎臓、膀胱、頸部及び前立腺の腫瘍を含む。構成的に活性な（すなわち非調節的な）受容体チロシンキナーゼ活性を有することが観察される腫瘍の非限定的な例は、神経膠腫、非-小細胞肺癌、卵巣癌及び前立腺癌を含む。腫瘍の他の例は、カポジ肉腫、CNS新生物、神経芽細胞腫、毛細血管性血管芽細胞腫、髄膜腫及び脳転移、黒色腫、胃腸管及び腎臓の腫瘍及び肉腫、横紋筋肉腫、グリア芽腫、好ましくは多形グリア芽腫、及び平滑筋肉腫を含む。他のRTKの過剰発現は、同様の成長不足を生じ得る。例えば、ほとんどの転移性骨肉腫は、前立腺、胸又は肺の原発性腫瘍から生じる。前立腺癌は、元々は、ホルモン依存性かもしれないが、かかる依存性の喪失は、骨に移動する細胞のIGFR依存性刺激と一致する。
抗原-結合タンパク質は、本発明の抗体の有効量を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍以外の異常に増殖性の疾患を治療するために有用でもある。本明細書で開示されている、「異常に増殖性の疾患」は、EGFRファミリー又は他のチロシンキナーゼ受容体のメンバーを発現する非-癌細胞の過剰な成長によって引き起こされる症状と定義される。異常に増殖性の疾患によって発生する過剰細胞は、通常のレベルでRTKを発現するか又はRTKを過剰発現することがある。
異常に増殖性の疾患の例は、乾癬、光線性汗孔角化症及び脂漏性角化症、瘤、ケロイド瘢痕、及び湿疹を含む。ウイルス感染、例えば乳頭腫ウイルス感染によって起こる異常に増殖性の疾患も含まれる。例えば、乾癬は、多くの異なった変化及び異なった重度で起こる。乾癬の異なった種類は、特徴、例えば膿-様疱（膿疱性乾癬）、皮膚の重度の腐肉の形成（乾癬性紅皮症)、液滴-様点（drop-like dots）(滴状乾癬) 及び平滑な炎症損傷症 (反対の乾癬) を示す。乾癬の全ての種類（例えば、尋常性乾癬、乾癬性紅皮症、関節症性乾癬、類乾癬、掌蹠膿疱症)の治療は、本発明により企画されている。
本発明によれば、ジ-ダイアボディは、他の薬剤、例えば疾患の治療のための抗新生物剤又は抗血管新生剤に化学的又は生物化学的に複合化することができる。抗体に結合された抗腫瘍剤は、抗体が結合している腫瘍を、又は抗体が結合している細胞環境における腫瘍を破壊又は損傷する任意の薬剤を含む。例えば、抗腫瘍剤は、毒物、例えば化学療法剤又は放射性同位体である。化学療法剤は、ペプチド及び非-ペプチドリンカーによる方法を含む一般的な方法を用いてジ-ダイアボディに複合化される（例えば、Hermentin and Seiler (1988) Behring Inst. Mitt. 82, 197-215を参照)。
ジ-ダイアボディは、診断目的のためのin vivo及びin vitroで有用な検出可能なシグナル発生剤に結合することもできる。シグナル発生剤は、外的な方法、一般的には電磁気放射線の測定によって検出できる測定可能なシグナルを発生する。ほとんどの場合には、シグナル発生剤は、酵素又は発色団、又は蛍光、リン光又は化学発光による光を放つ。発色団は、紫外領域又は可視領域で光を吸収する色素を含み、基質、又は酵素で触媒された反応の分解生成物でよい。
本発明は、処置又は第二試薬に組み込まれる診断薬と共に用いるジ-ダイアボディの使用を更に企画する。例えば、結合対の１メンバーは、本発明のジ-ダイアボディに結合される。抗新生物剤は、例えば、かかる対の第二メンバーに結合され、ジ-ダイアボディが結合される位置に向いている。好ましい実施態様では、ビオチンはジ-ダイアボディに複合化し、そのため、アビジン又はストレプトアビジンに複合化される抗新生物剤又は他の部分の標的を提供する。あるいは、ビオチン又は他のかかる部分は、本発明のジ-ダイアボディに結合し、例えば検出可能なシグナル-発生剤がアビジン又はストレプトアビジンに複合化する診断系では、レポーターとして使用される。
ジ-ダイアボディは、1以上の好適なアジュバント、例えばサイトカイン（例えば、IL-10及びIL-13)、又は他の免疫刺激剤例えばケモカイン、腫瘍-関連抗原及びペプチドに限定されない免疫刺激剤と組み合わせて投与することができる。しかしながら、理解されたいが、ダイアボディのみの投与は、治療上有効な方法で腫瘍の進行を抑制し、阻害し又は減じるために十分である。
ある実施態様では、RTKに結合し、かつリガンドに結合する別の抗原-結合タンパク質と組み合わせてリガンド結合を妨害する本発明の抗原-結合タンパク質を投与することが望ましい。リガンド結合抗体は当該分野では周知であり、例えば抗-VEGF（アバスチン（登録商標）；ベバチズマブ）を含む。
本発明のジ-ダイアボディは、抗新生物剤例えば化学療法剤又は放射性同位体を投与することによる併用療法でも用いられる。好適な化学療法剤は、当業者には公知であり、インリノテカン (CPT-11)、アントラサイクリン(例えばダウノマイシン及びデキソルビシン)、メトトレキサート、ビンデシン、ネオカルチノスタチン、シスプラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、5-フルオロウリジン、メルファラン、リチン及びカリケアマイシンを含む。ジ-ダイアボディ及び抗-新生物剤又は抗-血管新生剤は、脈管形成を阻害し及び/又は腫瘍成長を減少させるために効果的な量で患者に投与される。ジ-ダイアボディは、他の治療レジュメ、例えば放射線療法等の治療と組み合わせても投与される。組合せ療法の例については、例えば米国特許第6,217,866号明細書 (Schlessinger他) (抗新生物剤と組み合わせた抗-EGFR抗体); WO 99/60023 (Waksal他) (放射線と組合わせた抗-EGFR抗体)を参照。
任意の好適な抗新生物剤、例えば化学療法剤、放射線又はそれらの組合せが用いられる。当該分野で公知の又は評価されている抗新生物剤は、それらの標的又は作用様式に基づいて類にグループ化される。例えば、アルキル化剤は、特に限定されないが、シスプラチン、シクロホスファミド、メラファン及びダカルバジンを含む。抗-代謝物の例は、特に限定されないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、及びパクリタキセル、ゲンタビシン及びトポイソメラーゼ阻害剤イリノテカン (CPT-11)、アミノカンプトテシン、カンプトテシン、DX-8951f及びトポテカン (トポイソメラーゼI) 及びエトポシド (VP-16) 及びテニポシド (VM-26) (トポイソメラーゼII)を含む。放射線については、起源は、治療されるべき患者に対して、外部（外部ビーム放射線療法-EBRT）又は内部（近接照射療法）のいずれかでよい。かかる分類は、使用する抗新生物剤を選択するために有用である。例えば、IGFRに結合する抗体は、トポイソメラーゼ阻害剤と共に投与される場合に特に有効である。
投与される抗-新生物剤の用量は、多数の因子、例えば薬剤の種類、治療されるべき腫瘍の種類及び重度、及び薬剤の投与経路に依拠する。しかしながら、強調しておくが、本発明は任意の特定の例に限定されない。
併用療法では、ジ-ダイアボディは、別の薬剤を用いる開始療法の前に、開始療法中又は開始療法の後で、及びそれらの任意の組合せ、すなわち抗-新生物剤療法の開始前及び中、前及び後、中及び後、又は前、中及び後に、投与される。例えば、腫瘍又は新生物疾患の治療に関しては、ダイアボディは、放射線療法の開始前の、1〜30日間、好ましくは3〜20日間、より好ましくは5〜12日間投与することができる。本発明の好ましい実施態様では、化学療法は抗体療法と共に、前に又は後に投与される。
本発明では、任意の好適な方法又は経路が、本発明のジ-ダイアボディを投与するために、及び場合により、抗-新生物剤、受容体アンタゴニスト又は他の医薬組成物を共投与するために、使用することができる。例えば、本発明に従って利用される抗-新生物剤レジュメは、患者の腫瘍性症状を治療するために最も好適であると考えられる任意のレジュメを含む。異なった悪性腫瘍が、特異的な抗-腫瘍性ダイアボディ及び特異的な抗-新生物剤の使用を必要としてもよく、これらの使用は、患者基準で患者に対して決定されることになる。投与経路は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内投与を含む。投与される抗-新生物剤の用量は、多数の因子、例えば、新生物剤の種類、治療されるべき腫瘍の種類及び重度、及び抗-新生物剤の投与経路に依拠する。しかしながら、強調しておくが、本発明は任意の特定の投与方法又は投与経路に限定されない。
本発明のジ-ダイアボディは、予防又は治療の目的で哺乳動物に用いられる場合に、薬学的に許容される担体を追加的に含む組成物の形態で投与されることになる。好適な薬学的に許容される担体は、例えば、1以上の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及びそれらの組み合わせを含む。薬学的に許容される担体は、結合タンパク質の保存期間又は有効性を増加させる、少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、保存料又は緩衝剤を更に含んでもよい。注射用の組成物は、当該分野で周知であるが、哺乳動物に投与後に活性成分の迅速放出、徐放又は遅れた放出を提供するように調合することができる。
本発明は、ヒト化ジ-ダイアボディの治療上有効量を含む、腫瘍成長及び/又は脈管形成を阻害し又は他の疾患を治療するためのキットも含む。キットは、例えば、発癌又は脈管形成（例えば、上記のEGFR、VEGFR-1/Flt-1、VEGFR-2/Flk-1/KDR、IGFR、PDGFR、NGFR、FGFR等)に関連する、他の成長因子受容体の任意の好適なアンタゴニストを含んでもよい。あるいは、又は加えて、本発明のキットは、抗-新生物剤を更に含むことができる。本文脈における好適な抗-新生物剤の例は、本明細書に記載している。本発明のキットは、アジュバントを更に含むことができる；また、例は上に記載している。
当該分野で周知の研究的又は診断的方法のためのin vivo及びin vitroでの本発明のジ-ダイアボディの使用も、本発明の範囲内に含まれる。診断的方法は、本発明のジ-ダイアボディを含むキットを含む。
従って、本発明の受容体結合ジ-ダイアボディは、当該分野で周知の研究的、診断的、予防的又は治療的方法のためにin vivo及びin vitroで使用できる。当然のことながら、本明細書に開示されている本発明の原則の変更が、当業者によってなされ、かかる修飾が本発明の範囲内に含まれることになる、ことを理解及び予測されたい。
以下の実施例は、本発明を更に説明するものであるが、本発明の範囲を多少なりとも限定するものと解釈するべきでない。一般的な方法の詳細な説明、例えばベクター及びプラスミドの構築、ポリペプチドをコードする遺伝子のかかるベクター及びプラスミドへの挿入、プラスミドの宿主細胞への導入、及び遺伝子及び遺伝子産物の発現及びその決定で採用される一般的な方法は、Sambrook, J他, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 及びColigan, J. 他(1994) Current Protocols in Immunology, Wiley & Sonsを含む、多数の刊行物から得られる。本明細書に記載の全ての文献はその全体が組み込まれている。
細胞株及びタンパク質
一次-培養ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、37℃、5% CO2で、EBM-2培地 (Clonetics, Walkersville, MD) で維持した。ヒト白血球細胞、HEL及びU937は、10%のウシ胎児血清を含むRPMIで維持した。溶解性受容体融合タンパク質、キナーゼ挿入ドメイン-含有受容体 (KDR)-アルカリホスファターゼ（AP）の細胞外ドメイン、及びひれ-様チロシンキナーゼ受容体 (FIt-I)-APの細胞外ドメインは、安定にトランスフェクトされたNIH 3T3細胞で発現させ、(Lu 他(2000) J. Biol. Chem. 275: 14321-30）に記載のようにして、APに対する固定モノクローナル抗体を用いて、アフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。血管内皮成長因子 (VEGF165)タンパク質は、バキュロウイルスで発現させ、(Lu 他(2000)に記載の方法に従って精製した。KDR、scFv p1C11に対する単一鎖抗体を、KDR-AP融合タンパク質で免疫したマウスの脾臓細胞から構築したファージディスプレイライブラリーから単離した (Zhu 他(1998) Cancer Res. 58: 3209-14)。抗-Flt-1抗体、FBK612 (IgG1, κ)を産生するハイブリドーマ細胞株は、FIt-1-AP融合タンパク質で免疫したマウスから、ImClone Systems社 (New York, NY)で樹立した。FBK612、scFv612のタンパク質単一鎖種は、先に報告したハイブリドーマ細胞から単離した抗体可変遺伝子から構築した(Lu 他(2001)。
二重特異性ダイアボディの構築及び発現
2種の異なったVEGF受容体、KDR及びFlt-1に対する2つの抗体を、二重特異性ダイアボディの構築に使用した。P1C11は、KDRに特異的に結合し、KDR/VEGF相互作用を妨害するが、612はFIt-1に結合し、FIt-1がVEGFへ結合するのを妨害する。先につくった二価の二重特異性ダイアボディ DAB p1C11/612をコードする遺伝子は (WO 2004/003211)、四価のdi- diabodyを構築するためのテンプレートとして使用した。DAB p1C11/612内の「クロス-オーバー」scFv鎖の1つをコードする遺伝子は(Lu他(2000)、ヒンジ領域及びペプチドリンカー (EPKSCDKTHTCPPCGGGGSGGGGS)によってIgGのCH3ドメインをコードする遺伝子に最初に融合し、次いで、溶解性ジ-ダイアボディの発現のために、得られた融合ポリペプチドをそのパートナーである他の「クロス−オーバー」scFv鎖と共に発現ベクターにサブクローニングした（図１）。精製及びアッセイ目的でより小さなポリペプチド鎖のC-末端に、13-アミノ酸Eタグを加えた (Lu他, 2000)。当該ポリペプチドをコードする全ての配列は、DNA配列決定によって確認した。
ジ-ダイアボディの発現及び精製
ダイアボディは、先に記載の方法 (Lu他, 2000; Zhu他, 1998)に従って振盪フラスコ中で30℃で成育した発現プラスミドを含む大腸菌株HB2151から抽出した。細胞のペリプラスム抽出物は、20% (w/v) ショ糖、200 mM NaCl、1 mM EDTA及び0.1 mM PMSF5を含む25 mM Tris (pH 7.5)中で細胞ペレットを再懸濁し、次いで４℃で1時間緩やかに振盪することにより、調製した。12,000 rpm (17211 x g)で20分間、遠心分離後、ダイアボディを、RPAS Purification Module (Amersham Pharmacia Biotech)を用いる抗-Eタグアフィニティクロマトグラフィーによって上清から精製した。ダイアボディの調製物の純度を試験するために、精製タンパク質を4〜20%グラジエントポリアクリルアミドゲル (Novex, San Diego, CA)で電気泳動し、Colloidal Blue Stainキット(No vex)で染色して視覚化した。
ジ-ダイアボディは、哺乳動物COS細胞中でも発現した。各々が、同一の免疫グロブリンリーダーVLペプチド配列とそのN-末端上で融合する2つのポリペプチドをコードする核酸 (Zhu他, 1998)を単一発現ベクター（Lonza Biologies社由来のグルタミンシンテターゼ発現系）にクローン化した。製造者の教示 (Invitrogen)に従って、サブコンフルエントCOS細胞を、リポフェクタミンを用いて発現ベクターでトランスフェクトした。細胞を無血清培地で培養し、トランスフェクション後48〜72時間に上清を回収した。細胞残骸を除くために遠心分離した後、上記のRPAS Purification Moduleを用いて上清からジ-ダイアボディを精製した。
精製ジ-ダイアボディの収量は、振盪フラスコ中の終夜の細菌培養物の1リットル当たり150〜250μg、及び哺乳動物の培養物のトランスフェクション後48〜72時間の上清の1リットル当たり約800〜1250μgの範囲であった。大腸菌発現「ジ-ダイアボディ(b)」及び哺乳動物発現「ジ-ダイアボディ(M)」由来の、精製されたジ-ダイアボディ調製物の組成及び純度をSDS-PAGEを用いて分析した（図2）。二重特異性ダイアボディの「クロス-オーバー」scFvの成分も、電気泳動により解析した。非-還元性条件下で、二価の二重特異性ダイアボディ、DAB p1C11/612は、2つの「クロス-オーバー」scFvポリペプチド鎖のそれぞれ1つを表す、2つのバンドを与えた（図2A、レーン3）（上のバンド及び下のバンドは、それぞれ、理論的分子量 26693.8及び25179.6 ダルトン）。ジ-ダイアボディ調製物はまた2つの主なバンドを与え（図2A、レーン4）、下のバンドは「クロス-オーバー」scFv鎖（DAB p1C11/612でのバンドと同じ）を示し、上のバンドは、二量体で「クロス-オーバー」scFv-ヒンジ-CH3融合体を示す（理論的分子量 79175.3ダルトン）。還元性条件下（図2B）では、ジ-ダイアボディは、2つのバンドを与えた：下のバンドは最初の「クロス-オーバー」scFv鎖を、上のバンドはモノマー体で還元されたscFv-ヒンジ-CH3融合体に対応する。予測したとおり、単一特異的な二価ダイアボディDAB 612は、還元性条件及び非-還元性条件下で1つの主なバンドを与えた（レーン2、理論的分子量 26916.9ダルトン)。DAB p1C11は2つのバンドを与えた(レーン1): 上のバンドは、完全なE-タグを有する単一ポリペプチド、VL-G4S-VHに対応し(理論的分子量 26542.4ダルトン); 下のバンドは、E-タグ分解物を有する同一のポリペプチドを示す。
溶液中の抗体分子量の決定
精製されたジ-ダイアボディの分子量は、先に述べた方法 (Folta-Stogniew及びWilliams, 1999) に従って、分子篩クロマトグラフィー/多角的光散乱(SEC-MALS)分析によって決定した。すなわち、25〜50μgの各精製抗体の100μl PBS (pH 7.0)調製物を、UV及び屈折率検出器 (Agilent 1100, Agilent, Palo Alto, CA) を備えたHPLCシステムに連結した、Bio-Sep 3000カラム (Phenomenex, Torrance, CA)に充填し、次いでMini-Dawn LS (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA)に供した。カラムをPBS (pH 7.0)で平衡化し、0.5 ml/分の流速で操作した。ASTRAソフトウェア (Wyatt Technology) を用いて8.3μl間隔の溶出タンパク質ピークの全体から、重量平均分子量 (Mw) を計算した。全ての試料にZimm fit法を適用し、先に記載のように実行した (Folta-Stogniew 他(1999) J. Biomol. Tech. 10: 51-63)。
ジ-ダイアボディは、SECに3つの区別可能なピークを与えた。ASTRA-計算Zimm分析は、132 kDのMw値を有する単一分散ピーク（集団の75%）、270 kDのMw値を有する単一分散ピーク（集団の20%）及び470 kDのMw値を有する多分散ピーク（集団の75%）を示した。計算した統計的分子量に基づいて、132 kDピークは、正確に折り畳まれた単量体のジ-ダイアボディを示し、270 kDピークは、ジ-ダイアボディの二量体を示し、多分散470 kDピークは、オリゴマー状態の不均一集団である。対照として、理論的分子量150 kDを有する完全なIgG抗体は、150 kDの推定Mw値を有する単一ピークを与え、同一条件下で、理論的分子量60 kDを有するダイアボディは、62 kDの推定Mw値を有する単一ピークを与えた。これらの結果は、すなわち、精製ジ-ダイアボディの調製物の95%（75%単量体及び20%二量体ジ-ダイアボディ集団）が正確に折り畳まれた四価分子である、ことを示唆している。
二重特異性ダイアボディの二重特異性及び抗原-結合反応速度
二重特異性ジ-ダイアボディの二重抗原結合能力を決定するために、2つのELISAアッセイを行った。第一に、ジ-ダイアボディがその標的抗原の両方を同時に結合することができるか否かを試験するために、架橋アッセイを用いた。1 mMのジチオスレイトール (DTT) の存在下に、Flt-1-Fc融合タンパク質 (1μg/ml x 100μl/ウェル、終夜、4℃)で予備被覆した96-ウェルMaxi-sorpマイクロタイタープレート(Nunc, Roskilde, Denmark)で、室温で1時間、単一特異的ダイアボディ、二重特異的ダイアボディ及びジ-ダイアボディを最初にインキュベートした。0.1% Tweenを含むPBS (PBST) で3回、プレートを洗浄し、次いでKDR-AP融合タンパク質 (100 ng/ウェル) で室温で更に1時間、インキュベートした。次いで、プレート-結合KDR-APをAP基質、p-ニトロフェニルリン酸塩(Sigma, St. Louis, MO)の添加によって定量し、405 nmの吸光度を読み取った(Zhu他, 1998)。
これらの条件下、ジ-ダイアボディを、各々が単一ダイアボディ-CH3融合体からなる2つの半分子に還元した (図１)。還元された二価の二重特異性ダイアボディ及びジ-ダイアボディは、つの標的抗原に架橋することができたが、単一特異的なダイアボディ (DAB p1C11及びDAB 612) は架橋することができなかった（図3、上パネル）。この観察は、ジ-ダイアボディ、すなわち2つのダイアボディ-CH3融合体の二量体が、4つの抗原-結合部位 (各CH3アームに2つ) を有する、ことを示している。
第二アッセイ、直接的な結合アッセイでは、ダイアボディの様々な量を、KDR又はFlt-1-被覆96-ウェルプレートに添加し、プレートをPBSで3回洗浄した後、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを100μlの抗-Eタグ抗体-HRPコンジュゲート (Amersham Pharmacia Biotech) で室温で1時間、インキュベートした。プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を加え、先に述べた方法に従って450 nmの吸光度を読み取った (Lu他, 1999; 2000)。
全ての二重特異性ダイアボディは、用量依存的にKDR及びFlt-1に結合する (図3)。それぞれの場合に、哺乳動物細胞から発現されたジ-ダイアボディは最も有効な結合体であり、以下：ジ-ダイアボディ (M) (哺乳動物産生) > ジ-ダイアボディ (B) （大腸菌産生) > DAB p1C11 > DAB p1C11/612 (KDR結合について)、又はジ-ダイアボディ (M) > DAB 612 > ジ-ダイアボディ (B) > DAB p1C11/612 (Flt-1結合について)、の結合効率を有する。予測されるように、KDR-特異性DAB p1C11は、Flt-1に結合せず、また、Flt-1-特異的DAB 612は、KDRに結合しなかった。
KDR及びFlt-1に対するダイアボディの結合速度を、BIAcoreバイオセンサ (BIAcore 3000, Biacore, Inc., Uppsala, Sweden)を用いて測定した。センサーチップ (CM5 Research Grade, Biacore, Inc.) 上にKDR-AP又はFlt-1-AP融合タンパク質を固定し、溶解性抗体を1.5 nM〜200 nMのPBS溶液の濃度範囲で、10μl/分の流速で注入した。各濃度でのセンサーグラムを得、プログラムBIA Evaluation 2.0を用いて評価し、結合速度定数 (kon) 及び解離速度定数(koff)を決定した。速度定数比 koff/konから、親和定数 (Kd) を計算した。
二価DAB p1C11/612のKDR結合特性（反応速度及び親和性）は、scFv p1C11の結合特性と同じであった（表1）。四価のジ-ダイアボディは、一価のscFv p1C11を越える若干改善された分解速度 (koff) を示し、分解速度は二価 (単一特異的な) DAB p1C11の分解速度に近かった。scFv 612の二価ダイアボディへの変換は、Flt-1に対する結合親和性において劇的な改善（約10-倍）をもたらした。ジ-ダイアボディ調製物は、Flt-1について、二価のDAB p1C11/612に対する同様の総結合親和性を示し、有意差は、2つの調製物の各々の結合反応速度定数で観察された。大腸菌-由来のジ-ダイアボディ (B)は、scFv 612及びDAB p1C11/612の速度定数と非常に近い速度定数を示したが、哺乳動物細胞-由来の材料は、非常に遅い会合速度 (kon) 、及び二価のDAB 612の分解速度(koff)に近い顕著に改善された分解速度を示した。
Figure 2008512352
二重特異性ダイアボディの二重妨害活性
上記のプロトコールに従ってアッセイを行った (Lu他, 1999; 2000)。ダイアボディの様々な量を、KDR-AP (100 ng) 又はFlt-1-AP融合タンパク質(100 ng)の一定量と混合し、室温で1時間、インキュベートした。次いで、VEGF165 (200 ng/ウェル)で予備被覆した96-ウェルマイクロタイタープレートをPBSで5回洗浄した後、混合物を当該プレートに移し、プレートを室温で更に2時間インキュベートした。AP用基質を加え、次いで405nmでの吸光度を読み取り、プレート-結合KDR-AP又はFlt-1-AP分子を定量した。次いで、IC50、すなわちVEGFに対するKDR又はFlt-1結合の50%阻害に必要とされる抗体濃度を計算した。
図4は、用量依存的に、ダイアボディが、溶解性KDR及びFlt-1の固定化VEGFへの結合を妨げることを示す。結合アッセイで見られる同一のパターンに従い、四価のジ-ダイアボディ調製物は、二価のダイアボディであるDAB p1C11/612よりも、KDR/VEGF及びFlt-1/VEGFの相互作用により強力なブロッカーであった。KDR阻害のIC50値は、DAB p1C11/612の1.2 nM、及び単一特異的な二価のDAB p1C11の0.8 nMと比べて、ジ-ダイアボディ調製物について約0.4 nMであった。Flt-1阻害のIC50は、ジ-ダイアボディ調製物について約1 nMであり、DAB p1C11/612について8 nM、及び単一特異的な二価のDAB 612について0.2 nMであった。予想したように、DAB p1C11は、Flt-1/VEGF相互作用に何の影響も及ぼさず、DAB 612も、KDR/VEGF相互作用に何の影響も及ぼさなかった。
白血球のVEGF-誘導移動の阻害
ジ-ダイアボディを、VEGF-誘導細胞移動を阻害するその活性について試験した。2つのヒト白血球細胞株、すなわちKDR及びFlt-1を発現するHEL、及びFlt-1のみを発現するU937を使用した。白血球細胞であるHEL及びU937は、無血清の単純なRPMI 1640培地で3回洗浄し、当該培地で1 x 106/mlに懸濁した。100μlの細胞懸濁液のアリコートを、8μm-孔トランスウェル (transwell inserts) (Costar（登録商標）, Corning Incorporated, Corning, NY) に加え、37℃で30分間、様々な濃度、100 nM、25 nM及び6.25 nMの抗体でインキュベートした。次いで、インサートを、VEGF165を含むか又は含まない0.5 mlの無血清RPMI 1640を含む24-ウェルプレートのウェルに入れた。37℃、5% CO2で4時間、移動を行った。移動細胞をより低画分から集め、光学顕微鏡下でカウントした。
DAB p1C11及びDAB 612は、HEL細胞のVEGF-誘導移動を効果的に阻害したが、U937細胞移動は、DAB 612によって阻害されるにすぎず、DAB p1C11によっては阻害されなかった（図5）。二価のダイアボディ及び四価のジ-ダイアボディを含む二重特異性ダイアボディは、試験した全ての3つの異なった抗体濃度で、HEL及びU397細胞のVEGF-誘導移動に対する同程度の強力な阻害剤であった。予測したとおり、インシュリン-様成長因子受容体であるA12に対する対照抗体は、これらのアッセイで、VEGF-誘導細胞移動に有意な阻害を示さなかった。
ジ-ダイアボディの安定性
様々なダイアボディ調製物を、最高72時間まで、37℃で、PBS又はマウス血清中でインキュベートした。試料のアリコートを24時間及び72時間で除去し、上記のELISAアッセイを用いて、KDR及びFlt-1に対する結合効率をアッセイした。
ジ-ダイアボディの安定性を、KDR及びFlt-1に対する結合活性試験によって調べた。図6から明らかなように、二価の二重特異性ダイアボディであるDAB p1C11/612、及び単一特異性ダイアボディであるDAB p1C11及びDAB 612は、PBS及びマウス血清中で、37℃でインキュベートした後、各々の標的に対する完全な抗原結合活性を維持した。試験した各々の時点では、哺乳動物細胞-由来のジ-ダイアボディ（M）調製物は、大腸菌-由来の調製物に比べて、より優れた抗原-結合活性を維持した。24時間で、ジ-ダイアボディ (M)は、最初のKDR-結合活性の94%を示し、これに対して、ジ-ダイアボディ (B)は83%の結合活性を示した。72時間で、ジ-ダイアボディ (M)は、KDR及びFlt-1に対してそれぞれ77%及び92%結合活性を維持し、これに対して、ジ-ダイアボディ (B)は63%及び86%の結合活性を示した。
抗-EGFR/抗-IGR-IR ジ-ダイアボディの構築及び産生
二重特異的ジ-ダイアボディを構築するために、完全なヒト抗-EGFR抗体 (IMC-11F8) 及び完全なヒト抗-IGF-IR抗体 (IMC-A12) を用いた。二重特異性ジ-ダイアボディを上記のように構築し、次いで、IgGのFcドメインに、ダイアボディ クロス-オーバーscFv鎖の1つを融合した（詳細は、図7A及び7B参照）。哺乳動物細胞での、他のクロス-オーバーscFvとのFc融合体の共-発現は、2つの異なった特異性を有するIgG-様四価分子をもたらした（図7B）。ジ-ダイアボディは、無血清条件下で安定にトランスフェクトされたNSO細胞により産生し、プロティンAアフィニティカラムによって細胞培養上清から精製した。非-還元性条件下での精製されたダイアボディの電気泳動分析は、予想した移動性を有する2つの主なタンパク質バンド、すなわち二量体（分子量約100 kD) のFc融合体 (上バンド)、及び単量体 (分子量約25 kD) のクロス-オーバーscFv(下バンド)を与えた (図7C、レーン2)。IMC-11F8すなわちIgGは、約150 kDの単一タンパク質バンドを与えた (図7C、レーン1)。還元性条件下では、ジ-ダイアボディはまた、2つのバンドを生じた：50 kDの上バンド（単量体でのFc融合体を示す）及び25 kDの下バンド（クロス-オーバーscFv）(図7D、レーン2)。対照として、IMC-11F8は2つの主なバンドを与えた：IgG重鎖 (50 kD)及びIgG軽鎖 (25 kD) (図7D、レーン1)。
ジ-ダイアボディはEGFR及びIGFRに結合する
ジ-ダイアボディがEGFR及びIGFRに結合することができた、ことを証明するために2つのアッセイを用いた。ジ-ダイアボディが標的に同時に結合することができたか否かを決定するために架橋アッセイを用いた。様々な抗体を最初に溶液中でビオチン-標識IGFRでインキュベートし、次いでEGFRで被覆した96-ウェルプレートに移し、ストレプトアビジン-HRPでインキュベートし、プレート-結合ビオチン活性、すなわち、抗体によって固定化EGFRに架橋されたIGFRの量を測定した。図8Aから明らかなように、単一特異性IMC-11F8又はIMC-A12ではなく、ジ-ダイアボディのみが溶液中で固定化EGFRにIGFR架橋することができた。
ジ-ダイアボディの抗原-結合効率をその単一特異性対応物と比較するために、直接的な結合アッセイを用いた。IMC-A12及びIMC-11F8は、その各々の標的に結合するのみであったが、ジ-ダイアボディは、その単一特異性対応物と比べてどちらかと言うと低効率で、固定化EGFR及びIGFRに反応した（図2B及び2C）。ED50値、すなわち、EGFRに対する（50%の最高結合を与える抗体濃度）は、IMC-11F8については0.05 nM、ジ-ダイアボディについては0.1〜0.2 nMであり、IGFRに対する（50%の最大結合を与える抗体濃度）ED50値は、IMC-A12については0.1 nM、ジ-ダイアボディについては0.25〜0.5 nMであった。
ジ-ダイアボディによるin vitroでの腫瘍細胞増殖阻害
腫瘍細胞増殖のin vitroでの阻害におけるジ-ダイアボディの有効性を、よく知られた腫瘍細胞株DiFiを用いて確立した。当該腫瘍細胞株は、生存及び成長についてEGFRに依拠することが知られている。抗-EGFR抗体 (IMC-11F8)はDiFi細胞の増殖を有意に阻害したが、抗-IGFR抗体 (IMC-A12) 及び対照抗体 (IMC-1121；抗-KDR)はほとんど阻害しなかった(図9)。DiFi細胞の増殖は、IMC-11F8よりも高い濃度であったが、ジ-ダイアボディによっても阻害された。
IC50値は、IMC-11F8 (単独)では約1 nM、IMC-11F8及びIMC-A12の共投与組み合わせでは1 nM、及びジ-ダイアボディでは25 nMであった。
EGF及びIGFシグナル変換経路の妨害
EGF及びIGF-刺激受容体リン酸化及びダウンストリームシグナル変換を妨害する効率について、ジ-ダイアボディをアッセイした。MCF-7細胞のEGF又はIGFでのインキュベーションは、各々の受容体の有意なリン酸化をもたらす：EGF及びIGFの組み合わせによるインキュベーションは、EGFR及びIGFRの活性化をもたらした (図10A、レーン2、3及び4)。予想したとおり、腫瘍細胞がEGF及びIGFによって刺激される場合には、IMC-A12又はIMC-11F8による処理は、その対応する受容体のみのリン酸化を阻害した (図10A、レーン6及び7)。一方、ジ-ダイアボディは、IMC-11F8及びIMC-12の混合物と類似し、両受容体の活性化を顕著に妨害した (図10A、レーン5及び8)。対照抗体すなわちIMC-1121は、EGFR及びIGFRのリン酸化に何の影響も及ぼさなかった（図10A、レーン9）。
IMC-11F8、IMC-A12及びジ-ダイアボディの、Akt及びp44/p42 MAPキナーゼ (EGFR及びIGFRに関連する2つの主なダウンストリームシグナル変換分子) に対する効果も、MCF-7細胞で試験した (図10B)。IGFによる刺激は、Aktの有意なリン酸化をもたらすが (図10B、レーン2)、EGFは、p44/p42 MAPKの強力なリン酸化を起こす（図10B、レーン3)。予想したとおり、IGF及びEGFの組み合わせは、Akt及びp44/p42 MAPKの活性化を導く (図10B、レーン4)。EGF及びIGFの存在下では、IMC-11F8は、MAPKの活性化を有意に阻害したが、Aktの活性化を中程度に阻害しただけであり（図10B、レーン7)、一方、IMC-A12は、Aktリン酸化を強く減少させたが、p44/p42 MAPK活性化にはほとんど効果がなかった（図10B、レーン6)。IMC-A12及びIMC-11F8の組み合わせと同様に（図10、レーン8)、ジ-ダイアボディは、EGF及びIGFにより誘導されるAkt及びp44/p42 MAPKのリン酸化を効果的に妨害した（図10B、レーン5)。
IGFR内在化及び分解
IMC-A12は、細胞表面発現IGFRの、迅速かつ効率的な内在化及び分解を誘導することが見出された (Burtrum他, 2003, Cancer Res. 63: 8912)。ジ-ダイアボディは、腫瘍細胞上のIMC-A12の受容体調節活性を維持した。このことは、37℃で4時間インキュベートした後のMCF-7細胞における有意なIGFR内在化及び分解を引き起こした (図11A及びB)。ジ-ダイアボディによるインキュベーションは、BxPC3細胞中のIGFRの有意な分解ももたらした (図11C)。このジ-ダイアボディのIGFR調節効果は、IMC-A12の効果と同様の、用量依存的に最大の効果である、100 nMの抗体濃度を達成し (図11A)、及び、37℃で4時間インキュベーション後のBxPC3細胞において、時間依存的にIGFRの90%より多く分解した (図11C)。IGFR調節は、リガンド (IGF)、IMC-11F8又はIMC-1121 (抗-VEGFR-2)でのインキュベーションで観察されなかった。
腫瘍細胞に対するADCCの介在
成長因子/受容体相互作用及びダウン-レギュレーティング受容体表面発現を妨げることによる成長シグナルを妨害することに加えて、抗腫瘍IgG抗体は、効果的なADCCを介在することによって直接的な腫瘍細胞殺傷を引き起こすこともできる。ヒトエフェクター細胞の存在下で腫瘍細胞殺傷を介在するジ-ダイアボディの能力を試験した。図12から明らかなように、IMC-11F8は、A431及びBxPC3細胞に対する溶解活性を証明したが、MCF-7細胞に対しては有効でなかった。IMC-A12はMCF-7細胞に対してのみ効果的であるが、A431及びBxPC3細胞を殺傷できなかった。ジ-ダイアボディは、3つの腫瘍株の全ての殺傷を介在した。
ヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の成長阻害
ジ-ダイアボディの抗腫瘍活性を試験し、単一特異性親抗体と比較した。200〜300 mm3の樹立異種移植片を担持するヌードマウスを、腹腔内注射によって週に2回、様々な抗体で処置した。BxPC3膵臓腫瘍異種移植片の第一モデル (図13A)では、処置の開始後6週で、IMC-11F8及びIMC-A12のみが（40 mg/kgで）有意な腫瘍成長阻害を示した（それぞれ、77%及び58%）。ジ-ダイアボディ（40 mg/kg）は、同一用量を与えた時に、個々の親抗体に対して同様な抗腫瘍活性（52%腫瘍成長阻害）を示した。IMC-11F8及びIMC-A12 (40 mg/kgの各抗体)の組み合わせは、最高の抗腫瘍活性を示した。但し、ジ-ダイアボディの2倍の総抗体を用いた。
BxPC3の結果と一致して、HT29異種移植片は、ジ-ダイアボディによる処置に比べて、個々の抗-EGFR抗体又は抗-IGFR抗体による処置にはほとんど反応しなかった (図13B)。In vitro及びin vivoでの抗腫瘍活性に関してIMC-11F8と機能的に同等な抗-EGFR抗体である、IMC-A12又はIMC-C225のいずれかによる処置（Marie, P.他, 2004, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 45, Abstract #5353）は、40日経過処理では、それぞれ47%及び35%の腫瘍阻害をもたらした（生理食塩水及びヒトIgG群と比べて、p<0.03)。ジ-ダイアボディは、58%の腫瘍成長阻害率をもたらした、これは、IMC-C225及びIMC-A12の組み合わせによって達成された阻害率に匹敵する（63%腫瘍成長阻害）。腫瘍阻害全体では統計的な有意差はないが、試験の終盤では、ジ-ダイアボディで処置された群、抗体の組み合わせで処置された群又は個々の抗体で処置された群の間では、有意差がある。
図1は、様々な抗体断片の発現構築物を示す概念図である。ジ-ダイアボディにおいて、2つのscFvポリペプチド鎖の第一は、IgGヒンジ及びCH3ドメインに融合した。ダイアボディは、第一及び第二scFv鎖の会合から得られる。四量体構造は、ヒンジ及びCH3素メインによって会合する2つのダイアボディによって形成される。G4S: 5アミノ酸リンカー「GGGGS」。E: 13アミノ酸E-タグ。 図2Aは、精製抗体段断片にSDS-PAGE分析を示す。パネルA：非還元性条件；レーン1: ダイアボディ(DAB) p1C11; レーン2: DAB 612; レーン3: DAB p1C11/612; レーン4: ジ-ダイアボディ(B); レーン5：ジ-ダイアボディ(M)。非還元性条件下で実行される分子量平均も示す（上から下へ、それぞれ: 176.5、113.7、80.9、63.8、49.5、37.4、28.0及び19.6 kDa)。 図2Bは、精製抗体段断片にSDS-PAGE分析を示す。パネルB: 還元性条件; レーン1: ダイアボディ(DAB) p1C11; レーン2: DAB 612; レーン3: DAB p1C11/612; レーン4: ジ-ダイアボディ(B); レーン5：ジ-ダイアボディ(M)。非還元性条件下で実行される分子量平均も示す（上から下へ、それぞれ: 176.5、113.7、80.9、63.8、49.5、37.4、28.0及び19.6 kDa)。 図3Aは、KDR及びFlt-1に特異的なジ-ダイアボディの、二重特異性でかつ用量-依存的結合を示す。上パネル：Flt-1-被覆支持体及び溶解性KDR-APを用いる架橋アッセイ。 図3Bは、KDR及びFlt-1に特異的なジ-ダイアボディの、二重特異性でかつ用量-依存的結合を示す。中及び下パネル：様々な濃度の抗体断片がKDR又はFlt-1-被覆支持体に結合し、第二HRPコンジュゲート試薬でインキュベートした。ペルオキシダーゼでインキュベーション後、OD 450nmを読み取った。データは、3点試料の平均±SDを示す。 図3Cは、KDR及びFlt-1に特異的なジ-ダイアボディの、二重特異性でかつ用量-依存的結合を示す。中及び下パネル：様々な濃度の抗体断片がKDR又はFlt-1-被覆支持体に結合し、第二HRPコンジュゲート試薬でインキュベートした。ペルオキシダーゼでインキュベーション後、OD 450nmを読み取った。データは、3点試料の平均±SDを示す。 図4Aは、二重特異性抗体断片による固定化VEGFへのKDR及びFlt-1の結合の阻害を示す。様々な濃度の抗体断片を、所定量のKDR-AP又はFlt-1-AP融合タンパク質でインキュベートした。結合されたKDR-AP又はFlt-l-APを、ペルオキシダーゼ基質でインキュベートし、OD 405nm測定により定量した。データは、3点試料の平均±SDを示す。 図4Bは、二重特異性抗体断片による固定化VEGFへのKDR及びFlt-1の結合の阻害を示す。様々な濃度の抗体断片を、所定量のKDR-AP又はFlt-1-AP融合タンパク質でインキュベートした。結合されたKDR-AP又はFlt-l-APを、ペルオキシダーゼ基質でインキュベートし、OD 405nm測定により定量した。データは、3点試料の平均±SDを示す。 図5Aは、二重特異性抗体断片によるヒト白血球のVEGF-誘導移動の阻害を示す。支持体上のHEL又はU937細胞を、様々な濃度の抗体でインキュベートし、VEGFを含むウェルに入れた。移動細胞を回収し、カウントした。データは、3点測定の平均±SDである。 図5Bは、二重特異性抗体断片によるヒト白血球のVEGF-誘導移動の阻害示す。支持体上のHEL又はU937細胞を、様々な濃度の抗体でインキュベートし、VEGFを含むウェルに入れた。移動細胞を回収し、カウントした。データは、3点測定の平均±SDである。 図6Aは、PBS又はマウス血清中でインキュベートしたジ-ダイアボディ調製物の安定性を示す。ジ-ダイアボディを、最高72時間、37℃で、PBS又は血清でインキュベートした。データは、PBS中で4℃でインキュベートした試料の抗原結合活性のパーセンテージと比較した、37℃でインキュベーション後に保持された各抗体調製物の抗原結合活性のパーセンテージとして示す。データは、3点試料の平均±SDを示す。 図6Bは、PBS又はマウス血清中でインキュベートしたジ-ダイアボディ調製物の安定性を示す。ジ-ダイアボディを、最高72時間、37℃で、PBS又は血清でインキュベートした。データは、PBS中で4℃でインキュベートした試料の抗原結合活性のパーセンテージと比較した、37℃でインキュベーション後に保持された各抗体調製物の抗原結合活性のパーセンテージとして示す。データは、3点試料の平均±SDを示す。 図6Cは、PBS又はマウス血清中でインキュベートしたジ-ダイアボディ調製物の安定性を示す。ジ-ダイアボディを、最高72時間、37℃で、PBS又は血清でインキュベートした。データは、PBS中で4℃でインキュベートした試料の抗原結合活性のパーセンテージと比較した、37℃でインキュベーション後に保持された各抗体調製物の抗原結合活性のパーセンテージとして示す。データは、3点試料の平均±SDを示す。 図6Dは、PBS又はマウス血清中でインキュベートしたジ-ダイアボディ調製物の安定性を示す。ジ-ダイアボディを、最高72時間、37℃で、PBS又は血清でインキュベートした。データは、PBS中で4℃でインキュベートした試料の抗原結合活性のパーセンテージと比較した、37℃でインキュベーション後に保持された各抗体調製物の抗原結合活性のパーセンテージとして示す。データは、3点試料の平均±SDを示す。 図7は、EGFR及びIGFRに特異的な結合部位を有するジ-ダイアボディの構築及び産生を示す。パネル(A)及び(B)は、発現構築物を示す概略図である。L: リンカー (Arg-Thr-Val-Ala-Ala); H: IgG1ヒンジ領域。精製di- diabody調製物は、非-還元性(C)又は還元性(D)条件下、SDS-PAGEで分析した。レーン1: IMC-11F8 IgG; レーン2: ジ-ダイアボディ。左側に分子量標準も示す。 図8Aは、EGFR x IGFR ジ-ダイアボディの、二重特異性でかつ用量-依存的な結合を示す。(A)：受容体架橋アッセイ。最初に抗体調製物をビオチン-標識IGFRでインキュベートし、次いでEGFRで被覆したマイクロタイタープレートに移し、ストレプトアビジン-HRPでインキュベートして、プレート-結合ビオチン活性を測定した。 図8Bは、EGFR x IGFR ジ-ダイアボディの、二重特異性でかつ用量-依存的な結合を示す。(B) 及び (C)：固定化EGFR及びIGFRへのジ-ダイアボディの用量-依存的結合。様々な量の抗体を、ヒトEGFR (B) 又はIGFR 細胞外ドメインで被覆した96-ウェルプレート中でインキュベートした。(C)：洗浄し、ウサギ抗-ヒトIgG Fc-HRPコンジュゲートでインキュベートした。ペルオキシダーゼ基質を加え、OD 450nmを測定した。データは、3点試料の平均±SDを示す。 図8Cは、EGFR x IGFR ジ-ダイアボディの、二重特異性でかつ用量-依存的な結合を示す。(B) 及び (C)：固定化EGFR及びIGFRへのジ-ダイアボディの用量-依存的結合。様々な量の抗体を、ヒトEGFR (B) 又はIGFR 細胞外ドメインで被覆した96-ウェルプレート中でインキュベートした。(C)：洗浄し、ウサギ抗-ヒトIgG Fc-HRPコンジュゲートでインキュベートした。ペルオキシダーゼ基質を加え、OD 450nmを測定した。データは、3点試料の平均±SDを示す。 図9は、EGFR x IGFR ジ-ダイアボディの抗増殖性活性を示す。様々な量の抗体を4日間培養液中でDiFi細胞と共にインキュベートし、4時間MTTでインキュベートした。プレートを洗浄し、室温で10分間、HCl/イソプロパノールでインキュベートし、光学密度を570nmで読み取った。データは3点試料の平均±SDを示す。 図10は、受容体及びダウンストリームシグナル分子であるAkt及びMAPK p44/p42のEGF及びIGF-刺激活性化の阻害を示す。37℃で30分間、様々な抗体でMCF-7細胞をインキュベートし、37℃で20分間、EGF、IGF又は両方で刺激した。EGFR、IGFR並びにAkt及びMAPK p44/p42のリン酸化を分析した。レーン1、未処置；レーン2、IGF単独；レーン3、EGF単独；レーン4、IGF及びEGF；レーン5〜9、ジ-ダイアボディの存在下にIGF及びEGF（レーン5）、IMC-A12の存在下にIGF及びEGF（レーン6）、IMC-11F8の存在下にIGF及びEGF（レーン7）、IMC-A12及びIMC-11F8の存在下にIGF及びEGF（レー8）、又は陰性対照（レーン9、IMC-1121、抗-VEGFR2)。結果は、3つの別個の実験の代表例である。BxPC3及びHT29細胞を標的細胞として使用した場合には、同様な結果も観察された。 図11は、腫瘍細胞内のIGFR内在化及び分解を示す。腫瘍細胞をプレートに播き、無血清培地で終夜インキュベートした。次いで、IGF-I、EGF (50 nM)、IGF及びEGF (I+E)、又は様々な抗体を加え、最高4時間、37℃でインキュベートした。細胞を氷冷PBSで洗浄し、溶解し、4〜12% トリス-グリシンゲルを用いて電気泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、抗体C-20 (ウサギ抗-IGFR）及びIMC-11F8 (ヒト抗-EGFR）を用いてウェスタンブロッティングにより検出し、抗-ウサギ又は抗-ヒト抗体-HRPコンジュゲートで検出した。シグナルをECL試薬で視覚化した。(A)：MCF-7細胞中の用量-依存的なジ-ダイアボディ誘導IGFR分解。(B)：37℃で4時間インキュベーション後のIMC-A12及びIMC-A12とIMC-11F8との組み合わせのような効率的なジ-ダイアボディ (100 nM)誘導IGFR分解。(C)：37℃でインキュベートした場合の、時間-依存的なBxPC3細胞中でのジ-ダイアボディ (100 nM)誘導IGFR分解。DAb、ジ-ダイアボディ; A+F、IMC-A12及びIMC-11F8; 1121、対照抗体MC-1121。 図12は、ヒトPBMCの存在下でのジ-ダイアボディ依存性ADCCを示す。腫瘍細胞を、IMC-11F8、IMC-A12、ジ-ダイアボディ又は正常ヒトIgGで、96-ウェルプレートのウェル中で、37℃で30分間インキュベートし、100/1のエフェクタ/腫瘍細胞比でPBMCを加え、37℃で更に4時間インキュベートした。1500 rpmで10分間、遠心分離した後、100μlの上清を96-ウェル平底プレートに移し、100μl/ウェル LDHアッセイ試薬を添加し、490nmの吸光度を読み取った。「材料及び方法」で記載したように、特異的細胞溶解物のパーセンテージを計算した。データは3点測定の方法を示す。 図13は、ジ-ダイアボディによるヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の成長阻害を示す。雌性胸腺欠損nu/nuマウスに、BxPC3 (2 x 106/マウス）又はHT-29 (5 x 106/マウス）腫瘍細胞を用いて外側背面に皮下注射した。腫瘍が約200〜300 mm3に近づいた時、腫瘍サイズによってマウスをランダム化し、処置群に分けた。IMC-11F8 (又は等価なIMC-C225)、IMC-A12、IMC-11F8 (又はIMC-C225）及びIMC-A12、ジ-ダイアボディ、又は対照物 (生理食塩水又は標準ヒトIgG) によってマウスを処置した。各抗体を週に2回、40 mg/kgで腹腔内投与した。腫瘍体積及び各動物の体重を週に2回測定した。データは、各群、10〜12動物の腫瘍サイズの平均±SEを示す。

Claims (66)

  1. 2つの第一ポリペプチドと2つの第二ポリペプチドとの複合体を含む抗原-結合タンパク質であって、
    当該第一ポリペプチドが第一ダイアボディポリペプチドを有し、そして
    当該第二ポリペプチドが、安定な自己会合ができる1以上の重鎖定常ドメインのN-末端に位置する第二ダイアボディポリペプチドを有し、
    当該第一ダイアボディポリペプチド及び第二ダイアボディポリペプチドが、安定な会合をして、2つの抗原結合部位を有するヘテロダイマーを形成できる、前記タンパク質。
  2. 前記のヘテロダイマーの抗原結合部位が同一の特異性を有する、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  3. 前記のヘテロダイマーの抗原結合部位が異なった特異性を有する、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  4. 前記特異性が、同一の抗原上に存在するエピトープに対してである、請求項３記載の抗原-結合タンパク質。
  5. 前記特異性が、異なった抗原上に存在するエピトープに対してである、請求項３記載の抗原-結合タンパク質。
  6. 前記第二ポリペプチドが、第二ダイアボディポリペプチド、ヒンジ領域及びCH2ドメインから本質的になる、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  7. 前記第二ポリペプチドが、第二ダイアボディポリペプチド、ヒンジ領域及びCH3ドメインから本質的になる、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  8. 前記第二ポリペプチドが、第二ダイアボディポリペプチド、ヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインから本質的になる、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  9. 前記定常ドメインが、哺乳動物の定常ドメインである、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  10. 前記定常ドメインが、ヒト定常ドメインである、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  11. Fc受容体に結合できる定常ドメインを有する、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  12. 補体依存性傷害活性（CMC）を起こすことができる、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  13. 抗体細胞-依存性傷害活性（ADCC）を起こすことができる、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  14. 抗-腫瘍剤に結合する、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  15. VEGF受容体の活性化を中和する、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  16. 前記VEGF受容体がヒトVEGF受容体である、請求項１５記載の抗原-結合タンパク質。
  17. 前記VEGF受容体がVEGFR-1である、請求項１５記載の抗原-結合タンパク質。
  18. 前記VEGF受容体がVEGFR-2である、請求項１５記載の抗原-結合タンパク質。
  19. 前記抗原結合部位の少なくとも1つがKDR特異的である、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  20. KDRの活性化を中和する、請求項１９記載の抗原-結合タンパク質。
  21. 前記抗原結合部位の1つ又は2つがIMC-1121の可変領域である、請求項１９記載の抗原-結合タンパク質。
  22. 前記抗原結合部位の少なくとも1つがFLT-1特異的である、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  23. FLT-1の活性化を中和する、請求項２２記載の抗原-結合タンパク質。
  24. 前記抗原-結合部位の1つ又は2つがIMC-18F1の可変領域である、請求項２２記載の抗原-結合タンパク質。
  25. 前記抗原結合部位の少なくとも1つがFLT-4に特異的である、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  26. FLT-4の活性化を中和する、請求項２５記載の抗原-結合タンパク質。
  27. 前記抗原結合部位の少なくとも1つがEGFRである、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  28. EGFRの活性化を中和する、請求項２７記載の抗原-結合タンパク質。
  29. 前記抗原結合部位の1つ又は2つがIMC-C225の可変領域である、請求項２７記載の抗原-結合タンパク質。
  30. 前記抗原-結合部位の1つ又は2つがIMC-18F1の可変領域である、請求項２７記載の抗原-結合タンパク質。
  31. 前記抗原結合部位の少なくとも1つがHER2に特異的である、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  32. HER2を中和する、請求項３１記載の抗原-結合タンパク質。
  33. 前記抗原結合部位の少なくとも1つがIGFRに特異的である、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  34. IGFRの活性化を中和する、請求項３３記載の抗原-結合タンパク質。
  35. 前記抗原結合部位の1つ又は2つがIMC-A12の可変領域である、請求項３３記載の抗原-結合タンパク質。
  36. 前記抗原結合部位の1つ又は2つがIMC-2F8の可変領域である、請求項３３記載の抗原-結合タンパク質。
  37. 前記抗原結合部位の少なくとも1つがRON特異的である、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  38. RONの活性化を中和する、請求項３７記載の抗原-結合タンパク質。
  39. 前記抗原結合部位の1つ又は2つが、IMC-41A10の可変領域又はIMC-41A12の可変領域である、請求項３７記載の抗原-結合タンパク質。
  40. 前記抗原結合部位の少なくとも1つがFGFRに特異的である、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  41. FGFRの活性化を中和する、請求項４０記載の抗原-結合タンパク質。
  42. 前記抗原結合部位の少なくとも1つがPDGFRαに特異的である、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  43. PDGFRαの活性化を中和する、請求項４２記載の抗原-結合タンパク質。
  44. 前記抗原結合部位の少なくとも1つが、受容体チロシンキナーゼに特異的である、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  45. 前記抗原結合部位の1つがKDRに特異的であり、他の抗原結合部位がFLT-1に特異的である、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  46. 前記抗原結合部位の1つがEGFRに特異的であり、他の抗原結合部位がIGFRに特異的である、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  47. 前記抗原結合部位の1つがEGFRに特異的であり、他の抗原結合部位がRONに特異的である、請求項１記載の抗原-結合タンパク質。
  48. 抗原-結合タンパク質の製造法であって、以下のステップ：
    宿主細胞中で、第一ダイアボディポリペプチドを有する第一ポリペプチドをコードする組換えDNA構築物、及び、安定な自己会合をすることができる1以上の重鎖定常ドメインのN末端に位置する第二ダイアボディポリペプチドを有する第二ポリペプチドをコードする組換えDNA構築物を、当該ポリペプチドの発現及び当該抗原結合タンパク質の形成を許容するために十分な時間及び方法で共発現し、
    ここで、当該第一ダイアボディポリペプチド及び第二ダイアボディポリペプチドは、会合して、2つの抗原結合部位を有するヘテロダイマーを形成することができる；並びに
    当該抗原結合タンパク質を回収すること、
    を含む、前記方法。
  49. 前記構築物が、同一のDNA発現ベクターにある、請求項４８記載の方法。
  50. 前記構築物が、異なったDNA発現ベクターにある、請求項４８記載の方法。
  51. 前記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞又は哺乳動物細胞である、請求項４８記載の方法。
  52. 前記抗原-結合タンパク質が宿主細胞から分泌される、請求項４８記載の方法。
  53. 受容体チロシンキナーゼの活性化を中和する方法であって、細胞を、請求項１記載の抗原-結合タンパク質と、当該受容体の活性化を中和するために十分な量で、接触させることを含み、ここで当該抗原-結合タンパク質の抗原結合部位の少なくとも1つは、当該受容体チロシンキナーゼに特異的である、前記方法。
  54. 前記受容体チロシンキナーゼがVEGFR-1である、請求項５３記載の方法。
  55. 前記受容体チロシンキナーゼがVEGFR-2である、請求項５３記載の方法。
  56. 前記受容体チロシンキナーゼがEGFRである、請求項５３記載の方法。
  57. 前記受容体チロシンキナーゼがIGFRである、請求項５３記載の方法。
  58. 前記受容体チロシンキナーゼがRONである、請求項５３記載の方法。
  59. VEGF受容体を発現する細胞を、請求項１記載の抗原-結合タンパク質で処理することを含む、脈管形成を阻害する方法であって、抗原結合部位の少なくとも1つがVEGF受容体に特異的である、前記方法。
  60. VEGF受容体を発現する細胞を、請求項１記載の抗原-結合タンパク質で処理することを含む、腫瘍成長を阻害する方法であって、抗原結合部位の少なくとも1つがVEGF受容体に特異的である、前記方法。
  61. 前記第二の抗原結合部位が異なったVEGF受容体に特異的である、請求項５９又は６０記載の方法。
  62. 前記第二の抗原結合部位が異なったEGFRに特異的である、請求項５９又は６０記載の方法。
  63. EGFRを発現する細胞を、請求項１の抗原-結合タンパク質で処理することを含む、腫瘍成長を阻害する方法であって、抗原結合部位の少なくとも1つがEGFRに特異的である、前記方法。
  64. 前記第二の抗原結合部位がIGFRに特異的である、請求項６３記載の方法。
  65. 前記第二の抗原結合部位がRONに特異的である、請求項６３記載の方法。
  66. RTKを発現する細胞を、請求項１に記載の抗原-結合タンパク質で処理することを含む、腫瘍成長を阻害する方法であって、抗原結合部位の少なくとも1つがRTKに特異的であり、当該RTKがVEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、EGFR、HER2、IGFR、RON、FGFR、PDGFR、NGFR、Tek及びTie2からなる群より選ばれる、前記方法。
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WO (1) WO2006020258A2 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008520246A (ja) * 2004-11-18 2008-06-19 イムクローン システムズ インコーポレイティド 血管内皮成長因子受容体−ｉに対する抗体
JP2012503612A (ja) * 2008-09-26 2012-02-09 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ｅｇｆｒ／抗ｉｇｆ−１ｒ抗体
JP2012527876A (ja) * 2009-05-28 2012-11-12 グラクソ グループ リミテッド 抗原結合タンパク質
JP2013515508A (ja) * 2009-12-29 2013-05-09 エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル， エルエルシー Ｒｏｎ結合構築体およびその使用方法

Families Citing this family (302)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
JP2007510434A (ja) 2003-11-12 2007-04-26 シェーリング　コーポレイション 多重遺伝子発現のためのプラスミドシステム
US7811562B2 (en) 2004-12-03 2010-10-12 Schering Corporation Biomarkers for pre-selection of patients for anti-IGF1R therapy
RU2502523C2 (ru) 2005-06-17 2013-12-27 Имклоун Элэлси АНТИТЕЛА ПРОТИВ PDGFRα ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВТОРИЧНОЙ ОПУХОЛИ КОСТИ
NI200800032A (es) 2005-07-25 2009-03-23 Reducción de célula b utilizando moléculas de unión específicas cd37 y cd20
EP2500352A1 (en) * 2005-08-19 2012-09-19 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP2500359A3 (en) * 2005-08-19 2012-10-17 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EA017265B1 (ru) 2006-02-03 2012-11-30 Имклоун Элэлси Применение антитела imc-a12, которое является ингибитором igf-ir, для лечения рака предстательной железы
MX2008015524A (es) 2006-06-12 2009-01-13 Trubion Pharmaceuticals Inc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
AU2007325838B2 (en) 2006-11-22 2013-09-19 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including IGF-IR
NZ579734A (en) 2007-04-17 2012-01-12 Imclone Llc Platelet derived growth factor receptor-beta antibodies
WO2009018386A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
CA2706425A1 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Ablynx N.V. Method for obtaining polypeptide constructs comprising two or more single domain antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
WO2009102421A2 (en) 2008-02-14 2009-08-20 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins that bind egfr
EP2274008B1 (en) 2008-03-27 2014-02-26 ZymoGenetics, Inc. Compositions and methods for inhibiting pdgfrbeta and vegf-a
SI2132228T1 (sl) 2008-04-11 2011-10-28 Emergent Product Dev Seatle CD37 imunoterapevtik in kombinacija z njegovim bifunkcionalnim kemoterapevtikom
US9029508B2 (en) 2008-04-29 2015-05-12 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2291399B1 (en) 2008-05-22 2014-06-25 Bristol-Myers Squibb Company Multivalent fibronectin based scaffold domain proteins
CN102112494A (zh) 2008-06-03 2011-06-29 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
EP3002299A1 (en) 2008-06-03 2016-04-06 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP5674654B2 (ja) * 2008-07-08 2015-02-25 アッヴィ・インコーポレイテッド プロスタグランジンｅ２二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
WO2010028798A1 (en) * 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
WO2010028797A1 (en) * 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
WO2010028795A1 (en) * 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子
TWI480050B (zh) * 2009-02-10 2015-04-11 Daiichi Sankyo Co Ltd 抗－ｍｓｔ１ｒ抗體及其用途
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
WO2010112194A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen-binding polypeptides and multispecific antibodies comprising them
KR20110126748A (ko) 2009-04-07 2011-11-23 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항-ｅｒｂｂ-1/항-ｃ-ｍｅｔ 항체
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
MX2011010166A (es) 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-3/anti-c-met.
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
EP2473524A4 (en) 2009-09-01 2013-05-22 Abbott Lab IMMUNOGLOBULINE WITH DOUBLE VARIABLE DOMAIN AND ITS USE
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
CN104945509A (zh) 2009-09-16 2015-09-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含卷曲螺旋和/或系链的蛋白质复合体及其用途
KR20140015139A (ko) 2009-10-15 2014-02-06 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
SG185415A1 (en) 2010-05-06 2012-12-28 Novartis Ag Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein - related protein 6 (lrp6) multivalent antibodies
ES2659406T3 (es) 2010-05-06 2018-03-15 Novartis Ag Composiciones y procedimientos de uso para anticuerpos terapéuticos contra la proteína 6 relacionada con las lipoproteínas de baja densidad (LRP6)
US9562089B2 (en) 2010-05-26 2017-02-07 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold proteins having improved stability
AU2011276285A1 (en) 2010-07-06 2013-01-24 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anti-RON antibodies
WO2012016227A2 (en) 2010-07-29 2012-02-02 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
CN103298834A (zh) 2010-08-03 2013-09-11 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
JP5758004B2 (ja) 2010-08-24 2015-08-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ジスルフィドによって安定化されたＦｖ断片を含む二重特異性抗体
BR112013004581A2 (pt) 2010-08-26 2017-06-27 Abbvie Inc imunoglobulinas de domínio variável dual e seus usos
EP2853542A1 (en) * 2010-11-24 2015-04-01 Glaxo Group Limited Multispecific antigen binding proteins targeting HGF
MX342034B (es) 2011-02-28 2016-09-12 Hoffmann La Roche Proteinas monovalentes que se unen a antigenos.
BR112013019975A2 (pt) 2011-02-28 2017-08-01 Hoffmann La Roche proteínas de ligação de antígeno, composição farmacêutica, uso de uma proteína de ligação de antígeno, método para o tratamento de um paciente e método para a preparação de uma proteína de ligação de antígeno, ácido nucleico, vetor e célula hospedeira"
US8094026B1 (en) 2011-05-02 2012-01-10 Robert M Green Organized retail crime detection security system and method
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
ES2666856T3 (es) 2011-11-04 2018-05-08 Novartis Ag Proteína 6 relacionada con lipoproteínas de baja densidad (LRP6) - constructos extensores de la vida media
AR089529A1 (es) 2011-12-30 2014-08-27 Abbvie Inc Proteinas de union especificas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17
WO2013119966A2 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Genentech, Inc. Single-chain antibodies and other heteromultimers
CA2868404A1 (en) 2012-04-05 2013-10-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against human tweak and human il17 and uses thereof
JP6203838B2 (ja) 2012-06-27 2017-09-27 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 少なくとも２つの異なる結合実体を含む、テーラーメイドの高度に選択的かつ多重特異的なターゲティング実体を選択および作製するための方法、ならびにその使用
WO2014001325A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
CN104411725B (zh) 2012-07-04 2018-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗生物素抗体及使用方法
RU2017128512A (ru) 2012-07-04 2019-02-15 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела к теофиллину и способы их применения
JP6148729B2 (ja) 2012-07-04 2017-06-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 共有結合している抗原−抗体結合体
CN104428315B (zh) 2012-07-13 2017-09-29 罗氏格黎卡特股份公司 双特异性抗‑vegf/抗‑ang‑2抗体及其在治疗眼血管疾病中的应用
PE20151179A1 (es) 2012-11-01 2015-09-12 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual anti-vegf/dll4 y usos de las mismas
UY35195A (es) 2012-12-18 2014-07-31 Novartis Ag Composiciones y metodos para proteinas de accion prolongada
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP3620473A1 (en) 2013-01-14 2020-03-11 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
AU2014207549B2 (en) 2013-01-15 2018-12-06 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
DK2958943T3 (da) 2013-02-20 2019-12-09 Univ Pennsylvania Behandling af cancer ved anvendelse af humaniseret anti-EGFRvIII kimær antigenreceptor
ES2814962T3 (es) 2013-02-20 2021-03-29 Novartis Ag Fijación eficaz como objetivo de la leucemia humana primaria utilizando células T modificadas con receptor de antígeno quimérico anti-CD123
US9499855B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Elwha Llc Compositions, methods, and computer systems related to making and administering modified T cells
US20140274801A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Elwha Llc Compositions, methods, and computer systems related to making and administering modified t cells
US9587237B2 (en) 2013-03-14 2017-03-07 Elwha Llc Compositions, methods, and computer systems related to making and administering modified T cells
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP3623380A1 (en) 2013-03-15 2020-03-18 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
CA2906927C (en) 2013-03-15 2021-07-13 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
BR112015023797A2 (pt) 2013-03-15 2017-10-24 Abbvie Inc proteínas de ligação de especificidade dupla dirigidas contra il-1b e/ou il-17
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
CN104341504B (zh) 2013-08-06 2017-10-24 百奥泰生物科技(广州)有限公司 双特异性抗体
EP3055329B1 (en) 2013-10-11 2018-06-13 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
CA3225453A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
RS60031B1 (sr) 2013-12-20 2020-04-30 Hoffmann La Roche Humanizovana anti-tau(ps422) antitela i načini upotrebe
US10287354B2 (en) 2013-12-20 2019-05-14 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
CN111228509A (zh) 2014-01-03 2020-06-05 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗-半抗原/抗-血脑屏障受体的抗体、其复合物及其作为血脑屏障穿梭物的应用
EP3089759B1 (en) 2014-01-03 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Covalently linked polypeptide toxin-antibody conjugates
WO2015101587A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
WO2015112626A1 (en) 2014-01-21 2015-07-30 June Carl H Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
CU24481B1 (es) 2014-03-14 2020-03-04 Immutep Sas Moléculas de anticuerpo que se unen a lag-3
US20170081411A1 (en) 2014-03-15 2017-03-23 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
US20170335281A1 (en) 2014-03-15 2017-11-23 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
JP6591437B2 (ja) 2014-03-20 2019-10-16 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 血清アルブミン結合フィブロネクチンｉｉｉ型ドメイン
RU2723940C2 (ru) * 2014-03-21 2020-06-18 Экс-Боди, Инк. Биспецифические антигенсвязывающие полипептиды
ME03666B (me) 2014-03-28 2020-10-20 Xencor Inc Bispecifična antitela koja se vezuju za cd38 i cd3
SG10202109752XA (en) 2014-04-07 2021-10-28 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-cd19 chimeric antigen receptor
EP3160991A2 (en) 2014-06-25 2017-05-03 Novartis AG Compositions and methods for long acting proteins
EP3161001A2 (en) 2014-06-25 2017-05-03 Novartis AG Antibodies specific for il-17a fused to hyaluronan binding peptide tags
US20170290876A1 (en) 2014-06-25 2017-10-12 Novartis Ag Compositions and methods for long acting proteins
AR100978A1 (es) 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
BR112016030740A2 (pt) 2014-07-01 2018-02-20 Pfizer Inc. diacorpos heterodiméricos biespecíficos e seus usos
AU2015292755B2 (en) 2014-07-21 2020-11-12 Novartis Ag Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor
EP3172237A2 (en) 2014-07-21 2017-05-31 Novartis AG Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
EP3174546B1 (en) 2014-07-31 2019-10-30 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
US10851149B2 (en) 2014-08-14 2020-12-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of cancer using GFR α-4 chimeric antigen receptor
MY189028A (en) 2014-08-19 2022-01-20 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
AU2015317608B2 (en) 2014-09-17 2021-03-11 Novartis Ag Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
TWI716362B (zh) 2014-10-14 2021-01-21 瑞士商諾華公司 針對ｐｄ－ｌ１之抗體分子及其用途
KR20170084327A (ko) 2014-11-26 2017-07-19 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 cd38에 결합하는 이형이량체 항체
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
EP3223845B1 (en) 2014-11-26 2021-05-19 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd20
PL3227332T3 (pl) 2014-12-03 2020-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Wielospecyficzne przeciwciała
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
IL303247A (en) 2014-12-29 2023-07-01 Novartis Ag Methods for preparing cells expressing a chimeric receptor antigen
WO2016120217A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Cellectis Anti-hsp70 specific chimeric antigen receptors (cars) for cancer immunotherapy
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
SG11201708191XA (en) 2015-04-08 2017-11-29 Novartis Ag Cd20 therapies, cd22 therapies, and combination therapies with a cd19 chimeric antigen receptor (car) - expressing cell
CN108472360B (zh) 2015-04-10 2023-01-17 阿迪马布有限责任公司 从亲代同源二聚抗体种类中纯化异源二聚多特异性抗体的方法
JP7114457B2 (ja) 2015-04-17 2022-08-08 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア キメラ抗原受容体発現細胞の有効性および増殖を改善するための方法
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
HUE051661T2 (hu) 2015-05-18 2021-03-29 Tcr2 Therapeutics Inc Készítmények és gyógyászati felhasználások a TCR újraprogramozására fúziós fehérjék felhasználásával
EP3932428A1 (en) 2015-05-21 2022-01-05 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
AR105089A1 (es) 2015-06-24 2017-09-06 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS ANTI-TAU(pS422) HUMANIZADOS Y MÉTODOS DE UTILIZACIÓN
TW201708538A (zh) 2015-07-21 2017-03-01 諾華公司 改良免疫細胞之功效及擴展之方法
PT3317301T (pt) 2015-07-29 2021-07-09 Novartis Ag Terapias de associação compreendendo moléculas de anticorpo contra lag-3
US20180207273A1 (en) 2015-07-29 2018-07-26 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
WO2017027392A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
WO2017053469A2 (en) 2015-09-21 2017-03-30 Aptevo Research And Development Llc Cd3 binding polypeptides
ES2967078T3 (es) 2015-09-23 2024-04-25 Bristol Myers Squibb Co Dominios de fibronectina de tipo III de unión a seroalbúmina con velocidad de disociación rápida
EP3380620A1 (en) 2015-11-23 2018-10-03 Novartis AG Optimized lentiviral transfer vectors and uses thereof
JP7058219B2 (ja) 2015-12-07 2022-04-21 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｐｓｍａに結合するヘテロ二量体抗体
JP2019503349A (ja) 2015-12-17 2019-02-07 ノバルティス アーゲー Ｐｄ−１に対する抗体分子およびその使用
CA3007421A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Combination of c-met inhibitor with antibody molecule to pd-1 and uses thereof
EP3397756B1 (en) 2015-12-30 2023-03-08 Novartis AG Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
EP3851457A1 (en) 2016-01-21 2021-07-21 Novartis AG Multispecific molecules targeting cll-1
CN105481981B (zh) * 2016-01-27 2019-03-19 中国人民解放军第二军医大学 靶向vegf双特异性抗体及其用途
US20200281973A1 (en) 2016-03-04 2020-09-10 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
US20190112380A1 (en) 2016-03-29 2019-04-18 University Of Southern California Chimeric antigen receptors targeting cancer
SI3443096T1 (sl) 2016-04-15 2023-07-31 Novartis Ag Sestavki in postopki za selektivno izražanje himerni antigenskih receptorjev
US10100106B2 (en) 2016-05-20 2018-10-16 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
WO2017210617A2 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Porter, David, L. Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
RU2022104399A (ru) 2016-06-14 2022-05-05 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек
US10316088B2 (en) 2016-06-28 2019-06-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
WO2018013918A2 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
KR20230100748A (ko) 2016-07-28 2023-07-05 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 및 pd-1 억제제의 조합 요법
US20190161542A1 (en) 2016-08-01 2019-05-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
JP7109789B2 (ja) 2016-08-02 2022-08-01 ティーシーアール２ セラピューティクス インク． 融合タンパク質を使用したｔｃｒの再プログラム化のための組成物及び方法
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
ES2875959T3 (es) 2016-10-07 2021-11-11 Tcr2 Therapeutics Inc Composiciones y métodos para reprogramación de receptores de linfocitos T mediante el uso de proteínas de fusión
CN110225927B (zh) 2016-10-07 2024-01-12 诺华股份有限公司 用于治疗癌症的嵌合抗原受体
KR102562519B1 (ko) 2016-10-14 2023-08-02 젠코어 인코포레이티드 IL-15/IL-15Rα FC-융합 단백질 및 PD-1 항체 단편을 포함하는 이중특이성 이종이량체 융합 단백질
WO2018098365A2 (en) 2016-11-22 2018-05-31 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
MX2019006045A (es) 2016-11-23 2019-11-11 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas triespecificas dirigidas a psma y metodos de uso.
EP3544997A4 (en) 2016-11-23 2020-07-01 Harpoon Therapeutics, Inc. PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN BINDING PROTEIN
WO2018111340A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Novartis Ag Methods for determining potency and proliferative function of chimeric antigen receptor (car)-t cells
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
WO2018144535A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
JOP20190189A1 (ar) 2017-02-02 2019-08-01 Amgen Res Munich Gmbh تركيبة صيدلانية ذات درجة حموضة منخفضة تتضمن بنيات جسم مضاد يستهدف الخلية t
EP3589647A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Novartis AG Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN
EP3615068A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CN115028727A (zh) 2017-05-12 2022-09-09 哈普恩治疗公司 靶向msln的三特异性蛋白质及使用方法
AU2018265856B2 (en) 2017-05-12 2023-04-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
WO2018232020A1 (en) 2017-06-13 2018-12-20 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
EA202090104A1 (ru) 2017-06-22 2020-04-09 Новартис Аг Молекулы антител к cd73 и пути их применения
AU2018292618A1 (en) 2017-06-27 2019-12-19 Novartis Ag Dosage regimens for anti-TIM-3 antibodies and uses thereof
MA49517A (fr) 2017-06-30 2020-05-06 Xencor Inc Protéines de fusion fc hétérodimères ciblées contenant il-15/il-15ra et domaines de liaison à l'antigène
NZ760841A (en) 2017-07-11 2024-02-23 Compass Therapeutics Llc Agonist antibodies that bind human cd137 and uses thereof
CN111163798A (zh) 2017-07-20 2020-05-15 诺华股份有限公司 用于抗lag-3抗体的给药方案及其用途
AU2018347582A1 (en) 2017-10-13 2020-05-07 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific proteins and methods of use
US10927180B2 (en) 2017-10-13 2021-02-23 Harpoon Therapeutics, Inc. B cell maturation antigen binding proteins
WO2019079569A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Novartis Ag COMPOSITIONS AND METHODS FOR SELECTIVE DEGRADATION OF A PROTEIN
MX2020004229A (es) 2017-10-25 2020-07-22 Novartis Ag Metodos de produccion de celulas que expresan receptores antigenicos quimericos.
US20210179709A1 (en) 2017-10-31 2021-06-17 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
US11718679B2 (en) 2017-10-31 2023-08-08 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and PD-1 antagonists and uses thereof
KR20200085828A (ko) 2017-11-08 2020-07-15 젠코어 인코포레이티드 신규의 항-pd-1 서열을 사용한 이중특이적 및 단일특이적 항체
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
WO2019099838A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Novartis Ag Combination therapies
EP3713961A2 (en) 2017-11-20 2020-09-30 Compass Therapeutics LLC Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
MX2020006322A (es) 2017-12-19 2020-09-18 Xencor Inc Proteinas de fusion il-2 fc modificadas.
AU2019215031A1 (en) 2018-01-31 2020-08-20 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
GB201804701D0 (en) 2018-03-23 2018-05-09 Gammadelta Therapeutics Ltd Lymphocytes expressing heterologous targeting constructs
AU2019247415A1 (en) 2018-04-04 2020-10-22 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
CN112437777A (zh) 2018-04-18 2021-03-02 Xencor股份有限公司 包含IL-15/IL-15RA Fc融合蛋白和TIM-3抗原结合结构域的靶向TIM-3的异源二聚体融合蛋白
WO2019204665A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
US20210047405A1 (en) 2018-04-27 2021-02-18 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3788369A1 (en) 2018-05-01 2021-03-10 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
JP2021525243A (ja) 2018-05-21 2021-09-24 コンパス セラピューティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー Ｎｋ細胞による標的細胞の殺傷を増進するための組成物および方法
WO2019226658A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Multispecific antigen-binding compositions and methods of use
WO2019227003A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2019237035A1 (en) 2018-06-08 2019-12-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
JP7438988B2 (ja) 2018-06-13 2024-02-27 ノバルティス アーゲー Ｂｃｍａキメラ抗原受容体及びその使用
PE20210418A1 (es) 2018-06-19 2021-03-08 Atarga Llc Moleculas de anticuerpo de componente de complemento 5 y sus usos
JOP20200343A1 (ar) 2018-07-02 2020-12-31 Xencor Inc بروتين ربط مولد ضد مضاد لـ steap1
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
WO2020047501A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
WO2020047449A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
JP2021534783A (ja) 2018-08-31 2021-12-16 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
EP3849565A4 (en) 2018-09-12 2022-12-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center REDUCING CD33 EXPRESSION FOR SELECTIVE PROTECTION OF THERAPEUTIC CELLS
KR20210086623A (ko) 2018-09-25 2021-07-08 하푼 테라퓨틱스, 인크. Ddl3 결합 단백질 및 사용 방법
WO2020069405A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Novartis Ag Cd22 chimeric antigen receptor (car) therapies
WO2020069409A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Novartis Ag Cd19 chimeric antigen receptor (car) and cd22 car combination therapies
CA3115096A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
AU2019379576A1 (en) 2018-11-13 2021-06-03 Compass Therapeutics Llc Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof
CN113194952A (zh) 2018-12-20 2021-07-30 诺华股份有限公司 Hdm2-p53相互作用抑制剂和bcl2抑制剂的组合及其治疗癌症的用途
CA3123511A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
CA3123519A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2020165833A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
US10871640B2 (en) 2019-02-15 2020-12-22 Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects
WO2020172553A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Novartis Ag Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
KR20210134339A (ko) 2019-02-25 2021-11-09 노파르티스 아게 바이러스 전달을 위한 메조다공성 실리카 입자 조성물
US11472890B2 (en) 2019-03-01 2022-10-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind ENPP3 and CD3
AU2020241428A1 (en) 2019-03-15 2021-08-12 Cartesian Therapeutics, Inc. Anti-BCMA chimeric antigen receptors
EP3946593A1 (en) 2019-03-29 2022-02-09 Atarga, LLC Anti fgf23 antibody
US20220168389A1 (en) 2019-04-12 2022-06-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2020219742A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
BR112021026832A2 (pt) 2019-07-02 2022-05-10 Hutchinson Fred Cancer Res Vetores ad35 recombinantes e aprimoramentos da terapia gênica relacionada
WO2021035170A1 (en) 2019-08-21 2021-02-25 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
CN114786679A (zh) 2019-10-21 2022-07-22 诺华股份有限公司 具有维奈托克和tim-3抑制剂的组合疗法
EP4048285A1 (en) 2019-10-21 2022-08-31 Novartis AG Tim-3 inhibitors and uses thereof
WO2021108661A2 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Chimeric antigen receptors and uses thereof
CN115175937A (zh) 2019-12-20 2022-10-11 诺华股份有限公司 用于治疗骨髓纤维化和骨髓增生异常综合征的抗TIM-3抗体MBG453和抗TGF-β抗体NIS793与或不与地西他滨或抗PD-1抗体斯巴达珠单抗的组合
IL293752A (en) 2020-01-17 2022-08-01 Novartis Ag A combination containing a tim-3 inhibitor and a substance that causes hypomethylation for use in the treatment of myeloplastic syndrome or chronic myelomonocytic leukemia
CN115298322A (zh) 2020-01-17 2022-11-04 贝克顿迪金森公司 用于单细胞分泌组学的方法和组合物
WO2021163618A1 (en) 2020-02-14 2021-08-19 Novartis Ag Method of predicting response to chimeric antigen receptor therapy
WO2021168303A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Harpoon Therapeutics, Inc. Flt3 binding proteins and methods of use
WO2021173995A2 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
TW202146441A (zh) 2020-02-27 2021-12-16 瑞士商諾華公司 製備表現嵌合抗原受體的細胞之方法
CN111269326A (zh) 2020-02-28 2020-06-12 南京北恒生物科技有限公司 新型嵌合抗原受体及其用途
CN115461080A (zh) 2020-04-29 2022-12-09 安进公司 药物配制品
US20230167175A1 (en) 2020-04-29 2023-06-01 Amgen Inc. Pharmaceutical formulation
AU2021270299A1 (en) 2020-05-12 2022-12-15 Lyell Immunopharma, Inc. Chimeric antigen receptor spacers
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
CN111849910B (zh) 2020-05-27 2021-06-15 南京北恒生物科技有限公司 工程化免疫细胞及其用途
JP2023529211A (ja) 2020-06-11 2023-07-07 ノバルティス アーゲー Ｚｂｔｂ３２阻害剤及びその使用
CN113801238A (zh) 2020-06-11 2021-12-17 南京北恒生物科技有限公司 表达nk抑制性分子的工程化免疫细胞及其用途
JP2023531676A (ja) 2020-06-23 2023-07-25 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピぺリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与レジメン
CN116348492A (zh) * 2020-07-10 2023-06-27 生物分子控股有限责任公司 四面体抗体
EP4148125A4 (en) 2020-07-15 2023-11-15 Bioheng Therapeutics Limited MODIFIED IMMUNE CELL INTENDED FOR ALLOTRANSPLANTATION
US11524998B2 (en) 2020-07-16 2022-12-13 Novartis Ag Anti-betacellulin antibodies, fragments thereof, and multi-specific binding molecules
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
CN114057890A (zh) 2020-07-31 2022-02-18 南京北恒生物科技有限公司 新型共刺激结构域及其用途
WO2022029573A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 Novartis Ag Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
CN112063588A (zh) 2020-08-13 2020-12-11 南京北恒生物科技有限公司 工程化免疫细胞及其用途
EP4200332A1 (en) 2020-08-19 2023-06-28 Xencor, Inc. Anti-cd28 and/or anti-b7h3 compositions
CA3188978A1 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Sandeep Tharian Koshy Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
AU2021330845A1 (en) 2020-08-24 2023-01-19 Amgen Inc. Pharmaceutical formulation comprising a bite, bispecific antibody, and methionine
EP4204021A1 (en) 2020-08-31 2023-07-05 Advanced Accelerator Applications International S.A. Method of treating psma-expressing cancers
WO2022043558A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
CN114163532A (zh) 2020-09-10 2022-03-11 南京北恒生物科技有限公司 包含新型共刺激结构域的嵌合抗原受体及其用途
CN114525259A (zh) 2020-11-03 2022-05-24 南京北恒生物科技有限公司 靶向cd7的嵌合抗原受体及其用途
CN112300282A (zh) 2020-11-03 2021-02-02 南京北恒生物科技有限公司 靶向cd7的人源化抗体及其用途
EP4240765A2 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Novartis AG Antibody fc variants
CN116635062A (zh) 2020-11-13 2023-08-22 诺华股份有限公司 使用表达嵌合抗原受体（car）的细胞的组合疗法
CN114524876A (zh) 2020-11-23 2022-05-24 南京北恒生物科技有限公司 靶向nkg2a的抗体及其用途
WO2022152168A1 (zh) 2021-01-12 2022-07-21 南京北恒生物科技有限公司 靶向ror1的抗体及其用途
US20240141060A1 (en) 2021-01-29 2024-05-02 Novartis Ag Dosage regimes for anti-cd73 and anti-entpd2 antibodies and uses thereof
WO2022166365A1 (zh) 2021-02-03 2022-08-11 南京北恒生物科技有限公司 新型嵌合抗原受体及其用途
AU2022227686A1 (en) 2021-02-25 2023-07-27 Lyell Immunopharma, Inc. Ror1 targeting chimeric antigen receptor
CA3212665A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
WO2022192586A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
CN118056008A (zh) 2021-04-27 2024-05-17 诺华股份有限公司 病毒载体生产系统
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
AU2022285665A1 (en) 2021-06-01 2023-10-19 Amgen Inc. Accelerated method of making lyophilized protein formualtions
WO2023278585A1 (en) 2021-06-30 2023-01-05 Amgen Inc. Method of reconstituting lyophilized formulation
AU2022330406A1 (en) 2021-08-20 2024-03-07 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor–expressing cells
WO2023044483A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
US20230383010A1 (en) 2022-02-07 2023-11-30 Visterra, Inc. Anti-idiotype antibody molecules and uses thereof
TW202400658A (zh) 2022-04-26 2024-01-01 瑞士商諾華公司 靶向ｉｌ—１３和ｉｌ—１８的多特異性抗體
WO2023212559A1 (en) 2022-04-26 2023-11-02 Amgen Inc. Lyophilization method
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2024030976A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier
WO2024040020A1 (en) 2022-08-15 2024-02-22 Absci Corporation Quantitative affinity activity specific cell enrichment
WO2024056809A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Novartis Ag Treatment of autoimmune disorders using chimeric antigen receptor therapy
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA03011365A (es) * 2001-06-13 2005-03-07 Genmab As Anticuerpos monoclonales humanos para el receptor de factor de crecimiento epidermico (egfr).

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008520246A (ja) * 2004-11-18 2008-06-19 イムクローン システムズ インコーポレイティド 血管内皮成長因子受容体−ｉに対する抗体
JP4864900B2 (ja) * 2004-11-18 2012-02-01 イムクローン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 血管内皮成長因子受容体−ｉに対する抗体
JP2012503612A (ja) * 2008-09-26 2012-02-09 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ｅｇｆｒ／抗ｉｇｆ−１ｒ抗体
JP2012527876A (ja) * 2009-05-28 2012-11-12 グラクソ グループ リミテッド 抗原結合タンパク質
JP2013515508A (ja) * 2009-12-29 2013-05-09 エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル， エルエルシー Ｒｏｎ結合構築体およびその使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
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