MX2010014574A - Inmunoglobulinas de dominio variable dual para prostaglandina e2 y usos de las mismas. - Google Patents

Inmunoglobulinas de dominio variable dual para prostaglandina e2 y usos de las mismas.

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MX2010014574A
MX2010014574A MX2010014574A MX2010014574A MX2010014574A MX 2010014574 A MX2010014574 A MX 2010014574A MX 2010014574 A MX2010014574 A MX 2010014574A MX 2010014574 A MX2010014574 A MX 2010014574A MX 2010014574 A MX2010014574 A MX 2010014574A
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MX
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pge2
antibody
antigen
disease
binding protein
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MX2010014574A
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Tariq Ghayur
Jijie Gu
Peter C Isakson
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Abbott Lab
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Abstract

La presente invención se refiere a proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas diseñadas por ingeniería, métodos de elaboración, y específicamente a sus usos en la prevención, diagnóstico, y/o tratamiento de enfermedades.

Description

INMUNOGLOBULINAS DE DOMINIO VARIABLE DUAL PARA PROSTAGLANDINA E2 Y USOS DE LAS MISMAS Referencia a solicitudes relacionadas Esta solicitud es una solicitud no provisional que reclama prioridad para la Solicitud Provisional E.U.A. No. de serie 61/134,284, presentada el 8 de julio de 2008, y Solicitud Provisional E.U.A. No. de serie 61/191,711, presentada el 11 de septiembre de 2008, cuyos contenidos se operan en la presente solicitud para referencia.
! CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas, a por lo menos un dominio variable específico para prostaglandina E2 (PGE2), a métodos de elaboración, y específicamente a sus usos en la diagnosis, prevención y/o tratamiento de inflamación aguda y crónica, enfermedades autoinmunes, cáncer, dolor, enfermedades de los huesos, neuronales y otras.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las proteínas diseñadas, tales como lós anticuerpos multiespecíficos capaces de unirse a dos o más antígenos son conocidas en la técnica. Dichas proteínas de unión multiespecíficas se pueden generar utilizando técnicas de fusión celular, conjugación química, o ADN recombinante.
Los anticuerpos biespecíficos se han producido utilizando tecnología de cuadroma (véase Milstein, C. y A.C. Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40) basándose en la fusión somática de dos líneas de célula de hibridoma diferentes que expresan anticuerpos monoclonales (mAbs) de múrido con las especificidades deseadas del anticuerpo biespecífico. Debido al apareamiento aleatorio de dos cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina (Ig) diferentes dentro de la línea de célula de hibridoma híbrido (o cuadroma) resultante, se generan hasta diez especies diferentes que Ig, de las cuales solamente una es el anticuerpo biespecífico funcional. La presencia de subproductos mal apareados, y de rendimientos de producción significativamente reducidos, significa que se requieren procedimientos de purificación sofisticados.
Los anticuerpos biespecíficos también se pueden producir mediante conjugación química de dos mAbs diferentes (véase Staerz, U.D., et al. (1985) Nature 314(6012): 628-31). Esta estrategia no produce preparación homogénea. Otras estrategias han utilizado conjugación química de dos mAbs diferentes o fragmentos de anticuerpo más pequeños (véase Brennan, M., et al. (1985) Science 229(4708): 81-3).
Otro método utilizado para producir anticuerpos biespecíficos es la copulación de dos anticuerpos progenitores con un entrelazador heterobifuncional, pero los anticuerpos biespecíficos resultantes padecen de heterogeneidad molecular significativa debido a que la reacción del entrelazador con los anticuerpos progenitores no es de tipo dirigida a sitio. Para obtener preparaciones más homogéneas de anticuerpos biespecíficos se han entrelazado químicamente dos fragmentos Fab diferentes en sus residuos cisteína del gozne en una manera dirigida a sitio (véase Glennie, M.J., et al. (1987) J. Immunol. 139(7): 2367-75). Pero este método da como resultado fragmentos Fab'2, no la molécula de IgG completase ha desarrollado una amplia variedad de otros formatos de anticuerpo biespecífico recombinante (véase Kriangkum, J., et al. (2001) Biomol. Eng. 18(2): 31-40). Entre éstos, las moléculas de Fv de cadena individual en tándem y diacuerpos, y varios derivados de los mismos, son los más ampliamente utilizados. Rutinariamente, la construcción de estas moléculas comienza a partir de fragmentos de Fv de cadena individual (scFv) que reconocen antígenos diferentes (véase Economides, A.N., et al. (2003) Nat. Med. 9(1):47-52). Las moléculas de scFv en tándem (taFv) representan un formato sencillo que simplemente conecta las dos moléculas de scF con un enlazador peptídico adicional. Los dos fragmentos de scFv presentes en estas moléculas de scFv en tándem forman entidades de plegamiento separadas. Se pueden utilizar diversos enlazadores para conectar los dos fragmentos de scFv y enlazadores con una longitud de hasta 63 residuos (véase Nakanishi, K., et al. (2001) Ana. Rev. Immunol. 19: 423-74). Aunque los fragmentos de scFv progenitores se pueden expresar normalmente en forma soluble en bacterias, con frecuencia se observa, sin embargo, que las moléculas de scFv en tándem forman agregados insolubles en las bacterias. Por lo tanto, se aplican de manera rutinaria protocolos de re-plegamiento o el uso de sistemas de expresión mamíferos para producir moléculas de scFv solubles en tándem. En un estudio reciente, se reportó la expresión in vivo mediante conejos y ganado vacuno transgénicos de un scFv en tándem dirigido contra CD28 y un proteoglucano asociado a melanoma (véase Gracie, J.A., et al. (1999) J. Clin. Invest. 104(10): 1393-401). En esta construcción, las dos moléculas de scFv se conectan mediante un enlazador de CH1 y se encontraron concentraciones en suero de hasta 100 mg/L del anticuerpo biespecífico. Se han utilizado diversas estrategias incluyendo variaciones del orden del dominio o el uso de enlazadores intermedios con longitud o flexibilidad variable para permitir la expresión soluble en bacterias. Actualmente unos cuantos estudios han reportado la expresión de moléculas de scFv solubles en tándem en bacterias (véase Leung, B.P., et al. (2000) J. Immunol. 164(12): 6495-502; Ito, A., et al. (2003) J. Immunol. 170(9): 4802-9; Kami, A., et al. (2002) J. Neuroimmunol. 125(1-2): 134-40) utilizando ya sea un enlazador Ala3 muy corto o enlazadores largos ricos en glicina/serina. En otro estudio reciente, se utiliza despliegue en fago de un repertorio de scFv en tándem que contiene enlazadores intermedios aleatorizados con una longitud de 3 o 6 residuos para enriquecer respecto a aquellas moléculas que se producen en forma soluble y activa en bacterias. Esta estrategia da como resultado el aislamiento de una molécula de scFv en tándem con un enlazador de 6 residuos de aminoácido (véase Arndt, M. y J. Krauss (2003) Methods Mol. Biol. 207: 305-21). No está claro si esta secuencia enlazadora representa o no una solución general para expresión soluble de las moléculas de scFv en tándem. Sin embargo, este estudio demuestra que el despliegue en fago de moléculas de scFv en tándem en combinación con mutagénesis dirigida es una herramienta poderosa para enriquecer respecto a estas moléculas, las cuales pueden ser expresadas en bacterias en una forma activa.
Los diacuerpos biespecíficos (Db) utilizan el formato de diacuerpo para expresión. Los diacuerpos se producen a partir de fragmentos scFv mediante reducción de la longitud del enlazador que conecta el dominio de VH y VL hasta aproximadamente 5 residuos (véase Peipp, M. y T. Valerius (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4): 507-11). Esta reducción de tamaño del enlazador facilita la dimerización de dos cadenas de polipéptido mediante apareamiento cruzado (crossover pairing) de los dominios de VH y 1 VL. Los diacuerpos biespecíficos se producen expresando, dos cadenas de polipéptido con, cualquiera de la estructura VHA-VLB y VHB-VLA (configuración VH-VL), o VLA-VHB y VLB-VHA (configuración VL-VH) dentro de la misma célula. En el pasado se produjo una gran variedad de diacuerpos biespecíficos diferentes y la mayoría de los mismos se expresan en forma soluble en las bacterias. Sin embargo, un estudio comparativo reciente demuestra que la orientación de los dominios variables puede influir en la expresión y formación de sitios de unión activos (véase Mack, M. et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92(15): 7021-5). No obstante, la expresión soluble en bacterias representa una ventaja importante con respecto a las moléculas de scFv en tándem. Sin embargo, debido a que se expresan dos cadenas polipeptídicas diferentes dentro de una célula individual, se pueden producir homodímeros inactivos junto con los heterodímeros activos. Esto hace necesaria la implementación de pasos de purificación adicionales con el fin de obtener preparaciones homogéneas de diacuerpos biespecíficos. Una estrategia para forzar la generación de diacuerpos biespecíficos es la producción de diacuerpos de tipo "botón en ojal" (knob-into-hole) (véase Holliger, P., T. Prospero, y G. Winter (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90(14): 6444-8.18). Esta estrategia se demostró para un diacuerpo biespecífico dirigido contra HER2 y CD3. Se introduce un "botón" (knob) grande en el dominio de VH mediante intercambio de Val37 con Phe y Leu45 con Trp y se produce un agujero complementario en el dominio de VL mutando Phe98 a Met y Tyr87 a Ala, ya sea en el dominio variable anti-HER2 o en el dominio variable anti-CD3. Mediante el uso de esta estrategia, la producción de diacuerpos biespecíficos se podría incrementar desde 72% por el diacuerpo progenitor hasta alrededor de 90% por el diacuerpo de tipo botón en ojal. De manera importante, los rendimientos de producción disminuyen sólo ligeramente como resultado de estas mutaciones. Sin embargo, para varias construcciones se observa una reducción en la actividad de unión a antígeno. Por lo tanto, esta estrategia bastante elaborada requiere el análisis de varias construcciones con el fin de identificar aquellas mutaciones que produzcan molécula heterodimérica con actividad de unión inalterada. Además, dicha estrategia requiere modificación mutacional de la secuencia de inmunoglobulina en la región constante, creando por lo tanto una forma no original y no natural de la secuencia del anticuerpo, lo cual puede dar como resultado ¡nmunogenicidad incrementada, poca estabilidad in vivo, así como farmacocinética indeseable.
Los diacuerpos de cadena individual (scDb) representan una estrategia alternativa para mejorar la formación de moléculas tipo diacuerpo biespecífico (véase Holliger, P. y G. Winter (1997) Cáncer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30; Wu, A.M., et al. (1996) Immunotechnology 2(1): p. 21-36). Los diacuerpos de cadena individual biespecificos se producen conectando las dos! cadenas polipeptídicas formadoras de diacuerpo con un enlazador intermedio adicional con una longitud de aproximadamente 15 residuos de aminoácido. Por consiguiente, todas las moléculas con un peso molecular correspondiente a diacuerpos de cadena individual monoméricos (50-60 kDa) son biespecificos. Varios estudios han demostrado que los diacuerpos de cadena individual biespecificos se expresan en bacterias en forma soluble y activa con la mayoría de las moléculas purificadas presentes como monómeros (véase Holliger, P. y G. Winter (1997) Cáncer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30; Wu, A.M., et al. (1996) Immunotechnol. 2(1): 21-36; Pluckthun, A. y P. Pack (1997) Immunotechnol. 3(2): 83-105; Ridgway, J.B., et al. (1 996) Protein Engin. 9(7): 61 7-21 ). Por lo tanto, los diacuerpos de cadena individual combinan las ventajas de los scFvs en tándem (todos los monómeros son biespecíficos) y los diacuerpos (expresión soluble en bacterias).
Más recientemente los diacuerpos se han fusionado a Fe para generar más moléculas parecidas a Ig , denominadas di-diacuerpos (véase Lu , D. , et al. (2004) J . Biol. Chem. 279(4) : 2856-65). Además, se han descrito construcciones de anticuerpo multivalente que comprenden dos repeticiones de Fab en la cadena pesada de una IgG y que son capaces de unirse a cuatro moléculas de antígeno (véase WO 01 77342A1 , y Miller, K. , et al . (2003) J . Immunol . 170(9) : 4854-61 ) .
Existe en la técnica la necesidad de proteínas de unión multivalentes mejoradas que se puedan unir a dos o más antígenos. La solicitud de patente E. U .A No. de serie 1 1 /507,050 provee u na familia novedosa de proteínas de unión que se pueden unir a dos o más antígenos con alta afinidad , las cuales se denominan inmunoglobulinas de dominio variable dual (DVD-lg™). La presente invención también provee proteínas de unión novedosas que se pueden unir a dos o más antígenos.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION ¾ Esta invención se refiere a proteínas de unión multivalentes q ue se pueden unir a dos o más antígenos. La presente invención provee una familia novedosa de proteínas de unión que se pueden unir a dos o más antígenos con alta afinidad.
En una modalidad la invención provee una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en la cual la cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, C es un dominio constante, X1 representa un aminoácido o polipéptido, X2 representa una región Fe y n es 0 o 1. En una modalidad VD1 y VD2 en la proteína de unión son dominios variables de la cadena pesada. En otra modalidad, el dominio variable de la cadena pesada se selecciona a partir del grupo que consiste de un dominio variable de la cadena pesada de múrido, un dominio variable de la cadena pesada de humano, un dominio variable de la cadena pesada injertado con CDR, y un dominio variable de la cadena pesada humanizado. Incluso en otra modalidad, VD1 y VD2 se pueden unir al mismo antígeno. En otra modalidad VD1 y VD2 se pueden unir a antígenos diferentes. Incluso en otra modalidad, C es un dominio constante de la cadena pesada. Por ejemplo, X1 es un enlazador con la condición que X1 no sea CH1. Por ejemplo, X1 es un enlazador que se selecciona a partir del grupo que consiste de AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG(SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO: 9); SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTtPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); y GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26). En una modalidad, X2 es una región Fe. En otra modalidad, X2 es una región Fe variante.
En una modalidad la proteína de unión descrita en la presente solicitud comprende una cadena de polipéptido, en la cual la cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada, C es un dominio constante de la cadena pesada, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 es una región Fe.
En una modalidad, VD1 y VD2 en la proteína de unión son dominios variables de la cadena ligera. En una modalidad, el dominio variable de la cadena ligera se selecciona a partir del grupo que consiste de un dominio variable de la cadena ligera de murido, un dominio variable de la cadena ligera de humano, un dominio variable de la cadena ligera injertado con CDR, y un dominio variable de la cadena ligera humanizado. En una modalidad VD1 y VD2 se pueden unir al mismo antígeno. En otra modalidad VD1 y VD2 se pueden unir a antígenos diferentes. En una modalidad, C es un dominio constante de la cadena ligera. En otra modalidad, X1 es un enlazador con la condición que X1 no sea CL1. En una modalidad, X1 es un enlazador que se selecciona a partir del grupo que consiste de AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG(SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO. 9); SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPS VYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); y GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26). En una modalidad, la proteína de unión no comprende X2.
En una modalidad, tanto la cadena pesada variable como la cadena ligera variable comprenden el mismo enlazador, En otra modalidad, la cadena pesada variable y la cadena ligera: variable comprenden enlazadores diferentes. En otra modalidad, tanto la cadena pesada variable como la cadena ligera variable comprenden un enlazador corto (de aproximadamente 6 aminoácidos). En otra modalidad, tanto la cadena pesada variable como la cadena ligera variable comprenden un enlazador largo (mayor de 6 aminoácidos). En otra modalidad, la cadena pesada variable comprende un enlazador corto y la cadena ligera variable comprende un enlazador largo. En otra modalidad, la cadena pesada variable comprende un enlazador largo y la cadena ligera variable comprende un enlazador corto.
' En una modalidad la proteína de unión descrita en la presente solicitud comprende una cadena de polipéptido, en la cual la cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera, C es un dominio constante de la cadena ligera, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 no comprende una región Fe.
En otra modalidad la invención provee una proteína de unión que comprende dos cadenas de polipéptido, en la cual la primera cadena polipeptídica comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada, C es un dominio constante de la cadena pesada, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 es una región Fe; y la segunda cadena polipeptídica comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera, C es un dominio constante de la cadena ligera, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 no comprende una región Fe. En una modalidad particular, la proteína de unión de Dominio Variable Dual (DVD) comprende cuatro cadenas de polipéptido en la cual las primeras dos cadenas de polipéptido comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, respectivamente en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada, C es un dominio constante de la cadena pesada, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 es una región Fe; y las segundas dos cadenas de polipéptido comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n respectivamente, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera, C es un dominio constante de la cadena ligera, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 no comprende una región Fe. Dicha proteína de Dominio Variable Dual (DVD) tiene cuatro sitios de unión a antígeno..
En otra modalidad las proteínas de unión descritas en la presente solicitud se pueden unir a uno o más objetivos. En una modalidad, el objetivo se selecciona a partir del grupo que consiste de citocinas, proteínas de superficie celular, enzimas y receptores. En otra modalidad, la proteína de unión puede modular una función biológica de uno o más objetivos. En otra modalidad, la proteína de unión puede neutralizar uno o más objetivos. La proteína de unión de la invención se puede unir a citocinas que se seleccionan a partir del grupo que consiste de linfocinas, monocinas, hormonas polipeptídicas, receptores, o marcadores de tumor. Por ejemplo, la DVD-lg de la invención se puede unir a dos o más de los siguientes: Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-a) de múrido o de humano, Prostaglandina E2 (PGE2), Amiloide beta (Abeta) (sec. 1), Abeta (sec. 2), Abeta (sec. 3), Interleucina 1ß (??_-1ß), Receptor del Factor de Crecimiento tipo Insulina (IGFR), Interleucina 17A (IL-17A), Interleucina 6 (IL-6), receptor de Interleucina 6 (IL-6R), Interleucina 15 (IL-15), Interleucina 18 (IL-18), Factor de Crecimiento de Nervio (NGF), Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) (sec. 1), EGFR (sec. 2), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y S1P (véase también Tabla 2 y Ejemplo 2). En una modalidad específica la proteína de unión se puede unir a pares de objetivos que se selecciona a partir del grupo que consiste de TNF de ratón o de humano y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1 b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec. 2) y PGE2, e IGFR y PGE2 (véase Ejemplos).
En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de múrido y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 86, 92, 94, 96, 98, 100, 102 104, 106, y 108; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 89, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, y 109. En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de múrido y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 86 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 89. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de múrido y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 92 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 93. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de múrido y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 94 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 95. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de múrido y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 96 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 97. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de múrido y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 98 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 99. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de múrido y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO: 100 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 101. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de múrido y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 102 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 103. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de múrido y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 104 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 105. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de múrido y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 106 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 107. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de múrido y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 108 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 109.
En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de humano y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 114, 116, 118, y 120; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que se, selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 115, 117, 119, y 121. En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de humano y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 114 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 115. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de humano y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 116 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 117. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de humanó y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 118 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 119. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a TNF de humano y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 120 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 121.
En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a VEGF y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 128 y SEQ ID NO. 130; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 131¡. En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a VEGF y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 128 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 129. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a VEGF y PGE2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 130 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 131.
En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a NGF y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 134; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 133 y SEQ ID NO. 135. En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a NGF y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 132 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 133. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a NGF y PGE2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 134 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 135.
En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-17A y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 136 y SEQ ID NO. 138; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 137 y SEQ ID NO. 139. En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-17A y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 136 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 137. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-17A y PGE2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 138 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 139.
En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a I L- 1 b y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 140 y SEQ ID NO. 142; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 141 y SEQ ID NO. 143. En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a I L- 1 b y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 140 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 141. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a I L- 1 b y PGE2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 142 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 143.
En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-6 y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 144 y SEQ ID NO. 146; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 145 y SEQ ID NO. 147. En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-6 y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 144 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 145. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-6 y PGE2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 146 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 147.
En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a Abeta (sec. 1) y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 148 y SEQ ID NO. 150; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 149 y SEQ ID NO. 151. En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a Abeta (sec. 1) y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 148 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 149. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a Abeta (sec. 1) y PGE2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 150 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 151.
En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a Abeta (sec. 2) y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 152 y SEQ ID NO. 154; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 153 y SEQ ID NO. 155. En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a Abeta (sec. 2) y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 152 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 153. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a Abeta (sec. 2) y PGE2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 154 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 155.
En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a Abeta (sec. 3) y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 156 y SEQ ID NO. 158; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 157 y SEQ ID NO. 159. En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a Abeta (sec. 3) y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 156 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 157. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a Abeta (sec. 3) y PGE2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 158 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 159.
En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-18 y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD que se selecciona a partir d^l grupo que consiste de SEQ ID NO. 160 y SEQ ID NO. 162; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 161 y SEQ ID NO. 163. En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-18 y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 160 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 161. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-18 y PGE2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 162 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 163.
En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-15 y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 164 y SEQ ID NO. 166; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 167. En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-15 y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 164 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 165. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-15 y PGE2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 166 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 167.
En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a S1P y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 168 y SEQ ID NO. 170; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 169 y SEQ ID NO. 171. En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a S1P y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 168 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 169. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a S1P y PGE2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 170 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 171.
En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-6R y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 172 y SEQ ID NO. 174; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 173 y SEQ ID NO. 175. En una modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-6R y PGE2 comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 172 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 173. En otra modalidad, la proteína de unión que se puede unir a IL-6R y PGE2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 174 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO: 175.
En otra modalidad, la secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD comprende por lo menos una región de VH que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 87, 90, 110, y 112; y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD que comprende por lo menos una región de VL que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 39, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 88, 91, 111, y 113.
En otra modalidad la invención provee una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en la cual la cadena de polipéptido comprende VD1-(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena pesada; (X1)n es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, en el cual el (X1)n puede estar presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en el cual el (X2)n puede estar presente o ausente. En una modalidad, la región Fe está ausente de la proteína de unión.
En otra modalidad, la invención provee una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en la cual la cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual, VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena ligera; (X1)n es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, en el cual el (X1)n puede estar presente o ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, en el cual el (X2)n puede estar presente o ausente. En una modalidad, (X2)n está ausente de la proteína de unión.
En otra modalidad la proteína de unión de la invención comprende la primera y segunda cadenas de polipéptido, en la cual la primera cadena polipeptídica comprende un primer VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena pesada; (X1)n es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, en el cual el (X1)n puede estar presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en el cual el (X2)n puede estar presente o ausente; y en la cual la segunda cadena polipeptídica comprende un segundo VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena ligera; (X1)n es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, en el cual el (X1)n puede estar presente o ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, en el cual el (X2)n puede estar presente o ausente. En otra modalidad, la proteína de unión comprende dos primeras cadenas de polipéptido y dos segundas cadenas de polipéptido. Incluso en otra modalidad, (X2)n está ausente del segundo polipéptido. Incluso en otra modalidad, la región Fe, si está presente en el primer polipéptido, se selecciona a partir del grupo que consiste de región Fe de la secuencia original y una región Fe de secuencia variante. Incluso en otra modalidad, la región Fe se selecciona a partir del grupo que consiste de una región Fe proveniente de una lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, e IgD.
En otra modalidad la proteína de unión de la invención es una DVD-lg que se puede unir a dos antígenos que comprende cuatro cadenas de polipéptido, en la cual, la primera y tercera cadenas de polipéptido comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual, VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena pesada; (X1)n es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, en el cual el (X1)n puede estar presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en el cual el (X2)n puede estar presente o ausente; y en la cual la segunda y cuarta cadenas de polipéptido comprenden VD1-(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena ligera; (X1)n es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, en el cual el (X1)n puede estar presente o ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, en el cual el (X2)n puede estar presente o ausente.
En otro aspecto, la invención provee una proteína de unión humanizada que comprende una cadena de polipéptido, en la cual la cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable humanizado, VD2 es un segundo dominio variable humanizado, C es un dominio constante, X1 representa un aminoácido o polipéptido, X2 representa una región Fe y n es 0 o 1, en la cual la proteína de unión se une a prostaglandina E2 y al factor de necrosis tumoral alfa.
En una modalidad, C es un dominio constante de la cadena pesada, tal como, por ejemplo, C es un dominio constante de la cadena pesada de humano de una clase de anticuerpo que se selecciona a partir del grupo que consiste de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, lgA1, lgA2, IgD, IgM, IgE, IgY, y mutantes de IgG. C puede ser un dominio constante de la cadena pesada de tipo silvestre o mutante. Por ejemplo, C comprende la secuencia de SEQ ID NO: 122 o 123, o variante funcional o mutante de las mismas.
En otra modalidad, C es un dominio constante kappa de la cadena ligera. Por ejemplo, C es un dominio constante kappa de la cadena ligera de humano de una clase de anticuerpo que se selecciona a partir del grupo que consiste de IgG, IgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, lgA1, lgA2, IgD, IgM, IgE, IgY, y mutantes de las mismas. C puede ser un dominio constante kappa o lambda de la cadena ligera de tipo silvestre o mutante. Por ejemplo, C comprende la secuencia de SEQ ID NO: 124 o 125, o variante funcional o mutante de las mismas.
En otro aspecto, la invención provee una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en el cual la cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera, C es un dominio constante de la cadena ligera, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 no comprende una región Fe, en la cual la proteína de unión se une a prostaglandina E2 y al factor de necrosis tumoral alfa.
En otro aspecto, la invención provee una proteína de unión que comprende la primera y la segunda cadenas de polipéptido, en la cual la primera cadena polipeptídica comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada, C es un dominio constante de la cadena pesada, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 es una región Fe; y la segunda cadena polipeptídica comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera, C es un dominio constante de la cadena ligera, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 no comprende una región Fe, en la cual la proteína de unión se une a prostaglandina E2 y al factor de necrosis tumoral alfa.
Incluso en otro aspecto, la invención provee una proteína de unión que comprende cuatro cadenas de polipéptido, en la cual dos cadenas de polipéptido comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada, C es un dominio constante de la cadena pesada, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 es una región Fe; y dos cadenas de polipéptido comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera, C es un dominio constante de la cadena ligera, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 no comprende una región Fe, en la cual la proteína de unión se une a prostaglandina E2 y al factor de necrosis tumoral alfa.
La invención provee un método para elaborar una proteína de unión de tipo DVD-lg mediante pre-selección de los anticuerpos progenitores. En una modalidad, el método para elaborar una Inmunoglobulina de Dominio Variable Dual que se puede unir a dos antígenos comprende los pasos de a) obtener un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, que se pueda unir a un primer antígeno; b) obtener un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, que se pueda unir a un segundo antígeno; c) construir la primera y tercera cadenas de polipéptido que comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual, VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir del primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir del segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena pesada; (X1)n es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, en el cual el (X1)n puede estar presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en el cual el (X2)n puede estar presente o ausente; d) construir la segunda y cuarta cadenas de polipéptido que comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual, VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir del primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir del segundo anticuerpo progenitor o unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena ligera; (X1)n es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, en donde el (X1)n puede estar presente o ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, en el cual el (X2)n puede estar presente o ausente; e) expresar la primera, segunda, tercera y cuarta cadenas de polipéptido; de modo tal que se genere una Inmunoglobulina de Dominio Variable Dual que se pueda unir al primero y segundo antígenos.
Incluso en otra modalidad, la invención provee un método para generar una Inmunoglobulina de Dominio Variable Dual que se pueda unir a dos antígenos con las propiedades deseadas que comprende los pasos de a) obtener un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, que se pueda unir a un primer antígeno y que posea por lo menos una propiedad deseada exhibida por la inmunoglobulina de Dominio Variable Dual; b) obtener un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, que se pueda unir a un segundo antígeno y que posea por lo menos una propiedad deseada exhibida por la inmunoglobulina de Dominio Variable Dual; c) construir la primera y tercera cadenas de polipéptido que comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual; VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir del primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir del segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena pesada; (X1)n es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, en el cual el (X1)n puede estar presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en el cual el (X2)n puede estar presente o ausente; d) construir la segunda y cuarta cadenas de polipéptido que comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual; VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir del primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir del segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena ligera; (X1)n es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, en el cual el (X1)n puede estar presente o ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, en el cual el (X2)n puede estar presente o ausente; e) expresar la primera, segunda, tercera y cuarta cadenas de polipéptido; de modo tal que se genere una Inmunoglobulina de Dominio Variable Dual que se pueda unir al primero y segundo antígenos con las propiedades deseadas.
En una modalidad, los VDI de la primera y segunda cadenas de polipéptido descritos en la presente solicitud se obtienen a partir del mismo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo. En otra modalidad, los VDI de la primera y segunda cadenas de polipéptido descritos en la presente solicitud se obtienen a partir de anticuerpos progenitores diferentes o porciones de unión a antígeno de los mismos. En otra modalidad, los VD2 de la primera y segunda cadenas de polipéptido descritos en la presente solicitud se obtienen a partir del mismo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo. En otra modalidad, los VD2 de la primera y segunda cadenas de polipéptido descritos en la presente solicitud se obtienen a partir de anticuerpos progenitores diferentes o porciones de unión a antígeno de los mismos.
En una modalidad el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, y el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, son el mismo anticuerpo. En otra modalidad el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, y el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, son anticuerpos diferentes.
En una modalidad el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une a un primer antígeno y el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une a un segundo antígeno. En una modalidad particular, el primer y segundo antígenos son el mismo antígeno. En otra modalidad, los anticuerpos progenitores se unen a epítopes diferentes en el mismo antígeno. En otra modalidad el primer y segundo antígenos son antígenos diferentes. En otra modalidad, el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une al primer antígeno con una potencia diferente de la potencia con la cual el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une al segundo antígeno. Incluso en otra modalidad, el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une al primer antígeno con una afinidad diferente de la afinidad con la cual el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une al segundo antígeno.
En otra modalidad el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, y el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se seleccionan a partir del grupo que consiste de, anticuerpo humano, anticuerpo injertado con CDR, y anticuerpo humanizado. En una modalidad, las porciones de unión a antígeno se seleccionan a partir del grupo que consiste de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados mediante un puente de disulfuro en la región de gozne; un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo, un fragmento dAb, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, un anticuerpo de cadena individual, y diacuerpos.
En otra modalidad la proteína de unión de la invención posee por lo menos una propiedad deseada exhibida por el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, o el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo. De manera alternativa, el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo y el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo poseen por lo menos una propiedad deseada exhibida por la inmunoglobulina de Dominio Variable Dual. En una modalidad, la propiedad deseada se selecciona a partir de uno o más parámetros del anticuerpo. En otra modalidad, los parámetros del anticuerpo se seleccionan a partir del grupo que consiste de especificidad de antígeno, afinidad hacia el antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epítope, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada tisular, y unión a antígeno ortólogo. En una modalidad la proteína de unión es multivalente. En otra modalidad, la proteína de unión es multiespecífica. Las proteínas de unión multivalentes y o multiespecíficas descritas en la presente solicitud tienen propiedades deseables particularmente desde un punto de vista terapéutico. Por ejemplo, la proteína de unión multivalente y o multiespecífica puede (1) ser interiorizada (y/o catabolizada) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno a los cuales se unen los anticuerpos; (2) ser un anticuerpo agonista; y/o (3) inducir muerte celular y/o apoptosis de una célula que expresa un antígeno al cual el anticuerpo multivalente se puede unir. El "anticuerpo progenitor" que provee especificidad de unión a por lo menos un antígeno, de las proteínas de unión multivalentes y o multiespecíficas puede ser uno que sea interiorizado (y/o catabolizado) por una célula que expresa un antígeno al cual se une el anticuerpo; y/o puede ser un anticuerpo agonista, anticuerpo que induzca muerte celular, y/o anticuerpo que induzca apoptosis, y la proteína de unión multivalente y o multiespecífica como la descrita en la presente solicitud puede presentar mejora(s) en una o más de estas propiedades. Asimismo, el anticuerpo progenitor puede carecer de cualquiera de una o más de estas propiedades, pero puede ser dotado con las mismas cuando se construye como una proteína de unión multivalente como la descrita en la presente solicitud .
En otra modalidad la proteína de unión de la invención tiene una constante de velocidad de asociación (Kasoc) para dichos uno o más objetivos que se selecciona á partir del grupo que consiste de: por lo menos aproximadamente 1 02 M'V1 ; por lo menos aproximadamente 1 03 M"1s"1 ; por lo menos aproximadamente 1 04 M'V 1 ; por lo menos aproximadamente 1 05 M" s' 1 ; y por lo menos aproximadamente 1 06 M'V1 , según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie. En una modalidad, la proteína de unión de la invención tiene una constante de velocidad de asociación (KaS0c) para uno o más objetivos entre 1 02 M"V1 y 1 03 M'V1 ; entre 103 M" 1s" 1 y 1 04 IvrV ; entre 104 M'V1 y 105 M'V1 ; o entre 105 M'V1 y 106 M'V1 , según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie.
En otra modalidad la proteína de unión tiene una constante de velocidad de disociación (Kdisoc) para uno o más objetivos que se selecciona a partir del grupo que consiste de: cuando mucho aproximadamente 1 0"3 s~1 ; cuando mucho aproximadamente 1 0"4 s" ; cuando mucho aproximadamente 1 0"5 s"1 ; y cuando mucho aproximadamente 1 0"6 s" 1 , según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie. En una modalidad , la proteína de unión de la invención tiene una constante de velocidad de disociación (Kdisoc) para uno o más objetivos de 10'3 s"1 a 10"4 s"1; de 10"4 s"1 a 10"5 s" ; o de 10"5 s"1 a 10"e s' según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie.
En otra modalidad la proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) para uno o más objetivos que se selecciona a partir del grupo que consiste de: cuando mucho aproximadamente 10"7 M; cuando mucho aproximadamente 10"8 M; cuando mucho aproximadamente 10"9 M; cuando mucho aproximadamente 10"10 M; cuando mucho aproximadamente 10"11 M; cuando mucho aproximadamente 10"12 M; y cuando mucho 10"13 M. En una modalidad, la proteína de unión de la invención tiene una constante de disociación (KD) para sus objetivos de 10"7 M a 10"8 M; de 10"8 M a 10"9 M; de 10"9 M a 10'10 M; de 10"10 a 10"11 M; de 10'11 M a 1CT12 M; o de 10"12 a M 1CT13 M.
En otra modalidad, la proteína de unión descrita en la presente solicitud es un conjugado que también comprende un agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de una molécula de inmuno-adhesión, un agente para formación de imagen, un agente terapéutico, y un agente citotóxico. En una modalidad, el agente para formación de imagen se selecciona a partir del grupo que consiste de una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética, y biotina. En otra modalidad, el agente para formación de imagen es una radiomarca que se selecciona a partir del grupo que consiste de: 3H 14Cj 35S 90? 99Tc> 111,^ 125| > 131, 177^ 166^ y 153Sm |nc|USQ en otra modalidad, el agente terapéutico o citotóxico se selecciona a partir del grupo que consiste de un anti-metabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, toxina, y un agente apoptótico.
En otra modalidad, la proteína de unión descrita en la presente solicitud es una proteína de unión cristalizada y existe como un cristal. En una modalidad, el cristal es un cristal de liberación controlada farmacéutico libre de vehículo. Incluso en otra modalidad, la proteína de unión cristalizada tiene un tiempo de vida media mayor in vivo que la contraparte soluble de dicha proteína de unión. Incluso en otra modalidad, la proteína de unión cristalizada retiene la actividad biológica.
En otra modalidad, la proteína de unión descrita en la presente solicitud está glucosilada. Por ejemplo, la glucosilación es un patrón de glucosilación de humano.
Otro aspecto de la invención pertenece a un ácido nucleico aislado que codifica para cualquiera de las proteínas de unión descritas en la presente solicitud. Una modalidad adicional provee un vector que comprende el ácido nucleico aislado descrito en la presente solicitud en la cual el vector se selecciona a partir del grupo que consiste de pcDNA; pTT (Durocher et al, Nucleic Acids Research 2002, Volumen 30, No.2); pTT3 (pTT con sitio de clonación múltiple adicional; pEFBOS (Mizushima, S. y Nagata, S., (1990) Nucleic acids Research Vol. 18, No. 17); pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO, pEF6 TOPO y pBJ. En una modalidad, el vector es un vector descrito en la Solicitud de Patente E.U.A. No. de Serie 61/021,282.
En otro aspecto se transforma una célula hospedera con el vector descrito en la presente solicitud. En una modalidad, la célula hospedera es una célula procariota. En otra modalidad, la célula hospedera es E. coli. En una modalidad relacionada la célula hospedera es una célula eucariota. En otra modalidad, la célula eucariota se selecciona a partir del grupo que consiste de una célula protista, una célula animal, una célula aviar, una célula vegetal y una célula fúngica. Incluso en otra modalidad, la célula hospedera es una célula de mamífero incluyendo, pero sin limitarse a, CHO, COS; NSO, SP2, PER.C6 o una célula fúngica tal como Saccharomyces cerevisiae; o una célula de insecto tal como Sf9.
En una modalidad, dos o más DVD-lgs, por ejemplo, con especificidades diferentes, se producen en una célula hospedera recombinante individual. Por ejemplo, la expresión de una mezcla de anticuerpos ha sido nombrada Oligoclonics™, (Merus B.V., Los Países Bajos) patentes E.U.A. Nos. 7,262,028; 7,429,486.
Otro aspecto de la invención provee un método para producir una proteína de unión descrita en la presente solicitud que comprende cultivar cualquiera de las células hospederas también descritas en la presente solicitud en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir la proteína de unión. En una modalidad, 50%-75% de la proteína de unión producida mediante este método es una proteína de unión tetravalente específica dual. En una modalidad particular, 75%-90% de la proteína de unión producida mediante este método es una proteína de unión tetravalente específica dual. En una modalidad particular, 90%-95% de la proteína de unión producida es una proteína de unión tetravalente específica dual.
Una modalidad provee una composición para la liberación de una proteína de unión en la cual la composición comprende una formulación que a su vez comprende una proteína de unión cristalizada, como la descrita en la presente solicitud, y un ingrediente, y por lo menos un vehículo polimérico. Por ejemplo, el vehículo polimérico es un polímero que se selecciona a partir de uno o más del grupo que consiste de: poli(ácido acrílico), poli(cianoacrilatos), poli(aminoácidos), poli(anhídridos), poli(depsipéptido), poli(ésteres), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico) o PLGA, poli(b-hidroxibutirato), poli(caprolactona), poli(dioxanona); poli(etilenglicol), poli((hidroxipropil)metacrilamida, poli[(organo)fosfazeno], poli(ortoésteres), poli(alcohol vinílico), poli(vinilpirrolidona), copolímeros de anhídrido maléico-éter alquil-vinílico, polioles tipo pluronic, albúmina, alginato, celulosa y derivados de celulosa, colágena, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glucaminoglucanos, polisacáridos sulfatados, mezclas y copolímeros de los mismos. Por ejemplo, el ingrediente se selecciona a partir del grupo que consiste de albúmina, sacarosa, trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil-3-ciclodextrina, metoxipolietilenglicol y polietilenglicol. Otra modalidad provee un método para tratar a un mamífero que comprende el paso de administrar al mamífero una cantidad efectiva de la composición descrita en la presente solicitud.
La invención también provee una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión, como la descrita en la presente solicitud y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad adicional la composición farmacéutica comprende por lo menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno. Por ejemplo, el agente adicional se selecciona a partir del grupo que consiste de: un agente terapéutico, un agente para formación de imagen, un agente citotóxico, un inhibidor de angiogénesis (incluyendo pero sin limitarse a un anticuerpo anti-VEGF o una trampa para VEGF), un inhibidor de cinasa (incluyendo pero sin limitarse a un inhibidor de KDR y un inhibidor de TIE-2), un bloqueador de molécula de co-estimulación (incluyendo pero sin limitarse un anti-B7.1, anti-B7.2, CTLA4-lg, anti-CD20), un bloqueador de molécula de adhesión (incluyendo pero sin limitarse a un anticuerpo anti-LFA-1, un anticuerpo anti-E/L-selectina, un inhibidor de molécula pequeña), un anticuerpo anti-citocina o fragmento funcional del mismo (incluyendo pero sin limitarse a un anticuerpo anti-IL-18, un anticuerpo anti-TNF, y un anticuerpo anti-IL-6/receptor de citocina), metotrexato, ciclosporina, rapamicina, FK506, una marca o reportero detectable, un antagonista de TNF, un anti-reumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco anti- inflamatorio no esferoidal (NSAID por sus siglas en inglés), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un anti-psoriático, un corticosteroide, un esferoide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un fármaco para reemplazo hormonal, un agente radiofarmacéutico, un antidepresivo, un anti-psicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esferoide inhalado, una epinefrina o análogo, una citocina, y un antagonista de citocina.
En otro aspecto, la invención provee un método para tratar a un individuo humano que padece de un trastorno en el cual el objetivo, u objetivos, que puede(n) ser ligado(s) por la proteína de unión descrita en la presente solicitud es(son) perjudicial(es), que comprende administrar al individuo humano una proteína de unión descrita en la presente solicitud de modo tal que se inhiba la actividad del objetivo, u objetivos, en el individuo humano y se alivie uno o más de los síntomas o se logre el tratamiento. Por ejemplo, el trastorno se selecciona a partir del grupo que comprende artritis, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerante, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis escleroderma, enfermedad de injerto contra hospedero, rechazo de trasplante de órgano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con transplante de órgano, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico , síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein , vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica , uveitis, choque séptico, síndrome de choque séptico, sí ndrome séptico, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida , mielitis transversal aguda, corea de Huntington , enfermedad de Parkinson , enfermedad de Alzheimer, apoplejía, cirrosis biliar prima ria, anemia hemolítica, tumores malignos, insuficiencia cardiaca, infarto al miocardio, enfermedad de Addison , deficiencia poliglandular esporádica tipo I y deficiencia poliglandular tipo I I , sínd rome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) del adulto, alopecia, alopecia circunscripta, artropatía seronegativa, artropatía , enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerante, sinovitis enteropática, artropatía asociada con Chlamydia, Yersinia y Salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad ampollosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal , anemia hemolítica autoinmune, anemia hemol ítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adq uirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/Enfermedad del Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, Síndrome de Enfermedad de Inmunodeficiencia Adquirida, Enfermedades Relacionadas con Inmunodeficiencia Adquirida, Hepatitis B, Hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, pneumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada con enfermedad de tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de tejido conectivo mixta, enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada con lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de Sjógren, enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada con hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial post-infecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo 1 (hepatitis clásica autoinmune o lupoide), hepatitis autoinmune tipo 2 (hepatitis por anticuerpo anti-LKM), hipoglicemia mediada autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con transplante de órgano, enfermedad inmune crónica asociada con transplante de órgano, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, NOS de enfermedad renal, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad por esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmía del simpático, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad de tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjórgren, enfermedad/arteritis de Takayasu, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad autoinmune de la tiroides, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bocioso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixoedema primario, uveitis facogénica, vasculitis primaria, enfermedad hepática aguda con vitíligo, enfermedades hepáticas crónicas, cirrosis alcohólica, lesión hepática inducida por alcohol, coleosatatis, enfermedad hepática idiosincrática, hepatitis inducida por droga, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos del grupo B (GBS por sus siglas en inglés), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas tipo Th1 y tipo Th2, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor), y cánceres tales como cáncer de pulmón, de mama, de estómago, de vejiga urinaria, de colon, de páncreas, de ovario, de próstata y rectal y tumores malignos hematopoyéticos (leucemia y linfoma), Abetalipoprotemia, Acrocianosis, procesos parasitarios o infecciosos agudos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL por sus siglas en inglés), leucemia mieloide aguda (AML por sus siglas en inglés), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia por SIDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis por contacto alérgica, rinitis alérgica, rechazo de aloinjerto, deficiencia de antitripsina alfa 1, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración de célula del asta anterior, terapia anti-cd3, síndrome antifosfolípido, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, aneurismos aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arteriesclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrilación atrial (sostenida o paroxística), aleteo atrial, bloqueo atrioventricular, linfoma de célula B, rechazo de injerto de hueso, rechazo de trasplante de médula ósea (BMT por sus siglas en inglés), bloqueo de la rama del fascículo, linfoma de Burkitt, Quemaduras, arritmias cardiacas, síndrome de aturdimiento cardiaco, tumores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta de inflamación por bypass cardiopulmonar, rechazo de trasplante de cartílago, degeneraciones corticales cerebelares, trastornos del cerebelo, taquicardia atrial caótica o multifocal, trastornos asociados con quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CM L por sus siglas en inglés), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL por sus siglas en inglés), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD por sus siglas en inglés) , intoxicación con salicilato crónico, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonale, enfermedad de arteria coronaria, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis negativa en cultivo, fibrosis quística, trastornos asociados a terapia con citocina, demencia pugilística , enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica de deng ue, dermatitis, condiciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad aterioesclerótica diabética, enfermedad de cuerpo difuso de Lewy , cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos de los ganglios básales, síndrome de Down en edad intermedia , trastornos del movimiento inducidos por fármaco inducidos por fármacos q ue bloquean los receptores de dopamina del SNC , sensibilidad a fármacos, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección por virus de Epstein-Barr, eritromelalgia , trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo de implante de timo fetal , ataxia de Friedreich , trastornos arteriales periféricos funcionales, sepsis fúngica, gangrena gaseosa , úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo de injerto de cualquier órgano o tejido, sepsis por G ram negativos, sepsis por Gram positivos, granulomas debido a organismos intracelulares, leucemia de célula pilosa , enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo de trasplante de corazón , hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombolítica trombocitopénica, hemorragia, hepatitis (A) , arritmias del fascículo de His, infección por VI H/neuropatía de VI H , enfermedad de Hodgkin , trastornos de movimiento hiperquinético, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad , hipertensión , trastornos del movimiento hipoquinéticos, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática, citotoxicidad mediada por anticuerpo, Astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveitis/neuritis óptica, lesión por isquemia-reperfusión , apoplejía isquémica, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil , sarcoma de Kaposi , rechazo de trasplante de riñon , Legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema , rechazo de trasplante de hígado, linfoedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma malig no, meningitis, meningococcemia, enfermedades metabólicas/idiopáticas, dolor de cabeza por migraña, trastorno multi-sistema mitocóndrico, enfermedad de tejido conectivo mixta, gammopatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager y Machado-Joseph) , miastenia grave, Mycobacterium avium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, síndrome mielodisplásico, infarto al miocardio, trastornos isquémicos del miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crónica neonatal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I , fiebre neutropénica, linfoma de tipo no hodgkins , oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos arteriales oclusivos, terapia con okt3, orquitis/epididimitis, procedimientos de reversión de orquitis/vasectomia, organomegalia, osteoporosis, rechazo de trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de tumor maligno, rechazo de trasplante de la paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis peren ne, enfermedad del pericardio, enfermedad ateroesclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumon ía por Pneumocystis carinii, neumon ía , síndrome de POE MS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía , gammopatía monoclonal , y sínd rome de cambios de la piel) , síndrome post perfusión , síndrome post bomba , síndrome de cardiotom ía postinfarto al miocardio (post- I), preeclampsia, Parálisis supranuclear Progresiva, hipertensión pulmonar primaria, terapia con radiación , fenómeno y enfermedad de Raynaud , enfermedad de Raynoud , enfermedad de Refsum , taquicardia de QRS estrecho reg ular, hipertensión renovascular, daño por reperfusión, cardiomiopatía restrictiva , sarcomas, escleroderma, corea senil, demencia senil de tipo cuerpo de Lewy, artropatías seronegativas, choq ue, anemia de célula falciforme, rechazo de aloinjerto de piel , síndrome de cambios de la piel, rechazo de trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelares, miositis estreptocócica, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxis sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, ALL de célula T o de FAB, Telangiectasia, tromboangitis obliterante, trombocitopenia, toxicidad, transplantes, trauma/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad de tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades cardiacas valvulares, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosas, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado con vital, síndrome de Wernicke-Korsakoff, enfermedad de Wilson, rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática aguda, poli-radiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto, alopecia circunscripta, anafilaxis, síndrome de anticuerpo anti-fosfolípido, anemia aplásica, arteriosclerosis, eczema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado con infección por estreptococo, enteropatía autoinmune, pérdida auditiva autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS por sus siglas en inglés), miocarditis autoinmune, insuficiencia ovárica prematura autoinmune, blefaritis, bronquiectasis, penfigoide ampolloso, enfermedad cardiovascular, síndrome anti-fosfolípido catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatricial, síndrome clínicamente aislado (cis) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico con inicio en la niñez, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética, diabetes mellitus, hernia discal, prolapso de disco, anemia hemolítica inmune inducida por fármaco, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, episcleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barré (GBS por sus siglas en inglés), fiebre del heno, síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis por cuerpos de inclusión, enfermedad inflamatoria ocular infecciosa, enfermedad desmielinizante inflamatoria, enfermedad cardiaca inflamatoria, enfermedad renal inflamatoria, IPF/UIP, iritis, queratitis, queratojuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de célula de Langerhan, livedo reticularis, degeneración macular, poliangiitis microscópica, espondilitis anquilosante (morbus bechterev), trastornos de neurona motora, penfigoide de membrana mucosa, insuficiencia de órgano múltiple, miastenia grave, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de la raíz nerviosa, neuropatía, hepatitis no A no B, neuritis óptica, osteólisis, cáncer de ovario, artritis reumatoide juvenil (JRA por sus siglas en inglés) pauciarticular, enfermedad oclusiva de arteria periférica (PAOD por sus siglas en inglés), enfermedad vascular periférica (PVD por sus siglas en inglés), enfermedad de arteria periférica (PAD por sus siglas en inglés), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, polimialgia reumática, poliosis, JRA poliarticular, síndrome de deficiencia poliendocrina, polimiositis, polimialgia reumática (PMR por sus siglas en inglés), síndrome post-bomba, Parkinsonismo primario, cáncer de próstata y rectal y tumores malignos hematopoyéticos (leucemia y linfoma), prostatitis, aplasia de eritrocito puro, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, reestenosis, enfermedad cardiaca reumática, sapho (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis, y osteítis), escleroderma, amiloidosis secundaria, síndrome de dificultad respiratoria aguda (shock lung), escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enfermedad de tejido conectivo asociada a silicón, dermatosis de sneddon-wilkinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS por sus siglas en inglés), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, arteritis temporal, retinitis toxoplásmica, necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversal, TRAPS (reacción alérgica tipo 1 del receptor del factor de necrosis tumoral, diabetes tipo II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP por sus siglas en inglés), vasculitis, conjuntivitis primaveral, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome de VKH), degeneración macular húmeda, cicatrización de heridas, artropatía asociada con Yersinia y Salmonella.
En una modalidad, las enfermedades que se pueden tratar o diagnosticar con las composiciones y métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, cánceres primarios y metastásicos, incluyendo carcinomas de mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hepático, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario (incluyendo riñón, vejiga urinaria y urotelio), del tracto genital femenino (incluyendo cuello uterino, útero, y ovarios así como coriocarcinoma y enfermedad trofoblástica gestacional), del tracto genital masculino (incluyendo tumores de próstata, de las vesículas seminales, de los testículos y de las células germinales), de las glándulas endocrinas (incluyendo las glándulas tiroides, adrenales, y pituitaria), y de la piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas (incluyendo aquellos que se originan en hueso y tejidos blandos así como sarcoma de Kaposi), tumores del cerebro, nervios, ojos, y las meninges (incluyendo astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwannomas, y meningiomas), tumores sólidos que surgen de tumores malignos hematopoyéticos tales como leucemias, y linfomas (tanto linfomas de Hodgkin como linfomas de tipo no Hodgkin).
Las DVD-lgs de la invención también pueden tratar una o más de las siguientes enfermedades: síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática aguda, poli-radiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto, alopecia circunscripta, anafilaxis, síndrome de anticuerpo anti-fosfolípido, anemia aplásica, arterioesclerosis, eczema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado con infección por Streptococcus, pérdida auditiva autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), miocarditis autoinmune, trombocitopenia autoinmune (AITP), blefaritis, bronquioectasis, penfigoide ampolloso, enfermedad cardiovascular, síndrome anti-fosfolípido catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatricial, síndrome clínicamente aislado (CIS) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico con inicio en la niñez, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética, Diabetes mellitus, hernia discal, prolapso discal, anemia hemolítica inmune inducida por fármaco, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, epiescleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barré,(GBS), fiebre del heno, síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis de cuerpo de inclusión, enfermedad inflamatoria ocular infecciosa, enfermedad desmielinizante inflamatoria, enfermedad cardiaca inflamatoria, enfermedad renal inflamatoria, IPF/UIP, iritis, queratitis, queratojuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de célula de Langerhan, Livedo ref cu/ar/sdegeneración macular, tumores malignos, poliangütis microscópica, espondilitis anquilosante, trastornos de neurona motora, penfigoide de membrana mucosa, insuficiencia de órgano múltiple, miastenia grave, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de la raíz del nervio, neuropatía, hepatitis no A no B, neuritis óptica, osteólisis, cáncer de ovario, JRA pauciarticular, enfermedad oclusiva de arteria periférica (PAOD), enfermedad vascular periférica (PVD), enfermedad de arteria periférica (PAD), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, polimialgia reumática, poliosis, JRA poliarticular, síndrome de deficiencia poliendocrina, polimiositis, polimialgia reumática (PMR), síndrome post-bomba, parkinsonismo primario, cáncer de próstata y rectal y tumores malignos hematopoyéticos (leucemia y linfoma), prostatitis, aplasia de eritrocito puro, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, reestenosis, enfermedad cardiaca reumática, SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis, y osteítis), escleroderma, amiloidosis secundaria, síndrome de dificultad respiratoria aguda, escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enfermedad de tejido conectivo asociada con silicón, dermatosis de Sneddon-Wilkinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, arteritis sistémica, retinitis toxoplásmica, necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversal, TRAPS (Receptor del Factor de Necrosis Tumoral, reacción alérgica tipo 1, diabetes tipo II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP), vasculitis, conjuntivitis primaveral, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome de VKH), degeneración macular húmeda, y cicatrización de heridas.
En una modalidad, los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos, se utilizan para tratar cáncer o en la prevención de metástasis de los tumores descritos en la presente solicitud ya sea cuando se utilizan solos o en combinación con radioterapia y/u otros agentes quimioterapéuticos.
En otro aspecto la invención provee un método para tratar a un paciente que padece de un trastorno que comprende el paso de administrar cualquiera de las proteínas de unión descritas en la presente solicitud, antes, al mismo tiempo, o después de la administración de un segundo agente, como se discute en la presente solicitud. En una modalidad particular el segundo agente se selecciona a partir del grupo que consiste de budenosida, factor de crecimiento epidérmico, corticosteroides, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilatos, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, inhibidores de lipoxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxano, antagonistas del receptor de IL-1, mAbs anti-IL-1 ß, mAbs anti-l L6 o anti-receptor de IL-6, factores de crecimiento, inhibidores de elastasa, compuestos de piridinil-imidazol, anticuerpos o agonistas de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, IL-23, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF, anticuerpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD-19, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos, metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil micofenolato, leflunomida, NSAIDs, ibuprofen, corticosteroides, prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, IRAK, NIK, IKK, p38, inhibidores de MAP cinasa, inhibidores de la enzima convertidora de I L- 1 ß , inhibidores de la enzima convertidora de TNFa, inhibidores de la señalización de célula T, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores de citocina soluble, receptor de TNF p55 soluble, receptor de TNF p75 soluble, sIL-IRI, si L-1 Rl I , slL-6R, citocinas anti-inflamatorias, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGFp.
En una modalidad particular las composiciones farmacéuticas descritas en la presente solicitud se administran al paciente mediante por lo menos un modo que se selecciona a partir de parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intra-cartilaginoso, intra-cavidades, intra-celíaco, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraosteal, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, y transdérmico.
Un aspecto de la invención provee por lo menos un anticuerpo anti-idiotipo para por lo menos una proteína de unión de la presente invención. El anticuerpo anti-idiotipo incluye cualquier molécula que contenga péptido o proteína que comprende por lo menos una porción de una molécula de inmunoglobulina tal como, pero sin limitarse a , por lo menos una región determinante de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porción de unión a ligando de la misma , una región variable de la cadena pesada o de la cadena ligera, una región constante de la cadena pesada o de la cadena ligera, una región de estructura base, o cualquier porción de las mismas, que se pueda incorporar en una proteína de unión de la presente invención.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Los objetivos anteriores y otros objetivos, características y ventajas de la presente invención, así como la invención misma , se entenderán más completamente a partir de la sig uiente descripción de las modalidades preferidas cuando se lea junto con las figuras acompañantes, en las cuales: La figu ra 1 A es una representación esquemática de construcciones de Ig de Dominio Variable Dual (DVD)-lg y muestra la estrategia para la generación de una DVD-lg a partir de dos anticuerpos progenitores.
La figura 1 B, es una representación esquemática de una DVD-lg TN F/PGE2, sin enlazador (DVD1 -lg) y con enlazador (DVD2-Ig) , y dos anticuerpos mono-específicos progenitores: anti-TN F D2E7 (a) y anti-PGE2 2B5-8.0 (ß).
La figura 2 muestra los datos de ELI SA de la u nión de 2B5-7.0, 2B5-8.0, 2B5-9.0, y 2B5-10.0 a PGE2-biotina.
La figura 3 muestra los datos del bio-ensayo de EP4 de la unión de 2B5-8.0 con relación a un 2B5 e lgG1.
La figura 4 muestra el efecto del mAb anti-TNF 8C11 y del mAb anti-PGE2 2B5, solos y en combinación, sobre la calificación artrítica promedio en ratones inyectados dos veces por semana a través de un periodo de 15 días.
La figura 5 muestra el desdoblamiento inducido por temperatura de Adalimumab (lgG1). Se pueden mostrar tres transiciones de desdoblamiento, lo que demuestra que el desdoblamiento de 3 dominios es típico para los anticuerpos. Los valores de Tm son 56.9°C, 67.4°C, y 76.75°C (solución amortiguadora a pH 4.3).
La figura 6 muestra el desdoblamiento inducido por temperatura de la DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7. Se pueden mostrar cuatro transiciones de desdoblamiento, lo que demuestra el desdoblamiento de 4 dominios. Los valores de Tm son 58.8°C, 68.6°C, 75.0°C, y 83.4°C (solución amortiguadora a pH 6.0).
La figura 7 muestra el desdoblamiento inducido por temperatura de Adalimumab (lgG1). Se pueden mostrar tres transiciones de desdoblamiento, lo que demuestra que el desdoblamiento de 3 dominios es típico para los anticuerpos. Los valores de Tm son 68.3°C, 75.4°C, y 83.1°C (solución amortiguadora a pH 6.1).
DESC RI PCION DETALLADA DE LA INVENCION Esta invención se refiere a proteínas de unión multivalentes y/o multiespecíficas que se pueden u nir a dos o más antígenos. Específicamente, la invención se refiere a inmunoglobulinas de dominio variable dual (DVD-lg) , y a composiciones farmacéuticas de las mismas, así como a ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células hospederas para elaborar a dichas DVD-Igs. Los métodos para utilizar las DVD-Igs de la invención para detectar antígenos específicos, ya sea in vitro o in vivo también son abarcados por la invención .
A menos que se defina de otra manera en la presente solicitud , los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención deberán tener los significados que son comúnmente entendidos por los expertos en la técnica . Sin embargo, el significado y alcance de los términos deben ser claros, en caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones provistas en la presente solicitud tienen prioridad con respecto a cualquier diccionario o definición extrínseca . Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en sing ular deberán incluir los plurales y los términos en plural deberán incluir el singular. En esta solicitud , el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique de otra manera . Asimismo, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, tal como "incluye" e "incluido", no es limitativo. Además, términos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos y componentes que comprenden una unidad como elementos y componentes que comprenden más de una subunidad a menos que se indique específicamente de otra manera.
En términos generales, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y las técnicas de, cultivo celular y de tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en la presente solicitud son aquellas bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente invención generalmente se llevan a cabo de conformidad con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y se discuten a través de toda la presente descripción a menos que se indique de otra manera. Las reacciones y técnicas de purificación enzimáticas se efectúan de conformidad con las especificaciones del fabricante, como normalmente se logra en la técnica o como se describe en la presente solicitud. Las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica de síntesis, y química de medicamentos y farmacéutica descritas en la presente solicitud son aquellas bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para síntesis química, análisis químico, preparación, formulación, y suministro farmacéutico, y tratamiento de pacientes.
Para que la presente invención se pueda entender más fácilmente, a continuación se definen términos selectos.
El término "polipéptido" tal como se utiliza en la presente solicitud, se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. Los términos "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable con el término polipéptido y también se refieren a una cadena polimérica de aminoácidos. El término "polipéptido" abarca proteínas originales o artificiales, fragmentos de proteína y análogos polipeptídicos de una secuencia de proteína. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. El uso de "polipéptido" en la presente solicitud tiene la intención de abarcar polipéptido y fragmentos y variantes (incluyendo fragmentos de variantes) del mismo, a menos que el contexto contradiga de otra manera. Para un polipéptido antigénico, un fragmento de polipéptido contiene opcionalmente por lo menos un epítope contiguo o no lineal de polipéptido. Los límites precisos de dicho por lo menos un fragmento de epítope se pueden confirmar utilizando la habilidad común en la técnica. El fragmento comprende por lo menos aproximadamente 5 aminoácidos contiguos, tal como por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, por lo menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, o por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos. Una variante de polipéptido es como se describe en la presente solicitud.
El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que debido a su origen o fuente de obtención no está asociado con componentes naturalmente asociados que lo acompañan en su estado original; está sustancialmente libre de otras proteínas provenientes de la misma especie; es expresado por una célula de una especie diferente; o no se presenta en la Naturaleza. Por lo tanto, un polipéptido que es q u ímicamente sintetizado o sintetizado en un sistema celular diferente al de la célula a partir de la cual éste se origina naturalmente estará "aislado" de sus componentes naturalmente asociados. Una proteína también se puede hacer sustancialmente libre de los componentes naturalmente asociados mediante aislamiento, utilizando técnicas de purificación de proteína bien conocidas en la técnica .
El término "recuperar" tal como se utiliza en la presente solicitud , se refiere al procedimiento de hacer que una especie qu ímica tal como un polipéptido esté sustancialmente libre de los componentes naturalmente asociados mediante aislamiento, por ejemplo, utilizando técnicas de purificación de proteína bien conocidas en la técnica.
"Actividad biológica" tal como se utiliza en la presente solicitud , se refiere a cualquiera de una o más propiedades biológicas inherentes de una molécula , (ya sea que esté presente de manera natural tal como se encuentra in vivo, o provista o habilitada mediante medios recombinantes) . Las propiedades biológicas incluyen pero no se limitan a unión al receptor; inducción de proliferación celular, inhibición del crecimiento celular, inducciones de otras citocinas, inducción de apoptosis, y actividad enzimática. Actividad biológica también incluye la actividad de una molécula de lg .
Los términos "unión especifica" o "unirse específicamente", tal como se utilizan en la presente solicitud , con referencia a la interacción de un anticuerpo , una proteína , o un péptido con una segu nda especie qu ímica, significan que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítope) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura de proteína específica en vez de a las proteínas en general. Si un anticuerpo es específico para el epítope "A" , la presencia de una molécula que contenga al epítope A (o A libre, sin marcar) , en una reacción que contenga "A" marcado y al anticuerpo, reduce la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.
El término "anticuerpo", tal como se utiliza en la presente solicitud , se refiere ampliamente a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig) constituida por cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) , o cualquier s fragmento, mutante, variante, o derivación funcional de las mismas, que conserve las características de unión a epítope esenciales de una molécula de Ig . Dichos formatos de anticuerpo mutante, variante, o derivado del mismo son conocidos en la técnica . Las modalidades no limitativas de las mismas se discuten a continuación .
En un anticuerpo de longitud completa , cada cadena pesada está constituida por u na región variable de la cadena pesada (abreviado en la presente solicitud como HCVR o VH) y una región constante de la cadena pesada . La región constante de la cadena pesada está constituida por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está constituida por una región variable de la cadena ligera (abreviado en la presente solicitud como LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está constituida por un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de estructura base (FR). Cada VH y VL está constituida por tres CDRs y cuatro FRs, acomodadas desde el extremo amino-terminal hacia el extremo carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2) o subclase.
El término "región Fe" se utiliza para definir la región C-terminal de una cadena pesada de una inmunoglobulina, la cual puede ser generada mediante digestión con papaína de un anticuerpo intacto. La región Fe puede ser una región Fe de la secuencia original o una región Fe variante. La región Fe de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio CH4. Los reemplazos de residuos de aminoácido en la porción Fe para alterar la función efectora del anticuerpo son conocidos en la técnica (Winter, et al. patentes E.U.A. Nos. 5,648,260 y 5,624,821). La porción Fe de un anticuerpo media varias funciones efectoras importantes por ejemplo, inducción de citocina, ADCC, fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC por sus siglas en inglés) y tiempo de vida media/velocidad de depuraciójn del anticuerpo y los complejos antígeno-anticuerpo. En algunos casos, estas funciones efectoras son deseables para el anticuerpo terapéutico pero en otros casos podrían ser innecesarias o incluso perjudiciales, dependiendo de los objetivos terapéuticos. Algunos isotipos de IgG de humanó, en particular lgG1 e lgG3, median ADCC y CDC mediante unión a FcyRs y C1q del complemento, respectivamente. Los receptores de Fe neonatales (FcRn) son los componentes críticos que determinan el tiempo de vida media en circulación de los anticuerpos. Incluso en otra modalidad por lo menos un residuo de aminoácido es remplazado en la región constante del anticuerpo, por ejemplo la región Fe del anticuerpo, de modo tal que se alteran las funciones efectoras del anticuerpo. La dimerización de dos cadenas pesadas idénticas de una inmunoglobulina es mediada por la dimerización de los dominios CH3 y es estabilizada por los puentes de disulfuro dentro la región de gozne (Huber et al. Nature; 264: 415-20; Thies et al 1999 J Mol Biol; 293: 67-79). La mutación de los residuos cisteína dentro de las regiones de gozne para evitar los puentes de disulfuro de de tipo cadena pesada-cadena pesada puede desestabilizar la dimerización de los dominios CH3. Se han identificado los residuos responsables de la dimerización de CH3 (Dall'Acqua 1998 Biochemistry 37: 9266- 73.)· Por lo tanto, es posible generar una semi-lg monovalente. Como un aspecto interesante, estas moléculas de semi-lg monovalente se han encontrado en la Naturaleza tanto para la subclase IgG como para la subclase IgA (Seligman 1978 Ann Immunol 129: 855-70; Biewenga et al 1983 Clin Exp Immunol 51: 395-400). Se ha determinado que la estequiometría de FcRn:región Fe de Ig es de 2:1 (West et al .2000 Biochemistry 39: 9698-708), y la mitad de Fe es suficiente para mediar la unión a FcRn (Kim et al 1994 Eur J Immunol; 24: 542-548). Las mutaciones para perturbar la dimerización del dominio CH3 podrían no tener mayor efecto adverso sobre su unión a FcRn debido a que los residuos importantes para la dimerización de CH3 están localizados en la interfaz interior de la estructura de lámina b de CH3, mientras que la región responsable de la unión a FcRn está localizada en la interfaz exterior de los dominios CH2-CH3. Sin embargo, la molécula de semi-lg puede tener cierta ventaja en la penetración de tejido debido a su tamaño más pequeño que el de un anticuerpo regular. En una modalidad por lo menos un residuo de aminoácido es remplazado en la región constante de la proteína de unión de la invención, por ejemplo la región Fe, de modo tal que la dimerización de las cadenas pesadas se ve perturbada, lo que da como resultado moléculas de semi-DVD Ig. La actividad anti-inflamatoria de IgG es completamente dependiente de la sialilación del glicano N-ligado del fragmento Fe de IgG. Se han determinado los requerimientos precisos del glicano para la actividad anti-inflamatoria, de modo tal que se puede crear un fragmento Fe de lgG1 apropiado, con lo cual se genera un Fe de lgG1 sialilado, completamente recombinante, con potencia incrementada en gran manera (Anthony, R.M., et al. (2008) Science 320:373-376).
El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), tal como se utiliza en la presente solicitud, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Dichas modalidades de anticuerpo también pueden ser formatos biespecíficos, duales específicos, o multiespecíficos; que se unan específicamente a dos o más antígenos diferentes. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios de VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro en la región de gozne; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios de VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341.544-546, Winter et al., publicación WO 90/05144 A1 del PCT) el cual comprende un solo dominio variable; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Asimismo, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, éstos también se pueden ligar, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permita que éstos se puedan preparar como una cadena de proteína individual en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena individual (ScFv); véase, por ejemplo, Bird er a/., (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Se pretende también que dichos anticuerpos de cadena individual queden abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Otras formas de anticuerpos de cadena individual, tales como los diacuerpos también quedan abarcadas. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los cuales los dominios VH y VL están expresados en una cadena polipeptídica individual, pero utilizando un enlazador el cual es, muy corto como para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, con lo cual se obliga a dichos dominios a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., ét al. (1994) Structure 2:1121-1123). Dichas porciones de unión a anticuerpo son conocidas en la técnica (Kontermann y Dubel eds., Antibody Enqineerinq (2001) Springer-Verlag, New York, 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5). Además, los anticuerpos de cadena individual también incluyen "anticuerpos lineales" que comprenden un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) los cuales, junto con los polipéptidos de la cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno (Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); y patente E.U.A. No. 5,641,870).
El término "proteína de unión multivalente" se utiliza a través de toda esta descripción para indicar una proteína de unión que comprende dos o más sitios de unión a antígeno. En una modalidad, la proteína de unión multivalente se diseña para que tenga dichos tres o más sitios de unión a antígeno, y generalmente es un anticuerpo no presente en la Naturaleza. El término "proteína de unión multiespecífica" se refiere a una proteína de unión que se puede unir a dos o más objetivos relacionados o no relacionados. Las proteínas de unión de dominio variable dual (DVD) de la invención comprenden dos o más sitios de unión a antígeno y son proteínas de unión tetravalentes o multivalentes. Los DVDs pueden ser monoespecíficos, es decir, que se pueden unir a un antígeno o multiespecíficos, es decir que se pueden unir a dos o más antígenos. Las proteínas de unión de DVD que comprenden dos polipéptidos de DVD de la cadena pesada y dos polipéptidos de DVD de la cadena ligera son referidas como DVD-lg. Cada mitad de una DVD-lg comprende un polipéptido de DVD de la cadena pesada, y un polipéptido de DVD de la cadena ligera, y dos sitios de unión a antígeno. Cada sitio de unión comprende un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera con un total de 6 CDRs implicadas en la unión a antígeno por cada sitio de unión a antígeno.
El término "anticuerpo biespecífico", tal como se utiliza en la presente solicitud, se refiere a anticuerpos de longitud completa que son generados mediante tecnología de cuadroma (véase Milstein, C. y A.C. Cuello, Nature, 1983. 305(5934): p. 537-40), mediante conjugación química de dos anticuerpos monoclonales diferentes (véase Staerz, U.D., et al, Nature, 1985. 314(6012): p. 628-31), o mediante estrategia de botón en ojal o estrategias similares que introduzcan mutaciones en la región Fe (véase Holliger, P., T. Prospero, y G. Winter, Proc Nati Acad Sci USA, 1993. 90(14): p. 6444-8.18), lo que da como resultado múltiples especies de inmunoglobulinas diferentes de las cuales sólo una es el anticuerpo biespecífico funcional. Mediante función molecular, un anticuerpo biespecífico se une a un antígeno (o epítope) en uno de sus dos brazos de unión (un par de HC/LC), y se une a un antígeno diferente (o epítope) en su segundo brazo (un par de HC/LC diferente). Por esta definición, un anticuerpo biespecífico tiene dos brazos de unión a antígeno distintos (tanto en especificidad como en secuencias de CDR), y es monovalente para cada antígeno al cual éste se une.
El término "anticuerpo dual-específico", tal como se utiliza en la presente solicitud, se refiere a anticuerpos de longitud completa que se pueden unir a dos antígenos diferentes (o epítopes) en cada uno de sus dos brazos de unión (un par de HC/LC) (véase publicación WO 02/02773 del PCT). Por consiguiente una proteína de unión dual-específica tiene dos brazos de unión a antígeno idénticos, con especificidad idéntica y secuencias de CDR idénticas, y es bivalente para cada antígeno al cual ésta se une.
Un "sitio de unión a antígeno funcional" de una proteína de unión es aquel que se puede unir a un antígeno objetivo. La afinidad de unión al antígeno del sitio de unión a antígeno no es necesariamente tan fuerte como la del anticuerpo progenitor a partir del cual se obtiene el sitio de unión a antígeno, pero la capacidad para unirse al antígeno debe ser mensurable utilizando cualquiera de una variedad de métodos conocidos para evaluar la unión del anticuerpo a un antígeno. Asimismo, la afinidad de unión al antígeno de cada uno de los sitios de unión a antígeno de un anticuerpo multivalente en la presente solicitud no necesita ser cuantitativamente la misma.
El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular, las cuales actúan sobre otra población celular como mediadores intercelulares. Los ejemplos de dichas citocinas son linfocinas, monocinas, y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas están incluidas la hormona del crecimiento tal como la hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana modificada con N-metionilo, y la hormona de crecimiento bovina; la hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glucoproteína tales como la hormona estimulante de folículo (FSH), la hormona estimulante de la tiroides (TSH), y la hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblasto; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral alfa y beta; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento de nervio tales como NGF-alfa; factor de crecimiento de plaquetas; factor de crecimiento placentario, factores de crecimiento transformantes (TGFs) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento tipo insulina 1 y 11; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferón alfa, beta y gamma, factores estimulantes de colonia (CSFs) tales como CSF de macrófago (M-CSF); CSF de granuiocito y macrófágo (GM-CSF); y CSF de granuiocito (G-CSF); interleucinas (ILs) tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-33;'un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos incluyendo LIF y el ligando kit (KL). Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término citocina incluye proteínas provenientes de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia original.
El término "enlazador" se utiliza para indicar polipéptidos que comprenden dos o más residuos de aminoácido unidos mediante enlaces peptídicos y se utilizan para ligar una o más porciones de unión a antígeno. Dichos polipéptidos enlazadores son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., eí al. (1994) Structure 2:1121-1123). Los enlazadores de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, AKTTP LEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG(SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO: 9); SA TTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ. ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); y GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26).
Un "dominio constante de inmunoglobulina" se refiere a un dominio constante de la cadena pesada o de la cadena ligera. Las secuencias de aminoácido del dominio constante de la cadena ligera y de la cadena pesada de IgG de humano son conocidas en la técnica.
El término "anticuerpo monoclonal" o "mAb" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a un anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que constituyen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren de manera natural que pudieran estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo antígeno. Asimismo, en contraste a las preparaciones de anticuerpo policlonal que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopes) diferentes, cada mAb está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" no debe ser considerado como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular.
El término "anticuerpo humano", tal como se utiliza en la presente solicitud, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmurioglobulina de línea germinal de humano. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmurioglobulina de línea germinal de humano (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDRs y en particular CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", tal como se utiliza en la presente solicitud, no pretende incluir anticuerpos en los cuales las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie mamífera, tal como un ratón, han sido injertadas en las secuencias de estructura base de humano.
El término "anticuerpo recombinante de humano", tal como se utiliza en la presente solicitud, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan mediante medios recombinantes, tal como los anticuerpos que se expresan utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedera (descrito con mayor detalle en la Sección II C, más adelante), anticuerpos aislados a partir de una genoteca de anticuerpo de humano, combinatoria, recombinante (Hoogenboom H.R. (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., y Highsmith W.E. (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V., y Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., y Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que sea transgénico para los genes de inmunoglobulina de humano (véase, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A. y Green L.L. (2002) Current Opinión in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al. (2000) Immunology Today 21:364-370) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualesquiera otros medios que impliquen empalmar las secuencias de gen de inmunoglobulina de humano con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos recombinantes de humano tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal de humano. Sin embargo, en algunas modalidades, dichos anticuerpos recombinantes de humano se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para la secuencia de Ig de humano, mutagénesis somática in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque obtenidas a partir de y relacionadas con las secuencias de VH y VL de línea germinal de humano, podrían no existir de manera natural dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo de humano in vivo.
Un anticuerpo "madurado por afinidad" es un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más CDRs del mismo lo cual da como resultado una mejoría en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo progenitor que no posee dicha(s) alteración(es). Los anticuerpos madurados por afinidad de ejemplo pueden tener afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al. BidITechnology 10:779-783 (1992) describen la maduración por afinidad mediante reacomodo (shuffling) del dominio de VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de estructura base es descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sc¡, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992) y mutación selectiva en posiciones de mutagénesis selectiva, posiciones de contacto o de hipermutación con un residuo de aminoácido incrementador de actividad como se describe en la patente E.U.A. No. 6914128B1.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de la cadena pesada y cadena ligera provenientes de una especie y secuencias de región constante provenientes de otra especie, tal como los anticuerpos que tienen regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera de múrido ligadas a regiones constantes de humano.
El término "anticuerpo injertado con CDR" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera provenientes de una especie pero en los cuales las secuencias de una o más de las regiones de CDR de VH y/o VL están remplazadas con secuencias de CDR de otra especie, tal como los anticuerpos que tienen regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de múrido en las cuales una o más de las CDRs de múrido (por ejemplo, CDR3) han sido remplazadas con secuencias de CDR de humano.
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de la cadena pesada y cadena ligera provenientes de una especie no humana (por ejemplo, un ratón) pero en las cuales por lo menos una porción de la secuencia de VH y/o VL ha sido alterada para que sea de tipo "más humana", es decir, más similar a las secuencias variables de línea germinal de humano. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado con C DR, en el cual se introducen secuencias de CDR de humano en las secuencias de VH y VL no humanas para reemplazar las secuencias de C DR no h umanas correspondientes. También "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o fragmento del mismo que se une de manera inmuno-específica a un antígeno de interés y el cual comprende una región de estructura base (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácido de un anticuerpo humano y una región determinante de complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácido de un anticuerpo no humano. Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "sustancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácido por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácido de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones de CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donador) y todas o sustancialmente todas las regiones de estructura base son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina de humano. En una modalidad, un anticuerpo humanizado también comprende por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina de humano. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera así como por lo menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, de gozne, CH2, CH3, y CH4 de la cadena pesada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene solamente una cadena ligera humanizada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene solamente una cadena pesada humanizada. En modalidades específicas, un anticuerpo humanizado contiene solamente un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o una cadena pesada humanizada.
Los términos "numeración de Kabat", "definiciones de Kabat" y "marcación de Kabat" se utilizan de manera intercambiable en la presente solicitud. Estos términos, los cuales son reconocidos en la técnica, se refieren a un sistema para numerar residuos de aminoácido los cuales son más variables (es decir hipervariables) que otros residuos de aminoácido en las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno de las mismas (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 y, Kabat, E.A., ef al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Publicación del NIH No. 91-3242). Para la región variable de la cadena pesada, la región hipervariable varía de las posiciones de aminoácido 31 a 35 para CDR1, las posiciones de aminoácido 50 a 65 para CDR2, y las posiciones de aminoácido 95 a 102 para CDR3. Para la región variable de la cadena ligera, la región hipervariable varía de las posiciones de aminoácido 24 a 34 para CDR1, las posiciones de aminoácido 50 a 56 para CDR2, y las posiciones de aminoácido 89 a 97 para CDR3.
Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "CDR" se refiere a la región determinante de complementariedad dentro de las secuencias variables del anticuerpo. Hay tres CDRs en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera, las cuales son designadas como CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. El término "conjunto de CDR" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a un grupo de tres CDRs que se presentan en una región variable individual que se pueden unir al antígeno. Los límites exactos de estas CDRs han sido definidos de distinta manera de conformidad con diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) no solo provee un sistema de numeración de residuo inequívoco que se puede aplicar a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también provee límites de residuo precisos que definen las tres CDRs. Estas CDRs pueden ser referidas como las CDRs de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)) descubrieron que ciertas sub-porciones dentro de las CDRs de Kabat adoptan conformaciones de estructura base peptídica casi idénticas, a pesar de tener gran diversidad a nivel de secuencia de aminoácido. Estas sub-porciones fueron designadas como L1, L2 y L3 o H1, H2 y H3 en las cuales la "L" y la "H" indican las regiones de la cadena ligera y de la cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden ser referidas como las CDRs de Chothia, las cuales tienen límites que se traslapan con las CDRs de Kabat. Otros límites que definen CDRs que se traslapan con las CDRs de Kabat han sido descritos por Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) y MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)). Incluso otras definiciones de límite de CDR podrían no apegarse estrictamente a uno de los sistemas provistos en la presente solicitud, pero no obstante se traslapan con las CDRs de Kabat, aunque éstas se pueden acortar o alargar en vista de la predicción o hallazgos experimentales de que residuos particulares o grupos de residuos o incluso CDRs completas no afectan de manera significativa la unión al antígeno. Los métodos utilizados en la presente solicitud pueden utilizar CDRs definidas de conformidad con cualquiera de estos sistemas, aunque ciertas modalidades utilizan CDRs definidas por Kabat o por Chothia.
Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "estructura base" o "secuencia de estructura base" se refieré a las secuencias remanentes de una región variable menos las CDRs. Debido a que la definición exacta de una secuencia de CDR se puede determinar mediante sistemas diferentes, el significado de una secuencia de soporte está sujeto a interpretaciones correspondientemente diferentes. Las seis CDRs (CDR-L1, CDR-L2, y CDR-L3 de la cadena ligera y CDR-H1, CDR-H2, y CDR-H3 de la cadena pesada) también dividen las regiones de soporte en la cadena ligera y la cadena pesada en cuatro sub-regiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en las cuales CDR1 está posicionada entre FR1 y FR2, CDR2 entre FR2 y FR3, y CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las sub-regiones particulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región de soporte, en la forma referida por otros, representa las FRs combinadas dentro de la región variable de una cadena de inmunoglobulina individual, presente en la Naturaleza. Tal como se utiliza en la presente solicitud, una FR representa una de las cuatro sub-regiones, y FRs representa dos o más de las cuatro sub-regiones que constituyen una región de soporte.
Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "gen de anticuerpo de línea germinal" o "fragmento de gen" se refiere a una secuencia de inmunoglobulina codificada por células no linfoides que no han experimentado el proceso de maduración que conduce al reacomodo y mutación genética para expresión de una inmunoglobulina particular. (Véase, por ejemplo, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)). Una de las ventajas provistas por varias modalidades de la presente invención surge del reconocimiento que es más probable que los genes de anticuerpo de línea germinal conserven las estructuras de secuencia de aminoácidos esenciales características de los individuos en las especies que los genes de anticuerpo maduro, por lo tanto es menos probable que sean reconocidos como provenientes de una fuente exógena cuando se utilizan terapéuticamente en dicha especie.
Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "neutralizar" se refiere a contrarrestar la actividad biológica de un antígeno cuando una proteína de unión se une específicamente al antígeno. En una modalidad, la proteína de unión neutralizante se une a la citocina y reduce su actividad biológica en por lo menos aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80%, 85% o más.
El término "actividad" incluye actividades tales como la especificidad y afinidad de unión de una DVD-lg para dos o más antígenos.
El término "epítope" incluye cualquier determinante polipeptídico con capacidad de unión específica a una inmunoglobulina o receptor de célula T. En algunas modalidades, los determinantes de epítope incluyen agrupamientos de moléculas químicamente activos en superficie tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo, o sulfonilo, y, en algunas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Un epítope es una región de un antígeno que es ligada por un anticuerpo. En algunas modalidades, un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando éste reconoce su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Los anticuerpos "se unen al mismo epítope" si los anticuerpos presentan competencia cruzada (uno evita la unión o efecto modulador del otro). Además, las definiciones estructurales de los epítopes (traslape, similitud, identidad) son informativas, pero las definiciones funcionales con frecuencia son más relevantes debido a que éstas abarcan parámetros estructurales (unión) y funcionales (modulación, competencia).
El término "resonancia de plasmón de superficie", tal como se utiliza en la presente solicitud, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante detección de las alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz bio-detectora, por ejemplo utilizando el sistema BIAcore® (BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ). Para descripciones adicionales, véase Jónsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jónsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; y Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.
El término "Kas0c", tal como se utiliza en la presente solicitud, pretende hacer referencia a la constante de la velocidad de unión para la asociación de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) al antígeno para formar, por ejemplo, el complejo anticuerpo/antígeno como se sabe en la técnica. La "Kasoc" también es conocida por los términos "constante de velocidad de asociación", o "ka", tal cómo se utiliza de manera intercambiable en la presente solicitud. Este valor que indica la velocidad de unión de un anticuerpo a su antígeno objetivo o la velocidad de formación de complejo entre un anticuerpo y el antígeno también se demuestra mediante la siguiente ecuación: Anticuerpo ("Ab") + Antígeno ("Ag")'Ab-Ag.
El término "Kd¡soc", tal como se utiliza en la presente solicitud , pretende hacer referencia a constante de la velocidad de separación para la disociación , o "constante de la velocidad de disociación", de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) de, por ejemplo, el complejo anticuerpo/antígeno como se sabe en la técnica . Este valor indica la velocidad de disociación de u n anticuerpo de su antígeno objetivo o la separación del complejo Ab-Ag con el tiempo en anticuerpo y antígeno libres como se muestra mediante la siguiente ecuación : Ab + Ag? Ab-Ag .
El término "KD" tal como se utiliza en la presente solicitud , pretende hacer referencia a la "constante de disociación en equilibrio", y se refiere al valor obtenido en una medición de titulación en equilibrio, o dividiendo la constante de velocidad de disociación (kd¡SOc) entre la constante de velocidad de asociación (kasoc) . La constante de velocidad de asociación , la constante de velocidad de disociación y la constante de disociación en equilibrio se utilizan para representar la afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno. Los métodos para determinar las constantes de velocidad de asociación y disociación son bien conocidos en la técnica . El uso de técnicas basadas en fluorescencia ofrece alta sensibilidad y la capacidad de examinar muestras en soluciones amortig uadoras fisiológicas en eq uilibrio. Se pueden utilizar otras estrategias experimentales e instrumentos tales como una prueba BIAcore® (análisis de interacción biomolecular) (por ejemplo, instrumento disponible de BIAcore I nternational AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Suecia). De manera adicional , también se puede utilizar una prueba KinExA® (Prueba de Exclusión Cinética), disponible de Sapidyne I nstruments (Boise, Idaho).
"Marca" y "marca detectable" sig nifica una porción unida a un compañero de unión específica, tal como un anticuerpo o un analito, por ejemplo, para hacer que la reacción entre los miembros de un par de unión específica, tal como un anticuerpo y un analito , sea detectable, y el compañero de unión específica , por ejemplo, anticuerpo o analito, marcado de esta manera es referido como "marcado en forma detectable". Por lo tanto, el término "proteína de unión marcada" tal como se utiliza en la presente solicitud , se refiere a una proteína con una marca incorporada que provee la identificación de la proteína de unión . En una modalidad , la marca es un marcador detectable que puede producir una señal que se puede detectar utilizando medios visuales o instrumentales, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a u n polipéptido de porciones de biotinilo que se puedan detectar mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que se pueda detectar utilizando métodos ópticos o colorimétricos). Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen , pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H , 1 C , 35S , 90Y, "Te, 1 1 l n, 125l , 131 l , 177Lu , 166Ho, o 153Sm); cromógenos, marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, luminóforos de lantánido) , marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, luciferasa, fosfatasa alcalina); marcadores quimioluminiscentes; grupos biotinilo; epítopes de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal , marcas de epítope); y agentes magnéticos, tales como q uelatos de gadolinio . Los ejemplos representativos de marcas comú nmente empleadas para inmuno-ensayos incluyen porciones que producen luz, por ejemplo, compuestos de acridinio, y porciones que producen fluorescencia, por ejemplo, fluoresceína. En la presente solicitud se describen otras marcas. En este sentido, la porción por sí misma pod ría no estar marcada en forma detectable pero se pod ría tornar detectable después de reaccionar con incluso otra porción . El uso de "marcado en forma detectable" pretende abarcar a este último tipo de marcación detectable.
El término "conjugado" se refiere a una proteína de u nión , tal como u n anticuerpo, qu ímicamente enlazado a una seg unda porción q u ímica , tal como un agente terapéutico o citotóxico. El término "agente" se utiliza en la presente solicitud para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos. En una modalidad , los agentes terapéuticos o citotóxicos incluyen , pero no se limitan a, toxina de pertussis, taxol , citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi-antracin-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1 -deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Cuando se utiliza en el contexto de un inmuno-ensayo, el anticuerpo conjugado puede ser un anticuerpo marcado en forma detectable utilizado como el anticuerpo de detección.
Los términos "cristal" y "cristalizado" tal como se utilizan en la presente solicitud, se refieren a una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo), o porción de unión a antígeno del mismo, que existe en forma de un cristal. Los cristales son una forma del estado sólido de la materia, la cual es distinta de otras formas tal como el estado sólido amorfo o el estado cristalino líquido. Los cristales están constituidos por arreglos tridimensionales, repetitivos, regulares de átomos, iones, moléculas (por ejemplo, proteínas tales como anticuerpos), o ensambles moleculares (por ejemplo, complejos antígeno/anticuerpo). Estos arreglos tridimensionales están acomodados de conformidad con relaciones matemáticas específicas que son bien entendidas en el campo. La unidad fundamental, o bloque de construcción, que se repite en un cristal se denomina la unidad asimétrica. La repetición de la unidad asimétrica en un ordenamiento que se ajusta a una simetría cristalográfica bien definida, dada, provee la "celda unitaria" del cristal. La repetición de la celda unitaria mediante traslaciones regulares en todas las tres dimensiones provee el cristal. Véase Giege, R. y Ducruix, A. Barrétt, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2a ed., pp. 201-16, Oxford University Press, Nueva York, Nueva York, (1999).
El término "polinucleótido" significa una forma polimérica de dos o más nucleótidos, ya sea ribonucleótidos o desoxinucieótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de cadena sencilla y cadena doble de ADN.
El término "polinucleótido aislado" significa un polinucleótido (por ejemplo, de ADNc, genómico, o de origen sintético, o alguna combinación de los mismos) que, debido a su origen, el "polinucleótido aislado" no está asociado con el total o una porción de un polinucleótido con el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la Naturaleza; está ligado en forma operable a un polinucleótido con el que éste no está ligado en la Naturaleza; o no se presenta en la Naturaleza como parte de una secuencia más grande.
El término "vector", pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al cual éste ha sido enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual se refiere a un asa de ADN de doble cadena circular en la cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN en el genoma viral. Algunos vectores tienen capacidad de replicador) autónoma en una célula hospedera dentro de la cual estos se han introducido (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedera después de introducción dentro de la célula hospedera, y de esta manera se replican junto con el genoma hospedero. Asimismo, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales éstos están ligados en forma operativa. Dichos vectores son referidos en la presente solicitud como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante con frecuencia están en forma de plásmidos. En la presente descripción, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar de manera intercambiable ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, • retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno- asociados), los cuales cumplen funciones equivalentes.
El término "ligado en forma operable" se refiere a una yuxtaposición en la cual los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera pretendida. Una secuencia de control "ligada en forma operable" a una secuencia codificadora está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias "ligadas en forma operable" incluyen tanto secuencias de control de expresión que están contiguas con el gen de interés, como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de expresión" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de las secuencias codificadoras a las cuales éstas están ligadas. Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias apropiadas de inicio de transcripción, de terminación, de promotor e incrementados señales de procesamiento de ARN eficientes tales como las señales de empalmado y poliadenilación; secuencias que estabilizan al ARNm citoplasmático; secuencias que incrementan la eficiencia de traducción (es decir, secuencia de consenso de Kozak); secuencias que incrementan la estabilidad de proteína; y cuando se desee, secuencias que incrementen la secreción de proteína. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere en función del organismo hospedero; en los procariotas, dichas secuencias de control por lo general incluyen secuencias de promotor, de sitio de unión ribosómico, y de terminación de transcripción; en los eucariotas, en general, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es conveniente, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero de fusión.
"Transformación", se refiere a cualquier procedimiento mediante el cual el ADN exógeno entra a una célula hospedera. La transformación puede ocurrir bajo condiciones naturales o artificiales utilizando diversos métodos bien conocidos en la técnica. La transformación se puede basar en cualquier método conocido para la inserción dé secuencias de ácido nucleico exógenas dentro de una célula hospedera procariota o eucariota. El método se selecciona tomando como base la célula hospedera que está siendo transformada y puede incluir, pero no se limita a, infección viral, electroporación, lipofección, y bombardeo de partículas. Dichas células "transformadas" incluyen células transformadas de manera estable en las cuales el ADN insertado es capaz de replicación ya sea como un plásmido que se replica de manerá autónoma o como parte del cromosoma hospedero. Estas también incluyen células que expresan en forma transitoria el ADN o ARN insertado durante períodos limitados de tiempo.
El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera"), pretende hacer referencia a una célula en la cual se ha introducido ADN exógeno. En una modalidad, la célula hospedera comprende dos o más (por ejemplo, múltiples) ácidos nucleicos que codifican para anticuerpos, tales como las células hospederas descritas en la patente E.U.A. No. 7,262,028, por ejemplo. Se debe entender que dichos términos pretenden hacer referencia no solamente a la célula objeto particular, sino también a la progenie de dicha célula. Debido a que pueden presentarse ciertas modificaciones en las generaciones subsiguientes causadas ya sea por mutación o por influencias ambientales, dicha progenie podría, de hecho, no ser idéntica a la célula progenitora, pero aún sigue estando incluida dentro del alcance del término "célula hospedera" tal como se utiliza en la presente solicitud. En una modalidad, las células hospederas incluyen células procariotas y eucariotas que se seleccionan a partir de cualquiera de los Reinos de la vida. En otra modalidad, las células eucariotas incluyen células protistas, fúngicas, vegetales y animales. En otra modalidad, las células hospederas incluyen pero no se limitan a la línea de célula procariota de E. coli; líneas de célula de mamífero CHO, HEK 293, COS, NSO, SP2 y PER.C6; la línea de célula de insecto Sf9; y la célula fúngica Saccharomyces cerevisiae.
Se pueden utilizar técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótido, y cultivo de tejidos y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones y técnicas de purificación enzimáticas se pueden efectuar de conformidad con las especificaciones del fabricante o como normalmente se logra en la técnica o como se describe en la presente solicitud. Las técnicas y procedimientos anteriores se pueden efectuar en forma general de conformidad con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a través de toda la presente descripción. Véase por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).
"Organismo transgénico", como se sabe en la técnica, se refiere a un organismo que tiene células que contienen un transgen, en el cual el transgen introducido en el organismo (o un ancestro del organismo) expresa un polipéptido no expresado de manera natural en el organismo. Un "transgen" es una construcción de ADN, la cual está integrada de manera estable y operable en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un organismo transgénico, dirigiendo la expresión de un producto de gen codificado en uno o más tipos celulares o tejidos del organismo transgénico.
Los términos "regular" y "modular" se utilizan de manera intercambiable, y, tal como se utilizan en la presente solicitud, se refieren a un cambio o una alteración en la actividad de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de una citocina). La modulación puede ser un incremento o un decremento en la magnitud de una cierta actividad o función dé la molécula de interés. Los ejemplos de actividades y funciones de una molécula incluyen, pero no se limitan a, características de unión, actividad enzimática, activación de receptor celular, y transducción de señal.
De manera correspondiente, el término "modulador" es un compuesto capaz de cambiar o alterar una actividad o función de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de una citocina). Por ejemplo, un modulador puede causar un incremento o decremento en la magnitud de una cierta actividad o función de una molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del modulador. En algunas modalidades, un modulador es un inhibidor, el cual disminuye la magnitud de por lo menos una actividad o función de una molécula. Los inhibidores de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos, carbohidratos o moléculas orgánicas pequeñas. Los pepticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento WO 01/83525.
El término "agonista", se refiere a un modulador que, cuando se pone en contacto con una molécula de interés, causa un incremento en la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del agonista. Los agonistas particulares de interés pueden incluir, pero no se limitan a, polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, o cualesquiera otras moléculas que se unan al antígeno.
El término "antagonista" o "inhibidor", se refiere a un modulador que, cuando se pone en contacto con una molécula de interés causa un decremento en la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del antagonista. Los antagonistas particulares de interés incluyen aquellos que bloquean o modulan la actividad biológica o inmunológica del antígeno. Los antagonistas e inhibidores de antígenos pueden incluir, pero no se limitan a , proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos , o cualesquiera otras moléculas , que se unan al antígeno.
Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para reducir o aliviar la gravedad y/o du ración de un trastorno o de uno o más síntomas del mismo, evitar el avance de un trastorno, ocasionar la regresión de un trastorno, evitar la recurrencia, desarrollo, inicio o avance de uno o más síntomas asociados con un trastorno, detectar un trastorno, o incrementar o mejorar el o los efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico) .
"Paciente" e "individuo" se pueden utilizar de manera intercambiable en la presente solicitud para referirse a un animal , tal como un mamífero, incluyendo un primate (por ejemplo, un humano, un mono, y un chimpancé), un no primate (por ejemplo, una vaca , un cerdo, un camello, una llama, un caballo, una cabra , u n conejo, una oveja, un hámster, un cobayo, un gato, un perro, una rata, un ratón , una ballena), un ave (por ejemplo, un pato o un ganso) , y un tiburón . De preferencia, el paciente o individ uo es un humano, tal como un humano que está siendo tratado o evaluado respecto a una enfermedad , trastorno o condición , un humano en riesgo de una enfermedad , trastorno o condición, un humano que tiene una enfermedad , trastorno o condición , y/o un humano que está siendo tratado por una enfermedad, trastorno o condición .
El término "muestra", tal como se utiliza en la presente solicitud , se utiliza en su sentido más amplio. U na "muestra biológica", tal como se utiliza en la presente solicitud , incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de una sustancia proveniente de u n ente vivo o de un ente anteriormente vivo. Dichos entes vivos incluyen , pero no se limitan a, humanos , ratones, ratas, monos, perros, conejos y otros animales. Dichas sustancias incluyen , pero no se limitan a , sangre, (por ejemplo, sangre entera) , plasma, suero, orina , líq uido amniótico, líquido sinovial, células endoteliales, leucocitos, monocitos, otras células, órganos, tejidos, médula ósea , nodos linfáticos y bazo.
"Componente", "componentes", y "por lo ménos un componente" , se refieren en general a un anticuerpo de captura , un anticuerpo para detección o conjugado, un control, un calibrador, una serie de calibradores, un panel de sensibilidad, un contenedor, una solución amortiguadora, un diluyente, una sal, una enzima, un cofactor para una enzima, un reactivo de detección , un reactivo/solución de pretratamiento, u n substrato (por ejemplo, como una solución) , u na solución de terminación , y similares que pueden ser incluidos en un estuche para análisis de u na muestra de prueba, tal como una muestra de orina, suero o plasma de un paciente, de conformidad con los métodos descritos en la presente solicitud y otros métodos conocidos en la técnica. Por lo tanto, en el contexto de la presente descripción , "por lo menos un componente" , "componente", y "componentes" pueden incluir un polipéptido u otro analito como se indicó anteriormente, tal como una composición q ue comprende un anaiito tal como un polipéptido, el cual opcionalmente se inmoviliza sobre un soporte sólido, tal como mediante unión a un anticuerpo anti-analito (por ejemplo, anti-polipéptido). Algunos componentes pueden estar en solución o liofilizados para reconstitución para uso en una prueba.
"Control" se refiere a una composición que se sabe no contiene anaiito ("control negativo") o que contiene anaiito ("control positivo"). Un control positivo puede comprender una concentración conocida de anaiito. "Control" , "control positivo" , y "calibrador" se pueden utilizar de manera intercambiable en la presente solicitud para referirse a una composición que comprende una concentración conocida de anaiito. Se puede utilizar un "control positivo" para establecer las características de desempeño de la prueba y es un indicador útil de la integridad de los reactivos (por ejemplo, analitos) .
"Corte predeterminado" y "nivel predeterminado" se refieren generalmente a u n valor de corte de la prueba que sé utiliza para evaluar los resultados de diagnosis/prognosis/eficacia terapéutica mediante comparación de los resultados de la prueba contra el corte/nivel predeterminado, en donde el corte/nivel predeterminado ya ha sido vinculado o asociado con varios parámetros clínicos (por ejemplo, gravedad de la enfermedad , progreso/no progreso/mejoría, etc.) . Aunque la presente descripción puede proveer niveles predeterminados de ejemplo, es bien sabido que los valores de corte pueden variar en función de la naturaleza del inmuno-ensayo (por ejemplo, anticuerpos utilizados , etc.). También está dentro de la habilidad común del experto en la técnica adaptar la presente descripción para otros inmuno-ensayos para obtener valores de corte específicos de inmuno-ensayo para aquellos otros inmuno-ensayos basados en esta descripción. Mientras que el valor preciso del corte/nivel predeterminado puede variar entre pruebas, las correlaciones como las descritas en la presente solicitud (si las hubiera) deberían ser aplicables en términos generales.
"Reactivo de pretratamiento", por ejemplo, reactivo de lisis, precipitación y/o solubilización, tal como se utiliza en una prueba de diagnóstico como se describe en la presente solicitud es aquel que lisa cualesquiera células y/o solubiliza cualquier analito que esté/estén presente(s) en una muestra de prueba. El pretratamiento no es necesario para todas las muestras, como se describe también en la presente solicitud. Entre otras cosas, solubilizar el analito (por ejemplo, polipéptido de interés) puede implicar la liberación del analito a partir de cualesquiera proteínas de unión endógenas presentes en la muestra. Un reactivo de pretratamiento puede ser homogéneo (no requiere de un paso de separación) o heterogéneo (requiere un paso de separación). Con el uso de un reactivo de pretratamiento heterogéneo existe remoción de cualesquiera proteínas de unión a analito precipitadas a partir de la muestra de prueba antes de proceder con el siguiente paso de la prueba.
"Reactivos de control de calidad" en el contexto de inmuno-ensayos y estuches descritos en la presente solicitud, incluyen, pero no se limitan a, calibradores, controles, y paneles de sensibilidad. Típicamente se utiliza un "calibrador" o "patrón de referencia" (por ejemplo, uno o más, tal como una pluralidad) para establecer curvas de calibración (de referencia) para interpolación de la concentración de un analito, tal como un anticuerpo o un analito. De manera alternativa, se puede utilizar un calibrador individual, el cual está cerca de un valor de corte positivo/negativo predeterminado. Se pueden utilizar calibradores múltiples (es decir, más de un calibrador o una cantidad variable de calibrador(es)) en conjunto de modo tal que constituya un "panel de sensibilidad".
"Riesgo" se refiere a la posibilidad o probabilidad de que ocurra un evento particular ya sea en el presente o en algún punto en el futuro. "Estratificación del Riesgo" se refiere a un arreglo de factores de riesgo clínicos conocidos que permite a los médicos clasificar a los pacientes en riesgo bajo, moderado, alto o el más alto, de desarrollar una enfermedad, trastorno o condición particular.
"Específico" y "especificidad" en el contexto de una interacción entre miembros de un par de unión específica (por ejemplo, un antígeno (o fragmento del mismo) y un anticuerpo (o fragmento antigénicamente reactivo del mismo)) se refieren a la reactividad selectiva de la interacción. La frase "se une específicamente a" y frases análogas se refieren a la capacidad de los anticuerpos (o fragmentos antigénicamente reactivos de los mismos) de unirse específicamente al analito (o un fragmento del mismo) y no unirse específicamente a otras entidades.
"Compañero de unión específica" es un miembro de un par de unión específica. Un par de unión específica comprende dos moléculas diferentes, las cuales se unen específicamente una a la otra a través de medios químicos o físicos. Por lo tanto, además de los pares de unión específica antígeno y anticuerpo de los inmuno-ensayos comunes, otros pares de unión específica pueden incluir biotina y avidina (o estreptavidina), carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótido complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores y enzimas, inhibidores de enzima y enzimas, y similares. Asimismo, los pares de unión específica pueden incluir miembros que son análogos de los miembros de unión específica originales, por ejemplo, un análogo de analito. Los miembros de unión específica inmuno-reactivos incluyen antígenos, fragmentos de antígeno, y anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales así como complejos, fragmentos, y variantes (incluyendo fragmentos de variantes) de los mismos, ya sea aislados o producidos en forma recombinante.
"Variante" tal como se utiliza en la presente solicitud significa un polipéptido que difiere de un polipéptido dado (por ejemplo, polipéptido de IL-18, BNP, NGAL o VIH o anticuerpo anti-polipéptido) en la secuencia de aminoácido por la adición (por ejemplo, inserción), deleción, o sustitución conservadora de aminoácidos, pero que conserva la actividad biológica del polipéptido dado (por ejemplo, una IL-18 variante puede competir con el anticuerpo anti-IL-18 por la unión a IL-18). Se reconoce en la técnica que una sustitución conservadora de un aminoácido, es decir, reemplazar un aminoácido con un aminoácido diferente de propiedades similares (por ejemplo, carácter hidrofílico y grado y distribución de las regiones cargadas) típicamente implica un cambio menor. Estos cambios menores de pueden identificar, en parte, considerando el índice hidropático de los aminoácidos, como se entiende en la técnica (véase, por ejemplo, Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su carácter hidrofóbico y carga. Se sabe en la técnica que se pueden sustituir los aminoácidos de índices hidropáticos similares y aún conservar la función de proteína. En un aspecto, se sustituyen los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ± 2. También se puede utilizar el carácter hidrofílico de los aminoácidos para revelar sustituciones que podrían dar como resultado proteínas que retienen la función biológica. Una consideración del carácter hidrofílico de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo del carácter hidrofílico promedio local más grande de dicho péptido, una medida útil que se ha reportado se correlaciona bien con la antigenicidad y carácter inmunogénico (véase, por ejemplo, patente E.U.A. No. 4,554,101, la cual se incorpora en la presente solicitud para referencia). La sustitución de aminoácidos que tienen valores de carácter hidrofílico similares puede dar como resultado péptidos que retienen la actividad biológica, por ejemplo carácter inmunogénico, como se entiende en la técnica. En un aspecto, se efectúan sustituciones con aminoácidos que tienen valores de carácter hidrofílico dentro de ± 2 de uno con respecto al otro. Tanto el índice de carácter hidrofóbico como el valor de carácter hidrofílico de los aminoácidos son influenciados por la cadena lateral particular de dicho aminoácido. Consistente con dicha observación, se entiende que las sustituciones de aminoácido que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos, y particularmente de las cadenas laterales de dichos aminoácidos, como se revela mediante el carácter hidrofóbico, carácter hidrofílico, carga, tamaño, y otras propiedades. También se puede utilizar "variante" para describir un polipéptido o fragmento del mismo que ha sido procesado diferencialmente, tal como mediante proteólisis, fosforilación, u otra modificación posterior a la traducción, y que aún conserva su actividad biológica o reactividad al antígeno, por ejemplo, la capacidad de unirse a IL-18. El uso de "variante" en la presente solicitud tiene la intención de abarcar fragmentos de una variante a menos que el contexto contradiga de otra manera.
I. Generación de proteína de unión de DVD La invención pertenece a proteínas de unión de Dominio Variable Dual (DVD) que se pueden unir a uno o más objetivos y a métodos para elaboración de las mismas. En una modalidad, la proteína de unión comprende una cadena de polipéptido, en la cual la cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, C es un dominio constante, X1 representa un aminoácido o polipéptido, X2 representa una región Fe y n es 0 o 1. La proteína de unión de la invención se puede generar utilizando varias técnicas. La invención provee vectores de expresión, célula hospedera y métodos para generar la proteína de unión. 1.A: Generación de anticuerpos monoclonales progenitores Los dominios variables de la proteína de unión de DVD se pueden obtener a partir de anticuerpos progenitores, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales que se pueden unir a antígenos de interés. Estos anticuerpos pueden estar presentes en la Naturaleza o se pueden generar utilizando tecnología recombinante.
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se pueden preparar utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en el campo, incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinante, y despliegue en fago, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los mAbs se pueden producir utilizando técnicas de hibridoma incluyendo aquellas conocidas en el campo y que se enseñan, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling, et al., en. Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente solicitud no está limitado a anticuerpos que se producen a través de tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se obtiene a partir de un clon individual, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota, o de fago, y no al método mediante el cual éste se produce. Los hibridomas se seleccionan, clonan y se someten a tamizaje adicional respecto a las características deseables, incluyendo crecimiento robusto del hibridoma, alta producción de anticuerpo y características deseables del anticuerpo, como se discute en el Ejemplo 1 más adelante. Los hibridomas se pueden cultivar y expandir in vivo en animales singenéicos, en animales que carecen de un sistema inmune, por ejemplo, ratones desnudos, o en cultivo celular in vitro. Los métodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas son bien conocidos por los expertos en la técnica. En una modalidad particular, los hibridomas son hibridomas de ratón. En otra modalidad, los hibridomas se producen en una especie no humana, no de ratón tal como ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. En otra modalidad, los hibridomas son hibridomas de humano, en los cuales un mieloma no secretor de humano se fusiona con una célula de humano que expresa un anticuerpo que se puede unir a un antígeno específico.
Los mAbs recombinantes también se generan a partir de linfocitos aislados, individuales, utilizando un procedimiento conocido en la técnica como el método de anticuerpo de linfocitos seleccionado (SLAM por sus siglas en inglés), como se describe en la patente E.U.A. No. 5,627,052, Publicación WO 92/02551 del PCT y Babcock, J. S. et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. En este método, se identifican células individuales que secretan anticuerpos de interés, por ejemplo, linfocitos obtenidos a partir de un animal inmunizado, y se rescatan de las células, las moléculas de ADNc de la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera mediante PCR de transcriptasa inversa y estas regiones variables después se pueden expresar, en el contexto de regiones constantes de inmunoglobulina apropiadas (por ejemplo, regiones constantes de humano), en células hospederas de mamífero, tales como las células COS o CHO. Las células hospederas transfectadas con las secuencias de inmunoglobulina amplificadas, obtenidas a partir de linfocitos seleccionados in vivo, después pueden someterse a análisis y selección adicional in vitro, por ejemplo mediante visualización (panning) de las células transfectadas para aislar las células que expresan anticuerpos para el antígeno de interés. Además, las secuencias de inmunoglobulina amplificadas se pueden manipular in vitro, tal como mediante métodos de maduración por afinidad in vitro tal como los descritos en la publicación WO 97/29131 del PCT y en la publicación WO 00/56772 del PCT.
Los anticuerpos monoclonales también se producen inmunizando un animal no humano que comprende algunos, o todos, los locus de inmunoglobulina de humano con un antígeno de interés. En una modalidad, el animal no humano es un ratón transgénico XENO OUSE, una cepa de ratón diseñado que comprende fragmentos grandes de los loci de inmunoglobulina de humano y es deficiente en la producción de anticuerpo de ratón. Véase, por ejemplo, Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994) y las patentes E.U.A. Nos. 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 y 6,130,364. Véase también los documentos WO 91/10741, publicado el 25 de julio de 1991, WO 94/02602, publicado el 3 de febrero de 1994, WO 96/34096 y WO 96/33735, ambos publicados el 31 de octubre de 1996, WO 98/16654, publicado el 23 de abril de 1998, WO 98/24893, publicado el 11 de junio de 1998, WO 98/50433, publicado el 12 de noviembre de 1998, WO 99/45031, publicado el 10 de septiembre de 1999, WO 99/53049, publicado el 21 de octubre de 1999, WO 0009560, publicado el 24 de febrero de 2000 y WO 00/037504, publicado el 29 de junio de 2000. El ratón transgénico XENOMOUSE produce un repertorio de humano tipo adulto de anticuerpos completamente humanos, y genera anticuerpos monoclonales humanos específicos de antígeno. El ratón transgénico XENOMOUSE contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpo de humano a través de la introducción de fragmentos YAC de configuración de línea germinal, de tamaño megabase de los loci de la cadena pesada de humano y "x" loci de la cadena ligera. Véase Méndez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998).
También se pueden utilizar métodos in vitro para elaborar los anticuerpos progenitores, en los cuales se somete a tamizaje una genoteca de anticuerpo para identificar un anticuerpo que tenga la especificidad de unión deseada. Los métodos para dicho tamizaje de genotecas de anticuerpo recombinante son bien conocidos en la ? técnica e incluyen los métodos descritos en, por ejemplo, Ladner et al. patente E.U.A. No. 5,223,409; Kang ef al. Publicación No. WO 92/18619 del PCT; Dower et al. Publicación No. WO 91/17271 del PCT; Winter et al. Publicación No. WO 92/20791 del PCT; Markland et al. Publicación No. WO 92/15679 del PCT; Breitling et al. Publicación No. WO 93/01288 del PCT; McCafferty et al. Publicación No. WO 92/01047 del PCT; Garrard ef al. Publicación No. WO 92/09690 del PCT; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse ef al. (1989) Science 246: 275- 281: McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths ef al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins ef al. (1992) J Mol Biol 226:889-896: Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628: Gram ef al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad ef al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982, publicación de solicitud de patente US 20030186374, y Publicación No. WO 97/29131 del PCT.
Los anticuerpos progenitores de la presente invención también se pueden generar utilizando varios métodos de despliegue de fago conocidos en la técnica. En los métodos de despliegue de fago, los dominios de anticuerpo funcionales se despliegan sobre la superficie de partículas de fago que portan las secuencias de polinucleótido que los codifican. En particular, dicho fago se puede utilizar para desplegar dominios de unión a antígeno expresados a partir de un repertorio o genoteca de anticuerpo combinatoria (por ejemplo, de humano o múrido). El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une al antígeno de interés se puede seleccionar o identificar con antígeno, por ejemplo, utilizando antígeno marcado o antígeno unido o capturado en una superficie sólida o glóbulo. Los fagos utilizados en estos métodos típicamente son fagos filamentosos que incluyen los dominios de unión fd y M13 expresados a partir del fago con Fab, Fv o dominios de anticuerpo Fv estabilizados con disulfuro fusionados de manera recombinante ya sea al gen III o a la proteína del gen VIII del fago. Los ejemplos de métodos de despliegue de fago que se pueden utilizar para elaborar los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos descritos en Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); Solicitud del PCT No. PCT/GB91/01134; Publicaciones del PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y patentes E.U.A. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108.
Después de seleccionar el fago, las regiones codificadoras de anticuerpo provenientes del fago se pueden aislar y utilizar para generar anticuerpos completos incluyendo anticuerpos de humano o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresar en cualquier hospedero deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, como se describe con mayor detalle más adelante. Por ejemplo, también se pueden utilizar técnicas para producir en forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 empleando métodos conocidos en la técnica tales como aquellos descritos en la publicación WO 92/22324 del PCT; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); y Sawai et al, AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240:1041-1043 (1988). Los ejemplos de técnicas que se pueden utilizar para producir Fvs de cadena individual y anticuerpos incluyen aquellas descritas en las patentes E.U.A. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240: 1038-1040 (1988).
De manera alternativa al tamizaje de genotecas de anticuerpo recombinante mediante despliegue de fago, se pueden aplicar otras metodologías conocidas en la técnica para el tamizaje de genotecas combinatorias grandes para la identificación de anticuerpos progenitores. Un tipo de sistema de expresión alternativo es uno en el cual la genoteca de anticuerpo recombinante se expresa como fusiones de ARN-proteína, como se describe en la Publicación del PCT No. WO 98/31700 de Szostak y Roberts, y en Roberts, R. W. y Szostak, J. W. (1997) Proc. Nati Acad. Sci. USA 94:12297-12302. En este sistema, se crea una fusión covalente entre un ARNm y el péptido o proteína que éste codifica mediante traducción in vitro de moléculas de ARNm sintético que portan puromicina, un antibiótico aceptor de peptidilo, en sus extremos 3'. Por lo tanto, se puede enriquecer un ARNm específico a partir de una mezcla compleja de moléculas de ARNm (por ejemplo, una genoteca combinatoria) tomando como base las propiedades del péptido o proteína codificada, por ejemplo, anticuerpo, o porción del mismo, tal como unión del anticuerpo, o porción del mismo, al antígeno de especificidad dual. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para los anticuerpos, o porciones de los mismos, recuperadas a partir del tamizaje de dichas genotecas se pueden expresar utilizando medios recombinantes como se describe en la presente solicitud (por ejemplo, en células hospederas de mamífero) y, además, se pueden someter a maduración por afinidad adicional ya sea mediante rondas adicionales de tamizaje de las fusiones de ARNm-péptido en las cuales se han introducido mutaciones en la secuencia o secuencias originalmente seleccionadas, o mediante otros métodos para maduración por afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes, como se describe en la presente solicitud.
En otra estrategia los anticuerpos progenitores también se pueden generar utilizando métodos de despliegue de levadura conocidos en la técnica. En los métodos de despliegue de levadura, se utilizan métodos genéticos para fijar los dominios del anticuerpo a la pared celular de la levadura y los despliega sobre la superficie de la levadura. En particular, dicha levadura se puede utilizar para desplegar dominios de unión a antígeno expresados a partir de un repertorio o genoteca de anticuerpo combinatoria (por ejemplo, de humano o múrido). Los ejemplos de métodos de despliegue de levadura que se pueden utilizar para elaborar los anticuerpos progenitores incluyen aquellos descritos en Wittrup, et al., patente E.U.A. No. 6,699,658.
Los anticuerpos descritos en la presente solicitud también se pueden modificar para generar anticuerpos progenitores injertados con CDR y humanizados. Los anticuerpos progenitores injertados con CDR comprenden secuencias de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera provenientes de un anticuerpo de humano en las cuales una o más de las regiones CDR de VH y/o VL están remplazadas con secuencias de CDR de anticuerpos de múrido que se pueden al antígeno de interés. Una secuencia de estructura base proveniente de cualquier anticuerpo de humano puede servir como la plantilla para el injerto de CDR. Sin embargo, el reemplazo directamente en la cadena en dicha estructura base con frecuencia conduce a cierta pérdida de afinidad de unión al antígeno. Mientras más homólogo sea un anticuerpo de humano al anticuerpo de múrido original, menos probable será la posibilidad de que la combinación de las CDRs de múrido con la estructura base de humano introduzca distorsiones en las CDRs que pudieran reducir la afinidad. Por lo tanto, en una modalidad, la estructura base de humano que se elige para remplazar la estructura base variable de múrido excepto las CDRs tiene por lo menos un 65% de identidad de secuencia con la estructura base de la región variable de anticuerpo de múrido. En una modalidad, las regiones variables de humano y de múrido excepto las CDRs tienen por lo menos 70% de identidad de secuencia. En una modalidad particular, que las regiones variables de humano y de múrido excepto las CDRs tienen por lo menos 75% de identidad de secuencia. En otra modalidad, las regiones variables de humano y de múrido excepto las CDRs tienen por lo menos 80% de identidad de secuencia. Los métodos para producir dichos anticuerpos son conocidos en la técnica (véase el documento EP 239,400; publicación del PCT WO 91/09967; patentes E.U.A. Nos. 5,225,539; 5,530,101; y 5,585,089), revestimiento o restauración (resurfacing) (EP 592, 106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)), y reacomodo de la cadena (patente E.U.A. No. 5,565,352); y anticuerpos anti-idiotípicos.
Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de anticuerpo de especie o humana que se unen al antígeno deseado que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la especie no humana y regiones de estructura base de una molécula de inmunoglobulina de humano. Las secuencias de Ig de humano conocidas se describen, por ejemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www. public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools. html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/lmmune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www. path.cam.ac.uk/.about.mrcV/m ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/lmmunology.html.www.immunologylink.com /; path box. wustl.edu/.about.hcenter/index. html; www. biotech.ufl.edu/. a bout.h el/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www. m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa. html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www. biotech.ufl.edu/.about.fccl/p rotocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; axi mtl. imt. u ni-m a rb urg.de/. a bout.rek/AEP-Start. html; base rv. u ci. ku n. n I/. a bout.jraats/l i nksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www . i b t . u n a m . m x/v i r/V_m i ce . htm I ; imgt.cn usc.fr: 8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/SlideOI .html; www.cryst.bbk.ac.Uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www. path.cam.ac.uk/.about.mrcV/h urna nisation/TAHHP. html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www. cryst.bioc. cam.ac.uk/. a bou t.f molí n a/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). Dichas secuencias importadas se pueden utilizar para reducir el carácter inmunogénico o reducir, incrementar o modificar la unión, afinidad, velocidad de asociación, velocidad de disociación, avidez, especificidad, tiempo de vida media, o cualquier otra característica apropiada, como se sabe en la técnica.
Los residuos de estructura base en las regiones de estructura base de humano se pueden sustituir con el residuo correspondiente del anticuerpo donador de CDR para alterar, por ejemplo, mejorar, la unión a antígeno. Estas sustituciones en estructura base se identifican utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante modelado de las interacciones de la CDR y los residuos de estructura base para identificar los residuos de estructura base importantes para la unión a antígeno y comparación de secuencia para identificar residuos de estructura base inusuales en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, Queen et al, U.S. Pat. No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988). Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se pueden conseguir fácilmente y son conocidos por los expertos en la técnica. Están disponibles programas de computadora que ilustran y muestran las estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencia de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estos despliegues permite el análisis del posible papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata de inmunoglobulina, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata a unirse a su antígeno. De esta manera, se pueden seleccionar y combinar residuos de FR de las secuencias de consenso e importada de modo que se puedan lograr las características de anticuerpo deseadas, tales como afinidad incrementada hacia el antígeno o antígenos objetivo. En general, los residuos de CDR están directamente y de manera muy sustancial implicados en influir la unión a antígeno. Los anticuerpos se pueden humanizar utilizando una variedad de técnicas conocidas en el campo, tales como pero sin limitarse a las descritas en Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994); publicación del PCT WO 91/09967, PCT/:US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/Ó1755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, patentes E.U.A. Nos. 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567.
En otra estrategia los anticuerpos progenitores también se pueden generar utilizando técnicas de biología molecular estándar basadas en la secuencia de proteína resuelta para cualesquiera anticuerpos. La secuencia de proteína de cualesquiera anticuerpos se puede resolver mediante una combinación de degradación de Edman, espectro de masas y análisis BLAST descrito eh Edman, P. Acta Chem. Scand. 4:283 (1950), Niall HD Methods Enzymol. 27:942-1010 (1973), Vicki H. W. et al. Methods 35:211-222 (2005) y el programa Blast de NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/about/. 1.B: Criterios para la selección de anticuerpos monoclonales progenitores Una modalidad de la invención pertenece a la selección de anticuerpos progenitores con por lo menos una o más propiedades deseadas en la molécula de DVD-lg. En una modalidad, la propiedad deseada se selecciona a partir de uno o más parámetros del anticuerpo. En otra modalidad, los parámetros del anticuerpo se seleccionan a partir del grupo que consiste de especificidad de antígeno, afinidad hacia el antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epítope, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada tisular, y unión a antígeno ortólogo. 1.B.1 : Afinidad hacia el antígeno La afinidad deseada de un mAb terapéutico puede depender de la naturaleza del antígeno, y del punto final terapéutico deseado. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales tienen afinidades más altas (Kd = 0.01 - 0.50 p ) cuando se bloquea una interacción de citocina-receptor de citocina ya que dicha interacción por lo general son interacciones de alta afinidad (por ejemplo, intervalos de < pM - <nM). En tales casos, la afinidad del mAb hacia su objetivo debe ser igual o mejor que la afinidad de la citocina (ligando) por su receptor. Por otro lado, él mAb con afinidad menor (intervalo > nM) podría ser terapéuticamente efectivo por ejemplo, en la depuración de proteínas potencialmente patógenas en circulación por ejemplo, anticuerpos monoclonales que se unen a, secuestran, y eliminan especies en circulación de amiloide ?-ß. En otros casos, se puede utilizar reducir la afinidad de un mAb de alta afinidad existente mediante mutagénesis dirigida a sitio o utilizando mAb con afinidad menor hacia su objetivo para evitar efectos secundarios potenciales por ejemplo, un mAb de alta afinidad puede secuestrar/neutralizar el total de su objetivo pretendido, con lo cual agota/elimina completamente la función o funciones de la proteína elegida como objetivo. En este escenario, un mAb de baja afinidad puede secuestrar/neutralizar una fracción del objetivo que pudiera ser la responsable de los síntomas de la enfermedad (los niveles patológicos o sobre-producidos), permitiendo de esta manera que una fracción del objetivo continúe ejecutando su función o funciones fisiológicas normales. Por lo tanto, podría ser posible reducir la Kd para ajusfar la dosis y/o reducir los efectos secundarios. La afinidad del mAb progenitor podría desempeñar un papel en elegir apropiadamente como objetivo las moléculas de la superficie celular para lograr el resultado terapéutico deseado. Por ejemplo, si un objetivo se expresa en células de cáncer con alta densidad y en células normales con baja densidad, un mAb con afinidad más baja podría unirse a un número más grande de objetivos en las células tumorales que en las células normales, lo que da como resultado la eliminación de célula tumoral a través de ADCC o CDC, y por lo tanto podría tener efectos terapéuticamente deseables. Por lo tanto, seleccionar un mAb con afinidad deseada podría ser relevante tanto para objetivos como para objetivos de superficie.
La señalización a través de un receptor después que interactúa con su ligando puede depender de la afinidad de la interacción receptor-ligando. De manera similar, es concebible que la afinidad de un mAb hacia un receptor de superficie pueda determinar la naturaleza de la señalización intracelular y si el mAb puede o no suministrar una señal agonista o una señal antagonista. La natu raleza basada en afinidad de la señalización mediada por mAb puede tener un impacto de su perfil de efecto secundario. Por lo tanto, la afinidad deseada y funciones deseadas de los anticuerpos monoclonales terapéuticos necesitan ser determinadas cuidadosamente mediante experimentación in vitro e in vivo.
La Kd deseada de una proteína de unión (por ejemplo, u n anticuerpo) se puede determinar experimentalmente en función del resultado terapéutico deseado. En una modalidad se seleccionan anticuerpos progenitores con afinidad (Kd) hacia un antígeno particular igual a, o mejor que, la afinidad deseada de la DVD-lg hacia el mismo antígeno. La afinidad y cinética de unión al antígeno se evalúan mediante B IAcore u otra técnica similar. En una modalidad , cada anticuerpo progenitor tiene una constante de disociación (Kd) hacia su antígeno que se selecciona a partir del grupo que consiste de: cuando mucho aproximadamente 1 0"7 M ; cuando mucho aproximadamente 10"8 M; cuando mucho aproximadamente 1 0'9 M ; cuando mucho aproximadamente 1 0 1 0 M ; cuando mucho aproximadamente 10~ 1 1 M ; cuando mucho aproximadamente 1 0' 12 M ; y cuando mucho 1 0" 13 M . El primer anticuerpo progenitor a partir del cual se obtiene VD1 y el seg u ndo anticuerpo progenitor a partir del cual se obtiene VD2 pueden tener afinidad (KD) similar o diferente para el antígeno respectivo. Cada anticuerpo progenitor tiene una constante de velocidad de asociación ( gsoc) al antígeno que se selecciona a partir del grupo q ue consiste de: por lo menos aproximadamente 102 M' 1 s" 1 ; por lo menos aproximadamente 1 03 M"V ; por lo menos aproximadamente 104 M" 1s" 1 ; por lo menos aproximadamente 1 05 M" 1s' 1 ; y por lo menos aproximadamente 1 06 M" 1 s"1 , según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie. El primer anticuerpo progenitor a partir del cual se obtiene VD 1 y el segundo anticuerpo progenitor a partir del cual se obtiene VD2 pueden tener una constante de velocidad de asociación (Kas0c) similar o diferente para el antígeno respectivo. En una modalidad , cada anticuerpo progenitor tiene una constante de velocidad de disociación (Kdisoc) al antígeno que se selecciona a partir del grupo que consiste de: cuando mucho aproximadamente 1 0' 3 s" 1 ; cuando mucho aproximadamente 10~4 s" 1 ; cuando mucho aproximadamente 1 0"5 s" 1 ; y cuando mucho aproximadamente 1 0"6 s"1 , según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie. El primer anticuerpo progenitor a partir del cual se obtiene VD1 y el segundo anticuerpo progenitor a partir del cual se obtiene VD2 pueden tener constantes de velocidad de disociación (Kd¡Soc) similares o diferentes para el antígeno respectivo. 1 ,B.2: Potencia La afinidad/potencia deseada de los anticuerpos monoclonales progenitores puede depender del resultado terapéutico deseado. Por ejemplo, para interacciones receptor-ligando (R-L) la afinidad (kd) es igual o mejor que la kd de R-L (intervalo pM) . Para la depuración simple de una proteína patológica en circulación , la kd podría estar en el intervalo n M bajo por ejemplo, la depuración de varias especies de péptido ?-ß en circulación. Además, la kd también puede depender de si el objetivo expresa o no copias múltiples del mismo epítope por ejemplo un mAb que elija como objetivo el epítope conformacional en los oligómeros ?ß.
En casos en los que VD1 y VD2 se unen al mismo antígeno, pero a epítopes distintos, la DVD-lg puede contener 4 sitios de unión para el mismo antígeno, incrementando de esta manera la avidez y por lo tanto la kd aparente de la DVD-lg. En una modalidad, se eligen anticuerpos progenitores con kd igual o menor que la deseada en la DVD-lg. Las consideraciones de afinidad de un mAb progenitor también pueden depender de si la DVD-lg contiene o no cuatro o más sitios de unión a antígeno idénticos (es decir; una DVD-lg proveniente de un mAb individual). En este caso, la kd aparente sería mayor que la del mAb debido a la avidez. Dichas moléculas de DVD-lg se pueden utilizar para entrelazar el receptor de superficie, incrementar la potencia de neutralización, incrementar la depuración de proteínas patológicas, etc.
En una modalidad se seleccionan anticuerpos progenitores con potencia de neutralización para antígeno específico igual a o mejor que el potencial de neutralización deseado de la DVD-lg para el mismo antígeno. La potencia de neutralización se puede evaluar mediante un bio-ensayo dependiente de objetivo en el cual las células del tipo apropiado producen una señal mensurable (es decir proliferación o producción de citocina) en respuesta a la estimulación del objetivo, y la neutralización del objetivo por parte del mAb puede reducir la señal en una manera dependiente de la dosis. 1.B.: Funciones biológicas Los anticuerpos monoclonales pueden efectuar pote cialmente varias funciones. Algunas de esas funciones se listan en la Tabla 1. Estas funciones se pueden evaluar mediante pruebas tanto in vitro (por ejemplo, pruebas basadas en células y bioquímicas) como con modelos animales in vivo.
TABLA 1 Algunas aplicaciones potenciales para anticuerpos terapéuticos Se pueden seleccionar mAbs con funciones distintas descritos en los ejemplos en la presente solicitud en la Tabla 1 para lograr los resultados terapéuticos deseados. Después se pueden utilizar dos o más anticuerpos monoclonales progenitores seleccionados en formato de DVD-lg para obtener dos funciones distintas en una sola molécula de DVD-lg. Por ejemplo, se puede generar una DVD-lg seleccionando un mAb progenitor que neutralice la función de una citocina específica, y seleccionando un mAb progenitor que incremente la depuración de una proteína patológica. De manera similar, se pueden seleccionar dos anticuerpos monoclonales progenitores que reconozcan dos receptores de superficie celular diferentes, un mAb con una función agonista sobre un receptor y el otro mAb con una función antagonista sobre un receptor diferente. Estos dos anticuerpos monoclonales seleccionados, cada uno con una función distinta, se pueden utilizar para construir una molécula de DVD-lg individual que tendrá las dos funciones distintas (agonista y antagonista) de los anticuerpos monoclonales seleccionados en una sola molécula. De manera similar, se pueden utilizar dos anticuerpos monoclonales antagonistas hacia los receptores de superficie celular cada uno bloqueando la unión de los ligandos de receptor respectivos (por ejemplo, EGF y IGF), en un formato de DVD-lg. Por el contrario, se pueden seleccionar un mAb anti-receptor antagonista (por ejemplo, anti-EGFR) y un mAb anti-mediador soluble neutralizante (por ejemplo, anti-IGF1/2) para elaborar una DVD-lg. 1.B.4: Reconocimiento de epítope Regiones diferentes de las proteínas pueden efectuar funciones diferentes. Por ejemplo, regiones específicas de una citocina interactúan con el receptor de citocina para lograr la activación del receptor mientras que otras regiones de la proteína podrían ser necesarias para estabilizar a la citocina. En este caso, se puede seleccionar un mAb que se una específicamente a la región o regiones que interactúan con el receptor en la citocina y de esta manera bloquear la interacción citocina-receptor. En algunos casos, por ejemplo, se pueden seleccionar ciertos receptores de quimiocina que se unen a ligandos múltiples, un mAb que se une al epítope (región en el receptor de quimiocina) que interactúe solamente con un ligando. En otros casos, los anticuerpos monoclonales se pueden unir a epítopes en un objetivo que no son los directamente responsables de las funciones fisiológicas de la proteína, pero la unión de un mAb a estas regiones podría ya sea interferir con las funciones fisiológicas (impedimento estérico) o alterar la conformación de la proteína de modo tal que la proteína no pueda funcionar (mAb para receptores con ligando múltiple el cual altera la conformación del receptor de tal manera que ninguno de los ligandos se puede unir). También se han identificado anticuerpos monoclonales anti-citocina que no bloquean la unión de la citocina a su receptor, pero que bloquean la transducción de señal (por ejemplo, 125-2H, un mAb anti-IL-18).
Los ejemplos de epítopes y funciones de mAb incluyen, pero no se limitan a, bloqueo de la interacción receptor-ligando (R-L) (mAb neutralizante que se une al sitio de interacción con el receptor) ; impedimento estérico que da como resultado la unión disminuida o la no unión al receptor. Un anticuerpo se puede unir al objetivo en un sitio diferente al sitio de u nión al receptor, pero sigue interfiriendo con la unión a receptor y funciones del objetivo mediante inducción de un cambio conformacional y elimina la función (por ejemplo, Xolair), unión al receptor pero con bloqueo de la señal ( 1 25-2 H).
En una modalidad , el mAb progenitor necesita elegir como blanco al epítope apropiado para eficacia máxima . Dicho epítope se debe conservar en la DVD-lg. El epítope de unión de un mAb se puede determinar mediante varias estrategias , incluyendo co-cristalografía, proteólisis limitada del complejo mAb-antígeno más mapeo del péptido mediante espectrometría de masas (Legros V. et al 2000 Protein Sci. 9: 1 002-10) , genotecas de péptido desplegadas en fago (O'Connor KH et al 2005 J Immunol Methods. 299:21 -35) , así como mutagénesis (Wu C. et al . 2003 J Immu nol 1 70:5571 -7). 1 . B.5: Propiedades fisicoquímicas y farmacéuticas El tratamiento terapéutico con anticuerpos frecuentemente requiere la administración de dosis altas, con frecuencia varios mg/kg (debido a una potencia baja en una base en masa como consecuencia de un peso molecular típicamente g rande). Con el fin de adaptar el cumplimiento del paciente y para tratar adecuadamente las terapias para enfermedad crónica y el tratamiento de paciente externo, es deseable la administración por vía subcutánea (s.c.) o intramuscular (i.m.) de mAbs terapéuticos. Por ejemplo, el volumen máximo deseable para administración por vía s.c. es de -1.0 ml_, y por lo tanto, son deseables concentraciones de >100 mg/mL para limitar el número de inyecciones por dosis. En una modalidad, el anticuerpo terapéutico se administra en una dosis. Sin embargo, el desarrollo de dichas formulaciones está restringido por las interacciones proteína-proteína (por ejemplo, agregación, lo cual incrementa potencialmente los riesgos de inmunogenicidad) y por limitaciones durante el procesamiento y suministro (por ejemplo, viscosidad). Por consiguiente, las cantidades grandes requeridas para eficacia clínica y las restricciones de desarrollo asociadas limitan la explotación completa del potencial de la formulación de anticuerpo y de la administración por vía s.c. en regímenes de dosis altas. Es evidente que las propiedades fisicoquímicas y farmacéuticas de una molécula de proteína y la solución de proteína son de primordial importancia, por ejemplo, características de estabilidad, solubilidad y viscosidad. 1.?.5.?: Estabilidad Una formulación de anticuerpo "estable" es aquella en la cual el anticuerpo en la misma conserva esencialmente su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica después del almacenamiento. La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un periodo de tiempo seleccionado. En una modalidad, el anticuerpo en la formulación es estable a temperatura ambiente (aproximadamente 30°C) o a 40°C durante por lo menos 1 mes y/o estable aproximadamente a 2-8°C durante por lo menos 1 año, durante por lo menos 2 años. Asimismo, en una modalidad, la formulación es estable después de congelamiento (a, por ejemplo, -70°C) y descongelación de la formulación, referido de aquí en adelante como un "ciclo de congelación/descongelación". En otro ejemplo,, una formulación "estable" puede ser aquella en la cual menos de aproximadamente 10% y menos de aproximadamente 5% de la proteína está presente como un agregado en la formulación.
Se desea una DVD-lg estable in vitro a diversas temperaturas durante un periodo de tiempo prolongado. Esto se puede lograr mediante tamizaje rápido de mAbs progenitores estables in vitro a temperatura elevada, por ejemplo, a 40°C durante 2-4 semanas, y después se evalúa la estabilidad. Durante el almacenamiento a 2-8°C, la proteína revela estabilidad durante por lo menos 12 meses, por ejemplo, por lo menos 24 meses. La estabilidad (% de molécula intacta, monomérica) se puede evaluar utilizando varias técnicas tales como cromatografía por intercambio catiónico, cromatografía por exclusión de tamaño, SDS-PAGE, así como análisis de bioactividad. Para una lista más comprensiva de técnicas analíticas que se pueden utilizar para analizar las modificaciones covalentes y de conformación véase Jones, A. J. S. (1993) Analytical methods for the assessment of protein formulations and delivery systems. En: Cleland, J. L; Langer, R., editores. Formulation and delivery of peptides and proteins, 1a edición, Washington, ACS, pg. 22-45; y Pearlman, R.; Nguyen, T. H. (1990) Analysis of protein drugs. En: Lee, V. H., editor. Peptide and protein drug delivery, 1a edición, Nueva York, Marcel Dekker, Inc., pg. 247-301.
Heterogeneidad y formación de agregado: La estabilidad del anticuerpo puede ser tal que la formulación puede revelar menos de aproximadamente 10%, y, en una modalidad, menos de aproximadamente 5%, en otra modalidad, menos de aproximadamente 2%, o, en una modalidad, dentro del intervalo de 0.5% a 1.5% o menos en el material de anticuerpo de GMP que está presente como agregado. La cromatografía por exclusión de tamaño es un método que es sensible, reproducible, y muy robusto en la detección de agregados de proteína.
Además de niveles de bajos de agregado, en una modalidad, el anticuerpo debe ser químicamente estable. La estabilidad química se puede determinar mediante cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico o aniónico), cromatografía de interacción hidrofóbica, u otros métodos tales como enfocamiento isoeléctrico o electroforesis capilar. Por ejemplo, la estabilidad química del anticuerpo puede ser tal que después de almacenamiento de por lo menos 12 meses a 2-8°C el pico que representa el anticuerpo no modificado en una cromatografía de intercambio catiónico se puede incrementar en no más de 20%, en una modalidad, no más de 10%, o, en otra modalidad, no más de 5% en comparación con la solución de anticuerpo antes del análisis en almacenamiento.
En una modalidad, los anticuerpos progenitores despliegan integridad estructural; formación de puente de disulfuro correcto, y plegamiento correcto: La inestabilidad química debido a cambios en la estructura secundaria o terciaria de un anticuerpo puede afectar la actividad del anticuerpo. Por ejemplo, la estabilidad como queda indicada por la actividad del anticuerpo puede ser tal que después de almacenamiento de por lo menos 12 meses a 2-8°C la actividad del anticuerpo puede disminuir no más del 50%, en una modalidad no más del 30%, o incluso no más de 10%, o en una modalidad no más del 5% o 1% en comparación con la solución de anticuerpo antes del análisis en almacenamiento. Se pueden utilizar pruebas de unión a antígeno apropiadas para determinar la actividad del anticuerpo. 1.B.5.2: Solubilidad La "solubilidad" de un mAb se correlaciona con la producción de IgG monomérica, correctamente plegada. Por lo tanto, la solubilidad de la IgG se puede evaluar mediante HPLC. Por ejemplo, la IgG soluble (monomérica) da origen a un pico individual en el cromatógrafo de HPLC, mientras que la insoluble (por ejemplo, multimérica y agregada) da origen a una pluralidad de picos. Por lo tanto, un experto en la técnica será capaz de detectar un incremento o decremento en la solubilidad de una IgG utilizando técnicas de HPLC rutinarias. Para una lista más comprensiva de técnicas analíticas que pueden ser utilizadas para analizar la solubilidad (véase Jones, A. G. Dep. Chem. Biochem. Eng., Univ. Coll. Londres, Londres, RU. Editor(es): Shamlou, P. Ayazi. Process. Solid-Liq. Suspensions (1993), 93-117. Publisher: Butterworth-Heinemann,. Oxford, RU y Pearlman, Rodney; Nguyen, Tue H, Advances in Parenteral Sciences (1990), 4 (Pept. Protein Drug Delivery), 247-301). La solubilidad de un mAb terapéutico es crítica para poder formular a la concentración elevada con frecuencia requerida para dosificación adecuada. Como se indicó en la presente solicitud, podrían ser necesarias solubilidades de > 100 mg/mL para ajustar una dosificación eficiente de anticuerpo. Por ejemplo, la solubilidad del anticuerpo podría ser no menor de aproximadamente 5 mg/mL en fase de investigación inicial, en una modalidad no menos de aproximadamente 25 mg/mL en etapas de ciencia de procesos avanzados, o en una modalidad no menos de aproximadamente 100 mg/mL, o en una modalidad no menos de aproximadamente 150 mg/mL. Es evidente para el experto en la técnica que las propiedades intrínsecas de una molécula de proteína son importantes para las propiedades fisicoquímicas de la solución de proteína, por ejemplo, estabilidad, solubilidad, viscosidad. Sin embargo, el experto en la técnica apreciará que existe una amplia variedad de excipientes que se pueden utilizar como aditivos para afectar benéficamente las características de la formulación final de proteína. Estos recipientes pueden incluir: (i) solventes líquidos, cosolventes (por ejemplo, alcoholes tales como etanol); (ii) agentes amortiguadores (por ejemplo, amortiguadores de fosfato, acetato, citrato, aminoácido); (iii) azúcares o alcoholes de azúcar (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, fructosa, rafinosa, manitol, sorbitol, dextranos); (iv) agentes tensoactivos (por ejemplo, polisorbato 20, 40, 60, 80, poloxámeros); (v) modificadores de isotonicidad (por ejemplo, sales tales como NaCI, azúcares, alcoholes de azúcar); y (vi) otros (por ejemplo, conservadores, agentes quelantes, antioxidantes, sustancias quelantes (por ejemplo, EDTA), polímeros biodegradables, moléculas portadoras (por ejemplo, HSA, PEGs).
La viscosidad es un parámetro de alta importancia con respecto a la fabricación de anticuerpo y procesamiento de anticuerpo (por ejemplo, diafiltración/ultrafiltración), procedimientos de terminado en el llenado (aspectos de bombeo, aspectos de filtración) y aspectos de suministro (capacidad de aplicación con jeringa, suministro con dispositivo sofisticado). Las viscosidades bajas permiten que la solución líquida del anticuerpo tenga una concentración más alta. Esto permite que se pueda administrar la misma dosis en volúmenes más pequeños. Los volúmenes de inyección pequeños tienen la ventaja inherente de menor dolor sobre las sensaciones de la inyección, y las soluciones no necesariamente tienen que ser isotónicas para reducir el dolor al inyectar al paciente. La viscosidad de la solución de anticuerpo puede ser tal que a esfuerzos cortantes de 100 (1/s) la viscosidad de la solución de anticuerpo es menor de 200 mPa-s, en una modalidad menor de 125 mPa-s, en otra modalidad menor de 70 mPa-s, e incluso en otra modalidad menor de 25 mPa s o incluso menor de 10 mPa-s. 1.B.5.3: Eficiencia de producción La generación de una DVD-lg que se exprese de manera eficiente en células de mamífero, tal como las células de ovario de hámster chino (CHO), en una modalidad, requiere dos anticuerpos monoclonales progenitores los cuales por sí mismos son expresados de manera eficiente en células de mamífero. El rendimiento de producción a partir de una línea estable de mamífero (es decir CHO) debe estar por encima de aproximadamente 0.5 g/L, en una modalidad por encima de aproximadamente 1 g/L, y en otra modalidad en el intervalo de aproximadamente 2-5 g/L o más (Kipriyanov SM, Little M: 1999 Mol Biotechnol. 12:173-201; Carroll S, Al-Rubeai M. 2004 Expert Opin Biol Ther.4:1821-9).
La producción de anticuerpos y proteínas de fusión de Ig en células de mamífero es influenciada por varios factores. El diseño del vector de expresión a través de la incorporación de promotores, incrementadores y marcadores de selección fuertes puede llevar al máximo la transcripción del gen de interés a partir de una copia del vector integrado. La identificación de los sitios de integración del vector que son permisivos para niveles elevados de transcripción del gen puede aumentar la expresión de proteína a partir de un vector (Wurm et al, 2004, Nature Biotechnology, 2004, Vol/ejemplar/Págs. 22/11 (1393-1398)). Asimismo, los niveles de producción se ven afectados por la proporción de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y los diversos pasos en el proceso de ensamblado y secreción de proteína (Jiang et al. 2006, Biotechnology Progress, Ene-Feb 2006, vol. 22, no. 1, p. 313-8). 1.B.6: Inmunoqenicidad La administración de un mAb terapéutico puede dar como resultado cierta incidencia de una respuesta inmune (es decir, la formación de anticuerpos endógenos dirigidos contra el mAb terapéutico). Se deben analizar los elementos potenciales que pudieran inducir inmunogenicidad durante la selección de los anticuerpos monoclonales progenitores, y se deben tomar pasos para reducir dicho riesgo para optimizar los anticuerpos monoclonales progenitores antes de la construcción de la DVD-lg. Se ha descubierto que los anticuerpos obtenidos de ratón son altamente inmunogénicos en los pacientes. La generación de anticuerpos quiméricos constituidos por regiones constantes de humano y variables de ratón presentan un siguiente paso lógico para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos (Morrison y Schlom, 1990). De manera alternativa, la inmunogenicidad se puede reducir transfiriendo secuencias de CDR de múrido hacia la estructura base de anticuerpo de humano (reconfiguración/injerto de CDR/humanización), en la forma descrita para un anticuerpo terapéutico por Riechmann et al., 1988. Otro método es conocido como "restauración (resurfacing)" o "revestimiento (veneering)", comenzando con los dominios ligero y pesado variables de roedor, solamente los aminoácidos de estructura base accesibles en superficie se alteran a los humanos, mientras que permanecen la CDR y los aminoácidos enterrados provenientes del anticuerpo de roedor progenitor (Roguska et al., 1996). En otro tipo de humanización, en lugar de injertar las CDRs completas, una técnica injerta solamente las "regiones determinantes de especificidad" (SDRs), definidas como el subconjunto de residuos de CDR que están implicados en la unión del anticuerpo a su objetivo (Kashmiri et al., 2005). Esto necesita la identificación de las SDRs ya sea a través de análisis de estructuras tridimensionales disponibles de complejos anticuerpo-objetivo o análisis de mutación de los residuos de CDR del anticuerpo para determinar cuáles interactúan con el objetivo. De manera alternativa, los anticuerpos completamente humanos pueden tener inmunogenicidad reducida en comparación con los anticuerpos de múrido, quiméricos o humanizados.
Otra estrategia para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos es la eliminación de ciertas secuencias especificas que se predice serán inmunogénicas. En una estrategia, después que se analiza una primera generación biológica en humanos y se encuentra que es inaceptablemente inmunogénica, los epítopes de célula B se pueden mapear y después alterar para evitar la detección inmunitaria. Otra estrategia utiliza métodos para predecir y eliminar epítopes de célula T potenciales. Se han desarrollado métodos computacionales para escudriñar e identificar las secuencias de péptido de agentes terapéuticos biológicos con potencial para unirse a proteínas del MHC (Desmet et al., 2005). De manera alternativa se puede utilizar un método basado en célula dendritica de humano para identificar epítopes de célula T CD4+ en alérgenos proteínicos potenciales (Stickler et al., 2005; S. L. Morrison y J. Schlom, Important Adv. Oncol. (1990), pp. 3-18; Riechmann, L, Clark, M., Waldmann, H. y Winter, G. "Reshaping human antibodies for therapy" Nature (1988) 332:323-327; Roguska-M-A, Pedersen-J-T, Henry-A-H, Searle-S-M, Roja-C-M, Avery-B, Hoffee-M, Cook-S, Lambert-J- , Bláttler-W-A. Rees-A-R. Guild-B-C. A comparison of two murine mAbs humanized by CDR-grafting and variable domain resurfacing. Protein engineering, {Protein-Eng}, 1996, vol. 9, p. 895-904; Kashmiri-Syed-V-S, De-Pascalis-Roberto, Gonzales-Noreen-R, Schlom-Jeffrey. SDR grafting-a new approach to antibody humanization. Methods (San Diego Calif), {Methods}, Mayo 2005, vol. 36, no. 1, p. 25-34; Desmet-Johan, Meersseman-Geert, Boutonnet-Nathalie, Pletinckx-Jurgen, De-Clercq-Krista, Debulpaep-Maja, Braeckman-Tessa, Lasters-lgnace. Anchor profiles of HLA-specific peptides: analysis by a novel affinity scoring method and experimental validation. Proteins, 2005, vol. 58, p. 53-69; Stickler-M-M, Estell-D-A, Harding-F-A. CD4+ T-cell epitope determination using unexposed human donor peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunotherapy 2000, vol. 23, p. 654-60.) 1.B.7: Eficacia in vivo Para generar una molécula de DVD-lg con la eficacia in vivo, es importante generar y seleccionar mAbs con eficacia in vivo deseada similar cuando se administran en combinación. Sin embargo, en algunos casos la DVD-lg puede presentar eficacia in vivo que no puede ser lograda con la combinación de dos mAbs separados. Por ejemplo, una DVD-lg puede poner dos objetivos en proximidad cercana lo que conduce a una actividad que no se puede lograr con la combinación de dos mAbs separados. Funciones biológicas deseables adicionales se describen en la presente solicitud en la sección B3. Se pueden seleccionar anticuerpos progenitores con características deseables en la molécula de DVD-lg tomando como base factores tales como el tiempo de vida media (t1/2) farmacocinético; distribución en tejido; objetivos solubles contra objetivos en superficie celular; y concentración-soluble/densidad-superficie del objetivo. 1.B.8: Distribución en tejido in vivo Para generar una molécula de DVD-lg con distribución en tejido in vivo deseada, en una modalidad se deben seleccionar mAbs progenitores con perfil de distribución en tejido in vivo similar. De manera alternativa, tomando como base el mecanismo en la estrategia de elección específica dual de objetivo, ésta podría no ser requeridas en otros momentos para seleccionar mAbs progenitores con la similitud deseada de distribución en tejido in vivo cuando se administran en combinación. Por ejemplo, en el caso de una DVD-lg en la cual un componente de unión dirige la DVD-lg hacia un sitio específico con lo cual lleva al segundo componente de unión al mismo sitio objetivo. Por ejemplo, una especificidad de unión de una DVD-lg puede elegir como blanco el páncreas (células del islote) y la otra especificidad puede llevar GLP1 al páncreas para inducir insulina. 1.B.9: Isotipo Para generar una molécula de DVD-lg con las propiedades deseadas incluyendo, pero sin limitarse a, isotipo, funciones efectoras y tiempo de vida media en circulación, en una' modalidad se seleccionan mAbs progenitores con funciones Fc-efectoras apropiadas dependiendo de la utilidad terapéutica y del punto final terapéutico deseado. Existen cinco clases principales de la cadena pesada o isotipos algunos de los cuales tienen varios subtipos y éstos determinan las funciones efectoras de una molécula de anticuerpo. Estas funciones efectoras residen en la región de gozne, dominios CH2 y CH3 de la molécula de anticuerpo. Sin embargo, los residuos en otras partes de una molécula de anticuerpo pueden tener efectos sobre las funciones efectoras también. Las funciones Fc-efectoras de la región de gozne incluyen: (i) citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, (ii) unión al complemento (C1q), activación y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), (iii) fagocitosis/depuración de complejos antígeno-anticuerpo, y (iv) en algunos casos liberación de citocina. Estas funciones Fc-efectoras de una molécula de anticuerpo son mediadas a través de ia interacción de la región Fe con un conjunto de receptores de superficie celular específicos de clase. Los anticuerpos del isotipo lgG1 son más activos mientras que lgG2 e lgG4 tienen funciones efectoras mínimas o ninguna función efectora. Las funciones efectoras de los anticuerpos de IgG son mediadas a través de interacciones con tres tipos de receptor Fe celular estructuralmente homólogos (y subtipos) (FcgR1, FcgRIl y FcgRIII). Estas funciones efectoras de una IgG 1 se pueden eliminar mediante mutación de residuos de aminoácido específicos en la región de gozne inferior (por ejemplo, L234A, L235A) que son requeridos para unión a FcgR y C1q. Los residuos de aminoácido en la región Fe, en particular los dominios CH2-CH3, también determinan el tiempo de vida media en circulación de la molécula de anticuerpo. Esta función de Fe es mediada a través de la unión de la región Fe al receptor de Fe neonatal (FcRn), el cual es responsable del reciclado de las moléculas de anticuerpo desde los lisosomas ácidos de regreso a la circulación general. En otra modalidad, la actividad del fragmento Fe se puede incrementar en gran manera mediante sialilación del glucano N-ligado de la porción Fe (por ejemplo, con enlace 2,6 hacia la penúltima galactosa en el glucano de biantena, complejo encontrado en Asn 297 en la inmunoglobulina G (IgG)) (Anthony, RM (2008) Science 320:373-376).
El que un mAb deba tener un isotipo activo o uno inactivo depende del punto final terapéutico deseado para un anticuerpo. Algunos ejemplos de uso de isotipos y resultado terapéutico deseado se listan a continuación: a) si el punto final deseado es neutralización funcional de una citocina soluble entonces se puede utilizar un isotipo inactivo; b) si el resultado deseado es depuración de una proteína patológica se puede utilizar un isotipo activo; c) si el resultado deseado es depuración de agregados de proteína se puede utilizar un isotipo activo; d) si el resultado deseado es antagonizar un receptor de superficie se utiliza un isotipo inactivo (Tysabri, lgG4; OKT3, lgG1 mutada); e) si el resultado deseado es eliminar células objetivo se utiliza un isotipo activo (Herceptin, lgG1 (y con funciones efectoras incrementadas); y f) si el resultado deseado es depurar proteínas a partir de la circulación sin entrar al sistema nervioso central CNS se puede utilizar un isotipo de IgM (por ejemplo, depurar especies de péptido Ab en circulación).
Las funciones efectoras de Fe de un mAb progenitor se pueden determinar utilizando diversos métodos in vitro bien conocidos en la técnica.
Como se discutió, la selección del isotipo, y de esta manera de las funciones efectoras depende del punto final terapéutico. En casos en los cuales se desea la neutralización simple de un objetivo en circulación, por ejemplo bloquear las interacciones receptor-ligando, las funciones efectoras podrían no ser necesarias.
En dichas instancias son deseables los isotipos o mutaciones en la región de Fe de un anticuerpo que elimine las funciones efectoras. En otras instancias en las cuales la eliminación de células objetivo es el punto final terapéutico, por ejemplo eliminación de células de tumor, son deseables los isotipos o mutaciones o des-fucosilación en la región de Fe que incrementen las funciones efectoras (Presta GL, Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656, 2006; Satoh M., I ida S., Shitara K. Expert Opinión Biol. Ther. 6:1161-1173, 2006). De manera similar, dependiendo de la utilidad terapéutica, el tiempo de vida media en circulación de una molécula de anticuerpo se puede reducir/prolongar modulando las interacciones anticuerpo-FcRn mediante introducción de mutaciones específicas en la región Fe (Dall'Acqua WF, Kiener PA, Wu H. J. Biol. Chem. 281:23514-23524, 2006; Petkova SB., Akilesh S., Sproule TJ. et al. Internat. Immunol. 18:1759-1769, 2006; Vaccaro C, Bawdon R., Wanjie S et al. PNAS 103:18709-18714, 2007).
La información publicada sobre los diversos residuos que influyen en las diferentes funciones efectoras de un mAb terapéutico normal podría necesitar ser confirmada para DVD-lg. Puede ser posible que en el formato de DVD-lg puedan ser importantes residuos (diferentes) de la región Fe adicionales, diferentes de aquellos identificados para la modulación de las funciones efectoras de anticuerpo monoclonal.
En general, la decisión en cuanto a cuáles funciones efectoras de Fe (isotipo) serán críticas en el formato de DVD-lg final depende de la indicación de la enfermedad, objetivo terapéutico, punto final terapéutico deseado y consideraciones de seguridad. A continuación se listan ejemplos de regiones constantes de la cadena pesada y de la cadena ligera apropiadas incluyendo, pero sin limitarse a: • lgG1 -alotipo: G1mz • lgG1 muíante - A234, A235 • lgG2 -alotipo: G2m(n-) • Kappa - Km3 · Lambda Estudios de receptor de Fe v de C1q La posibilidad de citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) por parte del anticuerpo cuando se compleja con cualquier objetivo sobre-expresado sobre las membranas celulares puede ser abrogada mediante las mutaciones en la región de gozne (por ejemplo, L234A, L235A). Se espera que estos aminoácidos sustituidos, presentes en la región de gozne de IgG 1 del mAb, den como resultado unión disminuida del mAb a los receptores de Fe de humano (pero no a FcRn), ya que se cree que la unión a FcgR ocurre dentro de los sitios de traslape en la región de gozne de lgG1. Esta característica del mAb puede llevar a un perfil de seguridad mejorado con respecto a los anticuerpos que contienen una IgG de tipo silvestre. La unión del mAb a los receptores de Fe de humano se puede determinar mediante experimentos de citometría de flujo utilizando líneas celulares (por ejemplo, ???-1, K562) y una línea celular CHO diseñada que expresen FcgRIIb (u otros FcgRs). En comparación con anticuerpos monoclonales de control de IgG 1 , el mAb muestra unión reducida a FcgRI y FcgRIIa mientras que la unión a FcgRIIb no se ve afectada. La unión y activación de C1q mediante complejos de antígeno/lgG inmunitarios desencadena la cascada clásica del complemento con respuestas con las consiguientes respuestas inflamatoria y/o inmuno-reguladora. El sitio de unión a C1q en las IgGs ha sido localizado hasta los residuos dentro de la región de gozne de la IgG. La unión a C1q a concentraciones cada vez mayores de mAb se evalúa mediante ELISA para C1q. Los resultados demuestran que el mAb no se puede unir a C1q, como era de esperar cuando se compara con la unión de una lgG1 de control de tipo silvestre. En general, la mutación de la región de gozne L234A, L235A suprime la unión del mAb a FcgRI, FcgRIIa y C1q pero no afecta la interacción del mAb con FcgRIIb. Estos datos sugieren que in vivo, el mAb con Fe mutante interactúa normalmente , con el FcgRIIb inhibidor pero probablemente no pueda interactuar con los receptores FcgRI y FcgRIIa activadores o Clq.
Unión a FcRn de humano El receptor neonatal (FcRn) es responsable del transporte de IgG a través de la placenta y de controlar el tiempo de vida media catabólico de las moléculas de IgG. Sería deseable incrementar el tiempo de vida media terminal de un anticuerpo para mejorar la eficacia, para reducir la dosis o frecuencia de administración, o para mejorar la localización hacia el objetivo. De manera alternativa, podría ser conveniente hacer lo contrario, es decir, reducir el tiempo de vida media terminal de un anticuerpo para reducir la exposición corporal completa o para mejorar las proporciones de unión objetivo a no objetivo. Confeccionar a la medida la interacción entre la IgG y su receptor de salvamento, FcRn, ofrece una manera de incrementar o reducir el tiempo de vida medio terminal de la IgG. Las proteínas en la circulación, incluyendo IgG, son llevadas a la fase de fluido a través de micropinocitosis por ciertas células, tales como aquellas del endotelio vascular. La IgG se puede unir a FcRn en los endosomas bajo condiciones ligeramente ácidas (pH 6.0-6.5) y se puede reciclar hacia la superficie celular, en donde ésta es liberada bajo condiciones casi neutras (pH 7.0-7.4). El mapeo del sitio de unión a la región de Fe en FcRn80, 16, 17 muestra que dos residuos de histidina que están conservados a través de las especies, His310 y His435, son responsables de la dependencia del pH de esta interacción. Utilizando tecnología de despliegue de fago, se identifica una mutación de la región Fe de ratón de incrementar la unión a FcRn y prolonga el tiempo de vida media de la IgG de ratón (véase Víctor, G. et al.; Nature Biotechnology (1997), 15(7), 637-640). También se han identificado mutaciones de la región Fe que incrementan la afinidad de unión de la IgG de humano para FcRn a pH 6.0, pero no a pH 7.4 (véase Dall'Acqua William F, et al., Journal of Immunology (2002), 169(9), 5171-80). Asimismo, en un caso, también se observa un incremento similar dependiente del pH en la unión (de hasta 27 veces) para FcRn de rhesus, y esto da como resultado un incremento del doble en el tiempo de vida media en suero en monos rhesus en comparación con la IgG progenitora (véase Hinton, Paul R. et al., Journal of Biological Chemistry (2004), 279(8), 6213-6216). Estos hallazgos indican que es posible extender el tiempo de vida media en plasma de agentes terapéuticos de anticuerpo confeccionando a la medida la interacción de la región Fe con FcRn. Por el contrario, las mutaciones de la región Fe que atenúan la interacción con FcRn pueden reducir el tiempo de vida media del anticuerpo. 1.B.10: Farmacocinética (PK) Para generar una molécula de DVD-lg con el perfil farmacocinético deseado, en una modalidad se seleccionan mAbs progenitores con los perfiles farmacocinéticos deseados similares. Una consideración es que la respuesta inmunogénica hacia anticuerpos monoclonales (es decir, respuesta de anti-anticuerpo humano de humano (HAHA por sus siglas en inglés); respuesta de anticuerpo anti-quimérico de humano (HACA siglas)) complica adicionalmente la farmacocinética de estos agentes terapéuticos. En una modalidad, se utilizan anticuerpos monoclonales con inmunogenicidad mínima o no inmunogénicos para construir moléculas de DVD-lg de manera tal que las moléculas de DVD-lg resultantes también tienen inmunogenicidad mínima o no tienen inmunogenicidad. Algunos de los factores que determinan la farmacocinética de un mAb incluyen, pero no se limitan a, propiedades intrínsecas del mAb (secuencia de aminoácido de VH); inmunogenicidad; unión a FcRn y funciones de Fe.
El perfil PK de los anticuerpos monoclonales progenitores seleccionados se puede determinar fácilmente en roedores ya que el perfil PK en roedores se correlaciona bien con (o predice cercanamente) el perfil PK de anticuerpos monoclonales en mono cynomolgus y humanos. El perfil PK se determina como se describe en el Ejemplo Sección 1.3.3.1.
Después que se seleccionan los anticuerpos monoclonales progenitores con las características farmacocinéticas deseadas (y otras propiedades funcionales deseadas como se discute en la presente solicitud), se construye la DVD-lg. Debido a que las moléculas de DVD-lg contienen dos dominios de unión a antígeno provenientes de dos anticuerpos monoclonales progenitores, también se evalúan las propiedades farmacocinéticas de la DVD-lg. Por lo tanto, mientras se determinan las propiedades farmacocinéticas de la DVD-lg, se pueden utilizar pruebas farmacocinéticas para determinar el perfil PK tomando como base la funcionalidad de ambos dominios de unión a antígeno obtenidos a partir de los 2 anticuerpos monoclonales progenitores. El perfil PK de una DVD-lg se puede determinar como se describe en el ejemplo 1.3.3.1. Los factores adicionales que pueden afectar el perfil farmacocinético de la DVD-lg incluyen la orientación del dominio de unión a antígeno (CDR); tamaño del enlazador; e interacciones Fc/FcRn. Las características farmacocinéticas de los anticuerpos progenitores se pueden evaluar mediante evaluación de los siguientes parámetros: absorción, distribución, metabolismo y excreción.
Absorción Hasta la . fecha, la administración de anticuerpos monoclonales terapéuticos es a través de vías de administración parenterales (por ejemplo, intravenosa [IV], subcutánea [SC], o intramuscular [IM]). La absorción de un mAb en la circulación sistémica después de administración ya sea subcutánea o intramuscular desde el espacio intersticial es principalmente a través de la ruta linfática. La degradación proteolítica, pre-sistémica, saturable puede dar como resultado biodisponibilidad absoluta variable después de administración extravascular. Normalmente, se pueden observar incrementos en biodisponibilidad absoluta con dosis cada vez mayores de anticuerpos monoclonales debido a la capacidad proteolítica saturada a dosis más altas. El proceso de absorción para un mAb es normalmente muy lento ya que el fluido linfático drena lentamente al interior del sistema vascular, y la duración de absorción puede tardar desde horas hasta varios días. La biodisponibilidad absoluta de los anticuerpos monoclonales después de la administración subcutánea generalmente varía desde 50% hasta 100%.
Distribución Después de la administración intravenosa, los anticuerpos monoclonales normalmente siguen un perfil de concentración-tiempo en suero (o plasma) bifásico, comenzando con una fase de distribución rápida, seguido por una fase de eliminación lenta. En general, un modelo farmacocinético biexponencial describe de mejor manera este tipo de perfil farmacocinético. El volumen de distribución en el compartimiento central (Ve) para un mAb por lo general es igual a o ligeramente mayor que el volumen del plasma (2-3 litros). Un patrón bifásico distinto en el perfil de concentración contra tiempo en suero (plasma) podría no ser aparente con otras vías de administración parenterales, tales como IM o SC, debido a que la fase de distribución de la curva de concentración-tiempo en suero (plasma) es enmascarada por la porción de absorción larga. Muchos factores, incluyendo las propiedades fisicoquímicas, absorción mediada por receptor específica de sitio y orientada a objetivo, capacidad de unión del tejido, y dosis de mAb pueden influir en la biodistribución de un mAb. Algunos de estos factores pueden contribuir a la no linealidad en la biodistribución para un mAb.
Metabolismo v excreción Debido al tamaño molecular, los anticuerpos monoclonales intactos no son excretados en la orina a través del riñón. Estos son inactivados principalmente por el metabolismo (por ejemplo, catabolismo). Para anticuerpos monoclonales terapéuticos basados en IgG , los tiempos de vida media típicamente varían desde horas o 1 -2 d ías hasta más de 20 días. La eliminación de u n mAb puede ser afectada por muchos factores, incluyendo, pero sin limitarse a, afinidad por el receptor de FcRn , inmunogenicidad del mAb, el g rado de glucosilación del mAb, la susceptibilidad del mAb a la proteólisis, y eliminación mediada por receptor. 1 . B1 .1 1 : Patrón de reactividad cruzada en tejido en especies humanas y especies para toxicolog ía (especie Tox) Patrones de tinción idénticos sugieren que la toxicidad potencial en humanos se puede evaluar en especies Tox. Las especies Tox son aquellos animales en los cuales se estudia la toxicidad no relacionada.
Los anticuerpos individuales se seleccionan para satisfacer dos criterios. (1 ) Tinción de tejido apropiada para la expresión conocida del objetivo del anticuerpo. (2) Patrón de tinción similar entre tejidos de especie h umana y especie Tox provenientes del mismo órgano.
Criterio 1 : Las inmunizaciones y/o selecciones de anticuerpo típicamente emplean antígenos recombínantes o sintetizados (proteínas, carbohidratos u otras moléculas). La unión a la contraparte natural y el contra-tamizaje contra antígenos no relacionados con frecuencia son parte del embudo de tamizaje para anticuerpos terapéuticos. Sin embargo, el tamizaje contra una multitud de antígenos con frecuencia es impráctico. Por lo tanto, los estudios de reactividad cruzada en tejido con tejidos humanos de todos los órganos principales sirven para excluir la unión no deseada de anticuerpo a cualesquiera antígenos no relacionados.
Criterio 2: Los estudios de reactividad cruzada en tejido comparativos con tejidos de especie humana y especie Tox (mono cynomolgus, perro, posiblemente roedores y otros, se analizan los mismos 36 o 37 tejidos como en el estudio en humanos) ayudan a validar la selección de una especie Tox. En los estudios típicos de reactividad cruzada en tejido en secciones de tejidos congelados los anticuerpos terapéuticos pueden demostrar la unión esperada al antígeno conocido y/o en un grado menor la unión a tejidos tomando como base ya sean interacciones de bajo nivel (unión no específica, bajo nivel de unión a antígenos similares, interacciones basadas en carga de bajo nivel, etc.). En cualquier caso la especie animal más relevante para toxicología es aquella con el grado más alto de coincidencia de unión a tejido humano y animal.
Los estudios de reactividad cruzada en tejido siguen los lineamientos regulatorios apropiados incluyendo el Lineamiento 111/5271/94 de EC CPMP "Production and quality control of mAbs" y el Lineamiento US FDA/CBER de 1997 "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use". Se fijan criosecciones (5 µ ?) de tejidos humanos obtenidos en la autopsia o biopsia y se secan sobre portaobjetos. Se efectúa la tinción de secciones de tejido con peroxidasa, utilizando el sistema avidina-biotina. Lineamiento de la FDA "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use". Las referencias relevantes incluyen Clarke J 2004, Boon L. 2002a, Boon L 2002b, Ryan A 1999.
Los estudios de reactividad cruzada tisular con frecuencia se efectúan en dos etapas, en el que la primera etapa incluye criosecciones de 32 tejidos (típicamente: glándula adrenal, tracto gastrointestinal, próstata, vejiga urinaria, corazón, músculo esquelético, células sanguíneas, riñón, piel, médula ósea, hígado, médula espinal, tejido mamario, pulmón, bazo, cerebelo, nodo linfático, testículos, corteza cerebral, ovario, timo, colon, páncreas, tiroides, endotelio, paratiroides, uretra, ojo, pituitaria, útero, trompas de Falopio y placenta) provenientes de un donador humano. En la segunda fase se efectúa un estudio de reactividad cruzada completa hasta con 38 tejidos (incluyendo adrenales, sangre, vaso sanguíneo, médula ósea, cerebelo, cerebro, cuello uterino, esófago, ojo, corazón, riñón, intestino grueso, hígado, pulmón, nodo linfático, glándula mamaria de la mama, ovario, oviducto, páncreas, paratiroides, nervio periférico, pituitaria, placenta, próstata, glándula salival, piel, intestino delgado, médula espinal, bazo, estómago, músculo estriado, testículos, timo, tiroides, amígdala, uretra, vejiga urinaria, y útero) de tres adultos no relacionados. Los estudios se hacen típicamente como mínimo a dos niveles de dosis.
El anticuerpo terapéutico (es decir artículo de prueba) y el anticuerpo de control igualado al isotipo pueden estar modificados con biotina para detección del complejo avidina-biotina (ABC); otros métodos de detección pueden incluir detección de anticuerpo terciario para un artículo de prueba marcado con FITC (u otro), o formación previa de complejo con un anti-lgG de humano marcado para un artículo de prueba no marcado.
Brevemente, se fijan criosecciones (aproximadamente 5 µ?t?) de tejidos humanos obtenidos en la autopsia o biopsia y se secan sobre portaobjetos. Se efectúa la tinción con peroxidasa de secciones de tejido, utilizando el sistema de avidina-biotina. Primero (en caso de un sistema detección con formación previa de complejo), el artículo de prueba se incuba con el anti-lgG de humano modificado con biotina secundario y se desarrolla como complejo inmune. El complejo inmune, a la concentración final de 2 y 10 pg/ml del artículo de prueba, se agrega sobre las secciones tisulares en los portaobjetos y después las secciones tisulares se hacen reaccionar durante 30 minutos con un estuche de avidina-biotina-peroxidasa. Posteriormente, se aplica DAB (3,3'-diam¡nobencidina), un substrato para la reacción de peroxidasa, durante 4 minutos para tinción de tejidos. Se utilizan glóbulos de antígeno-sefarosa como secciones tisulares de control positivo.
Cualquier tinción específica se juzga ya sea como una reactividad esperada (por ejemplo, consistente con la expresión de antígenos) o como una reactividad inesperada tomando como base la expresión conocida del antígeno objetivo en cuestión. Cualquier tinción juzgada como específica se califica respecto a intensidad y frecuencia. Los estudios de competencia o bloqueo de antígeno o suero también pueden ayudar a determinar si la tinción observada es específica o no específica.
Si se encuentra que dos anticuerpos seleccionados satisfacen los criterios de selección - tinción tisular apropiada, coincidencia de tinción entre tejidos específicos de humano y animal para toxicología - éstos se pueden seleccionar para generar la DVD-ig- El estudio de reactividad cruzada tisular tiene que repetirse con la construcción de DVD-lg final, pero aunque estos estudios siguen el mismo protocolo como se indica en la presente solicitud, éstos son más complejos de evaluar debido a que cualquier unión puede provenir de cualquiera de los dos anticuerpos progenitores, y cualquier unión inexplicada necesita ser confirmada con estudios complejos de competición de antígeno.
Es fácilmente evidente que la compleja tarea de estudios de reactividad cruzada tisular con una molécula multiespecífica tal como una DVD-lg se simplifica en gran medida si los dos anticuerpos progenitores se seleccionan respecto a (1) falta de hallazgos de reactividad cruzada tisular inesperados y (2) respecto a similitud apropiada de los hallazgos de reactividad cruzada tisular entre los tejidos de especie humana y especie animal para toxicología correspondientes. 1.B.12: Especificidad y selectividad Para generar una molécula de DVD-lg con especificidad y selectividad deseada, se necesita generar y seleccionar mAbs progenitores con perfiles de especificidad y selectividad deseados similares.
Los estudios de unión para especificidad y selectividad con una DVD-lg pueden ser complejos debido a los cuatro o más sitios de unión, dos de cada uno por cada antígeno. Brevemente, los estudios de unión utilizando ELISA, BIAcore, KinExA u otros estudios interacción con una DVD-lg necesitan monitorear la unión de uno, dos o más antígenos a la molécula de DVD-lg. Mientras que la tecnología BIAcore puede resolver la unión secuencial, independiente de antígenos múltiples, los métodos más tradicionales incluyendo ELISA o las técnicas más modernas como KinExA no pueden. Por lo tanto, la caracterización cuidadosa de cada anticuerpo progenitor es crítica. Después de que cada anticuerpo individual ha sido caracterizado respecto a especificidad, la confirmación de retención de especificidad de los sitios de unión individuales en la molécula de DVD-lg se simplifica en gran medida.
Es fácilmente evidente que la compleja tarea de determinar la especificidad de una DVD-lg se simplifica en gran medida si los dos anticuerpos progenitores se seleccionan respecto a especificidad antes de que se combinen como una DVD-lg.
Los estudios de interacción antígeno-anticuerpo pueden tomar muchas formas, incluyendo muchos estudios de interacción proteína-proteína clásicos, incluyendo ELISA (prueba con inmunosorbente ligado a enzima), espectrometría de masas, entrelazamiento químico, SEC con dispersión de luz, diálisis en equilibrio, permeación de gel, ultrafiltración, cromatografía en gel, SEC analítico de zona grande, ultracentrifugación micropreparativa (equilibrio de sedimentación), métodos espectroscópicos, microcalorimetría con titulación, equilibrio de sedimentación (en ultracentrífuga analítica), velocidad de sedimentación (en centrífuga analítica), resonancia de plasmón de superficie (incluyendo BIAcore). Las referencias relevantes incluyen "Current Protocols in Protein Science", John E. Coligan, Ben M. Dunn, David W. Speicher, Paul T, Wingfield (eds.) Volumen 3, capítulos 19 y 20, publicado por John Wiley & Sons Inc., y las referencias incluidas en el mismo y "Current Protocols in Immunology", John E. Coligan, Barbara E. Bierer, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (eds.) publicado por John Wiley & Sons Inc y las referencias relevantes incluidas en el mismo.
Liberación de citocina en sangre entera La interacción del mAb con células sanguíneas humanas se puede investigar utilizando una prueba de liberación de citocina (Wing, M. G. Therapeutic Immunology (1995), 2(4), 183-190; "Current Protocols in Pharmacology", S.J. Enna, Michael Williams, John W. Ferkany, Terry Kenakin, Paul Moser, (eds.) publicado por John Wiley & Sons Inc; Madhusudan , S. Clinical Cáncer Research (2004), 10(19), 6528-6534; Cox, J. Methods (2006), 38(4), 274-282; Choi, I. European Journal of Immunology (2001), 31(1), 94-106). Brevemente, se incuban varias concentraciones de mAb con sangre entera de humano durante 24 horas. La concentración analizada debe cubrir un amplio intervalo que incluya concentraciones finales que imiten los niveles sanguíneos típicos en pacientes (incluyendo pero sin limitarse a 100 ng/ml - 100 pg/ml). Después de la incubación, los sobrenadantes y los Usados celulares se analizan respecto a la presencia de IL-1Ra, TNF-a, IL-1b, IL-6 e IL-8. Los perfiles de concentración de citocina generados para el mAb se comparan con los perfiles producidos por un control negativo de IgG de humano y un control de LPS o PHA positivo. El perfil de citocina presentado por el mAb proveniente tanto de los sobrenadantes celulares como de los Usados celulares es comparable con IgG de humano de control. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal no interactúa con células sanguíneas humanas para liberar espontáneamente citocinas inflamatorias.
Los estudios de liberación de citocina para una DVD-lg son complejos debido a los cuatro o más sitios de unión, dos de cada uno por cada antígeno. Brevemente, los estudios de liberación de citocina como se describen en la presente solicitud, miden el efecto de la molécula de DVD-lg completa sobre sangre entera u otros sistemas celulares, pero puede resolver cuál porción de la molécula ocasiona la liberación de citocina. Una vez que se detecta la liberación de citocina, se tiene que determinar la pureza de la preparación de DVD-lg, debido a que algunos componentes celulares que se co-purifican pueden ocasionar por sí mismos la liberación de citocina. Si la pureza no es el tema, podría ser necesario utilizar fragmentación de DVD-lg (incluyendo pero sin limitarse a remoción de la porción Fe, separación de los sitios de unión, etc.), mutagénesis de sitio de unión u otros métodos para someter a desconvolución cualesquiera observaciones. Es fácilmente evidente que esta tarea compleja se simplifica en gran medida si los dos anticuerpos progenitores se seleccionan respecto a falta de liberación de citocina antes de que se combinen como una DVD-lg. 1.B.13: Reactividad cruzada con otras especies para estudios toxicológicos En una modalidad, los anticuerpos individuales se seleccionan con suficiente reactividad cruzada hacia la especie Tox apropiada, por ejemplo, mono cynomolgus. Los anticuerpos progenitores necesitan unirs'e al objetivo de especie ortóloga (es decir, mono cynomolgus) y provocar la respuesta apropiada (modulación, neutralización, activación). En una modalidad, la reactividad cruzada (afinidad/potencia) hacia el objetivo de especie ortóloga debe estar dentro de 10 veces la del objetivo humano. En la práctica, los anticuerpos progenitores se evalúan para especies múltiples, incluyendo ratón, rata, pero, mono (y otros primates no humanos), así como para especies de modelo de enfermedad (es decir ovejas para modelo de asma). La reactividad cruzada aceptable hacia la especie Tox de los anticuerpos monoclonales progenitores permite estudios toxicológicos futuros de la DVD-lg en la misma especie. Por esta razón, los dos anticuerpos monoclonales progenitores deben tener reactividad cruzada aceptable para una especie Tox común permitiendo por lo tanto estudios de toxicología de DVD-lg en la misma especie.
Los mAbs progenitores se seleccionan a partir de varios mAbs que se puedan unir a objetivos específicos y que sean bien conocidos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a anticuerpo anti-TNF (patente E.U.A. No. 6,258,562), anticuerpo anti-PGE2 de ratón o humanizado (Solicitudes E.U.A. Nos. de serie 61/134,264 y 61/197,258 y Caso de apoderado No. 9263. US.01, presentadas con la presente, anticuerpo anti-IL-12 y/o anti-IL-12p40 (patente E.U.A. No. 6,914,128); anticuerpo anti-IL-18 (US 2005/0147610 A1), anti-C5, anti-CBL, anti-CD147, anti-gp120, anti-VLA-4, anti-CD11a, anti-CD18, anti-VEGF, anti-CD40L, anti CD-40 (por ejemplo, véase WO2007124299) anti-ld, anti-ICAM-1 , anti-CXCL13, anti-CD2, anti-EGFR, anti-TGF-beta 2, anti-HGF, anti-cMet, anti DLL-4, anti-NPR1, anti-PLGF, anti-E-selectina, anti-Fact VII, anti-Her2/neu, anti-F gp, anti-CD1 /18, anti-CD14, anti-ICAM-3, anti-RON, anti CD-19, anti-CD80 (por ejemplo, véase WO2003039486, anti-CD4, anti-CD3, anti-CD23, anti-beta2-integrina, anti-alfa4beta7, anti-CD52, anti-HLA DR, anti-CD22 (por ejemplo, véase patente E.U.A. No. 5,789,554), anti-CD20, anti-MIF, anti-CD64 (FcR), anti-TCR alfa beta, anti-CD2, anti-Hep B, anti-CA 125, anti-EpCAM, anti- gp120, anti-C V, anti-gpl Ibl I la, anti-lgE, anti-CD25, anti-CD33, anti-HLA, ant¡-IGF1,2, anti IGFR, anti-VNRintegrina, anti-IL-1 alfa, anti-IL-1beta, anti-receptor de IL-1, anti-receptor de IL-2, anti-IL-4, antireceptor de IL-4, anti-l L5, anti-receptor de IL-5, anti-IL-6, anti-IL-6R, RANKL, NGF, DKK, alfaVbeta3, IL-17A, anti-IL-8, anti-IL-9, anti-IL-13, anti-receptor de IL-13, anti-IL-17, y anti-IL-23; IL-23p19; (véase Presta LG. 2005 Selection, design, and engineering of therapeutic antibodies J Allergy Clin Immunol. 116:731-6 y http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/antibodies.html).
Los mAbs progenitores también se puede seleccionar a partir de varios anticuerpos terapéuticos aprobados para uso, en pruebas clínicas, o en desarrollo para uso clínico. Dichos anticuerpos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, rituximab (Rituxan®, IDEC/Genentech/Roche) (véase por ejemplo patente E.U.A. No. 5,736,137), un anticuerpo quimérico anti-CD20 aprobado para tratar linfoma de tipo No Hodgkin; HuMax-CD20, un anti-CD20 que actualmente está siendo desarrollado por Genmab, un anticuerpo anti-CD20 descrito en la patente E.U.A. No. 5,500,362, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel), any PRO70769 (PCT/US2003/040426, titulada "Immunoglobulin Variants and Uses Thereof), trastuzumab (Herceptin®, Genentech) (véase por ejemplo patente E.U.A. No. 5,677,171), un anticuerpo anti-Her2/neu humanizado aprobado para tratar cáncer de mama; pertuzumab (rhuMab-2C4, Omnitarg®), actualmente bajo desarrollo por Genentech; un anticuerpo anti-Her2 descrito en la patente E.U.A. No. 4,753,894; cetuximab (Erbitux®, Imclone) (patente E.U.A. No. 4,943,533; PCT WO 96/40210), un anticuerpo quimérico anti-EGFR en pruebas clínicas para una variedad de cánceres; ABX-EGF (patente E.U.A. No. 6,235,883), actualmente está siendo desarrollado por Abgenix-lmmunex-Amgen; HuMax-EGFr (E.U.A. No. de Serie 10/172,317), actualmente está siendo desarrollado por Genmab; 425, EMD55900, EMD62000, y EMD72000 (Merck KGaA) (patente E.U.A. No. 5,558,864; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62 (Instituto para Investigación del Cáncer) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3):129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cáncer. 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cáncer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cáncer, 105(2):273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canadá y Centro de Inmunología Molecular, Cuba (patente E.U.A. No. 5,891,996; patente E.U.A. No. 6,506, 883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology , 3(1 ):71 -81 ); mAb-806 (Instituto Ludwig para Investigación del Cáncer, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Nati Acad Sci USA. 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, Instituto Nacional del Cáncer) (PCT WO 0162931A2); y SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138); alemtuzumab (Campath®, Millenium), un mAb humanizado actualmente aprobado para tratamiento de leucemia linfocítica crónica de célula B; muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®), un anticuerpo anti-CD3 desarrollado por Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), un anticuerpo anti-CD20 desarrollado por IDEC/Schering AG, gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®), un anticuerpo anti-CD33 (proteína p67) desarrollado por Celltech/Wyeth, alefacept (Amevive®), una fusión de Fe anti-LFA-3 desarrollada por Biogen), abciximab (ReoPro®), desarrollado por Centocor/Lilly, basiliximab (Simulect®), desarrollado por Novartis, palivizumab (Synagis®), desarrollado por Medimmune, infliximab (Remicade®), un anticuerpo anti-TNF alfa desarrollado por Centocor, adalimumab (Humira®), un anticuerpo anti-TNF alfa desarrollado por Abbott, Humicade®, un anticuerpo anti-TNF alfa desarrollado por Celltech, golimumab (CNTO-148), un anticuerpo de TNF completamente humano desarrollado por Centocor, etanercept (Enbrel®), una fusión de Fe de receptor de TNF p75 desarrollada por Immunex/Amgen, lenercept, una fusión de Fe de receptor p55TNF previamente desarrollada por Roche, ABX-CBL, un anticuerpo anti-CD147 que está siendo desarrollado por Abgenix, ABX-IL8, un anticuerpo anti-l L8 que está siendo desarrollado por Abgenix, ABX-MA1, un anticuerpo anti-MUC18 que está siendo desarrollado por Abgenix, Pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFG1 ), un anti-MUC1 bajo desarrollo por Antisoma, Therex (R1550), un anticuerpo anti-MUC1 que está siendo desarrollado por Antisoma, AngioMab (AS 1405), que está siendo desarrollado por Antisoma, HuBC-1, que está siendo desarrollado por Antisoma, Tioplatin (AS 1407) que está siendo desarrollado por Antisoma, Antegren® (natalizumab), un anticuerpo anti-alfa-4-beta-1 (VLA-4) y alfa-4-beta-7 que está siendo desarrollado por Biogen, mAb VLA-1, un anticuerpo anti-VLA-1 integrina que está siendo desarrollado por Biogen, mAb LTBR, un anticuerpo anti-receptor beta de linfotoxina (LTBR) que está siendo desarrollado por Biogen, CAT-152, un anticuerpo anti-TGF- 2 que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology, ABT 874 (J695), un anticuerpo anti-IL-12 p40 que está siendo desarrollado por Abbott, CAT-192, un anticuerpo anti-TGFpi que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology y Genzyme, CAT-213, un anticuerpo anti-Eotaxin1 que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology, LymphoStat-B® un anticuerpo anti-Blys que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology y Human Genome Sciences Inc., TRAIL-R1mAb, un anticuerpo anti-TRAIL-R1 que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology y Human Genome Sciences, Inc., Avastin® bevacizumab, rhuMAb-VEGF), un anticuerpo anti-VEGF que está siendo desarrollado por Genentech, un anticuerpo anti-familia del receptor HER que está siendo desarrollado por Genentech, Factor Anti-Tejido (ATF), un anticuerpo anti-Factor Tisular que está siendo desarrollado por Genentech, Xolair® (Omalizumab), un anticuerpo anti-lgE que está siendo desarrollado por Genentech, Raptiva® (Efalizumab), un anticuerpo ant¡-CD11a que está siendo desarrollado por Genentech y Xoma, Anticuerpo MLN-02 (anteriormente LDP-02), que está siendo desarrollado por Genentech y Millenium Pharmaceuticals, HuMax CD4, un anticuerpo anti-CD4 qu está siendo desarrollado por Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo anti-IL15 que está siendo desarrollado por Genmab y Amgen, HuMax-Inflam, que está siendo desarrollado por Genmab y Medarex, HuMax-Cancer, un anticuerpo anti-Heparanasa I que está siendo desarrollado por Genmab y Medarex y Oxford GcoSciences, HuMax-Linfoma, que está siendo desarrollado por Genmab y Amgen, HuMax-TAC, que está siendo desarrollado por Genmab, IDEC-131, y anticuerpo anti-CD40L que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (Clenoliximab), un anticuerpo anti-CD4 que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, un anticuerpo anti-CD80 que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-152, un anti-CD23 que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, anticuerpos anti-factor de migración de macrófagos (MIF) que están siendo desarrollados por IDEC Pharmaceuticals, BEC2, un anticuerpo anti-idiotípico que está siendo desarrollado por Imclone, IMC-1C11, un anticuerpo anti-KDR que está siendo desarrollado por Imclone, DC101, un anticuerpo anti-flk-1 que está siendo desarrollado por Imclone, anticuerpos anti-cadherina de VE que están siendo desarrollados por Imclone, CEA-Cide® (labetuzumab), un anticuerpo anti-antígeno carcinoembrionario (CEA) que está siendo desarrollado por Immunomedics, LymphoCide® (Epratuzumab), un anticuerpo anti-CD22 que está siendo desarrollado por Immunomedics, AFP-Cide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, MyelomaCide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, LkoCide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, ProstaCide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, MDX-010, un anticuerpo anti-CTLA4 que está siendo desarrollado por Medarex, MDX-060, un anticuerpo anti-CD30 que está siendo desarrollado por Medarex, MDX-070 que está siendo desarrollado por Medarex, MDX-018 que está siendo desarrollado por Medarex, Osidem® (IDM-1), y anticuerpo anti-Her2 que está siendo desarrollado por Medarex e Immuno-Designed Molecules, HuMax®-CD4, un anticuerpo anti-CD4 que está siendo desarrollado por Medarex y Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo anti-IL15 que está siendo desarrollado por Medarex y Genmab, CNTO 148, un anticuerpo anti-TNFa que está siendo desarrollado por Medarex y Centocor/J&J, CNTO 1275, un anticuerpo anti-citocina que está siendo desarrollado por Centocor/J&J, MOR101 y MOR102, anticuerpos anti-molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) (CD54) que están siendo desarrollados por MorphoSys, MOR201, un anticuerpo anti-receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblasto (FGFR-3) que está siendo desarrollado por MorphoSys, Nuvion® (visilizumab), un anticuerpo anti-CD3 que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, HuZAF®, un anticuerpo anti-interferón gamma que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, anti-integrina a 5ß1, que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, anti-IL-12, que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, ING-1, un anticuerpo anti-Ep-CAM que está siendo desarrollado por Xoma, Xolair® (Omalizumab) un anticuerpo anti-lgE humanizado desarrollado por Genentech y Novartis, y MLN01, un anticuerpo anti- integrina Beta2 que está siendo desarrollado por Xoma. En otra modalidad, los terapéuticos incluyen KRN330 (Kirin); anticuerpo huA33 (A33, Instituto Ludwig para Investigación del Cáncer); CNTO 95 (alfa V integrinas, Centocor); MEDI-522 (integrina alfa \/ß3, Medimmune); volociximab (integrina alfa ?ß1, Biogen/PDL); mAb humano 216 (epítope glucosilado de célula B, NCI); BiTE MT 103 (CD 19 x CD3 biespecífico, Medimmune); 4G7xH22 (célulaBxFcgammaRI biespecífico, Medarex/Merck KGa); rM28 (CD28 x MAPG biespecífico, patente E.U.A. No. EP 1444268); MDX447 (EMD 82633) (CD64 x EGFR biespecífico, Medarex); Catumaxomab (removab) (EpCAM x anti-CD3 biespecífico, Trion/Fres); Ertumaxomab (HER2/CD3 biespecífico, Fresenius Biotech); oregovomab (OvaRex) (CA-125, ViRexx); Rencarex® (WX G250) (anhidrasa carbónica IX, Wilex); CNTO 888 (CCL2, Centocor); TRC105 (CD105 (endoglin), Tracon); BMS-663513 (agonista de CD137, Brystol Myers Squibb); MDX-1342 (CD19, Medarex); Siplizumab (MEDI-507) (CD2, Medimmune); Ofatumumab (Humax-CD20) (CD20, Genmab); Rituximab (Rituxan) (CD20, Genentech); veltuzumab (hA20) (CD20, Immunomedics); Epratuzumab (CD22, Amgen); lumiliximab (IDEC 152) (CD23, Biogen); muromonab-CD3 (CD3, Ortho); HuM291 (receptor fe CD3, PDL Biopharma); HeFi- , CD30, NCI); MDX-060 (CD30, Medarex); MDX-1401 (CD30, Medarex); SGN-30 (CD30, Seattle Genentics); SGN-33 (Lintuzumab) (CD33, Seattle Genentics); Zanolimumab (HuMax-CD4) (CD4, Genmab); HCD 122 (CD40, Novartis); SGN-40 (CD40, Seattle Genentics); Campathlh (Alemtuzumab) (CD52, Genzyme); MDX-1411 (CD70, Medarex); hl_L1 (EPB-1) (CD74.38, Immunomedics); Galiximab (IDEC-144) (CD80, Biogen); MT293 (TRC093/D93) (colágena cortada, Tracon); HuLuc63 (CS1, PDL Pharma); ipilimumab ( DX-010) (CTLA4, Brystol Myers Squibb); Tremelimumab (Ticilimumab, CP-675,2) (CTLA4, Pfizer); HGS-ETR1 (Mapatumumab) (DR4 agonista de TRAIL-R1, Human Genome Science/Glaxo Smith Kline); AMG-655 (DR5, Amgen); Apomab (DR5, Genentech); CS-1008 (DR5, Daiichi Sankyo); HGS-ETR2 (lexatumumab) (DR5 agonista de TRAIL-R2, HGS); Cetuximab (Erbitux) (EGFR, Imclone); IMC-11F8, (EGFR, Imclone); Nimotuzumab (EGFR, YM Bio); Panitumumab (Vectabix) (EGFR, Amgen); Zalutumumab (HuMaxEGFr) (EGFR, Genmab); CDX-110 (EGFRvlll, AVANT Immunotherapeutics); adecatumumab (MT201) (Epcam, Merck); edrecolomab (Panorex, 17-1A) (Epcam, Glaxo/Centocor); MORAb-003 (receptor a de folato, Morphotech); KW-2871 (gangliósido GD3, Kyowa); ORAb-009 (GP-9, Morphotech); CDX-1307 (MDX-1307) (hCGb, Celldex); Trastuzumab (Herceptin) (HER2, Celldex); Pertuzumab (rhuMAb 2C4) (HER2 (DI), Genentech); apolizumab (HLA-cadena beta de DR, PDL Pharma); AMG-479 (IGF-1R, Amgen); anti-IGF-1R R1507 (IGF1-R, Roche); CP 751871 (IGF1-R, Pfizer); IMC-A12 (IGF1-R, Imclone); BIIB022 (IGF-1R, Biogen); Mik-beta-1 (IL-2Rb (CD122), Hoffman LaRoche); CNTO 328 (IL6, Centocor); Anti-KIR (1-7F9) (receptor de célula asesina tipo Ig (KIR), Novo); Hu3S193 (Lewis (y), Wyeth, Instituto Ludwig para Investigación del Cáncer); hCBE-11 (LT&R, Biogen); HuHMFG 1 (MUC1, Antisoma/NCI); RAV12 (epítope de carbohidrato N-ligado, Raven); CAL (proteína relacionada con la hormona paratiroidea (???-rP), Universidad de California); CT-011 (PD1, CureTech); MDX-1106 (ono-4538) (PD1 , Medarex/Ono); MAb CT-011 (PD1, Curetech); IMC-3G3 (PDGFRa, Imclone); bavituximab (fosfatidilserina, Peregrine); huJ591 (PSMA, Fundación Cornell para la Investigación); muJ591 (PSMA, Fundación Cornell para la Investigación); GC1008 (inhibidor (lgG4) de TGFb (pan), Genzyme); Infliximab (Remicade) (TNFa, Centocor); A27.15 (receptor de transferrina, Instituto Salk, INSERN WO 2005/111082); E2.3 (receptor de transferrina, Instituto Salk); Bevacizumab (Avastin) (VEGF, Genentech); HuMV833 (VEGF, Tsukuba Research Lab - WO/2000/034337, Universidad de Texas); IMC-18F1 (VEGFR1, Imclone); IMC-1121 (VEGFR2, Imclone).
C: Construcción de moléculas de DVD La molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual (DVD-lg™) está diseñada de tal manera que dos dominios variables de la cadena ligera (VL) diferentes provenientes de los dos anticuerpos monoclonales progenitores diferentes se ligan en tándem directamente o a través de un enlazador corto mediante técnicas de ADN recombinante, seguidos por el dominio constante de la cadena ligera. De manera similar, la cadena pesada comprende dos dominios variables de la cadena pesada (VH) diferentes ligados en tándem, seguidos por el dominio constante CH1 y la región Fe (figura 1A).
Los dominios variables se pueden obtener utilizando técnicas de ADN recombinante a partir de un anticuerpo progenitor generado mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente solicitud. En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de la cadena pesada o ligera de múrido. En otra modalidad, el dominio variable es un dominio de la cadena pesada o ligera variable humanizado o injertado con CDR. En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de la cadena pesada o ligera de humano.
En una modalidad, el primero y segundo dominios variables se ligan directamente uno al otro utilizando técnicas de ADN recombinante. En otra modalidad, los dominios variables se ligan a través de una secuencia enlazadora. En una modalidad, se ligan dos dominios variables. También se pueden ligar tres o más dominios variables directamente o a través de una secuencia enlazadora. Los dominios variables se pueden unir al mismo antígeno o se pueden unir a antígenos diferentes. Las moléculas de DVD de la invención pueden incluir un dominio variable de ¡nmunoglobulina y un dominio variable no proveniente de ¡nmunoglobulina tal como el dominio de unión a ligando de un receptor, dominio activo de una enzima. Las moléculas de DVD también pueden comprender 2 o más dominios no provenientes de ¡nmunoglobulina.
La secuencia enlazadora puede ser un aminoácido individual o una secuencia de polipéptido. En una modalidad, las secuencias enlazadoras se seleccionan a partir del grupo que consiste de AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG(SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO: 9); SAKTTP KLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); y GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26). La elección de secuencias enlazadoras se basa en el análisis de estructura de cristal de varias moléculas de Fab. Existe un enlazamiento flexible natural entre el dominio variable y el dominio constante CH1/CL en la estructura molecular de Fab o del anticuerpo. Este enlazamiento natural comprende aproximadamente 10-12 residuos de aminoácido, de los cuales 4-6 residuos son contribuidos por el extremo C-terminal del dominio V y 4-6 residuos provienen del extremo C-terminal del dominio CL/CH1. Las DVD-lgs de la invención se generan utilizando 5-6 residuos de aminoácido N-terminales, u 11-12 residuos de aminoácido, de CL o CH1 como enlazador en la cadena ligera y la cadena pesada de DVD-lg, respectivamente. Los residuos N-terminales de los dominios CL o CH1, particularmente los primeros 5-6 residuos de aminoácido, adoptan una conformación de asa sin estructuras secundarias fuertes, por lo tanto pueden actuar como enlazadores flexibles entre los dos dominios variables. Los residuos N-terminales de CL o CH1 son extensión natural de los dominios variables, ya que éstos son parte de las secuencias de Ig, por lo tanto reducen al mínimo en grado elevado cualquier inmunogenicidad que potencialmente surja de los enlazadores y las uniones.
Otras secuencias enlazadoras pueden incluir cualquier secuencia de cualquier longitud del dominio CL/CH1 pero no todos los residuos del dominio CL/CH1; por ejemplo los primeros 5-12 residuos de aminoácido de los dominios CL/CH1; los enlazadores de la cadena ligera pueden provenir de CK O CX; y los enlazadores de la cadena pesada se pueden obtener a partir de CH1 de cualesquiera isotipos, incluyendo Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, Cal, Ca2, C5, Ct, y ?µ. Las secuencias enlazadoras también se pueden obtener a partir de otras proteínas tales como proteínas tipo Ig, (por ejemplo, TCR, FcR, KIR); secuencias basadas en G/S (por ejemplo las repeticiones de G4S; SEQ ID NO: 27); secuencias derivadas de la región de gozne; y otras secuencias naturales provenientes de otras proteínas.
En una modalidad un dominio constante se liga a los dos dominios variables ligados utilizando técnicas de ADN recombinante. En una modalidad, la secuencia que comprende los dominios variables de la cadena pesada ligados se liga a un dominio constante de la cadena pesada y la secuencia que comprende los dominios variables de la cadena ligera ligados se liga a un dominio constante de la cadena ligera. En una modalidad, los dominios constantes son el dominio constante de la cadena pesada de humano y el dominio constante de la cadena ligera de humano respectivamente. En una modalidad, la cadena pesada de DVD se liga también a una región Fe; la región Fe puede ser una región Fe de secuencia original, o una región Fe de variante. En otra modalidad, la región Fe es una región Fe de humano. En otra modalidad, la región Fe incluye la región Fe de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, o IgD.
En otra modalidad dos polipéptidos de DVD de la cadena pesada y dos polipéptidos de DVD de la cadena ligera se combinan para formar una molécula de DVD-lg. La tabla 2 lista las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de anticuerpos de ejemplo para objetivos útiles para tratar enfermedad, por ejemplo, para tratar cáncer. En una modalidad, la invención provee un DVD que comprende por lo menos dos de las regiones de VH y/o VL listadas en la tabla 2, en cualquier orientación. El ejemplo 3 provee DVD-lgs dirigidas a las regiones VH y VL listadas en la tabla 2. El ejemplo 2 provee regiones de VH y VL para DVD-lgs dirigidas a TNF y PGE2 (véase tablas 5-8).
TABLA 2 Lista de secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de anticuerpos para generar DVD-lgs secuencia SEQ ID Abt Región de NO Id Unico la proteína 123456789012345678901234567890123456 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNW 28 AB014VH VH VEGF VRQAPG KG LEWVGWINTYTG EPTYAAD F KRRFTFS L DTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHW YFDVWGQGTLVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWY 29 AB014VL VL VEGF QQ PGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHW 30 AB017VH VH TNF VRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISR DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSL DYWGQGTLVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWY 31 AB017VL VL TNF QQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKR QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNW 32 AB020VH VH NGF IRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKD TSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYF DYWGQGTLVTVSS DIQ TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWY 33 AB020VL VL NGF QQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFT FTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEI R EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNW 34 AB029VH VH IL-17A VRQAPGKGLEWVAAINQDGSEKYYVGSVKGRFTISR DNAKNSLYLQ NSLRVE DTAVYYC VR D YYD I LTD YY IHYWYFDLWGRGTLVTVSS EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAW 35 AB029VL VL IL-17A YQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDF TLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPCTFGQGTRLEIK R QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSVYGMNW 36 AB032VH VH IL-1 b VRQAPG GLEWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVYYCARDLRTGPFDYW GQGTLVTVSS ' EIVLTQSPDFQSVTP EKVTITCRASQSIGSSLHWY 37 AB032VL VL IL-1b QQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFT LTINSLEAEDAAAYYCHQSSSLPFTFGPGTKVDIKR secuencia SEQ ID Abt Región de NO Id Unico la proteína 123456789012345678901234567890 23456 QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTNGMGV 38 AB040VH SWIRQPSGKGLEWLAHIYWDEDKRYNPSLKSRLTIS VH IL-6 KDTSNNQVFLKITNVDTADTATYYCARRRIIYDVED YFDYWGQGTTLTVSS QIVLIQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQ 39 AB040VL VL IL-6 QKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSL TISRMEAEDAATYYCQQWSGYPYTFGGGTKLEIKR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYG SW 40 AB043VH VH Abeta VRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISR (sec. 1) DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDY WGQGTLVTVSS DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDGKT 41 AB043VL VL Abeta YLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS (sec. 1) GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTK VEIKR EVKLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW 42 AB044VH VH Abeta VRQAPGKGLEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFTISRD (sec. 2) NVRNTLYLQ NSLRAEDTAVYYCTRGRSNSYAMDYW GQGTSVTVSS DVLVTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTQTLVHRNGDT 43 AB044VL VL Abeta YLEWYLQKPGQSPQSLIY VSNRFSGVPDRFSGSGS (sec. 2) GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTK LEIKR VH Abeta EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSW 44 AB045VH VRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISR (sec. 3) DNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTLV TVSS VL Abeta DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDT 45 AB045VL YLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS (sec. 3) GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTK VEIKR EVQLVQSGTEVKKPGESLKISCKGSGYTVTSYWIGW 46 AB046VH VH IL-18 VRQMPGKGLEWMGFIYPGDSETRYSPTFQGQVTISA DKSFNTAFLQWSSLKASDTA YYCARVGSGWYPYTF DIWGQGTMVTVSS E I VMTQSPATLS VS PG E R ATLSC RAS ES I SS N LAWY 47 AB046VL VL IL-18 QQKPGQAPRLFIYTASTRATDIPARFSGSGSGTEFT LTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPSITFGQGTRLEIK R EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLGW 48 AB048VH VH PEG2 VRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTT DTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQ GTLVTVSS DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNT 49 AB048VL VL PEG2 YLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTK VEIKR secuencia SEQ ID Abt Región de NO Id Unico la proteína 123456789012345678901234567890123456 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKVSGYFFTTYWIGW 50 AB049VH VRQMPGKGLEY GIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISA VH IL-15 DKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGNWNCFDYW GQGTLVTVSS 51 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAW AB049VL VL IL-15 YQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRFSGSGSGTDF TLTISRLEPEDFAVYYCQRYGSSHTFGQGT LEISR EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCQSFGYI Fl DHTI HW 52 AB052VH MRQMPGQGLEWMGAISPRHDITKYNEMFRGQVTISA VH S1 P DKSSSTAYLQWSSLKASDTAMYFCARGGFYGSTIWF DFWGQGTMVTVSS ETTVTQSPSFLSASVGDRVTITCITTTDIDDDMNWF 53 AB052VL VL S1 P QQEPGKAPKLUSEGNILRPGVPSRFSSSGYGTDFT LTISKLQPEDFATYYCLQSDNLPFTFGQGTKLEIKR EVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWS 54 AB054VH WVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNPSLKSRVTMLR VH IL-6R DTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTA DY WGQGSLVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWY 55 AB054VL VL IL-6R QQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFT FTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKR QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIR 56 AB003VH VH EGFR QSPG GLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQF (1a sec) SLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGT VTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKP 57 AB003VL VL EGFR GKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGTDFTFTISSLQP (1a sec) EDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKR QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQS 58 AB033VH VH EGFR PGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNS SQVFF (2a sec) K NSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRT 59 AB033VL VL EGFR NGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVES (2a sec) EDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSSYAMNWVRQA 60 AB011VH 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123456789012345678901234567890 23456 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLGW 74 VH VRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTT Hu2B5.7 DTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQ GTLVTVSS DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNT 75 VL YLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS Hu2B5.7 GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTK VEIKR EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLGW 76 VH VRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTT Hu2B5.8 DTSTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQ GTLVTVSS DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNT 77 VL YLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS Hu2B5.8 GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTK VEIKR EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLGW 78 VH VRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTMTT Hu2B5.9 DTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQ GTLVTVSS DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNT 79 VL YLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS Hu2B5.9 GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTK VEIKR La descripción detallada de molécu las de DVD-lg específicas q ue se pueden un ir a objetivos específicos, y los métodos para elabora rlas , se proveen en la sección de Ejemplos más adela nte .
D: Prod ucción de proteínas de DVD Las proteínas de u nión de la presente invención se pueden produci r mediante cualqu iera de u n número de técn icas conocidas en el campo. Por ejemplo , expresión a partir de células hospederas, en la cual el vector o vectores de expresió n q ue codifica(n) para las cadenas pesada de DVD y ligera de DVD se transfecta(n) en una célula hospedera mediante técnicas estándar. Las diversas formas del término "transfección" pretenden abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedera procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque es posible expresar las proteínas de DVD de la invención en células hospederas ya sea procariotas o eucariotas, las proteínas de DVD son expresadas en células eucariotas, por ejemplo, células hospederas de mamífero, debido a que dichas células eucariotas (y en particular las células de mamífero) tienen mayor probabilidad que las células procariotas de ensamblar y secretar una proteína de DVD plegada adecuadamente e inmunológicamente activa.
Las células hospederas de mamífero de ejemplo para expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr", descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable para DHFR, por ejemplo, como se describe en R.J. Kaufman y P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621). células de mieloma NS0, células COS, células SP2 y células PER.C6. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican para las proteínas de DVD se introducen en células hospederas de mamífero, las proteínas de DVD se producen cultivando las células hospederas durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión de las proteínas de DVD en las células hospederas o la secreción de las proteínas de DVD hacia el medio de cultivo en el cual se cultivan las células hospederas. Las proteínas de DVD se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos estándar de purificación de proteína.
En un sistema de ejemplo para la expresión recombinante de proteínas de DVD de la invención, un vector de expresión recombinante que codifica tanto para la cadena pesada de DVD como para la cadena ligera de DVD se introduce en células CHO dhfr' mediante transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes para las cadenas pesada y ligera de DVD están cada uno ligados en forma operativa a elementos reguladores de incrementador de CMV/prom tor de AdMLP para controlar niveles elevados de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen DHFR, el cual permite la selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector utilizando selección/amplificación con metotrexato. Las células hospederas transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera de DVD y la proteína de DVD intacta se recupera del medio de cultivo. Se utilizan técnicas de biología molecular estándar para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospederas, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospederas y recuperar la proteína de DVD a partir del medio de cultivo. Incluso la invención también provee un método para sintetizar una proteína de DVD de la invención cultivando una célula hospedera de la invención en un medio de cultivo apropiado hasta que se sintetice una proteína de DVD de la invención. El método también puede comprender aislar la proteína de DVD a partir del medio de cultivo.
Una característica importante de la DVD-lg es que ésta se puede producir y purificar en una manera similar a la de un anticuerpo convencional. La producción de DVD-lg da como resultado un producto principal individual, homogéneo con la actividad dual-específica deseada, sin ninguna modificación de secuencia de la región constante o modificaciones químicas de ningún tipo. Otros métodos previamente descritos para generar proteínas de unión de longitud completa "biespecíficas", "multiespecíficas", y "multi-específicas multivalentes" no conducen a un producto primario individual sino en cambio conducen a la producción intracelular o secretada de una mezcla de proteínas de unión de longitud completa, multivalentes, multiespecíficas, mono-específicas, inactivas, ensambladas, y a proteínas de unión de longitud completa multivalentes con combinación de sitios de unión diferentes. Como un ejemplo, tomando como base el diseño descrito por Miller y Presta (publicación del PCT WO2001/077342(A1 ), existen 16 posibles combinaciones de las cadenas pesada y ligera. Por consiguiente, solamente 6.25% de la proteína probablemente esté en la forma activa deseada, y no como un producto principal individual o producto primario individual en comparación con las otras 15 posibles combinaciones. La separación de las formas completamente activas, deseadas de la proteína a partir de las formas inactivas y parcialmente activas de la proteína utilizando técnicas de cromatografía estándar, típicamente utilizadas en la fabricación a gran escala, todavía está por demostrar.
De manera sorpresiva, el diseño de las "proteínas de unión de longitud completa multivalentes dual-específicas" de la presente invención conduce a una cadena ligera de dominio variable dual y a una cadena pesada de dominio variable dual que se ensamblan principalmente hasta las "proteínas de unión de longitud completa multivalentes dual-específica".
Por lo menos 50%, por lo menos 75% y por lo menos 90% de las moléculas de inmunoglobulina de dominio variable dual ensambladas, y expresadas son la proteína tetravalente dual-específica deseada. Este aspecto de la invención en particular incrementa la utilidad comercial de la invención. Por lo tanto, la presente invención incluye un método para expresar una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual en una célula individual que conduce a un producto primario individual de una "proteína de unión de longitud completa tetravalente dual-específica".
La presente invención provee métodos para expresar una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual en una célula individual que conducen a un "producto primario" de una "proteína de unión de longitud completa tetravalente dual-específica", en los cuales el "producto primario" es más del 50% de toda lá proteína ensamblada, que comprende una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual.
La presente invención provee métodos para expresar una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual en una célula individual que conducen a un "producto primario" individual de una "proteína de unión de longitud completa tetravalente dual-específica", en los cuales el "producto primario" es más de 75% de toda la proteína ensamblada, que comprende una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual.
La presente invención provee métodos para expresar una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual en una célula individual que conducen a un "producto primario" individual de una "proteína de unión de longitud completa tetravalente dual-específica", en los cuales el "producto primario" es más de 90% de toda la proteína ensamblada, que comprende una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual.
II. Proteínas de unión de DVD convertidas en derivados Una modalidad provee una proteína de unión marcada en la cual la proteína de unión de la invención se convierte en derivado o se liga a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Por ejemplo, una proteína de unión marcada de la invención se puede convertir en derivado ligando funcionalmente una proteína de unión de la invención (mediante copulación química, fusión genética, asociación no covalente u otro) a una o más de otras entidades moleculares., tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que pueda mediar la asociación de la proteína de unión con otra molécula (tal como una región central de estreptavidina o una marca de polihistidina).
Los agentes detectables útiles con los cuales se puede convertir en derivado una proteína de unión de la invención incluyen compuestos fluorescentes. Los ejemplos de agentes detectables fluorescentes incluyen fluoresceína, isotiocinato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamin-1 -naftalensulfonilo, ficoeritrina y similares. Una proteína de unión también se puede convertir en derivado con enzimas detectables, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, glucosa oxidasa y similares. Cuando una proteína de unión se convierte en derivado con una enzima detectable, ésta se detecta mediante adición de reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando el agente detectable peroxidasa de rábano está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción con color, el cual es detectable, una proteína de unión también se puede convertir en derivado con biotina, y se detecta a través de medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina.
Otra modalidad de la invención provee una proteína de unión cristalizada y formulaciones y composiciones que comprenden dichos cristales. En una modalidad la proteína de unión cristalizada tiene un tiempo de vida media mayor in vivo que la contraparte soluble de la proteína de unión. En otra modalidad la proteína de unión retiene la actividad biológica después de la cristalización.
La proteína de unión cristalizada de la invención se puede producir de conformidad con métodos conocidos en la técnica y como se describe en el documento WO 02072636.
Otra modalidad de la invención provee una proteína de unión glucosilada en la cual el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende uno o más residuos de carbohidrato. La producción creciente de proteína in vivo puede experimentar procesamiento adicional, conocido como modificación posterior a la traducción. En particular, se pueden agregar residuos de azúcar (glucosilo) enzimáticamente, un procedimiento conocido como glucosilación. Las proteínas resultantes que tienen cadenas laterales de oligosacárido ligadas covalentemente son conocidas como proteínas glucosiladas o glucoproteínas. Los anticuerpos son glucoproteínas con uno o más residuos de carbohidrato en el dominio Fe, así como en el dominio variable. Los residuos de carbohidrato en el dominio Fe tienen un efecto importante sobre la función efectora del dominio Fe, con efecto mínimo sobre la unión a antígeno o el tiempo de vida media del anticuerpo (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16). En contraste, la glucosilación del dominio variable puede tener un efecto sobre la actividad de unión a antígeno del anticuerpo. La glucosilación en el dominio variable puede tener un efecto negativo sobre la afinidad de unión del anticuerpo, probablemente debido a impedimento estérico (Co, .S., et al, Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367), o dar como resultado una afinidad incrementada por el antígeno (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717-2723).
Un aspecto de la presente invención está dirigido a la generación de mutantes de sitio de glucosilación en los cuales el sitio de glucosilación O-ligado o N-ligado de la proteína de unión ha sido mutado. Un experto en la técnica puede generar dichos mutantes utilizando tecnologías estándar bien conocidas. Los mutantes de sitio de glucosilación que retienen la actividad biológica pero que tienen actividad de unión incrementada a disminuida son otro objetivo de la presente invención.
Incluso en otra modalidad, se modifica glucosilación del anticuerpo o porción de unión a antígeno de la invención. Por ejemplo, se puede elaborar un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilación). La glucosilación se puede alterar, por ejemplo, para incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dichas modificaciones con carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden efectuar una o más sustituciones de aminoácido que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de la región variable para de esta manera eliminar la glucosilación en dicho sitio. Dicha aglucosilación puede incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dicha estrategia se describe con mayor detalle en la publicación del PCT WO20030 6466A2, y en las patentes E.U.A. Nos. 5,714,350 y 6,350,861.
Adicionalmente o de manera alternativa, se puede elaborar una proteína de unión modificada de la invención que tenga un tipo alterado de glucosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo (véase Kanda, Yutaka et al, Journal of Biotechnology (2007), 130(3), 300-310.) o un anticuerpo que tenga estructuras de GIcNAc bisectrices incrementadas. Dichos patrones de glucosilación alterada han demostrado incrementar la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de carbohidrato se pueden lograr, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedera con maquinaria de glucosilación alterada. Las células con maquinaria de glucosilación alterada han sido descritas en la técnica y se pueden utilizar como células hospederas en las cuales se expresan los anticuerpos recombinantes de la invención para de esta manera producir un anticuerpo con glucosilación alterada. Véase, por ejemplo, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-1, así como, patente europea No: EP 1,176,195; publicaciones del PCT WO 03/035835; WO 99/5434280.
La glucosilación de la proteína depende de la secuencia de aminoácido de la proteína de interés, así como de la célula hospedera en la cual se expresa la proteína. Organismos diferentes pueden producir diferentes enzimas de glucosilación (por ejemplo, glucosiltransferasas y glucosidasas), y tienen diferentes substratos (azúcares de nucleótido) disponibles. Debido a dichos factores, el patrón de glucosilación de la proteína, y la composición de los residuos de glucosilo, pueden diferir en función del sistema hospedero en el cual se exprese la proteína particular. Los residuos de glucosilo útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a , glucosa, galactosa , mañosa, fucosa , n-acetílglucosamina y ácido siálico. En una modalidad , la proteína de unión glucosilada comprende residuos glucosilo tales que el patrón de glucosilación es humano.
Es bien sabido por los expertos en la técnica que la glucosilación de proteína diferente puede dar como resultado características de proteína diferentes. Por ejemplo, la eficacia de una proteína terapéutica que se produce en un microorganismo hospedero, tal como levadura, y q ue se glucosila utilizando la ruta endógena de la levadura pueden ser reducida en comparación con la de la misma proteína expresada en una célula de mamífero, tal como una línea de células CHO. Dichas glucoproteínas también pueden ser inmunógenas en los humanos y mostrar tiempo de vida reducido in vivo después de la administración . Los receptores específicos en humanos y otros animales pueden reconocer residuos glucosilo específicos y promover la depuración rápida de la proteína a partir del torrente sanguíneo. Otros efectos adversos pueden incluir cambios en el plegamiento de la proteína, solubilidad, susceptibilidad a proteasas, tráfico, transporte, distribución en compartimientos, secreción, reconocimiento por otras proteínas o factores, carácter antigénico, o carácter alergénico. Por consiguiente, un practicante puede elegir una proteína terapéutica con una composición y patrón de glucosilación específicos, por ejemplo composición y patrón de glucosilación idénticos, o por lo menos similares, a los producidos en células humanas o en células específicas de especie de animal objeto pretendido.
La expresión de proteína glucosiladas diferentes de las de una célula hospedera se puede lograr modificando genéticamente la célula hospedera para que exprese enzimas de glucosilación heterólogas. Utilizando técnicas conocidas en el campo, un practicante puede generar anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos que presenten glucosilación de proteína humana. Por ejemplo, se han modificado genéticamente cepas de levadura para que expresen enzimas de glucosilación normalmente no presentes de modo tal que las proteínas glucosiladas (glucoproteínas) que se producen en estas cepas de levadura exhiben glucosilación de proteína idéntica a la de las células animales, en especial células de humano (solicitudes de patente E.U.A. 20040018590 y 20020137134 y publicación del PCT WO2005100584 A2).
Además de las proteínas de unión , la presente invención también está dirigida a anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) específicos para d ichas proteínas de unión de la invención . U n anticuerpo anti-ld es un anticuerpo, se reconoce determinantes únicos generalmente asociados con la región de unión a antígeno de otro anticuerpo. El anti-ld se puede preparar inmunizando un animal con la proteína de unión o una región que contenga C DR de la misma. El animal inmunizado reconoce, y responde contra los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante y produce un anticuerpo anti-ld . Es fácilmente evidente que es más fácil generar anticuerpos anti-idiotípicos contra dichos dos o más anticuerpos progenitores incorporados en una molécula de DVD-lg ; y confirmar los estudios de unión utilizando métodos bien reconocidos en la técnica (por ejemplo, BIAcore, ELISA) para verificar que los anticuerpos anti-idiotípicos específicos para el idiotipo de cada anticuerpo progenitor también reconozcan el idiotipo (por ejemplo, sitio de unión a antígeno) en el contexto de la DVD-lg . Los anticuerpos anti-idiotípicos específicos para cada uno de dichos dos o más sitios de un ión a antígeno de una DVD-lg proveen reactivos ideales para medir las concentraciones de DVD-lg de una DVD-lg de humano en suero del paciente; se pueden establecer pruebas de concentración de DVD-lg utilizando un "Formato ELISA de prueba de emparedado" con un anticuerpo para una primera región de unión a antígeno aplicada como revestimiento sobre la fase sólida (por ejemplo, chip BIAcore, placa de ELISA etc.), enjuague con solución amortiguadora para enjuague, incubación con la muestra de suero, otro paso de enjuague y finalmente incubación con otro anticuerpo anti-idiotípico para el otro sitio de unión a antígeno, por sí mismo marcado con una enzima para cuantificación de la reacción de unión. En una modalidad, para una DVD-lg con más de dos sitios de unión diferentes, ios anticuerpos anti-idiotípicos para los dos sitios de unión más externos para los dos sitios de unión más externos (más alejados y cercanos a la región constante) no sólo ayudan a determinar la concentración de DVD-lg en suero de humano sino también documentan la integridad de la molécula in vivo. Cada anticuerpo anti-ld también se puede utilizar como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune incluso en otro animal, para producir un denominado anticuerpo anti-anti-ld.
Además, el experto en la técnica apreciará que una proteína de interés se puede expresar utilizando una genoteca de células hospederas genéticamente diseñadas para que expresen varias enzimas de glucosilación, de modo tal que células hospederas miembros de la genoteca producen la proteína de interés con patrones de glucosilación variantes. Un practicante después puede seleccionar y aislar la proteína de interés con patrones de glucosilación novedosos particulares. En una modalidad, la proteína que tiene un patrón de glucosilación novedoso particularmente seleccionado exhibe propiedades biológicas mejoradas o alteradas.
III. Usos de DVD-lg Dada su capacidad para unirse a dos o más antígenos, las proteínas de unión de la invención se pueden utilizar para detectar los antígenos (por ejemplo, en una muestra biológica, tal como suero o plasma), utilizando un inmuno-ensayo convencional, tal como una prueba con inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica tisular. La DVD-lg se marca directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables apropiadas incluyen varias enzimas, grupos de prótesis, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas apropiadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupo de prótesis apropiados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes apropiados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de material radiactivo apropiado incluyen 3H, 14C, 35S, 90Y, "Te, 1 ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho, o 153Sm.
En una modalidad, las proteínas de unión de la invención pueden neutralizar la actividad de los antígenos tanto in vitro como in vivo. Por consiguiente, dichas DVD-lgs se pueden utilizar para inhibir la actividad del antígeno, por ejemplo, en un cultivo celular que contiene los antígenos, en individuos humanos o en otros individuos mamíferos que tienen los antígenos con los cuales una proteína de unión de la invención presenta reacción cruzada. En otra modalidad, la invención provee un método para reducir la actividad de antígeno en un individuo que padece de una enfermedad o trastorno en el cual la actividad del antígeno es perjudicial. Una proteína de unión de la invención se puede administrar a un individuo humano para propósitos terapéuticos.
Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "un trastorno en el cual la actividad de antígeno es perjudicial" tiene la intención de incluir enfermedades y otros trastornos en los cuales la presencia del antígeno en un individuo que padece del trastorno ha demostrado que es o se sospecha que puede ser la responsable de la fisiopatología del trastorno o es un factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el cual la actividad del antígeno es perjudicial es un trastorno en el cual se espera que la reducción de la actividad del antígeno alivie los síntomas y/o avance del trastorno. Dichos trastornos se pueden evidenciar, por ejemplo, mediante un incremento en la concentración del antígeno en un fluido biológico de un individuo que padece del trastorno (por ejemplo, un incremento en la concentración del antígeno en suero, plasma, líquido sinovial, etc. del individuo). Los ejemplos no limitativos de trastornos que se pueden tratar con las proteínas de unión de la invención incluyen los trastornos discutidos más adelante y en la sección perteneciente a composiciones farmacéuticas de los anticuerpos de la invención.
Las DVD-lgs de la invención se puede unir a un antígeno o a antígenos múltiples. Dichos antígenos incluyen, pero no se limitan a, los objetivos listados en las siguientes bases de datos. Estas bases de datos de objetivo incluyen dichos listados: Objetivos terapéuticos: (http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp); Citocinas y receptores de citocina: (http://www.cytokinewebfacts.com/, http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi, y http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medick umamoto-u.ac.jp/CFC/i ndexR.html); Quimiocinas: (http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html); Receptores de quimiocina y GPCRs: (http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html, http://www.gpcr.org/7tm/); Receptores olfatorios: (http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp); Receptores: (http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm); Objetivos de Cáncer: (http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi); Proteínas secretadas como objetivos potenciales anticuerpo: (http://spd.cbi.pku.edu.cn/); Proteína cinasas: (http://spd.cbi.pku.edu.cn/), y Marcadores de CD de Humano: (http://content.labvelocity.eom/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf ) y (Zola H, 2005 CD molecules 2005: human cell differentiation molecules Blood, 106:3123-6).
Las DVD-lgs son útiles como agentes terapéuticos para bloquear simultáneamente dos objetivos diferentes para incrementar la eficacia/seguridad y/o para incrementar la cobertura del paciente. Dichos objetivos pueden incluir a objetivos solubles (por ejemplo, TNF y PGE2) y objetivos de receptor de superficie celular (por ejemplo, VEGFR y EGFR). Estas también se pueden utilizar para inducir citotoxicidad redirigida entre células de tumor y células T (por ejemplo, Her2 y CD3) para terapia de cáncer, o entre célula auto-reactiva y células efectoras para enfermedad autoinmune o transplante, o entre cualquier célula objetivo y célula efectora para eliminar células causantes de enfermedad en cualquier enfermedad dada.
Además, la DVD-lg se puede utilizar para disparar el agrupamiento y activación del receptor cuando ésta está diseñada para elegir como blanco dos epítopes diferentes en el mismo receptor. Esto podría tener beneficios de elaboración de terapéuticos anti-GPCR agonistas y antagonistas. En este caso, la DVD-lg se puede utilizar para elegir como blanco dos epitopes diferentes (incluyendo epitopes tanto en las regiones de asa como en el dominio extracelular) en una célula para agrupamiento/señalización (dos moléculas de superficie celular) o señalización (en una molécula). De manera similar, se puede diseñar una molécula de DVD-lg para disparar la ligación a CTLA-4, y una señal negativa eligiendo como blanco dos epitopes diferentes (o 2 copias del mismo epítope) del dominio extracelular de CTLA-4, que conduce a una regulación negativa de la respuesta inmune. CTLA-4 es un objetivo clínicamente validado para tratamiento terapéutico de un número de trastornos inmunológicos. Las interacciones de CTLA-4/B7 regulan en forma negativa la activación de célula T mediante atenuación del avance del ciclo celular, producción de IL-2, y proliferación de células T después de la activación, y el acoplamiento (engagement) de CTLA-4 (CD152) puede regular en forma negativa la activación de célula T y promover la inducción de tolerancia inmune. Sin embargo, la estrategia de atenuar la activación de célula T mediante acoplamiento de anticuerpo agonista de CTLA-4 ha sido infructuosa debido a que la activación de CTLA-4 requiere ligación. La interacción molecular de CTLA-4/B7 es en arreglos de "cremallera desalineada", como queda demostrado por el análisis estructural del cristal (Stamper 2001 Nature 410:608). Sin embargo ninguno de los reactivos de unión a CTLA-4 actualmente disponibles tiene propiedades de ligación, incluyendo mAbs anti-CTLA-4. Ha habido varios intentos para solucionar este problema. En un caso, se genera un anticuerpo de cadena individual unido a miembro celular, e inhibe significativamente el rechazo alogénico en ratones (Hwang 2002 Jl 169:633). En un caso separado, se genera anticuerpo de cadena individual ligado a superficie de APC artificial contra CTLA-4 y demuestra atenuar las respuestas de célula T (Griffin 2000 Jl 164:4433). En ambos casos, la ligación a CTLA-4 se logra mediante anticuerpos unidos a miembro cercanamente localizado en sistemas artificiales. Aunque estos experimentos proveen prueba de concepto para regulación negativa inmune mediante disparo de señalización negativa CTLA-4, los reactivos utilizados en estos reportes no son apropiados para uso terapéutico. Para este fin, la ligación de CTLA-4 se puede lograr utilizando una molécula de DVD-lg, que elija como blanco dos epítopes diferentes (o 2 copias del mismo epítope) del dominio extracelular de CTLA-4. El razonamiento es que la distancia que abraca dos sitios de unión de una IgG, aproximadamente 150-170 A, es demasiado grande para ligación activa de CTLA-4 (30-50 Á entre 2 homodímeros de CTLA-4). Sin embargo, la distancia entre los dos sitios de unión en la DVD-lg (un brazo) es mucho más corta, también en el intervalo de 30-50 A, lo que permite la ligación apropiada de CTLA-4.
De manera similar, la DVD-lg puede elegir como blanco dos miembros diferentes de un complejo de receptor de superficie celular (por ejemplo, IL-12R alfa y beta). Asimismo, la DVD-lg puede elegir como blanco a CR1 y una proteína/patógeno soluble para controlar la depuración rápida de la proteína/patógeno soluble objetivo.
De manera adicional, las DVD-lgs de la invención se pueden utilizar para suministro específico de tejido (marcador objetivo a tejido y un mediador de enfermedad para farmacocinética local incrementada por lo tanto mayor eficacia y/o menor toxicidad), incluyendo el suministro intracelular (eligiendo como blanco o receptor de interiorización y una molécula intracelular), suministro al interior del cerebro (eligiendo como blanco al receptor de transferrina y un mediador de enfermedad de SNC para cruzar la barrera hemato-encefálica). La DVD-lg también puede servir como una proteína portadora para suministrar un antígeno a un sitio específico a través de unión a un epítope no neutralizante de dicho antígeno y también para incrementar el tiempo de vida media del antígeno. Asimismo, la DVD-lg se puede diseñar ya sea para que esté ligada físicamente a dispositivos médicos implantados en los pacientes o para elegir como blanco dichos dispositivos médicos (véase Burke, Sandra E.; Kuntz, Richard E.; Schwartz, Lewis B., Zotarolimus eluting stents. Advanced Drug Delivery Reviews (2006), 58(3), 437-446; Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices, Hildebrand, H. F.; Blanchemain, N.; Mayer, G.; Chai, F.; Lefebvre, M.; Boschin, F., Surface and Coatings Technology (2006), 200(22- 23), 6318-6324; Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu, Peng; Grainger, David W., Biomaterials (2006), 27(11), 2450-2467; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices., Marques, A. P.; Hunt, J. A.; Reis, Rui L, Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005), 377-397). Brevemente, dirigir los tipos apropiados de célula al sitio del implante médico puede promover la curación y restauración de la función tisular normal. De manera alternativa, también se provee la inhibición de mediadores (incluyendo pero sin limitarse a citocinas), liberados después de implantar el dispositivo por un DVD acoplado a o dirigido a un dispositivo. Por ejemplo, durante años se han utilizado endoprótesis (Stents) en cardiología de intervención para despejar las arterias bloqueadas y para mejorar el flujo de sangre hacia el músculo cardiaco. Sin embargo, se sabe que los stents de metal descubierto tradicionales causan reestenosis (re-estrechamiento de la arteria en el área tratada) en algunos pacientes y puede conducir a coágulos sanguíneos. Recientemente, se describió un stent revestido con anticuerpo anti-CD34 el cual reduce la reestenosis y evita que se presenten coágulos sanguíneos mediante captura de células progenitoras endoteliales (EPC) que circulan a través de toda la sangre. Las células endoteliales son células que recubren los vasos sanguíneos, lo que permite que la sangre fluya uniformemente. Las EPCs se adhieren a la superficie dura del stent formando una capa lisa que no sólo promueve la curación sino que también evita la reestenosis y los coágulos sanguíneos, complicaciones previamente asociadas con el uso de stents (Aoji et al. 2005 J Am Coll Cardiol. 45(10):1574-9). Además de mejorar los resultados para pacientes que requieren stents, existen algunas implicaciones para pacientes que requieren cirugía de derivación (bypass) cardiovascular. Por ejemplo, un conducto vascular protético (arteria artificial) revestido con anticuerpos anti-EPC podría eliminar la necesidad de utilizar arterias provenientes de las piernas o brazos de los pacientes para injertos de cirugía de bypass. Esto podría reducir los tiempos de cirugía y anestesia, lo cual a su vez podría reducir las muertes por cirugía coronaria. La DVD-lg está diseñada de tal manera que ésta se une a un marcador de superficie celular (tal como CD34) así como a una proteína (o un epítope de cualquier tipo, incluyendo pero sin limitarse a proteínas, lípidos y polisacáridos) que han sido aplicados como revestimiento en el dispositivo implantado para facilitar el reclutamiento de células. Dichas estrategias también se pueden aplicar a otros implantes médicos en general. De manera alternativa, las DVD-lgs se pueden aplicar como revestimiento en dispositivos médicos y después del implante y de la liberación de todos los DVDs a partir del dispositivo (o cualquier otra necesidad que pudiera requerir DVD-lg nueva adicional, incluyendo envejecimiento y desnaturalización de la DVD-lg ya cargada) el dispositivo se puede volver a recargar mediante administración sistémica de DVD-lg nueva al paciente, en donde la DVD-lg está diseñada para unirse a un objetivo de interés (una citocina, un marcador de superficie celular (tal como CD34) etc.) con un conjunto de sitios de unión y a un objetivo aplicado como revestimiento en el dispositivo (incluyendo una proteína, un epítope de cualquier tipo, incluyendo pero sin limitarse a lípidos, polisacáridos y polímeros) con el otro. Esta tecnología tiene la ventaja de extender la utilidad de los implantes revestidos.
En una modalidad, the DVD-lg se une a un nanotubo de carbono (CNT) no citotóxico y se dirige hacia un tejido, por ejemplo, un tejido tumoral. Los CNTs emiten calor cuando éstos absorben energía proveniente de luz en el infrarrojo cercano (NIR). Una vez que la DVD-lg se ha unido a su antígeno o antígenos tumorales, la exposición no invasiva a luz NIR extirpan el tumor dentro del intervalo de NIR. (Chakravarty, P. et al. (2008) Proc. Nati. Acad. Sci. 105:8697-8702).
A. Uso de DVD-lgs en varias enfermedades Las moléculas DVD-lg de la invención también son útiles como moléculas terapéuticas para tratar varias enfermedades. Dichas moléculas de DVD se pueden unir a uno o más objetivos implicados en una enfermedad específica. Los ejemplos de dichos objetivos en varias enfermedades se describen a continuación. 1. Respuesta autoinmune e inflamatoria humana Muchas proteínas han sido implicadas en las respuestas autoinmunes e inflamatoria generales, incluyendo C5, CCL1 (I-309), CCL11 (eotaxina), CCL13 (mcp-4), CCL15 (MIP-ld), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1, CXCL10 (IP-10), CXCL11 (l-TAC/IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9, IL13, IL8, CCL13 (mcp-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1 (CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, IL17C, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1 (citocina activadora de monocito endotelial), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, IL10RB, IL13, IL13RA1, IL5RA, IL9, IL9R, ABCF1, BCL6, C3, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, IL1RN, IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRADD, TRAF1 , TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, BLR1 , CCL1 , CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1 , SDF2, XCL1, XCL2, XCR1, AMH, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orf10 (IL27w), CER1, CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451J0118, FGF2, GFI1, IFNA1, IFNB1 , IFNG, IGF1, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1 , TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1A, TNFRSF1 B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11 A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFPM2, RNF110 (ZNF144), familia de FGF, PLGF, DLL4, y NPR-1. En un aspecto, se proveen DVD-lgs que se pueden unir a uno o más de los objetivos listados en la presente solicitud.
Se contemplan DVD Igs que se pueden unir a los siguientes pares de objetivos para tratar enfermedad inflamatoria: TNF de humano o de ratón y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec. 2) y PGE2, e IGFR y PGE2 (véase Ejemplos). 2. Asma El asma alérgica se caracteriza por la presencia de eosinofilia, metaplasia de célula caliciforme, alteraciones de célula epitelial, hiperreactividad de vías aéreas (AHR), y expresión de citocina Th2 y Th1, así como niveles elevados de IgE en suero. En la actualidad se acepta ampliamente que la inflamación de vías aéreas es el factor clave subyacente a la patogénesis del asma, que implica una interacción compleja de células inflamatorias tales como células T, células B, eosinófilos, mastocitos y macrófagos, y de sus mediadores secretados incluyendo citocinas y quimiocinas. Los corticosteroides son el tratamiento antiinflamatorio más importante para el asma hoy en día, sin embargo su mecanismo de acción es no específico y existen preocupaciones de seguridad, especialmente en la población de pacientes juveniles. Por lo tanto, el desarrollo de terapias más específicas y dirigidas está justificado. Existe una evidencia cada vez mayor de que IL-13 en ratones imita muchas de las características del asma, incluyendo AHR, hiper-secreción de moco y fibrosis de vías aéreas, independientemente de la inflamación eosinofílica (Finotto et al., International Immunology (2005), 17(8), 993-1007; Padilla et al., Journal of Immunology (2005), 174(12), 8097-8105).
Se ha implicado que IL-13 tiene un papel pivotante de ocasionar las respuestas patológicas asociadas con el asma. El desarrollo de terapia con mAb anti-IL-13 para reducir los efectos de IL-13 en el pulmón es una nueva estrategia excitante que ofrece promesa considerable como un tratamiento novedoso para el asma. Sin embargo otros mediadores de rutas inmunológicas diferenciales también están implicados en la patogénesis del asma, y el bloqueo de estos mediadores, además de IL-13, puede ofrecer beneficio terapéutico adicional. Dichos pares de objetivos incluyen, pero no se limitan a, IL-13 y una citocina pro-inflamatoria, tal como el factor de necrosis tumoral a (TNF-a). TNF-a puede amplificar la respuesta inflamatoria en asma y se puede vincular con la gravedad de la enfermedad ( cDonnell, et al., Progress in Respiratory Research (2001), 31 (New Drugs for Asthma, Allergy y COPD), 247-250.). Esto sugiere que el bloqueo tanto de IL-13 como de TNF-a puede tener efectos benéficos, particularmente en enfermedad de vías aéreas severa. En otra modalidad la DVD-lg de la invención se une a los objetivos IL-13 y TNFa o IL-13 y PGD2 y se utiliza para tratar asma.
Los modelos animales tales como modelo en ratón de asma inducida por OVA, en el cual se pueden evaluar tanto la inflamación como AHR, son conocidos en la técnica y se pueden utilizar para determinarla capacidad de varias moléculas DVD-lg para tratar el asma. Los modelos animales para estudiar asma se describen en Coffman, et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1875-1879; Lloyd, et al., Advances in Immunology (2001), 77, 263-295; Boyce et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1869-1873; y Snibson, et al., Journal of the British Society for Allergy y Clinical Immunology (2005), 35(2), 146-52. Además de las evaluaciones de seguridad rutinarias de estos pares de objetivos, las pruebas específicas respecto al grado de inmuno-supresión pueden estar justificadas y ayudar en la selección de los mejores pares de objetivos (véase Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102; Hart et al., Journal of Allergy y Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257).
Tomando como base la justificación descrita en la presente solicitud y utilizando el mismo modelo de evaluación para eficacia y seguridad, se pueden determinar otros pares de objetivos a los que se pueden unir las moléculas de DVD-lg y que son útiles para tratar asma. En una modalidad, dichos objetivos incluyen, pero no se limitan a, IL-13 e IL-1beta, debido a que IL-1beta también está implicada en la respuesta inflamatoria en asma; IL-13 y citocinas y quimiocinas que están implicadas en la inflamación, tales como IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-13 e IL-25; IL-13 y TARC; IL-13 y MDC; IL-13 y MIF; IL-13 y TGF-ß; IL-13 y agonista de LHR; IL-13 y CL25; IL-13 y SPRR2a; IL-13 y SPRR2b; e IL-13 y ADAM8. La presente invención también provee DVD-lgs que se pueden unir a uno o más objetivos implicados en asma que se seleccionan a partir del grupo que consiste de PGD2, CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1, IFNG, histamina y receptores de histamina, IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24.CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1 , CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21 , TGFB1 , TNF, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR, PGD2 y quitinasa.
Se contemplan las DVD Igs que se pueden unir a los siguientes pares de objetivos para tratar asma: TNF de humano o de ratón y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1 b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec. 2) y PGE2, e IGFR y PGE2 (véase Ejemplos). 3. Artritis reumatoide La artritis reumatoide (RA), una enfermedad sistémíca, se caracteriza por una reacción inflamatoria crónica en el sinovio de las articulaciones y está asociada con degeneración de cartílago y erosión del hueso yuxta-articular. Muchas citocinas pro-inflamatorias incluyendo TNF, quimiocinas, y factores de crecimiento son expresadas en las articulaciones enfermas. La administración sistémica de anticuerpo anti-TNF o de proteína de fusión sTNFR a modelos en ratón de RA ha demostrado ser anti-inflamatoria y protectora de las articulaciones. Las investigaciones clínicas en las cuales se bloquea la actividad de TNF en pacientes con RA con infliximab administrado por vía intravenosa (Harriman G, Harper LK, Schaible TF. 1999 Summary of clinical triáis in rheumatoid artritis using infliximab, an anti-TNFalfa treatment. Ann Rheum Dis 58 Supl 1:161-4), un mAb anti-TNF quimérico, han brindado evidencia de que TNF regula la producción de IL-6, IL-8, MCP-1, y VEGF, el reclutamiento de células inmunitarias inflamatorias hacia las articulaciones, angiogénesis, y reducción de niveles sanguíneos de las metaloproteinasas de matriz 1 y 3. Un mejor entendimiento de la ruta inflamatoria en artritis reumatoide ha llevado a la identificación de otros objetivos terapéuticos implicados en artritis reumatoide. Tratamientos prometedores tales como antagonistas de interleucina-6 (anticuerpo para receptor de IL-6 MRA, desarrollado por Chugai, Roche (véase Nishimoto, Norihiro et al., Arthritis & Rheumatism (2004), 50(6), 1761-1769), CTLA4lg (abatacept, Genovese Me et al 2005 Abatacept for rheumatoid artritis refractory to tumor necrosis factor alfa inhibition. N Engl J Med. 353:1114-23.), y terapia anticélula B (rituximab, Okamoto H, Kamatani N. 2004 Rituximab for rheumatoid artritis. N Engl J Med. 351: 1909) ya han sido probados en pruebas controladas aleatorizadas en el transcurso del año pasado. Se han identificado otra citocinas y se ha demostrado que son de beneficio en modelos animales, incluyendo interleucina-15 (anticuerpo terapéutico HuMax-IL_15, AMG 714 véase Baslund, Bo et al., Arthritis & Rheumatism (2005), 52(9), 2686-2692), interleucina-17, e interleucina-18, y las pruebas clínicas de estos agentes actualmente se están realizando. La terapia con anticuerpo dual-específico, que combina anti-TNF y otro mediador, tiene gran potencial para incrementar la eficacia clínica y/o cobertura del paciente. Por ejemplo, el bloqueo tanto de TNF como de PGE2 puede potencialmente erradicar la inflamación y angiogénesis, de las cuales ambas están implicadas en la fisiopatología de RA. También se contempla el bloqueo con DVD-lgs específicas de otros pares de objetivos implicados en RA incluyendo, pero sin limitarse a, TNF y PGE2; TNFa e IL-18; TNFa e IL-12; TNFa e IL-23; TNFa e IL-1beta¡ TNFa y MIF; TNFa e IL-17; TNFa e IL-17A; TNFa e IL-17F; TNFa e IL-17C; TNFa e IL-15; TNFa y VEGF; TNFa y OX40; TNFa y OX40L; TNFa y BAFF; TNFa y CD20; TNFa y HMGB1 ; TNFa e histamina; TNFa y RAGE; TNFa y CXCL12; TNFa y CTLA4; TNFa y Cad-11; TNFa y Wnt5A; TNFa y ADMATS-4; TNFa y ADMATS-5; TNFa y ADMATS-4/5; TNFa y MMP13; TNFa y MMP1; TNFa y MMP3; TNFa y MP4; TNFa y RANKL; TNFa y SOST; TNFa y DKK1 ; TNFa y LRP5/6; TNFa y Kremen; TNFa y SFRPS; TNFa e IL-6; TNFa e IL-32; TNFa e IL-33; TNFa e IL-6R; TNFa y Catepsina K; TNFa y Bradiquinina; TNFa y NGF; PGE2 y CTLA4; PGE2 e IL-?ß; PGE2 e IL-12; PGE2 e IL-23; PGE2 e IL-15, PGE2 e IL-17; PGE2 e IL-17A; PGE2 e IL-17F; PGE2 e IL-17C; PGE2 e IL-18; PGE2 e IL-6; PGE2 e IL-6R; PGE2 y gp130; PGE2 y BAFF; S1P y PGE2, EGFR. (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec. 2) y PGE2, e IGFR y PGE2, PGE2 y Abeta (sec. 1, 2, o 3), PGE2 y ADMATS-4; PGE2 y ADMATS-5; PGE2 y ADMATS-4/5; PGE2 y MMP-1; PGE2 y MMP-3; PGE2 y MMP-4; PGE2 y MMP-13; PGE2 y Catepsina K; PGE2 y Bradiquinina; PGE2 y RANKL; PGE2 y DKK1; PGE2 y SOST; PGE2 y NGF; PGE2 y RAGE; PGE2 y S1P; PGE2 e IL-15; PGE2 y VEGF; PGE2 y Cadherina. Además de las evaluaciones de seguridad rutinarias de dichos pares de objetivos, las pruebas específicas respecto al grado de inmuno-supresión pueden estar justificadas y son útiles para seleccionar los mejores pares de objetivos (véase Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al, Developments in biological standardization (1992), 77 99-102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257). El que una molécula de DVD-lg sea útil o no para el tratamiento de artritis reumatoide se puede evaluar utilizando modelos pre-clínicos de artritis reumatoide en animales tales como el modelo en ratón de artritis inducida por colágena. Otros modelos útiles también son bien conocidos en la técnica (véase Brand DD., Comp Med. (2005) 55(2): 114-22). Tomando como base la reactividad cruzada de los anticuerpos progenitores para ortólogos de humano y de ratón (por ejemplo, reactividad para TNF de humano y de ratón, IL-15 de humano y de ratón etc.) se pueden efectuar estudios de validación en el modelo de CIA en ratón con moléculas de DVD-lg obtenidas a partir de "anticuerpo sustituto igualado"; brevemente, una DVD-lg basada en dos (o más) anticuerpos específicos de objetivo de ratón se puede hacer coincidir hasta el mayor grado posible con las características de los anticuerpos humanos o humanizados progenitores utilizados para la construcción de la DVD-lg de humano (afinidad similar, potencia de neutralización similar, tiempo de vida media similar etc.). 4. Lupus eritematoso sistémico (SLE) El sello inmunopatogénico característico de SLE es la activación de célula B policlonal, lo cual conduce a hiperglobulinemia, producción de auto-anticuerpo y formación de complejo inmune. La anormalidad fundamental parece ser la falla de las células T para suprimir los clones de célula B prohibidos debido a una desregulación de célula T generalizada. Además la interacción de célula B y T es facilitada por varias citocinas tales como IL-10 así como moléculas co-estimuladoras tales como CD40 y CD40L, B7 y CD28 y CTLA-4, las cuales inician la segunda señal. Estas interacciones junto con depuración fagocítica disminuida de los complejos inmunes y material apoptótico, perpetúan la respuesta inmune con la lesión tisular resultante. Los siguientes objetivos pueden estar implicados en SLE y potencialmente se pueden utilizar para una estrategia con DVD-lg para la intervención terapéutica: terapias dirigidas a célula B: CD-20, CD-22, CD-19, CD28, CD4, CD80, HLA-DRA, IL10, IL2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR1, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1, MS4A1 , RGS1 , SLA2, CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, TNFRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALNAC4S-6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IL10, IL11, IL4, INHA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1, CD1C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA, y NT5E.; señales co-estimuladoras: CTLA4 o B7.1/B7.2; inhibición de supervivencia de célula B: BlyS, BAFF; inactivación del complemento: C5; modulación de citocina: el principio clave es que la respuesta biológica neta en cualquier tejido es el resultado de un equilibrio entre niveles locales de citocinas pro-inflamatorias o antiinflamatorias (véase Sfikakis PP et al 2005 Curr Opin Rheumatol 17:550-7). SLE es considerada como una enfermedad controlada por Th-2 con elevaciones documentadas de IL-4, IL-6, IL-10 en suero.
También se contemplan DVD Igs que se pueden unir a uno o más objetivos que se seleccionan a partir del grupo que consiste de IL-4, IL-6, IL-10, IFN-a, PGE2, y TNF-a. La combinación de objetivos discutidos en la presente solicitud puede incrementar la eficacia terapéutica para SLE lo cual se puede analizar en un número de modelos pre-clínicos de lupus (véase Peng SL (2004) ethods Mol Med.; 102:227-72). Tomando como base la reactividad cruzada de los anticuerpos progenitores para ortólogos de humano y de ratón (por ejemplo, reactividad hacia CD20 de humano y de ratón, Interferón alfa de humano y de ratón etc.) se pueden efectuar estudios de validación en un modelo de lupus en ratón con moléculas de DVD-lg obtenidas de "anticuerpo sustituto igualado"; brevemente, una DVD-lg basada en dos (o más) anticuerpos específicos de objetivo de ratón se puede hacer coincidir hasta el mayor grado posible con las características de los anticuerpos humanos o humanizados progenitores utilizados para la construcción de DVD-lg de humano (afinidad similar, potencia de neutralización similar, tiempo de vida media similar etc.).
Se contemplan las DVD Igs que se pueden unir a los siguientes pares de objetivos para tratar SLE: TNF de humano o de ratón y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec. 2) y PGE2, e IGFR y PGE2 (véase Ejemplos). 5. Esclerosis múltiple La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad humana de tipo auto-inmune compleja con una etiología predominantemente desconocida. La destrucción inmunológica de la proteína básica de mielina (MBP) a través de todo el sistema nervioso es la patología principal de la esclerosis múltiple. MS es una enfermedad de patologías complejas, que implica infiltración por células T CD4+ y CD8+ y de respuesta dentro del sistema nervioso central. La expresión en el SNC de citocinas, especies nitrogenadas reactivas y moléculas coestimuladoras ha sido descrita en MS. De primordial consideración son los mecanismos inmunológicos que contribuyen al desarrollo de autoinmunidad. En particular, la expresión de antígeno, interacciones de citocina y leucocitos, y células T reguladoras, las cuales ayudan a equilibrar/modular otras células T tales como las células Th1 y Th2, son áreas importantes para identificación de objetivo terapéutico.
IL-12 es una citocina pro-inflamatoria que es producida por APC y promueve la diferenciación de las células efectoras Th1. IL-12 se produce en lesiones en desarrollo de pacientes con MS así como animales afectados con EAE. Previamente se demostró que la interferencia en las rutas de IL-12 previene efectivamente EAE en roedores, y que la neutralización in vivo de IL-12p40 utilizando un mAb anti-IL-12 tiene efectos benéficos en el modelo de EAE inducido por mielina en titíes comunes.
TWEAK es un miembro de la familia de TNF, expresada en forma constitutiva en el sistema nervioso central (SNC), con efectos pro-inflamatorios, proliferativos o apoptóticos en función de los tipos celulares. Su receptor, Fn14, es expresado en SNC por células endoteliales, astrocitos reactivos y neuronas. La expresión de ARNm de TWEAK y Fn14 se incrementa en médula espinal durante encefalomielitis auto-inmune experimental (EAE). El tratamiento con anticuerpo anti-TWEAK en EAE inducida por glucoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG) en ratones C57BL/6 da como resultado una reducción de la gravedad de la enfermedad y de infiltración de leucocitos cuando los ratones se tratan después de la fase de cebado.
Un aspecto de la invención pertenece a moléculas de DVD Ig que se pueden unir a uno o más, por ejemplo dos, objetivos que se selecciona a partir del grupo que consiste de PGE, PGE1, PGE2, S1P, S1P1, S1P2, S1P3, S1P4, S1P5, VLA-4, CD44, RAGE, fosfatidil-serina (PS), ácido lisofosfatídico (LPA), IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFNgamma, GM-CSF, FGF, C5, CD52, y CCR2. Una modalidad incluye una DVD Ig anti-IL-12/TWEAK dual-específica como un agente terapéutico benéfico para el tratamiento de MS.
En la técnica se conocen varios modelos animales para evaluar la utilidad de las moléculas de DVD para tratar MS (véase Steinman L, et al, (2005) Trends Immunol. 26(11 ):565-71 ; Lublin FD., et al., (1985) Springer Semin lmmunopathol.8(3): 197-208; Genain CP, et al., (1997) J Mol Med. 75(3): 187-97; Tuohy VK, et al., (1999) J Exp Med. 189(7):1033-42; Owens T, et al., (1995) Neurol Clin.13(1):51-73; y 't Hart BA, et al., (2005) J Immunol 175(7):4761 -8. Tomando como base la reactividad cruzada de los anticuerpos progenitores para ortólogos de especie humana y animal (por ejemplo, reactividad hacia IL-12 de humano y de ratón, TWEAK de humano y de ratón etc.) se pueden efectuar estudios de validación en el modelo de EAE en ratón con moléculas de DVD-lg obtenidas de "anticuerpo sustituto igualado"; brevemente, una DVD-lg basada en (o más) anticuerpos específicos de objetivo de ratón se puede hacer coincidir hasta el mayor grado posible con las características de los anticuerpos humanos o humanizados progenitores utilizados para la construcción de DVD-lg de humano (afinidad similar, potencia de neutralización similar, tiempo de vida media similar etc.). El mismo concepto se aplica a modelos animales en otras especies no roedoras, en donde una DVD-lg obtenida a partir de "anticuerpo sustituto igualado" se podría seleccionar respecto a la farmacología anticipada y posibles estudios de seguridad. Además de las evaluaciones de seguridad rutinarias de dichos pares de objetivos las pruebas específicas respecto al grado de inmuno-supresión pueden estar justificadas y son útiles para seleccionar los mejores pares de objetivos (véase Luster et al, Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 7799-102; Jones R. 2000 Rovelizumab (ICOS Corp). IDrugs.3(4):442-6)· Se contemplan las DVD Igs que se pueden unir a los siguientes pares de objetivos para tratar MS: TNF de humano o de ratón y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1 b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec. 2) y PGE2, e IGFR y PGE2 (véase Ejemplos). 6. Sepsis La fisiopatología de sepsis es iniciada por los componentes de la membrana exterior tanto de organismos Gram-negativos (lipopolisacárido [LPS], lípido A, endotoxina) como de organismos Gram-positivos (ácido lipoteicóico, peptidoglucano). Estas componentes de membrana exterior se pueden unir al receptor de CD14 en la superficie de monocitos. Debido a los receptores tipo toll recientemente descritos, después se transmite una señal a la célula, que lleva a la eventual producción de las citocinas pro-inflamatorias factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) e interleucina-1 (IL-1). Respuestas inflamatorias e inmunes abrumadoras son características esenciales de choque séptico y juegan un papel central en la patogénesis de daño tisular, insuficiencia de órgano múltiple, y muerte inducida por. Las citocinas, especialmente factor de necrosis tumoral (TNF) e interleucina (IL-I), han demostrado ser mediadores críticos del choque séptico. Estas citocinas tienen un efecto tóxico directo en los tejidos; éstas también activan la fosfolipasa A2. Estos y otros efectos conducen a concentraciones incrementadas de factor activador de plaquetas, promoción de la actividad de la oxido mítico sintetasa, promoción de infiltración en tejidos por los neutrófilos, y promoción de actividad de neutrófilo.
El factor de necrosis tumoral tiene un papel establecido en la fisiopatología de sepsis, con efectos biológicos que incluyen hipotensión, supresión miocardiaca, síndrome de fuga vascular, necrosis de órgano, estimulación de la liberación de mediadores secundarios tóxicos y activación de la cascada de coagulación (Tracey, K. J. y Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503; Russell, D y Thompson, R. C. (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:714-721). La síntesis y metabolismo de la prostaglandina E2 están incrementados en daño y trauma por quemadura (Hahn, É. L. y Gamelli, R. L. (2000) J. Trauma. 49: 1147-1154). Por consiguiente, las moléculas de DVD-lg™ o porciones de DVD-lg™, de la invención se pueden utilizar para tratar sepsis en cualquiera de sus escenarios clínicos, incluyendo choque séptico, daño por quemadura, trauma, choque endotóxico, sepsis por Gram negativos y síndrome de choque séptico.
El tratamiento de sepsis y choque séptico sigue siendo un acertijo clínico, y las pruebas prospectivas recientes con modificadores de la respuesta biológica (es decir anti-TNF, anti-MIF) dirigidos a la respuesta inflamatoria han demostrado beneficio clínico solamente modesto. Recientemente, el interés se ha desplazado hacia terapias dirigidas a revertir los periodos acompañantes de supresión inmune. Los estudios en animales de experimentación y pacientes críticamente enfermos se han demostrado que la apoptosis incrementada de órganos linfoides y algunos tejidos del parénquima contribuyen a esta supresión inmune, anergia, y disfunción del sistema del órgano. Durante los síndromes sépticos, la apoptosis de linfocitos puede ser disparada por la ausencia de IL-2 o por la liberación de glucocorticoides, granzimas, o las denominadas citocinas "de la muerte": factor de necrosis tumoral alfa o él ligando Fas. La apoptosis avanza a través de auto-activación de caspasas citosólicas y/o mitocóndricas, las cuales pueden ser influenciadas por los miembros pro-apoptóticos y anti-apoptóticos de la familia de Bcl-2. En animales experimentales, el tratamiento con inhibidores de apoptosis no sólo puede evitar la apoptosis de célula linfoide; éste también puede mejorar el resultado. Aunque las pruebas clínicas con agentes anti-apoptóticos permanecen distantes debido en gran parte a las dificultades técnicas asociadas con su administración y elección como blanco del tejido, la inhibición de apoptosis de linfocito representa un objetivo terapéutico atractivo para el paciente séptico. Del mismo modo, un agente dual-específico que elija como blanco tanto al mediador inflamatorio como al mediador apoptótico, puede tener beneficio adicional.
Asimismo, para tratar la sepsis, se puede coadministrar una molécula de DVD-lg™ o porción de DVD-lg™, de la invención con uno ó más agentes terapéuticos adicionales que puedan aliviar adicionalmente la sepsis, tal como un inhibidor de interleucina-1 (tal como los descritos en la Publicaciones del PCT Nos. WO 92/16221 y WO 92/17583), la citocina ¡nterleucina-6 (véase por ejemplo, Publicación del PCT No. WO 93/11793) o un antagonista del factor activador de plaquetas (véase por ejemplo, Publicación de solicitud de patente europea No. EP 374510).
De manera adicional, en una modalidad preferida, se administra una molécula de DVD-lg™ o porción de DVD-lg™ de la invención se administra a un individuo humano dentro de un subgrupo de pacientes con sepsis que tienen una concentración de IL-6 en suero o plasma mayor de 500 pg/ml, y de manera más preferida 1000 pg/ml, al momento del tratamiento (véase Publicación del PCT No. WO 95/20978 por Daum, L., et al).
Un aspecto de la invención pertenece a DVD Igs que se pueden unir a uno o más objetivos implicados en sepsis, en una modalidad dos objetivos, que se seleccionan a partir del grupo que consiste de PGE, PGE1, PGE2, S1P, S1P1, S1P2, S1P3, S1P4, S1P5, RAGE, VLA-4, CD44, RAGE, HMGB1, S100, TNF, IL-1, MIF, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12, IL-23, FasL, LPS, receptores tipo 7o//, TLR-4, factor tisular, MIP-2, ADORA2A, CASP1, CASP4, IL-10, IL-IB, NFKB1 , PROC, TNFRSF1 A, CSF3, CCR3, IL1RN, MIF, NFKB1, PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOX1, midquina, IRAK1, NFKB2, SERPINA1, SERPINE1, y TREM1. La eficacia de dichas DVD Igs para sepsis se puede evaluar en modelos animales pre-clínicos conocidos en la técnica (véase Buras JA, et al., (2005) Nat Rev Drug Discov. 4(10):854-65 y Calandra T, et al., (2000) Nat ed. 6(2): 164-70).
Se contemplan las DVD Igs que se pueden unir a los siguientes pares de objetivos para tratar sepsis: TNF de humano o de ratón y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. T) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec. 2) y PGE2, e IGFR y PGE2 (véase Ejemplos). 7. Trastornos neurológicos 7.1. Trastornos neurodegenerativos Las enfermedades neurodegenerativas crónicas por lo general son enfermedades dependientes de la edad caracterizadas por pérdida progresiva de las funciones neuronales (muerte de célula neuronal, desmielinización), pérdida de movilidad y pérdida de memoria. El conocimiento emergente de los mecanismos subyacentes a las enfermedades neurodegenerativas crónicas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) muestra una etiología compleja y se ha reconocido una variedad de factores que contribuyen a su desarrollo y avance por ejemplo, edad, condición glucémica, producción y multimerización de amiloide, acumulación de productos finales de glucosilación avanzados (AGE) que se unen a su receptor RAGE (receptor para AGE), estrés oxidante cerebral incrementado, flujo sanguíneo cerebral disminuido, neuro-inflamación incluyendo liberación de citocinas y quimiocinas inflamatorias, disfunción neuronal y activación de la microglía. Por lo tanto, estas enfermedades neurodegenerativas crónicas representan una interacción compleja entre tipos y mediadores celulares múltiples. Las estrategias de tratamiento para dichas enfermedades son limitadas y en su gran mayoría constituyen ya sea el bloqueo de procesos inflamatorios con agentes anti-inflamatorios no específicos (por ejemplo, corticosteroides, inhibidores de COX) o agentes para evitar pérdida de neurona y/o funciones sinápticas. Estos tratamientos no pueden detener el avance de la enfermedad. Estudios recientes sugieren que terapias más dirigidas tales como anticuerpos para el péptido A-b soluble (incluyendo las formas oligoméricas de A-b) no sólo pueden ayudar a detener el avance de la enfermedad sino que también ayudan también a mantener la memoria. Estas observaciones preliminares sugieren que las terapias especificas que eligen como blanco más de un mediador de enfermedad (por ejemplo, A-b y una citocina pro-inflamatoria tal como TNF) pueden proveer eficacia terapéutica incluso más adecuada para enfermedades neurodegenerativas crónicas que la observada con la elección como blanco de un solo mecanismo de enfermedad (por ejemplo, A-b soluble solo) (véase CE. Shepherd, et al, Neurobiol Aging. 24 de Octubre de 2005; Nelson RB., Curr Pharm Des. 2005;11 :3335; William L. Klein.; Neurochem Int. 2002;41:345; Michelle C Janelsins, et al., J Neuroinflammation. 2005;2:23; Soloman B., Curr Alzheimer Res. 2004; 1:149; Igor Klyubin, et al., Nat Med. 2005; 11:556-61; Arancio O, et al., E BO Journal (2004) 1-10; Bornemann KD, et al., Am J Pathol. 2001;158:63; Deane R, et al., Nat Med. 2003;9:907-13; y Eliezer Masliah, et al., Neuron. 2005;46:857).
Las moléculas de DVD-lg de la invención se pueden unir a uno o más objetivos implicados en enfermedades neurodegenerativas crónicas tales como enfermedad de Alzheimer. Dichos objetivos incluyen, pero no se limitan a, cualquier mediador, soluble o de superficie celular, implicado en la patogénesis de AD, por ejemplo AGE (S100 A, anfoterina), citocinas pro-inflamatorias (por ejemplo, IL-1), quimiocinas (por ejemplo, MCP 1), moléculas que inhiban la regeneración de nervio (por ejemplo, Nogo, RGM A), moléculas que incrementen el crecimiento de neurita (neurotrofinas). La eficacia de las moléculas de DVD-lg se puede validar en modelos animales pre-clínicos tales como el ratón transgénico que sobre-expresa la prpteína precursora de amiloide o RAGE y desarrollan síntomas parecidos a los de la enfermedad de Alzheimer. Además, las moléculas de DVD-lg se pueden construir y analizar respecto a eficacia en los modelos animales y se puede seleccionar la mejor DVD-lg terapéutica para análisis en pacientes humanos. Las moléculas de DVD-lg también se pueden utilizar para tratamiento de otras enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Parkinson. La alfa-Sinucleína está implicada en la patología de Parkinson. Una DVD-lg que pueda elegir como blanco a alfa-sinucleína y mediadores inflamatorios tales como PGE, PGE1, PGE2, RAGE, HMGB1, S100, TNF, IL-1, MCP-1 puede demostrar terapia efectiva para la enfermedad de Parkinson y se contemplan en la invención.
Se contemplan las DVD Igs que se pueden unir a los siguientes pares de objetivos para tratar enfermedades neurológicas: TNF de humano o de ratón y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec. 2) y PGE2, e IGFR y PGE2 (véase Ejemplos). 7.2 Regeneración neuronal y lesión de médula espinal A pesar de un incremento en el conocimiento de los mecanismos patológicos, la lesión de médula espinal (SCI por sus siglas en inglés) sigue siendo una condición devastadora y representa una indicación médica caracterizada por una alta necesidad médica. La mayoría de las lesiones de la médula espinal son lesiones por contusión o compresión y la lesión primaria generalmente es seguida por mecanismos de lesión secundario (mediadores inflamatorios por ejemplo, citocinas y quimiocinas) que empeoran la lesión inicial y dan como resultado agrandamiento significativo del área de lesión, algunas ocasiones más de 10 veces. Estos mecanismos primario y secundario en SCI son muy similares a aquellos en lesión cerebral causada por otros medios por ejemplo, apoplejía. No existe tratamiento satisfactorio y la inyección de bolo de dosis elevada de metilprednisolona (MP) es la única terapia utilizada dentro de una ventana de tiempo estrecha de 8 horas después de la lesión. Sin embargo, este tratamiento sólo está pensado para evitar la lesión secundaria sin ocasionar ninguna recuperación funcional significativa. Esta ha sido bastante criticada por la falta de eficacia inequívoca y efectos secundarios severos, tal como inmuno-supresión con las infecciones subsiguientes y alteraciones de músculo histo-patológicas graves. No se han aprobado ningún otro fármaco, producto biológico o moléculas pequeñas, que estimulen el potencial regenerativo endógeno, pero en años recientes principios de tratamiento y candidatos de fármaco prometedores han demostrado eficacia en modelos animales de SCI. Hasta en un grado amplio la falta de recuperación funcional en SCI en humano es causada por factores que inhiben el crecimiento de neurita, en los sitios de la lesión, en tejido cicatricial, en mielina así como en las células asociadas con la lesión. Dichos factores son las proteínas asociadas a mielina NogoA, OMgp y MAG, RGM A, los CSPG (proteoglucanos de sulfato de condroitina) asociados a cicatriz y factores inhibidores en astrocitos reactivos (algunas semaforinas y efrinas). Sin embargo, en el sitio de la lesión no solamente se encuentran moléculas inhibidoras del crecimiento sino también factores estimulantes del crecimiento de neurita tales como neurotrofinas, laminina, L1 y otros. Este ensamble de moléculas inhibidoras del crecimiento de neurita y promotoras del crecimiento puede explicar que el bloqueo de factores individuales, tales como NogoA o RGM A, da como resultado una recuperación funcional significativa en modelos de SCI en ratones, debido a una que reducción de las influencias inhibidoras podría desplazar el equilibrio de inhibición de crecimiento a promoción de crecimiento. Sin. embargo, las recuperaciones observadas sin bloquear una molécula individual inhibidora del crecimiento de neurita no son completas. Para obtener recuperaciones más rápidas y más pronunciadas sería deseable ya sea bloquear dos moléculas inhibidoras del crecimiento de neurita por ejemplo Nogo y RGM A, o bloquear una molécula inhibidora del crecimiento de neurita e incrementar las funciones de una molécula incrementadora del crecimiento de neurita por ejemplo Nogo y neurotrofinas, o bloquear una molécula inhibidora del crecimiento de neurita por ejemplo, Nogo y una molécula pro-inflamatoria por ejemplo, TNF, (véase McGee AW, et al., Trends Neurosci. 2003;26:193; Marco Domeniconi, et al., J Neurol Sci. 2005;233:43; Milán Makwanal, et al., FEBS J. 2005;272:2628¡ Barry J. Dickson, Science. 2002;298:1959; Felicia Yu Hsuan Teng, et al., J Neurosci Res. 2005;79:273; Tara Karnezis, et al., Nature Neuroscience 2004; 7, 736; Gang Xu, et al., J. Neurochem.2004; 91; 1018).
En un aspecto, se proveen DVD-lgs que se pueden unir a pares de objetivos tales como NgR y RGM A; NogoA y RGM A; MAG y RGM A; OMGp y RGM A; RGM A y RGM B; CSPGs y RGM A; agrecano, midquina, neurocano, versicano, fosfacano, Te38 y TNF-a; anticuerpos específicos de globulómero ?ß combinados con anticuerpos que promueven la gemación de dendritas y axones. La patología de dendrita es una señal muy temprana de AD y se sabe que NOGO A restringe el crecimiento de dendrita. Se puede combinar dicho tipo de anticuerpo con cualquiera de los anticuerpos candidatos para SCI (proteínas de mielina). Otros objetivos de DVD-lg pueden incluir cualquier combinación de NgR-p75, NgR-Troy, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR-Lingo, Lingo-Troy, Lingo-p75, MAG u Omgp. De manera adicional, los objetivos también pueden incluir cualquier mediador, soluble o de superficie celular, implicado en la inhibición de neurita por ejemplo Nogo, Ompg, MAG, RGM A, semaforinas, efrinas, A-b soluble, citocinas pro-inflamatorias (por ejemplo, IL-1), quimiocinas (por ejemplo, MIP 1a), moléculas que inhiban la regeneración de nervio. La eficacia de moléculas de DVD-lg anti-nogo/anti-RGM A o moléculas de DVD-lg similares se puede validar en modelos animales pre-clínicos de lesión de médula espinal. Además, estas moléculas de DVD-lg se pueden construir y analizar respecto a eficacia en los modelos animales y se puede seleccionar la mejor DVD-lg terapéutica para pruebas en pacientes humanos. Además, las moléculas de DVD-Ig se pueden construir de modo tal que elijan como blanco dos sitios de unión a ligando distintos en un receptor individual por ejemplo, el receptor de Nogo el cual se une a tres ligandos Nogo, Ompg, y MAG y RAGE que se une a A-b y S100 A. Asimismo, los inhibidores de crecimiento de neurita por ejemplo, nogo y receptor de nogo, también juegan un papel en evitar la regeneración de nervio en enfermedades inmunológicas tales como esclerosis múltiple. La inhibición de la interacción nogo-receptor de nogo ha demostrado incrementar la recuperación en modelos animales de esclerosis múltiple. Por lo tanto, las moléculas de DVD-lg que pueden bloquear la función de un mediador inmune por ejemplo una citocina tal como IL-12 y una molécula inhibidora del crecimiento de neurita, por ejemplo, nogo o RGM pueden ofrecer eficacia más rápida y mayor que el bloqueo de cualquiera de una molécula inmune o una molécula inhibidora de crecimiento de neurita sola.
Se contemplan las DVD Igs que se pueden unir a los siguientes pares de objetivos para tratar lesión de médula espinal o para fomentar la regeneración neuronal: TNF de humano o de ratón y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1 b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec.2) y PGE2, e IGFR y PGE2 (véase Ejemplos). 8. Trastornos oncológicos La terapia de anticuerpo monoclonal ha surgido como una modalidad terapéutica importante para cáncer (von Mehren, M., et al. (2003) Annu. Rev. Med. 54:343-69). Los anticuerpos pueden ejercer efectos antitumorales induciendo apoptosis, redirigiendo la citotoxicidad, interfiriendo con las interacciones ligando-receptor, o evitando la expresión de proteínas que son críticas para el fenotipo neoplásico. Además, los anticuerpos pueden elegir como blanco componentes del microambiente tumoral, perturbando estructuras vitales tales como la formación de vasculatura asociada al tumor. Los anticuerpos también pueden elegir como blanco receptores cuyos ligandos sean factores de crecimiento, tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico. El anticuerpo por lo tanto inhibe que los ligandos naturales que estimulan el crecimiento celular se unan a las células tumorales elegidas como blanco. De manera alternativa, los anticuerpos pueden inducir una red anti-idiotípica, citotoxicidad mediada por complemento, o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). El uso de anticuerpo dual-específico que elige como blanco dos mediadores de tumor separados probablemente brinde beneficio adicional en comparación con una terapia mono-específica.
El factor de necrosis tumoral ha sido implicado en inducir caquexia, estimular el crecimiento de tumor, incrementar el potencial metastásico y mediar la citotoxicidad en tumores malignos (véase, por ejemplo, Tracey y Cerami, supra). Se descubrió que COX-2 es sobre-expresada y conduce a la generación de prostaglandinas abundantes incluyendo PGE2 en cánceres tales como cáncer de mama, gástrico, pulmonar y pancreático, etc. Los AINES e inhibidores de COX-1/2 han demostrado ser efectivos en modelos de tumor. Los anticuerpos anti-PGE2 también pueden tener implicaciones amplias para la prevención/tratamiento de un número de otros tumores malignos (Chell, S. y Kaidi, A. Biochim Biophys Acta. (2006) 1766:104-119). Por consiguiente, las moléculas de DVD-lg™ o porciones de DVD-lg™, de la invención, se pueden utilizar en el tratamiento de tumores malignos, para inhibir el crecimiento o metástasis tumoral para tumores que incluyen pero sin limitarse a tumor de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de próstata, cáncer pancreático y/o para aliviar caquexia secundaria al tumor maligno. Las moléculas de DVD-lg™ o porciones de DVD-Ig™, se pueden administrar sistémicamente o localmente al sitio del tumor.
En otra modalidad, un DVD de la invención se puede unir a PGE2 e IGF 1,2, PGE2 y Erb2B, PGE2 y VEGFR, PGE2 e IGFR, PGE2 y EGFR, PGE2 y CD20, PGE2 y CD138, PGE2 y CD40, PGE2 y CD38, VEGF y fosfatidilserina; VEGF y ErbB3; VEGF y PLGF; VEGF y ROB04; VEGF y BSG2; VEGF y CDCP1; VEGF y ANPEP; VEGF y c-MET; HER-2 y ERB3; HER-2 y BSG2; HER-2 y CDCP1; HER-2 y ANPEP; EGFR y CD64; EGFR y BSG2; EGFR y CDCP1; EGFR y ANPEP; IGF1R y PDGFR; IGF1R y VEGF; IGF1R y CD20; CD20 y CD74; CD20 y CD30; CD20 y DR4; CD20 y VEGFR2; CD20 y CD52; CD20 y CD4; HGF y c-MET; HGF y NRP1; HGF y fosfatidilserina; ErbB3 e IGF1R; ErbB3 e IGF1.2; c-Met y Her-2; c-Met y NRP1; c- et e IGF1R; IGF1.2 y PDGFR; IGF1.2 y CD20; IGF1.2 e IGF1R; IGF2 y EGFR; IGF2 y HER2; IGF2 y CD20; IGF2 y VEGF; IGF2 e IGF1R; IGF1 e IGF2; PDGFRa y VEGFR2; PDGFRa y PLGF; PDGFRa y VEGF; PDGFRa y c-Met; PDGFRa y EGFR; PDGFRb y VEGFR2; PDGFRb y c-Met; PDGFRb y EGFR; RON y c-Met; RON y MTSP1; RON y MSP; RON y CDCP1; VGFR1 y PLGF; VGFR1 y RON; VGFR1 y EGFR; VEGFR2 y PLGF; VEGFR2 y NRP1; VEGFR2 y RON; VEGFR2 y DLL4; VEGFR2 y EGFR; VEGFR2 y ROB04; VEGFR2 y CD55; LPA y S1P; EPHB2 y RON; CTLA4 y VEGF; CD3 y EPCAM; CD40 e IL6; CD40 e IGF; CD40 y CD56; CD40 y CD70; CD40 y VEGFR1; CD40 y DR5; CD40 y DR4; CD40 y APRIL; CD40 y BCMA; CD40 y RANKL; CD28 y MAPG; CD80 y CD40; CD80 y CD30; CD80 y CD33; CD80 y CD74; CD80 y CD2; CD80 y CD3; CD80 y CD19; CD80 y CD4; CD80 y CD52; CD80 y VEGF; CD80 y DR5; CD80 y VEGFR2; CD22 y CD20; CD22 y CD80; CD22 y CD40; CD22 y CD23; CD22 y CD33; CD22 y CD74; CD22 y CD19; CD22 y DR5; CD22 y DR4; CD22 y VEGF; CD22 y CD52; CD30 y CD20; CD30 y CD22; CD30 y CD23; CD30 y CD40; CD30 y VEGF; CD30 y CD74; CD30 y CD 19; CD30 y DR5; CD30 y DR4; CD30 y VEGFR2; CD30 y CD52; CD30 y CD4; CD138 y RANKL; CD33 y FTL3; CD33 y VEGF; CD33 y VEGFR2; CD33 y CD44; CD33 y DR4; CD33 y DR5; DR4 y CD137; DR4 e IGF1.2; DR4 e IGF1R; DR4 y DR5; DR5 y CD40; DR5 y CD 137; DR5 y CD20; DR5 y EGFR; DR5 e IGF1.2; DR5 e IGFR, DR5 y HER-2, y EGFR y DLL4. Otras combinaciones de objetivo incluyen uno o más miembros de la familia EGF/erb-2/erb-3. Otros objetivos (uno o más) implicados en enfermedades oncológicas a los que se pueden unir las DVD-lgs incluyen, pero no se limitan a aquellos que se seleccionan a partir del grupo que consiste de: PGE2, Muc-1, TRAIL, CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, BMP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, TNF, TNFSF10, BMP6, EGF, FGF1, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGF1, IGF2, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, INHA, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, FGF10, FGF18, FGF2, FGF4, FGF7, IGF1R, IL2, BCL2, CD164, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRH1, IGFBP6, IL1A, IL1B, ODZ1, PAWR, PLG, TGFB1I1, AR, BRCA1, CDK3, CD 4, CDK5, CD 6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, EN01, ERBB2, ESR1, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, NOX5, NR6A1 , PAP, PCNA, PRKCQ, PRKD1, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53, CHGB, GNRH1, IGF1, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6, SHBG, NR1D1, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESR1, ESR2, NR0B1, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1I2, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2, NR6A1, PGR, RARB, FGF1, FGF2, FGF6, KLK3, KRT1, APOC1, BRCA1 , CHGA, CHGB, CLU, COL1A1, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGF1, FGF10, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRH1, IGF1, IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, INSL3, INSL4, KL 10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9, MSMB, NTN4, ODZ1, PAP, PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDH1 , CDH10, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDH1 , CDH10, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROB02, CD44, ILK, ITGA1, APC, CD164, COL6A1, MTSS1, PAP, TGFB1I1, AGR2, AIG1, AKAP1, AKAP2, CANT1 , CAV1 , CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYC1 , DAB2IP, DES, DNCL1, ELAC2, EN02, EN03, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEB1, GAGEC1 , GGT1 , GSTP1, HIP1, HUMCYT2A, IL29, K6HF, KAI1, KRT2A, MIB1, PART1, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PR1, PSCA, SLC2A2, SLC33A , SLC43A1, STEAP, STEAP2, TPM1, TP 2, TRPC6, ANGPT1, ANGPT2, ANPEP, ECGF1 , EREG, FGF1, FGF2, FIGF, FLT1 , JAG1, KDR, LAMA5, NRP1, NRP2, PGF, PLXDC1 , STAB1, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAI1, COL4A3, IL8, LAMA5, NRP1, NRP2, STAB1, ANGPTL4, PECAM1, PF4, PR0K2, SERPINF1, TNFAIP2, CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL10, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNA1, IFNB1 , IFNG, IL1B, IL6, MDK, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFB1 , TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, COL18A1, EDG1 , ENG, ITGAV, ITGB3, THBS1, THBS2, BAD, BAG1, BCL2, CCNA1 , CCNA2, CCND1 , CCNE1, CCNE2, CDH1 (E-cadherina), CDKN1B (p27Kip1), CDKN2A (p16INK4a), COL6A1, CTNNB1 (b-catenina), CTSB (catepsina B), ERBB2 (Her-2), ESR1, ESR2, F3 (TF), FOSL1 (FRA-1), GATA3, GSN (Gelsolin), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST (glucoproteina 130), ITGA6 (a6 integrina), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-Jun), MKI67 (Ki-67), NGFB (NGF), NGFR, NME1 (NM23A), PGR, PLAU (uPA), PTEN, SERPINB5 (maspin), SERPINE1 (PAI-1), TGFA, THBS1 (tromboespondina 1), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), TOP2A (topoisomerasa lia), TP53, AZGP1 (zinc-a-glucoproteína), BPAG1 (plectina), CDKN1A (p21 Wap1/Cip1 ), CLDN7 (claudina 7), CLU (clusterina), ERBB2 (Her-2), FGF1, FLRT1 (fibronectina), GABRP (GABAa), GNAS1, ID2, ITGA6 (a6 integrina), ITGB4 (b 4 integrina), KLF5 (GC Box BP), KRT 19 (Queratina 19), KRTHB6 (queratina tipo II específica de cabello), MACMARCKS, T3 (metalotionectina III), MUC1 (mucina), PTGS2 (COX-2), RAC2 (p21Rac2), S100A2; SCGB1D2 (lipofilina B), SCGB2A1 (mamaglobina 2), SCGB2A2 (mamaglobina 1), SPRR1B (Spr1), THBS1, THBS2, THBS4, y TNFAIP2 (B94), RON, c-Met, CD64, DLL4, PLGF, CTLA4, fosfatidilserina, ROB04, CD80, CD22, CD40, CD23, CD28, CD80, CD55, CD38, CD70, CD74, CD30, CD138, CD56, CD33, CD2, CD137, DR4, DR5, RANKL, VEGFR2, PDGFR, VEGFR1, TSP1, MSP, EPHB2, EPHA1, EPHA2, EpCAM, PGE2, NKG2D, LPA, SIP, APRIL, BCMA, MAPG, FLT3, PDGFR alfa, PDGFR beta, ROR1, PSMA, PSCA, SCD1, y CD59. Los objetivos preferibles (uno o más) implicados en enfermedades oncológicas a los que las DVD-lgs se pueden unir además de PGE2 incluyen, pero no se limitan a, aquellos seleccionados a partir de la lista anterior.
Se contemplan las DVD Igs que se pueden unir a los siguientes pares de objetivos para tratar enfermedad oncológica: TNF de humano o de ratón y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1 b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec.2) y PGE2, e IGFR y PGE2 (véase Ejemplos). 9. Enfermedades infecciosas El factor de necrosis tumoral y la prostaglandina E2 han sido implicados en la mediación de efectos biológicos observados en una variedad de enfermedades infecciosas. Por ejemplo, TNFa ha sido implicado en la mediación de inflamación cerebral y trombosis capilar e infarto en malaria (véase, por ejemplo, Tracey y Cerami, supra). TNFa también ha sido implicado en la mediación de inflamación cerebral, que induce la degradación de la barrera que hemato-encefálica, disparó del síndrome de choque séptico y activación de infarto venoso en meningitis (véase, por ejemplo, Tracey y Cerami, supra). TNFa también ha sido implicado en la inducción de caquexia, estimulación de proliferación viral y en la mediación de lesión al sistema nervioso central en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) (véase, por ejemplo, Tracey y Cerami, supra). Por consiguiente, las moléculas de DVD-lg o porciones de DVD-lg, de la invención, se pueden utilizar en el tratamiento de enfermedades infecciosas, incluyendo meningitis bacteriana (véase por ejemplo, publicación de solicitud de patente europea No. EP 585 705), malaria cerebral, SIDA y complejo relacionado con SIDA (ARC) (véase, por ejemplo, publicación de solicitud de patente europea No. EP 230 574), algunas enfermedades inducidas por virus, tales como el síndrome de Guillain Barré, mononucleosis infecciosa, otras linfoadenopatías e infecciones virales con virus del herpes; así como infección por citomegalovirus secondaria al transplante (véase por ejemplo, Fietze, E., et al. (1994) Transplantation 58:675-680). Las moléculas de DVD-lgTM o porciones de DVD-lgTM, de la invención, también se pueden utilizar para aliviar síntomas asociados con enfermedades extensas, incluyendo fiebre y mialgias debido a infección (tal como influenza) y caquexia secundaria a la infección (por ejemplo, secundaria a SIDA o ARC).
Se contemplan las DVD Igs que se pueden unir a los siguientes pares de objetivos para tratar enfermedad infecciosa: TNF de humano o de ratón y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec.2) y PGE2, e IGFR y PGE2 (véase Ejemplos). 10. Transplante El factor de necrosis tumoral y la prostaglandina E2 han sido implicados como mediadores clave del rechazo de aloinjerto y enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD) y en la mediación de una reacción adversa que ha sido observada cuando se utiliza el anticuerpo de rata OKT3, dirigido contra el complejo CD3 del receptor de célula T, para inhibir el rechazo de trasplantes renales (véase, por ejemplo, Tracey y Cerami, supra; Eason, J. D., et al. (1995) Transplantation 59:300-305; Suthanthiran, M. y Strom, T. B. (1994) New Engl. J. Med. 331:365-375). Por consiguiente, los anticuerpos, y porciones de anticuerpo, de la invención, se pueden utilizar para inhibir el rechazo de transplante, incluyendo rechazos de aloinjertos y xenoinjertos y para inhibir. Aunque la molécula de DVD-lg™ o porción de DVD-lg™ se puede utilizar sola, ésta se utiliza, de manera más preferida, en combinación con uno o más de otros agentes que inhiban la respuesta inmune contra el aloinjerto o que inhiban GVHD.
Por ejemplo, en una modalidad, se utiliza una molécula de DVD-lg™ o porción de DVD-lg™ de la invención en combinación con OKT3 para inhibir las reacciones inducidas por OKT3. En otra modalidad, se utiliza un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención en combinación con uno o más anticuerpos dirigidos a otros objetivos implicados en la regulación de las respuestas inmunes, tales como las moléculas de superficie celular CD25 (receptor a de interleucina 2), CD11a (LFA-1 ), CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7-1) y/o CD86 (B7-2). Incluso en otra modalidad, se utiliza un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención en combinación con uno o más agentes inmuno-supresores generales, tales como ciclosporina A o FK506.11.
Trastornos pulmonares El factor de necrosis tumoral ha sido implicado en la fisiopatología del síndrome de dificultad respiratoria del adulto, incluyendo activación endotelial de leucocito estimulante, dirigir la citotoxicidad a los neumocitos e inducir el síndrome de fuga vascular (véase, por ejemplo, Tracey y Cerami, supra). Por consiguiente, se pueden utilizar los anticuerpos, y porciones de anticuerpo, de la invención, para tratar varios trastornos pulmonares, incluyendo síndrome de dificultad respiratoria del adulto (véase, por ejemplo, Publicación del PCT No. WO 91/04054), síndrome de dificultad respiratoria aguda, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, sarcoidosis pulmonar, fibrosis y silicosis pulmonar. Las moléculas de DVD-lg™ o porciones de DVD-lg™, se pueden administrar sistémicamente o localmente a la superficie del pulmón, por ejemplo como un aerosol.
Se contemplan las DVD Igs que se pueden unir a los siguientes pares de objetivos para tratar trastornos relacionados con transplante: TNF de humano o de ratón y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1 b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec. 2) y PGE2, e IGFR y PGE2 (véase Ejemplos). 11. Trastornos intestinales El factor de necrosis tumoral y las prostaglandinas han sido implicadas en la fisiopatología de trastornos inflamatorios del intestino (véase, por ejemplo, Tracy, K. J., et al. (1986) Science 234:470-474; Sun, X-M., et al. (1988) J. Clin. Invest. 81:1328-1331; MacDonald, T. T., et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81:301-305). Los anticuerpos quiméricos anti-hTNFa de múrido han sido sometidos a evaluación clínica para tratamiento de enfermedad de Crohn (van Dullemen, H. M., et al. (1995) Gastroenterology 109: 29-135). El anticuerpo anti-TNFa HUMIRA ha sido aprobado para el tratamiento de enfermedad de Crohn. Las moléculas de DVD-lg™ o porciones de DVD-lg™, de la invención también se pueden utilizar para tratar trastornos intestinales, tales como enfermedad inflamatoria del intestino idiopática, la cual incluye dos síndromes, enfermedad de Crohn y colitis ulcerante.
Se contemplan las DVD Igs que se pueden unir a los siguientes pares de objetivos para tratar enfermedad intestinal: TNF de humano o de ratón y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1 b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec.2) y PGE2, e IGFR y PGE2 (véase Ejemplos). 12. Trastornos cardiacos Las moléculas de DVD-lg™ o porciones de DVD-lg™ de la invención también se puede utilizar para tratar varios trastornos cardiacos, incluyendo isquemia del corazón (véase, por ejemplo, publicación de solicitud de patente europea No. EP 453 898) e insuficiencia cardiaca (debilidad del músculo cardíaco) (véase por ejemplo, Publicación del PCT No. WO 94/20139).
Se contemplan las DVD Igs que se pueden unir a los siguientes pares de objetivos para tratar enfermedad cardiaca: TNF de humano o de ratón y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1 b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec. 2) y PGE2, e IGFR y PGE2 (véase Ejemplos). 13. Otros Las moléculas de DVD-lg™ o porciones de DVD-lg™ de la invención también se pueden utilizar para tratar algunos otros trastornos en los cuales las actividades de TNFa y/o PGE2 son perjudiciales. Los ejemplos de otras enfermedades y trastornos en los cuales las actividades de TNFa y/o PGE2 han sido implicadas en la fisiopatología, y por lo tanto que se pueden tratar utilizando una molécula de DVD-lg™ o porción de DVD-lg™ de la invención incluyen trastornos inflamatorios del hueso, enfermedad de crecimiento óseo y enfermedad de resorción de tejido óseo (véase, por ejemplo, Bertolini, D. R., et al. (1986) Nature 319:516-518; Konig, A., et al. (1988) J. Bone Miner. Res. 3:621-627; Lerner, U. H. y Ohlin, A. (1993) J. Bone Miner. Res. 8: 147-155; y Shankar, G. y Stem, P. H. (1993) Bone 14:871-876), hepatitis, incluyendo hepatitis alcohólica (véase por ejemplo, McCIain, C. J. y Cohén, D. A. (1989) Hepatology 9:349-351; Felver, M. E., et al. (1990) Alcohol. Clin. Exp. Res. 14:255-259; y Hansen, J., et al. (1994) Hepatology 20:461-474) y hepatitis viral (Sheron, N., et al. (1991) J. Hepatol. 12:241-245; y Hussain, M. J., et al. (1994) J. Clin. Pathol. 47:1112-1115), alteraciones de la coagulación (véase por ejemplo, van der Poli, T., et al. (1990) N. Engl. J. Med. 322: 1622-1627; y van der Poli, T., et al. (1991) Prog. Clin. Biol. Res. 367:55-60), quemaduras (véase por ejemplo, Giroir, B. P., et al. (1994) Am. J. Physiol. 267:H 18-124; y Liu, X. S., et al. (1994) Burns 20:40-44), daño por reperfusión (véase por ejemplo, Scales, W. E., et al. (1994) Am. J. Physiol. 267:G1122- 1127; Serrick, C, et al. (1994) Transplantation 58:1158-1162; y Yao, Y. M. , et al. (1995) Resuscitation 29:157-168), formación de queloide (véase por ejemplo, McCauley, R. L, et al. (1992) J. Clin. Immunol. 12:300-308), formación de tejido cicatricial y pirexia, artritis alérgica, trastornos hematológicos, tales como anemias hemolíticas y trombocitopenias, trastornos endocrinológicos, tales como diabetes mellitus, enfermedad de Addison, hipoparatiroidismo idiopático y tiroiditis linfocítica crónica, trastornos de la reproducción tales como, infertilidad, abortos recurrentes y eclampsia, y trastornos oculares tales como degeneración macular relacionada con la edad (AMD).
Se contemplan las DVD Igs que se pueden unir a los siguientes pares de objetivos para tratar las enfermedades anteriores: TNF de humano o de ratón y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1 b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. ,1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec. 2) y PGE2, e IGFR y PGE2 (véase Ejemplos).
IV. Composiciones farmacéuticas La invención también provee composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión, de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas de unión de la invención son para ser utilizadas en, pero sin limitarse a, diagnosticar, detectar, o monitorear un trastorno,, en la prevención, tratamiento, a manejo, o alivio de un trastorno o de uno o más síntomas del mismo, y/o en investigación. En una modalidad específica, una composición comprende una o más proteínas de unión de la invención. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una o más proteínas de unión de la invención y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos además de las proteínas de unión de la invención para tratar un trastorno. En una modalidad, se sabe que los agentes profilácticos o terapéuticos son útiles para o han sido o actualmente están siendo utilizados en la prevención, tratamiento, manejo, o alivio de un trastorno de uno o más síntomas del mismo. De conformidad con estas modalidades, la composición también puede estar constituida por un vehículo, diluyente o excipiente.
Las proteínas de unión de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas apropiadas para administración a un individuo. Típicamente, la composición farmacéutica comprende una proteína de unión de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en la presente solicitud, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluyen cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina regulada con fosfatos, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, en la composición se incluyen agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio. Los vehículos farmacéuticamente aceptables también puede comprender cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, conservadores o amortiguadores, los cuales incrementan el tiempo de vida en anaquel o la efectividad del anticuerpo o porción de anticuerpo.
Se conocen varios sistemas de suministro y se pueden utilizar para administrar uno o más anticuerpos uno o más anticuerpos de la invención o la combinación de uno o más anticuerpos de la invención y un agente profiláctico o agente terapéutico útil para prevenir, manejar, tratar, o aliviar un trastorno o uno o más síntomas del mismo, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes que puedan expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro vector, etc. Los métodos para administrar un agente profiláctico o terapéutico de la invención incluyen, pero no se limitan a, administración por vía pareriteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), administración epidural, administración intratumoral, y administración en las mucosas (por ejemplo, vías intranasal y oral). Además, se puede utilizar la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente para conversión en aerosol. Véase, por ejemplo, patentes E.U.A. Nos. 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; y 4,880,078; y Publicaciones del PCT Nos. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903. En una modalidad, se administra una proteína de unión de la invención, terapia de combinación, o una composición de la invención utilizando tecnología para suministro de fármaco en pulmones Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). En una modalidad específica, los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención se administran por vía intramuscular, intravenosa, intratumoral, oral, intranasal, pulmonar, o subcutánea. Los agentes profilácticos o terapéuticos se pueden administrar mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección de bolo, mediante absorción a través de los recubrimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
En una modalidad, se puede utilizar la unión específica de nanotubos de carbono (CNTs) acoplados al anticuerpo a las células de tumor in vitro, seguido por su extirpación altamente específica con luz en el infrarrojo cercano (NIR) para elegir como blanco las células tumorales. Por ejemplo, se pueden utilizar lípidos polares modificados con biotina para preparar dispersiones de CNT no citotóxicas, biocompatibles, estables que después se unen a una o dos DVD-lgs convertidas en derivados con avidina neutralita dirigidas contra uno o más antígenos tumorales (por ejemplo, CD22) (Chakravarty, P. et al. (2008) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 105:8697-8702.
En una modalidad específica, sería deseable administrar los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención (ocalmente al área en necesidad de tratamiento; esto se puede lograr, por ejemplo, y no a manera de limitación, mediante infusión local, mediante inyección, o por medio de un implante, el implante es de un material poroso o no poroso, incluyendo membranas y matrices, tales como membranas sialásticas, polímeros, matrices fibrosas (por ejemplo, Tissuel®), o matrices de colágena. En una modalidad, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención antagonistas localmente al área afectada a un individuo para prevenir, tratar, manejar y/o aliviar un trastorno o un síntoma del mismo. En otra modalidad, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención localmente al área afectada en combinación con una cantidad efectiva de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) diferentes de una proteína de unión de la invención de un individuo para prevenir, tratar, manejar, y/o aliviar un trastorno o uno o más síntomas del mismo.
En otra modalidad, el agente profiláctico o terapéutico se puede suministrar en un sistema de liberación controlada o liberación sostenida. En una modalidad, se puede utilizar una bomba para lograr la liberación controlada o sostenida (véase Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos para lograr la liberación controlada o sostenida de las terapias de la invención (véase por ejemplo, Medical Applications of Controlled Reléase, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Fia. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véase también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); patente E.U.A. No. 5,679,377; patente E.U.A. No. 5,916,597; patente E.U.A. No. 5,912,015; patente E.U.A. No. 5,989,463; patente E.U.A. No. 5,128,326; Publicación del PCT No. WO 99/15154; y Publicación del PCT No. WO 99/20253. Los ejemplos de polímeros utilizados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(etileno-co-acetato de vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglucólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), poliláctidos (PLA), poli(láctido-co-glucólidos) (PLGA), y poliortoésteres. En una modalidad, el polímero utilizado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas que puedan lixiviar, estable en almacenamiento, estéril y biodegradable. Incluso en otra modalidad, se puede colocar un sistema de liberación controlada o sostenida en proximidad del objetivo profiláctico o terapéutico, requiriendo de esta manera sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
Los sistemas de liberación controlada son discutidos en la revisión de Langer (1990, Science 249:1527-1533). Se puede utilizar cualquier técnica conocida por el experto en la técnica para producir formulaciones de liberación sostenida que comprendan uno o más agentes terapéuticos de la invención. Véase, por ejemplo, patente E.U.A. No. 4,526,938, Publicación del PCT WO 91/05548, Publicación del PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cáncer Xenograft Using a Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application", Pro. Int'l. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater. 24:853-854, y Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery", Proc. Int'l. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24:759-760.
En una modalidad específica, en la cual la composición de la invención es un ácido nucleico que codifica para un agente profiláctico o terapéutico, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para promover la expresión de su agente profiláctico o terapéutico codificado, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de modo tal que éste se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (véase patente E.U.A. No. 4,980,286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o recubrimiento con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o administrándolo en conexión con un péptido de homeobox el cual se sabe que entra al núcleo (véase, por ejemplo, Jolíot et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). De manera alternativa, se puede introducir un ácido nucleico de manera intracelular e incorporar dentro del ADN de la célula hospedera para expresión mediante recombinación homologa.
Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración pretendida. Los ejemplos de vías de administración incluyen, pero no se limitan a, administración por vía parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, intranasal (por ejemplo, inhalación), transdérmica (por ejemplo, tópica), trans-mucosas, y rectal. En una modalidad específica, la composición se formula de conformidad con procedimientos acostumbrados como una composición farmacéutica adaptada para administración por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal, o tópica a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración por vía intravenosa son soluciones en solución amortiguadora acuosa isotónica estéril. En donde sea necesario, la composición también puede incluir un agente para solubilización y un anestésico local tal como lignocamne para aliviar el dolor en el sitio de la inyección.
Si las composiciones de la invención se van a administrar por vía tópica, las composiciones se pueden formular en forma de ungüento, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, aspersión, aerosol, solución, emulsión, u otra forma bien conocida por el experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19a edición, Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). En una modalidad, para formas de dosificación tópicas no asperjables, se utilizan formas viscosas a semisólidas o sólidas que comprenden un vehículo o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica mayor que la del agua. Las formulaciones apropiadas incluyen, sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, bálsamos, y similares , los cuales, si se desea, se esterilizan o mezclan con agentes auxiliares (por ejemplo, conservadores, estabilizadores, agentes humectantes, amortiguadores, o sales) para influir en varias propiedades, tal como, por ejemplo, presión osmótica. Otras formas de dosificación tópica apropiadas incluyen preparaciones en aerosol asperjables en las cuales el ingrediente activo, en una modalidad, en combinación con un vehículo sólido o líquido inerte, se empaca en una mezcla con un volátil presurizado (por ejemplo, un propelente gaseoso, tal como freón) o en una botella comprimible. También se pueden agregar hidratantes o humectantes a las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación si se desea. Los ejemplos de dichos ingredientes adicionales son bien conocidos en la técnica.
Si el método de la invención comprende administración por vía intranasal de una composición, la composición se puede formular en forma de un aerosol, aspersión, niebla o en forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para uso de conformidad con la presente invención se pueden suministrar de manera conveniente en forma de una presentación de aspersión en aerosol a partir de paquetes presurizados o de un nebulizador, con el uso de un propelente apropiado (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas apropiado). En el caso de un aerosol presurizado la dosis unitaria se puede determinar proveyendo una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos (constituidos, por ejemplo, por gelatina) para uso en un inhalador o insuflador se pueden formular de modo tal que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo apropiada tal como lactosa o almidón.
Si el método de la invención comprende administración por vía oral, las composiciones se pueden formular oralmente en forma de tabletas, cápsulas, obleas, gelcaps, soluciones, suspensiones, y similares. Las tabletas o cápsulas se pueden preparar utilizando medios convencionales con excipientes farmacéuticamente .aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona, o hidroxipropil-metilcelulosa); materiales de relleno (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina, o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, o sílice); desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa o almidón-glicolato de sodio); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Las tabletas se pueden recubrir utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración por vía oral pueden tomar forma de, pero sin limitarse a, soluciones, jarabes o suspensiones, o éstas se pueden presentar como un producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo apropiado antes del uso. Dichas preparaciones líquidas se pueden preparar utilizando medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes para suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa, o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsificantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico, o aceites vegetales fraccionados); y conservadores (por ejemplo, metil-o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales amortiguadoras, saborizantes, colorantes, y edulcorantes según sea apropiado. Las preparaciones para administración por vía oral se pueden formular de manera apropiada para liberación lenta, liberación controlada, o liberación sostenida de un agente o agentes profilácticos o terapéuticos.
El método de la invención puede comprender administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, de una composición formulada con un agente para conversión en aerosol. Véase, por ejemplo, patentes E.U.A. Nos. 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; y 4,880,078; y Publicaciones del PCT Nos. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903. En una modalidad específica, se administra una proteína de unión de la invención, terapia de combinación, y/o composición de la invención utilizando tecnología de suministro de fármaco pulmonar Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).
El método de la invención puede comprender la administración de una composición formulada para administración parenteral mediante inyección (por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua). Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria (por ejemplo, en ampolletas o en contenedores de dosis múltiples) con un conservador agregado. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes para formulación tales como agentes para suspensión, estabilizadores y/o dispersantes. De manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstitución con un vehículo apropiado (pór ejemplo, agua estéril libre de pirógenos) antes del uso.
Los métodos de la invención pueden comprender adicionalmente la administración de composiciones formuladas como preparaciones para depósito. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar mediante implante (por ejemplo, en forma subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos apropiados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o en resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles (por ejemplo, como una sal poco soluble).
Los métodos de la invención abarcan la administración de composiciones formuladas como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como aquellas obtenidas a partir de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con canciones tales como los obtenidos a partir de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína, etc.
En términos generales, los ingredientes de las composiciones se suministran ya sea por separado o mezclados entre sí en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolleta o bolsita que indique la cantidad del agente activo. En casos que el modo de administración sea infusión, la composición se puede surtir con una botella para infusión que contenga agua o solución salina de grado farmacéutico. En casos en los que el modo de administración sea mediante inyección, se puede proveer una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
En particular, la invención también provee que uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas de la invención esté(n) empacado(s) en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolleta o bolsita que indique la cantidad del agente. En una modalidad, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas de la invención se suministran como un polvo liofilizado esterilizado seco or concentrado libre de agua en un contenedor herméticamente sellado y se puede reconstituir (por ejemplo, con agua o solución salina) hasta la concentración apropiada para administración a un individuo. En una modalidad, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la invención se suministra como un polvo liofilizado esterilizado seco en un contenedor herméticamente sellado a una dosis unitaria de por lo menos 5 mg, por lo menos 10 mg, por lo menos 15 mg, por lo menos 25 mg, por lo menos 35 mg, por lo menos 45 mg, por lo menos 50 mg, por lo menos 75 mg, o por lo menos 100 mg. Los agentes profilácticos o terapéuticos o las composiciones farmacéuticas de la invención liofilizados(as) se deben almacenar a una temperatura entre 2°C y 8°C en su contenedor original y los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas de la invención se deben administrar en el transcurso de 1 semana, por ejemplo, dentro de 5 días, dentro de 72 horas, dentro de 48 horas, dentro de 24 horas, dentro de 12 horas, dentro de 6 horas, dentro de 5 horas, dentro de 3 horas, o dentro de 1 hora después que se reconstituyen. En una modalidad alternativa, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o las composiciones farmacéuticas de la invención se suministra en forma líquida en un contenedor herméticamente sellado que indique la cantidad y concentración del agente. En una modalidad, la forma líquida de la composición administrada se suministra en un contenedor herméticamente sellado por lo menos 0.25 mg/ml, por lo menos 0.5 mg/ml, por lo menos 1 mg/ml, por lo menos 2.5 mg/ml, por lo menos 5 mg/ml, por lo menos 8 mg/ml, por lo menos 10 mg/ml, por lo menos 15 mg/kg, por lo menos 25 mg/ml, por lo menos 50 mg/ml, por lo menos 75 mg/ml, por lo menos 100 mg/ml, por lo menos 150 mg/ml, o por lo menos 200 mg/ml. la forma líquida se debe almacenar a una temperatura entre 2°C y 8°C en su contenedor original.
Las proteínas de unión de la invención se pueden incorporar en una composición farmacéutica apropiada para administración parenteral. En una modalidad, el anticuerpo o porciones de anticuerpo se preparan como una solución inyectable que contiene 0.1-250 mg/ml de proteína de unión. La solución inyectable puede estar constituida por una forma de dosificación líquida o liofilizada en un frasco de vidrio transparente o de color ámbar, ampolleta o jeringa pre-llenada. El amortiguador puede ser L-histidina (1-50 mM), de manera óptima 5-10 mM, a pH 5.0 a 7.0 (de manera óptima pH 6.0). Otros amortiguadores apropiados incluyen pero no se limitan a, succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. Se puede utilizar cloruro de sodio para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (de manera óptima 150 mM para una forma de dosificación líquida). Se pueden incluir crioprotectores para una forma de dosificación liofilizada, principalmente 0-10% de sacarosa (de manera óptima 0.5-1.0%). Otros crioprotectores apropiados incluyen trehalosa y lactosa. Se puede incluir agentes para volumen para una forma de dosificación liofilizada, principalmente 1-10% de manitol (de manera óptima 2-4%). Se pueden utilizar estabilizadores en formas de dosificación tanto líquidas como liofilizadas, principalmente L-metionina 1-50 mM (de manera óptima 5-10 mM). Otros agentes para volumen apropiados incluyen glicina, arginína, pueden ser incluidos como 0-0.05% de polisorbato 80 (de manera óptima 0.005-0.01%). Agentes tensoactivos adicionales incluyen pero no se limitan a polisorbato 20 y agentes tensoactivos de tipo BRIJ. La composición farmacéutica que comprende las proteínas de unión de la invención preparada como una solución inyectable para administración por vía parenteral, también puede comprender un agente útil como un coadyuvante, tales como aquellos utilizados para incrementar la absorción, o dispersión de una proteína terapéutica (por ejemplo, anticuerpo). Un coadyuvante particularmente útil es hialuronidasa, tal como Hylenex® (hialuronidasa recombinante de humano). La adición de hialuronidasa a la solución inyectable mejora la biodisponibilidad en humanos después de la administración por vía parenteral, particularmente administración subcutánea. Esto también permite volúmenes de sitio de inyección más grandes (es decir mayores de 1 mi) con menos dolor y molestia, e incidencia mínima de reacciones en el sitio de inyección, (véase WO2004078140, y US2006104968).
Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables y para infusión), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma elegida depende del modo pretendido de administración y de la aplicación terapéutica. Las composiciones típicas están en forma de soluciones inyectables o para infusión, tal como las composiciones similares a las utilizadas para inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. El modo de administración elegido es por vía parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). En una modalidad, el anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.
Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada apropiada para concentración alta de fármaco. La soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados en la presente solicitud, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. En términos generales, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados en la presente solicitud. En el caso de polvos liofilizados, estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y secado por aspersión que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente esterilizada por filtración de la misma. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de agentes tensoactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede obtener incluyendo, en la composición, un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Las proteínas de unión de la presente invención se pueden administrar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, en una modalidad, la vía/modo de administración es inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Como será apreciado por el experto en la técnica, la vía y/o modo de administración puede variar en función de los resultados deseados. En algunas modalidades, el compuesto activo se puede preparar con un vehículo que pueda proteger el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilen-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágena, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o son conocidos en términos generales por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
En algunas modalidades, una proteína de unión de la invención se puede administrar por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también se puede encerrar en una casa de gelatina de cubierta dura o blanda, compactar como tabletas, o incorporar directamente en la dieta del individuo. Para administración terapéutica oral, los compuestos del incorporar con excipientes y utilizar en forma de tabletas que se puedan ingerir, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención mediante administración diferente a la parenteral, podría ser necesario recubrir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un materia! para evitar su inactivación.
En las composiciones también se pueden incorporar compuestos activos complementarios. En algunas modalidades, una proteína de unión de la invención se coformula con y/o se coadministra con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar trastornos con la proteína de unión de la invención. Por ejemplo, una proteína de unión de la invención se puede coformular y/o coadministrar con uno o más anticuerpos adicionales que se unan a otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que se unen a otras citocinas o que se unen a moléculas de superficie celular). Asimismo, se puede utilizar uno o más anticuerpos de la invención en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Dichas terapias de combinación pueden utilizar de manera conveniente dosis mas bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando de esta manera posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.
En algunas modalidades, una proteína de unión está ligada a un vehículo extensor del tiempo de vida media conocido en la técnica. Dichos vehículos incluyen, pero no se limitan a, el dominio Fe, polietilenglicol, y dextrano. Dichos vehículos se describen, por ejemplo, en la ^solicitud E.U.A. No. de Serie 09/428,082 y en la solicitud publicada del PCT No. WO 99/25044.
En una modalidad específica, se administran secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína de unión de la invención u otro agente profiláctico o terapéutico de la invención para tratar, prevenir, a manejar, o aliviar un trastorno o uno o más síntomas del mismo por medio de terapia de gen. Terapia de gen se refiere a la terapia efectuada mediante la administración a un individuo de un ácido nucleico expresado o susceptible de ser expresado. En esta modalidad de la invención, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo o agente profiláctico o terapéutico codificado de la invención que media un efecto profiláctico o terapéutico.
Se puede utilizar cualesquiera de los métodos para terapia de gen disponibles en la técnica de conformidad con la presente invención. Para la revisión es generales de los métodos de terapia de gen, véase Goldspiel et al, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; Mayo de 1993, TIBTECH 11 (5):155-215. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que se pueden utilizar se describen en Ausubel et al. (eds.), Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). La descripción detallada de varios métodos de terapia de gen se divulga en el documento US20050042664.
Las proteínas de unión de la invención son útiles para tratar varias enfermedades en las cuales los objetivos que son reconocidos por las proteínas de unión son perjudiciales. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerante, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis escleroderma, enfermedad de injerto contra hospedero, rechazo de trasplante de órgano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con transplante de órgano, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica, uveitis, choque séptico, síndrome de choque séptico, síndrome séptico, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, apoplejía, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, tumores malignos, insuficiencia cardiaca, infarto al miocardio, enfermedad de Addison, deficiencia poliglandular esporádica tipo I y deficiencia poliglandular tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) del adulto, alopecia, alopecia circunscripta, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerante, sinovitis enteropática, artropatía asociada con Chlámydia, Yersinia y Salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad ampollosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/Enfermedad del Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, Síndrome de Enfermedad de Inmunodeficiencia Adquirida, Enfermedades Relacionadas con Inmunodeficiencia Adquirida, Hepatitis B, Hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, pneumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada con enfermedad de tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de tejido conectivo mixta, enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada con lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de Sjógren, enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada con hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrante linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial post-infecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo 1 (hepatitis clásica autoinmune o lupoide), hepatitis autoinmune tipo 2 (hepatitis por anticuerpo anti-LKM), hipoglicemia mediada autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con transplante de órgano, enfermedad inmune crónica asociada con transplante de órgano, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, NOS de enfermedad renal, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad por esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmia del simpático, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad de tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjórgren, enfermedad/arteritis de Takayasu, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad autoinmune de la tiroides, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bocioso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixoedema primario, uveitis facogénica, vasculitis primaria, enfermedad hepática aguda con vitíligo, enfermedades hepáticas crónicas, cirrosis alcohólica, lesión hepática inducida por alcohol, coleosatatis, enfermedad hepática idiosincrática, hepatitis inducida por droga, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos del grupo B (GBS), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas tipo Th1 y tipo Th2, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor ), y cánceres tales como cáncer de pulmón, de mama, de estómago, de vejiga urinaria, de colon, de páncreas, de ovario, de próstata y rectal y tumores malignos hematopoyéticos (leucemia y linfoma), Abetalipoprotemiá, Acrocianosis, procesos parasitarios o infecciosos agudos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia por SIDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis por contacto alérgica, rinitis alérgica, rechazo, de aloinjerto, deficiencia de antitripsina alfa 1, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración de célula del asta anterior, terapia anti-cd3, síndrome antifosfolípido, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, aneurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arteriesclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrilación atrial (sostenida o paroxística), aleteo atrial, bloqueo atrioventricular, linfoma de célula B, rechazo de injerto de hueso, rechazo de trasplante de médula ósea (BMT), bloqueo de la rama del fascículo, linfoma de Burkitt, Quemaduras, arritmias cardiacas, síndrome de aturdimiento cardiaco, tumores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta de inflamación por bypass cardiopulmonar, rechazo de trasplante de cartílago, degeneraciones corticales cerebelares, trastornos del cerebelo, taquicardia atrial caótica o multifocal, trastornos asociados con quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CML), "alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica(CLL), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), intoxicación con salicilato crónico, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonale, enfermedad de arteria coronaria, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis negativa en cultivo, fibrosis quística, trastornos asociados a terapia con citocina, demencia pugilística, enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica de dengue, dermatitis, condiciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad aterioesclerótica diabética, enfermedad de cuerpo difuso de Lewy, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos de los ganglios básales, síndrome de Down en edad intermedia, trastornos del movimiento , inducidos por fármaco inducidos por fármacos que bloquean los receptores de dopamina del SNC, sensibilidad a fármacos, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección por virus de Epstein-Barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo de implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos arteriales periféricos funcionales, sepsis fúngica, gangrena gaseosa, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo de injerto de cualquier órgano o tejido, sepsis por Gram negativos, sepsis por Gram positivos, granulomas debido a organismos intracelulares, leucemia de célula pilosa, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo de trasplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombolítica trombocitopénica, hemorragia, hepatitis (A), arritmias del fascículo de His, infección por VIH/neuropatía de VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimiento hiperquinético, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos del movimiento hipoquinéticos, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática, citotoxicidad mediada por anticuerpo, Astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveitis/neuritis óptica, lesión por isquemia-reperfusión, apoplejía isquémica, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo de trasplante de riñon, legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo de trasplante de hígado, linfoedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, metabólico/idiopático, dolor de cabeza por migraña, trastorno multi-sistema mitocóndrico, enfermedad de tejido conectivo mixta, gammopatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, Mycobacterium avium intracellulare, tuberculosis por Mycobacterium, síndrome mielodisplásico, infarto al miocardio, trastornos isquémicos del miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crónica neonatal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I, fiebre neutropénica, linfoma de tipo no hodgkins, oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos arteriales oclusivos, terapia con okt3, orquitis/epididimitis, procedimientos de reversión de orquitis/vasectomia, organomegalia, osteoporosis, rechazo de trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de tumor maligno, rechazo de trasplante de la paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenne, enfermedad del pericardio, enfermedad ateroesclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía por Pneumocystis carinii, neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammopatía monoclonal, y síndrome de cambios de la piel), síndrome post perfusión, síndrome post bomba, síndrome de cardiotomía postinfarto al miocardio (post-MI), preeclampsia, Parálisis supranuclear Progresiva, hipertensión pulmonar primaria, terapia con radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynoud, enfermedad de Refsum, taquicardia de QRS estrecho regular, hipertensión renovascular, daño por reperfusión, cardiomiopatía restrictiva, sarcomas, escleroderma, corea senil, demencia senil de tipo cuerpo de Lewy, artropatías seronegativas, choque, anemia de célula falciforme, rechazo de aloinjerto de piel, síndrome de cambios de la piel, rechazo de trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelares, miositis estreptocócica, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxis sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, ALL de célula T o de FAB, Telangiectasia, tromboangitis obliterante, trombocitopenia, toxicidad, transplantes, trauma/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad de tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades cardiacas valvulares, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosas, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado con vital, síndrome de Wernicke-Korsakoff, enfermedad de Wilson, rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, (véase Peritt et al. Publicación del PCT No.
WO2002097048A2, Leonard et al, Publicación del PCT No. W09524918 A1, y Salfeld et al., Publicación del PCT No. WO00/56772A1).
Las DVD-lgs de la invención también pueden tratar una o más de las siguientes enfermedades: síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática aguda, poli-radiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto, alopecia circunscripta, anafilaxis, síndrome de anticuerpo anti-fosfolípido, anemia aplásica, arterieesclerosis, eczema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado con infección por Streptococcus, pérdida auditiva autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), miocarditis autoinmune, trombocitopenia autoinmune (AITP), blefaritis, bronquioectasis, penfigoide ampolloso, enfermedad cardiovascular, síndrome anti-fosfolípido catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatricial, síndrome clínicamente aislado (CIS) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico con inicio en la niñez, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética, Diabetes mellitus, hernia discal, prolapso discal, anemia hemolítica inmune inducida por fármaco, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, epiescleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barré,(GBS), fiebre del heno, síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis de cuerpo de inclusión, enfermedad inflamatoria ocular infecciosa, enfermedad desmielinizante inflamatoria, enfermedad cardiaca inflamatoria, enfermedad renal inflamatoria, IPF/UIP, iritis, queratitis, queratojuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de célula de Langerhan, Livedo reticularis, degeneración macular, tumores malignos, poliangiitis microscópica, espondilitis anquilosante, trastornos de neurona motora, penfigoide de membrana mucosa, insuficiencia de órgano múltiple, miastenia grave, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de la raíz del nervio, neuropatía, hepatitis no A no B, neuritis óptica, osteólisis, cáncer de ovario, JRA pauciarticular, enfermedad oclusiva de arteria periférica (PAOD), enfermedad vascular periférica (PVD), enfermedad de arteria periférica (PAD), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, polimialgia reumática, poliosis, JRA poliarticular, síndrome de deficiencia poliendocrina, polimiositis, polimialgia reumática (PMR), síndrome post-bomba, parkinsonismo primario, cáncer de próstata y rectal y tumores malignos ematopoyéticos (leucemia y linfoma), prostatitis, aplasia de eritrocito puro, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, restenosis, enfermedad cardiaca reumática, SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, iperostosis, y osteítis), escleroderma, amiloidosis secundaria, síndrome de dificultad respiratoria aguda, escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enfermedad de tejido conectivo asociada con silicón, dermatosis de Sneddon-Wilkinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, arteritis sistémica, retinitis toxoplásmica, necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversal, TRAPS (Receptor del Factor de Necrosis Tumoral, reacción alérgica tipo 1, diabetes tipo II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP), vasculitis, conjuntivitis primaveral, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome de VKH), degeneración macular húmeda, y cicatrización de heridas.
Las proteínas de unión de la invención se pueden utilizar para tratar a humanos que padecen de enfermedades autoinmunes, en particular aquellas asociadas con inflamación, incluyendo, artritis reumatoide, espondilitis, alergia, diabetes autoinmune, uveitis autoinmune. En una modalidad, las proteínas de unión de la invención o porciones de unión a antígeno de las mismas, se utilizan para tratar artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, diabetes mellitus dependiente de insulina y psoriasis.
En una modalidad, las enfermedades que se pueden tratar o diagnosticar con las composiciones y métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, cánceres primarios y metastásicos, incluyendo carcinomas de mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hepático, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario (incluyendo riñon, vejiga urinaria y urotelio), del tracto genital femenino (incluyendo cuello uterino, útero, y ovarios así como coriocarcinoma y enfermedad trofoblástica gestacional), del tracto genital masculino (incluyendo tumores de próstata, de las vesículas seminales, de los testículos y de las células germinales), de las glándulas endocrinas (incluyendo las glándulas tiroides, adrenales, y pituitaria), y de la piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas (incluyendo aquellos que se originan en hueso y tejidos blandos así como sarcoma de Kaposi), tumores del cerebro, nervios, ojos, y las meninges (incluyendo astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwannomas, y meningiomas), tumores sólidos que surgen de tumores malignos hematopoyéticos tales como leucemias, y linfomas (tanto linfomas de Hodgkin como linfomas de tipo no Hodgkin).
En una modalidad, los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos, se utilizan para tratar cáncer o en la prevención de metástasis de los tumores descritos en la presente solicitud ya sea cuando se utilizan solos o en combinación con radioterapia y/u otros agentes quimioterapéuticos.
Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con agentes que incluyen pero no se limitan a, agentes antineoplásicos, radioterapia, quimioterapia tal como agentes alquilantes de ADN, cisplatina, carboplatina, agentes anti-tubulina, paclitaxel, docetaxel, taxol, doxorrubicina, gemcitabina, gemzar, antraciclinas, adriamicina, inhibidores de topoisomerasa I, inhibidores de topoisomerasa II, 5- fluorouracilo (5-FU), leucovorin, irinotecano, inhibidores del receptor de tirosina cinasa (por ejemplo, erlotinib, gefitinib), inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), inhibidores de cinasa, y siRNAs.
De preferencia, las proteínas de unión de la invención o porciones de unión a antígeno de las mismas, se utilizan para tratar artritis reumatoide, artritis juvenil, espondilitis reumatoide, espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis gotosa, artritis psoriática, psoriasis, alergia, esclerosis múltiple, enfermedades desmielinizantes, diabetes autoinmune, lupus eritematoso sistémico, síndrome nefrótico, dolor por osteoartritis, dolor por artritis, dolor neuronal, choque séptico, lesión por quemadura, trauma, choque endotóxico, sepsis por Gram negativos, síndrome de choque séptico, transplante, enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD), enfermedad de hospedero contra injerto (HVGD), cáncer de cabeza y cuello, cáncer pulmonar, cáncer gástrico, cáncer de próstata, cáncer pancreático, caquexia secundaria a tumor maligno, meningitis bacteriana, malaria cerebral, SIDA, complejo relacionado con SIDA (ARC), síndrome de Guillain-Barré, mononucleosis infecciosa, linfoadenopatías virales, infecciones por virus del herpes, infección por citomegalovirus secundaria al transplante, fiebre y mialgias debidas a infección (tal como influenza), caquexia secundaria a (por ejemplo, secundaria a SIDA o ARC), síndrome de dificultad respiratoria del adulto, síndrome de dificultad respiratoria aguda, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, sarcoidosis pulmonar, fibrosis y silicosis pulmonar, enfermedad idiopática inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn y colitis ulcerante, isquemia del corazón, insuficiencia cardiaca (debilidad de músculo cardíaco), trastornos inflamatorios del hueso, enfermedad de crecimiento de hueso, enfermedad de resorción de tejido óseo, hepatitis, hepatitis alcohólica, hepatitis viral, alteraciones de la coagulación, quemaduras, daño por reperfusión, formación de queloide, formación de tejido cicatricial, pirexia, artritis alérgica, trastornos hematológicos, tales como anemias hemolíticas y trombocitopenias, trastornos endocrinológicos, tales como diabetes mellitus, enfermedad de Addison, hipoparatiroidismo idiopático, tiroiditis linfocítica crónica, trastornos de la reproducción, amenorrea, infertilidad, abortos recurrentes, eclampsia, trastornos oculares, degeneración macular relacionada con la edad (AMD).
Una proteína de unión de la invención también se puede administrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales útiles en el tratamiento de varias enfermedades.
Una proteína de unión de la invención se puede utilizar sola o en combinación para tratar dichas enfermedades. Se debe entender que las proteínas de unión se pueden utilizar solas o en combinación con un agente adicional, por ejemplo, un agente terapéutico, el agente adicional es seleccionado por el experto en la técnica por su propósito pretendido. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido la técnica como útil para tratar la enfermedad o condición que está siendo tratada por el anticuerpo de la presente invención. El agente adicional también puede ser un agente que imparta un atributo benéfico a la composición terapéutica, por ejemplo, un agente que afecte la viscosidad de la composición.
También se debe entender que las combinaciones que se van a incluir dentro de esta invención son aquellas combinaciones útiles para su propósito pretendido. Los agentes indicados más adelante son ilustrativos para dichos propósitos y no pretenden estar limitados. Las combinaciones, las cuales son parte de esta invención, pueden ser los anticuerpos de la presente invención y por lo menos un agente adicional que se selecciona a partir de las listas siguientes. La combinación también puede incluir más de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicionales si la combinación es tal que la composición formada puede efectuar su función pretendida.
Las combinaciones para tratar enfermedades autoinmunes e inflamatorias son fármacos no esteroidales anti-inflamatorios también conocidos como AINES (NSAIDS) los cuales incluyendo fármacos como ibuprofen. Otras combinaciones son los corticosteroides incluyendo prednisolona; los efectos secundarios bien conocidos del uso de esteroides se puede reducir o incluso eliminar reduciendo gradualmente la dosis de esteroide requerida cuando se trata a los pacientes en combinación con las DVD Igs de esta invención. Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para artritis reumatoide con los cuales un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención se puede combinar incluyen las siguientes: fármacos antiinflamatorios supresores de citocina (CSAID por sus siglas en inglés); anticuerpos para o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento de humano, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-23, interferónes, E AP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Las proteínas de unión de la invención, o porciones de unión a antígeno de las mismas, se pueden combinar con anticuerpos para moléculas de superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA o sus ligandos incluyendo CD154 (gp39 o CD40L).
Las combinaciones de agentes terapéuticos pueden interferir en diferentes puntos en la cascada autoinmune e inflamatoria subsiguiente; los ejemplos incluyen antagonistas de TNF tal como los anticuerpos humanizados o de humano para TNF, quiméricos, Adalimumab, (Publicación del PCT No. WO 97/29131), CA2 (Remicade™), CDP 571, y los receptores de TNF p55 o p75 solubles, derivados, de los mismos, (p75TNFR1gG (Enbrel™) o p55TNFR1gG (Lenercept), y también inhibidores de la enzima convertidora de TNFa (TACE); de manera similar los inhibidores de IL-1 (inhibidores de la enzima convertidora de lnterleucina-1 , IL-IRA etc.) pueden ser efectivos por la misma razón. Otras combinaciones incluyen interleucina 11. Incluso otra combinación incluye participantes clave de la respuesta autoinmune los cuales pueden actuar paralelos a, dependientes de o en concierto con la función de IL-12; en especial son antagonistas de IL-18 incluyendo anticuerpos para IL-18 o receptores de IL-18 solubles, o proteínas de unión a IL-18. Se ha demostrado que IL-12 y IL-18 tienen funciones que se traslapan pero distintas y una combinación de antagonistas para ambos podría ser más efectiva. Incluso otra combinación son los inhibidores anti-CD4 no agotantes. Incluso otras combinaciones incluyen antagonistas de la ruta co-estimuladora de CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2) incluyendo anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagonistas.
Las proteínas de unión de la invención también se pueden combinar con agentes, tales como metotrexato, 6-MP, azatioprina sulfasalazina, mesalazina, olsalazina cloroquinina/hidroxicloroquina, pencilamina, aurotiomalato (intramuscular y oral), azatioprina, cochicina, corticosteroides (orales, inhalados e inyección local), agonistas del adrenorreceptor beta-2 (salbutamol, terbutalina, salmeteral), xantinas (teofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromil, ketotifen, ipratropio y oxitropio, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil micofenolato, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofen, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización mediante citocinas pro-inflamatorias tales como TNF-a o IL-1 (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de MAP cinasa), inhibidores de la enzima convertidora de I L- 1 ß , inhibidores de la enzima convertidora de TNFa (TACE), inhibidores de señalización de célula T tales como los inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores solubles de TNF p55 o p75 y los derivados p75TNFRIgG (Enbrel™ y p55TNFRIgG (Lenercept)), sIL-1RI, sIL-IRII, slL-6R), citocinas anti-inflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGFp), celecoxib, ácido fólico, sulfato de hidroxicloroquina, rofecoxib, etanercept, infliximab, naproxen, valdecoxib, sulfasalazina, metilprednisolona, meloxicam, acetato de metilprednisolona, aurotiomalato de sodio, aspirina, acetónido de triamcinolona, napsilato de propoxifeno/apap, folato, nabumetona, diclofenac, piroxicam, etodolac, diclofenac sódico, oxaprozin, clorhidrato de oxicodona, bitartrato de hidrocodona/apap, diclofenac sódico/misoprostol, fentanil, anakinra, recombinante de humano, clorhidrato de tramadol, salsalato, sulindac, cianocobalamina/fa/piridoxina, acetaminofen, alendronato de sodio, prednisolona, sulfato de morfina, clorhidrato de lidocaína, indometacina, sulfato de glucosamina/condroitina, clorhidrato de amitriptilina, sulfadiazina, clorhidrato de oxicodona/acetaminofen, clorhidrato de olopatadina, misoprostol, naproxen sódico, omeprazol, ciclofosfamida, rituximab, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, anti-IL-18, anti-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, Roflumilast, IC-485, CDC-801, y Mesopram. Las combinaciones incluyen metotrexato o leflunomida y en casos de artritis reumatoide moderada o severo, ciclosporina.
Los agentes adicionales no limitativos los cuales también se pueden utilizar en combinación con una proteína de unión para tratar artritis reumatoide incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (AINES); fármacos anti-inflamatorios supresores de citocina (CSAIDs); CDP-571/BAY-10-3356 (anticuerpo anti-TNFa humanizado; Celltech/Bayer); cA2/infliximab (anticuerpo anti-TNFa quimérico; Centocor); 75 kdTNFR-lgG/etanercept (proteína de fusión de receptor de TNF-lgG de 75 kD; Immunex; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. ed. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNF-lgG (proteína de fusión del receptor TNF-lgG de 55 kD; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (anticuerpo anti-CD4 primatizado no agotantes; IDEC/SmithKIine; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, S185); DAB 486-IL-2 y/o DAB 389-IL-2 (proteínas de fusión IL-2; Seragen; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); anti-Tac (anti-IL-2Ra humanizado; Laboratorios de Diseño de Proteína/Roche); IL-4 (citocina anti-inflamatoria; DNAX/Schering); IL-IO (SCH 52000; IL-10 recombinante, citocina anti-inflamatoria; DNAX/Schering); IL-4; agonistas de IL-10 y/o IL-4 (por ejemplo, anticuerpos agonistas); IL-1RA (antagonista de receptor de IL-1; Synergen/Amgen); anakinra (Kineret®/Amgen); TNF-bp/s-TNF (proteína de unión a TNF soluble; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39. No. 9 (suplemento), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268. pp. 37-42); R973401 (inhibidor de fosfodiesterasa Tipo IV; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol..39, No. 9 (suplemento), S282); MK-966 (inhibidor de COX-2; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S81); lloprost (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S82); metotrexato; talidomida (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282) y fármacos relacionados con talidomida (por ejemplo, Celgen); leflunomida (inhibidor anti-inflamatorio y de citocina; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45, pp. 103-107); ácido tranexámico (inhibidor de activación de plasminógeno; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S284); T-614 (inhibidor de citocina; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); prostaglandina E1 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); Tenidap (fármaco anti-inflamatorio no esteroidal; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S280); Naproxen (fármaco anti-inflamatorio no esteroidal; véase por ejemplo, Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209-1213); Meloxicam (fármaco antiinflamatorio no esteroidal); Ibuprofen (fármaco anti-inflamatorio no esteroidal); Piroxicam (fármaco anti-inflamatorio no esteroidal); Diclofenac (fármaco anti-inflamatorio no esteroidal); Indometacina (fármaco anti-inflamatorio no esteroidal); Sulfasalazina (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S281); Azatioprina (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism {1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S281); inhibidor de ICE (inhibidor de la enzima convertidora interleucina-1 ß); zap-70 y/o inhibidor 1ck (inhibidor de la tirosina cinasa zap-70 o Ick); inhibidor de VEGF y/o inhibidor VEGF-R (inhibidores del factor de crecimiento de célula endotelial vascular o del receptor de factor de crecimiento de célula endotelial vascular; inhibidores de angiogénesis); fármacos corticosteroides anti-inflamatorios (por ejemplo, SB203580); inhibidores de TNF-convertasa; anticuerpos anti-IL-12; anticuerpos anti-IL-18; interleucina-11 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S296); interleucina-13 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S308); inhibidores interleucina-17 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S 120); oro; penicilamina; cloroquina; clorambucil; hidroxicloroquina; ciclosporina; ciclofosfamida; irradiación linfoide total; globulina anti-timocito; anticuerpos anti-CD4; CD5-toxinas; péptidos y colágena administrados por vía oral; lobenzarit disódico; agentes reguladores de citocina (CRAs por sus siglas en inglés) HP228 y HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); oligo-desoxinucleótidos de fosforotioato antisentido para ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor 1 soluble del complemento (TP10; T Cell Sciences, Inc.); prednisona; orgoteína; polisulfato de glucosaminoglucano; minociclina; anticuerpos anti-IL2R; líquidos marinos y botánicos (ácidos grasos de peces y semillas vegetales; véase por ejemplo, DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); auranofina; fenilbutazona; ácido meclofenámico; ácido flufenámico; globulina inmune intravenosa; zileuton; azaribina; ácido micofenólico (RS-61443); tacrolimus (FK-506); sirolimus (rapamicina); amiprilosa (terafectina); cladribina (2-clorodesoxiadenosina); metotrexato; inhibidores de bcl-2 (véase Bruncko, Milán et al., Journal of Medicinal Chemistry (2007), 50(4), 641-662); antivirales y agentes moduladores inmunes.
En una modalidad, la proteína de unión o porción de unión a antígeno de la misma, se administra en combinación con uno de los siguientes agentes para el tratamiento de artritis reumatoide: inhibidor de molécula pequeña de KDR, inhibidor de molécula pequeña de Tie-2; metotrexato; prednisona; celecoxib; ácido fólico; sulfato de hidroxicloroquina; rofecoxib; etanercept; infliximab; leflunomida; naproxen; valdecoxib; sulfasalazina; metilprednisolona; ibuprofen; meloxicam; acetato de metilprednisolona; aurotiomalato de sodio; aspirina; azatioprina; acetónido de triamcinolona; napsilato de propoxifeno/apap; folato; nabumetona; diclofenac; piroxicam; etodolac; diclofenac sódico; oxaprozin; clorhidrato de oxicodona; bitartrato de hidrocodona/apap; diclofenac sódico/misoprostol; fentanil; anakinra, recombinante de humano; clorhidrato de tr madol; salsalato; sulindac; cianocobalamina/fa/piridoxina; acetaminofen; alendronato sódico; prednisolona; sulfato de morfina; clorhidrato de lidocaína; indometacina; sulfato de glucosamina/condroitina; ciclosporina; clorhidrato de amitriptilina; sulfadiazina; clorhidrato de oxicodona/acetaminofen; clorhidrato de olopatadina; misoprostol; naproxen sódico; omeprazol; mofetil micofenolato; ciclofosfamida; rituximab; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-18 BP; IL-12/23; anti-IL 18; anti-IL 15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; Roflumilast; IC-485; CDC-801 ; y mesopram.
Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para enfermedad inflamatoria del intestino con los cuales se puede combinar una proteína de unión de la invención incluyen los siguientes: budenosida; factor de crecimiento epidérmico; corticosteroides; ciclosporina, sulfasalazina; aminosalicilatps; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores de tromboxano; antagonistas del receptor de IL-1; mAbs anti-IL-1 ß; mAbs anti-IL-6; factores de crecimiento; inhibidores de elastasa; compuestos de piridinil-imidazol; anticuerpos para o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento de humano, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con anticuerpos para moléculas de superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes, tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil micofenolato, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofen, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización mediante citocinas pro-inflamatorias tales como TNFa o IL-1 (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de MAP cinasa), inhibidores de la enzima convertidora de IL-ip, inhibidores de la enzima convertidora de TNFa, inhibidores de señalización de célula T tales como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores solubles de citocina y derivados de los mismos (por ejemplo, los receptores solubles de TNF p55 o p75, slL-1RI, slL-1/RII, slL-6R) y citocinas anti-inflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF3) e inhibidores de bcl-2.
Los ejemplos de agentes terapéuticos para enfermedad de Crohn en los cuales se puede combinar una proteína de unión incluyen los siguientes: antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, Adalimumab (Publicación del PCT No. WO 97/29131; HUMIRA), CA2 (REMICADE), CDP 571, construcciones de TNFR-lg, inhibidores de (p75TNFRIgG (ENBREL) y p55TNFRIgG (LENERCEPT)) e inhibidores de PDE4. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con corticosteroides, por ejemplo, budenosida y dexametasona. Las proteínas de unión de la invención o porciones de unión a antígeno de las mismas, también se pueden combinar con agentes tales como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico y olsalazina, y agentes que interfieren con las síntesis o acción de citocinas pro-inflamatorias tales como IL-1, por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de I L- 1 ß e IL-1ra. Los anticuerpos de la invención o porción de unión a antígeno del mismo también se pueden utilizar con inhibidores de señalización de célula T, por ejemplo, 6-mercaptopurinas inhibidoras de tirosina cinasa. Las proteínas de unión de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con IL-11. Las proteínas de unión de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con mesalamina, prednisona, azatioprina, mercaptopurina, infliximab, succinato sódico de metilprednisolona, difenoxilato/sulfato de atrop, clorhidrato de loperamida, metotrexato, omeprazol, folato, ciprofloxacina/dextrosa-agua, bitartrato de hidrocodona/apap, clorhidrato de tetraciclina, fluocinonida, metronidazol, timerosal/ácido bórico, colestiramina/sacarosa, clorhidrato de ciprofloxacina, sulfato de hiosciamina, clorhidrato de meperidina, clorhidrato de midazolam, clorhidrato de oxicodona/acetaminofen, clorhidrato de prometazina, fosfato de sodio, sulfametoxazol/trimetoprim, celecoxib, policarbofilo, napsilato de propoxifeno, hidrocortisona, multivitaminas, balsalazida disódica, fosfato de codeína/apap, clorhidrato de colesevelam, cianocobalamina, ácido fólico, levofloxacinaa, metilprednisolona, natalizumab e ¡nterferón-gamma Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: corticosteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida, ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; interferón-ß? a (AVONEX; Biogen); interferón-ß? b (BETASERON; Chiron/Berlex); interferón a-n3) (Interferon Sciences/Fujimoto), interferón-a (Alfa Wassermann/J&J), interferón ß??-IF (Serono/ln ale Therapeutics), PEG-interferón a 2b (Enzon/Schering-Plough), Copolímero 1 (Cop-1; COPAXONE; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; clabribina; anticuerpos para o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento de humano y sus receptores, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Las proteínas de unión de la invención se pueden combinar con anticuerpos para moléculas de superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos. Las proteínas de unión de la invención, también se pueden combinar con agentes, tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil micofenolato, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofen, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización mediante citocinas pro-inflamatorias tales como TNFa o IL-I (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de MAP cinasa), inhibidores de la enzima convertidora de I L- 1 ß , inhibidores de TACE, inhibidores de señalización de célula T tales como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores solubles de citocina y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores solubles de TNF p55 o p75, slL-1RI, SIL-1RII, SIL-6R), citocinas anti-inflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGF3) e inhibidores de bcl-2.
Los ejemplos de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple en los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen interferón-ß, por ejemplo, IFN31a e IFtv^lb; Copaxone, corticosteroides, inhibidores de caspasa, por ejemplo inhibidores de caspasa-1, inhibidores de IL-1, inhibidores de TNF, y anticuerpos para el ligando de CD40 y CD80.
Las proteínas de unión de la invención, también se pueden combinar con agentes, tales como alemtuzumab, dronabinol, Unimed, daclizumab, mitoxantrona, clorhidrato de xaliproden, fampridina, acetato de glatirámero, natalizumab, sinnabidol, a-inmunocina NNS03, ABR-215062, AnergiX.MS, antagonistas de receptor de quimiocina, BBR-2778, calagualina, CPI-1189, LE (mitoxantrona encapsulada en liposomas), THCCBD (agonista canabinoide) MBP-8298, mesopram (inhibidor de PDE4), MNA-715, anticuerpo anti-receptor de IL-6, neurovax, pirfenidona alotrap 1258 (RDP-1258), sTNF-RI, talampanel, teriflunomida, TGF-beta2, tiplimotida, antagonistas de VLA-4 (por ejemplo, TR-14035, VLA4 U ltrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), antagonistas de interferón gamma, agonistas de I L-4.
Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para angina de pecho con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: aspirina, nitroglicerina , mononitrato de isosorbida, succinato de metoprolol, atenolol, tartrato de metoprolol , besilato de amlodipina, clorhidrato de diltiazem, dinitrato de isosorbida, bisulfato de clopidogrel , nifedipina , atorvastatina calcica, cloruro de potasio, furosemida , simvastatina , clorhidrato de verapamil, digoxina, clorhidrato de propranolol, carvedilol , lisinopril, espironolactona , clorohid rotiazida, maleato de enalapril , nadolol, ramipril , enoxaparina sódica, heparina sódica , valsartán, clorhidrato de sotalol, fenofibrato, ezetimiba, bumetanida , losarían potásico, lisinopril/clorohidrotiazida , felodipina , captopril , fumarato de bisoprolol.
Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para espondilitis anquilosante con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: ibuprofen , diclofenac y misoprostol, naproxen, meloxicam , indometacina , diclofenac, celecoxib, rofecoxib, Sulfasalazina , Metotrexato, azatioprina, minociclina , prednisona, etanercept, infliximab.
Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para asma con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: albuterol , salmeterol/fluticasona , montelukast sódico, propionato de fluticasona, budesonida , prednisona, xinafoato de salmeterol, clorhidrato de levalbuterol, sulfato de albuterol/ipratropio, fofato sódico de prednisolona, acetónido de triamcinolona, dipropionato de beclometasona, bromuro de ipratropio, azitromicina, acetato de pirbuterol, prednisolona, teofilina anhidra, succinato sódico de metilprednisolona, claritromicina, zafirlukast, fumarato de formoterol, vacuna del virus de la influenza, metilprednisolona, amoxicilina trihidratada, flunisolida, inyección para alergia, cromolin sódico, clorhidrato de fexofenadina, flunisolida/mentol, amoxicilina/clavulanato, levofloxacina, dispositivo auxiliar del inhalador, guaifenesina, fosfato sódico de dexametasona, clorhidrato de moxifloxacina, hiclato de doxiciclina, guaifenesina/d-metorfano, p-efedrina/cod/clorfenir, gatifloxacina, clorhidrato de cetirizina, furoato de mometasona, xinafoato de salmeterol, benzonatato, cefalexina, pe/hidrocodona/clorfenir, clorhidrato de cetirizina/pseudoefed, fenilefrina/cod/prometazina, codeína/prometazina, cefprozil, dexametasona, guaifenesina/pseudoefedrina, clorfeniramina/hidrocodona, nedocromil sódico, sulfato de terbutalina, epinefrina, metilprednisolona, sulfato de metaproterenol.
Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para COPD con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención ^incluyen los siguientes: sulfato de albuterol/ipratropio, bromuro de ipratropio, salmeterol/fluticasona, albuterol, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, prednisona, teofilina anhidra, succinato sódico de metilprednisolona, montelukast sódico, budesonida, fumarato de formoterol, acetónido de triamcinolona, levofloxacina, guaifenesina, azitromicina, dipropionato de beclometasona, clorhidrato de levalbuterol, flunisolida, ceftriaxona sódica, amoxicilina trihidratada, gatifloxacina, zafirlukast, amoxicilina/clavulanato, flunisolida/mentol, clorfeniramina/hidrocodona, sulfato de metaproterenol, metilprednisolona, furoato de mometasona, p-efedrina/cod/clorfenir, acetato de pirbuterol, p-efedrina/loratadina, sulfato de terbutalina, bromuro de tiotropio, (R,R)-formoterol, TgAAT, Cilomilast, Roflumilast.
Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para VHC con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: interferón-alfa-2a, interferón-alfa-2b, interferón-alfa conl, interferón-alfa-n1 , interferón-alfa-2a modificado con PEG, interferón-alfa-2b modificado con PEG, ribavirina, PEG-interferón alfa-2b + ribavirina, ácido ursodesoxicólico, ácido glicirrícico, timalfasin, Maxamina, VX-497 y cualesquiera compuestos que se utilicen para tratar VCH a través de intervención con los siguientes objetivos: polimerasa de VCH, proteasa de VCH, helicasa de VCH, IRES (sitio de entrada a ribosoma interno) de VCH.
Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para fibrosis pulmonar idiopática con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: prednisona, azatioprina, albuterol, colchicina, sulfato de albuterol, digoxina, gamma interferón, succinato sódico de metilprednisolona, lorazepam, furosemida, lisinopril, nitroglicerina, espironolactona, ciclofosfamida, bromuro de ipratropio, actinomicina d, alteplasa, propionato de fluticasona, levofloxacina, sulfato de metaproterenol, sulfato de morfina, clorhidrato de oxicodona, cloruro de potasio, acetónido de triamcinolona, tacrolimus anhidro, calcio, interferón-alfa, metotrexato, mofetil micofenolato, interferón-gamma-1 ß.
Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para infarto al miocardio con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: aspirina, nitroglicerina, tartrato de metoprolol, enoxaparina sódica, heparina sódica, bisulfato de clopidogrel, carvedilol, atenolol, sulfato de morfina, succinato de metoprolol, warfarina sódica, lisinopril, mononitrato de isosorbida, digoxina, furosemida, simvastatina, ramipril, tenecteplasa, maleato de enalapril, torsemida, retavasa, losartan potásico, clorhidrato de quinapril/carbonato de magnesio, bumetanida, alteplasa, enalaprilat, clorhidrato de amiodarona, clorhidrato de tirofiban m-hidratado, clorhidrato de diltiazem, captopril, irbesartán, valsartán, clorhidrato de propranolol, fosinopril sódico, clorhidrato de lidocaína, eptifibatida, cefazolin sódico, sulfato de atropina, ácido aminocaproico, espironolactona, interferón, clorhidrato de sotalol, cloruro de potasio, docusato sódico, clorhidrato de dobutamina, alprazolam, pravastatina sódica, atorvastatina cálcica, clorhidrato de midazolam, clorhidrato de meperidina, dinitrato de isosorbida, epinefrina, clorhidrato de dopamina, bivalirudina, rosuvastatina, ezetimiba/simvastatina, avasimiba, caripórida.
Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para psoriasis con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: inhibidor de molécula pequeña de KDR, inhibidor de molécula pequeña de Tie-2, calcipotrieno, propionato de clobetasol, acetónido de triamcinolona, propionato de halobetasol, tazaroteno, metotrexato, fluocinonida, betametasona diprop aumentado, acetónido de fluocinolona, acitretina, champú de alquitrán, valerato de betametasona, furpato de mometasona, ketoconazol, pramoxina/fluocinolona, valerato de hidrocortisona, flurandrenólido, urea, betametasona, propionato de clobetasol/emol, propionato de fluticasona, azitromicina, hidrocortisona, fórmula hidratante, ácido fólico, desonida, pimecrolimus, alquitrán de hulla, diacetato de diflorasona, folato de etanercept, ácido láctico, metoxsalen, hc/bismuto subgal/znox/resor, acetato de metilprednisolona, prednisona, bloqueador solar, halcinonida, ácido salicílico, antralina, pivalato de clocortolona, extracto de hulla, alquitrán de hulla/ácido salicílico, alquitrán de hulla/ácido salicílico/azufre, desoximetasone, diazepam, emoliente, fluocinonida/emoliente, aceite mineral/aceite de ricino/na lact, aceite mineral/aceite de cacahuate, petróleo/miristato de isopropilo, psoraleno, ácido salicílico, jabón/tribromsalan, timerosal/ácido bórico, celecoxib, infliximab, ciclosporina, alefacept, efalizumab, tacrolimus, pimecrolimus, PUVA, UVB, sulfasalazina.
Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para artritis psoriática con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: metotrexato, etanercept, rofecoxib, celecoxib, ácido fótico, sulfasalazina, naproxen, leflunomida, acetato de metilprednisolona, indometacina, sulfato de hidroxicloroquina, prednisona, sulindac, betametasona diprop aumentado, infliximab, metotrexato, folato, acetónido de triamcinolona, diclofenac, sulfóxido de dimetilo, piroxicam, diclofenac sódico, ketoprofen, meloxicam, metilprednisolona, nabumetona, tolmetin sódico, calcipotrieno, ciclosporina, diclofenac sódico/misoprostol, fluocinonida, sulfato de glucosamina, aurotiomalato de sodio, bitartrato de hidrocodona/apap, ibuprofen, risedronato sódico, sulfadiazina, tioguanina, valdecoxib, alefacept, efalizumab e inhibidores de bcl-2.
Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para reestenosis con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: sírolimus, paclitaxel, everolimus, tacrolimus, Zotarolimus, acetaminofen.
Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para ciática con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: bitartrato de hidrocodona/apap, rofecoxib, clorhidrato de ciclobenzaprina, metilprednisolona, naproxen, ibuprofen, clorhidrato de oxicodona/acetaminofen, celecoxib, valdecoxib, acetato de metilprednisolona, prednisona, fosfato de codeína/apap, clorhidrato de tramadol/acetaminofen, metaxalona, meloxicam, metocarbamol, clorhidrato de lidocaína, diclofenac sódico, gabapentina, dexametasona, carisoprodol, ketorolac trometamina, indometacina, acetaminofen, diazepam, nabumetona, clorhidrato de oxicodona, clorhidrato de tizanidina, diclofenac sódico/misoprostol, napsilato de propoxifeno/apap, asa/oxicod/oxicodona ter, ibuprofen/hidrocodona bit, clorhidrato de tramadol, etodolac, clorhidrato de propoxifeno, clorhidrato de amitriptilina, carisoprodol/codeína fos/asa, sulfato de morfina, multivitamínicos, naproxen sódico, citrato de orfenadrina, temazepam.
Los ejemplos de agentes terapéuticos para SLE (Lupus) en los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: NSAIDS, por ejemplo, diclofenac, naproxen, ibuprofen, piroxicam, indometacina; inhibidores de COX2, por ejemplo, Celecoxib, rofecoxib, valdecoxib; anti-palúdicos, por ejemplo, hidroxicloroquina; esteroides, por ejemplo, prednisona, prednisolona, budenosida, dexametasona; citotóxicos, por ejemplo, azatioprina, ciclofosfamida, mofetil micofenolato, metotrexato; inhibidores de PDE4 o inhibidor de síntesis de purina, por ejemplo Cellcept. Las proteínas de unión de la invención, también se pueden combinar con agentes tales como sulfasalazina, 5-aminoácido salicílico, olsalazina, Imuran y agentes que interfieren con la síntesis, producción o acción de citocinas pro-inflamatorias tales como IL-1, por ejemplo, inhibidores de caspasa tales como inhibidores de la enzima convertidora de I L-1 ß e IL-1ra. Las proteínas de unión de la invención también se pueden utilizar con inhibidores de señalización de célula T, por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasa; o moléculas que eligen como blanco las moléculas de activación de célula T, por ejemplo, anticuerpos para CTLA-4-lgG o anti-familia B7, anticuerpos anti-familia de PD-1. Las proteínas de unión de la' invención, se pueden combinar con IL-11 o anticuerpos anti-citocina, por ejemplo, fonotolizumab (anticuerpo anti-IFNg), o anticuerpos anti-receptor, por ejemplo, anticuerpo anti-receptor de IL-6 y anticuerpos para moléculas de superficie de célula B. Los anticuerpos de la invención o porción de unión a antígeno de los mismos también se pueden utilizar con LJP 394 (abetimus), agentes que agotar o inactiva las células B, por ejemplo, Rituximab (anticuerpo anti-CD20), linfostat-B (anticuerpo anti-BlyS), antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, Adalimumab (publicación del PCT No. WO 97/29131; HUMIRA), CA2 (REMICADE), CDP 571, construcciones de TNFR-lg, (p75TNFRIgG (ENBREL) y p55TNFRIgG (LENERCEPT)) e inhibidores de bcl-2, debido a que se ha demostrado que la sobre-expresión de bcl-2 en ratones transgénicos ocasiona un fenotipo tipo lupus (véase Marquina, Regina et al., Journal of Immunology (2004), 172(11), 7177-7185), por lo tanto, se espera que la inhibición tenga efectos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de una proteína de unión de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de unión puede ser determinada por el experto en la técnica y puede variar de conformidad con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, género, y peso del individuo, y la capacidad de la proteína de unión para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es aquella en la cual cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo, o porción de anticuerpo, son sobrepasados por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado Típicamente, debido a que se utiliza una dosis profiláctica en los individuos antes de o en una etapa temprana del enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.
Los regímenes de dosificación se pueden ajusfar para proveer la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un bolo individual, se pueden administrar varias dosis divididas con el tiempo o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente conveniente formular composiciones parenterales en formas de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosis. Forma de dosificación unitaria tal como se utiliza en la presente invención se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los individuos mamíferos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención queda dictada por y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico o profiláctico particular que se va a obtener, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formular dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en los individuos.
Un intervalo no limitativo, de ejemplo, para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de una proteína de unión de la invención es 0.1-20 mg/kg, por ejemplo, 1-10 mg/kg. Se debe indicar que los valores de dosis pueden variar con el tipo y gravedad de la condición que se va a aliviar. También se debe entender que para cualquier individuo particular, los regímenes de dosificación específicos se deben ajusfar con el tiempo de conformidad con las necesidades del individuo y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosis indicados en la presente solicitud son solamente ejemplos y no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reclamada.
Será fácilmente evidente para los expertos en la técnica que son evidentes otras modificaciones y adaptaciones apropiadas de los métodos de la invención descritos en la presente solicitud y que las mismas se pueden hacer utilizando equivalentes adecuados sin alejarse del alcance de la invención o de las modalidades descritas en la misma . Habiendo descrito la presente invención con detalle, la misma se entenderá más claramente mediante referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se incluyen para propósitos de ilustración únicamente y no pretenden ser limitativos de la invención .
V. Diagnósticos La descripción de la presente solicitud también provee aplicaciones de diagnóstico. Esto se elucida con mayor detalle más adelante.
I . Método de prueba La presente descripción también provee un método para determinar la presencia, cantidad o concentración de un analito (o fragmento del mismo) en una muestra de prueba utilizando por lo menos una DVD-lg cómola descrita en la presente solicitud . Se puede utilizar cualquier prueba propiedad tal como se conozca en la técnica, en el método. Los ejemplos incluyen , pero no se limitan a, inmuno-ensayo, tal como inmuno-ensayo en emparedado (por ejemplo, inmuno-ensayos en emparedado monocional, policlonal y/o DVD-lg o cualquier variación de los mismos (por ejemplo, monoclonal/DVD-lg , DVD-lg/policlonal, etc.), incluyendo detección de radioisótopos (dar inmuno-ensayo (RIA)) y detección de enzima (inmuno-ensayo de enzima (EIA) o la prueba con inmu no sorbente ligado a enzima (ELISA) (por ejemplo pruebas ELISA Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN))), inmuno-ensayo de inhibición competitiva (por ejemplo, de avance e inverso), inmuno-ensayo de polarización de fluorescencia (FPIA), técnica de inmuno-ensayo multiplicado con enzima (EMIT), transferencia de energía con resonancia de bioluminiscencia (BRET), y prueba químioluminiscente homogénea, etc. En un inmuno-ensayo basado en SELDI, un reactivo de captura que se une específicamente a un analito (o un fragmento del mismo) de interés se une a la superficie de una sonda de espectrometría de masas, tal como un arreglo de chip de proteína pre-activada. El analito (o un fragmento del mismo) se captura después específicamente en el biochip, y el analito capturado (o un fragmento del mismo) se detecta mediante espectrometría de masas. De manera alternativa, el analito (o un fragmento del mismo) se puede eluir del reactivo de captura y detectar mediante MALDI (desorción/ionización de láser asistido con matriz) tradicional o mediante SELDI. Un inmuno-ensayo de micropartícula químioluminiscente, en particular uno que utilice el analizador automatizado ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), es un ejemplo de un inmuno-ensayo preferido.
En la práctica de la presente descripción se utilizan métodos bien conocidos en la técnica para recolectar, manejar y procesar orina, sangre, suero y plasma, y otros fluidos corporales, por ejemplo, cuando se utiliza una DVD-lg como la descrita en la presente solicitud como un reactivo de inmuno-diagnóstico y/o en un estuche de inmuno-ensayo de analito. La muestra de prueba puede comprender porciones adicionales además del analito de interés, tales como anticuerpos, antígenos, haptenos, hormonas, fármacos, enzimas, receptores, proteínas, péptidos, polipéptidos, oligonucleótidos y/o polinucleótidos. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra de sangre entera que se obtiene a partir de un individuo. Puede ser necesario o deseado que una muestra de prueba, particularmente sangre entera, se trate antes del inmuno-ensayo como se describe en la presente solicitud, por ejemplo, con un reactivo de pretratamiento. Incluso en casos en los que el pretratamiento no sea necesario (por ejemplo, la mayoría de muestras de orina), el pretratamiento se puede efectuar de manera opcional (por ejemplo, como parte de un régimen en una plataforma comercial).
El reactivo de pretratamiento puede ser cualquier reactivo apropiado para uso con el inmuno-ensayo y estuches de la invénción. El pretratamiento comprende opcionalmente: (a) uno o más solventes (por ejemplo, metanol y etilenglicol) y opcionalmente, sal, (b) uno o más solventes y sal, y opcionalmente, detergente, (c) detergente, o (d) detergente y sal. Los reactivos de pretratamiento son conocidos en la técnica, y dicho pretratamiento se puede utilizar, por ejemplo, en la forma en que se utiliza para las pruebas en los analizadores Abbott TDx, AxSYM®, y ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), como se describe en la literatura (véase, por ejemplo, Yatscoff et al., Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood, Clin. Chem. 36:1969-1973 (1990), y Wallemacq et al, Evaluation of the New AxSY Cyclosporine Assay: Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood and EMIT Cyclosporine Assays, Clin. Chem. 45: 432-435 (1999)), y/o como los comercialmente disponibles. De manera adicional, el pretratamiento se puede efectuar como se describe en los siguientes documentos: patente E.U.A. No. 5,135,875, Publicación de patente europea No. 0 471 293, Solicitud provisional de patente E.U.A. 60/878,017, presentada el 29 de diciembre de 2006, y publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2008/0020401 todas de Abbott (incorporadas para referencia en sus totalidades por sus enseñanzas referentes al pretratamiento). El reactivo de pretratamiento puede ser un agente heterogéneo o un agente homogéneo.
Con el uso de un reactivo de pretratamiento heterogéneo, el reactivo de pretratamiento precipita la proteína de unión a analito (por ejemplo, proteína que se puede unir a un analito o un fragmento del mismo) presente en la muestra. Dicho paso de pretratamiento comprende retirar cualquier proteína de unión a analito separando la proteína de unión a analito precipitada del sobrenadante de la mezcla formada por la adición del agente de pretratamiento a la muestra. En dicha prueba, el sobrenadante de la mezcla sin ninguna proteína de unión se utiliza en la prueba, procediendo directamente al paso de captura de anticuerpo.
Con el uso de un reactivo de pretratamiento homogéneo no existe dicho paso de separación. La mezcla completa de la muestra de prueba y reactivo de pretratamiento se ponen en contacto con un compañero de unión específico marcado para el analito (o un fragmento del mismo), tal como un anticuerpo anti-analito marcado (o un fragmento antigénicamente reactivo del mismo). El reactivo de pretratamiento utilizado para dicha prueba típicamente se diluye en la mezcla de muestra de prueba pretratada, ya sea antes o durante la captura por el primer compañero de unión específico. A pesar de dicha dilución, una cierta cantidad del reactivo de pretratamiento sigue estando presente (o aún permanece) en la mezcla de muestra de prueba durante la captura. De conformidad con la invención, el compañero dé unión específico marcado puede ser una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma).
En un formato heterogéneo, después que se obtiene la muestra de prueba de un individuo, se prepara una primera mezcla. La mezcla contiene la muestra de prueba que está siendo analizada respecto a un analito (o un fragmento del mismo) y un primer compañero de unión específico, en donde el primer compañero de unión específico y cualquier analito contenido en la muestra de prueba forman un primer complejo de compañero de unión específico-analito. De preferencia, el primer compañero de unión específico es un anticuerpo anti-analito o un fragmento del mismo. El primer compañero de unión específico puede ser una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) como se describe en la presente solicitud. El orden en el cual la muestra de prueba y el primer compañero de unión específico se agregan para formar la mezcla no es crítico. De preferencia, el primer compañero de unión específico se inmoviliza sobre una fase sólida. La fase sólida utilizada en el inmuno-ensayo (por el primer compañero de unión específico y, opcionalmente, el segundo compañero de unión específico) puede ser cualquier fase sólida conocida en la técnica, tal como, pero sin limitarse a, partícula magnética, un glóbulo, un tubo de ensayo, una placa de microtitulación, una celda, una membrana, una molécula de andamiaje, una película, un papel filtro, un disco y un chip.
Después que se forma la mezcla que contiene al complejo de primer compañero de unión específico-analito, se retira del complejo cualquier analito no unido utilizando cualquier técnica conocida en el campo. Por ejemplo, el analito no unido se puede eliminar mediante lavado. De manera deseable, sin embargo, el primer compañero de unión específico está presente en exceso de cualquier analito presente en la muestra de prueba, de modo tal que todo el analito que está presente en la muestra de prueba es ligado por el primer compañero de unión específico.
Después que se retira cualquier analito no unido, se agrega un segundo compañero de unión específico a la mezcla para formar un complejo de primer compañero de unión específico-analito-segundo compañero de unión específico. El segundo compañero de unión específico de preferencia es un anticuerpo anti-analito que se une a un epítope en el analito que difiere del epítope en el analito ligado por el primer compañero de unión específico. Asimismo, también de preferencia, el segundo compañero de unión específico se marca con o contiene una marca detectable como se describió anteriormente. El segundo compañero de unión específico puede ser una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) como se describe en la presente solicitud.
Se puede utilizar cualquier marca detectable apropiada como se sabe en la técnica. Por ejemplo, la marca detectable puede ser una marca radioactiva (tal como 3H, 125l, 35S, 1 C, 3 P, y 33P), una marca enzimática (tal como peroxidasa de rábano, peroxidasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y similares), una marca quimioluminiscente (tal como ésteres, tioésteres, o sulfonamidas de acridinio; luminol, isoluminol, ésteres de fenantridinio y similares), una marca fluorescente (tal como fluoresceína (por ejemplo, 5-fluoresceína, 6-carboxifluoresceína, 3'6-carboxifluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, 6-hexacloro-fluoresceína, 6-tetraclorofluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, y similares)), rodamina, ficobiliproteínas, R-ficoeritrina, puntos de quantum (por ejemplo, selenuro de cadmio bloqueado con sulfuro de zinc), una marca termométrica, o una marca de reacción en cadena de inmuno-polimerasa. Una introducción a las marcas, procedimientos de marcado y detección de marcas se encuentra en Polak y Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2a edición, Springer Verlag, N. Y. (1997), y en Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), el cual es un manual y catálogo combinado publicado por Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon. Se puede utilizar una marca fluorescente en FPIA (véase, por ejemplo, patentes E.U.A. Nos. 5,593,896, 5,573,904, 5,496,925, 5,359,093, y 5,352,803,, las cuales se incorporan en la presente solicitud para referencia en sus totalidades). Se puede utilizar un compuesto de acridinio como una marca detectable en una prueba quimioluminiscente homogénea o heterogénea (véase, por ejemplo, Adamczyk et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006); Adamczyk et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:2313-2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 14:3917-3921 (2004); y Adamczyk et al., Org. Lett.5:3779-3782 (2003)).
Un compuesto de acridinio preferido es una acridinio-9-carboxamida. Los métodos para preparar 9-carboxamidas de acridinio se describen en Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6:107-114 (1991); Adamczyk et al., J. Org. Chem. 63:5636-5639 (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron 55:10899-10914 (1999); Adamczyk et al., Org. Lett. 1:779-781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem. 11:714-724 (2000); Mattingly et al., en Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Ratón, pp. 77-105 (2002); Adamczyk et al., Org. Lett. 5:3779-3782 (2003); y patentes E.U.A. Nos. 5,468,646, 5,543,524 y 5,783,699 (cada una de las cuales se incorpora en la presente solicitud para referencia en su totalidad por sus enseñanzas referentes a lo mismo). Otro compuesto de acridinio preferido es un éster acridinio-9-carboxilato de ariío. Un ejemplo de un éster acridinio-9-carboxilato de arilo es fluorosulfonato de 10-metil-9-(fenoxicarbonil)acridinio (disponible de Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Los métodos para preparar ésteres de acridinio-9-carboxilato de arilo se describen en McCapra et al., Photochem. Photobiol. 4:1111-21 (1965); Razavi et al., Luminescence 15:245-249 (2000); Razavi et al., Luminescence 15:239-244 (2000); patente E.U.A. No. 5,241,070 (cada una de las cuales se incorpora en la presente solicitud para referencia en su totalidad por sus enseñanzas referentes a lo mismo). Detalles adicionales referentes a éster acridinio-9-carboxilato de arilo y su uso se indican en el documento US 2008-0248493.
Las pruebas quimioluminiscentes (por ejemplo utilizando acridinio como se describió anteriormente u otros agentes quimioluminiscentes) se pueden efectuar de conformidad con los métodos descritos en Adamczyk et al., Anal. Chim. Acta 579(1):61-67 (2006). Aunque se puede utilizar cualquier formato de prueba apropiada, un medidor de quimioluminiscencia en microplaca (Mithras LB-940, Berthold Technologies E.U.A., LLC, Oak Ridge, TN) permite el análisis de muestras múltiples de volúmenes pequeños rápidamente.
El orden en el cual la muestra de prueba y el compañero o compañeros de unión específica se agregan para formar la mezcla para la prueba quimioluminiscente no es crítica. Si el primer compañero de unión específica está marcado en forma detectable con un agente quimioluminiscente tal como un compuesto de acridinio, se forman complejos de primer compañero de unión específica-analito marcados en forma detectable. De manera alternativa, si se utiliza un segundo compañero de unión específico y el segundo compañero de unión específica está marcado en forma detectable con un agente quimioluminiscente tal como un compuesto de acridinio, se forman complejos de primer compañero de unión específica-analito-segündo compañero de unión específica marcados de manera detectable. Cualquier compañero de unión específica no unido, ya sea que esté marcado o no, se puede retirar de la mezcla utilizando cualquier técnica conocida en el campo, tal como lavado.
Se puede generar peróxido de hidrógeno in situ en la mezcla o se puede proveer o administrar a la mezcla (por ejemplo, la fuente de peróxido de hidrógeno es una o más soluciones amortiguadoras u otras soluciones que se sepa contengan peróxido de hidrógeno) antes, simultáneamente con, o después de la adición de un compuesto de acridinio antes descrito. El peróxido de hidrógeno se puede generar in situ en un número de maneras como será evidente para el experto en la técnica.
Después de la adición simultánea o subsiguiente dé por lo menos una solución básica a la muestra, se genera una señal detectable, específicamente, una señal quimioluminiscente, que indica la presencia del analito. La solución básica contiene por lo menos una base y tiene un pH en mayor o igual a 10, de preferencia, mayor o igual a 12. Los ejemplos de soluciones básicas incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de amonio, hidróxido de magnesio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido de calcio, carbonato de calcio, y bicarbonato de calcio. La cantidad de solución básica agregada a la muestra depende de la concentración de la solución básica. Tomando como base la concentración de la solución básica utilizada, el experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad de solución básica a agregar a la muestra.
La señal quimioluminiscente que se genera se puede detectar utilizando técnicas rutinarias conocidas por el experto en la técnica. Tomando como base la intensidad de la señal generada, se puede cuantificar la cantidad de analito en la muestra. Específicamente, la cantidad de analito en la muestra es proporcional a la intensidad de la señal generada. La cantidad de analito presente se puede cuantificar mediante comparación de la cantidad de luz generada con una curva patrón para el analito o mediante comparación con un patrón de referencia. La curva patrón se puede generar utilizando diluciones en serie o soluciones de concentración conocida de analito mediante espectroscopia de masas, métodos de gravimétricos, y otras técnicas conocidas en el campo. Aunque lo anterior se describe con énfasis en el uso de un compuesto de acridinio como el agente quimioluminiscente, el experto en la técnica puede adaptar fácilmente esta descripción para uso de otros agentes quimioluminiscentes.
Los inmuno-ensayos de analito por lo general se pueden efectuar utilizando cualquier formato conocido en la técnica, tal como, pero sin limitarse a, un formato de emparedado.
Específicamente, en un formato de inmuno-ensayo, se utilizan por lo menos dos anticuerpos para separar y cuantificar el analito, tal como un analito de humano, o un fragmento del mismo, en una muestra. De manera más específica, dichos por lo menos dos anticuerpos se unen a epítopes diferentes en un analito (o un fragmento del mismo) formando un complejo inmune, el cual es referido como un "emparedado". En términos generales, en los inmuno-ensayos se pueden utilizar uno o más anticuerpos para capturar el analito (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba (estos anticuerpos frecuentemente son conocidos como un anticuerpo de "captura" o anticuerpos de "captura") y se pueden utilizar uno o más anticuerpos para ligar una marca detectable (específicamente, cuantificable) al emparedado (estos anticuerpos frecuentemente son conocidos como el "anticuerpo de detección", los "anticuerpos de detección", el "conjugado", o los "conjugados"). Por lo tanto, en el contexto de un formato de inmuno-ensayo de emparedado, se puede utilizar una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) como la descrita en la presente solicitud como un anticuerpo de captura, un anticuerpo de detección, o ambos. Por ejemplo, se puede utilizar una DVD-lg que tenga un dominio que se pueda unir a un primer epítope en un analito (o un fragmento del mismo) como un anticuerpo de captura y/o se puede utilizar otra DVD-lg que tenga un dominio que se pueda unir a un segundo epítope en un analito (o un fragmento del mismo) como un anticuerpo de detección. En este sentido, se puede utilizar una DVD-lg que tenga un primer dominio que se pueda unir a un primer epítope en un analito (o un fragmento del mismo) y un segundo dominio que se pueda unir a un segundo epítope en un analito (o un fragmento del mismo) como un anticuerpo de captura y/o un anticuerpo de detección. De manera alternativa, se puede utilizar una DVD-lg que tenga un primer dominio que se pueda unir a un epítope en un primer analito (o un fragmento del mismo) y un segundo dominio que se pueda unir a un epítope en un segundo analito (o un fragmento del mismo) como un anticuerpo de captura y/o un anticuerpo de detección para detectar, y opcionalmente cuantificar, dos o más analitos: En caso que un analito pueda estar presente en una muestra en más de una forma, tal como una forma monoméricá y una forma dimérica/multimérica, la cual puede ser como homomérica o heteromérica, se puede utilizar una DVD-lg que tenga un dominio que se pueda unir a un epítope que solamente esté expuesto en la forma monoméricá y otra DVD-lg que tenga un dominio que se pueda unir a un epítope en una parte diferente de una forma dimérica/multimérica como anticuerpos de captura y/o anticuerpos de detección, con lo cual se permite la detección, y opcionalmente la cuantificación, de formas diferentes de un analito dado. Asimismo, el uso de DVD-lgs con afinidades diferenciales dentro de una DVD-lg individual y/o entre DVD-lgs puede proveer una ventaja de avidez. En el contexto de los inmuno-ensayos como los descritos en la presente solicitud, por lo general podría ser útil o deseado incorporar uno o más enlazadores dentro de la estructura de una DVD-lg. Cuando está presente, de manera óptima, el enlazador debe ser de longitud y flexibilidad estructural suficiente para permitir la unión a un epítope por parte de los dominios interiores así como la unión de otro epítope por parte de los dominios exteriores. En este sentido, si una DVD-lg puede unirse a dos analitos diferentes y un analito es más grande c que el otro, de manera deseable el analito más grande es ligado por los dominios exteriores.
En términos generales, se puede poner en contacto una muestra que está siendo analizada respecto a (por ejemplo, que se sospecha que contiene) un analito (o un fragmento del mismo) con por lo menos un anticuerpo (o anticuerpos) de captura y por lo menos un anticuerpo de detección (el cual puede ser un segundo anticuerpo de detección o un tercer anticuerpo de detección o incluso un anticuerpo numerado en forma sucesiva, por ejemplo, como en el caso en el que el anticuerpo de captura y/o detección comprenda anticuerpos múltiples) ya sea en forma simultánea o secuencial y en cualquier orden. Por ejemplo, la muestra de prueba se puede poner en contacto primero con por lo menos una anticuerpo de captura y después (en forma secuencial) con por lo menos un anticuerpo de detección. De manera alternativa, la muestra de prueba puede ponerse primero en contacto con por lo menos un anticuerpo de detección y después (en forma secuencial) con por lo menos un anticuerpo de captura. Incluso en otra alternativa, la muestra de prueba se puede poner en contacto simultáneamente con un anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección.
En el formato de prueba en emparedado, una muestra de la que se sospecha que contiene analito (o un fragmento del mismo) se pone primero en contacto con por lo menos un primer anticuerpo de captura bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de primer anticuerpo/analito. Si se utiliza más de un anticuerpo de captura, se forma un complejo de primer anticuerpo de captura/analito que comprende dos o más anticuerpos de captura. En una prueba de emparedado, los anticuerpos, es decir, de preferencia dicho por lo menos un anticuerpo de captura, se utilizan en cantidades en exceso molar respecto a la cantidad máxima de analito (o un fragmento del mismo) esperada en la muestra de prueba. Por ejemplo se pueden utilizar desde aproximadamente 5 pg hasta aproximadamente 1 mg de anticuerpo por cada mi de solución amortiguadora (por ejemplo, solución amortiguadora para revestimiento de micropartícula).
Los inmuno-ensayos de inhibición competitiva, los cuales con frecuencia se utilizan para medir analitos pequeños debido a que se requiere unión por parte de sólo un anticuerpo, comprenden formatos secuenciales y clásicos. En un inmuno-ensayo de inhibición competitiva secuencial se aplica como revestimiento un anticuerpo de captura para un analito de interés sobre una cavidad de una placa de microtitulación u otro soporte sólido. Cuando la muestra que contiene el analito de interés se agrega a la cavidad, el analito de interés se une al anticuerpo de captura. Después de lavar, se agrega una cantidad conocida de analito marcado (por ejemplo, biotina o peroxidasa de rábano (HRP)) a la cavidad. Es necesario un substrato para una marca enzimática para generar una señal. Un ejemplo de un substrato apropiado para HRP es 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB). Después de lavar, se mide la señal generada por el analito marcado y ésta es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra. En un inmuno-ensayo de inhibición competitiva clásico se aplica un anticuerpo para un analito de interés como revestimiento sobre un soporte sólido (por ejemplo, una cavidad de una placa de microtitulación). Sin embargo, a diferencia del inmuno-ensayo de inhibición competitiva secuencial, la muestra y el analito marcado se agregan a la cavidad al mismo tiempo. Cualquier analito en la muestra compite con el analito marcado por la unión al anticuerpo de captura. Después de lavar, se mide la señal generada por el analito marcado y es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra.
De manera opcional, antes de poner en contacto la muestra de prueba con dicho por lo menos un anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura), dicho por lo menos un anticuerpo de captura se puede unir a un soporte sólido, lo cual facilita separar de la muestra de prueba al complejo de primer anticuerpo/analito (o un fragmento del mismo). El substrato al cual se une el anticuerpo de captura puede ser cualquier soporte sólido o fase sólida apropiada que facilite separar de la muestra el complejo anticuerpo de captura-analito.
Los ejemplos incluyen una cavidad de una placa, tal como una placa de microtitulación, un tubo de ensayo, un gel poroso (por ejemplo, gel de sílice, agarosa, dextrano, o gelatina), una película polimérica (por ejemplo, poliacrilamida), glóbulos (por ejemplo glóbulos de poliestireno o glóbulos magnéticos), una tira de un filtro/membrana (por ejemplo nitrocelulosa o nylon), micropartículas (por ejemplo, partículas de látex, micropartículas susceptibles de imantación (por ejemplo, micropartículas que tienen núcleos de óxido férrico u óxido de cromo y revestimientos homopoliméricos o heteropoliméricos y radios de aproximadamente 1-10 mieras). El substrato puede comprender un material poroso apropiado con una afinidad de superficie apropiada para ligar los antígenos y porosidad suficiente para permitir el acceso por parte de los anticuerpos de detección. Generalmente se prefiere un material microporoso, aunque se puede utilizar un material gelatinoso en un estado hidratado. Dichos substratos porosos de preferencia están en forma de hojas que tienen un espesor de aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 0.5 mm, de preferencia aproximadamente 0.1 mm. Aunque el tamaño de poro puede variar bastante, de preferencia, el tamaño de poro es de aproximadamente 0.025 hasta aproximadamente 15 mieras, de manera más preferida desde aproximadamente 0.15 hasta aproximadamente 15 mieras. La superficie de dichos substratos se puede activar mediante procedimientos químicos que ocasionan el enlazamiento covalente de un anticuerpo al substrato. De esto resulta la unión irreversible, generalmente por adsorción a través de fuerzas hidrofóbicas, del antígeno o el anticuerpo al substrato; de manera alternativa, se puede utilizar un agente para copulación química u otros medios para unir covalentemente el anticuerpo al substrato, con la condición que dicha unión no interfiera con la capacidad del anticuerpo para unirse al analito. De manera alternativa, el anticuerpo se puede ligar con micropartículas, las cuales han sido previamente revestidas con estreptavidina (por ejemplo, Glóbulos Magnéticos DYNAL®, Invitrogen, Carlsbad, CA) o biotina (por ejemplo, utilizando micropartículas revestidas con estreptavidina Power-BindTM-SA-MP (Seradyn, Indianapolis, IN)) o anticuerpos monoclonales antiespecíficos de especie. Si fuera necesario, el substrato se puede convertir en derivado para permitir la reactividad con varios grupos funcionales en el anticuerpo. Dicha conversión en derivado requiere el uso de ciertos agentes de copulación, cuyos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, anhídrido maléico, N-hidroxisuccinimida, y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida. Si se desea, se pueden unir uno o más reactivos de captura, tales como anticuerpos (o fragmentos de los mismos), cada uno de los cuales es específico para el o los analitos, a fases sólidas en sitios físicos o dirigibles diferentes (por ejemplo, tal como en una configuración de biochip (véase, por ejemplo, patente E.U.A. No. 6,225,047; Publicación de solicitud de patente internacional No. WO 99/51773; patente E.U.A. No. 6,329,209; Publicación de solicitud de patente internacional No. WO 00/56934, y patente E.U.A. No. 5,242,828). Si el reactivo de captura se une a una sonda de espectrometría de masas como soporte sólido, la cantidad de analito unido a la sonda se puede detectar mediante espectrometría de masas por ionización-desorción de láser. De manera alternativa, se pueden empacar una columna individual con glóbulos diferentes, los cuales se convierten en derivados con dichos uno o más reactivos de captura, con lo cual se captura el analito en un solo lugar (véase, tecnologías basadas en glóbulo derívatizados con anticuerpo, por ejemplo, la tecnología xMAP de Luminex (Austin, TX)).
Después que la muestra de prueba que está siendo analizada respecto al analito (o un fragmento del mismo) se pone en contacto con dicho por lo menos un anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura), la mezcla se incuba para permitir la formación de un complejo de primer anticuerpo (o anticuerpo múltiple)-analito (o un fragmento del mismo). La incubación se puede efectuar a un pH de aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 10.0, a una temperatura de aproximadamente 2°C hasta aproximadamente 45°C, y durante un periodo de por lo menos aproximadamente un (1) minuto hasta aproximadamente dieciocho (18) horas, de preferencia desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 24 minutos, de manera más preferida durante aproximadamente 4 hasta aproximadamente 18 minutos. El inmuno-ensayo descrito en la presente solicitud se puede efectuar en un paso (significando la muestra de prueba, por lo menos un anticuerpo de captura y por lo menos un anticuerpo de detección se agregan todos en forma secuencial o simultáneamente a un recipiente de reacción) o en más de un paso, tal como dos pasos, tres pasos, etc.
Después que se forma el complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito (o un fragmento del mismo), el complejo se pone después en contacto con por lo menos un anticuerpo de detección bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito (o un fragmento del mismo)/segundo anticuerpo de detección). Aunque titulado para calidad como el "segundo" anticuerpo (por ejemplo, segundo anticuerpo de detección), de hecho, en casos en los que se utilicen anticuerpos múltiples para captura y/o detección, dicho por lo menos un anticuerpo de detección puede ser el segundo, tercero, cuarto, etc. anticuerpos utilizados en el inmuno-ensayo. Si el complejo de anticuerpo de captura/analito (o un fragmento del mismo) se pone en contacto con más de un anticuerpo de detección, entonces se forma un complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito (o un fragmento del mismo)/anticuerpo de detección (múltiple). Al igual que con el anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura), cuando dicho por lo menos un anticuerpo de detección (por ejemplo, segundo y cualesquiera subsiguientes) se pone en contacto con el complejo de anticuerpo de captura/analito (o un fragmento del mismo), se requiere de un periodo de incubación bajo condiciones similares a las descritas anteriormente para la formación del complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito (o un fragmento del mismo)/anticuerpo de detección (segundo o múltiple). De preferencia, por lo menos un anticuerpo de detección contiene una marca detectable. La marca detectable se puede ligar a dicho por lo menos un anticuerpo de detección (por ejemplo, el segundo anticuerpo de detección) antes de, simultáneamente con, o después de la formación del complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito (o un fragmento del mismo)/anticuerpo de detección (segundo o múltiple). Se puede utilizar cualquier marca detectable conocida en la técnica (véase la discusión anterior, incluyendo las referencias de Polak y Van Noorden (1997) y Haugly (1996)).
La marca detectable se puede unir a los anticuerpos ya sea directamente o a través de un agente de copulación. Un ejemplo de un agente de copulación que se puede utilizar es EDAC (clorhidrato de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida), el cual se puede conseguir comercialmente a partir de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Otros agentes de copulación que se pueden utilizar son conocidos en la técnica. Los métodos para unir una marca detectable a un anticuerpo son conocidos en la técnica. De manera adicional, se pueden comprar o sintetizar muchas marcas detectables que ya contienen grupos de extremo que facilitan la copulación de la marca detectable al anticuerpo, tales como éster de CPSP-acridinio (es decir, carboxamida de 9-[N-tosil-N-(3-carboxipropil)]-10-(3-sulfopropil)acridinio) o éster de SPSP-acridinio (es decir, N10-(3-sulfopropil)-N-(3-sulfopropil)-acridinio-9-carboxamida).
El complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito/anticuerpo de detección (segundo o múltiple) puede, pero no tiene que, ser separado del resto de la muestra de prueba antes de la cuantificación de la marca. Por ejemplo, si dicho por lo menos un anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura) está unido a un soporte sólido, tal como una cavidad o un glóbulo , la separación se puede lograr retirando el fluido (de la muestra de prueba) del contacto con el soporte sólido. De manera alternativa, si dicho por lo menos primer anticuerpo de captura está unido a un soporte sólido, éste se puede poner en contacto simultáneamente con la muestra que contiene al analito y dicho por lo menos un seg undo anticuerpo de detección para formar un complejo de primer (múltiple) anticuerpo/analito/segundo (múltiple) anticuerpo, seguido por remoción del fluido (muestra de prueba) del contacto con el soporte sólido. Si dicho por lo menos un primer anticuerpo de captura no está unido a un soporte sólido, entonces el complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito/anticuerpo de detección (segundo o múltiple) no tiene que ser retirado de la muestra de prueba para cuantificación de la cantidad de la marca.
Después de la formación del complejo de anticuerpo de captu ra marcado/analito/anticuerpo de detección (por ejemplo, el complejo de primer anticuerpo de captura/analito/segundo anticuerpo de detección) , se cuantifica la cantidad de marca en el complejo utilizando técnicas conocidas en el campo. Por ejemplo, si se utiliza una marca enzimática, el complejo marcado se hace reaccionar con un substrato para la marca que produzca una reacción cuantificable tal como el desarrollo de color. Si la marca es una marca radioactiva , la marca se cuantifica utilizando medios apropiados, tales como un contador de centelleo. Si la marca es una marca fluorescente, la marca se cuantifica estimulando la marca con una luz de un color (el cual se conoce como la "longitud de onda de excitación") y detectando otro color (el cual se conoce como la "longitud de onda de emisión") que es emitido por la marca en respuesta a la estimulación. Si la marca es una marca quimioluminiscente, la marca se cuantifica detectando la luz emitida ya sea visualmente o mediante el uso de luminómetros, película de rayos X, película fotográfica de alta velocidad, una cámara CCD, etc. Una vez que se cuantifica la cantidad de la marca en el complejo, se determínala concentración del analito o un fragmento del mismo en la muestra de prueba utilizando medios apropiados, tal como mediante el uso de una curva patrón que se genera utilizando diluciones en serie del analito o un fragmento del mismo de concentración conocida. Además de utilizar diluciones en serie del analito o un fragmento del mismo, la curva patrón se puede generar en forma gravimétrica, mediante espectrometría de masas y mediante otras técnicas conocidas en el campo.
En una prueba de micropartícula quimioluminiscente que utiliza el analizador ARCHITECT®, el pH del diluyente del conjugado debe ser de aproximadamente 6.0 +/- 0.2, la solución amortiguadora para revestimiento de micropartícula se debe mantener aproximadamente a temperatura ambiente (es decir, a una temperatura de aproximadamente 17 hasta aproximadamente 27°C), el pH de la solución amortiguadora para revestimiento de micropartícula debe ser de aproximadamente 6.5 +/- 0.2, y el pH del diluyente de micropartícula debe ser de aproximadamente 7.8 +/- 0.2. El contenido de sólidos de preferencia es menor de aproximadamente 0.2%, tal como menos de aproximadamente 0.15%, menos de aproximadamente 0.14%, menos de aproximadamente 0.13%, menos de aproximadamente 0.12%, o menos de aproximadamente 0.11%, tal como aproximadamente 0.10%.
Los FPIAs están basados en principios de inmuno-ensayo de unión competitiva. Un compuesto marcado en forma fluorescente, cuando es excitado por una luz linealmente polarizada, emite fluorescencia que tiene un grado de polarización inversamente proporcional a su velocidad de rotación. Cuando un complejo de anticuerpo-rastreador marcado en forma fluorescente es excitado por una luz linealmente polarizada, la luz emitida permanece altamente polarizada debido a que el fluoróforo está limitado a no girar entre el tiempo en que la luz es absorbida y el tiempo en que la luz es emitida. Cuando un compuesto rastreador "libre" (es decir, un compuesto que no está unido a un anticuerpo) es excitado por luz linealmente polarizada, su rotación es mucho más rápida que la del conjugado anticuerpo-rastreador correspondiente que se produce en un inmuno-ensayo de unión competitiva. Los FPIAs son convenientes con respecto a los RIAs ya que no hay sustancias radioactivas que requieran de manejo y eliminación especial. Además, los FPIAs son pruebas homogéneas que se pueden efectuar fácil y rápidamente.
En vista de lo anterior, se provee un método para determinar la presencia, cantidad, o concentración de analito (o un fragmento del mismo) en una muestra de prueba. El método comprende analizar la muestra de prueba respecto a un analito (o un fragmento del mismo) mediante una prueba (i) que emplea (i') por lo menos uno de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, una variante de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, y una DVD-lg (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante de la misma) que se pueda unir a un analito, y (ii') por lo menos una marca detectable y (ii) que comprende comparar una señal generada por la marca detectable i como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración del analito (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba con una señal generada como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración del analito (o un fragmento del mismo) en un control o calibrador. El calibrador es op.cionalmente parte de una serie de calibradores, en los cuales cada uno de los calibradores difiere de los otros calibradores , en la concentración del analito.
El método puede comprender (i) poner en contacto la muestra de prueba con por lo menos un primer compañero de unión específica para el analito (o un fragmento del mismo) que se selecciona a partir del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, una variante de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, y una DVD-lg (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante de la misma) que se pueda unir a un analito para formar un complejo de primer compañero de unión específica/analito (o fragmento del mismo), (ii) poner en contacto el complejo de primer compañero de unión específica/analito (o fragmento del mismo) con por lo menos un segundo compañero de unión específica para el analito (o fragmento del mismo) que se selecciona a partir del grupo que consiste de un anticuerpo anti-analito marcado en forma detectable, un fragmento de un anticuerpo anti-analito marcado en forma detectable que se pueda unir al analito, una variante de un anticuerpo anti-analito marcado en forma detectable que se pueda unir al analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo anti-analito marcado en forma detectable que se pueda unir al analito, y una DVD-lg (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante de la misma) marcada en forma detectable para formar un complejo de primer compañero de unión específica/analito (o fragmento del mismo)/segundo compañero de unión específica, y (iii) determinar la presencia, cantidad o concentración de analito en la muestra de prueba detectando o midiendo la señal generada por la marca detectable en el complejo de primer compañero de unión específica/analito (o fragmento del mismo)/segundo compañero de unión específica formado en (ii). Puede ser preferido un método en el cual por lo menos un primer compañero de unión específica para el analito (o un fragmento del mismo) y/o por lo menos un segundo compañero de unión específica para el analito (o un fragmento del mismo) sea una DVD-lg (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante de la misma) como se describe en la presente solicitud.
De manera alternativa, el método puede comprender poner en contacto la muestra de prueba con por lo menos un primer compañero de unión específica para el analito (o un fragmento del mismo) que se selecciona a partir del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, una variante de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, y una DVD-lg (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante de la misma) y simultáneamente o de manera secuencial, en cualquier orden, poner en contacto la muestra de prueba con un segundo compañero de unión específica, el cual puede competir con el analito (o un fragmento del mismo) por la unión a dicho por lo menos un primer compañero de unión específica y que se selecciona a partir del grupo que consiste de un analito marcado en forma detectable, un fragmento del analito marcado en forma detectable que se pueda unir al primer compañero de unión específica, una variante del analito marcada en forma detectable que se pueda unir al primer compañero de unión específica, y un fragmento de una variante del analito marcado en forma detectable que se pueda unir al primer compañero de unión específica.
Cualquier analito (o un fragmento del mismo) presente en la muestra de prueba y dicho por lo menos un segundo compañero de unión específica compiten entre sí para formar un complejo de primer compañero de unión específica/analito (o fragmento del mismo) y un complejo de primer compañero de unión específica/segundo compañero de unión específica, respectivamente. El método también comprende determinar la presencia, cantidad o concentración del analito en la muestra de prueba detectando o midiendo la señal generada por la marca detectable en el complejo de primer compañero de unión específica/segundo compañero de unión específica formado en (ii), en donde la señal generada por la marca detectable en el complejo de primer compañero de unión específica/segundo compañero de unión específica es inversamente proporcional a la cantidad o concentración del analito en la muestra de prueba.
Los métodos anteriores también pueden comprender diagnosticar, pronosticar, o evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico de un paciente a partir del cual se obtiene la muestra de prueba. Si el método comprende además evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente a partir del cual se obtuvo la muestra de prueba, el método comprende también de manera opcional modificar el tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente según sea necesario para mejorar la eficacia. El método se puede adaptar para ser utilizado en un sistema automatizado o en un sistema semi-automatizado.
Con respecto a los métodos de prueba (y el estuche para lo mismo), es posible utilizar anticuerpos anti-analito comercialmente disponibles o métodos para la producción de anti-analito como se describe en la literatura. Los suministros comerciales de varios anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, CA), y R&D Systems (RDS; Minneapolis, WIN).
En términos generales, se puede utilizar un nivel predeterminado como una marca de referencia contra la cual se evalúan los resultados obtenidos después de analizar una muestra de prueba respecto al analito o un fragmento del mismo, por ejemplo, para detectar la enfermedad o el riesgo de enfermedad. En términos generales, al efectuar dicha comparación, el nivel predeterminado se obtiene corriendo una prueba particular un número suficiente de veces y bajo condiciones apropiadas tales que se pueda efectuar un vínculo o asociación de la presencia, cantidad o concentración del analito con una etapa o punto final particular de una enfermedad, trastorno o condición o con indicios clínicos particulares. Típicamente, el nivel predeterminado se obtiene con pruebas de individuos de referencia (o poblaciones de individuos). El analito medido puede incluir fragmentos del mismo, productos de degradación del mismo, y/o productos de corte enzimático del mismo.
En particular, con respecto a un nivel predeterminado como el utilizado para monitorear el avance y/o tratamiento de la enfermedad, la cantidad o concentración del analito o un fragmento del mismo puede ser "sin cambio", "favorable" (o "alterada favorablemente"), o "desfavorable" (o "alterada desfavorablemente"). "Elevada" o "incrementada" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra de prueba que es mayor que un nivel o intervalo típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado), o es más alto que otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra anterior o de línea). El término "disminuida" o "reducida" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra de prueba que es menor que un nivel o intervalo típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado), o que es menor que otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra anterior o de línea basal). El término "alterada" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra que está alterada (incrementada o disminuida) con respecto a un nivel o intervalo típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado), o con respecto a otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra anterior o de línea basal).
El nivel o intervalo típico o normal para el analito se define de conformidad con la práctica estándar. Debido a que los niveles del analito en algunos casos son muy bajos, se puede considerar que ha ocurrido un denominado nivel alterado o alteración cuando existe cualquier cambio neto en comparación con el nivel o intervalo típico o normal, o nivel o intervalo de referencia, que no puede ser explicado por el error experimental o la variación de la muestra. Por lo tanto, el nivel medido en una muestra particular será comparado con el nivel o intervalo de niveles determinados en muestras similares provenientes de un denominado individuo normal. En este contexto, un "individuo normal" es un individuo sin enfermedad detectable, por ejemplo, y un paciente o población "normal" (algunas veces denominado "control") es aquel o aquella que no presenta(n) enfermedad detectable, respectivamente, por ejemplo. Asimismo, dado que el analito no se encuentra rutinariamente a un nivel alto en la mayoría de la población humana, un "individuo normal" puede ser considerado un individuo sustancialmente sin cantidad o concentración incrementada o elevada detectable del analito, y un paciente o población "normal" (algunas veces denominados "control") es aquel o aquella que no presenta cantidad o concentración sustancial detectable incrementada o elevada del analito. Un "individuo aparentemente normal" es uno en el cual el analito no ha sido evaluado o actualmente está siendo analizado. Se dice que el nivel de un analito está "elevado" cuando el analito normalmente es indetectable (por ejemplo, el nivel normal es cero, o está dentro de un intervalo de aproximadamente 25 hasta aproximadamente 75 percentiles de las poblaciones normales), pero se detecta en una muestra de prueba, así como cuando el analito está presente en la muestra de prueba a un nivel más alto que el normal. Por lo tanto, entre otras cosas, la descripción provee un método para someter a tamizaje a un individuo que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad, trastorno, o condición particular. El método de prueba también puede implicar el análisis de otros marcadores y similares.
Por consiguiente, los métodos descritos en la presente solicitud también se pueden utilizar para determinar si un individuo tiene o no, o está o no en riesgo de desarrollar, una enfermedad, trastorno o condición dada. Específicamente, dicho método puede comprender los pasos de: (a) determinar la concentración o cantidad de analito (o un fragmento del mismo) en una muestra de prueba proveniente de un individuo (por ejemplo, utilizando los métodos descritos en la presente solicitud, o métodos conocidos en la técnica); y (b) comparar la concentración o cantidad de analito (o un fragmento del mismo) determinada en el paso (a) con un nivel predeterminado, en el cual si la concentración o cantidad de analito determinada en el paso (a) es favorable con respecto a un nivel predeterminado, entonces se determina que el individuo no tiene o no está en riesgo de una enfermedad, trastorno o condición determinada. Sin embargo, si la concentración o cantidad de analito determinada en el paso (a) es desfavorable con respecto al nivel predeterminado, entonces se determina que el individuo tiene o está en riesgo de una enfermedad, trastorno o condición determinada.
De manera adicional, en la presente solicitud se provee un método para monitorear el avance de la enfermedad en un individuo. De manera óptima, el método comprende los pasos de: (a) determinar la concentración o cantidad de analito en una muestra de prueba proveniente de un individuo; (b) determinar la concentración o cantidad de analito en una muestra de prueba posterior proveniente del individuo; y (c) comparar la concentración o cantidad del analito como se determinó en el paso (b) con la concentración o cantidad de analito determinada en el paso (a), en el cual, si la concentración o cantidad determinada en el paso (b) está sin cambiar o es desfavorable cuando se compara con la concentración o cantidad de analito determinada en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad en el individuo ha continuado, avanzado o empeorado. Por comparación, si la concentración o cantidad de analito como se determinó en el paso (b) es favorable cuando se compara con la concentración o cantidad de analito como se determinó en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad en el individuo se descontinuó, presentó regresión o mejoró.
De manera opcional, el método también comprende comparar la concentración o cantidad de analito como se determinó en el paso (b), por ejemplo, con un nivel predeterminado. Además, de manera opcional el método comprende tratar al individuo con una o más composiciones farmacéuticas durante un periodo de tiempo si la comparación muestra que la concentración o cantidad de analito como se determinó en el paso (b), por ejemplo, está alterada desfavorablemente con respecto al nivel predeterminado.
Incluso, los métodos se pueden utilizar para monitorear el tratamiento en un individuo que recibe tratamiento con una o más composiciones farmacéuticas. Específicamente, dichos métodos implican proveer una primera muestra de prueba proveniente de un individuo antes que el individuo haya sido administrado con una o más composiciones farmacéuticas. Después, se determina la concentración o cantidad de analito en una primera muestra de prueba proveniente de un individuo (por ejemplo, utilizando los métodos descritos en la presente solicitud o como se conozcan en la técnica). Después que se determina la concentración o cantidad de analito, después se compara, opcionalmente, la concentración o cantidad de analito con un nivel predeterminado. Si la concentración o cantidad de analito según se determina en la primera muestra de prueba es más baja que el nivel predeterminado, entonces el individuo no se trata con una o más composiciones farmacéuticas. Sin embargo, si la concentración o cantidad de analito tal como se determina en la primera muestra de prueba es más alta que el nivel predeterminado, entonces el individuo se trata con una o más composiciones farmacéuticas durante un periodo de tiempo. El periodo de tiempo que se trata al individuo con dicha una o más composiciones farmacéuticas puede ser determinado por el experto en la técnica (por ejemplo, el periodo de tiempo puede ser de aproximadamente siete (7) días hasta aproximadamente dos años, de preferencia desde aproximadamente catorce (14) días hasta aproximadamente un (1) año).
Durante el curso del tratamiento con dichas una o más composiciones farmacéuticas, después se obtienen la segunda muestra de prueba y muestras de prueba subsiguientes a partir del individuo. El número de muestras de prueba y el tiempo en el cual dichas muestras de pruebas obtienen a partir del individuo no son críticos. Por ejemplo, una segunda muestra de prueba se puede obtener siete (7) días después que al individuo se le administra por primera vez dichas una o más composiciones farmacéuticas, una tercera muestra de prueba se podría obtener dos (2) semanas después que al individuo se le administra por primera vez dichas una o más composiciones farmacéuticas, una cuarta muestra de prueba se podría obtener tres (3) semanas después que al individuo se le administra por primera vez dichas una o más composiciones farmacéuticas, una quinta muestra de prueba se podría obtener cuatro (4) semanas después que al individuo se le administra por primera vez dichas una o más composiciones farmacéuticas, etc.
Después que se obtiene cada segunda muestra de prueba o muestras de prueba subsiguientes a partir del individuo, se determina la concentración o cantidad de analito en la segunda muestra de prueba o muestras de prueba subsiguientes (por ejemplo, utilizando los métodos descritos en la presente solicitud o como se conozcan en la técnica). La concentración o cantidad de analito tal como se determina en cada una de la segunda muestra de prueba y muestras de prueba subsiguientes después se compara con la concentración o cantidad de analito tal como se determinó en la primera muestra de prueba (por ejemplo, la muestra de prueba que originalmente se comparó opcionalmente con el nivel predeterminado). Si la concentración o cantidad de analito como se determinó en el paso (c) es favorable cuando se compara con la concentración o cantidad de analito como se determinó en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad en el individuo se detuvo, presentó regresión o mejoró, y al individuo se le debe seguir administrando dicha una o las composiciones farmacéuticas del paso (b). Sin embargo, si la concentración o cantidad determinada en el paso (c) no cambió o es desfavorable cuando se compara con la concentración o cantidad de analito como se determinó en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad en el individuo ha continuado, avanzó o empeoró, y el individuo se debe tratar con una concentración más alta de dicha una o más composiciones farmacéuticas administradas al individuo en el paso (b) o el individuo debe ser tratado con una o más composiciones farmacéuticas que sean diferentes de dichas una o más composiciones farmacéuticas administradas al individuo en el paso (b). Específicamente, el individuo puede ser tratado con una o más composiciones farmacéuticas que sean diferentes de dichas una o más composiciones farmacéuticas que el individuo a recibido previamente para disminuir o reducir dicho nivel de analito del individuo.
En términos generales, para pruebas en las cuales se puede efectuar repetición del análisis (por ejemplo, monitoreo del avance y/o respuesta de la enfermedad al tratamiento), se obtiene una segunda muestra de prueba o muestras de prueba subsiguientes en un periodo de tiempo después que se obtuvo la primera muestra de prueba a partir del individuo. Específicamente, se puede obtener una segunda muestra de prueba a partir del individuo minutos, horas, días, semanas o años después que se obtiene la primera muestra de prueba a partir del individuo. Por ejemplo, la segunda muestra de prueba se puede obtener a partir del individuo en un periodo de tiempo de aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 15 semanas, aproximadamente 16 semanas, aproximadamente 17 semanas, aproximadamente 18 semanas, aproximadamente 19 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1 .5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2.5 años, aproximadamente 3.0 años, aproximadamente 3.5 años, aproximadamente 4.0 años, aproximadamente 4.5 años, aproximadamente 5.0 años, aproximadamente 5.5 años, aproximadamente 6.0 años, aproximadamente 6.5 años, aproximadamente 7.0 años, aproximadamente 7.5 años, aproximadamente 8.0 años, aproximadamente 8.5 años, aproximadamente 9.0 años, aproximadamente 9.5 años o aproximadamente 10.0 años después que se obtiene la primera muestra de prueba a partir del individuo.
Cuando se utiliza para monitorear el avance de la enfermedad, la prueba anterior se puede utilizar para monitorear el avance de la enfermedad en individuos que padecen de condiciones agudas. Condiciones agudas, también conocidas como condiciones de cuidado crítico, se refieren a enfermedades agudas, potencialmente letales u otras condiciones médicas críticas que implican, por ejemplo, al sistema cardiovascular o al sistema excretor. Típicamente, las condiciones de cuidado crítico se refieren a aquellas condiciones que requieren intervención médica aguda en un instalación basada en hospital (incluyendo, pero sin limitarse a, la sala de emergencias, unidad de cuidado intensivo, centro de trauma, u otra instalación para cuidado de urgencias) o administración por un paramédico u otro personal médico basado en el campo. Para condiciones de cuidado crítico, el monitoreo repetido generalmente se efectúa dentro de un marco de tiempo más corto, específicamente, minutos, horas o días (por ejemplo, aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días o aproximadamente 7 días), y la prueba inicial, de igual manera, generalmente se efectúa dentro de un marco de tiempo más corto, por ejemplo, aproximadamente minutos, horas o días del inicio de la enfermedad o condición.
Las pruebas también se pueden utilizar para monitorear el avance de enfermedad en individuos que padecen de condiciones crónicas o no agudas. Las condiciones de cuidado no critico o, condiciones no agudas, se refiere a condiciones diferentes de de una enfermedad aguda, potencialmente letal u otras condiciones médicas críticas que implican, por ejemplo, el sistema cardiovascular y/o el sistema excretor. Típicamente, las condiciones no agudas incluyen aquellas de duración a largo plazo o crónicas. Para las condiciones no agudas, la repetición del monitoreo generalmente se efectúa con un marco de tiempo más largo, por ejemplo, horas, días, semanas, meses o años (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 15 semanas, aproximadamente 16 semanas, aproximadamente 17 semanas, aproximadamente 18 semanas, aproximadamente 19 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente ! 1 .5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2. 5 años, aproximadamente 3.0 i años, aproximadamente 3.5 años, aproximadamente 4.0 i años, aproximadamente 4.5 años, aproximadamente 5.0 i años, aproximadamente 5.5 años, aproximadamente 6.0 i años, aproximadamente 6.5 años, aproximadamente 7.0 i años, aproximadamente 7 .5 años, aproximadamente 8.0 i años, aproximadamente 8 .5 años, aproximadamente 9.0 años, aproximadamente 9.5 años o aproximadamente 10.0 años), y de igual manera, la prueba inicial generalmente se efectúa dentro de un marco de tiempo más largo, por ejemplo, aproximadamente horas, días, meses o años del inicio de la enfermedad o condición.
Asimismo, las pruebas anteriores se pueden efectuar utilizando una primera muestra de prueba que se obtiene a partir de un individuo, en donde la primera muestra de prueba se obtiene a partir de una fuente, tal como orina, suero o plasma. De manera opcional, las pruebas anteriores se pueden repetir después utilizando una segunda muestra de prueba que se obtiene a partir del individuo, en donde la segunda muestra de prueba se obtiene a partir de otra fuente. Por ejemplo, si la primera muestra de prueba se obtiene a partir de orina, la segunda muestra de prueba se puede obtener a partir de suero o plasma. Los resultados obtenidos de las pruebas utilizando la primera muestra de prueba y la segunda muestra de prueba se pueden comparar. La comparación se puede utilizar para evaluar el estatus de una enfermedad o condición en el individuo.
Asimismo, la presente descripción también se refiere a métodos para determinar si un individuo predispuesto a, o que padece de una enfermedad, trastorno o condición dada se puede beneficiar o no del tratamiento. En particular, la descripción se refiere a métodos y productos de diagnóstico acompañados de analito. Por lo tanto, el método para "monitorear el tratamiento de la enfermedad en un individuo" como se describe en la presente solicitud también puede abarcar de manera óptima seleccionar o identificar candidatos para terapia.
Por lo tanto, en modalidades particulares, la descripción también provee un método para determinar si un individuo que tiene, o que está en riesgo de, una enfermedad, trastorno o condición dada es o no un candidato para terapia. En términos generales, el individuo es uno que ha experimentado algún síntoma de una enfermedad, trastorno o condición dada o que realmente ha sido diagnosticado con, o que está en riesgo de, una enfermedad, trastorno o condición dada, y/o que demuestra una concentración o cantidad desfavorable de analito o un fragmento del mismo, como se describe la presente solicitud.
El método comprende opcionalmente una prueba como la descrita en la presente solicitud, en la cual el analito se analiza antes y después del tratamiento del individuo con una o más composiciones farmacéuticas (por ejemplo, particularmente con un farmacéutico relacionado a un mecanismo de acción que implica al analito), con terapia inmuno-supresora, o mediante terapia de inmuno-absorción, o en el cual el analito se evalúa después de dicho tratamiento y la concentración o la cantidad de analito se compara contra un nivel predeterminado. Una concentración desfavorable de cantidad de analito observada después del tratamiento confirma que el individuo no se beneficiará de recibir tratamiento adicional o continuado, mientras que una concentración o cantidad favorable de analito observada después del tratamiento confirma que el individuo se beneficiará de recibir tratamiento adicional o continuado. Esta confirmación ayuda con el manejo de estudios clínicos, y la provisión de cuidado mejorado para el paciente.
No es necesario decir que, aunque algunas modalidades en la presente solicitud son convenientes cuando se utilizan para evaluar una enfermedad, trastorno o condición dada como se discute la presente solicitud , las pruebas y estuches se pueden utilizar para evaluar el analito en otras enfermedades, trastornos y condiciones. El método de prueba también puede implicar el análisis de otros marcadores y similares.
El método de prueba también se puede utilizar para identificar un compuesto que alivie una enfermedad , trastorno o condición dada. Por ejemplo, se puede poner en contacto una célula que exprese al analito con un compuesto candidato. El nivel de expresión del analito en la célula puesta en contacto con el compuesto se puede comparar con el de una célula de control utilizando el método de prueba descrito en la presente solicitud .
II . Estuche También se provee un estuche para analizar una muestra de prueba respecto a la presencia, cantidad o concentración de un analito (o un fragmento del mismo) en una muestra de prueba. El estuche comprende por lo menos un componente para analizar la muestra de prueba respecto al analito (o un fragmento del mismo) e instrucciones para analizar la muestra de prueba respecto al analito (o un fragmento del mismo). Dicho por lo menos un componente para analizar la muestra de prueba respecto al analito (o un fragmento del mismo) puede incluir una composición que comprenda una DVD-lg anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma), la cual opcionalmente está inmovilizada en una fase sólida.
El estuche puede comprender por lo menos un componente para analizar la muestra de prueba respecto a un analito mediante inmuno-ensayo, por ejemplo, inmuno-ensayo de micropartícula quimioluminiscente, e instrucciones para analizar la muestra de prueba respecto a un analito mediante inmuno-ensayo, por ejemplo inmuno-ensayo de micropartícula quimioluminiscente. Por ejemplo, el estuche puede comprender por lo menos un compañero de unión específica para un analito, tal como un anticuerpo monoclonal/policlonal (o un fragmento del mismo que se pueda unir al analito, una variante del mismo que se pueda unir al analito, o un fragmento de una variante que se pueda unir al analito) anti-analito o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma), de los cuales cualquiera puede estar marcado en forma detectable. De manera alternativa o adicionalmente, el estuche puede comprender analito marcado en forma detectable (o un fragmento del mismo que se pueda unir a un anticuerpo monoclonal/policlonal anti-analito o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma)), el cual puede competir con cualquier analito en una muestra de prueba por la unión a un anticuerpo monoclonal/policlonal (o un fragmento del mismo que se pueda unir al analito, una variante del mismo que se pueda unir al analito, o un fragmento de una variante que se pueda unir al analito) anti-analito o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma), de los cuales cualquiera puede estar inmovilizado en un soporte sólido. El estuche puede comprender un calibrador o control, por ejemplo, analito aislado o purificado. El estuche puede comprender por lo menos u n contenedor (por ejemplo, tubo, placas de microtitulación o tiras, los cuales pueden estar revestidos de antemano con un primer compañero de unión específica, por ejemplo) para efectuar la prueba , y/o una solución amortiguadora , tal como una solución amortiguadora para análisis o u na solución amortig uadora para lavado, de las cuales cualquiera puede ser provista como una solución concentrada , una solución de substrato para la marca detectable (por ejemplo una marca enzimática) , o una solución de detención . De preferencia , el estuche comprende todos los componentes, es decir, reactivos, patrones de referencia , soluciones amortiguadoras, diluyentes, etc., que sean necesarios para llevar a cabo la prueba. Las instrucciones pueden estar en forma impresa o en forma legible con computadora , tal como un disco, C D, DVD, o similares.
Cualesquiera anticuerpos, tales como un anticuerpo anti-analito o una DVD-lg anti-analito, o rastreador pueden incorporar una marca detectable como se describe en la presente solicitud , tal como un fluoróforo, una porción radioactiva, una enzima , una marca de biotina/avidina, un cromóforo, una marca quimioluminiscente, o similares , o el estuche puede incluir reactivos para efectuar el marcado detectable. Los anticuerpos, calibradores y/o controles se pueden proveer en contenedores separados o pre-dispensados en un formato de prueba apropiado, por ejemplo, en placas de microtitulación.
Opcionalmente, el estuche incluye componentes de control de calidad (por ejemplo, paneles de sensibilidad , calibradores, y controles positivos) . La preparación de los reactivos de control de calidad es bien conocida en la técnica y se describe en las hojas de inserto para u na variedad de productos de inmuno-diagnóstico. Opcionalmente se utilizan miembros de panel de sensibilidad para establecer las características de desempeño de la prueba, y opcionalmente también son indicadores útiles de la integridad de los reactivos del estuche de inmuno-ensayo, y de la normalización de las pruebas.
El estuche también puede incluir opcionalmente otros reactivos requeridos para efectuar una prueba diagnóstica o facilitar las evaluaciones de control de calidad , tales como soluciones amortiguadoras, sales, enzimas, cofactores de enzima, substratos para enzima , reactivos de detección , y similares. También pueden estar incluidos en el estuche otros componentes, tales como soluciones amortig uadoras y soluciones para el aislamiento y/o tratamiento de una muestra de prueba (por ejemplo, reactivos de pretratamiento). El estuche puede incluir adicionalmente uno o más de otros controles. Uno o más de los componentes del estuche pueden estar liofilizados, en cuyo caso el estuche también puede comprender reactivos apropiados para la reconstitución de los componentes liofilizados.
Los diversos componentes del estuche se proveen opcionalmente en contenedores apropiados según sea necesario, por ejemplo, una placa de microtitulación. El estuche también puede incluir contenedores para contener o almacenar una muestra (por ejemplo, un contenedor o cartucho para una muestra de orina). En donde sea apropiado, el estuche también puede contener opcionalmente recipientes de reacción, recipientes de mezclado, y otros componentes que faciliten la preparación de los reactivos o de la muestra de prueba. El estuche también puede incluir uno o más instrumentos para ayudar en la obtención de una muestra de prueba, tal como una jeringa, pipeta, fórceps, cuchara graduada, o similares.
Si la marca detectable es por lo menos un compuesto de acridinio, el estuche puede comprender por lo menos una acridinio-9-carboxamida, por lo menos un éster de acridinio-9-carboxilato de arilo, o cualquier combinación de los mismos. Si la marca detectable es por lo menos un compuesto de acridinio, el estuche también puede comprender una fuente de peróxido de hidrógeno, tal como una solución amortiguadora, una solución, y/o por lo menos una solución básica. Si se desea, el estuche puede contener una fase sólida, tal como una partícula magnética, glóbulo, tubo de ensayo, placa de microtitulación, celda, membrana, molécula de andamiaje, película, papel filtro, disco o chip.
III. Adaptación del estuche y método El estuche (o componentes del mismo), así como el método para determinar la presencia, cantidad o concentración de un analito en una muestra de prueba mediante una prueba, tal como un inmuno-ensayo como se describe en la presente solicitud, se puede adaptar para ser utilizado en una variedad de sistemas automatizados y semi-automatizados (incluyendo aquellos en los cuales la fase sólida comprende una micropartícula), como se describe, por ejemplo, en las patentes E.U.A. Nos. 5,089,424 y 5,006,309, y como se vende comercialmente, por ejemplo, por Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) como ARCHITECT®.
Algunas de las diferencias entre un sistema automatizado o semi-automatizado en comparación con un sistema no automatizado (por ejemplo, ELISA) incluyen el substrato al cual se une el primer compañero de unión específica (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal/policlonal, (o un fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo) anti-analito, o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento de la misma, una variante de la misma, o un fragmento de una variante de la misma); de cualquier manera, la formación del emparedado y la reactividad del analito se pueden ver afectadas), y la longitud y sincronización de la captura, detección y/o cualesquiera pasos de lavado opcionales. Mientras que un formato no automatizado, tal como una ELISA, podría requerir de un tiempo de incubación relativamente más largo con la muestra y reactivo de captura (por ejemplo, aproximadamente 2 horas), un formato automatizado o semi-automatizado (por ejemplo, ARCHITECT®, Abbott Laboratories) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, aproximadamente 18 minutos para ARCHITECT®). De manera similar, mientras que un formato no automatizado, tal como una ELISA, puede incubar un anticuerpo de detección, tal como el reactivo conjugado, durante un tiempo de incubación relativamente más largo (por ejemplo, aproximadamente 2 horas), un formato automatizado o semi-automatizado (por ejemplo, ARCHITECT®) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, aproximadamente 4 minutos para el ARCHITECT®).
Otras plataformas disponibles de Abbott Laboratories incluyen, pero no se limitan a, AxSYM®, IMx® (véase, por ejemplo, patente E.U.A. No. 5,294,404, la cual se incorpora en la presente solicitud para referencia en su totalidad), PRISM®, EIA (glóbulo), y Quantum™ II, así como otras plataformas. De manera adicional, las pruebas, estuches y componentes del estuche se pueden utilizar en otros formatos, por ejemplo, en sistemas de prueba electroquímicos u otros sistemas de prueba portátiles o en el sitio de atención. La presente solicitud, por ejemplo, se puede aplicar a al sistema de inmuno-ensayo electroquímico Abbott Point of Care (i-STAT®, Abbott Laboratories) comercial que efectuar inmuno-ensayos en emparedado. Los inmuno-detectores y sus métodos de fabricación y funcionamiento en dispositivos de prueba de un solo uso se describen, por ejemplo en, patente E.U.A. No. 5,063,081, publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2003/0170881, publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2004/0018577, publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2005/0054078, y publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2006/0160164, las cuales se incorporan en sus totalidades para referencia a por sus enseñanzas referentes a lo mismo.
En particular, con respecto a la adaptación de una prueba de analito al sistema l-STAT®, se prefiere la siguiente configuración. Se fabrica un chip de silicio micro-fabricado con un par de electrodos de trabajo amperométricos de oro y un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata. En uno de los electrodos de trabajo, se adhieren glóbulos de poliestireno (0.2 mm de diámetro) con anticuerpo monoclonal/policlonal (o fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo) anti-analito, inmovilizado, o DVD-lg (o un fragmento de la misma, una variante de la misma, o un fragmento de una variante de la misma) anti-analito, a un revestimiento polimérico de policlonal polivinílico con patrón sobre el electrodo. Este chip se ensambla en un cartucho l-STAT® con un formato fluídico apropiado para inmuno-ensayo. En una porción de la pared de la cámara que contiene la muestra de cartucho está presente una capa que comprende un compañero de unión específica para un analito, tal como un anticuerpo monoclonal/policlonal (o un fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo que se pueda unir al analito) anti-analito, o una DVD-lg (o un fragmento de la misma , una variante de la misma, o un fragmento de una variante de la misma que se pueda unir al analito) anti-analito, de las cuales cualquiera se puede marcar en forma detectable. Dentro de la bolsa de fluido del cartucho está un reactivo acuoso que incluye fosfato de p-aminofenol.
En funcionamiento, se agrega una mezcla de la que se sospecha que contiene un analito a la cámara de contención del cartucho de prueba , y cartucho se inserta en el lector de l-STAT®. Después que el compañero de unión específica para un analito se disuelve en la muestra, un elemento de bombeo dentro del cartucho obliga a la muestra a pasar a un conducto q ue contiene el chip. En este punto, ésta se hace oscilar para promover la formación del emparedado. En el penúltimo paso de la prueba, el fluido se obliga a salir de la bolsa y a pasar al interior del conducto para lavar la muestra el chip y hacia una cámara de desecho. En el paso final de la prueba, la marca de fosfatasa alcalina reacciona con el fosfato de p-aminofenol para escindir el grupo fosfato y permitir que el p-aminofenol liberado se oxide electroqu ímicamente en el electrodo de trabajo. Tomando como base la corriente medida, el dispositivo de lectura puede calcular la cantidad de analito en la muestra por medio de un algoritmo incrustado y curva de calibración determinada en la fábrica.
No es necesario decir que los métodos y estuches como se describen en la presente solicitud abarcan necesariamente otros reactivos y métodos para efectuar el inmuno-ensayo. Por ejemplo, se abarcan varias soluciones amortiguadoras tales como las conocidas en la técnica y/o que se puedan preparar fácilmente u optimizar para ser utilizadas, por ejemplo, para lavado, como un diluyente de conjugado, diluyente de micropartícula, y/o como un diluyente del calibrador. Un diluyente de conjugado de ejemplo es el diluyente de conjugado ARCHITECT® empleado en algunos estuches (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) y que contiene ácido 2-(N-morfolino)etansulfónico (MES), una sal, un bloqueador de proteína, un agente antimicrobiano, y un detergente. Un ejemplo de diluyente del calibrador es el diluyente de calibrador de humano ARCHITECT® empleado en algunos estuches (Abbott Laboratories, Abbott Párk, IL), el cual comprende una solución amortiguadora que contiene MES, otra sal, un bloqueador de proteína, y un agente antimicrobiano. De manera adicional, como se describe en la solicitud de patente E.U.A. No. 61/142,048 presentada el 31 de diciembre de 2008, se puede obtener generación de señal mejorada, por ejemplo, en un formato de cartucho l-Stat, utilizando una secuencia de ácido nucleico ligada al anticuerpo de señal como un amplificador de la señal.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Diseño. Construcción, y análisis de una DVD-lg Ejemplo 1.1: Pruebas utilizadas para identificar v caracterizar anticuerpos progenitores v DVD-lg Las siguientes pruebas se utilizan a través de todos los ejemplos para identificar y caracterizar anticuerpos progenitores y DVD-lg a menos que se indique de otra manera.
Ejemplo 1.1.1: Pruebas utilizadas para determinar la unión v afinidad de anticuerpos progenitores v DVD-lg para su(s) antíqeno(s) objetivo Ejemplo 1.1.1. A: PRUEBA ELISA Las pruebas con inmuno-sorbente ligado a enzima (ELISA) para el tamizaje respecto a anticuerpos que se unen a un antígeno objetivo deseado se efectúan de la siguiente manera.
Método 1 Se revisten placas de ELISA (Corning Costar, Acton, MA) 50 L/cavidad de anti-lgG específico de Fe de ratón, de cabra, 5Mg/ml, (Pierce # 31170, Rockford, IL) en solución salina amortiguada con fosfatos (PBS) durante la noche a 4°C. Las placas se lavan una vez con PBS que contiene Tween-20 al 0.05%. Las placas se bloquean mediante adición de 200 gL/cavidad de solución amortiguadora para bloqueo diluida hasta 2% en PBS (BioRad #170-6404, Hercules, CA.) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan una vez después de bloquear con PBS que contiene Tween-20 al 0.05%.
Se agregan cincuenta microlitros por cavidad de, por ejemplo, sobrenadantes de hibridoma, de suero de ratón, o preparaciones de anticuerpo o de DVD-lg diluidas en PBS que contiene 0.1% de seroalbúmina de bovino (BSA) (Sigma, St. Louis, MO) a la placa ELISA preparada como se describió anteriormente y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavan tres veces con PBS que contiene Tween-20 al 0.05%. A cada cavidad se agregan cincuenta microlitros de antígeno objetivo purificado recombinante modificado con biotina diluido hasta 100 ng/mL en PBS que contiene 0.1% de BSA y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan 3 veces con PBS que contiene Tween-20 al 0.05%. Se diluye estreptavidina HRP (Pierce # 21126, Rockland, IL) 1:20000 en PBS que contiene 0.1% BSA; se agregan 50 L/cavidad y las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan 3 veces con PBS que contiene Tween-20 al 0.05%. A cada cavidad se agregan cincuenta microlitros de solución de TMB (Sigma # T0440, St. Louis, MO) y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detiene mediante adición de ácido sulfúrico 1N. Las placas se leen espectrofotométricamente a una longitud de onda de 450 nm.
Método 2 Las pruebas con inmuno-sorbente ligado a enzima para el tamizaje respecto a anticuerpos anti-PGE2 o moléculas que contienen DVD-lg anti-PGE2 que se unen a prostaglandina E2 se efectúan de la siguiente manera. Se revisten placas de ELISA (Costar 3369, Corning, NY) con 50 µ? de anti-lgG de Fe de hospedero (Sigma, St. Louis, MO) a 2 g/ml en PBS (Invitrogen Carlsbad, CA). Después de incubación durante la noche a 4°C, la placa se bloquea con 200 µ? de Superblock (Pierce #37535, Rockford, IL). Las muestras que contienen IgG o DVD-lg se diluyen hasta 1 pg/ml en solución amortiguadora para análisis (10% de Superblock en PBS que contiene 0.05% de Surfactamps (Pierce #37535, Rockford, IL) y se incuban en la placa a 50 µ?/cavidad durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas se lavan cuatro veces con TTBS (solución amortiguada con Tween-Tris). Para la unión a PGE2, se diluye PGE2-biotinamida (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) hasta 30 nM y se diluye en serie en solución amortiguadora para análisis. La curva de titulación se agrega a cada muestra de IgG o DVD-lg a un volumen de 50 µ?/cavidad y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan como se describió previamente y se agregan 50 µ?/cavidad de la dilución 1:5000 de estreptavidina polihrp40 (Fitzgerald Industries, Concord, MA) en solución amortiguadora para análisis y se incuba durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se efectúa un paso de lavado final y las placas se revelan utilizando un sistema de TMB de un solo paso (Sigma #T8665, St. Louis, MO) y H2S042N. Las placas se leen a 450 nm en una lectora de placas Molecular Devices Spectramax (Sunnyvale, CA). La CE50 se determina utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA) (Figura 2).
Método 3 De manera alternativa, se puede determinar un tamizaje de unión a prostaglandina para anticuerpos o moléculas de DVD-lg utilizando una ELISA para 3H-PGE2. Las placas se revisten a 50 µ?/cavidad con 5 g/ml de anti-lgG (Fe) de humano, de cabra (Thermo Scientific # 31170, Hudson, NH) o anti-lgG (Fe) de ratón, de cabra (Thermo Scientific # 31125, Hudson, NH) en PBS y se incuban durante la noche a 4°C. Al día siguiente las placas se voltean y se secan con papel secante. Las placas después se bloquean con 200 µL/ca idad de Superblock (Thermo Scientific # 37515, Hudson, NH), durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se voltean y se secan con papel secante. Los anticuerpos monoclonales se diluyen hasta 0.04 pg/ml en PBST (Abbott Bioresearch Center, Worcester, MA)/ 10% de Superblock y se agregan 50 uL de cada uno de anticuerpo o DVD-lg a cada cavidad de la placa de ELISA previamente bloqueada a 2ng/cavidad y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavan 3 veces con PBS + 0.1% de Tween-20. Se prepara una dilución en serie de 3 veces de 3H-PGE2 (Perkin Elmer # NET-428, Waltham, MA) en PBST + 10% de Superblock. Después se agregan cincuenta microlitros de la solución de 3H-PGE2 a cada cavidad de la placa y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavan 6 veces con PBST + 10% de Superblock y se agregan 50 µ? de fluido para centelleo (Perkin Elmer # 6013621, Waltham, MA) a cada cavidad. Las placas se leen utilizando la lectora TopCount (Perkin Elmer, Waltham, MA) con un retraso de conteo de 5 minutos. El número de CE50 se determina utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA).
Ejemplo 1.1.1.B: ELISA de competición Las pruebas con inmuno-sorbente ligado a enzima de competición para determinar la especificidad de unión a prostaglandina para anticuerpos anti-PGE2 o moléculas de DVD-lg que contienen anti-PGE2 que se unen a prostaglandina E2 se efectúan de la siguiente manera.
Método 1 Se revistan placas de ELISA (Costar 3369, Corning, NY) con 50 µ?/cavidad de anti-lgG de Fe de hospedero (Sigma, St. Louis, MO) a 2 Mg/ml en PBS (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de una incubación durante la noche a 4°C, la placa se bloquea con 200 µ? de Superblock (Pierce #37535, Rockford, IL). Las muestras de IgG se diluyen hasta 6 µ9/??? en solución amortiguadora para análisis (10% de Superblock en PBS que contiene 0.05% de Surfactamps (Pierce #37535, ockford, IL). Para la unión a PGE2, la PGE2-biotinamida se diluye hasta 3 nM en solución amortiguadora para análisis. Se prepara una curva de titulación en solución amortiguadora para análisis para las prostaglandinas PGA2 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI), PGD2 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) y PGE2 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) comenzando en 300 nM mediante una dilución en serie 1:10. Los reactivos se agregan a los tubos a un volumen de 50 µ? cada/cavidad y se pre-incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la pre-incubación, la mezcla se transfiere a las placas bloqueadas y se deja incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, las placas se lavan cuatro veces con solución amortiguada con Tween 20-Tris (TTBS). Después se agrega estreptavidina polihrp40 en solución amortiguadora para análisis (Fitzgerald Industries, Concord, MA) a una dilución 1:5000 a las cavidades y se incuba durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se efectúa un paso final de lavado y las placas se revelan utilizando un sistema TMB de un solo paso (Sigma #T8665, Sigma, St. Louis, MO) y H2S04 2N. Las placas se leen a 450 nm en una lectora de placas Molecular Devices Spectramax (Sunnyvale, CA). Las cavidades en las cuales las prostaglandinas no marcadas compiten con la PGE2-biotinamida por lo unión dan como resultado un decremento de la señal. El número de CI50 se determina utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA). El índice de reactividad cruzada se calcula después mediante CI50 de PGE2/CI50 de la(s) otra(s) prostaglandina(s).
Método 2 De manera alternativa, la selectividad de objetivo se determina utilizando una ELISA de competición de 3H-PGE2. Las placas se revisten con 50 uL/cavidad de 5 pg/ml de anti-lgG (Fe) de humano, de cabra (Thermo Scientific # 31170, Hudson, NH) o anti-lgG (Fe) de ratón, de cabra (Thermo Scientific # 31125, Hudson, NH) en PBS y se incuba durante la noche a 4°C. Al día siguiente las placas se voltean y se secan con papel secante. Las placas después se bloquean con 200 ML/cavidad de Superblock (Thermo Scientific # 37515, Hudson, NH), 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se voltean y se secan con papel secante. Los anticuerpos monoclonales se diluyen hasta 0.04 Mg/ml en PBST (Abbott Bioresearch Center, Worcester, MA) + 10% de Superblock y se agregan 50 L de cada uno a cada cavidad (2 ng/cavidad) de la placa de ELISA pre-bloqueada y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavan 3 veces con PBS + 0.1% de Tween-20. 3H-PGE2 (Perkin Elmer # NET-428, Waltham, MA) se diluye en PBST + 10% de Superblock hasta 6 nM (solución de reserva 2X). Cada prostaglandina (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) se prepara en PBST + 10% de Superblock a varias concentraciones que varían desde 2000 µ? (solución de reserva 2X) hasta 0.00004 µ? (2X). Se mezclan volúmenes iguales de la solución de 3H-PGE2 y de cada dilución de prostaglandina. Después se agregan cincuenta microlitros de esta mezcla a cada cavidad de la placa y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavan manualmente 6 veces con PBST 10% de Superblock y se agregan 50 µ?_ de fluido para centelleo (Perkin Elmer # 6013621, Waltham, MA) a cada cavidad. Las placas se leen utilizando una lectora TopCount (Perkin Elmer, Waltham, MA) con un retraso de 5 minutos en el conteo. El número CI50 se determina utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA). El índice de reactividad cruzada se calcula después mediante CI50 de PGE2/CI50 de otra(s) prostaglandina(s) Ejemplo 1.1.1.C: Determinación de afinidad utilizando la prueba BIAcore La prueba BIAcore (BIAcore, Inc, Piscataway, NJ) determina la afinidad de los anticuerpos o DVD-lg con mediciones cinéticas de las constantes de velocidad de asociación y velocidad de disociación.
La unión de los anticuerpos o DVD-lg a un antígeno objetivo (por ejemplo, un antígeno objetivo recombinante purificado) se determina mediante mediciones basadas en resonancia de plasmón de superficie con un instrumento BIAcore® 3000 (BIAcore® AB, Uppsala, Suecia) utilizando HBS-EP para corrida (HEPES 10 mM [pH 7.4], NaCI 150 mM, EDTA 3 mM, y 0.005% de agente tensoactivo P20) a 25°C. Todos los productos químicos se obtienen a partir de BIAcore® AB (Uppsala, Suecia) o de lo contrario a partir de una fuente diferente como se describe en el texto. Por ejemplo, aproximadamente 5000 UR de anti-lgG, (Fcy) de ratón, anticuerpo policlonal específico de fragmento, de cabra (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL) diluidas en acetato de sodio 10 mM (pH 4.5) se inmovilizan directamente a través de un chip biosensor C 5 de grado investigación utilizando un estuche para copulación de amida estándar de conformidad con las instrucciones y procedimientos del fabricante a 25 pg/ml. Las porciones sin reaccionar en la superficie del biosensor se bloquean con etanolamina. Se utiliza superficie de carboximetildextrano modificado en las celdas de flujo 2 y 4 como una superficie de reacción. El carboximetil dextrano no modificado sin anti-lgG de ratón, de cabra, en las celdas de flujo 1 y 3 se utiliza como la superficie de referencia. Para el análisis cinético, las ecuaciones de velocidad derivadas del modelo de unión 1:1 de Langmuir se ajustan simultáneamente a las fases de asociación y disociación de todas las ocho inyecciones (utilizando análisis de ajuste global) con el uso del software Biaevaluation 4.0.1. Los anticuerpos o DVD-lg purificados se diluyen en solución salina amortiguada con HEPES para capturar a través de las superficies de reacción de específicas de anti-lgG de ratón, de cabra. Los anticuerpos que se van a capturar como un ligando (25 pg/ml) se inyectan sobre matrices de reacción a una velocidad de flujo de 5 µ?/min. Las constantes de velocidad de asociación y disociación, kasoc (M"1S 1) y kdisoc (s 1) se determinan bajo una velocidad de flujo continua de 25 µ?/min. Las constantes de velocidad se obtienen efectuando mediciones de unión cinética a diez concentraciones diferentes de antígeno que varían desde 10 - 200 nM o de manera alternativa de 1.25 a 1000 mM. La constante de disociación en equilibrio (M) de la reacción entre los anticuerpos o DVD-lgs y el antígeno objetivo se calcula después a partir de las constantes de velocidad cinética mediante la siguiente fórmula: KD = kdisoc kasoc- La unión se registra como una función del tiempo y se calculan las constantes de velocidad cinética. En esta prueba se puede medir velocidades de asociación tan rápidas como 106 M"1S"1 y velocidades de disociación tan lentas como 10~6 s"1.
Ejemplo 1.1.2: Pruebas utilizadas para determinar la actividad funcional de los anticuerpos progenitores y DVD-lg Ejemplo 1.1.2. A: Bioensayo de EP4 Se determina la capacidad de los anticuerpos anti-PGE2 y moléculas de DVD-lg que contienen anti-PGE2 para inhibir la respuesta celular de PGE2 en una prueba de flujo de Ca++ en células HEK293 Ga16 establemente transfectadas con receptor EP4 de humano. Las células se siembran en placas de poli-D-lisina negras/claras, (Corning #3667, Corning, NY) y se incuban con colorante sensible a Ca++ (Molecular Devices) durante 90 minutos. La solución de reserva de PGE2 (en etanol absoluto) se diluye con solución amortiguadora FLIPR (que contiene 1X HBSS (Invitrogen, Carlsbad, CA), HEPES 20 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.1% de BSA (Sigma, St. Louis, MO) y Probenecid 2.5 mM (Sigma, St. Louis, MO)). Los anticuerpos anti-PGE2> las moléculas de DVD-lg o los anticuerpos de control igualados al isotipo también se prediluyen en solución amortiguadora FLIPR. Se agregan 25 µ? de PGE2 o de mezcla pre-incubada de PGE2/anticuerpo o de mezcla pre-incubada de PGE2/molécula de DVD-lg a las paredes pre-sembradas con células. Se efectúa una respuesta a dosis de PGE2 mediante una titulación en serie de PGE2 y se determina utilizando FLIPR1 o Tetra (Molecular Devices). La CE50 se determina utilizando GraphPad Prism 5 (GraftPad Software, La Jolla, CA). Para analizar los anticuerpos y moléculas de DVD-lg, se incuba PGE2 a concentración de CE50 con concentraciones variables de los artículos de prueba o anticuerpo igualado al isotipo (control negativo) durante 20 minutes, se agrega a EP4 de humano cargado con colorante en células HEK293 Ga16. El flujo de Ca++ se monitorea utilizando FLIPR1 y los datos se analizan utilizando GraphPad Prism 5.
Ejemplo 1.1.2.B: Inhibición competitiva de la unión de PGE? a los receptores de PGE? mediante anticuerpos anti-prostaglandina E? utilizando 3H-PGE? La inhibición competitiva de unión de PGE2 a los receptores de PGE2, por ejemplo EP4 o EP3, mediante un anticuerpo anti-PGE2 se determinan utilizando una prueba de unión a receptor basada en célula o basada en membrana empleando 3H-PGE2 (ProstaglandinE2, [5,6,8,11,12, 14, 15-3H(N)], Perkin Elmer, Waltham, MA. Cat# NET428250UC).
Las células que expresan endógenamente o que sobre- expresan establemente al receptor EP4 (es decir, células HEK293-EP4 o células HEK293-EP4-Ga16 utilizadas para la el bioensayo de EP4) (105 células/mL) se cultivan durante la noche en una placa de 24 cavidades en medio DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) / 10% de FCS (Sigma #T8665, Sigma, St. Louis, MO). Se retira el medio y se agregan 100 µ? de solución reguladora para unión (medio sin FCS). La placa se coloca en hielo durante 10 minutos. PGE2 no radioactiva (0-1 µ?) se agrega junto con el rastreador (40 pM de 3H-PGE2) en un volumen de 100 µ?. La unión a receptor en equilibrio se efectúa durante 90 minutos a 4°C. El medio se retira y las células se lavan cuatro veces con 200 µ? de medio frío. Las células se recolectan agregando 20 µ? de NaOH 0.5 M. El Usado se transfiere una placa de centelleo líquido. Se agregan 100 µ? de Aquasafe 500 (Zinsser Analytic, Frankfurt, Alemania) más cóctel de LSC (Lumac LSC, Groningen, Los Países Bajos) a cada cavidad y se mezcla. La radioactividad unida a célula determina mediante conteo de centelleo líquido. Para la mayoría de las interacciones agonista-receptor, se considera que la inhibición de unión al receptor por parte del agonista (PGE2) sigue un modelo de un sitio. Los valores de CE50, Ki y Ka se calculan utilizando el GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA).
La inhibición de un anticuerpo anti-PGE2 sobre la unión de 3H-PGE2 (ProstaglandinE2, [5,6,8,11 ,12,14, 15-3H(N)], Perkin Elmer, Watham, MA. Cat# NET428250UC) al receptor EP3 se efectúa utilizando preparaciones de membrana provenientes de células que sobre-expresan al receptor EP3 (Millipore, Billerica, MA). Antes de la prueba de unión, se agregan 50 µ?/cavidad de polyetilenimina (PEI) al 0.3% (Sigma, St. Louis, MO) a una placa de filtro GF/B Unifilter-96 (Perkin Elmer, Watham, MA) y se coloca a 4°C durante una hora hasta que está lista para ser utilizada. Se prepara una dilución 1:3 de anticuerpo a una concentración 2X en solución reguladora para unión (HEPES 50 mM pH 7.0,' MgCI2 10 mM, EDTA 1 mM, BSA al 0.2%). También se prepara 3H-PGE2 a una concentración 2X en solución reguladora para unión. Después se agregan 50 µ? de una dilución en serie de anticuerpo a cada cavidad que contienen 50 µ? de 3H-PGE2 200 pM, se mezcla bien y se deja reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las membranas congeladas se descongelan y se vuelven a suspender en solución reguladora para unión. Se agregan 5µg de membrana a cada cavidad. Las mezclas se incuban a temperatura ambiente durante 60 minutos antes de filtrar en placas de filtración GF/B pretratadas utilizando un dispositivo para recolección Packard de 96 cavidades. Las placas se secan después durante una hora antes de agregar Microscint™20 (Perkin Elmer, Waltham, MA). Las placas se sellan después y se cuentan en la lectora TopCount (Perkin Elmer, Waltham, MA). La unión no específica se determina en presencia de PGE2 100 µ? fría. La radioactividad medida (cpm) se utiliza para determinar los valores de Cl50 utilizando Graphpad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).
Ejemplo 1.1.2.C: Prueba de L929 La capacidad de los anticuerpos anti-TNFa y de las moléculas de DVD-lg anti-TNFa para inhibir la muerte inducida por TNFa de células L929 (ATCC #CCL-1) se analiza de la siguiente manera. Se recolectan células L929 y se vuelven a suspender a 1 x 106 células/ml en medio para prueba RPMI que contiene 4 pg/ml de actinomicina. Las células se siembran en el día uno a 50 µ?/cavidad en una placa de 96 cavidades (Costar) a una concentración final de 5 x 104 células/cavidad. Las moléculas de DVD-lg se preparan para análisis mediante dilución en serie en medio para prueba RPMI sin actinomicina. Las muestras diluidas se agregan después a la placa de 96 cavidades a un volumen de 50 µ?/cavidad. El TNFa de múrido (A-846899.0) se diluye en serie para generar una curva patrón y se agregan 50 µ? a las cavidades de la curva patrón. Las concentraciones finales de la curva varían de 3 ng/ml - 0.0014 ng/ml. Para neutralización, el TNFa de múrido se agrega a las cavidades de muestra de DVD a 50 µ? para una concentración final de 100 pg/ml. Las cavidades se llevan a un volumen final de 200 µ?/cavidad y se incuban durante 18 horas a 37°C, 5% de C02. Después de la incubación, las placas se centrifugan a 1200 rpm y se retiran 100 µ? de las cavidades. Se agrega WST-1 (Roche) a las células a 10 µ?/cavidad y las placas se incuban a 37°C, 5% de C02 durante 4 horas. Las placas se centrifugan a 1200 rpm y se retiran 75 µ? de las cavidades y se transfieren a una placa de ELISA (Costar 3369) y se leen a 420 - 600 nm en una lectora de placas Molecular Devices Spectramax. Los DVDs neutralizantes protegen las células contra la muerte, lo que da como resultado un color naranja brillante.
Ejemplo 1.1.2.D: Bioensavo de citocina La capacidad de un anticuerpo progenitor anti-citocina o DVD-lg que contiene secuencias anti-citocina para inhibir o neutralizar una bioactividad de citocina objetivo se analiza determinando el potencial inhibidor del anticuerpo o DVD-lg. Por ejemplo, se puede utilizar la capacidad de un anticuerpo anti-IL-4 para inhibir la producción de IgE mediada por IL-4. Por .ejemplo, se aislan células B no afectadas de humano a partir de sangre periférica, respectivamente, capas leucocíticas mediante centrifugación por densidad de Ficoll-paque, seguido por separación magnética con glóbulos MACS (Miltenyi Biotech) específicos para anticuerpos humanos F(ab)2 de cabra marcados con slgD FITC seguido por glóbulos MACS anti-FITC. Las células no afectadas clasificadas magnéticamente se ajustan a 3 x 105 células por mi en XV15 y se siembran en 100 µ? por cavidad de placas de 96 cavidades en un arreglo 6 x 6 en el centro de la placa, rodeadas por cavidades llenas con PBS durante los 10 días de cultivo a 37°C en presencia de 5% de C02. Se prepara una placa de cada uno por anticuerpo a ser analizado, que consiste de 3 cavidades cada uno de controles no inducidos e inducidos y repeticiones por quintuplicado de titulaciones de anticuerpo comenzando en 7 µg/ml y que se corren en dilución de tres veces hasta concentraciones finales de 29 ng/ml agregadas en 50µ? de predilución cuatro veces concentrada. Para inducir la producción de IgE, se agrega a cada cavidad rhll_-4 a 20 ng/ml más anticuerpo monoclonal anti-CD40 (Novartis) a 0.5 pg/ml de concentraciones finales en 50 µ? cada uno, y las concentraciones de IgE se determinan al final del periodo de cultivo mediante un método de ELISA en emparedado estándar.
Ejemplo 1.1.2.E: Prueba de liberación de citocina Se analiza la capacidad de un anticuerpo progenitor o DVD-lg para ocasionar la liberación de citocina. Se extrae sangre periférica a partir de tres donadores saludables mediante perforación de la vena hacia tubos vacutainer heparinizados. Las sangre entera se diluye 1:5 con medio RPMI-1640 y se coloca en placas de cultivo de tejidos de 24 cavidades a 0.5 mL por cavidad. Los anticuerpos anti-citocina (por ejemplo, anti-IL-4) se diluyen en RPMI-1640 y se colocan en las placas a 0.5 mL/cavidad para obtener concentraciones finales de 200, 100, 50, 10, y 1 pg/mL. La dilución final de la sangre entera en las placas de cultivo es 1:10. Se agregan LPS y PHA a cavidades separadas a concentraciones finales de 2 Mg/mL y 5 pg/mL como un control positivo para la liberación de citocina. Se utiliza IgG policlonal de humano como anticuerpo de control negativo. El experimento se efectúa por duplicado. Las placas se incuban a 37°C a 5% de C02. 24 horas después los contenidos de las cavidades se transfieren a tubos ensayo y se centrifugan durante 5 minutos a 1200 rpm. Se recolectan los sobrenadantes libres de célula y se congelan para las pruebas de citocina. Las células que quedan en las placas y en los tubos se Usan con 0.5 ml_ de solución de lisis, y se colocan a -20°C y se descongelan. Se agregan 0.5 mL de medio (para llevar el volumen hasta el mismo nivel que el de las muestras de sobrenadante libre de célula) y las preparaciones de células se recolectan y congelan para pruebas de citocina. Los sobrenadantes libres de célula y los Usados celulares se analizan respecto a niveles de citocina mediante ELISA, por ejemplo, respecto a los niveles de IL-8, IL-6, IL-1 ß, IL-IRA, o TNF-a.
Ejemplo 1.1.2.F: Estudio de reactividad cruzada de citocina Se analiza la capacidad de un anticuerpo progenitor anti-citocina o DVD-lg dirigida contra una o unas citocinas de interés para reacción cruzada con otras citocinas. Los anticuerpos progenitores o DVD-lg se inmovilizan en una matriz de biosensor BIAcore. Un mAb anti-Fc de humano se enlaza covalentemente a través de los grupos amina libres a la matriz de dextrano activando primero los grupos carboxilo en la matriz con N-hidroxisuccinimida (NHS) 100 mM y clorhidrato de N-et¡l-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) 400 mM. Se inyectan aproximadamente 50 µ? de cada preparación de anticuerpo o DVD-lg a una concentración de 25pg/mL, diluida en acetato de sodio, pH4.5, a través del biosensor activado y las aminas libres en la proteína se unen directamente a los grupos carboxilo activados. Típicamente, se inmovilizan 5000 Unidades de Resonancia (UR's). Los EDC-ésteres de matriz sin reaccionar se desactivan mediante una inyección de etanolamina 1 M. Se prepara una segunda celda de flujo como un patrón de referencia inmovilizando lgG1/K de humano utilizando el estuche de copulación de amina estándar. Las mediciones de SPR se efectúan utilizando el chip de biosensor CM. Todos los antígenos a ser analizados en la superficie del biosensor se diluyen en solución amortiguadora para corrida HBS-EP que contiene 0.01% de P20.
Para examinar la especificidad de unión a citocina, se inyecta un exceso de la citocina de interés (100 nM, por ejemplo, soluble recombinante de humano) a través de la superficie del biosensor con anticuerpo progenitor o DVD-lg anti-citocina inmovilizado (tiempo de contacto de 5 minutos). Antes de la inyección de la citocina de interés e inmediatamente después de esto, la solución amortiguadora HBS-EP sola fluye a través de cada celda de flujo. Se toma la diferencia neta en las señales entre la línea basal y el punto correspondiente a aproximadamente 30 segundos después de completar la inyección de citocina para representar el valor de unión final. De nuevo, la respuesta se mide en unidades de resonancia. Las matrices de biosensor se regeneran utilizando HCI 10 mM antes de inyectar la siguiente muestra en caso que se observe un evento de unión, de lo contrario se inyecta solución amortiguadora para corrida a través de las matrices. Las citocinas de humano (por ejemplo, IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL- 7, IL-18, IL-19, IL-20, IL-22, IL-23, IL-27, TNF-a, TNF-ß, e IFN-?, por ejemplo) también se inyecta simultáneamente a través de la superficie de referencia con lgG1/K inmovilizada de ratón para registrar cualquier fondo de unión no específica. Mediante preparación de una superficie de referencia y una superficie de reacción, BIAcore puede restar automáticamente los datos de la superficie de referencia de los datos de la superficie de reacción para eliminar la mayoría del cambio de índice de refracción y ruido de inyección. Por lo tanto, es posible establecer la respuesta de unión real atribuida a una reacción de unión de anticuerpo o DVD-lg anti-citocina.
Cuando una citocina de interés se inyecta a través de un anticuerpo anti-citocina inmovilizado, se observa unión significativa. La regeneración con HCI 10 mM elimina completamente todas las proteínas no asociadas covalentemente. El examen del sensorgrama muestra que el anticuerpo o DVD-lg anti-citocina inmovilizado que se une a la citocina soluble es fuerte y robusto. Después de confirmar el resultado esperado con la citocina de interés, se analiza el panel de citocinas humanas recombinantes remanentes, para cada anticuerpo o DVD-lg por separado. Se registra la cantidad de citocina unida o no unida a anticuerpo o DVD-lg anti-citocina para cada ciclo de inyección. Se utilizan los resultados de tres experimentos independientes para determinar el perfil de especificidad de cada anticuerpo o DVD-lg. Se seleccionan los anticuerpos o DVD-lg con la unión esperada a la citocina de interés y que no se une a ninguna otra citocina.
Ejemplo 1.1.2.G: Reactividad cruzada tisular Los estudios de reactividad cruzada tisular se efectúan en tres etapas, la primera etapa incluye criosecciones de 32 tejidos, la segunda etapa incluye hasta 38 tejidos, y la tercera etapa incluye tejidos adicionales provenientes de tres adultos no relacionados como se describe más adelante. Los estudios se hacen típicamente a dos niveles de dosis.
Etapa 1 Se fijan y secan sobre portaobjetos criosecciones (de aproximadamente 5 µ?t?) de tejidos humanos (32 tejidos (típicamente: glándula adrenal, tracto gastrointestinal, próstata, vejiga urinaria, corazón, músculo esquelético, células sanguíneas, riñon, piel, médula ósea, hígado, médula espinal, tejido mamario, pulmón, bazo, cerebelo, nodo linfático, testículos, corteza cerebral, ovario, timo, colon, páncreas, tiroides, endotelio, paratiroides, uretra, ojo, pituitaria, útero, trompas de Falopio y placenta) provenientes de un donador humano obtenidos en la autopsia o biopsia). Se efectúa la tinción con peroxidasa de las secciones de tejido, utilizando el sistema de avidina-biotina.
Etapa 2 Se fijan y secan sobre portaobjetos criosecciones (de aproximadamente 5 µ??) de tejidos humanos, 38 tejidos (incluyendo adrenales, sangre, vaso sanguíneo, médula ósea, cerebelo, cerebro, cuello uterino, esófago, ojo, corazón, riñon, intestino grueso, hígado, pulmón, nodo linfático, glándula mamaria de la mama, ovario, oviducto, páncreas, paratiroides, nervio periférico, pituitaria, placenta, próstata, glándula salival, piel, intestino delgado, médula espinal, bazo, estómago, músculo estriado, testículos, timo, tiroides, amígdala, uretra, vejiga urinaria, y útero) provenientes de 3 adultos no relacionados obtenidos en la autopsia o biopsia). Se efectúa la tinción con peroxidasa de las secciones de tejido, utilizando el sistema de avidina-biotina.
Etapa 3 Se fijan y secan sobre portaobjetos criosecciones (de aproximadamente 5 µ?t?) de tejidos de mono cynomolgus (38 tejidos (incluyendo adrenales, sangre, vaso sanguíneo, médula ósea, cerebelo, cerebro, cuello uterino, esófago, ojo, corazón, riñon, intestino grueso, hígado, pulmón, nodo linfático, glándula mamaria de la mama, ovario, oviducto, páncreas, paratiroides, nervio periférico, pituitaria, placenta, próstata, glándula salival, piel, intestino delgado, médula espinal, bazo, estómago, músculo estriadotestículos, timo, tiroides, amígdala, uretra, vejiga urinaria, y útero) provenientes de 3 monos adultos no relacionados obtenidos en la autopsia o biopsia). Se efectúa la tinción con peroxidasa de las secciones de tejido, utilizando el sistema de avidina-biotina.
El anticuerpo o DVD-lg se incuba con el anti-lgG de humano secundario modificado con biotina y se desarrolla como un complejo inmune. El complejo inmune se agrega a las concentraciones finales de 2 y 10 Mg/mL de anticuerpo o DVD-lg sobre las secciones de tejido en los portaobjetos y después las secciones de tejido se hacen reaccionar durante 30 minutos con un estuche de avidina-biotina-peroxidasa. Posteriormente, se aplica DAB (3,3'-diaminobencidina), un substrato para la reacción de peroxidasa, durante 4 minutos para tinción del tejido. Se utilizan glóbulos de antígeno-sefarosa como secciones de tejido de control positivo. Los estudios de bloqueo de antígeno objetivo y suero humano sirven como controles adicionales. El complejo inmune a las concentraciones finales de 2 y 10 g/mL de anticuerpo o DVD-lg se pre-incuba con el antígeno objetivo (concentración final de 100 Mg/ml) o suero humano (concentración final 10%) durante 30 minutos, y después se agrega sobre las secciones de tejido en los portaobjetos y después las secciones de tejido se hacen reaccionar durante 30 minutos con un estuche de avidina-biotina-peroxidasa. Posteriormente, se aplica DAB (3,3'-diaminobencidina), un substrato para la reacción de peroxidasa, durante 4 minutos para tinción del tejido.
Cualquier tinción específica se juzga como reactividad esperada (por ejemplo, consistente con la expresión de antígeno) o reactividad inesperada tomando como base la expresión conocida del antígeno objetivo en cuestión. Cualquier tinción juzgada como específica se califica respecto a intensidad y frecuencia. La tinción de tejido entre la etapa 2 (tejido de humano) y la etapa 3 (tejido de mono cynomolgus) se juzga ya sea como similar o diferente.
Ejemplo 1.1.2.H: Efecto tumoricida de un anticuerpo progenitor o de DVD-lg in vitro Los anticuerpos progenitores o DVD-lg que se unen a antígenos objetivo en células tumorales se puede analizar respecto a la actividad tumoricida. Brevemente, los anticuerpos progenitores o DVD-lg se diluyen en D-PBS-BSA (solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco con 0.1% de BSA) y se agregan a las células de tumor humano a concentraciones finales de 0.01 pg/mL a 100 pg/mL. Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera humidificada, 5% de C02 durante 3 días. Se cuantifica el número de células vivas en cada cavidad utilizando reactivos MTS de conformidad con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, Wl) para determinar el por ciento de inhibición de crecimiento del tumor. Las células sin tratamiento con anticuerpo se utilizan como controles de 0% de inhibición mientras que las cavidades sin células se consideran representativas de 100% de inhibición.
Para evaluación de apoptosis, se determina la activación de caspasa 3 mediante el siguiente protocolo: se lisan células tratadas con anticuerpo en placas de 96 cavidades en 120 µ? de solución amortiguadora para lisis 1x (Hepes 1.67 mM, pH 7.4, KCI 7mM, MgCI2 0.83mM, EDTA 0.11 mM, EGTA 0.11 mM, 0.57% de CHAPS, DTT 1mM, tabletas de coctel de inhibidor de proteasa 1x; sin EDTA; Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ) a temperatura ambiente con agitación durante 20 minutos. Después de la lisis células, se agregan 80 µ? de una solución amortiguadora para reacción de caspasa-3 (Hepes 48 mM, pH 7.5, sacarosa 252 mM, 0.1% de CHAPS, DTT 4 mM, y substrato Ac-DEVD-AMC 20 µ?; Biomol Research Labs, Inc., Plymouth Meeting, PA) y las placas se incuban durante 2 horas a 37°C. las placas se leen en un contador 1420 VICTOR Multilabel (Perkin Elmer Life Sciences, Downers Grove, IL) usando los siguientes ajustes: excitación = 360/40, emisión = 460/40. Se observa un incremento de unidades de fluorescencia provenientes de las células tratadas con anticuerpo con relación a las células tratadas con control de anticuerpo de isotipo, lo que es indicativo de apoptosis.
Ejemplo 1.1.2.1: Inhibición de activación del receptor mediante anticuerpos o DVD-lg a in vitro Los anticuerpos progenitores o DVD-lg que se unen a los receptores de célula o sus ligandos se puede analizar respecto a inhibición de activación del receptor. Los anticuerpos progenitores o DVD-lg diluidos en D-PBS-BSA (solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco con 0.1% de BSA) se agregan a células de carcinoma humano a concentraciones finales de 0.01 g/mL a 100 Mg/mL. Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera humidificada, 5% de C02 durante 1 hora. A las células se agregan factores de crecimiento (por ejemplo, IGF1 o IGF2) a concentración de 1-100 ng/mL durante 5-15 minutos para estimular la auto-fosforilación del receptor (por ejemplo, IGF1R). Las cavidades sin tratamiento con anticuerpo se utilizan como controles de 0% de inhibición mientras que las cavidades sin estimulación del factor de crecimiento se consideran representativas del 100% de inhibición. Los Usados celulares se preparan mediante incubación con solución amortiguadora para extracción celular (Tris 10 mM, pH 7.4, NaCI 100 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 1 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, 1% de Tritón X-100, 10% de Glicerol, 0.1% de SDS, y coctel de inhibidor de proteasa). El fosfo-IGF1R en estos Usados celulares se determina utilizando estuches de ELISA específicos adquiridos en R&D System (Minneapolis, MN).
Ejemplo 1.1.2.J: Eficacia de un anticuerpo o DVD-lg anti-antíqeno de célula tumoral por sí mismo o en combinación con quimioterapia sobre el crecimiento de xenoiniertos de carcinoma de humano (flanco subcutáneo, ortotópico, o metástasis espontánea) Se cultivan células de cáncer de humano in vitro hasta 99% de viabilidad, 85% de confluencia en matraces para cultivo de tejidos. Ratones de género femenino o masculino SCID (Charles Rivers Labs) de 19-25 gramos se marcan el lado dejan y se afeitan. Ratones se inoculan después por vía subcutánea en el flanco derecho con 0.2 mi de 2 x 106 células de tumor humano (matrigel 1:1) en el día 0 del estudio. La administración (IP, Q3D/semana) de vehículo (PBS), anticuerpo o DVD-lg, y/o quimioterapia se inicia después que lo ratones se igualan en tamaño en jaulas separadas de ratones con volúmenes de tumor promedio de aproximadamente 150 a 200 mm3. Los tumores se miden utilizando un par de calibradores dos veces por semana comenzando aproximadamente el día 10 después de la inoculación y los volúmenes de tumor se calculan de conformidad con la fórmula V = L x W2/2 (V: volumen, mm3; L: longitud, mm, W: anchura, mm). Se observa reducción en el volumen del tumor en animales tratados con anticuerpo o DVD-lg solos o en combinación con quimioterapia con relación a tumores en animales que reciben solamente vehículo o un mAb de control de isotipo.
Ejemplo 1.1.2.K: Unión de anticuerpos monoclonales a la superficie de líneas de célula de tumor de humano según se evalúa mediante citometría de flujo Se recolectan líneas de células estables que sobre-expresan el antígeno de superficie celular de interés o líneas de célula de tumor de humano a partir de matraces de cultivo de tejidos y se vuelven a suspender en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) que contiene 5% de suero fetal de bovino (PBS/FCS). Antes de la tinción, las células de tumor humano se incuban en hielo con IgG de humano a 200 pg/ml en PBS/FCS. Se incuban 1-5 x105 células con anticuerpo o DVD-lg (1-2 pg/mL) en PBS/FCS durante 30-60 minutos en hielo. Las células se lavan dos veces y se agregan 100 µ? de anti-IgG de ratón-ficoeritrina, de cabra (dilución 1:300 en PBS/BSA) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Cat.#115-115-164). Después de 30 minutos de incubación en hielo, las células se lavan dos veces y se vuelven a suspender en PBS/FCS. La fluorescencia se mide utilizando un aparato Becton Dickinson FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA).
Ejemplo 1.2: Generación y caracterización de anticuerpos monoclonales progenitores para un antígeno de interés de humano Los mAbs de ratón progenitores que se puede unir a y neutralizar un antígeno de humano de interés y una variante del mismo se obtienen de la siguiente manera: Ejemplo 1.2.1: Inmunización de ratones con un antígeno humano de interés Se inyecta por vía subcutánea 20 microgramos de antígeno de humano purificado recombinante (por ejemplo, IGF1.2), mezclado con coadyuvante completo de Freund o coadyuvante Immunoeasy (Qiagen, Valencia, CA) en cinco ratones Balb/C, cinco ratones C57B/6, y cinco ratones AJ, de 6-8 semanas de edad en el día 1. En los días 24, 38, y 49, se inyecta por vía subcutánea 20 microgramos de variante de antígeno de humano purificado recombinante mezclado con coadyuvante incompleto de Freund o coadyuvante Immunoeasy en los mismos ratones. En el día 84 o el día 112 o el día 144, a los ratones se les inyecta por vía intravenosa 1 pg del antígeno humano purificado recombinante de interés.
Ejemplo 1.2.2: Generación de hibridomas Los esplenocitos obtenidos a partir de los ratones inmunizados descritos en el ejemplo 1.2. A se fusionan con células SP2/0-Ag-14 a una proporción de 5:1 de conformidad con el método establecido descrito en Kohler, G. y Milstein (1975) Nature, 256:495 para generar hibridomas. Los productos de la fusión se siembran en medio para selección que contiene azaserina e hipoxantina en placas de 96 cavidades a una densidad de 2.5 x 106 esplenocitos por cavidad. Siete a diez días después de la fusión, se observan colonias de hibridoma macroscópicas. El sobrenadante proveniente de cada cavidad que contiene colonias de hibridoma se analiza mediante ELISA respecto a la presencia de anticuerpo para el antígeno de interés (como se describe en el ejemplo 1.2. A). Los sobrenadantes que representan actividad antígeno-específica se analizan después respecto a actividad (como se describe en las pruebas del ejemplo 1.1.2), por ejemplo, la capacidad para neutralizar al antígeno de interés en un bio-ensayo tal como el que se describe en el ejemplo 1.1.2. A).
Ejemplo 1.2.3: Caracterización de anticuerpos monoclonales progenitores para un antígeno objetivo humano de interés Ejemplo 1.2.3.1: Análisis de la actividad neutralizante del anticuerpo monoclonal progenitor Los sobrenadantes de hibridoma se analizan respecto a la presencia de anticuerpos progenitores que se unen a un antígeno de interés y que también se pueden unir a una variante del antígeno de interés (" Variante del antígeno"). Los sobrenadantes con anticuerpos positivos en ambas pruebas se analizan después respecto a su potencia de neutralización de antígeno, por ejemplo, en los bioensayos de citocina del ejemplo 1.1.2. Los hibridomas que producen anticuerpos con valores de CI50 en el bioensayo menores de 1000 pM, en una modalidad, menores de 100 pM se escalan y se clonan mediante dilución limitante. Las células de hibridoma se expanden en medio que contiene 10% de suero fetal de bovino con bajo contenido de IgG (Hyclone #SH30151, Logan, UT.). En promedio, se recolectan 250 mL de cada sobrenadante de hibridoma (obtenido a partir de una población clonal), se concentran y purifican mediante cromatografía por afinidad de proteína A, como se describe en Harlow, E. y Lañe, D. 1988 "Antibodies: A Laboratory Manual". La capacidad de los mAbs purificados para inhibir la actividad de su antígeno objetivo se determina, por ejemplo, utilizando los bioensayos de citocina como los descritos en el ejemplo 1.1.2.
Ejemplo 1.2.3.2: Análisis de la reactividad cruzada de anticuerpo monoclonal progenitor contra el antígeno objetivo de cvnomolaus de interés Para determinar si los mAbs seleccionados descritos en la presente solicitud reconocen o no al antígeno de interés de cynomolgus, se efectúa el análisis BIAcore como se describe en la presente solicitud (ejemplo 1.1.1.C) utilizando antígeno objetivo recombinante de cynomolgus. Además, también se pueden medir las potencias de neutralización de los mAbs contra el antígeno recombinante de cynomolgus de interés en el bioensayos de citocina (Ejemplo 1.1.2). Los mAbs con reactividad cruzada buena para cynomolgus (en una modalidad, dentro de 5 veces la reactividad para antígeno humano) se seleccionan para caracterización futura.
Ejemplo 1.2.4: Determinación de la secuencia de aminoácido de la región variable para cada anticuerpo monoclonal anti-humano de múrido El aislamiento de las moléculas de ADNc, la expresión y caracterización de los mAbs anti-humano, de ratón, recombinantes se conduce de la siguiente manera. Para cada determinación de secuencia de aminoácido, se aislan aproximadamente 1 x 106 células de hibridoma mediante centrifugación y se procesan para aislar el ARN total con Trizol (Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se somete a síntesis de la primera cadena de ADN utilizando el sistema de síntesis de primera cadena Superscript (Invitrogen, Carlsbad, CA) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se utiliza Oligo(dT) para cebar la síntesis de la primera cadena para seleccionar respecto al ARN poli(A)+. El producto de ADNc de la primera cadena se amplifica después mediante PCR con iniciadores diseñados para amplificación de regiones variables de inmunoglobulina de múrido (Conjuntos de iniciadores para Ig (Ig-Primer Sets), Novagen, Madison, Wl). Los productos de PCR se resuelven en un gel de agarosas, se cortan, se purifican, y después se subclonan con el estuche para clonación TOPO en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transforman en E. coli químicamente competente TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA). La PCR de colonia se efectúa en los transformantes para identificar clones que contengan el inserto. El ADN de plásmido se aisla a partir de los clones que contienen el inserto utilizando un estuche QIAprep Miniprep (Qiagen, Valencia, CA). Los insertos en los plásmidos se someten a determinación de secuencia en ambas cadenas para determinar las secuencias de AND de la cadena ligera variable o cadena pesada variable utilizando los iniciadores M 13 de ida (forward) y M13 de regreso (reverse) (Fermentas Life Sciences, Hanover D). Se identifican las secuencias de la cadena ligera variable y la cadena pesada variable de los mAbs. En una modalidad, los criterios de selección para un panel de mAbs líderes para el desarrollo del siguiente paso (humanización) incluyen los siguientes: • El anticuerpo no contiene ningún sitio de glucosilación N-ligado (NXS), excepto el normal en CH2 • El anticuerpo no contiene ninguna cisteína adicional además de la cisteína normales en cada anticuerpo • La secuencia del anticuerpo está alineada con las secuencias de línea germinal de humano más cercanas para VH y VL y cualesquiera aminoácidos inusuales se deben inspeccionar respecto a su ocurrencia en otros anticuerpos humanos naturales • La glutamina N-terminal (Q) se cambia a ácido glutámico (E) si esto no afecta la actividad del anticuerpo. Esto puede reducir la heterogeneidad debido a cicllización de Q • El corte de secuencia de señal eficiente se confirma mediante espectrofotometría de masas. Esto se puede hacer con material de célula COS o de célula 293 • La secuencia de la proteína se inspecciona respecto al riesgo dé desamidación de Asn que pudiera dar como resultado pérdida de actividad • El anticuerpo tiene un nivel bajo de agregación • El anticuerpo tiene solubilidad >5-10 mg/ml (en fase de investigación); >25 mg/ml · El anticuerpo tiene un tamaño normal (5-6 nm) mediante dispersión de luz dinámica (DLS) • El anticuerpo tiene una heterogeneidad de carga baja • El anticuerpo carece de liberación de citocina (véase Ejemplo 1.1.2.E) · El anticuerpo tiene especificidad para la citocina pretendida (véase Ejemplo 1.1.2.F) • El anticuerpo carece de reactividad cruzada tisular (véase Ejemplo 1.1.2. G) • El anticuerpo tiene similitud entre la reactividad cruzada tisular en humano y cynomolgus (véase Ejemplo 1.1.2. G) Ejemplo 1.3: Generación v caracterización de anticuerpos progenitores humanizados recombinantes Ejemplo 1.3.1: Construcción v expresión de anticuerpos progenitores anti-humano quiméricos recombinantes El ADN que codifica para la región constante de la cadena pesada de mAbs progenitores anti-humano de múrido se reemplaza por un fragmento de ADNc que codifica para la región constante de IgG 1 de humano que contiene 2 mutaciones de aminoácido en la región de gozne mediante recombinación homologa en bacterias. Estas mutaciones son un cambio de leucina a alanina en la posición 234 (numeración UE) y un cambio de leucina a alanina en la posición 235 (Lund et al, 1991, J. Immunol, 147:2657). La región constante de la cadena ligera de cada uno de estos anticuerpos se reemplaza con una región constante kappa de humano. Los anticuerpos quiméricos de longitud completa se expresan en forma transitoria en células COS mediante co-transfección de los ADNc de la cadena ligera y de la cadena pesada quiméricos ligados en el plásmido de expresión pBOS (Mizushima y Nagata, Nucleic Acids Research 1990, Vol 18, pg 5322). Los sobrenadantes celulares que contienen anticuerpo quimérico recombinante se purifican mediante cromatografía con Proteina A-Sefarosa y el anticuerpo unido se eluye mediante adición de solución amortiguadora ácida. Los anticuerpos se neutralizan y dializan en PBS.
El ADNc de la cadena pesada que codifica para un mAb quimérico se co-transfecta con ADNc de la cadena ligera quimérico (ambos ligados en el vector pBOS) en células COS. El sobrenadante celular que contiene el anticuerpo quimérico recombinante se purifica mediante cromatografía con Proteína A-Sefarosa y el anticuerpo unido se eluye mediante adición de solución amortiguadora ácida. Los anticuerpos se neutralizan y dializan en PBS.
Los mAbs progenitores Anti-humano quiméricos purificados se analizan después respecto a su capacidad para unirse (mediante BIAcore) y respecto a la actividad funcional, por ejemplo, para inhibir a la producción de IgE inducida por citocina como se describe en el ejemplo 1.1. Los mAbs quiméricos que mantienen la actividad de los mAbs de hibridoma progenitor se seleccionan para desarrollo futuro.
Ejemplo 1.3.2: Construcción v expresión de anticuerpos progenitores anti-humano humanizados Ejemplo 1.3.2.1: Selección de estructuras base de anticuerpo de humano Cada secuencia de gen de la cadena ligera variable y la cadena pesada variable de múrido se alinean por separado contra 44 secuencias de la cadena pesada variable de línea germinal o 46 secuencias de la cadena ligera variable de línea germinal de inmunoglobulina de humano (obtenidas a partir del sitio en red de Ig Blast del NCBI en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html.) utilizando el software Vector NTI.
La humanización se basa en homología de secuencia de aminoácido, análisis de agrupamiento de CDR, frecuencia de uso entre los anticuerpos humanos expresados, e información disponible sobre las estructuras cristalinas de los anticuerpos humanos. Tomando en consideración los posibles efectos sobre la unión del anticuerpo, apareamiento VH-VL, y otros factores, los residuos de múrido se mutan a residuos de humano en donde los residuos de la estructura base de múrido y de humano sean diferentes, con unas cuantas excepciones. Las estrategias de humanización adicionales se diseñan tomando como base un análisis de secuencias de anticuerpo de línea germinal de humano, o un subgrupo de las mismas, que posea un alto grado de homología, es decir, similitud de secuencia, con la secuencia de aminoácido real de las regiones variables del anticuerpo de múrido.
El modelado de homología se utiliza para identificar residuos únicos para las secuencias de anticuerpo de múrido que se predicen son críticos para la estructura del sitio de combinación del anticuerpo, las CDRs. El modelado de homología es un método por computadora en el cual se generan coordenadas tridimensionales aproximadas para una proteína. La fuente de las coordenadas iniciales y el lineamiento para su refinamiento adicional es una segunda proteína, la proteína de referencia, para la cual se conocen las coordenadas tridimensionales y cuya secuencia está relacionada con la secuencia de la primera proteína. La relación entre las secuencias de las dos proteínas se utiliza para generar una correspondencia entre la proteína de referencia y la proteína para la cual se desean las coordenadas, la proteína objetivo. Las secuencias primarias de las proteínas de referencia y objetivo se alinean con coordenadas de porciones idénticas de las dos proteínas transferidas directamente desde la proteína de referencia hacia la proteína objetivo. Las coordenadas para las porciones no coincidentes de las dos proteínas, por ejemplo, de mutaciones, inserciones, o deleciones de residuos, se construyen a partir de plantillas estructurales genéricas y se refinan en cuanto a energía para asegurar la consistencia con las coordenadas del modelo ya transferidas. Esta estructura de proteína por computadora se puede refinar adicionalmente o utilizar directamente en estudios de modelado. La calidad de la estructura del modelo queda determinada por la exactitud de la contención con que las proteínas de referencia y objetivo están relacionadas y por la precisión con la cual se construye la alineación de secuencia.
Para los mAbs de múrido, se utiliza una combinación de búsqueda BLAST e inspección visual para identificar estructuras de referencia apropiadas. La identidad de secuencia de 25% entre las secuencias de aminoácido de referencia y objetivo es considerada como el mínimo necesario para intentar un ejercicio de modelado por homología. Las alineaciones de secuencia se construyen manualmente y las coordenadas de modelo se generan con el programa Jackal (véase Petrey, D. et al. (2003) Proteins 53 (Supl. 6): 430-435).
Las secuencias primarias de las regiones de estructura base de múrido y de humano de los anticuerpos seleccionados comparten identidad significativa. Las posiciones de residuo que difieren son candidatos para inclusión del residuo de múrido en la secuencia humanizada con el fin de retener la potencia de unión observada del anticuerpo de múrido. Se construye manualmente una lista de residuos de estructura base que difieren entre las secuencias de humano y de múrido.
La probabilidad de que un residuo de estructura base dado pueda afectar las propiedades de unión del anticuerpo depende de su proximidad a los residuos de CDR. Por lo tanto, utilizando las estructuras de modelo, los residuos que difieren entre las secuencias de múrido y de humano se clasifican de conformidad con su distancia desde cualquier átomo en las CDRs. Aquellos residuos que caen dentro de 4.5 A de cualquier átomo de CDR se identifican como los más importantes y son recomendados como candidatos para retención del residuo de múrido en el anticuerpo humanizado (es decir, mutación de retroceso).
Los anticuerpos humanizados construidos in vitro se construyen utilizando oligonucleótidos. Para cada ADNc de región variable, se diseñan 6 oligonucleótidos de 60-80 nucleótidos cada uno para que se traslapen uno al otro por 20 nucleótidos en el extremo 5' y/o 3' de cada oligonucleótido. En una reacción de fijación, todos los 6 oligonucleótidos se combinan, ebullen, y fijan en presencia de dNTPs. Se agrega ADN polimerasa I, fragmento largo (Klenow) (New England Biolabs #M0210, Beverley, MA) para llenar los espacios de aproximadamente 40 pares de bases entre los oligonucleótidos que se traslapan. Se efectúa PCR para amplificar el gen de la región variable completo utilizando dos iniciadores más remotos que contienen secuencias colgantes complementarias al sitio de clonación múltiple en un vector pBOS modificado (Mizushima, S. y Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res. 18:17). Los productos de PCR obtenidos a partir de cada ensamble de ADNc se separan en un gel de agarosa y la banda correspondiente al tamaño de ADNc de la región variable pronosticada se corta y se purifica. La región pesada variable se inserta en marco en un fragmento de ADNc que codifica para la región constante de lgG1 de humano que contiene dos mutaciones de aminoácido en la región de gozne mediante recombinación homóloga en bacterias. Estas mutaciones son un cambio de leucina a alanina en la posición 234 (numeración UE) y un cambio de leucina a alanina en la posición 235 (Lund et al. (1991) J. Immunol. 147:2657). La región de la cadena ligera variable se inserta en cuadro con la región constante kappa de humano mediante recombinación homóloga. Las colonias bacterianas se aislan y se extrae el ADNc de plásmido. Los insertos de ADNc se someten a determinación de secuencia en su totalidad. Las cadenas pesada y ligera humanizadas correctas correspondientes a cada anticuerpo se co-transfectan en células COS para producir en forma transitoria anticuerpos anti-humano humanizados de longitud completa. Los sobrenadantes celulares que contienen el anticuerpo quimérico recombinante se purifican mediante cromatografía de proteína A-sefarosa y el anticuerpo unido se eluye mediante adición de solución amortiguadora ácida. Los anticuerpos se neutralizan y dializan en PBS.
Ejemplo 1.3.3: Caracterización de anticuerpos humanizados La capacidad de los anticuerpos humanizados purificados para inhibir una actividad funcional se determina, por ejemplo, utilizando los bioensayos para citocina como los descritos en los ejemplos 1.1.2. Las afinidades de unión de los anticuerpos humanizados para antígeno humano recombinante se determinan utilizando medición de resonancia de plasmón de superficie (BIAcore®) como se describe en el ejemplo 1.1.1.C. Se calisifican los valores de C o de los bioensayos y la afinidad de los anticuerpos humanizados. Los mAbs humanizados que mantienen completamente la actividad de los mAbs de hibridoma progenitor se seleccionan como candidatos para desarrollo futuro. Los mejores 2-3 mAbs humanizados más favorables se caracterizan adicionalmente.
Ejemplo 1.3.3.1: Análisis farmacocinéticos anticuerpos humanizados Se efectúan estudios farmacocinéticos en ratas Sprague- Dawley y monos cynomolgus. Las ratas y los monos cynomolgus de ambos géneros se dosifican por vía intravenosa o por vía subcutánea con una sola dosis de 4 mg/kg de mAb y las muestras se analizan utilizando ELISA para captura de antígeno, y los parámetros farmacocinéticos se determinan mediante análisis no compartimental. Brevemente, se revisten placas de ELISA con anticuerpo anti-biotina, de cabra, (5 mg/ml, 4°C, durante la noche), se bloquean con Superblock (Pierce), y se incuban con antígeno de humano modificado con biotina a 50 ng/ml en TTBS con 10% de Superblock a temperatura ambiente durante 2 horas. Las muestras de suero se diluyen en serie (0.5% de suero, 10% de Superblock en TTBS) y se incuban en la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. La detección se lleva a cabo con anticuerpo anti-humano, de cabra, marcado con HRP y las concentraciones se determinan con ayuda de curvas patrón utilizando el ajuste logístico de cuatro parámetros. Los valores para los parámetros farmacocinéticos se determinan mediante modelo no compartimental utilizando el software WinNonlin (Pharsight Corporation, Mountain View, CA). Se seleccionan los mAbs humanizados con buen perfil farmacocinético (T /2 es 8-13 días o mejor, con baja depuración y excelente biodisponibilidad 50-100%).
Ejemplo 1.3.3.2: Análisis fisicoquímico y de estabilidad in vitro de anticuerpos monoclonales humanizados Ejemplo 1.3.3.2. A: Cromatografía por exclusión de tamaños Los anticuerpos se diluyen hasta 2.5 mg/mL con agua y se analizan 20 ml_ en un sistema de H PLC Shimadzu utilizando u na columna G3000 SWXL de gel de TSK (Tosoh Bioscience, cat# k5539-05k) . Las muestras se eluyen de la columna con sulfato de sodio 21 1 mM , fosfato de sod io 92 mM , pH 7.0, a una velocidad de flujo de 0.3 mL/minutos. Las condiciones de operación del sistema de HPLC son las siguientes: Fase móvil: Na2S04 21 1 mM , Na2H P04-7H20 92 mM , pH 7.0 Gradiente: Isocrático Velocidad de flujo: 0.3 mL/minuto Longitud de onda del detector: 280 nm Temperatura del enfriador del auto-muestrador: 4°C Temperatura de horno de la columna : Ambiente Tiempo de corrida: 50 minutos Ejemplo 1 .3.3.2. B: SDS-PAGE Los anticuerpos se analizan mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAG E) bajo condiciones tanto reductoras como no red uctoras. Se utiliza Adalimumab lote AFP04C como un control. Para las condiciones reductoras, las muestras se mezclan 1 : 1 con 2X solución amortig uadora para muestra de tris glicina SDS-PAGE (I nvitrogen , cat# LC2676, lote# 1 323208) con DTT 1 00 mM , y se calientan a 60°C durante 30 minutos. Para las condiciones no reductoras, las muestras se mezclan 1:1 con solución amortiguadora para muestra y se calientan a 100°C durante 5 minutos. Las muestras reducidas (10 mg por carril) se cargan en un gel de tris-glicina al 12% pre-vaciado (Invitrogen, cat# EC6005box, lote# 611 1021), y las muestras no reducidas (10 mg por carril) se cargan en un gel de tris-glicina al 8%-16% pre-vaciado (Invitrogen, cat# EC6045box, lote# 61 11021). Se utilizan SeeBlue Plus 2 (Invitrogen, cat#LC5925, lote# 1351542) como un marcador de peso molecular. Los geles se corren en una caja de gel de minicelda XCell SureLock (Invitrogen, cat# EI0001) y las proteínas se separan aplicando primero un voltaje de 75 para apilar las muestras en el gel, seguido por un voltaje constante de 125 hasta que el frente del colorante alcance el fondo del gel. La solución amortiguadora para corrida utilizada es solución amortiguadora 1X tris glicina SDS, que se prepara a partir de una solución amortiguadora 10X tris glicina SDS (ABC, MPS-79-080106)). Los geles se tiñen durante la noche con tinción azul coloidal (Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016) y se destiñen con agua Milli-Q hasta que el fondo sea claro. Los geles teñidos se barren después utilizando un Escudriñador de Expresión Epson (modelo 1680, No. de serie DASX003641).
Ejemplo 1.3.3.2.C: Análisis de velocidad de segmentación Los anticuerpos se cargan en la cámara de muestra de cada una de tres piezas centrales epon de carbono de dos sectores estándar. Estas piezas centrales tienen una longitud de trayectoria óptica de 1.2 cm y están construidas con ventanas de zafiro. Se utiliza PBS para una solución amortiguadora de referencia y cada cámara contiene 140 µ?_. Todas las muestras se examinan simultáneamente utilizando un rotor de 4 agujeros (??-60??) en una ultracentrifuga analítica ProteomeLab XL-1 de Beckman (serie # PL106C01).
Se programan las condiciones de corrida y el control de la centrífuga se efectúa utilizando ProteomeLab (v5.6). Se deja que las muestras y el rotor se equilibren térmicamente durante una hora antes del análisis (20.0 ± 0.1°C). La confirmación de la carga de la celda apropiada se efectúa a 3000 rpm y se registra un solo barrido para cada celda. Las condiciones de velocidad de sedimentación son las siguientes: Volumen de la celda de muestra: 420 mL Volumen de la celda de referencia: 420 mL Temperatura: 20°C Velocidad del rotor: 35,000 rpm Tiempo: 8:00 horas Longitud de onda UV: 280 nm Tamaño del incremento radial: 0.003 cm Recolección de datos: UN punto de dato por incremento sin promediar la señal.
Número total de barridos: 100 Ejemplo 1.3.3.2.D: Medición del peso molecular de anticuerpos intactos con LC-MS Se analiza el peso molecular de los anticuerpos intactos mediante LC-MS. Cada anticuerpo se diluye hasta aproximadamente 1 mg/mL con agua. Se utiliza un sistema de HPLC 1100 (Agilent) con una micro-trampa para proteína (Michrom Bioresources, Inc, cat# 004/25109/03) para desalar e introducir 5 mg de la muestra en un espectrómetro de masas API Qstar pulsar I (Applied Biosystems). Se utiliza un gradiente corto para eluir las muestras. El gradiente se corre con la fase móvil A (0.08% de FA, 0.02% de TFA en agua grado HPLC) y la fase móvil B (0.08% de FA y 0.02% de TFA en acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 50 mL/minuto. El espectrómetro de masas se hace funcionar a un voltaje de aspersión de 4.5 kvoltios con un intervalo de barrido de relación masa a carga de 2000 a 3500.
Ejemplo 1.3.3.2.E: Medición del peso molecular de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo con LC-MS La medición del peso molecular de la cadena ligera (LC), cadena pesada (HC) HC desglucosilada del anticuerpo se analizan mediante LC-MS. El anticuerpo se diluye hasta 1 mg/mL con agua y la muestra se reduce a LC y HC con una concentración final de DTT 10 mM durante 30 minutos a 37°C. Para desglucosilar el anticuerpo, 100 mg del anticuerpo se incuban con 2 mL de PNGasa F, 5 mL de N-octilglucósido al 10% en un volumen total de 100 mL durante la noche a 37°C. después de la desglucosilación la muestra se reduce con una concentración final de DTT 10 mM durante 30 minutos a 37°C. Se utiliza un sistema de HPLC Agilent 1100 con una columna C4 (Vydac, cat# 214TP5115, No. de serie 060206537204069) para desalar e introducir la muestra (5 mg) en un espectrómetro de masas API Qstar pulsar i (Applied Biosystems). Se utiliza un gradiente corto para eluir la muestra. El gradiente se corre con la fase móvil A (0.08% de FA, 0.02% de TFA en agua grado HPLC) y la fase móvil B (0.08% de FA y 0.02% de TFA en acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 50 mL/minuto. El espectrómetro de masas se hace funcionar a un voltaje de aspersión de 4.5 kvoltios con un intervalo de barrido de relación masa a carga de 800 a 3500.
Ejemplo 1.3.3.2. F: Mapeo de péptido El anticuerpo se desnaturaliza durante 15 minutos a temperatura ambiente con una concentración final de clorhidrato de guanidina 6 M en bicarbonato de amonio 75 mM. Las muestras desnaturalizadas se reducen con una concentración final de DTT 10 mM a 37°C durante 60 minutos, seguido por alquilación con ácido yodoacético 50 mM (IAA) en la oscuridad a 37°C durante 30 minutos. Después de la alquilación, la muestra se dializa durante la noche contra cuatro litros de bicarbonato de amonio 10 mM a 4°C. La muestra dializada se diluye hasta 1 mg/mL con bicarbonato de amonio 10 mM, pH 7.8 y 100 mg de anticuerpo se digieren ya sea con tripsina (Promega, cat# V5111) o Lys-C (Roche, cat# 11 047825 001) a una relación 1:20 (p/p) de tripsina/Lys-C:anticuerpo a 37°C durante 4 horas. Las digestiones se detienen con 1 mL de HCI 1 N. Para el mapeo de péptido con detección de espectrómetro de masas, 40 mL los digeridos se separan mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa ( PHPLC) en una columna C18 (Vydac, cat# 218TP51, No. de serie NE9606 10.3.5) con un sistema de HPLC Agilent 1100. La separación de péptido se corre con un gradiente utilizando la fase móvil A (0.02% de TFA y 0.08% de FA en agua grado HPLC) y la fase móvil B (0.02% de TFA y 0.08% de FA en acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 50 mL/minutos. El espectrómetro de masas API QSTAR Pulsar i se hace funcionar en modo positivo a un voltaje de aspersión de 4.5 kvoltios y un intervalo de barrido de relación masa a carga de 800 a 2500.
Ejemplo 1.3.3.2. G: Mapeo del puente de disulfuro Para desnaturalizar el anticuerpo, se mezclan 100 mL del anticuerpo con 300 mL de clorhidrato de guanidina 8 M en bicarbonato de amonio 100 mM. El pH se inspecciona para asegurar que éste esté entre 7 y 8 y las muestras se desnaturalizan durante 15 minutos a temperatura ambiente en una concentración final de clorhidrato de guanidina 6 M. Una porción de la muestra desnaturalizada (100 mL) se diluye a 600 mL con agua Milli-Q para obtener una concentración final de clorhidrato de guanidina de 1 M. La muestra (220 mg) se digiere ya sea con tripsina (Promega, cat # V5 11, lote# 22265901) o Lys-C (Roche, cat# 11047825001, lote# 12808000) a relaciones de 1:50 de tripsina o 1:50 de Lys-C:anticuerpo (p/p) (4.4 mg de enzima: 220 mg de muestra) a 37°C durante aproximadamente 16 horas. Se agregan 5 mg adicionales de tripsina o Lys-C a las muestras y la digestión se deja continuar durante 2 horas adicionales a 37°C. Las digestiones se detienen agregando 1 mL de TFA a cada muestra. Las muestras digeridas se separan mediante RPHPLC utilizando una columna C18 (Vydac, cat# 218TP51 No. de serie NE020630-4-1 A) en un sistema de HPLC Agilent. La separación se corre con el mismo gradiente utilizado para el mapeo de péptido utilizando la fase móvil A (0.02% de TFA y 0.08% de FA en agua grado HPLC) y la fase móvil B (0.02% de TFA y 0.08% de FA en acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 50 mL/minuto. Las condiciones de operación de HPLC son las mismas que aquellas utilizadas para el mapeo de péptido. El espectrómetro de masas API QSTAR Pulsar i se hace funcionar en modo positivo a un voltaje de aspersión de 4.5 kvoltios y un intervalo de barrido de relación masa a carga de 800 a 2500. Los puentes de disulfuro se asignan comparando los pesos moleculares observados de los péptidos con los pesos moleculares pronosticados de los péptidos trípticos o Lys-C ligados mediante puentes de disulfuro.
Ejemplo 1.3.3.2.H: Determinación de sulfhidrilo El método utilizado para cuantificar las cisteínas libres en un anticuerpo se basa en la reacción del reactivo de Ellman, 5,50-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), con los grupos sulfhidrilo (SH) lo cual da origen a un producto cromofórico característico, 5-tio-(ácido 2-nitrobenzoico) (TNB). La reacción se ilustra en la fórmula: DTNB + RSH ® RS-TNB + TNB- + H + La absorbancia del TNB- se mide a 412 nm utilizando un espectrofotómetro Cary 50. Se gráfica una curva de absorbancia utilizando diluciones de 2 mercaptoetanol (b-ME) como el patrón de referencia de SH libre y las concentraciones de los grupos sulfhidrilo libres en la proteína se determinan a partir de la absorbancia a 412 nm de la muestra| La solución de reserva del patrón de referencia b-ME se prepara mediante una dilución en serie de b-ME 14.2 M con agua grado HPLC hasta una concentración final de 0.142 mM. Después se preparan patrones de referencia por > triplicado para cada concentración. El anticuerpo se concentra hasta 10 mg/mL utilizando un filtro de centrífuga amicon ultra 10,000 MWCO (Millipore, cat# UFC801096, lote# L3KN5251) y la solución amortiguadora se cambia a la solución amortiguadora de formulación utilizada para adalimumab (fosfato de sodio monobásico 5.57 mM, fosfato de sodio dibásico 8.69 mM, NaCI 106.69 mM, citrato de sodio 1.07 mM, ácido cítrico 6.45 mM, manitol 66.68 mM, pH 5.2, 0.1% (p/v) de Tween). Las muestras se mezclan en una agitadora a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después se agregan 180 nuL de solución amortiguadora Tris 100 mM, pH 8.1 a cada muestra y patrón de referencia seguido por la adición de 300 mL de DTNB 2 mM en solución amortiguadora de fosfato 10 mM, pH 8.1. Después de mezclado minucioso, las muestras y los patrones de referencia se miden respecto a absorción a 412 nm en un espectrofotómetro Cary 50. La curva patrón se obtiene graficando la cantidad de SH libre y la D0412 nm de los patrones de referencia de b-ME. El contenido de SH libre de las muestras se calcula tomando como base esta curva después de restar el testigo.
Ejemplo 1.3.3.2.1: Cromatografía de intercambio catiónico débil El anticuerpo se diluye hasta 1 mg/mL con fosfato de sodio 10 mM, pH 6.0. La heterogeneidad de carga se analiza utilizando un sistema de HPLC Shimadzu con una columna analítica WCX-10 ProPac (Dionex, cat# 054993, No. de serie 02722). Las muestras se cargan en la columna en 80% de la fase móvil A (fosfato de sodio 10 mM, pH 6.0) y 20% de la fase móvil B (fosfato de sodio 10 mM, NaCI 500 mM, pH 6.0) y se eluyen a una velocidad de flujo de 1.0 mL/minuto.
Ejemplo 1.3.3.2.J: Determinación del perfil de oliqosacárido Los oligosacáridos liberados después del tratamiento del anticuerpo con PNGasa F se convierten en derivados con el reactivo para marcación 2-aminobenzamida (2-AB). Los oligosacárido los con marca fluorescente se separan mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de fase normal (NPHPLC) y las diferentes formas de los oligosacáridos se caracterizan tomando como base la comparación del tiempo de retención con patrones de referencia conocidos.
El anticuerpo se digiere primero con PNGasaF para cortar los oligosacáridos N-ligados de la porción Fe de la cadena pesada. El anticuerpo (200 mg) se coloca en un tubo de Eppendorf de 500 mL junto con 2 mi de PNGasa F y 3 mL de N-octilglucósido al 10%.
Se agrega solución salina amortiguada con fosfato para llevar el volumen final a 60 mL. La muestras se incuba durante la noche a 37°C en un aparato termomixer de Eppendorf ajustado a 700 RPM. Adalimumab lote AFP04C también se digiere con PNGasa F como un control.
Después del tratamiento con PNGasa F, las muestras se incuban a 95°C durante 5 minutos en un termomixer Eppendorf ajustado a 750 RPM para precipitar las proteínas, después las muestras se colocan en una centrífuga Eppendorf durante 2 minutos a 10,000 RPM para centrifugar las proteínas precipitadas. El sobrenadante que contienen los oligosacáridos se transfiere a un tubo Eppendorf de 500 mL y se seca en un aparato speed-vac a 65°C.
Los oligosacáridos se marcan con 2AB utilizando un estuche para marcación con 2AB adquirido de Prozyme (cat# GKK-404, lote# 132026). El reactivo para marcación se prepara de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se agrega ácido acético (150 mL, suministrado en el estuche) al frasco de DMSO (suministrado en el estuche) y se mezcla pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo varias veces. La mezcla de ácido acético/DMSO (100 mL) se transfiere a un frasco del colorante 2-AB (justo antes que utiliza) y se mezcla antes que el colorante se disuelva completamente. La solución del colorante se agrega después a un frasco de agente reductor (provisto en el estuche) y se mezcla bien (reactivo para marcación). El reactivo para marcación (5 mL) se agrega a cada frasco de muestra de oligosacárido seco, y se mezcla minuciosamente. Los frascos de reacción se colocan en un termomixer Eppendorf ajustado a 65°C y 700-800 RPM durante 2 horas de reacción.
Después de la reacción de marcado, se retira el exceso de colorante fluorescente utilizando cartuchos GlycoClean S de Prozyme (cat# GKI-4726). Antes de agregar las muestras, los cartuchos se lavan con 1 mL de agua milli-Q seguido con 5 ishes de 1 mL de solución de ácido acético al 30%. Justo antes de agregar las muestras, se agrega 1 mL de acetonitrilo (Burdick y Jackson, cat# AH015-4) a los cartuchos.
Después que todo el acetonitrilo pasa a través del cartucho, la mancha se aplica de manera puntiforme en el centro de un disco recién lavado y se permite que se adsorba en el disco durante 10 minutos. El disco se lava con 1 mL de acetonitrilo seguido por cinco ishes de 1 mL de acetonitrilo al 96%. Los cartuchos se coloca en sobre un tubo de Eppendorf de 1.5 mL y los oligosacáridos marcados con 2-AB se eluyen con 3 ishes (400 mL cada ish) de agua milli Q.
Los oligosacáridos se separan utilizando una columna Glycosep N HPLC (cat# GKI-4728) conectada a un sistema de HPLC Shimadzu. El sistema de HPLC Shimadzu consiste de un controlador del sistema, desgasificador, bombas binarias, auto-muestreador con un enfriador de muestra, y un detector fluorescente.
Ejemplo 1.3.3.2. K: Estabilidad a temperaturas elevadas La solución amortiguadora de anticuerpo puede ser fosfato de sodio monobásico 5.57 mM, fosfato de sodio dibásico 8.69 mM, NaCI 106.69 mM, citrato de sodio 1.07 mM, ácido cítrico 6.45 mM, manitol 66.68 mM, 0.1% (p/v) de Tween, pH 5.2; o histidina 10 mM, metionina 10 mM, 4% de manitol, pH 5.9 utilizando filtros de ultracentrífuga Amicon. La concentración final de los anticuerpos se ajusta a 2 mg/mL con las soluciones amortiguadoras apropiadas. Las soluciones de anticuerpo después se esterilizan por filtración y se preparan alícuotas de 0.25 mL bajo condiciones estériles. Las alícuotas se dejan ya sea a -80°C, 5°C, 25°C, o 40°C durante 1, 2 o 3 semanas. Al final del periodo de incubación, las muestras se analizan mediante cromatografía por exclusión de tamaño y SDS-PAGE.
Las muestras para estabilidad se analizan mediante SDS- PAGE bajo condiciones tanto reductoras como no reductoras. El procedimiento utilizado es el mismo que el descrito en la presente solicitud. Los geles se tiñen durante la noche con tinción azul coloidal (Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016) y se destinen con agua Milli-Q hasta que el fondo sea claro. Los geles teñidos después se barren utilizando un Escudriñador de Expresión Epson (modelo 1680, No. de serie DASX003641). Para obtener más sensibilidad, los mismos geles se tiñen con plata utilizando el estuche para tinción con plata (Owl Scientific) y se utilizan los procedimientos recomendados dados por el fabricante.
Ejemplo 1.3.3.2.L: Calorimetría de barrido diferencial (DSC) Una proteína en solución acuosa está en equilibrio entre la conformación original (plegada) y su conformación desnaturalizada (desdoblada). La estabilidad del estado original está basada en la magnitud de la energía libre de Gibbs (DG) del sistema y la relación termodinámica entre los cambios de entalpia (DH) y entropía (DS). Una DG positiva indica que el estado original es más estable que el estado desnaturalizado - mientras más positiva sea la DG, mayor será la estabilidad. Para que una proteína se desdoble, se necesitan romper las fuerzas de estabilización. La entropía de conformación supera las fuerzas de estabilización jo que permite que la proteína se desdoble a temperaturas en las cuales la entropía se vuelve dominante. La calorimetría de barrido diferencial (DSC) mide la DH del desdoblamiento de la proteína debido a la desnaturalización por calor. Como una regla general, mientras más alto sea el punto medio de transición (la Tm), más estable será la proteína a temperaturas más bajas. Durante el mismo experimento la DSC también mide el cambio en capacidad térmica (DCp) para la desnaturalización de la proteína. Los cambios en la capacidad térmica asociados con el desdoblamiento de la proteína se deben principalmente a cambios en la hidratación de las cadenas laterales que estaban enterradas en el estado original, pero que quedan expuestas al solvente en el estado desnaturalizado. La DSC es un pronosticador de la estabilidad de la formulación líquida para proteínas y otras macromoléculas biológicas (Remmele, R.L. et al. (2000) BioPharm 13: 36-46; Remmele, R.L. et al. (1998) Pharm. Res. 15:200-208).
Una aplicación diferente de la DSC es la caracterización del estructura de la proteína, como queda demostrado para una variedad de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, Adalimumab (Humira), trastuzumab (Herceptin), bevacizumab (Avastin) y otros anticuerpos (lonescu, R. et al. (2008) J. Pharmaceut. Sci. 97(4): 1414-1426). Un anticuerpo de IgG típicamente muestra tres transiciones de desdoblamiento (Tm): el desdoblamiento del anticuerpo intacto está asociado con la fusión del dominio CH2 en el fragmento Fe, fusión del dominio CH3 en el fragmento Fe, y fusión del fragmento Fab (lonescu, R. et al. (2008) J. Pharmaceut. Sci. 97(4): 1414-1426) (Figuras 5 y 7).
Antes del análisis de DSC, las proteínas se dializan en un sistema amortiguador apropiado utilizando los cassettes Slide-A-Lyzer. Este sistema amortiguador (fosfato 10 mM, citrato 10 mM) también se utiliza como una referencia/testigo para la medición de DSC. Tanto los anticuerpos progenitores como la molécula de DVD-lg se analizan a 2 mg/mL. Se utiliza un instrumento de DSC automatizado VP-DSC con celda capilar (Microcal) . El desdoblamiento de las moléculas se estudia aplicando una velocidad de barrido de 1 °C/minuto a través de un intervalo de temperaturas de 25°C - 95°C. Otros parámetros de la medición son : periodo de ajuste: 16 segundos, espera para el barrido previo: 10 minutos, modo de retroalimentación : ninguno.
Ejemplo 1 .4: Generación de una DVD-lg Se construyan moléculas de DVD-lg que se pueden unir a dos antígenos utilizando dos anticuerpos monoclonales progenitores, uno contra el antígeno A de humano, y el otro contra el antígeno B de humano, seleccionados como se describe en la presente solicitud .
A Ejemplo 1 .4.1 : Generación de una DVD-lg que tiene dos longitudes de enlazador Se utiliza una región constante que contiene ?1 Fe con mutaciones en 234, y 235 para eliminar las funciones efectoras de ADCC/CDC . Se generan cuatro construcciones diferentes de DVD-lg anti-A/B DVD-lg : 2 con enlazador corto y 2 con enlazador largo, cada una en dos orientaciones de dominio diferentes: VA-VB-C y VB-VA-C (véase Tabla 3). Las secuencias de enlazador, obtenidas a partir de la secuencia N-terminal del dominio C 1 /Ck o CH 1 de humano, son las siguientes: Para construcciones DVDAB: cadena ligera (si anti-A tiene ?): Enlazador corto: QPKAAP (SEQ ID NO: 15); enlazador largo: QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16) cadena ligera (si anti-A has ?): Enlazador corto: TVAAP (SEQ ID NO: 13); Enlazador largo: TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14) cadena pesada (?1): Enlazador corto: ASTKGP (SEQ ID NO: 21); Enlazador largo: ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22) Para construcciones DVDBA: cadena ligera (si anti-B tiene ?): Enlazador corto: QPKAAP (SEQ ID NO: 15); Enlazador largo: QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16) cadena ligera (si anti-B tiene ): Enlazador corto: TVAAP (SEQ ID NO: 13); Enlazador largo: TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14) cadena pesada (?1 ): Enlazador corto: ASTKGP (SEQ ID NO : 21 ); Enlazador largo: ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22).
Las construcciones de la cadena pesada y la cadena ligera se subclonan en el vector de expresión pBOS, y se expresan en células COS, seguido por purificación mediante cromatografía con Proteína A. Los materiales purificados se someten a análisis de SDS-PAGE y SEC.
La siguiente Tabla 3 describe las construcciones de la cadena pesada y cadena ligera utilizadas para expresar cada proteína de DV-lg anti-A/B.
TABLA 3 Construcciones para expresar proteínas de DVD-lg anti-A/B Ejemplo 1.4.2: Clonación molecular de construcciones de ADN para DVDABSL y DVDABLL Para generar las construcciones DVDABHC-LL y DVDABHC-SL de la cadena pesada, se amplifica un dominio VH del anticuerpo A mediante PCR utilizando iniciadores específicos (los iniciadores 3' contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente); mientras tanto el dominio VH del anticuerpo B se amplifica utilizando iniciadores específicos (iniciadores 5' que contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente). Ambas reacciones de PCR se efectúan de conformidad con técnicas y procedimientos estándar para PCR. Los dos productos de PCR se purifican en gel, y se utilizan juntos como la plantilla de traslape para la reacción de PCR de traslape subsiguiente. Los productos de PCR de traslape se subclonan en el vector de expresión mamífero pBOS-hCyl ,z, non-a doblemente digerido con Srf I y Sal I (Abbott) utilizando estrategia de recombinación homologa estándar.
Para generar las construcciones DVDABLC-LL y DVDABLC-SL de la cadena ligera, se amplifica un dominio VL del anticuerpo A mediante PCR utilizando iniciadores específicos (los iniciadores 3' contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente); mientras tanto el dominio VL del anticuerpo B se amplifica utilizando iniciadores específicos (iniciadores 5' que contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente). Ambas reacciones de PCR se efectúan de conformidad con técnicas y procedimientos estándar para PCR. Los dos productos de PCR se purifican en gel, y se utilizan juntos como la plantilla de traslape para la reacción de PCR de traslape subsiguiente utilizando condiciones estándar de PCR. Los productos de PCR de traslape se subclonan en el vector de expresión mamífero pBOS-hCk doblemente digerido con Srf I y Not I (Abbott) utilizando estrategia de recombinación homologa estándar. Se utiliza una estrategia similar para generar DVDBASL y DVDBALL como se describe más adelante.
Ejemplo 1.4.3: Clonación molecular de construcciones de ADN para DVDBASL v DVDBALL Para generar las construcciones DVDBAHC-LL y DVDBAHC-SL de la cadena pesada, se amplifica el dominio VH del anticuerpo B mediante PCR utilizando iniciadores específicos (los iniciadores 3' contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente); mientras tanto el dominio VH del anticuerpo A se amplifica utilizando iniciadores específicos (los iniciadores 5' contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente). Ambas reacciones de PCR se efectúan de conformidad con técnicas y procedimientos estándar para PCR. Los dos productos de PCR se purifican en gel, y se utilizan juntos como la plantilla de traslape para la reacción de PCR de traslape subsiguiente utilizando condiciones estándar de PCR. Los productos de PCR de traslape se subclonan en el vector de expresión mamífero pBOS-hCyl ,z, non-a doblemente digerido con Srf I y Sal I (Abbott) utilizando estrategia de recombinación homologa estándar.
Para generar las construcciones DVDBALC-LL y DVDBALC-SL de la cadena ligera, se amplifica un dominio VL del anticuerpo B mediante PCR utilizando iniciadores específicos (los iniciadores 3' contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente); mientras tanto el dominio VL del anticuerpo A se amplifica utilizando iniciadores específicos (iniciadores 5' que contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente). Ambas reacciones de PCR se efectúan de conformidad con técnicas y procedimientos estándar para PCR. Los dos productos de PCR se purifican en gel, y se utilizan juntos como la plantilla de traslape para la reacción de PCR de traslape subsiguiente utilizando condiciones estándar de PCR. Los productos de PCR de traslape se subclonan en el vector de expresión mamífero pBOS-hCk doblemente digerido con Srf I y Not I (Abbott) utilizando estrategia de recombinación homóloga estándar.
Ejemplo 1.4.4: Preparación de construcciones de vector de DVD-lq Las secuencias de aminoácido de anticuerpo progenitor para anticuerpos específicos, los cuales reconocen antígenos específicos o epítopes de los mismos, para incorporación en una DVD-lg DVD-lg se pueden obtener mediante preparación de hibridomas como se describió anteriormente o se pueden obtener mediante determinación de secuencia de proteínas o ácidos nucleicos de anticuerpo conocidos. Además, se pueden obtener secuencias conocidas a partir de la literatura. Las secuencias se pueden utilizar para sintetizar ácidos nucleicos utilizando tecnologías estándar de síntesis o amplificación de ADN y ensamblando los fragmentos de anticuerpo deseados en vectores de expresión, utilizando tecnología de ADN recombinante estándar, para expresión en células.
Por ejemplo, los codones de ácido nucleico fueron determinados a partir de secuencias de aminoácidos y el ADN de oligonucleótido fue sintetizado por Blue Heron Biotechnology, Inc. (www.blueheronbio.com) Bothell, WA E.U.A. Los oligonucleótidos se ensamblan en fragmentos de ADN de doble cadena de 300-2,000 pares de bases, se clonan en un vector de plásmido y se confirma la secuencia. Los fragmentos clonados se ensamblan utilizando un proceso enzimático para producir el gen completo y se subclonan en un vector de expresión. (Véase 7,306,914; 7,297,541; 7,279,159; 7,150,969; 20080115243; 20080102475; 20080081379; 20080075690; 20080063780; 20080050506; 20080038777; 20080022422; 20070289033; 20070287170; 20070254338; 20070243194; 20070225227; 20070207171; 20070150976; 20070135620; 20070128190; 20070104722; 20070092484; 20070037196; 20070028321; 20060172404; 20060162026; 20060153791; 20030215458; 20030157643).
Se utiliza un grupo de vectores pHybE (Solicitud de Patente E.U.A. No. de Serie 61/021,282) para clonación de anticuerpo progenitor y DVD-lg. Se utiliza V1, obtenido a partir de pJP183; pHybE-hCgl.z, non-a V2, para clonación de las cadenas pesadas del anticuerpo y DVD con una región constante de tipo silvestre. Se utiliza V2, obtenido a partir de pJP191 ; pHybE-hCk V2, para clonación de las cadenas ligeras del anticuerpo y DVD con una región constante kappa. Se utiliza V3, obtenido a partir de pJP192; pHybE-hCI V2, para clonación de las cadenas ligeras del anticuerpo y los DVDs con una región constante lambda. Se utiliza V4, construido con un péptido de señal lambda y una región constante kappa, para clonación de las cadenas ligeras del DVD con un dominio V híbrido lambda-kappa. Se utiliza V5, construido con un péptido de señal kappa y una región constante lambda, para clonación de las cadenas ligeras de DVD con un dominio V híbrido kappa-lambda. Se utiliza V7, obtenido a partir de pJP183; pHybE-hCgl ,z, non-a V2, para clonación de las cadenas pesadas del anticuerpo y DVD con una región constante mutante (234,235 AA).
Con referencia a la Tabla 4, se utilizan un número de vectores en la clonación de las cadenas VH y VL de los anticuerpos progenitores y DVD-lg .
TABLA 4 Vectores utilizados para clonar anticuerpos progenitores v DVD- Igs Ejemplo 1 .4.4.2 : Transfección v expresión en células 293 Las construcciones de vector de DVD-lg se transfectado en células 293 para producción de la proteína de DVD-lg . El procedimiento de transfección transitorio 293 utilizado es u na modificación de los métodos publicados en Du rocher et al. (2002) N ucleic Acids Res. 30(2) : E9 y Pham et al. (2005) Biotech . Bioengineering 90(3):332-44. Los reactivos que se utilizan en la transfección incluyen: • células HEK 293-6E (l ínea de célula de riñón embrionario de humano que expresa establemente a EBNA1 ; obtenidas a partir del Consejo Nacional de Investigación de Canadá (National Research Council Canadá)) cultivadas en matraces Erlenmeyer desechabies en una incubadora humidificada ajustada a 130 rpm , 37°C y 5% de CQ2.
• Medio de cultivo: Medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen 12338-018) más 25 pg/mL de Geneticina (G418) (Invitrogen 10131-027) y 0.1% de Pluronic F-68 (Invitrogen 24040-032).
• Medio de transfección: Medio de expresión FreeStyle 293 más HEPES 10 mM (Invitrogen 15630-080).
• Solución de reserva de polietilenimina (PEI): 1 mg/mL de solución de reserva estéril, pH 7.0, preparada con PEI lineal de 25 kDa (Polysciences) y almacenada a menos de -15°C.
• Medio de alimentación con triptona: Solución de reserva estéril al 5% p/v de Triptona N1 (Organotechnie, 19554) en Medio de expresión FreeStyle 293.
Preparación de las células para transfección Aproximadamente 2-4 horas antes de la transfección, se recolectan células HEK293-6E mediante centrifugación y se vuelven a suspender en medio de cultivo a una densidad celular de aproximadamente 1 millón de células viables por mL. Para cada transfección, se transfieren 40 mL de la suspensión celular a un matraz Erlenmeyer desechable de 250 mL y se incuba durante 2-4 horas.
Transfección El medio de transfección y la solución de reserva de PEI se pre-calientan hasta temperatura ambiente (TA). Para cada transfección, se combinan 25 g del ADN de plásmido y 50pg de polietilenimina (PEI) en 5 mL de medio de transfección y se incuban durante 15-20 minutos a TA para permitir que se forman los complejos de ADN.PEI. Para las transfecciones de BR3-lg, se utilizan 25 del plásmido BR3-lg por transfección. Cada 5 mL de la mezcla de complejo ADN:PEI se agregan a un cultivo de 40 mL previamente preparado y se regresan a la incubadora humidificada ajustada a 130 rpm, 37°C y 5% de C02. Después de 20-28 horas, se agregan 5 mL de medio de alimentación con triptona a cada transfección y los cultivos se continúan durante seis días.
Ejemplo 1.4.5: Caracterización y selección de líder de las DVD-las A/B Las afinidades de unión de las DVD-lgs anti-A/B se analizan en BIAcore tanto contra la proteína A como contra la proteína B. La propiedad tetravalente de la DVD-lg se examina mediante estudios de unión múltiples en BIAcore. Por otra parte, la potencia de neutralización de las DVD-lgs para la proteína A y la proteína B se valoran mediante bioensayos, respectivamente, como se describe en la presente solicitud. Se seleccionan las moléculas de DVD-lg que retienen mejor la afinidad y potencia de los mAbs progenitores originales para caracterizaciones fisicoquímicas y bio-analíticas (PK en ratas) más profundas como se describe en la presente solicitud para cada mAb. Tomando como base la colección de análisis, la DVD-lg líder final se hace avanzar al desarrollo en línea de célula estable CHO, y el material derivado de CHO se utiliza en estudios de estabilidad, farmacocinética y eficacia en mono cynomolgus, y en actividades de pre-formulación.
EJEMPLO 2 Construcción, expresión, v purificación de inmunoglobulinas de dominio variable dual (DVD-lgs) anti-TNFa/anti-PGE2 de múrido Se genera una DVD-lg que se puede unir TNFa y PGE2 de múrido. Brevemente, los mAbs progenitores incluyen dos anticuerpos de múrido de alta afinidad, anti-TNFa (clon 8C11) y anti-PGE2 (clon 2B5-8.0), respectivamente. Los genes de VL/VH del hibridoma del clon 8C11 del anticuerpo monoclonal anti-TNFa se aislan mediante RT-PCR utilizando el Estuche de Iniciador de Ig de ratón (Novagen, Madison, Wl). Las secuencias de proteína para VL/VH de 2B5-8.0 se obtienen como se describe en el ejemplo 1.2.4 y se convierten en secuencias de ADN. Se utilizan diferentes enlazadores entre los dos dominios variables tanto en la cadena ligera (por ejemplo, ADAAP) como en la cadena pesada (por ejemplo, AKTTPP). Estas secuencias enlazadoras, seleccionadas a partir de los extremos N-terminales de Ck y CH1 de múrido, son una extensión natural de los dominios variables y exhiben una conformación flexible sin estructuras secundarias significativas tomando como base el análisis de varias estructuras de cristal de Fab. El procedimiento detallado de la Ejemplo 1.4.5: Caracterización y selección de líder de las DVD-las A/B Las afinidades de unión de las DVD-lgs anti-A/B se analizan en BIAcore tanto contra la proteína A como contra la proteína B. La propiedad tetravalente de la DVD-lg se examina mediante estudios de unión múltiples en BIAcore. Por otra parte, la potencia de neutralización de las DVD-lgs para la proteína A y la proteína B se valoran mediante bioensayos, respectivamente, como se describe en la presente solicitud. Se seleccionan las moléculas de DVD-lg que retienen mejor la afinidad y potencia de los mAbs progenitores originales para caracterizaciones fisicoquímicas y bio-analíticas (PK en ratas) más profundas como se describe en la presente solicitud para cada mAb. Tomando como base la colección de análisis, la DVD-lg líder final se hace avanzar al desarrollo en línea de célula estable CHO, y el material derivado de CHO sé utiliza en estudios de estabilidad, farmacocinética y eficacia en mono cynomolgus, y en actividades de pre-formulación.
EJEMPLO 2 Construcción, expresión, v purificación de inmunoqlobulinas de dominio variable dual (DVD-lgs) anti-TNFa/anti-PGE¾ de múrido Se genera una DVD-lg que se puede unir TNFa y PGE2 de múrido. Brevemente, los mAbs progenitores incluyen dos anticuerpos de múrido de alta afinidad, anti-TNFa (clon 8C11) y anti-PGE2 (clon 2B5-8.0), respectivamente. Los genes de VL/VH del hibridoma del clon 8C11 del anticuerpo monoclonal anti-TNFa se aislan mediante RT-PCR utilizando el Estuche de Iniciador de Ig de ratón (Novagen, Madison, Wl). Las secuencias de proteína para VL/VH de 2B5^8.0 se obtienen como se describe en el ejemplo 1.2.4 y se convierten en secuencias de ADN. Se utilizan diferentes enlazadores entre los dos dominios variables tanto en la cadena ligera (por ejemplo, ADAAP) como en la cadena pesada (por ejemplo, AKTTPP). Estas secuencias enlazadoras, seleccionadas a partir de los extremos N-terminales de Ck y CH1 de múrido, son una extensión natural de los dominios variables y exhiben una conformación flexible sin estructuras secundarias significativas tomando como base el análisis de varias estructuras de cristal de Fab. El procedimiento detallado de la clonación con PCR se describe a continuación: EJEMPLO 2.2.1 Clonación molecular de DVD-lq de múrido anti-TNFa/anti-PGE; de múrido con enlazadores de múrido Los métodos para elaborar moléculas de DVD-lg se describen en la solicitud de patente E.U.A. No. 20070071675. La secuencia de aminoácido de las regiones de VH y VL para varios anticuerpos recombinantes específicos para PGE2 se muestra en la Tabla 5. Utilizando PCR de traslape, se generan seis moléculas de DVD-lg de múrido anti-TNFa/anti-PGE2 de múrido ya sea sin enlazador de múrido (mNL), con enlazador corto de múrido (mSL), o con enlazador largo de múrido (mLL) y las secuencias de proteína de la VH y la VL se listan en la siguiente Tabla 6. El ADN que codifica para la VH de las moléculas de DVD-lg se fusiona con la región constante de lgG1 de la cadena pesada de ratón, y el ADN que codifica para la VL de las moléculas de DVD-lg se fusiona con la región constante k de la cadena ligera de ratón, respectivamente. La expresión y purificación de proteína de las moléculas de DVD-lg son esencialmente las mismas que las descritas en el Ejemplo 1.3 y en la publicación de patente E.U.A. No.20070071675.
TABLA 5 Anticuerpos recombinantes específicos para prostaglandina E2 SEQ Región de la ID Secuencia proteína No. 123456789012345678901234567890 QVQLQQSGPELVRPGSSVKISCKASGYTFT KYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGYDYTHY 80 VH 2B5-7.0 NEKFKDKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSED SAVYFCARSDGSSTY GQGTLVTVSA DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCTSSQNIV HSNGNTYLEWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRF 81 VL 2B5-7.0 SGVPDRFSGSGSGTVFTLKISRVEAEDLGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKR QVQLQQSGPELVRPGSSVKISCKASGYTFT KYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGYDYTHY 82 VH 2B5-8.0 NEKFKDKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSED SAIYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSA DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCTSSQNIV HSNGNTYLEWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRF 83 VL 2B5-8.0 SGVPDRFSGSGSGTVFTLKISRVEAEDLGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKR QVQLQQSGPELVRPGSSVKISCKASGYTFT KYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPYGDYTHY 84 VH 2B5-9.0 NEKFKDKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSED 1 SAVYFCARSDGSSTYWGQGTLVTVSA DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCTSSQNIV HSNGNTYLEWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRF 85 VL 2B5-9.0 SGVPDRFSGSGSGTVFTLKISRVEAEDLGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKR La figura 2 muestra la unión de los anticuerpos en la Tabla 5 a PGE2-biotina en una ELISA de unión directa. La figura 3 muestra la inhibición de la respuesta celular a PGE2 en una prueba de unión a EP4.
TABLA 6 Lista de secuencias de aminoácido de las regiones de VH v VL de DVD-lg anti-TNFa/anti-PGE? de múrido con enlazadores de múrido SEQ Región de la ID Secuencia pro eína NO. 123456789012345678901234567890 86 VH 8Cll-mNL-2B5 EFQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYSFT DYNMNWVKQSNGKSLEWVGVINPNYGSSTY NQKFKGKATLTVDQSSSTAYMQLNSLTSED SAVYYCARKWGQLGRGFFDVWGTGTTVTVS SQVQLQQSGPELVRPGSSVKISCKASGYTF TKYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGYDYTH YNEKFKDKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSE DSAIYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSA 87 VH 8C11 Residuos 1- EFQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYSFT DYNMNWV QSNGKSLEWVGVINPNYGSSTY 121 de SEQ ID NQKFKGKATLTVDQSSSTAYMQLNSLTSED SAVYYCARKWGQLGRGFFDVWGTGTTVTVS NO. :86 S MNL PARA HC No 88 VH 2B5 Residuos QVQLQQSGPELVRPGSSVKISCKASGYTFT KY LG VKQRPGHGLEWIGDIYPGYDYTHY 122-237 de NEKFKDKATLTVDTSSSTAYMQLNSLTSED SAIYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSA SEQ ID NO. : 86 123456789012345678901234567890 89 VL 8Cll-mNL-2B5 QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVS YMHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQW SSSPLTFGAGTKLELKRDVLMTQTPLSLPV SLGDQASISCTSSQNIVHSNGNTYLE YLQ RPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSG TVFTL ISRVEAEDLGVYYCFQVSHVPYTF GGGTKLEIKR 90 VL 8C11 Residuos 1- QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVS YMHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPAR 107 de SEQ ID FSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQW SSSPLTFGAGTKLELKR NO . : 89 MNL PARA LC 91 VL 2B5 Residuos 108- DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCTSSQNIV HSNGNTYLEWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRF 220 de SEQ ID SGVPDRFSGSGSGTVFTLKISRVEAEDLGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKR NO . : 89 123456789012345678901234567890 92 VH 8Cll-mSL-2B5 EFQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYSFT DYNMNWVKQSNGKSLEWVGVINPNYGSSTY NQKFKGKATLTVDQSSSTAYMQLNSLTSED SAVYYCARKWGQLGRGFFDVWGTGTTVTVS SAKTTAPQVQLQQSGPELVRPGSSVKISCK ASGYTFTKYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYP GYDYTHYNEKFKDKATLTVDTSSSTAYMQL EJEMPLO 2.2.2 Clonación molecular de DVD-lg de múrido anti-TNFa/anti-PGE2 de múrido con enlazadores humanos Los métodos para elaborar moléculas de DVD-lg se describen en la publicación de patente E.U.A. No. 20070071675. Utilizando PCR de traslape, se generan seis moléculas de DVD-lg de múrido anti-TNFa/anti-PGE2 de múrido ya sea sin enlazador humano (hNL), con enlazador humano corto (hSL), o con enlazador humano largo (hLL) y sus secuencias de proteína de la VH y la VL se listan en la siguiente Tabla 7. El ADN que codifica para la VH de las moléculas de DVD-lg se fusiona con la región constante de lgG1 de la cadena pesada de humano y el ADN que codifica para la VL de las moléculas de DVD-lg se fusiona con la región constante k de la cadena ligera de humano, respectivamente. La expresión y purificación de proteína de las moléculas de DVD-lg son esencialmente las mismas que las descritas en el Ejemplo 1.3 y en la publicación de patente E.U.A. No. No. 20070071675.
TABLA 7 Lista de secuencias de aminoácido de las regiones de VH y VL de DVD-lg anti-TNFct/antt-PGE2 de múrido con enlazadores humanos SEQ Región de la Secuencia ID Proteína NO. 123456789012345678901234567890 86 VH 8Cll-hNL-2B5 EFQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYSFT DYNMNWVKQSNGKSLEWVGVINPNYGSSTY NQKFKGKATLTVDQSSSTAYMQLNSLTSED SAVYYCARKWGQLGRGFFDVWGTGTTVTVS SQVQLQQSGPELVRPGSSVKISCKASGYTF TKYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGYDYTH YNEKFKDKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSE DSAIYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSA 87 VH 8C11 Residuos 1- EFQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYSFT DYNMNWVKQSNGKSLEWVGVINPNYGSSTY 121 de SEQ ID NQKFKGKATLTVDQSSSTAYMQLNSLTSED SAVYYCARKWGQLGRGFFDVWGTGTTVTVS NO . : 86 S HNL PARA HC No 88 VH 2B5 Residuos 122- QVQLQQSGPELVRPGSSVKISCKASGYTFT KYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGYDYTHY 237 de SEQ ID NEKFKDKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSED SAIYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSA NO. : 86 123456789012345678901234567890 89 VL 8Cll-hNL-2B5 QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVS YMHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQW SSSPLTFGAGTKLELKRDVLMTQTPLSLPV SLGDQASISCTSSQNIVHSNGNTYLEWYLQ RPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSG TVFTLKISRVEAEDLGVYYCFQVSHVPYTF GGGTKLEIKR 90 VL 8C11 Residuos 1- QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVS YMHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPAR 107 de SEQ ID FSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQW SSSPLTFGAGTKLELKR NO . : 89 HNL PARA LC No 91 VL 2B5 Residuos 108- DVL TQTPLSLPVSLGDQASISCTSSQNIV HSNGNTYLEWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRF 220 de SEQ ID SGVPDRFSGSGSGTVFTLKISRVEAEDLGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKR NO. : 89 123456789012345678901234567890 102 VH 8Cll-hSL-2B5 EFQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYSFT Ejemplo 2.2.3 Caracterización de DVD-lq de múrido anti-TNFa/anti-PGE2 de múrido con enlazadores humanos Ejemplo 2.2.3.1: Pruebas para identificar la actividad de unión a PGE? de moléculas de DVD-lg anti-TNFa/anti-PGE? de ratón con enlazadores humanos Las pruebas utilizadas para identificar y caracterizar la actividad de unión a PGE2 de DVD-lgs anti-TNFa/anti-PGE2 de múrido con enlazadores humanos, incluyendo la prueba ELISA para 3H-PGE2 se describen en el ejemplo 1 a menos que se indique de otra manera. 2B5-8.0, 2B5-huSL-8C11 y 2B5-hLL-8C11 y PGE2 a valores de KD de 334, 238, 383 pM, respectivamente.
Ejemplo 2.2.3.2: Pruebas para identificar la actividad de neutralización anti-PGE? de moléculas de DVD-lq anti-TNFa/anti- PGE? de ratón con enlazadores humanos Las pruebas utilizadas para identificar y caracterizar la actividad de neutralización de PGE2 de DVD-lgs anti-TNFct/anti-PGE2 de múrido con enlazadores humanos, incluyendo la prueba para EP4, se describen en el Ejemplo 1 a menos que se indique de otra manera. 2B5-8.0, 2B5-huSL-8C11 y 2B5-hLL-8C11 neutralizan a PGE2 a valores de Cl50 de 20, 20, 64 pM, respectivamente.
Ejemplo 2.2.3.3: Pruebas para identificar la actividad de unión anti-TNFa de moléculas de DVD-lg TN Fa/anti-PGE? de ratón con enlazadores humanos Las pruebas utilizadas para identificar y caracterizar la actividad de unión a TNFa de DVD-lgs anti-TNFa/anti-PGE2 de múrido con enlazadores humanos, incluyendo ELISA, se describen en el Ejemplo 1 a menos que se indique de otra manera. 8C11, 2B5-huSL-8C11 y 2B5-hLL-8C11 neutralizan a PGE2 a valores de Cl50 de 201, 234, 256 pM, respectivamente.
Ejemplo 2.2.3.4: Pruebas para identificar la actividad de neutralización anti-TNFa de moléculas de DVD-lg TNFa/anti-PGE2 de ratón con enlazadores humanos Las pruebas utilizadas para identificar y caracterizar actividad de neutralización de TNFa de DVD-lgs anti-TNFa/anti-PGE2 de múrido con enlazadores humanos, incluyendo la prueba para L929 se describen en el Ejemplo 1 a menos que se indique de otra manera. 8C11, 2B5-huSL-8C11 y 2B5-hLL-8C11 neutralizan a PGE2 a valores de Cl50 de 5852, 4389, y 88 pM, respectivamente. Aunque aún no está clara la razón por la cual 2B5-hLL-8C11 tiene actividad mucho más potente para neutralizar a TNFa de múrido, ésta podría estar relacionada con la cinética y el tamaño de formación del complejo de las moléculas de DVD-lg con TNFa de múrido.
EJEMPLO 2.3 Construcción v caracterización de moléculas de DVD-ig anti- TNFq/anti-PGE? de humano Se diseña una molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual (DVD-lg) de modo tal que dos dominios variables de la cadena ligera (VL) diferentes provenientes de los dos mAbs progenitores diferentes estén ligados en tándem ya sea directamente o a través de un enlazador corto, utilizando técnicas de AD N recombinante, seguido por el dominio constante de la cadena ligera. De manera similar, la cadena pesada comprende dos dominios variables de la cadena pesada (VH) diferentes ligados en tándem, seguido por el dominio constante CH 1 y la región Fe, utilizando los métodos descritos en la publicación de patente E. U .A. No. 20070071675. La región constante de una molécula de DVD-lg de humano puede ser cualquiera de una lgG 1 , lgG2 , lgG3, lgG4 de humano.
Utilizando el anti-TNFa de humano, D2E7, y H U2 B5.7 como bloques de construcción , se construyen cuatro moléculas de DVD-lg anti-TN Fa/PG E2: dos variantes con cualquiera de los dominios de unión a TN Fa o PGE2 en los extremos N-terminales, y cada una con enlazador corto (SL) o enlazador largo (LL) para formar una estructura en puente entre las cadenas pesada y ligera de los dos dominios de unión a antígeno.
Los dominios de VH y VL de los dos anticuerpos progenitores utilizados para generar una DVD-lg que se pueda unir a TN Fa y PG E2 de humano se listan en la Tabla 8. Brevemente, los mAbs progenitores incluyen dos anticuerpos de múrido de alta afinidad, anti-TNFa de humano (D2E7) y anti-PGE2 humanizada (HU2B5.7), respectivamente. Los genes de VL/VH del anticuerpo monoclonal anti-TNFa D2E7 se amplifica mediante PCR a partir de plásmidos que codifican para la secuencia de ADN de D2E7, como se describe en la patente E.U.A. No. 6,258,562. Los genes de VL/VH de HU2B5.7 provienen de plásmidos que codifican para la secuencia de ADN de HU2B5.7, como se ilustra en el Ejemplo 2.3. Todas las moléculas de DVD2-lg se construyen de manera similar, excepto que éstas tienen un enlazador entre los dos dominios variables tanto en la cadena ligera como en la cadena pesada. Estas secuencias enlazadoras, que se seleccionan a partir de los extremos terminales de Ck y CH1 de humano, son una extensión natural de los dominios variables y exhiben una conformación flexible sin estructuras secundarias significativas tomando como base el análisis de varias estructuras de cristal de Fab. Los procedimientos detallados de la clonación con PCR se describen a continuación: Ejemplo 2.3.1 Clonación molecular de DVD-lg de humano anti-TNFa/anti-PGE2 de humano La construcción general de moléculas de DVD-lg se describe en la publicación de patente E.U.A. No. 20070071675. Utilizando PCR de traslape, se generan cuatro moléculas de DVD-lg de h umano ant¡-TN Fa/anti-PG E2 de h umano con enlazador h u m ano corto linker (S L) y enlazador humano largo (LL) y sus secuencias de proteína de VH y VL se listan en la siguiente Tabla 8. El ADN que codifica para la VH de las moléculas de DVD-lg se fusiona con la región constante de IgG 1 de la cadena pesada de hu m a no , y el AD N que codifica para la VL de las moléculas de DVD-lg se fusiona con la región constante k de la cadena ligera de humano respectivamente . La expresión y purificación de proteína de las moléculas de DVD-lg son esencialmente las mismas que las descritas en el Ejemplo 1 .3 y en la publicación de patente E.U .A. No. 20070071675.
TABLA 8 Lista de las secuencias de aminoácido de las regiones de VH y VL de DVD-lg anti-TNFct/anti-PGE? de humano con enlazadores humanos SEQ Región de la Secuencia ID proteina NO. 123456789012345678901234567890 110 Vh hu2b5.7 EVQLVQSGAEV KPGASVKVSCKASGYTFT KYWLGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHY NEKFKDRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDD TAVYYCARSDGSSTY GQGTLVTVSS 111 Vh hu2b5.7 DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIV HSNGNTYLE YLQKPGQSPQLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 123456789012345678901234567890 112 VH D2E7 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFD DYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDY ADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVS S 123456789012345678901234567890 113 VL D2E7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIR NYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQR YNRAPYTFGQGTKVEIKR 123456789012345678901234567890 114 DVD VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT HU2B5.7SLD2E7 KYWLGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHY NEKFKDRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDD TAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSSASTK GPEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFT H HU2B5.7 Residuos 1- EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 116 de SEQ ID KYWLGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHY NO. :114 NEKFKDRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDD TAVYYCARSDGSSTY GQGTLVTVSS SL PARA HC Residuos 117- ASTKGP 122 de SEQ ID NO. :114 D2E7 Residuos 123- EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFD 243 de SEQ ID DYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDY NO. :114 ADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVS S 123456789012345678901234567890 DVD VL DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIV HU2B5.7SLD2E7 HSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKRTVAAPDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNY LAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYN RAPYTFGQGTKVEIKR TABLA 9 Secuencia del dominio constante de la cadena pesada v del dominio constante de la cadena ligera de IqG de humano Proteína Identificador de Secuencia Secuencia 123456789012345678901234567890123 Región constante SEQ ID NO. : 122 ASTKGPSVFFLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS de Ig gama-1 SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV LFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO. : 123 ASTKGPSVFPLAPSS STSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL PP PKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN YVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Región constante SEQ ID NO. : 124 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS de Ig kappa LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC Región constante SEQ ID NO. :125 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFY PGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYA de Ig Lambda ASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTV APTECS Ejemplo 2.3.2 Pruebas para caracterizar moléculas de DVD-lg anti-TNFa/Anti- PGE? de humano Las pruebas utilizadas para identificar y caracterizar moléculas de DVD-lg anti-TNFa/anti-PGE2 de humano, incluyendo ELISA, ELISA de competición, ELISA para 3H-PGE2 ELISA y/o ELISA de competición de 3H-PGE2, prueba de bloqueo de receptor, se describen en el Ejemplo 1.1 a menos que se indique de otra manera.
La afinidad para PGE2 se mide utilizando ELISA para 3H-PGE2. Las moléculas D2E7-SL-Hu2B5.7,.D2E7-LL-Hu2B5.7 y Hu2B5.7-SL-D2E7-SL mantienen afinidades de unión a PGE2 comparables (Tabla 10).
TABLA 10 Caracterización in vitro de moléculas de DVD-lg anti-TNFa/PGE2 La especificidad de unión a prostaglandina de las moléculas de DVD-lg anti-TNFa/PGE2 se evalúa utilizando una ELISA de competición de 3H-PGE2 y se presenta en forma resumida en la Tabla 11.
TABLA 11 Selectividad de unión a prostaglandina de D2E7-SL-Hu2B5.7 calculada como CRI *CRI (Cross Reactivity Index) = 100 x CI50 of PGE2/CI50 of other prostaglandins in a competition RIA This number reflects the percentage of cross-reactivity EJEMPLO 2.3.3 Actividad funcional anti-actividad de PGE2 de moléculas de DVD lg TNFct/anti-PGE2 de humano Las pruebas utilizadas para caracterizar la actividad funcional de las moléculas de DVD-lg anti-TNFa/anti-PGE2 de humano, incluyendo el bioensayo para EP4, se describen en el Ejemplo 1.1 a menos que se indique de otra manera. Todas las cuatro moléculas de DVD-lg mantienen potencias de neutralización dé unión comparables en pruebas celulares para PGE2 (Tabla 10).
EJEMPLO 2.3.4 Afinidad de las moléculas de DVD-lg anti-TNFa/anti-PGE2 de humano para TNFa Las pruebas utilizadas para identificar y caracterizar la actividad anti-TNF de moléculas de DVD-lg anti-TNFa/anti-PGE2 de humano, incluyendo la prueba ELISA y la prueba BIAcore son esencialmente las mismas que aquellas descritas en el Ejemplo 1.1 a menos que se indique de otra manera. Las moléculas de DVD-lg, D2E7-SL-HU2B5.7 y D2E7-LL-HU2B5.7, con D2E7 en los extremos N- terminales mantienen afinidad de unión a TNFa comparable, mientras que HU2B5.7-SL-D2E7 y HU2B5.7-SL-D2E7 con D2E7 en los extremos C-terminales tienen afinidad de unión a TNFa significativamente reducida (Tabla 10).
La cinética de unión a TNFa de D2E7-SL-Hu2B5.7 para TNFa proveniente de varias especies se presenta en forma resumida en la Tabla 12.
TABLA 12 Afinidad de unión a TNFa de D2E7-SL-Hu2B5.7 Tabla 12 Nota: "-" no analizado EJEMPLO 2.3.5 Actividad funcional de anticuerpos anti-TNFa v actividad anti- TNFa de moléculas de DVD-lg anti-TNFa/anti-PGE2 La prueba L929 utilizada para caracterizar la actividad funcional anti-TNFa de humano de moléculas d DVD-lg anti-TNFa/ant¡-PGE2 de humano es esencialmente la misma que la descrita en el ejemplo 1.1.2.C a menos que se indique de otra manera. Las moléculas de DVD-lg, D2E7-SL-HU2B5.7 y D2E7-LL-HU2B5.7, con D2E7 en los extremos N-terminales mantiene actividad de neutralización de TNFa comparable, mientras que HU2B5.7-SL-D2E7 y HU2B5.7-SL-D2E7 con D2E7 en los extremos C-terminales reduce significativamente la actividad de neutralización de TNFa (Tabla 10).
La actividad de neutralización de TNFa de D2E7-SL-Hu2B5.7 para TNFa de varias especies se presenta en forma resumida en la Tabla 12.
EJEMPLO 2.3.6 ) Interferencia mutua de unión a antígeno de moléculas de DVD-lg anti-TNFa/anti-PGE2 Para determinar si D2E7-SL-HU2B5.7 puede neutralizar o no a TNFa y PGE2 simultáneamente, se pre-satura D2E7-SL-HU2B5.7 primero con un antígeno, y después se analiza respecto a la neutralización del segundo antígeno. D2E7-SL-HU2B5.7 no muestra ningún decremento en la potencia de neutralización para PGE2 en la prueba de EP4 cuando se une previamente a TNFa, ni tampoco hay ningún decremento en la potencia de neutralización para TNFa en la ) prueba de L929 cuando se une previamente a PG E2.
EJEMPLO 2.3.7 Prueba de inhibición competitiva del receptor EP3 La prueba de inhibición competitiva del receptor EP3 utilizada para caracterizar la actividad funcional del actividad anti-anti-PGE2 de humano de moléculas de DVD-lg anti-TNFa/anti-PG E2 de humano se describe en el Ejemplo 1 a menos que se indique de otra manera. El valor de C l50 para D2E7-SL-HU2B5.7 para bloquear la unión de 3H-PGE2 al receptor EP está en el intervalo de 70-120 pM .
EJ EM PLO 2.3.8 Reactividad cruzada de citocina de humano La selectividad de citocina de D2 E7-SL-H U2B5.7 se evalúa mediante ELISA como se describe en el Ejemplo 1 . Se analiza un panel de 26 citocinas solubles de h umano respecto a competición con D2E7-SL-H U2B5.7 por la unión a TN Fa modificado con biotina inmovilizado. La unión competitiva específica se presenta solamente con TN Fa; ningu na otra citocina muestra competición con D2 E7-SL-H U2B5.7 por unión a TNFa modificado con biotina. Estos datos sugieren que D2E7-SL-H U2B5.7 es altamente específica para TN Fa.
EJ EM PLO 2.3.9 Incubación de D2E7-SL-HU2B5.7 con sangre humana Se investiga la interacción de D2E7-Hu-2B5.7 con células de sangre humana utilizando pruebas para determinar la liberación de citocina y unión a superficie celular como se describe en el Ejemplo 1. Estas pruebas ayudan a evaluar si D2E7-Hu-2B5.7 causa la activación de células inflamatorias o se une aproteínas de superficie celular no pretendidas en la sangre. La incubación de D2E7-Hu-2B5.7 obtener a partir de células CHO con células de sangre periférica humana no induce ninguna liberación de citocina por encima de los valores de control, lo que sugiere que ésta no causa activación de células inflamatorias.
EJEMPLO 2.3.10 Eficacia in vivo de actividad anti-PGE2 de moléculas de DVD-lg TNFa/anti-PGE? de humano en un modelo de edema de planta de la pata inducido por carraqenina El Edema De Planta De La Pata Inducido Por Carragenina es un modelo agudo en roedor de la función inmune innata. La inyección intradérmica (ID) de un agente inflamatorio ocasiona un influjo rápido de neutrófilos y edema de fluido, el cual alcanza un máximo aproximadamente a las 4 horas, seguido por un influjo de macrófagos y monocitos, el cual alcanza un máximo aproximadamente a las 48 horas. A ratones C57.BL/6 (8-10 semanas de edad, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) se les inyecta por vía intradérmica en la planta de la pata trasera 30 µ?_ de cualquiera de PBS (izquierda) o ?-carragenina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) en PBS (derecha) a una concentración de 5.0 mg/mL (150 pg/ratón). Se mide el grosor de la planta de la pata trasera utilizando un calibrador de resorte Dyer modelo #310-119 en la línea basal (tiempo = 0), y 4 horas después del desafío con carragenina. La diferencia significativa para el grosor de la pata se determina comparando la hinchazón promedio de la pata para cada grupo de tratamiento para vehículo en una prueba t de Student de dos colas.
A lo ratones se les administra una titulación de dosis de cualquiera de una molécula de DVD-lg anti-TNFa/PGE2 de humano D2E7-SL-Hu2B5.7 o un anticuerpo anti-PGE2 (2B5-8.0) por vía intraperitoneal (IP) 18 horas antes del desafío con carragenina, o indometacina, por vía oral 2 horas antes del desafío. El punto final medido es la diferencia en hinchazón de la pata (edema) entre las patas derecha e izquierda 4 horas después del tratamiento. El anticuerpo anti-PGE2 inhibe el edema de la pata en una forma dependiente de la dosis, y provee una inhibición máxima de 40-50% de hinchazón de la pata a 10 mg/kg, comparable con la inhibición máxima lograda por la indometacina. Dos experimentos independientes con D2E7-SL-Hu2B5.7 demuestran inhibiciones muy similares. Las concentraciones en suero de D2E7-SL-HU2B5.7 que proveen inhibición máxima (a 10 mg/kg) son -50 pg/mL a las 22 horas después de la dosis, y este nivel es similar al observado para el mAb anti-PGE2. Estos resultados indican que el dominio de unión anti-PGE2 de la DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 es totalmente funcional in vivo (Tabla 13).
Tabla 13 Hinchazón de la pata en Edema de Planta de la Pata Inducido por Carraqenina en ratón después de tratamiento con anticuerpo o DVD-lg Ejemplo 2.3.11 Rescate de moléculas de DVD-lg TNFg/anti-PGE2 de humano letalidad inducida por LPS-D-Galactosamina Se prepara D2E7-SL-Hu2B5.7 en solución salina estéril (Baxter lote C755694) y se inyecta por vía intraperitoneal a 100, 30, 10, 3, 1 mg/kg en ratones de género femenino C57BL6/N (n = 10) (8-10 semanas de edad, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) 18 horas antes del desafío con LPS. Se utiliza solución salina sola como un control negativo. Otro grupo recibe mg/kg de 8C11-1E10, un anticuerpo monoclonal anti-TNF de ratón, como un control positivo.
Al momento del desafío, los ratones se inyectan por vía intraperitoneal con un volumen de dosis de 500µ?_ de solución salina que contiene 100 ng/ratón de LPS (Sigma L4130, lote 095K4056, St. Louis, MO) y 20 mg/ratón de D-galactosamina (Sigma G-0500, lote 048KI 547, St. Louis, MO). Los ratones después se monitorean respecto a letalidad dos veces al día durante 48 horas. A las 48 horas los ratones supervivientes remanentes se sacrifican y desangran para niveles de anticuerpo en plasma.
Los resultados se muestran en la Tabla 14. El D2E7-SL-Hu2B5.7 a 100 mg/kg protege al 90% de los ratones contra letalidad. La protección se logra a una exposición promedio (media ± desv. est.) de 307.7 ± 26.1 Mg/ml. Todos los otros grupos de dosis proveen poca o ninguna protección. El anticuerpo de ratón anti-anti-TNF de ratón (8C11-1E10) a 12 mg/kg se utiliza como un control positivo y provee 100% de protección contra letalidad inducida por LPS/D-gal. Esta eficacia con el anticuerpo 8C11 se logra a una exposición promedio (media ± desv. est.) de 65 ± 4.0 pg/ml.
TABLA 14 Capacidad de D2E7-SL-Hu2B5.7 para rescatar de la letalidad inducida por LPS-D-qalactosidasa % de supervivencia Concentración promedio de Ab en plasma ( g/mL) Solución salina 0 NA D2E7-SL-HU2B5.7 a 1 mg/kg 0 NA D2E7-SL-Hu2B5.7 a 3 mg/kg 10 26.6 D2E7-SL-Hu2B5.7 a 10 mg/kg 20 91.7 D2E7-SL-Hu2B5.7 a 30 mg/kg 10 184.0 D2E7-SL-Hu2B5.7 a 100 mg/kg 90 307.7 D2E7-SL-Hu2B5.7 a 12 mg/kg IP 100 65.2 Ejemplo 2.3.12 Eficacia in vivo de actividad anti-TNFa de humano de moléculas de DVD-lq TNFa/anti-PGE? de humano en un modelo de artritis inducida por TNFa transgénico de humano Ejemplo 2.3.12.1: Modelo de artritis inducida por TNFa transgénico de humano Se dividen ratones B6.Cg(SJL)-Tg(TA/F) N21 + transgénicos para TNFa de humano (40 de género masculino y 40 de género femenino) (Taconic, Hudson, NY) a 4 semanas de edad en 10 grupos de 8 ratones (4 de género masculino y 4 de género femenino/grupo). Cada semana, comenzando desde la semana 5 hasta la semana 12 de edad se evalúan la morfología de las articulaciones del tobillo trasero de lo ratones y y se califica respecto a signos y síntomas de artritis. Las calificaciones artríticas se asignan de la siguiente manera. 0 = sin artritis (apariencia y flexión normales) 1 = artritis ligera (distorsión de la articulación) 2 = artritis moderada (hinchazón, deformación de la articulación); y 3 = artritis severa (se detecta anquilosis durante la flexión y movimiento severamente disminuido) Los animales se aleatorizan para lograr calificación artrítica promedio (MAS) aproximadamente similar para todos los grupos en la semana 9 a las primeras señales de síntomas. Los animales después se tratan por vía intraperitoneal dos veces por semana comenzando desde la semana 10 de edad hasta la semana 12 de edad. A los ratones en el grupo 1 que sirven como el control no tratado se les administra PBS. Los animales de los grupos 2 y 3 reciben tratamiento con mAb anti-TNFa (D2E7) a 30 y 10 mg/kg, respectivamente, mientras que los animales de los grupos 4 y 5 reciben tratamiento con mAb anti-PGE2 (2B5-8.0) 30 y 10 mg/kg, respectivamente. Los animales de los grupos 6 y 7 se tratan tanto con tratamiento con mAb anti-TNFa (D2E7) como con tratamiento con mAb anti-PGE2 (2B5-8.0) con cada uno de los mAbs a 30 y 10 mg/kg respectivamente. Los animales de los grupos 8, 9 y 10 se tratan con DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 a 40, 13.3 y 4 mg/kg respectivamente. La figura 4 muestra la calificación artrítica promedio de los animales tratados con 2B5-8.0, D2E7, o con una combinación de 2B5-8.0 y D2E7.
Ejemplo 2.3.12.2: Eficacia in vivo en un modelo de artritis inducida por TNFa transgénico de humano A diferencia del modelo de artritis inducida por colágena, en el cual la enfermedad es impulsada por mecanismos múltiples, la enfermedad en el modelo en ratón de TNFa transgénico de humano es impulsada principalmente por sobre-expresión de TNFa de humano. Los síntomas de la enfermedad típicamente son evidentes a las 9-10 semanas y se desarrollan completamente alrededor de las 20 semanas de edad. Estos ratones se tratan con dosis equivalentes de D2E7-SL-Hu2B5.7, D2E7, o mAb anti-PGE2 2B5-8.0 dos veces por semana entre las semanas 10 y 12. La enfermedad se califica semanalmente comenzando desde la semana 9 y se expresa como la inhibición del ABC de la calificación de artritis promedio. D2E7-SL-Hu2B5.7 reduce artritis en una manera dependiente de la dosis en los grupos de 3 mg/kg (30%) y 10 mg/kg (63%). La eficacia máxima lograda a dosis equivalentes de.10 mg/kg (63%) y 30 mg/kg (60%) es comparable con la eficacia máxima (59%) del mAb anti-TNFa de humano D2E7 a 30 mg/kg. No hay efecto significativo sobre el avance de la enfermedad en este modelo a partir del bloqueo de PGE2 con 2B5-8.0, debido a que el artritis en este modelo es impulsada principalmente por TNFa de humano. En general, estos resultados demuestran la actividad in vivo del dominio de unión anti-TNFa.
Ejemplo 2.3.13 Análisis farmacocinético de D2E7-SL-hu2B5.7-DVD-lg Se llevan a cabo estudios farmacocinéticos con D2E7-SL-hu2B5.7-DVD-lg en ratas Sprague Dawley y monos cynomolgus. A las ratas de género masculino y femenino se les dosifica por vía intravenosa o subcutánea una sola dosis de 4 mg/kg (ratas) o 5 mg/kg (monos) de D2E7-SL-hu2B5.7-DVD-lg y las muestras de suero se analizan utilizando el método quimioluminiscente basado en captura de antígeno MSD (Meso Scale Discovery). Los parámetros farmacocinéticos se calculan mediante análisis no compartimental utilizando WinNonlin.
Ejemplo 2.3.13.1: Prueba utilizada para cuantificar D2E7- SL-hu2B5.7-DVD-lq en muestras de suero PK La siguiente prueba de MSD se utiliza para medir las concentraciones de DVD-lg en rata. Se lavan placas de estreptavidina para MSD (Meso Scale Discovery) con solución salina amortiguada con fosfatos que contiene Tween-20 al 0.05% (diluida a partir de PBS 10X, Abbott Bioresearch Center, Cuarto de Medios, Worcester, MA y Tween-20, Sigma, St. Louis, MO). Las placas se bloquean con 250 pL/cavidad de solución para bloqueo (Bloqueo para MSD, Meso Scale Discovery, diluida hasta una concentración final de 3% en PBS) durante 1 hora, cubiertas, con agitación (600 rpm) a temperatura ambiente.
Antes del análisis, las muestras de rata se descongelan en hielo, se mezclan suavemente, y se centrifugan a 14,000rpm durante 3 minutos a 4°C en una centrífuga Eppendorf. Se preparan la curva patrón y las muestras de control en suero de rata. Las muestras de estudio, muestras para la curva patrón, testigos, y las muestras de control de calidad se incuban en solución en una placa de 96 cavidades con profundidad de cavidad de 2 ml_ separada (Corning, Corning, NY) 1:1:1 = V:V:V con TNFa biotinilado (A-923884.0 Lote no. 1346920, Abbott Bioresearch Center Biologies Pharmacy, Worcester, MA; 0.1 ug/mL en solución amortiguadora para prueba) y anti-lgG de humano, sulfo-marcada, de cabra (Meso Scale Discovery, 1 ug/mL en solución amortiguadora para prueba) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras después se transfieren a las placas de MSD y se incuban durante una hora adicional con agitación (600 rpm) a temperatura ambiente. Las placas de MSD se lavan y se revelan con solución amortiguadora para lectura 2x (Meso Scale Discovery). La quimioluminiscencia se mide dentro de 10 minutos en el aparato para formación de imágenes MSD Sector Imager 6000.
Las curvas patrón se analizan utilizando ajuste logístico de cuatro parámetros y las concentraciones de la muestras se calculan utilizando el software XLfit4 versión 2.2.1 Build 16, (Microsoft Corporation, Redmond, WA). Los parámetros farmacocinéticos se calculan para cada animal utilizando el software Winonlin versión 5.0.1 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA) mediante análisis no compartimental (Tabla 15).
Ejemplo 2.3.13.2: Estudios farmacocinéticos efectuados en rata SD Se adquieren ratas Sprague-Dawley quirúrgicamente alteradas (con cánula en la vena yugular, JVC) y regulares de género masculino y femenino (de aproximadamente siete semanas de edad, con un peso de 240-390 gramos) a partir de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Los animales se alojan en cuartos mantenidos a temperatura y humedad constantes bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, alimentadas con dieta normal para roedor y con acceso ad libitum al agua y alimento. La hidratación y condiciones clínicas de los animales se monitorean diariamente.
Las muestras de sangre (0.2 mL de las ratas y 0.5 mL de los monos) se recolectan en diversos puntos de tiempo, se dejan coagular durante 30 minutos a temperatura ambiente, se centrifugan durante 8 minutos a 13,200 rpm, el suero se transfiere a tubos Eppendorf y se almacenan congelados a -80°C.
Después de la administración por vía intravenosa en ratas, la DVD-lg D2E7-SL-2B5.7 exhibe descomposición bi-exponencial, típica de los anticuerpos. La depuración y los volúmenes de distribución de la DVD-lg D2E7-SL-2B5.7 son bajos, con un tiempo de vida media largo de 10 días que es comparable con otros anticuerpos monoclonales terapéuticos de humano. Después de la administración por vía subcutánea en ratas, la absorción es lenta, con una Cmáx alta de aproximadamente 25-31 ug/ml que se alcanza en 3 días. En los animales sin ADA, el tiempo de vida media es largo (T 1/2 ~ 12 días), y la biodisponibilidad es alta (F: 87-98 %) (Tabla 15).
TABLA 15 Parámetros farmacocinéticos principales de D2E7-SL.-Hu2B5.7- DVD-lg en rata Spraque-Dawlev y en mono Cynomolgus *n = 2; n = 6 EJEMPLO 2.4 Análisis fisicoquímico de DVD-lg anti-TNFa/anti-PGE? EJEMPLO 2.4.1 Cromatografía por exclusión de tamaño Las muestras de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 se diluyen hasta 1 mg/mL con PBS y se inyectan 20 µ? en un sistema de HPLC Shimadzu HPLC con una columna de gel TSK G3000 SWXL (Tosoh Bioscience, cat# 08541). Las muestras se eluyen de la columna con sulfato de sodio 100 mM, fosfato de sodio 100 mM, azida de sodio 1 mM, pH 6.8, a una velocidad de flujo de 0.5 mL/minutos. Las condiciones de operación del sistema de HPLC son las siguientes.
Fase móvil: fosfato de sodio 100 mM, sulfato de sodio 100 mM, azida de sodio 1 mM, pH 6.8, Gradiente: Isocrático Velocidad de flujo: 0.5 mL/minuto Longitud de onda del detector: 280 nm Temperatura del enfriador del dispositivo de auto-muestreo: 4°C Temperatura del horno de la columna: Ambiente Tiempo de corrida: 30 minutos El pico principal eluye alrededor de 16 minutos. El pico que eluye alrededor de los 13 minutos se asocia con los agregados. El pico de monómero es 99.7%, y el pico del agregado es de 0.3%.
EJEMPLO 2.4.2.B SDS-PAGE Las muestras de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 se analizan mediante electroforesis de dodecil sulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) bajo condiciones tanto reductoras como no reductoras. Para las condiciones reductoras, las muestras se mezclan 1:1 con solución amortiguadora para muestra 2X de Tris-Glicina SDS (Invitrogen, cat# LC2676) con DTT 200 mM, y se calientan a 70°C durante 15 minutos. Para las condiciones no reductoras, las muestras se mezclan 1:1 con solución amortiguadora para muestra 2X de Tris-Glicina SDS y se calientan a 75°C durante 15 minutos. Las muestras tanto reducidas como no reducidas se cargan en geles de Tris-Glicina al 8%-16% pre-vaciados (Invitrogen, cat# EC6045box). Se utiliza el patrón de referencia no teñido Mark 12 (Invitrogen, cat# LC5677) como un marcador de peso molecular. Los geles se corren en una caja de gel de mini celda XCell SureLock (Invitrogen, cat# EI0001) y las proteínas se separan aplicando un voltaje de 125 voltios hasta que frente del colorante llega el fondo del gel. La solución amortiguadora para corrida utilizada es solución amortiguadora 1X de Tris-Glicina SDS, que se prepara a partir de una solución amortiguadora 10X de Tris-glicina SDS (ABC, MPS-79-080106)). Los geles se tiñen durante la noche con tinción azul coloidal (Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016) y se destinen con agua Milli-Q hasta que el fondo es claro. Los geles teñidos se barren después utilizando un densitómetro de lecho plano (Bio-Rad, cat# GS-800).
Bajo condiciones no reductoras se observa una sola banda principal consistente con el peso molecular esperado (~ 200 KDa) de la DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7. Esta banda principal migra más alto que una I g G 1 típica, lo cual es consistente con los dominios adicionales en una DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7. Bajo condiciones reductoras se observan dos bandas importantes consistentes con el peso molecular esperado para la cadena pesada (62.5 KDa) y la cadena ligera (37.5KDa) respectivamente.
EJEMPLO 2.4.3 Análisis de velocidad de sedimentación Las muestras de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 se dializan contra PBS durante la noche. Las muestras se diluyen en PBS para producir valores de absorbancia aproximados de 1.0 a 280 nm en las celdas de 1.2 cm de longitud de trayectoria en la centrífuga analítica. Esta dilución da como resultado una concentración final de -0.5 mg/mL. En la celda de referencia se utiliza PBS. Los valores de densidad, viscosidad, y barra v de la solución se calculan utilizando SEDINTERP (v1.09). Cada muestra de DVD-lg se analiza de manera independiente y se corren tres repeticiones idénticas para cada muestra. Las soluciones de muestra y los testigos de referencia se cargan en celdas estándar de dos sectores con una longitud de trayectoria óptica de 1.2 cm, ventanas de zafiro, y piezas centrales epon de carbono. Todas las muestras se examinan simultáneamente utilizando un rotor de 4 agujeros (AN-60TÍ) en una ultracentrífuga analítica Beckman ProteomeLab XL-I (No. de serie PL106C01).
Se programan las condiciones de corrida y se efectúa el control de la centrífuga utilizando ProteomeLab (v5.6). Los datos de absorbancia se utilizan para el análisis.
Se deja que las muestras y el rotor se equilibren térmicamente por más de dos horas antes de iniciar la corrida (20.0 ± 0.1°C). La confirmación de la carga apropiada de celda se efectúa a 3000 rpm y se registra un barrido individual para cada celda. Las condiciones de velocidad de sedimentación son las siguientes: Volumen de celda de muestra: 420 pL Volumen de celda de referencia: 420 pL Temperatura: 20°C Velocidad del rotor: 35,000 rpm Tiempo: 8:00 horas Longitud de onda UV: 280 nm Tamaño del incremento radial: 0.003 cm Recolección de datos: Un punto de datos por cada incremento sin promediar la señal Número total de barridos: 100 Los resultados de la ultracentrifugación analítica para velocidad de sedimentación demuestran que la DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 es predominantemente monomérica (99.58%) en solución con un porcentaje bajo de agregados. El coeficiente de sedimentación del monómero (7.5 S) es mayor que el valor típico de 6 - 6.5 S medido para una molécula convencional de lgG1 de humano. Este coeficiente de sedimentación más grande medido para la DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 es el resultado del tamaño hidrodinámico más grande que resulta del dominio dual-variable. De manera adicional, el coeficiente de fricción (1.64) es mayor que el que típicamente se observa para IgGs humanizadas recombinantes. La mayoría de los anticuerpos tienen coeficientes de fricción de 1.4 -1.5.
EJEMPLO 2.4.4 SDS-CE Se obtiene SDS-CE tanto reducida como no reducida de la DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7. Las muestras de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 se diluyen hasta 2 mg/mL con agua Milli-Q y se muezclan 1:1 con solución amortiguadora para SDS-CE. Para las muestras no reducidas, se agrega yodoacetamida 0.5 M (Sigma A3221-1VL) en el volumen de 1/10 de la muestra de proteína. Para las muestras reducidas, se agrega 1/10 del volumen de proteína de ß-mercaptoetanol (Sigma M-7154). Las muestras se someten a acción de remolino y se transfieren a un baño de agua a 70°C. Las muestras se incuban durante 15 minutos después se detienen en un baño de agua a temperatura ambiente. Los frascos de la muestra se centrifugan a baja velocidad brevemente a y se someten a acción de remolino para recolectar el líquido de la muestra en el fondo. Las muestras se transfieren a frascos para PCR y se cargan en rejillas para frascos para el análisis. Se utiliza el sistema de electroforesis capilar ProteomeLab PA800 (Beckman Coulter) y capilares de sílice vaporizada no revestidos (Beckman Coulter, parte de P/N .1 0663) para el análisis de SDS-CE .
SDS-C E no red ucida m uestra un pico mayor consistente con la DVD-lg D2E7-S L- Hu2B5.7 intacta . El porcentaje de área de pico de este pico m ayor es de 95.3% . Existen picos menores q ue migran más antes que el pico mayor. Estos picos menores probablemente son fragmentos de la molécula de DVD-lg , algunos de los cuales son causados por el tratamiento térmico durante la preparación de la muestra. SDS-CE red ucida muestra dos picos mayores correspondientes a la cadena ligera (36.1 %) y la cadena pesada (60.8%) respectivamente. Los picos menores que migran después del pico de la cadena pesada (0.5%) probablemente son ocasionados por reducción incompleta. SDS-CE reducida también muestra un pico pequeño (2.2%) en frente del pico de la cadena pesada. Este pico está relacionado con la cadena pesada no glucosilada.
EJEM PLO 2.4.5 Dispersión de luz di námica Las muestras de DVD-lg D2E7-SL-H u2B5.7 y las dos moléculas progenitoras D2E7 y H u2B5.7 se diluyen hasta 2 mg/mL con PBS (G IBCO 20012). Las muestras se centrifugan a 1 0,000 RPM durante 10 minutos antes que se midan en el sistema de dispersión de luz dinámica DynaPro-801 . El radio hidrodinámico de la DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 es de 6.43 nm. El radio hidrodinámico promedio de D2E7 y Hu2B5.7 es de 5.46 nm y 5.36 nm, respectivamente. Estos resultados demuestran que la DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 tiene un radio hidrodinámico más grande que el de las dos moléculas progenitoras, lo cual es consistente con el hecho que la DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 tiene dominios adicionales que una molécula de lgG1 típica.
EJEMPLO 2.4.6 Medición de peso molecular con LC-MS El peso molecular intacto y el peso molecular desglucosilado de la muestra de DVD-lg D2E7-SL- Hu2B5.7 se analiza mediante LC-MS. Cada muestra se diluye hasta aproximadamente 1 mg/mL con agua. Se inyectan 0.5 µ? de la muestra diluida en el sistema para LC/MS Agilent 6510 Q-TOF (Agilent G6510A, no. de serie US65020122) con una columna Poroshell 300SB-C3 (Agilent, cat# 661750-909). Se utiliza un gradiente corto (Tabla 16) para eluir las muestras. El gradiente se corre con la fase móvil A (ácido fórmico al 0.1% en agua, J. T. Baker, cat# 9834-03) y la fase móvil B (ácido fórmico al 0.1% en acetonitrilo, J. T. Baker, cat# 9832-03) a una velocidad de flujo de 50 ML/minuto. El espectrómetro de masas se hace funcionar a un voltaje de aspersión de 5 kvoltios y el intervalo de barrido es de 600 a 3200 de relación masa a carga. Para desglucosilar la DVD-lg D2E7-SL- Hu2B5.7, se mezclan 50 pg de muestra de DVD-lg con 2.5 µ?_ de N-octilglucósido al 10% (Sigma, cat# O8001) y 1 µ? de PNGasa F (Prozyme, cat# GKE5006A). Se agrega agua Milli-Q a cada muestra para hacer el volumen total de 50 µ?_. La muestra se incuba a 37°C durante 17 horas. Las mismas condiciones de HPLC y espectrometría de masas utilizadas para adquirir el peso molecular intacto se utilizan para obtener el peso molecular desglucosilado (Tabla 16).
TABLA 16 Gradiente de HPLC para análisis de peso molecular intacto El peso molecular intacto de la DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 es de 200,574 Dalton, con una diferencia de 5 Daltons respecto al valor teórico de 200,569 basado en el aminoácido derivado de la secuencia de ADNc, con la adición de la modificación de los dos oligosacáridos N-ligados NGA2F. También se observan pesos moleculares de 200,736 Daltons y 200,894 Daltons, que corresponden a modificaciones diferentes de oligosacárido. Después de desglucosilar, se determina que el peso molecular de la DVD-lg es de 197,684 Daltons, con una diferencia de 5 Daltons con respecto al valor teórico de 197,679. También se observa un nivel bajo de picos con peso molecular 197,810 Daltons y 197,936 Daltons, lo cual corresponde al peso molecular desglucosilado con Usinas extermínales.
EJEMPLO 2.4.7 Medición de peso molecular mediante LC-MS de la cadena ligera y la cadena pesada Se analizan las mediciones de peso molecular de la cadena ligera (LC), la cadena pesada (HC) y HC desglucosilada de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 mediante LC-MS. Se diluye una muestra de DVD-lg hasta 1 mg/mL con agua y la muestra se reduce hasta LC y HC con una concentración final de DTT 25 mM durante 30 mihutos a 37°C. Se inyectan 0.5 [iL de la muestra diluida en el sistema para LC/MS Agilent 6510 Q-TOF (Agilent G6510A, no. de serie US65020122) con una columna Poroshell 300SB-C3 (Agilent, cat# 661750-909). Se corre un gradiente (Tabla 17) con la fase móvil A (ácido fórmico al 0.1% en agua, J. T. Baker, cat# 9834-03) y la fase móvil B (ácido fórmico al 0.1% en acetonitrilo, J. T. Baker, cat# 9832-03) a una velocidad de flujo de 50 pL/minuto. El espectrómetro de masas se hace funcionar a un voltaje de aspersión de 5 kvoltios y el intervalo de barrido es de 600 a 3200 de relación masa a carga. La DVD-lg desglucósilada se reduce con una concentración final de DTT 25 mM durante 30 minutos a 37°C. El peso molecular de la cadena pesada desglucósilada se adquiere utilizando las mismas condiciones que las anteriores.
TABLA 17 Gradiente de HPLC para análisis de peso molecular reducido Se determina que el peso molecular de la cadena ligera de la DVD-lg es de 36,193 Daltons, que coincide con el valor teórico de 36,193 Daltons. El peso molecular de la cadena pesada es de 64,097 Daltons, con una diferencia de 1 Dalton con respecto al valor teórico de 64,096 Daltons tomando como base la secuencia de aminoácido y la adición del oligosacárido N-ligado NGA2F. También se observan pesos moleculares de 64,260 Daltons y 64,423 Daltons, que corresponden a la cadena pesada con las dos modificaciones de oligosacárido N-ligado de NA1F y NA2F, respectivamente. Después de desglucosilar, el peso molecular de la cadena ligera no cambia, lo que indica la ausencia de modificación de oligosacárido en la cadena ligera. El peso molecular de la cadena pesada es de 62,653 Daltons, con una diferencia de 2 Daltons con respecto al valor teórico de 62,651. También se observa un nivel bajo de variante de Usina C-terminal como un peso molecular de 62,781 Daltons.
EJEMPLO 2.4.8 Mapeo de péptido El mapeo de péptido de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 se efectúa de la siguiente manera: se diluyen 200 pg de la muestra de DVD-lg hasta 1 mg/mL con bicarbonato de amonio 50 mM (Mallinckrodt cat# 0155), se reduce y se desnaturaliza en DTT 10 mM (EM Sciences, cat# 3810) y clorhidrato de guanidina 6 M (Pierce, no. de producto 24115) a 37°C durante 30 minutos. Se agregan 10 µ?_ de ácido yodoacético 1 M (Sigma cat# 14386-100G) y la muestra se incuba en la oscuridad a 37°C durante 30 minutos. La muestra reducida, desnaturalizada y alquilada se realiza primero utilizando un aparato slide-A-lyzer (Pierce, no. de producto 66333) contra 4 litros de bicarbonato de amonio 50 mM a 4°C durante 30 minutos, después se dializa contra 4 litros de bicarbonato de amonio 50 mM durante la noche. La muestra se recupera y digiere con tripsina (Promega, cat# V511A) a una relación 1:20 de enzima a proteína (p/p), a 37°C durante 4 horas.
La digestión se detiene mediante adición de 2 µ? de TFA (J. T. Baker, cat# 9470-01). La muestra se transfiere a un frasco de HPLC para análisis LC/MS. Se inyectan 5 pL de la muestra y la muestra se separa mediante HPLC de fase inversa utilizando una columna Vydac C18 (Vydac, cat# 218MS51) en un sistema de HPLC capilar Agilent 1200. El calentador de la columna se ajusta a 60°C. La separación se corre con un gradiente mostrado en la Tabla 18 utilizando solución amortiguadora A (FA al 0.1% en agua, J. T. Baker, cat# 9834-03) y solución amortiguadora B (FA al 0.1% en acetonitrilo, J. T. Baker, cat# 9832-03) a una velocidad de flujo de 50 pL/minuto. El sistema para LC/MS Agilent 6510 Q-TOF (Agilent cat# G6510A, no. de serie US65020122) se hace funcionar en modo de electroaspersión positiva. El espectrómetro de masas se hace funcionar a un voltaje de aspersión de 5.0 kvoltios e intervalo de barrido de 200 a 3000 de relación masa a carga.
TABLA 18 Gradiente de HPLC para mapeo de péptido (Lote 1582940) mediante LC-MS Tiempo Fase móvil A Fase móvil B (min) (%) (%) 0 98 2 10 98 2 160 65 35 180 50 50 200 2 98 210 2 98 212 98 2 222 98 2 222.1 A to Teóricamente, la molécula de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 tiene 332 aminoácidos en su cadena ligera y 573 aminoácidos en su cadena pesada. El mapa de péptido mediante LC-MS reportada los aminoácidos observados y sus secuencias. Las Tablas 20-22 muestran los resultados de LC/MS de los péptidos de la cadena ligera y de la cadena pesada. Se detectan todos los aminoácidos de la cadena ligera y de la cadena pesada de DVD-lg. La masa observada coincide bastante bien con la masa teórica, y la diferencia es menor de 0.02 Daltons. La recuperación de secuencia total es de 100% para la DVD-lg. Aunque los residuos de lisina C-terminal son codificados para las cadenas pesadas, éstos pueden ser removidos en forma posterior a la traducción por la carboxipeptidasa B endógena expresada por las células hospederas. El mapa de péptido mediante LC-MS demuestra^que aunque está presente la lisina C-terminal, la mayoría del péptido C-terminal carece de lisina.
TABLA 19 Secuencias de la cadena ligera v pesada de DVD-lg D2E7-SL- HuB5.7 Cadena de DVD-lg SEQ ID NO Secuencia de aminoácido 1234567890123456789012345678901234567890 Ligera 126 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKP GKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDVA YYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPDVLMTQT PLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQ SPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED VGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC Pesada 127 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQA PGKGLEWVSAIT NSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVS SASTKGPEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYW LGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTTD TSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTY GQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSS STSGGTAALGCLVKDYFPEPV TABLA 20 Resultados de LC/MS de la cadena ligera de DVD-lg Péptido Secuencia de aminoácido Masa Teórica Masa Observada (desde - hasta) 1 l-18a 1877.88 1877.88 2 19-24 749.39 749.40 3 25-30 630.34 630.34 4 31-42 149 .76 1494.76 5 43-45 31 .20 31 .20 6 46-61 1674.93 1674.93 7 62-90 3187.43 3187.43 8 91-93 451.22 451.22 9 94-103 1068.52 1068.52 10 104-107 487.30 487.3 643.40 teó. 11 108-108b 174.11 643.40 observada 12 109-168 6540.29 6539.30 13 169-172 474.26 474.28 14 173-179 776.38 776.38 15 180-192 1302.61 1302.61 16 193-195 374.23 374.23 17 196-221 2909.32 ' 2909.32 . 18 222-225 487.30 487.30 2101.12 teó. 19 226-226c 174.11 2101.12 observada 20 227-244 1945.02 1945.02 21 245-260 1797.87 1797.87 22 261-263 346.19 346.19 23 264-267 559.31 559.31 24 268-287 2134.96 2134.96 25 288-301 1501.75 1501.75 26 302-306 624.28 624.28 27 307-308 283.16 283.16 28 309-325 1875.90 1874.92 29 326-329 522.26 522.28 869.33 teó. 30 330-332d 365.09 869.33 observada el extremo N-terminal b. el péptido 11 se observa como un digerido incompleto de la secuencia 104-108 c. el péptido 19 se observa como un digerido incompleto de la secuencia 226-244 d. el péptido 30 se observa como un digerido incompleto de la secuencia 326-332 Tabla 21 Péptido Secuencia de aminoácido Masa Teórica Masa Observada (desde - hasta) 1 l-16a 1623.86 1623.86 2 17-19 374.23 374.23 3 ' 20-38 2233.96 2233.96 4 39-43 499.28 499.28 5 44-67 2661.25 2661.24 6 68-72 622.34 622.34 |3265.58 teó. 7 73-76b 446.21 3265.58 observada 8 77-87 1337.68 i 1337.68 9 88-98 1290.54 1289.56 10 99-125 2807.39 2807.39 11 126-139 1439.76 1439.76 12 140-146 685.41 ; 685.41 13 147-150 493.22 ! 492.24 14 151-158 873.42 873.42 15 159-165 978.51 ; 978.51 16 166-190 2931.28 2931.28 17 191-192 293.17 293.17 IB 193-194 289.14 : 289.14 19 195-211 1888.91 ¡ 1888.91 20 212-214 374.23 ! 374.23 21 215-225 1320.53 ; 1319.55 22 226-247 2218.04 : 2218.04 23 248-259 1185.64 1185.64 24 260-273 1321.65 1320.67 25 274-336 6713.29 6713.30 26 337-339 360.20 360.20 ¡ 599.36 teó. 27 340-340 146.11 599.36 observada 28 341-344 471.27 ¡ 471.27 29 345-348 509.18 ; 509.18 30 349-374 2845.42 1 2845.42 Resultados de LC/MS de la cadena pesada de DVD-lq a. la columna 2 muestra el número de aminoácido comenzando desde el extremo N-terminal b. el péptido 7 se observa como un digerido incompleto de la secuencia 44-72 c. el péptido 27 se observa como un digerido incompleto de la secuencia 340-344 1 TABLA 22 ¡ Péptido Secuencia de aminoácido Masa Teórica Masa Observada (desde - hasta) I 834.43 31 375-3813 834.43 2139.00 32 382-400 2139.00 i 1676.79 33 401-414 1676.79 i 500.31 34 415-418 500.31 2633.04 35 419-427b N/A 1807.00 36 428-443 1807.00 j 438.21 37 444-446 438.21 307.12 38 447-448 307.12 446.25 39 449-452 446.25 837.50 40 453-460 837.50 447.27 41 461-464 447.27 217.14 42 465-466 217.14 456.24 43 467-470 456.24 1285.67 44 471-481 1285.67 604.31 45 482-486 604.31 1161.61 46 487-496 1161.61 47 497-518 2543.12 2543.13 48 519-535 1872.91 1872.91 49 536-540 574.33 574.33 50 541-542 261.14 261.14 51 543-565 2801.24 2801.24 52 566-572 659.35 659.35 52c 566-573 787.44 787.44 Resultados de LC/MS de la cadena pesada de DVD-lg (continued) a. la columna 2 muestra el número de aminoácido comenzando desde el extremo N-terminal. i b. el péptido 35 se observa como péptido con modificación de oligosacárido N-ligado. , c. se observa nivel bajo de Usina C-terminal. 1 EJEMPLO 2.4.9 Mapeo de puente de disulfuro a el mapeo del puente de disulfuro se efectúa mediante mapa de péptido de la DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 bajo condiciones no reductores. Se diluyen dos alícuotas de muestras de DVD-lg hasta 0.5 mg/mL con bicarbonato de amonio 50 mM y se desnaturalizan en RapiGest SF al 0.1% (Waters Corporation, parte no. 186001861) a 65°C durante 1 hora. El volumen total de cada muestra es 100 uL.
I Las muestras se digieren con tripsina (Promega, cat# V511A) y Lys-C (Roche Diagnostics, cat#. 11 047 825 001), respectivamente. La digestión con tripsina se efectúa a una relación de enzima a proteína de (p/p) de 1:6.25 y la digestión con Lys-C se efectúa a una relación de enzima a proteína de 1:20 (w/w), ambas a 37°C durante aproximadamente 17 horas. Las digestiones se detienen mediante adición de 1 µ? de TFA. The muestras se incuban a 37°C durante 30 minutos. Se observa una turbidez ligera. Las muestras después se centrifugan a 13,000 RPM durante 10 minutos. Losj subproductos hidrolíticos de RapiGest SF son inmiscibles en agua,1 y se observa algo de precipitación. El sobrenadante se transfiere a un frasco de muestra para análisis de LC/MS. Las muestras se separan mediante HPLC de fase inversa utilizando una columna Vydác C18 en el sistema para HPLC capilar Agilent 1200. El calentador |de la columna se ajusta a 60°C. La separación se corre con el mismo gradiente utilizado para el mapa de péptido mostrado en la Tabla 18, utilizando solución amortiguadora A (FA al 0.1% en) y solución amortiguadora B (FA al 0.1% en acetonitrilo) a una velocidad del flujo de 50 ML/minutos. El sistema para LC/MS Agilent 6510 Q-TOF se hace funcionar en modo de electro-aspersión positiva. El espectrómetro de masas se hace funcionar a un voltaje de aspersión de 5.0 kvoltios e intervalo de barrido de 200 a 3000 de relación masa a carga. Los puentes de disulfuro se asignan comparando los pesos moleculares observados de los péptidos con los pesos moleculares pronosticados péptidos trípticos o Lys-C ligados por puentes de disulfúro.
La DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 tiene un dominio variable adicional en ambas cadenas ligeras y cadenas i pesadas en comparación con una molécula de lgG1 típica. Los resultados experimentales del mapeo de puente de disulfuro dé la DVD-lg se presentan en forma resumida en la tabla 23. Cuando se combinan los resultados de digestión con tripsina y digestión clon Lys-C, se observan todos los péptidos ligados con disulfuro teóricos.
TABLA 23 Mapeo de puente de disulfuro de la DVD-lq D2E7-SL-Hu2B5.7 EJEMPLO 2.4.10 Determinación de sulfhidrilo libre I El método utilizado para cuantificar las cisternas libres en la DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 se basa en la reacción del reactivo de Ellman, 5,50-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), con los grupos sulfhidrilo (SH) lo cual da origen a un producto cromofórico característico, 5-tio-(ácido 2-nitrobenzoico) (TNB). La reacción se ilustra en la fórmula: 1 DTNB + RSH ® RS-TNB + TNB- + H + i La absorbancia del TNB- se mide a 412 nm utilizando un lectora de placa SPECTRA max Plus 384 (Molecular! Devices). Se gráfica una curva de absorbancia utilizando diluciones de 2 mercaptoetanol (ß-??) como el patrón de referencia de SH libre y las concentraciones de los grupos sulfhidrilo libres en la proteína se determinan a partir de la absorbancia a 412 nm de la muestra.
La solución de reserva del patrón de referencia ß-?? (Pierce, cat# 35602) se prepara mediante una dilución en serie de ß-ME 14.2 M con agua grado HPLC hasta una concentración final de 0.142 mM. Después se preparan patrones de referencia por triplicado para cada concentración. Las muestras se mezclan en una agitadora a temperatura ambiente durante 20 minutos (Tabla 24). Después de mezclado minucioso, las muestras y los patrones de 1 referencia se mezclan con 54 pL de Tris 100 mM, pH 8.1, y 90 pL d|e DTNB 2 mM (Sigma, D8130). La DO se mide para absorción a 4121 nm. La curva patrón se obtiene graficando la cantidad de SH libre y D0 12 nm de los patrones de referencia de ß-??. El contenido de SH libre de las muestras se calcula tomando como base esta curva después de restar el testigo.
TABLA 24 Esquema de preparación de la muestra y el control Muestra Volumen 20% Milli- Muestr Mezcla Volumen Muestra (preparada de la SDS Q a en final mg/mL 3xs) muestra agua nmol agitador a ¦ I Blanco 90 18 72 180 0.00 0.0 temp 54 90 324 Muestra 90 18 72 180 10.94 24.3 ambiente 54 90 324 DVD durante 1 20 minutos La curva patrón para la determinación de la concentración de sulfhidrilo libre cubre un intervalo de absorbancia a 412 nm desde 0.002 a 1.347 de DO. El coeficiente de correlación para los datos ajustados es de 0.994. Se preparan dos muestras por duplicado de la DVD-lg y se analizan. Los niveles de sulfhidrilo libre de las dos muestras por duplicado son de 0.35% y 0.63% respectivamente.
EJEMPLO 2.4.10 ; Cromatografía de intercambio catiónico débil i i La muestra de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 sé diluye hasta 1 mg/mL en solución amortiguadora A (Sodium phosphate dibasic 10 mM, pH 7.5), y se analizan utilizando un método ide HPLC de intercambio catiónico débil utilizando la columna ProPac WCX-10 (Dionex, ProPac WCX-10, producto no. 054993, 4 mm x 250 mm). La Tabla 25 muestra las condiciones de operación del sistema de HPLC para análisis WCX-10. Los resultados muestran que la DVD-lg tiene 19.3% de especies ácidos, 65.2% del pico mayor.i y 15.5% de especies básicas. j TABLA 25 Condiciones de operación del sistema de HPLC para análisis de WCX-10 EJEMPLO 2.4.11 Electroforesis de zona capilar La electroforesis de zona capilar es un método de i electroforesis capilar en el cual el capilar se llena solamente con solución amortiguadora. El mecanismo de separación se basa en diferencias en la movilidad electroforética del analito! La movilidad electroforética de una molécula se relaciona con la relación carga a tamaño. Se utiliza el aparato Beckman-Coulter ProteorjneLab PA 800 i para el análisis de CZE. Se utiliza un capilar neutro (eCAP neutral, 56 cm de longitud total, 50 pm de D.l. Beckman-Coulter, P/N 477441). El método utiliza un capilar de 30.2 cm con una ventana de detección de 20.2 cm desde la entrada de introducción de la muestra. La solución amortiguadora para corrida se prepara mezclando 5 mL de solución amortiguadora de citrato/MES (Beckman jCoulter, cat# 477443) con 0.5 mL de solución de MC al 1% (Convergent i Bioscience, cat# 101876) y se centrifuga a 10, 000 fpm durante 2 minutos. 1 i Los resultados muestran dos picos básicos que migran antes del pico mayor. Los picos corresponden a las¡ variantes de lisina. El pico principal muestra una cola en el lado ácido, la cual es ocasionada por especies ácidas que no se resuelven bi¡en a partir del j pico principal. i EJEMPLO 2.4.12 1 Determinación de oligosacárido Los oligosacáridos liberados después de tratamiento del anticuerpo con PNGasa F se cometen en derivados cón un reactivo para marcación 2-aminobenzamida (2-AB). Los oligosacáridos con marca fluorescente se separan mediante cromatografía ¡líquida de alto rendimiento en fase normal (NPHPLC) y las diferentes formas de oligosacáridos se caracterizan tomando como base la comparación i del tiempo de retención contra patrones de referencia conocidos.
La DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 se digiere: primero con PNGasa F para cortar de la porción Fe de la cadena pesada los oligosacáridos N-ligados. Se digieren 200 pg de DVD-I¡g con 3 pL de PNGasa F (Prozyme: cat#. GKE5006D) en presencia de 2.5 pL de N-octilglucósido al 10% (Sigma, cat# O8001). Se agrega agua Milli-Q para llevar el volumen final hasta 50 pL. La muestra sé incuba en un termomixer ajustado a 37°C y 700-800 RPM durante 17 ¡horas.
Después de desglucosilar, la proteína se precipita a 95°C durante 6 minutos. El tubo de la muestra se centrifuga !a 10,000 RPM durante 5 minutos. De sobrenadante se transfiere a un tubo de microcentrífuga y se coloca en una centrifuga speed vacuum. La solución se lleva a sequedad. La temperatura se ajusta|a temperatura i ambiente o hasta 30°C para acelerar el procedimiento, j Se utiliza el estuche para marcación con 2-AB de Prozyme para el paso de marcado. Para preparar el reactivo, se agregan 150 µ? de ácido acético (frasco C) a un frasco de DMSO (frasco B) y se mezcla bien mediante acción de remolino. Después se agregan 100 µ?_ de la mezcla ácido acético/DMSO aj un frasco del colorante 2-AB (frasco A) y se somete a acción de remolino hasta que el colorante se disuelve. El contenido completo de este frasco se ? agrega después al frasco de reductor (frasco D). ! La frasco se calienta a 65°C hasta que se disuelve, y después se mezcla con acción de remolino hasta que los contenidos , se disuelve completamente. Esto es el reactivo para marcado. Se agregan 10 pL I del reactivo para marcado a cada muestra de oligosácáridos seca. Los tubos de la muestra se someten a acción de remolino para tener los oligosácáridos secos en solución. Los tubos se centrifugan rápidamente para recolectar el volumen completo en el fondo. Estos después se colocan en un termomixer ajustado a 65°C y 750 RPM durante 2 horas.
Después que la muestra se marca, el reactivo fluorescente libre se elimina utilizando cartuchos GlycoClean S. Cada cartucho se lava con I 1 mL de agua Milli-Q y se deja drenar completamente. El lavado i acuoso es seguido 5 x 1 mL de ácido acético al 30% y se deja drenar i completamente. El cartucho se lava con 2 x 1 mL de acetonitrilo y se deja drenar completamente.
Después de marcar los oligosácáridos, cada tubo se centrifuga rápidamente para recolectar todo el volumen en el fondo del tubo. Todos los tubos se dejan enfriar hasta temperatura ambiente. Cada muestra se aplica en forma puntiforme en la membrana recién lavada del cartucho GlycoClean S,' en el que la muestra se distribuye a través de la superficie completa de la membrana. Cada tubo de la muestra se enjuaga con 20 µ?_ de acetonitrilo y el volumen se agrega a la membrana1 del cartucho correspondiente. Cada cartucho GlycoClean S se déjala temperatura i ambiente durante un mínimo de 15 minutos para permitir que los oligosacáridos marcados se adsorban sobre la membrana.
Cada cartucho se lava con 1 mL de acetonitrilo al 100% y se deja drenar completamente. Se agrega 5 x 1 mL de solución de acetonitrilo al 96%, dejando que cada alícuota se drene antes de que se aplique la siguiente. El flujo pasante se desecha. El volumen muerto del cartucho se elimina de la base del cartucho antes de i elusión de la muestra. Cada cartucho se coloca sobre un tubo de microcentrífuga de 1.5 mi marcado de manera apropiada. Los oligosacáridos marcados con 2-AB se eluyen con 3 x 400 pL de agua Milli-Q. i Cada muestra se diluye por un factor de 3.3 x con i acetonitrilo. Se mezclan 150 pL de la muestra dej oligosacárido I marcado con 2-AB eluida con 350 pL de acetonitrilo. Se inyectan 200 pL para análisis de HPLC. ! Los oligosacáridos se separan utilizando ! una columna Glycosep N HPLC (cat# GKI-4728) conectada a un sistema de HPLC Shimadzu. El sistema de HPLC Shimadzu consiste de un controlador del sistema, desgasificador, bombas binarias, dispositivo de auto-muestreo con un enfriador de la muestra, y con detector de i i fluorescencia . 1 Los resultados de la determ inación de perfil de oligosacárido de la DVD-lg D2E7-S L-H u2 B5.7 se m uestran en la Tabla 26. ! TABLA 26 Condiciones de HPLC para ei análisis de oligosacárido N-liqado Articulo Descripción/ Condiciones de Operación Columna GlycoSep™ N Guard, 4.6 x 10 mm \ Guardia, de la GlycoSep™ N, 4.6 x 250 mm | columna Fase móvil A 100% de acetonitrilo , Fase móvil B 50 mM de formiato de amonio, pH 4.4 \ Columna de 75% de acetonitrilo/agua | almacenamiento Tiempo (minutos) Fase móvil B% 0.01 35 5 35 75 40 95 40 Gradiente 100 100 105 100 107 35 127 35 127.1 Parar Velocidad de 0.40 mL/min flujo Longitud de 1 onda de 330 nm ( excitación Longitud de onda de 420 nm emisión Ganancia 4 1 Sensitividad Media ; Respuesta 1.5 seg ¡ ¡Temperatura de' Nominal 4°C | automuestreo' Temperatura del horno de 30°C i Columna Sarga de la 150 pL muestra Tiempo de 127.1 minutos ej ecución TABLA 27 Sumario de los resultados de la determinación dé perfil de oligosacárido EJEMPLO 2.4.13 i Dicroísmo circular ! La muestra de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 se diluye hasta 0.3 mg/mL con fosfato de sodio 5 mM pH 6.8. Primero se dializan 500 i µ? de la muestra contra fosfato de sodio 5 mM pH 6.8 durante 20 minutos a 4°C, y después se dializan contra la m!isma solución amortiguadora durante la noche a 4°C. Después que la muestra se recupera de los cassettes del aparato Slide-A-Lyzer, se mide la 1 absorbencia de la proteína A28o- Las muestras^ se diluyen adicionalmente hasta 0.15 mg/mL con el dializado y el' valor final de A28o es a 0.221 de DO. Se utiliza solución amortiguadora de fosfato de sodio 5 mM, pH 6.8 como el testigo de referencia para la sustracción del fondo. i Los espectros de UV lejano se obti!enen · en un espectropolarímetro Jasco J-810 utilizando un¡ alojamiento termostáticamente controlado a 20°C. Cada medición: de dicroísmo circular (CD) representada un promedio corregido de tres barridos de longitud de onda de 184-260 nm. La cámara de la celda se purga j continuamente con nitrógeno a través de todo el experimento. Los voltajes del detector HT[V] se mantienen por debajo de 600 voltios para evitar saturación de PMT.
Las diferencias en la estructura secundaria ¡de la proteína se miden tomando como base los espectros de dicroísmo circular distintivos en la región de ultravioleta lejano. La ¡ estructura a-helicoidal se caracteriza por una banda positiva fuerte aproximadamente a 190 nm y bandas negativas aproximadamente a 208 nm y 222 nm. La estructura de lámina ß se caracteriza por una banda positiva aproximadamente a 200 nm y una b¡anda negativa aproximadamente a 216 nm. La hélice aleatoria tiene una . banda negativa aproximadamente a 195 nm y una banda positiva aproximadamente a 220 nm. Los espectros de CD de la DVD-lg muestra una banda positiva aproximadamente a 200 nm y una banda negativa aproximadamente a 216 nm, lo cual és la rúbrica característica de la estructura de lámina ß. Los resultados i demuestran que la DVD-lg tiene una estructura secundaria de lámina ß. Existe una elipticidad pequeña positiva entre 230 hm y 240 nm.
Esta elipticidad positiva también se observa en Hu2B5.7, una de las moléculas progenitoras, pero no en D2E7, la otra molécula progenitora. Es posible que esta elasticidad positiva es'té relacionada con el plegamiento de la porción anti-PGE-2 de la molécula. j EJEMPLO 2.4.14 ¡ Calorimetría de barrido diferencial (DSC) Se efectúa calorimetría de barrido diferencial (DSC) sobre D2E7 y la DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 de conformidad con los métodos del Ejemplo 1.3.3.2.L. En contraste a los anticuerpos convencionales, las DVD-lgs contienen un dominio adicional que teóricamente se i puede desdoblar, es decir, un dominio VH1 y VL1 ¡adicional. Sin considerar traslape de las temperaturas de transición (Tm) de desdoblamiento (Tm) de los diversos dominios, se puéden esperar 4 transiciones de desdoblamiento que pueden ser caracterizadas mediante análisis de DSC. La DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 tiene 4 transiciones, las cuales se pueden determinar en 58.8°C, 68.6°C, i ; 75.0°C, y 83.4°C (Figura 6). Asimismo, estos datos demuestran que la molécula de DVD-lg tiene buena estabilidad conformacional intrínseca lo que la hace un muy buen candidato para desarrollo de producto exitoso, ya que ningún dominio de la molécula de DVD se desdobla antes de 58.8°C, lo cual es mucho más alto que la s e EJEMPLO 3.1 Métodos aplicados para caracterización biofisicoquímica y desarrollo de formulación ; Los criterios analizados varían desde parámetros de calidad generales (por ejemplo, contenido de pioteína, pH), parámetros que indican la estabilidad intrínseca (DSC), estabilidad I física (por ejemplo, contaminación de partícula y agregado insoluble y formación de precipitado monitoreado mediante inspección visual y conteo de partícula con oscurecimiento de luz, pureza incluyendo monitoreo de fragmentación y agregación mediante SÉC), y parámetros que indican la estabilidad química de la proteína (por i ejemplo, IEC para desamidación, oxidación, estabilidad química general; SEC). DI manera adicional, se determinan características importantes para una forma de dosificación superior; de productos biológicos tal como viscosidad de soluciones de iconcentración elevada a diversas temperaturas (viscosímetro de cono-aplaca).
Las partículas subvisibles se monitorean; utilizando el método de bloqueo del uso de conformidad con la Farmacopea de los EE.UU. (USP). Además, la estabilidad fisicoquímica de las formulaciones se evalúa mediante SEC la cual permitje la detección i de fragmentos y agregados. Para monitorear la estabilidad química, I se aplican cromatografía líquida a alta presión por; exclusión de tamaños (SE-HPLC) (detección de fragmentos y espécimen de hidrólisis) y CEX-HPLC (HPLC de intercambio catiónico). CEX-HPLC resuelve diferentes isoformas de lisina y productos de degradación (por ejemplo, especies desamidadas y oxidadas) que se pudieran haber formado durante el almacenamiento. j ! EJEMPLO 3.1.1 | Cromatografía por exclusión de tamaño (SIEC) i La cromatografía por exclusión de tamaños se utiliza para separar proteínas tomando como base el tamaño. Las proteínas se llevan a en una fase móvil acuosa y a través de una fase estacionaria porosa de resina empacada en una columna. El tiempo de retención i en la columna es una función del tamaño hidrodinámico de la i proteína y del tamaño de los poros en el lecho de resina empacada. Las moléculas más pequeñas pueden penetrar en poros más pequeños en la resina y son retenidas por más tiempo que las moléculas más grandes. Después de eluir de la columna las proteínas se detectan mediante absorbancia en UV. El método de SEC utiliza i una guarda de columna TSK (TOSOH Biosciences, Montgomeryville, PA, cat. no. 08543) y una columna de gel TSK G3000SWxL (TOSOH Biosciences, Montgomeryville, PA, cat. no. 08541). La| fase móvil es i Na2HP04 100 mM, Na2S04200 mM, pH 7.0. La velocidad de flujo es de 0.3 mL/minuto. El volumen de inyección es de 20 pL de una muestra de 1 mg/mL. La temperatura de la columna és temperatura ambiente. La temperatura del dispositivo de auto-muestreo es de 2- I 8°C. El tiempo de corrida total es de 50 minutos. La detección se basa en absorbancia en UV a una longitud de onda de 214 nm, con la anchura de banda fija a 8 nm, utilizando la longitud de onda de referencia a 360 nm con anchura de banda de 100 nm.
EJEMPLO 3.1.2 | Cromatografía de intercambio iónico (IEC) Columna Dionex Propac WCX-10 4x250mm, p/n 054993; guarda de 4x50mM, p/n 054994. Solución amortiguadora A: Na2HP04 I 10 mM, pH 7.5, solución amortiguadora B Na2HP04 lO mM, NaCI 500 mM, pH 5.5. Detección a 280 nm, temperatura de la columna 35°C, velocidad de flujo 1 mL/min.
TABLA 28 Gradiente de IEC Tiempo (min) %B 5 8 39 25 41 100 46 100 48 8 52 8 52.10 Parar EJEMPLO 3.1.3 Medición de niveles de partículas subvisibles El número de partículas subvisibles se: mide en un contador de partícula por bloqueo de luz KLOTZ en alineación con las recomendaciones de la Farmacopea de los EE.UU. Se ¡utilizan 3.5 mi de la muestra para llenar tubos de 5 mi de fondo ¡ redondo bajo i condiciones de flujo laminar de aire, y la medición se efectúa en i modo n = 3 (0.8 mL por medición individual) después de un enjuague i inicial de 0.8 mL por cada muestra. Los niveles de partícula provistos en las tablas se refieren al número de partículas por mL de solución de proteína. ] EJEMPLO 3.1.4 Inspección visual La solución de proteínas se inspecciona cuidadosamente i contra un fondo negro y un fondo blanco respecto a señales que indiquen y estabilidad física de la proteína tal como turbidez, enturbiamiento y formación de partículas. ! i i I EJEMPLO 3.1.5 ; í Solubilidad i La solubilidad de la proteína se evalúa en solución i amortiguadora de pH 6 (Histidina 15 mM) concentrando la proteína i hasta 100 mg/mL. ¡ EJEMPLO 3.1.6 Viscosidad de la proteína La viscosidad de la proteína se evalúa en un reómetro Brookfieid de cono y placa a una velocidad de esfuerzo cortante de 100/s entre 8 a 25°C. i ; EJEMPLO 3.1.7 ¡ DSC La estabilidad térmica se evalúa utilizando ún instrumento i para DSC. El instrumento para DSC utilizado es; un VP-DSC I automatizado con celda capilar (Microcal). Se¡ estudia el desdoblamiento de las moléculas aplicando una velocidad de barrido de 1°C/minuto a través de un intervalo de temperatura de 25°C - 95°C para muestra a 1 mg/mL. Los parámetros de medición adicionales son: periodo de ajuste: 16 segundos, espera de pre-barrido: 10 minutos, modo de retroalimentación: ninguno. Por cada medición individual, se utilizan 420 µ? de muestra/testigo para llenar el contenedor de muestra para medición de DSC, con uh esquema de llenado de la placa como se provee más adelante. Los termogramas obtenidos de esta manera se ajustan a un modelo nó de tipo dos estados para obtener las tem peratu ras y entalpias del punto medio de las diferentes tra nsiciones.
Ejem plo 3.2 · Desarrollo del análisis de formulación de DVD-lg D2E7-S L-H u2 B5.7 I EJEMPLO 3.2.1 ! Estabilidad de soluciones de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 a través de un intervalo amplio de pH a las condiciones de almacenamiento recomendadas y aceleradas La estabilidad de la proteína se evalúa a 2mg/ml én un sistema amortiguador de fosfato 1 0 mM , citrate 10 mM dentro de un intervalo i de valores de pH de pH 4 a pH 9. Los estudios de estabilidad se efectúan a la temperatura de almacenamiento recomendada (2-8°C) y a condiciones aceleradas (40°C) hasta por lo menos 3 mese. En términos generales, la estabilidad fisicoquímica de las proteínas es altamente dependiente de las condiciones de pH y temperaturas a las cuales éstas se almacenan y/o formulan . Dichas condiciones de estrés pueden dar como resultado inestabilidades tales como, por ejemplo, agregación , desamidación , etc. , durante el almacenamiento y pueden afectar severamente la seguridad , eficacia y cualidad general del producto. Generalmente se acepta que proveen un producto farmacéutico segu ro, estable basado en proteínas grandes es u na tarea desafiante, y con mucha frecuencia , la inestabilidad de la i i proteína requiere de Mof ¡lización del producto para mantener la estabilidad a través de períodos más largos de tiempo. No es raro i que los candidatos para desarrollo biológico que sean muy prometedores en modelos pre-clínicos fallen en el desarrollo clínico debido a estabilidad inadecuada.
TABLA 29 i Niveles de monómero. agregado v fragmentos en muestras de i DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 en la estabilidad según se determina mediante SEC (tiempo de almacenamiento 3 meses) TABLA 30 Formación de isoformas ácidas y básicas en m uestras en estabilidad según se determina mediante I EX (tiem po de almacenamiento 3 meses) \ Las Tablas 29 y 30 proveen los resultados del análisis de estabilidad con SEC e I EX para almacenamiento de hasta 3 meses de DVD-lg D2E7-SL-H u2B5.7 a través del perfil de pH muy amplio, y muestran los niveles de monómero y espécimen ; de isoforma principal , respectivamente, con el tiempo. La Tabla 29 demuestra q ue DVD-lg D2E7-SL-H u2B5.7 revela niveles de monómerb virtuaimente idénticos a través de un pH de solución que varía désele pH 4 hasta pH 9. Todas las formulaciones revelan niveles de monómero claramente por encima de un nivel de calidad de monómero de 90% (indicativo de muy buena estabilidad, incluso a través de los 3 meses i de análisis en tiempo real). Las formulaciones realmente mantienen estabilidad a largo plazo de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 hasta un grado que incluso se podría satisfacer una especificación de calidad extremadamente estricta para análisis de estabilidad en tiempo real de más de 90%. De manera similar, el decremento dej la estabilidad que indica que la isoforma principal es menos de 5% ¡después de 3 meses de almacenamiento a través de intervalos de pH más amplios. Por lo tanto, las formulaciones de la invención pueden proveer estabilidad física y química a través de un intervalo muy amplio de concentración de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 y a través de un tiempo prolongado con respecto también al nivel de monómero. Esto es muy sorpresivo, debido a que es bien aceptado en la comunidad científica I que la inestabilidad física (que conduce a un décremento de I monómero) se ve fuertemente afectada por el pH de la solución y que i las proteínas normalmente son estables sólo dentro d¡e un intervalo i de pH muy estrecho. ¡ EJEMPLO 3.2.2 Estabilidad de soluciones de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 a través de un intervalo amplio de pH durante el procesamiento de descongelación-congelación 1 La estabilidad de proteínas se evalúa a 1 mg/ml sistemas amortig uadores de fosfato 1 0 m M , citrato 1 0 m M a varios valores de pH entre pH 4 a pH 9 estudios de congelación-descongelación q ue se efectúan siguiendo un procedim iento estándar. E l congelam iento se efectúan m anteniendo las m uestras a -80°C du ra nte por lo menos 6 horas . El descongelam iento se efectúan a 30°C en un baño de agua .
¡ En términos generales, las proteínas son susceptibles a inestabilidades físicas tales como agregación y formación de partícula subvisible debido a la desnaturalización que se puede presentar en la interfaz hielo-agua que se crea d urante: el proceso de congelamiento, o debido a una variedad de otros parámetros tales como desnaturalización en frío y/o crioconcentración . | Debido a q ue las proteínas normalmente se almacenan en forma congelada como sustancia farmacéutica a granel y como producto! farmacéutico ¡ liofil izado (lo cual incluye congelamiento como la primera operación unitaria del procesamiento) , la estabilidad du rante el procesamiento I de congelamiento/descongelamiento forma una parte integral de una característica de estabilidad de la proteína para ajustarse al cumplimiento con las operaciones de fabricación y req uerimientos de i estabilidad generales.
; TABLA 31 ' i Formación de agregados y fragmentos en muestras i des pués del i procesam iento de congelamiento/descongelamiento seg ún se determina mediante SEC (se efectúan cuatro ciclos de congelam iento/descongelamiento) I TABLA 32 í i Formación de partículas subvisibles mayores o ¡guales a 10 m ieras por sol ución de proteína M1 en muestras después del congelamiento/descongelamiento según se determi na mediante contador de partículas KLOTZ (se efectúan 4 ciclos de congela miento/des congelamiento) TABLA 33 | 1 i Inspección visual de muestras después del i congelam iento/descongelamiento (se efectúan 4 ciclos del congelamiento/descongelamiento). "Claro" significa que no se observan signos indicativos de inestabilidad física tal como formación turbio de partícula, nebulosidad, enturbamiento o turbidez y opalescencia incrementada j i i I I i 0 F/T 1 F/T 2 F/T 3 F/T 4. F/T pH 4 Claro Claro Cl'aro Claro Claro pH 5 Claro Claro Claro Claro Claro pH 6 Claro Claro Claro Claro Claro pH. 7 Claro Claro Claro Claro Claro pH 8 Claro ¦ Claro Claro Claro Claro pH 9 Claro Claro Claro Claro i Claro I Es bien sabido que el procesamiento de i congelamiento/descongelamiento puede dar como resultado desnaturalización sustancial de la proteína y agregación, lo que i resulta en la formación de agregados solubles e insolubles (Parborji et a., Pharm Res 11 (5) 1994). Se sabe que cantidades incluso mínimas de proteína (<0.1%) dan razón de la precipitación (Hoffman, Analytical methods and stability testing of biopharmaceuticals, in í Protein formulation and delivery, ed. by McNally, E. JJ, 3 (2000) 71-110). Todas las formulaciones presentadas en la presente solicitud se ! someten a procesamiento de congelación-descongelación repetida y i los resultados demuestran que ninguna de las formulaciones son sensibles a ciclos repetidos de congelamiento/descongelamiento (- 80°C/30°C). Todas las formulaciones de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 i son similarmente estables independientemente de su pH (en todos los I cambios no se presenta cambio significativo en comparación con los valores iniciales) a pesar del pH más alto de las formulaciones, lo i cual está más cerca del pl de la DVD-lg D2E7-SL;-Hu2B5.7. De manera sorpresiva, las formulaciones de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 son físicamente estables hasta por al menos cuatro ciclos de j congelación-descongelación (todas las muestras revelan niveles de monómero que superan un nivel de calidad de 90%), Jos niveles de partícula subvisible (todas las muestras están en cumplimiento con los requerimientos de número de partícula subvisible establecidos por las farmacopeas norteamericana y europea para formas de dosificación parenteral de volumen bajo), y los datos !de inspección I . visual (todas las muestras se observan libres de partículas y de inestabilidad física).
EJEMPLO 3.2.3 ¡ i Estabilidad de soluciones de DVD-lg anti-TNF-anti-PGE2 a varias formulaciones seleccionadas durante las mediciones de DSC La estabilidad térmica de 1 mg/ml de DVD-lg anti-TNF-anti-PGE2 entre pH 4 a pH 8 se evalúa utilizando un instrumento para DSC. La estabilidad térmica tal como se evalúa mediante DSC se I correlaciona con la estabilidad cinética de las moléculas de proteína durante el almacenamiento. j i TABLA 34 ! i Temperaturas de punto medio de las cuatro transiciones de desdoblamiento en sistemas amortiguadores de citrato 10 m M y fosfato 10 mM a diferentes valores de pH para la molécula de DVD-lg anti-TNF-anti-PGE2 con un enlazador largo y enlazador corto í Se puede mostrar que son requeridas temperaturas altas I (que estén muy por encima de las temperaturas de almacenamiento I recomendadas de un producto de DVD-lg anti-TNF/anti-PGE2) para inducir el desdoblamiento forzado de los dominios de DVD-lg anti-TN F/anti-PGE2, independientemente de las moléculas dé DVD-lg anti-TN F/anti-PGE2 con enlazador corto o enlazador largo. | EJ EM PLO 3.2.4 | Estabi lidad de soluciones de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 a 1 0 mq/m l durante el procesamiento de congelación-descongelación También se evalúa la estabilidad de DVD-lg D2E7-SL- I Hu2B5.7 durante el estrés de congelación/descongelación a 10 mg/ml en solución amortiguadora a pH 6 (Histidina15 mM). Las muestras se congelan a -80°C y se les congelan en un baño de agua a 30°C.
TABLA 35 Formación de agregados v fragmentos en las muestras después de congelación/descongelación según se determina mediante SEC (se efectúan 3 ciclos 3 de congelación/descongelación) I I TABLA 36 i Inspección visual de muestras después del procesamiento de congelación/descongelación (se efectúan 3 ciclos de i congelación/descongelación de soluciones de DVD-lg anti-TNF- anti-PGE2 ¡ i 0 F/T 1 F/T 2 F/T 3 F/T pH 6 Claro Claro Claro Claro La formulación presentada en la presenté solicitud se somete a procesamiento de congelación-descongelación repetido y los resultados demuestran que DVD-lg D2E7-SL-HÚ2B5.7 no es sensible a inestabilidad como consecuencia de ciclos repetidos de congelación/descongelación (-80°C/30°C) a concentraciones de 10 mg/mL. se puede mostrar que las formulaciones de DV -lg anti-TNF- I anti-PGE2 son estables a 10 mg/mL hasta por al menos tres ciclos de i congelación-descongelación con respecto a estabilidad física (todas las muestras revelan niveles de monómero que exceden un nivel de calidad de 90%) y datos de inspección visual (todas las muestras se observan libres de partículas y de inestabilidad física). ! ; EJEMPLO 3.2.5 | Estabilidad de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 en varias formulaciones I a las condiciones almacenamiento recomendadas v aceleradas i La estabilidad de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7| se evalúa a 2 mg/ml a pH 6 bajo varias condiciones de formulación. Los estudios de estabilidad se efectúan a 2-8°C y 40°C. i I TABLA 37 Formación de agregados v fragmentos en muestras para estabilidad de DVD-lg anti-TNF-anti-PGE2 según se determina mediante SEC (hasta 3 mese de almacenamiento) La Tabla 37 provee los resultados del análisis ¡de SEC para hasta 3 meses de almacenamiento de DVD-lg anti-TNFi-anti-PGE2 en formulaciones seleccionadas, que muestran los nivelesjde monomero i con el tiempo. La Tabla 37 demuestran que las formulaciones de DVD-lg anti-TNF-anti-PGE2 revelan niveles virtualmente idénticos de i monomero lo que indica alta estabilidad y robustez dé formulación, debido a que todas las formulaciones revelan nivelesjde monómero i claramente por encima de un nivel de calidad de 90%¡de monómero i (indicativo de una muy buena estabilidad, incluso a través de los 3 meses de análisis en tiempo real). Las formulaciones realmente mantienen estabilidad a largo plazo de DVD-lg D2E7-SL-Hu2B5.7 hasta un grado tal que se podría cumplir con especiificaciones de i calidad extremadamente estrictas para análisis de éstabilidad en tiempo real de niveles de monómero de más de 90%.
TABLA 38 Temperaturas de punto medio de las cuatro transiciones de I desdoblamiento bajo condiciones de formulación diferentes a pH I 6 según se determina mediante DSC ¡ Se requieren temperaturas elevadas (que estén muy por encima de las temperaturas de almacenamiento recomendadas de un producto de DVD-lg anti-TNF-anti-PGE2) para: inducir el desdoblamiento forzado de los dominios de las formulaciones de I DVD-lg anti-TNF-anti-PGE2. ¡ i EJEMPLO 4 i i 1 Generación y caracterización de inmunoqlobulinas de dominio variable dual adicionales (DVD-lg) específicas paira PGE2 y segundo objetivo j i j Se generan inmunoglobulinas de dominio variable dual (DVD-lg) utilizando anticuerpos progenitores con secuencias de I aminoácido conocidas sintetizando fragmentos de poli ucleótido que codifican para las secuencias de cadena variable de DVD-lg y cadena ligera variable de DVD-lg y clonando los fragmentos! en un vector i pHybC-D2 de conformidad con el Ejemplo 1.4.4.1. Las construcciones de DVD-lg se clonan en y se expresan en células 1293 como se describe en el Ejemplo 1,4.4.2. La proteína de DVD-lg jse purifica de conformidad con métodos estándar. Las características funcionales i se determinan de conformidad con los métodos descritos en el I Ejemplo 1.1.1 y 1.1.2 como se indica. j Los siguientes ejemplos comprenden dos tablas cada uno.
La primera tabla en cada ejemplo contienen las secuencias de VH y VL de dos anticuerpos progenitores utilizados para generar las DVD- i Igs. La segunda tabla en cada ejemplo contiene las secuencias de las cadenas de VH y VL de DVD-lg que se construyen a partir de las secuencias de la primera tabla. j EJEMPLO 4.1 | i Generación de VEGF v PGE2 I I TABLA 39 SEQ Nombre Nombre Nombre Secuencia ID de de de NO. Dominio Dominio Dominio 1234567890123456789012345678901234 Variable Variable Variable DVD Externo Interno 128 VD162H AB014VH AB048VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGM N VRQAPG GLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRF i TFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHY YGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVQS GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLGWVRQAP GQGLE MGDIYPGYDYTHYNÉKFKDRVTLTTDTS TSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQG TLVTVSS ! 129 VD162L AB014 L AB048VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLN WYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSG I TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGT i KVEIKRTVAAPDVLMTQTPLSLPVTPGEPASISC I i TSSQNIVHSNGNTYLE YLQ PGQSPQLLIYKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY I YCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 130 VD161H AB048VH AB014VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKY L G VRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRV EJEMPLO 4.2 ¡ Generación de DVD-lgs para NGF y PGE2 TABLA 40 SEQ Nombre Nombre Nombre Secuencia j ID de de de 1 NO. Dominio Dominio Dominio 12345678901234567890123456789012345 Variable Variable Variable i DVD Externo Interno ! 132 VD164H AB020VH AB048VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLN WIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTIS í KDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATS 1 YYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVQSGAEVKK PGASVKVSCKASGYTFTKYWLGWVRQAPGQGLEWM GDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTTDTSTSTAYMEL 1 RSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS i 133 VD164L AB020VL AB048VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSiSNNLNW YQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTD FTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLE 1 IKRTVAAPDVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQ NIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSG ! VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVS HVPYTFGGGTKVEIKR ] 1 134 VD163H AB048VH AB020VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLG 1 WVRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTL TTDTSTSTAY ELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTY 1 1 WGQGTLVTVSSASTKGPQVQLQESGPGLVKPSETL SLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLE IGIIWG ¡ DGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAA VTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSS ! EJEM PLO 4.3 Generación de DVD-lgs para 1L-1 7A y PGÉ2 TABLA 41 i SEQ Nombre Nombre Nombre Secuencia ID de de de NO. Dominio Dominio Dominio 12345678901234567890123456789012345 Variable Variable Variable DVD Externo Interno 136 VD156H AB029VH AB0 8VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMN WVRQAPGKGLEWVAAINQVGSEKYYVGSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDYYDILT DYYIHYWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPEVQLVQS GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLGWVRQAPG QGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFDKRVTLTTDTSTS TAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQGTLV TVSS ; 137 VD156L AB029VL AB0 8VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGT DFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPCTFGQGTRL EIKRTVAAPDVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSS QNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQV SHVPYTFGGGTKVEIKR 138 VD155H AB048VH AB029VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGITFTKYWLG WVRQAPGQGLEW GDIYPGYDYTHYNEKF DRVTL TTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTY WGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVESGGGLVQPGGSL RLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVAAINQ DGSEKYYVGSVKGRFTISRDNÁKNSLYLQMNSLRV EDTAVYYCVRDYYDILTDYYIHYWYFDLWGRGTLV TVSS i 139 VD155L AB0 8VL AB029VL DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGG GTQVEIKRTVAAPEIVLTQSPGTLSLSPGERATLS CRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRIÍEPEDFAVYYCQQY GSSPCTFGQGTRLEIKR ' ? EJ EM PLO 4.4 Generación de DVD- lqs pa ra IL-1 b y PG E2 (séc. 1 ) TABLA 42 SEQ Nombre Nombre Nombre Secuencia | ID de de de i NO. Dominio Dominio Dominio 12345678901234567890123456789012345 1 Variable Variable Variable DVD Externo Interno i ¡ 140 VD158H AB032VH AB048VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSVYGMN 1 WVRQAPGKGLEWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVYYCARDLRTGPF DYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVQSGAEVKKPGA SVKVSCKASGYTFTKYWLGWVRQAPGQGLEWMGDI 1 YPGYDITHYNEKFKDRVTLTTDTSTSTAYMELRSL 1 RSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 1 141 VD158L AB032VL AB048VL EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHW 1 YQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTD i FTLTINSLEAEDAAAYYCHQSSSLPFTFGPGTKVD IKRTVAAPDVL TQTPLSLPVTPGE ASISCTSSQ NIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVS HVPYTFGGGTKVEIKR ! 142 VD157H AB048 H AB032VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLG WVRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTL TTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTY WGQGTLVTVSSASTKGPQVLQVESGGGVVQPGRSL RLSCAASGFTFSVYGMN VRQAPGKGLEWVAIIWY 1 DGDNQYYADSVKGRFTISRD^SKNTLYLQMNGLRA 1 EDTAVYYCARDLRTGPFDYWÓQGTLVTVSS 143 VD157L AB048VL AB032VL DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQ IVHSNGN EJEMPLO 4.5 j i Generación de DVD-lgs para IL-6 v PGE2 TABLA 43 SEQ Nombre Nombre Nombre Secuencia ID de de de ! NO. Dominio Dominio Dominio 12345678901234567890123456789012345 Variable Variable Variable DVD Externo Interno 144 VD250H AB040VH AB048VH QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTNGMG VSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDEDKRYNPSLKSRLT ISKDTSNNQVFLKITNVDTADTATYYCARRRIIYD VEDYFDYWGQTTLTVSSASTKGPEQVQLVQSGAEV KKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLGWVRQAPGQGLE WMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTTDTSTSTAYM ELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 145 VD250L AB0 0VL AB048VL QIVLIQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWY QQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSY SLTISRMEAEDAATYYCQQWSGYPYTFGGGTKLEI KRTVAAPDVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQN IVHSNGNTYLE YLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVÉAEDVGVYYCFQVSH VPYTFGGGTKVEI R 1 146 VD249H AB048VH AB040VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLG VRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTL TTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTY GQGTLVTVSSASTKGPQVTLKESGPGILQPSQTL SLTCSFSGFSLSTNG GVSWIRQPSGKGLEWLAHT Y DEDKRYNPSLKSRLTISKDTSNNQVFLKITNVD TADTATYYCARRRIIYDVEDYFDYWGQGTTLTVSS 147 VD249L AB048VL AB040VL DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGG GTKVEIKRTVAAPQIVLIQSPAIMSASPGEKVTMT CSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGV PVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSG YPYTFGGGTKLEIKR i EJEMPLO 4.6 ¡ Generación de DVD-lqs para Abeta (sec. 1 ) y PGE2 TABLA 44 SEQ Nombre Nombre Nombre Secuencia ¡ 1 ID de de de NO. Dominio Dominio Dominio 12345678901234567890123456789012345 Variable Variable Variable DVD Externo Interno i 148 VD227H AB0 3VH AB048VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMS WVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDtAVYYCVRYDHYSGS 1 SDYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVQSGAEVKKPG ASVKVSCKASGYTFTKYWLGWVRQAPGQGLEWMGD IYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTTDTSTSTAYMELRS LRSDDTAVYYCARSDGSSTY^GQGTLVTVSS 149 VD227L AB043VL AB0 8VL DVVMTQSPLSLPVTPGEPASÍSCKSSQSLLDSDGK GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC QGTHFPRTFGQ GTKVEIKRTVAAPDVLMTQTPLSLPVTPGEPASIS 1 CTSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFT¿KISRVEAEDVGVYY CFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 150 VD228H AB048VH AB043VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLG WVRQAPGQGLE MGDIYPGYDYTHYNEKF DRVTL ! TTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTY WGQGTLVTVSSASTKGPEVQ¿LESGGGLVQPGGSL RLSCAASGFTFSNYGMS VRQAPGKGLE VASIRS GGGRTYYSDNVKGRFTISRD SKNTLYLQ NSLRA EDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTLVTVSS 151 VD228L AB048VL AB043VL DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNUVHSNGN 1 EJEMPLO 4.7 I Generación de DVD-lgs para Abeta (sec.2) v PGE2 TABLA 45 I i j EJ EM PLO 4.8 Generación de DVD-lgs para Abeta (sec. 3) y PGE2 TABLA 46 SEQ Nombre Nombre Nombre Secuencia ID de de 1 de NO. Dominio Dominio Dominio 12345678901234567890Í23456789012345 Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1 i 156 VD213H AB045VH AB048VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMS 1 WVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTI 1 SRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQG TLVTVSSASTKGPEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC KASGYTFTKYWLGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGYDY 1 THYNE FKDRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTA VYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 157 VD213L AB045VL AB048 L DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGD TYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVP TFGG I GTKVEIKRTVAAPDVLMTQTPLSLPVTPGEPASIS 1 CTSSQNIVHSNGNTYLE YLQKPGQSPQLLIYKVS 1 NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY 1 CFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 158 VD214H AB048VH AB045VH EVQLVQSGAEVK PGASVKVSCKASGYTFT Y LG WVRQAPGQGLEWMGDIYPGYDiYTHYNEKF DRVTL TTDTSTSTAY ELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTY 1 WGQGTLVTVSSASTKGPEVQI1VESGGGLVQPGGSL RLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINS NGGSTYYPDSVKGRFTISRD AKNTLYLQMNSLRA 1 EDTAVYYCASGDYWGQGTLVTVSS 159 VD214L AB0 8VL AB045VL DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGN EJEMPLO 4.9 i Generación de DVD-lgs para IL-1 8 y PGE2 I TABLA 47 1 TABLA 47 i I EJEMPLO 4.10 Generación de DVD-lqs para IL-15 y PGE2 TABLA 48 ' i i EJEMPLO 4.11 Generación de DVD-lqs para S1P y PGE2 TABLA 49 ! EJEMPLO 4.1 2 Generación de DVD-lqs para 1L-6R y PGE2 TABLA 50 SEQ Nombre Nombre Nombre Secuencia ; ID de de de 1 NO. Dominio Dominio Dominio 12345678901234567890123456789012345 Variable Variable Variable i DVD Externo Interno 172 VD152H AB054VH AB0 8VH EVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAW SWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNPSLKSRVTM LRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTA DYWGQGSLVTVSSASTKGPEVQLVQSGAEV KPG ASVKVSCKASGYTFTKYWLGWVRQAPGQGLEWMGD IYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTTDTSTSTAYMELRS LRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 173 VD152L AB054VL AB0 8VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNW YQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTD FTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVE I RTVAAPDVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQ NIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIY VSNRFSG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVS HVPYTFGGGTKVEIKR ! 174 VD151H AB048VH AB054VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLG VRQAPGQGLE MGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTL TTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTY WGQGTLVTVSSASTKGPEVQLQESGPGLVRPSQTL SLTCTVSGYSITSDHAWSWVí^QPPGRGLEWIGYIS YSGITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTA ADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSS 15 VD151L AB048VL AB054VL DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGN TYLE YLQKPGQSPQLLIY VSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGG GT VEIKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSG VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGN EJEMPLO 4.13 j i Secuencias de vector de clonación utilizadas para clonar las i I secuencias de anticuerpo progenitor y DVD-lg ¡ TABLA 51 EJEMPLO 5 Pruebas utilizadas para identificar y caracterizar anticuerpos progenitores y DVD-lgs j i I I Las siguientes pruebas se utilizan para; identificar y caracterizar anticuerpos progenitores y DVD-lg, a menos que se i indique de otra manera. ¡ EJEMPLO 5.1 ! Pruebas utilizadas para determinar la unión v afinidad de anticuerpos progenitores v DVD-lg para su(s) antígeno(s) objetivo I I i I EJEMPLO 5.1.1 ELISA de unión dirigida ¡ Las pruebas de inmunosorbente ligado a¡ enzima para tamizaje respecto a anticuerpos que se unan a un antígeno objetivo I deseado se efectúan de la siguiente manera. Se revisten placas de unión alta de ELISA (Corning Costar # 3369, ActonJ MA) con 100 L/cavidad de 10 pg/ml del antígeno objetivo deseado (¡R&D Systems, Minneapolis, MN) o proteína de fusión de dominio extrácelular/Fc del antígeno objetivo deseado (R&D Systems, Minneapolis, MN) o anticuerpo monoclonal de ratón anti-polihistidina (R&D Systems # AB050, Minneapolis, MN) en solución salina amortiguada con fosfatos (PBS 10X, Abbott Bioresearch Center, Media Prep# MPS-073, Worcester, MA) durante la noche a 4°C. Las placas se lavan cuatro veces con PBS que contiene 0.02% de Tween 20. Las placas se bloquean mediante adición de 300 L/cavidad devolución para bloqueo (leche en polvo secar descremada, varios] proveedores, i diluida hasta 2% en PBS) durante 1/2 hora a temperatura ambiente. i Las placas se lavan cuatro veces después de bloquear con PBS que contiene 0.02% de Tween 20. ' i De manera alternativa, se agregan 100 µ? por cavidad de 10 Mg/ml del antígeno objetivo deseado marcado con jhistidina (His) (R&D Systems, Minneapolis, MN) a placas de ELISA revestidas con ¡ I anticuerpo monoclonal de ratón anti-poliHistidina como se describió anteriormente y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.
Las cavidades se lavan cuatro veces con PBS que contiene 0.02% de Tween 20. I i Se agregan cien microlitros de preparaciones de anticuerpo o DVD-lg diluidas en solución para bloqueo como se ! describió anteriormente a la placa de antígeno objetijvo deseada o placa de proteína de fusión antígeno objetivo deseado/Fc o la placa i de antígeno objetivo deseado marcado con His/anticuerpo anti-poliHistidina preparada como se describió anteriormente y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavan cuatro veces con PBS que contiene 0.02% de Tween 20.
Se agregan cien microlitros de anticuerpo de cabra conjugado con HRP específico de Fc-anti-lgG de humano a 10 ng/ml (Southern Blotech # 2040-05, Birmingham, AL) a cada cavidad de la placa de antígeno objetivo deseado o la placa de anticuerpo anti-poliHistidina/antígeno objetivo deseado marcado con! histidina. De manera alternativa, se agregan cien microlitros de 10 ng/mL anticuerpo de cabra conjugado con HRP específico |de la cadena ligera capa-anti-lgG de humano a 10 ng/mL (Southern Biotech # 2060-05 Birmingham, AL) a cada cavidad de la placa de fusión de Fc/antígeno objetivo deseado y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan cuatro veces 4 veces con PBS que contiene 0.02% de Tween 20. ! Se agregan cien microlitros de solución de TMB mejorada (Neogen Corp. #308177, K Blue, Lexington, KY) a cada cavidad y se I incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detiene mediante adición de 50 µ? de ácido sulfúrico 1N. Las placas se leen espectrofotométricamente a una longitud de onda de 450 nm.
La Tabla 52 contiene una lista de los antígenos utilizados en la prueba de unión directa. ¡ La Tabla 53 contiene los datos de unión expresados como CE50 en nM para aquellos a anticuerpos y construcciorjies de DVD-lg analizados en la prueba de ELISA de unión directa. ¡ i En la prueba ELISA de unión directa) en algunas ocasiones no se observa la unión, probablemente debido a que el i sitio de unión a anticuerpo en el antígeno objetivo estaba ya sea "enmascarado" o el antígeno se "distorsionó" cuando se aplicó como revestimiento a la superficie de plástico. La incapacidad de una DVD-lg de unirse a su objetivo también se puede deber a limitación i estérica en la DVD-lg DVD-lg por el formato de EÜSA de unión directa. Los anticuerpos progenitores y las DVD-lgs que no se unen en el formato de ELISA de unión directa se unen al antígeno objetivo en otros formatos de ELISA, tales como FACS, Biacore o bioensayo.
La no unión de una DVD-lg también se restaura ajustando la longitud i del enlazador entre los dos dominios variables de la DVD-lg, como se mostró previamente.
TABLA 52 Antígenos utilizados en la prueba ELISA de unión directa ! /ECD= Dominio extracelular ! /FC = Fusión de región Fe i i i TABLA 53 I Prueba de ELISA de unión directa de anticuerpos progenitores v construcciones de DVD La unión de todas las construcciones de DVD se mantiene y es comparable con los anticuerpos progenitores. Todos los i dominios variables N-terminales se unen con una afinidad alta similar a la del progenitor.
EJEMPLO 5.1.2 Determinación de afinidad utilizando tecnología BIACORE TABLA 54 ! i Reactivo utilizado en el análisis Biacoré ECD = Dominio extracelular ¡ i /FC = proteína de fusión dominio de Fe de lgG/antígeno| Métodos BIACORE ¡ La prueba BIAcore (Biacore, Inc, Piscataway, NJ) determina la afinidad de los anticuerpos o DVD-lg con mediciones cinéticas de las constantes de velocidad de asociación y velocidad de disociación. La unión de los anticuerpos o DVD-lg a un antígeno objetivo (por ejemplo, un antígeno objetivo recombinante purificado) se determina mediante mediciones basadas en resonancia de plasmón de superficie con un instrumento Biacore® j 1000 o 3000 (Biacore® AB, Uppsala, Suecia) utilizando HBS-EP! para corrida I (HEPES 10 mM [pH 7.4], NaCI 150 mM, EDTA 3 mMj y 0.005% de agente tensoactivo P20) a 25°C. Todos los productos químicos se obtienen a partir de Biacore® AB (Uppsala, Suecia) o de algún otro modo a partir de una fuente diferente como se describe en el texto. i Por ejemplo, se inmovilizan aproximadamente 5000 UR anticuerpo policlonal de cabra específico del fragmento (Fcy), anti-lgG de ratón (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL) diluidos en acetato de sodio 10 mM (pH 4.5) directamente a través de un chip biósensor grado ¡ investigación CM5 utilizando un estuche de copulación de amina estándar de conformidad con las instrucciones y procedimientos del ? fabricante a 25 µ g /rh I . Las porciones sin reaccionar ejn la su perficie i del biosensor se bloq uean con etanolam ina. Se | utiliza como superficie de reacción una su perficie de carboximetil-dextrano m odificada en las celdas de flujo 2 y 4. El carboximetil-dextrano no modificado sin anti-lgG de ratón / de cabra en las celdas de flujo 1 y 3 se utiliza como la superficie de referencia . Para el anjálisis cinético, las ecuaciones de velocidad derivadas del modelo dé unión 1 : 1 de Langmuir se ajusta simultáneamente a las fases de asociación y disociación de todas las ocho inyecciones (utilizando análisis de i ajuste global) con el uso del software Biaevaluatibn 4.0.1 . Los anticuerpos o DVD-lg purificados se diluyen en solución salina amortig uada con H EPES para captura a través de las ¡ superficies de reacción específicas de anti-lgG de ratón , de cabra. Los anticuerpos i o DVD-lg que se van a capturar como un ligando ¡(25 pg/ml) se inyectan sobre las matrices de reacción a una velocidad de flujo de 5 µ?/min. Las constantes de velocidad de asociación y disociación , kaSoc (M" 1 S 1 ) y kd i soc (s" ) se determinan bajo una velocidad de flujo i continuo de 25 µ?/min . Las constantes de velocidad se derivan haciendo mediciones de unión cinética a diferentes concentraciones de antígeno que varían desde 1 0 - 200 nM . La constante de kdisoc kasoc - La unión se registra con una función del tiempo y se i calculan las constantes de velocidad cinética. En esta prueba , se I pueden medir velocidades de asociación tan rápidas cómo 106 M"1S"1 y velocidades de disociación tan bajas como 10"6 s"1. j i ¡ TABLA 55 Análisis BIACORE de anticuerpos progenitores v construcciones 1 de DVD ¡ La unión de todas las construcciones de DVD-lg caracterizada mediante tecnología BIAcore se mantiene y es ?. comparable con la de los anticuerpos progenitores. Todos los i ¡ dominios variables N-terminales se unen con una afinidad alta similar i a la del anticuerpo progenitor. ! EJEMPLO 5.1.3 j Bioensavo v prueba de neutralización de IL-?a/ß j Se siembran células MRC5 a 1.5-2 x 1Ó4 células por cavidad en un volumen de 100 pL y se incuban durante la noche a ¡ 37°C, 5% de C02. Se prepara una solución de reserva! de anticuerpo para trabajo de 20 pg/mL (concentrada 4x) en medio MEM completo.
Se efectúa una dilución en serie de ocho puntos (5 (jg/mL- 0.0003 µg/mL) en MEM completo en-placas para dilución Mars¡h. Se agregan i 65 uL /cavidad de cada dilución de anticuerpo por cuadruplicado a una placa de 96 cavidades con fondo en forma de V (C'pstar# 3894) y i 65 pL de una solución 200 pg/mL de IL-1 a o i L- 1 ß oj65 pL de una ¡ solución mixta que contiene una solución 50 pg/mL tanto de IL-1a j como de I L- 1 ß . Las cavidades de control reciben 65 pL de una solución 200 pg/ml de IL-1 a o I L- 1 ß o una solución 50 pg/mL de IL- i 1a/ß mixta (concentrada 4x) más 65 µ?_ de medio MEM y las cavidades de control de medio reciben 130 µ?_ de medila. Después de 1 hora de incubación, se agregan 100 µ?_ de la mezcla Ab/Ag a las células MRC5. Todos los volúmenes de cavidad son iguales a 200 µ?_. Todos los reactivos de la placa se concentran después;a 1x. Después de un período de 16-20 horas de incubación, los contenidos de la cavidad (150 µ?_) se transfieren a una placa de 96 cavidades de fondo redondo (Costar# 3799) y se colocan en un congelador a -20°C. Los sobrenadantes se analizan respecto a los niveles de hjlL-8 utilizando un estuche ELISA para IL-8 de humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) o MSD hlL-8 (estuche para quimioluminiscencia). La potencia de neutralización se determina calculando el por ciento dei inhibición con i relación al valor de control de IL-1 a, l L- 1 ß , o el IL-la/ß ¡sólo.
! I TABLA 56 ! Prueba de neutralización de IL-1B con anticuerpo progenitor y i construcciones de DVD-lg para I L-1 ß ¡ ¡ ¡ Todas las DVD-lgs que contienen VDs ¡de AB032 en cualquier posición N-terminal o C-terminal muestran neutralización en la prueba de neutralización de I L-1 ?a/ß en MRC5. i i EJEMPLO 5.1.4 Bio-ensavo v prueba de neutralización de I L-17 ! La línea celular HS27 de humano (ATCC #CRL-1634) secreta IL-6 en respuesta a IL-17. La secreción de IL-6 inducida por i IL-17 es inhibida por anticuerpos neutralizantes antij-IL-17 (Véase, por ejemplo, J. Imm. 155:5483-5486, 1995 o Cytokijne 9:794-800, 1997). | Las células HS27 se mantienen en medio de prueba: medio DMEM con alto contenido'de glucosa (Gibco #11965) con 10% de suero fetal de bovino (Gibco#26140), L-glutamina 4 mM, piruvato de sodio 1 mM, penicilina G (100 U/500 mi) y estreptomicina (100 pg/500 mi). Las células se cultivan en matraces T150 hasta que estas tienen una confluencia de 80-90% el día de la prueba. IL-17 de I humano (R&D Systems, #317-IL/CF) se reconstituye n PBS estéril sin Ca2+ y Mg2+ se almacena congelado, se descongela al momento I del uso y se diluye hasta 40 ng/ml (4X) en medio de prueba. Se preparan diluciones en serie de los anticuerpos en una placa separada (a concentraciones 4X), se mezclan con un ¡volumen igual de 40 ng/ml (4X) de hulL-17 y se incuba a 37°C durante 1 hóra. Se i agregan células HS27 (típicamente alrededor de 20,000 células en 50 µ? de medio de prueba) a cada cavidad de una placa pjara cultivo del i I tejido de fondo plano de 96 cavidades (Costar #3599i), seguido por adición de 50 µ? de la mezcla de anticuerpo más IL-17¡ pre-incubada.
La concentración final de IL-17 es de 10 ng/ml. las célu'las se incuban j durante aproximadamente 24 horas a 37°C. Los sobrenadantes de los ¦ . i medios se recolectan después. El nivel de neutralización de lL-17 se mide mediante determinación de las cantidades dé IL-6 en el sobrenadante utilizando un estuche Meso Scale ¡Discovery de i conformidad con las instrucciones del fabricante. Los yalores de Cl50 i se obtienen utilizando el ajuste de la pendiente variablé del logaritmo del anticuerpo contra cantidad de IL-6 (Tabla 57). ¡ TABLA 57 i Prueba de neutralización de IL-17 con anticuerpo progenitor y i construcciones de DVD-lg para IL-17 i ! Todas DVD-lgs que contienen VDs de AB029 en cualquier posición N-terminal o C-terminal muestran neutralización en la prueba de neutralización de IL-17. j EJEMPLO 5.1.5 ' i Pruebas de inmunosorbente ligado a enzima para determinarla capacidad de unión a PGE? para anticuerpos anti-PGE? o i moléculas de DVD-lg gue contienen anti-PGE? i i I Las pruebas de inmunosorbente ligado ai enzima para tamizaje respecto a anticuerpos anti-PGE2 o moléculas de DVD-lg que contienen anti-PGE2 que se unen a prostaglandina E2 se efectúan de la siguiente manera. ! Se revisten placas de ELISA (Costar 3369,', Corning, NY) i con 50 µ? de anti-Fc IgG de hospedero (Sigma, St. Louis, MO) a 2 Mg/ml en PBS (Invitrogen, Carlsbad, CAj. Después de incubación durante la noche a 4°C, la placa se bloquea con 200 µ? !de Superblock (Pierce #37535, Rockford, IL). Las muestras que con'tienen IgG se i diluyen hasta 1 Mg/ml en solución amortiguadora para análisis (10% de Superblock en PBS que contiene 0.05% de Surfactamps (Pierce #37535, Rockford, IL) y se incuban en la placa a !50 µ?/cavidad durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de ila incubación, las placas se lavan cuatro veces con TTBS (solución amortiguada con Tween-Trisj. Se diluye PGE2-biotinamida (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) hasta 30 nM y se diluye en serie¡ en solución amortiguadora para análisis. La curva de titulación se agrega a cada muestra de IgG a un volumen de 50 µ?/cavidad y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan corno se describió previamente y se agregan 50 µ?/cavidad de dilución 1:5000 de estreptavidina polihrp40 (Fitzgerald Industries, Concord, MA) en i solución amortiguadora para análisis y se incuba durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se efectúa un paso de lavado final y las placas se revelan utilizando un sistema TMB de un soló paso (Sigma #T8665, St. Louis, MO) y H2S04 2N. Las placas se leen a 450 nm en una lectora de placas Molecular Devices Spectramax (Sunnyvale, I CA). La CE50 se determina utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA). j TABLA 58 ¡ i Unión a PGE2 mediante ELISA de anticuerpos progenitores y i construcciones de DVD ¡ I i I i La unión de todas las DVD-lgs se mantiene y es com pa rable con la del anticuerpo progen itor. ¡ ! EJEMPLO 5.5.6 I Bio-ensayo de EP4 para determi nar la capacidad de neutralización de PGE? para anticuerpos anti-PGE? o moléculas de DVD-lg que contienen anti-PGE? j Se determina la capacidad de anticuerpos anti-PGE2 y moléculas de DVD-lg que contienen anti-PGE2 para inhibir la I respuesta celular de PGE2 en una prueba de flujo de ca++ utilizando EP4 de humano establemente transfectado en células H EK293 Ga1 6.
Las células se siembran en placas de | poli-D-lisina i negras/transparentes, (Corning #3667) y se incuban | con colorante sensible a Ca++ (Molecular Devices) durante 90 minutos. La solución de reserva de PGE2 (en etanol absoluto) se diluyej con solución amortiguadora FLIPR (que contiene HBSS 1 X, HEPES¡ 20 mM , 0.1 % de BSA y Probenecid 2.5 mM). Los anticuerpos anti-PG E2, moléculas de DVD-lg o anticuerpos de control comparados con isotipo también i ser pre-diluyen en solución amortiguadora FLI PR . Se ¡ag regah 25 µ? I de PGE2 o mezcla de PG E2/anticuerpo pre-incubada jo mezcla pre-incubada de PG E2/molécula de DVD-lg a las cavidades previamente ! sembradas con células. Se efectúan una respuesta a dosis de PG E2 .I mediante titulación en serie de PG E2 y se determina utilizando FLI PR1 o Tetra (Molecular Devices). La CE50 se determina utilizando GraphPad Prism 5. Para análisis de anticuerpos y moléculas de DVD- Ig, se incuba PGE2 a concentración CE5o con concentraciones variables de los artículos de prueba o anticuerpo comparado con i isotipo (control negativo) durante 20 minutos, se agrégan a EP4 de humano cargado con colorante en células HEK293 Ga¡16. El flujo de i Ca++ se monitorea utilizando FLIPR1 y los datos se analizan I utilizando GraphPad Prism 5.
I TABLA 59 | Bioensayo de PGE2 de anticuerpos progenitores v ! construcciones de DVD j Las DVD-lgs mantienen su capacidad para inhibir la respuesta celular a PGE2 y son comparables a los anticuerpos progenitores. \.
EJEMPLO 5.5.7 ¡ Análisis fisicoquímico y estabilidad in vitro de anticuerpos monoclonales humanizados Cromatografía por exclusión de tamaño i ¡ Los anticuerpos se diluyen hasta 2.5 mg/mL con agua y se analizan 20 mL en un sistema de HPLC Shimadzu ¡utilizando una í columna de gel TSK G3000 SWXL (Tosoh Bioscience, cat# k5539- 05k). Las muestras se eluyen de la columna con sulfató de sodio 211 i mM, fosfato de sodio 92 mM, pH 7.0, a una velocidad de flujo de 0.3 mL/minutos. Las condiciones de operación del sistema! de HPLC son las siguientes: Fase móvil: Na2S04 211 mM, Na2HP04*7Hj>0 92 mM, pH 7.0 Gradiente: Isocrático ¡ Velocidad de flujo: 0.3 mL/minuto \ Longitud de onda del detector: 280 nm i Temperatura del enfriador del dispositivo de auto-muestreo:4°C j Temperatura del horno de la columna: Ambiente Tiempo de corrida: 50 minutos i i J La Tabla 60 contiene datos de pureza de los anticuerpos progenitores y las construcciones de DVD-lg expresados como por i ciento de monómero (proteína no agregada del peso molecular esperado). ! I I TABLA 60 Pureza de anticuerpos progenitores y construcciones de DVD-lg i DVD-lg según se determina mediante cromatografía por exclusión de tamaños j ! i Las DVD-lgs muestran un perfil excelente de SEC en el que la mayoría de las DVD-lgs muestran >90% de monómero. Este perfil de DVD-lg es similar al observado para los anticuerpos progenitores. ; ' i EJEMPLO 5.5.8 1 Unión de anticuerpos monoclonales a la superficie de líneas de i células de tumor de humano según se evalúa mediante citometría de flujo : Se recolectan líneas celulares estables que sobre-expresan un antígeno de interés de superficie celular o líneas de célula de tumor de humano a partir de matraces de cultivo de tejidos i y se vuelven a suspender en solución salina amortiguada con fosfatos I (PBS) que contiene 5% de suero fetal de bovino (PBS/Fr BS). Antes de la tinción, se incuban células de tumor humano en hielo con (100 µ?) de IgG de humano a 5pg/ml en PBS/FCS. Se incuban 1 -5 x 1 05 células con anticuerpo o DVD-lg (2 pg/mL) en PBS/FBS durante 30- 60 minutos en hielo. Las células se lavan dos veces ! y se agregan 100 µ? de F(ab')2 de cabra anti IgG de humano, Fcy-ficoerrtrina (dilución 1 :200 en PBS) (Jackson I mmunoResearch, West Grove, PA, i Cat.#109-1 16-170) . Después de 30 minutos de incubación en hielo, las células se lavan dos veces y se vuelven a suspender en PBS/FBS. La fluorescencia se mide utilizando un aparato Becton Dickinson FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CÁ). i La Tabla 61 muestra los datos de FACS para las construcciones de DVD-lg . La media geométrica es ¡ la n raíz del | producto de multiplicación de n señales fluorescentes (a 1 x a2 x i a3....an) . Con datos transformados a logaritmo la media geométrica se utiliza para normalizar la ponderación de la d istri bución de datos.
I i ? La siguiente tabla contiene la media geométrica de j FACS de los anticuerpos progenitores y las construcciones de DVD-lg.
I j TABLA 61 Clasificación de célula activada por fluorescencia de construcciones de DVD-lg Todas los DVDs muestran unión a susj objetivos de superficie celular. Los dominios N-terminales de los D! Ds se unen a sus objetivos en la superficie celular igual o mejor que el anticuerpo progenitor. La unión se puede restaurar o mejorar ajustándola longitud del enlazador.
EJEMPLO 5.5.9 | ¡ Transfección y expresión en células 293 I La expresión de los anticuerpos de referencia y DVDs se logra co-transfectando en forma transitoria células HEK293(EBNA) complacidos que contienen los genes correspondientes para la cadena ligera (LC) y la cadena pesada (HC). ; Las células HEK293(EBNA) se propagan en medio Freestyle 29|3 (Invitrogen, I Carlsbad CA) a una escala de 0.5 L en matraces (2Lj Corning Cat# 431198) con agitación en una incubadora con C02 (8% de C02, 125 RPM, 37°C). Cuando los cultivos alcanzan una densidad de 1 x 106 i células/ml, las células se transfectan con complejo para transfección. El complejo para transfección se prepara mezclando p'rimero 150 ug I LC-plásmido y 100 ug de HC-plásmido juntos en 25: mi de medio ! Freestyle, seguido por adición de 500 ul de solución jde reserva de PEI [solución de reserva: 1 mg/ml (pH 7.0) PEI lineal de 25 kDa, i Polysciences Cat# 23966]. El complejo de transfecc¡ón se mezcla mediante inversión y se deja incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos antes que se agregue al cultivo celular. Después de la transfección, los cultivos se siguen cultivando en la incubadora con C02 (8% de C02l 125 RPM, 37°C). 24 horas dfespués de la transfección, el cultivos se complementa con 25 mi de una solución al 10% de Triptona N1 (Organo Technie, La Courneuvej Francia Cat# 19553). Nueve días después de la transfección, las células se retiran de los cultivos mediante centrifugación (16,000 g, 10jminutos), y el sobrenadante que se retiene se esteriliza mediante filtración I (Millipore HV Durapore Stericup, 0.45 um) y se coloca a 4°C hasta que inicie el paso de purificación. i ! Cada anticuerpo o DVD-lg se purifica individualmente utilizando una columna empacada de 1 mi desechable (empacada por Orochem Technologies) que contiene resina MabSeléct SuRe (GE i Healthcare). Las columnas de pre-equilibran en PBS ¡y después se cargan con las muestras nocturnas de 0.55 L recolectadas (15 horas) a 1 ml/minuto haciendo recircular el flujo pasante de regreso al contenedor de abastecimiento. Después del paso de cargar, las i columnas se lavan con 20 mi de PBS y la proteína se eluye abasteciendo solución amortiguadora para elución [ácido cítrico 50 mM pH 3.5] a 4 ml/minuto y las fracciones se recolectan (1 mi) en ¡ tubos que ya contienen 0.2 mi de Tris 1.5M pH 8.2 (llevando el pH final hasta aproximadamente 6.0). Las fracciones que contienen anticuerpo se combinan tomando como base los cromatogramas y se dializan en la solución amortiguadora para almacenamiento final [ácido cítrico 10 mM, Na2HP04 10 mM, pH 6.0]. Después de la diálisis, las muestras se filtran a través de un filtro Steriflip de0.22um (Millipore) y la concentración de proteína se determina mediante absorbancia [espectrofotómetro de arreglo de diodo Hewlett Packard 8453]. | El análisis de SDS-PAGE se efectúa j en muestras analíticas (tanto reducidas como no reducidas) para evaluar la pureza final, verificar la presencia de bandas de cadena ligera y cadena pesada de tamaños apropiados, y confirmar la ' ausencia de cantidades significativas de cadena ligera libre (es decir no complejada) (en las muestras no reducidas). i I La Tabla 62 contiene los datos de rendimiento para los anticuerpos progenitores o las construcciones de DVD-jlg expresadas como miligramos por litro en células 293. ¡ TABLA 62 í Expresión transitoria en rendimientos de anticuerpos I progenitores v construcciones de DVD-lq en células 293 í Todos los DVDs se expresan bien en células 293. Los i DVDs se pueden purificar fácilmente a través de un'a columna de I proteína A. en la mayoría de los casos se pueden obtener fácilmente >5 mg/L de DVD-lg purificada a partir de los sobrenadantes de células 293. ; EJEMPLO 5.5.10 ¡ Caracterización y selección del líder de las DVD-lgs A/B i Las afinidades de unión de DVD-lgs anti-A^B se analizan en Biacore tanto contra la proteína A como contra la 'proteína B. La i propiedad tetravalente de la DVD-lg se examina utilizando estudios de unión múltiple en Biacore. Mientras tanto, se evalúa mediante i bioensayos la potencia de neutralización de las DVD-lgs para la i proteína A y la proteína B, respectivamente, como se describe la ' i presente solicitud. Se seleccionan las moléculas de DVD-lg que i mejor conservan la afinidad y potencia de los mAbs progenitores i originales para caracterizaciones fisicoquímicas y bio-analíticas (PK de rata) más profundas como se describe en la presente solicitud I para cada mAb. Tomando como base la colección de análisis, la i DVD-lg líder final se hace pasar al desarrollo en línea celular estable i CHO, y el material derivado de CHO se emplea en estudios de estabilidad, farmacocinética y eficacia el mono cynomolgus, y en actividades de pre formulación. ; La presente invención incorpora para referencia en su totalidad técnicas bien conocidas en el campo de biología molecular y suministro de fármacos. Estas técnicas incluyen, pero n|o se limitan a, técnicas descritas en las siguientes publicaciones: \ i j ¡ i Ausubel et al. (eds.), Current Protocols: in Molecular Bioloqy. John Wiley &Sons, NY (1993); j i Ausubel, F.M. et al. eds., Short Protocols In Molecular Bioloqy (4a Ed. 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471 -32938-X).
ControMed Drug Bioavailabilitv, Drug Product Pesian and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, New York (19^84); Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins. a Practical Approach, 2a ed., pp. 20 1-16, Oxford I University Press, New York, New York, (1999); ¡ i Goodson, en Medical Applications of ControMed Reléase, vol. 2, pp. 115-138 (1984); j Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell i Hvbridomas 563-681 (Elsevier. N.Y.. 1981: ] i : Harlow et al., Antibodies: A Laboratorv Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); i I Kabat et al., Sequences of Proteins of llmmunólogical Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991); i Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of I i Immunological Interest. Quinta Edición, Departamento de Salud y | Servicios Humanos de los EE.UU., Publicación del NIH No. 91-3242; Kontermann y Dubel eds., Antibody Engiríeering (2001) Springer-Verlag. New York, 790 pp. (ISBN 3-540-41354 5).
Kriegler, Gene Transfer and Expression, J A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); \ Lu y Weiner eds., Cloning and Expression Vectors for i Gene Function Analvsis (2001) BioTechniques Press. j Westborough, MA. 298 pp. (ISBN 1 -881299-21 -X). ; Medical Applications of Controlled Reléase. Lanqer y Wise i (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Fia. (1974); j Oíd, R. W. & S. B. Primrose, Principies of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Enqineerinq j (3a Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in¡ Microbiology; V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4).
Sambrook, J. et al. eds., Molecular Cloning': A Laboratorv I Manual (2a Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Pr^ss, NY. Vols. 1-3. (ISBN 0-87969-309-6). j Sustained and Controlled Reléase Druq Deliverv Systems. i J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 I Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers, NY (translated by Horst Ibelgaufts). 634 pp. (ISBN 0-89573-614-4). ; i I Incorporación para referencia j Los contenidos de todas las referencias citadas I (incluyendo referencias en la literatura, patentes, solicitudes de patente, bases de datos, y sitios en la red) que pudieran ser citados a través de toda esta solicitud quedan expresamente incorporados para I referencia en sus totalidades para cualquier propósito,1 así como las I referencias citadas en los mismos. La práctica de la presente invención utiliza, a menos que se indique de otra manera, técnicas ? I convencionales de inm unolog ía, biolog ía molecular y biolog ía celula r, las cuales son bien conocidas en la técn ica . ¡ i I Eq uivalentes ¡ La invención se puede modaliza r en ¡ otras formas específicas sin alejarse del alcance o características esenciales de la misma. Por lo tanto las modalidades anteriores deben ser consideradas en todo sentido, ilustrativas más que limitativas de la invención descrita en la presente solicitud . El campo d íe la invención i queda por lo tanto indicado por las reivindicaciones anexas más que por la descripción anterior, y todos los cambios que yengan dentro del significado y alcance de equivalencia de las reivindicaciones queda por lo tanto abarcado en la presente solicitud . ¡ i

Claims (1)

  1. i I 536 ¦ ! I REIVINDICACIONES ¡ 1.- Una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en donde dicha cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual; i VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada; ¡ C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; X2 es una región Fe; y ; n es 0 o 1 ; j en donde la proteína de unión se puede unir a un par de antígenos que se selecciona a partir del grupo que consiste de TNF y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1 b y PGE2, IL-6 y t?GE2, IL-6R y i PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, ||L-15 y PGE2, i S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec. 2) y PGE2, e IGFR y PGE2. ¡ 2.- La proteína de unión de conformidad con la i reivindicación 1, en donde VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ i ID NOs: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 87, 90¡, 1 10, y 112. i 3.- Una proteína de unión que comprende una cadena de I I polipéptido, en donde dicha cadena de polipéptido co¡mprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual; VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada ligera; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada ligera; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1 X2 no comprende una región Fe; y n es 0 o 1; donde la proteína de unión se puede unir a un par de antígenos que se selecciona a partir del grupo que consiste de TNF y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, I L-1 b y PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, ! Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, I L-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y¡ PGE2, EGFR (sec. 2) y PGE2, e IGFR y PGE2. I 4. - La proteína de unión de conformidad con la i ¡ reivindicación 3, en donde los dominios variables de la| cadena ligera i VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID; NOs: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 88, 91, 111, y 113. ¡ 5. La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1 o 3, en donde n es 0. ; 6.- Una proteína de unión que comprendé la primera y i segunda cadenas de polipéptido, en donde dicha primera cadena de polipéptido comprende un primer VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2|)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada; C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; X2 es una región Fe; y en donde dicha segunda cadena dé polipéptido comprende un segundo VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera; i VD2 es un segundo dominio variable de la c'adena ligera; C es un dominio constante de la cadena ligera; j X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; i X2 no comprende una región Fe; y j n es 0 o 1, en donde la proteína de unión s¡e puede unir a un par de antígenos que se selecciona a partir del grup|o que consiste de TNF y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1 b j PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y FjGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) yj PGE2, EGFR (sec.2) y PGE2, e IGFR y PGE2. j 7.- La proteína de unión de conforrtjiidad con la reivindicación 6, en donde los dominios variables jde la cadena pesada VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 87, 90, 110, y 1 12 y en donde los dominios variables de la cadena ligera VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, í 88, 91, 11 1, y 113. i 8.- La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1, 3, o 6, en donde X1 o X2 es una ; secuencia de i aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ la dos primeras cadenas de polipéptido y dos segundas1 cadenas de I polipéptido. ¡ ! 10. - La proteína de unión de conformidad con la ! reivindicación 1, 3, o 6, en donde la región Fe se selecciona a partir del grupo que consiste de región Fe de la secuencia original y una región Fe de secuencia variante. j 11. - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 10, en donde la región Fe se selecciona a partir del grupo que consiste de una región Fe proveniente de una lgG1, lgG2, I ! I 540 I i lgG3, lgG4 , IgA, Ig M , Ig E , e IgD . j 1 2. - La proteína de u nión de conform idad co n la reivindicación 1 , 3, o 6 , en donde dicho VD 1 de la primiera cadena de polipéptido y d icho VD1 de la segu nda cadena de 'polipéptido se obtienen a partir del m ismo primero y seg undo anticuerpo progen itor, respectivamente, o porción de unión a antígeno del mismo. 1 3. - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1 , 3, o 6, en donde dicho VD 1 de la primera cadena de polipéptido y dicho VD1 de la segunda cadena de polipéptido se obtienen a partir de un primero y segundo anticuerpo progenitor diferentes, respectivamente, o porción de unión a ¡ antígeno del mismo. 1 14. - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1 , 3, o 6, en donde dicho VD2 de la prinVera cadena de polipéptido y dicho VD2 de la segu nda cadena de polipéptido se obtienen a partir del mismo primero y segundo anticuerpo progenitor, respectivamente, o porción de unión a antígeno del mismo. 1 5. - La proteína de u nión de conformidad con la i reivindicación 1 , 3, o 6, en donde dicho VD2 de la primera cadena de i poMpéptido y dicho VD2 de la segunda cadena de polipéptido se obtienen a partir de primero y segundo anticuerpo progenitor diferentes, respectivamente, o porción de unión a j antígeno del mismo. | ¡ 16. - La proteína de unión de conformidad con cualquiera i de las reivindicaciones 1 3-15, en donde dicho primero y dicho segundo anticuerpos progenitores se unen a epítopes, diferentes en dicho antígeno. 17. - La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une a dicho primer antígeno con una potencia diferente de la potencia con la cual dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une a dicho segundo antígeno. 18. - La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une a dicho primer antígeno con una afinidad diferente de la afinidad con la cual dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une a dicho segundo antígeno. 19. La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, y dicho segundo I anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se seleccionan a partir del grupo que consiste de un anticuerpo humano, a anticuerpo injertado con CDR, y un anticuerpo human zado. 20.- La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, y dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno clel mismo, se seleccionan a partir del grupo que consiste de un fragmento Fab; un dos cadenas de polipéptido comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada; C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; y X2 es una región Fe; y en donde dos cadenas de polipéptido comprenden VD1 (X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un enlazador con la condición que éstje no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; y n es 0 o 1; en el cual los dominios variables de la cadena pesada VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 87, 90, 1 10, y 1 12 y en donde los dominios variables de la cadena ligera VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 88, 91, 1 11, y 113. 25.- Una proteína de unión que se pueda unir a dos antígenos que comprende cuatro cadenas de polipéptido, en donde dos cadenas de polipéptido comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual ! VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada; C es un dominio constante de la cadena pesadja; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; X2 es una región Fe; y n es 0 o 1; y en donde dos cadenas de polipéptido comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un enlazador con ia condición que ést'e no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; y n es 0 o 1 ; en donde la DVD-lg se une a por lo menos un antígeno que se selecciona a partir del grupo que consiste de Prostaglandina E2 (PGE2), Amiloide beta (Abeta) (sec. 1), Abeta (sec. 2), Abeta (seq. 3), Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-a), interleucina 1ß (??_-1ß), Receptor del Factor de Crecimiento tipo Insulina (IGFR), Interleucina 17A (IL-17A), Interleucina 6 (IL-6), receptor de Interleucina 6 (IL-6R), Interleucina 15 (IL-15), Interleucina 18 (IL-18), factor cié crecimiento de nervio (NGF), Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) (sec. 1), EGFR (sec. 2), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y S1P. 26.- La proteína de unión de conformidad con la i reivindicación 1, 3, 6, 24, o 25, en donde dicha prótjeína de unión tiene una constante de velocidad de asociación (KaS0c) para dicho uno o más objetivos que se selecciona a partir del grupo que consiste de: por lo menos aproximadamente 102 M"1S"1; po'r lo menos i aproximadamente 103 M S ; por lo menos aproximadamente 104 M" 1S"1; por lo menos aproximadamente 105 M"1S"1; y por lo menos aproximadamente 106 M' S"1, según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie. 27. - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1, 3, 6, 24, o 25, en donde dicha proteína de unión tiene una constante de velocidad de disociación (Kdisoc) para dichos uno o más objetivos que se selecciona a partir del grupo que consiste de: cuando mucho aproximadamente 10"3 S" ; cuando mucho aproximadamente 10~4 S"1; cuando mucho aproximadamente 10"5 S"1; y cuando mucho aproximadamente 10"6 S"1, según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie. 28. - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1, 3, 6, 24, o 25, en donde dicha proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) para dichos uno o más objetivos que se selecciona a partir del grupo que consiste de: cuando mucho aproximadamente 10"7 M; cuando mucho aproximadamente 10"8 M; cuando mucho aproximadamente 10"9 M; cuando mucho aproximadamente 10 10 M; cuando mucho aproximadamente 10"?1 M; cuando mucho aproximadamente 1CT12 M; y cuando mucho 10"13 M. 29. - Un conjugado de proteína de unión que comprende una proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 6, 24, o 25, dicho conjugado de proteína de unión también comprende un agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de; una molécula de inmuno-adhesjión, un agente para formación de imagen, un agente terapéutico, y un agente citotóxico. 30. - El conjugado de proteína de unión de conformidad con la reivindicación 29, en donde dicho agente es un agente para formación de imagen que se selecciona a partir del grupo que consiste de una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética, y biotina. 31. - El conjugado de proteína de unión dé conformidad con la reivindicación 30, en donde dicho agente para formación de imagen es una radiomarca que se selecciona a partir del grupo que 111 131. 177 consiste de: 3H, 14C, 35S, 90Y, "Te, In, 125i I, Lu, 166Ho, y 153Sm. 32.- El conjugado de proteína de unión de conformidad con la reivindicación 30, en donde dicho agente es un agente terapéutico o citotóxico que se selecciona a partir del grupo que 40. - Una célula hospedera que comprende un vector de conformidad con la reivindicación 38. 41. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 40, en donde dicha célula hospedera !es una célula procariota. 42. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 41, en donde dicha célula hospedera es E. coli. 43. - La célula hospedera de conformidad con la I reivindicación 40, en donde dicha célula hospedera es una célula eucariota. 44. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 43, en donde dicha célula eucariota se selecciona a partir del grupo que consiste de célula protista, célula animal, célula vegetal y célula fúngica. 45.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 43, en donde dicha célula eucariota es una célula animal que se selecciona a partir del grupo que consiste de; una célula de mamífero, una célula aviar, y una célula de insecto. 46. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 45, en donde dicha célula hospedera es una célula CHO. 47. - La célula hospedera de conformjidad con la reivindicación 45, en donde dicha célula hospedera es GOS. ! 48. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 43, en donde dicha célula hospedera es una célula de levadura. 49.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 48, en donde dicha célula de | levadura es Saccharomyces cerevisiae. 50.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 45, en donde dicha célula hospedera es una célula Sf9 de insecto. 51. - Un método para producir una proteína de unión, que comprende cultivar una célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-50 en medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir la proteína de unión. 52. - El método de conformidad con la reivindicación 51, en donde 50%-75% de la proteína de unión producida e¡s una proteína de unión tetravalente específica dual. 53.- El método de conformidad con la reivindicación 51, en donde 75%-90% de la proteína de unión producida es una proteína de unión tetravalente específica dual. 54. - El método de conformidad con la reivindicación 51, en donde 90%-95% de la proteína de unión producida es una proteína de unión tetravalente específica dual. 55. - una proteína que se produce de conformidad con el método de la reivindicación 51. 56. - Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36 y 55, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 57.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 56, que comprende además por lo menos un agente terapéutico adicional. 58.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 57, en donde dicho agente terapéutico adicional se selecciona a partir del grupo que consiste de: agen e terapéutico, agente para formación de imagen, agente citotóxico, inhibidores de angiogénesis; inhibidores de cinasa; bloqueadores dé molécula de co-estimulación; bloqueadores de molécula de adhesión; anticuerpo anti-citocina o fragmento funcional del mismo; metotrexato; ciclosporina; rapamicina; FK506; marca o reportero detectable; un antagonista de TNF; un antirreumático; un relajante muscular, narcótico, un fármaco anti-inflamatorio no esteroida (NSAID), analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un anti -psoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresorl, una hormona del crecimiento, un fármaco para reemplazo hormonjal, un agente radiofarmacéutico, un antidepresivo, un anti-psicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un betaj agonista, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citocina, y un antagonista de citocina. 59.- Un método para tratar a un individuo por una enfermedad o un trastorno administrando al individuo a proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36 y 55 de modo tal que se logre el tratamiento. | 60.- El método de conformidad con la reivindicación 59, en donde dicho trastorno se selecciona a partir del grupo que comprende artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerante, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiróiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis escleroderma, enfermedad de injerto contra hospedero, rechazo de trasplante de órgano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con transplante de órgano, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis alctiva crónica, uveitis, choque séptico, síndrome de choque séptico, síndrome séptico, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodefíciencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, apoplejía, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítíca, tumores malignos, insuficiencia cardiaca, infarto al miocardio, enfermedad de Addison, deficiencia poliglandular tipo I esporádica, y deficiencia poliglandular tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) del adulto, alopecia, alopecia circunscripta, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerante, sinovitis enteropática, artropatía asociada con Chlamydia, Yersinia y Salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad ampollosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/Enfermedad del Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, Síndrome de Enfermedad de Inmunodeficiencia Adquirida, Enfermedades Relacionadas con Inmunodeficiencia Adquirida, Hepatitis B, Hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica1, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, pneumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada con enfermedad de tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de tejido conectivo mixta, enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticialj asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada con lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de Sjógren, enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada con hemosiderosis¡ enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante/ pneumonía eosinofílica crónica enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial post-infecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo 1 (hepatitis clásica autoinmune o lupoide), hepatitis autoinmune tipo 2 (hepatitis por anticuerpo anti-LKM), hipoglicemia mediada autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con transplante de órgano, enfermedad inmune crónica asociada con transplante de órgano, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, NOS de enfermedad renal, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática ! o NOS, autoinmunidad por esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmia del simpático, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad de tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjorgren, enfermedad/arteritis de Takayasu, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad autoinmune de la tiroides, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bocioso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixoedema primario, uveitis facogénica, vasculitis primaria, enfermedad hepática aguda con vitíligo, enfermedades hepáticas crónicas, cirrosis alcohólica, lesión hepática inducida por alcohol, coleosatatis, enfermedad hepática idiosincrática, hepatitis inducida por droga, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos del grupo B (GBS), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas tipo Th1 y tipo Th2, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor ), y cánceres tales como cáncer de pulmón, de mama, de estómago, de vejiga urinaria, de colon, de páncreas, de ovario, de próstata y rectal y tumores malignos hematopoyéticos (leucemia y linfoma) Abetalipoprotemia, Acrocianosis, procesos parasitarips o infecciosos agudos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia adrenal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia por SIDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis por contacto alérgica, rinitis alérgica, rechazo de aloinjerto, deficiencia de antitripsina alfa 1, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración de célula del asta anterior, terapia anti-cd3, síndrome antifosfolípido, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, aneurismas aórticos! y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arteriesclerosis, fístula eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo de implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos arteriales periféricos funcionales, sepsis fúngica, gangrena gaseosa, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo de injerto de cualquier órgano o tejido, sepsis por Gram negativos, sepsis por Gram positivos, granulomas debido a organismos intracelulares, leucemia de célula pilosa, enfermedad de Hallervorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo de trasplante de corazón, helnacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombolítica trombocitopénica, hemorragia, hepatitis (A), arritmias del fascículo de His, infección por VIH/neuropatía de VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimiento hiperquinético, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos del movimiento hipoquinéticos, evaluación del eje hipotalámico pituitario-adrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática, citotoxicidad mediada por anticuerpo, Astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, ¡ridociclitis/uveitis/neuritis óptica, lesión por isquemia-reperfusión, apoplejía isquémica, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo de trasplante de riñon, legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo de transplante de hígado, linfoedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, metabólico/idiopático, dolor de | cabeza por migraña, trastorno multi-sistema mitocóndrico, enfermedad de tejido conectivo mixta, gammopatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, Mycobslcterium avium ¡ntracellulare, Mycobacterium tuberculosis, síndrome mielodisplásico, infarto al miocardio, trastornos isquémicos del miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crónica neon'atal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I, fiebre neutropénica, linfoma de tipo no hodgkins, oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos oculares oclusivos, terapia con okt3, orquitis/epididimitis, procedimientos de reversión de orquitis/vasectomía, organomegalia, osteoporosis, rechazo de trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de tumor maligno, rechazo de trasplante de la paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenne, enfermedad del pericardio, enfermedad ateroesclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía por Pneumocystis carinii, neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrihopatía, gammopatía monoclonal, y síndrome de cambios de la piel), síndrome post perfusión, síndrome post bomba, síndrome de cardiotomía postinfarto al miocardio (post-MI), preeclampsia, Parálisis] supranuclear i Progresiva, hipertensión pulmonar primaria, terapia con radiación, fenómeno y enfermedad de Rayna ud , enferm edad | de Rayn oud , enferm edad de Refsum , taq uicard ia de Q RS estrecho reg ula r, hipertensión renovascular, daño por reperfusión , cardiom iopatía restrictiva , sarcom as, escleroderma, corea senil , demencia senil de tipo cuerpo de Lewy, artropatías seronegativas, choq ué , anem ia de célula falciforme, rechazo de aloinjerto de piel, síndrome de cambios de la piel, rechazo de trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones I espinocerebelares, miositis estreptocócica, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxis sistémica, síndromej de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide j uvenil de inicio sistémico, ALL de célula T o de FAB, Telangiectasia, tromboangitis obliterante, trombocitopenia, toxicidad , transplantes, trauma/hemorragia , reacciones de hipersensibilidad de tipo I I I , hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia , urosepsis, urticaria, enfermedades cardiacas valvulares, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosas, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado con vital, síndrome de Wernicke-Korsakoff, enfermedad de Wilson , rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática ag uda , poli-radiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto, alopecia '¡ circunscripta , anafilaxis, síndrome de anticuerpo anti-fosfolípido, anemia aplásica , arteriesclerosis, eczema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado con infección estreptococo, enteropatía autoinmune, pérdida auditiva autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), miocarditis autoinmune, autoímmune insuficiencia ovárica prematura, blefaritis, bronquiectasis, penfigoide ampolloso, enfermedad cardiovascular, síndrome anti-fosfolípido catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatricial, sídrome clínicamente aislado (cis) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno siquiátrico con inicio en la niñeL, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética, diabetes mellitus, hernia discal, prolapso de disco, anemia hemolítica inmune inducida por fármaco , endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, episcleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barré (GBS), fiebre del heno, síndrome de Hughes, enfermedad Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, a ergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis por cuerpos de inclusión, enfermedad inflamatoria ocular infecciosa, enfermedad desmielinizante inflamatoria, enfermedad cardiaca inflamatoria, enfermedad renal inflamatoria, IPF/UIP, iritisl, queratitis, queratojuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meíer, parálisis de Landry, histiocitosis de célula de Langerhan, livedo reticularis, degeneración macular, poliangiitis microscópica, espondilitis anquilossante (espondilitis anquilosante), trastornos de neurona motora, penfigoide de membrana mucosa, insuficiencia de órgano múltiple, miastenia grave, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de la raíz nerviosa, neuropatía, non-A non- B hepatitis, neuritis óptica, osteolisis, cáncer de ovario, artritis reumatoide juvenil (JRA) pauciarticular, enfermedad oclusiva de arteria periférica (PAOD), enfermedad vascular periférica (PVD), enfermedad de arteria periférica (PAD), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, polimialgia reumática, poliosis, JRA poliarticular, síndrome de deficiencia poliendocrina, polimiositis, polimialgia reumática (PMR), síndrome post-bomba, Parkinsonismo primario, cáncer de próstata y recial y tumores malignos hematopoyéticos (leucemia y linfoma), prostatitis, aplasia de eritrocito puro, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, restenosis, enfermedad cardiaca reumática, sapho (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis, y osteítis), escleroderma, amiloidosis secundaria, síndrome de dificultad respiratoria aguda (shock lung), escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, j enfermedad de tejido conectivo asociada a silicón, dermatosis de i sneddon-wilkinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, i arteritis temporal, retinitis toxoplásmica, necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversal, TRAPS (reacción alérgica tipo 1 del receptor del i factor de necrosis tumoral, diabetes tipo II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP), vasculitis, conjuntivitis primaveral, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome de VKH), degeneración macular húmeda, cicatrización de heridas, artropatía asociada con Yersinia y Salmonella. 61. - El método de conformidad con la reivindicación 60, en donde dicha administración al individuo es mediante por lo menos un modo que se selecciona a partir de parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intra-cartilaginoso, int a-cavidades, intra-celíaco, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraosteal, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, y transdérmico.. 62. - Un método para generar una Inmunoglobulina de Dominio Variable Dual que se puede unir a dos antígenos que comprende los pasos de I a) obtener un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, que se pueda unir a un primer antígeno; b) obtener un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, que se pueda unir a un segundo antígeno; c) construir la primera y tercera cadenas ele polipéptido que comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; X2 es una región Fe; y n es 0 o 1 ; y d) construir la segunda y cuarta cadenas de polipéptido que comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de dicho primer anticuerpo' progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de dicho segundo anticuerpo progenitor o unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un enlazador con la condición que ést¡e no sea CH1 X2 no comprende una región Fe; y n es 0 o 1 ; y e) expresar dichas primera, segunda, tercera y cuarta cadenas de polipéptido; de modo tal que se genere una Inmunóglobulina de Dominio Variable Dual que se pueda unir a dicho primero y segundo antígenos, en donde la proteína de unión se puede unir a un par de antígenos que se selecciona a partir del grupo que consiste de TNF y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1b y PGE2, IL -6 y PGE2, IL- 6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y|PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) y PGE2, EGFR (sec.2) y PGE2, e IGFR y PGE2. 63. - El método de conformidad con la reivindicación 62, en donde los dominios variables VD1 y VD2 de la Jadena pesada comprenden una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 28, 30, 32, 34, j36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 87, 90, 110, y 1 12 y en donde los dominios variables de la cadena ligera VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 88, 91, 1 11, y 113. 64. - El método de conformidad con la reivindicación 62, en donde dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, y dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se seleccionan a partir del grupo que consiste de un anticuerpo humano, a anticuerpo injertado con CDR, y un anticuerpo humanizado. 65. - El método de conformidad con la reivindicación 62, I i en donde dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, y dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a a ntígeno del m ismo , se selecciona n a p a rt i del grupo q ue consiste de un fragmento Fab , un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que com prende dos frag mentos Fab ligados med iante u n puente de disulfuro en la región de gozne; un fragmento Fd que consiste de los dom inios VH y CH 1 ; u n fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo, un fragmento dAb, una régión determinante de complementariedad (CDR) aislada , un anticuerpo de cadena individ ual, y diacuerpos. 66. - El método de conformidad con la reivindicación 62 , en donde dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo posee por lo menos una propiedad deseada exhibida por la inmunoglobulina de Dominio Variable Dual. 67. - El método de conformidad con la reiv indicación 62 , en donde dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo posee por lo menos u na propiedad deseada exhibida por la inmunoglobulina de Dominio Variable Dual. 68. - El método de conformidad con la reivindicación 62 , en donde la región Fe se selecciona a partir del grupo que consiste de una región Fe de la secuencia original y una ¡región Fe de secuencia variante. 69. - El método de conformidad con la reivindicación 62 , en donde la región Fe se selecciona a partir del grupo q ue consiste de una región Fe proveniente de una lgG 1 , lgG2 , lgG3, lgG4, IgA, IgM , IgE, e Ig D. 70.- El método de conformidad con la reivindicación 66 , en donde dicha propiedad deseada se selecciona a partir de uno o más parámetros del anticuerpo. 71. - El método de conformidad con la reivindicación 67, en donde dicha propiedad deseada se selecciona a partir de uno o más parámetros del anticuerpo. 72. - El método de conformidad con la reivindicación 70, en donde dichos parámetros de anticuerpo se seleccionan a partir del grupo que consiste de especificidad de antígeno, afinidad hacia el antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epítope, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada tisular, y unión a antígeno ortólogo. 73. - El método de conformidad con la reivindicación 71, en donde dichos parámetros de anticuerpo se seleccionan a partir del grupo que consiste de especificidad de antígeno, afinidad hacia el antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epítope, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada tisular, y unión a antígeno ortólogo. 74.- El método de conformidad con la reivindicación 62, en donde dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une a dicho primer antígeno con una afinidad diferente de la afinidad con la cual dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, s¡e une a dicho segundo antígeno. 75. - El método de conformidad con la reivindicación 62, en donde dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une a dicho primer antígeno con una potencia diferente de la potencia con la cual dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une a dicho segundo antígeno. 76. - Un método para generar una Inmurioglobulina de Dominio Variable Dual que se pueda unir a dos antígenos con las propiedades deseadas que comprende los pasos de a) obtener un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, que se pueda unir a un primer antígeno y que posea por lo menos una propiedad deseada exhibida por la inmunoglobulina de Dominio Variable Dual; b) obtener un segundo anticuerpo progenitojr o porción de unión a antígeno del mismo, que se pueda unir a un segundo antígeno y que posea por lo menos una propiedad deseada exhibida por la inmunoglobulina de Dominio Variable Dual; ¡ c) construir la primera y tercera cadenas |de polipéptido que comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual; VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; X2 es una región Fe; y n es 0 o 1 ; d) construir la segunda y cuarta cadenas de polipéptido que comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual; VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; y n es 0 o 1 ; e) expresar dichas primera, segunda, tercera y cuarta cadenas de polipéptido; de modo tal que se genere una Inmunoglobulina de Dominio Variable i Dual que se pueda unir a dicho primero y segundo antígenos con las propiedades deseadas, en donde la proteína de unión se puede unir a un par de antígenos que se selecciona a partir del grupo que consiste i de TNF y PGE2, NGF y PGE2, IL-17A y PGE2, IL-1 b yj PGE2, IL-6 y PGE2, IL-6R y PGE2, VEGF y PGE2, Abeta (sec. 1) y! PGE2, Abeta (sec. 2) y PGE2, Abeta (sec. 3) y PGE2, IL-18 y PGE2, PGE2 y PGE2, IL-15 y PGE2, S1P y PGE2, EGFR (sec. 1) PGE2, EGFR (sec. 2) y PGE2, e IGFR y PGE2.
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