KR970002255B1 - 핵산 리간드 - Google Patents

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KR
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target
rna
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protein
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KR1019920703193A
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골드 래리
투어크 크라이그
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넥스스타 파아마슈티컬드, 인크.
아담 코크란
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Abstract

내용없음.

Description

[발명의 명칭]
핵산 리간드
[도면의 간단한 설명]
제1도는 박테리오파아지 T4 DNA 폴리머라제를 코드화하는 유전자 43 메신저 RNA의 일부 리보누클레오티드 배열도이다. 도시된 것은 gp 43에 결합하는 것으로 알려진 영역내 배열이다. 보울드체 대문자는 gp 43의 결합에 필요한 정보의 범위를 나타낸다. 8염기쌍 루우프는 랜덤화 배열로 대치되어 SELEX용 대상집단을 생성하였다.
제2도는 T4 DNA 폴리머라제와 결합하는 RNA에 대한 루우프 배열 변이체의 선별을 예시한 SELEX 공정의 개략도이다(gp 43). RNA 시험 혼합물 제조용 DNA 주형은 올리고머 3, 4 및 5의 연결에 의하여 (a)단계에서 지적한 바와 같이 제조되는데, 올리고머의 배열은 하기 표 1에 제공된다. (a)단계에서, 올리고머 1 및 2와의 혼성에 의하여 적절한 연결이 보장되는데, 올리고머 1 및 2는, 올리고머 3과 4 및 올리고머 4와 5를 각각 가교상 결합시키는 상보배열(표 1에 재시)을 갖는다. 얻어진 길이 110 염기 주형은 겔 정제되고, 올리고 1로 아닐링(annealing)되며, 시험관내 전사반응에 사용되어(Miligan 등(187) Nucl, Acids Res. 15 : 8783-8798) 8염기 루우프의 랜덤화 배열을 함유하는 초기 RNA를 생성한다(단계 b). 얻어진 전사체는 겔 정제되고, 실시예 1에서 설명한 바와 같이, gp 43에 결합하기 위하여 니트로셀룰로즈 필터상에서 선별되도록 처리된다(단계 c). 선별된 RNA는 3단계 공정으로 증폭된다 : (d) 선별된 RNA의 cDNA 카피는, 프라이머로서 올리고 5(표 1)를 이용하여 역전사효소합성으로 제조되고; (e) cDNA들은 올리고 1(표 1)의 Tag DNA 폴리머라제 연쇄반응을 이용하여 증폭되는데, 올리고 1은 Innis 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 9436에서 설명한 바와 같이, 필수 T7 프로모터 배열 및 올리고 5(표 5)를 운반하며; 및 (f) 증폭후의 2중사슬 DNA 생성물은 시험관에서 전사된다. 얻어진 선별 증폭 RNA는 다음 단계의 선별작업에 사용되었다.
제3도는 RNA 루우프 변이체와 gp 43의 결합을 위한 SELEX로부터 유도된 시험관내 전사체의 전기영동 뱃치 배열결정 반응의 오우토라디오그라프(autoradiograph) 복합사진이다. 그림은, 실험 B의 선별조건에 대한 선별 사이클 수의 함수로서(2, 3 및 4 사이클에 대한) 루우프 배열 성분내 변화를 가르키는데, 실험 B의 모든 선별 사이클에서 gp 43의 농도는 3×10-8M이며 RNA의 농도는 약 3×10-5이었다. 배열결정은 Gauss 등(1987) Mol. Gen. Genet. 206 : 24-34에서 설명한 바와 같이 수행되었다.
제4도는 상이한 결합조건을 채택하여 RNA 루우프 변이체를 gp 43에 결합시키기 위한 제4차 SELEX 증폭으로부터 선별된 RNA들의 뱃취 RNA 배열의 오우토라디오그라프 복합사진이다. 실험 A에서 gp 43의 농도는 3×10-8M이며 RNA의 농도는 약 3×10-7M이었다. 실험 B에서는 gp 43은 3×10-8M, RNA는 약 3×10-5M이었다. 실험 C에서는 gp 43는 3×10-7M 및 RNA는 약 3×10-5M이었다.
제5도는 실험 B(실시예 1 참조)의 선별조건하에서 gp 43과의 결합을 위하여 선별된 루우프 변이체에 대한 3개의 배열결정 겔의 오우토라디오그라프 복합사진이다. 좌측배열 겔은 제4차 선별/증폭후의 선별 RNA의 뱃취 배열결정 겔이다. 중앙 및 우측 배열 겔은 뱃치 RNA들로부터 유도된 2개의 클론 분리체의 2중사슬 DNA 배열결정 겔이다. 선별된 RNA의 뱃치는 2개의 주 변이체로 구성되는데, 그 하나는 와일드형 배열(중앙 배열겔)과 신규배열(우측 배열겔)이다.
제6도는 상이한 선별 RNA 루우프 배열 변이체 및 랜덤화 루우프 배열을 갖는 RNA에 대하여, gp 43 농도 함수로서 표시되는 gp 43에 대한 결합 RNA %를 나타내는 그라프이다. 와일드형 루우프 배열 AAUAACUC의 결합은 흰 동그라미 실선으로; 주변이체 루우프 배열 AGCAACCU는 X, 점선으로; 소수 변이체 루우프 배열 AAUAACUU는 흰 네모, 실선으로; 소수 변이체 루우프 배열 AAUGACUC는 검은 동그라미, 점선으로; 소수 변이체 루우프 배열 AGCGACCU는 십자(+), 점선으로; 및 루우프 배열의 랜덤화 혼합물(NNNNNNNN)의 배열은 흰 동그라미 및 점선으로 나타난다.
제7도는 8 염기쌍 루우프에서 랜덤화된 대상 집단으로부터 신규의 gp 43 결합 RNA를 선별하기 위한 4차의 SELEX 후에 달성된 결과를 그림으로 요약한 것이다. SELEX는 제4도에 도시한 뱃치 배열로부터 예상된 명확한 결과를 나타내지 않았으나, 대신에 거의 동일 비율의 와일드형 및 단일 다수 변이체와 3개의 단일 변이체를 산출하였다. 20개의 클론화 분리체로부터 나온 각각의 빈도는, 제6도에 도시한 필터 결합 검정법으로부터 유도된 바와 같이, 각각에 대한 개략적인 친화성 상수(Kd)와 함께 나타난다.
제8도는 효소 말단 전이효소(TDT) 및 DNA 폴리머라제(DNA pol)를 이용한 대상 핵산 리간드의 합성방법을 나타내는 일련의 도면이다. 5' 프라이머 또는 1차 리간드 배열은, 4개의 디옥시누클레오티드 트리포스페이트들(dNTPs)의 존재하에 말단 전이효소로 배양함으로써 랜덤화 배열의 꼬리(tail)를 구비하게 된다. 단일 디옥시 누클레오티드 트리포스페이트(예를 들면, dCTP)의 존재하에 동일효소를 이용하여, 랜덤화 세그먼트를 호모 폴리마 테일링(homopolymer tailing)하면 폴리-G 테일화 3' 프라이머에 대한 아닐링 부위가 마련된다. 아닐링 후, 2중사슬 분자는 DNA 폴리머라제의 작용에 의하여 충진된다. 필요한 경우, 혼합물은 폴리머라제 연쇄반응에 의하여 다시 증폭된다.
제9도는 2개의 공간적으로 분리된 표적 단백질과의 결합 상호작용을 갖는 큰 핵산 리간드를 선별하기 위한 SELEX를 이용하는 방법을 나타내는 도면이다. 이 방법을 워킹이라고 하는데, 그것은 제2단계가 제1단계의 연장인 2개의 단계를 포함하기 때문이다. 도면의 상부는, 제1결합부위에서 단백질에 결합된, 제1차 SELEX에 의하여 선별된 결합 핵산 리간드(진화된 1차 리간드를 지닌 표적(관심 단백질)을 나타낸다. 말단전이효소에 의하여 촉매작용을 받는 반응은 진화된 1차 리간드의 길이를 연장시키며, 1차 리간드를 함유하는 보존영역이 있는 신규의 랜덤화 배열 세트를 발생시킨다. 도면의 하부는, 단백질의 제2결합부위에서의 2차 리간드 상호작용으로부터 생기는 개선된 결합을 기초로 한 제2차의 SELEX 결과를 나타낸다. 1차 및 2차라는 용어는 단순히 공정상의 용어로, 하나가 다른 하나보다 친화성이 높다는 의미를 갖는 것은 아니다.
제10도 및 제11도는 두 단계에서 SELEX를 이용한 선별공정의 도면이다. 제10도에서 SELEX는, 표적 단백질의 억제제와 같은 특정 결합제에 연결된 가교상 올리고누클레오티드와 착화된 표적상의 2차 결합부위에 결합되는 리간드를 선별하는데 응용된다. 가교상 올리고누클레오티드는, 접근가능한 2차 결합부위에 결합되는 리간드의 선별을 유리하게 하는 안내역할을 한다.
제11도에서, 2차 SELEX는 원래 선별된 2차 결합부위와 1차 표적 분자내 영역 모두에서 결합하는 리간드를 진화하는데 응용된다. 이와 같이 진화된 핵산은 매우 견고하게 결합하며, 그 자신이 표적 단백질의 억제제 역할을 하거나 또는 표적 단백질의 억제제 또는 기질에 대항하여 경쟁할 수도 있다.
제12도는 실시예 2에서 사용된 대상 혼합물을 구성하기 위하여 이용된 올리고머의 배열 및 배치를 나타낸다. 첫째줄은, 좌로부터 우로, 각각 올리고머 1b 및 2b의 배열을 나타낸다(하기 표 2 참조). 둘째줄은 좌로부터 우로, 올리고머 3b, 4b 및 5b의 배열을 나타낸다(표 2). 그 배열이 상보성인 올리고머 1b 및 2b로 혼성함으로써 적절한 올리고머의 연결이 보장된다. 얻어진 연결된 주형은 겔정제되고 올리고머 1b로 아닐링되어 시험관내 전사반응에 이용되어(Milligan 등(1987)). 도면의 바닥줄에 시험관내 전사체로 표시된 RNA 대상 혼합물을 생성한다. 대상 혼합물은, 도시한 바와 같이, 32 누클레오티드 랜덤화 세그먼트를 함유한다.
제13도는 RNA가 수용하는 것으로 알려진 다양한 2차 구조를 함유하는 가상 RNA 배열을 나타낸다. 포함된 것은 : (A) 머리핀 루우프, (B) 융기, (C) 비대칭 융기 및 (D) 수우도 놋트이다.
제14도는 HIV-RT에 대한 리간드 친화성의 니트로셀룰로즈 필터 결합검정을 나타낸다. 도시된 것은 HIV-RT의 농도를 변화시키면서 니트로셀룰로즈 필터에 결합된 입력 RNA의 %이다.
제15도는 HIT-RT에 대한 리간드 친화성의 별도의 니트로셀룰로즈 필터 결합 검정을 나타낸다.
제16도는 HIT-RT 리간드 1.1 및 1.3a a) 3' 영역측정에 대한 정보영역 측정을 나타낸다. RNA들은 5' 단부라벨되고, 부분적인 알카리 가수분해 처리되고, 니트로셀룰로즈 필터상에서 선별, 변성 8% 폴리아크릴 아미드겔상에서 분리, 오우토라디오그라프 처리되었다. 약 90피코몰의 라벨된 RNA와 80피코몰의 HIV-1 RT가 0.5, 2.5 및 5㎖의 완축액에 혼합되어 37℃에서 5분간 배양된 후 니트로셀룰로즈 필터로 세척되었다. 용출된 RNA는 각 실험에서 사용된 최종농도의 HIV-1 RT 밑에 나타난다. 또한 부분적인 RNase T1 다이제스트 생성물을 도시하였는데, 이는 화살표 b) 5' 영역측정으로 도시한 바와 같이, 인접배열상에서의 정보영역을 식별할 수 있게 한다. 5' 영역은 상술한 바와 같은 조건하에서 a)에서 측정된다.
제17도는 RNA 리간드 1.1에 의한 HIV-1 RT의 억제작용을 나타낸다. 최종 반응농도가 10마이크로몰에서 4.6나노몰의 범위가 되는, 32N 대상 혼합물 RNA 및 리간드 1.1 RNA의 일련의 3배 휘석 용액을 HIV-RT와 혼합, 6㎕의 200mM KOAc, 50mM Tris-HCI, pH7.7, 10mM 디티오트레이톨, 6mM Mg(OAc)2및 0.4mM NTPS 중에서 5분간 37℃에서 배양하였다. 별도의 튜브에, RNA 주형(올리고 7 및 9를 이용하여 U. S. Biochemical Corp. 으로부터 얻은 PCR 생성물 T7-1으로부터 전사된)과 라벨된 올리고 9를 혼합하고 95℃에서 1분간 가열하고, 10mM Tris-HCl, pH7, 0.1mM EDTA 중에서 15분간 얼음으로 냉각시켰다. 4㎕의 이 주형을 각각 6㎕ 효소-억제제 혼합물에 첨가하여 반응을 개시시키고, 37℃에서 다시 5분간 배양한 후 정지시켰다. 모든 반응에서, HIV-1 RT의 최종농도는 16 나노물, RNA 주형은 13 나노물 및 라벨된 프라이머의 최종농도는 150나노물이었다. 각 반응의 확장 생성물을 도시하였다.
제18도는 리간드 1.1에 의한 HIV-1 RT의 억제효과가 MMLV RT 및 AMVRT에 미치는 영향을 비교한 것이다. 도시된 결과 농도가 되도록 억제제를 5배로 희석한 것을 제외하고는 제17도에서와 같이 실험을 수행하였다. 각 RT의 농도는 희석하여 HIV-RT의 농도를 표준으로 하고 쿠마시 블루(Coomassie blue)와 은오염 양쪽과 겔 밴드 강도와 비교하고 바이오라드 단백질 농도 분석 및 활성평가를 비교하였다.
제19도는 R-17 외피 단백질 리간드 용액을 나타내는 선별된 머리핀의 배열을 나타낸다. 각 단백질에서의 누클레오티드 표시는 네모칸에 나타난다. bulge로 표현된 칼럼은, 대응 스템 염기쌍 사이의 스템의 일면 또는 양면에 여분의 나선형 누클레오티드를 갖고 있는 클론의 수를 나타낸다. end로 표시된 칼럼은 기존의 염기쌍에 머리핀이 절단된 클론의 수를 나타낸다.
제20도를 브래디키닌(bradykinin)에 대한 30N 벌크 RNA의 결합곡선을 나타낸다. 스핀 칼럼; 10mM KOAc, 10mM DEM, pH 7.5; RNA 농도 1.5×10-8M을 이용하여 분석하였다.
제21도는 소정의 구조적 특징이 부유화된 대상 혼합물의 생성에 이용되는 주형을 나타낸다. 주형 A는 머리핀 루우프의 대상 혼합물을 부유화하도록 고안되었다. 주형 B는 수우도놋트의 대상 혼합물을 부유화하도록 고안되었다.
제22도는 HIV-rev 리간드 용액의 특징 Ⅰ 및 Ⅱ에 대한 스템-루우프 배열의 개략도이다. 루우프 1 및 3 사이에서 스템 1 및 2의 점선은 가능한 염기쌍을 나타낸다.
제23도는 각각 특징 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ을 나타내기 위한 분리체 6a, 1a 및 8의 rev 리간드 부영역의 중복 2차구조를 나타낸다. 또한 비교하기 위하여, 예상적으로 중복된 와일드형 RRE RNA를 도시하였다.
제24도는 다양한 농도의 HIV rev 단백질을 지닌 니트로셀룰로즈 필터에 결합된 입력 수의 %그라프이다. 또한, 32N 개시 집단의 결합곡선(#) 및 10차후에 용출된 집단의 곡선(P) 및 올리고 8 및 9로 구성되어 있는 주형으로부터 전사된 와일드형 RRE 배열의 결합곡선(W)도 나타내었다.
제25도는 특징Ⅰ(a) rev 리간드의 비교이다. 지표는 제24도에서와 동일하다. 또한 여론(consensus)구조의 결합곡선(c)도 도시하였다.
제26도는 특징Ⅰ(b) rev 리간드의 비교이다. 지표는 제24도에서와 동일하다.
제27도는 특징Ⅱ rev 리간드의 비교이다. 지표는 제24도에서와 동일하다.
제28도는 특징Ⅲ rev 리간드의 비교이다. 지표는 제24도에서와 동일하다.
제29도는 특징Ⅰ로서 칭하여지는 HIV rev에 대한 여론 핵산 리간드 용액을 나타낸다.
제30도는 특징Ⅱ로서 칭하여지는 HIV rev에 대한 여론 핵산 리간드 용액을 나타낸다.
제31도는 수우도놋트의 개략도이다. 수우도놋트는 2개의 스템 및 3개의 루우프로 구성되는데, 여기서 스템 S1및 S2와 루우프 1, 2 및 3으로 칭한다.
[발명의 상세한 설명]
본 출원은, 발명의 명칭이 지수증식에 의한 리간드의 계통적 진화로서, 1990년 6월 11일 출원된 미합중국 특허 출원번호 제07/536,428호의 일부 계속 출원이다.
본 연수는 국립보건기구를 통한 미연방정부의 자금 지원하에 이루어졌다. 미연방정부는 본 발명에 대하여 소정의 권리를 갖는다.
[발명의 분야]
본 출원인은, 특히 소정의 표적 분자와 결합하는 신규의 높은 친화성 핵산 리간드를 기술하고자 한다. 특히 소정이 표적 분자와 결합하는 핵산 리간드를 선별하는 방법이 제시된다.
이 방법은 지수증식에 의한 리간드의 계통적 진화(Systematic Evolution of Ligands By Exponential Enrichment)의 약자인 SELEX라고 칭한다. 본 발명의 방법(SELEX)은 소정의 표적 분자용 핵산 리간드를 유리하는데 유용하다.
본 발명의 핵산 생성물은, 검정법, 진단법, 세포선별 등에 있어서 결합반응이 일어날 수도 있는 경우에, 표적 분자기능의 억제제, 프로우브(probe), 격리제 등으로서 유용하다. 또한 본 발명의 핵산 생성물은 촉매활성이 있다. 표적 분자는 단백질, 다당류, 당단백질, 호르몬, 리셉터 및 세포표면과 같은 천연 및 합성 폴리머와 의약, 대사물질, 공동인자, 천이상태 유사체 및 독소와 같은 소분자를 포함한다.
[발명의 배경]
대부분의 단백질이나 소분자가 핵산과 특이하게 결합하는 것으로 알려져 있는 것은 아니다. 공지의 예외적인 단백질은 억제인자, 중합효소, 활성제와 같은 조절 단백질들인데, 이들은 생세포내에서 핵상에서 코드화된 유전정보를 세포구조로 운반하게 하고 유전물질을 복사하게 하는 역할을 한다. 또한 GTP와 같은 소분자는 일부 인트론 RNA와 결합한다.
생물은 진화되어 핵산의 기능을 대량적인 정보역할로 제한하였다. 크릭크(Crick)에 의하여 가정된 중심원리(Central Dogma)는, 원형 및 확장된 형태 모두에서, 핵산(RNA 또는 DNA)이 주형핵산의 정보를 판독(read)하여 상보핵산을 생성하는 복제공정을 통하여 다른 핵산을 합성하는데 있어서, 주형의 역할을 할 수 있다고 제안하고 있다. 유전현상 및 유전자 발현에 대한 모든 실험적 패러다임은 핵산의 이와 같은 성질에 의존하는데; 본질적으로, 염기쌍이라는 화학적 개념 및 복제공정이 상기 염기쌍을 착오없이 반복하여 사용할 수 있다는 점 때문에, 2중사슬 핵산이 정보적으로 다중적(informationally radundant)이다.
단백질의 개별성분인 20개의 천연 아미노산은 충분한 화학적 상이성 및 활성을 가지고 있어서, 결합 및 촉매 작용에 있어서 광범위한 활성을 제공한다. 그러나 핵산은 단백질에 비하여 화학적 가능성이 좁지만, 정보적 기능을 가지고 있어서 유전정보가 비루스에서 비루스로, 세포에서 세포로 및 기관에서 기관으로 전달되게 하는 역할을 한다. 이러한 관계에서, 핵산 성분, 누클레오티드는 왓트손-크릭크(Watson-Crick) 염기쌍내에 정보적 다중복을 허용하는 표면쌍만을 지녀야 한다. 핵산성분은 광범위한 결합작용이나 촉매작용에 충분한 화학적 상이성 및 활성을 지닐 필요는 없다.
그러나 자연계에서 발견되는 일부 핵산은 특정 표적 분자와 결합하는데 참여하는, 몇 개의 촉매작용을 나타내는 사례까지도 보고되어 있다. 이와 같은 종류의 활성 범위는, 단백질 및 보다 구체적으로는 항체에 비하여 좁다. 예를 들면, 핵산이 일부 표적 단백질과 높은 친화성 및 특성을 나타내며 결합할 경우, 그 결합 정도는, DNA 또는 RNA 리간드를 포함하는 누클레오티드의 정확한 배열에 좌우된다. 짧은 2중사슬 DNA 배열은 원핵생물 및 진핵생물 모두에서 전사작용을 억제 또는 활성화하는 표적 단백질과 결합하는 것으로 알려져 있다. 기타의 짧은 2중사슬 DNA 배열은 선택될 수 있는 제한효소, 표적단백질과 높은 친화성 및 특성을 나타내며 결합하는 것으로 알려져 있다. 기타의 짧은 사슬 DNA 배열은, 아마도 염색체 역할에 참여하는 특정 단백질 결합용 리간드를 생성함으로써, 염색체상에서 동원체 및 말단소립(末端小粒)의 역할을 한다. 2중사슬 DNA는, 그 기능이 DNA 결합을 지향하고 있는 표적 단백질의 곳곳에서 결합하는 능력이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 그 예가 적기는 하나 단일사슬 DNA도 일부 단백질과 높은 친화성 및 특성을 나타내며 결합할 수 있다. 2중사슬 DNA 결합 단백질의 알려진 예로부터 아미노산 측쇄를 B형 2중사슬 DNA의 주(主) 그루브(groov) 속으로 넣으며, 특이성을 나타내는 배열검사를 가능케 하는 다양한 단백질 특성과 관련된 결합상호작용을 알 수 있다.
2중사슬 RNA는 때때로, E. coil.로부터의 엔도누클리아제 R Nass Ⅲ과 같은 특정 단백질용 리간드로서의 역할을 한다. 단일사슬 RNA가 분자간 2중사슬화 국부 영역을 내포하는 복합 3차원 형태를 형성하기는 하나, 단일 사슬 RNA 리간드와 결합하는 표적 단백질의 예는 좀더 공지되어 있다. 아미노-아실 tRAN 합성 효소는 tRNA 분자와 높은 특이성을 나타내며 견고히 결합한다. RNA 비루스의 게놈내의 짧은 영역은 비루스 외피 단백질에 견고하게 높은 특이성을 나타내며 결합한다. RNA의 짧은 배열은 박테리오파아지 T4-코드화 DNA 폴리머라제와 역시 높은 친화성 및 특이성을 나타내며 결합한다. 따라서 소정 표적 단백질에 대하여 결합 동반자와 역할을 하는 2중 또는 단일사슬의 RNA 및 DNA 리간드를 찾을 수 있다. 공지된 대부분의 DNA 결합 단백질이 특정적으로 2중사슬 DNA와 결합하는 반면에, 대부분의 RNA 결합 단백질은 단일사슬 RNA를 인식한다. 문헌상의 이와 같은 통계적 편향은 의심할 바 없이, DNA를 2중사슬 게놈으로서 사용하며, RNA의 게놈으로서의 역할 이외의 많은 역할 중에서 RNA를 단일사슬 단위로서 사용하고 있는 현재의 생물권의 통계적 경향을 반영하는 것이다. 화학적으로, 단일사슬 DNA를 완벽한 특정 단백질 상호작용용 동반자로부터 제외할 강력한 근거는 없다.
RNA 및 DNA는 또한 보다 작은 표적부자와도 결합하는 것으로 알려졌다. 2중 사슬 DNA는 액티노미신 D와 같은 다양한 항생물질에 결합한다. 특정 단일사슬 RNA는 항생 티오스트레프톤에 결합하며; 특정 RNA 배열 및 구조는, 특히 그 기능이 표적 기관의 리보솜을 불활성하는 것인, 소정의 기타 항생 물질에 결합한다. 진화적으로 관련된 일단의 RNA들은, 20개 아미노산 중 하나에는 물론(Yarus, M.(1988) Science 240 : 1751∼1758 페이지), 누클레오티드 및 누클레오시드(Bass, B. 및 Cech, T. (1984) Natre 308 : 820-826 페이지)에 특이성 및 양호한 친하성을 나타내며 결합한다. 분자가 형성되는 화학적 가능성이 좁아서 포스포디에스테르 전환반응 및 핵산의 가수분해와는 별로 관련이 없기는 하나, 촉매성 RNA도 현재 알려져 있다.
이들 공지의 예에도 불구하고, 대부분의 단백질 및 기타 세포성분은 생리학적 조건하에서 핵산에 결합되지 않는 것으로 생각되어 왔으며 관측될 수 있는 결합은 특정성이 없었다. 다른 화합물과 결합하는 핵산의 수도 위에서 열거한 비교적 소수의 예에 국한되며, 특정 결합용 핵산의 화학적 목록도 자연에서 발생하는 구조에 반하여 선별되고 있다. 본 발명은, 화합물로서의 핵산이 사실상 제한을 받지 않고 배열형태, 크기 및 구조를 형성할 수 있으며, 생물학적 시스템에서 전개된 것보다 훨씬 목록이 다양하다는 발명자의 근본적인 인식을 전제로 하고 있다.
화학적 상호작용은 공지된 소정의 단백질-핵산 결합의 예의 경우에 탐구되어 왔다. 예를 들면, 박테리오파아지 R17 외피 단백질 결합의 RNA 부위의 크기 및 배열은 울렌베크(Uhlenbeck) 및 공동연구자에 의하여 확인되었다. R17 외피 단백질에 대한 국소 천연 RNA 결합부위(21 염기 길이)는, 다양한 칫수로 라벨된 mRNA의 단편을 니트로셀룰로즈 필터 결합분석처리함으로써 측정되었는데, 상기 분석에서, 단백질-RNA 단편 복합체는 필터에 결합된 상태를 유지한다(Carey 등 (1983) Biochemistry 22 : 2601). 수많은 극소 R17 외피 단백질 결합 부위의 배열 변이체가 시험관에서 생성되어 각개 핵산의 단백질 결합에 대한 기여도를 측정하는데 이용된다(울렌베크 등, 1983) J. Biomol. Structure Dynamicsl : 539 및 Romaniuk 등, (1967) Biochemistry 26 : 1563). 단백질 결합을 위하여 결합부위가 필수적으로 머리핀 루우프 구조를 유지하여야 한다는 것 외에도, 머리핀 스템에서 융기된 누클레오티드를 포함하여, 결합부위의 대부분의 단일사슬 잔기에 있는 누클레오티드 치환체가 현저하게 결합에 영향을 준다는 것이 밝혀졌다. 비슷한 연구에서, 박테리오파아지 Qβ 외피 단백질의 그 번역인자에 대한 결합이 검사되었다(Witherell 및 Uhlebeck (1989) Biochemistry 28 : 71). Qβ외피 단백질 RNA 결합부위는 크기 및 예상 2차 구조에 있어서, R17과 유사한 것으로 밝혀졌는데, 융기된 누클레오티드 및 3염기 루우프를 내포한 8염기쌍 머리핀 구조를 가진 약 20염기를 포함하고 있었다. R17 외피 단백질 결합부위와는 대조적으로 루우프의 단지 하나의 단일사슬 잔기만이 결합에 필수적이며, 융기된 누클레오티드의 존재는 요구되지 않는다. 번역조절과 관련된 단백질-RNA 결합 상호작용은 현저한 특이성을 나타낸다.
핵산은 용액 중 2차 및 3차 구조를 형성하는 것으로 알려진다. 2중사슬 형태의 DNA는 소위 B 2중나사형, Z-DNA 및 고차나선형 코일(superhelical twist)을 내포한다(Rich, A 등(1984) Ann, Rev. Biochem. 53 : 791∼846 페이지). 단일사슬 RNA는 머리핀 루우프와 같은 2차 구조 및 수우도놋트(psdudoknot) 구조의 국부화 영역을 형성한다(Schimmel, 9, (1989) Cell58 : 9∼12 페이지). 그러나, 루우프 구조의 안정도, 형성 반응속도 및 변성, 열역할에 대한 쌍을 이루지 않은 루우프 누클레오티드의 영향은 거의 알려지지 않았으며, 3차 구조 및 3차원 형태에 관한 것이나, 핵산의 3차 중첩에 대한 반응속도 및 열역학에 관한 것은 대부분은 알려진 것이 없다(Tuerk, C. 등 (1988) Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 85 : 1364∼1368 페이지).
RNA 박테리오파아지 Qβ의 복제에 있어서, 실험관내 진화 형태가 보고되어 있다. Mills, D. R. 등 (1967) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58 : 217∼224 페이지; Levinsohn, R. 및 Spiegleman, S. (1969) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60 : 866∼872; Levinsohn, R. 및 Spiegleman, S. (1969) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61; 805∼811; Saffhill, R. 등 (1970) J. Mol. Biol. 51 : 531∼539; Kacian, D. L. 등 (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 : 3038∼3042; Mills, D. R. 등 (1973) Science 180 : 916∼927 페이지. 파아지 RNA는 파아지-특정 단백질의 번역을 지향하는 폴리시트론성 메신저 RNA 역할을 하며 또한, Qβ RNA 레플리카제(replicase)에 의하여 촉매작용을 받은 그 자신의 복제용 주형으로서의 역할도 한다. 이 RNA 레플리카제는 그 자신의 RNA 주형에 대하여 매우 특이적이다. 시험관에서 복제의 순환과정 중, 작은 변이체 RNA가 유리되었는데, 이것도 Qβ레플리카제에 의하여 복제되었다. 복제의 순환과정이 수행되는 조건하에서 극소한 변형으로 인하여 상이한 RNA가 축적되는 현상이 발견되었는데, 이것은 아마도 그 복제가 변경된 조건을 선호한 때문일 것이다. 이들 실험에서 선별된 RNA는 초기 복제의 레플리카제에 의하여 효율적으로 결합되었으며 RNA의 신장중 반응속도면에서 선별된 주형으로서 역할을 하였다. 크라머(Kramer) 등 (1974)은 J. Mol. Biol. 89 : 719에서 Qβ레플리카제의 변이체 RNA 주형을 유리하는 방법을 보고하고 있는데, 그 복제는 천연 주형보다도 브롬화 에티디움에 의한 억제작용에 대하여 더욱 저항성이 있었다. 이 변이체는 초기 RNA 집단에는 존재하지 않았으나 Qβ레플리카제에 의한 시험관에서의 복제 순환과정중에 일어나 연속 변이에 의하여 생성된 것이라는 제안이 있었다. 선별중의 유일한 변화원인은 Qβ레플리카제에 의하여 신장기간중에 일어나는 본래의 착오정도에서 기인하는 것이었다. 이들 연구에서, 칭하는 선별이라는 것은 초기의 균일한 RNA 배열의, 하나 이상의 제한된 수의 자연 발생 변이체의, 선별적인 증폭에 의하여 일어난다. 바람직한 결과의 선별은 없었으며, 다만 Qβ 레플리카제의 활동 양상에 대하여 고유한 것일 뿐이었다.
Joyce 및 Robertson(Joyce (1989). RNA : Catelysis, Splicing, Evolution, Belfort 및 Shub(출판), Elservier Amsterdam pp. 83∼87; 및 Robertson 및 Joyce (1990) Nature 344 : 467)는, 특히 단일 사슬 DNA를 절단하는 RNA를 식별하는 방법을 보고하고 있다. 촉매활성에 대한 선별은, 리보자이메(ribozyme)가 특정 위치에서 기질 ssRNA 또는 DNA의 절단에 촉매작용을 일으키는 능력 및 3'-단부의 기질을 3'-단부의 리보자이메로 전환시키는 능력을 근거로 한다. 소정 반응의 생성물은, 촉매작용에 의하여 형성된 접합부를 지나 오직 완성된 생성물과 결합할 수 있는 올리고디옥시 누클레오티드 프라이머를 이용하여 선별되었으며, 리보자이메 배열의 선별적인 역전사를 허용하였다. 선별된 촉매배열은, T7 RNA 폴리머라제의 프로모터를 cDNA의 3'-단부에 부착함으로써 증폭된 후, RNA로 전사되었다. 이 방법은, 소수의 리보자이메 변이체로부터, 선별된 기질의 절단에 대하여 최대의 반응성을 가지는 변이체를 식별하는데 이용되었다. 변이현상이 증폭중 발생하는 단일 누클레오티드의 변화에 좌우되기 때문에, 단지 제한된 변이체 배열만이 시험가능하였다.
종전 기술은 다른 물질과의 상호작용에 있어서의 핵산에 관한 특정 올리고뉴클레오티 배열과의 결합에 관련된 단백질 리간드의 표적이나, 최근에는 제한된 범위의 활성을 지닌 촉매로서와 같은 화학적 기능을 제한된 범위 밖에는 나타내고 있지 못한다. 종전의 선별 실험은 기존의 기능을 지닌 좁은 범위의 변이체에 국한되어 왔다. 지금부터는 우선 핵산의 광범위한 기능을 이해하게 될 것이며 아래에 그 기능의 이해방법을 개시하고자 한다.
[발명의 요약]
본 발명의 핵산 분자인 신규의 생성물들을 제공하는데 각 생성물은 독특한 배열을 가지며, 소정의 표적 화합물 또는 분자와 특이하게 결합하는 특성을 갖는다. 본 발명의 각 화합물은 소정 표적분자의 특정 리간드이다. 본 발명은 핵산이 2차 및 3차의 다양한 구조를 형성하는 충분한 능력과, 단량체이거나 중합체이든간에 사실상 어떤 화합물과도 리간드로서 작용(특정 결합쌍을 형성)할 수 있는 충분한 화학적 다양성을 단량체내에 지니고 있다는 독특한 견해를 근거로 하고 있다. 어떤 크기의 분자도 표적으로서의 역할을 할 수 있다. 가장 흔하게는 및 바람직하게는 치료방법에 있어서, 결합현상은 생리학적으로 수용 가능한 제한된 범위에 근사한 염, 온도 및 pH 조건하에서 수용액중에 일어난다.
본 발명은 또한, 소정 표적에 대한 핵산 리간드를 제조하는데 일반적으로 응용할 수 있는 방법을 제공한다. 이 방법은, 결합 친화성 및 선별성 선별 방법을 이용하여, 대상 혼합물로부터 선별하고 한 단계씩 구조의 개선을 반복하는 과정을 포함한다. 바람직하게는 랜덤화 배열의 세그먼트를 포함하는, 핵산 혼합물로부터 출발하여, 여기서 SELEX라고 칭하는 본 방법은, 결합에 적합한 조건하에서 혼합물을 표적물과 접촉시키고, 표적분자와 결합된 핵산으로부터 결합되지 않는 핵산을 분리시키며, 핵산-표적쌍을 해리하고, 핵산-표적쌍으로부터 해리된 핵산을 증폭하여 부유화 핵산 혼합물을 생성한 후, 결합단계를 재반복, 분리, 해리 및 증폭을 소정의 순환기간을 통하여 반복하는 단계를 포함한다.
SELEX는, 다수의 가능한 배열 및 구조를 함유하는 핵산 혼합물내에는 소정 표적물에 대한 광범위한 결합 친화성이 있다는 본 발명자의 견해를 기초로 하고 있다. 예를 들면 20 누클레오티드 랜덤화 세그먼트를 포함하는 핵산 혼합물은 420가능 대상물을 가질 수 있다. 친화성 상수가 높을수록 결합할 가능성이 크다. 분리, 해리 및 증폭 후, 보다 높은 결합 친화성 대상물이 되기 위하여, 제2핵산 혼합물이 생성, 부유화된다. 얻어진 핵산 혼합물이 단지 하나 또는 2, 3개의 배열만을 주로 포함하는 것이 될 때 까지 선별과정을 반복하면 최상의 리간드를 얻을 수 있다. 이들은 다음에 순수한 리간드로서의 결합 친화성을 위하여 클론화, 배열화 및 개별적으로 시험될 수 있다.
선별 및 증폭의 과정은 소정 목표가 달성될 때 까지 반복된다. 가장 일반적인 경우, 선별/증폭은, 순환과정을 반복하여도 결합강도에 현저한 개선이 이루어지지 않을 때까지 계속된다. 반복적인 선별/증폭 방법은 매우 민감하여 최소 65,000 배열 변이체를 함유하는 혼합물에서 단일 배열 변이체를 유리할 수 있다. 본 방법은 1014배열을 함유하는 혼합물에서 소수의 높은 친화성 배열까지도 유리할 수도 있다. 원칙적으로, 본 방법은 1018의 상이한 핵산류를 시험하는데도 이용될 수 있다. 시험혼합물의 핵산은 바람직하게는 충분한 증폭에 필요한 보존 배열은 물론, 랜덤화 배열부분도 포함된다. 핵산배열 변이체는, 랜덤화 핵산배열의 합성 및 랜덤하게 절개된 세포 핵산으로부터의 칫수선별을 포함하는, 수 많은 방법으로 생성될 수 있다. 다양한 배열부분은 전체적으로 또는 부분적으로 랜덤 배열을 함유할 수 있는데; 랜덤화 배열과 첨합된 보존배열의 부(副) 부분도 함유할 수 있다. 시험핵산의 배열변형은, 선별/증폭의 반복중 또는 이전에 변이유발에 의하여 도입 또는 증가될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선별공정은, 선별된 표적에 가장 강력하게 결합하는 핵산 리간드를 유리하는데 효율적이어서, 단지 1회의 선별 및 증폭공정이 요구되었다. 이와 같은 효율적인 선별은 예를 들면 크로마토그라피형 공정에서 일어날 수 있는데, 이 공정에서 칼럼상에 결합된 표적과 결합하는 핵산의 능력이 작동하여 칼럼이 최고의 친화성 핵산 리간드를 충분히 분리 및 유리할 수 있게 한다.
많은 경우에 있어서, 단일 핵산 리간드가 확인 될 때 까지 SELEX의 반복단계를 반드시 수행할 필요가 있는 것은 아니다. 표적-특정 핵산 리간드 용액은, 수 많은 보존 배열 및 표적에 대한 핵산 리간드의 친화성에 현저한 영향을 주지 않고 치환 또는 첨가될 수 있는, 다수의 보존 배열 및 다수의 배열을 갖는 일단의 핵산구조 또는 특색을 내포할 수 있다. 완결전에 SELEX 공정을 중단하여, 다수의 핵산 리간드 용액 집단의 배열을 결정할 수 있는데, 이 방법은 핵산 리간드 용액을 포괄적으로 이해할 수 있는 설명을 가능하게 한다.
핵산 리간드 계통군에 관한 기술이 SELEX에 의하여 해결된 후, 소정의 경우, SELEX 실험 중 받은 정보에 의하여 이룩된 일련의 SELEX를 다시 수행할 필요가 있을 수 있다. 하나의 구체예에서, 2차 시리즈의 SELEX는, 리간드 구조의 다른 모든 부부은 랜덤화하는 반면에, 핵산 리간드군의 보존영역을 고정하게 된다. 하나의 선택적인 구체예에서, 가장 대표적인 핵산 리간드군의 집단은 SELEX 공정의 기초로서 이용될 수 있는데, 여기서 핵산배열의 원래의 푸울은 완전히 랜덤화하는 것이 아니고, 가장 잘 알려진 리간드로 편향하는 것이다. 이들 방법에 의하여, SELEX 공정을 최적화하여 가장 바람직한 핵산 리간드에 도달하는 것이 가능하게 된다.
1차, 2차 및 3차 구조의 다양한 핵산이 존재하는 것으로 알려져 있다. 비 왓트손-크릭크(non-Watson-Crick)형 상호작용과 가장 일반적으로 관련되는 것으로 나타나는 구조 또는 특색을 머리핀 루우프, 대칭 및 비대칭 용기(bulge), 수우도놋트(psuedoknot) 및 무수한 이들 조합이라 한다. 대부분의 잘 알려진 경우에 있어서 이들 특색은 그들이 30 미만의 누클레오티드 핵산배열에서 형성될 수 있음을 나타내고 있다. 이와 같은 이유로, 인접하는 랜덤화 세그먼트와의 SELEX 방법은, 약 20~50누클레오티드, 가장 바람직한 구체예에서는 25~40 누클레오티드의, 랜덤화 세그먼트를 함유하는 핵산배열를 개시하는 것이 바람직하다. 본 발명은, 최소 길이가 약 15 누클레오티드인 인접하는 랜덤화 배열을 갖는, 약 109∼1018핵산배열 혼합물을 포함하는 용액을 내포한다. 바람직한 구체예에서, 랜덤화된 배열 부분은 리간드의 증폭을 용이하게 하는 고정된 배열에 의하여 인접하게 된다.
단백질과 같은, 촉매표적의 경우에 있어서, 리간드 친화성은, 제1선별 배열 및 제2랜덤화 배열을 포함하는 대상 혼합물에 SELEX 방법을 적용시킴으로써 증가될 수 있다. 결합과 관련된 제1선별 리간드의 배열 또는 그 부분이, 제2시험 혼합물 핵산의 랜덤화 부분으로 도입될 수 있다. SELEX 방법은 제2시험 혼합물로 반복되어 표적과의 결합용으로 선별된 2개의 배열을 갖는 제2핵산 리간드를 유리시키는데, 제2핵산 리간드는 유리된 제1핵산 리간드에 비하여 증가된 결합강도 및 증가된 결합 특이성을 갖는다. 표적과의 결합에 연관된 제2핵산 리간드 배열은, 다음에 제3시험 혼합물의 다양한 핵산배열 부분으로 도입될 수 있는데, SELEX의 반복 후, 제3혼합물은 제3핵산 리간드가 된다. 이들 공정은, 표적분자에 대한 소정의 결합강도 및 소정의 결합특이성을 지닌 핵산 리간드가 달성될 때까지 반복될 수 있다. 선별된 표적분자에 결합하는 핵산배열원소의 반복적인 선벼루 및 조합이 공정을 여기서 워킹(walking) 이라고 명명하는데, 이 용어는, 제1결합분자내 영역으로부터 시작하여, 기타 접근 가능한 영역인 고분자의 표면 또는 틈(cleft)에 최적 상태로 결합한다는 의미를 내포한다. 리간드와 표적 사이의 결합 접촉 면적을 증가시키면 결합반응의 친화성 상수를 증가시킬 수 있다. 이들 워킹 방법은, 특정 표적분자와의 결합에 대하여 높은 특이성을 나타내는 핵산 항체를 유리하는데 특히 유용하다.
하나의 변형 워킹방법은 앵커(anchor)라고 하는 비핵산 리간드를 채택하고 있는데, 이 앵커는 제1결합분자내 영역으로서 표적분자에 결합한다(제9도 참조). 이 앵커분자는 원칙적으로, 표적분자에 결합하며 핵산에 직접 또는 간접적으로 공유 결합식으로 연결될 수 있는 어떤 비핵산분자일 수 있다. 예를 들어 표적분자가 효소일 경우, 앵커분자는 그 효소의 억제제 또는 기질일 수 있다. 앵커는 또한 표적에 대한 특정 항체 또는 항체 단편일 수도 있다. 앵커분자는 공지 배열의 핵산 올리고머에 공유결합식으로 연결되어 가교상 분자를 생성한다. 올리고머는 바람직하게는 최소 약 3∼10 염기를 포함한다. 대상 핵산의 시험 혼합물은 다음에 가교상 분자의 공지 배열에 대한 상보적 배열 및 랜덤화 부분을 내포하도록 제조된다. 가교상 분자는 표적분자에 착물화된다. 다음에 SELEX는 가교상 분자와 표적분자의 복합체에 결합하는 핵산을 선별하는데 응용된다. 복합체와 결합하는 핵산 리간드가 유리된다. 다음에 상술한 워킹방법은, 복합체에 대한 증가된 결합강도 또는 증가된 결합 특이성을 얻는데 이용된다. 워킹방법은 복합체나 또는 표적 그 자체에 대한 결합을 선별하는 방법을 채택할 수 있다. 이 방법은, 표적분자내의 특정부위에 결합하는 핵산 리간드를 유리하는데 특히 유용하다. 시험 혼합물의 상보 배열은, 가교상 분자의 결합부위나 그 부근에서 표적분자에 결합하는 핵산배열을 확실하게 유리시키는 역할을 한다. 가교상 분자가 표적분자의 억제제로부터 유도된 경우, 이 방법은 표적분자의 기능을 억제하는 핵산 리간드를 발생시키는 경향이 있다. 이것은, 단백질 기능을 활성화 또는 억제하는 핵산을 유리하는 경우 등에 있어서 특히 유용하다. 리간드와 표적의 조합은 새로운 강화기능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 핵산 리간드는 복수의 리간드 성분을 함유할 수 있다. 상술한 바와 같이, 워킹방법으로 유도된 핵산 리간드는 하나 이상의 핵산 리간드 성분을 갖는 것으로 고려될 수 있다. 본 발명은 또한, SELEX에 의하여 식별된 핵산 리간드와 동일하지는 않으면서도 SELEX로 얻어진 결과를 기초로 하여 구성된 핵산 항체도 내포한다. 예를 들면, 복수의 동일한 리간드 구조가 단일 핵산의 부분으로 제조되는 핵산 항체가 구성될 수 있다. SELEX 실험도 수행될 수 있는데, 여기에 최상의 핵산 항체를 식별하기 위하여, 고정된 동일 또는 상이한 리간드 구조는, 랜덤 핵산 영역 및/또는 고정 리간드 구조 사이의 거리가 변화하는 영역에 의하여 결합한다.
표적분자의 기능에 미치는 핵산 리간드의 결합효과를 평가하기 위한 검정법, 선별법 또는 스크린법은 용이하게 SELEX 방법과 결합될 수 있다. 특히, 효소활성의 억제 또는 활성화에 대한 스크린 방법은 SELEX 방법과 결합될 수 있다. 특히, 효소활성의 억제 또는 활성화에 대한 스크린 방법은 SELEX 방법과 결합될 수 있다. 특히, 효소활성의 억제 또는 활성화에 대한 스크린 방법은 SELEX 방법과 결합될 수 있다.
좀더 특별한 구체예에서, SELEX 방법은 핵산-결합 단백질 및, 생물학적 기능부분으로서 핵산과 결합여부를 알 수 없는 단백질 모두를 포함하여, 단백질에 결합하는 핵산 리간드를 유리하고 식별하는 신속한 수단을 제공한다. 핵산결합 단백질은 많은 기타 폴리머라제 및 역전사효소를 내포한다. 본 방법은 또한 누클레오티드, 누클레오시드, 누클레오티드 공동인자 및 구조적으로 관련된 분자와 결합하는 단백질에 용이하게 응용될 수 있다.
다른 관점에서 본 발명은 표적분자의 존재 여부를 검출하고 및/또는 그 량을 측정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 여기서 설명한 방법에 의하여 유리될 수 있는 핵산 리간드를 채택하고 있다. 표적분자의 검출은, 표적분자에 대한 특정 핵산 리간드와의 결합에 의하여 매개된다. 핵산 리간드는 라벨(예를 들면 라이도라벨)되어 질적 또는 양적 검출이 가능하게 된다. 검출 방법은 단백질인 표적분자에 대하여 특히 유용하다. 이 방법은 그 생물학적 기능의 일부로서 핵산 결합여부를 알 수 없는 단백질의 검출에 더욱 유용하다. 본 발명의 핵산리가드는, 종래의 항체 기준진단과 유사한 방법으로 진단에 채용될 수 있다. 이와 같은 검출방법 및 진단에 있어서의 종래의 항체에 대한 핵산 리간드의 하나의 장점은, 핵산이 PCR 증폭 또는 관련 방법등의 이용에 의하여 실험광에서 용이하게 증폭될 수 있다는 점이다. 다른 장점은 전반적인 SELEX 공정이 실험관에서 수행되며 면역시험 동물을 필요로 하지 않는다는 점이다. 또한, 핵산 리간드의 결합친화성이 이용자의 필요에 부응할 수 있다.
작은 표적분자의 핵산 리간드는 진단 검정시약으로서 수용하며, 금속이온 봉쇄제, 약물운반매개체 및 호르몬 작용 조절제로서 치료적 용도가 있다. 촉매 핵산은 본 발명의 선택적 생성물이다. 예를 들면, 효소 촉매 반응의 천이 상태 유사체에 대한 결합을 선택함으로써, 촉매핵산이 선택될 수 있다.
또 다른 관점에서 본 발명은, SELEX에 의하여 유리될 수 있는 핵산 리간드를 이용하여 표적분자의 기능을 변성시키는 방법을 제공한다. 표적분자와 결합하는 핵산 리간드는 스크린되어 표적분자의 기능을 특정적으로 변성시키는 것들을 선별하는데, 예를 들면, 표적분자 기능의 활성제 또는 억제제를 선별한다. 표적분자의 기능을 변성시키는데 효과적인 일정량의 선별된 핵산 리간드가 표적분자와 결합되어 소정의 기능성이 달성된다. 이 방법은 단백질인 표적분자에 특히 적용될 수 있다. 특히 유용한 본 방법의 용도는 단백질 기능을 억제하는 것인데, 예를 들면, 수용체가 작동체에 결합하는 것을 억제하거나 효소 촉매 작용을 억제하는 것이다. 이 경우에, 표적 단백질 억제작용에 유효한 일정량의 선별된 핵산분자가 표적분자와 결합되어 소정의 억제작용을 달성한다.
[상세한 설명]
아래의 용어들은 정의된 바에 따라 여기서 사용된다.
핵산은 단일사슬이나 2중사슬의 DNA, RNA와 그 화학적 수식체를 의미하는데, 다만 그 수식은 선별된 핵산의 증폭을 간섭하지 않는 것이다. 이와 같은 수식에서는, 이것에만 제한되는 것은 아니나, 시토신 고리밖아민에서의 수식, 5-브로모-우라실의 치환, 백본(backbon)수식, 메틸화, 이상 염기쌍 조합 등이 포함된다.
리간드는 다른 분자(표적)와 결합하는 핵산을 의미한다. 대상 핵산집단에 있어서, 리간드는 다른 대부분의 집단보다 높은 친화성을 결합하는 것들이다. 대상 혼합물에는 소정의 표적에 대하여 하나 이상의 리간드가 존재할 수 있다. 리간드는 표적분자에 대한 결합친화성으로 구분될 수 있다.
대상 혼합물은 배열을 달리하는 핵산의 혼합물인데, 여기서 요구되는 리간드를 선별한다. 대상 혼합물의 공급원은 천연발생 핵산 또는 그 단편, 화학적으로 합성된 핵산, 효소적으로 합성된 핵산 또는 상기 기술 등의 조합에 의하여 제조된 핵산으로부터 나올 수 있다.
표적분자는 리간드가 요구되는 것으로 주목되는 모든 화합물을 의미한다. 표적분자는 단백질 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 리셉터(receptor), 항원, 항체, 비루스, 기질, 대사물질, 천이상태 유차세 공동인자, 억제제, 의약, 염료, 영양제, 성장인자 등 제한없이 될 수 있다.
분리는 여기서 리간드-표적쌍이라고 부르는, 표적분자에 결합된 리간드가, 표적분자에 결합되지 않는 핵산으로부터 분리될 수 있는 과정을 의미한다. 분리는 당 분야에 공지된 다양한 방법으로 완수될 수 있다. 핵산-단백질쌍은 니트로셀룰로즈 필터에 결합될 수 있는 반면에, 미결합 핵산은 결합될 수 없다. 리간드-표적쌍을 특정적으로 보유하고 있는(또는 부착된 표적에 착화된 결합리간드를 특정적으로 보유하고 있는) 칼럼은 분리용으로 이용될 수 있다. 여과 겔 억제법(filteration gel retandation)은 물론 액상-액상분리 및 밀도구배원심분리법도 이용될 수 있다. 분리방법의 선별은 표적과 리간드-표적쌍의 특성에 좌우되며, 당 분야의 통상적인 숙련자에게 공지된 원리 및 특성에 따라 결정될 수 있다.
증폭이란 분자의 커피 또는 분자종류의 량 또는 수를 증가시키는 공정 또는 공정의 조합을 의미한다. 개시된 실시예에서 RNA 분자를 증폭하는 것은 일련의 3개의 반응에 의하여 수행되었다 : 선별된 RNA들의 cDNA 카피제조, 폴리머라제 연쇄반응을 이용하여 각 cDNA의 카피수를 증가 및 cDNA 카피를 전사하여 선별된 RNA들과 동일한 배열을 갖는 RNA 분자를 얻는다. 당 분야의 숙련자에게 공지된 바와 같이, 직접 DNA 복제, 직접 RNA 증폭 등과 같은 방법을 포함하여, 당 분야에 공지된 반응 또는 반응들의 조합이 적절히 이용될 수 있다. 증폭방법은 결과적으로, 증폭된 혼합물의 비율면에 있어서, 초기 혼합물내의 상이한 배열의 비율을 필수적으로 나타내도록 되어야 한다.
특이적 결합이라는 것은 각각의 경우에 따라 정의되는 용어이다. 주어진 리간드 및 표적간의 상호작용관계에 있어서, 표적과 대상 리간드 혼합물 사이에 측정된 것보다 높은 친화성을 나타내는 표적과 리간드의 하나의 결합 상호작용이 관측된다. 결합친화성을 비교하기 위하여는 양쪽 결합반응의 조건이 동일하여야 하며, 사용목적의 조건과 비교할 수 있어야 한다. 가장 정확한 비교를 위하여는, 전체 리간드와 전체 표적 사이의 상호작용을 반영하는 측정이 이루어져야 한다. 본 발명의 핵산 리간드는, SELEX 중 필요한 특이성을 요구하는 선별조건을 세우거나, 워킹을 통하여 리간드를 테일로링(tailoring)과 수식 및 SELEX의 상호작용을 이용하는 기타 수식에 의하여 요구되는 특성에 맞도록 선별될 수 있다.
랜덤화(randomized)라는 용어는 소정의 길이에 결쳐서 원칙적으로 임의의 가능한 배열을 갖고 있는 핵산의 세그먼트를 기술할 때 사용된다. 랜덤화 배열은, 필요에 따라 약 8로부터 100 누클레오티드 이상의 범위를 갖는 다양한 길이를 갖는다. 랜덤 배열 세그먼트가 만들어지게 되는 화학 또는 효소반응은, 존재할 수도 있는 알 수 없는 편향성 또는 누클레오티드 선호성 때문에, 계산상의 랜덤배열을 생성하지 못할 수도 있다. 랜덤화라는 용어는, 비이상성으로부터의 이와 같은 편향 가능성을 반영하기 위하여 랜덤 대신에 사용된다. 순차적 화학합성과 같은 현재 공지된 기술에 있어서, 큰 편차가 일어나는 것으로는 알려져 있지 않다. 20 누클레오티드 미만의 짧은 세그먼트에 있어서, 존재할 수도 있는 극소 편향성은 무시할 수 있는 정도이다. 단일 합성의 배열이 길수록 편향성의 영향은 크다.
편향성은, 합성 반응의 전구체 누클레오시드(또는 디옥시누클레오시드) 트리포스페이트의 몰비율을 변경하는 것과 같은 방법 등에 의하여 랜덤화 배열에 의도적으로 도입될 수 있다. 소정기관내에서 개별 염기의 비율에 근접하기 위하여 또는 2차 구조에 영향을 미치기 위하여 고의적인 편향성이 요구될 수도 있다.
SELEXION은, 핵산 리간드를 식별하고, SELEX 공정중의 어떤 변형이 공정의 최적화에 최대의 영향을 주는가를 예견하는 SELEX의 강력한 능력을 전시하기 위하여 사용된 수학적 분석 및 컴퓨터 시뮬레이션을 가르킨다.
SELEXION은 비선형 분석에 의하여 집적 최적화된 지수증식에 의한 리간드의 계통적 진화(Systematic Evolution of ligands by Exponential enrichment with Integrated Optimization by Nonlinear analysis)이 약자이다.
핵산 항체라는 것은 표적분자에 선별적으로 결합하는 분리된 핵산구조 또는 특징을 포함하는 하나의 핵산 리간드류를 가르킬 때 사용되는 용어이다. 핵산 항체는 2중 또는 단일사슬 RNA 또는 DNA로 제조될 수 있다. 핵산 항체는 합성되며, 바람직한 구체예에서는, SELEX 공정에 의하여, 소성의 표적에 대한 리간드 용액이나 수용된 용액을 기초로 하여 구성된다. 많은 경우에, 본 발명의 핵산 항체는 자연발생되지 않는 것이나, 다른 환경에 있어서 그들은 자연적으로 발생하는 핵산 배열과 현저한 유사성을 가질 수 있다.
본 발명의 핵산 항체는, 표적에 대하여 특이적 결합친화성을 갖는 모든 핵산을 내포하나, 표적이 왓트선/크릭크 염기상이나 3중 나선체(trcple helixagent)(참조, Riordan, M. 등(1992) Nature 350 : 442-443)에 주로 의존하는 메카니즘을 통하여 핵산과 결합하는 폴리누클레오티드일 경우는 포함하지 않는다 : 그러나, 단, 핵산 항체가 2중 사슬 DNA일 경우, 표적은, 그 생리학적 기능이 2중사슬 DNA와의 특이적 결합이 좌우되는 자연 발생 단백질이 아니다.
RNA 특징이라는 용어는 RNA 분자의 2차 또는 3차 구조를 기술하기 위하여 일반적으로 사용된다. RNA의 1차 배열은 일차원적인 누클레오티드(A, C, G 또는 U)의 특정 열(string)이다. 3차원 형태를 지시하는 것이 1차 배열이기는 하나, 1차 배열은 RNA의 3차원 형태에 관하여 처음부터 정보를 제공하지 않는다. 어떤 경우에는, 소정의 표적 위에서 SELEX를 수행한 후에 얻어진 리간드 용액이 1차 배열로서 최상으로 표시될 수 있다. 그와 같은 리간드 용액에 속하는 구조적 정보가 SELEX에 의하여 얻어진 결과를 기초로 하며 항상 확인될 수 있는 것이 아니긴 하나, 1차 배열로서의 리간드 용액의 표현이 절대 필요한 3차 구조의 존재를 부정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
RNA 특징의 2차 구조는 특정 누클레오티드간의 2차원적 접촉에 의하여 표현된다. 가장 용이하게 인식된 2차 구조 특징은 왓트손/크릭크 염기쌍 A : U 및 C : G를 포함한다. 흔히 안정성이 낮은 비 왓트손/크릭크 염기쌍은 G : U, A : C, G : A 및 U : U쌍을 포함한다(염기쌍은 한 번 제시됨; RNA 분자에서 종래의 X : Y 염기쌍은, X가 Y에 대한 5'인 하나에 배열이어서, 염기쌍 Y : X도 허용됨). 제13도에서, 단일 사슬 영역에 의하여 연결된 한조의 2차 구조가 제시되는데; 2차 구조에 대한 종래의 명명은 머리핀 루우프, 비대층 융기 머리핀 루우프, 대칭 머리핀 루우프 및 수우도놋트를 포함한다.
1차 배열과는 거리가 멀며, 왓크손/크릭크 및 비완스손/크릭크 염기쌍을 통하여 상호작용하는 것으로 생각되지 않는 누클레오티드가 사실상 상호작용을 할 경우, 이들 상호작용(흔히 2차원적으로 묘사된다)도 2차 구조의 일부이다.
RNA 특징의 3차원 구조는 RNA 특징의 원자의 공간적인 설명일 뿐이다. 나선형 백본의 모든 원자의 정확한 위치는 RNA내 염기의 정확한 배열에 좌우되기는 하나,왓트손/크릭크 짝짓기를 통하여 완전히 염기쌍을 이룬 2중사슬 RNA는 3차원의 정상적인 구조를 갖는다. RNA 특징의 2차 구조와 관련된 많은 문헌이 있는데, 왓트손/크릭크 염기쌍을 갖고 있는 2차 구조는 흔히 A형 2중사슬 나선을 형성하는 것으로 생각된다.
A형 나선으로부터, 3차원의 다른 특징으로 전개할 수 있다. 비 왓트손/크릭크 염기쌍, 머리핀 루우프, 융기 및 수우도놋트는 나선형을 기초로 한 구조이다. 이들 추가특징의 구조는 좀더 완벽하게 원문에 기술된다.
RNA의 실제 구조는 3차원 분자인 누클레오티드의 모든 원자를 내포한다. 완전분해하는 것이 연구가에 의하여 좀처럼 달성되지는 않으나, 완전히 분해된 구조는 결합 수 및 무기원자를 내포한다. 3차원에서 분리된 RNA 구조는 모든 2차 구조 요소(3차원 구조로 표현된) 및 2차 구조 요소에 의하여 제한받지 않은 누클레오티드 원자에 대한 고정위치를 내포한다.
RNA들의 1차 배열은, 고정된 2차 구조를 제한하는 것과 같이, 가능한 3차원 구조를 제한한다. RNA의 3차원 구조는, 2차원에서의 원자간 특정 접촉에 의하여 제한을 받으며, 다음에 에너지로 최소화 및, 생성 분자가 동일한 1차 및 2차 배열의 구조를 갖는 다른 형태보다 더 안정되도록 모든 자유로히 회전할 수 있는 결합들을 회전시키는 분자의 능력에 의하여 다시 제한을 받는다.
가장 중요한 것은, RNA 분자가, 제13도에 도시한 임의의 수의 특징을 포함하는 RNA 특징의 집합으로 구성되어 있는 3차원의 구조를 갖는다는 것이다.
따라서, RNA 특징은, 핵산 화합물이 형성할 수 있는 가장 안정한 형태의 그룹으로 일반적인 용어로 설명할 수 있는 모든 방법을 포함한다. 소정의 표적에 대하여, 리간드 용액 및 핵산항체는 여기서 설명한 RNA 특징들 또는 몇 개의 RNA 특징의 일부 조합들 중의 하나일 수 있다.
리간드 용액은 통상적으로 고정된 3차원 구조로서, 또는 SELEX를 통하여 식별된 보존성분을 규정하는 집단으로서 정의된다. 예를 들면, 특정 표적용으로 확인된 리간드는 보통 1차 배열(NNNCGNAANUCGN'N'N')을 함유할 수 있는데, 그것은 다음과 같이 2차원의 머리핀으로 표현될 수 있다 :
AAN
N U
G C
C G
N N'
N N'
N N'
3차원 구조는 다섯 염기쌍 중 셋, 및 다섯 루우프누클레오티드 중 둘의 정확한 배열에 대하여 민감하지 않으며, 배열/구조의 거의 모든 면에서 보아 계속 다시 사용할 수 있는 적절한 리간드이다. 따라서 리간드 용액은 가능한 대 집단의 적절한 배열/구조를 나타내는 것을 의미하는데, 각각은 모든 정확한 배열/구조 용액을 포함하는 계통군의 설명에 의하여 식별된다.
이러한 정의를 통하여, 리간드 용액은 다양한 성분의 RNA 특징간에 정확한 수치적 균등성이 있는 구성멤버만을 포함할 필요는 없다는 것을 의미하게 된다. 일부 리간드는, 예를 들면, 5 누클레오티드의 루우프를 갖는 반면에 동일한 표적에 대한 다른 리간드는 동일한 루우프에 2, 3개 또는 5개 이상의 누클레오티드를 함유할 수 있으며 또한 리간드 용액의 설명중에 포함될 수도 있다.
SELEX에 의하여 유도된 리간드 용액이 비교적 다수의 가능한 성분을 내포할 수는 있으나, 리간드 용액은 표적 특이적이며, 대부분 리간드 용액 계통군의 각 구성멤버는 표적에 대한 핵산 항체로서 사용될 수 있다. 핵산 항체로서 이용되는 리간드 용액 계통군으로부터의 특정 구성멤버의 선별은 부문에 설명된 대로 이루어질 수 있으며 당 분야의 통상적인 숙련자에게는 자명한, 많은 고려사항의 영향을 받을 수 있다.
본 발명의 방법은 박테리오파아지 T4 감염에 있어서 번역조절의 조사와 관련하여 개발되었다. 박테리오파아지 T4 DNA 폴리머라제(gp 43)와 같은 특정 비루스 단백질 합성의 자동조절은 단백질을 그 자신의 메시지와 결합시키고, 그 번역을 차단하게 된다. SELEX 방법은 gp 43 RNA 결합부위의 배열 및 구조요건을 설명하는데 이용되곤 한다. SELEX는 랜덤 핵산 배열로부터 바람직한 결합부위를 신속히 선별하게 한다. RNA에 결합되는 것으로 알려진 단백질에 결합되는 핵산 배열의 유리 및 식별에 의하여 예시되기는 하였으나, 본 발명의 방법은 일반적으로, 임의의 소정 단백질과 결합할 수 있는 핵산의 선별에 응용된다. 본 방법은, 자연적 활성 또는 생물학적 기능의 일부로서 핵산과 결합하지 않는(혹은 결합하는 것으로 알려지지 않은) 단백질과 결합하는 핵산의 선별에 응용할 수 있다. SELEX 방법은 결합부위의 구조 또는 배열에 관한 어떤 지식도 요구하지 않으며 표적 단백질의 구조 또는 배열에 관한 어떤 지식도 요구하지 않는다. 이 방법은 선별을 위하여 정제된 표적 단백질에 의존하지 않는다. 일반적으로, SELEX를 응용하면 대부분의 많은 표적의 리간드를 부유화시킨다. 리간드 혼합물에 있어서, 소정 표적의 기란드를 유리하는 기술이 있을 수 있다. 예를 들면 표적과의 결합을 특이하게 완결하기 위하여, 소정 표적의 다른 리간드(예를 들면, 기질, 억제제, 항체)가 사용되어 소정 핵산 리간드가 다른 표적의 리간란드로부터 분리될 수 있다.
바람직한 구체예에서, SELEX로부터 유도된 리간드는 단일사슬 RNA 배열을 포함한다. 본 발명자들이 RNA에 관하여 당 분야의 통상적인 결론과 대조적인 결론을 내릴 수 있으며, 이들 결론을 SELEX 공정을 이룩하는데 이용하여 리간드 용액으로부터 유도된 핵산 항체를 달성할 수 있다는 것은 본 발명의 임계요소이다.
RNA는 우선, 유전자인 DNA 배열과 효소 및 기타 단백질 내에서 발견되는 단백질 배열 사이의 정보 메신저로서 인식된다. 왓트손 및 크릭크가 DNA의 구조 및 DNA 배열과 단백질 배열 사이의 관계를 발표한 직후부터, 단백질 합성방법은 훨씬 실험적 생화학으로 집중되었다. 우연히 메신저 RNA(mRNA)는 유전자와 단백질 사이의 화학적 중간체로 확인되었다. 기관에 존재하는 RNA류의 대부분은 mRNA들이며 이들 RNA는 계속하여 대량으로 정보분자로서 나타난다. RNA가 누클레오티드의 1차 배열을 통하여 유전자 물질로서의 그 기능을 하는 것과 같은 방법으로, RNA는 누클레오티드의 1차 배열을 통하여 대량으로 정보분자로서의 그 역할을 하는데; 즉, 핵산 내의 정보가 1차원으로 표현될 수 있다.
유전자 발현의 생화학이 연구된 바와 같이, 세포내 몇 개의 RNA 분자는 그 역할이 정보와 관련이 없는 것으로 밝혀졌다. 리보솜은 mRNA가 단백질로 번역되어지는 실체라는 것이 발견되었으며, 리보솜은 필수 RNA(리보솜 RNA들, 또는 rRNA들)를 함유한다는 것이 발견되었다. 수년간 rRNA들은, 리보솜의 단백질 성분이 리보솜의 단백질 합성 작용을 수행하도록 리보솜의 단백질 성분이 걸려 있는(hang) 일종의 골격구조로 되어 있다고 생각되었다. 별도의 많은 RNA 부류, 전달 RNA들(tRNA들)은 가정되고 발견되었다. tRNA들은 mRNA내에 코돈을 인식하고 단백질로 농축되는 아미노산을 운반하는 화학적으로 2원 기능 어댑터이다. 가장 중요한 것은, tRNA 구조가 1974년 X-레이분석에 의하여 관측되기는 하였으나, RNA는 몇 십년간 1차원의 열(string)로 생각되었다는 점이다. rRNA는 연구분야에 있어서 이색적인 위치를 차지하였다. 장기간 동안, 다양한 종류로부터 나온 rRNA에 깊은 유사성이 있는 이유 및 RNA 분자의 실제적인 화학적 능력을 아무도 깨닫지 못하였다. 몇몇 연구자들이 RNA가 정보적 역할보다는 일단은 효소적 역할을 한다고 가정하였으나 이 가정은 현재의 RNA 기능을 예견하는 전제가 되지 않는다. 리보자임에 관한 Tom Cech의 연구 … 신규의 RNA 분자류 … 는 RNA의 기능에 관한 관점을 확대시켰다. 그룹 I 인트론은 자동촉매작용적으로 연결될 수 있어서, 최소한 제한된 촉매 작용이 RNA의 범위내에 존재한다. 이 촉매 장용의 범위내에 알트만 및 페이스(Altman and Pace)에 의하여 발견된 활성, RNase P의 RNA 성분의 활성이 존재한다. Cech 및 Altman은 이 공로로 노벨상을 수상하였는데, 이것은 정보적 역할에 대한 RNA 분자의 종전의 제한을 근본적으로 변화시켰다. Cech 및 Altman의 연구때문에 rRNA들은, 일부 사람들에 의하여 지금은 리보솜의 촉매 센터로 생각되고 있으며, 이제는 더 이상 단순히 구조적으로 생각하지 않는다.
본 발명의 중심적인 전제가 되는 것은, RNA 분자가 결합 및 기타 능력에 있어서 연구분야에 의하여 과소평가되고 있다는 것이다. 리보자임이 RNA 기능에 관한 연구분야에서 괄목할 만한 진전을 가져왔으나, 본 출원은, RNA분자(필연적으로 DNA는 물론)에 대한 형태 가능성이, 실질적으로 어떠한 결합 기능을 지닌 RNA들을 발견하는데 있어서 SELEX를 이용할 기회를 부여한다는 점을 고려하고 있다. 본 출원은 또한, RNA에 대한 촉매기능 범위는, 단백질 범위만큼 넓을 필요는 없으나, 현존하는 종래의 개념을 뛰어넘어 훨씬 넓다는 점을 고려하고 있다.
일부 RNA의 3차원 형태는 X-레이 회절법이나 NMR 방법으로부터 직접 알 수 있다. 존재하는 데이터는 희귀하다. 3개의 RNA 소분자 : 2개의 작은 머리핀 및 작은 수우도놋트와 함께 4개의 tRNA의 구조가 밝혀졌다. 다양한 tRNA들이 독특한 구조요소를 갖는데; 예를 들면 신장인자 tRNA의 안티코돈 염기는 용매의 기능을 발휘하는데 반하여, 개시제 tRNA의 안티코돈 염기는 용매와는 거리가 멀다. 일부의 이들 차이점은 결정격자 충진력을 발생시키나, 일부는 또한 의심할 바 없이, 동종 2차원 및 3차원 구조내의 상이한 단일사슬 배열에 의하여 특이체질적 에너지 최소화 결과를 낳는다.
배열변경의 방법은 넓다. RNA 머리핀의 단일사슬 루우프가 8 누클레오티드를 함유하는 경우, 65.536의 상이한 배열이 포화 배열 공간(space)을 포함한다. 이와 같은 이론의 주장에 제한을 받는 것은 아니나, 본 발명의 발명자들은, 그 조성의 각 멤버는, 에너지 최소화를 통하여, 가장 안정된 구조를 가지며, 이들 구조의 대부분이 용매나 단백질과 같은 잠재 가능성 상호작용 표적분자에 미묘하게 구별되는 화학적 표면을 제공하는 것으로 믿는다. 즉, 특정 구조적 특징내의 모든 65.536 배열을 박테리오파아지 T4 DNA 폴리머라제에 대하여 시험하였을 때, 그 조성으로부터의 2배열이 다른 모든 배열보다 양호하게 결합되었다. 이와 같은 현상은 상기 2배열의 구조적인 면이 그 표적에 대하여 특이적이며, 나머지 65.534 배열은 그 표적에 대한 결합에 있어서 2배열 만큼 적합하지는 않다는 것을 의미한다. 65.536 배열 중에는, 다른 표적과의 상호작용에 최적일 수 있는 기타의 멤버가 있다는 것을 거의 확실하다.
RNA 구조의 설명에 있어서 관건이 되는 개념은, RNA들이 흔히 랜덤 코일 또는 플로피, 비구성요소를 암시하도록 유도되기는 하여도, 모드 배열은 자신의 최대 안정 구조를 찾는다는 점이다. 왓트손/크릭크 염기쌍을 형성할 수 없는 RNA의 호모몰리머는, 인접 염기의 상호간의 위치를 고정시킴으로써 얻어진 중첩에너지에 기인하는 비랜덤 구조를 갖는 것으로 흔히 밝혀진다. 분명히 4개의 모드 누클레오티드와 관련되는 배열은 고정된 구조의 국부 영역을 가질 수 있으며, 왓트손/크릭크 염기쌍 없이도 비동형 배열은 처음 가정한 것보다도 더 많은 구조를 가질 수 있다. RNA 루우프의 고정된 구조에 대한 경우도 강력하다. tRNA의 안티코돈 루우프는 하나의 구조를 갖어서, 아마도, t4DNA 폴리머제에 최상으로 결합하는 2개의 위닝(winning) 배열을 갖는다.
RNA의 상보배열의 비 평행사슬은 A-형 나선을 산출하는데, 이로부터 루우프 배열이 나오고 되돌아간다. 루우프 배열이 상호작용을 하는 강력한 능력은 없다 하여도, 에너지 최소화는 에너지적으로 자유구조의 최적화이다(즉, 어떠한 분명한 활성화에너지도 루우프 배열의 에너지 최소화를 방해하지 않는다는 것이다). 최적화를 위한 운동역학적으로 유사한 개시점은 RNA 스템의 루우프 접근 염기쌍일 수 있는데, 이것은 루우프 누클레오티드 및 염기의 최적 중첩이 일어날 수 있는 평평한 표면을 제공한다. RNA의 루우프는, 비평행 알파-나선 또는 베타-사슬을 연결하는 단백질 루우프와 원칙적으로 동일하다. 이들 단백질 루우프를 흔히 랜덤 코일이라고 부르기는 하나, 그들은 랜덤형도 코일형도 아니다. 이와 같은 루우프를 오메가 구조라고 하는데 이는, 루우프가 상호간 비교적 가까운 위치로 출입하며 (참조, Leszczynski, J. 및 Rose. G. 등(1986) Science 234 : 849-855 페이지); 단백질의 이들 위치가 RNA 머리핀의 루우프 접근 염기쌍과 관념적으로 동일하다는 것을 반영하는 것이다.
많은 오메가 구조가 X-레이 회절법에 의하여 밝혀졌는데 그 구조는 특이체질적이다. 분명히 각 구조는, 단부가 서로 가까운 루우프상에 작용된 독특한 에너지 최소화의 결과이다. 단백질 및 RNA 양 쪽에서, 이들 루우프는, 아미노산의 루우프 근접쌍 또는 염기쌍을 제외하고는 나머지 구조로부터의 정보없이 에너지 최소화를 한다. 단백질 오메가 루우프 및 RNA 머리핀 루우프 양쪽에 있어서, 자유로히 회전가능한 모든 결합은 자유 에너지를 최소화하는 기도에 참여한다. 단백질이 RNA보다 좀더 많은 자유도를 갖는데 반하여, RNA는 단백질보다 정전기에 대한 응답성이 높은 것으로 보여진다. 에너지 최소화를 통하여 RNA 구조를 측정하면, 단백질에 대한 측정과 필적할 수 있는 정확한 분해 구조를 산출한다.
RNA 및 단백질 양쪽의 단일사슬 영역은 가능한 구조를 확장시키도록 고정될 수 있다. 즉, 단일사슬 루우프가 알파-나성형 또는 베타-사슬형 평행사슬의 단백질구조에서 출입하는 경우, 출입의 지점은 오메가 구조에서 보다도 훨씬 상호간으로부터이다. 또한, 펩티드의 단일사슬에 의하여 연결된 거리는 평행 알파-나선 또는 메타-사슬의 길이에 의하여 변경될 수 있다.
단일사슬이 고정된 단백질 2차 구조상에 놓여져 있는 단백질 구조에 있어서, 얻어진 에너지 최소화는, 원칙적으로 단일사슬 분자내 영역과 하부위치 구조 사이의 상호작용을 허용하게 한다. 이것은 2차구조의 염교(salt bridge)를 형성할 수 있는 아미노산 측쇄가 정규 2차 구조 정상에 위치하는 확장된 단일사슬에서 동일한 행위를 하는 것으로 보여진다. 이와 같은 단백질 영역의 정확한 구조는 다시 특이체질적이며 매우 배열의존적이다. 이 경우, 배열 의존성은 단일사슬 및 2차 구조의 하부위치 배열을 모두 포함한다.
주목할 것은, 수우도놋트로 알려진 RNA 구조는 이들 확장된 단백질 특징과 유사하며, 용매 또는 염기가 용매/표적이나 하부위치 RNA 2차 구조를 향하여 특이체질적으로 배열된 RNA의 확장된 단일사슬 표적분자를 향하여 개선되는 역할을 한다. 수우도놋트는, 보통 평행사슬 사이의 루우프를 기초로 한 단백질 특징과 함께, 단일사슬의 길이 및 위치하고 있는 나선의 배열을 변경시키는 능력을 갖고 있다.
단백질 특징에 있어서 정확히 유사하게, 하부위치 2차 구조내 배열과의 공변화(covariation)에 의하여, 용매나 하부위치 구조를 향하여 단일사슬 누클레오티드를 전개하는 것이 가능하여, 표적과 상호작용하는 기능적 화학그룹 및 정전기를 변경시킨다. 이와 같은 구조적 변경이 에너지 극소화에 따른 것인데, 명확도가 낮은데도 단지 하나의 수우도놋트 구조만이 알려져 있다는 사실을 유의하는 것이 중요하다. 그럼에도 불구하고 본 발명의 가치는, 수우도놋트로부터 나올 수 있는 형태 및 기능적 표현은 독특한 특질에 있어서 거의 무한하다는 인식에서부터 발생한다.
수우도놋트의 머리핀 루우프 및 단일사슬 분자내 영역은 비평행 RNA 나선상에 놓여진다. RNA의 나선은 융기라고 불리우는 비정상 부분을 내포할 수 있다. 융기는 나선의 한 사슬이나 양쪽에 존재할 수 있으며, 표적의 식별에 유용한 특이체질적 구조적 특징을 제공한다. 또한, 나선 비정상 부분은 정상 나선 사이에 각을 이룬 연결 부분을 제공할 수 있다.
RNA의 한 사슬상의 큰 융기(13도 참조)는, 루우프 근접 염기쌍이 융기와 측면을 이루는 2개의 염기쌍에 의하여 대치된 점을 제외하고는, 머리핀 루우프와 비교할 만하다.
비대칭 융기(제13도 참조)는 융기를 가로질러 누클레오티드 접촉에 의하여 안정된 확장된 비정상 구조를 제공할 수 있다. 이들 접촉은 왓트손/크릭크 상호작용이나, 다른 수소결합 및 염기 중첩을 포함하는 기타 안정화 배열과 관련될 수 있다.
마지막으로, 고정된 RNA 형태 또는 특징을 목적으로 할 때, RNA와 단백질 사이에 어떤 실제적인 차이점이 존재하는가를 생각해 볼 가치가 있다. 단백질은, 단백질 및 펩티드에 의하여 현재 거의 완전히 수행된 활성을 위한 진화중에 RNA를 표현해 왔다고 생각되기 때문에, 촉매작용 및 높은 특정인식작용을 포함한 단백질의 화학적 특성은, 다양한 형태 및 활성을 구성하는데 있어서 RNA보다 유용하다고 생각된다. 대표적인 이유는, 단지 4개의 누클레오티드에 비하여 20개의 아미노산이 존재하며, 라이신, 아르기닌, 아스파트산 및 글루탐산의 강한 이온성(RNA 염기에서는 이에 상응할 만한 것이 전혀 없음), 핵산의 강한 음성 설탕-인산염 백본(backbone)에 비교할 때 비교적 중성적인 펩티드 백본, PK가 거의 중성에 가까운 히스티딘의 존재, 아미노산의 측쇄가 알파나선 및 베타-사슬에서 용매를 향하고 있다는 사실 및 단백질의 정상적인 2차 구조를 포함한다. RNA를 포함하는 2중사슬 핵산에 있어서, 염기쌍은 염기를 서로 향하게 하고, 1차원 수준에 존재하는 화학적 정보를 대량 이용한다. 다라서, 모양의 다양성 및 기능에 기여하는 것으로 현재 이해하고 있는 모든 면에서, 단백질은 RNA를 포함하는 핵산보다 훨씬 우수한 화합물이라고 생각된다. 진화중, 단백질은 RNA에 대한 인식 및 촉매작용을 위하여 선택되어 현재의 광범위한 견해를 지지하게 된다.
본 발명과는 반대이며 동시에 중심이 되는 것은, RNA에 대하여 가능한 수많은 배열 및 형태가, RNA가 비록 단지 4개의 누클레오티드로 제조되어 있고, RNA의 백본이 높게 대전되어 있음에도 불구하고, 모든 소정 기능 및 결합 친화성을 허용한다고 생각할 수 있다는 점이다. 즉, 적절한 배열을 지닌, 상술한 RNA 특징은, 대부분의 표적과 견고하고 특이적인 결합에 요구되는 화학적 기능을 산출하는 것이다. RNA는 면역시스템과 같이 융통성이 있다고 할 수 있겠다. 즉, 면역시스템이 소정의 표적에 발작(fit)을 일으키는 반면에, RNA는 그와 같은 동일한 기회를 부여한다. 여기서 기술한 가능한 방법론은 1018배열을 이용할 수 있으며, 단백질 또는 특정 항체가 RNA에 대하여 가질 수 있는 어떠한 본래의 장점이, RNA 리간드가 선별되어지는 광범위한 가능 푸울(pool)에 의하여 보상되어 지도록, 다수의 구조를 다룬다. 또한, 수식된 누클레오티드를 이용함으로써, 천연 RNA들 보다도 화학적으로 변경된 RNA가 이용될 수 있다.
SELEX 방법은, 단백질과 같은 표적분자와 결합하는 핵산 리간드의 선별방법과, 이와 같이 선별된 핵산의 증폭방법의 조합과 연관된다. 선별/증폭 단계를 반복적으로 순환시키면, 다수의 핵산을 함유하고 있는 푸울로부터 표적에 가장 강력하게 결합하는 하나 또는 수소의 핵산을 선별할 수 있게 된다.
선별/증폭의 순환 공정은 소정의 목표가 달성될 때까지 계속된다. 예를 들면, 시험혼합물내의 핵산의 소정 결합정도가 달성되거나 또는 혼합물 중 최소의 핵산성분이 얻어질 때까지(근본적인 경우에 있어서는, 시험 혼합물중에 단일 종류가 남을 때까지), 순환이 계속될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 결합이 더 이상 전개되지 않을 때까지 순환을 계속하는 것이 요구된다. 특정 혼합물의 핵산이 선별/증폭 순환중 결합정도가 백그라운드 수준에서 그 개선이 제한을 받는 경우가 있다. 이와 같은 경우에는 시험 혼합물의 더 많은 가능한 배열변이체를 내포하여 배열을 변화시키거나 또는, 랜덤화 영역의 길이를, 결합이 개선될 때까지 증가시켜야 한다. 실험계획을 확정하고 및/또는 워킹 기술도 채용될 수 있다.
특히 본 방법은 대상핵산 시험 혼합물의 초기 제조가 요구된다. 개별적인 시험핵산은 혼합물내의 모든 핵산에 보존된 배열과 측면을 이루는 랜덤화 영역을 함유할 수 있다. 보존 영역은 핵산의 증폭 및 선별을 용이하게 하기 위하여 마련된다. 당 분야에는 이와 같이 알려진 배열이 많기 때문에, 배열의 선택은 당 분야의 통상적인 숙련자가, 소정의 증폭방법과 함께, 할 수 있는 것 중의 하나이다. 랜덤화 영역은 완전히 또는 부분적인 랜덤화 배열을 가질 수 있다. 선택적으로 핵산의 이 부분은, 혼합물의 모든 핵산류에 있어서 일정하게 고정되어 있는 부부분(副部分)과 함께, 랜덤화된 부부분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 표적단백질과 결합하는 것으로 알려진, 도는 결합되기 위하여 선별된 배열 영역은 랜덤화 영역과 일체가 되어 결합성이 개선되거나 결합의 특이성이 개선될 수 있다. 시험 혼합물의 배열 다양성은, 선별/증폭 공정중 시험 혼합물의 핵산에 변이를 발생시킴으로써 도입 또는 증대 될 수 있다. 원칙적으로, 시험 혼합물에 채택된 핵산은 그가 증폭될 수 있는 대로 임의의 길이가 될 수 있다. 본 발명의 방법은, 다수의 배열 변이체로부터 선별하는데 있어서 가장 실용적으로 채택된다. 따라서 본 방법은, 약 4염기로부터 임의의 도달할 수 있는 크기의 핵산 배열의 결합을 평가하는데 바람직하게 채택될 것으로 기대된다.
시험 혼합물내 핵산의 랜덤화 부분은 수많은 방법으로 유도될 수 있다. 예를 들면, 완전 또는 부분적인 배열의 랜덤화는 핵산(또는 그 부분)의 직접적인 화학합성 또는 적절한 효소를 사용하며 핵산(또는 그 부분)이 제조될 수 있는 주형의 합성에 의하여 용이하게 달성될 수 있다. 비제한 농도의 4개의 모든 누클레오티드 트리포스페이트의 존재하에 말단전이효소에 의한 촉매작용으로, 단부 첨가반응은 랜덤화 배열을 세그먼트에 첨가시킬 수 있다. 시험 핵산의 배열 다양성은, 게놈 DNA제제 또는 세포 RNA제제와 같은 큰, 천연 핵산의 부분적으로 다이제스트(아니면 분열된)된 제제의, 크기가 선별된 단편을 이용함으로서도 달성될 수 있다. 랜덤화 배열이 채용되는 이들 경우에 있어서, 시험 혼합물에 모든 가능한 변이체 배열을 포함할 필요는 없다(즉, 긴 랜덤화 세그먼트로부터 가능하다). 일반적으로, 최다수의 가능한 배열 변이체가 식별되는 것을 보증하기 위하여, 실제 선별에서와 같이 시험 혼합물이 다수의 가능한 배열 변이체를 함유하는 것이 바람직하다. 30 누클레오티드의 랜덤화 배열은 계산상 1018의 상이한 대상 배열을 포함한다. 실제 문제로서, 단일 선별에 있어서 단지 약 1018대상물을 샘플화하는 것이 편리하다. 실제적으로 고려하여야 할 사항은 DNA 합성 칼럼상의 주형의 수 및 용역내의 RNA와 표적의 용해도이다(물론, 이론상 대상 혼합물내의 배열의 수에는 제한이 없다). 따라서, 30보다 긴 랜덤화 배열을 갖는 대상 혼합물은 하나의 선별에 있어서 편리하게 샘플화 될 모든 대상물에 대하여 너무 많은 배열을 함유한다. 본 발명의 핵산 리간드를 선별하기 위하여 대상 혼합물의 모든 가능한 배열을 샘플화 할 필요는 없다. 시험 혼합물의 핵산이 증폭될 수 있다는 것은 본 발명에 대한 근본 사항이다. 따라서, 시험핵산에 채용된 보존 영역은 증폭을 방해하는 배열을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
위에서 설명한 다양한 RNA 특징은 거의 언제나 30 누클레오티드를 함유하는 폴리누클레오티드에 의하여 정의될 수 있다. SELEX 공정의 물리적 억압 때문에, 약 30 누클레오티드를 함유하는 랜덤화 혼합물도, 모든 가능한 변이체를 사실상 시험할 수 있는 동안에 이용될 수 있는, 거의 가장 긴 인접하는 랜덤화 세그먼트가 된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는, 인접하는 랜덤화 영역을 지닌 대상 혼합물을 이용할 때, 최소 15 누클레오티드 및 최소 약 109핵산을 함유하는 랜덤화 배열을 사용하는 것이며, 가장 바람직한 구체예에서는 최소 25 누클레오티드를 함유한다.
본 발명은, 최소 15 누클레오티드의 인접하는 랜덤화 세그먼트의 모든 가능한 변이체를 함유하는, 대상 혼합물을 포함한다. 대상 혼합물의 각 개별 구성멤버도 선별된 핵산 배열의 증폭을 지원하는 랜덤화 세그먼트와 측면을 이루는 고정 배열을 포함한다.
대상 혼합물은 랜덤화 배열 및 고정 배열 모두를 포함하여 제조될 수도 있는데, 여기서 고정 배열은 증폭공정 이외의 기능을 한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 소정의 핵산 특징을 지닌 대상 혼합물의 핵산 백분율을 높이기 위하여, 대상 혼합물내의 고정 배열이 선별될 수도 있다. 예를 들면, 적절한 고정된 누클레오티드를 철합하면, 대상 혼합물내의 수우도놋트 또는 머리핀 루우프의 백분율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 소정 핵산구조 특징의 백분율을 높이는 고정 배열을 내포하도록 제조된 대상 혼합물은 본 발명의 일부가 된다. 당 분야의 숙련자는, 여기서 설명한 바와 같은 다양한 핵산 항체를 일상적으로 검사함으로써, 별도의 실험을 하지 않고도, 그과 같은 대상 혼합물을 구성할 수 있을 것이다. 하기 실시예 2 및 8은 바람직한 RNA 특징을 극대화하도록 고안된 대상 혼합물으 특정 실시예를 설명하고 있다.
SELEX에 의하여 리간드 용액 또는 부분적 리간드 용액이 얻어진 후에, 다양한 고정 배열을 함유하거나 의도적으로 부분적 랜덤화 배열을 사용하고 있는 대상 혼합물도 채용될 수 있다. 다음에 리간드 용액에 의하여 알려진 대상 혼합물로 새로운 SELEX 공정이 개시될 수 있다.
폴리머라제 연쇄반응(PCR)은 핵산 증폭의 예시적 방법이다.
PCR 방법에 대한 설명이 발견되는 문헌에는 다음과 같은 것이 있다 : Saiki 등(1985) Science 230 : 1350-1354; Saiki 등(1986) Nature 324 : 163-166; Scharf 등(1986) Science 233 : 1076-1078; Innis 등(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 : 9435-9440; 및 미합중국 특허 제4,683,195호(Mullis 등) 및 미합중국 특허 제4,638,202(Mullis 등). 그 기본적 형태에 있어서, PCR 증폭은, ssDNA이 3' 및 5'단부에 대하여 상보적인 특정 올리고누클레오티드 프라이머를 채택하여 소정 단일사슬 DNA(또는 RNA의 cDNA카피)의 복제, DNA 폴리머라제로 프라이머 확장 및 DNA 변성과정을 반복하여 순환하는 것이다. 하나의 프라이머로부터의 확장에 의하여 발생된 생성물은, 다른 프라이머로부터의 확장을 위한 주형으로서의 역할을 한다. PCT 공개 출원 WO 89/01050(Barg 등)에서 설명된 관련 증폭방법은, 2중쇄 중간체를 제공하기 위하여, 증폭될 배열의 상류에 프로모터 배열의 존재 또는 도입을 요구하고 있다. 다음에 중간체를 함유하고 있는 2중사슬 프로모터의 다수의 RNA 카피가 RNA 폴리머라제를 사용하여 생성된다. 얻어진 RNA 카피는 역전사효소로 처리되어, 중간체를 함유하는 별도의 2중사슬 프로모터를 생성하는데, 상기 중간체는 다음에 다시 RNA 폴리머라제로 증폭처리된다. 선택적인 증폭방법에는 선별된 DNA 또는 선별된 RNA의 cDNA 카피를 적절한 벡터로 클론화하고 벡터 및 클론화 DNA가 복제되어 증폭되는 숙주기관으로 벡터를 도입하는 방법이 있다(Gratelli, J.C. 등(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87 : 1874). 일반적으로, 선별된 핵산배열을 신뢰성있게 효율적으로 증폭하는 수단이 본 발명의 방법에 채택될 수 있다. 다만, 증폭 후에 나타나는 배열의 비율이 증폭 전의 혼합물내에 있는 상대적 배열 비율을 최소한 대략적으로 라도 반영하여야 한다는 점은 필요하다.
RNA들의 증폭을 위한 본 발명의 특정 구체예는 상기 Innis 등(1988)을 기초로 하고 있다. 시험 혼합물내의 RNA 분자 및 표적분자는, 증폭 및 PCR 후에, 그 5'부분에 필수 T7 프로모터 배열을 제공하도록 고안되어 있다. 선별된 RNA 분자의 전장(全長) cDNA 카피는, 선별된 RNA의 3'배열에 대하여 상보적인 올리고머로 프라임된 역전사효소를 사용하여 제조된다. 얻어진 cDNA는 Tag DAN 폴리머리제 사슬 확장에 의하여 증폭되어, 선별된 DNA에 T7 프로모터 배열을 제공한다. 본 증폭공정의 2중사슬 생성물은 다음에 시험관내에서 전사된다. 전사체는 다음 선별/증폭 순환에 이용된다. 본 발명은 임의로 적절한 핵산정체단계를 포함할 수 있다.
일반적으로, 다른 분자, 즉 단백질 또는 가장 일반적인 경우로는 어떤 표적분자에 대한 특이적 결합능력을 기초로 한 핵산선별이 가능한 어떠한 실험계획도 본 발명의 방법에 채용될 수 있다. 증폭될 수 있는 부분의 핵산을 선별하는 것만이 필요하다. 예를 들면, 실시예 1에서 설명한 바와 같은 필터결합선별인데, 실시예 1에서는, 핵산/단백질혼합물이 다음에 니트로셀룰로즈 필터로 여과되고 적절한 완충액으로 세척되어 유리 핵산을 제거한다. 단백질/핵산은 흔히 필터에 결합된 상태로 남는다. 배양된 혼합물의 시험핵산에 대하여 상대적으로 단백질을 농축하면 선별하고자 하는 결합강도에 영향을 미친다. 핵산이 과잉이면, 가능한 결합부위에 대한 경쟁이 일어나서 가장 강력하게 결합하는 핵산이 선별된다. 역으로 단백질이 과잉이면, 단백질과 결합하는 모든 핵산이 선별될 것으로 예상된다. 소정의 선별을 달성하기 위하여 채택된 핵산에 대한 단백질의 상대적인 농도는, 단백질 형태, 결합상호작용의 강도 및 존재할 수 있는 어떤 백그라운드 결합의 수준에 좌우된다. 소정의 선별결과를 달성하기에 필요한 상대적인 농도는 실험을 하지 않고도 경험적으로 용이하게 결정될 수 있다. 마찬가지로, 백그라운드 결합을 최소화하기 위하여, 필터세척방법을 최적화할 필요가 있을 수도 있다. 이러한 필터세척방법의 최적화도 또한 통상적 숙력자의 능력범위에 속한다.
SELESION이라고 칭하는 SELEX의 수학적 평가는 본 발명의 발명자들에 의하여 이용되어 왔다. 본 출원서의 부록 A는 SELEXION으로부터 유도된 SELEX에 관한 일반사항을 얻기 위하여 이용된 수학적분석의 간략한 검토사항을 포함하고 있다.
SELEXION으로부터 얻어진 일반 사항은 다음과 같다.
1) SELEX의 각 라운드에서 최상 결합 RNA를 회수할 가능성은, 존재하는 그 분자의 수, 집단 RNA 푸울에 대한 결합 이점 및 사용된 단백질의 총량과 함께 증가한다. 결합의 차이점을 최대화하는 방법을 미리 안다는 것은 항상 직관적으로 자명한 것은 아니나, 최상 결합 RNA의 회수 가능성은 역시 샘플 표적분자 및 RNA 분자수의 최대화에 의하여 증가될 수 있다 : 2) SELEX의 여러 라운드에서 사용될 이상적인 핵산 및 단백질 농도는 몇 가지 요소에 좌우된다. SELEXION에 의하여 제시된 실험적 매개변수는 본 실시예에서 채택한 것과 같다. 예를 들면, SELEX가 수행될 때 어느 것이 거의 필연적인 경우가 되는지, 궁극적인 리간드 용액의 상대적 친화성을 알 수 없을 때, 표적 단백질에 대하여 총 핵산의 3~7%가 결합하도록, 단백질 및 핵산 대상 혼합물 농도가 선택되는 것이 바람직하다. 이와 같은 기준을 이용함으로써, 각 라운드의 SELEX에 있어서, 10배 내지 20배의 높은 친화성 리간드가 달성되는 것을 예상할 수 있다.
바람직한 구체예에서 다양한 표적에 대한 핵산 리간드를 선별하기 위하여 사용된 실험조건은, 표적이 생체내에서 발견되는 환경을 모방하도록 선택한다. 하기 실시예 10은, 선별조건을 변경하는 것이 특정 표적에 수용되는 리간드 용액에 어떠한 영향을 미치는가를 나타내고 있다. NGF에 대한 리간드 용액이 고저 염도 조건에서 현저한 유사성을 가지나, 차이점이 관측되었다. 표적이 생체내 환경을 보다 정확히 반영하기 위하여 변경될 수도 있는 조절가능한 조건에는, 이것만에 제한을 받는 것은 아니나, 총 이온 강도, 2가 양이온의 농도 및 용액의 PH가 포함한다. 당 분야의 숙련자는 소정표적에 대한 지식을 기초로 하여 적절한 분리조건을 용이하게 선택할 수 있을 것이다.
증폭단계를 진행하기 위하여, 선별된 핵산은 분리 후에 표적으로부터 방출되어야 한다. 이 공정은 선별된 핵산의 화학적 분해없이 수행되어 증폭가능한 핵산을 얻어야 한다. 특정 구체예에 있어서, 선별된 RNA 분자는, 200㎕의 7M 요소, 20mM 시트르산 나트륨(pH 5.0), 500㎕의 페놀과 결합된 1mM EDTA 용액(0.1M 초산나트륨 pH 5.2로 평형화된)을 함유하는 방금 제조한 용액을 사용하여 니트로셀룰로즈 필터로부터 용출되었다. 500㎕의 페놀을 지닌 200㎕의 7M 요소용액도 성공적으로 채용되었다. 선별된 RNA의 용출용액은 다음에 에테르 추출, 에탄올이 침전되고 침전물은 수중에서 재부유되었다. 필터로부터의 선별 RNA 용출에 다수의 상이한 조건의 완충액이 사용될 수 있다. 예를 들면, 염화 구아니디움, 티오시안산 구아니디움 등과 같이 당분야에 알려진 비계면활성제 수성 단백질 변성제가 제한없이 사용될 수 있다. 필터로부터 핵산을 용출하기 위하여 사용된 특정용액은 당 분야의 숙련자에 의하여 일상적으로 선택될 수 있다.
특히 단백질인 표적에 결합한 핵산을 분리하기 위한 선택적인 분리 실험계획이 있다. 예를 들면, 고형 지지물에 결합된 표적분자를 함유하는 칼럼을 시험 핵산혼합물이 통과함으로써, 결합 및 분리가 달성될 수 있다. 표적과 결합하는 이들 핵산은 칼럼상에 유지되고 미결합 핵산은 칼럼으로부터 세척될 수 있다.
본 출원서 전체에 걸쳐서, SELEX 공정은, 소정의 선별성이 달성될 때까지 선별 및 증폭이 반복되는 반복성 공정으로 정의된다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 선별 공정은, 오직 1단계의 분리후에도 하나의 리간드 용액을 제공할 수 있도록 충분히 할 수 있다. 예를 들면, 대상 혼합물이, 적절한 조건 및 충분히 긴 칼럼으로, 도입되는 표적지지 칼럼은, 이론적으로, 하나의 리간드 용액을 얻기 위하여 표적에 대한 친화성을 기준으로 핵산을 충분히 분리할 수 있어야 한다. 원래의 선별단계가, 단지 1단계 후에 하나의 리간드 용액을 산출할 수 있을 정도로 충분히 선별적인 정도까지, 상기 공정은 본 발명의 범위내에 속한다.
본 발명의 하나의 구체예에서, SELEX는 증폭이 뒤따르는 대상 혼합물에 단일 또는 분리된 소수의 핵산 리간드가 남을 때까지 반복적으로 수행된다. 이와 같은 경우, 리간드 용액은 단일 핵산 배열로서 표시되며, 표적에 대하여 비교 가능한 결합 친화성을 갖는 배열의 계통군은 포함하지 않는다.
본 발명의 선택적인 구체예에서, SELEX 반복은 대상 혼합물에 보다 높은 친화성 핵산 리간드가 부유화되어 있으나 여전히 비교적 다수의 분리 배열이 함유되어 있는 시점에서 종결된다. 이 시점은, 집단 대상 혼합물의 배열 무작위성을 주기적으로 분석하거나 표적에 대한 친화성을 검정함으로써 당 분야의 숙련자에 의하여 결정될 수 있다.
이 시점에서 SELEX는 종결되며, 클론이 제조되고 배열결정된다. 물론 배열결정될 수 있는 클론의 수는 거의 무제한이다. 그러나 하기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 20∼50 클론 사이에서 배열결정후, 가장 주된 배열의 검출 및 리간드 용액의 특징을 한정할 수 있다. 가상적 예에 있어서, 30배열을 클론화한 후, 6배열이 동일한 것이 발견된 반면에, 다른 배열의 20배열 부분은 위닝 배열내의 배열과 밀접한 관계가 있다는 것을 알았다. 가장 주력 배열은 표적에 대한 하나의 리간드 용액이라고 생각되기는 하지만, 클론화 배열의 많은 공통성을 내포하는 배열군으로 구성되어 있는 하나의 리간드 용액을 구성 또는 기술하는 것이 흔히 더 적합하다.
본 발명의 다른 구체예에서, 수많은 제한특성을 갖는 배열군으로 표시되는 리간드 용액(예를 들면, 리간드 용액이 AAGUNNGUNNCNNNN일 경우, 여기서 N은 명백히 4개의 누클레어티드 중 어느 것이나 될 수 있다)은 추가의 SELEX 공정을 개시하는데 사용될 수 있다. 이 구체예에서, 대상 혼합물은 부분적으로 고정되고 부분적인 랜덤화 누클레오티드를 포함하는데, 고정된 누클레오티드는 초기 SELEX 공정에서 수용된 리간드 용액을 기초로 하여 선별된다. 이 방법에 있어서, 리간드 용액 계통군의 다른 구성 멤버보다 잘 결합하는 단일 누클레오티드 배열이 있을 경우, 그것은 신속히 식별된다.
본 발명의 다른 선택적인 구체예에서, SELEX 공정에서 수용된 리간드 용액을 기초로 한 2차 SELEX 실험도 이용될 수 있다. 이 구체예에서, 가장 주된 단일배열(예를 들면, AAGUCCGUAACACAC)이 2차 SELEX 공정을 통지하는데 이용된다. 이 2차 SELEX 공정에서, 선별된 윈너(winner)를 기초로 한 배열을 산출하기 위하여 대상 혼합물이 제조되는 한편, 각 배열에는 충분한 램덤화가 존재함을 확인할 수 있다. 이 대상 혼합물은, 랜덤화 보다는 편향된 편인 누클레오티드 출발물질을 사용함으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, A용액은 75% 및 25% U. C 및 G를 함유한다. 핵산 합성장치는 주력 누클레오티드를 산출하도록 되어 있으나, A용액내에 다른 누클레오티드가 존재함으로써, A위치에서 주된 성분이면서도 또한 이 위치에서 변형을 산출하는 핵산배열을 만들어낸다. 초기 SELEX 공정에서 얻어진 결과에 의하여 통지된, 이 2차 SELEX는 소정의 표적에 대한 최상의 리간드 용액을 얻기 위한 가능성을 최대화한다. 다시 한번, 리간드 용액은 바람직한 단일 핵산 리간드로 구성되거나 또는 필연적으로 유사한 결합 친화성과 구조적으로 관련된 배열군으로 구성될 수도 있다는 것을 명확히 하여야 한다.
실제에 있어서는, SELEX 공정이 단일 배열이 얻어질 때까지 수행되지 않는 것이 바람직할 경우가 때때로 있다. SELEX 공정은, 표적에 대한 특정 배열의 결합 친화성과 관련되지 않는 라운드의 SELEX 후의 대상 혼합물의 특정 배열의 점유율에 영향을 미치는 몇 개의 편향 포인트를 내포한다. 예를 들면, 특정 배열을 향한 또한 대항하는 편향은 선별후에 회수된 RNA로부터 cDNA를 생성하는 중에, 또는 증폭공정중에 일어날 수 있다. 이와 같은 예측 불가능한 편향의 영향은 오직 하나 소수의 배열이 반응혼합물내에서 주력을 이루고 있을 시기 이전에 SELEX를 정지시킴으로써, 최소화 될 수 있다.
상술한 바와 같이, 시험 핵산 혼합물의 배열 변형은 변이작용에 의하여 달성되거나 증가될 수 있다. 예를 들면 PCR 증폭중 핵산배열을 효율적으로 변형시키는 하나의 방법이 설명되어 있다(leung 등, 1989). 이 방법 또는 기능적으로 동등한 방법은, 본 발명의 증폭방법과 임의로 결합될 수 있다.
선택적으로 종래의 DNA 변이유발 방법은 핵산증폭 방법에 접합될 수 있다. 응용할 수 있는 변이유발 방법에는 화학적 유도 변이유발 및 올리고누클레오티드 부위-지향 변이유발이 포함된다.
본 발명은 또한, 별도로 주목되는 핵산의 능력 및 핵산이 단백질과 같은 표적과 상호작용할 것으로 예상되거나 상호작용한 것으로 후에 밝혀지는 형태의 방법을 이용하는데 까지 확대될 수 있다. 예를 들면, SELEX 방법론은, 단백질과 미카엘 부가물(Michael adducts)을 형성하는 리간드를 스크린하는데 채용될 수 있다. 단백질내에 통상적 임계 크레스테인 또는 기타 친핵체와 인접하는 정위치에 자라잡은 피리미딘은, 그 친핵체와 반응하여 미카엘 부가물을 형성할 수 있다. 미카엘 부가물이 형성되는 메카니즘은, 피리미딘 염기의 6 위치에의 친핵성 공격으로 사실상 5, 6 디히드로피리미딘인 일시적(그러나 서서히 전환됨) 중간체를 생성하는 것이다. 단백질이 임의의 적절한 변성제에 의하여 변성된 후에도 RNA와 표적 단백질간에 결합이 일어나는지를 관측함으로써 이와 같은 중간체의 존재를 시험하는 것이 가능하다. 즉, 표적의 결합 포켓이 파괴되었을 때, 연속된 공유결합 상호작용을 조사한다. 그러나, 미카엘 부가물은 흔히 가역적이며 때때로 너무 빨라서 이 실험을 통하여 미카엘 부가물을 확인할 수 없다는 것이 이전에 미카엘 부가물이 존재하지 않았다는 것을 지적하는 것은 아니다.
SELEX는, 매우 높은 친화성, 효소 또는 기타 표적 단백질에 대한 불활성에 가까운 기질을 생성하기 위하여, 미카엘 부가물 형성법의 장점을 취하도록 수행될 수 있다. RNA의 랜덤화 혼합물 및 표적간의 결합 후, 필터나 또는 다른 수단에 의한 분리전, 표적이 변성된다는 점을 상상한다. 계속되는 분리, 후속되는 미카엘 부가물의 전환 및 방출된 RNA상의 cDNA합성, 계속되는 나머지 SELEX의 순환공정은, 변성전 표적과 결합하나 미카엘 부가물이 과학자에 의하여 전환될 때까지 공유결합적으로 계속 결합하는 RNA를 부유화시킨다. 생체내의 이 리간드는 표적 단백질을 영구적으로 억제하는 성질을 갖는다. 단백질 tRNA-우라실 메틸 전이효소(RUMT)는 미카엘 부가물을 통하여 기질 tRNA를 결합한다. RUMT가 E. coli내에 높은 수준으로 발현될 경우, 효소가 RNA에 다량으로 공유결합된 상태로 발견되는데, 이것은 SELEX를 통하여 거의 비가역적인 억제제가 발견될 수 있다는 것을 강력히 암시하는 것이다.
본 발명의 방법은 다수의 용도를 갖고 있다. 본 방법은 예를 들면, DNA 또는 RNA에 대한 단백질 결합부위의 식별 및 특성화를 지원하는데 이용될 수 있다. 이와 같은 결합부위는, 전사 활성체 또는 억제제에 대한 결합부위, 프로모터 부위의 전사 복합체, 복제의 근원 또는 부근의 복제 보조 단백질과 DNA 폴리머라제 및 리보솜 결합부위의 리보솜 및 번역 억제제로서와 같은, 유전자 발현의 전사 또는 번역조절기능을 한다. 이와 같은 결합부위의 배열정보는, 이들 영역을 특정화하는데 필요한 노동집약적 방법을 취하지 않고도 조절영역을 유리 및 식별하는데 이용될 수 있다. 유리된 DNA 조절영역은, 예를 들면 유전자 발현을 선택적으로 변경하기 위하여 이종(異種) 구성에 채택될 수 있다.
여기서 설명한 방법이, 임의의 소정 표적분자와 특이하게 결합하는 핵산분자를 식별, 유리 또는 제조에 이용될 수 있다는 점은 매우 중요하며 본 발명의 예상외의 일면을 나타낸다. 즉, 본 방법은 특정 단백질과 결합하는데 있어서 특정적인 핵산을 제조하는데 채택될 수 있다. 이와 같은 핵산 리간드는 많은 면에서 기능적으로 항체와 유사하다. 항체와 유사한 결합기능을 갖는 핵산 리간드는 본 발명의 방법에 의하여 유리될 수 있다. 이와 같은 핵산 리간드는 여기서 핵산항체라고 명명되며, 일반적으로, 폴리클론 또는 모노클론 항체가 발견한 용도에 유용하다. 핵산항체는 일반적으로 실험관내 또는 생체내 용도의 항체의 대용품이 될 수 있다. 핵산항체가 채택되는 경우, 핵산은 사실상 분해에 대하여 저항성이 있어야 한다는 점만이 필요하다. 핵산항체의 용도에는, 임의의 공급원으로부터의 표적분자에 대한 특성적, 양적, 또는 질적 감식; 핵산에 대한 특이적 결합을 기초로 한 표적분자의 정제; 및 특정 표적부위에 대한 특정 독성 또는 기타 치료제에 의존하는 다양한 치료방법이 포함된다.
표적분자는 바람직하게는 단백질이나, 기타 탄수화물, 펩티도글리칸 및 다양한 소분자에서 선택될 수 있다. 종래의 단백질 항체로서, 핵산항체는, 생물학적 구조의 하나의 총체적 부분인 분자와의 특정 상호작용을 통하여, 세포표면 또는 비루스와 같은, 표적 생물학적 구조에 채택될 수 있다. 핵산항체는, 종래의 항체와 같이, 자기관용(self tolerance)에 의하여 제한되지 않는다는 점에서 유리하다. 또한 SELEX가 전적으로 시험관내 공정이기 때문에, 핵산항체는 합성을 위하여 동물 또는 세포배양을 필요로 하지 않는다는 점이다. 잘 알려진 바와 같이 핵산은 상보 핵산배열과 결합할 수 있다. 핵산의 이와 같은 성질은 핵산분자의 검출, 정량 및 유리에 광범위하게 이용되어 왔다. 따라서 본 발명의 방법은 핵산간의 이와 같이 잘 알려진 결합능력을 강조할 생각은 없다. 특히, 핵산항체의 이용과 관련된 본 발명의 방법은, 핵산분자간의 공지의 결합친화성을 강조하고자 하는 것이 아니다. 핵산 오퍼레이터 배열에 결합되는 조절 단백질과 같이, 수많은 단백질이 핵산과의 결합을 통하여 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다.
자신이 자연 부위에 결합하는 특정 핵산결합 단백질의 공지의 기능은, 예를 들면, 그들 단백질의 검출, 정량, 유리 및 정제에 이용되어 있다. 핵산항체의 이용과 관련된 본 발명의 방법은, 단백질이 결합하는 것으로 알려진 핵산배열과 핵산결합 단백질간의 공지된 결합 친화성을 강조하고자 하는 것이 아니다. 그러나, 동일 핵산결합 단백질과 결합하는 신규의, 비자연발생 배열이 SELEX를 이용하여 개발될 수 있다. SELEX는 단백질과 결합하는 핵산배열을 매우 신속히 결정하게 하여, 미지의 오퍼레이터 및 결합부위 배열의 구조를 결정하는데 신속히 이용될 수 있으며, 이 결합부위 배열은 다음에 여기서 설명한 바와 같은 용도에 채택될 수 있다는 점을 주목하여야 한다. 본 발명이, 핵산과 결합하는 것으로 알려지지 않은 단백질의 검출, 정량, 유리 및 정제용으로서의 핵산분자의 일반적인 용도를 처음으로 개시하는 것이라고 믿어진다. 아래에서 논의되는 바와 같이, SELEX에 의하여 유리된 특정 핵산항체는, 예를 들면, 특정 표적분자 또는 구조의 기능을 억제, 강화 또는 활성화하는데 영향을 주는 역할을 할 수 있다. 특히, 핵산항체는 단백질의 기능을 억제, 강화 또는 활성화하는데 이용될 수 있다.
핵산과 공지의 결합능력을 갖고 있는 단백질(DNA 폴리머라제, 기타 레틀리카제 및 RNA상의 부위를 인식하나 더 이상의 촉매작용에는 참여하지 않는 단백질 등과 같은)은 SELEX를 통하여, 표적단백질의 활성부위에 결합되는 높은 친화성의 RNA 리간드를 산출한다. 즉, HIV-1 역전사효소의 경우에 있어서, 얻어진 RNA 리간드(실시예 2에서 1.1이라고 함)는 프라이머 DNA, RNA 주형 및 4개의 디옥시누클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서 cDNA성을 차단한다.
RNA 구조에 관한 발명자 이론은 거의 모든 단백질이 SELEX용 표적으로서의 역할을 한다는 것이다. 비핵산 결합 단백질에 대한 초기 실험은, 일반적인 핵산 또는 특정 RNA와 상호작용하는 것으로 생각되지 않는 3개의 단백질로 수행되었다. 3개의 단백질은 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA, tissue plasminogen activator), 신경성장인자(NGF, nerve growth factor) 및 성장인자 리셉터의 세포외 분자내 영역(gfR-Xtra)이었다. 이들 모든 단백질을 시험하여 니트로셀룰로즈 필터상에 혼합된 랜덤화 RNA들을 보유하는지 조사하였다. tPA 및 NGF는 μM 직하의 Kd로 랜덤화 RNA에 대한 친화성을 보였다. gfR-Xtra는 측정할 만한 친화성을 나타내지 않았는데, 이것은 그 단백질에 대한 RNA 항체가 존재한다면, 대부분의 다른 RNA에 대하여 친화성이 없는 부위와 결합하여야 한다는 것을 의미한다.
30 랜덤화 위치를 지닌 RNA들을 이용하여 SELEX를 수행함으로써 tPA 및 NGF를 얻었다. SELEX 수행중 tPA 및 NGF는 리간드 용액을 제공하였는데, 이것은 각 단백질의 일부 부위가, 다른 RNA에 결합된 그 부위(또는 다른 부위)보다, 위닝 배열과 보다 견고하게 결합되었음을 의미한다. 위닝배열은 2개의 단백질에 있어서 상이하다.
tPA 및 NGF는 SELEX 수행중 매우 잘 활동하기 때문에, 단백질과 펩티드의 무작위 수집표본을 시험하여, RNA에 대한 어떤 친화성이 있는지를 조사하였다. 단백질이 RNA에 대하여 어떤 친화성을 갖는다면, SELEX를 수행할 때, 낮은, 일반화된 친화성을 제공하는 표적의 동일영역과 접촉하는 보다 높은 친화성 배열을 평균적으로 산출할 것으로 판단되었다. 한 셋트의 단백질 및 펩티드를 시험하여 랜덤화 RNA들(40 랜덤화 위치를 함유하는)이 니트로셀룰로즈 필터상에 유지되는지를 조사하였다. 시험된 단백질의 약 2/3가 RNA와 결합하였으며, 소수의 단백질이 RNA와 매우 견고히 결합하였다(실시예 9 참조).
RNA를 니트로셀룰로즈 필터에 결합시키지 않는 단백질은, RNA 항체의 발생가능성과는 관련이 없는 하찮은 이유로 실패할 수 있다. 예를 들면, 브래디키닌(bradykinin)은 니트로셀룰로즈 필터와 결합하지 못하는데, 따라서 상기 실험에 실패하게 된다. 펩티드의 아미노말단을 통하여 고체 기질에 연결된 브래디키닌을 제조한 후, 랜덤화 RNA가 그 기질에 견고히 결합된 것을 발견하였다(실시예 7 참조). 초기의 실험에 있어서, 2개의 짧은 펩티드, 브래디키닌 및 봄베신을 랜덤화 RNA와 매우 견고히 결합하였다. 이들 펩티드 표적으로 SELEX를 통하여 얻어진 높은 친화성의 RNA 리간드는, 아마도, 이들 활성 펩티드의 길항체일 것이며, 치료용으로 유용할 것이다. 약 30 클레오티드의 RNA가 매우 작은 펩티드와 결합하면서 그 펩티드에게 사실상 모든 활성에 대하여 활성을 부여하지 않는다고 생각하기는 어렵다.
하기 실시예 4, 7, 9 및 10에서 설명한 바와 같이, 자연계에서 핵산과 상호작용하는 것으로 생각되지 않는 단백질이, 상당한 정도로 핵산의 랜덤화 혼합물과 결합하는 것이 발견되었다. RNA 혼합물과 비특이적으로 결합하는 것으로 밝혀진 이들 단백질의 경우에 SELEX의 고정을 통하여 리간드 용액이 얻어질 수 있다는 것이 또한 밝혀졌다. 따라서 소정의 표적이 핵산의 랜덤 혼합물에 대하여 어떤 결합성을 나타내는지를 SELEX의 수행전에, 판단하는 것은 잠정적으로 가치가 있는 스크린이다.
본 발명의 두번째 중요한 점이며 예상밖인 점은, 여기에 설명하는 방법이, 특정 표적과 특이하게 결합하는 핵산분자의 식별, 유리 또는 제조에 이용될 수 있으며 그 핵산분자의 기능에 영향을 준다는 것이다. 이와 같은 면에서, 표적분자는 다시 한번 단백질인 것이 바람직하나, 특정 핵산결합이 달성될 수 있는 다른 탄수화물 및 다양한 작은 분자중에서도 선택될 수 있다. 작은 분자와 결합하는 핵산 리간드는, 자신들을 그 천연 리간드와의 상호작용으로부터 격리 또는 방지함으로써 그 기능에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면 효소의 활성은, 효소의 기질과 결합하는 핵산 리간드에 의하여 영향을 받을 수 있다. 작은 분자의 핵산 리간드, 즉 핵산항체는 진단시험(기타 정량분석)용 시약으로서 특히 유용하다. 예를 들면, 조절기질, 결합 대사물질 또는 비정상량의 정상대사물질의 존재는 본 발명의 핵산 리간드를 이용하여 검출 및 측정될 수 있다. 촉매작용이 있는 핵산 리간드는, 표적에서 화학적 변화에 촉매작용을 일으킴으로써 소분자의 기능에 영향을 줄 수 있다. 가능한 촉매활성의 범위는 적어도 단백질이 나타내는 범위가 된다. 소정반응의 천이상태 유사체에 대한 리간드의 선별수단이 되는 것으로는, 촉매성 핵산 리간드를 선별하는데 의존하는 하나의 방법이 있다.
본 발명이 처음으로, 단백질의 기능에 영향, 억제 또는 강화하는 핵산분자의 일반적인 용도를 개시하는 것으로 믿어진다. 본 발명의 결합 선별방법은 선별된 핵산과의 결합에 대한 표적분자의 수식을 위한 2차 선별 또는 스크린법과 용이하게 결합될 수 있다. SELEX에 의하여 시험될 수 있는 대집단의 다양한 핵산배열은 소정의 결합능력 및 표적분자활성을 수식하는 기능을 갖는 핵산배열이 발견될 수 있는 가능성을 강화시킨다. 본 발명의 방법은, 그 천연의 생물학적 활성의 일부로서 핵산과 결합하는 단백질 및 그 생물학적 기능의 일부로서 핵산과 결합하는 것으로 알려지지 않는 단백질을 포함하는 임의의 표적 단백질의 기능에 선택적으로 영향을 줄 수 있는 핵산 리간드를 선별하는데 유용하다. 여기에 기술한 방법은, 핵산, 단일사슬 또는 2중사슬의, DNA 또는 RNA; 누클레오티드 또는 누클레오시드로서, 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 그들로부터유도된 염기를 갖는 것들, 특히 아데닌, 티민 구아닌, 우라실, 사이토신 및 하이포크산틴 염기 및 유도체, 특히 메틸화 유도체를 갖는 것들; 및 니코틴아미드 누클레오티드, 플래빈-아데닌 디누클레오티드 및 보조효소 A를 포함하는 보조효소 누클레오티드와 결합하는 임의의 단백질과 결합하고 그 기능을 수식하는 핵산 리간드를 유리 또는 제조하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법은 표적효소의 촉매작용에 영향을 주는, 즉, 촉매작용을 억제하거나 또는 기질 결합을 수식하며, 단백질 리셉터의 기능성에 영향을 주며, 즉 리셉터와의 결합을 억제하거나 또는 리셉터와의 결합특이성을 수식하며; 단백질 다량체의 형성에 영향을 주며, 즉 단백질 서브유니트의 4원구조를 분쇄하며; 및 단백질 운반특성을 수식하며, 즉 단백질에 의한 소분자 및 이온들의 운반을 막을 수 있는, 핵산분자를 식별, 유리 또는 제조하는데 채택될 수 있다고 생각된다.
SELEX 공정은 여기서, 하나의 리간드 용액이 얻어질 때까지 반복되는 핵산배열 대상 혼합물의 반복적인 선별 및 증폭으로 정의된다. 본 공정에서 추가의 단계는 소정 표적에 대한 핵산항체의 제조이다. 소정의 공정용으로 유도된 리간드 용액이 단일 배열인 경우에도, 꼭 그 리간드 용액을 함유하는 핵산항체가 합성되어야 한다. 예를 들면, SELEX 실험은 SELEX 대상 혼합물에서 사용된 30 랜덤화 누클레오티드 배열중 20만으로 구성되어 있는 바람직한 단일 리간드 용액을 제공할 수도 있다. 바람직하게는, 치료적으로 유용한 핵산항체는 SELEX의 증폭단계에서 요구되는 10 비임계성 누클레오티드 또는 고정 배열을 함유하지 않는다. 일단 요구되는 구조의 핵산항체가 리간드 용액을 기초로 하여 결정되면, 실제적인 핵산항체의 합성을 당분야에 잘 알려진 다양한 기술에 의하여 수행된다.
본 발명의 구체적인 구체예에서, 핵산항체는 동일 표적에 대하여 복수의 핵산 리간드를 함유할 수 있다. 예를 들면, SELEX는 2개의 분리된 리간드 용액을 식별할 수 있다. 2개의 리간드 용액이 상이한 위치에서 표적과 결합할 수도 있기 때문에, 핵산항체는 바람직하게는 양쪽 리간드 용액을 모두 함유할 수 있다. 다른 구체예에서, 핵산항체는 하나 이상의 단일 리간드 용액을 함유할 수 있다. 이와 같이 다가(多價)의 핵산항체는, 단지 하나의 리간드를 갖는 동등한 핵산항체에서는 얻을 수 없는, 표적에 대한 증가된 결합 친화성을 갖는다.
또한, 핵산항체는 다음과 같은 성질을 갖는 기타 성분도 함유할 수 있다 : 1) 핵산항체에게 표적에 대한 독립적인 친화성을 부가하는 것; 2) 표적에 대한 핵산 리간드의 친화성을 의존적으로 강화하는 것; 3) 처리가 요망되는 생체내 적절한 위치로 핵산항체를 지향 즉 배치하는 것; 또는 4) 표적에 대한 핵산 리간드의 특이성을 이용하여 상기 위치에 일부 추가 반응을 일으키는 것.
본 발명의 방법은, 표적 단백질의 기능을 억제하는 핵산을 얻는데 유용하며; 특히, 그 기능이 핵산, 누클레오티드, 누클레오시드와 그 유도체 및 상동체와의 결합과 관련되는 단백질의 기능을 억제하는 핵산을 얻는데 유용하다. 본 발명의 방법은, 폴리머라제, 역전사효소 및 핵산, 누클레오티드 또는 누클레오시드가 기질 또는 공동인자가 되는 기타 효소와 같은 핵산억제제를 제공할 수 있다.
SELEX와 결합될 수 있는 2차 선별 방법은 효소 억제작용의 선별 또는 크린, 기질 결합의 변경, 기능성의 상실, 구조의 분쇄 등을 포함한다. 당 분야의 통상적인 숙련자는 여기서 설명하는 방법과 양립할 수 있는 다양한 선택적인 선별 또는 스크린 방법을 선택할 수 있다.
어떤 경우에 있어서는 당 분야의 숙련자가 용이하게 알 수 있는 것이 있는데, 즉 특정 표적분자 또는 특정 응용방면에 있어서, 리간드로서 DNA 분자보다는 RNA 분자를 채택하는 것이 바람직한 반면에, 다른 경우에는 RNA보다는 DNA가 바람직하다.
본 발명의 선별방법도, 분자 복합체, 예를 들면 기질/단백질 또는 억제제/단백질 복합체에 특이적으로 결합하는 핵산을 선별하는데 채택될 수 있다. 복합체 분자, 그러나 미완성 분자가 아닌 분자와 특이하게 결합하는 핵산중에는, 복합체의 형성을 억제하는 핵산이 있다. 예를 들면, 기질/효소 복합체와의 특이적 결합을 위하여 선별된 핵산 리간드 중에는, 용이하게 선별될 수 있으며, 효소에 대한 기질결합을 억제하여 효소에 의한 촉매작용을 억제 또는 분쇄하는 핵산이 있다.
단백질의 특히 기능적인 또는 활성부위 또는 다른 표적분자에 결합하는 핵산의 식별 또는 유리작업에 특히 유용한, 본 발명의 하나의 구체예는, 표적분자내의 소정 부위 또는 부근에 결합하는 또 다른 한조(組)의 핵산 리간드가 생성되는 방향으로 선별/증폭 공정을 진행하기 위하여 표적 단백질내의 소정 부위에 결합하는 것으로 알려진 또는 결합하기 위하여 선별된 하나의 분자를 채택한다. 표적분자내의 소정 부위 또는 부근에 결합하는 또 다른 한조(組)의 핵산 리간드가 생성되는 방향으로 선별/증폭 공정을 진행하기 위하여 간단한 예를 들면, 표적분자내의 소정부위와 결합하는 것으로 알려진 핵산배열이, 결합에 대한 시험중인 모든 핵산의 랜덤화 영역 부근에 첨합된다. 다음에 SELEX가 이용(제9도)되어, 이들 변이체를 선별하는데, 모든 변이체는 공지의 결합배열을 함유하게 되며, 표적분자와 가장 강력하게 결합한다.
표적분자와 보다 강력하게 또는 보다 특이하게 결합하는 것으로 예상되는 보다 긴 결합배열은 이와 같이 얻어진다. 다음에 보다 긴 결합배열은 핵산 시험 혼합물의 랜덤화 영역 부근에 도입되어, 더욱 긴 결합배열을 선택하기 위하여 선별/증폭공정이 반복된다. 이들 단계의 반복(즉, 선별된 배열을 시험 혼합물에 첨합시킨 후 개선된 또는 보다 특이적 결합을 위하여 선별/증폭)은 소정 수준의 결합강도 또는 특이성이 달성될 때까지 반복될 수 있다. 이 반복적인 워킹 방법은, 특정 표적분자 또는 표적분자내의 부위에 대하여 매우 특이적인 핵산의 선별을 가능케 한다. 이와 같은 반복적인 워킹 방법의 다른 구체예는, 반드시 핵산분자일 필요는 없는 앵커 분자를 채택한다(제10도 및 제11도 참조). 이 실시예에서, 표적 효소의 기질 또는 억제제와 같은 소정 표적과 결합하는 분자가 화학적으로 수식되어 공지의 배열인 올리고누클레오티드에 공유결합식으로 연결될 수 있다(제10도 안내(guide) 올리고누클레오티드). 표적과 결합하는 앵커 분자에 화학적으로 연결된 안내 올리고누클레오티드도 표적 분자와 결합한다. 안내 올리고누클레오티드의 배열성분은 시험핵산 혼합물의 랜덤화 영역 부근에 첨합된다. 다음에 SELEX가 수행되어 표적분자/앵커 복합체에 가장 강력하게 결합하는 배열들을 선별하게 된다. 다음에 반복적인 워킹 공정은, 표적에 대한 증강된 결합강도 또는 결합 특이성을 지닌 보다 긴 핵산분자를 선별 또는 제조하기 위하여 이용된다. 앵커 공정을 이용하면, 표적분자내의 소정부위 또는 그 부근에 결합하는 핵산 리간드의 보다 신속한 유리현상을 예상할 수 있게 한다. 특히, 반복적인 워킹 공정과 결합되는 앵커 방법은 단백질 기능의 매우 특이한 억제제가 되는 핵산을 산출한다(제11도).
SELEX를 수행하는 특정 구체예에서, 표적에 대한 핵산배열의 친화성과 무관한 일부 인자에 의하여 선별공정이 왜곡되지 않도록 하기 위하여, 선별공정과 관련하여 스크린 공정을 +(추가)/-(삭제)하는 것이 요망된다. 예를 들면, 선별공정이 단백질 결합 니트로셀룰로즈에 의하여 수행될 경우, 특정 핵산 배열이 우선적으로 니트로셀룰로즈에 의하여 보존되어 SELEX 공정중에 선별되는 것을 알 수 있다. 이들 배열은 추가의 단계를 첨합시킴으로써 대상 혼합물로부터 제거될 수 있는데, 상기 추가단계에서는 이전의 SELEX 혼합물이 질산면을 통과하여 그 특성을 위하여 홀로 선별된 배열들을 선별적으로 제거한다. 이와 같은 스크린 및 선별은, 표적이 불순물을 함유하거나 선별공정이 표적에 대한 친화성과 무관한 편향성을 나타날 때 마다 수행될 수 있다.
SELEX는, gp 43이라고도 하는 박테이로파아지 T4 DNA 폴리머라제의 기능을 억제 및 결합하는 RNA 분자를 유기하는데 응용함으로써 과시되어 왔다. T4 DNA 폴리머라제의 의 신규 RNA 리간드는 T4 DNA 폴리머라제에 대한 특정 검정시약으로서 유용하다. T4 DNA 폴리머라제의 합성은 자생적으로 조절된다. 기능 단백질 부재하에서는, 복제-결핍오염(replieation-eficient infection)의 와일드형 단백질 합성(Russel(1973) T. Mol. Biol 79 : 83∼94)의 비율과 비교할 때, 호박 단편 및 변이 단백질이 과잉 발현되었다. gp 43의 N-말단 단편의 시험관내 번역은 정제된 gp 43을 첨가함으로써 특정적으로 억제되며, gp 43은 그 리보솜 결합부위 부근의 mRNA의 분리된 부분을 핵산분해효소의 공격으로부터 보호한다(Andrake 등 (1988) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 85 : 7942∼7946). gp 43이 결합하는 RNA 번역 오퍼레이터의 크기와 배열 및 그 결합강도가 설정되었다. gp 43 오퍼레이터의 최소 크기는, 제1도에서 예시한 바와 같이 약 36누클레오티드의 배열인데, 제1도에서 지적한 바와 같이 머리핀 루우프 구조를 가질 것으로 예상된다.
오퍼레이터의 최소 크기는, gp 43에 대한 오퍼레이터의 말단-라벨화 가수분해 단편의 결합을 분석함으로써 측정되었다. 머리핀 및 루우프 배열의 오퍼레이터 변이체의 결합을 분석하면, 오퍼레이터에 대한 gp 43은 결합이 나선내 1차 염기 변화에 민감하다는 것을 나타낸다. 폴리머라제에 대한 결합은, 머리핀 안정성을 현저하게 저하시키는 변화에 의하여 더욱 감소되었다. 오퍼레이터 결합은 루우프 배열에 대하여 매우 민감하다는 것이 밝혀졌다. gp 43에서의 복제 및 오퍼레이터 결합은 서로 배타적인 활성이라는 것이 발견되었다. 완전한 오퍼레이터를 함유하는 마이크로몰의 정제된 RNA를 첨가하면 gp 43에 의한 시험관내 복제가 강력하게 억제되는 것을 알았다.
단백질에 결합하는 핵산분자를 유리하는 선별 증폭공정의 능력을 평가하기 위하여, 제1도의 와일드형 gp 43 오퍼레이터가, 랜덤화 배열 영역을 함유하는 RNA 분자의 초기 혼합물을 만드는데 있어서의 기초로서 채택되었다. 110염기 단일 사슬 DNA주형으로부터의 시험관내 전사에 의하여, RNA 시험 혼합물을 제조하였다. 제1도에 설명한 바와 같이 주형을 구헝하여 루우프 배열을 제외하고는 대부분의 와일드형 오퍼레이터 배열을 코드화하였다. 각 염기에서 완전히 랜덤하게 합성되는 랜덤화 배열영역으로 8염기 루우프 배열을 대치하였다. 주형도 충분한 증폭에 필요한 배열을 함유하였다. : 즉, 폴리머라제 연쇄반응에 있어서의 역전사 및 증폭을 위한 프라이머에 대하여 상보적인 3' 단부의 하나의 배열과 T7 RNA 폴리머라제 전사개시에 요구되는 5' 단부의 하나의 배열 및 시험관에 전사체의 cDNA에 대한 충분한 상보성 배열이다. DNA 주형은, 이론적으로 65,536개의 종류를 함유하는, 모든 루우프 배열 변이체의 혼합물이다.
와일드형 루우프 RNA에 대한 해리상수는 약 5×10-9M인 것이 밝혀졌다. 루우프 배열 변이체 집단에 대한 해리상수는 2.5×10-7으로 계산되었다. 루우프 배열의 랜덤화는 결합친화성을 1/50로 저하시켰다.
루우프 배열 변이체를 함유하는 시험관내 전사체는 정제된 gp 43과 혼합되어 배양되었다. 그 혼합물은 질산면 필터를 통하여 여과되었다. 단백질-RNA 복합체가 필터상에 보존되며, 미결합 RNA는 보존되지 않는다. 다음의 실시예 1에서 설명한 바와 같이, 선별된 RNA가 필터로부터 용출되었다. 상기 Gauss(1987)에서 기술한 바와 같이, 3' 프라이머의 존재하에, 선별된 RNA들은 AMV 역전사효소로 확장되었다. 얻어진 cDNA는, 상기 Innis 등(1986)에 기술된 바와 같이, 30회 동안, 5' 프라이머의 존재하에 Tag DNA 폴리머라제로 증폭되었다. 선별된 증폭 DNA는 시험관내 전사에 대한 주형으로서의 역할을 하여 선별된 증폭 RNA 전사체를 생성하였는데, 이 전사체는 다음에 다른 결합선별/증폭단계로 처리된다. 결합선별 혼합물내의 RNA/단백질 비율은 선별의 전 순환기간을 통하여 일정하였다. 몇 개의 상이한 RNA/단백질 몰비를 이용하여 반복적인 선별/증폭 공정을 수행하였다. 모든 실험에서 RNA는 과잉이었는데 : 시험 A는 RNA/gp 43이 10/1(몰/몰) ; 실험 B는 RNA/gp 43이 1000/1; 및 실험 C는 RNA/gp 43을 100/1로 채택하였다.
선별공정의 진행과정을, 각 순환 공정의 종결 단계에서, 증폭된 cDNA의 라멜 전사체의 필터결합검정법에 의하여 감시하였다. 선별공정을 감시하기 위하여, 실험 B는 각 라운드에서 나온 RNA 생성물에 대한 뱃취배열결정도 하였다. 2, 3 및 4라운드의 선별/증폭 공정후의 RNA 생성물에 대한 배열결정 겔의 오우토라피오그람을 제3도에 도시한다. 3차 선별후까지 명확한 루우프 배열 편향이 도입되지 않았다는 것이 분명하였다. 4라운드의 선별후, 8염기 루우프 배열에 대한 명확한 콘센서스(consensus) 배열이 A(a/g) (u/c)AAC(u/c) (u/c)로서 식별되었다. 실험 A, B 및 C에 있어서, 4라운드 선별후의 선별 RNA의 뱃취 배열결정이 제4도에서 비교된다. 상이한 RNA/단백질 비율을 이용하는 3개의 독립적인 SELEX 모두는 유사하게 명백한 콘센서스 배열을 제공하였다. 그러나, 실험 A 및 C로부터 나온 선별 RNA에서 와일드형 루우프 배열(AAUAACUC)에 대한 약간의 명확한 편향성이 있었다.
선별된 RNA내에 어떤 허용가능한 배열조합이 실제로 존재할 수 있는가를 조사하기 위하여, 실험 B에서 4라운드의 선별후에 선별된 DNA들로부터 개별 DNA들을 클론화하였다. 실험 B로부터 얻어진 뱃치 배열을, 루우프 배열의 4개의 다양한 위치를 가각각 포함하는 2개의 가능한 누클레오티드가 균등하게 분포되어 있는 것을 가르키는 것으로 나타났다. 개별 DNA들은, Sambrook, J. 등(1989) Molecular Clonnong : A Laboratory Mannual, (Cold Spring Harbor, N. Y), Sections 1. 13 : 1.85∼1.86에 의하여 기술된 바와 같이, pUC18로 클론화되었다. 코로니 필터 혼성화(colony filter hybridization)에 의하여 3' 프라이머로 확인된 20개의 개별 클론들이 배열결정되었다. 어떤 배열결정된 클론도, 루우프 배령의 외부 오퍼레이터 배열내의 어떤 위치에서도 변이체가 아니었다. 제7도에 도시한 바와 같이, 오직 5개의 변이체 배열만이 관측되었는데, 놀랍게도 단지 2개 배열 변이체만이 선별된 혼합물의 주성분이었다. 20개의 개별 분리체내의 각 배열의 빈도를 제7도에 나타낸다. 와이드형 배열 AAUAACUC 및 루우프 AGCAACCU는 실험 B의 선별된 RNA에 거의 동일량으로 존재하였다. 기타 선별된 변이체는 2 다수 변이체중 1 염기 변이체이었다. 배열 변이체의 결합강도는, 정제된 각 클론 분리체로부터 유도된, 라벨된 시험관내 전사체를 이용하여 필터 결합 검정법으로 비교되었다. 제6도에서 알 수 있는 바와 같이, gp 43에 대한 RNA의 결합친화성 및 선별된 배열의 풍부성 사이에 개략적인 상호관련성이 관측되었다. 2개의 다수 루우프 배열 변이체는 gp 43에 대하여 거의 동일한 결합 친화성을 나타내었다.
제7도에 도시한 바와 같이, 선별/증폭 공정에 의하여 유리된 루우프 배열 변이체는 모두, 와일드형 오퍼레이터 배열에 대하여 표현된 바와 같은 gp 43 폴리머라제 활성의 억제제로서의 역활을 할 수 있다.
박테리오파이지 T4 DNA 폴리머라제(gp 43)의 신규의 RNA 리간드의 선별에 의하여 SELEX 사용의 일례가 마련되었다(Andrake등(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 7942∼7946).
본 발명은, SELEX 공정으로부터 유도된 특이적 리간드 용액을 포함하는데, 상기 리간드 용액은 HIV-1 역전사효소, R17 외피 단백질, HIV-1 rev 단백질, HSV DNA 폴리머라제, E. coli 리보솜 단백질 S1, tPA 및 NGF에 대하여 증가된 친화성을 보인다. 이들 리간드 용액은, 당 분야의 숙련자에 의하여 이용되어, 다양한 표적에 대한 핵산항체를 합성할 수 있다.
하기 실시예는 광범위한 표적에 대한 SELEX의 성공적인 응용방법을 설명하고 있다. 표적은 일반적으로 2개의 카테고리로 나눌 수 있는데, 즉 핵산결합 단백질과 핵산과 상호작용하는 것으로 알려지지 않는 단백질이다. 각 경우에 있어서, 하나의 리간드 용액이 얻어진다. 일부 경우에 있어서 리간드 용액을, 머리핀 루우프, 비대칭 용기 또는 수우도놋트와 같은 핵산 특징으로서 표현하는 것이 가능하다. 기타 실시예에서 리간드 용액은 1차 배열로서 표현된다. 이와 같은 경우에 리간드 용액이 한정적인 3차 구조를 함유하지 않는다는 의미는 아니다.
T4 DNA 폴리머라제 외에, SELEX 공정이 성공적으로 수행되는 표적에는 박테리오파아지 R17 외피 단백질, HIV 역전사효소(HIV-RT), HIV-1 rev 단백질, HSV DNA폴리머라제±공동인자, E. coli 리보솜 단백질 S1, tPA 및 NGF가 포함된다. 하기 실험도 다양한 단백질에 대한 랜덤화 핵산 대상 혼합물의 집단(bulk) 결합 친화성 시험을 위한 실험계획을 설명하고 있다. 실시예 7도 브래디키닌의 고정화 및 브래디키닌에 대한 집단랜덤화 핵산결합 연구결과를 설명하고 있다.
하기 실시예 및 설명은 어떤 면에서도 제한받는 의미로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 바닥에 깔려 있는 근본적 견해는, 화합물로서의 핵산은 사실상 무한정의 크기, 형태 및 구조를 형성하며 엄청난 결합 및 촉매능력이 가능한데, 그 중 생물학적 시스템에 존재하는 것으로 알려진 것은 극히 미미하다는 것이다.
[실시예]
다음의 물질들과 방법들이 전반적으로 사용되었다.
전사벡터 pT7-2는 상업적으로 취득가능하다(미국생화학회사, 오하이오주 클리브랜드 소재) 플라스미드 pUC18은 노란더(Norrander) 등(1983) Gene 24 : 15∼27에 의해 설명되어 있으며 또한 뉴잉글랜드 생물실험실들로부터 상업적으로 구할 수 있다. 새로운 재조합하는 플라스미드를 만들기 위한 DNA의 모든 조작은 마니아티스 등(1982)에 설명된 바와 같다. 분자 크로닝 : 실험실 교본, 뉴욕 콘드스프링, 콜드스프링하버연구소, 특히 예시한 다른 것은 제외함. DNA 올리고누클레오티드는 가우스 등 Mol. Gen. Genet. 206 : 24∼34에 설명된 바와 같이 인공합성되어 정제시킨다.
T7 RNA 중합효소와의 시험관내 전사와 RNA 겔-정제는 라벨반응에서 ATP, CTP 및 GTP의 농도는 각기 0.5mM이고, UTP 농도는 0.05mM이라는 것을 제외하고는, 밀리간 등(1987) Nucl. Acids Res. 15 : 8783∼8798에 설명된 바와 같이 수행되었다. UTP는 약 20Ci/mmol의 비방사능으로32P알파위치에 서로 라벨되었다. T4 감염으로부터 조(粗) mRNA 제조, 올리고스의 라벨 및 AMY 역전사효소로의 프라이머 확장은 모두 상기 가우스 등(1987)의 방법에 의한 것이다.
라벨 및 겔 정제된 RNA와 정제된 gp 43의 희석액은 4℃에서 200mM의 아세트산 칼륨, 50mM Tris-HCl pH7.7에서 만들어진다. 니트로셀룰로우즈 필터 결합 검정에서, 정제된 gp 43은 연속적으로 희석되고 각 단백질 희석액은 30㎕ 분취량을 희석, 라벨 및 겔-정제 RNA의 30㎕분취량에 가한다. RNA 희석액(50㎕)을 깨끗한 니트로셀룰로즈 필터에 묻혀 말려서 시험관당 입력계수를 결정하기 위해 셈한다. 반응에서 단백질의 농도는 10-10M에서 10-8M의 범위이고 각 실험에서 RNA들의 농도는 대략 10-12M이다. 4℃에서 30분간 배양한 후, 각 시험관을 37℃에서 3분간 놓은 뒤 각 샘플의 50㎕를 미리 적셔 둔 미트로셀룰로즈 필터들로(Millipore #HAWP 02500) 여과하고 3ml의 200mM 아세트산 칼륨, 50mM Tris-HCl pH7.7로 세척했다. 필터들을 말린 뒤 에콜룸TM섬광용액(ICN 바이오메디칼 주식회사)에서 셈하였다. gp 43의 부재하에 조절하여, 이로부터 백그라운드가 결정되었다(언제나 입력 계수의 약 5%보다 작았다). 각 조의 측정으로부터 백그라운드를 빼었고, 필터에 남은 전체 입력계수의 퍼센트를 계산했다. 각 데이타점들의 집합에서 다음의 방정식으로 표현되는 곡선을 구성하도록 수정한 기 발표된 프로그램(위에서의 카세시와 카레라스, 1984)을 사용하여 최적 이론 이분자 결합곡선을 얻었다.
θ=A[gp 43]/(Kd+[gp 43])
여기서 θ는 필터에 결합된 전 RNA의 부분이다. A는 결합이 포화를 이루는 RNA의 퍼센트이다(이와 같은 단백질-RNA 상호작용에 대해 약60%), [gp 43]은 입력 gp 43 농도이고 Kd는 이분자 반응에 대한 분해상수이다. 이 방정식은 비스방거(1979)의 Theorie und Methoden der Enzymkinetik, Verlag Chemie, 독일 바인하임 제9페이지의 방정식을 [1∼5] 설명된 실험에서 단백질의 농도가 RNA-단백질 복합체의 농도보다 휠씬 크다는 가정을 단순화한 것인데, 이 가정은 기술된 실험에서 유효하다.
[실시예 1]
T4 DNA 폴리머라제의 DNA 억제제의 선택
시험관내 전사에 대한 110 염기 단일 사슬 DNA 주형을 제2도에 도시된 바와 같이, 두개의 캡핑(capping) 올리고누클레오티드(표 1 및 2) 존재하에 3개의 합성 올리고누클레오티드(표 1,3,4 및 5)를 연결하여 제조한다.
주형으로 만든 올리고 중의 하나를 시험관내 전사체의 역전사 및 폴리머라제 연쇄반응(PCRs)들에서의 연속적인 증폭에 있어서, 3' 프라이머로서 또한 사용했다(이니스 등.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 9436∼9440) 캡핑 올리고스(1)의 하나는 T7 RNA 폴리머라제 전사개시에 요구되는 전보와 PCR 증폭단계에서 5' 프라이머로서 작용하는 시험관내 전사체의 cDNA를 보충하는 충분한 배열을 포함한다. DNA 주형은 거친 형태의 원형 순서 AAUAACUC를 암호화하는 순서 대신에 완전히 임의의 순서로 대체되는 것을 제외하고 T4 DNA 폴리머 효소에 대한 전체 RNA 인식 위치를 포함하는 RNA를 암호화했다.
임의의 순서는 올리고누클레오티드 번호 4(표 1)의 순서에서 N으로 표시된 각 위치에 대한 반응 혼합물에서 분출량에 모든 4개의 dNTP들이 주어진 것을 제외하고 상용 DNA 합성기(응용 바이오시스템)를 사용하여 통상적인 화학합성에 의해 도입된다. 임의의 순서는 PCR에 사용된 5'와 3' 올리고스에 대한 시발체 풀림 순서에 의해 측면에 전하게 된다. DNA 주형은 따라서 모든 원형 순서변화의 혼합이며, 이론적으로 65,536개의 개개의 종들을 포함한다. 거친 형태(wild-type)의 원형의 상이한 RNA 순서에 대한 분해상수는 약 5×10-9M이며, 순서들의 모집단에 대한 분해상수는 약 2.5×10-7M, 50겹의 낮은 결합 친화성으로 측정되었다.
루우프 배열 변이체를 포함하는 시험관내의 전사체는 복수 라운드의 선별을 통해 3개의 상이한 RNA-단백질 비율로 정제된 gp 43과 섞었다(A와 B에 대해 gp 43의 농도는 3×10 M, 저단백질, 그리고 C에 대해선 gp 43의 농도는 3×10 M, 고단백질, A에 대해선 RNA의 농도는 약 3×10 M, 저 RNA, B와 C에 대해선 RNA의 농도는 약 3×10 M, 고 RNA). 일회는 다음의 단계들로 구성된다 :
1) 선별. RNA와 단백질을 위에서 설명한 원하는 비율로 혼합하고, 37℃에서 배양하여 니트로셀루로즈로 세척하고 RNA를 위에서 설명한 바와 같이 필터로부터 용출시킨다.
2) 증폭. 필터로부터 용출된 RNA를 위에서의 Gauss 등(1987)에 설명된 조건하에서 50㎕ 반응물내의 50 피코몰의 3' 프라이머 존재하에 AMV 가역전사효소로 확장시켰다. 얻어진 cDNA 합성물에 대해 5' 프라이머 50 피코몰을 가하고 100㎕의 반응체적에서 위에서의 이니스(1988)에 설명된 Tag DNA 폴리머라제로 30회 증폭한다.
3) 전사. 시험관내의 전사는 위에서의 밀리간 등(1987)에 설명된 선택되고 증폭된 주형상에서 수행되며, 그 후 DNase I을 가하여 DNA 주형을 제거한다. 그 결과로서 선별된 RNA 전사체는 다음회의 1단계에서 사용된다. 사이클의 각 단계에서 제조된 생성물의 단지 1/20만의 다음의 사이클들에 사용되어 선택과정을 추적할 수 있다. 선택방법의 진행은 각 PCR 반응으로부터 라벨화 전사체들의 필터결합 검정에 의해 감시되었다. 선별과 증폭의 4번째 회의후 라벨화되고 선택된 RNA 생성물들은 와일드형의 조절 RNA의 것과 동등한 gp 43에 결합되었다. 하나의 실험(B)에 대한 각 라운드로부터의 RNA 생성물과 모든 3가지 실험들에 대한 4번째 라운드로부터의 생성물은 겔-정제되고 배열결정되었다. 제3도에, 실험 B에 대한 제2, 제3 및 제4라운드의 선별과 증폭으로부터 유도되고 정제된 시험관내의 전사체의 배열을 나타내고 있다. 제3의 선별 이후까지 아무런 명백한 루우프 배열의 경향이 없었다는 것이 분명하다. 선별에 있어서 이 지점에 의해, 명백한 콘센서스 배열 A(a/g) (u/c)AAC(u/c) (u/c)에 대한 제4회에 의해 완전한 감지가능한 경향이 있다. 시험 A, B, C에 대한 제4의 선별과 증폭후에 전사된 RNA의 뱃치배열결정(batch sequencing)이 제4도에 도시되어 있다. 상이한 단백질/RNA 비율을 갖는 3번의 모든 독립적인 시행이 유사한 결과들을 준다. 실험 A와 C에서 4개의 변수 위치들의 각각에서 와일드형 배열에 대한 명백한 어떤 편향이 있다.
실제로 어떤 가능한 조합들이 존재했는가를 알아보기 위해, 제한부위 정보를 포함한 두개의 크로닝 올리고누클레오티드를 사용하여 이미 설명한 바와 같이(위에서의 샘브룩 등(1989); 위에서의 이니스 등(1988)) 각각이 PUC18로 크론되는 실험 B의 제4회로부터 나온 RNA로부터의 배열들을 증폭한다. 시행 B의 선택된 배치들은 추가의 시험을 위해 선택되는데, 각기 4개의 변수 위치로 구성되는 2개의 허용가능한 누클레오티드의 균일한 분포인 것으로 나타났기 때문이다. 군체 필터 잡종형성에 의해 3' 프라이머로 식별된 20개의 개개의 크론들이 배열결정되었다. 이 개개의 것들의 어느 것도 미세하게 변환 루우프 배열위치의 오퍼레이터 배열 외부의 어느 위치에서도 돌연변이는 아니었다. 그 배열분포를 제7도에 요약하였다. 놀라운 것은 선택된 RNA 혼합물이 실지로 두개의 주 루우프 배열로 구성되었다는 것이다. 하나는 와일드형의 배열 AAUAACUC였는데 그것의 20개 중 9개가 분리되었다. 나머지 하나인 AGCAACCU 는 4위치에서 돌연변이였고 20개의 크론들 중 8개에서 존재했다(제7도 참조). 감지된 다른 세개의 루우프 배열은 이들 2개의 주배열 중 하나의 돌연변이였다. 이 크로날 분리체의 각각으로부터 유도된 시험관내의 라벨화 전사체를 가지고 한 필터결합실험들은 gp 43에 대한 RNA의 결합친화성과 선택된 부유화 사이에 개략적인 상관관계가 있음을 나타내었다(제7도 참조).
[실시예 2]
HIV 가역전사효소에 대한 특정 RNA 리간드의 분리
HIV-1의 가역전사효소 활성은 공통 아미노 말단을 갖는 2개의 서브유니트(p51과 p66)의 헤테로다이머(heterodimer)로 구성된다. 더 큰 펩티드의 카르복시말단 지역은 가역전사효소의 RNaseH 영역을 구성한다; 그 영역의 구조는 최근에 고 해상도로 결정되었다.
이 HIV-1 가역전사효소가 직접적으로 또 특별히 그 동족 프라이머 tRNA 와 상호작용하는데, 이에 대해 실험적을 아티코돈(anti-codon) 루우프와 스템(stem)에서 교차결합된다는 것은 이미 알려져 있다. 또한 단지 헤테로다이머만이 이 특정 RNA 인식을 나타냈으며; 가역전사효소의 어느 헤테로다이머류도 특이성을 갖고 이 tRNA와 결합하지 않았다.
2개의 주형모집단(각기 약 10 의 상이한 배열을 가진)을 결합으로 SELEX에 사용하기 위해 만들었다. 하나의 주형모집단은, dDNA 합성 및 PCR 증폭을 제공하는 랜덤화 영역의 말단에 있는 고정배열들을 사용하여 32개의 누클레오티드 위치상에서 랜덤화되었다. RNA의 5' 말단에 있는 추가의 고정 배열로서, 제2주형모집단은 tRNA 의 안티코돈 루우프와 스템을 갖는다(이 작업에 사용된 모든 올리고가 표 2에 표시되어 있다). HIV-1 가역전사효소 [RT]에 대한 두개의 랜덤화 모집단의 친화성에 아무런 차이도 없었다(그리고, 표시된 바와 같이, 선택된 RNA들은 특정결합에서 5' 영역도 이용하지 않았다). 표적 단백질로서 헤테로다이머 HIV-RT를 사용하여 각각의 모집단에 대한 SELEX의 9라운드가 수행되었다.
랜덤화 DNA가 결합의 이용과 올리고누클레오티드의 가교결합으로서 제조되는 메카니즘은 앞서 설명하였다. 그러한 방법론이 1마이크로몰 규모에서 DNA 합성으로 부가된 이론적 한계로부터 출발모집단에서 상이한 배열의 전체 수를 감소시킬 수 있다.
이 연결반응에서 각 올리고누클레오티드의 약 1나노몰(nanomole)이 사용되었다. 연결된 산출물은 약50%의 수율로 겔-정제 되었다. 이 정제된 주형은 위에서 설명한 T7 RNA로 전사된다. 니트로셀루로즈 검정에 의해 측정되는 바와 같이 약 7×10 M으로 발생하는 반최대 결합으로 HIV-RT가 이 불규칙 모집단을 포화상태로 결합시킨다는 것을 발견하였다. 모든 RNA-단백질 결합반응은 200mM KOAc, 50mM Tris-HCI pH7.7, 10mL 디티오트레이톨(dithiothreitol)의 결합완충액에서 행해졌다. RNA 및 단백질 희석액을 혼합하고 얼음 위에서 30분간 저장한 후 37℃로 5분간 이전시킨다(결합검정에서 반응 체적은 60㎕이며, 그 중 50㎕가 검정된다; SELEX 라운드에서 반응체적은 100㎕이다). 각 반응은 미리 적신(결합완충물로) 니트로셀루로즈 필터를 통해 흡입되어 300ml의 결합완충액으로 세정한 후 건조시켜서 검정을 위하여 세거나 SELEX 실험계획의 일부로서 용출시킨다. 9라운드를 수행했다. 모든 9라운드에 대한 RNA 농도는 약3×10 M 이었다. HIV-RT는 제1선별에선 2×10 M, 2-9 선택에선 1×10 M 이었다.
tRNA 안티코돈 루우프와 스템을 포함하는 RNA를 이용하는 실험이 우선 완료되었다. 제9라운드에서 수행된 니트로셀룰로즈 필터 결합 검정들은 RNA 모집단이 출발 대상 혼합물을 비교할 때 HIV-1 RT에 대한 친화성에서 약 100배로 증가되었음을 나타내었다. 그러나 단백질이 없는 상태에서 니트로셀루로즈 필터에 대한 백그라운드 결합은 입력 RNA의 약 2%로부터 15%로 증가되었다. 각각의 배열은 이 모집단으로부터 크론화되어(단지 필요에 의한 유지에 대해 선택된 잠재적인 배열의 일부 높은 백그라운드를 제거하기 위하여 니트로셀루로즈를 통해 여과한 후) 표 3에 기재되어 있다.
HIV RT에 대한 선택된 배열들의 친화성이 니트로셀루로즈 필터 결합 검정결과들이 제14도에 도시되어 있다. 배열들의 일부는 리간드 1.1과 1.3a의 결합곡선으로 예시된 HIV-RT에 대한 리간드로 선택되며, 표 4와 5에 표시된 바와 같이 일부 배열 상동성을 나타낸다. 일부 리간드 배열은 단백질이 없는 상태에서 니트로셀루로즈 필터에서 현저한 잔류량을 나타내며, 리간드 1.4로 예시되었다(제14도). 그리고 퓨린 반복 성분의 루우프를 가진 긴 나선형의 특징이 있는 것 같다. (표 4에 도시된 바와 같이) 클론화 이전에 이 실험에서 그것들을 삭제하려는 우리의 최소의 때늦은 노력에도 불구하고, 이 배열들은 이 실험으로부터 채집된 그것들의 상당한 부분을 나타내었다.
결과로서, 실험 2(상이한 5' 고정배열을 갖는다)는 선별의 제1, 제6 및 제9라운드전에 니트로셀루로즈를 통해 미리 여과되었다. 이 실험으로부터 채집된 배열들이 표 6에 표시되어 있다. 표 4 와 5에 표시된 바와 같이 실험 1로부터 고 친화성의 것들에 유사한 많은 배열들이 다시 나타난다. 무엇이든 니트로셀루로즈 필터만으로 얻어진 배열의 특징에 맞는 많은 더 적은 배열들이 있다. 이 실험으로부터 선택된 리간드 배열의 니트로셀루로즈 결합검정결과들이 리간 1.1의 그것들과 비교되어 제15도에 도시되어 있다.
가장 일반적인 배열(1,1) 및 유사한 비열(1-3a)을 갖는 고 친화성 리간드 RNA들을 HIV-1RT에 대한 고 친화성 결합을 위해 요구되는 정보의 경계를 측정하기 위해 추가로 분석되었다. 이 실험들의 결과들이 제16도에 도시되어 있다. 이 실험들은 이 배열들, UUCCGNNNNNNNNCGGGAAA에 공통인 특징(motif)이 인식 영역내에서 유사하게 위치된다는 것을 보여 주었다. 이 특징의 배열 UUCCG와 CGGGA는 8개의 기본 루우프를 갖는 RNA 나선을 형성하도록 염기쌍을 이룰 수 있다. 이 고정된 배열 외에 무엇이 HIV-1 RT에 대한 고 친화성 결합에 기여하는가를 발견하기 위해 하나의 대상 혼합물 주형을, 표 7에 도시된 바와 같은 이들 2개의 배열과는 다른 누클레오티드 위치에서 랜덤 혼합을 포함하도록 만들었다. SELEX의 8라운드' 이후, 각 배열들은 크론화되고 배열결정되었다. 46개의 배열들이 표 7에 표시되어 있다. 이 배열들의 조사로부터 중앙의 8n 가변영역과 하류 4n 가변영역 및 측변배열 사이에 광범위한 염기쌍 현상이 나타나는데; 이 염기쌍 현상은 위에서 논의된 것과 조합하여 RNA 수우도놋트(psedoknot)를 가르킨다. 이렇게 전개된 모집단에서 현저한 특정배열들이 없다는 것은 1차 배열 수준에서 선별이 없으며, 선별이 순수하게 2차 구조를 기초로 하여 일어난다는 것, 즉 HIV-1 RT에 대한 유사한 친화성을 주는 많은 배열 조합들이 있으며, 어느 것도 경쟁적인 장점을 갖지 않는다는 것을 제시한다. 제1 및 제2 SELEX 실험의 분석들은 UUCCG…CGGGANAA 특징에 상동성을 갖는 그러한 모집단들을 구성하는 개개의 배열들이 또한 이 수우도놋트 염기쌍 현상에 대한 강한 잠재력을 보여 준다는 것을 드러낸다.
제31도는 여기서 수우도놋트로서 언급된 것의 체계적인 도식을 보여 준다. 수우도놋트는 두개의 나선형 부분과 세개의 루우프 부분으로 구성된다. 모든 수우도놋트가 모두 세개의 루우프를 포함하지는 않는다. 얻어진 데이타를 해석하기 위해, 수우도놋트의 여러 부분들이 제31도에 도시된 바와 같이 분류되었다. 예를 들면, 표 5에 실험 1과 2에서 얻어진 여러 배열들이 여러 배열들로 가정된 수우도놋트 형상에 따라 분류되어 기재되어 있다.
표 5에서 정의된 실험 1과 2의 결과들은 Sl(a), Sl(b) 및 L3에서의 배열이 고정된 실험 3으로 유도된다. 또한 SELEX가 유도한 핵산은 수우도놋트들에서 거의 광범위하게 형상되었다. 각 실험들에서 결과들의 조사는 HIV-RT에 대한 핵산용액이 모두 수우도놋트로 형상화된 가장 기본적인 공통분모인 비교적 다수의 성분들을 포함한다는 것을 나타낸다.
HIV-RT용 핵산 용액에 대한 또 다른 일반적 정의는 다음과 같다.
1) Sl(a)는 때때로 배열 5'-UUCCG-3'를 포함하며 Sl(b)는 배열 5'-CGGGA-3'를 포함한다. 그러나, 염기쌍 플립들이 허용되고 스템(stem)이 축소될 수도 있다.
2) L1은 짧거나 길 수 있지만 가끔 가장 양호한 접합색산 속에 두개의 누클레오티드를 포함한다.
3) S2는 통상 5개 또는 6개의 염기상들을 포함하며, 독립배열인 것 같다. 이 스템은 비-왓슨/크릭(non-Watson/Crick)쌍들을 함유할 수도 있다.
4) L2는 누클레오티드를 함유하지 않을 수도 있지만 만일 누클레오티드를 함유하게 된다면 그것은 A의 것이 적합하다.
5) L3은 일반적으로 3개 또는 그 이상의 누클레오티드를 갖지만 A에서 농후하다.
6) SELEX는 얻어지는 대부분의 배열들은 L1, S2(a) 및 L2의 누클레오티드 합계가 8개로 동일하다.
이 실험의 주된 목적은 HIV-1 RT에 대한 리간드(ligand) 용액을 찾아내는 것이다. 전개된 리간드 크론 1. 1의 능력은 역전사효소능을 억제하기 위한 실험 1에서의 초기 모집단의 능력과 비교되었는데, 그 결과는 제17도에 나타나 있다. RT에 대한 억제제인 RNA의 농도가 동일한 상태에서도 역전사효소는 리간드 1. 1에 의해 크게 억제되었다. 대조적으로, HIV-1 RT의 유효한 억제작용은 단지 초기 모집단 RNA 10mM(또는 200-배 과잉)에서나 나타난다. 따라서, 고성능 리간드는 HIV-1 RT에 대해 효소의 촉매적 측면에서 직접적으로 서로 작용하기도 하고 차단하기도 한다.
이 억제작용의 현저성을 시험하기 위해, 리간드 1.1이 여러 농도에서 역전사효소 MMLV, AMV 및 HIV-1 억제작용에 대해 어떻게 작용하는지가 분석실험되었다. 실험결과는 제18도에 나타나 있는데 리간드 1.1의 억제 작용은 HIV-1 역전사효소에 대해 현저함을 알 수 있다.
[실시예 3]
박테리오파아지 R17 외피 단백질용 특수 RNA의 유리
SELEX가 박테리아파아지 R17 외피 단백질에 대해 실험되었다. 단백질은 캐리 등의 바이오케미스트(Carey et al., Bio chemistry), 22. 2601(1983)에 의해 기재된 방법에 따라 정제되었다. 결합완충제는 pH 7.5의 초산칼륨 100mM에 디티오트레이톨 10mM과 트리스-아세테이트 50mM로 배합한 것이다. 단백질과 RNA는 37℃에서 3분간 함께 배양된 후 유리 RNA로부터 단백질 결합 RNA를 분리하기 위해 니트로셀루로즈 휠터로 여과되었다. 휠터는 pH 7.5의 트리스-초산 50mM로 세척하였다. 단백질 농도는 SELEX의 초기 4라운드에서 1.2×10 M, 5라운드부터 11라운드 파아지는 4×10 M이었다.
RNA는 전술한대로 DNA로부터 전사되었다. 본 DNA 배열은 박테리오파아지 T17 RNA 중합화 효소 프로모터 배열 즉, 표준기술에 따라 RNA가 중합되는 것과 같은 프로모터 배열을 포함한다. SELEX 주기의 증폭과정 중 cDNA 합성은 하기 배열의 DNA에 의해 프라임된다 : cDNA 리머(PCR 프라이머 1) : 5' GTTTCAATAGAGATATAAAATTCTTTCATAG 3'
cDNA를 증폭하는데 사용되었던 DNA 프라임은 32개의 랜덤화 위치를 가지며 T7 프로모터를 포함하는 배열인 AT 디누클레오티드와 PCR 프라이머 1과의 상보성 고정 배열이었다. 따라서 SELEX의 초기 사이클을 시작하는데 사용되는 RNA는 다음 배열을 갖는다 :
pppGGGAGCCAACACCACAAUUCCAAUCAAG·32N·AUCUAUGAAAGAAUUUUAUCUCUAUUGAAAC
한 셋트의 크론은 SELEX의 11회전 이후에 얻어졌으며 배열결정되었다. 47개의 크론 속에는 38개의 다른 배열이 얻어졌으며 그 안에는 3개가 적어도 한번 이상 나타난다 : 즉, 한개의 배열은 6번, 또 한개의 배열은 4번, 다른 한개의 배열은 2번 나타난다. 나머지 35배열은 각각 1번씩 나타난다. 1차 배열이나 2차 구조와 같은 경우는 두개의 배열이 다른 것과 상이하다. 그리고 더 이상은 분석되지 않았다. 36번 배열은 일반적으로 배열 ANCA를 갖는데 이 ANCA는 머리핀의 돌기부 같은 테트라누클레오티드 루우프 모양을 하고 있다. 36개 사례에서 돌기된 누클레오티드는 모두 아데닌이다. 네개의 머리핀 루우프의 누킬레오티드에 의해 정열된 전체 셋트의 배열을 표 8에 나타내었다. 출발 RNA(Au)의 랜덤화 영역에 대한 2개의 누클레오티드 3'는 자유롭게 바꾸거나 삭제될 수 있는데, 이는 cDNA 프라머가 2개의 상보성 누클레오티드를 함유하지 않기 때문이다. 많은 크론들이 이들 누클레오티드 중 하나 또는 양자와 교환된다.
취득된 RNA 특징(motif)은(제19도 참조) 부위-편향 돌연변이 유도학 및 결합연구를 통해 일찍이 확인된 코드 결합부위와 직접적인 관련을 맺고 있다(Uhlenbeck et al. Supra, 1983; 및 Ramaniuk et al. Supra, 1987 참조). 그러나 이러한 셋트에 있어서, 어떤 배열들은 기대했던 것보다 좀더 보존적이다. 이전의 결합 데이타는 ANCA 배열이 모두 동일하다는 것을 시사하고 있지만 루우프 배열 AUCA는 우성의 성질을 갖는다. R17게놈(genome)의 천연결합위치는 아래 배열 및 구조를 갖는다 :
UU
A A
GC
GC
A
GC
천연구조는 GGAG 배열을 갖는데, 리보솜 결합을 촉진하고, R17 복제 코드화 영역의 번역을 개시하는 역할을 한다. SELEX 중에는 그 필요성이 없으며, 얻어지는 배열은 돌기부 및 루우프 근처에서 C : G 염기쌍을 G : C 염기쌍보다 더 함유한다. 그러므로, SELEX는 천연 리간드에 비해 높은 친화성을 갖는 리간드가 되도록 함으로써 생물의 진화론적 속박을 풀어 준다. 마찬가지로 각 36배열에서 발견되는 루우프 시티딘(sytidine)은 천연산의 우리딘(uridine)인데, C가 U보다 더 높은 친화성을 주는 것으로 알려져 있다. 가장 견고한 결합은 조직에 대해 결함을 유발할지도 모르므로 진화하는 동안 자연의 입장에서 보면 고도의 친화성보다는 적당한 친화성을 가져야 한다.
[실시예 4]
세린 프로테아제용 핵산 리간드의 단리
세린 프로테아제는 단백질 안에서 펩티드 본드를 생성하는 단백질 효소이다. 세린 프로테아제는 포유동물의 유전자군의 멤버이다. 그리고 포유동물의 수명과 관계가 있는 중요효소이다. 세린 프로테아제는 핵산에 결합되어 있지 않은 것으로 알려져 있다. 세린 프로테아제의 예로는 조직 플라스미노겐 활성제, 트립신, 엘라스타제, 치모트립신, 스롬빈과 플라스민이 있다. 많은 질병상태 예를 들면 혈액응고증, 혈전증은 세린 프로테아제에 결합된 핵산 리간드로 치료될 수 있다. 세린 프로테아제를 제외한 프로테아제 또한 포유동물생물학에 있어서 중요한 것인데, 이들 또한 본 발명에 의해 얻어진 적당한 유연성을 갖는 핵산 리간드 표적이 될 수 있다.
현재 상품화되어 있는 인간의 조직 플라스노겐 활성제(htPA)가 본 발명의 SELEX 방법을 통해 등급을 결정하기 위한 세린 프로테아제로 선택되었다. 사용된 RNA 대상 혼합물은 하기 실시예 11의 HSV DNA 중합효소실험에서 사용된 것과 같은 것이다.
SELEX 기간 중의 결합은 pH 7.5의 nACl 50mM과 트리스-아세테이트 50mM 혼합액에서 37℃로 3분간 행해진다. SELEX는 10회에 걸쳐 진행되었다. 30N대상 혼합물이 tPA에 주어졌는데, 이 tPA는 NaAc 150mM 트리스-아세테이트 50mM로 된 pH 7.5이고 7×10 M의 친화성(Kd)을 갖는다 : SELEX 9회전 후의 RNA 친화성은 약 3배나 더 견고했다. 9개의 크론이 단리되고 배열결정되어 이 중 얼마는 순수 RNA들로서 tPA에 결합하기 위해 시험되었다. 낮은 염에서 얻어진 9개 크론의 배열은 아래와 같다.
실험된 모든 배열은 적어도 30N의 초기 대상 혼합물 보다는 어느 정도 결합이 양호했다. 그러나 니트로셀루로즈에 대한 A계열의 결합은 마치 공유배열특징이 니트로셀루로즈 기질에 단독으로 유지력을 부여하는 것처럼 tPA가 없는 상태에서만 대상 혼합물의 결합보다 양호했다. 해당 특징은 상기 배열에서 밑줄 친 부분이다. 다른 SELEX 실험에서는 AGG 반복단위는 HIV-1역전사효소, 인체성장 홀몬 수용체 한외세포 영역, 최초 워킹 실험에서는 심지어는 R17 피복단백질에 대하여도 리간드 용액의 작용을 확인하는 시험에서 단리되었다. 실험에서 이들 배열들은 니트로셀루로즈 필터에 잘 부착되어 있었는데. 이때 표적에서 한 단백질은 보이지 않았다. 이것으로 AGG 반복단위가 머리핀 루우프에 존재한다는 것이 확실해졌다. SELEX가 대부분의 구체예에서 반복되는 공정임을 감안한다면, 그러한 결합 특징이 나타난다는 것은 놀랄 만한 일이 아니다.
니트로셀루로즈 결합 특징의 존재현상은 몇가지 자명한 방법 중 하나 이상의 방법에 의하여 피할 수 있다. RNA는 그러한 특징 제거를 위해 SELEX에 앞서, 니트로셀루로즈 필터로 여과될 수 있다. 기제대체물, 예컨대 글라스화이버필터와 같은 것을 SELEX의 대체 라운드에 사용할 수도 있다. 대체 격리시스템, 예컨대 칼럼, 슈크로스그래디언트(sucrose gradients) 등이 사용될 수도 있다. 표적에 결합을 증가시키지 않으나, 선별공정에 의하여 선택된 특징을 찾아내는 반복공정에서, 주어진 단일 공정은 편향성이 된다는 것은 자명하다. 따라서, 이들 특징을 제거하기 위한 대체공정 또는 선발공정을 거치는 것이 매우 중요하다. 독립표적인 편향으로서 단리된 다른 특징과 같이, AGG 반복단위는, 표적에 대한 가장 좋은 배열의 친화성이 비교적 낮을 때 또는 가장 좋은 배열의 친화성에 표적을 위한 출발대상혼합물의 친화성보다 아주 약간 양호할 때, 가장 자주 나타나는 경향이 있다.
[실시예 5]
포유동물 수용체용 핵산 리간드의 단리
포유동물 수용체는 세포의 세포질막 안에 존재하는 단백질인데 세포 밖에서 순환하는 분자에 반응한다. 대부분의 수용체는 핵산에 결합하지 않는 것으로 알려져 있다. 인체성장호르몬 수용체는 순환인체 성장호르몬에 대해 반응하고 인슈린 수용체는 인슈린에 대해 반응한다. 수용체는 세포막의 한 외세포쪽에 분자구형 부위를 갖는데 상기 구형부위는 특히 호르몬(천연 리간드)에 결합되어 있다. 많은 질병이 수용체에 결합된 핵산 리간드로 치유될 수 있다.
인체성장호르몬 수용체(shGHR)의 가용성 구형 영역에 결합된 리간드는 실시예 4의 대상 혼합물을 이용하여 확인하고 정제한다. 다시 말하자면 결합완충제는 무(無) DTT이다. 인체성장호르몬 수용체의 가용성 구형 영역은 상품화되어 있고 또 대학연구소로부터 구입이 가능한데, 재조합 DNA 기술을 총 유전자 정보 코드화 세포막-결합 수용체 단백질에 적용하여 얻는다. SELEX는 리간드가 발견될 때까지 재반복해서 사용된다. 리간드는 크론화되고 배열화된 것이다. 그리고 가용성 수용체를 위한 결합친화성이 측정된다. 대부분의 수용체들은 다른 수용체와 한외세포영역에서 단백질의 확고한 동질성을 보이지 않지만, 특성을 알아내기 위해서 똑같은 리간드를 가지고 다른 가용성 수용체들과의 결합친화성을 측정해 본다. 리간드는 shGHR의 통상적인 결합력의 억제성 측정을 위해 사용되는데, 핵산 리간드의 천연 호르몬 리간드 사이의 비교결합력을 측정하여 정한다.
[실시예 6]
포유동물 호르몬 또는 인자용 핵산 리간드의 유리
포유동물 호르몬 또는 인자는 단백질, 성장호르몬 또는 소분자들[예컨대, 에파인프린(epinephrine), 티로이드(thyroid) 호르몬]인데, 동물의 몸을 돌면서 세포의 세포질막 안에 존재하는 수용체와 결합하여 효과를 나타낸다. 예를 들면, 인체성장호르몬은 첫번째로 인체성장호르몬 수용체와 작용하여 세포성장을 촉진시키는 반면 인슈린은 첫번째로 인슈린 수용체와 작용하여 세포성장을 시킨다. 많은 성장인자들 즉, 과립 백혈구군 촉진인자(GCSF), 특히 어떤 것은 셀-타입을 포함하는 수용체와 함께 표적세포에 작용한다. 그래서, 호르몬과 인자들은 꽤 많은 수용체를 위한 천연 리간드로 된다. 호르몬과 인자들은 통상 핵산에 결합하지 않는 것으로 알려져 있다. 많은 질병이 예를 들면, 갑상선기능항진증, 만성저혈당증은 호르몬이나 인자에 결합된 핵산 리간드로 치유될 수 있다.
인체 인슈린에 결합된 리간드는 실시예 3의 출발물질을 사용하여 확인하고 정제한다. 인체 인슈린은 상품화 되어 있는데, 통상 재조합 DNA 기술로 제조한다. SELEX는 리간드가 발견될 때까지 다시 반복해서 사용된다. 리간드는 크론화되고 배열화된 것이다. 그리고 인체 인슈린을 위한 결합 친화성이 측정된다. 대부분의 호르몬이나 인자들은 인체 인슈린과 단백질의 확고한 동질성을 보이지 않지만, 특성을 알아내기 위해서 똑같은 리간드를 가지고 다른 호르몬들이나 인자들과의 결합친화성을 측정해 준다. 여하튼, 소분류 IGF과(family)나 인슈린-유사 성장인자를 포함해서 꽤 많은 호르몬과 인자의 유전자과(family)가 존재한다. 학샌 리간드는 인체 인슈린 수용체에 대한 인체 인슈린의 통상적인 결합력의 억제성 측정을 위해 사용되는데, 인체 인슈린의 유무에 관계없이 인슈린의 수용체 및 핵산 리간드와 천연 리간드 사이의 결합력을 측정하여 정한다.
[실시예 7]
SELEX용 컬럼모재의 제조
아래 실시예 9에 기재된 방법에 따르면, 폴리펩티드 브라디키닌(polypeptide bradykinin)은 니트로셀루로즈에 의해 보존되지 않는다는 것을 알 수 있다. 표준공정에 의하면 SELEX 공정을 브라디키닌에 적용할 수 있도록 하기 위해서는 단백질은 지지모재로서 활성화 CH 세파로스 4B(Pharmacia LKB)에 부착되어 있어야 한다. 생성 모재는 닌히드린(ninhydrin) 분석에 의해 브리디키닌이 2.0mM이 되는 것으로 측정되었다[Crestfield et al. J. Biol. Chem. Vol. 238, pp. 238, pp. 622∼627(1963); Rosen Arch. Biochem. Biophys. Vol. 67, pp. 10∼15(1957) 참조]. 지지모재에 남아 있는 활성화 그룹은 트리스(Tris)로 차단되었다[Pharmacia, Affinity Chromatography : Prindiples and Methods, Ljungforetagen AB, Uppsala, Sweden(1988) 참조].
스핀-컬럼(Spin-Column) 분리가 대상 혼합물 용액과 구슬형 모재를 접속시키는데 사용되었다. SELEX를 위해 선발된 단계를 수행하는 일반적 공정에 있어서는 50 : 50의 표적 세파로스의 반응 완충제 40㎕를 0.5ml의 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 옮겨 준다. RNA 대상 혼합물이 반응 완충제 60㎕에 가해지고, 이 반응 혼합물은 37℃에서 30분 동안 평형상태가 되도록 놓아둔다. 구멍이 튜브의 바닥에 뚫리고 이 튜브는 더 큰 에펜도르프 튜브 속으로 옮겨져서 양 튜브의 뚜껑에 제거된 상태에서 튜브를 돌려(1000 RPM, 10, 21℃) 무거운 것과 가벼운 것을 분리한다. 그 다음 작은 튜브는 새로운 큰 튜브로 옮겨져서 내용물은 50㎕의 세척 완충제로 4번에 걸쳐 씻겨지는데 충분리 회전방식에 의해 씻는다. 결합을 분석하는데 있어서는, 방사성 RNA가 들어 있는 튜브를 새로운 에펜도르프 튜브에 옮기고 원심분리로 건조시킨다. 벌크(bulk) 결합시험은 30핵산 랜덤화 세그먼트를 함유하는 RNA 대상 혼합물을 브라디키닌 세파로스 모재에 공급하여 수행한다. 회전-컬럼 기술을 사용해서, 여러 가지 모재에 대한 벌크 30N RNA의 결합도가 고농도의 식염농도하에서 측정되는데, 이는 세파로스에 대한 백그라운드 결합을 최소화하는 가장 양호한 상태를 알아내기 위해서이다. 세파로스에 대한 RNA의 백그라운드 결합은 트리스(Tris)로 세파로스에 존재하는 활성그룹을 차단함으로써 최소화할 수 있는데, 결합 완충제로 DEM 100mM와 KOAC 10∼20mM을 사용한다. 이 완충상태에서는, RNA 불규칙 벌크용액의 결합곡선은 벌크 Kd가 약 1.0×10-5이다(제20도 참조). 이 결합곡선은 차단되고, 활성화된 세파로스에 대해서 브라디키닌 세파로스를 희석시켜 측정한다.
[실시예 8]
RNA 특징 구조에서의 강화된 대상 혼합물의 제조
바람직한 구체예를 보면, SELEX에 사용되는 대상 혼합물은 20 내지 50 랜덤화 핵산 사이의 연속된 영역을 갖고 있다. 랜덤화 세그먼트는 선별된 핵산의 증폭을 가능하게 하는 고정배열과 측면하고 있다.
또 다른 구체예에서는, 대상 혼합물이 만들어졌는데, 이는 주어진 핵산 특징을 함유하고 있는 대상 혼합물 중의 핵산 비율을 높이기 위한 것이다. 여기에 2가지의 특정예가 제시되었지만, 이에 따라 본 발명이 그 범위로 제한되는 것은 아니다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자라면, 동일한 목적에 도달할 수 있는 대상 혼합물의 동등물을 만들어 낼 수 있다.
제21도의 배열 A와 같은 특정예를 보면, 대상 혼합물 중 대부분의 핵산이 4와 8 염기쌍 사이의 나선영역 및 20과 21 중 하나의 인접하는 랜덤화 배열의 루우프 형성을 위해 편향을 일으키도록 대상 혼합물이 제조된다. 배열 혼합물의 5'와 3' 양쪽단부는 핵산의 증폭을 위해 필수적인 고정배열을 갖게 된다. 이들 인접한 기능성 고정배열은 랜덤화 영역의 대체 부위에 있는 고정배열을 갖는 염기쌍에 대하여 선택된 고정배열이 된다. 배열의 5'로부터 3' 말단쪽으로 가면 5개의 상이한 영역을 만나게 되는데 이것은 : 1) 증폭용 고정배열; 2) 나선구조 형성용 고정배열; 3) 20 또는 21 랜덤화 핵산 잔류물; 4) 12개의 랜덤화 누클레오티드; 5) 제3영역 누클레오티드를 갖는 나선구조 형성용 고정배열; 6) 12개의 랜덤화 누클레오티드; 및 7) 증폭용 고정배열이다.
바람직한 대상 혼합물에는, 가공 LL선 영역이 대체 GS, CG, GC, CG 염기쌍을 이루기 위해 설계된다. 이 염기쌍 특징은 특히 안정된 나선구조를 보여 준다.
[실시예 9]
핵산과 결합하지 않는다고 알려진 단백질에 대한 랜덤화 RNA 배열의 벌크 결합
본 실시예는 SELEX에 대한 실시예 1의 실험에서와 같이 일반적인 니트로셀루로즈 선별공정에 따라서 수행된다. 일군의 무작위 선택 단백질이 RNA 배열의 벌크 대상 혼합물에 대해 친화성을 갖고 있는지를 알아보기 위해 테스트되었다. 각 실험에 소용되는 대상 혼합물은 40N RNA 용액(40 랜덤화 핵산 세그먼트를 갖는 랜덤화 혼합물)으로 구성되는데 상기 용액은 결합도 측정을 위해 라디오라벨 처리되었다. 대상 혼합물은 결합완충제(KOAC 200mM, TrisoAC 50mM pH 7.7, DTT 10mM)에 희석되고 그 중 30㎕가 60㎕가 될 때까지 가해졌다. 반응은 5분간 37℃ 인큐베이터에서 진행된 후 필터 결합 처리되었다.
시험된 단백질은 아세틸콜린에스테라제(Acetylcholinesterase, MW 230,000); N-아세틸-β-D-글루코사미니다제(N-acdtyl-β-D-Glucosaminidase, MW 180,000); 엑틴(Actin, MW 43,000); 알코올 디하이드로게나제(MW 240,000); 알데히드 디하이드로게나제(MW 200,000); 앙기오텐신(Angiotensin MW 1297); 아스코르바트 옥시다제(Ascorbate Oxidasem, MW 14,000); 아트리알 누트리우레틱 훽타(Atiral Nutriuretic Factor, MW 3,064); 및 봄베신(Bombesin, MW 1621)이다. 단백질은 뵈링거 일겔하임(Boehringer Ingelheim)으로부터 구입한 것이고, 용해하여 완충고성제로 사용되었다.
각 실험에 사용된 RNA 대상혼합물은 라디오라벨이 10,726카운트(counts)이고, 백그라운드 결합은 72카운트이었다. 그 결과가 제9표에 요약되어 있다. 시험된 단백질 중 아세틸콜린 에스테라제, N-아세틸-β-D-글루코사미니다제와 악틴을 제외한 모든 단백질은 어느 정도 벌크 RNA 친화성을 보여준다. N-아세틸-β-D-글루코사미니다제는 구입시의 용액 농도가 낮아서 결과가 확실치 못하다. 또한, 만일 실험된 단백질 중 어느 것도 니트로셀루로즈에 결합하지 않는다면-브리다키닌-케이스- 이 실험에서 친화성은 검출되지 않을 것이다. 위의 실시예 7에 언급된 컬럼에 의해 뒷받침되는 브라디키닌은 이 실험중 벌크 결합이 일어나는 것이 확인되지 않았다 하더라도 벌크 결합이 주어진 단백질안에 존재하지 않는다고는 할 수 없다.
[실시예 10]
신경성장인자를 위한 RNA 리간드 용액의 유리
신경성장인자(NGF)는 표적 세포의 외벽표면에서 수용체를 통해 반응한다. 앤타고니스트(Antagohists)는 성장인자를 향해 그리고 다른 호르몬들은 수용체를 차단하거나 인자 혹은 호르몬을 적정(titrating)하는 것에 의해 반응할 수 있다. RNA는 SELEX 방법에 의해 NGF에 직접 결합하고 있는 것으로 나타났다.
출발 RNA는 정확하게 HSV DNA 중합효소 경우에서처럼 제조되었다(실시예 11).
2가지 별개의 실험이 NGF를 사용하여 실시되었다. 첫번째는 저염(low salt) 결합완충제를 사용하여 37℃에서 3분간 배양하는 10라운드 SELEX이며, 이어 여과하여 SELEX 중에 완충제로 세정한다. 저염결합완충제는 50mM NaCl 플러스 50mM 트리스-에세테이트 pF 7.5를 사용하여, 여과후 50mM Tris-acetate pH 7.5로 세정한다; 이 SELEX. 실험은 단지 7라운드만 했다.
저염실험에서는 36크론화 배열을 얻었다. 15개 크론들은 거의 동일했다-#2, 3, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 19, 22, 28, 33 및 34는 동일했다. 반면 #15와 25는 하나의 차이를 갖는다 :
두번째 부유한 배열(6번 발견됨)은 :
CCUCAGAGCGCAAGAGUCGAACGAAUACAG(#12, 20, 27 및 31)이었다.
고염(high salt) SELEX 롭터 10개의 크론들이 배열되었으나, 저염실험에서는 그들 중 8개만이 동일하며, 부유한(그러나 소수인) 제2 클래스와 명백히 관련된다. 주도저인 배열은 :
……CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA……
두 실험들 사이에 총 14개의 상이한 배열이 얻어졌다(하나의 차이를 갖는 배열이 이 분석에서 함께 취급된다); 그것들이 여기서 위에 표기된 유사성과 밑줄 그어진 빈도수로 표시되어 있다. nef.a에서 vgf.k까지 저염 실험으로 얻은 것이며, hsngh.a에서 hsng.c까지 고염실험의 것이다 :
유사한 배열내에 아무런 분명한 2차구조도 포함되어 있진 않지만, 주도적인 배열은 임계의 누클레오티드를 NGF 결합부위에 의해 잘 맞는 구조에 두게 되는 것 같다.
핵산 hsng.a의 NGF에 결합하는 분석이 시행되고, 이 핵산은 대부분의 30N 대상혼합물보다 큰 약 20 내지 30겹의 Kd를 갖는 다는 것이 발견되었다. 동일한 핵산이 또한 30N 대상혼합물보다 R17 외피단백질과 tPA에 더 낮거나 동일한 정도의 친화성을 갖는다는 것이 발견되었다.
[실시예 11]
HSV-1 DNA 폴리머라제에 대한 핵산 리간드의 단리
헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV-1)는 포유류의 DNA 포함 바이러스이다. 많은 DNA 포함 바이러스와 마찬가지로 HSV-1은 자신의 DNA 폴리머라제를 암호화한다. HSV-1 DNA 폴리 머라제라는 두가지의 형태로 정제되었으며, 상이한 성질을 가지나 각각은 시험관내에서 DNA 복제를 촉진시킨다. 하나의 폴리펩티드인 단순한 형태가 헤르난데즈, 티. 알.(Hernandez, T. R.)과 레만, 아이. 알.(Lehman, I. R.), (J. Biol, Chem., 265, 11227-11232, 1990)에 따르 클론화 유전자를 나타내는 세포들로부터 정제된다. 헤테로디머(heterodimer)인 DNA 폴리머라제의 제2 형태는 크루트, 제이. 제이.(Crute, J. J.)와 레만, 아이. 알.(Lehman, I.R.),(J. Biol, Chem., 264, 19266-19270, 1989)에 따라 HSV-1 감염세포로부터 정제되며, 헤테로디머는 폴리머라제 그 자체와 HSV-1로 암호화된 다른 폴리머라제, UL42에 대응하는 하나의 펩티드를 포함한다.
SELEX는 단일 폴리펩티드와 헤테로디머 양쪽에 모두 시행된다. 각 경우의 결합 완충제는 50mM 아세트산 칼륨과 50mM 트리스 아세테이트, pH 7.5 및 1mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)이었다. 결합된 RNA를 분리하기 위한 여과는 37℃에서 4분간 배양한 후 행해졌다; 필터들은 디티오트레이톨을 뺀 결합 완충제로 세척되었다.
RNA 대상혼합물은 앞서 설명한 바와 같이 DNA로부터 복사되었다. 다른 실험들의 경우에서와 같이, DNA 배열은 RNA가 표준기술에 따라 합성되게 하는 박테리오파이지 T7 RNA 폴리머라제 촉진제 배열을 포함한다. SELEX의 증폭부분동안 cDNA 합성은 그 배열의 DNA에 의해 프라임된다 : cDNA 프라이머(PCR 프라이머 1) : 5'GCCGGATCCGGGCCTCATGTGAA3'
SELEX 사이클의 그 부분에서 cDNA를 증폭하는데 사용되는 DNA 프라이머들은, 그 중 하나인 T7 촉진제를 포함하는데, 그 PCR 프라이머는 다음의 배열을 포함한다 :
5PCR 프라이머 2 : 5' CCGAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA 3'
최초의 랜덤화 DNA는 T7 촉진제를 갖는 배열, 30랜덤화 위치들 및 PCR 프라이머 1에 상보성인 고정 배열을 포함한다. SELEX의 제1싸이클을 시작하는데 사용되는 RNA는 따라서 다음의 배열을 갖는다 :
pppGGGAGCUCAGAAUAAACGCUCAA-30N-UUCGACAUGAGGCCCGGAUCCGGC
SELEX는 7라운드 동안 시행되었고, 그 후 cDNA는 앞서 기술한 바와 같이 제조되고 클론화되었다. H로 표시되는 일련의 배열들이 표적으로써 단순한 HSV 폴리머라제를 사용하여 얻어졌으며, 반면 U 시리즈는 UL42 폴리펩티드를 포함하는 헤테로디머 폴리머라제를 사용하여 얻어졌다.
H 시리즈로부터 배열의 약 25%가 랜덤화 영역의 5' 단부에 12누클레오티드들의 정확한 배열을 포함한다. (상부문자들은 랜덤화 영역과 관련된 것이다.) 어떤 배열에서, 고정된 프라이머들 사이의 길이는 정확히 30누클레오티드가 아니었다. 그리고 한 경우(H2)에서 대규모 삭제가 랜덤화 영역내에서 발견되었다. 이 H 부분집합의 원소들은 다음과 같다.
U 시리즈의 두 원소는 이 기본적인 배열 특징을 공유한다 :
H와 U 시리즈로부터의 남은 배열은 아무런 명백한 공동배열을 나타나지 않았는데, 또한 어느 시리즈에서도 7라운드의 배열은 단일 주종 배열로서 이것은 HSV DNA 폴리머라제를 억제하는 최적의 리간드 군을 발견하는데는 좀더 많은 회수의 SELEX가 필요하다는 것을 의미한다.
1차 배열 …cgcucaaUAAGGAGGCCAC…이 길항물질류의 대상이 될 수도 있으나 그 시리즈들의 멤버들은 아직 DNA 합성의 억제제로서 시험되어 왔다. UAAGGAGGCCAC에 대한 바로 5'에 고정된 배열이 이 부분집합의 출현에 참여하거나 공유된 12누클레오티드가 랜덤화 영역내에서 다양하게 위치하는 것으로 보인다.
[실시예 12]
E. coli 리보솜 S1에 대한 핵산 리간드의 유리
E. coli 30S 리보솜 단백질 S1은 21 30S 단백질중 가장 큰 것이다. 이 단백질은 폴리피리미딘들에 대한 고친화성에 기초하여 정제되었다. 그리고 피리미딘이 풍부한 단일 사슬의 폴리누클레오티드에 다소 밀착되어 결합된다고 생각된다. SELEX에 의해 리간드 용액으로 확인된 RNA가 피리미딘들에 풍부한 단순한 단일 사슬의 RNA보다 어떤 면에서든 정보가 풍부한 것이 아닌가 하는 의문이 제기되었다.
RNA들, DNA들, cDNA 프라이머(PCR 프라이머 1) 및 PCR 프라이머 2는 HSV-1 DNA 폴리머라제(실시예 11 참조)에 사용된 것들과 동일했다. 결합완충제는 100mM 염화암모늄과 10mM 염화마그네슘과 2mM 디티오트래이톨 및 10mM 트리스 클로라이, pH 7.5를 포함했다. 결합은 실온에서 행해졌으며, 복합체들은 니트로셀룰로스 여과에 의해 다시 한번 분리되었다. 단백질은 아이. 보니(I. Boni) 등 (European J. Biochem., 121,371, 1982)에 따라 정제되었다.
13 SELEX 라운드후에 25 배열들의 집합이 얻어졌다. 이 배열들의 20 이상이 수우도놋트를 포함했으며, 그 수우도놋트들은 공통적인 원소들을 포함한다.
수우도놋트들의 일반적인 구조가 다음과 같이 도식화될 수 있다.
스템 1a-루우트 1-스텝 2a-스템 1b-루우트 2-스텝 2b(제31도 참조)
대부분의 S1 단백질 리간드들은 다음을 포함한다 :
4에서 5의 염기쌍들의 스텝 1에서 5'에 G를 갖는 것.
직접 스텝 1에 겹쳐진 6 내지 7의 염기쌍들의 스텝 2
때때로 GGAAC로 끝나는 5 내지 7의 누클레오티등의 루우트 2
이 데이타들의 합리적인 해석은 루우프 2가 스템1을 가로질러 펼쳐져서 단백질 S1의 활동적인 위치에 단일 사술의 결합을 단수화하여 강화하는 형태로 그 루우프를 단단히 고정하게 된다는 것이다. 2차원에서의 콘센서스 수우도놋트의 그림은 다음과 같아 보일 것이다.
그러한 그림에서 염기쌍들은 선과 점선들로 도시되며, 렌덤화 영역으로부터 염기들의 선택들이 상부분자로 표기되며, Y는 피리미딘, R은 퓨린, N-N'는 임의의 염기쌍, N은 임의의 투클레오티드를 의미한다. 하부문자들은 PCR 증폭에 사용된 고정된 배열을 나타낸다.
단일사슬 폴리누클레오티드 결합 단백질고 단백질내의 영역들은 SELEX중에 때때로 그 부위와의 반응을 극대화하는 법으로 단백질의 결합위치에 루우트 2라고 하는 확장된 단단한 단일사술을 나타내는 수우도놋트를 선택하는 것으로 보인다. 따라서 HIV-1 RT 수우도놋트가 나타났을 때는, 단일 사술의 영역 루우트 2가, 복제중에 주형사술을 유지하는 RT 지역내에 결합되어 있다고 생각하는 것이 합리적이다. 즉, 대부분의 복제 효소(DNA 폴리머라제, RNA폴리머라제, RNA 복제효소, 가역전자효소)이 SELEX로부터의 선택 리간드로서 수우도놋트를 신호할 주형사술을 유지하기 위한 영역을 가지는 것이 합리적인 것으로 보인다.
HIV-1 rev 회전단백질에 대한 헥산 리간드의 유리
HIV-1 rev 단백질의 RNA-인식부위는 복잡해 보이며, 그기능은 전염성의 바이러스 질병의 다산적인 감염에 필수적이다. [울센(Olsen)등, Science, Vol. 247, pp. 845∼848(1880) 참조.] 이 단백직에 한 SELEX 과정은 인식요소에 대해 더 ㅁ반ㅎ은 것을 배우고 표적단백질에 대한 리간드를 분리하기 위해 수행되었다.
대상 혼합물은 위의 실시예 2에서 설명된 바와 같이 32 누클레오티드 긴 렌덤 영역으로 만들어졌다. rev단백질은 출발대상혼합물을 니트로셀룰로즈 검정들에 의해 결정된 것과 같이 약 1×10(-7)M에서 일어나는 반최대의 결합에 포화상태로 결합할 수 있음이 발견되었다. 모든 RNA-단백질 결합반응들이 200mM KOAC, 20mM Tris-HCl pH 7.7, 10mM 디티오트레이톨의 결합 온충제에서 수행되었다. RNA와 단백질 희석액을 혼합하여 30분간 얼음에 저장한 후 37℃로 5분간 이전되었다. (결합 검정에서 반응체적은 60㎕이며, 그 중 50㎕이 분석되었다; SELEX 라운드에서 반응체적은 100㎕이다.) 각 반응은(결합완충제로) 미리 적셔둔 리트로셀룰로즈 필터를 통해 빨아들이고 결합완충제의 3ml로 세정한 후 건조시켜서 분석치들을 셈하거나 SELEX 실험계획의 일부로서 용출시킨다. 약 3×10(-7)M의 RNA농도를 사용하여 SELEX의 10라운를 수행했다. rev 단백질의 농도는 첫 라운드에 1×10(-7)이었고, 모든 위의 라운드에선 2.5×10(-8)이었다. 최초의 대상 혼합물이 니트로셀룰로즈 필터로 다 지나가서 니트로셀룰로즈에 고 친화성을 가진 배열들의 수가 감소되었다. 이 과정을 3, 6 및 9라운드 후에 반복하였다. SELEX의 반복되는 라운드에서 통상적을 일어날 비정상 크기의 종들을 피하기 위해 매 3라운드의 선별 후에 cDNA 산출물을 정제하였다. 10라운드 후에 RNA 모집단의 다양한 영역의 배열은 디데옥시 -연쇄( dideoxy-chain) 종말 배열화에 의해 결정되듯이 무작위적이 아니었다. 53 분리체들이 클론화되어 배열되었다.
클론화된 배열들의 각각이 표 10에 표시되어 있다. 모든 배열들이 쥬커(Zucker) RNA 2차구조 예측 프로그램에 의해 분석되었다. [Zucker, Science, vol. 244. pp. 48∼52(1988); Jaeger 등, Proc. Nat1. Acad. Sci, USA, vol. 86. pp. 7706∼7710(1989) 참조.] 공통적인 2차구조의 기초에서 모든 배열들이 표 2에 표시된 바와 같이 3개의 공통적인 특징으로 구분되었다. 특징 1과 2는 나선으로 각 단부에 서 닫힌 돌기된 루루프를 포함하는 형상에서는 유사하다. 이러한 일반화된 구조가 표 12에 체계적으로 표시되어 있다. 그리고 영역들이 논의하기 쉽게 분류되었다; 그것은 5'로부터 3' 스텝 1a(3' 스텝 1b에 대한 염기쌍). 루우프 1, 스텝 2a, 루우프 3, 스텝 2b, 루우프 2 및 스텝 1b까지이다. 다양한 영역들에 적합한 배열들이 표 12의 각각의 배열에 대하여 표시되어 있다. (배열(3a)에서 상동성 배치가 180도 움직여서 루우프로 둘러쌓이는 것은 스텝 1이라는 것에 유의할 것) RNA분자의 겸을 이루는 에너지(고정된 측면배열을 포함하여)는 표 13에 표시되어 있다.
rev가 HIV-1 전사체에 결합하는데 적어도 최소한으로 관련되도록 결정된 와일드형의 rev 반응성분(rev responsive element, RRE)이 또한 이 프로글매에 의해 겹쳐지며, 표 12와 13에 포함된다.
이 배열들은 또한 해르츠 등(Comput. Appl. Bisci, vol.6, pp. 81∼92,1990)에 의해 설명된 방법에 기초하여 관련된 하부배열에 대하여 조사되었다. 두 개의 중요한 패턴이 확인되었다. 각각의분리체가 패턴들에 가장 잘 어울리는 것으로 확이노디었으며, 그 결과를 표13에서 볼 수 있다. 관련된 하부배열의 특징을 유사한 형태에서 공통적인 2차구조들로 표시된다; 즉, 제1배열 UUCAGAUACA는 제2의 정보 부유한 배열 UGGACUC(통상 루우프 3)의 5' 단부에서 UG와 쌍을 이루는 루우프 1 더하기 3' 말단 CA로서 통상 발견된다. 또한 배열 Ⅱ의 CUC에 대한 배열 Ⅰ의 GAG의 염기쌍의 강한 예측도 있다. 특징 Ⅱ는 하부배열 GAUACAG가 CA의 UGㅔ 대한 유사한 짝짓기로 CUGGACAC 반대편의 류유프로서 우세하더는 점에서 특징 Ⅰ과 유사하다. 특징 Ⅱ는 루우트의 사이즈와 특히 루우프를 가로지르는 예상된 염기쌍 현상이 없는 일부 배열이란 점에서 상이하다. 와일드 형태의 RRE의 한 영역는 특징 Ⅱ와 매우 유사하다. 특징 Ⅳ는 특징 Ⅰ에서와 같이 염기쌍을 이룬 GA-UC에 인접한 두개의 벌어진 U들로 특정되지만 적어도 모든 다른 배열들과 유사하지 않다. 불행히도 더 상세한 비교는 특징 Ⅳ 접힘 패턴이 임계 2차구조에서 3'고정 배열 영역을 포함하기 때문에 복잡해진다. 이 배열들이 불변이므로 그들중 어느 하나의 중요성을 분석할 방법이 없기 대문이다. 각 특징의 대표적인 것들의 중첩배열이 와일드형의 RRE의 중첩배열과 함께 제23도에 표시되어 있다.
배열들은 rev 단백질에 대한 친화성에 대해 더 분석된다. 주형들은 다수의 크론들로부터 RCR되는데, 라벨된 시험관애의 전사체글이 상기 크론들로부터 준비되며 각기 rev 단백질을 결합하는 능력을 위해 검정된다. 이 결합곡선을 제24도 내지 제28도에 도시하였다. 올리고누클레오티드 주형들로부터 라벨된 전사체들도 또한 합성되며 위에서 설명된 와일드형태의 RRE를 포함하는데, 고도의 안정된 형상의 통일적인 특징으로서 추정되는 것이다. 실험적 변동사항을 조절하기 위해서, 가장 우수한 결합 배열, 분리체(6a)는 모든 결합실럼에서 표준으로 검정된다. RNA-단백질 혼합물은 희석된 RNA들이 1분간 90도로 가열되고 혼합전 얼음으로 냉각시키는 것 외엔 위에서 설명한 바와 같이 취급된다. 분리체(6a)에 대한 평균 Ka는 8.5×10(-8)M이며, 이 실험의 결과를 표13에 표시되었다.
제24도의 결합곡선은 전개된 모집단(P)이 출발대상혼합물에 상대적인 rev 단백질에 대한 결합에 있어서, 약 30배를 증전시켰음을 보여준다. 와일드 형태의 RRE의 결합은 가장 풍부한 클론(1C)의 결합을 매우 닮아 있다. 이 실험은 또한 rev 결합 반응이 2차구조에 얼마나 민감한가를 나타낸다. 분리체(6a, 6b)는 높은 정보내용의 지역에선 동일하지만, 3개의 누클레오티드 위치에서 변하는 2차구조의 수준에선 아주 상이하다. 스템 1의 염기쌍 구인상을 예측하는 이 변화들은 6b의 친화성을 24배만큼 맞춘다. 2차구조 변태들에 대한 민감성은 제25도에 도시된 바와 같이 분리체(17)의 결합으로 더 상세히 설명되어 있다. 분리체 17은 표12에 표시된 바와 같이 최대의 정보 스코어를 가지고 있다. 그러나 표 11에 표시딘 바와 같이 루우프 1의 5'단부에 별도의 분기된 U가 있다. 이 별도의 U는 특징 Ⅰ의 다른 배열들에 비교하여 rev에 대한 분리체(17)의 친화성이 감소되는 결과를 낳는다. 대조적으로, 루우프 2배열의 단일 누클레오티드의 삭제는, 교차분기 염기쌍 현상의 가능성을 감소시키는 것을 조차 rev 반응을 잘 견디어낸다.
또 다른 지배적인 공통점은 CA가 UG와 쌍을 이루어 스템 2를 시작하는 UGC 반대편의 배열 ACA의 보존이다. 이 배열은 와일드 형태의 RRE는 물론 특징 Ⅰ과 Ⅱ에 의해서 공유된다. 배열 11 및 12는 이 위치(표12 참조)에서 염기쌍 치환을 나타내며, 배열(12)은 시험되었ㄱ도 나먼지 특징 Ⅰ 배열의 대부붐과 비교하여 친화성이 감소되었다.
SELEX에 의해 rev 리간드로 결정된 RNA 배ㄹㄹ들은 1차 및 2차구조로 분류될 수 있다. 통일성은 독특한 형상을 하고 있고 단일 및 이중사슬 누클레오티드를 보존하는 2개의 나선과 측면하는 비대칭 돌기로서 나타난다. 돌기를 가로지르는 염기상 현상이 많은 분리된 배렬들(특징 Ⅰ)을 예측하지만 그것이 rev 상호작용에 대해 중요하거나 결정적인 것은 아니다. 루우프 1에 대한 최적 크기는 8(특징 Ⅰ) 또는 (특징 Ⅱ)로 타나나며 9나 3의 크기에는 불리한 점이 관측된다. 루우프 3의 최적크기는 5와 4이다. 또한, 이들 리간드들의 다양한 영역들과의 rev 상호작용은 부가적일 수 있다. 특징 Ⅱ는 스템 2에서 루우프 1과 3의 접합점에서 기본적으로 특징 Ⅰ과 유사하다. 특징 Ⅲ은 스템 1에서 루우프 1과 3의 접합점에서 특징 Ⅰ과 유사하다. HIV-rev에 대한 특징 Ⅰ과 Ⅱ의 헥산용액의 동일된 다이어그램이 제29도 및 제30도에 도시되어 있다.
클론화된 모집단에서 배열의 풍부함은 rev 단백질에 대한 친화성과는 엄격히 관련되어 있지는 않다. SELEX과정을 통해 사용된 rev 단백질의 농도가 모든 이러한 분리체들의 유효 퍼센티지를 결합하는데 충분했었다는 것이 가능하다. 결과로서, rev에 대한 결합에 대한 엄격성이 낮은 선택에 부가된 PCR 동안 cDNA 및 DNA의 복제가능성에 대한 선택이 있을 수도 있다. 이 리간드들의 고도의 구조적 성질과 이 주형들에 대한 cDNA 합성의 효율에서의 가능한 차이들이 이와 같은 잠재적인 복제경향을 강화한다. 또한 SELEX 과정중에 어떤 돌연변이가 발생할 수 있다. 배열 6a는 6b와 유사하므로 공통적인 원조를 가져야 한다. SELEX의 라운드종의 이러한 상대적으로 늦은 도달은 목표에 대한 그 더 높은 친화성에 무관한 이러한 배열의 부족을 설명한다. 같은 방법으로, 나타난 어떤 리간드들은 최초의 대상혼합물에서는 나타나나 크론된 모집단에서는 나타나지 않는 원조배열들로부터 선택되는 동안 상대적으로 늦게 변화되었을 수도 있다.
여기에 개시된 발명은 여기에 개시된 실시예의 범위에 한정되지 않는다. 개시된 바와 같이 본 발명은 당해분야의 통상적인 기술을 가진 자들에 의해 많은 헥산 리간드와 표적에 적용될 수 있다. 각개의 경우에 여기에 설명된 것들을 적용함 있어 적절한 수정, 변경 및 편법들이 당해 분야의 기술자들에 의해 여기에서 개시되고 청구범위로 작성된 발명의 범위내에서 채용되고 이해될 수 있다.
고정된 영역의 누클레오티드는 낮은 경우의 문자로서 표시된다.
주커(Zuker) 프로그램에 의하여 예견된 2차구조는 2중 화살표로 교신된다.
배열 Ⅰ = UUGAGAUACA
배열 Ⅱ = UGGACUC
선택, 잘 혼합된 용액내의 가역적인 단백질 -RNA 복합체 형성에 대한 단순한 운동학적 메카니즘은 다음과 같이 표현된다 :
여기서 [Pf]는 유리 단백질 농도이며, [RNAFi]는 유리 RNA 중 i의 농도이고, [P : RNAi]는 단백질-RNA중 i의 복합체 농도이고, k+i는 단백질 -RNA종 i의 복합체의 분해 상수비이고, n은 독특한 한조의 상수비를 갖는 RNA 배열번호이다.
복수결합위치나 협동성을 포함하는 또 다른 메카니즘은 이와 같은 단순한 도식의 적절한 확장을 가진 연속적 처리로 간주될 수 있다.
상기와 같은 도식으로 표현되는 어떠한 체계에 대해서, 시간의 함수로서 각 단백질-RNA종 i의 복합체의 농도변화를 기술하는 기본 화학-동력학적 또는 질량-작용 방정식들은
여기서 [Pf], [RNAFi] 및 [P : RAFi]는 유리 단백질, 유리 RNA종 i 및 단백질-RNA종 i의 복합체의 시간 1에서의 농도이다.
유리 단백질 농도는 전체 단백질농도의 모든 단백질-RNA 복합체의 차([P]-Σ[P : RNAK])이다; 마찬가지로, 유리 RNA종 i의 농도는 전 RNA종 i의 복합체 농도의 차([RNAi]-[P : RNAi]) diek : 부록
이 운동방정식들은 운동학적 또는 평형분석 어느 쪽에도 사용될 수 있다. 연속적인 미분형태는 각 과정의 평균율이 그 과정에서의 변화에 비해 상대적으로 클 때는 언제나 타당하며, 다른 말로 하면 식(3)은 상수비율등의 각 독특한 한조를 표시하는 여러 분자들을 가진 RNA 풀의 표현에 대해서 정확하다. 가자 잘 결합하는 RNA의 한 분자나 소수의 분자만이 있을 때는 언제나 가장 잘 결합하는 RNA를 회복할 높은 확률을 주는 조건을 결정하기 위해 결합의 통계적 표현이 사용된다. 이 통계적 공식들은 성공확률에 대해선 다음 장에서 유도될 것이다.
평형상태에서 각 단백질-RNA종 i의 복합체의 농도변화는 영이다 :
사용된 기호들은 식(3)에서 정의된 것과 같으며, kdi는 단백질-RNA종 i의 복합체에 대한 평형 분해 상수이다. (kdi=k-i/k+i).
단지 하나의 RNA 종만을 고려할 때(즉, n=1), 단백질-RNA의 평형농도에 대한 해석적인 해는 다음의 2차 방정식을 푸는 것으로 가능하다.
이 방정식은 두개의 실근을 가지며, 물리적으로 실현가능한 하나는
물론 마이클리스-벤텐 공식에서의근사법과 같은 복합체의 평형상태나 준정상상태농도에 대한 수많은 고전적인 근사법들이 있으나, 어느 것도 SELEX에 사용된 전 RNA와 단백질 농도의범위에 대한 충분한 정도의 정확성을 주진 못한다. (고전 근사법법의 함정과 한계에 대한 논의는 사바고 1991; 스트라우스와 골드수타인 1943; 웹 1963 참조) 단백질에 하나의 결합위치만을 가진 단일 RNA종의 단순 가역결합에 대한 2차 방정식의 해석적인해가 SELEX에 사용된 모든 RNA 및 단백질 농도에 대해서 정확하지만, 또 두개의 경쟁하는 종들의 결합농도가 3차 방정식의 해석적 해로써 계산될 수 있지만, 3개 이상의 경쟁하는 그종들을 고려할 때는 언제나 단백질-RNA 복합체의 평형농도들을 계산하기 위해서 반복적인 수치해석법이 요구된다.
어떤 전 단백질 농도, [P], 어떤 RNA종 i의 농도, [RNAi]의 분포 및 어떤 평형분해상수들, kdi의 분포가 주어지면, 각각의 단백질-RNA종 i 복합체의 평형농도, [P : RNAi]를 구하기 위한 컴퓨터프로그램을 개발했다. 뉴튼의 방법(예턴대 론베르거, 1973) 프레스 등, 1988 참조)에 의한 식(4)의 음의 해에- 대한 자코비안 행렬(예컨대 론베르거 1973 참조)은 다음 공식을 사용하여 계산된다.
여기서 aij는 자코비안 행렬의 i행 j열의 성분이며, δij=1 이며 i≠j에 대해 δij=0이다.
때때로 뉴튼의 방법의 성공여부는 해의 적절한 초기추정치에 의존하여(예를 들면 론베르거, 1973; 프레스 등, 1988 참조). 이 경우 각 단백질-RNA종 i 복합체의 평형농도, [RNAi]이다. 전 RNA 풀에 대한 용적 kd를 사용하면, 모든 단백질-RNA 복합체에서 단백질 농도는 다음과 같이 측정될 수 있다 :
여기서 [P : RNA]는 모든 단백질 -RNA 복합체의 농도이며, [RNA]는 전 [RNA] 풀의농도, kd는 전 RNA풀에 대한 용적 평행 분해 상수로써 다음의 공식을 사용하여 계산된다.
여기서 [RNA][P]/2는 단백질의 절반과 RiO=[RNAi]/[RNA]를 결합하는 전 RNA 농도이다.
복합체에서의 단백질 농도에 대ㅎ나 이 추정치를 가지고, 각각의 단백질-RNA종 i 복합체의 농도에 대한 초기 근사치를 다음의 공식을 사용하여 얻을 수 있다.
식(4)를 만족시키는 [P : RNAi]의 같에 대한 해들은 식(7)을 사용하는 뉴튼의 방법의 반복적용으로 높은 정도의 정확성으로 정확도를 높일 수 있다. 이러한 수법으로 네번 또는 다섯번의 뉴트의 방법을 반복하여 유효자릿수가 12보다 많은 해들을 얻는다.
이와 같이이 정확한 해에 대한 급속한 수렴은 처음부터 통상 하나이상의 유효자릿수를 주는 식(10)에서의 초기근사치-평행분해상수의 범위와 각 RNA종의 풍부함에 의존하는-때문이다. 이러한 정확도에 대한 하나의 이유는 [P]-[P : RNA]가 kdi보다 클때, 예컨대, [RNA]가 kdi보다 작거나kdi가 kd보다 작을때 [P : RNA]에서의 오차가 식(10)에서 상쇄되기 때문이다. 흥미있는 것은, 이것이 용적 RNA 풀보ㄷ 좋은 결합을 갖는 어떠한 단백질-RNA종 i복합체에 대해 정확성이 높아지게 된다는 것을 의미한다는 것이다. 풍부한 계산들의 초기 정확도의 대표적인 에를-각 회수에서 가장 잘 결합하는 RNA종들은 구성된 전 RNA 폴의부분들의 증가로써 정의되며, 식(10)을 식(20)에 대입하여 근사치가 구해진다-제시된 전체적인 정확성은 식(10)을 사용하여 모든 단백질-RNA종 i의 복합체에 대해 계산된 평형농도의 정확성을 반영한다. 다음 절에서 극대의 풍부함에 대한 최적 RNA와 단백질 농도를 계산하는 이러한 정확성에 대해 평가할 것이다.
분리, 헥산배열이 상이한 종들을 분해하는 어떠한 방법도-필터결합(투어크와 골드, 1990), 겔-유동성 전이(블랙웰과 와인트라움, 1990), 친화도 크로마토그래피(엘링톤과 쏘스탁, 1990; 그린 등, 1990; 울리판트와 스트릴, 1987), 항체침전, 상분배 또는 핵벽개로부터의 방어(로버트슨과 조이스, 1990)를 포함하는 -SELEX와 함께 사용할 수 있다. 예컨대 필터결합을 사용하면 대부분의 단백질 -RNA 복합체들을 니트로 셀룰로우스 필터에 접착되는데 반해 대부분의 유리 RNA 분자들은 통과해 나간다. (올렌백 등, 1983; 야루스와 베르크, 1967; 야루스와 베르그, 1970). 필터에 접착된 후 필터로부터 획복될 수 있는 단백질-RNA 복합체의 실제부분은 다음 절에서 취급한다.
유리 RNA 분자들의 일부도 특정할 수 없는 이류로 필터에 정착되므로 필터에 채집된 각 RNA종 i의 전체량은 다음 공식을 사용하여 계산되는데; 이것이 단백질-RNA복합체에서의 가장 잘 결합되는 RNA 분자들롭주터의 원하는 신호와 단백질-RNA 복합체에서 경쟁하는 RNA 분자들과 특정할 수 없는 이류로 채집딘 유리 RNA 분자들로부터의 잡음을 설명한다.
여기서 RNAfilt는 채집된 RNA종 i의 분자수이며, Vol은 필터를 통과한 반응혼합물의 체적이고, [P : RNAi]는 앞절에서 기술된 바오 같이 계산된 단백질-RNA종 i 복합체의 평형농도이며, BG는 특정할 수 없는 이유로 채집된 자유 RNA의 부분이고, [RNAi]는 전 RNA종 i의 농도이다. 어떠한 분리방법도 통상적으로 결합 및 비결합 리간드의 완벽한 분리보다 적은 유리를 제공하므로, 따라서 각 칫수에서 결합리관를 가진 이유로 채집된 유리 리간드의 부분을 측정해야 한다.
이미 설명한 바와 같이, 용액 내의 모든 단백질-RNA 복합체가 필터에 채집되지는 않는다. 더우기 강하게 결합된 복합체 내의 RNA는 약하게 결합된 복합체내의 RNAㅂ다 피러ㅌ에 더 잘 포획될 수도 있다. 이것이 사실이라면, 강하게 결합하는 RNA 분자의 풍부함은 SELEX의 각 회에서 더 강화되게 될 것이다. 반면, 어떤 분자들이 다른 것들은 물론 필터로부터 용출될 수 없다면 그것들의 풍부함은 감소될 것이다.
확대 및 재규격화, 필터로부터 회복되는 각 RNA종 i의 양은 다음 공식을 사용하여 계산된다 :
여기서 FR은 필터로부터 회복될 수 있는 RNA의 부분이며, RNAfilt는 식(11)로 계산된 필터에 채집된 RNA 종 i의 분자수이다. 이 계산에서 FR의 값은 일정한 것으로 간주되며 필터에 접착되는 단백질 -RNA 복합체의 부분과 PCR에 대해 cDNA를 만드는 가역전사 효소에 의해 회복되어 복사될 수 있는 그러한 복합체들 내의 RNA 부분에 의해 결정된다. FR이 모든 종에 대해 일정하다고 가정하는 것은 합리적인 출발저민데, 왜냐면 충분한 시간이 주어지면, 모든 분자들이 PCR에 대한 동일한 프라이머 위치들을 가지고, 과도의 프라이머 분자가 사용될때, 각 종들은-드물든 풍부하든-종국적으로 프라이머 분자와 풀리게 되는 같은 확률을 갖기 때문이다. 또한 각 RNA 분자는 같은 길이를 가지므로, 크기에 다른 확대 미분율이 없다. 물론 어떠한 RNA 종들도 cDNA 합성에 대한 프라이머 풀림과 간섭하는 제2의 구조를 갖는다. 또한 대응하는 cDNA의 제1의 또는 제2의 구조가 PCR확대 동안 DNA 중합효소 비율을 적어지게 한다면, 그 종들의 풍부함은 감소된다. 실제로 어느 구조가 차이를 내는지 예측할 뛰어난 규칙이 없기 때문에, 이 효과들을 결합할 수 없다. 이 구조들에 대해 더 많은 것을 알게 될 때, 어떠한 유효한 효과들도 SELEX의 수학적 표현에 추가될 수 있다.
필터로부터 회복된 RNA의 전량은 채취되어 PCR 확대에 대한 cDNA 전사를 만드는 각 종들의 분자들의 수의함으로 계산된다 :
어떠한 운반체나 불특정 경합체 분자로 식(13)에서 전체로부터 배제되어야 하는데, PCR 브라이머 위치없이는 이 분자들이 확대되지 않기 때문이다. 친호도 측정 조례들은 종종 이러한 불특정 경합체 RNA 분자들을 포함하는데, 만일 그러한 분자들도 SELEX에 사용된다면, 명백히 그것들은 확대될 수 없을 것이다. 흥미있는 것은 불특정 경합체 분자들의 주요결고는 선택갖능한 특정위치들의 수의 감소이다. 따라서, 확대가능한 리간드 분자들의 원하는 양을 주어진 고농도의 불특정 경합체 분자들과 결합하는 단백질 농도를 결정하기 위해서, 교정된 결합곡선들이 각 적정(titratica)에서 이 분자들이 적절한 농도를 포함함으로써 발생되어야 한다. SELEX의 각 회에서 고농도의 불특정, 확대가능하지 않은 경합ㅈ체 분자들을 사용하는 잇점은 실험용기(labware)에서 임의의 경합체 분자들을 사용하는 잇점은 실험용기(labware)에서 임의의 블특정 위치들에 대한 증폭가능한 리간드 분자들의 흡수감소와 표적 단백질에서 임의의 블특정 위치들에 대한 증폭가능한 리간드 분자들의 결합감소 또는 잘못 분배된 위치에서 불특정 이유로 채집된 자유 증폭가능한 분자들의 부분의 감소이다.-그러나 그러한 위치들이 유효한 수들로 주어지고 사용된 불특정 경합체 분자들의 양으로 효과적으로 포화될 때만이다. 이 조건들이 만족되지 않는다면, 불특정 경합체 분자들을 추가하는 효과는 필연적으로 사용된 단백질의 양을 감소시키는 것과 같다.
일회 이후 각각의 확대 가능한 RNA 종 i의 회복된 양은 식(13)에서의 전체량에 대하여 다음의 식으로 계산된다 :
cDNA 복사의 PCR 화개와 시험관속의 전사(모든 cDNA 부나들에서 동일한 촉진자 위치롤부터)에 의해 RNA 풀을 그 최초의 농도로 복귀시키는 재규격화 후에 SELEX의 일회이후 각 RNA 종들의 농도는 :
여기서 [RNA]는 RNA 풀의 전체농도이다. SELEX의 각각의 추가적인 칫수에 대해 모든 RNA 종들의 농도는 일회로부터 각 RNA 종들에 대한 Fi 1이 다음에 출발부분 Fi 0이 되4도록 식(7)∼(15)의 반복으로 계산될 수 있다.

Claims (89)

  1. 하기 a), b) 및 c) 단계를 포함하는 각각 8개 이상의 헥산 잔기의 랜덤화 배열의 영역을 지닌 단일 사슬 헥산을 포함하는 대상 혼합물로부터 헥산리간드를 식별하는 방법. a) 대상 혼합물과 표적을 접촉 : 여기서 대상혼합물에 비하여 표적에 증가된 친화성을 갖는 헥산이 나머지 대상 혼합물로부터 분리될 수 있다. b) 나머지 대상 혼합물로부터 증가된 친화성을 갖는 헥산을 분리; 및 c) 헥산 리간드 부유화 혼합물을 산출하기 위하여, 시험관 내에서 증가된 친화성 헥산을 증폭시킴으로써, 표적화합물의 헥산 리간드가 식별될 수 있도록 함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대상 혼합물이 결합이 선호하는 조건하에서 상기 표적과 접촉되고, 및 헥산-표적쌍이 형성되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 하기 d) 단계를 더 포함하는 방법. d) 소정 수준의 증가된 리간드 부유화를 달성하는데 요구되는 히수에 해당하는 각각의 연속적인 반복과정의 리간드 부유화 혼합물을 사용하여 a)∼d) 단계를 반복.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증가된 리간드 부유화의 수준이 표적에 대한 리간드 용액을 확정하기에 충분한 정도인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표적이 단백질인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질이 헥산결합 단백질인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 단백질이 헥산결합 단백질인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 증폭단계가 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 채택하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 분리단계가 필터결합선별법을 채택하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 대상 혼합물이 리보헥산을 포함하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 접촉단계가 과잉의 상기 소정 표적의 존재하에 수행하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 표적이 모재상에 지지되는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 모재지지 표적이 칼럼에 고정되는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 대상 혼합물이 각각 랜덤화 배열의 세그먼트를 포함하고 있는 헥산들을 포함하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 대상 혼합물이 보존 누클레오티드 및 랜덤화 또는 편향된 누클레오티드를 함유하는 주형으로부터의 합성에 의하여 제조되는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 대상 혼합물이 각각 보존 배열의 세그먼트를 포함하고 있는 헥산들을 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 대상 혼합물이 각각 보존 배열의 세그먼트가 상기 표적에 결합하는 것으로 알려진 헥산 배열을 포함하는 방법.
  18. 제2항에 있어서, 상기 표적이 단백질이과 상기 헥산-표적쌍이 미카엘 부가물(Michael adducts)을 함유하는 방법.
  19. 제4항에 의한 리간드 용액을 식별하고, 및 상기 용액으로부터 유도된 헥산을 클론화함으로써, 정제된 헥산항체가 제조되는 단계를 포함하는 항체의 제조방법.
  20. 표적분자의 기능에 영향을 미치는 헥산의 능력을 위하여, 상기 표적에 대한 증가된 친화성을 목적으로, 제1항에 의한 헥산분자를 스크린하는 추가의 단계를 포함하는, 표적분자의 기능에 영향을 미치는 헥산의 선별방법.
  21. 제4항에 있어서, 다음 e) 및 f) 단계를 더 포함하는 방법. e) 헥산들을 포함하는 제2 대상 혼합물의 제조 : 여기서 각 헥산이 랜덤화 누클레오티드 세그먼트 및 보조 누클레오티드 세그먼트를 포함하며, 상기 보존 누클레오티드 세그먼트는 상기 리간드 용액으로부터 유도된 누클레오티드 배열을 포함한다.; 및 f) 상기 제2 대상 혼합물을 사용하여 단계 a)∼d)를 반복.
  22. 제4항에 있어서, 다음 e) 및 f)단계를 더 포함하는 방법. e) 헥산들을 포함하는 제2 대상 혼합물의 제조 : 여기서 각 헥산은 상기 리간드 용액으로부터 유도딘, 편향된 누클레오티드를 함유한다. : 및 f) 상기 제2 대상 혼합물을 사용하여 단계 a)∼d)를 반복.
  23. 제1항에 있어서, 상기 표적이 천이상태 유사체인 방법.
  24. 하기 a)∼d) 단계를 포함하는, 소정 표적의 헥산 리간드가 부유화된 헥산 혼합물의 제조방법. a) 보존 세그먼트 및 랜덤화 세그먼트를 포함하는 헥산의 대상 혼합물을 제조 : b) 헥산-표적쌍 및 미결합 헥산을 형성하기 위하여 결합이 선호하는 조건하에서 헥산의 혼합물과 표적을 접촉 : c) 헥산-표적쌍으로 부터 미결합 헥산을 분리하기 위하여 미결합 헥산과 헥산-표적쌍을 분리 : 및 d) 헥산의 리간드 부유와 혼합물을 산출하기 위하여 헥산-표적쌍의 분리된 헥산을 증폭.
  25. 제24항에 있어서, 상기 헥산의 랜덤화 세그먼트가 화학적으로 합성되는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 헥산의 랜덤화 세그먼트가 효소촉매반응에 의하여 합성되는 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 헥산의 랜덤화 세그먼트가 자연발생헥산의 분열에 의하여 제조되는 방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 헥산의 랜덤화 세그먼트가 약 15 누클레오티드 이상의 인접하는 열(string)인 방법.
  29. 제24항에 있어서, 상기 헥산의 랜덤화 세그먼트가 약 25 누클레오티드 이상의 인접하는 열(string)인 방법.
  30. 단일사슬 헥산들을 포함하는 헥산 대상 혼합물 : 여기서 상기 헥산들은 보존 누클레오티드 세그먼트 및 랜덤화 누클레오티드 세그먼트를 포함하며, 상기 렌덤화 누클레오티드 세그먼트가 15 이상의 인접하는 일련의 누클레오티드이다.
  31. 제30항에 있어서, 상기 랜덤화 누클레오티드 세그먼트가 약 25 누클레오티드 이상의 인접하는 열인 헥산대상 혼합물.
  32. 제30항에 있어서, 상기 혼합물이 약 109이상의 헥산을 함유하는 헥산 대상 혼합물.
  33. 제30항에 있어서, 상기 혼합물이 약 1014이상의 헥산을 함유하는 헥산 대상 혼합물.
  34. 제30항에 있어서, 상기 랜덤화 누클레오티드 세그먼트가 보존 누클레오티드 세그먼트와 측면을 이루는 헥산 대상 혼합물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 측면을 이루는 보존 누클레오티드 세그먼트ㄱ 선별되어, 선별된 헥산의 증폭에 도움을 주는 헥산 대상 혼합물.
  36. 제30항에 있어서, 상기 보존 및 랜덤화 세그먼트가, 소정의 3차 구조를 지닌 상기 대상 혼합물의 헥산 백분율을 강화시키도록 배열된 헥산 대상 혼합물.
  37. 제36항에 있어서, 헤어핀 루우프 형상의 헥산으로서 강화된 헥산 대상 혼합물.
  38. 제36항에 있어서, 수우도놋트 형상의 헥산으로서 강화된 헥산 대상 혼합물.
  39. 3차원형 화학구조를 이루는 표적에 대하여 특이적 결합 친화성을 갖는 합성 헥산항체.
  40. 제39항에 있어서, 단일 사슬 RNA, 2중사슬 RNA, 단일사슬 DNA , 2종사슬 DNA 및 그들의 화학적 수식체로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 헥산리간드를 포함하는 헥산항체.
  41. 제39항에 있어서, 상기 표적이, 주로 왓트손/크럭크 염기쌍 또는 3종 나선결합에 의존하는 메카니즘을 통하여 상기 헥산항체와 결합하는 폴리누클레오티드 이와의 구조(단, 헥산항체가 2종사슬 DNA일 때, 표적은 그 기능이 2종사슬 KNA과의 특이적 결합에 의존되는 자열발생 단백질이 아님)을 갖는 헥산항체.
  42. 제39항에 있어서, 표적이 단백질인 헥산항체.
  43. 제39항에 있어서, 항체가 단일사슬 RNA를 포함하는 헥산항체.
  44. 제39항에 있어서, 복수의 표적-특징 리간드를 포함하는 헥산항체.
  45. 제44항에 있어서, 하나 이상의 동일 리간드를 포함하는 헥산항체.
  46. 제44항에 있어서, 2개 이상의 분리된 표적-특징 리간드를 포함하는 헥산항체.
  47. 제39항에 있어서, 비헥산 성분을 더 포함하는 헥산항체.
  48. 제47항에 있어서, 상기 비헥산 성분이, 상기 항체를 환자 체내의 선별된 위치에 배치시킬 수 있는 헥산항체.
  49. 제47항에 있어서, 상기 비헥산 성분이 표적-특정 리간드인 헥산항체.
  50. 제39항에 있어서, 상기 표적이 단백질이고 상기 항첵 상기 표적과 미카엘 부가물을 형성할 수 있는 헥산항체.
  51. 제39항에 있어서, 제1항의 방법에 의하여 얻어진 헥산 리간드를 포함하는 헥산항체.
  52. 제51항에 있어서, 상기 표적이 단백질인 헥산항체.
  53. 제51항에 있어서, 상기 헥산 리간드가, 단일사슬 RNA, 2중 사슬 RNA, 단일사슬 DNA, 2중사슬 DNA, 및 이들 수식체로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 헥산 ㅎㅇ체.
  54. 제42항에 있어서, 상기 단백질이 헥산 폴리머라제인 헥산항체.
  55. 제54항에 있어서, 상기 단백질이 DNA 폴리머라제인 헥산항체.
  56. 제55항에 있어서, 상기 단백질이 gp 43인 헥산항체.
  57. 제56항에 잇어서, 하기 RNA 배열, 5'-NNNGACCUAGCAACCUGGGCUAGGAAU-3' 또는 그 대응 DNA 배열 또는 그 상보배열을 포함하는 헥산항체.
  58. 제54항에 있어서, 상기 단백질이 역전사효소인 헥산항체.
  59. 제58항에 있어서, 상기 역전사 효소가 HIV-1 역전사효소인 헥산항체.
  60. 제59항에 있어서, 상기 항체가 수우도놋트의 구조형상인 헥산항체.
  61. 제60항에 있어서, RNA 배열, 5'-UUCCG-3'를 포함하는 헥산항체.
  62. 제60항에 있어서, 하기 RNA 배열.
    또는 그 대응 DNA 배열 또는 그 상보배열을 포함하는 헥산항체.
  63. 제60항에 있어서, RNA 배열. 5'-CGGGA-3'를 포함하는 헥산항체.
  64. 제60항에 있어서, 루우프 1이 2 누클레오티드 길이니 헥산항체.
  65. 제60항에 있어서, 스템 2가 5 또는 6 염기쌍인 헥산항체.
  66. 제60항에 있어서, 루우프 2ㄱ 존재할 경우, 누클레오티득 A들인 헥산항체.
  67. 제60항에 있어서, 루우프 3가 3 이상의 누클레오티드를 포함하며 상기 누클레오티드들의 A가 부유화된 헥산항체.
  68. 제60항에 있어서, 루우프 1, 스템 2(a) 및 루우프 2가 8 누클레오티드로 구성되는 헥산항체.
  69. 제42항에 있어서, 상기 단백질이 박테리오파아지 의피 단백질인 헥산항체.
  70. 제69항에 있어서, 상기 단백질이 박테리오파아지 R17 의피 단백질인 헥산항체.
  71. 제70항에 있어서, 하기 RNA 배열.
    U C
    A A
    CG
    CG
    A
    CG
    NN'
    NN'
    또는 그 대응 DNA 배열 또는 그 상보배열을 포함하는 헥산항체.
  72. 제42항에 있어서, 상기 단백질이 세린 프로티아제(serine protease)인 헥산항체.
  73. 제72항에 있어서, 상기 단백질이 tPA인 헥산항체.
  74. 제42항에 있어서, 상기 단백질이 포유동물 리셉터인 헥산항체.
  75. 제74항에 있어서, 상기 단백질이 인체성장이자인 헥산항체.
  76. 제42항에 있어서, 상기 단백질이 포유동물 호르몬 또는 인자인 헥산항체.
  77. 제76항에 있어서, 상기 단백질이 인슐린인 헥산항체.
  78. 제42항에 있어서, 상기 단백질이 헥산과 결합하는 것으로 알려지지 않은 단백질인 헥산항체.
  79. 제76항에 있어서, 상기 단백질이 신경성장인자(NGF)인 헥산항체.
  80. 제79항에 있어서, 하기 배열로 구성되어 있는 군으로 부터 선택된 RNA 배열.
    5'-CUCA-3'
    5'-GAGCGCAAGACGAAUAG-3'
    5'-UACA-3' : 및
    5'-ACAUCGAUGACCGGAAUGCCGCACACAGAG-3'
    또는 그 대응 DNA 배열 또는 그 상보배열을 포함하는 헥산항체.
  81. 제55항에 있어서, 상기 단백질이 HSV-1 DNA 폴리머라제인 헥산항체.
  82. 제81항에 있어서, 하기 RNA 배열,
    5'-UAAGGAGGCCAC-3'
    또는 그 대응 DNA 배열 또는 그 상보배열들을 포함하는 헥산항체.
  83. 제42항에 있어서, 상기 단백질이 리보솜 단백질인 헥산항체.
  84. 제83항에 있어서, 상기 단백질이 E.coli 리보솜 단백질 SI인 헥산항체.
  85. 제77항에 있어서, 하기 RNA 배열.
    또는 그 대응 DNA 배열 또는 그 상보배열들을 포함하는 헥산항체.
  86. 제42항에 있어서, 상기 단백질이 비루스 rev 단백질인 헥산항체.
  87. 제86항에 있어서, 상기 단백질이 HIV-1 rev 단백질인 헥산항체.
  88. 제87항에 있어서, 비대칭 융기 구조형상인 헥산항체.
  89. 제88항에 있어서, 하기 배열로 구성되어 있는 군으로 부터 선택된 RNA 배열.
    또는 그 대응 배열 또는 그 상보배열들을 포함하는 헥산항체.
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