KR20110111327A - 아라키돈산-함유 오일 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바람직하게는 사실상 에이코사펜타엔산을 함유하지 않는 아라키돈산 함유 오일을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 트리글리세라이드의 형태로 매우 높은 양의 아라키돈산을 갖는 오일 함유 조성물 및 이러한 오일의 용도에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 모르티에렐라 알피나는 특히 높은 수준의 아라키돈산 잔기를 갖는 트리글리세라이드 오일을 제공하는 조건을 사용하여 배양하고, 바이오매쓰를 수거하고, 오일을 추출하고, 회수한 다음, 분유 첨가제로서 사용한다.

Description

아라키돈산-함유 오일 및 이의 제조방법 {Arachidonic acid-containing oil and methods for the production thereof}
본 발명은 아라키돈산의 제조, 아라키돈산을 함유하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
아라키돈산 (ARA)은 오메가-6 부류의 장쇄 다중 불포화 지방산 (PUFA)이다 (5, 8, 11, 14-에이코사테트라엔산, 즉 20:4). ARA는 체내에서 가장 풍부한 C20 PUFA이다. 이는 특히 기관, 근육 및 혈액 조직에서 우세하며 혈액, 간, 근육 및 기타 주요 기관 시스템에서 주로 인지질과 결합하여 구조상 지질로서 주요한 역할을 한다. 구조상 지질로서의 1차 역할 이외에, ARA는 또한 다수의 순환 에이코세노이드, 예를 들면, 프로스타글란딘 E2(PGE2), 프로스타사이클린 I2(PGI2), 트롬복산 A2(TXA2), 및 루코트리엔 B4(LTB4) 및 C4(LTC4)에 대한 직접적인 전구체이다. 이들 에이코세노이드는 지방 단백질 대사, 혈액 유동, 혈관 긴장도, 백혈구 기능 및 혈소판 활성화에 대한 조절 효과를 나타낸다.
사람의 대사에서의 이의 중요성에도 불구하고, ARA는 체내에서 새로이 합성할 수 없다. ARA는 필수 지방산인 리놀레산 (LOA)의 신장 및 불포화화에 의해 합성된다. 이러한 방법은 낮은 수준으로 체내에 존재하는 효소인 효소 Δ6-불포화제의 존재를 요구한다 [참조: Burre et al., Lipids, 25:354-356 (1990)]. 따라서, 대부분의 ARA는 음식물에 의해 제공되어야 하며, 이는 매우 빠른 신체 성장, 예를 들면, 유년기에 특히 중요하다.
생후 1년 동안, 유아는 체중이 2배 또는 3배가 될 수 있다. 따라서, 식이에 의한 ARA의 높은 수준이 요구된다. 이러한 증가된 요구를 만족시키기 위해, 사람의 모유는 높은 수준의 ARA를 함유한다 [참조: Sanders et al., Am . J. Clin . Nutr., 31:805-813 (1978)]. ARA는 모유에서 가장 우세한 C20 PUFA이다. 산모, 특히 유아를 모유로 키운 채식주의 산모 중에서, 대다수는 추가의 식이에 의한 ARA로부터 이익을 얻는다. 그러나, 대다수의 산모는 유아를 모유로 키우지 않거나, 빠른 유아 성장의 전체 기간 동안 모유로 키우지 않고 분유 (infant formula)를 이용한다.
출원인에게 공지된 시판되는 분유는 트리글리세라이드의 형태에 ARA를 함유하지 않는다. 본원에서 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제4,670,285호 (Clandinin 등)는 ARA를 포함하는 지방산에 대한 유아의 요구를 기술한다. 이들 지방산을 제공하기 위해, Clandinin 등은 제시되는 분유의 지방 성분으로서 난황, 어유 또는 적혈구 인지질 및 식물성 오일의 블렌드를 제안한다. 그러나, 어유는 다량의 에이코사펜타엔산 (EPA)를 함유한다. EPA는 유아에서 ARA 합성을 억제하는 것으로 공지되어 있다 [참조: Carlson, et al., INFORM, 1:306 (1990)]. 따라서, 추가의 EPA의 제공 없이 ARA의 제공을 요한다. 또한, 난황은 비교적 낮은 농도의 ARA를 함유하므로, Clandinin 등의 혼합물은 경제적으로 유용하지 않다.
ARA는 식물성이 아닌 동물성 오일에 존재하므로, 이의 상업적인 양으로의 제조는 요망하지만 회피적인 목적을 여전히 남긴다. 문헌 [참조:Shinmen, et al., Microbiol. Biotech. 31:11-16 (1989)]은 통상의 교반 탱크 발효를 사용하여 분리된 진균류, 모르티에렐라 알피나 (Mortierella alpina)에 의한 ARA의 제조를 보고하였다 [참조: 일본 특허 제1,215,245호, Shinmen 등]. 배양후, 유기물을 수거하고, 건조시킨 다음, 지질을 유기 용매를 사용하여 진균 바이오매쓰 (biomass)로부터 추출하고, 지질을 화학적으로 (공유적으로) 개질시킨다. 예를 들면, 지질 혼합물을 에틸 에스테르로 가수분해시키거나 전환시키고, 식이 보충제로서 사용하기 전에 사이클로덱스트린과 배합한다. Shinmen 등은 개질되지 않은 미생물 오일의 투여를 기술하거나 제시하지 않았다.
포르피리디움 크루엔툼 (Porphyridium cruentum)인 적색 미조류 (microalgae)는 다량으로 연못에서 성장할 수 있으며, 40% 이하의 ARA를 함유할 수 있는 지질 함량을 갖는다 [참조: Ahern et al., Biotech , Bioeng 25:1057-1070 (1983)]. 불행하게도, ARA는 주로 갈락토리피드와 결합되어 있고, 복합체 극성 지질은 모유에 존재하지 않는다. 따라서, 총 유용한 ARA는 바이오매쓰의 1%의 분획을 차지할 뿐만 아니라 ARA의 형태는 추가의 개질 없이는 분유에 대한 첨가제로서 사용하기에 적합하지 않다.
미국 특허 제4,870,011호 (Suzuki 등)는 모르티에렐라 속의 진균류로부터 γ-리놀렌산과 같은 지질을 수득하는 방법을 기술한다. γ-리놀렌산은 진균류에 함유된 지질의 혼합물로부터 정제한다.
독일 제3603000A1호 (Milupa)는 고도의 다중 불포화된 산 지방 혼합물 및 분유의 지방 성분으로서의 이의 용도를 기술한다. 지방 혼합물은 각각 2.5:1의 비로 ARA 및 도코사헥사노산 (DHA)의 높은 함량 및 콜레스테롤의 높은 함량을 갖는다. 지방산의 공급원은 특정 유형의 미조류, 어유, 소 및 돼지로부터의 기관 지방 또는 고도로 정제된 난황 오일로 제시되어 있다. DHA 및 ARA의 공급원은 패코파이트 (phaecophyte) 및 로도파이트 (rhodophyte) 유형의 미조류이다. 오일의 공급원으로서 임의의 미생물의 사용에 관하여 제시되어 있지 않다. 조류 오일 및 어유는 또한 통상 생체내에서 ARA의 합성을 억제하는 EPA를 포함한다. 추가로, 고도로 정제된 난황 오일은 경제적인 ARA의 공급원이 아니다. 더욱이, 선재하는 분유를 보충하기 위한 ARA 농축 첨가제에 대하여 기술되어 있지 않다.
따라서, 바람직하게는 EPA의 동시 제조 없이 ARA를 제조하는 경제적이고, 상업적으로 유용한 방법을 필요로 한다. 이러한 요구를 충족시키는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명의 다른 목적은 분유에서의 ARA의 수준이 사람의 모유에서의 수준과 대략적으로 같도록 분유에 사용하기 위한 첨가제 및 이러한 첨가제에 대한 공급원을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 경구 (enteric), 비경구 또는 피부 생성물로 사용하기 위한 ARA 함유 진균 오일을 제공하는 것이다.
본 발명은 아라키돈산 함유 진균 오일 (ARASCO)의 제조 및 용도 및 이러한 오일을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 오일은 단순 세포 오일로서 언급할 수 있다. 진균류는 오일 생성 조건하에서 배양하고 수거한 다음 오일을 추출하고 회수한다. 추가의 화학적 개질 없이 오일을 신생아, 임부, 수유부 또는 ARA-결핍 병리를 나타내는 사람을 포함하는 이를 필요로 하는 사람에게 ARA를 보충하기 위해 직접 사용할 수 있다. 본 발명의 이점은 제조의 용이성 및 높은 순도 및 검출가능한 양의 EPA의 결핍을 포함한다.
“ARA” 및 "EPA"는 아라키돈산 및 에이코사펜타엔산의 잔기 각각을 의미하며, 여기서 잔기는 지방산 아실 트리글리세라이드 또는 인지질의 일부로서 글리세롤로 에스테르화된다. 본원에서 사용된 조성물은 조성물중의 잔류량의 EPA가 조성물이 영양 보충제로서 사용되는 경우 ARA의 합성을 억제하는 양보다 적은 경우 "본질적으로 EPA을 함유하지 않는다". 본 발명은 아라키돈산 (ARA)의 경제적인 공급원을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 실질적으로 에이코사펜타엔산 (EPA)을 함유하지 않는 아라키돈산 함유 진균 오일 (ARASCO)의 제조 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용된 “실질적으로 함유하지 않는”이란 EPA가 오일 중에서 ARA의 양의 약 1/5 미만으로 존재한다는 것을 의미한다. 오일, 단순 세포 오일은 개질되지 않은 형태로 직접 투여할 수 있다. 본원에서 사용된 “개질되지 않은”이란 지방산 또는 오일 자체의 화학적 특성이 공유적으로 변화되지 않았음을 의미한다. 따라서, 예를들면, 오일의 후속 흡수를 역전시킬 수 있는 ARASCO 또는 ARA의 일시적 개질은 본 발명의 범위를 벗어나지 않는다.
본 발명에 따르는 개질되지 않은 진균 오일은, 비교적 고 비율의 지방산 잔기가 ARA (바람직하게는 지방산 잔기의 40% 이상이 ARA이고, 더욱 바람직하게는 잔기의 50% 이상이 ARA이다)이고, EPA 잔기에 대한 ARA 잔기의 비도 높은 (5:1 이상, 바람직하게는 20:1 이상, w/w) 트리글리세라이드를 제공한다. 천연 공급원으로부터의 이러한 오일은 본 발명 이전에는 기술되어 있지 않다. 이러한 조성을 갖는 트리글리세라이드는 화학적으로 (예를 들면, ARA 함량이 높은 유리 지방산 혼합물을 에스테르화하거나 이러한 지방산 혼합물을 에틸 에스테르로 에스테르 교환하여) 합성될 수 있으나, 지방산 혼합물의 처리 (예: 정제, 에스테르화 등)는 목적하지 않은 부산물을 형성시킬 수 있다. 대조적으로, 본 발명에 따르는 방법은 천연 공급원으로부터 추출에 의해 목적하는 조성을 갖는 트리글리세라이드를 제공한다.
몇몇 진균 종의 지방산 조성
종 14:0 16:0 16:1 18:1 18:2 18:3 20:4 20:5 총 지방
모르티에렐라 알피나 - 8.2 - 33.5 16.3 23.3 13.0 - 3.0
모르티에렐라 엘롱가타 2.0 13.2 - 26.6 11.9 13.2 13.8 2.4 4.0
모르티에렐라 이사벨리나 0.3 15.7 0.8 55.8 11.1 9.0 - - 7.3
사프롤레그니아 파라시리카 7.4 19.1 1.9 6.3 24.5 12.5 10.5 10.5 9.3
피티엄 카테루엘라난 6.5 9.9 10.3 21.2 18.5 3.5 13.4 10.9 5.0
피티엄 콜로라듐 13.6 9.9 - 14.7 10.9 2.5 24.3 21.7 2.2
피티엄 그라실 14.7 9.1 2.2 14.8 12.6 3.6 22.1 5.7 4.5
피티엄 이레굴라레 10.3 15.4 6.9 12.3 21.0 3.9 10.6 12.4 11.9
피티엄 우트리만 9.5 16.7 10.5 17.1 20.7 1.3 9.0 6.9 13.3
피티엄 인시디오섬 9.5 11.4 12.1 1.0 8.3 9.3 31.9 - 2.8
*이미 특징화된 지방산을 갖는 이들 진균 종에서, 대부분은 ARA를 생성시키지 못하는 것으로 밝혀졌다 [참조: Weete, J.D., Fungal Lipid Biochemistry , Plenum Press, N.Y. (1974)]. ARA를 생성시키지 못하는 이들 종중에서, 이미 특징화된 피티엄 종을 포함하는 대다수는 ARA 이외에 상당량의 에이코사펜타엔산 (EPA)을 생성한다. 표 1은 피. 인시디오섬의 지방산 프로필과 진균류의 기타 종의 지방산 프로필을 나타내었다. 예기치 않게도, 피. 인시디오섬은 동시에 EPA를 생성시키지 않으면서 ARA를 생성시킨다는 것을 밝혀내었다. 어유에서와 같이, 식이 보충제에서의 EPA의 높은 수준은 식이에 의한 리놀레산 (LOA)으로부터 ARA를 형성시키는 능력을 억제한다. 따라서, ARA 및 EPA를 모두 생성시키는 이들 진균종은 본 발명의 방법에 이용될 수 있으나 상당량의 EPA를 생성시키지 않는 종을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 바람직한 종은 피티엄 인시디오섬 및 모르티에렐라 알피나를 포함한다. 두 종은 시판되고 있고 각각 수탁번호 28251 및 42430으로 기탁되어 있다 (American Type Culture Collective, Rockville, Maryland). 피. 인시디오섬 및 엠. 알피나는 본 기술을 통해 대표적인 진균 종으로 사용된다. 물론, 본원에서 기술한 바와 같이 ARA 함유 트리글리세라이드 및 저하된 EPA를 생성시키는 기타 진균종도 본 발명내에 포함된다.
본 발명의 양태를 해결하는 중요한 문제점중의 하나는 EPA의 증가된 식이 수준의 존재에 의해 야기된 유아에서 ARA 생합성의 억제이다. 이러한 문제점은 사람의 모유에서 발견되는 것과 사실상 유사한 수준으로 분유에 사용하기 위한 ARA를 제공하여 정정할 수 있다. 통상적으로, 사람의 모유에서 ARA:EPA의 비는 각각 약 20:1이다. 본 발명은 식이 EPA의 네가티브 효과를 해결하기 위해 ARA의 상당량을 제공하는 미생물 오일을 구체적으로 예기한다. 바람직하게는 ARA-함유 오일의 사용은 약 5:1 이상의 ARA:EPA의 비를 초래한다. 보다 바람직하게는, 이러한 비는 약 10:1 이상이고, 가장 바람직하게는 약 20:1 이상이다. 제시된 바와 같이, 최종 생성물에서 EPA의 양에 대하여 ARA의 양이 높을수록, 보다 바람직하다.
본 발명의 방법에서, 진균류를 적합한 ARA-함유 오일 생성 배양 조건하에서 배양한다. 일반적으로, 진균 배양 기술은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있고 이들 기술은 본 발명의 방법에 적용할 수 있다. 예를 들면, 접종하는 양으로 진균을 진탕 플라스크에서 침지 배양할 수 있다. 플라스크에 성장 배지를 제공하고 진균 균사체로 시딩한 다음 약 3 내지 4일 동안 왕복 진탕기상에서 성장시킨다.
성장 배지의 조성은 변할 수 있지만 항상 탄소 및 질소 공급원을 함유한다. 바람직한 탄소 공급원은 글루코즈이며, 성장 배지 1ℓ당 글루코즈는 약 10 내지 100 g의 범위내일 수 있다. 통상적으로, 약 15 g/ℓ가 진탕 플라스크 배양에 이용된다. 이의 양은 최종 배양액의 목적하는 농도에 따라 좌우될 수 있다. 사용될 수 있는 기타 탄소 공급원은 당밀, 고프럭토즈 옥수수 시럽, 가수분해된 전분 또는 발효 공정에 사용되는 기타 저가의 통상적인 탄소 공급원을 포함한다. 추가로, 락토즈는 피. 인시디오섬에 대한 탄소 공급원으로서 제공될 수 있다. 따라서, 락토즈 함량이 높고 매우 저가의 탄소 공급원인 유청을 기재로서 사용할 수 있다. 이들 탄소 공급원의 적합한 양은 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 통상적으로, 배양동안 추가의 탄소의 첨가를 요한다. 이는 유기체가 배치 모드에서 탄소의 첨가가 모두 비실제적으로 입증될 수 있는 보다 많은 탄소를 사용하기 때문이다.
질소는 통상적으로, 성장 배지 1ℓ당 약 2 내지 약 15 g의 농도로 효모 추출물의 형태로 제공된다. 바람직하게는 약 4 g/ℓ가 제공된다. 펩톤, 트립톤, 옥수수 침지액, 콩가루, 가수분해된 식물성 단백질 등을 포함하는 기타 질소 공급원을 사용할 수 있다. 이들 공급원의 첨가량은 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 질소는 배치 모드로, 즉 배양전 일시에 모두 가할 수 있다.
적합한 온도, 통상 약 25 내지 30℃에서 3 내지 4일 동안 배양한 후, 통상의 교반 탱크 발효기 (STF)에서 접종물로서 사용하기에 충분한 양의 진균류가 성장한다. 이러한 발효기는 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있고 시판되고 있다. 발효는 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 모드로 수행할 수 있다. 바람직하게는, STF는 러쉬톤-유형의 터빈 임펠러가 사용될 수 있으나, 해양 임펠러가 장착되어 있다.
발효기를 목적하는 탄소 및 질소 공급원을 가하여 준비한다. 예를 들면, 1.5ℓ들이 발효기를 글루코즈 약 50 g 및 효모 추출물 약 15 g을 수도물 1ℓ당 혼합하여 준비할 수 있다. 이미 논의된 바와 같이, 기타 탄소 또는 질소 공급원 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
영양물 용액을 함유하는 반응기를 예를 들면 접종 전 가열하여 멸균시켜야 한다. 약 30℃로 냉각시킨 후, 접종물을 가하고, 배양을 개시한다. 기체 교환은 공기 스파징에 의해 제공한다. 공기 스파징율은 변할 수 있으나, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 4.0VVM (공기 용적/발효기 용적/분)를 형성하도록 조절한다. 바람직하게는, 용해 산소 수준은 용액의 공기 포화값의 약 10 내지 약 50%로 유지시킨다. 따라서, 스파징율의 조절은 배양 동안 요구될 수 있다. 교반이 바람직하다. 교반은 임펠러에 의해 제공된다. 교반 선단 속도는 바람직하게는 약 50 내지 약 500cm/초, 바람직하게는 약 100 내지 200cm/초의 범위내로 조정된다.
일반적으로 접종물의 양은 다양할 수 있다. 통상, 접종물 약 2 내지 약 10용적%가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 발효기 시드 트레인에서 접종물 약 5용적%가 사용될 수 있다.
영양물 수준을 모니터링해야 한다. 글루코즈 수준이 5 g/ℓ 미만으로 강하되는 경우, 추가의 글루코즈를 가해야 한다. 통상의 배양 사이클은 1ℓ당 글루코즈 약 100 g 및 효모 추출물 약 15 g을 이용한다. 진균류에 의해 오일 생성이 증가함에 따라 배양 동안 질소를 고갈시키는 것이 바람직하다. 이는 엠. 알피나가 생성 유기물로서 사용되는 경우 특히 그러하다.
특히 바람직한 양태에서, 높은 수준의 ARA을 포함하는 오일 함량이 높은 모르티에렐라 알피나는 매우 높은 영양물 수준을 사용하여 발효기에서 배양시킬 수 있다. 예기치 않게도, 효모 추출물 15 g/ℓ에 의해 제공된 것보다 과량의 질소-함유 영양물의 수준이 발효 동안 탄소-함유 영양물의 총 첨가량이 비교적 높은 한 발효 개시시에 가해질 수 있다는 것을 밝혀내었다. 바람직하게는 발효 시기의 초기 25 내지 50%동안 연속적으로 또는 간헐적으로 공급되거나 시기의 동일 부분에 걸쳐 다중 시점에서 분취량으로 공급된 탄소 영양물의 총량은 배양 배지 1ℓ당 글루코즈 75 내지 300 g에 상응한다 (C:N 비 ≥ 5:1, 글루코즈:효모 추출물 w/w로 표현). 특히 바람직한 모드에서, 질소 영양물은 콩가루이며 배지 1ℓ당 약 16 g의 수준으로 가하고, 탄소 영양물은 글루코즈 약 80 g 이상에 상응하는 수준으로 초기에 존재한다. 높은 수준의 탄소 및 질소 영양물을 사용하는 경우, 2개의 영양물 용액을 따로 함유하는 용액을 멸균시키는 것이 바람직하다. 또한, 바이오매쓰 수율은 높은 수준의 탄소 영양물을 함유하는 발효 동안 질소 영양물의 일부를 보류시키고 발효 동안 나머지 질소 영양물을 연속적으로 또는 하나 이상의 분취량으로 공급하여 증진시킬 수 있음을 발견했다.
이따금, 배양물은 과량의 발포체를 생성시킨다. 임의로, 소포제, 예를 들면, 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 Mazu 310R 또는 식물성 오일은 발포체 형성을 방지하기 위해 가할 수 있다.
배양 온도는 다양할 수 있다. 그러나, 고온에서 배양하는 경우 ARA 및 EPA를 모두 생성시키는 진균류는 보다 적은 EPA 및 보다 많은 ARA를 생성시키는 경향이 있다. 예를 들면, 모르티에렐라 알피나를 18℃ 미만에서 배양하는 경우, EPA를 생성시키기 시작한다. 따라서, ARA의 선택 생성을 유도하는 수준으로 온도를 유지시키는 것이 바람직하다. 적합한 온도는 통상 약 25 내지 약 30℃이다.
바람직하게는, 목적하는 바이오매쓰 밀도가 달성될때까지 계속 배양한다. 목적하는 바이오매쓰는 유기체의 약 25 g/ℓ이다. 이러한 바이오매쓰는 통상 접종후 48 내지 72시간내에 얻어진다. 이때에, 유기체는 통상 약 5 내지 40% 복합체 지질, 즉 오일을 함유하고 이들중 약 10 내지 40%가 ARA이거나 바람직하게는 트리글리세라이드 분획중 ARA 잔기가 40% 이상, 보다 바람직하게는 트리글리세라이드 분획중 ARA가 50% 이상인 오일을 수거할 수 있다.
본 발명에 따르는 ARA 제조용 진균 발효는 약 5 내지 8의 pH를 갖는 발효 배지에서 수행할 수 있다. 그러나, 엠. 알피나의 배양물로부터의 바이오매쓰, 오일 및 ARA의 수율은 조절되지 않은 pH 변화보다는 배지의 pH를 프로필링하여 증진시킬 수 있다. 수율은 발효 동안 높은 산소 수준을 유지시켜 증진시킬 수도 있다. 발효 과정의 변화는 발효기에서 높은 영양물 수준을 사용하는 경우 특히 효과적이다.
초기 질소 영양물 수준이 1ℓ당 효모 추출물 약 15 g의 상당물을 초과하고/하거나 탄소 영양물 수준이 1ℓ당 글루코즈 약 150 g의 상당물을 초과하는 경우, 진균류의 성장은 억제될 수 있다. 이러한 성장 억제는 공급된 배치 발효, 예를 들면, 발효용 영양물을 분취량으로 세분하고 앞선 분취량에 의해 공급된 영양물의 일부 또는 전부가 대사되면 이 분취량을 발효기에 일련으로 공급하여 해결할 수 있다. 성장 억제를 해결하는 이점은 단지 탄소 영양물을 공급하여 달성할 수 있다 (참조: Shinmen 등). 이러한 이점은 또한 총 영양물을 분취량으로 세분하고 분취량을 발효 동안 공급하거나, 영양물 용액을 연속 공급하여 수득할 수 있음을 발견했다. 유사하게는, 이러한 이점이 탄소 영양물이 높은 수준으로 초기에 존재하는 발효에 대해서만 질소 영양물을 공급하여 달성할 수 있음을 예기치 않게도 발견했다.
성장 억제가 발효의 pH 프로필링, 발효기에서 높은 산소 장력 유지 또는 이들 둘 다에 의해 완화될 수 있다는 것을 예기치 않게도 발견했다. 낮은 pH (pH=5 내지 6)에서 높은 영양물 배지중 엠. 알피나의 발효가 증진된 바이오매쓰 성장 (및 증가된 오일 수율)을 초래함을 밝혀내었다. 그러나, 이들 조건하에서 생성된 오일은 오일중 낮은 수준의 ARA 잔기를 갖는다. 대조적으로, 높은 pH (pH=7 내지 7.5)에서의 발효는 오일중 ARA의 수준을 증가시키나, 성장이 보다 불량하다. 바람직한 모드에서 본 발명의 발효 방법은 발효의 초기 단계동안 pH가 낮고 이후 단계 동안 높은 pH 프로필링을 포함한다. 초기 단계는 영양물이 빠르게 대사되는 동안의 빠른 (지수) 성장 시기를 포함하고, 이후의 단계는 세포 분열이 하나 이상의 영양물의 불충분한 양에 통상 기인하여 저지되고 ARA-풍부 오일의 생성이 증진되는 정지 단계를 포함한다. 프로필링은 발효기 pH를 발효시기 동안 일정한 간격을 둔 2개 이상의 단계에서 조절되는 수준으로 조절하여 수행할 수 있다.
또한 배지의 용해 산소 (D.O.) 함량은 높은 수준 (예: 공기 포화 수준의 40% 이상)으로 유지시키는 것이 높은 영양물 수준에 의한 성장 억제의 경감 및/또는 오일중 ARA 잔기의 상대 수준의 증가를 초래할 수 있음을 발견했다. D.O.는 용기내 압력 증가 (보다 많은 공기를 발효기 상부 공간에 가함), 교반 증가 (예: 임펠러 선단 속도 증가) 및 통기율 증가 (예: 주어진 시간에서 발효기를 통한 공기의 양 증가, 통상 VVM 공기 용적/발효기 용적/분에서의 증가로 나타냄) 및/또는 스파징 기체의 O2 함량 증가에 의해 높은 수준으로 유지시킬 수 있다. 이들 조건하에서의 발효는 탄소 이용을 증가시켜 최종 바이오매쓰 밀도를 높여주고 발효기에서 ARA-풍부 오일의 생산성을 높여준다. 특히, 하나 이상의 상기 조작을 도입한 발효는 40% 이상의 ARA 잔기, 바람직하게는 50% 이상의 ARA 잔기를 갖는 추출 가능한 트리글리세라이드 오일을 생성시킨다.
특히 바람직한 양태에서, 발효 배지는 글루코즈 80 g/ℓ 이상에 상응하는 탄소 영양물 및 효모 추출물 16 g/ℓ 이상에 상응하는 질소 영양물을 함유하고, 배지는 pH 5 내지 6으로 조절되어 멸균화된다. 접종 후, 배지의 pH는 초기 수준에서 또는 약간 이상으로 조절한다. 탄소 영양물 수준이 글루코즈 상당물 60 g/ℓ 이하로 강하되면 (통상 약 48시간), pH 조절용 고정점은 약 pH 6 이상으로 변화시킨다. 산소 흡수율 (및/또는 이산화탄소 배기율, CER)이 최대에 도달하는 시점에서 (통상 약 72시간 후), 고정점을 pH 6.5 내지 7로 상승시킨다 (통상 점진적으로, 예를들면, 시간당 약 0.1 pH 단위의 비율로). pH를 조절하여 발효의 최종 단계 동안 약 pH 7 내지 7.5 이하로 유지시킨다.
이러한 양태에서, 배지중 용존 산소 수준 (D.O.)은 바람직하게는 용기내 압력을 11psi로 일련 증가시키고, 임펠러 선단 속도를 약 30cm/초에 상당하게 교반을 증가시키고, 약 0.5의 공기 용적/발효기 용적/분으로 통기율을 증가시켜 공기 포화 수준의 40% 이내로 유지시킨다. 빠른 성장 및 발효에 의한 높은 O2 흡수 시기후, 성장 (및 O2 흡수)은 감소할 것이다. 교반/통기율은 이 시점에서 D.O.가 높은 수준으로, 통상 약 40% 이상의 공기 포화 수준으로 유지되는 한 감소시킬 수 있다.
본원에서 기술한 바와 같이 엠. 알피나의 발효를 최적화하여, 오일의 25 내지 70중량%가 트리글리세라이드 형태인 ARA 잔기로서 바이오매쓰중 20 내지 60%의 오일을 함유하는 매우 높은 수율의 바이오매쓰를 수득할 수 있다. 바이오매쓰 (및 오일)을 본원에서 기술한 바와 같이 수거할 수 있다. 바람직하게는, 바이오매쓰는 ARA g/ℓ/일로 측정되는 최대 생성성의 48시간내에 발효기로부터 수거한다.
수거는 적합한 방법, 예를들면, 여과, 원심분리 또는 분무 건조에 의해 수행할 수있다. 보다 낮은 비용으로, 여과가 바람직하다.
수거 후, 균사 케이크를 추출할 수 있다. 균사 케이크는 수거후 수득되는 바이오매쓰의 수집물이다. 케이크는 느슨하거나 압착되어 있고 분쇄되거나 그러하지 않을 수 있다. 임의로, 케이크는 추출전 진공 건조, 유체상 건조, 분무 건조 또는 동결 건조에 의해 제거되는 잔류수를 가질 수 있다. 이러한 임의의 사항을 선택하는 경우, ARA 함유 오일을 추출하기 위해 비극성 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 임의의 비극성 추출이 적합할 수 있으며 헥산이 바람직하다.
바람직한 양태에서, 오일은 습윤 연마 또는 순수한 헥산으로의 삼투에 의해 건조 바이오매쓰로부터 추출한다. 용매는 통상 약 5:1 (w/w)의 용매:바이오매쓰의 비로 가한다. 습윤 연마후, 고체를 경사 여과 또는 원심분리에 의해 추출물로부터 분리한다. 오일중 불포화 지방산 잔기의 산화를 피하기 위해 용매-함유 추출물 (미스셀라, miscella)을 혐기성적으로 유지시키는 것이 유익하다. 미스셀라를 탈용매화하여 진균 원유를 생성시킨다.
비극성 용매로 진균 바이오매쓰로부터 추출된 원유는 특히 바이오매쓰가 연마되는 경우 탁한데, 이는 연마가 세포벽 단편 및 가용성 폴리사카라이드와 같은 미립자를 방출시킬 수 있기 때문이다. 이러한 탁한 오일의 정화는 원유를 보다 극성인 용매, 예를들면, 아세톤 또는 알콜에 용해시켜 수행할 수 있다. 바람직한 양태에서, 진균 균사체의 원유 추출물을 추가로 아세톤 추출/침전에 의해 정화한다. 아세톤 미스셀라는 아세톤을 탁한 원유 추출물 (바람직하게는 약 20% 오일 수준, 즉 약 4의 아세톤 용적/원유 용적)에 가하고, 철저히 혼합한 다음, 혼합물을 미립자의 침전에 충분한 시간 동안 (통상 실온에서 약 1시간) 방치시켜 제조한다. 오일 함유 아세톤 미스셀라는 원심분리 및/또는 여과에 의해 정화하고 탈용매화하여 아세톤-정화된 진균 오일을 제조한다. 아세톤-정화된 진균 오일은 진균 바이오매쓰의 추출동안 생성된 미립자가 아세톤 단계에서 제거되지 않는 경우 정제 공정을 방해하기 때문에 추가로 처리 (예: 통상의 기술에 의한 탈고무화, 표백 및 탈취)하는 것이 바람직하다.
또다른 바람직한 양태는 일반적으로는 식물성 오일을 추출하기 위해 사용되지는 않으나 진흙 및 토양을 추출하기 위해 고안된 시판되는 추출 단위 (Crown Ironworks 제조 (Crown Mark IV) 또는 French, Inc.제조)로 수행할 수 있는 건조 바이오매쓰의 역류 추출을 포함한다. 추출 효능이 바이오매쓰의 재연마 없이 높지 않으나, 역류 추출 방법은 보다 적은 “미립자”를 생성시켜 투명한 정제된 오일의 회수시 기술적 어려움을 저하시키는 이점을 갖는다.
또는 습윤 케이크 (통상 약 30 내지 50%의 고체 함유)를 분쇄하고 극성 용매, 예를 들면, 에탄올 또는 이소프로필 알콜을 사용하여 직접 추출하거나 CO2 또는 NO와 같은 용매를 사용하여 초임계 유체 추출할 수 있다. 바람직하게는, 케이크는 추출전에 분쇄한다. 유익하게는 본 발명은 초임계 유체 추출 기술의 경제적인 사용을 허락한다 [참조: McHugh, et al., Supercritical Fluid Extraction, Butterworth (1986)]. 이러한 기술은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있고 커피콩을 탈카페인화하는데 현재 적용되는 기술을 포함한다.
수성 추출의 바람직한 방법은 균사체 바이오매쓰를 극성 용매 이소프로필 알콜과 적합한 반응 케틀에서 혼합함을 포함한다. 바이오매쓰 1부당 용매 3 내지 6부의 사용이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 혼합은 질소하에 또는 산화방지제의 존재하에 수행하여 지질 추출물중 ARA의 산화를 방지한다. 본원에서 사용된 “지질 추출물”, “오일”, “지질 복합체” 및 “진균 오일”이 교호적으로 사용된다.
추출후, 혼합물을 여과하여 지질 추출물을 함유하는 용매로부터 바이오매쓰를 제거할 수 있다. 이때, 바이오매쓰는 회수하고 식품 보충제로서 사용할 수 있다. 본원에서 사용된 “식품 보충제”는 공급물 또는 동물에게 제공될 수 있는 통상의 공급은, 예를 들면, 그레인 등과 혼합될 첨가제를 의미한다.
용매는 지질 추출물로부터 분리하고 재사용하기 위해 적합한 수집기 속에서 증발시켜 회수할 수 있으며, 이때 잔류하는 것을 “원유”라 한다. 용매로서 이소프로필 알콜의 사용은 자발적으로 형성되는 물/이소프로필 알콜 공비물을 증발 제거하는 것과 같이 원유로부터 잔류수를 제거시킨다.
원유를 추가의 처리 없이 사용할 수 있으나, 추가 정제할 수 있다. 식물성 생성물로부터 레시틴 제조에 사용되고 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법은 추가의 정제 단계에서 사용할 수 있다. 이러한 방법은 ARA-함유 지질 또는 ARA 자체를 화학적으로 또는 공유적으로 개질시키지 않는다.
수율은 다양하나 통상 건조 균사체 100 g당 ARA 함유 인지질 약 5 g이다. 엠. 알피나의 경우, 건조 균사체 100 g당 트리글리세라이드를 추가적으로 10 내지 50 g을 수득할 수 있다. 원유 또는 정제된 생성물은 사람에게 투여하기 위해 사용할 수 있다. 둘다는 본원에 사용된 ARASCO의 정의내에 포함된다.
가장 바람직한 본 발명의 목적은 분유에서의 ARA의 농도가 사람의 모유에서의 ARA의 농도와 대략 근접하도록 사람의 분유에 사용하기 위한 첨가제를 제공하는 것이다. 표 2는 ARASCO가 결핍되거나 함유된 모유 및 분유에서의 지방산의 조성과 ARASCO에서의 지방산의 조성을 비교한다.
진균 오일 생성물 및 모유의 지방산 조성
지방산 ARASCO 분유1 분유 + 오일 모유
8:0 -- 24.1 23.6 0.35
10:0 -- 17.7 17.3 1.39
12:0 -- 14.9 14.6 6.99
14:0 4.6 5.8 5.8 7.96
16:0 16.0 6.8 7.0 19.80
16:1 3.2 0.2 0.3 3.20
18:0 -- 2.3 2.3 5.91
18:1 26.4 10.0 10.3 34.82
18:2n6 9.9 17.4 17.3 16.00
18:3n3 4.1 0.9 1.0 0.62
20:1 2.2 0.1 0.14 1.10
20:2n6 -- -- -- 0.61
20:3n6 1.4 -- 0.03 0.42
20:4n6 32.0 -- 0.64 0.59
20:5n3 -- -- -- 0.03
22:1 -- -- -- 0.10
22:4n6 -- -- -- 0.21
22:5n6 -- -- -- 0.22
22:6n3 -- -- -- 0.19
1 Simopoulis, A., Omega -3 Fatty Acids in Health and Disease , pp. 115-156 (1990)
나타낸 바와 같이, ARASCO에 의해 보충된 분유에 존재하는 ARA의 양은 사람의 모유에서의 ARA 수준과 대략 근접한다. 추가로, 분유의 총 지방산 조성은 ARASCO의 첨가에 의해 유의하게 변화되지 않았다. 통상적으로 분유 1ℓ당 ARASCO 약 50 내지 약 1000 mg을 사용할 수 있다. 요구되는 특정량의 ARASCO는 ARA의 함량에 좌우된다. 이는 오일중 약 10 내지 약 70%의 지방산으로 변할 수 있다. 그러나, 통상적으로는 ARA 함량은 약 30 내지 50%이다. 바람직하게는 분유 보충에 사용되는 오일은 ARA로서 40% 이상의 지방산 잔기, 바람직하게는 ARA 잔기로서 50% 이상을 함유한다. ARA 함량이 약 30%인 경우, 특히 바람직한 보충비는 분유 1ℓ당 ARASCO 약 600 내지 700 mg이다. 이러한 비는 ARASCO 1부 대 분유 오일 50부에 의해 분유 (예: SimilacR, Ross Laboratories, Columbus, Ohio)의 이미 존재하는 지방 성분을 희석한다. 유사한 희석비를 보다 높은 ARA 함량을 갖는 오일에 대하여 계산할 수 있다. 바람직하게는 ARASCO는 EPA를 실질적으로 함유하지 않는다.
피티엄 인시디오섬을 기술된 방법에 사용하는 경우, 추출된 ARA 함유 오일은 주로 인지질이다. 그러나, ARA 잔기가 높은 트리글리세라이드의 상당량이 본원에서 기술된 바와 같이 배양된 피. 인시디오섬으로부터 또한 회수될 수 있음을 발견했다. 모르티에렐라 알피나를 본 방법에 사용하는 경우, ARA 함유 오일은 주로 트리글리세라이드이다. 두 형태의 ARASCO는 분유 첨가제로서 유용하다. 전자는 ARA를 함유하는 분유 및 시판되는 분유에 통상적으로 가한 유화제, 즉 포스파티딜 콜린을 함유하는 분유를 제공한다. 엠. 알피나로부터의 오일은 생산하기에 보다 경제적이다.
본 발명의 ARA 함유 오일은 분유에 대한 첨가제로서의 이의 용도 이외에 많은 용도를 갖는다. 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 바와 같이, ARA 결핍과 관련된 대다수의 병리, 예를 들면, 소모증 (Vajreswari, et al., Metabolism 39 : 779- 782 (1990)], 아토피성 질환 [Melnik, B., Monatsschr , Kindertheilta, 138; 162-166 (1990)], 간질환, 페닐 케톤뇨증, 정신분열증, 지발성 안면마비 또는 각종 과산화소체성 장애이다. 본 발명의 한 양태에서, 이러한 병리는 약제학적으로 유효량의 본 발명의 오일을 투여하여 치료된다. 통상적으로, 약제학적 유효량은 환자의 ARA의 혈청 수준을 정상화시키는데 요구되는 양이다. 이러한 병리를 치료하기에 특히 바람직한 보충제는 위에서 기술한 ARA 함량이 높은 오일, 특히 ARA가 40% 이상인 오일 또는 보다 바람직하게는 50% ARA 잔기이다. 이러한 오일은 건강 보호 제공자에 의해 선택되는 바와 같이 경구, 국소 또는 비경구적으로 투여할 수 있다.
당해 분야의 숙련가에게 공지된 캡슐화는 경구 투여의 효과적인 방법이다. 진균 오일을 함유하는 캡슐은 ARA 식이 보충을 목적하거나 요구하는 사람에게 투여할 수 있다. 이러한 방법은 ARA를 임부 또는 수유부에게 투여하는데 특히 효과적이다.
ARASCO를 ARA 결핍 관련 병리를 방제하기 위해 투여하는 경우, 약제학적 유효량을 투여하여야 한다. 이의 양은 과도한 실험 없이도 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 통상적으로, 이의 양은 ARA의 혈청 수준을 통상 정상화하는 0.5 내지 2.0 g/일이다.
본 발명의 또다른 양태는 본원에 기술된 ARA 함량이 높은 오일과 같은 ARASCO 함유 향장 조성물을 포함한다. 향장 조성물은 향장품으로서 적용되는 화합물을 의미한다. 이러한 조성물의 바람직한 예는 링클 (wrinkle) 크림이다. 이러한 향장 조성물은 피부색 유지를 돕기 위해 피부에 ARA를 국소 적용하는 효과적인 수단을 제공한다.
본 발명에서는 EPA의 동시 제조 없이 ARA를 제조하는 경제적이고, 상업적으로 유용한 방법을 제공하고, 또한 분유에서의 ARA의 수준이 사람의 모유에서의 수준과 대략적으로 같도록 분유에 사용하기 위한 첨가제 및 이러한 첨가제에 대한 공급원을 제공한다.
본 발명이 일반적으로 기술되었으며, 다음의 구체적인 비-제한 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공된다.
실시예
실시예 1.
피. 인시디오섬 지질의 제조 및 분유로의 첨가
80ℓ(총용적)들이 발효기에서, 51ℓ의 수도물, 1.2 kg의 글루코즈, 240 g의 효모 추출물 및 15ml의 MAZU 210SR 소포제를 합한다. 발효기를 45분 동안 121℃에서 멸균한다. 추가로 5ℓ의 응축수를 멸균 과정동안에 첨가한다. pH를 6.2로 조정하고 약 1ℓ의 접종물 (5 내지 10 g/ℓ의 세포 농도)인 피티엄 인시디오섬 (ATCC #28251)을 첨가한다. 교반 속도를 125 RPM (250cm/초 선단 속도)으로 조정하고 통기율을 1 SCFM (표준 상태의 분당 기체의 체적)로 설정한다. 작동한지 24시간에 통기율을 3 SCFM으로 증가시킨다. 28시간에 2ℓ의 50% 글루코즈 시럽 (1 kg 글루코즈)을 첨가한다. 50시간에 발효기에서 발효물을 수거하여 ℓ당 약 2.2 kg 수율의 습윤 중량 (약 15 g의 건조 중량)을 수득한다. 수거된 바이오매쓰를 동결건조전에 흡입 필터상에서 높은 고체 케이크 (50% 고체)로 압착시킨다. 건조된 바이오매쓰를 모르타르 및 막자로 분쇄하고 2시간동안 계속적인 교반하에 실온에서 건조 바이오매쓰의 200 g당 1ℓ의 헥산으로 추출한다. 따라서 혼합물을 여과시키고 여액을 증발시켜 건조 바이오매쓰 100 g당 원유 약 5 내지 6 g을 수득한다. 이어서 바이오매쓰를 1시간 동안 실온에서 건조 바이오매쓰의 20 g당 1ℓ의 에탄올로 재추출하고 여과하며 용매를 증발시켜 건조 바이오매쓰 100 g당 원유 22 g을 추가로 수득한다. 제1 분획물이 인지질 및 트리글리세리드의 혼합물을 포함하는 반면에 제2 분획물은 주로 인지질이다. 혼합된 분획물은 약 30 내지 35% 아라키돈산 및 검출될 수 없는 EPA를 포함한 오일을 생산한다. 상기 오일을 준비된 배지의 ℓ당 60 mg의 보충율로 하여 시판되는 분유 SimilacR (Ross Laboratories, Columbus, Ohio)에 적가한다.
실시예 2
엠. 알피나 지질의 제조 및 분유로의 첨가
모르티에렐라 알피나 (ATCC #42430)를 1ℓ의 수도물 및 20 g의 감자 덱스트로즈 배지를 포함한 2ℓ의 진탕 플라스크에서 배양시킨다. 플라스크를 일정한 오비탈에서 교반시키고 7일 동안 25℃로 유지한다. 원심분리하여 수거한 후에 바이오매쓰를 동결 건조시켜 약 8 g의 지질이 풍부한 균사체를 수득한다. 상기 균사체를 실시예 1에서와 같이 헥산을 사용하여 추출하고 약 2.4 g의 원유를 수득한다. 상기 오일은 약 23%의 아라키돈산을 포함하고 ℓ당 1000 mg의 농도로 시판되는 분유 SimilacR에 적가한다.
실시예 3
엠. 알피나에 의한 아라키돈산의 대량생산
배지 GYE (50 g/ℓ 덱스트로즈 및 6 g/ℓ Tastone 154)를 포함하는 접종 발효기에 엠. 알피나를 접종한다. 발효 온도를 28℃, 초기 교반 130 내지 160cm/초, 초기 용기 압력 6psi 및 초기 교반 속도 0.25VVM으로 설정한다. pH를 멸균 이전에 5.0으로 조정하고 초기 발효 pH를 멸균후에 5.5로 설정한다. 배지를 8N NaOH를 사용하여 5.5이상의 pH를 유지한다. 산소 농도를 하기의 순서로 교반/통기를 조절함으로써 40%이상의 D.O.로 유지한다: 용기 압력을 11psi로 증가시키고; 175cm/초 임펠러 선단 속도로 교반을 증가시키며; 통기율을 0.5VVM으로 증가시킨다. Dow 1520-US 소포제를 필요한 만큼 첨가하여 발포체 형성을 조절한다 (소포제의 약 0.1ml/ℓ를 발포체 형성을 예방하기 위해 멸균 이전에 배지에 첨가하여야만 한다).
pH가 6.0 이상으로 상승된 후 12시간 내에 시드 발효기에서 주요 발효기로 접종물을 이전시킨다.
*주요 발효기는 GYE 배지 (50 g/ℓ 덱스트로즈 및 6 g/ℓ Tastone 154)를 포함한다: 글루코즈를 따로 멸균하고 멸균후에 주요 발효기에 첨가한다. 발효온도는 28℃, 초기 교반은 160cm/초, 초기 용기 압력은 6psi로 설정하고 초기 통기율은 0.15 VVM으로 설정한다. 초기 pH를 멸균후에 5.5로 설정하고 8N NaOH를 사용하여 pH를 5.5 이상으로 유지한다. pH는 정지기 (접종후 약 24시간 후에 시작)동안에 상승하지만 H2SO4를 첨가하여 pH 6.8 이하로 유지한다. 용기 압력을 점차적으로 11psi로 증가시키고 교반을 175cm/초 임펠러 선단 속도로 증가시키며 통기를 0.5VVM으로 증가시킴으로서 산소 농도를 40% 이상의 D.O.로 유지한다. Dow 1520-US 소포제를 필요한 만큼 첨가하여 발포체 형성을 조절한다 (소포제의 약 0.1ml/ℓ를 발포체 형성을 예방하기 위해 멸균 이전에 배지에 첨가하여야만 한다).
배양액을 바이오매쓰 및 지방산 분석을 위해 12시간 마다 샘플링하고 pH를 6.5로 상승시킨후에 3 내지 4일후에 수거한다. 건조 바이오매쓰 밀도는 8.5 g/ℓ 이상이어야만 한다. 브로쓰내의 글루코즈 농도는 50 g/ℓ에서 25 g/ℓ 이하로 감소한다. 수거에서 전체 배양 브로쓰를 바스켓 원심분리하여 소비된 배지로부터 균사체를 분리하고 바이오매쓰를 건조시킨다.
실시예 4
엠. 알피나에서 바이오매쓰의 개선된 수율- 1차 수행
실시예 3의 방법에 따라 엠. 알피나를 진탕 플라스크 배양물로부터 접종되는 20ℓ들이 교반식 탱크 발효기에서 배양한다. 65 g/ℓ 글루코즈 (Staleydex) 및 6 g/ℓ 효모 추출물 (Tastone 154)에서 엠. 알피나를 배양하여 12 g/ℓ 바이오매쓰를 생산한다. 16시간에 6g/ℓ Tastone 154를 추가로 첨가하여 18 g/ℓ 바이오매쓰를 생산한다.
실시예 5
엠. 알피나에서 바이오매쓰의 개선된 수율- 2차 수행
추가로 Tastone 154를 첨가함으로써 추가로 바이오매쓰를 증가시키기 위한 실험을 수행한다. 이들 실험은 2 × 20ℓ 발효, 168시간으로 구성된다. 이들 발효 모두를 위해 초기 글루코즈 농도는 100 g/ℓ(실시예 4의 65 g/ℓ와 비교)이다. 하나의 발효기는 첨가물인 Tastone 154의 3 × 6 g/ℓ를 수용하고 또 다른 발효기는 4 × 6 g/ℓ 첨가물을 수용한다. 효모 추출물은 농축용액으로서 구성되고 오토클레이브되며 멸균 후에 여러 시간에 걸쳐 발효기에 첨가된다.
접종물을 제조하기 위해 처리 시드 (1ml 냉침된 균사체)를 각각 50ml의 GYE 배지 (100 g/ℓ Staleydex, 6 g/ℓ Tastone 154)를 포함하는 2개의 플라스크에 접종하고 4일 동안 28℃, 150rpm에서 배양시킨다. 4일 배양후에 브로쓰는 펠렛화된 바이오매쓰를 포함하고 있다; 펠렛은 직경 2 내지 5mm이다. 이들 플라스크에서의 배양은 고농도의 글루코즈로 인해 예상되는 것보다 느리다. 바이오매쓰를 Waring 혼합기에서 2 × 3초 동안 냉침시키고 25ml의 냉침물을 사용하여 각각의 2 × 2.8ℓ Fernbach 접종 플라스크 (총 800ml 순 용적)를 접종한다 (초기 실험에서는 10ml의 냉침물이 사용되었다. 접종량은 시드 플라스크내의 보다 낮은 바이오매쓰의 농도 및 고농도의 글루코즈로 인한 Fernbach에서의 느린 성장이 예상되기 때문에 증가된다). Fernbach 플라스크내의 배지는 100 g/ℓ의 덱스트로즈 (Staleydex) 및 8 g/ℓ의 효모 추출물 (Tastone 154)이다. 덱스트로즈 및 효모 추출물을 40분 동안 따로 오토클레이브한다. 시드 배양 온도를 28℃로 유지하고 교반은 100rpm 내지 150rpm으로 한다.
Fernbach 플라스크에서 44시간 배양후에 접종물을 2 × 20ℓ 발효기로 이전한다. 접종물은 매우 느슨한 균사 응집체 형태로 있고 바이오매쓰 밀도는 약 5.2 g/ℓ이다.
1.6 kg (10%) 덱스트로즈 (Staleydex) 및 Mazu 소포제 (12.5ℓ R.O. H2O에 용해된 1.6 g)를 포함하는 스테이션 14 및 15에서의 발효기를 122℃에서 45분 동안 멸균한다. 800ml의 접종물 (5%)을 각각의 발효기 (0시간)에 첨가한다. 발효기 작동 계수는 다음과 같다:
온도: 28℃
pH: 2N NaOH 및 2N H2SO4를 사용하여 5.5로 조절
통기: 0.5VVM
백 압력: 0.2bar
교반 (초기): 80cm/초 및
D.O.: 40% 이상으로 조절
스테이션 14:
3 × 6 g/ℓ Tastone 154
효모 추출물 (Tastone 154)을 96 g/ℓ의 농도로 용해시키고 1시간 동안 오토클레이브한다. 3 × 1ℓ의 양 (1.8%)으로 효모 추출물을 0, 20 및 26시간에 공급한다.
15시간에, DO가 40% 이하로 떨어지고 교반을 15 내지 22시간 동안 점차적으로 175cm/초로 증가시킨다. 이어서 DO는 산소를 사용하여 기류를 수정함으로써 조절한다. 23 내지 72시간에 산소를 기류에 첨가한다. 36시간에 시작하여 적당한 혼합이 되도록 추가로 교반을 증가시킨다. 48시간에 교반을 200cm/초로 증가시키고 72시간에 250cm/초 및 80시간에 280cm/초로 증가시킨다. 120시간에 적당한 온도 조절을 촉진시키기 위해 교반을 290cm/초로 증가시킨다. 144시간에 교반을 280cm/초로 감소시킨다.
스테이션 15:
4 × 6 g/L Tastone 154
효모 추출물 (Tastone 154) 384 g을 96 g/ℓ의 농도로 용해시키고 1시간 동안 오토클레이브한다. 4 × 1L의 양 (2.4%)으로 효모 추출물을 0, 20, 26 및 32시간에 첨가한다.
16시간에, DO가 40% 이하로 떨어지고 교반을 23시간에 점차적으로 175cm/초로 증가시킨다. 이어서 DO는 산소를 사용하여 기류를 수정함으로써 조절한다. 23 내지 72시간에 산소를 기류에 첨가한다. 36시간에 시작하여 적당한 혼합이 되도록 추가로 교반을 증가시킨다. 48시간에 교반을 210cm/초로 증가시키고 72시간에 260cm/초 및 80시간에 290cm/초로 증가시킨다. 90시간에 교반을 280cm/초로 감소시키고, 144시간에 교반을 260cm/초로 감소시킨다.
관찰:
접종시, 2개의 발효기의 바이오매쓰는 매우 느슨하고 경박한 균사 응집체의 형태로 있다. 24시간에 펠렛이 형성되기 시작한다. 펠렛은 작은 중앙 코아 및 넓고 느슨한 가장자리를 가진 작은 (1 내지 3mm) 펠렛이다. 48시간에 펠렛은 보다 커지고 보다 명확해진다. 72시간에 가장자리는 좁아지고 많은 느슨한 균사 단편의 존재는 펠렛이 단편화된다는 것을 지적한다. 168시간에 펠렛 코아는 직경 0.5 내지 2mm이고 가장자리는 두터운 스트랜드로 응집하는 균사체와 함께 감소되며 거기에는 많은 응축된 균사 응집체가 있다.
발효기에서 처음 24시간 동안에 발포체가 약간 형성된다. 그 후 발포체 형성량이 증가하고 발포체의 높이가 2 내지 4㎝ 이상일 경우 수동으로 소포제를 첨가한다. 산발적인 발생이 있지만, 48시간 쯤 발포체가 어느정도 가라 않는다. 발효 과정동안 양 발효기의 출구 필터에서 발포체가 형성된다. 발효시 약 150ml의 소포제가 필요하다.
양 발효기의 윗 공간에 상당량의 생성 바이오매쓰가 축적된다. 이는 넓은 표면적/용적 비를 갖는 소형의 발효기에서 균사체 발효의 보기 드문 문제는 아니다. 낮아진 용적 수위의 결과로 상당한 양의 스플래싱 (액체 수위가 상부 임펠러에 닿는다)을 일으킬 경우 Stn 15의 생성 바이오매쓰는 마지막 24시간 동안 증가됨을 보인다. 168시간 후에 발효기의 최종 용적은 약 13ℓ이다.
미시적 조사에서는 72시간쯤 많은 조각이 배양 브로쓰에 존재함을 보이고, 손상되고 위축된 진균 팁의 증거를 갖는다. 세포질에 존재하는 오일 소적은 168시간에 나일 레드염색으로 나타난다. 오일 소적은 매우 작고, 많은 반면 때때로 큰 오일 소적이 보이기도 한다. 탄소 및 질소 이용과 함께 바이오매쓰 및 오일 수율을 표 3에 나타낸다.
Stn 14
3 ×6g/l 효모추출물
로그 시간 글루코즈 NH3 건조 중량 오일 함량 ARA 함량 생산성
(g/l) (mM) (g/l) (건조 중량%) (오일중 %) (g오일/l/d)
0 105.0 3.0 0.4
24 97.4 5.9 3.3 4.8 % 23.5 % 0.16
48 73.7 0 18.3 7.9 % 23.4 % 0.72
72 60.3 0 21.0 14.4 % 25.4 % 1.01
96 48.0 0 22.3 18.8 % 27.5 % 1.02
120 40.0 25.2 21.1 % 29.4 % 1.06
144 34.7 26.6 21.8 % 30.9 % 0.97
168 29.0 27.5 26.1 % 31.3 % 1.03
Stn 15
4 ×6g/l 효모추출물
로그 시간 글루코즈 NH3 건조 중량 오일 함량 ARA 함량 생산성
(g/l) (mM) (g/l) (건조 중량%) (오일중 %) (g오일/l/d)
0 109.0 2.9 0.4
24 103.0 5.1 3.4 4.3 % 21.9 % 0.15
48 74.1 0.3 23.6 6.8 % 23.1 % 0.80
72 51.4 0 29.8 10.3 % 23.9 % 1.02
96 40.0 0 32.7
120 27.9 31.7 18.2 % 26.6 % 1.15
144 19.8 33.5 20.7 % 28.1 % 1.16
168 11.0 29.9 21.7 % 29.9 % 0.93
실시예 6
엠. 알피나로부터 바이오매쓰의 개선된 수율- 3차 수행
이번 실험은 포스페이트 및 무기질 수준 증가에 의해 수득할 생성물의 양을 추가로 증가시키려고 시도한다. 덱스트로즈 및 Mazu 204 소포제를 R.O. H2O 12.5ℓ 보다는 11.5ℓ에 용해시키고, 상온에서 정치한후 30분쯤에 염용액을 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 5와 유사한 방법으로 수행한다. Stn 14는 추가의 Fe, Zn 및 Cu를 얻고, Stn 15는 Fe, Zn 및 Cu 이외에도 추가의 포스페이트를 얻는다.
스테이션 14:
3 × 6 g/ℓ Tastone 154
3 × 1ℓ 양 중에 효모 추출물을 96 g/ℓ로 용해시키고, 1시간 동안 오토클레이브한다. 0, 22, 28시간에서 효모 추출물 용액 1ℓ 분취량을 첨가하고, 22 및 28시간에 이산화탄소 주입율 (CER, 발효기에서 대사율의 지표)은 대수적으로 증가하고, 발효가 시작되면 기준화한다.
염 공급물은 다음을 함유한다:
FeCl3 6H2O 4 8 0
㎎
ZnSO4 7H2O 2 4 0
㎎
CuSO4 5H2O 1 6
㎎
5 g/ℓ 시트르산 1ℓ 중에 FeCl3를 용해시킨다. 잔류의 염을 첨가하고 pH를 NaOH를 이용하여 4.5로 맞춘다. 용액을 1시간 동안 오토클레이브한다. 30시간에 염 공급물을 첨가한다.
발효기에서 초기 교반 속도는 원래 계획된 대로 80㎝/초 보다 50㎝/초인데, 이는 발효기 (13ℓ) 안의 초기 액체 수위가 상부 임펠러를 간신히 침지시키며, 높은 교반 속도는 상당히 많은 스플래싱을 일으키기 때문이다. 16시간에 D.O.는 40% 이하로 떨어지고, 교반은 28시간쯤 점진적으로 175㎝/초로 증가한다. 그 후 D.O.는 산소로 기류를 바꿈으로써 40% 이상으로 조절된다. 46시간에 혼합하기 위해 교반을 190㎝/초로 증가한다. 교반을 추가로 48시간쯤 200㎝/초로, 51시간쯤 220㎝/초로, 53시간쯤 235㎝/초로, 56시간쯤 250㎝/초로, 57시간쯤 260㎝/초로, 70시간쯤 280㎝/초로 증가시킨다. 이러한 교반 속도 (450rpm)에서 혼합은 불량하다. ‘일부 움직임’의 최소한의 기준을 유지하는 동안 바이오매쓰의 턴오버 (turnover)는 매우 느려지고, 일부 부분은 정체에 이른다. 소량의 소포제의 첨가는 발포체의 높이를 줄이고, 정체된 포켓을 제거한다. 116 시간에 교반을 265㎝/초로 줄이고, 120시간에 추가로 250㎝/초로 줄인다.
발효기는 약 18시간부터 발포체를 형성한다. 발포체 형성은 수동으로 소포제를 첨가함으로써 조절한다. 소포제를 처음 20시간에 첨가한다. 24시간쯤 발효에서 발포체가 형성되고, 정기적 소포제의 첨가를 필요로 한다. 72시간쯤 대부분의 발포체 형성이 가라앉는다. 그러나 발효에는 아직도 정기적 소포제의 첨가를 필요로 한다.
24시간쯤 바이오매쓰는 매우 느슨한 펠렛 (1 내지 2mm) 및 느슨한 균사 응집체로 형성된다. 상당한 양의 세포 조각이 있다. 48시간쯤 바이오매쓰는 느슨한 균사 응집체, 매우 작은 코어 및 느슨한 주변부를 갖는 매우 작은 펠렛 (1 내지 2mm), 느슨한 주변부가 없는 작은 압착 펠렛 (1 내지 3mm)으로 형성된다. 96시간쯤 바이오매쓰는 원형의 압착 펠렛 (1 내지 2mm), 바늘형의 펠렛 (0.5mm 이하) 및 느슨한 균사 응집체로 형성된다. 144시간에 나일 레드 염색은 균사체 안에 작고 많은 오일 소적을 보인다.
스테이션 15:
3×6 g/ℓ Tastone 154
효모 추출물을 96 g/ℓ로 용해시키고, 1시간 동안 오토클레이브한다. 0, 22, 26시간에서 3×1ℓ 중에 효모 추출물 용액을 첨가하고, 22 및 26 시간에 CER은 대수적으로 증가하고, 발효가 시작되면 기준화한다.
다음을 함유하는 염 공급물을 제조한다:
KH2PO4 7 7
g
FeCl3 6H2O 4 8 0
㎎
ZnSO4 7H2O 2 4 0
㎎
CuSO4 5H2O 1 6
㎎
5 g/ℓ 시트르산 500ml 중에 FeCl3를 용해시킨다. 잔류의 염을 첨가하고 pH를 NaOH를 이용하여 4.5로 맞춘다. KH2PO4를 R.O 수 500ml중에 용해시킨다. 두 용액을 1시간 동안 오토클레이브하고, 30시간에 발효기에 배합 및 첨가하기 전에 23℃로 냉각한다.
발효기에서 초기 교반 속도는, 원래 계획된 대로 80㎝/초 보다 50㎝/초인데, 이는 발효기 (13ℓ) 안의 초기 용액 수위가 상부 임펠러를 간신히 침지시키고, 높은 교반 속도는 상당히 많은 스플래싱을 일으키기 때문이다. 16시간에 D.O.는 40% 이하로 떨어지고, 교반은 27시간쯤 점진적으로 175㎝/초로 증가한다. 그 후 D.O.는 산소로 기류를 바꿈으로써 40% 이상으로 조절한다. 41시간에 최소한 소량의 혼합을 위해 교반을 200㎝/초로 증가한다. 교반을 추가로 42시간쯤 220㎝/초로, 46시간쯤 230㎝/초로, 51시간쯤 235㎝/초로, 70시간쯤 240㎝/초로 증가시킨다. 이 교반속도 (410rpm)에서 혼합은 불량하다. 최소한 수준의 바이오매쓰의 움직임을 유지한다. 80시간에 교반속도를 205㎝/초로 감소시킨다.
발효가 시작된 후 18시간에 발포체가 형성된다. 발포체 형성은 수동으로 소포제를 첨가함으로써 조절된다. 소포제는 처음 17시간에 첨가된다. 20시간쯤 발효는 상당한 발포체를 형성하고 정기적으로 소포제를 첨가할 필요가 있다. 발포체 형성은 주로 72시간쯤 가라앉는다. 그러나 그 이후의 발효시에도 수시로 소포제를 첨가할 필요가 있다.
24시간쯤 바이오매쓰는 느슨한 펠렛 (1 내지 2mm) 및 느슨한 균사 응집체로 형성된다. 상당한 양의 세포 조각이 있다. 48시간쯤 바이오매쓰는 느슨한 균사 응집체, 매우 작은 코어 및 느슨한 주변부를 갖는 매우 작은 펠렛 (1 내지 2mm), 느슨한 주변부가 없는 작은 압착 펠렛 (1 내지 3mm)의 형태이다. 96시간쯤 바이오매쓰는 다수의 느슨하고, 모발형의 주변부를 갖는 직경 1 내지 2mm의 원형의 펠렛 (1 내지 2mm) 및 다수의 느슨한 균사 단편으로 형성된다. 144시간에 나일 레드 염색은 일부 균사체 안에 매우 작고 많은 오일 소적과 또한 다른 균사체를 통해서 매우 큰 오일 소적을 보인다.
Stn 15는 Stn 14과 포스페이트를 첨가한다는 것만이 다르다. 일반적으로 낮은 교반 속도에서 발효를 통해 더 좋은 혼합을 보인다. Stn 15는 더 느슨한 바이오매쓰 성상을 보인다. 탄소 이용율 이외에 바이오매쓰 및 오일 수율은 표 4에 나타내었다. 더 높은 글루코즈 이용율 (Stn 15의 82 g/ℓ와 Stn 14의 64 g/ℓ 비교), 더 높은 바이오매쓰 축적 및 균사체 부분에 큰 오일 소적의 존재는 더 많은 포스페이트를 함유하고 있는 발효기의 특징이다.
Stn 14
+ 염
로그 시간 글루코즈 건조 중량 오일 함량 ARA 함량 생산성
(g/l) (g/l) (건조 중량%) (오일중 %) (g오일/l/d)
0 116.0 1.1
24 101.0 1.8 1.2 % 22.2 % 0.02
48 84.0 14.3 6.2 % 24.7 % 0.44
72 60.0 24.5 10.6 % 24.2 % 0.87
96 45.0 28.2 15.5 % 25.3 % 1.09
120 34.0 28.9 18.1 % 26.6 % 1.05
144 30.8 20.8 % 27.2 % 1.07
Stn 15
+ 염 + 포스페이트
로그 시간 글루코즈 건조 중량 오일 함량 ARA 함량 생산성
(g/l) (g/l) (건조 중량%) (오일중 %) (g오일/l/d)
0 113.0 0.4
24 101.0 2.1 1.1 % 24.0 % 0.02
48 74.0 21.7 8.1 % 24.7 % 0.88
72 51.0 26.2 19.9 % 26.5 % 1.74
96 31.0 30.1 25.5 % 28.6 %
120 18.0 33.8 31.7 % 31.4 % 2.14
144 6.0 34.5 36.0 % 32.9 % 2.07
실시예 7
아라키돈산을 함유한 엠. 알피나 바이오매쓰의 대량 생산
GYE 배지 (텍스트로즈 50 g/ℓ, Tastone 154 6 g/ℓ)를 함유하는 시드 발효기를 증식 발효기로부터 접종한다. 온도 28℃를 유지하고, 초기 교반 속도를 130 내지 160㎝/초 (약 43rpm)로 정한다. 초기 용기 압력은 6psi이고, 초기 통기율은 0.25VVM으로 정한다. 멸균하기 전에 pH를 5.0으로 맞추고, 초기 발효기 pH는 멸균한 후에 5.5로 맞춘다. 배지내의 산소 농도는 (1) 용기 압력을 11psi로 증가시키고, (2) 교반을 156 내지 175㎝/초 임펠러 선단 속도로 증가시키고, (3) 통기율을 0.5VVM으로 증가시켜 D.O. ≥ 40%를 유지한다. 발포체 형성은 필요에 따라 소포제 DOW 1520-US를 첨가함으로써 조절한다 (발포체 형성을 방지하기 위한 소포제 약 0.1ml/ℓ는 멸균하기 전에 배지에 첨가해야 한다). 접종한 후 배양액은 8N NaOH로 pH≥5.5로 유지한다.
pH가 6.0으로 상승한 후 12시간 이내에 시드 발효기의 내용물을 주요 발효기로 옮긴다. 주요 발효기의 배지 조성은 다음과 같다.
80 g/ℓ 덱스트로즈 (ADM),
16 g/ℓ 콩가루 (ADM nutrisoy)
30 mg/ℓ FeCl3·6H2O (Sigma/Aldrich)
1.5 mg/ℓ ZnSO4·7H2O (Sigma/Aldrich)
0.1 mg/ℓ CuSO4·5H2O (Sigma/Aldrich)
1 mg/ℓ 바이오틴 (Sigma/Aldrich)
2 mg/ℓ 티아민·HCl (Sigma/Aldrich)
2 mg/ℓ 판토텐산 (헤미칼슘 염) (Sigma/Aldrich)
(멸균하기 전에 pH를 4.8 내지 5.0으로 조정한다.)
시드 발효기 (11.8%)로 주요 발효기를 접종한다. 발효기 온도는 28℃로 유지한다. 초기 교반율은 162㎝/초 (약 23rpm)으로 고정하고, 초기 용기 압력은 6psi이고, 초기 통기율은 0.15VVM (약 300scfh)이다.
배지중의 산소 농도는 1) 발효기 압력을 11psi로 증가시키고, 2) 교반을 300㎝/초 임펠러 선단 속도 (약 30㎝/초 증분)로 증가시키고, 3) 통기율을 0.5VVM으로 증가시켜 D.O.를 40% 이상으로 유지시킨다.
pH는 하기의 pH 조절 프로토콜에 따라서 조정한다.
○멸균하기 전에 초기 pH를 5.5로 맞춘다. 8N NaOH로 pH≥5.5로 유지한다.
*○접종 후 24 내지 36시간에 2 g/ℓ KH2PO4 (약 700ℓ H2O중에 110 kg)을 첨가한다.
○덱스트로즈 농도 ≤ 60 g/ℓ일 경우 48 시간에 pH 고정점 ≥6.1로 변화시킨다.
○72시간에 pH 고정점을 6.6에서 시작하여 시간당 pH 약 0.1의 속도로 천천히 증가시킨다.
○필요한 경우 H2SO4를 사용하여 pH 7.3 이하로 유지한다.
발효기로부터 12시간 마다 바이오매쓰 및 지방산 분석을 위해 샘플링하여, pH ≥6.6으로 증가시킨 후 (접종 후 약 6일) 약 3일 동안 수거를 시작한다. 건조 바이오매쓰 밀도는 ≥ 24 g/ℓ이다. 브로쓰의 덱스트로즈 농도는 80 g/ℓ에서 ≤14g/ℓ로 떨어뜨린다.
수거는 전 배양 브로쓰를 회전 진공 필터를 통과시켜 소비된 배지로부터 균사체를 분리한다.
본 실시예 방법에 따라서 2개의 전형적인 발효를 수행한 결과를 표 5와 표 6에 나타낸다.
엠. 알피나의 발효 경과
배양 배지 = 글루코즈 (80g/l) + 콩가루 (16g/l) + 염 + 비타민
로그 시간 글루코즈
(g/ℓ)		 NH3
(mM)		 건조 중량
(g/ℓ)		 오일 함량
(건조 중량%)		 ARA 함량
(오일중 %)		 생산성
(g 오일/ℓ/d)
0 58.0
66 43.0 12.6 14.9% 33.7% 0.68
94 33.0 17.0 27.0% 40.0% 1.17
118 23.0 20.6 28.2% 42.6% 1.18
142 16.0 17.1 39.2% 44.2% 1.13
165 9.6 21.5 41.5% 45.5% 1.30
188 5.2 19.8 41.7% 47.3% 1.05
215 1.7 23.2 46.0% 48.9% 1.19
237 0.2 23.1 44.8% 51.2% 1.05
엠. 알피나의 발효 경과
배양 배지 = 글루코즈 (65g/l) + 콩가루 (16g/l) + 염 + 비타민 + 항생제
로그 시간 글루코즈
(g/ℓ)		 NH3
(mM)		 건조 중량
(g/ℓ)		 오일 함량
(건조 중량%)		 ARA 함량
(오일중 %)		 생산성
(g 오일/ℓ/d)
0
65 36.0 13.0 8.2% 29.0% 0.39
90 23.0 12.0 18.0% 42.0% 0.58
115 15.0 14.0 30.0% 47.0% 0.88
139 9.0 15.0 32.0% 51.0% 0.83
171 4.0 17.0 36.0% 55.0% 0.86
209 1.4 12.0 36.0% 57.0% 0.50
243 0 14 37.0% 60.0% 0.51
187 0 13 34.0% 64.0% 0.57

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  1. 분유에 대한 첨가제로서의 아라키돈산 함유 오일의 용도.
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