DE69627816T2

DE69627816T2 - Arachidonsaure und verfahren zu ihrer herstellung sowie verwendung derselben

Info

Publication number: DE69627816T2
Application number: DE69627816T
Authority: DE
Inventors: David J. Kyle
Original assignee: Martek Biosciences Corp
Current assignee: Martek Biosciences Corp
Priority date: 1995-01-03
Filing date: 1996-01-03
Publication date: 2004-01-22
Anticipated expiration: 2016-01-04
Also published as: KR20120073363A; EP0800584B1; NO973085L; EP2322642A3; CN1175976B; KR20060096168A; BR9607179A; CN1175976A; JP4014219B2; JPH10512444A; EP1342787A2; EP0800584A1; CN102399831A; AU713567B2; PT800584E; EP2322641A3; KR20140114068A; EP2322641A2; CN101560529A; CN101560529B

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Arachidonsäureenthaltenden Öls, ein unmodifiziertes Pilz-Triglyceridöl, das Arachidonsäure enthält, und Verwendungen dieses Öls.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Arachidonsäure (ARA) ist eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA) der Omega-6-Klasse (5,8,11,14-Eicosatetraensäure, d.h. 20 : 4). ARA ist die am reichlichsten vorhandene C₂₀-PUFA im menschlichen Körper. Sie ist besonders häufig in Organ-, Muskel- und Blutgeweben und spielt eine Hauptrolle als ein Strukturlipid, das hauptsächlich mit Phospholipiden in Blut-, Leber-, Muskelsystemen und anderen Organsystemen assoziiert ist. Zusätzlich zu deren Hauptrolle als Strukturlipid ist ARA auch der direkte Vorläufer für eine Vielzahl zirkulierender Eicosenoide, wie Prostaglandin E₂ (PGE₂), Prostacyclin I₂ (PGI₁), Thromboxan A₂ (T_xA₂) und Leukotrienen B₄ (LTB₄) und C₄ (LTC₄). Diese Eicosenoide zeigen regulatorische Wirkungen auf den Lipoproteinmetabolismus, die Blutrheologie, den Gefäßtonus, die Leukozytenwirkung und die Plättchenaktivierung.
Trotz dessen Bedeutung für den menschlichen Metabolismus, kann ARA in Menschen nicht de novo hergestellt werden. ARA wird durch Verlängerung und Entsättigung von Linolsäure (LOA), einer essentiellen Fettsäure, hergestellt. Dieses Verfahren erfordert die Anwesenheit des Enzyms Δ6-Desaturase, ein Enzym, das im menschlichen Körper in einem niedrigen Niveau bzw. Anteil vorhanden ist (Burre et al., Lipids, 25: 354–356 (1990)). Demgemäß muss das meiste ARA in einer Diät zugeführt werden und dies ist insbesondere während den Zeiten eines sehr raschen Körperwachstums, wie in der Kindheit, von Bedeutung.
Während seines ersten Lebensjahres kann ein Kind sein Gewicht verdoppeln oder verdreifachen. Demgemäß sind erhöhte Niveaus von diätetischem ARA erforderlich. Um dieser erhöhten Anforderung zu genügen, enthält die Milch der menschlichen Brust ein hohes Niveau an ARA (Sanders et al., Am. J. Clin. Nutr., 31: 805–813 (1978)). ARA ist die häufigste C₂₀-PUFA in Brustmilch. Unter solchen Müttern, insbesondere Vegetarierinnen, die ihre Kinder stillen, würden viele von zusätzlichem diätetischen ARA profitieren. Viele Mütter stillen ihre Kinder jedoch nicht oder stillen nicht über den gesamten Zeitraum des raschen Wachstums eines Kleinkindes und wählen statt dessen die Verwendung von Säuglingsnahrung.
Keine der Anmelderin bekannte, im Handel erhältliche Säuglingsnahrung enthält ARA in Triglycerid-Form. Das U.S.-Patent Nr. 4,670,285 (Clandinin et al.) beschreibt den Bedarf eines Kindes für Fettsäuren, einschließlich ARA. Um diese Fettsäuren bereitzustellen, schlagen Clandinin et al. ein Gemisch von Eigelb, Fischöl oder Phospholipiden aus roten Blutzellen und Pflanzenöle als Fettkomponente einer vorgeschlagenen Säuglingsnahrung vor.
Fischöl enthält jedoch eine große Menge an Eicosapentaensäure (EPA). EPA ist für die Unterdrückung der ARA-Synthese in Kleinkindern bzw. Säuglingen bekannt (Carlson et al., INFORM, 1: 306 (1990)). Daher wäre es wünschenswert, in der Lage zu sein, ARA ohne zusätzliches EPA bereitzustellen. Ferner enthält Eigelb eine relativ geringe Konzentration an ARA, so dass Clandinin et al.'s Gemisch nicht wirtschaflich überlebensfähig ist.
Weil ARA in Tieren, nicht aber in Pflanzenölen vorhanden ist, blieb dessen Herstellung in kommerziellen Mengen ein wünschenswertes, aber schwer zu erreichendes Ziel. Shinmen et al. (Microbiol. Biotech. 31: 11–16 (1989)) haben die Herstellung von ARA durch einen isolierten Pilz, Mortierella alpina, unter Verwendung einer üblichen Fermentation in einem gerührten Gefäß beschrieben (siehe auch das japanische Patent 1,215,245 von Shinmen et al.). Nach dem Kultivieren wurden die Organismen geerntet und getrocknet. Deren Lipide wurden aus der Pilz-Biomasse mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und die Lipide wurden chemisch (kovalent) modifiziert. Beispielsweise wurde das Lipidgemisch hydrolysiert oder in Ethylester überführt und anschließend mit Cyclodextrin vor der Verwendung als diätetischer Zusatz vereint. Shinmen et al. beschreiben nicht oder legen auch nicht die Verabreichung von unmodifizierten mikrobiellen Ölen nahe.
Porphyridium cruentum, eine rote Mikroalge, kann in Teichen in großen Mengen gezüchtet werden und weist einen Lipidgehalt auf, der bis zu 40% ARA betragen kann (Ahern et al., Biotech. Bioeng., 25: 1057–1070 (1983)). Unglücklicherweise ist ARA hauptsächlich mit Galactolipiden assoziiert, einem komplexen polaren Lipid, das in der Brustmilch nicht vorhanden ist. Daher ist nicht nur das gesamte verwendbare ARA, hergestellt in einem Anteil von einem Prozent der Biomasse, sondern auch die Form des ARA nicht ohne weitere Modifizierung für eine Verwendung als Additiv in Säuglingsnahrung geeignet.
Das U.S.-Patent Nr. 4,870,011 (Suzuki et al.) beschreibt ein Verfahren zum Erhalten von Lipiden, wie γ-Linolensäure, aus Pilzen der Gattung Mortierella. Die γ-Linolensäure wird aus dem Gemisch der Lipide, die in dem Pilz enthalten sind, gereinigt.
DE 3603000A1 (Milupa) beschreibt ein Gemisch von mehrfach ungesättigten Fettsäuren und dessen Verwendung als Fettkomponente von Säuglingsnahrung. Das Fettgemisch weist einen hohen Anteil von ARA bzw. Docosahexansäure (DHA) in einem Verhältnis von 2,5 : 1, genauso wie einen hohen Anteil an Cholesterin auf. Die Quellen der Fettsäuren sind als bestimmte Arten von Makroalgen, Fischölen, Organfetten von Rind und Schwein oder hochraffiniertem Eigelböl aufgeführt. Eine Quelle des DHA und ARA sind Makroalgen vom Phaecophyt- und Rhodophyt-Typ. Es gibt keine Anregung, irgendwelche Mikroben als Quelle für das Öl zu verwenden. Algen- und Fischöle schließen typischerweise auch EPA ein, was die ARA-Synthese in vivo unterdrückt. Zusätzlich ist hochraffiniertes Eigelböl keine wirtschaftliche Quelle für ARA. Ferner ist darin kein ARA-konzentriertes Additiv für das Zusetzen in bereits bestehende Säuglingsnahrung beschrieben.
WO 92/13086 beschreibt die Herstellung und Verwendung von Pilzölen aus Pythium insidiosum als Additive für Säuglingsnahrung. Die Öle enthalten 30–35% Arachidonsäure und keine nachweisbare Eicosapentaensäure.
H. Yamada et al. beschreiben in "Industrial Applications of Single Cell Oils", D. Kyle et al., Hrsg., AOCS, Champaign, IL, Seiten 118–138 (1992) die Verwendung von Pilzmikroorganismen, insbesondere Mortierella alpina, für die Herstellung von ARA, EPA und anderen mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Pilzöle, die bis zu etwa 65% ARA enthalten, sind beschrieben.
Demgemäß besteht ein Bedarf für ein wirtschaftliches, kommerziell durchführbares Verfahren zur Herstellung von ARA, vorzugsweise ohne die gleichzeitige Herstellung von EPA. Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung diesen Bedarf zu befriedigen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Additiv und eine Quelle für das Additiv für eine Verwendung in Säuglingsnahrung bereitzustellen, so dass die ARA-Niveaus in der Nahrung ungefähr den Niveaus in menschlicher Brustmilch entsprechen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein ARA-enthaltendes Pilzöl für die Verwendung in enteralen, parenteralen oder dermalen Produkten bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung von Arachidonsäure-enthaltendem Pilzöl (ARASCO) und diese Öle enthaltende Zusammensetzungen. Das Öl kann als ein Einzelleröl bezeichnet werden. Pilze werden unter Ölproduzierenden Bedingungen kultiviert, geerntet und das Öl wird extrahiert und gewonnen. Das Öl kann ohne weitere chemische Modifizierung direkt verwendet werden, um zusätzliches ARA für Personen mit einem derartigen Bedarf, einschließlich neugeborener Säuglinge, schwangere oder stillende Frauen oder Personen, die ARA-Mangelkrankheitszustände bzw. -pathologien zeigen, bereitzustellen. Die Vorteile der Erfindung schließen dessen einfache Herstellung, hohe Reinheit und das Fehlen von nachweisbaren Mengen von EPA ein.
Die vorliegende Erfindung stellt bereit:
ein Verfahren zur Herstellung eines Arachidonsäure-(ARA)-enthaltenden Öls, wie in Anspruch 1 definiert;
ein unmodifiziertes Pilz-Triglyceridöl, wie in Anspruch 8 definiert;
ein Verfahren zum Versorgen von Säuglingsnahrung mit Triglycerid, das ARA enthält, wie in Anspruch 10 definiert;
eine Säuglingsnahrung, umfassend ein Triglycerid, das ARA enthält, wie in Anspruch 11 definiert;
ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Versorgung mit zusätzlicher ARA, wie in Anspruch 12 definiert; und
eine kosmetische Zusammensetzung, wie in Anspruch 22 definiert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
"ARA" und "EPA" werden hier auch verwendet, um auf Reste der Arachidonsäure bzw. Eicosapentaensäure, wobei die Reste mit Glycerin als Teil eines Fettacyltriglycerids oder eines Phospholipids verestert sind, zu verweisen. Wie hier verwendet, ist eine Zusammensetzung "im wesentlichen frei von EPA", wenn die restliche Menge von EPA in der Zusammensetzung weniger als die Menge beträgt, die die ARA-Synthese unterdrücken würde, wenn die Zusammensetzung als Nahrungsergänzungsmittel verwendet wird. Die vorliegende Erfindung ist erfolgreich im Bereitstellen einer wirtschaftlichen Quelle von Arachidonsäure (ARA).
In einer Ausführungsform betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Arachidonsäure-enthaltenden Pilzöls (ARASCO), das im wesentlichen frei von Eicosapentaensäure (EPA) ist. Der hier verwendete Ausdruck "im wesentlichen frei" bedeutet, dass EPA in weniger als etwa einem Fünftel der Menge von ARA in dem Öl vorhanden ist. Dieses Öl, ein Einzelleröl, kann direkt in unmodifizierter Form verabreicht werden. Der hier verwendete Ausdruck "unmodifiziert" bedeutet, dass die chemischen Eigenschaften der Fettsäuren oder der Öle selbst nicht kovalent verändert werden. Daher würde beispielsweise eine temporäre Modifizierung von ARASCO oder ARA, die nach der Aufnahme des Öls umgekehrt werden könnte, nicht über den Umfang dieser Erfindung hinausgehen.
Unmodifizerte Pilzöle gemäß dieser Erfindung stellen Triglyceride bereit, wobei ein relativ hoher Anteil an Fettsäureresten ARA sind (mindestens 50% der Reste sind ARA), und das Verhältnis von ARA-Resten zu EPA-Resten ist auch hoch (mindestens 10 : 1, vorzugsweise mindestens 20 : 1, w/w bzw. Gew./Gew.). Ein derartiges Öl aus natürlichen Quellen wurde vor der vorliegenden Erfindung nicht beschrieben. Während Triglyceride mit einer derartigen Zusammensetzung chemisch synthetisiert werden können (beispielsweise durch Veresterung von Gemischen freier Fettsäuren mit hohem ARA-Gehalt oder Umesterung mit Ethylestern eines Gemischs einer derartigen Fettsäure), kann die Manipulierung des Fettsäuregemisches (beispielsweise Reinigung, Veresterung, etc.) unerwünschte Nebenprodukte hervorrufen. Im Gegensatz dazu stellt das Verfahren dieser Erfindung Triglyceride mit erwünschter Zusammensetzung durch Extraktion aus natürlichen Quellen bereit.
Für diese Pilzspezies, deren Fettsäuren vorher charakterisiert wurden, wurde festgestellt, dass die meisten kein ARA bilden (Weete, J.D., Fungal Lipid Biochemistry, Plenum Press, N.Y. (1974)). Unter diesen Spezies, die kein ARA bilden, stellen viele, einschließlich aller vorher charakterisierten Pythium-Spezies, zusätzlich zu ARA signifikante Mengen an Eicosapentaensäure (EPA) her. Tabelle 1 beschreibt das Fettsäureprofil von P. insidiosum, genauso wie das Fettsäureprofil anderer Pilzspezies.
Tabelle 1: Fettsäurezusammensetzung mehrerer Pilzspezies
Wie für Fischöl, bewirken hohe EPA-Niveaus in diätetischen Zusätzen eine 5 Unterdrückung der Fähigkeit zur Bildung von ARA aus diätetischer Linolsäure (LOA).
Demgemäß wird Mortierella alpina in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet. Diese Spezies ist im Handel erhältlich und ist im "American Type Culture Collective" in Rockville, Maryland, unter der Zugangsnummer 42430 hinterlegt.
Eines der signifikanten Probleme, die eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung überwindet, besteht in der Unterdrückung der ARA-Biosynthese in Säuglingen, die durch die Anwesenheit erhöhter diätetischer Niveaus von EPA verursacht wird. Dieses Problem kann durch Bereitstellen von ARA für die Verwendung in Säuglingsnahrung in im wesentlichen ähnlichen Niveaus zu den in menschlicher Brustmilch gefundenen korrigiert werden. Typischerweise beträgt das Verhältnis von ARA : EPA in menschlicher Brustmilch etwa 20 : 1. Die vorliegende Erfindung beabsichtigt insbesondere die Herstellung eines mikrobiellen Öls, das eine ausreichende Menge von ARA bereitstellt, um die negativen Wirkungen von diätetischem EPA zu überwinden. Vorzugsweise wird die Verwendung des ARA-enthaltenden Öls in einem Verhältnis von ARA : EPA von mindestens etwa 5 : 1 resultieren.
Mehr bevorzugt wird das Verhältnis mindestens etwa 10 : 1 betragen und am meisten bevorzugt wird es mindestens etwa 20 : 1 betragen. Es ist offensichtlich, dass ein Ergebins erwünscht ist, bei dem die Menge an ARA in dem Endprodukt, bezogen auf die Menge von EPA, möglichst hoch ist.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die Pilze unter geeigneten Kultivierungsbedingungen zur Herstellung eines ARA-enthaltenden Öls unter einem nachfolgend beschriebenen pH-Profil kultiviert. Im allgemeinen sind Techniken der Pilzkultivierung einem Fachmann bekannt und derartige Techniken können in dem vorliegenden erfinderischen Verfahren angewendet werden. Beispielsweise kann die Kultivierung einer beimpften Menge eines Pilzes in einer eingtauchten Kultur in Schüttelkolben stattfinden. Die Kolben werden mit einem Wachstumsmedium versehen, mit einem Pilzmyzel wird eine Kultur angesetzt und auf einer sich hin- und herbewegenden Schüttelvorrichtung für etwa drei bis vier Tage wachsen gelassen.
Die Zusammensetzung des Wachstumsmediums kann variieren, enthält aber immer Kohlenstoff- und Stickstoffquellen. Eine bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Glucose, wobei die Menge davon von etwa 10 bis 100 Gramm Glucose pro Liter Wachstumsmedium beträgt. Typischerweise werden etwa 15 Gramm/Liter für Kulturen in einem Schüttelkolben verwendet. Die Menge kann abhängig von der gewünschten Dichte der fertigen Kultur variieren. Andere Kohlenstoffquellen, die verwendet werden können, schließen Molasse, Maissirup mit einem hohen Fructosegehalt, hydrolysierte Stärke oder jede andere herkömmliche, günstige Kohlenstoffquelle, die in Fermentationsprozessen verwendet wird, ein. Geeignete Mengen dieser Kohlenstoffquellen kann ein Fachmann rasch bestimmen. Üblicherweise muss zusätzlicher Kohlenstoff während dem Verlauf der Kultivierung zugegeben werden. Dies liegt daran, weil die Organismen so viel Kohlenstoff verbrauchen, dass dessen gesamte Zugabe in einer diskontinuierlichen Weise Probleme hervorrufen könnte.
Stickstoff wird typischerweise in Form von Hefeextrakt in einer Konzentration von etwa 2 bis etwa 15 Gramm Extrakt pro Liter Wachstumsmedium bereitgestellt. Vorzugsweise werden etwa vier Gramm pro Liter bereitgestellt. Andere Stickstoffquellen können verwendet werden, einschließlich Pepton, Trypton, Maissaft ("corn steep liquor"), Sojamehl, hydrolysiertes Pflanzenprotein, etc. Die zu diesen Quellen zuzugebende Menge kann von einem Fachmann einfach bestimmt werden. Stickstoff kann in diskontinuierlicher Weise zugegeben werden, d.h., alles zu einem Zeitpunkt vor der Kultivierung.
Nach Kultivierung für 3 bis 4 Tage bei einer geeigneten Temperatur, typischerweise etwa 25–30°C, ist eine Pilzmenge gewachsen, die für eine Verwendung als Impfkeim bzw. Inokulum in einem herkömmlichen Rührtankfermenter (STF) ausreichend ist. Derartige Fermenter sind einem Fachmann bekannt und sind im Handel erhältlich. Die Fermentierung kann in einer diskontinuierlichen Fermentationsart, einer diskontinuierlichen Fermentationsart mit Zufuhr oder einer kontinuierlichen Fermentationsart durchgeführt werden. Vorzugsweise ist der STF mit einem eingetauchten Impellerrührer ausgestattet, obwohl ein Turbinenimpellerrührer vom Rushton-Typ auch verwendet werden kann.
Der Fermenter wird durch Zugabe der gewünschten Kohlenstoff- und Stickstoffquelle vorbereitet. Beispielsweise kann ein 1,5 Liter-Fermenter durch Mischen von etwa 50 Gramm Glucose und etwa 15 Gramm Hefeextrakt pro Liter Leitungswasser vorbereitet werden. Wie vorstehend diskutiert, können andere Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen oder Gemische davon verwendet werden.
Der Reaktor, der die Nährlösung enthält, sollte beispielsweise durch Erwärmen vor einer Beimpfung sterilisiert werden. Nach einem Kühlen auf etwa 30°C kann die Beimpfung zugeführt werden und die Kultivierung kann initiiert werden. Der Gasaustausch wird durch Durchleiten von Luft bereitgestellt. Die Luftdurchleitrate kann variieren, wird vorzugsweise jedoch auf etwa 0,5 bis etwa 4,0 VVM (Volumen Luft pro Volumen Fermenter pro Minute) eingestellt. Vorzugsweise wird das Niveau an gelöstem Sauerstoff bei etwa 10% bis etwa 50% des Luftsättigungswertes der Lösung gehalten. Demgemäß kann ein Einstellen der Durchleitrate während der Kultivierung erforderlich sein. Ein Rühren ist wünschenswert. Das Rühren wird durch den Impellerrührer bereitgestellt. Die Rührerblattspitzengeschwindigkeit liegt vorzugsweise in einem Bereich von etwa 50 cm/s bis etwa 500 cm/s, vorzugsweise von etwa 100 bis 200 cm/s.
Im allgemeinen kann die Beimpfungsmenge variieren. Typischerweise können von etwa 2 Vol.-% bis etwa 10 Vol.-% Inokulum verwendet werden. In einer Fermenterkulturreihe können vorzugsweise etwa 5 Vol.-% Inokulum verwendet werden.
Die Nährstoffniveaus sollten überwacht werden. Wenn das Glucoseniveau unter 5 g/L abfällt, sollte zusätzliche Glucose zugegeben werden. Ein typischer Kultivierungszyklus verwendet etwa 100 Gramm Glucose und etwa 15 Gramm Hefeextrakt pro Liter. Es ist wünschenswert, den Stickstoff während des Verlaufs der Kultivierung aufzubrauchen, da dies die Ölproduktion durch M. alpina steigert.
Mortierella alpina mit einem hohen Ölanteil, einschließlich hoher Niveaus von ARA, kann in einem Fermenter unter Verwendung sehr hoher Nährstoffniveaus kultiviert werden. Es wurde unerwarteterweise festgestellt, dass Niveaus von Stickstoff-enthaltendem Nährstoff von mehr als dem durch 15 Gramm/Liter Hefeextrakt bereitgestellten Niveau zu Beginn der Fermentation zugegeben werden können, solange die Gesamtmenge an zugegebenem Kohlenstoff-enthaltendem Nährstoff während der Fermentation vergleichsweise hoch ist. Die Gesamtmenge an Kohlenstoffnährstoff, vorzugsweise kontinuierlich oder unterbrochen für die ersten 25–50% des Fermentationszeitverlaufs oder in Aliquoten zu mehreren Zeitpunkten über den gleichen Zeitverlauf zugeführt, wird vorzugsweise einer Menge von 75–300 Gramm Glucose pro Liter Kulturmedium äquivalent sein (C : N-Verhältnis ≥5 : 1, ausgedrückt als w/w Glucose : Hefeextrakt). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Stickstoffnährstoff Sojamehl, das in einem Niveau von etwa 16 Gramm pro Liter Medium zugegeben wird, und der Kohlenstoffnährstoff ist anfänglich in einem zu etwa 80 Gramm Glucose oder mehr äquivalenten Niveau vorhanden. Wenn hohe Niveaus von Kohlenstoff- und Stickstoffnährstoffen verwendet werden, ist es bevorzugt, die Lösungen, die die zwei Nährstofflösungen enthalten, getrennt zu sterilisieren. Es wurde auch festgestellt, dass die Biomassenausbeute für Fermentationen, die hohe Niveaus von Kohlenstoff-nährstoffen enthalten, durch Rückhalten eines Teils des Stickstoffnährstoffs und durch kontinuierliches Zuführen des verbleibenden Stickstoffnährstoffs oder durch Zuführen in ein oder mehreren Aliquoten während des Verlaufs der Fermentation gesteigert werden kann.
Gelegentlich wird die Kultur eine übermäßige Schaummenge produzieren. Gegebenenfalls kann ein Antischaummittel, wie ein dem Fachmann bekanntes Schaummittel, z. B. Mazu 310^® oder Pflanzenöl, zugegeben werden, um den Schaum zu verhindern.
Die Temperatur der Kultivierung kann variieren. Solche Pilze, die sowohl ARA als auch EPA produzieren, neigen jedoch zur Herstellung von weniger EPA und mehr ARA, wenn sie bei höheren Temperaturen kultiviert werden. Wenn Mortierella alpina bei weniger als 18°C kultiviert wird, beginnt er, EPA zu bilden. Daher ist es bevorzugt, die Temperatur bei einem Niveau zu halten, das die bevorzugte Herstellung von ARA induziert. Geeignete Temperaturen betragen typischerweise von etwa 25°C bis etwa 30°C.
Vorzugsweise schreitet die Kultivierung fort, bis eine gewünschte Biomassendichte erreicht wird. Eine gewünschte Biomasse ist etwa 25 g/L Organismus. Eine derartige Biomasse wird typischerweise innerhalb von 48–72 Stunden nach Beimpfung erhalten. Zu diesem Zeitpunkt enthalten die Organismen typischerweise etwa 5–40% komplexer Lipide, d.h. Öl, wovon mindestens 25% ARA ist oder vorzugsweise mindestens 40% ARA-Reste in dem Triglyceridanteil, mehr bevorzugt mindestens 50% ARA-Reste in dem Triglyceridanteil vorhanden sind, und können geerntet werden.
Die Pilzfermentation für die ARA-Herstellung gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch das pH-Profil des Mediums eher als durch Gestatten eines unkontrollierten pH-Anstiegs gesteigert. Die Ausbeuten können auch durch Aufrechterhalten hoher Sauerstoffniveaus während der Fermentation gesteigert werden. Diese Modifizierungen des Fermentationsverfahrens sind insbesondere wirksam, wenn hohe Nährstoffniveaus in dem Fermenten verwendet werden.
Wenn das anfängliche Stickstoffnährstoffniveau eine zu etwa 15 Gramm Hefeextrakt pro Liter äquivalente Menge übersteigt und/oder das Kohlenstoffnährstoffniveau eine zu etwa 150 Gramm Glucose pro Liter äquivalente Menge übersteigt, kann das Pilzwachstum gehemmt werden. Diese Wachstumshemmung kann durch diskontinuierliche Fermentation mit Zufuhr überwunden werden, beispielsweise durch Aufteilen des Nährstoffs für die Fermentation in Aliquote, die nacheinander dem Fermenten zugeführt werden, wenn ein Teil oder der gesamte zugeführte Nährstoff durch die vorherigen Aliquote metabolisiert wurden. Der Vorteil des Überwindens der Wachstumshemmung kann durch Zufuhr von ausschließlich Kohlenstoffnährstoff erreicht werden (siehe Shinmen et al.). Es wurde festgestellt, dass dieser Vorteil durch Aufteilen des Gesamtnährstoffs in Aliquote und Zuführen der Aliquote während der Fermentation oder durch kontinuierliches Zuführen der Nährstofflösung erreicht werden kann. In ähnlicher Art und Weise wurde unerwarteterweise festgestellt, dass der Vorteil durch Zuführen des Stickstoffnährstoffs ausschließlich zu einer Fermentation, bei der der Kohlenstoffnährstoff anfänglich in einem hohen Niveau vorhanden ist, erreicht werden kann.
Es wurde auch unerwarteterweise festgestellt, dass die Wachstumshemmung durch das pH-Profil der Fermentation, durch Aufrechterhalten einer hohen Sauerstoffspannung in dem Fermenter oder beides gemäßigt werden kann. Es wurde festgestellt, dass die Fermentation von M, alpina in Medien mit einem hohen Nährstoffgehalt bei einem niedrigen pH-Wert (pH = 5–6) in einem erhöhten Biomassenwachstum (und auch in einer erhöhten Ölausbeute) resultiert. Das unter diesen Bedingungen hergestellte Öl weist jedoch niedrigere Niveaus an ARA-Resten in dem Öl auf. Umgekehrt resultiert die Fermentation bei einem hohen pH-Wert (pH = 7–7,5) in erhöhten Niveaus von ARA in dem Öl, aber in einem schwächeren Wachstum. Das Fermentationsverfahren dieser Erfindung schließt ein pH-Profil ein, bei dem der pH-Wert während früher Stadien der Fermentation niedrig ist und während später Stadien hoch ist. Frühe Stadien schließen Perioden des raschen (exponentiellen) Wachstums ein, während dem die Nährstoffe rasch metabolisiert werden; späte Stadien schließen die stationäre Phase ein, wenn die Zellteilung üblicherweise aufgrund ungenügender Mengen von einem oder mehreren Nährstoffen gehemmt ist, und die Produktion von ARA-reichem Öl ist erhöht. Das Einstellen des Profils kann durch Steuern des Fermenten-pH-Werts auf Niveaus erreicht werden, die in zwei oder mehreren Schritten über den Fermentationszeitraum eingestellt werden.
Es wurde auch festgestellt, dass das Beibehalten des Gehalts von gelöstem Sauerstoff des Mediums (D.O.) auf einem hohen Niveau (z. B. ≥40% des Luftsättigungsniveaus) in einer Unterbrechung der Wachstumshemmung durch hohe Nährstoffniveaus und/oder in einer Steigerung des relativen Nivaeaus der ARA-Reste in dem Öl resultiert. Der D.O. kann durch Erhöhung des Gefäßdrucks (Einpressen von mehr Luft in den Fermenterkopfraum), Steigerung des Rührens (z. B. Steigerung der Impellerblattspitzengeschwindigkeit) und Steigerung der Belüftung (d.h. Erhöhung der Menge der durch den Fermenter in einer gegebenen Zeit durchgeführten Luft, üblicherweise ausgedrückt als Steigerung der VVM, Volumen Luft pro Fermentervolumen pro Minute) und/oder durch Erhöhung des O₂-Gehalts des Zufuhrgases auf einem hohen Niveau gehalten werden. Bei einer Fermentation unter diesen Bedingungen wurde festgestellt, dass der Verbrauch von Kohlenstoff gesteigert wurde, was in einer höheren Endbiomassenkonzentration und einer größeren Produktivität an ARA-reichem Öl in dem Fermenter resultiert. Insbesondere Fermentationen, die ein oder mehrere der vorstehenden Modifikationen einschließen, resultieren in der Herstellung eines extrahierbaren Triglyceridöls mit mindestens 40% ARA-Resten und vorzugsweise mindestens 50% ARA-Resten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Fermentationsmedium den Kohlenstoffnährstoff in einer ≥80 g/L Glucose äquivalenten Menge und den Stickstoffnährstoff in einer ≥15 g/L Hefeextrakt äquivalenten Menge und das Medium wird nach Sterilisation auf einen pH-Wert zwischen 5 und 6 eingestellt. Nach Beimpfen wird der pH-Wert des Mediums auf oder schwach über dessen Anfangsniveau eingestellt. Wenn das Niveau des Kohlenstoffnährstoffs auf ≤60 Gramm Glucose-Äquivalent/Liter (üblicherweise etwa 48 Stunden) abgesunken ist, wird der Einstellungspunkt für die pH-Steuerung auf etwa pH ≥6 geändert. Zu der Zeit oder etwa zu der Zeit, wenn die Sauerstoff-Aufnahmerate (und/oder die Kohlendioxid-Abgaberate, CER) dessen Maximum erreicht (üblicherweise nach etwa 72 Stunden), wird der Einstellungspunkt auf einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7 (üblicherweise schrittweise z. B. in einer Rate von 0,1 pH-Einheiten pro Stunde) angehoben. Der pH-Wert wird anschließend derart gesteuert, daß er für die Endstufen der Fermentation unter etwa pH = 7–7,5 bleibt.
Für diese Ausführungsform wird das Niveau an gelöstem Sauerstoff-enthaltendem Medium (D.O.) nahe bei oder über 40% des Luftsättigungsniveaus, vorzugsweise durch aufeinanderfolgendes Steigern des Gefäßdrucks auf 0,773 kg/cm² (11 psi), Steigern des Rührens auf eine zu etwa 300 cm/s äquivalente Impellerblattspitzengeschwindigkeit und Steigern der Belüftung auf etwa 0,5 Volumen Luft pro Fermentervolumen pro Minute gehalten. Nach einem Zeitraum raschen Wachstums und hoher O₂-Aufnahme durch die Fermentation wird das Wachstum (und die O₂-Aufnahme) abnehmen. Das Rühren/Die Belüftung kann an diesem Punkt verringert werden, solange der D.O. auf einem hohen Niveau, üblicherweise über etwa 40% Luftsättigung, gehalten wird.
Durch die hier beschriebene Optimierung der Fermentation von M. alpina ist es möglich, sehr hohe Ausbeuten an Biomasse, enthaltend 20–60% Öl in der Biomasse, zu erhalten, wobei 25–70 Gew.-% des Öls ARA-Reste in Triglyceridform sind. Die Biomasse (und Öl) können wie hier beschrieben geerntet werden. Vorzugsweise wird die Biomasse aus dem Fermenten innerhalb von 48 Stunden bei Erreichen der maximalen Produktivität, gemessen als Gramm ARA/L/Tag, geerntet.
Das Ernten kann durch jedes geeignete Verfahren, beispielsweise durch Filtrieren, Zentrifugieren oder Sprühtrocknen, durchgeführt werden. Aufgrund der geringen Kosten kann ein Filtrieren bevorzugt sein.
Nach dem Ernten kann der Myzelkuchen extrahiert werden. Der Myzelkuchen betrifft das Sammeln von Biomasse, die nach der Ernte resultiert. Der Kuchen kann lose oder gepresst, zerkrümelt oder unzerkrümelt vorliegen. Gegebenenfalls kann dem Kuchen vor der Extraktion jedes Restwasser entzogen werden, beispielsweise durch Vakuumtrocknen, Fließbettrocknen, Sprühtrocknen oder Lyophilisieren. Wenn diese Option gewählt wird, ist es bevorzugt, nicht-polare Lösungsmittel zur Extraktion des ARA-enthaltenden Öls zu verwenden. Obwohl grundsätzlich jedes nicht-polare Extraktionsmittel geeignet ist, ist Hexan bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Öl aus der getrockneten Biomasse durch Nassmahlen oder Perkolieren bzw. Filtrieren mit unverbrauchtem Hexan extrahiert. Das Lösungsmittel wird üblicherweise in einem Lösungsmittel-zu-Biomasse-Verhältnis von 5 : 1 (w/w) zugegeben. Nach dem Nassmahlen werden die Feststoffe von dem Extrakt durch Dekantieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Es ist vorteilhaft, das Lösungsmittel-enthaltende Extrakt (Miscella bzw. Gemisch) anaerob zu halten, um eine Oxidation der ungesättigten Fettsäurereste in dem Öl zu vermeiden. Die Miscella wird vom Lösungsmittel befreit, um ein Rohpilzöl herzustellen.
Das von der Pilz-Biomasse mit nicht-polaren Lösungsmitteln extrahierte Rohöl kann trüb sein, insbesondere wenn die Biomasse gemahlen wird, weil das Mahlen feine Teilchen, wie Zellwandfragmente und lösliche Polysaccharide freisetzen kann. Die Klärung eines derartigen trüben Öls kann durch Lösen des Rohöls in polareren Lösungsmitteln, wie Aceton oder Alkohol, erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Rohölextrakt des Pilzmyzels weiter durch Aceton-extraktion/Ausfällung geklärt. Eine Aceton-Miscella wird durch Zugeben von Aceton zu dem trüben Rohölextrakt (vorzugsweise in einem Niveau von etwa 20% Öl, d.h. etwa 4 Volumen Aceton pro Volumen Rohöl), sorgfältiges Mischen und Stehen des Gemischs für eine ausreichende Zeit zur Ausfällung der feinen Teilchen (üblichennieise etwa eine Stunde bei Raumtemperatur) hergestellt. Die Öl-enthaltende Aceton-Miscella wird durch Zentrifugation und/oder Filtration und anschließender Entfernung des Lösungsmittels geklärt, um ein Aceton-geklärtes Pilzöl herzustellen. Ein Aceton-geklärtes Pilzöl ist für die weitere Verarbeitung (beispielsweise Degummieren, Bleichen und Deodorieren durch herkömmliche Techniken) bevorzugt, weil die feinen Materialien, die während der Extraktion der Pilzbiomasse gebildet werden, in dem Reinigungsverfahren stören werden, wenn sie nicht in dem Aceton-Schritt entfernt werden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform schließt die Gegenstromextraktion trockener Biomasse ein, die in im Handel erhältlichen Extraktionseinheiten, beispielsweise solchen, hergestellt durch Crown Ironworks (Crown Mark IV) oder French, Inc., durchgeführt werden können, die nicht allgemein zur Extraktion von Pflanzenölen verwendet werden, sondern zur Extraktion von Schmutz und Boden entworfen wurden. Obwohl die Extraktionswirksamkeit ohne das erneute Mahlen der Biomasse nicht so hoch ist, weist das Gegenstrom-Extraktionsverfahren den Vorteil der Herstellung von weniger "feinem" Material auf, wodurch die technische Schwierigkeit der Gewinnung eines klaren raffinierten Öls vermindert ist.
Alternativ kann der nasse Kuchen (der typischerweise etwa 30–50% Feststoffe enthält) zerkrümelt werden und direkt unter Verwendung polarer Lösungsmittel, wie Ethanol oder Isopropylalkohol, oder einer überkritischen Fluidextraktion mit Lösungsmitteln, wie CO₂ oder NO, extrahiert werden. Vorzugsweise werden die Kuchen vor der Extraktion zerkrümelt. Vorteilhafterweise gestattet die vorliegende Erfindung die wirtschaftliche Verwendung überkritischer Fluidextraktionstechniken. McHugh, et al., Supercritical Fluid Extraction, Butterworth (1986). Derartige Techniken sind einem Fachmann bekannt und schließen die gegenwärtig beispielsweise zur Entkoffeinierung von Kaffeebohnen angewendeten Techniken ein.
Ein bevorzugtes Verfahren der wässrigen Extraktion schließt das Mischen der Myzel-Biomasse mit dem polaren Lösungsmittel Isopropylalkohol in einem geeigneten Reaktionskessel ein. Derartige Kessel sind bekannt. Die Verwendung von drei bis sechs Teilen Lösungsmittel pro Teil Biomasse ist wünschenswert. Am meisten bevorzugt wird das Mischen unter Stickstoff oder in Gegenwart von Antioxidantien durchgeführt, um die Oxidation von ARA in dem Lipidextrakt zu vermeiden. Die hier verwendeten Ausdrücke "Lipidextrakt", "Öl", Lipidkomplex" und "Pilzöl" sind austauschbar.
Nach dem Extrahieren kann das Gemisch filtriert werden, um die Biomasse von dem Lösungsmittel, das das Lipidextrakt enthält, zu entfernen. Zu diesem Stadium kann die Biomasse wiedergewonnen werden und als Nahrungszusatzstoff verwendet werden. Der hier verwendete Ausdruck "Nahrungszusatzstoff' bedeutet Nahrung oder ein mit einer typischen Nahrung zu mischendes Additiv, beispielsweise ein Korn, etc., das Tieren verabreicht werden kann.
Das Lösungsmittel wird von dem Lipidextrakt getrennt und kann auch für eine erneute Verwendung, wie durch Verdampfen in einer geeigneten Sammelvorrichtung, wiedergewonnen werden, was "Rohöl" zurücklässt. Die Verwendung von Isopropylalkohol als Lösungsmittel resultiert wünschenswerterweise in der Entfernung von jedem Restwasser von dem Rohöl, da das Verdampfen das Wasser/Isopropylalkohol-Azeotrop, das spontan gebildet wird, entfernt.
Während das Rohöl ohne weitere Behandlung verwendet werden kann, kann es auch weiter aufgereinigt werden. Verfahren, wie die in der Herstellung von Lecithin aus pflanzlichen Produkten angewendeten und solche, die einem Fachmann bekannt sind, können in diesem zusätzlichen Reinigungsschritt angewendet werden. Derartige Verfahren modifizieren die ARA-enthaltenden Lipide oder ARA selbst nicht chemisch oder kovalent.
Die Ausbeuten variieren, betragen jedoch typischerweise etwa 5 Gramm ARA-enthaltendes Phospholipid pro 100 Gramm getrocknetes Myzel. In dem Fall von M. alpina können zusätzlich 10–50 Gramm Triglycerid pro 100 Gramm trockenem Myzel erhalten werden. Entweder das Rohöl oder das raffinierte Produkt können für eine Verabreichung für Menschen verwendet werden. Beide sollen in die Definition von ARASCO, wie hier verwendet, eingeschlossen sein.
Die am meisten bevorzugte Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Additiv für die Verwendung mit Säuglingsnahrung bereitzustellen, so dass die Konzentration von ARA in derartigen Formulierungen bzw. Zusammensetzungen etwa der Konzentration von ARA in menschlicher Brustmilch nahe kommt. Tabelle 2 vergleicht die Zusammensetzung der Fettsäuren in ARASCO mit denen in Brustmilch und in Säuglingsnahrung, mit und ohne ARASCO.
Tabelle 2: Fettsäure-Zusammensetzung von Pilzölprodukten und Muttermilch
Es kann deutlich erkannt werden, dass die Menge von ARA, die in mit ARASCO ergänzter Säuglingsnahrung vorhanden ist, den ARA-Niveaus in menschlicher Brustmilch sehr nahe kommt.
Darüber hinaus hat sich die gesamte Fettsäurezusammensetzung der Säuglingsnahrung durch die Zugabe von ARASCO nicht signifikant verändert. Typischerweise können zwischen etwa 50 bis etwa 1000 mg ARASCO pro Liter Säuglingsnahrung verwendet werden. Die spezifische Menge an erforderlichem ARASCO hängt von dem ARA-Gehalt ab. Das zum Ergänzen von Säuglingsnahrung verwendete Öl enthält mindestens 50% Fettsäurereste als ARA. Wenn der ARA-Gehalt über 30% beträgt, würde eine Ergänzungsrate etwa 600 bis 700 mg ARASCO pro Liter Säuglingsnahrung betragen. Eine derartige Rate verdünnt die bereits vorhandenen Fettkomponenten einer Säuglingsnahrung, wie Similac^® (Ross Laboratories, Columbus, Ohio) durch nur einen Teil ARASCO auf fünfzig Teile Formulierungsöle. Ähnliche Verdünnungsraten können für Öle mit höheren ARA-Gehalten berechnet werden. Vorzugsweise ist ARASCO im wesentlichen frei von EPA.
Wenn Mortierella alpina in diesem Verfahren verwendet wird, ist das ARA-enthaltende Öl überwiegend ein Triglycerid. Dieses ARASCO ist als Additiv für Säuglingsnahrung geeignet. Das Öl aus M. alpina ist wahrscheinlich wirtschaftlich herzustellen.
Das ARA-enthaltende Öl der vorliegenden Erfindung ist zusätzlich zu dessen Verwendung als Additiv für Säuglingsnahrung vielfach verwendbar. Wie einem Fachmann bekannt ist, gibt es viele Krankheitszustände bzw. Pathologien, die mit einem ARA-Mangel assoziiert sind, wie Marasmus (Vajreswari, et al., Metabolism 39: 779–782 (1990)), Atopie (Melnik, B., Monatsschr. Kinderheilta., 138: 162–166 (1990)), Leberkrankheit, Phenylketonurie, Schizophrenie, dystones Syndrom oder unterschiedliche peroxisomale Störungen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden solche Krankheitszustände durch Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge des Öls der vorliegenden Erfindung behandelt. Typischerweise ist die pharmazeutisch wirksame Menge die erforderliche Menge zur Normalisierung des Serumniveaus von ARA in einem Patienten. Insbesondere sind für die Ergänzung zur Behandlung derartiger Krankheitszustände die vorstehend beschriebenen Öle mit einem hohen ARA-Gehalt bevorzugt. Das Öl kann enteral, topisch oder parenteral, wie durch einen Fachmann der medizinischen Versorgung ausgewählt, verabreicht werden.
Die Einkapselung, wie sie einem Fachmann bekannt ist, ist ein wirksames Verfahren zur enteralen Verabreichung. Pilzöl-enthaltende Kapseln können solchen Personen mit Bedarf oder Personen, die eine diätetische Ergänzung mit ARA wünschen, verabreicht werden. Ein derartiges Verfahren ist insbesondere für die Verabreichung von ARA für schwangere oder stillende Frauen wirksam.
In Fällen, bei denen ARASCO zur Bekämpfung von ARA-Mangel-assoziierten Krankheitszuständen verabreicht wird, sollte eine pharmazeutisch wirksame Menge verabreicht werden. Diese Menge kann durch einen Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden. Typischerweise beträgt diese Menge 0,5–2,0 g/Tag, was das Serumniveau von ARA üblicherweise normalisieren wird.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft kosmetische Zusammensetzungen, die ARASCO enthalten, wie hier beschriebene Öle mit hohem ARA-Gehalt. Kosmetische Zusammensetzungen betreffen solche Verbindungen, die als Kosmetika angewendet werden. Ein bevorzugtes Beispiel einer derartigen Zusammensetzung ist eine Faltencreme. Derartige kosmetische Zusammensetzungen stellen ein wirksames Mittel zur topischen Anwendung von ARA auf Haut bereit, um das Aufrechterhalten des Haut(farb)tons zu unterstützen.
Die vorliegende Erfindung wurde in allgemeiner Weise beschrieben und wird nachfolgend durch die spezifischen, nicht-einschränkenden Beispiele weiteren erläutert. Die Beispiele 1 und 2 sind Beispiele des Standes der Technik, die aus WO 92/13086 entnommen sind. Die Beispiele 3 bis 6 sind keine erfindungsgemäßen Beispiele, sondern schließen Materialien ein, die für das Verständnis von Beispiel 7 geeignet sind. Beispiel 7 ist ein erfindungsgemäßes Beispiel.
Beispiel 1 (Stand der Technik)
Herstellung von P. insidiosum-Lipid und Zugabe zu einer Säuglingsnahrung
In einem 80 Liter (Gesamtvolumen)-Fermenter wurden 51 Liter Leitungswasser, 1,2 kg Glucose, 240 Gramm Hefeextrakt und 15 ml MAZU 210S^® Antischaum vereint. Der Fermenten wurde bei 121°C für 45 Minuten sterilisiert. Eine zusätzliche Menge von 5 Litern Kondensationswasser wurden während des Sterilisierungsverfahrens zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 6,2 eingestellt und anschließend wurde ungefähr 1 Liter Inokulum (bei einer Zelldichte von 5–10 g/L) Pythium insidiosum (ATCC #28251) zugegeben. Die Rührrate wurde auf 125 UpM (250 cm/s Blattspitzengeschwindigkeit) eingestellt und die Belüftungsrate wurde auf 0,028 m³ pro Minute (1 SCFM (Standardkubikfuß pro Minute)) eingestellt. Bei 24 Stunden Betrieb wurde die Belüftungsrate auf 0,084 m³ pro Minute (3 SCFM) erhöht. Bei Stunde 28 wurden zusätzliche 2 Liter 50%iger Glucosesirup (1 kg Glucose) zugegeben. Bei Stunde 50 wurde der Fermenten geerntet, was in einer Ausbeute von etwa 2,2 kg Nassgewicht (ungefähr 15 g Trockengewicht) pro Liter resultierte. Die geerntete Biomasse wurde auf einem Saugfilter vor dem Gefriertrocknen zu einem Kuchen mit einem hohen Feststoffanteil (50% Feststoff) ausgequetscht. Die getrocknete Biomasse wurde in einem Mörser mit Pistill zermahlen und mit 1 Liter Hexan pro 200 Gramm trockener Biomasse bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Rühren für 2 Stunden extrahiert. Das Gemisch wurde anschließend filtriert und das Filtrat wurde verdampft, um etwa 5–6 Gramm Rohöl pro 100 Gramm trockener Biomasse zu ergeben. Die Biomasse wurde anschließend mit 1 Liter Ethanol pro 20 Gramm trockener Biomasse für 1 Stunde bei Raumtemperatur erneut extrahiert, filtriert und das Lösungsmittel verdampft, um zusätzliche 22 Gramm Rohöl pro 100 Gramm trockener Biomasse zu ergeben. Die zweite Fraktion bestand vorwiegend aus Phospholipiden, wohingegen die erste Fraktion ein Gemisch von Phospholipiden und Triglyceriden enthielt. Die kombinierten Fraktionen produzierten ein Öl, enthaltend etwa 30–35% Arachidonsäure und nicht nachweisbar EPA. Dieses Öl wurde tropfenweise zu einem im Handel erhältlichen Säuglingsnahrungsprodukt Similac^® (Ross Laboratories, Columbus, Ohio) mit einer Ergänzungsrate von 60 mg pro Liter hergestelltem Medium gegeben.
Beispiel 2 (Stand der Technik)
Herstellung von M, alpina-Lipid und Zugabe zu Säuglingsnahrung
Mortierella alpina (ATCC #42430) wurde in einem 2 Liter-Schüttelkolben, der 1 Liter Leitungswasser und 20 Gramm Kartoffel-Dextrose-Medium enthielt, wachsen gelassen. Der Kolben wurde unter konstanter Umlaufrührung gerührt und wurde bei 25°C für sieben Tage belassen. Nach dem Ernten durch Zentrifugation wurde die Biomasse gefriergetrocknet, was etwa 8 Gramm Lipid-reiches Myzel ergab. Das Myzel wurde unter Verwendung von Hexan wie in Beispiel #1 extrahiert und resultierte in etwa 2,4 g Rohöl. Dieses Öl enthielt etwa 23% Arachidonsäure und wurde zu der im Handel erhältlichen Formulierung Similac^® tropfenweise in Konzentrationen von 1000 mg pro Liter gegeben.
Beispiel 3 (nicht erfindungsgemäß)
Herstellung von Arachidonsäure durch M. alpina in großem Maßstab
Ein Inokulierungsfermenter, der das Medium GYE (50 g/L Dextrose und 6 g/L Taston 154) enthielt, wurde mit M. alpina beimpft. Die Fermentationstemperatur wurde auf 28°C, das anfängliche Rühren auf 130–150 cm/s, der anfängliche Gefäßdruck auf 0,422 kg/cm² (6 psi) und die anfängliche Belüftungsrate auf 0,25 VVM eingestellt. Der pH-Wert wurde vor der Sterilisierung auf 5,0 eingestellt und der pH-Wert nach der Sterilisierung, zu Beginn der Fermentation, wurde auf 5,5 eingestellt. Das Medium wurde mit 8 N NaOH bei einem pH-Wert ≥5,5 gehalten. Das Sauerstoffniveau wurde durch Einstellen von Rühren/Belüften in der nachfolgenden Sequenz bei D.O. ≥40% gehalten: Erhöhung des Gefäßdrucks auf 0,773 kg/cm² (11 psi), Erhöhung des Rührens auf 175 cm/s Impellerblattspitzengeschwindigkeit und Erhöhung der Belüftung auf 0,5 WM. Das Schäumen wurde durch Zugabe von Dow 1520-US-Antischaum, wenn benötigt, gesteuert. (Ungefähr 0,1 ml/L Antischaum sollte zu dem Medium vor der Sterilisierung gegeben werden, um das Schäumen zu verhindern).
Das Inokulum wurde von dem Kulturfermenten zu dem Hauptfermenten innerhalb von 12 Stunden, nachdem der pH-Wert auf über 6,0 anstieg, überführt.
Der Hauptfermenter enthielt das GYE-Medium (50 g/L Dextrose und 6 g/L Taston 154); Glucose wurde getrennt sterilisiert und dem Hauptfermenter nach Sterilisierung zugegeben. Die Fermentertemperatur wurde auf 28°C, das anfängliche Rühren auf 160 cm/s, der anfängliche Gefäßdruck auf 0,422 kg/cm² (6 psi) und die anfängliche Belüftungsrate auf 0,15 WM eingestellt. Der anfängliche pH-Wert wurde auf 5,5 nach Sterilisierung eingestellt und mit 8 N NaOH bei pH ≥5,5 gehalten. Dem pH-Wert wurde gestattet, während der stationären Phase (beginnend etwa 24 Stunden nach Beimpfung) anzusteigen, aber wurde durch Zugabe von H₂SO₄ unter pH 6,8 gehalten. Das Sauerstoffniveau wurde durch nachfolgende Steigerung des Gefäßdrucks auf 0,773 kg/cm² (11 psi), Steigern des Rührens auf 175 cm/s Impellerblattspitzengeschwindigkeit und Erhöhung der Belüftung auf 0,5 VVM bei D.O. ≥40% gehalten. Das Schäumen wurde bei Bedarf durch Zugabe von Antischaum-Dow 1520-US gesteuert. (Ungefähr 0,1 ml/L Antischaum sollten zu dem Medium vor der Sterilisierung gegeben werden, um ein Schäumen zu verhindern).
Von der Kultur wurde alle 12 Stunden für die Biomasse und die Fettsäureanalyse eine Probe entnommen und die Ernte wurde 3–4 Tage, nachdem der pH-Wert auf 6,5 anstieg, eingeleitet. Die Dichte der trockenen Biomasse sollte ≥8,5 g/L betragen. Die Glucosekonzentration in der Nährbrühe sollte von 50 g/L auf ≥25 g/L abgefallen sein. Bei der Ernte wurde die gesamte Kulturnährbrühe durch eine Korbzentrifuge geführt, um das Myzel von dem verbrauchten Medium abzutrennen, und die Biomasse wurde getrocknet.
Beispiel 4 (nicht erfindungsgemäß)
Verbesserte Ausbeute der Biomasse aus M, alpina – Erster Lauf
M. alpina wurde in 20 L Rührtankfermentern kultiviert und aus einer Kultur aus einem Schüttelkolben gemäß dem Verfahren nach Beispiel 3 beimpft. Die M. alpina-Kultur in 65 g/L Glucose (Staleydex) und 6 g/L Hefeextrakt (Triton 154) resultierte in der Herstellung von 12 g/L Biomasse. Die Zugabe von zusätzlichen 6 g/L Triton 154 nach 16 Stunden resultierte in der Herstellung von 18 g/L Biomasse.
Beispiel 5 (nicht erfindungsgemäß)
Verbesserte Ausbeute der Biomasse aus M. alpina – Zweiter Lauf
Die Experimente wurden in einem Versuch zur Steigerung der Biomasse weiter durch zusätzliche Zugabe von Triton 154 durchgeführt. Diese Experimente bestanden aus 2 × 20 L Fermentationen mit 168 Stunden Verweilzeit. Für beide dieser Fermentationen betrug die anfängliche Glucosekonzentration 100 g/L (im Vergleich zu 65 g/L für Beispiel 4). Ein Fermenter erhielt 3 × 6 g/L Zugaben von Taston 154 und der andere erhielt 4 × 6 g/L Zugaben. Der Hefeextrakt wurde als eine konzentrierte Lösung bereitgestellt, autoklaviert und zu verschiedenen Zeiten nach der Sterilisierung dem Fermenter zugegeben.
Zur Herstellung des Inokulums wurden Arbeitskulturen (1 ml mazeriertes Myzel) in 2 Kolben beimpft, wobei jeder 50 ml GYE-Medium (100 g/L Staleydex; 6 g/L Taston 154) enthielt, und für 4 Tage bei 28°C und 150 UpM wachsen gelassen. Nach 4 Tagen Wachstum enthielt die Nährbrühe pelletierte Biomasse; die Pellets bzw. Kügelchen wiesen einen Durchmesser von 2–5 mm auf. Das Wachstum in diesen Kolben war langsamer als erwartet, möglicherweise aufgrund der höheren Konzentration von Glucose. Die Biomasse wurde für 2 × 3 Sekunden in einem Waring-Mischer mazerisiert und 25 ml des Mazerisats wurden verwendet, um jeden der 2 × 2,8 L Fernbach-Inokulum-Kolben, 800 ml Nettovolumen, zu beimpfen. (In früheren Experimenten wurden 10 ml Mazerisat verwendet. Die Menge des Inokulums wurde wegen der geringeren Biomassedichte in dem Kulturkolben und weil erwartet wurde, dass das Wachstum in den Fernbach-Kolben aufgrund der höheren Glucosekonzentration geringer sein kann, erhöht). Das Medium in den Fernbach-Kolben war Dextrose (Staleydex) 100 g/L und Hefeextrakt (Taston 154), 8 g/L. Die Dextrose und der Hefeextrakt wurden getrennt für 40 min autoklaviert. Die Kulturfermentationstemperatur wurde bei 28°C und das Rühren bei 100 UpM bis 150 UpM gehalten.
Nach 44 Stunden Kultur in den Fernbach-Kolben wurde das Inokulum in 2 × 20 L Fermenter überführt. Das Inokulum lag in Form von sehr losen hyphalen Aggregaten vor und die Dichte der Biomasse betrug ungefähr 5,2 g/L.
Die Fermenter bei Stationen 14 und 15, enthaltend 1,6 kg (10%) Dextrose (Staleydex) und Mazu 204 Antischaum (1,6 g, gelöst in 12,5 L R.O. H₂O), wurden für 45 min bei 122°C sterilisiert. 800 mL Inokulum (5%) wurden anschließend zu jedem Fermenter (bei 0 Stunden) gegeben. Die Fermenter-Arbeitsparameter waren:
Temperatur: 28°C,
pH: eingestellt auf 5,5 mit 2 N NaOH und 2 N H₂SO₄,
Belüftung: 0,5 WM,
Druck: 20 kPa (0,2 bar),
Rühren (anfänglich): 80 cm/s, und
D.O.: auf über 40% eingestellt.
Station 14: 3×6 g/L Taston 154
Der Hefeextrakt (Taston 154) wurde in einer Konzentration von 96 g/L gelöst und für 1 h autoklaviert. Die Hefeextrakt-Zufuhren in 3 × 1 L Mengen (1,8%) wurden bei 0, 20 und 26 Stunden durchgeführt.
Bei 15 Stunden fiel DO unter 40% und das Rühren wurde schrittweise auf 175 cm/s von 15 bis 22 Stunden gesteigert. DO wurde anschließend durch Änderung des Luftstroms mit Sauerstoff eingestellt; Sauerstoff wurde in einem Luftstrom von 23 bis 72 Stunden zugegeben. Beginnend mit 36 Stunden, wurde das Rühren weiter gesteigert, um ein geeignetes Mischen sicherzustellen. Nach 48 Stunden wurde das Rühren auf 200 cm/s gesteigert; bei 72 Stunden auf 250 cm/s und bei 80 Stunden auf 280 cm/s. Bei 120 Stunden wurde das Rühren auf 290 cm/s gesteigert, um eine adäquate Temperaturkontrolle zu fördern. Bei 144 Stunden wurde das Rühren auf 280 cm/s verringert.
Station 15: 4 × 6 g/L Taston 154
Der Hefeextrakt (Taston 154), 384 g, wurde in 96 g/L gelöst und für 1 h autoklaviert. Das Zugeben von Hefeextrakt in 4×1 L Mengen (2,4%) wurde bei 0, 20, 26 und 32 Stunden durchgeführt.
Bei 16 Stunden fiel DO unter 40% und das Rühren wurde schrittweise auf 175 cm/s bei 23 Stunden gesteigert. DO wurde anschließend über 40% durch Änderung des Luftstroms mit Sauerstoff eingestellt; Sauerstoff wurde zu dem Luftstrom von 23 bis 72 Stunden zugegeben. Beginnend bei 36 Stunden, wurde das Rühren weiter gesteigert, um ein geeignetes Mischen sicherzustellen. Bei 48 Stunden wurde das Rühren auf 210 cm/s gesteigert; bei 72 Stunden auf 260 cm/s und bei 80 Stunden auf 290 cm/s. Bei 90 Stunden wurde das Rühren auf 280 cm/s verringert und bei 144 Stunden es auf 260 cm/s verringert.
Beobachtungen:
Bei der Beimpfung lag die Biomasse in beiden Fermentern in Form von sehr losen, federartigen, hyphalen Aggregaten vor. Bei 24 Stunden begannen sich Pellets zu bilden. Die Pellets waren klein (1–3 mm) mit einem kleinen zentralen Kern und einer breiten losen Umhüllung. Bei 48 Stunden waren die Pellets größer und besser definiert. Bei 72 Stunden war die Umhüllung enger und die Anwesenheit von vielen losen hyphalen Fragmenten zeigte an, dass die Pellets aufgebrochen waren. Bei 168 Stunden wiesen die Pelletkerne einen Durchmesser von 0,5–2 mm auf, wobei die Umhüllung mit der Hyphenaggregation in dicke Stränge vermindert war und viele kondensierte hyphale Aggregate vorlagen.
Die Fermenter schäumten in den ersten 24 Stunden nur schwach. Die Schaummenge stieg anschließend an und wurde durch manuelle Zugabe von Antischaum eingestellt, wenn der Schaumkopf größer als 2–4 cm war. Das Schäumen hatte sich bei 48 Stunden etwas abgesenkt, obwohl es sporadische Ausbrüche gab. Beide Fermenten schäumten in den Auslassfiltern einmal während dem Verlauf der Fermentationen. Die Fermentationen erforderten ungefähr 150 mL Antischaum.
Beide Fermenter sammelten eine beträchtliche Menge gewachsener Biomasse in dem Kopfraum an. Dies ist kein unübliches Problem bei der Myzel-Fermentation in kleinen Fermentern mit einem großen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen. Die Menge der gewachsenen Biomasse in Stn 15 schien während der letzten 24 Stunden zuzunehmen, wenn das abgesenkte Volumenniveau in einer beträchtlichen Menge an Spritzern (das Flüssigkeitsniveau näherte sich dem oberen Ende des Impellers) resultierte. Das Endvolumen in den Fermentern nach 168 Stunden betrug ungefähr 13 L.
Eine mikroskopische Untersuchung zeigte, dass bei 72 Stunden viele Bruchstücke in der Kulturnährbrühe vorhanden waren, und es gab einige Beweise von beschädigten und verkümmerten Pilzspitzen. Die Anwesenheit von Öltröpfchen in dem Cytoplasma wurde durch Nilrot-Anfärben bei 168 Stunden gezeigt. Die Öltröpfchen waren sehr klein und zahlreich im Gegensatz zu den manchmal beobachteten großen Öltröpfchen. Die Biomasse- und Ölausbeute zusammen mit dem Kohlenstoff- und Stickstoffverbrauch sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3 Fermentations-Zeitverlauf
Beispiel 6 (nicht erfindungsgemäß)
Verbesserte Ausbeute der Biomasse aus M. alpina – Dritter Lauf
Mit diese Reihe von Experimenten wurde versucht, die Menge an erhaltenem Produkt durch Erhöhen der Niveaus von Phosphat und Mineralien weiter zu steigern. Das Verfahren war im wesentlichen das aus Beispiel 5, außer dass Dextrose und Mazu 204 Antischaum in 11,5 L R.O. H₂O, eher als 12,5 L, gelöst wurden, um Raum für Salzlösungen zu schaffen, die bei 30 Stunden zugegeben wurden. Stn 14 erhielt zusätzlich Fe, Zn und Cu; Stn 15 erhielt zusätzlich Phosphat, genauso wie Fe, Zn und Cu.
Station 14: 3 × 6 g/L Taston 154
Der Hefeextrakt wurde bei 96 g/L, in 3 × 1 L Mengen, gelöst und für 1 Stunde autoklaviert. Ein Liter Aliquote der Hefeextraktlösung wurden bei 0, 22 und 28 Stunden zugegeben. Bei 22 und 28 Stunden nahm die Kohlendioxid-Abgaberate (CER, ein Anzeichen für die Metabolismusrate in dem Fermenten) exponentiell zu und die Fermentation hatte gerade begonnen, nach Base zu verlangen. Die zugeführten Salze enthielten:
FeCl₃ 6H₂O 480 mg
ZnSO₄ 7H₂O 240 mg
CuSO₄ 5H₂O 16 mg
FeCl₃ wurde in 1 L einer 5 g/L Citronensäure gelöst. Die verbleibenden Salze wurden zugegeben und der pH-Wert mit NaOH auf 4,5 eingestellt. Die Lösung wurde für 1 Stunde autoklaviert. Die Salze wurden bei 30 Stunden zugegeben.
Die anfängliche Rührrate des Fermenters betrug 50 cm/s, eher als 80 cm/s, wie ursprünglich geplant, weil das anfängliche Niveau der Flüssigkeit in dem Fermenten (13 L) in einem gerade eingetauchten oberen Ende des Impellers und die höhere Rührrate in einem signifikant stärkeren Spritzen resultierte. Bei 16 Stunden fiel D.O. unter 40% und das Rühren wurde schrittweise auf 175 cm/s bei 28 Stunden erhöht. D.O. wurde anschließend über 40% durch Ändern des Luftstroms mit Sauerstoff gesteuert. Bei 46 Stunden wurde das Rühren auf 190 cm/s erhöht, um ein Mischen zu gestatten. Das Rühren wurde weiter auf 200 cm/s bei 48 Stunden, auf 220 cm/s bei 51 Stunden, auf 235 cm/s bei 53 Stunden, auf 250 cm/s bei 56 Stunden, auf 260 cm/s bei 57 Stunden und auf 280 cm/s bei 70 Stunden gesteigert. Selbst bei dieser Rührrate (450 UpM) war die Durchmischung schlecht. Während ein Minimalkriterium "einiger Bewegung" aufrechterhalten wurde, war der Umsatz der Biomasse sehr langsam und einige Bereiche erreichten eine Stagnation. Die Zugabe weniger Tropfen Antischaum verringerte den Schaumkopf und entfernte stagnierende Taschen bzw. Bereiche. Bei 116 Stunden wurde das Rühren auf 265 cm/s verringert, und bei 120 Stunden wurde es weiter auf 250 cm/s verringert.
Der Fermenter begann bei ungefähr 18 Stunden zu schäumen. Das Schäumen wurde durch manuelle Zugabe von Antischaum gesteuert. Antischaum wurde zuerst bei 20 Stunden zugegeben. Bei 24 Stunden schäumte die Fermentation signifikant und erforderte die regelmäßige Zugabe von Antischaum. Bei 72 Stunden hatte das Schäumen zum größten Teil abgenommen. Die Fermentation erforderte jedoch immer noch die gelegentliche Zugabe von Antischaum.
Bei 24 Stunden lag die Biomasse in Form sehr loser Pellets (1–2 mm) und loser hyphaler Aggregate vor. Es gab eine beträchtliche Menge an Zelltrümmern. Bei 48 Stunden lag die Biomasse in Form sehr loser hyphaler Aggregate, sehr kleiner Pellets (1–2 mm) mit sehr kleinen Kernen und loser Umhüllung und kleiner kompakter Pellets (1–3 mm) ohne lose Umhüllung vor. Bei 96 Stunden lag die Biomasse in Form von kompakten, runden Pellets (1–2 mm), nadelförmigen Pellets (weniger als 0,5 mm) und loser hyphaler Aggregate vor. Ein Nilrot-Anfärben bei 144 Stunden zeigte die Anwesenheit von vielen, sehr kleinen Öltröpfchen in dem Myzel.
Station 15: 3 × 6 g/L Taston 154
Der Hefeextrakt wurde bei 96 g/L gelöst und für 1 h autoklaviert. Die Hefeextraktlösung wurde in 3 × 1 L Mengen bei 0, 22 und 26 Stunden zugegeben.
Bei 22 und 26 Stunden nahm CER exponentiell zu und die Fermentation hatte gerade begonnen, nach Base zu verlangen.
Eine Salzzufuhr wurde vorbereitet und enthielt:
KH₂PO₄ 77 g
FeCl₃ 6H₂O 480 mg
ZnSO₄ 7H₂O 240 mg
CuSO₄ 5H₂O 16 mg
Das FeCl₃ wurde in 500 ml von 5 g/L Citronensäure gelöst. Die verbleibenden Salze wurden zugegeben und der pH-Wert mit NaOH auf 4,5 eingestellt. KH₂PO₄ wurde in 500 ml R.O. Wasser gelöst. Beide Lösungen wurden für 1 Stunde autoklaviert und anschließend auf 23°C gekühlt, bevor sie vereint wurden und dem Fermenten bei 30 Stunden zugegeben wurden.
Die anfängliche Rührrate in dem Fermenten betrug 50 cm/s, eher als 80 cm/s, wie ursprünglich geplant, weil das anfängliche Niveau der Flüssigkeit in dem Fermenter (13 L) in einem gerade eingetauchten oberen Ende des Impellers und eine höhere Rührrate in einem signifikant stärkeren Spritzen resultierte. Bei 16 Stunden fiel D.O. unter 40% und das Rühren wurde schrittweise auf 175 cm/s bei 27 Stunden erhöht. D.O. wurde anschließend über 40% durch Ändern des Luftstroms mit Sauerstoff gesteuert. Bei 41 Stunden wurde das Rühren auf 210 cm/s gesteigert, um mindestens eine minimale Durchmischung zu gestatten. Das Rühren wurde weiter erhöht auf 220 cm/s bei 42 Stunden, auf 230 cm/s bei 46 Stunden, auf 235 cm/s bei 51 Stunden und auf 240 cm/s bei 70 Stunden. Bei dieser Rührrate (410 UpM) war die Durchmischung nur schlecht bis mäßig. Ein minimales Niveau an Biomassebewegung wurde aufrechterhalten. Bei 80 Stunden wurde das Rühren auf 205 cm/s verringert.
Der Fermenten begann bei ungefähr 18 Stunden zu schäumen. Das Schäumen wurde durch manuelle Zugabe von Antischaum gesteuert. Antischaum wurde erstmals bei 17 Stunden zugegeben. Bei 20 Stunden Fermentation war das Schäumen signifikant und erforderte die regelmäßige Zugabe von Antischaum. Das Schäumen hatte bei 72 Stunden stark abgenommen. Die Fermentation forderte jedoch immer noch die gelegentliche Zugabe von Antischaum.
Bei 24 Stunden lag die Biomasse in Form sehr loser Pellets (1–2 mm) und loser hyphaler Aggregate vor. Es gab eine beträchtliche Menge von Zelltrümmern. Bei 48 Stunden lag die Biomasse in Form sehr loser hyphaler Aggregate, sehr kleiner Pellets (1–2 mm) mit sehr kleinen Kernen und loser Umhüllung und sehr kompakter Pellets (1–3 mm) ohne lose Umhüllung vor. Bei 96 Stunden lag die Biomasse in Form von runden Pellets, 1–2 mm im Durchmesser, viele mit loser, haariger Umhüllung und vieler loser hyphaler Fragmente vor. Ein Nilrot-Anfärben bei 144 Stunden zeigte die Anwesenheit von vielen kleinen Öltröpfchen in einigen Myzelien und auch die Anwesenheit von sehr großen Öltröpfchen in anderen Myzelien.
Stn 15, das sich von Stn 14 nur durch die Zugabe von Phosphat unterschied, zeigte ein besseres Mischverhalten in der Fermentation bei im allgemeinen niedrigeren Rührraten. Stn 15 zeigte auch eine "losere" Biomassenmorphologie. Die Biomasse- und Ölausbeute, genauso wie der Kohlenstoffverbrauch, sind in Tabelle 4 gezeigt. Der größere Glucoseverbrauch (82 g/L für Stn 15, verglichen mit 64 g/L für Stn 14), höhere Biomassenansammlung und die Anwesenheit großer Öltröpfchen in Myzelportionen kennzeichnen den Fermenten, der mehr Phosphat enthält.
Tabelle 4 Fermentationszeitverlauf
Beispiel 7 (erfindungsgemäß)
Herstellung von Arachidonsäure-enthaltender M. alpina-Biomasse in großem Maßstab
Ein Kulturfermenter, der GYE-Medium (50 g/L Dextrose und 6 g/L Taston 154) enthielt, wurde aus einem Kulturfermenter beimpft. Die Temperatur von 28°C wurde aufrechterhalten und das anfängliche Rühren auf 130–160 cm/s (etwa 43 UpM) eingestellt. Der anfängliche Gefäßdruck betrug 0,422 kg/cm² (6 psi) und die anfängliche Belüftungsrate wurde auf 0,25 WM eingestellt. Der pH wurde vor Sterilisierung auf 5,0 eingestellt, wobei anschließend, nach Sterilisierung, der anfängliche Fermenter-pH-Wert auf 5,5 eingestellt wurde. Das Sauerstoffniveau in dem Medium wird durch die folgende Sequenz bei D.O. ≥40% gehalten: (i) Steigerung des Gefäßdrucks auf 0,773 kg/cm² (11 psi), (ii) Steigerung des Rührens von 156 auf 175 cm/s Impellerblattspitzengeschwindigkeit und (iii) Steigerung der Belüftung auf 0,5 VVM. Das Schäumen wurde durch Zugabe von Antischaum Dow 1520-US, bei Bedarf, gesteuert. (Ungefähr 0,1 ml/L Antischaum sollte zu dem Medium vor der Sterilisierung zugegeben werden, um das Schäumen zu verhindern). Nach Beimpfung wurde die Kultur bei einem pH-Wert von ≥5,5 mit 8 N NaOH gehalten.
Innerhalb von 12 Stunden nach dem pH-Anstieg über 6,0 wurden die Inhalte des Kulturfermenters in den Hauptfermenter überführt. Das Medium des Hauptfermenters enthielt:
80 g/L Dextrose (ADM)
16 g/L Sojamehl (ADM nutrisoy)
30 mg/L FeCl₃·6H₂O (Sigma/Aldrich)
1,5 mg/L ZnSO₄·7H₂O (Sigma/Aldrich)
0,1 mg/L CuSO₄·5H₂O (Sigma/Aldrich)
1 mg/L Biotin (Sigma/Aldrich)
2 mg/L Thiamin·HCl (Sigma/Aldrich)
2 mg/L Pantothensäure (Halb-Calciumsalz) (Sigma/Aldrich)
(Eingestellt auf pH 4,8–5,0 vor Sterilisierung)
Beimpfter Hauptfermenten mit Kulturfermenten (11,8%). Die Fermentationstemperatur wurde bei 28°C gehalten. Das anfängliche Rühren wurde auf 162 cm/s (ca. 23 UpM), der anfängliche Gefäßdruck auf 0,422 kg/cm² (6 psi) und die anfängliche Belüftungsrate auf 0,15 WM (ca. 300 scfh) eingestellt.
Das Sauerstoffniveau in dem Medium wurde durch (i) Steigern des Gefäßdrucks auf 0,773 kg/cm² (11 psi), (ii) Steigern des Rührens auf 300 cm/s Impellerblattspitzengeschwindigkeit (schrittweise von ca. 30 cm/s), und iii) Erhöhen der Belüftung auf 0,5 WM bei D.O. ≥40% beibehalten.
Das pH-Profil wird gemäß dem folgenden pH-Kontroll-Protokoll eingestellt:

– Der anfängliche pH-Wert wird nach Sterilisierung auf 5,5 eingestellt. Beibehalten des pH-Werts bei ≥5,5 mit 8 N NaOH.
– Bei 24–36 Stunden nach Beimpfen, Zugabe von: 2 g/L KH₂PO₄ (110 kg in ca. 700 L H₂O).
– Bei 48 Stunden, wenn die Dextrosekonzentration ≥60 g/L beträgt, Änderung des pH-Einstellpunkts auf ≥6,1.
– Bei 72 Stunden, Beginn der langsamen Zunahme des pH-Einstellpunkts auf ≥6,6 bei einer Rate von ca. 0,1 pH-Einheiten pro Stunde.
– Aufrechthalten des pH-Werts unter 7,3 durch H₂SO₄-Zugabe, wenn nötig.

Von dem Fermenter wurden alle 12 Stunden für die Biomasse- und Fettsäureanalyse Proben entnommen und die Ernte begann ungefähr 3 Tage nach Erhöhen des pH-Werts auf ≥6,6 (etwa 6 Tage nach Beimpfen). Die Dichte der Trockenbiomasse sollte ≥24 g/L betragen. Die Dextrosekonzentration in der Nährbrühe sollte von 80 g/L auf ≤14 g/L abgenommen haben.
Die Ernte wurde durch Führen der gesamten Kulturnährbrühe durch einen Rotations-Vakuumfilter zur Trennung des Myzels von dem verbrauchten Medium geführt.
Die Ergebnisse von zwei typischen Fermentationsläufen gemäß dem Verfahren dieses Beispiels sind in den Tabellen 5 und 6 gezeigt.
Tabelle 5. Fortschreiten der M. alpina-Fermentation
Tabelle 6. Fortschreiten der M. alpina-Fermentation

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Arachidonsäure-enthaltenden Öls, wobei das Öl Triglyceride enthält, wobei mindestens 25% der Fettsäurereste Arachidonsäure (ARA) sind und die Menge der Eicosapentaensäure-(EPA)-Reste in dem Öl nicht mehr als ein Fünftel der Menge der Arachidonsäure(ARA)-Reste beträgt, umfassend: (a) das Züchten von Mortierella alpina in einem belüfteten Fermenten, der ein Fermentationsmedium enthält, (b) das Beibehalten des pH-Werts zwischen 5 und 6 am Beginn der Züchtung, (c) das Beibehalten des pH-Werts zwischen 7 und 7,5 am Ende der Züchtung, und (d) das Ernten der Biomasse aus dem Fermenten und (e) das Rückgewinnen des Arachidonsäure-enthaltenden Öls aus der Biomasse.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Kohlenstoffquelle in einer Menge, die zu mehr als 80 g/L Glucose äquivalent ist, und eine Stickstoffquelle in einer Menge, die zu mehr als 15 g/L Hefeextrakt äquivalent ist, in das Fermentationsmedium im Verlauf der Fermentierung zugegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Kulturmedium mindestens 35% des Luftsättigungsgehalts beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Stickstoffquelle in zwei oder mehrere gleiche Teilmengen geteilt wird, welche in den Fermenter zu verschiedenen Zeiten eingespeist werden, wobei mindestens eine Teilmenge in den Fermenter zu einer Zeit eingespeist wird, die von der Zeit verschieden ist, bei der die Kohlenstoffquelle in den Fermenter gebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ferner rohes Arachidonsäure-enthaltendes Öl aus der Biomasse durch Extraktion mit einem nicht-polaren Lösungsmittel rückgewonnen wird und das rohe Öl durch Extraktion mit einem polaren organischen Lösungsmittel gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das nicht-polare Lösungsmittel Hexan ist.
Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei das polare Lösungsmittel Aceton, Ethanol oder Isopropylalkohol ist.
Unmodifiziertes Pilz-Triglyceridöl, erhältlich aus M. alpina, wobei mehr als 50% der Fettsäurereste Arachidonsäure-(ARA)-Reste sind, die in Triglyceridform vorhanden sind, und wobei das Öl nicht mehr als ein Zehnte! so viel Eicosapentaensäure (EPA) wie ARA umfaßt.
Öl nach Anspruch 8, umfassend mindestens 50% Arachidonsäure (ARA) in Triglyceridform und im wesentlichen keine Eicosapentaensäure (EPA).
Verfahren zum Versorgen von Säuglingsnahrung mit Triglycerid, das Arachidonsäure (ARA) enthält, welches das Zugeben des Öls nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 zu einer Säuglingsnahrung in einer Menge umfaßt, die ausreichend ist, einen Arachidonsäure-(ARA)-Gehalt bereitzustellen, welcher der Menge an Arachidonsäure (ARA) in menschlicher Muttermilch entspricht.
Säuglingsnahrung, umfassend ein Triglycerid, das Arachidonsäure (ARA) in einer zu der Menge in menschlicher Muttermilch vergleichbaren Menge enthält, wobei die Arachidonsäure (ARA) durch Zugeben einer ausreichenden Menge des Öls nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 zu der Säuglingsnahrung zugeführt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Versorgung eines Menschen mit Bedarf an zusätzlicher Arachidonsäure (ARA), umfassend das Formulieren des Öls nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 zu einer pharmazeutisch verträglichen Dosierungsform, wobei das Arzneimittel derart formuliert wird, um eine Menge Arachidonsäure (ARA) bereitzustellen, die zur Versorgung des Menschen mit zusätzlicher Arachidonsäure (ARA) wirksam ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Arzneimittel derart formuliert ist, um 0,2 bis 0,8 Gramm Arachidonsäure (ARA)/Tag bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, wobei das Arzneimittel für eine enterale Verabreichung pharmakologisch verträglich ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, wobei das Arzneimittel für eine parenterale Verabreichung pharmakologisch verträglich ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, wobei das Arzneimittel für eine topische Verabreichung pharmakologisch verträglich ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei der Mensch eine schwangere oder stillende Frau ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei der Mensch mit Bedarf an zusätzlicher Arachidonsäure (ARA) an einer neurologischen Störung leidet.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die neurologische Störung ein dystones Syndrom, Schizophrenie oder eine peroxisomale Störung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, wobei der Mensch mit Bedarf an zusätzlicher Arachidonsäure (ARA) an einem Krankheitszustand leidet, der mit vermindertem Serumgehalt an Arachidonsäure (ARA) verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Krankheit eine Leberkrankheit, Phenylketonurie oder Mukoviszidose ist.
Kosmetische Zusammensetzung, umfassend das Öl nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei das Öl in der Zusammensetzung in einer Menge vorhanden ist, die wirksam ist, mitzuhelten, den Hautton beizubehalten, wenn die Zusammensetzung topisch angewendet wird.