CN103667068A

CN103667068A - 一种由微生物（单细胞真菌高山被孢霉）产生的富含花生四烯酸的油及其制备工艺

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Publication number: CN103667068A
Application number: CN201210343057.2A
Authority: CN
Inventors: 钱云; 周洁; 伯纳德·波拉
Original assignee: Roquette Freres SA
Current assignee: Roquette Freres SA
Priority date: 2012-09-14
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2014-03-26
Also published as: AU2013316906A1; AU2013316906B2; KR102055229B1; DK2895628T3; EP2895628B1; EP2895628A1; US20150252395A1; JP2015529465A; JP6118904B2; US9476075B2; KR20150052084A; CN104662147B; ES2703520T3; CN104662147A; PL2895628T3; WO2014041303A1

Abstract

本发明涉及一种能够大量生产花生四烯酸（或ARA）的高山被孢霉菌株，一种使用该菌株的相关脂类化合物的生产方法，以及使用该菌株制备的产物和化合物。

Description

一种由微生物(单细胞真菌高山被孢霉)产生的富含花生四烯酸的油及其制备工艺

本发明涉及一种富含花生四烯酸油的新化合物，其是由微生物产生，且最好是被孢霉类的单细胞真菌（丝状霉）产生，本文指的是高山被孢霉的特殊菌株。

脂类、蛋白质和碳水化合物是三大营养素。

脂类中又特别包括甘油三酯和磷脂。

甘油三酯约占口服食用脂类的95%。在人体内，它们主要存在于脂肪组织，是贮存能量的主要形式。

磷脂是结构性脂类，它们是细胞膜的组成部分，尤其是保证细胞膜的流动性。

甘油三酯和磷脂的主要组成部分是脂肪酸，脂肪酸既可获自食物，也可以通过人体自身合成。

从生物化学角度，脂肪酸可分为（根据脂肪酸分子包含的双键数量）饱和脂肪酸（AGS）、单不饱和脂肪酸（AGMI）和多不饱和脂肪酸（AGPI）。

从生理学角度，我们将它们分成：

-必需脂肪酸：人体成长和正常运行必需，但又不能自身合成的脂肪酸；

-“条件性”必需脂肪酸，是保证细胞正常生长和生理功能的主要物质，如果是通过食物获取的，则可以通过它们的前体化合物获取。如果没有它们必需的前体，则为严格必需脂肪酸。

-非必需脂肪酸。

所有必需脂肪酸和“条件性”必需脂肪酸组成了必需脂肪酸。

其它脂肪酸则未非必需脂肪酸。

我们将必需脂肪酸分成两大类：omega 6脂肪酸（或AGPI n-6），其前体和主要代表是亚油酸（LA），以及omega 3脂肪酸（或AGPI n-3），其前体是α-亚麻酸（ALA）。

在非必需脂肪酸中，尤其包括：

-omega 3脂肪酸类的二十碳五烯酸（EPA），

-油酸、食物中大量存在的单饱和脂肪酸以及

-饱和脂肪酸。

除了产自花生、红花、油菜、玉米、亚麻、核桃、芝麻、大豆、向日葵外，多种不饱和脂肪酸还可以由多种单细胞生物化合物（藻类、真菌等）产生。

花生四烯酸（“ARA”）是我们在有些植物油中发现的一种长链脂肪酸。

这是一种C 20:4（n-6、n-9、n-12、n-15）多不饱和脂肪酸，比如20个碳原子和碳原子上的四个乙烯键5(n-15)、8(n-12)、11(n-9)和14(n-6)组成的脂肪酸。

这种脂肪酸也被称作“四烯酸”，因为它具有4个不饱和有机物（4个碳-碳双键）。

我们还可在专题著作中发现把它称作“全顺式-5,8,11,14–二十碳四烯酸”（其中“顺式”定义了双键的构型，而且“全部”双键均为“顺式”构型）。

ARA是人体内最丰富的一种C20的AGPI，人体可以通过亚油酸合成。

机体、肌肉和血液中都存在花生四烯酸。

ARA是多种生物活性化合物的重要前体，这些生物活性化合物被统称为“类二十烷酸”，该家族包括前列腺素、凝血氧烷和白细胞三烯。

这些类二十烷酸对脂蛋白代谢、血液流变、肌肉紧张、白细胞功能、血小板激活和细胞生长具有调节作用。

ARA还是人乳乳脂成分之一，并被视为婴幼儿神经最佳生长必不可少的物质。科学家和食品监管机构努力获得与人乳中的长链脂肪酸性质一致的婴幼儿制品，他们建议在可在婴幼儿制品中添加花生四烯酸，尤其是用于给早产儿的配方中。

用于婴幼儿制品的含有花生四烯酸的油中最好特别含少量或不含其他AGPI（比如，二十碳五烯酸或EPA）。

实际上并不推荐其他AGPI，因为其中有些脂肪酸可能与婴幼儿制品中使用的花生四烯酸互相干扰，并且/或者可能妨碍含有花生四烯酸的油与其他油类混合，从而损害人乳中脂肪酸的恰当比例（重组人乳）或其他希望的应用。

此外，ARA还有多种应用，比如不仅用于人类食品的制备，还用于动物的食物中。

实际上ARA在动物营养学方面有许多公认的性质：

-消炎作用，因为ARA是系列2前列腺素和大麻素的前体（主要在猪身上得到证明），

-在鱼类（鲷鱼）身上的抗应激性，通过与前列腺素不同的途径，

-在猪身上的调节免疫性。

此外还进行了传递研究，以显示花生四烯酸在肉体、奶和产出的卵内的转移。

当从微生物中被分离出来时，商业产物的主要可用形式为通过被孢菌类的丝状霉发酵获得的富含花生四烯酸的油。

在EP 276541中描述了采用alpina，hygrophila，spinosa被孢菌生产ARA的工艺。

国际专利申请WO 94/28913则描述了一种使用高山被孢霉来生产基本上没有EPA的ARA的发酵工艺。

然而，正如EP 726.321中所断定的，用来测试其生产ARA能力的所有被孢菌（alpina，hygrophila，spinosa，schmuckeri和carmagensis），其中生产能力最优秀的是被孢菌schmuckeri或carmagensis的菌株。

所以，ARA生产领域的专家们承认，与M.alpina、hygrophila或spinosa相比，选择M.Schmuckeri或M.carmagensis菌株，才能保证最佳效率、生产率和重量。

然而，我们仍旧需要具备可以生产ARA含量高、并且具有长链饱和脂肪酸或长链多不饱和脂肪酸全部特性的优质油。

此外，对于众多国家监管当局而言，婴儿食品中只允许使用高山被孢霉。

首先，要由申请公司提供富含花生四烯酸并同时具有下列成分的油的新配方：

-含有少量除ARA以外的多不饱和脂肪酸（比如EPA），

-含量有限的一些长链饱和脂肪酸（比如山嵛酸、肉豆蔻酸、棕榈酸或木焦油酸）。

此外，申请公司注意到含有少量这些饱和脂肪酸可以获得在透明度、冷浊度低方面比商品油重量更好的油。

申请公司还关注调试比现有技术中描述的工艺更高效和更经济的替代生产工艺，所以在研究中鉴别了具有杰出的生产花生四烯酸的能力的高山被孢霉的新菌株，因为它可以生产50%的花生四烯酸（这里的%表示占全部脂肪酸的重量百分百）。

因此，与在M.Schmuckeri或M.carmagensis类型的菌株中进行研究的技术先例不同，申请公司找到了生产ARA的最佳菌株。

此外，除了非凡的花生四烯酸生产能力之外，该菌株还可以获得（这里的%表示占全部脂肪酸的重量百分百）：

-低于0.5%，最好是低于0.2%的EPA，

-低于0.5%，最好是低于0.2%的肉豆蔻酸（C14:O），

-低于9%，最好是低于7%的棕榈酸(C16:0)，

-低于3%，最好是低于2.5%的山嵛酸(22:0)，以及

-低于3%，最好是低于2.5%的木焦油酸(C 24:0)。

2012年6月12日将这种高山被孢霉菌株交存至法国的巴斯德研究所的法国国家微生物保藏中心（CNCM），编号为CNCM I-4642，同时交存至中国的武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），中华人民共和国武汉市，邮编：430072，编号为M 209116。

它的特征是：ARN 25S编码基因D1–D2部位的顺序排列（ID序列号1）：

1TTAAACAGTG CGTGAAATTG TTGAAAGGGA AACGCTTGAC ACCAGTCATG CGAGCGGAAA

61ATCAGTCTTT TGCAGTGGGG AGTTGTGTGG GTTCGGACCG CAAGGCCGGC CTGTGCTGCA

121TCTCTGCTGT AAGTGATGCA CTTTTTCGTT TGCAGGCCAA CATCAGTTTC TTCTGCTGGA

181CAAAACTCTT GAGAAGGTAG CAGCTTTGGC TGTGTTATAG CTCTTGAGCG ATACAGTGGA

241GGGGACTGAG GTTTTCGCAG CGCGTGCTCT CGGGCAAGGC TGATTGGGTG CTATGGGATC

301GTTCGGTGTA CAATGCATGC ATTTTGCGCC GTGTCTTTTC TGTACTCGCT CAACTCGGCT

361C

这可以识别它是一种高山被孢霉类型的菌株。

所以，本发明涉及的是2012年6月12日保藏在CNCM的编号为I-4642的高山被孢霉菌株。

在本申请的下面内容中该菌株将被称为“CNCM I-4642”。

本发明还涉及该菌株的一种变种或它的一种衍生菌株，上述变种或衍生菌株均保留了其生产高含量花生四烯酸的属性。尤其是它可以生产占全部脂肪酸重量50%以上的花生四烯酸。

它特别涉及通过基因突变或基因工程从CNCM I-4642菌株中获取的一种高山被孢霉菌株。基因突变可以是定向的或随机的。

本发明还涉及该菌株的制备方法，包括CNCM I-4642菌株的基因突变或基因工程，以及可以选择生产占全部脂肪酸重量50%以上的花生四烯酸的菌株的随意性筛选阶段。

发明涉及CNCM I-4642菌株或保留花生四烯酸生产能力的它的变种或衍生菌株的培养方法，包括在合适的培养基和合适的发酵条件下培养菌株的阶段。

此外发明还涉及从CNCM I-4642菌株或它的变种或衍生菌株中萃取油的形式制备花生四烯酸的方法，其特征是采用包含下列步骤的方法来制备含有花生四烯酸的油：

o 在异养条件下培养菌株，以生产占生物质总重量40到55%的脂类，最好是占重量40到50%的脂类，脂类重量占到45%左右则更好，并ARA的重量占全部脂肪重量的50到55%。

o 收集如此制备的生物质，

o 使上述生物质干燥，

o 使用己烷和丁烷构成的组中选择溶剂，尤其是液体丁烷，萃取油，并且，

o 精炼并收集如此萃取出的油。

在异养条件下进行培养。通常培养阶段包括使菌株再生的预培养阶段，然后是培养阶段或更确切地说，发酵阶段。后者是相关脂类化合物的生产阶段。

申请公司推荐对CNCM I-4642菌株采取五步骤的需氧发酵，下面将举例说明。

前四个步骤的特征是在培养基中培养CNCM I-4642菌株，在培养基中根据生物质、全部脂类和花生四烯酸的动态产量来调节碳源的供应。

在这四个阶段，值得注意的是，与通过被孢菌发酵生产花生四烯酸的其他先进工艺相反，微生物生长方面的碳源供应没有或几乎不受限制。

此外，在第五个阶段，培养基的碳源浓度低，最多为重量的1%，而且甚至停止碳源供应。

在该阶段，微生物生长的碳源受到限制或有限，从而使微生物代谢它们自身的脂肪质和/或脂类。

需要注意的是，与专题著作中描述的相反：

-这里不必调节/控制培养基中的溶氧浓度，而是要尽量保持。因此这里无需调节氧气供应来提供ARA的产量。

-也不必具体规定培养基中磷、钾、钠、镁和钙的供应量，尤其是为了控制发酵期间微生物菌丝形态。

接着，本发明涉及在发酵结束后，收集富含相关脂类化合物的生物质，这里指的是ARA。

发酵阶段结束后，生物质可以：

-用巴斯德法灭菌，从而使生物质中的脂类降解酶（脂肪酶）失活，也要使培养基中的脂类降解酶（脂肪酶）失活，

-采用一切专业人士已知的方法从发酵培养基中收集生物质，比如可以从发酵装置中萃取生物质并采用微滤或离心法简单浓缩，或者使用水溶剂连续浓缩-稀释进行清洗。

因此本发明涉及含有CNCM I-4642菌株或保留ARA生产能力的它的变种或衍生菌株的生物质。

特别的是，在发酵或培养阶段结束后，该生物质富含有关的脂类化合物，比如ARA。

它能够通过本文件中描述的方法获取。

发酵后，生物质可能含有：

-占生物质总重量40到55%的脂类，最好是占重量40到50%的脂类，脂类重量占到45%左右则更好，并且

-占全部脂肪酸重量50到55%的ARA。

除了生物质之外，本发明还涉及从含有CNCM I-4642菌株或保留花生四烯酸生产能力的它的变种或衍生菌株中制备的萃取物或细胞裂解物。

特别的是从发酵后收集到的生物质中制备的萃取物或裂解物。

所以，该萃取物或裂解物富含有关的脂类化合物，比如ARA。它尤其可以含有占重量40到55%的脂类，最好是占重量40到50%的脂类，脂类重量占到45%左右并且含有占全部脂肪酸重量50到55%的ARA则更好。

可采用各种途径使细胞断裂，从中萃取脂类，其中包括机械方法、化学方法和酶。

本发明还涉及使用己烷和丁烷构成的组中选择溶剂，尤其是液体丁烷，从生物质中萃取的油，尤其是多次连续萃取。

将溶剂真空稀释后，即可收集到油。

因此，ARA的生产方法包括：

-采集生物质，

-干燥生物质或制备细胞裂解物，

-萃取油，并且

-精炼油。

从来自巴斯德发酵的肉汤培养基的干燥的微生物生物质中萃取油。

采集并干燥生物质，然后使用诸如液体丁烷作为溶剂，从干燥的生物质中萃取油。

最后，油含有占全部脂肪酸重量50%以上的ARA和90%以上的甘油三酯。

最后，本发明涉及在食品领域，特别是婴儿食品化合物制备中使用通过本发明的任意一项工艺生产的ARA或富含ARA的油。

因此，它涉及一种用于食品领域的化合物的制备方法，包括通过本发明的任意一项工艺生产ARA或富含ARA的油，然后通过添加上述ARA或富含ARA的油来制备用于食品领域的化合物。

本发明特别涉及包含CNCM I-4642菌株或保留花生四烯酸生产能力的它的变种或衍生菌株的产物或化合物，经培养或发酵上述菌株后得到的生物质，上述菌株的萃取物或细胞裂解物。它还涉及包含通过本发明任意一项工艺生产的富含ARA的油的产物或化合物。上述产物或化合物富含相关的脂类化合物，比如花生四烯酸（或ARA）。特别是上述产物或化合物富含ARA。最好，它们能含有占全部脂肪酸重量50%以上的花生四烯酸（或ARA）。此外，它们具有：

-低于0.5%，最好是低于0.2%的EPA，

-低于0.5%，最好是低于0.2%的肉豆蔻酸（C14:O），

-低于9%，最好是低于7%的棕榈酸(C16:0)，

-低于3%，最好是低于2.5%的山嵛酸(22:0)，以及

-低于3%，最好是低于2.5%的木焦油酸(C 24:0)。

最好，该产物或化合物是食品化合物或膳食补充剂或营养化合物。

它的形式可以是液体或固体。

特别地，产物可以含有细胞冷冻干燥制品或上述细胞的裂解物。

该产物或化合物的形式可以是粉末、颗粒、胶囊剂、胶囊或片剂，最好是粉末形式。

或者，产物或化合物为液体形式，并且含有通过本发明任意一项工艺获得的原油或精制油。

以下实例将有助于更好地理解本发明，它们是说明性的，而非限制性。

例1：通过高山被孢霉CNCM I-4642菌株生产原油

在含有从体积较小的两组发酵装置中接种的培养基的发酵装置中进行主发酵：

快速预培养（6x 200ml）

-在含有3%葡萄糖、1.5%酵母粉（氮含量7%）的培养基中，

-温度：28°C，

-搅拌速率：240rpm，

-时间：24–48小时，

预培养结束后：6x 200ml全部混合在3L的反应器中。

发酵的第一阶段（1m ³ 的反应器）

-在含有3%葡萄糖、1.5%酵母粉（氮含量7%）的培养基中，

-接种率：0.1到1%vol，

-温度：28°C,

-压力：0.03mPa,

-通风率：最大，

-无需机械搅拌，

-时间：32到48小时，

-有效容积：总容积的70%，

-pH值：6到6.5（用碱调节），

-最终体积：750l。

发酵的第二阶段（10m ³ 的反应器）

-在含有4%葡萄糖、1.5%酵母粉（氮含量7%）、0.2%防霉剂（向日葵油）的培养基中，

-接种率：10到15%vol，

-温度：28°C，

-压力：0.03mPa，

-通风率：最大，

-无需机械搅拌，

-时间：24到32小时，

-有效容积：总容积的70%，

-pH值：6到6.5（用碱调节），

-最终体积：7.5m³。

主发酵（85m ³ 的反应器）

-在含有3%葡萄糖、2%酵母粉（氮含量7%）、0.2%防霉剂（向日葵油）的培养基中，

-碳氮比（C/N）：7到8，

-接种率：15到25%vol，

-温度：27–28°C，

-通风率：最大，

-无需机械搅拌，

-时间：155到165小时，

-有效容积：总容积的70%，

-pH值：7-7.1，

-最终体积：60–63m³。

如果致力于描述该主发酵阶段，请记住这是个需氧发酵过程。

按照进行通风以及无需机械手段使细胞与培养基混合为标准确定发酵反应器:这里最好是直径为3.5米、高8.7米的泡罩塔（“bubble column”）。

发酵装置的总容积85m³。发酵时间一般为6到7天（155到165小时），而且温度在27到28°C。

发酵中使用恰当而简单的培养基。

最好是仅由葡萄糖组成的碳源，和由酵母粉组成的氮源（含氮量为7%）。

碳氮摩尔比保持在7到8。

氮源和碳源分别杀菌并且分别添加。

在葡萄糖发酵开始时一次性提供氮源，并以“分批补料”（fed批次）方式添加。

培养基为含有下列物质的水：

-防霉剂（食品级硅质防霉剂）和/或向日葵油，控制生成的苔藓水平，以及

-氢氧化钠（NaOH），将pH值控制在6.5到7.1的最佳范围内。

最适宜的温度最好是27到28°C。

发酵期间搅拌培养基。

通过培养基中的消毒空气的“起泡”产生的通风进行搅拌，并且“起泡”作用为细胞提供了氧气。

对通风不进行控制，并且整个发酵期间将通风保持在最大状态，即0.8到1VVM的范围内。

不进行补充的机械搅拌来帮助通风。

发酵结束后，如果葡萄糖含量等于零，并且pH值增加到7.5以上，（这表明细胞开始溶解），则停止反应器，并且可以通过过滤（压滤机）从发酵罐中取出微生物。

在85m³的反应器中发酵期间，控制培养基中碳源的总量，五个阶段明确区分如下：

1.第一阶段

这一阶段从t=0小时开始，并且一般在20到24小时后结束。

在这段期间内，碳源过多，并且不应限制细胞的生长。

在此期间不会添加碳源，并且培养基中还原糖的含量从30g/l下降到20g/l。

不控制pH值；其数值从6.3微降至5.7。

第一阶段结束后，生物质浓度可以达到16g/l培养基，全部脂类含量达到4.7g/l培养基以上，并且花生四烯酸含量最好是大于1.3g/l培养基。

2.第二阶段

这一阶段从t=20小时开始，并且一般在50到55小时后结束。

在这段期间内，不应限制可使用的碳源，并且正常情况下的添加速度应当略低于细胞的消耗率。

添加葡萄糖溶液（25g/l），平均比例为0.15M碳/kg培养基每小时（单位是碳源中的碳摩尔量），并且培养基中还原糖的含量从20g/l下降到11g/l。

调节pH值并通过添加NaOH溶液将其控制在5.7到7。

第二阶段结束后，生物质浓度可以达到21g/l培养基，全部脂类含量达到8.3g/l培养基以上，并且花生四烯酸含量最好是大于3.1g/l培养基。

前两个阶段的目的是生产主要生物质。

3.第三阶段

这一阶段从t=55小时开始，并且一般在100到105小时后结束。

在这段期间内，并不一直限制可使用的碳源，并且正常情况下的添加速度应当略低于细胞的消耗率。

添加葡萄糖溶液（25g/l），平均比例为0.08M碳/kg培养基每小时，并且培养基中还原糖的含量从11g/l下降到4g/l。

调节pH值并通过添加NaOH溶液将其控制在7到7.1。

第三阶段结束后，生物质浓度可以达到24g/l培养基，全部脂类含量达到11g/l培养基以上，并且花生四烯酸含量最好是大于5g/l培养基。

4.第四阶段

这一阶段从t=100小时开始，并且一般在130到135小时后结束。

在这段期间内，略微限制碳源，并且正常情况下的添加速度应当略低于细胞的消耗率。

添加葡萄糖溶液（25g/l），平均比例为0.04M碳/kg培养基每小时，并且培养基中还原糖的含量从4g/l下降到1g/l。

不控制pH值，pH值会略微增加，从7.1上升到7.3。

第四阶段结束后，生物质浓度可以达到26g/l培养基，全部脂类含量达到12.4g/l培养基以上，并且花生四烯酸含量最好是大于6.2g/l培养基。

第三和第四阶段的目的是生产主要脂类。

5.第五阶段

这一阶段从t=130小时开始，并且一般在160到170小时后结束。

在这段期间内，限制可使用的碳源，并停止碳源的供应。

培养基中还原糖的含量从1g/l迅速下降到0g/l。

不控制pH值，pH值会从7.3略微上升到7.5。

第五阶段结束后，生物质浓度可以达到27g/l培养基，全部脂类含量达到14g/l培养基以上，并且花生四烯酸含量最好是大于7.6g/l培养基。

第五阶段的目的是在不影响全部脂类浓度的情况下增加花生四烯酸的含量。

当pH值超过7.5时，这表明细胞开始溶解，则停止反应器，将发酵培养基在70°C下消毒30分钟，并且在30°C-25°C下冷却后，通过压滤机从发酵装置中取出微生物。

下面的表I中说明了该发酵操作的主要指标：

表I.

Nd:未确定。

下面的表II中列出了该发酵的小结

表II

10批85m3“批次”上测得的平均结果

例2：CNCM I-4642菌株生物质的回收和封装

例1的发酵操作第五阶段结束后，将发酵培养基在70°C下消毒30分钟，并且在30°C-25°C下冷却后，接着就可以从通过压滤机械脱水的发酵培养基中回收微生物。

经过滤并用清水（0.5V水/1V培养基），生物质块状物的干物质含量为65到75%。

在第二阶段，将生物质块状物做成0.5到1.5cm²的颗粒，然后使用流化床干燥器干燥颗粒。

干燥时间约为45到55分钟，进气温度调至150°C。

如果出气温度超过95到100°C，则停止进气。

在室温下冷却生物质，并且将生物质储存在25kg的氮气袋中,以限制氧化。

下面的表III中介绍了生物质的成分。

表III.

10批85m³“批次”上测得的平均结果

例3.从干燥的生物质颗粒中萃取原油。

此项工艺是指使用液体溶剂的亲和力来萃取油。

使用6到7巴压力下的液体丁烷从例2中获取的颗粒中萃取油。

为了优化萃取率，将生物质与回收利用的新鲜溶剂连续混合七次，并且每次的接触时间为50到60分钟。

萃取率高于85%（并且可以达到90到95%）。

将溶剂真空蒸馏和干燥后回收油（压力为0.1mPa，温度为70到80°C）。

下面的表IV介绍了得到的原油的性质。

表IV.

10批85m³“批次”上测得的平均结果

例4.油的精制和提纯

1.精制阶段

该精制阶段分成传统上由专业人士完成的六个连续步骤：

-去胶质：使用柠檬酸进行酸化,

-皂化：使用碱进行中和，

-离心分离以去除胶质和皂质，

-用水清洗，

-使用硅土、活性碳和黏土进行脱色，

-过滤。

2.提纯阶段

该提纯阶段的目的是去除异味、过氧化物并且优化油的稳定性。

该阶段包括以下连续的一个或两个步骤：

-分子蒸馏（如果UNS因子过高则使用），

-在真空条件下用蒸汽除臭。

整个工艺的提纯率约为78到80%，并且下面的表V中介绍了性能指标：

表V.

10批85m3“批次”上测得的平均结果

PUFA：多不饱和脂肪酸

Trans FA：反式脂肪酸

最终的油表现为40°C下黄色、均匀且无杂质的澄清液体。

无异味、无腐臭味。

例5.符合本发明的油与商品油或专题著作中描述的油的脂质性质对比研究

先将甲醇盐酸的酯基转移并用氯仿萃取，然后再采用气相色谱法来测定脂肪酸中的甲酯。结果用分布%来表示；采用内部的标准化方法进行分析。

使用一台配备分流/不分流进样口的色谱分析仪（型号：VARIAN3800），该进样口带有玻璃衬管和火焰离子化鉴定器。

制备内部标定溶液：大约精确到每毫升甲醇0.5mg甲基十七酸甲酯。甲基十七酸甲酯用作色谱分析标记。

在6ml的试管中，精确称量约30mg事先干燥的样品。用移液管分2次加入1ml的内部标定溶液，然后加入2ml 3N盐酸甲醇。然后塞紧管口，并将其置于110°C恒温干浴器中4小时。

冷却后，加入约0.5ml水和0.5ml饱和氯化钠水溶液，分3次萃取1ml氯仿。通过在含有硫酸钠的管子内干燥来回收6ml试管中的氯仿相。在约1mL的氮气流下进行浓缩和注入。

通过该脂肪酸的面积与色谱图上标记的全部峰值的面积之和的比率得到每种脂肪酸(i)的分布%，从月桂醇（C 12:0）一直到DHA（C22:6Δ4c，7c，10c，13c，16c，19c），但不包括甲基十七酸甲酯的峰值。

按照该方法分析的油（见下面的表VI），除本发明涉及的油之外，都是嘉吉、兴隆和三得利公司销售的油。

介绍了从专题著作中描述的M.carmagensis和M.schmuckeri萃取的油的脂肪酸性质，作为证明。

ND：未发现

符合本发明的富含花生四烯酸的油具有：

-50%以上的ARA，

-EPA含量约为0.1%

-而且尤其是与商业或专题著作中描述的其他微生物产油相比，肉豆蔻酸(C14:O)低于0.5%，最好是低于0.2%；棕榈酸(C16:0)低于9%，最好是低于7%；山嵛酸(C22:0)低于3%，最好是低于2.5%，并且木焦油酸(C 24:0)低于3%，最好是低于2.5%。

Claims

1.一种高山被孢霉（Mortierella alpina）菌株，其于2012年6月12日在法国国家微生物保藏中心（CNCM）以保藏号I-4642保藏。

2.一种高山被孢霉（Mortierella alpina）菌株，其通过突变或基因工程从权利要求1的菌株获得，并且其具有产生以总脂肪酸的重量计至少50%的花生四烯酸的能力。

3.一种目的脂类化合物的生产方法，包括培养权利要求1或权利要求2的菌株，以及回收富含目的脂类化合物的生物质，以及任选地，回收目的脂类化合物。

4.权利要求3的方法，其中目的脂类化合物为花生四烯酸（或ARA）。

5.权利要求4的方法，其中花生四烯酸（ARA）以油形式存在。

6.权利要求5的方法，其中包含花生四烯酸的油通过包括下列步骤的方法来制备：

﹣在异养条件下培养菌株，以生产生物质，所述生物质以重量计脂类为40到55%，优选以重量计脂类为40到50%，更优选以重量计脂类为约45%，并且具有以总脂肪酸的重量计50到55%的ARA。

﹣回收所获得的生物质，

﹣干燥所述生物质，

﹣用选自己烷和丁烷的溶剂，尤其是用液体丁烷萃取油，

﹣精炼和回收所萃取的油。

7.权利要求1或权利要求2的菌株在生产目的脂类化合物，例如花生四烯酸（ARA）中的应用。

8.由权利要求3的方法产生的脂类化合物，例如花生四烯酸（ARA）在制备食品组合物中的应用。

9.一种产物或者组合物，其包含权利要求1或权利要求2的菌株，或者其富含目的脂类化合物，例如花生四烯酸（ARA）的细胞裂解物或者萃取物。

10.权利要求9的产物或组合物，其中所述产物或组合物富含花生四烯酸（ARA）。

11.权利要求10的产物或组合物，其中所述产物或组合物包含以总脂肪酸的重量计50%以上的花生四烯酸（ARA），并且具有：

-低于0.5%，优选低于0.2%的二十碳五烯酸（EPA），

-低于0.5%，优选低于0.2%的肉豆蔻酸（C14:0），

-低于9%，优选低于7%的棕榈酸(C16:0)，

-低于3%，优选低于2.5%的山嵛酸(C22:0)，以及

-低于3%，优选低于2.5%的木焦油酸(C24:0)。

12.权利要求9到11任一项的产物或组合物，其中所述产物或组合物是食品或膳食补充剂。

13.一种生产高山被孢霉（Mortierella alpina）菌株的方法，所述高山被孢霉菌株具有产生以总脂肪酸的重量计至少50%的花生四烯酸，该方法包括权利要求1的菌株的突变和基因工程。