KR20070007836A - 동결보존 배지 - Google Patents

Abstract

난모세포의 동결보존에 사용하기 위해 완충액으로서 PBS를 이용하지 않는 나트륨 결손 배지가 제공된다. 또한, 상기 배지를 사용하는 방법과 이에 의하여 동결보존된 난모세포가 제공된다.

Description

동결보존 배지{CRYOPRESERVATION MEDIA}

관련 출원

본 출원은 비잠정출원(nonprovisional application)이고, 2004년 3월 25일자로 출원된 미국특허출원 제60/556,172호에 대한 우선권을 주장하며, 이것의 개시는 본원의 참조문헌으로 통합된다.

발명의 분야

본 발명은 난모세포(oocytes)를 포함하는 포유류 세포의 동결보존(cryopreservation)에 적용되는 배지에 관한 것이다.

쉽게 재현가능한 방식으로 높은 성공률을 갖는 포유류 난모세포를 동결보존하는 능력은 아직까지 완전하지 못하다. 예를 들어, 마우스 난모세포의 동결보존은 유전학적으로 중요한 마우스 종의 장기간 저장을 위하여 중요한 것일 수 있으며, 인간, 상업적 가축과 멸종위기의 종을 포함하는 포유류 난모세포 동결보존을 위한 모델로서 추가적으로 활용될 수 있다. 비록 마우스, 인간, 소 및 토끼에서 자손들이 냉동-해동 난모세포로부터 생산되었지만(Whittingham, 1997; AI-Hasani et al., 1987; Fuku et al., 1992; Chen 1986; Van Uem et al., 1987), 결과들은 가변성이 있고, 난모세포 동결보존 표준을 만드는 데에는 충분히 성공적이지 못했다.

동결보존에서 인간 난모세포 생존율은 난모세포의 크기와, 동결방지제(cryoprotectant)의 조성, 농도 및 노출 시간을 포함하는 사용된 동결방지제, 및 냉동/해동 속도에 의존한다.

동결보존 공정에서, 난모세포 크기는 생존율에 영향을 끼치는 매우 중요한 매개변수인데, 이는 난세포질 내 다량의 수분이 냉동 과정 동안에 세포 내 얼음 생성을 유발하기 때문으로서, 세포 내 얼음은 세포 내의 구조 손상에 대한 주요한 요인 중의 하나이다.

난모세포 동결보존 프로토콜들은 일반적으로, 먼저 수분결정화에 의해 야기되는 세포 내 구조손상을 최소한으로 감소시키는 작용을 하는 투과성 동결방지제(예를 들어, 1,2-프로판디올(PROH))를 포함하는 용액에 난모세포를 노출시키고, 다음으로 난모세포의 탈수를 증가시키기 위하여 투과성 동결방지제와 비투과성 동결방지제(예를 들어, 수크로오스)의 혼합물을 포함하는, 소위 로딩(loading) 용액에 난모세포를 2~5분 동안 노출시키고, -150℃로 서서히 냉각시키고, 액체 질소 내(-196℃)에 저장시키고, 소위 해동 용액에 노출시키므로써 해동시키고, 동결방지제를 희석 및 제거하여, 추가의 조작을 위한 생리학적 환경으로 회복시키는 것을 포함한다.

난모세포 동결에 더하여, 난소 자가이식의 동결보존 및 이식이 마우스와 양에서 일정부분 성공하였다(Gosden et al., 1994; Gunasena et al., 1997). 이 보고서들에서 난소 조직들은 간단한 배아 동결 프로토콜을 사용하여 동결되었다. 난소 조직은 냉동시 생존하였고, 생식관(reproductive tract) 또는 신장낭(kidney capsule)에 이식한 후에도 여포 성숙을 수반하는 발달을 계속할 수 있었다.

최근의 동결보존 프로토콜은 마우스, 소, 및 양의 자손을 생산하는 배아 동결 방법으로부터 발전되었다(Whittingham et al., 1972; Willadsen et al., 1976, 1978). 현재, 마우스와 다른 포유류 배아의 동결보존 과정은 대체로 효율적이지만, 이 기술들은 난모세포 동결에는 적절하게 사용될 수 없다. 마우스 난모세포를 동결보존하는 연구논문들은 매우 상이한 생존율과 수정율을 보고하고 있다(Carroll et al., 1993; Carroll et al., 1990; Cohen et al., 1988; George et al., 1994; Glenister et al., 1990; Gook et al., 1993; Whittingham et al., 1977). 마우스 난모세포 동결의 성공 여부의 변수는 대부분 냉동 프로토콜의 변형 및/또는 다른 동결방지제의 사용에 기인하는 것으로 여겨진다. 이들 프로토콜이 차이가 있을지라도, 이들은 동일한 기본적인 동결 생물학적 원칙을 따른다.

동결보존기술의 진보로부터 크게 도움이 되는 특히 중요한 영역은 인간 생식을 돕는다는 것이다. 이 분야에서 한쪽 또는 양쪽 모두의 파트너들은 생식력에 문제를 가질 수 있다. 이러한 문제들을 극복하기 위하여, 여성으로부터 난자를 채취하고, 남성으로부터 정자를 채취한다. 다음으로 정자는 난자와 수정하는데 사용되며, 다음으로 하나 이상의 발달 배는 여성의 자궁에 착상된다. 전형적으로, 난자의 성숙은 채취 이전에 약물처리로 유도되고, 정자는 이러한 난자와 수정하기 위하여 사용되어야 한다. 일반적으로, 매우 제한된 수의 외과적 채취 과정들이 개별적으로 행해지고 있으며, 많은 수의 난자를 여성에 착상하는 것은 여러명의 출생을 막기 위하여 제한된다. 그러므로, 채취된 난자, 정자, 수정란, 및 배아를 보존하는 것이 필요하다.

현재까지는 불가능하지만, 성공적이고 재현가능한 동결보존 난모세포의 가능성은 여성이 적절한 정자 제공자(아마도 장래의 남편)를 찾을 때까지 난자를 동결시키고, 다음으로, 동결된 난자를 해동시키고, 수정하는 것을 가능하게 할 것이다. 결과의 배아는 착상, 태아 발달, 및 궁극적으로 출산을 가능하게 하기 위하여, 호르몬과 공지된 기술을 사용하여 배아를 받아들일 준비가 된 환자의 자궁으로 착상될 수 있다. 윤리적으로, 수정란 또는 배아를 보존하는 데는 논쟁이 있는데, 이는 미수정 생식세포를 동결시키는 것과 관련된 것보다 더 중요한 문제이다. 난모세포의 동결보존은 인간에서 배아 동결과 관련된 윤리적인 걱정들을 피하게 해주고, 불임 문제를 가지는 부부에게 다른 대안을 제공할 수 있다. 여성이 건강한 난자를 생산하는 시기이며, 따라서, 수정에 더욱 적합하게 되며, 출산으로 이어질 수 있는 시기인 20대 및 30대 초반과 같은 초기에 난모세포를 저장하면, 40세 이상에서 시험관 수정(IVF) 프로그램으로 기대되는 비교적 낮은 임신확률보다 노년에 임신의 기회를 증가시킬 수 있다. 따라서, 생존 가능한 동결보존된 난모세포는 건강한 배아 및 자손을 낳게 한다.

재현가능하고 효율적인 방법으로 특히, 인간으로부터 난모세포를 동결보존하는 것은 공지된 기술에 따라서는 대개 실패했었다. 그러나, 인간을 포함하는 몇 가지 종들의 동결 난모세포로부터 자손들이 생산되었던 것을 주목해야 한다. 개선된 동결보존 배지는 난모세포 저장에 도움이 되고, 배아의 동결에 더 성공적인 방법을 제공하므로써, 임신의 가능성을 개선시켜 준다.

동결보존기술은 인간 이외의 다른 종들에도 적용가능하다. 상업적인 가축에 있어서, 난모세포 또는 배아 동결보존의 개선은 개체군들의 유전적인 관리와 생산된 자손의 수를 크게 개선시키므로써, 상당한 시간 절약과 효율로 귀착된다. 멸종위기에 처한 동물들에 있어서, 배아 동결의 개선 또는 난자를 동결하는 방법의 발전은 생산되는 자손 수의 증가, 자손의 유전적 특징의 향상, 개체군의 유전적 건강의 개선, 산출을 목적으로 하는 살아있는 동물을 수송하는데 드는 비용 및 위험 제거, 및 특정 종의 멸종을 지연 또는 방지할 수 있는 가능성을 가진다.

멸종위기에 처한 종들로부터 난모세포들의 동결보존은 중요한 유전물질을 재생하는 귀중한 방법을 제공할 수도 있다. 난자가 해동되고, 수정되어, 수정된 자손을 제공할 수 있고, 정자가 대체로 쉽게 저장되어 제공된다면, 종들은 무한히 보존될 수 있으며, 실질적으로 멸종의 위험을 제거할 수 있다. 동결보존된 난모세포들은 개체군의 관리에 더 나은 지원을 위한 유전 정보원을 제공하면서, 전 세계로 쉽게 수송될 수도 있다. 이러한 방법에 있어서, 선조 동물로부터 잘 알려지지 않은 유전자가 지금부터 200년 정도의 어느 시기에 개체군으로 재도입될 수도 있다. 동결 난모세포(및 정자)는 쉽고 저렴하게 분배될 수 있기 때문에, 개체군의 유전적 다양성 및 전반적인 건강을 개선시키는 가능성이 달성될 것이다. 현장에서 수집된 난모세포들을 동결시킬 수 있고, 난모세포의 유전학적 건강을 개선시키기 위하여 유폐된 개체군 내로 주입이 가능하다. 이 기술로써 도처에 동결된 동물원들이 현실화될 수 있다.

생물학적 동결보존 시스템은 잘 알려져 있다. 이 시스템들은 세포들을, 예를 들면 -20℃ 또는 그 이하로 지속적으로 동결되고, 녹은 후에도 정상적인 세포활동을 다시 시작하게 한다. 전형적으로, 직면한 문제점들은 세포 파괴로 귀착되는 세포 내 얼음생성(IIF)과 삼투성 불균형을 포함한다. 수많은 선행방법들은 IIF의 예방에 관한 것이다.

세포들의 동결보존은 탈수, 동결방지제의 도입과 액체질소(LN₂) 내로 넣기 전에 저온, 일반적으로 -30℃ 내지 -80℃로 냉각시키는 것과 관련된다. 첫째 목적은 세포로부터 수분을 제거하는 것인데, 물이 용융점 이하로 냉각될 때, 세포막뿐만 아니라 세포 내 소기관을 손상시킬 수 있는 얼음결정들을 생성하기 때문이다(Mazur, 1977). 세포밖 용액의 오스몰(osmolality)은 밖의 물이 냉동되면 증가하므로, 물은 피동적으로 세포로부터 유출된다. 더 낮은 온도에서 더 많은 얼음이 생성되며, 계속되는 세포 탈수를 초래한다. 세포동결의 다음 목적은 고체화될 때 유리와 같은 구조를 만들어 IIF를 예방하기 위하여, 세포 내에 잔존하는 수분과 동결방지제를 결합시키는 것과 관련된다. 물의 녹는점은 동결과 해동 동안 양쪽에서 도달가능하기 때문에, IIF는 각각의 시간에서 일어날 수 있다. 따라서, 손상은 세포가 증가된 농도의 전해질 및/또는 IIF에 노출될 때 발생할 수 있다. IIF는 세포를 둘러싼 세포 밖 얼음의 존재에 의하여 촉진(시딩(seeding))될 수 있거나, 이질적으로 세포 내 구조에 의하여 촉진될 수 있다. 그러나, 동결방지제의 존재 하에서, 시딩 및/또는 이질적 얼음 핵화로부터 유발되는 IIF는 발생하지 않으므로(Toner et al., 1991), IIF는 동결방지제의 존재 하에서는 난모세포를 동결시킬 때 문제될 수 없음을 암시한다. 그러므로, 나트륨을 포함하는 전해질이 동결보존 동안에 대부분의 손상을 제공하는 것으로 생각된다. 나트륨 이온에 의한 세포 파괴는 세포막 및/또는 세포 내 소기관들을 변화시킬 수 있다. Lovelook(1954)은, 세포 손상은 전해질 농도의 증가에 의해 야기되는 막의 불안정화가 원인인 것으로 가정하였다. 나아가, Mazur 등(1974)은 세포 표면은 동결 손상의 주요 부위라고 주장하였다. Mazur의 연구에서, 비투과성 용질인 수크로오스는 투과성 동결방지제 글리세롤만큼이나 동결/해동 손상으로부터 적혈구를 보호하는데 효과적임을 보여주었다. 동결 동안 마우스 난모세포의 손상의 대부분은 나트륨 이온에 의하여 유발될 수 있지만, 우리는 IIF의 가능성을 배제할 수는 없다. 세포 파괴가 동결 또는 해동 동안에 증가된 농도의 나트륨 이온에 노출되어 일어나는지, 또는 세포막들을 가로지르는 나트륨 이온들의 수송에 관련된 문제인지는 밝혀져야 될 것으로 남아있다. 나트륨 이온은 약 0.95Å의 반경을 갖는 반면에, 리튬은 0.60Å의 반경을 갖고, 칼륨은 약 1.33Å의 반경을 갖는다. IIF, 동결방지제 및 동결 프로토콜을 변경하는 것에 관하여 초점을 맞춘 과거의 동결보존에 관한 연구들의 대부분은 난모세포 동결을 크게 개선시킬 수가 없었다. 따라서, 사용된 동결방지제의 타입 또는 동결 프로토콜은 이미 난모세포 동결을 위해서 적합할 수 있고, IIF는 앞서의 방법들에 의해 추정된 주요한 문제점이 아닐 수 있다.

표준 배아 동결보존 기술들은 공지되어 있다. 일반적으로, 배아는 동결방지제의 흡수를 가능하게 하기 위하여, 간단한 나트륨-기초 염용액(simple sodium-based salt solution)으로 희석된 동결보호제(디메틸설폭사이드(DMSO), 1,2-프로판 디올(PrOH), 글리세롤, 에틸렌글리콜)에 5~15분 동안 노출된다. 다음으로, 배아는 시딩되는 시점에서 약 7℃로 신속히(-2℃/분) 냉각되고, 약 -30℃ 이하로 서서히(-0.3~-0.5℃/분) 냉각되고, 다음으로, 액체질소(LN₂) 내로 곧바로 담궈진다. 또한, 배아는 수분 이상 노출될 경우에 세포에 독성이 있는 매우 높은 동결방지제 농도(2~6M)만을 사용하여, 신속히 동결 또는 유리화(vitrification)될 수 있다. 동결보존 후, 배아는 해동되고 배양된다. 해동 과정은 다르지만, 차이는 거의 없다. 두 가지의 기본적 개념들이 해동 과정에 관련된다:

1) 동결방지제의 제거 및

2) 세포막을 파괴시키지 않을 정도의 속도로, 대개 수크로오스를 사용한 배아의 재수화.

이러한 동결 및 해동 과정은 배아에는 비교적 잘 적용되나, 난모세포들의 성공적인 저장을 허용치는 않는다. 배아는 생존할 수 있고, 난모세포들은 생존이 불가능한 이유(들)는 알려져 있지 않지만, IIF, 이온 로딩(loading) 및/또는 삼투 스트레스에 기인한 막 손상이 의심된다.

연구자들은 최적일 것으로 여겨진 동결보존 배지 제조에는 관심이 없이, 주로 동결 과정(천천히 대 신속히), 해동 과정(천천히 대 신속히), 및 동결방지제의 제거 방법에 의한 IIF 및 삼투 스트레스의 문제에 집중하였다.

연구자들은 하나 이상의 동결방지제를 사용하여 재현 가능한 방식으로 난모세포들을 동결보존하는 것을 시도했지만 실패하였다. 일반적으로, PrOH 및 DMSO는 난모세포와 배아의 동결보존을 위하여 오늘날 가장 통상적으로 사용되는 동결방지제들이다. 인간에서 DMSO 및 PrOH 내에서 동결된 난모세포로부터 임신이 이루어졌지만, PrOH는 인간 배아를 저장하는데 있어서 더 큰 투과성, 감소된 독성 및 증가된 성공률로 인하여 선택된 동결방지제이다(Gook et al., 1995; Imoedemhe and Sigue, 1992; Lassalle et al., 1985; Mandelbaum et al., 1987; Testar et al., 1986). 마우스 난모세포는 PrOH를 사용해 동결되었지만, 전체적으로 열악한 결과를 낳았다(Gook et al., 1993; Todorow et al., 1989). Todorow 등(1989)은 생존율과 수정률이 각각 63%와 27%임을 보고하였다. PrOH가 DMSO와 조합으로 사용되는 경우에, 생존율과 수정률은 각각 87%와 42%로 증가되었다. 수많은 연구들은 DMSO를 사용하여 동결보존한 마우스 난모세포들에 대하여 각각 79%와 50%로 상승된 생존율과 수정률을 보고하였다(Glenister et al., 1987; George and Johnson, 1993; Carroll et al., 1989; Todorow et al., 1989; Schroeder et al., 1990; Aigner et al., 1992; Bouquet et al., 1992). 한 실험실이 91%에 이르는 생존율과 78%에 이르는 수정률과 54.4% 정도로 높은 배반포 생성률을 보고했지만(Carroll et al., 1993), 이들의 결과들이 쉽게 재현될 수 있는지를 알아보는 것이 문제로 남아있다.

Stachecki에 의하여 1999년 11월 16일자로 등록된 미국특허 제5,985,538호에서는 효과량의 동결방지제와 함께 50mM 미만의 나트륨 이온, 적어도 100mM의 콜린(Choline)염을 포함하는 동결보존 배지를 교시하고 있다. Stachecki의 동결보존 배지가 기본으로 하는 기본배지는 PBS(phosphate-buffered saline) 용액을 적용한다. 또한, 생리적 농도의 무기염, 다양한 아미노산뿐만 아니라, 글루코오스, 락토 오스, 및 피루베이트(pyruvate)를 포함하는 에너지원의 혼합물을 함유하는 HEPES-완충 배지는 PBS에 기반을 둔 배지보다 동결보존 후 난모세포 및 배아를 더 우수하게 보존하는 것으로 알려져 있다(Simmons 등에 의해 1998년 2월 10일자로 등록된 미국특허 제5,716,847호 참고).

따라서, 난모세포를 포함하는 포유동물세포들의 동결보존시에 사용되는 배지로서, 상기 동결보존 배지는 나트륨이 결손(depletion)되고, PBS 완충액을 적용하지 않고, HEPES 또는 MOPS 완충액을 적용하고, 100mM 미만의 염화콜린을 함유하며, 상기 동결보존된 난모세포를 포함하는 포유동물세포는 적어도, 약 70~약 90%의 생존율을 갖는 배아 동결에 상응하는 생존율을 보유하는 배지의 제공은 본 기술 분야에 중요한 공헌을 할 것이다.

발명의 개요

본 발명은 난모세포들을 포함하는 포유동물세포들의 동결보존을 위한 완충액으로서, PBS를 사용하지 않고, 나트륨이 결손된 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 난모세포들을 포함하는 포유동물세포들의 동결보존시 본 발명의 조성물의 사용방법을 제공한다.

더 나아가, 본 발명은 본 발명의 조성물을 사용하여 동결보존된 난모세포를 제공한다.

발명의 상세한 설명

우수한 생존능력을 보유하는 포유동물세포의 장기 저장은 연구 및 치료와 같은 분야에서 많은 유용한 용도를 가진다. 추가적으로, 암 및 골수 이식의 화학 치료 또는 방사선 치료를 받고 있거나, 불임을 초래할 수 있는 가능성이 있는 다른 과정에 있는 여성에게 유용하게 된다. 폐경에 근접하기 전과 폐경기 전 또는 감소된 생식력 또는 생식력의 손실을 초래케 하는 부상, 감염 또는 다른 요인과 같은 사건들, 나아가 노화 과정의 결과보다 시기적으로 앞선 난모세포 또는 난소의 장기 저장은 생식력을 보장한다. 이 과정은 난모세포 복구 또는 난소의 일부분 또는 전체 난소의 외과적 제거, 감소된 나트륨 동결보존 배지 내에서의 동결보존, 이어서 동결보존된 조직 또는 수정된 난모세포의 외과적 착상을 포함하는 공정에 의해 복원된 번식력의 가능성을 제공할 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 단일 배아 동결 프로토콜을 사용하는 난소 자가 이식편의 동결보존과 이식은 마우스와 양에서 성공적이었다(Gosden et al., 1994; Gunasena et al., 1997). 난소 절편의 저장은 본 발명에 따른 감소된 나트륨 동결보존 배지를 사용하는 과정으로 개선될 수 있는데, 이는 종래의 나트륨을 기초로 하는 배지와 비교하여, 본 발명의 동결보존 배지에서 동결된 난모세포들의 더 큰 비율이 생존 및 발달하기 때문이다. 또한, 이와 동일한 유형의 기술은 이후의 이식 또는 착상용으로 다른 조직 및 기관의 동결보존을 위해 사용될 수 있다.

난모세포 동결방법을 더욱 개선시키고, 이러한 방법의 일상적인 사용을 가능케 하기 위하여, 본 발명은 세포막을 가로지르는 나트륨 이동 및/또는 세포의 나트륨 로딩과 같은 손상을 주는 영향을 부분적으로 경감시키는 동결보존 배지를 제공한다. 세포 동결 동안의 이온, 특히 나트륨 이온의 파괴적인 영향때문에, 본 발명은 치환 가능한 다른 이온을 탐색하였다. 본 발명에 있어서, 세포 배지 내의 바람직한 주요한 양이온은 콜린이다. 콜린은 2-트리메틸 아미노 1-에탄올의 관용명으로서, 4차 아민이고, 이는 적당한 카운터 이온에 의해 동반된다. Toner 등(1993)은 동결방지제가 동결보존을 위해 절대적으로 필요한지를 조사하여, 마우스 접합자(zygote)들은 동결방지제가 결핍된 고장(hypertonic)의 염화나트륨(NaCl)-보충 PBS 용액에서 -40℃로 냉각시킨 후에 실온으로 가온시 분해됨을 보고하였다. 반대로, 동결방지제가 결핍된 고장의 염화콜린(ChCl)-보충 PBS 용액에서 -40℃로 냉각된 대부분의 접합자들은 실온으로 가온된 후에도 손상되지 않고 남아 있었다. 막이 손상되지 않고 남아있는 반면에, 이들 접합자들은 정상적으로 발달하지 않으며, 이것은 ChCl이 용균을 방지하는 반면, 발달을 촉진시키기에는 충분하지 않음을 나타낸다.

이 연구는 ChCl이 NaCl을 대체하여 사용가능한지 또는 ChCl과 동결방지제의 혼합물이 효과가 있는지를 겨냥하여 연구된 것은 아니다. 그러나, 나트륨 대신에 사용된 콜린 음이온은 나트륨의 소모를 초래한 것으로 믿어진다.

본 발명은 다른 세포유형들에 대한 개선된 동결보존법을 제공할뿐만 아니라, 동결/해동 사이클을 통하여 난모세포가 생존하는 것을 가능하게 하는 난모세포를 저장하기 위한 개선된 배양법과 동결보존 배지를 제공한다. 본 발명에 따른 동결보존 용액은 난모세포를 동결보존하기 위하여 사용되는 개선된 염기-배지 조성물에 적용된다.

또한, 본 발명의 조성물은 낮은 나트륨 농도를 갖는 세포 저장용 배지로서 적용될 수 있다. 배지는, 약 100~약 2,500mM, 바람직하게는 약 1,500mM의 양으로 존재하는, 예를 들어, 1,2-프로판디올과 같은 동결방지제, 예를 들어, 약 5~약 20%의 양으로 존재하는, 소 태아 혈청, 송아지 혈청, 소 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민, 인간 척수 혈청, 및 플라스미네이트으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있는, 예를 들어, 소 태아 혈청과 같은 천연 또는 인공 혈청단백질, 및 HEPES 또는 MOP 생리완충액을 포함할 수 있다. HEPES는 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산이다. MOPS는 4-모르폴린프로판설폰산이다. 완충액으로 사용되는 HEPES 또는 MOPS의 농도는 약 10~약 25mM, 바람직하게는 약 21mM이다. 동결방지제는 냉동시에 물의 결정화를 억제시키는데 효과적인 양으로 존재하는 것이 바람직하고, 1,2-프로판디올, 디메틸설폭사이드, 글리세롤 및 에틸렌글리콜로 구성되는 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있으며, 약 100~약 2,500mM의 1,2-프로판디올이 바람직하다.

특별한 설명이 없는 한, 명세서와 특허청구범위에서 사용되는 용어 "중량%"는 수성 또는 액체 상에서 중량/중량(w/w)을 기초로 하여 계산된 전체 조성물의 중량 퍼센트를 뜻한다.

세포 냉동을 설명하기 위하여 사용되는 것으로서, 용어 "동결방지제"는 동결-해동 사이클 동안에 세포들을 보호하여, 생존과 생존력 유지를 향상시키는 분자를 나타낸다. 동결방지제가 갖는 이점은 그것의 1) 농도, 2) 노출시간, 및 3) 난모세포에 첨가되는 온도와 관련된다.

본 발명에서 사용되는 것으로서, 용어 "오스몰(osmolality)"은 수성액 내에 용해된 용질입자(예를 들면, 증진제(extender))의 삼투압의 크기이다. 용질입자는 이온과 비-이온화된 분자 모두를 포함한다. 오스몰은 물 1kg 내에 용해된 삼투압적으로 활성이 있는 입자들의 농도(즉, 삼투압 몰농도(osmole))로서 표시된다.

본 발명의 동결보존 배지는 나트륨이 결손된 것으로, 막의 용해(lysis)는 NaCl이 공급된 동결보존 배지에서 주로 발생하므로, 막 손상을 막기 위해서는 NaCl의 제거에 의존하게 된다. 따라서, 본 발명은 동결보존 배지 조성물로부터 대부분의 나트륨을 제거시키고, 그것 대신에 콜린 또는 다른 적합한 양이온 종들로 대체시킨다. 콜린은 4차 아민인 2-트리메틸아미노 1-에탄올의 관용명으로서, 카운터 이온에 의해 동반된다. 콜린은 막 화학(예를 들어, 포스파티딜 콜린) 및 세포들 사이의 (신경전달물질인 아세틸 콜린) 전달에 관계를 갖고 있다. 본 발명에 따른 동결보존액과 이들 생화학적 경로 사이에 직접적인 관계는 아직도 이해가 되지 않았지만, 동결보존 효과는 관계지을 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 이들 경로상에서 서로 작용하거나 또는 콜린을 대체할 수 있는 화합물 또한 유용할 수 있다. 콜린이 가지는 비교적 우수한 효과인 (수화된) 이온의 크기와 세포막을 통한 콜린의 낮은 확산 속도는 중요한 특성일 것으로 믿어진다. 따라서, 생리적인 pH에서 양으로 하전되는 다른 4차 아민 또는 분자들 또한 동결보존 용액 성분으로서 유용할 수 있다.

본 발명에 따른 동결보존 배지는 나트륨이 결손된 것으로, 바람직하게는 7mM 미만의 나트륨을 갖고, 더욱 바람직하게는 1~2mM의 나트륨을 갖는다.

따라서, 본 발명은 낮은 나트륨 농도를 갖고, 양이온 종으로 콜린을 제공하는 동결보존 용액을 제공한다. 본 발명에 따른 하나의 구체예에서는 낮은 나트륨 농도를 제공하고 있지만, 거의 모든 나트륨을 대체하는 것이 또한 가능한데, 예를 들어, 중탄산나트륨 대신에 중탄산칼륨(3.0~5.0mM 범위, 바람직하게는 4mM 농도), 나트륨 피루베이트 대신에 피루브산(약 0.25~약 0.40mM 범위, 바람직하게는 0.33mM 농도), EDTA의 테트라나트륨염 대신에 EDTA의 디칼륨염(0.001~0.1mM 범위, 바람직하게는 0.01mM 농도), 페놀 레드의 나트륨염 대신에 페놀 레드의 산성 형태(0.0001~0.01mM 범위, 바람직하게는 0.008mM 농도), 및 pH 7.30~7.50의 범위, 바람직하게는 pH 7.40으로 용액의 pH를 조절하기 위해 사용된 NaOH 대신에 KOH로 대체가 가능하다. 이것은 배지에 첨가된 단백질 용액과 배지를 만들기 위해 사용된 물에 존재하는 단지 미량의 나트륨 이온들만을 남아있게 할 것이다.

본 발명의 조성물에 제공된 염화콜린(ChCl)의 농도는 약 85~약 99mM이 바람직하다. 본 발명의 실시를 위해 특히 바람직하게는 동결보존 배지 조성물이 약 90.6mM의 염화콜린을 포함하는 것이다.

또한, 동결보존 용액 조성물 내에서 ChCl의 농도는 약 90.6mM로부터 약 99mM로 증가될 수 있다. 이는 보존된 세포를 더 탈수시키고, IIF 발생 기회 감소에 도움을 줄 수 있다.

또한, 동결보존 배지 조성물은, 예를 들어, 히알루론산 등의 첨가에 의해 개량되거나 또는 개질 가능하다. 전형적으로, 히알루론산은 동결보존 배지의 전체 체적을 기초로 했을 때, 약 0.1mg/㎖로부터 약 1.0mg/㎖에 이르는 범위 내로 존재한다.

또한, ChCl을 기초로 하는 배양 배지는 결손된 나트륨 배지를 필요로 하지만, 동결보존과 연관이 없는 다른 환경하에서도 사용될 수 있다.

마우스 난모세포와 같은 난모세포가 동결보존될 때 발생되는 대부분의 위해요소는 나트륨 이온에 의한 세포 파괴와 관련된다. 종래의 나트륨-기초 동결 배지는 난모세포 생존, 수정 및 이어지는 발달에 부분적으로 나트륨의 독성 때문에 해로울 수 있다는 것이 알려져 있다. 본 발명에 따르면, 비 투과성 이온 분자 콜린은 나트륨을 대체할 수 있으며, 이에 의해 난모세포들이 해동된 후에도 막의 완전상태를 유지할 수 있다. 더구나, ChCl을 기초로하는 배지에서 동결된 대부분의 난모세포들은 동결보존으로 생존하고, 수정되며, 시험관 내에서 착상 단계 근처에서 분열하였다. 마우스 난모세포들에서, 단일 동결 프로토콜을 사용하여 고도의 생존율(75%)을 관찰하였을 뿐만 아니라 수정 및 발달을 관찰하였다.

가임신(pseudopregnant) 어미쥐에 배아를 옮긴 다음에, 동결보존된 난모세포들로부터 유래된 배반포는 수용상태의 자궁으로 이식가능하고, 임신으로 발달되었다(Stacheki et al., 1998). 이러한 결과는 마우스 난모세포들을 동결보존하기 위한 능력에서 상당히 고도의 개선을 보여준다. 이러한 진보는 동결보존 배지 조성물의 개선, 특히 NaCl의 제거와 ChCl로의 대체 및 개량된 PBS보다 HEPES 또는 MOPS-완충처리된 생리용액상의 동결보존 배지를 바탕으로 함으로써 가능할 수 있다. 이 기술은 마우스 난모세포들을 쉽게 재현가능하도록 냉동시키고, 다른 종으로부터의 난모세포뿐만 아니라, 배아, 정액, 적혈구 및 조직들을 포함하는 다른 세포들의 저장에 적용할 수 있는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 동결보존 용액은 난모세포의 고도의 생존, 수정 및 발달을 가능하게 하는 환경을 제공한다.

본 발명의 동결보존 배지와 방법들은 난모세포를 보존가능하게 하므로써, 해동시 다수가 생존할 수 있고, 활성화시에 높은 분열 속도를 나타낸다. 이러한 난모세포는 살아있는 것으로 간주된다.

다음의 실시예들은 본 발명을 더 상세히 설명하기 위하여 제공된다.

실시예 1

동결보존 배지의 제조

동결보존 용액을 아래의 표1에서 설명된 조성에 따라 제조하고, 전체부피 1ℓ를 만들기 위해 증류수로 희석하였다.

[표 1]

나트륨 결손 세이지( SAGE ) 동결 배지의 조성

성분	g/L	mM	바람직한 mM 범위
염화콜린	12.650	90.6	85~99
염화칼륨	0.350	4.7	4.0~5.0
황산마그네슘, 7수화물	0.050	0.2	0.05~2.0
인산칼륨, 1가 염기, 무수화물	0.0014	0.01	0.001~0.05
중탄산칼륨	0.400	4.0	3.0~5.0
HEPES, 유리산	5.004	21.0	18.0~24.0
글루코오스, D-(+)	0.500	2.78	2.0~3.5
피루브산	0.029	0.33	0.25~0.40
칼슘 락테이트, 5수화물	0.629	2.04	1.5~2.5
알라닐-글루타민	0.217	1.0	0.01~2.0
L-아스파라긴	0.013	0.1	0.01~0.5
L-아스파르트산	0.013	0.1	0.01~0.5
글리신	0.008	0.1	0.01~0.5
L-프롤린	0.012	0.1	0.01~0.5
L-세린	0.011	0.1	0.01~0.5
EDTA, 디포타슘염, 2수화물	0.004	0.01	0.001~0.1
페놀 레드	0.003	0.008	0.0001~0.01
인간 알부민	12.000		10~20g/L
젠타마이신	0.010		0.001~0.02g/L
1,2-프로판디올	114.150	1,500	200~2,500
수크로오스	102.69	300	50~1,000

배지를 제조하기 위한 모든 절차들은 실온에서 수행하였다. 혼합과 함께, 상 기 표 1에서 열거된 순서에 따라서 벌크 컴다운딩 용기에 각각 성분을 무게를 달아 첨가하였다. 다음 성분을 첨가하기 전에, 각 성분을 용해시켰다. 마지막 성분을 첨가한 후에, 벌크를 교반시켜 혼합하였다.

벌크 용액의 시료 5㎖를 취하고 pH를 측정하였다. 10N KOH로 pH를 7.35(+/- 0.05)로 조절하였다.

벌크 용액의 시료를 취하고, 최종 pH, 오스몰, 색 및 투명도를 측정하였다.

벌크 용액은 채우기 전에 24시간 동안 밀폐된 용기 내에서 2~8℃로 저장할 수 있다. 만약, 벌크 용액이 저장된 경우라면, 30~35℃에서 pH 7.3~7.4임을 확인하기 위하여 채우기 전에 pH를 측정한다.

다음으로, 용액을 0.2㎛ 포어 크기로 된 필터를 통해 여과시키고, 적당한 크기로 된 용기 내로 무균처리해 채우고, 살균된 마개로 닫았다. 다음으로, 용기를 생성물의 명칭, 용기 내의 배지의 부피, 생성물의 일련번호 및 생산일로부터 1년의 유통기간을 나타내는 유통기한을 표시하였다.

실시예 2

마우스 난모세포의 수거 및 배양

여포 활성은 4~6주된 암컷 C57BL/6XC3HF1(B6C3 F1)마우스(Charles River Lab, Wilmington, MA)에서 10IU 말 융모막 고나도트로핀(Gesty Professional Compounding Centers of America, Houston, TX)의 복강 내 주입에 의하여 자극하고, 이어서 48시간 후에 10IU hCG(Sigma Chemical Company, St. Rouis, MO)로 처리하였다. 누적 덩어리들을 hCG 처리 14시간 후에 난관으로부터 수거하고, 누적 세포 들을 제거하기 위하여 10분 동안 200U/㎖ 히알루로니다아제(Sigma)로 처리하였다. 난모세포들을 Quinn's Sperm Washing Medium(Sage In-Vitro Fertilization, Inc, Trumbull, CT)으로 세척하고, 동결보존 또는 수정시까지 실온에 두었다. 모든 세포 배양은 조직 배양을 위한 오일(Sage)로 가득 채워진 35mm×10mm 세포 배양 용 접시(Corning: VWR Scientific, Piscataway, N.J.)에서 Quinn's Advantage Fertilization Medium(Sage)의 마이크로드롭(10㎖)을 사용하여, 37℃ 인큐베이터에서, 5% CO₂, 5% O₂, 90% N₂로 수행하였다.

마우스 난모세포의 동결 및 해동

반투명이고, 둥글고, 제1극체가 노출된 정상적인 모양의 난모세포들을 동결보존을 위하여 선택하였다. 이 난모세포들 중의 몇몇을 비-동결 대조군으로서 사용될 수 있게 따로 두었다. 난모세포들을 상기 표 1에서 설명된 바와 같은 조성을 갖는 본 발명에 따른 새롭게 제조된 개량 HEPES-HTF 배지에서 동결보존하였다. 난모세포들을 10분 동안 1.5M 동결보존제를 포함하는 본 발명에 따르는 동결보존 용액 내에서 23℃로 전-평형(pre-equilbration)되게 한 후에, 다음으로 20분 동안 1.5M 동결방지제와 0.3M 수크로오스를 포함하는 본 발명에 따른 동결보존 용액으로 옮겼다. 이 시간 동안, 난모세포들을 0.25㎖의 French Straws(Agtech, Inc., Manhatten, KS.) 내로 로딩시키고, 개봉된, 마개가 없는 말단에서 열 봉합시켰다. -8℃로 미리 냉각된 Freeze Control Preprogrammed Temperature Controlled Freezer(Biogenics, Napa, CA) 내에 스트로(straws)를 넣고, 액체 질소 내에서 냉 각된 핀셋을 사용하여 시딩하고, 10분간 -8℃로 유지시키고, 액체 질소 내로 빠뜨리기 전에, -35℃로 -0.3℃/분 속도로 냉각시켰다. 난모세포들은 추가적인 10초 동안 30℃ 수조에 담그기 전, 10~30초 동안 공기에 스트로를 노출시켜 해동시켰다. 난모세포들을 스트로로부터 23℃에서 0.5M 수크로오스를 함유하는 본 발명에 따른 용액으로 옮기고, 이 용액 내에서 10분간 유지되게 한 후, 추가적인 10분 동안 23℃에서 0.2M 수크로오스를 함유하는 본 발명에 따른 용액으로 옮긴 후, 수크로오스를 함유하지 않는 본 발명에 따른 용액으로 헹구었다. 마우스 난모세포 동결보존을 위한 모든 이러한 동결 및 해동 용액들은 20%(v/v) 태아 소 혈청(Gemini Bio-Products, Inc., Calabasas, CA)을 포함한다.

동결보존 배지로 마우스 난모세포의 동결 결과

동결 및 해동 후, 마우스 난모세포들의 생존과 수정에 대한 배지 유형별 효과

	Sage 동결 배지 (표 1과 동일)	Stachecki 동결 배지
동결된 수	29	29
생존율(%)	29(100)	21(72)
수정된 수	25	15
살아있는 난모세포(%)	86	71
동결된 난모세포(%)	86	52

수정된 동결 난모세포의 비율은 Stachecki 배지와 비교하여 Sage 동결 배지를 사용시에 더 높았다.

실시예 3

인간 난모세포 동결보존

인간 난모세포들을 Sage 배지와 Stachecki 배지 모두를 사용해 동결보존하였 다.

인간에서 난자 동결을 위한 나트륨-결손 배지. 이러한 결과는 여러 사이클을 거치며, 상기 사이클은 나트륨-결손 PBS 또는 기본 배지로서 Sage 동결 배지가 동결에 사용되었음을 주목하여야 한다.

해동 사이클 실시의 수: 31

실시된 해동 사이클이 수행된 환자의 수: 28

해동된 난자의 수: 189

해동 후 살아있는 난자의 수: 132(해동된 난자의 70%)

ICSI가 수행된 난자의 수: 130

ICSI 후 손상된 수: 26(주입된 난모세포의 20%)

수정된 수: 79(주입된 난모세포의 60%)

배아 전달 과정: 5(전달되지 못한 6 사이클이 존재함을 주의: 수정 실패에 기인된 것 2 및 ET 전에 배아 정지 때문인 것 4)

임상적으로 임신된 수(하나 이상의 임신낭): 9

해동 사이클 당 임상적 임신율 = 9/31 = 29%

환자 당 임상적 임신율 = 9/28 = 32.1%

전달 당 임상적 임신율 = 9/25 = 36%

유산된 수: 2

임신 진행중인 수: 2

분만된 수: 5

단생아의 수: 3

쌍둥이의 수: 2

(참조문헌으로 본원에 수록되어 개시된 Materials and Methods in Human Reproduction, Vol.18, NO.6, 1250~1255, June 2003, 참조)

실시예 4

마우스 난모세포 동결보존

마우스 난모세포 동결보존에 있어서, HEPES-HTF와 PBS에 기초한 배지의 효과를 비교하였다.

나트륨-결손 조성이거나, 또는 나트륨-결손 조성이 아닌 개량 HEPES-HTF와 PBS를 기초한 배지에 바탕을 둔 2×2 계승의 실험을 수행하였다. 인공배란된 암컷으로부터 새로이 수거된 난모세포들을 하나로 모으고, 4개의 동일한 군(29~38/군)으로 나눈 후, 표준화된 서냉 과정을 사용하여 0.5mL 스트로에서 동결보존하였다. 9~147일(평균 61일) 후, 난모세포들을 해동시키고, 시험관 내에서 수정시켜, 결과로 얻은 배아들을 배반포 단계로 배양시켰다. 실험을 각각 처리시에 전체 136 난모세로들로 4회에 걸쳐 반복하였다. 4회 반복된 것들 사이의 회복, 생존 및 수정 및 발달 속도를 정확하게 분석하였다.

HEPES-HTF(HTF는 인간 난관액(tubal fluid)이다)에서 동결된 생존한 모든 난모세포들 중의 1/3을 수정시키고, 배반포로 발달시켰다. 이것은 PBS를 기초로 한 배지에서의 비율보다 2배나 더 높다. 본 발명에서 나트륨-결손 HEPES-HTF 기초 배지(SAGE 동결배지)를 사용한 배반포 발달 비율은 PBS를 기초로 한 나트륨-결손 배 지를 사용하는 Stachecki 등(1998)에 의해 보고된 배지를 사용한 경우보다 22% 더 높았다(39% 대 32%). 두 개의 상이한 성분들에 기초한 나트륨-결손 정규 배지 사이의 중요한 차이는 없다. 새로 수거된 대조군 난모세포들 중의 85%는 배반포로 발달하였다.

결 론 : 개량 HEPES-HTF 성분에 기초한 배지는 마우스 난모세포들의 동결보존을 위한 PBS에 기초한 배지보다 우수하였다. 이러한 HEPES-HTF 배지는 인간 난모세포에 사용되어 PBS를 기초로 한 배지(Boldt, 미간행; 아래 실시예 5 참조)로 얻을 수 있는 임신율보다 높은 임신율을 나타내었다. 마우스 모델은 인간에서 얻어진 결과와 유사한 것으로 나타났다.

실시예 5

ART 사이클로 배아 동결보존하는 것의 대안으로서 인간 난모세포 동결보존

목 적: 냉동된 난자-배아 전달(FEET)에 대한 실험 및 FEET와 냉동된 배아 전달(FET)로부터의 결과의 비교

셋 팅: 임상적 IVF 프로그램

대 상: 나트륨이 결손된 동결액을 사용하여 동결되고, 해동된 난모세포를 갖는 IVF-ET 사이클이 수행되는 24쌍. 배아를 회복 3일째에 동결시키고, 순차적으로 해동 및 전달시킨 추가적인 62쌍.

조 정: 난모세포 동결보존 대상에 표준 IVF-ET 치료를 수행하였고, 서서히 동결-신속히 해동되는 절차에 따라서 나트륨 결손 PBS 또는 개량 HTF(mHTF) 기초 동결 배지를 사용하여 동결 및 해동된 과잉의 난모세포들을 적용시켰다. 해빙과 동 시에 생존하는 난모세포들을 ICSI에 의해 수정시키고, 다음으로 배아를 표준 배아 전달 과정을 사용하여 전달하였다. 해동된 배아 전달은 표준 해동 및 전달 과정을 사용하여 수행하였다.

주요한 결과 측정: FEET에 대한 해동된 난자 당 및 전달된 배아 당 생존율, 수정율, 임신율, 및 착상율을 계산하였다. 난모세포 동결-해동 사이클을 거친 배아 당 생존율, 임신율, 및 착상율을 FET 사이클에 대하여 계산된 동일 인자들과 비교하였다.

결 과 : 30 FEET 사이클에서, 56.4%의 해동 후 생존율과 65.9%의 ICSI 후 수정율을 얻었다. PBS를 기초로 한 배지에서, 생존율과 수정율은 47.2%와 58.8%였고, mHTF 배지에서, 생존율과 수정율은 60.8%와 68.5%였다. FEET로부터 25 ET 사이클에서, 해동된 난자 당 4.0% 착상율과 전달된 배아 당 13.4%의 임신율을 갖는 9 임신과 6 출산을 얻었다(해동된 난자 당 30% 임신율 및 ET 당 36% 임신율). (2003년 보고된 사이클을 포함하는) 전체적인 FEET 결과들을 FET로부터 얻은 결과들과 비교하면, 생존율, 임신율 및 착상율에서 차이는 없다.

결 론 : FEET는, 우수한 생존율과 임신율은 난모세포 동결보존으로써 이루어질 수가 있고, FET에 상응할만한 임신율과 착상율을 제공할 수 있음을 보여준다.

서 론 : 인간 난모세포를 성공적으로 동결 및 해동시킬 수 있는 능력은 생식의학(reproductive medicine)과 매우 밀접한 관계를 갖는다. 여기에는 몇 가지의 임상적인 시나리오가 있는데, 난모세포를 저장하는 능력이 도움이 될 수 있다.

종교적인 또는 다른 이유들로 배아를 동결하는 것을 원하지 않는 ART 치료를 수행하고 있는 환자. 난모세포를 동결하므로써, 이러한 환자는 하나의 난자 회복 사이클로부터 임신을 위한 몇몇의 시도를 할 수 있다. 또한, 이러한 과정은 배아를 동결하고 저장하는데 있어서의 법적 및 윤리적 문제를 일으키지 않는다.

이러한 것은 다음을 포함한다.

1. 난소 기능의 영구적인 손실의 위험이 있는 치료를 필요로 하는 암과 같은 의학적 상태를 지닌 환자.

2. 인생의 후반기에 사용하기 위하여 이른 나이에 난자를 동결하고 저장하는 것이 바람직한 노화와 관련된 생식력의 감소에 관련이 있는 환자.

3. 동결된 난자를 격리시키는 것이 가능한 제공자 난자 치료 및 동결된 난자를 사용하기 이전에 제공자의 감염성 질병에 대한 검사.

4. 배아 동결이 금지된 국가.

동결액용 기본 배지로서 나트륨-결손 PBS 배지를 사용한 ART 치료를 수행하는 여성에 난모세포 동결보존 및 해동에 관한 초기 시도 프로그램이 보고되었다. 현재 상황에서, 난모세포 동결보존의 효율성 및 동결보존을 위한 두 가지의 다른 나트륨-결손 배지를 비교한 추가적인 실험결과가 제공되고 있다. 프로그램의 난모세포 동결보존의 효율성을 결정하기 위하여 동결된 난모세포 대 동결된 배아 전달이 비교되었다.

방 법

제공된 결과는 2002년 1월부터 2004년 10월에 걸쳐 실시된 24명의 환자들에서 30회의 동결된 난자-배아 전달(FEET) 사이클로부터 얻어졌다. 이 시간 동안 행 하여진 모든 해동 사이클은 분석내용 중에 포함되어 있다. 분석 결과에 포함된 각각의 환자들은 새로운 ART 사이클을 수행하였고, 종교적 또는 윤리적 문제로 인하여 배아 동결은 없었다. 이러한 경우들에서, 우리의 프로토콜은 환자가 전달을 원하는 배아의 수와 동일한 수의 난자만을 수정시켰다. 연구 기간 동안에, 난자 동결은 Community Hospital Institutional Review Board에 의하여 연구 목적으로 승인된 연구 프로토콜로 행하여졌다. 모든 환자들은 난자가 냉동되기 전에 난모세포 동결보존의 연구성에 대해 증거가 되는 통지된 동의서에 사인을 하였다. 이러한 환자들에서는 제공자 난자 사이클이 포함되어 있지 않았다.

환자들을 표준 ART 자극 프로토콜을 사용하여 IVF를 위하여 자극하였다. 환자들은 황체기 루프롤라이드 아세테이트(leuprolide acetate) 억제로 음성 조절되거나, 또는 적어도 4개의 여포가 최대 직경 12mm에 도달시에 GnRH 길항제 억제에 놓이게 하였다. 자극을 위하여 순수한 FSH(Gonal F 또는 Follistim 중의 하나)를 사용하였고, 적어도 4개의 여포가 최대 직경 ≥18mm에 도달시에 환자들에 hCG(10,000IU IM)을 주었다. 경질적인(transvaginal) 난모세포 회복은 hCG 투여 후 35~36시간에 실시되었다. 난자는 제1극체의 존재에 대해 시험되었고, 몇 개의 난자(환자 나이에 따라서 3~5개)는 "새로운" IVF 사이클에서 수정을 위해 남겨두었다. 남아있는 난자를 약 30~60초 동안 히알루로니다아제(80IU/㎖)에 노출시켰다. 이 기간 동안, 누적 덩어리들을 피펫을 통해 흡인하여, 여분의 누적 세포들을 제거하였다. 다음으로, 난자들을 새로운 배지로 옮기고, 부착된 코로나 방사(corona radiate) 세포들을 좁은 구멍의 마이크로 피펫으로 흡인하여 제거시켰다. 제1극제 가 노출된 성숙된 난자를 동결보존하기 위하여 선별하였다.

본원에서 설명된 사이클로 난모세포를 동결보존하기 위하여 두 가지의 상이한 배지가 사용되었다. 8 FEET 사이클에 대하여, 20% 인공 혈청 치환물로 보충되고, 1.5M 프로판디올/0.2M 수크로오스를 함유하는 나트륨이 결손된 PBS가 동결을 위하여 사용되었다. PBS 배지는 시그마(St. Louis, MO)로부터 구입된 세포 배양 등급 시약들을 사용하여 실험실 내에서 제조하였다. 22 FEET 사이클에 대하여, 12mg/㎖ 인간 혈청 알부민으로 보충되고, 1.5M 프로판디올과 0.3M 수크로오스를 포함하는 나트륨-결손 개량된 인간 난관액 배지가 동결보존을 위해 사용되었다. mHTF 기초 동결 배지는 SAGE In Vitro Fertilization Inc., a Cooper Surgical Company, Trumbull, CT에서 제조되었다.

동결보존에 대하여, 난자를 실온(22~24℃)에서 20분 동안 동결액 1.0㎖ 내에서 인큐베이션하였다. 동결방지제에 20분간 노출시킨 후, 난자를 0.5㎖의 동결액을 함유하는 냉동 바이알(Nunc)에 넣은 다음, 22℃로 고정된 Planar freezer에 넣었다. 바이알을 -2℃/분으로 -6℃까지 냉동시키고, -6℃에서 5분간 유지시킨 다음에, 액체 질소로 냉각 처리된 금속 핀셋 한 쌍으로 유체 메니스커스에서 바이알의 바깥쪽을 접촉하여 수정시켰다. 다음으로, 바이알을 10분 동안 -6℃에서 추가적으로 유지시키고, -0.3℃/분으로 -35℃까지 냉동시키고, 이 시점에서 바이알을 액체 질소에 담그고, 다음으로 해동될 때까지 액체 질소 탱크 내에 저장하였다.

해동을 위한 준비로서, 환자들에게 경구용 에스트라디올을 5 사이클 일(CD)~8 CD까지 2mg/일, 8 CD로부터 12 CD까지 4mg/일, 12 CD로부터 18 CD까지 6mg/일을 투여하였다. CD 18에서, 자궁내막두께를 측정하기 위하여 질초음파를 실시하였다. 만일, 자궁내막이 ≥9mm이 아니면, 환자에게 6mg/일을 계속 투여하고, 원하는 두께 ≥9mm가 될 때까지 격일로 재평가하였다. 원하는 자궁내막두께가 얻어지면, 에스트라디올의 투여량을 4mg/일로 낮추고, 음성적 BhCG가 FEET 사이클의 말단에서 존재하거나, 또는 환자가 임신된 것으로 보일 때까지 계속 투여한다. 자궁내막이 ≥9mm에 도달시, 환자는 오일 중의 프로게스테론 25mg IM을 복용하기 시작하고, 난자를 프로게스테론 투여 첫째 날에 해동시키고, 프로게스테론 투여 4일째 ET를 수행한다. 프로게스테론은 2일째는 50mg으로 증가시키고, 다음으로 3일째는 100mg으로 증가키기고, 환자들의 임신테스트를 수행할 때까지, 12일간 오일 중의 프로세스테론 100mg IM을 계속 투여하였다. 임신한 환자들에게 경구용 에스트라디올 4mg/일과 오일 중의 프로게스테론 100mg IM/일을 계속 투여하였다. 혈중 에스트라디올과 프로게스테론 농도를 매 2주일 마다 측정하였고, 각각의 사용량은 에스트라디올 농도는 50pg/㎖ 근처 또는 이상, 프로게스테론 농도는 50mg/㎖ 근처 또는 이상으로 유지되도록 노력을 다하여 조절하였다. 모든 환자들은 10주일의 임신기간까지 이 프로토콜을 유지하였다. 그 후, 다음 2주일 동안에 공급되던 에스트라디올과 프로게스테론을 서서히 감소시키고, 12주일 후에는 산부인과 의사에게 자문을 구하였다.

해동시킨 후, 바이알을 액체 질소 저장으로부터 제거시키고, 저장 동안에 바이알에 들어갈 수도 있는 질소 성분을 비우기 위해 마개를 풀었다. 다음으로, 모든 얼음 결정들이 사라질 때까지, 바이알을 32℃ 수조에서 해동시키는데, 해동 시간은 약 1~1.5분이었다. 그 후, 바이알의 내용물들을 Falcon 3003 또는 3037 접시의 뚜껑에서 피펫팅하고, 난자를 동정하고, 0.5M 수크로오스 1.0㎖가 들어 있는 ＃3037 접시로 옮겼다. 실온에서 10분 동안 둔 후, 난자를 0.2M 수크로오스 1㎖가 들어 있는 다른 # 3037 접시로 옮기고, 실온에서 10분 더 유지시켰다. 수크로오스 용액은 나트륨 결손 PBS 또는 나트륨 결손 SAGE 개량 HTF로 제조하였다. 0.2M 수크로오스에서 10분 경과 후, 난자들을 0.5% HSA를 포함하는 Quinn's 수정 배지(SAGE Biopharma)로 세척하고, 수정이 될 때까지 2~5시간 동안 미네랄 오일 중의 이 배지 50㎕에서 배양하였다. 모든 수정은 조숙 표층립 방출과 연관된 잠재적인 수정의 문제점을 피하기 위하여 ICSI에 의해 실시되었다. 환자들은 배아 동결을 수행하는 것을 꺼리기 때문에, 일반적으로, 전달을 위한 최대한의 배아 수로 알려진 해동 및 ICSI 절차들 양쪽 모두에서 살아남은 3~4개의 난자가 존재할 때까지 해동이 실행되었다. 어떠한 경우에 있어서, 5개의 난자를 요청한 환자의 모든 난자가 해동되었고, 숫자에 관계없이 배아들이 전달된 경우, 5/5 난자가 해동 후 살아남고, ICSI 후에 수정되었고, 5개의 배아의 전달 후, 단생아 임신으로 1명을 출산하였다.

난자를 ICSI 후 16~20시간에서 수정에 대한 시험을 하였고, 두 개의 전핵(pronuclei)을 갖는 난자를 10% SPS가 공급된 Quinn's 절단 배지(SAGE In Vitro Fertilization, Inc.) 50㎕에서 배양하였다. 배아 전달은 해동 후 3일째 실시되었고, 모든 배아는 ET 전 최소 1시간에 산 Tyrode's를 사용해 부화하였다. 모든 ET는 Wallace 카테터(catheter)를 사용해 초음파의 도움으로 실시하였다.

난자 동결과 배아 동결을 비교한 결과는 난자 동결/해동 사이클과 3일째 배 아 동결/해동으로 얻은 결과를 비교하여 얻었다. 우리의 배아 동결/해동 사이클의 대부분(95% 이상)이 3일째 배아와 관련되기 때문에 3일째 배아 동결을 선택한 이유이다. 배아 동결 결과에 대하여, 만약 해동 후, 50%이상의 난할이 손상되지 않고 남아 있으면 배아는 생존하는 것으로 보인다. 환자들은 난자 해동 사이클에 대하여, 에스트라디올/프로게스테론 대체 요법에 두어졌고, 배아를 해동시키고, 프로게스테론 투여 4일째 전달하였다. 해동 후 해동된 및/또는 전달된 배아 당 생존율, 임신율 및 착상율에 관한 비교가 수행되었다. 많은 FET 환자들의 추적 관찰이 어려워 임신을 비교할 수는 없었다.

생존율, 수정율, 임신율, 및 착상율의 결과를 p<0.05 정도로 정의된 표준편차를 갖는 카이 제곱 검정(chi square test)으로 분석하였다.

결 과

기본 배지로서 나트륨 결손 PBS 또는 나트륨 결손 개량 HTF를 사용해 냉동시킨 난자로부터 얻은 결과들은 표 1에 설명되어 있다. 2002년 1월부터 2004년 10월에 걸쳐서 25명의 여성들에서 총 30 해동 사이클이 수행되었으며, 25 배아 전달 과정으로 종료되었다. 이들 중 5 사이클은 배아 전달로 진행하지 못하였는데, 3개의 이용가능한 난자들 중 어느 것도 해동 후 생존하지 못하였다. 흥미로운 것은, 이러한 환자는 해동 사이클 이전에 동결된 난자의 동일한 코호트(cohort)로부터 해동된 4개의 난자를 가지며, 이들 모두는 해동시 살아있었으며, 9주일 임신기간에서 임신이 실패로 되었다. 난자가 수정되지 않거나, (2개의 전핵의 존재로서 확인되는) 정상적인 수정이 되지 않은 2 사이클이 있었다. 나머지 2개의 미전달 시이클은 배아 발달이 전달 이전에 멈춘 사이클로부터의 결과이다.

평균적으로, 9개의 난모세포가 PBS 군에서 해동되었고, 7개의 난모세포가 mHTF 군에서 해동되었다. 동결액으로 PBS를 사용한 8 사이클에서 FEET의 결과 생존율은 mHTF를 사용하여 관찰한 결과(60.8%)보다 낮았으나(47.2%), 통계학적으로 중요성을 갖지는 못한다. 이것은 mHTF 군(12.0%)과 비교하였을 때, PBS 군(26.5%)을 사용한 경우 ICSI 후 손상 속도가 더 크기 때문일 것이다.

이러한 환자들에서 해동 실시 당 30.0% 임신율이고, 환자 당 또는 ET 당 36% 임신율을 보이는 총 9 임신이 학립되었다. 이들 중, 식별할 수 없는 임신낭을 가진 하나의 생화학적 임신이 있었는데, 이 환자는 알려지지 않은 이유로 hCG가 양성으로 확인된 후, 2 일째 프로게스테론 공급을 종료하였다. 임신낭을 갖는 하나의 임신이 있었으나, 태아의 심장박동이 없었으며, 한 명의 태아와 쌍둥이 태아의 심장 박동을 갖는 두 임신이 있었으나, 유산되었고, 쌍둥이 태아의 심장 박동이 있는 하나의 임신에서, 한 명의 태아는 자궁 내에서 사망하였고, 다른 한 명의 태아는 심각한 임신자간(pre-eclampsia)으로 조산하여, 생후 22 주째에 사망하였다. 전체적으로, 위에서 얻은 9 임신에서 확인된 총 9 개의 태아 심장 박동 착상 부위들이 있는데, 이는 전달된 배아 당 13.4%의 착상율 및 해동된 난자 당 4.0%의 착상율에 해당한다. 8 PBS 사이클에 대하여, 임신낭을 가지지만, 태아 심장 박동이 없는 단지 한 임신이 있었다. mHTF 사이클에 대하여는, 22 해동 및 18 전달 사이클에서 얻어진 8 임신이 있었으며, 시도된 해동 당 36.3%의 임신율 및 해동 당 44.4%으 임신율을 얻었다. 해동된 난자 당 및 mHTF 사이클로 전달된 배아 당 착상율은 각각 5.9% 및 17.6%였다.

난자 해동과 배아 해동의 효율을 비교하기 위하여, 우리는 난자 동결/해동 사이클로부터의 임상적 결과와 3일째 배아 동결/해동 사이클로부터 얻은 결과를 비교하였다. 이러한 비교에 있어서, 이전에 보고하였던 11 환자에서 16 해동 사이클로부터의 결과를 포함한다. 결과는 표 3에 나타내었다. 해동 후 난자와 배아의 생존율은 전달 당 임신율 및 전달된 배아 당 착상율 양자와 같이 통계적으로 동등하였다.

토 의

난모세포 동결보존에 관한 실험은 난모세포 동결/해동이 일상적으로 수행될 수 있으며, 배아 동결로부터 얻어진 결과들과 비교할 만한 생존율 및 임신율을 얻을 수 있음을 보여준다. 이 방법은 나트륨-결손 기초 배지의 사용이 적용되며, 이것을 사용한 동물 모델에서 해동 후 생존율이 증가됨을 보여준다. 나아가, 동결 이전에 20분 동안 동결방지제에 두는 시간을 연장시키고, 시딩 온도를 증가시키고, 유리 배지의 수크로오스 농도를 증가시킴에 의한 탈수 시간의 변화는 또한 해동 후 생존에 도움을 줄 수 있다. 본 전략은 약 30%의 해동 당 임신율과 약 36%의 전달 당 임신율을 가지며, 해동 후 50% 이상의 생존율을 제공한다. 이 결과들은 최대값보다 낮은 수치로 나타날 수 있는데, 어떠한 제한이 난자 동결로부터 얻어질 수 있기 때문이다. 이러한 일련의 과정에 있어서, 환자들은 배아 동결을 동의하지 않았기 때문에, 비교적 소량의 난자가 해동되고 각각의 사이클에서 수정되었다. 만약, 보다 많은 난자가 해동되고 수정되었다면, 임신율은 전달 이전의 배아 선별의 증가 된 능력에 기인하여 증가될 것으로 기대된다.

본 결과는 mHTF는 PBS보다 난모세포를 동결하는데 더 우수한 기본 배지임을 암시하는데, 이는 동결/해동 용액을 준비하기 위하여 사용되는 mHTF의 여러 사이클에서의 생존, 수정 및 임신율이 더 높기 때문이다. 그러나, 본 연구에서 PBS에 대하여 보고된 사이클의 수는 다소 낮다. 만약, 우리가 동결/해동 용액의 제조를 위하여 PBS를 사용한 우리의 이전의 16 해동 사이클로 계산하면, PBS에 대한 우리의 전체적인 결과는 62%의 생존율, 55%의 수정율, 해동 당 20.8%, ET 당 27.8%의 임신율, 및 3.1%와 11.4%의 해동 당 및 전달된 배아 당 착상율을 가진다. 이러한 각각의 결과는 표 1에서 보여지는 것과 같은 mHTF 사이클로부터 얻어진 결과보다 낮다. 관찰된 차이는 작은 샘플 크기에 기초하면 통계적으로 중요성이 발견되지는 않지만, mHTF-기초 동결보존을 사용한 이러한 모든 수치들의 증가되는 경향은 본 발명이 난모세포 동결보존에 바람직하다는 것을 암시한다.

모든 기관들에 의하여 일상적이고 기본적인 것으로 수행되기 위하여, 방법들은 1. 재생가능하고, 효과적으로, 2. 실험실에서 쉽게 재현가능하고, 3. 존재하는 기술과 공존할 수 있는 임신, 출산, 및 선천성 기형율을 얻는 것으로 발전하여야 한다. 난자 동결의 재현성과 효율에 관하여, 난자 동결을 위한 현재 사용되는 방법들은 두 가지의 일반적인 카테로리로 분류된다: 서서히 동결시키는 방법과 유리화 전략. 전자에 있어서, 다수의 실험실들은 서서히 동결/해빙하는 접근방법의 적용을 사용하여, 임신과 살아서 태어나게 하는 성공적인 해동 결과를 보고하였다. 난자 동결보존을 위하여 서서히 동결시키는 방법을 보고하는 여러 그룹들은 모두 약간의 다른 전략을 가진다. 예를 들어, 나트륨-결손 배지가 난자 동결을 위하여 사용되고, 다른 그룹에서는 동결 전략의 부분으로서, 37℃에서 동결보존 배지 내의 난모세포의 평형을 이용한다. 몇몇 그룹은 그들의 동결방지 용액에 증가된 세포외 수크로오스를 사용하였다. 궁극적으로, 그러한 접근방법은 10 여년 간 사용되어왔던 배아 동결을 위한 기술들의 약간의 변화이며, 그러한 방법들은 어떠한 IVF 실험실에서도 쉽게 도입될 수 있다.

또한, 세포 내 얼음 생성을 피하기 위한 고농도의 동결방지제의 사용에 관련된 유리화는 몇몇 보고된 출산으로 난모세포 보존을 위하여 성공적으로 사용되었다. 유리화 전략에는 통일된 것이 없다. 현재 수많은 기관들로부터의 보고서들과 결과들을 모두 통틀어, 난자 동결은 어떠한 하나의 접근법이 가장 성공적인지를 결정하기 위한 다른 방법들을 평가하기 위하여 요구되는 추가적인 작업과 함께, 재현가능하고, 효율적으로 수행될 수 있음을 보여준다.

일상적인 사용, 즉, 현존하는 기술과 유사한 임신, 출산 및 선천성 기형의 결과를 위한 최종적인 요구는 몇몇 논점들과 관련된다. 첫째로, 난자 동결은 배아 동결과 같은 대안적인 기술과 비교하여 동등한 임신율을 제공해야만 한다. 난모세포 해동을 3 동결 보존 배아의 해동과 비교한 결과는, 동일한 착상율과 임신율을 얻을 수 있음을 보여준다. 유사하게, Yang 등은 동결 난자와 동결 배아 사이클에서 동일한 임신율을 보여주었고, Porcu 등은 신선한 난모세포와 냉동된 난모세포 사이클 사이에서 임신율의 차이는 없음을 보여주었다. 반대로, Borini 등은 수정란 당 착상율은 동결된 난자 사이클에 대한 2.2%와 비교하여 동결 배아 사이클에서 3.9% 였음을 보여 주었으며, 난자 동결이 덜 효율적임을 제안하였다. 따라서, 이러한 연구들은 난자 동결이 배아 동결의 효율에 접근하거나 또는 심지어는 그것과 동일한 효율을 갖고서 실행될 수 있음을 보여주었지만, 아주 더 효능이 있는 난자 동결을 이루기 위해서는 더 한 층의 작업이 필요하다.

난자 냉동이 더 높은 빈도의 임신 이상, 선천성 기형, 염색체 이상, 또는 자손의 장래의 건강에 미치는 효과로 결과되어지는지 여부는 의문으로 남아있다. 한정된 결과들은, 13 임신이 확립되었고, 4를 잃었고, 우리가 우리의 프로그램에서 신선한 IVF 사이클로써 관찰한 약 18% 보다도 더 높은 30%의 손실률을 낳았다. 다른 작은 시도들은 20~50%의 손실률을 나타내었다. 동결보존 동안에 난자의 냉각 및 결과로 인한 동결은 스핀들 마이크로튜블(spindle microtubule)의 탈중합에 기인한 난자의 감수분열의 스핀들의 손실을 야기시키고, 이러한 결과 해동 및 수정 후 이수성(aneuploidy)의 위험을 증가시킨다. 그러나, 몇몇 연구는 해동과 동시에 재가열하는 경우, 많은 비율의 난자들은 염색체의 손실 없이 그들의 스핀들 아파라투스(spindle apparatus)를 재형성함을 보여주었다. 이러한 결과들이 재검증되는 동안, 이러한 기술의 전체적인 이점을 결정하기 위한 생존, 임신, 및 추산 결과의 전세계적인 결과들의 축적이 행하여져야만 한다.

참고 문헌

Claims (54)

1. PBS 완충액을 사용하지 않는 포유동물 세포용 나트륨-결손 동결보존 배지.
2. 제1항에 있어서, 상기 배지는 HEPES 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
3. 제2항에 있어서, 상기 HEPES는 약 10~약 25mM 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 배지.
4. 제2항에 있어서, 상기 HEPES는 약 21mM의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 배지.
5. 제2항에 있어서, 히알루론산이 동결보존 배지의 전체 체적을 기준으로 약 0.1~약 1.0mg/㎖의 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 배지.
6. 제2항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 난모세포인 것을 특징으로 하는 배지.
7. 제6항에 있어서, 상기 난모세포는 인간 난모세포인 것을 특징으로 하는 배 지.
8. 제2항에 있어서, 1,2-프로판디올, 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 에틸렌 글리콜 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 동결방지제를 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
9. 제3항에 있어서, 1,2-프로판디올, 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 에틸렌 글리콜 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 동결방지제를 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
10. 제9항에 있어서, 상기 동결방지제는 1,2-프로판디올인 것을 특징으로 하는 배지.
11. 제10항에 있어서, 상기 동결방지제인 1,2-프로판디올은 약 100~약 2,500mM 농도 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 배지.
12. 제1항에 있어서, 상기 나트륨은 7mM 미만의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 배지.
13. 제2항에 있어서, 상기 나트륨은 약 1~약 2mM의 양으로 존재하는 것을 특징으 로 하는 배지.
14. 제1항에 있어서, 히알루론산을 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
15. 제14항에 있어서, 상기 히알루론산은 동결보존 배지의 전체 체적을 기준으로 약 0.1~약 1.0㎎/㎖의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 배지.
16. 제1항에 있어서, 상기 배지는 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 배지.
17. 제2항에 있어서, 상기 배지는 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 배지.
18. 제9항에 있어서, 상기 배지는 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 배지.
19. 제10항에 있어서, 상기 배지는 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 배지.
20. 약 1~약 2mM 농도의 나트륨 및 약 21mM 농도의 HEPES로 필수적으로 구성되는 나트륨-결손 동결보존 배지.
21. 제1항의 동결보존 배지에서 난모세포를 동결하는 것을 포함하며, 해동시 상기 난모세포의 생존력이 상기 배지에서 동결보존되지 않은 난모세포와 비교하여 증가되는, 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 방법.
22. 제2항의 동결보존 배지에서 난모세포를 동결하는 것을 포함하며, 해동시 상기 난모세포의 생존력이 상기 배지에서 동결보존되지 않은 난모세포와 비교하여 증가되는, 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 방법.
23. 제3항의 동결보존 배지에서 난모세포를 동결하는 것을 포함하며, 해동시 상기 난모세포의 생존력이 상기 배지에서 동결보존되지 않은 난모세포와 비교하여 증가되는, 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 방법.
24. 제4항의 동결보존 배지에서 난모세포를 동결하는 것을 포함하며, 해동시 상기 난모세포의 생존력이 상기 배지에서 동결보존되지 않은 난모세포와 비교하여 증가되는, 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 방법.
25. 제1항의 배지를 사용하여 동결보존된 살아있는 난모세포.
26. 제2항의 배지를 사용하여 동결보존된 살아있는 난모세포.
27. 제3항의 배지를 사용하여 동결보존된 살아있는 난모세포.
28. 제4항의 배지를 사용하여 동결보존된 살아있는 난모세포.
29. 제1항에 있어서, 상기 배지는 MOPS 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
30. 제29항에 있어서, 상기 MOPS는 약 10~약 25mM 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 배지.
31. 제29항에 있어서, 상기 MOPS는 약 21mM의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 배지.
32. 제29항에 있어서, 상기 히알루론산은 동결보존 배지의 전체 체적을 기준으로 약 0.1~약 1.0㎎/㎖ 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 배지.
33. 제29항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 난모세포인 것을 특징으로 하는 배 지.
34. 제33항에 있어서, 상기 난모세포는 인간 난모세포인 것을 특징으로 하는 배지.
35. 제29항에 있어서, 1,2-프로판디올, 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 에틸렌 글리콜 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 동결방지제를 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
36. 제30항에 있어서, 1,2-프로판디올, 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 에틸렌 글리콜 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 동결방지제를 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
37. 제36항에 있어서, 상기 동결방지제는 1,2-프로판디올인 것을 특징으로 하는 배지.
38. 제37항에 있어서, 상기 동결방지제인 1,2-프로판디올은 약 100~약 2,500mM 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 배지.
39. 제29항에 있어서, 상기 나트륨은 7mM 미만의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 배지.
40. 제29항에 있어서, 상기 나트륨은 약 1~약 2mM의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 배지.
41. 제29항에 있어서, 히알루론산을 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
42. 제41항에 있어서, 상기 히알루론산은 동결보존 배지의 전체 체적을 기준으로 약 0.1~약 1.0㎎/㎖의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 배지.
43. 제29항에 있어서, 상기 배지는 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 배지.
44. 제36항에 있어서, 상기 배지는 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 배지.
45. 제37항에 있어서, 상기 배지는 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 배지.
46. 약 1~약 2mM 농도의 나트륨 및 약 21mM 농도의 MOPS로 필수적으로 구성되는 나트륨-결손 동결보존 배지.
47. 제29항의 동결보존 배지에서 난모세포를 동결하는 것을 포함하며, 해동시 상기 난모세포의 생존력이 상기 배지에서 동결보존되지 않은 난모세포와 비교하여 증가되는, 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 방법.
48. 제30항의 동결보존 배지에서 난모세포를 동결하는 것을 포함하며, 해동시 상기 난모세포의 생존력이 상기 배지에서 동결보존되지 않은 난모세포와 비교하여 증가되는, 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 방법.
49. 제31항의 동결보존 배지에서 난모세포를 동결하는 것을 포함하며, 해동시 상기 난모세포의 생존력이 상기 배지에서 동결보존되지 않은 난모세포와 비교하여 증가되는, 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 방법.
50. 제32항의 동결보존 배지에서 난모세포를 동결하는 것을 포함하며, 해동시 상기 난모세포의 생존력이 상기 배지에서 동결보존되지 않은 난모세포와 비교하여 증가되는, 동결보존된 난모세포의 생존력을 증가시키는 방법.
51. 제29항의 배지를 사용하여 동결보존된 살아있는 난모세포.
52. 제30항의 배지를 사용하여 동결보존된 살아있는 난모세포.
53. 제31항의 배지를 사용하여 동결보존된 살아있는 난모세포.
54. 제32항의 배지를 사용하여 동결보존된 살아있는 난모세포.