CN114514924A - 卵巢组织保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种卵巢组织保存方法，包括将卵巢组织顺次浸没于平衡液和玻璃化液后放置于液氮中保存，以及将保存于液氮中的卵巢组织取出后顺次置于N种复苏液进行复苏过程。本发明采用液氮快速降温的方法尽可能降低卵巢组织冻融过程的损伤，提高组织复苏后的活率，保存其生理功能。
Description
技术领域
本发明涉及生物保存技术领域，尤其涉及卵巢组织保存方法。
背景技术
2018年全球新增860万例女性癌症患者，在每年新确诊的女性癌症患者中，大约有5％为育龄期女性。肿瘤治疗无论手术或放化疗均可造成医源性的生育力丧失，卵巢功能受损或衰竭的风险可达100％。随着癌症患者低龄化的现象渐趋明显，肿瘤患者治疗后有较高的长期生存率，约有75％的患者具有保存生育能力和内分泌水平的需求。有研究表明，大约有8％的子宫内膜癌、12％的卵巢癌和40％的宫颈癌发生在生育年龄的妇女，而这些患者大多仍然有生育要求。
卵巢组织冷冻是随着女性疾病患者对保留生育力的需求而发展起来的一项新技术，为接受放化疗的肿瘤患者保留完整生育功能提供了一线生机。临床研究表明，卵巢组织冻存复苏后移植成功率约85％～90％，95％的患者能够恢复卵巢内分泌功能，临床妊娠率约45％，出生率约35％～40％。卵巢组织冷冻保存的方法和冷冻解冻液对卵巢组织中卵泡的存活率具有重要的影响，良好的冻存程序可以保存大量的卵泡，为后续能否成功移植奠定基础。
理想的卵巢组织的冻融方法和冻存复苏溶液体系要能够保存卵巢组织的活性和功能。目前虽然开发出了多种冷冻保存溶液，但其复苏活性不理想。
因此，有必要提供一种新型的卵巢组织保存方法以解决现有技术中存在的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种卵巢组织保存方法。
为实现上述目的，本发明的所述卵巢组织保存方法包括：
提供卵巢组织、平衡液、玻璃化液和N种复苏液，N为不小于2的正整数；
将所述卵巢组织顺次浸没于所述平衡液和所述玻璃化液后放置于液氮中保存；
将保存于液氮中的卵巢组织取出后顺次置于所述N种复苏液进行复苏过程。
本发明的所述卵巢保护方法的有益效果在于：将所述卵巢组织顺次浸没于所述平衡液和所述玻璃化液后放置于液氮中保存；将保存于液氮中的卵巢组织取出后顺次置于所述N种复苏液进行复苏过程，有利于提高卵巢组织复苏后活率。
优选的，控制所述平衡液的温度为10-25摄氏度，所述卵巢组织浸没于所述平衡液的时间不超过25分钟。
优选的，控制所述玻璃化液的温度为10-25摄氏度，所述卵巢组织浸没于所述玻璃化液的时间至少为15分钟。
进一步优选的，控制所述卵巢组织浸没于所述玻璃化液的时间至少为15分钟直至所述卵巢组织下沉于置有所述玻璃化液的容器底部。
优选的，控制使用的第一种复苏液的温度为30-40摄氏度，所述卵巢组织浸没于所述第一种复苏液的时间不超过10分钟。
进一步优选的，控制其余复苏液的温度为10-25摄氏度，所述卵巢组织浸没于所述其余复苏液分别进行的复苏过程时间不超过15分钟。
优选的，控制所述玻璃化液中非渗透冷冻保护剂的含量是所述平衡液中非渗透性冷冻保护剂含量的8-30倍。
优选的，控制所述玻璃化液中渗透性冷冻保护剂的含量是所述平衡液中渗透性冷冻保护剂含量的0.8-1.5倍。
优选的，不同复苏液中非渗透性冷冻保护剂的含量随所述N次复苏过程逐步降低0.2-1倍。
优选的，控制所述玻璃化液中乙二醇含量高于所述平衡液中乙二醇含量，所述玻璃化液中二甲基亚砜含量高于所述平衡液中二甲基亚砜含量。
优选的，控制所述平衡液、所述玻璃化液和每种复苏液均包含组成和含量相同的基准液。
具体实施方式
针对现有技术存在的问题，本发明的实施例提供了一种生物保存液及其在卵母细胞和卵巢组织保存中的应用，以提供卵巢组织存活的微环境，提高卵巢组织复苏后的活率。
本发明实施例的人血白蛋白为非重组人血白蛋白。具体的，所述非重组人血白蛋白经对健康人血液纯化得到，能够维持与调节溶液的渗透压并对细胞形成保护作用。
本发明实施例的所述生物保存液，由平衡液、玻璃化液和N种解冻液组成，以应用于对卵巢组织进行的冻存过程和N次复苏过程，N为不小于2的正整数。
本发明一些实施例中，所述平衡液由基准液、渗透性冷冻保护剂、非渗透冷冻保护剂和溶剂组成。
具体的，所述平衡液的非渗透冷冻保护剂为人血白蛋白，所述平衡液的渗透性冷冻保护剂由乙二醇和二甲基亚砜组成。
本发明一些实施例的平衡液中，以占所述平衡液的体积计，人血白蛋白含量为5-40mg/ml，乙二醇和二甲基亚砜的体积百分比均为2-30％。
本发明一些实施例的平衡液中，乙二醇和二甲基亚砜具有相同的含量。
本发明一些实施例中，所述玻璃化液由基准液、渗透性冷冻保护剂、非渗透冷冻保护剂和溶剂组成。
具体的，所述玻璃化液的非渗透冷冻保护剂由人血白蛋白以及蔗糖和海藻糖的任意一种组成。所述玻璃化液的渗透性冷冻保护剂由乙二醇和二甲基亚砜组成。
本发明一些实施例的玻璃化液中，以占所述玻璃化液的体积计，蔗糖和海藻糖任意一种的含量为0.1-2mol/L，人血白蛋白含量为5-40mg/ml，乙二醇和二甲基亚砜的体积百分比均为2-30％。
本发明一些实施例的玻璃化液中，乙二醇和二甲基亚砜具有相同的含量。
本发明一些实施例中，所述玻璃化液中渗透性冷冻保护剂的含量高于所述平衡液中的渗透性冷冻保护剂的含量。
具体的，所述玻璃化液中渗透性冷冻保护剂含量是所述平衡液中渗透性冷冻保护剂含量的0.8-1.5倍。
本发明一些实施例中，所述玻璃化液中非渗透冷冻保护剂含量高于所述平衡液中非渗透性冷冻保护剂的含量。
具体的，所述玻璃化液中非渗透冷冻保护剂含量是所述平衡液中非渗透性冷冻保护剂含量的8-30倍。
本发明一些实施例中，所述玻璃化液的非渗透冷冻保护剂具有与所述平衡液中相同含量的人血白蛋白。
本发明一些实施例中，所述玻璃化液的乙二醇含量高于所述平衡液的乙二醇含量，所述玻璃化液的二甲基亚砜含量高于所述平衡液的二甲基亚砜含量。
本发明一些实施例中，每种解冻液由基准液、非渗透性冷冻保护剂和溶剂组成。
具体的，所述解冻液非渗透性冷冻保护剂由人血白蛋白，以及蔗糖和海藻糖的任意一种组成。
本发明一些实施例的解冻液中，以每种解冻液的体积计，每种解冻液中人血白蛋白含量均为5-40mg/ml，蔗糖和海藻糖任意一种的含量为0.05-3mol/L。
本发明一些实施例中，不同解冻液中的非渗透性冷冻保护剂含量随所述复苏过程逐步降低0.2-1倍。
本发明一些实施例中，不同解冻液具有相同含量的人血白蛋白。
本发明一些实施例中，不同解冻液中蔗糖和海藻糖任意一种的含量随所述N次复苏过程逐步降低。
本发明一些实施例中，所述平衡液、所述玻璃化液和每种解冻液的溶剂均为纯化水。
本发明一些实施例中，所述平衡液、所述玻璃化液和每种解冻液均包含组成和含量相同的基准液。
具体的，所述基准液由抗氧化剂、营养剂、能量物质、缓冲剂、抗菌剂和pH调节剂组成。
本发明一些实施例中，以占所述平衡液、所述玻璃化液和每种解冻液的任意一种的体积计，抗氧化剂、营养剂、能量物质、缓冲剂、抗菌剂和pH调节剂的含量依次为0.1-10mmol/L、6-19g/L、0.5-1g/ml、14-21g/L、15-45mg/L以及3.36g/L。
本发明一些实施例中，所述抗氧化剂为牛磺酸。
本发明一些实施例中，所述营养剂为丙氨酰谷氨酰胺。
本发明一些实施例中，所述能量物质为丙酮酸钠和葡萄糖。
本发明一些实施例中，所述缓冲剂为HEPES。
本发明一些实施例中，所述抗菌剂为硫酸庆大霉素。
本发明一些实施例中，所述pH调节剂为碳酸氢钠。
本发明实施例还提供了所述生物保存液应用于卵巢组织保存过程，包括控制所述平衡液和所述玻璃化液的温度为10-25摄氏度，控制第一种解冻液的温度为30-40摄氏度，其余解冻液的温度为10-25摄氏度，使用玻璃化液进行样本处理结束后转入液氮速冻保存。
本发明一些实施例的所述生物保存液应用于卵巢组织保存过程中，控制使用平衡液进行样本处理的时间不超过25分钟，使用玻璃化液进行样本处理的时间至少为15分钟直至卵巢组织切片在所述玻璃化液中由悬浮状态下沉至容器底部，使用所述第一种解冻液进行复苏的时间不超过5分钟，使用所述其余解冻液进行复苏的时间不超过15分钟。
以下以具体的实施例进行详细说明：
实施例1-3提供的平衡液、玻璃化液和三种解冻液的具体组成和含量请分别对应参见表1-3.
表1
表2
表3
本发明实施例1-3中，采用6-8周龄的健康SPF级雌性KM小鼠(上海杰思捷实验动物有限责任公司)的卵巢组织片进行冻存保存和复苏。另外，以未经冻存处理的新鲜卵巢组织片为对照组。
卵巢组织片的获取过程为：取12只小鼠并处死，摘取双侧卵巢，将卵巢切割为若干厚度为1mm的卵巢组织片。
卵巢组织片的冻存过程具体为：
平衡液和玻璃化液平衡至室温，以上述平均厚度为1mm的卵巢组织片为实验材料。
将卵巢组织片浸没于平衡液溶液中平衡25min后用无菌纱布吸去卵巢组织片表面的浮液。
然后将卵巢组织浸入玻璃化液中平衡至少15min直至卵巢组织片下沉至容器底部，处理结束后，将卵巢组织片平铺于组织支架上，用无菌纱布吸去组织上的浮液后连同组织支架快速浸入液氮中静置至少5min，然后将组织支架移入已在液氮中预冷的冻存管并转入液氮罐中进行保存。
卵巢组织片的复苏过程具体为：
解冻液1预热至37℃以及解冻液2和解冻液3平衡至室温。
将载有卵巢组织片的组织支架从液氮中取出并移入解冻液1中，使卵巢组织片从组织支架上脱落并在5毫升的解冻液1中浸泡3min；然后将卵巢组织片转移至5毫升的解冻液2静置5min；最后将卵巢组织片转移至5毫升的解冻液3静置5min。
本发明实施例1-3中，将复苏后的卵巢组织片置于福尔马林中进行固定后脱水至透明，石蜡包埋后行厚度为4μm的连续切片，进行HE染色以对原始卵泡个数和形态进行分析，进行TUNEL染色以分析细胞凋亡情况。结果请参见表4。
表4
| 分组 | 原始卵泡数/个 | 正常原始卵泡率 | 凋亡细胞率 |
| 对照组 | 116 | 93.96±0.91％ | 2.65±0.52％ |
| 实施例1 | 128 | 87.75±3.80％ | 5.60±2.00％ |
| 实施例2 | 114 | 90.19±2.66％ | 3.5±1.08％ |
| 实施例3 | 122 | 81.88±4.34％ | 8.98±3.70％ |
实施例1、2和3各组数据与对照组的对应数据相比较P>0.05，均无显著性差异。
其中：
正常原始卵泡率＝正常原始卵泡数目/原始卵泡个数；
凋亡细胞率＝凋亡细胞数目/原始卵泡个数。
本发明实施例用来冻存保存和复苏的卵巢组织不限于片状，还可以是块状或整个卵巢。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。
Claims (11)
1.一种卵巢组织保存方法，其特征在于：
提供卵巢组织、平衡液、玻璃化液和N种复苏液，N为不小于2的正整数；
将所述卵巢组织顺次浸没于所述平衡液和所述玻璃化液中处理后转入液氮中冷冻保存；
将保存于液氮中的卵巢组织取出后顺次置于所述N种复苏液中进行复苏过程。
2.根据权利要求1所述的卵巢组织保存方法，其特征在于，控制所述平衡液的温度为10-25摄氏度，所述卵巢组织浸没于所述平衡液的时间不超过25分钟。
3.根据权利要求1所述的卵巢组织保存方法，其特征在于，控制所述玻璃化液的温度为10-25摄氏度，所述卵巢组织浸没于所述玻璃化液的时间至少为15分钟。
4.根据权利要求3所述的卵巢组织保存方法，其特征在于，控制所述卵巢组织浸没于所述玻璃化液的时间至少为15分钟直至所述卵巢组织下沉于盛有所述玻璃化液的容器底部。
5.根据权利要求1所述的卵巢组织保存方法，其特征在于，控制使用的第一种复苏液的温度为30-40摄氏度，所述卵巢组织浸没于所述第一种复苏液的时间不超过10分钟。
6.根据权利要求5所述的卵巢组织保存方法，其特征在于，控制其余复苏液的温度为10-25摄氏度，所述卵巢组织浸没于所述其余复苏液分别进行的复苏过程时间不超过15分钟。
7.根据权利要求1所述的卵巢组织保存方法，其特征在于，控制所述玻璃化液中非渗透冷冻保护剂的含量是所述平衡液中非渗透性冷冻保护剂含量的8-30倍。
8.根据权利要求1所述的卵巢组织保存方法，其特征在于，控制所述玻璃化液中渗透性冷冻保护剂的含量是所述平衡液中的渗透性冷冻保护剂含量的0.8-1.5倍。
9.根据权利要求1所述的卵巢组织保存方法，其特征在于，不同复苏液中非渗透性冷冻保护剂的含量随所述N次复苏过程逐步降低0.2-1倍。
10.根据权利要求1所述的卵巢组织保存方法，其特征在于，控制所述玻璃化液中乙二醇含量高于所述平衡液中乙二醇含量，所述玻璃化液中二甲基亚砜含量高于所述平衡液中二甲基亚砜含量。
11.根据权利要求1所述的卵巢组织保存方法，其特征在于，控制所述平衡液、所述玻璃化液和每种复苏液均包含组成和含量相同的基准剂。
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