KR102106757B1 - 난소 동결 보존용 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 난소 동결 보존용 펩티드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드 및/또는 라이코펜을 포함하는 난소 동결-해동시 또는 난소 동결 보존, 이식시 난소의 생존율을 향상시키는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 난소 동결 보존시 효과적으로 난소의 생존율을 향상시킬 수 있는 조성물이 제공될 수 있다. 최근 젊은 암 생존자의 증가와 결혼 및 초산연령의 늦어짐으로 인해 가임력 보존이 중요해지고 있어, 본 발명은 유용성은 점차 증가할 것으로 예상된다.

Description

난소 동결 보존용 펩티드 및 이를 포함하는 조성물{A peptide for cryopreservation of ovaries and the composition comprising the same}

본 발명은 난소 동결 보존시 난소의 생존율 향상 효과를 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드로서, 난소 동결-해동시 또는 난소 동결 보존, 이식시 난소의 생존율 향상 효과를 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

난소 동결 보존은, 암환자가 받게 되는 항암·방사선 치료로 인해 세포 활동이 활발한 난소가 손상되는 것을 막기 위해 이루어 지며, 항암 치료 전에 실시하여 항암 치료 후에도 가임력의 손실 없이 임신의 기회를 다시 가질 수 있는 유용한 방법이다. 구체적으로는 동결-해동한 난소 조직을 체외배양 하여 성숙된 난자를 얻거나 [Hartshorne GM, Rev Reprod, 2: 94-104, 1997], 난소 조직을 동종 혹은 이종의 개체에 이식하여 성숙난자를 얻은 후, 배우자의 정자와 수정시켜 임신에 성공할 수 있다[Gosden RG et al, Hum Reprod, 9: 597-603, 1994; Gunasena KT et al, Hum Reprod, 12: 101-6, 1997] 하지만, 난소 동결 보존은 동결-해동 과정 중에 난소 조직이 손상될 수 있다는 문제가 있다. 이 문제는 구체적으로 동결보호제나 급격한 온도 변화 또는 삼투압 차이 등에 의해 세포 생리 기작, 세포막, 그리고 세포 소기관 등이 손상을 입는 것을 의미한다[Fuller BJ et al, Cryobiology, 26: 333-40, 1989]. 최근에는 이 문제를 해결하기 위한 난소 동결 보존 중 난소 조직의 손상을 줄일 수 있는 방법 및 조건을 찾는 연구가 활발하게 진행 중이다. 최근 젊은 암 생존자의 증가와 결혼 및 초산연령의 늦어짐으로 인해 가임력 보존이 중요해졌고, 가임력 보존을 위한 난소 동결 보존시, 난소의 생존율을 효과적으로 향상시킬 수 있는 화합물이 필요한 실정이다.

KR 0976241 B1

이선희 외, 37-44pp, Kor. J. Fertil. Steril., Vol. 29, No. 1, 2002

이러한 배경하에서 본 발명자들은 난소의 생존율을 향상시킬 수 있는 난소 동결 보존용 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 일측면에 따른 목적은 난소 동결 보존시 난소의 생존율 향상 효과를 가지는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 일측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드; 및 라이코펜으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유용성분을 포함하는 난소 동결 보존용 조성물이 제공된다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편일 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 상기 펩티드 및 라이코펜을 동시에 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 라이코펜은 토마토로부터 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 LDH(Lactate Dehydrogenase)의 농도를 감소 시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약학적 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 언급된 난소 동결 보존용 조성물을 난소를 동결하고 이를 해동하는 배지에 처리하는 단계를 포함하는 난소 동결 보존 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따른 난소 동결 보존 방법에 있어서, 상기 난소 동결 보존 방법은 배아 동결 보존 또는 난자 동결 보존을 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면 난소 동결 보존시 난소의 생존율을 효과적으로 향상시킬 수 있는 조성물이 제공될 수 있다. 최근 젊은 암 생존자의 증가와 결혼 및 초산연령의 늦어짐으로 인해 가임력 보존이 중요해지고 있어, 본 발명은 유용성은 점차 증가할 것으로 예상된다.

도 1은 난소의 동결-해동 과정을 거치고, 각 배지에 Pep1 및 라이코펜를 처리한 후, 각 배지의 2일, 4일, 6일, 8일 시점의 LDH 농도를 측정한 그래프 이다.
도 2는 난소의 동결-해동 과정을 거치고, 각 배지에 Pep1, 라이코펜 그리고 Pep1과 라이코펜을 같이 처리한 후, 각 배지의 2일, 4일, 6일, 8일 시점의 LDH 농도를 측정한 그래프이다.
도 3은 난소 조직 배지에 Pep1을 50μmol와 100μmol 각 처리 후, 2일, 4일, 6일 시점의 LDH 농도를 측정한 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

텔로미어(telomere)는 염색체의 말단에 반복적으로 존재하는 유전 물질로서, 해당 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지한다고 알려져 있다. 세포가 분열할 때마다 텔로미어의 길이는 조금씩 짧아지는데, 일정한 횟수 이상의 세포 분열이 있게 되면 텔로미어는 매우 짧아지고, 그 세포는 분열을 멈추고 죽게 된다. 반면 텔로미어를 길게 하면 세포의 수명이 연장된다고 알려져 있으며, 그 예로 암세포에서는 텔로머라제(telomerase)라는 효소가 분비되어 텔로미어가 짧아지는 것을 막기 때문에, 암세포가 죽지 않고 계속 증식할 수 있다고 알려져 있다.

라이코펜은 주로 토마토에서 발견되는 천연물로 강력한 산화방지제이다.

발암과 돌연변이 유발(mutagenesis)에 대한 라이코펜의 억제 작용은 활성산소종(reactive oxygen species) 제거(scavenging), 알코올중독치료(detoxification)의 상향 조절[Astorg P, Nutrition Cancer 29, 60-68, 1997], 세포 주기 퇴화의 억제와 신호 전달 경로(Signal transduction pathways)의 조절[Bhuvaneswari, V, Current Medical Chemistry Anticancer Agents 5, 627-635, 2005]과 관련되어 있다고 알려져 있다. 최근에는 라이코펜이 화학적으로 야기되는 1차 DNA 상해(primary DNA damage) 및 중국 햄스터의 난소 세포의 염색체 절단 및 손실을 방지하는 기능이 있음이 밝혀졌다[Scolastici C et al, Toxicology in Vitro 21, 841, 2007].

본 명세서에 개시된 펩티드는 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드 또는 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드와, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1의 펩티드, 서열번호 1의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제, 구체적으로 인간(Homo sapiens) 텔로머라제에서 유래한 펩티드를 포함한다.

본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 세포 투과 펩티드는, 30개 이하의 아미노산으로 구성될 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 세포 투과 펩티드는 텔로머라제, 구체적으로 인간(Homo sapiens) 텔로머라제에서 유래한 펩티드를 포함한다.

서열 번호 1에 기재된 펩티드는 아래 표 1과 같다. 아래 표 1의 “이름”은 펩티드를 구별하기 위해 명명한 것이다. 본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1에 기재된 펩티드는 인간 텔로머라제의 전체 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 다른 일측면에서, 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제에 포함된 펩티드 중 해당 위치의 펩티드를 선별해 합성한 “합성 펩티드”를 포함한다. 서열번호 2는 전체 텔로머레이즈의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

서열번호	이름	텔로머라제 상 위치	서열	길이
1	pep1	[611-626]	EARPALLTSRLRFIPK	16 aa
2		[1-1132]	MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRR GAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGT TLTALEAAANPALPSDFKTILD	1132 aa

본 발명의 일측면에서, 아미노산 변화는 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 성질에 속한다. 예를 들어, 펩티드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.

본 명세서에서 “아미노산”이라 함은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 일측면에서 펩티드는 D-아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 한편, 본 발명의 다른 측면에서 펩티드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩티드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.

본 명세서에 개시된 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 본 명세서에 개시된 펩티드는 서열 번호 1 또는 그 단편인 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly, 그리고 이들과 반대인 것들이다. 보존적 치환의 다른 예는 다음 표와 같다.

원래 아미노산	예시적인 잔기 치환	바람직한 잔기 치환
Ala (A)	val; leu; ile	Val
Arg (R)	lys; gln; asn	Lys
Asn (N)	gln; his; asp, lys; arg	Gln
Asp (D)	glu; asn	Glu
Cys (C)	ser; ala	Ser
Gln (Q)	asn; glu	Asn
Glu (E)	asp; gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	Arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; norleucine	Leu
Leu (L)	norleucine; ile ; val; met; ala; phe	Ile
Lys (K)	arg; gln; asn	Arg
Met (M)	leu; phe; ile	Leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	tyr; phe	Tyr
Tyr (Y)	trp; phe ; thr; ser	Phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; norleucine	Leu

본 발명의 일측면에서는 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 난소 동결 보존용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 난소 동결 보존용 조성물은 일측면에서는 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 10 ㎎/L 내지 1000㎎/L, 구체적으로 10 ㎎/L 내지 500㎎/L, 더 구체적으로 30㎎/L 내지 200㎎/L 의 함량으로 포함할 수 있으나 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다. 상기 범위 또는 그 이하의 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.

본 발명의 일측면에서 조성물은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 난소 동결 보존용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다.

경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다(즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).

수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 쉬운 방법이기 때문이며, 그것이 아님이 명시되어 있지 않는, 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 끝 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.

본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석되어서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다 .

하기 실시예에서는 난소 동결-해동시 생존률 향상에 대한 효과를 규명하기 위해 서열번호 1에 따른 펩티드 Pep1 및 라이코펜(Lycopene)의 처리 이후 LDH (Lactate dehydrogenase)의 농도 변화를 확인하는 실험을 실시하였다.

이하, 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 펩티드의 합성

서열번호 1 의 펩티드를 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S(Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산을 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

NH₂-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin

NH₂-Ala-2-chloro-Trityl Resin

NH₂-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin

펩타이드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacetic acid.

커플링 시약(Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩타이드를 Resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H₂O=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.

아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다. 실험에 사용된 모든 펩티드들의 순도는 95% 이상이며, 이는 고성능 액체 크로마토 그래피 (high-performance liquid chromatography)를 이용해 결정하였다.

서열번호 1 의 펩티드 Pep 1의 구체적인 제조 과정을 설명하면 다음과 같다.

1) 커플링

NH₂-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin 에 보호된 아미노산(8당량)와 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

2) Fmoc 탈보호

20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩타이드 기본 골격 NH₂-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-chloro-Trityl Resin)을 만들었다.

4) 절단(Cleavagge): 합성이 완료된 펩타이드 Resin에 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩타이드를 Resin에서 분리하였다.

5) 얻어진 mixture에 Cooling diethyl ether를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩타이드를 침전시킨다.

6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 powder로 제조하였다.

실시예 2: 난소 동결-해동시 Pep1 및 라이코펜 처리에 의한 LDH 억제 확인

LDH(Lactate dehydrogenase)는 동물, 식물, 원핵생물에서 발견되는 효소이다. LDH는 혈구세포나 심근과 같은 체세포 많이 발견되는데, 조직 손상이 발생하면 방출되어 부상이나 질병의 마커로 활용될 수 있기 때문에 의학적으로 매우 중요하다.

Pep1의 난소 동결-해동시 방출되는 LDH에 대한 억제 현상을 규명하는 기본 데이터를 도출하기 위하여, Pep1과 라이코펜에 대한 LDH 에세이를 실시하였다.

반응물 준비

동물병원으로부터 암컷 개의 난소를 입수하여 난소절제술(Oophorectomy)을 이용하여 절제함으로써 얻어진 난소(whole ovary)를 10% FBS(Fetal bovine serum, Cat. No. S101-07, Welgene, S. Korea)가 첨가된 DMEM F/12(Cat. No. 12400-024, Gibco, U.S.A.)에 보관 하여 실험실로 이동 하였다.

난소를 DPBS(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, Cat. No. 21600-010, Gibco, U.S.A.)가 담긴 배양접시로 옮긴 후, 수술용 칼(surgical blade, Cat. No. B.S. 2982, Sheffield, England)를 사용하여 반으로 절개 하였다.

난소의 수질(Ovarian medulla)를 수술용 칼로 긁어서 제거 하여, 최대한 난소 피질(ovarian cortex)만 남게 하고, DPBS로 세척을 한 후 DPBS가 담긴 배양접시로 옮긴 다음, 수술용 칼로 난소를 절편(1㎜ x 5㎜ x 1㎜)내었다.

난소 절편 3개씩을 냉동시약((1.5M DMSO(Dimethyl Sulfoxide, Cat. No. Sigma, U.S.A.) + 0.1M Sucrose(Cat. No. S3089, Sigma, U.S.A)+ 10% BSA(Bovine Serum Albumin, Cat. No. A9647, Sigma, U.S.A.))이 들어있는 각 cryogenic tube(Cat. No. 8562, Stockwell, U.S.A.)에 넣고 4℃에서 30분 동안 교반하면서 처리를 한 후, Kryo 10 series III (MiraeBiotech, S. Korea)을 사용하여 0℃에서 -7℃까지 분당 -2℃로 감온, Seeding 후 -7℃에서 10분 유지, -40℃까지 분당 -0.3℃로 감온, -140℃까지 분당 -10℃ 감온하는 방법으로 동결을 한 후 cryogenic tube를 액체 질소에 보관 하였다.

냉동보관된 난소 조직 절편들이 담긴 cryogenic tube를 1주일 뒤 37℃에서 2분 동안 해동 한 후 세척과정(1.5M Sucrose를 포함하는 PBS에서 1분, 1.0 Sucrose를 포함하는 PBS 1분, 0.5 Sucrose를 포함하는 PBS에서 1분, PBS에서 1분씩 2번)을 거쳐 세척을 한 뒤 배양액((AIM/V(Cat.No. 12055-091, Gibco, U.S.A.) 배지 + 10% SPS(Quinn’s Advantage SPS Serum Protein Substitute, Cat. No. ART-3010, SAGE, U.S.A.) + 1IU/ml IVF-M Inj. 75iu(Human Menopausal Gonadotropin, LG Life Sciences, S. Korea))에 넣어서 보관 후 난소 조직 절편들을 이용하여 아래와 같은 세가지 실험을 각 실시하였다.

실험군 1

대조군(10% SPS + 1IU/ml HMG),

Pep1((10% SPS + 1IU/ml HMG + Pep1(Cat. No. , Kaelgemvax, S. Korea) 100μmol)),

라이코펜((10% SPS + 1IU/ml HMG + 라이코펜 (Cat. No. L9879, Sigma, U.S.A.) 10μmol))

실험군 2

대조군(10% SPS + 1IU/ml HMG),

Pep1(10% SPS + 1IU/ml HMG + Pep1 100μmol),

라이코펜 (10% SPS + 1IU/ml HMG + 10μmol),

Pep1 + 라이코펜(10% SPS + 1IU/ml HMG + Pep1 100μmol + 라이코펜 10μmol)

실험군 3

Control (10% SPS + 1IU/ml HMG),

Pep1 50μmol(10% SPS + 1IU/ml HMG + Pep1 50μmol),

Pep1 100μmol(10% SPS + 1IU/ml HMG + Pep1 100μmol)

위 세 가지의 실험 조건으로 배양을 한 후 배양 2일, 4일, 6일(실험군 3) 또는 배양 2일, 4일, 6일, 8일(실험군 1, 실험군 2)에 배양액을 100㎕씩을 취하여 마이크로원심관(Cat. No. MCT-150-C, Axygen, U.S.A.)에 담아 -20℃에서 보관 하였다.

8일째 배양액을 보관한 하루 뒤 보관된 마이크로원심관에 담긴 배양액을 해동하여 LDH(Lactate dehydrogenase) assay kit(Cat. No. 10008882, Cayman, U.S.A)를 사용하여 Pep1과 라이코펜의 효과를 확인하였다.

실험군 1의 결과를 통해서는, 2일에서 8일까지의 각 측정 시점에서 라이코펜을 투여한 그룹이 대조군 보다 LDH 농도가 낮고, Pep 1을 투여한 그룹이 라이코펜을 투여한 그룹보다 LDH 농도가 낮음을 확인할 수 있었다(도 1 참조). 실험군 2를 통해서는 Pep1과 라이코펜을 같이 투여한 그룹이 2일, 4일, 6일의 각 측정 시점에서 대조군이나, Pep1, 라이코펜을 각 투여한 그룹보다 LDH 농도가 낮게 나타났다(도 2 참조). 실험군 3의 결과에서는 LDH농도 변화 양상에 있어, 4일과 6일째 측정 시점에서 Pep1을 고농도(100μmol) 처리한 그룹에서 대조군 및 저농도(50 μmol) 투여군에 비해 LDH농도가 낮음을 관찰할 수 있었다(도 3 참조).

위 실험 결과들로부터 난소 동결-해동 과정 이후의 Pep1과 라이코펜의 처리가 포유류 난소 조직의 손상을 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

<110> KAEL-GEMVAX CO., LTD. KIM, Sangjae <120> A peptide for cryopreservation of ovaries and the composition comprising the same <130> 13P738/IND <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 1132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15 His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30 Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45 Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95 Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110 Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 120 125 Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140 Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175 Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly 180 185 190 Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205 Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220 Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255 Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val 260 265 270 Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285 Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His 290 295 300 Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335 Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser 355 360 365 Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415 Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln 420 425 430 Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu 435 440 445 Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe 450 455 460 Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480 Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser 485 490 495 Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met 500 505 510 Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys 515 520 525 Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560 Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575 Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 580 585 590 Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln 595 600 605 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 610 615 620 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640 Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655 Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg 660 665 670 Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg 675 680 685 Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700 Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile 705 710 715 720 Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln 725 730 735 Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His 740 745 750 Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp 755 760 765 Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser 770 775 780 Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800 Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815 Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro 820 825 830 Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp 835 840 845 Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu 850 855 860 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala 865 870 875 880 Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys 885 890 895 Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu 900 905 910 Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe 915 920 925 Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser 930 935 940 Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe 945 950 955 960 Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975 Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn 980 985 990 Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln 995 1000 1005 Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln 1010 1015 1020 Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1045 1050 1055 Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp 1060 1065 1070 Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr 1075 1080 1085 Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser 1090 1095 1100 Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn 1105 1110 1115 1120 Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1125 1130

Claims (8)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드; 및 라이코펜 중 하나 이상의 유용성분을 포함하는 난소 동결 보존용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 펩티드 및 라이코펜을 동시에 포함하는 난소 동결 보존용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 라이코펜은 토마토로부터 추출된 것인 난소 동결 보존용 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 LDH(Lactate Dehydrogenase)의 농도를 감소 시키는 난소 동결 보존용 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적 용도로 사용되는 조성물인 난소 동결 보존용 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을, 난소를 동결하는 배지 및 이를 해동하는 배지 중 하나 이상에 처리하는 단계를 포함하는 난소 동결 보존 방법.
7. 제6항에 있어서, 난소 동결 보존 방법은 배아 동결 보존 또는 난자 동결 보존을 포함하는 난소 동결 보존 방법.
   
8. 삭제

Images