KR101746158B1 - Composition for ameliorating atopic dermatitis comprising Gypsophila oldhamiana extract and use thereof - Google Patents
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Abstract
은시호 추출물을 유효 성분으로서 포함하는 아토피 피부염을 개선시키기 위한 조성물 및 그의 용도를 제공한다.A composition for improving atopic dermatitis comprising an alginate extract as an active ingredient, and a use thereof.
Description
은시호 추출물을 포함하는 아토피 피부염을 개선시키기 위한 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for improving atopic dermatitis, which contains a safflower extract, and a use thereof.
신체는 외부에서 이물질이 침입하면 이로부터 자신을 보호하기 위해 이물질을 제거하고 신체를 보호하기 위한 반응을 보이는데 이것을 면역반응이라고 한다. 이와 달리 과민반응은 우리 몸에 해롭지 않은 것에 대한 비정상적인 면역반응을 지칭하며 오히려 조직을 파괴하는 면역질환(immune disorder)의 일종이다. When the body enters from the outside, the body removes the foreign substance from the body and protects it from the body. It is called the immune reaction. In contrast, hypersensitivity refers to an abnormal immune response to something that is not harmful to our body, rather it is a kind of immune disorder that destroys the tissue.
면역질환은 면역계의 기능이상에 의해 발생하며, 자가면역질환, 면역결핍증, 알레르기 질환 등을 포함한다. 이중 알레르기 질환은 유전적, 환경적 요인 등이 복합적으로 작용하여 발생한다. 아토피라는 용어는 그리스어에서 파생된 단어로 20세기 초부터 사용되기 시작했으며, 외부로부터의 자극에 대하여 비정상적으로 반응하는 과민반응(hypersensitivity)을 일컫는 말이며, 알레르기와 같은 의미로 혼용되고 있다. Immune diseases are caused by dysfunction of the immune system, and include autoimmune diseases, immunodeficiency diseases, allergic diseases and the like. Double allergic diseases are caused by a combination of genetic and environmental factors. The term atopy is a term derived from Greek and has been in use since the beginning of the 20th century. It is a term referring to hypersensitivity that reacts abnormally to external stimuli. It is used in the same meaning as allergy.
아토피 질환은 아토피에 의해 임상적 증상으로 발현되는 경우를 의미한다. 여기에는 아토피 피부염, 천식, 알레르기 비염, 알레르기 결막염 등의 질환들이 모두 포함된다. '아토피 피부염'이라는 용어가 길어서 짧게 '아토피'라고 하지만 두 용어의 정의는 의학적으로 분명히 다르다. 아토피 질환은 상호작용하면서 동시에 또는 시간차를 두고 발현되는 경향을 보이기 때문에 '알레르기 행진'이라는 특성으로 설명하기도 한다. 알레르기 행진은 어린 영아가 성장하면서 아토피 피부염, 식품 알레르기, 천식 및 알레르기 비염의 순서로 알레르기 질환을 앓게 되는 현상을 말하며, 알레르기 유발원에 대한 감작의 진행과 관련이 있다. 국내 연구에 의하면, 유전적 요인에 의한 아토피 피부염 발생률은 부모 모두 아토피 질환이 있는 경우 41.7%, 부모 모두 알레르기 병력이 없을 경우 14.7%로 나타나 아토피 피부염 발생과 부모의 알레르기 질환력 사이의 연관성을 보여주고 있다. Atopic dermatitis is a clinical manifestation of atopy. These include atopic dermatitis, asthma, allergic rhinitis, and allergic conjunctivitis. The term 'atopic dermatitis' is short and is called 'atopy', but the definitions of the two terms are clearly different medically. Atopic dermatoses tend to be expressed at the same time or at the same time as they interact with each other, so they are described as 'allergy march'. Allergic streaks are the symptoms of atopic dermatitis, food allergies, asthma, and allergic rhinitis in the order of young infants, and are associated with progression of sensitization to allergens. According to domestic studies, the incidence of atopic dermatitis due to genetic factors was 41.7% in parents with atopic disease and 14.7% in parents without allergic disease, indicating a link between atopic dermatitis and parental allergic disease have.
아토피 피부염은 알레르기 행진이 일어나는 첫 번째 질환으로 인식되고 있고, 아토피성 질환이 발생할 것을 예측할 수 있는 지표로 이용되고 있다. 아토피 피부염 시기에 면역반응을 조절하지 않을 경우 알레르기 행진이 가속화되는 것으로 추정되므로 천식, 비염 등을 예방하기 위해서라도 아토피 피부염 조절이 필요하다. 아토피 피부염의 병인은 크게 피부장벽과 연관된 병인(outside-in model)과 비정상적인 면역반응과 연관된 병인(inside-out model)으로 나누고 있으며, 유전과 환경적인 요인에 대한 통합적인 고려가 필요하다. Atopic dermatitis is recognized as the first disease of allergy march and it is used as an index to predict the occurrence of atopic disease. If the immune response is not controlled during the period of atopic dermatitis, it is estimated that the allergic march accelerates, so atopic dermatitis control is necessary to prevent asthma and rhinitis. The pathogenesis of atopic dermatitis is largely divided into an outside-in model associated with skin barrier and an inside-out model associated with abnormal immune response, and an integrated consideration of genetic and environmental factors is required.
현재 사용 중인 아토피 질환 치료제는 알레르기 반응의 최종산물인 히스타민 분비를 억제하거나 알레르기 증상의 하나인 염증반응을 억제하는 효과를 가진 스테로이드제 및 항히스타민제에 치중되며, 일부 면역조절제와 광선치료법이 사용되고 있다. 기존 치료제의 경우 알레르기 증상 완화에 효과가 있으나 근본적인 치료방법이 아니며 장기적인 사용시 약물의 효능 감소 및 다양한 부작용 발생의 위험이 있다. 스테로이드제의 부작용은 비만, 당뇨, 고혈압, 우울증 등이 있으며, 항히스타민제의 부작용은 우울증, 집중력 장애, 무기력증, 졸림, 성기능 장애 등이 있으며, 면역억제제의 부작용은 국소자극, 고혈압, 신장독성 등이 있다. 이러한 점에서 스테로이드제, 항히스타민제, 면역억제제를 대체할 수 있는 혹은 기존 치료제의 사용을 낮출 수 있어 장기간 사용시 부작용이 적은 신개념 치료 소재의 개발 필요성이 대두되고 있다. At present, the therapeutic agent for atopic disease is focused on steroids and antihistamines which have the effect of inhibiting the secretion of histamine, which is the final product of allergic reaction, or suppressing the inflammatory reaction, which is one of the allergic symptoms, and some immunomodulators and phototherapy are used. Conventional medicines are effective in alleviating allergic symptoms, but they are not a fundamental treatment method, and there is a risk of reducing drug efficacy and various side effects in long-term use. Side effects of steroids include obesity, diabetes, hypertension, and depression. Side effects of antihistamines are depression, concentration problems, lethargy, drowsiness, sexual dysfunction, and side effects of immunosuppressive drugs include local irritation, hypertension, have. In this respect, it is necessary to develop a new concept treatment material which can substitute steroid, antihistamine, immunosuppressant, or use of existing therapeutic agent and thus has less side effects in long-term use.
아토피 피부염의 병인 중 유전적인 요소가 매우 중요한 역할을 하는데, T세포 과다 활성화를 유발하는 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-13(IL-13)은 Th2 세포에 의해 분비되며 면역글로불린E(IgE)의 합성을 조절하여 아토피 피부염의 시작에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.Interleukin-4 (IL-4), interleukin-5 (IL-5) and interleukin-13 (IL-13), which induce T cell hyperactivation, play an important role in the pathogenesis of atopic dermatitis. Th2 Is secreted by the cells and regulates the synthesis of immunoglobulin E (IgE), which is known to play an important role in the onset of atopic dermatitis.
Langerhans 세포와 염증성 수지상 상피 세포(inflammatory dendritic epidermal cell: IDEC)는 나이브(naive) T 세포를 Th2 타입으로 전환시킴으로 알러지성 면역반응의 시작에 매우 중요한 역할을 하며, 이 과정에서 IL-4가 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. Langerhans 세포 표면에 IgE 에 대한 수용체가 있으며, 음식물이나 공기 중 알레르겐(allergen), 미생물의 수퍼안티겐(superantigen)과 결합하여 염증성 시그널을 분비하게 하고 알러지성 면역반응을 일으킨다. Th2 시토킨 (IL-4, IL-5, IL-13)은 IgE를 생성하기 위한 이소타입 스위칭(isotype switching)을 매개하고 내피세포의 부착 분자(adhesion molecule)의 발현을 높여준다. Langerhans cells and inflammatory dendritic epidermal cells (IDECs) play an important role in the initiation of allergic immune responses by converting naive T cells to Th2 type, and IL-4 is very important in this process It is known to play a role. There is a receptor for IgE on the surface of Langerhans cells, which binds to food, air allergens, and superantigen of microorganisms to secrete inflammatory signals and trigger an allergic immune response. Th2 cytokines (IL-4, IL-5, and IL-13) mediate isotype switching to produce IgE and enhance the expression of adhesion molecules in endothelial cells.
피부에서 IL-4는 T세포 유형 중 특히 아토피 피부염의 특징적인 병리현상인 Th2 세포의 불균형적인 활성 증대를 유도한다는 사실이 밝혀져 있으며, 동시에 B세포를 자극하여 IgE 생산을 증대시킴으로써 비만세포에 의한 히스타민 분비를 촉진하여 홍반, 발적, 가려움증 등의 아토피 반응을 유발하는 핵심 시토킨이다. 그러므로 IL-4의 생산 및 이 반응의 최종 결과물인 T 세포의 과도한 증식을 동시에 억제할 수 있는 물질은 일반적인 면역억제 물질보다 아토피 피부염의 치료에 더욱 적합한 효능을 제공할 수 있을 것으로 기대한다. 피부에서 IL-4는 필라그린(filaggrin)이 자연보습인자(NMF)로 전환되는 과정에 필요한 단백분해효소인 카스파제-14(caspase-14)의 발현 또한 현저히 저하시키며, 데스모글라인 1(desmoglein 1) 등의 교소체 단백질을 분해하는 klk7 펩티다제의 발현을 촉진시켜 표피의 박리를 유도하고 경표피 수분 손실을 증가시킨다.It has been shown that IL-4 induces the disproportionate activity of Th2 cells, which is a characteristic pathology of atopic dermatitis, among T cell types in the skin. At the same time, it stimulates B cells to increase IgE production, It is a key cytokine that promotes the secretion and causes atopic reactions such as erythema, redness and itching. Therefore, it is expected that a substance capable of simultaneously inhibiting the production of IL-4 and the excessive proliferation of T cells, which is the final product of this reaction, may provide more efficacy for the treatment of atopic dermatitis than a general immunosuppressant. IL-4 in the skin also markedly reduces the expression of caspase-14, a proteolytic enzyme necessary for the conversion of filaggrin to natural moisturizing factor (NMF), and desmoglein 1) and promotes the expression of klk7 peptidase, which degrades the collagen protein, leading to the exfoliation of the epidermis and increasing the water loss of the epidermis.
무모 마우스에서 DNCB(2,4-dinitrochlorobenzen)와 아세톤을 이용하여 등 피부에 자극을 주면 자극된 국소 부위에 지연형 알러지 반응을 유도하게 되고 비정상적인 면역기능을 일으키고 피부장벽을 망가트릴 수 있다(Yoon et al., BMC Complementary and Alternative Medicine. (2015) 15:353). 이처럼 DNCB를 이용하여 아토피 피부염과 유사한 모델을 만들어 그 개체의 피부장벽기능과 면역기능에 관련된 인 비보 모델을 만들 수 있다. DNCB로 아토피 피부염을 유도한 마우스의 경표피 수분손실량(TEWL)과 pH는 증가하며 수화(hydration)는 감소하게 된다.In irritable mice, stimulation of dorsal skin using 2,4-dinitrochlorobenzen (DNCB) and acetone induces a delayed allergic reaction in the stimulated local area, causing abnormal immune function and damaging the skin barrier (Yoon et al. al., BMC Complementary and Alternative Medicine (2015) 15: 353). Thus, a model similar to atopic dermatitis can be created using DNCB to create an in vivo model related to skin barrier function and immune function of the individual. The mice with atopic dermatitis induced by DNCB had increased TEWL and pH and decreased hydration.
Balb/c 마우스에서 옥사졸론(4-ethoxymethylene-2-phenyloxazolone)과 아세톤을 마우스의 귀 부분에 도포하면 아토피와 비슷한 병변을 가지게 된다. 옥사졸론-아토피피부염 유도된 귀는 발적을 일으키면서 비정상적인 면역반응과 대조군과 비교하였을 때 귀 두께가 두꺼워진다. 이와 같은 옥사졸론 모델을 만들어 그 개체의 피부장벽기능과 면역기능에 관련된 인 비보 실험을 할 수 있다. In Balb / c mice, 4-ethoxymethylene-2-phenyloxazolone and acetone are applied to the ear of the mouse to have lesions similar to atopy. The oxazolone-atopic dermatitis-induced ear causes an abnormal immune reaction while causing redness and thickening of the ear when compared with the control group. This oxazolone model can be used to perform in vivo experiments related to the skin barrier function and immune function of the individual.
만약 DNCB와 옥사졸론 등으로 아토피 피부염과 같은 병변을 유도 한 후 피부장벽 기능이나, 귀 두께, 면역학적 기능을 정상작동 하게 하는 물질이 있다면 아토피 피부염에 대한 치료 또는 예방에 매우 바람직한 후보가 될 수 있을 것이다.If DNCB, oxazolone, and other substances that induce lesions such as atopic dermatitis and work normally on skin barrier function, ear thickness, and immunological function, then it may be a very desirable candidate for treatment or prevention of atopic dermatitis will be.
만약 조직에서 IL-4의 발현 저해를 유도하는 물질이 있다면, 이 물질은 카스파제-14의 발현을 저해하지 않으며, klk7 펩티다제의 발현을 촉진시키지 않아서 안으로는 면역조절 밖으로는 피부장벽손상방지로 아토피 피부염 치료 또는 예방에 매우 바람직한 후보가 될 수 있을 것이다. If there is a substance that induces the inhibition of IL-4 expression in tissues, this substance does not inhibit the expression of caspase-14 and does not promote the expression of klk7 peptidase, It may be a highly desirable candidate for the treatment or prevention of atopic dermatitis.
은시호는 학명이 Gypsophila oldhamiana Miq.로서 석죽과 (Caryophyllaceae)에 속하는 다년생 초본이며 식물명은 대나물로 불린다. 은시호는 원래 유럽에 나는 풀인데 귀화하여 우리나라 각지의 산기슭의 풀밭이나 바닷가 산지에서 자라는 다년생 초본이다. 줄기는 한군데 여러 대가 모여 높이 70~100cm 정도로 곧게 자라나 윗부분에서 가지가 갈라지며 저절로 비스듬히 휘어진다. 마주나게 달리는 잎은 잎자루가 없고 피침형으로 끝이 뾰족하며 3개의 엽맥이 뚜렷하다. 잎의 기부는 점점 좁아져 잎자루처럼 된다. 6~7월 흰색 또는 연홍색의 많은 꽃이 산방산 취산화서를 이룬다. 꽃잎은 5장이고 꽃받침은 끝이 5갈래로 갈라진다. 10개의 수술과 1개의 암술이 있다. 삭과는 익으면 끝이 4개로 갈라진다. 뿌리를 약용하며, 논문으로는 혈당억제 효능이 보고되어 있다. Is the scientific name Gypsophila oldhamiana Miq. is a perennial plant belonging to the Caryophyllaceae family. Is a perennial herb that grows in the grassy meadows and seashores of the mountains around Korea. The stem grows up to 70 ~ 100cm in height, but the branch is split at the upper part and bent at an angle. Leaves opposite each other have no petiole, lanceolate, pointed end, and three veins are distinct. The base of the leaves becomes narrower and becomes like a petiole. June to July Many of the flowers, white or pale red, form the acid bran. The petal is 5, and the calyx is divided into 5 branches at the end. There are 10 stamens and 1 pistil. Capsules are divided into 4 pieces when ripe. Root is medicinal, and the effect of inhibiting blood glucose has been reported.
그러나, 은시호 추출물이 IL-4의 발현을 저해시켜 아토피 피부염에 효능이 있다는 것에 대하여는 알려진 바 없다.However, it is not known that the extract of Shiho inhibits IL-4 expression and is effective for atopic dermatitis.
일 양상은 은시호 추출물, 또는 그의 분획물을 유효 성분으로서 포함하는 아토피 피부염 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 개선시키기 위한 조성물을 제공한다.An aspect of the present invention provides a composition for improving atopic dermatitis or a secondary disease caused therefrom, which comprises a citrus extract, or a fraction thereof as an active ingredient.
다른 양상은 은시호 추출물, 또는 그의 분획물을 유효 성분으로서 포함하는 IL-4의 발현을 저해시키기 위한 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a composition for inhibiting the expression of IL-4, which comprises an extract of Shiho, or a fraction thereof, as an active ingredient.
다른 양상은 마이크로웨이브 조사하에 은시호를 C1-C6의 알콜, 물, 또는 이들의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 은시호 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.Another aspect provides a method of preparing a silver nitrate extract comprising contacting a silver nitrate with a C1-C6 alcohol, water, or a mixture thereof under microwave irradiation.
다른 양상은 상기한 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 아토피 피부염을 개선시키는 방법을 제공한다.Another aspect provides a method of improving atopic dermatitis in an individual comprising administering the composition to a subject.
일 양상은 은시호(Gypsophila oldhamiana) 추출물, 또는 그의 분획물을 유효 성분으로서 포함하는 아토피 피부염 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 개선시키기 위한 조성물을 제공한다. An aspect of the present invention provides a composition for improving atopic dermatitis or a secondary disease caused therefrom, which comprises Gypsophila oldhamiana extract, or a fraction thereof, as an active ingredient.
다른 양상은 은시호 추출물, 또는 그의 분획물을 유효 성분으로서 포함하는 IL-4의 발현을 저해시키기 위한 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a composition for inhibiting the expression of IL-4, which comprises an extract of Shiho, or a fraction thereof, as an active ingredient.
상기 은시호 추출물은 세포에서 인터루킨-4의 발현을 억제시키기에 또는 아토피 피부염 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 개선시키기에 유효한 양으로 포함될 수 있다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 조성물 당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg일 수 있다. 상기 조성물은 인 비트로 또는 개체 중의 세포에서 IL-4의 발현을 억제시키기 위한 것일 수 있다. 개체 중의 세포는 예를 들면 IL-4 발현 증가에 의하여 아토피 피부염이 진행되고 있는 부위, 또는 IL-4의 침적에 의하여 피부염증이 과도하게 진행되어 아토피 피부염 증상을 보이는 부위에 위치하는 것일 수 있다. The silver sulfate extract may be included in an amount effective to inhibit the expression of interleukin-4 in the cell or to ameliorate atopic dermatitis or a second disease caused thereby. The effective amount may be appropriately selected depending on the cell or individual selected by a person skilled in the art. The effective amount is in the range of 0.1 mg to 1000 mg, such as 0.1 mg to 500 mg, 0.1 mg to 100 mg, 0.1 mg to 50 mg, 0.1 mg to 25 mg, 1 mg to 1000 mg, 1 mg to 500 mg, mg, 1 mg to 100 mg, 1 mg to 50 mg, 1 mg to 25 mg, 5 mg to 1000 mg, 5 mg to 500 mg, 5 mg to 100 mg, 5 mg to 50 mg, 5 mg to 25 mg, To 1000 mg, 10 mg to 500 mg, 10 mg to 100 mg, 10 mg to 50 mg, or 10 mg to 25 mg. The composition may be one for inhibiting the expression of IL-4 in cells in vitro or in an individual. Cells in an individual may be located at a site where atopic dermatitis is progressing, for example, by an increase in IL-4 expression, or in a region where skin inflammation is excessively advanced due to deposition of IL-4 and symptoms of atopic dermatitis are manifested.
상기 조성물은 면역세포의 과활성화를 억제시킴으로써 아토피 피부염을 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다. The composition may be one for preventing or treating atopic dermatitis by inhibiting hyperactivation of immune cells.
상기 조성물은 아토피 피부염을 유도하여 피부장벽기능이 약화된 마우스에서 피부장벽기능을 강화시켜 아토피 피부염을 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다.The composition may be one for preventing or treating atopic dermatitis by enhancing the skin barrier function in mice in which the skin barrier function is weakened by inducing atopic dermatitis.
상기 조성물은 아토피 피부염을 유도하여 비정상적인 피부 면역기능을 가진 마우스에서 그 기능을 회복시킴으로 써 아토피 피부염을 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다.The composition may be one for preventing or treating atopic dermatitis by inducing atopic dermatitis and restoring its function in a mouse having abnormal skin immune function.
상기 조성물은 개체의 아토피 피부염 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것인 방법을 제공하는 것이다. Wherein the composition is for preventing or treating atopic dermatitis of a subject or a secondary disease caused thereby.
상기 2차 질병은 장벽기능의 약화로 인한 피부감염증의 증가일 수 있다. The secondary disease may be an increase in skin infections due to a weakening of the barrier function.
상기 은시호 추출물은 은시호 뿌리, 잎, 꽃, 과실, 뿌리, 또는 그 조합으로부터 추출된 것일 수 있다. 상기 은시호 추출물은 건조 추출물일 수 있다.The silver leaf extract may be one derived from silver leaf root, leaf, flower, fruit, root, or a combination thereof. The silver sulfate extract may be a dry extract.
상기 은시호 추출물은 친수성 용매 (hydrophilic solvent) 예를 들면, 물, 알콜 또는 그 조합에 의하여 추출된 것일 수 있다. 상기 알콜은 C1 내지 C10의 하나이상의 -OH기를 갖는 화합물일 수 있다. 상기 알콜은 C1 내지 C4의 알콜일 수 있다. 상기 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 또는 그 조합인 것일 수 있다.The silver sulfate extract may be a hydrophilic solvent, for example, water, alcohol or a combination thereof. The alcohol may be a compound having at least one-OH group of C1 to C10. The alcohol may be a C1 to C4 alcohol. The alcohol may be methanol, ethanol, propanol, butanol, or a combination thereof.
상기 은시호 추출물은 조추출물, 분획물, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 조추출물은 상기 은시호를 추출 용매와 접촉시켜 얻어지는 것으로서 특정 성분을 포함하는 것으로 분리하지 않은 것을 말한다. 상기 분획물은 상기 조추물에 대하여 특정 성분을 포함하는 물질을 분리한 것을 말한다. 상기 분리는 유기 용매를 사용한 분리, 크로마토그래피 또는 여과일 수 있다. 상기 크로마토그래피는 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, HPLC, 또는 그 조합일 수 있다.The silver sulfate extract may be a crude extract, a fraction, or a combination thereof. The crude extract is obtained by bringing the above silver salt into contact with an extraction solvent, which does not contain a specific component and is not separated. Said fractions are those obtained by separating a substance containing a specific component from the above-mentioned congealed water. The separation can be carried out by separation using an organic solvent, chromatography or filtration. The chromatography may be ion exchange chromatography, affinity chromatography, size exclusion chromatography, HPLC, or a combination thereof.
상기 추출은 상기 은시호를 상기 추출 용매 중에 첨가하고 인큐베이션하는 것일 수 있다. 상기 은시호는 세절되거나 분쇄되어 미분화된 입자의 형태를 가질 수 있다. 상기 은시호는 건조되거나 세척된 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 실온 내지 환류 온도에서 교반 또는 교반 없이 수행되는 것일 수 있다. 인큐베이션 온도는 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 실온 내지 환류 온도, 30℃ 내지 환류 온도, 40℃ 내지 환류 온도, 50℃ 내지 환류 온도, 60℃ 내지 환류 온도, 또는 65℃ 내지 환류 온도일 수 있다. 상기 추출 시간은 추출 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 추출 시간은 2 내지 4시간, 예를 들면 2.5 내지 3.5 시간일 수 있다. 상기 추출 용매는 은시호의 5 내지 15배, 예를 들면, 5 내지 13배, 5 내지 11배, 8 내지 15배, 8 내지 13배, 8 내지 11배, 또는 9 내지 11배일 수 있다. 상기 추출은 1회 이상, 예를 들면 1 내지 5회, 1 내지 4회, 1 내지 3회, 2 내지 5회, 또는 2 내지 4회 추출되는 것일 수 있다. 얻어진 조추출물은 여과, 농축 및 건조될 수 있다. 상기 건조는 감압 건조될 수 있다.The extraction may be by adding the silver seeds to the extraction solvent and incubating. The silver halide can be in the form of finely divided particles which have been pulverized or pulverized. The silver seal may be dried or washed. The incubation may be performed at room temperature to reflux temperature without stirring or stirring. The incubation temperature may be appropriately selected depending on the solvent selected. For example, from room temperature to reflux temperature, from 30 ° C to reflux temperature, from 40 ° C to reflux temperature, from 50 ° C to reflux temperature, from 60 ° C to reflux temperature, or from 65 ° C to reflux temperature. The extraction time can be appropriately selected in accordance with the extraction condition. The extraction time may be 2 to 4 hours, for example 2.5 to 3.5 hours. The extraction solvent may be 5 to 15 times, for example, 5 to 13 times, 5 to 11 times, 8 to 15 times, 8 to 13 times, 8 to 11 times, or 9 to 11 times that of the silver salt. The extraction may be one or more times, for example, 1 to 5 times, 1 to 4 times, 1 to 3 times, 2 to 5 times, or 2 to 4 times. The crude extract obtained can be filtered, concentrated and dried. The drying may be reduced pressure drying.
상기 추출물은 마이크로웨이브 조사하에서 추출된 것일 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사는 실온, 10 내지 25℃, 10 내지 30℃, 10 내지 40℃, 10 내지 45℃, 10 내지 50℃, 10 내지 55℃, 10 내지 60℃, 10 내지 65℃, 또는 10 내지 70℃에서 수행되는 것일 수 있다. 마이크로웨이브 주파소는 1,000 내지 3,000Mhz, 1,500 내지 3,000Mhz, 2,000 내지 3,000Mhz, 또는 2,450 MHz 주파수일 수 있다. 출력은 100~300W, 100~250W, 또는 120~240W일 수 있다. 조사 시간은 10 내지 30분. 10 분 내지 1시간, 10 분 내지 2시간, 10 분 내지 3시간, 10 분 내지 4시간, 10 분 내지 5시간, 10 분 내지 6시간, 10 분 내지 9시간, 10 분 내지 12시간, 10 분 내지 24시간 동안 수행되는 것일 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사는 밀폐된 용기 중에서 수행되는 것일 수 있다.The extract may be extracted under microwave irradiation. The microwave irradiation may be performed at room temperature, 10 to 25 캜, 10 to 30 캜, 10 to 40 캜, 10 to 45 캜, 10 to 50 캜, 10 to 55 캜, 10 to 60 캜, Lt; RTI ID = 0.0 > 70 C. < / RTI > The microwave frequency may be 1,000 to 3,000 MHz, 1,500 to 3,000 MHz, 2,000 to 3,000 MHz, or 2,450 MHz. The output may be 100 to 300 W, 100 to 250 W, or 120 to 240 W. The irradiation time is 10 to 30 minutes. 10 minutes to 1 hour, 10 minutes to 2 hours, 10 minutes to 3 hours, 10 minutes to 4 hours, 10 minutes to 5 hours, 10 minutes to 6 hours, 10 minutes to 9 hours, 10 minutes to 12 hours, 10 minutes To < / RTI > 24 hours. The microwave irradiation may be performed in an airtight container.
상기 조 추출물은 유기 용매를 사용하여 더 추출될 수 있다. 상기 유기용매는 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄, 부탄올, 아세톤, 아세토니트릴 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 추출은 상기 조 추출물을 상기 유기 용매 중에 첨가하고 인큐베이션하는 것일 수 있다. 추출 조건은 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 인큐베이션은 실온 내지 환류 온도에서 교반 또는 교반 없이 수행되는 것일 수 있다. 인큐베이션 온도는 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 실온 내지 환류 온도, 30℃ 내지 환류 온도, 40℃ 내지 환류 온도, 50℃ 내지 환류 온도, 60℃ 내지 환류 온도, 또는 65℃ 내지 환류 온도일 수 있다. 상기 추출 시간은 추출 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 추출 시간은 2 내지 4시간, 예를 들면 2.5 내지 3.5 시간일 수 있다. 상기 추출 용매는 은시호의 5 내지 15배, 예를 들면, 5 내지 13배, 5 내지 11배, 8 내지 15배, 8 내지 13배, 8 내지 11배, 또는 9 내지 11배일 수 있다. 상기 추출은 1회 이상, 예를 들면 1 내지 5회, 1 내지 4회, 1 내지 3회, 2 내지 5회, 또는 2 내지 4회 추출되는 것일 수 있다. 얻어진 추출물은 여과, 농축 및 건조될 수 있다. 상기 건조는 감압 건조될 수 있다.The crude extract can be further extracted using an organic solvent. The organic solvent may be ethyl acetate, hexane, dichloromethane, butanol, acetone, acetonitrile or a combination thereof. The extraction may be by adding the crude extract to the organic solvent and incubating. The extraction conditions can be appropriately selected depending on the selected solvent. The incubation may be performed at room temperature to reflux temperature without stirring or stirring. The incubation temperature may be appropriately selected depending on the solvent selected. For example, from room temperature to reflux temperature, from 30 ° C to reflux temperature, from 40 ° C to reflux temperature, from 50 ° C to reflux temperature, from 60 ° C to reflux temperature, or from 65 ° C to reflux temperature. The extraction time can be appropriately selected in accordance with the extraction condition. The extraction time may be 2 to 4 hours, for example 2.5 to 3.5 hours. The extraction solvent may be 5 to 15 times, for example, 5 to 13 times, 5 to 11 times, 8 to 15 times, 8 to 13 times, 8 to 11 times, or 9 to 11 times that of the silver salt. The extraction may be one or more times, for example, 1 to 5 times, 1 to 4 times, 1 to 3 times, 2 to 5 times, or 2 to 4 times. The resulting extract can be filtered, concentrated and dried. The drying may be reduced pressure drying.
상기 추출은 조추출물, 또는 그 분획물을 HPLC하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 HPLC는 반분취 (semi-preparative) HPLC일 수 있다. The extraction may further comprise HPLC of the crude extract or its fractions. The HPLC may be a semi-preparative HPLC.
상기 조성물은 화장품학적으로, 약학적으로, 또는 식품적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 약학, 식품 또는 화장료 조성물일 수 있다.The composition may further comprise a cosmetically, pharmaceutically, or pharmaceutically acceptable excipient or carrier. The composition may be a pharmaceutical, food or cosmetic composition.
상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다.The composition may be formulated into oral or parenteral dosage forms. Oral administration formulations may be granules, powders, solutions, tablets, capsules, dry syrups, or combinations thereof. The oral dosage form may be an injection or an external preparation for skin. The external skin preparation may be a cream, a gel, an ointment, a skin emulsifier, a skin suspension, a transdermal patch, a drug-containing bandage, a lotion, or a combination thereof.
상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예컨대 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제등을 필요에 따라서 적절하게 배합할 수 있다.The external preparation for skin is a composition for external use for skin such as cosmetics or medicines such as an aqueous component, an oily component, a powder component, an alcohol, a moisturizer, a thickener, an ultraviolet absorbent, a whitening agent, an antiseptic, an antioxidant, a surfactant, , Various skin nutrients, and the like can be appropriately compounded as needed.
상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.The external preparation for skin may be a metal blocker such as sodium edetate, sodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate or gluconic acid, caffeine, tannin, bellapamil, licorice extract, glabridine, Vitamin C, ascorbic acid magnesium phosphate, ascorbic acid glucoside, arbutin, kojic acid, glucose, fructose, fructose, fructose and other herbal medicines, various herbal medicines, tocopherol acetate, glycyrrhizic acid, Sugars such as trehalose and the like can also be appropriately compounded.
상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.The composition may comprise a pharmaceutically acceptable diluent or carrier. The carrier may be an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, or a combination thereof. The excipient may be microcrystalline cellulose, lactose, low substituted hydroxy cellulose, or a combination thereof. The disintegrant may be sodium starch glycolate, calcium monohydrogen phosphate anhydrous, or a combination thereof. The binder may be polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropylcellulose, hydroxypropylcellulose, or combinations thereof. The lubricant may be magnesium stearate, silicon dioxide, talc, or a combination thereof.
상기 조성물은 아토피 피부염을 예방 또는 치료하기 위한 화장용 조성물일 수 있다. The composition may be a cosmetic composition for preventing or treating atopic dermatitis.
상기 조성물은 아토피 피부염을 예방 또는 치료하기 위한 식품용 조성물일 수 있다. The composition may be a food composition for preventing or treating atopic dermatitis.
다른 양상은 상기한 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 아토피 피부염을 개선시키는 방법을 제공한다.Another aspect provides a method of improving atopic dermatitis in an individual comprising administering the composition to a subject.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 상처가 존재하는 부위에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다.Administration can be by any method known in the art. Administration may be by any means directly administered to a subject, such as by intravenous, intramuscular, oral, transdermal, mucosal, intranasal, intratracheal or subcutaneous administration, . The administration can be systemically or locally administered. The administration may be topical administration to the site where the wound is present.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 아토피 피부염의 개선을 필요로 하는 개체일 수 있다.The subject may be a mammal, such as a person, a cow, a horse, a pig, a dog, a sheep, a goat, or a cat. The subject may be an individual in need of improvement of atopic dermatitis.
상기 투여는 은시호 추출물을 개체당 일당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다.Wherein the administration comprises administering to the subject in an amount of 0.1 mg to 1,000 mg, such as 0.1 mg to 500 mg, 0.1 mg to 100 mg, 0.1 mg to 50 mg, 0.1 mg to 25 mg, 1 mg to 1,000 mg, 1 mg to 500 mg, 1 mg to 100 mg, 1 mg to 50 mg, 1 mg to 25 mg, 5 mg to 1,000 mg, 5 mg to 500 mg, 5 mg to 100 mg, 5 mg to 50 mg, 25 mg, 10 mg to 1,000 mg, 10 mg to 500 mg, 10 mg to 100 mg, 10 mg to 50 mg, or 10 mg to 25 mg.
다른 양상은 마이크로웨이브 조사하에 은시호를 C1-C6의 알콜, 물, 또는 이들의 혼합물과 접촉시키는 단계;를 포함하는 은시호 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. Another aspect provides a method of making a silver chloride extract comprising contacting a silver halide with a C1-C6 alcohol, water, or a mixture thereof under microwave irradiation.
상기 마이크로웨이브 조사는 실온, 10 내지 25℃, 10 내지 30℃, 10 내지 40℃, 10 내지 45℃, 10 내지 50℃, 10 내지 55℃, 10 내지 60℃, 10 내지 65℃, 또는 10 내지 70℃에서 수행되는 것일 수 있다. 마이크로웨이브 주파소는 1,000 내지 3,000Mhz, 1,500 내지 3,000Mhz, 2,000 내지 3,000Mhz, 또는 2,450 MHz 주파수일 수 있다. 출력은 100~300W, 100~250W, 또는 120~240W일 수 있다. 조사 시간은 10 내지 30분. 10 분 내지 1시간, 10 분 내지 2시간, 10 분 내지 3시간, 10 분 내지 4시간, 10 분 내지 5시간, 10 분 내지 6시간, 10 분 내지 9시간, 10 분 내지 12시간, 10 분 내지 24시간 동안 수행되는 것일 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사는 밀폐된 용기 중에서 수행되는 것일 수 있다.The microwave irradiation may be performed at room temperature, 10 to 25 캜, 10 to 30 캜, 10 to 40 캜, 10 to 45 캜, 10 to 50 캜, 10 to 55 캜, 10 to 60 캜, Lt; RTI ID = 0.0 > 70 C. < / RTI > The microwave frequency may be 1,000 to 3,000 MHz, 1,500 to 3,000 MHz, 2,000 to 3,000 MHz, or 2,450 MHz. The output may be 100 to 300 W, 100 to 250 W, or 120 to 240 W. The irradiation time is 10 to 30 minutes. 10 minutes to 1 hour, 10 minutes to 2 hours, 10 minutes to 3 hours, 10 minutes to 4 hours, 10 minutes to 5 hours, 10 minutes to 6 hours, 10 minutes to 9 hours, 10 minutes to 12 hours, 10 minutes To < / RTI > 24 hours. The microwave irradiation may be performed in an airtight container.
일 양상에 따른 은시호 추출물, 또는 그의 분획물을 유효 성분으로서 포함하는 아토피 피부염 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 개선시키기 위한 조성물에 의하면, 아토피 피부염 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 개선시키는데 사용될 수 있다.According to one aspect, there is provided a composition for improving atopic dermatitis or a secondary disease caused therefrom, the composition comprising a citrus extract or a fraction thereof as an active ingredient, and the composition can be used for improving atopic dermatitis or a secondary disease caused therefrom.
다른 양상에 따른 은시호 추출물, 또는 그의 분획물을 유효 성분으로서 포함하는 IL-4의 발현을 저해시키기 위한 조성물에 의하면, IL-4의 발현을 저해시키는데 사용될 수 있다.4 can be used to inhibit the expression of IL-4, according to a composition for inhibiting the expression of IL-4, which comprises as an active ingredient a silver sulfate extract according to another aspect, or a fraction thereof.
다른 양상에 따른 마이크로웨이브 조사하에 은시호를 C1-C6의 알콜, 물, 또는 이들의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 은시호 추출물을 제조하는 방법에 의하면, 은시호 추출물을 효율적으로 제조할 수 있다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a silver chelate extract comprising the step of contacting a silver chelate with an alcohol, water or a mixture thereof with a C1-C6 alcohol under microwave irradiation, .
다른 양상에 따른 상기한 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 아토피 피부염을 개선시키는 방법에 의하면, 개체의 아토피 피부염을 효율적으로 개선시킬 수 있다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for improving atopic dermatitis in an individual comprising the step of administering the composition to a subject, wherein the atopic dermatitis of the individual can be efficiently improved.
도 1은 무모 마우스에서 은시호 추출물 처리 후 시간 경과에 따른 경표피 수분 손실량(TEWL)을 나타낸 것이다.
도 2는 무모 마우스에서 은시호 처리 후 시간 경과에 따른 수분 함유량(hydration)을 나타낸 것이다.
도 3은 무모 마우스에서 은시호 처리 후 시간 경과에 따른 피부 표현형의 비교 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 Balb/c 마우스에서 은시호 추출물 처리 후 시간 경과에 따른 귀 두께를 나타낸 것이다.
도 5는 Balb/c 마우스에서 은시호 추출물 처리 후 비히클 군과의 귀 표현형의 비교를 나타낸 것이다. FIG. 1 shows the amount of water-loss (TEWL) of light-skinned skin according to the elapsed time after treatment with a silver nitrate extract in a hairless mouse.
FIG. 2 shows the moisture content of the hairless mouse according to the elapsed time after the silver halide treatment.
FIG. 3 shows comparative photographs of skin phenotype according to time elapsed after treatment with silver nitrate in hairless mouse.
FIG. 4 shows the ear thickness according to time elapsed after treatment with silver nitrate extract in Balb / c mice.
Figure 5 shows a comparison of ear phenotype with the vehicle group after treatment with silver chelate extract in Balb / c mice.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1: One: 은시호The 추출물의 제조 및 그 효과의 확인 Preparation of extract and identification of its effect
본 실시예에서는 은시호로부터 추출물을 제조하고, 그 추출물이 아토피 피부염 개선에 미치는 효과를 확인하였다.In this example, extracts were prepared from the citron, and the effect of the extracts on the improvement of atopic dermatitis was confirmed.
1. 은시호 추출물 및 그의 1. Isothiazole extract and his 분획물의Fraction 제조 Produce
(1) 은시호 추출물의 제조(1) is the preparation of Seiho extract
본 실시예에서 사용된 은시호는 대나물의 뿌리를 사용하는 것으로 대한미국 충남 공주시 삼홍건재약업사에서 구입하여 사용하였다. The silvery seeds used in this example were purchased from the company Samphong Construction Chemicals, Gongju, Chungnam, USA.
은시호 즉 대나물 뿌리 1.2kg을 전정가위를 이용하여 1~2 cm의 크기로 세절 한 후 BANDELIN electronic GmbH & Co. KG에서 제조한 초음파 기기인 BANDELIN SONOREX Ultrasonic baths의 조(bath)에 담긴 물 12.0 L에 담그고 실온에서 3 시간 동안 초음파를 조사하였다. 이때 반응조는 두껑을 닫아 밀봉한 상태로 두었으며 초음파는 약 100W(주파수 2455 MHz)로 조사하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하여 농축하여 농축물 34.7 g(이하 '은시호-물 추출물'이라 한다)을 얻었다.(1.2 kg) was cut into 1 ~ 2 cm size using vestibular scissors, and then BANDELIN electronic GmbH & The ultrasonic wave was irradiated for 3 hours at room temperature by immersing in 12.0 L of water contained in a bath of BANDELIN SONOREX Ultrasonic baths manufactured by KG. At this time, the reaction vessel was closed with the lid closed, and ultrasonic waves were irradiated at about 100 W (frequency: 2455 MHz). The extract obtained by repeating this three times was dried under reduced pressure and concentrated to obtain 34.7 g of a concentrate (hereinafter referred to as "Seiho-water extract").
또한, 상기 은시호-물 추출물의 추출과정에서 물 12.0L를 100% 메탄올 12.0L를 사용한 것을 제외하고 동일한 과정에 의하여 은시호-메탄올 추출물 151.2g을 얻었다.In addition, 151.2 g of silver citrate-methanol extract was obtained by the same procedure except that 12.0 L of water and 12.0 L of 100% methanol were used in the extraction of the silver sulfate-water extract.
또한, 상기 은시호-물 추출물의 추출과정에서 물 12.0L를 100% 에탄올 12.0L를 사용한 것을 제외하고 동일한 과정에 의하여 은시호-에탄올 추출물 34.7g을 얻었다.In addition, 34.7 g of silver chelate-ethanol extract was obtained by the same procedure except that 12.0 L of water and 12.0 L of 100% ethanol were used in the extraction of the silver sulfate-water extract.
(2) (2) 은시호The 추출물의 Extract 분획물의Fraction 제조 Produce
(1)절에서 제조한 은시호-에탄올 추출물 34.7 g을 500mL의 증류수에 현탁시키고 계통학적 분획방법에 따라 동량의 헥산, 메틸렌클로리드, 에틸아세테이트(EtOAc) 및 부탄올(n-BuOH)로 각각 3회씩 추출하여 분획한 후 감압농축하여 헥산층 1.98g, 메틸렌클로리드층 0.77g, EtOAc층 0.45g, 및 부탄올층 4.93g을 획득하여 각각 헥산 분획, MC 분획, EA 분획 및 Bu 분획으로 하였다. (34.7 g) of the silver chelate-ethanol extract prepared in (1) above was suspended in 500 mL of distilled water and treated with the same amount of hexane, methylene chloride, ethyl acetate (EtOAc) and butanol ( n- BuOH) The fractions were fractionated and concentrated under reduced pressure to obtain 1.98 g of a hexane layer, 0.77 g of a methylene chloride layer, 0.45 g of an EtOAc layer and 4.93 g of a butanol layer to obtain hexane fraction, MC fraction, EA fraction and Bu fraction, respectively.
2. 2. 은시호The 추출물 및 그 Extract and its 분획물이The fraction IL-4 발현에 미치는 영향 Effect on IL-4 Expression
본 실험에 사용한 랫트 호염기성 백혈병 세포(rat basophilic leukemia cell)인 RBL-2H3 세포는 한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank; Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. The rat basophilic leukemia cells (RBL-2H3 cells) used in this experiment were purchased from Korea Cell Line Bank (Seoul, Korea).
RBL-2H3 세포를 웰당 5x105개 농도로 6공 평판 배양기 (6-well plate)의 각 웰에 접종하여 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum: FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DMEM (Dulecco' Modified Eagle Medium) 배지 중에서 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하고, 16시간 후에 1μM의 시클로스포린(cyclosporine) A와 시료를 10μg/ml의 농도로 첨가하고 1 시간 동안 배양하여 전처리하였다. 시료는 (1)에서 제조된 은시호 추출물 또는 그의 분획물이다. 다음으로, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate: PMA) 50 ng/ml와 이오노미신(ionomycin) 1μM을 첨가하고 동일한 조건에서 9시간 동안 배양하였다. PMA와 이오노미신은 인터페론, 페르포린, IL-2, 및 IL-4와 같은 시토킨의 세포내 생산을 자극하기 위하여 사용된다.RBL-2H3 cells were inoculated into each well of a 6-well plate at a concentration of 5 × 10 5 cells / well and cultured in DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin / streptomycin (Dulecco 'Modified Eagle Medium) medium at 37 ° C and 5% CO 2. After 16 hours, 1 μM cyclosporine A and a sample were added at a concentration of 10 μg / ml and cultured for 1 hour Pretreatment. The sample is a silver chelate extract prepared in (1) or a fraction thereof. Next, 50 ng / ml of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and 1 μM of ionomycin were added and incubated for 9 hours under the same conditions. PMA and ionomycin are used to stimulate intracellular production of cytokines such as interferon, perforin, IL-2, and IL-4.
세포는 RNeasy mini kit (Qiagen)을 사용하여 QIAsymphony 또는 QIAQube (Qiagen) 기기에 장착하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, SantaClara, CA, USA)를 사용하여 견고성(integrity)을 확인하였다. cDNA는 ImProm-II Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 1㎍의 RNA를 cDNA로 합성하였다. PCR은 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. Cells were harvested from the QIAsymphony or QIAQube (Qiagen) instrument using RNeasy mini kit (Qiagen) to extract RNA. The extracted RNA was checked for integrity using an Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif., USA). cDNA was synthesized from cDNA of 1 의 of RNA using ImProm-II Reverse Transcription System (Promega, Madison, Wis., USA). PCR was performed using GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA).
PCR 반응은 0.02 ㎕ Ex taq polymerase (TAKARA, Otsu, Shiga, Japan), 2 ㎕ Ex taq polymerase buffer, 1.6 ㎕ dNTP (10 mM), 2 ㎕ 포워드 프라이머 (20uM), 2 ㎕ 리버스 프라이머 (20 uM), 11.38 ㎕ nuclease free water와 1㎕의 합성한 first-strand cDNA를 잘 섞어 총 20 ㎕ 용량의 반응 혼합물에 대하여 PCR을 수행하였다. The PCR reaction was carried out in the same manner as in Example 1 except that 0.02 μl Ex taq polymerase (TAKARA, Otsu, Shiga, Japan), 2 μl Ex taq polymerase buffer, 1.6 μl dNTP (10 mM), 2 μl forward primer (20 μM), 2 μl reverse primer 11.38 μl of nuclease free water and 1 μl of the synthesized first-strand cDNA were mixed well to perform PCR on the reaction mixture having a total volume of 20 μl.
IL-4의 PCR 조건은 94℃에서 4분 (1 cycle), 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초 (25 cycles), 72℃에서 5분 (1 cycle)이었고, 베타-액틴 조건은 94℃에서 4분 (1 cycle), 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초 (20 cycles), 72℃에서 5분 (1 cycle) 이었다. RT-PCR 결과는 QIAxcel advanced (Qiagen)기기를 사용하여 밴드의 강도를 측정하였다. 효능에 대한 분석은 [PMA + 이오노미신(ionomycin)](PI) 처리군의 비율을 100으로 하여 이와 비교하여 결정하였다. RT-PCR에 사용된 프라이머는 표 1에 나타낸 바와 같다.The PCR conditions for IL-4 were 94 ° C for 1 minute, 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds (25 cycles) and 72 ° C for 5 minutes (1 cycle) Beta-actin conditions were 94 ° C for 4 minutes, 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 cycles (20 cycles) and 72 ° C for 5 minutes (1 cycle). RT-PCR results were measured using QIAxcel advanced (Qiagen) instruments. The efficacy was determined by comparing the ratio of [PMA + ionomycin] (PI) treated group to 100. The primers used for RT-PCR are shown in Table 1.
표 2는 은시호 추출물 및 분획이 IL-4 발현에 미치는 영향을 PI 처리군을 100으로 하여 그에 대한 비율로 IL-4가 저해되는 정도를 나타낸 것이다. Table 2 shows the degree of inhibition of IL-4 by the ratio of IL-4 to IL-4 treated group with PI treatment group.
표 2에서, CsAs는 시클로스포린 A를 나타낸다. In Table 2, CsAs represent cyclosporin A.
표 2에 나타낸 바와 같이, 은시호 추출물 및 분획은 RBL-2H3 세포에서 IL-4의 발현을 저해시켰다. 이는 은시호 추출물 및 분획이 아토피 피부염의 증상을 완화시키는데 도움이 될 수 있다는 것을 나타낸다. As shown in Table 2, the silver chelate extract and fraction inhibited the expression of IL-4 in RBL-2H3 cells. This indicates that the citrus extract and fraction can help alleviate the symptoms of atopic dermatitis.
3. 3. 은시호The 에탄올 추출물이 Ethanol extract DNCBDNCB 에 의하여 아토피 피부염 유도된 무모 Induced atopic dermatitis 마우Maou 스(hairless mouse)에서 피부 장벽기능에 미치는 영향Effect of hairless mouse on skin barrier function
6 주령(암컷, 23-27g) 무모 마우스(hairless mouse, 오리엔트바이오에서 구입)를 3개의 군으로 분리하였다: 무처리군(n=2), 2,4-디니트로클로로벤젠(2,4-dinitrochlorobenzene: DNCB) 유도 후 비히클 처리군(n=4), DNCB 유도 후 은시호 추출물 처리군(n=4). DNCB는 물중 99% 아세톤과 올리브 오일을 부피 기준으로 3:1로 섞은 용액을 용매로 사용하였다. 비히클은 프로필렌 글리콜과 에탄올을 부피 기준으로 7:3으로 섞은 것을 사용하였다. 군 분리 후 7일 동안 1일 1회 1(v/v/)% DNCB 용액을 마우스 등에 200㎕ 씩 도포하였다. 마지막 도포 후 일주일 간 처리하지 않고 일주일 후 2일 간격으로 총 7번 0.1(v/v)% DNCB 용액을 위와 같은 방법으로 도포하였다. 0.1(v/v)% DNCB 용액을 도포하며 14일 동안 비히클을 용매로 한 은시호 추출물 1(v/v)% 용액과 비히클을 오전 및 오후로 나누어 1일 2회로 마우스 등에 200㎕ 씩 각각 도포하였다. Hairless mice (purchased from Orient Bio) at 6 weeks of age (female, 23-27g) were separated into three groups: untreated group (n = 2), 2,4- dinitrochlorobenzene (n = 4) after induction of DNCB, and after treatment (n = 4) after DNCB induction. DNCB was prepared by mixing 3: 1 by volume of 99% acetone in water with olive oil as a solvent. The vehicle was a mixture of propylene glycol and ethanol in a volume ratio of 7: 3. One (v / v /)% DNCB solution was applied to mice and the like 200 μl once a day for 7 days after group separation. A total of 7 times 0.1 (v / v)% DNCB solution was applied at intervals of 2 days after one week without treatment for one week after the last application in the same manner as above. 0.1 (v / v)% DNCB solution applied to the vehicle, and one in the solvent for 14 days is Bupleurum extract 1 (v / v)% solution, and the vehicle is divided into AM and PM respectively, by coating or the like 200㎕ 1 day 2 circuit mouse Respectively.
시료가 도포된 마우스 피부에 대하여, 경피수분손실량 (TEWL, Trans Epidermal Water Loss)은 AquaFlux (Biox, London, UK)를 이용해서 측정하였고, 피부 수분 함유량(hydration)과 pH는 Skin-O-Mat (COSMOMEP, Berlin, Germany)를 이용하여 측정하였다. 처음 DNCB에 의하여 아토피 피부염을 유도하기 전, 유도 후 7일 후, 14일 후 및 21일 후 측정하였다.The skin moisture content (TEWL, Trans Epidermal Water Loss) was measured using aquaflux (Biox, London, UK) and the skin hydration and pH were measured using Skin-O-Mat COSMOMEP, Berlin, Germany). First, DNCB was measured 7 days, 14 days and 21 days after induction of atopic dermatitis.
도 1은 무모 마우스에서 은시호 추출물 처리 후 시간 경과에 따른 경표피 수분 손실량(TEWL)을 나타낸 것이다. FIG. 1 shows the amount of water-loss (TEWL) of light-skinned skin according to the elapsed time after treatment with a silver nitrate extract in a hairless mouse.
도 1에 나타낸 바와 같이, 은시호 추출물은 무모 마우스에서 대조군인 비히클에 비해 경표피 수분손실량이 무처리군과 비슷한 정도로 낮아진 것을 확인할 수있다. 이 결과로 은시호 추출물은 무모 마우스에서 비히클에 비해 확연하게 피부장벽 기능이 강화된 것을 확인할 수 있다. 도 1에서 가로축은 경표피 수분손실량을 나타낸다.As shown in FIG. 1, it can be seen that the amount of water-loss of the hard-skin layer was lowered to a level similar to that of the untreated group in the untreated mice compared to the vehicle in the control group. As a result, it was confirmed that the extract of Shiho had a stronger skin barrier function than that of the vehicle in the uninhabited mouse. In Fig. 1, the abscissa represents the amount of water-loss of the transdermal skin.
도 2는 무모 마우스에서 은시호 처리 후 시간 경과에 따른 수분 함유량(hydration)을 나타낸 것이다. FIG. 2 shows the moisture content of the hairless mouse according to the elapsed time after the silver halide treatment.
도 2에 나타낸 바와 같이, 은시호 추출물은 무모 마우스에서 대조군인 비히클에 비해 수분 함유량이 높아진 것을 확인할 수 있다. 이 결과는 은시호 추출물은 무모 마우스에서 비히클에 비해 더 피부장벽 기능을 강화시킨다는 것을 나타낸다.As shown in Fig. 2, it can be seen that the water-soluble extract of the green tea extract has a higher water content than that of the control vehicle in the hairless mouse. This result indicates that the Nisshinbo extract enhances skin barrier function more in the hairless mouse than the vehicle.
표 3은 무모 마우스에서 은시호 처리 후 시간 경과에 따른 피부 표면 pH를 나타낸 것이다. Table 3 shows the skin surface pH over time after treatment with silver nitrate in hairless mice.
표 4에 나타낸 바와 같이, 은시호 추출물은 무모 마우스에서 대조군인 비히클에 비해 pH 값이 낮아졌다. 피부 장벽이 무너지면 pH 값은 상승하게 된다. 이 결과는 은시호 추출물은 무모 마우스에서 비히클에 비해 피부장벽 기능을 강화시킨다는 것을 나타낸다.As shown in Table 4, the silver chelate extract had a lower pH value in the hairless mouse than the control vehicle. When the skin barrier collapses, the pH value increases. These results indicate that the NK extract enhances skin barrier function in mice compared to vehicle in reared mice.
도 3은 무모 마우스에서 은시호 처리 후 시간 경과에 따른 피부 표현형의 비교 사진을 나타낸 것이다. FIG. 3 shows comparative photographs of skin phenotype according to time elapsed after treatment with silver nitrate in hairless mouse.
도 3에 나타낸 바와 같이, 은시호 추출물은 무모 마우스에서 DNCB-아토피 피부염 유도 후 7 일째부터 대조군인 비히클 군보다 피부 상태를 좋게 하였다. DNCB-아토피 피부염을 유도하면 각질이 심하게 일어나며 피부가 각화되는 것을 볼 수 있다. 반면, 1% 은시호 추출물을 처리했을 때 피부의 각화와 각질의 양이 감소하였다. 이 결과는 은시호 추출물은 무모 마우스에서 비히클에 비해 피부장벽 기능이 확연하게 강화시킨다는 것을 나타낸다. As shown in Fig. 3, the extract of Echinochloa crus-galli showed better skin condition than the control group as a control group from day 7 after induction of DNCB-atopic dermatitis in hairless mice. When DNCB-atopic dermatitis is induced, it can be seen that the keratin is severely affected and the skin is keratinized. On the other hand, 1% of keratocyte extracts showed decreased keratinization and keratinization. This result indicates that the extract of Shi Hui significantly strengthens the skin barrier function in the hairless mouse compared to the vehicle.
4. 은시호 에탄올 추출물이 4- 에톡시메틸렌 -2- 페닐옥사졸론(이하 '옥사졸론'이라 한다)에 의하여 아토피 피부염이 유도된 Balb /c mouse에서 비정상적인 면역학적 기능에 미치는 영향 4. The effect of ethanol extract on the abnormal immunological function of Balb / c mouse induced by atopic dermatitis by 4 -ethoxymethylene -2 -phenyloxazolone (hereinafter referred to as 'oxazolone' )
6 주령(암컷, 17-20g) 무모 마우스(hairless mouse, 오리엔트 바이오에서 구입)를 3개의 군으로 분리하였다: 무처리군(n=2), 옥사졸론-아토피 피부염 유도 후 비히클 처리군(n=4), 옥사졸론-아토피 피부염 유도 후 은시호 추출물 처리군(n=4). 옥사졸론은 물 중 99% 아세톤을 용매로 사용하였다. 비히클은 프로필렌 글리콜과 에탄올을 부피 기준으로 7:3으로 섞은 것을 사용하였다. At 6 weeks of age (female, 17-20 g) hairless mice (purchased from Orient Bio) were divided into three groups: untreated (n = 2), vehicle treated with oxazolone- 4), oxazolone-induced atopic dermatitis after induction with nematode extract (n = 4). Oxazolone used 99% acetone in water as a solvent. The vehicle was a mixture of propylene glycol and ethanol in a volume ratio of 7: 3.
군 분리 후 첫 날 1(v/v)% 옥사졸론 용액을 마우스 양쪽 귀에 20㎕ 씩 한번 도포하였다. 일주일 후 2일 간격으로 총 11번 0.1% 옥사졸론 용액을 위와 같은 방법으로 도포하였다. 0.1% 옥사졸론 용액을 도포하며 23일 동안 비히클을 용매로 한 은시호 추출물 1(v/v)% 용액과 비히클을 오전 및 오후로 나누어 마우스 양쪽 귀에 20㎕ 씩 각각 도포하였다. 귀 두께는 옥사졸론-아토피 피부염 유도 전부터 30일 동안 매일 측정하였다. 귀 두께는 미투투요 사 디지매틱캘리퍼스를 사용하여 2번 측정후 평균값으로 계산하였다.On the first day after group separation, 1 (v / v)% oxazolone solution was applied to both ears at a rate of 20 μl once. A total of 11 times 0.1% oxazolone solution was applied in the same manner as above every two days after one week. A 1% (v / v)% solution of a green tea extract with a vehicle as a solvent for a period of 23 days with a 0.1% oxazolone solution applied and the vehicle were divided into morning and afternoon and applied to each ear by 20 占 퐇. Ear thickness was measured daily for 30 days prior to the induction of oxazolone-atopic dermatitis. Ear thickness was calculated as mean after two measurements using Mitutoyo Digimatic Caliper.
도 4는 Balb/c 마우스에서 은시호 추출물 처리 후 시간 경과에 따른 귀 두께를 나타낸 것이다. 도 4에서, 가로축은 옥사졸론-아토피 피부염 유도일로부터 경과일을 나타내고, 세로축은 귀 두께(mm)를 나타낸다.FIG. 4 shows the ear thickness according to time elapsed after treatment with silver nitrate extract in Balb / c mice. 4, the abscissa represents the elapsed days from the oxazolone-atopic dermatitis induction date, and the ordinate represents the ear thickness (mm).
도 4에 나타낸 바와 같이, 은시호 추출물은 Balb/c 마우스에서 대조군인 비히클에 비해 귀 두께를 얇게 하였다. 옥사졸론을 마우스의 귀에 바를 경우 비정상적인 면역반응에 의해 귀두께는 두꺼워지고 각질이 일어나게 된다. 이 결과는 은시호 추출물이 Balb/c 마우스에서 비히클에 비해 피부 장벽 기능을 강화시킨다는 것을 나타낸다. As shown in Fig. 4, the green tea extract reduced the ear thickness in Balb / c mice as compared to the control vehicle. When oxazolone is applied to the ear of a mouse, the abnormal immune response causes thickening of the glans and keratinization. These results indicate that the Citrus extract enhances skin barrier function in Balb / c mice as compared to vehicle.
도 5는 Balb/c 마우스에서 은시호 추출물 처리 후 비히클 군과의 귀 표현형의 비교를 나타낸 것이다. Figure 5 shows a comparison of ear phenotype with the vehicle group after treatment with silver chelate extract in Balb / c mice.
도 5에 나타낸 바와 같이, 은시호 추출물은 Balb/c 마우스에서 대조군인 비히클에 비해 홍반 현상을 감소시키고 각질을 감소 또는 제거시켰다. As shown in Fig. 5, the green tea extract reduced erythema and reduced or eliminated exfoliation in Balb / c mice as compared to the control vehicle.
5. 5. 은시호The 에탄올 추출물의 경구투여 급성 독성실험 Acute Toxicity Test of Oral Administration of Ethanol Extract
본 발명자들은 은시호 추출물의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. The present inventors conducted the following experiments in order to examine the acute toxicity of the green tea extract.
6 주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성 독성실험을 실시하였다. 은시호 추출물을 물줄 0.5(v/m) 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 5 g/kg/15 ㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 실험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상 증상, 체중 변화를 관찰하여 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강 장기의 이상 여부를 관찰하였다.Acute toxicity tests were carried out using 6-week-old SPF SD rats. Was suspended in a 0.5% (v / m) methylcellulose solution of water and administered once orally at a dose of 5 g / kg / 15 ml. Hematologic tests and blood biochemical tests were performed by observing the mortality, clinical symptoms, and weight changes of the animals after the administration of the test materials. The autopsy was performed to visually examine the abdominal organs and thoracic organs.
실험 결과, 실험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학검사, 부검소견 등에서도 독성 변화는 관찰되지 않았다.As a result of the experiment, there were no clinically symptomatic or dead animals in all animals treated with the test substance, and no toxic change was observed in weight change, blood test, blood biochemical test, and autopsy findings.
그 결과, 은시호-에탄올 추출물은 랫트에서 5 g/kg까지 독성 변화를 나타내지 않으며, 경구 투여 최소 치사량 (LD50)은 5 g/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.As a result, the BFL-ethanol extract does not represent a 5 g / kg toxic change in rats up to the minimum oral lethal dose (LD 50) was found to be a safe substance less than 5 g / kg.
<110> Korea Institute of Science and Technology
<120> Composition for ameliorating atopic dermatitis comprising
Gypsophila oldhamiana extract and use thereof
<130> PN114841KR
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for IL-4
<400> 1
ccaccttgct gtcaccctgt tctgct 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for IL-4
<400> 2
gtgttgtgag cgtggactca ttcacg 26
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for beta-actin
<400> 3
accgtgaaaa gatgacccag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
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<223> Reverse primer for beta-actin
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tgtcagctgt ggtggtgaag 20
<110> Korea Institute of Science and Technology
<120> Composition for ameliorating atopic dermatitis comprising
Gypsophila oldhamiana extract and use thereof
<130> PN114841EN
<160> 4
<170> Kopatentin 2.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for IL-4
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<223> Reverse primer for beta-actin
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|---|---|---|---|
| KR1020160086407A KR101746158B1 (en) | 2016-07-07 | 2016-07-07 | Composition for ameliorating atopic dermatitis comprising Gypsophila oldhamiana extract and use thereof |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| KR1020160086407A KR101746158B1 (en) | 2016-07-07 | 2016-07-07 | Composition for ameliorating atopic dermatitis comprising Gypsophila oldhamiana extract and use thereof |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019103571A1 (en) * | 2017-11-27 | 2019-05-31 | 한국과학기술연구원 | Composition for treating dermatitis, containing extract and fraction of aerial parts of gypsophila oldhamiana miq, and use thereof |
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2016
- 2016-07-07 KR KR1020160086407A patent/KR101746158B1/en active IP Right Grant
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019103571A1 (en) * | 2017-11-27 | 2019-05-31 | 한국과학기술연구원 | Composition for treating dermatitis, containing extract and fraction of aerial parts of gypsophila oldhamiana miq, and use thereof |
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