JPS5861752A - 悪性物質の吸着材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血液、血漿、その他の体液より、抗ＤＮＡ抗
体、抗ＥＮＡ抗体、抗核抗体などの自己抗体および免疫
複合体を除去する吸着材と、それを用いた吸着装置に関
する。さらに詳しくは、全身性紅斑性ループス（システ
ミック・ループス・エリテマトーデス；以下ＳＬＥと略
記する）をはじめとする膠原病患者の体液中に存在する
これらの自己抗体、免疫複合体を特異的に吸着除去する
ことにより、体液を浄化再生し、疾患の進行を防止する
と共に、症状を軽減せしめ、さらに治癒を早める簡便な
吸着材および吸着装置を提供することを目的とする。

ＳＬＥは若年者とくに若い女性に多く、全身臓器なかで
も血管系、結合織がおかされるという難治性疾患であり
、自己免疫病変群の代表的疾患である。その病因につい
ては不明であったが、近年、ＳＬＥ患者血液中の抗核抗
体等の存在が、各種の症状の発生に重要な関連性がある
と考えられ、また、血管炎や腎病変の病因としては、抗
原−抗体免疫複合体が組織に沈着するというメカニズム
が重視されてきている。最近、患者血漿中の抗原、抗体
、免疫複合体といった悪性物質を除去する上から、患者
血漿と他の新鮮凍結血漿ないしは、アルプミ□ン製剤と
入れ換える血漿交換療法が施行され、か　２− なりの進行防止、症状軽減あるいは治癒効果が確認され
るようになってきた。

しかしながら、この血漿交換療法には、（１）除去した
血漿を補充するための新鮮凍結血漿ないしは血漿成分の
大量かつ持続的な入手が困難なこと、（２１他人の血漿
を利用するため、肝炎ウィルス等の感染の危険が高いと
いった欠点があり、一般に普及できるものではない。

壕だ、患者血漿中の悪性物質の除去には、限外濾過膜を
用いる方法があり、血漿成分の補給を要しないという長
所を有しながらも、（１）分子量により、きれいに分離
することができないこと、（２）除去に分子鎖以外の選
択性がないため、血漿中の有用な物質も除去してしまう
こと、（３１膜の目づまりによるヂ過速度の低下、カッ
トオフ分子量の変動力どの問題点を有している。

さらに、担体にＤＮＡ、合成核酸ポリマー等の生体（類
似）高分子を固定し、自己抗体を除去する方法も提案さ
れている。しかし、この方法は、（１）固定化物質が高
価であること、（２）抗原である固定化物質の遊離が起
こり、患者体内−の流入の恐れがあることから、実用上
、治癒に用いるには難点がある。

本発明者らは、これらの間鯨を克服すべく、簡便かつ安
全で、患者血漿中から悪性物質のみを特異的に除去する
ための吸着材を鋭意研究した。その結果、従来、生体（
類似）高分子において吸着能を有するものが知られてい
たのに対し、驚くべきことに、核酸塩基を構成する低分
子物質においても、高分子と同等以上の吸着能を有する
ことを見い出し、先に特許出願した。

本発明者らは、さらに詳細に研究した結果、驚くべきこ
とには、糖リン酸を構成要素として含む低分子量の物質
においても、高分子量と同等以上の吸着能を有すること
を見い出し、本発明を完成するに至った。

これにより、固定化物質の脱離流出の不安は解消され、
実際の臨床応用上の困難を打破することができた。すな
わち、本発明は、糖リン酸を構成焚素として含む低分子
量の物質ないしはその誘導体の少なくとも１種が不溶性
担体に結合している抗ネイティブＤＮＡ抗体（抗ｎ−Ｄ
ＮＡ抗体）、抗ダブルストランドＤＮＡ抗体（抗ｄｓ　
−Ｄ　ＮＡ抗体）、抗核抗体等の自己抗体および免疫複
合体の吸着拐、およびこの吸着材の少なくとも１種を、
流体の導出入口を有する容器内に収容せしめてなること
を特徴とする該自己抗体と免疫複合体の吸着装置である
。

本発明の吸着材の除去対象とする疾患は、抗ｎ−ＤＮＡ
抗体、抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体、抗核抗体およびその免疫複
合体の出現するものであれば、いずれにも適用できる。

具体的には、ＳＬＥ、混合性結合繊病（ＭＣＴＤ　）　
、進行性全身性硬化症、シエーグレン症候群、皮膚筋炎
（多発性筋炎）、ケイ肺症、慢性関節リウマチ、橋本病
、慢性肝炎、糖尿病、気管支拡張症などがある。

抗原−抗体反応を利用し、抗原を担体に固定化して、抗
体を除去しようとする試みが知られており、抗ＤＮＡ抗
体等においても、ＤＮＡを担体に固定して除去が可能で
ある。しかし、すでに述べた　５− ように、実用には不適でちった。本発明により、体内に
万一はいっても安全な物質を用いて、ＤＮＡと同等以上
の吸着性能を有する吸着材が開発され、これにより広範
囲な臨床応用が可能になり、今後、自己免疫疾患の治療
に大きな進歩をもたらすものと思われる。

本発明に用いられる糖リン酸を構成要素として含む低分
子量の物質とは、エリトロース、トレオース等のテトロ
ース類、アラビノース、キシロース、リキソース、リボ
ース等のアルドペントース類、キシルロース、ベンツロ
ース、リフロース等のケトペントース類、ガラクトース
、グルコース、タロース、マンノース等のアルドヘプト
ース類、ソルボース、タガトース、フシコース、フルク
トース等のケトヘキソース類、Ｎ−アセチル−グルコサ
ミン等へキンサミン類、アルドヘプトース、ケトヘプト
ース、ケトオクトース、ケトノノース等の多年糖類、２
−デオキシペントース、６−デオキシヘキソース、２−
デオキシヘキソース、２．６−シブオキシヘキソース、
３，６−ジデオキシ　６− ヘキソース等のデオキシ糖類、糖アルコール無水物類、
ウロン酸、ケトアルドン酸、アスコルビン酸等の酸性糖
類、糖メチルエーテル類、分岐糖類、アミノ糖類、シア
ル酸類のモノまたはジ正リン酸エステル、モノまたはジ
ビロリン酸エステル、トリフオスフェート等がある。こ
れらの糖はＤＸ　Ｌ体、スレオ、エリスロ体にか＼わり
なく用い不ことができる。また、重合度１０以下のホモ
″！、たはへテロオリゴ糖に正リン酸、ビロリン酸、ト
リフオスフェート基が結合したものも用いることができ
る。さらに、重合度１０以下の糖リン酸のホモまたはへ
テロ重合体も用いることができる。これらすべての誘導
体も用いることができる。このうち特に、ルポース、デ
オキシリボースのす／酸エステルが好ましく、さらに、
デオキシリボースの３．５ジ正リン酸およびそのオリゴ
マーがより好ましい。

これらを単に一つだけ固定するのではなく、複数の種類
を担体に固定してもよい。

本発明に用いる担体は、水に不溶性のものであれば、い
ずれも用いることができるが、非特異的吸着を避ける点
で、親水性担体を用いるのが望ましい。不溶性担体の形
状は、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状、ガーゼ状、不
織布等いずれのものも用いることができるが、実施上の
取り扱い、リガンドの保持量、血漿との接触有効面積等
の点で、粒子状、繊維状のものが好ましい。

粒子状担体としては、平均粒径５０μから２５００μの
範囲にあることが好ましい。平均粒径はＪＩＳ−Ｚ−８
８０１に規定されるフルイを用いて流水中で分級した後
、缶縁の上限粒径と下限粒径の中間値金缶縁の粒径とし
、その重量平均として平均粒径を算出する。また、粒子
形状は球形が好ましいが、特に限定されるものではない
。平均粒径が２５００μを超えると、悪性物質の吸着量
および吸着速度が低下し、５０μ未満では、体外循環に
用いると圧損が大きく目づまりが起こりやすく、また凝
固系の活性化、血球粘着をおこしやすい。

使用できる粒子状担体としては、アガロース系、架橋デ
キストラン系、セルロース系、架橋ポリアクリルアミド
系、多孔性シリカビーズ、活性炭等の担体を用いること
ができるが、アガロース系、架橋デキストラン系、セル
ロース系等の多糖類ゲルが良い結果を与える。また、通
常、固定化酵素、アフイニテイクロマトグラフイに用い
られる公知の担体は、特別な限定なく使用できる。

また、本発明で用いられる粒子状担体としては、多孔性
合成重合体粒子を用いることができる。該粒子はその表
面に、先に記した本発明に用いる物質を固定できるもの
であり、平均孔径３００Ｘないし９ｏｏｏ！、より好ま
しくは１ｏｏｏＸないし６０００久の範囲にあるもので
ある。該粒子の重合体組成は、ポリアミド系、ポリエス
テル系、ポリウレタン系、ビニル化合物の重合体を用い
ることができるが、特に親水性のビニル化合物系多孔性
合成体粒子が好ましい結果を与える。

該多孔性構造は平均孔径３００Ｘないし９０００スの範
囲にあるものが好ましいが、平均孔径が小さすぎる場合
には、吸着される自己抗体の量が少なく、大きすぎる場
合には、重合体粒子の強度が　９− 低下し、かつ表面積が減少するため実用的ではない。

平均孔径の測定は、水銀圧入式ポロシメーターによって
行うことができる。この方法は多孔性物質に水銀を圧入
してゆき、浸入した水銀量から気孔量を、圧入に要する
圧力から孔径を求める方法であり、４０に以上の孔を測
定することができる。

平均孔径は、孔径ｆ：ｒ、ポロシメーターで測定した累
積気孔量をＶとしたとき、ｄｖ／ｄｔｏｇｒの値が最大
となるときのｒの値とする。

繊維状担体を用いる場合には、その繊維径が０．０２デ
ニールないし１０デニール、より好ましくは０．１デニ
ールないし５デニールの範囲にあるものがよい。繊維径
が大きすぎる場合には、自己抗体の吸着量および吸着速
度が低下し、小さすぎる場合には、凝固系の活性化、血
球粘着、目づまりをおこしやすい。使用できる繊維状担
体としては、再生セルロース系繊維、ナイロン、アクリ
ル、ポリエステル等公知の親水性繊維でおる。

結合リガンドを親水性担体に固定化する方法は、−１０
− 共有結合、イオン結合、物理的吸着法、架橋法、包埋あ
るいは担体表面への沈澱不溶化等あらゆる公知の方法を
用いることができるが、結合リガンドの溶出を防ぐ上で
、共有結合によるものがよい。

共有結合の方法としては、通常、固定化酵素、アフィニ
ティーカラムの製造に用いられる方法がとられる。担体
を活性化する方法として、ハロゲン化シアン、過ヨウ素
酸、架橋試薬、エポキシド等を用いて行なえる。担体と
リガンドとの間に、任意の長さの分子（スペーサー）を
挿入して使用することができる。

本発明で担体に結合させるリガンドの量は、担体１２（
乾燥重量）当り０．１１ｒｎＯｔないしは１０００μｍ
ｏｌの範囲であり、より好ましくは０．５μｍｏｌない
しは１００μｍｏｌの範囲である。保持量が０．１μｍ
ａｔ未満の場合は、悪性物質の吸着能の低下が起こり、
２００μｍｏｌを超える場合は、血漿有用成分の非特異
吸着が起こり好ましくない。担体と結合させるリガンド
の部分は、水酸基、リン酸基、アミン基を用いることが
できる。

該吸着材の作用機構は、抗原抗体反応に近いものと考え
られるが、本来の抗原である生体高分子または類似した
合成高分子を用いずに、万一体内にはいっても伺ら支障
がなく、体内で代謝される低分子によって、充分な吸着
除去能力を呈することは驚くべきことといえる。また、
免疫複合体の吸着には、複合体中の抗体の残余Ｆａｂ部
分とりガントとの相互作用が寄与しているものと考えら
れる。

本発明の自己抗体吸着装置は、上記説明の自己抗体吸着
材を、流体の導出入口を有する容器内に充填し、体液が
自己抗体吸着材と接触しつつ通過するようにしたもので
ある。これの具体例を第１図と第２図に示す。第１図に
おいて、円筒ｆｉ＋の両端開口部に、内側にフィルター
（２）を張ったバッキング（３）を介して体液導出入口
（４）を有するキャップ（５）をネジ（６）で嵌合し、
両端のフィルターの間隙に吸着材（力を充填保持させて
なるものである。

吸着材としては、本発明の前記吸着材を単独で充填して
もよく、他の吸着材と混合もしくは積層してもよい。吸
着材層の容積は、体外循環に用いる場合、５０〜４０〇
−程度が適当である。

本発明の装置を体外循環で用いる場合には、大路次の二
通りの方法がある。一つには、体内から取り出した血液
を遠心分離機もしくは膜製血漿分離器を使用して、血漿
成分と血球成分とに分離したのち、血漿成分を本発明の
装置に通過させ、浄化した後、血球成分と合わせて体内
にもどす方法であり、他の一つは体内から取り出した血
液を直接本発明の装置に通過させ、浄化する方法である
。

また、血液もしくは血漿の通過速度については、該吸着
材の吸着能率が非常に高いため、吸着材の粒度を粗くす
ることができ、また充填度を低くできるので、吸着材層
の形状の如伺にか＼わらず、高い通過速度を与えること
ができる。そのため多量の体液処理をすることができる
。

体液の通液方法としては、臨床上の必要に応じ、あるい
は設備の設置状況に応じて、連凧的に通液してもよいし
、また断続的に通液使用してもよい。

本発明の吸着材および吸着装置は、以上述べて−１３− きたように、体液中の抗ｎ−ＤＮＡ抗体、抗ｄｓ　−Ｄ
ＮＡ抗体、抗核抗体等の自己抗体および免疫複合体を高
率かつ特異的に吸着除去し、非常にコンパクトであると
共に簡便かつ安全である。また、滅菌操作も容易かつ確
実に実施できるという効果を併せもっている。また、本
発明の吸着材は、装置に充填して治療器として用いられ
るにとどまらず、抗ｎ−ＤＮＡ抗体、抗ｄｓ　−Ｄ　Ｎ
Ａ抗体、抗核抗体等の自己抗体および免疫複合体の分離
、精製用吸着材およびこれらの測定用基材としても極め
て有効に利用できる。

以下、実施例により、本発明の実施の態様をより詳細に
説明する。

実施例１ ｃＮｎｒＮｎ化セファローズ４Ｂ（スユーデン・ファル
マシア社裂、平均粒径２６０μ）に通常の方法によって
デオキシリボース３，５−シリン酸を結合せしめ（″′
実験と応用アフイニテイクロマトグラフィー”Ｐ４８．
１９７６講談社サイエンティフィック刊）、通常の活性
基をトリスノ・イドロオ−１４− ギシメチルアミンメタンでブロッキングした。保持量は
６０μｍｏ、ｔ／　ｇであった。吸着材は生理食塩水で
充分に洗浄した後、脱水して実験に供した。

吸着実験は、患者血漿３容と吸着材１容を混合し、３７
℃、３時間インキュベーションによす行った。また、対
照として、未活性化セファローズ４Ｂ（ｉｌ−用いた。

抗ｄｓ　−Ｄ　ＮＡ抗体価はクリチデア　ルシリア（ｃ
ｒｉｔｈｉｄｉａ　１ｕｃｉｌｉａｅ　）を用いる螢光
抗体間接法を用いた。

抗核抗体価は、細胞を塗抹したスライドガラスに段階希
釈した検体（−次抗体）を滴下し、抗原−抗体反応を行
い、ペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリン抗体（
二次抗体）を滴下し、酵素の呈色反応を光学顕微鏡で観
察した。測定には、「エンザイムＡＮＡテスト」〔（株
）医学生物学研究所製〕のキットを用いた。陽性を示す
最高希釈倍数をもって抗体価を表示した。

免疫複合体量の測定には、ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ　）により免疫複合体を沈降させ、補体溶血反応と
組合わせる方法を用いた。この方法の操作方法、条件は
次のようにして行った。

ｆｉ＋検体０．３ｍｌを分離管に注ぐ。次に、０，２Ｎ
ＥＤＴＡ　　５０μｔを加えて攪拌し、さらにほう酸緩
衝液を５０μを加えて攪拌する。１２．５チＰＥＧ　（
分子量６０００）を０．１−加えて攪拌し、４℃、９０
分靜装する。

（２）４℃、１７００？で１０分間遠心し、沈澱を２．
５チＰＥＧ　１，０ゴで洗う。１７００ｒで１５分間遠
心し、上清を捨てる。

ｆ３＋３７℃のＧ　Ｖ　Ｂ”　（２価陽イオンを含むゼ
ラチンベロナール緩衝液）３０μｔを加え、沈澱を溶解
する。補体源としてプール健康人血清１０μｔを加える
。６７℃、３０分間、免疫複合体と補体とを反応させる
。

（４１１，５Ｘ　１０８／ｄ　Ｅ　Ａ　（抗体感作赤血
球）　１．Ｏｒｄを加え、３７℃、６０分間、振とうさ
せて、残存補体による溶血反応を促進させる。

（５）反応後、４℃の生理食塩水６．５−を加えて遠心
し、上清の吸光度（ＯＤ４１４）を測定する。

（６）健康人血清を対照とし、これに対する溶血の阻止
率を算出する。単位をＰＥＧ−Ｃ０％とする。

ＥＡＶｉ日本凍結乾燥研究所製の補体価測定用感作赤血
球（ＫＷ）を用いた。

アルブミン量はブロムクレゾールグリーン（ＢＣＧ）を
用いるアルブミン測定法を利用し、試薬１ｄ（Ａ／ｃ　
　Ｂ−テスト　ワコー、和光純薬工業（株）製〕を用い
た。吸着実験後のアルブミンの減少量の患者血漿に対す
る割合を除去率とした。結果を表１に示した。

実施例２ 結合リガンドにリボース３，５−シリン酸を用いたほか
は、すべて実施例１と同一条件で実施した。

結果を表１に示した。

−１７− 実施例６ 結合リガンドにデオキシリボース５−シリン酸、３−シ
リン酸を用いたほかは、すべて実施例１と同一条件で実
施した。結果を表１に示した。

実施例４ 結合リガンドにデオキシリボース５−リン酸の２量体（
３，５結合２量体）を用いた他は、すべて実施例１と同
一条件で実施した。結果を表１に示した。

実施例５ ０．５デニールのペンベルブ長繊維（旭化成工業（株）
製）を用いて、常法によりＣＮＢ　ｒで活性化し、デオ
キシリボース３，５−シリン酸を用いて固定した。該吸
着材１１と患者血漿１０−を３７℃、３時間インキュベ
ートした。対照として未処理のペンペルグを用いた。こ
れ以外はすべて実施例１と同一条件で実施した。結果を
表１に示した。

−１８− セ・ツブ　＾・・・・・・・・・未パン　７・・・・・
・・・・＠善甜実施例６ 実施例１に用いた吸着材１０−を、第２図に示す実験系
を用いて吸着実験を行った。

すなわち、容器（８）に同一患者血漿（９）を５０−入
れ、ポンプ００）により毎分１−の流速で汲み出し、悪
性物質吸着装置ａυに送り、ドリップチャンバー０４お
よびサンプリングロａａｌ’ｔｃ経て、容器（８）に返
送されるようにチューブＱ４）を配設した。

上記装置により、血液を３時間循環させた後、血液をサ
ンプリングし、血漿中の自己抗体、免疫複合体量等は、
実施例１と同様に測定した。

抗ｄｓ　−Ｄ　ＮＡ抗体価、抗核抗体価ともに６４０が
４０に低下した。また免疫複合体は７５チ除去できた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の悪性物質吸着装置の１例を示す断面図
、第２図は実施例６のモデル実験説明図である。 １・・・・・・・・・円筒　２・・・・・・・・・フィ
ルター　６・・・・・・・・・バッキング　４・・・・
・・・・・体液導出人口　５・・・・・・・・・キヤ＝
　２０　＝ −２１− 第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、不溶性担体に糖リン酸を構成要素として含む低分子
   量の物質ないしはその誘導体の少なくとも１種が結合し
   ていることを特徴とする自己抗体、免疫複合体の吸着材
   。 ２、糖リン酸がベントースリン酸である特許請求の範囲
   第１項記載の吸着材。 ３、不溶性担体に糖リン酸を構成要素として含む低分子
   量の物質ないしはその誘導体の少なくとも１種が結合し
   ている吸着材を単独または２種以上、流体の導出入口を
   有する容器内に収容せしめてなることを特徴とする自己
   抗体、免疫複合体の吸着装置。