JP4812061B2 - Novel polyhydroxyalkanoate containing unit having [(substituted phenyl) methyl] sulfanyl structure in side chain and method for producing the same - Google Patents

Description

【００２１】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ₂、ＣＯＯＲ’、ＳＯ₂Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ₃、Ｃ₂Ｈ₅のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ₃、ＯＣ₂Ｈ₅のいずれかを表す）から任意に選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示されるユニットをポリマー分子中に含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートである。
【００２２】
なお、本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、前記一般式（１）で示されるユニットに加えて、
下記一般式（２）：
【００２３】
【化１７】

【００２４】
（式中、ｙは、０〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示される３−ヒドロキシアルカン酸ユニット、
あるいは、下記一般式（３）：
【００２５】
【化１８】

【００２６】
（式中、ｚは、３および５から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示される３−ヒドロキシアルカ−５−エン酸ユニットのうち、少なくとも１種類をもポリマー分子中に含んでいてもよい。また、そのポリマー分子の数平均分子量は、５０００〜３０００００の範囲である。
【００２７】
上記の構成を有する本発明のＰＨＡには、例えば、下記化学式（４）：
【００２８】
【化１９】

【００２９】
で示される３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートが含まれる。
または、下記化学式（５）：
【００３０】
【化２０】

【００３１】
で示される３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートが含まれる。
【００３２】
また、本発明は、
下記一般式（６）：
【００３３】
【化２１】

【００３４】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ₂、ＣＯＯＲ’、ＳＯ₂Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ₃、Ｃ₂Ｈ₅のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ₃、ＯＣ₂Ｈ₅のいずれかを表す）から任意に選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表す）で示される化合物を少なくとも一種類以上含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程を有することを特徴とする、
下記一般式（１）：
【００３５】
【化２２】

【００３６】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ₂、ＣＯＯＲ’、ＳＯ₂Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ₃、Ｃ₂Ｈ₅のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ₃、ＯＣ₂Ｈ₅のいずれかを表す）から任意に選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示されるユニットを分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。
【００３７】
本発明の方法で製造されるポリヒドロキシアルカノエートは、前記一般式（１）で示されるユニットに加えて、
下記一般式（２）：
【００３８】
【化２３】

【００３９】
（式中、ｙは、０〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示される３−ヒドロキシアルカン酸ユニット、
あるいは、下記一般式（３）：
【００４０】
【化２４】

【００４１】
（式中、ｚは、３および５から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示される３−ヒドロキシアルカ−５−エン酸ユニットのうち、少なくとも１種類をもポリマー分子中に含んでいてもよい。
【００４２】
また、本発明のＰＨＡの製造方法においては、培養工程において利用する前記培地は、ポリペプトンを含んでいることができる。あるいは、培養工程において利用する前記培地は、酵母エキスを含んでいることができる。さらに、培養工程において利用する前記培地は、糖類を含んでいることができる。この場合、培地中に含有される糖類は、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群から選択される１種類以上の化合物であることが好ましい。
【００４３】
加えて、本発明のＰＨＡの製造方法においては、培養工程において利用する前記培地は、有機酸またはその塩を含んでいるものでもよい。その際、培地中に含有される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることが好ましい。あるいは、培養工程において利用する前記培地は、アミノ酸またはその塩を含んでいることもできる。例えば、培地中に含有されるアミノ酸またはその塩は、グルタミン酸、アスパラギン酸、あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることが好ましい。
【００４４】
場合によっては、本発明のＰＨＡの製造方法においては、培養工程において利用する前記培地は、炭素数４から１２の直鎖アルカン酸またはその塩を含んでいることもできる。
【００４５】
また、本発明のＰＨＡの製造方法においては、前記微生物の培養において二段階以上の培養を行うことができる。この場合、二段階目以降の培養では培地中に窒素源が含まれていないことが好ましい。
【００４６】
更に、本発明のＰＨＡの製造方法において、前記微生物の培養において二段階以上の培養を行う場合、その培養工程において
（工程１−１） 下記一般式（６）：
【００４７】
【化２５】

【００４８】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ₂、ＣＯＯＲ’、ＳＯ₂Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ₃、Ｃ₂Ｈ₅のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ₃、ＯＣ₂Ｈ₅のいずれかを表す）から任意に選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表す）で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつポリペプトンを含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程と、これに続き、
（工程１−２） 前記一般式（６）で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつ有機酸またはその塩とを含む培地中で、工程１−１で培養された微生物を更に培養する工程とを有する製造方法とすることができる。その際、前記工程１−２で用いる培地中に含有される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることが好ましい。なお、前記工程１−２で利用する培地中には、窒素源が含まれていないことがより好ましい。
【００４９】
また更に、
（工程１−３） 下記一般式（６）：
【００５０】
【化２６】

【００５１】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、ＣＮ、ＮＯ₂、ＣＯＯＲ’、ＳＯ₂Ｒ’’（なお、Ｒ’は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ₃、Ｃ₂Ｈ₅のいずれかを表し、Ｒ’’は、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＮａ、ＯＫ、ＯＣＨ₃、ＯＣ₂Ｈ₅のいずれかを表す）から任意に選択される基であり、また、ｘは、１〜８から選択される任意の整数を表す）で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつ糖類を含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程と、これに続き、（工程１−４） 前記一般式（６）で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、また、糖類を含む培地中で、工程１−３で培養された微生物を更に培養する工程とを有する製造方法を挙げることもできる。その際、前記工程１−３及び工程１−４で用いるそれぞれの培地中に含有される糖類は、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群から選択される１種類以上の化合物であることが好ましい。なお、前記工程１−４で利用する培地中には、窒素源が含まれていないことがより好ましい。
【００５２】
本発明のＰＨＡの製造方法には、例えば、下記化学式（７）：
【００５３】
【化２７】

【００５４】
で示される５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸を含む培地中で微生物を培養し、
下記化学式（４）：
【００５５】
【化２８】

【００５６】
で示される３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットをポリマー分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法が含まれる。
【００５７】
本発明のＰＨＡの製造方法には、例えば、下記化学式（８）：
【００５８】
【化２９】

【００５９】
で示される４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸を含む培地中で微生物を培養し、
下記化学式（５）：
【００６０】
【化３０】

【００６１】
で示される３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットをポリマー分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法もまた含まれる。
【００６２】
なお、本発明のＰＨＡの製造方法においては、前記の培養工程に加えて、培養細胞からポリヒドロキシアルカノエートを回収する工程を設けることができ、その際、このポリヒドロキシアルカノエート回収工程は、培養された微生物細胞中に蓄積されるポリヒドロキシアルカノエートを可溶化する工程を含むことを特徴とする製造方法、もしくは、培養された微生物細胞中に蓄積されるポリヒドロキシアルカノエートを分離する方法として、微生物細胞を破砕する工程を含むことを特徴とする製造方法とすることが望ましい。
【００６３】
一方、上述した種々の構成をとることが可能な本発明のＰＨＡの製造方法において、利用する微生物は、前記培養方法によって、本発明のＰＨＡを生産しうる微生物であれば如何なる微生物でもよく、その中でも特に、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物であることが好ましい。例えば、前記シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物が、シュードモナス・チコリアイ ＹＮ２株（Pseudomonas cichorii YN2； FERM BP−7375）、シュードモナス・チコリアイ Ｈ４５株（Pseudomonas cichorii H45； FERM BP−7374）、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ１６１株（Pseudomonas jessenii P161； FERM BP−7376）のうちから選択される微生物であることがより好ましい。
【００６４】
【発明の実施の形態】
本発明の新規なポリヒドロキシアルカノエートは、含まれるヒドロキシアルカン酸のモノマーユニット中に、スルフィド構造（−Ｓ−）及び上記芳香環構造をその側鎖に有し、この構造によりこれまでに知られている微生物生産ポリヒドロキシアルカノエートとは著しく異なった物理化学的性質を有している。本発明の新規なポリヒドロキシアルカノエートは、例えば、ＰＨＡ生産能力を有する微生物を、原料となるω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸に加えて、増殖基質を含んだ培地中で培養する工程、この培養工程において微生物により生産され、その細胞内に蓄積される、側鎖末端に［（置換フェニル）メチル］スルファニル基を有するユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを回収する工程、この二段階の工程を経て製造されるものである。また、かかる微生物により産生されるＰＨＡは、一般式（１）に示されるユニットを含め、全ての３−ヒドロキシアルカン酸ユニットの、３位の炭素は不斉炭素であるが、その絶対配置は、Ｒ体となり、生分解性を示すものである。
【００６５】
なお、上記一般式（１）、ならびに、一般式（６）における、ベンゼン環上の置換基Ｒにおけるハロゲン原子には、フッ素、塩素、臭素が含まれる。
【００６６】
以下に、本発明について、より詳細に説明する。
【００６７】
本発明のＰＨＡの製造方法では、目的とする一般式（１）で示されるユニットを含むＰＨＡの生産に用いる微生物は、原料化合物の一般式（６）で示されるω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸を含む培地中で培養した際、対応する側鎖末端に［（置換フェニル）メチル］スルファニル基を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを生産し、その細胞内に蓄積する微生物であれば、いかなる微生物であってもよい。例えば、ＰＨＡ産生能を有するシュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物が挙げられる。好適なシュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物の一例を挙げると、シュードモナス・チコリアイ ＹＮ２株（Pseudomonas cichorii YN2； FERM BP−7375）、シュードモナス・チコリアイ Ｈ４５株（Pseudomonas cichorii H45； FERM BP−7374）、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ１６１株（Pseudomonas jessenii P161； FERM BP−7376）の三種の菌株が挙げられる。これら三種の微生物は、寄託者として本願出願人を名義として、先に国内寄託され、その後、その原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託へと移管され、国際寄託機関としての経済産業省 産業技術総合研究所 生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）よりそれぞれ、前記の受託番号を付与され、現在の、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。また、新規なＰＨＡ産生能を有する菌株として、既に、特願平１１−３７１８６３号に記載されている微生物である。
【００６８】
以下に、ＹＮ２株、Ｈ４５株及びＰ１６１株について、その菌学的性質を示す。
【００６９】
＜ＹＮ２株の菌学的性質＞
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ ：桿菌、０．８μｍ×１．５〜２．０μｍ
細胞の多形性 ：なし
運動性 ：あり
胞子形成 ：なし
グラム染色性 ：陰性
コロニー形状 ：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、半透明
（２）生理学的性質
カタラーゼ ：陽性
オキシダーゼ ：陽性
Ｏ／Ｆ試験 ：酸化型（非発酵性）
硝酸塩の還元 ：陰性
インドールの生成 ：陽性
ブドウ糖酸性化 ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ ：陰性
ウレアーゼ ：陰性
エスクリン加水分解 ：陰性
ゼラチン加水分解 ：陰性
β−ガラクトシダーゼ ：陰性
King's B寒天での蛍光色素産生 ：陽性
４％ＮａＣｌでの生育 ：陽性（弱い生育）
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積：陰性（＊）
Ｔｗｅｅｎ８０の加水分解 ：陽性
＊ nutrient agar培養コロニーをズダンブラックで染色することで判定。
（３）基質資化能
ブドウ糖 ：陽性
Ｌ−アラビノース ：陽性
Ｄ−マンノース ：陰性
Ｄ−マンニトール ：陰性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン ：陰性
マルトース ：陰性
グルコン酸カリウム ：陽性
ｎ−カプリン酸 ：陽性
アジピン酸 ：陰性
ｄｌ−リンゴ酸 ：陽性
クエン酸ナトリウム ：陽性
酢酸フェニル ：陽性
＜Ｈ４５株の菌学的性質＞
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ ：桿菌、０．８μｍ×１．０〜１．２μｍ
細胞の多形性 ：なし
運動性 ：あり
胞子形成 ：なし
グラム染色性 ：陰性
コロニー形状 ：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、クリーム色
（２）生理学的性質
カタラーゼ ：陽性
オキシダーゼ ：陽性
Ｏ／Ｆ試験 ：酸化型
硝酸塩の還元 ：陰性
インドールの生成 ：陰性
ブドウ糖酸性化 ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ ：陰性
ウレアーゼ ：陰性
エスクリン加水分解 ：陰性
ゼラチン加水分解 ：陰性
β−ガラクトシダーゼ ：陰性
King's B寒天での蛍光色素産生 ：陽性
４％ＮａＣｌでの生育 ：陰性
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積：陰性
（３）基質資化能
ブドウ糖 ：陽性
Ｌ−アラビノース ：陰性
Ｄ−マンノース ：陽性
Ｄ−マンニトール ：陽性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン ：陽性
マルトース ：陰性
グルコン酸カリウム ：陽性
ｎ−カプリン酸 ：陽性
アジピン酸 ：陰性
ｄｌ−リンゴ酸 ：陽性
クエン酸ナトリウム ：陽性
酢酸フェニル ：陽性
【００７０】
＜Ｐ１６１株の菌学的性質＞

（２）生理学的性質
カタラーゼ ：陽性
オキシダーゼ ：陽性
Ｏ／Ｆ試験 ：酸化型
硝酸塩の還元 ：陽性
インドールの生成 ：陰性
ブドウ糖酸性化 ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ ：陽性
ウレアーゼ ：陰性
エスクリン加水分解 ：陰性
ゼラチン加水分解 ：陰性
β−ガラクトシダーゼ ：陰性
King's B寒天での蛍光色素産生 ：陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 ：陽性
Ｌ−アラビノース ：陽性
Ｄ−マンノース ：陽性
Ｄ−マンニトール ：陽性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン ：陽性
マルトース ：陰性
グルコン酸カリウム ：陽性
ｎ−カプリン酸 ：陽性
アジピン酸 ：陰性
ｄｌ−リンゴ酸 ：陽性
クエン酸ナトリウム ：陽性
酢酸フェニル ：陽性
【００７１】
（培養工程）
本発明にかかるＰＨＡの製造方法は、原料の上記一般式（６）に示されるω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸を含む培地中で、上記するＰＨＡ産生能を有する微生物を培養することで、対応する前記一般式（１）で表される、側鎖末端に（置換フェニルメチル）スルファニル基を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを生産させ、細胞内に蓄積させる。
【００７２】
微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作製、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地（肉汁培地、酵母エキスなど）や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。温度、通気、攪拌などの培養条件は、用いる微生物に応じて適宜選択する。
【００７３】
一方、前記したようなＰＨＡ生産微生物を用いて、目的とする一般式（１）で示される、側鎖末端に（置換フェニルメチル）スルファニル基を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを製造する際には、培地として、ＰＨＡ生産用の原料として、このモノマーユニットに対応する、上記一般式（６）で示されるω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸に加えて、微生物の増殖用基質を少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。原料の一般式（６）で示される化合物は、培地あたり０．０１％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲、より好ましくは、０．０２％〜０．２％（ｗ／ｖ）の範囲に初期の含有率を選択することが望ましい。原料の一般式（６）で示されるω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸の水溶性は必ずしも良好ではないが、本発明においては、上記の微生物を用いる場合、培地中に懸濁された状態であっても何ら問題とはならない。
【００７４】
なお、原料の一般式（６）で示される化合物は、分散性を高めるため、場合によっては、１−ヘキサデセンやｎ−ヘキサデカンのような溶媒に溶解、あるいは、微細な懸濁物とした形状で培地中に添加することも可能である。その際には、利用する１−ヘキサデセンやｎ−ヘキサデカンのような溶媒の添加濃度は、培地に対して、その濃度は３％（ｖ／ｖ）以下にすることが必要である。
【００７５】
培地には、微生物が増殖に利用する増殖基質を別途添加することが好ましい。この増殖基質は、酵母エキスやポリペプトン、肉エキスといった栄養素を用いることが可能である。更に、糖類、ＴＣＡ回路中の中間体として生じる有機酸ならびにＴＣＡ回路から一段階ないしは二段階の生化学反応を経て生じる有機酸またはその塩、アミノ酸またはその塩、炭素数４〜１２の直鎖アルカン酸またはその塩などから、用いる菌株に応じて、増殖基質としての有用性を考慮して、適宜選択することができる。
【００７６】
これら種々の増殖基質のうち、糖類としては、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール等のアルジトール、
グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００７７】
また、有機酸あるいはその塩としては、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸またはそれらの塩からなる群から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。一方、アミノ酸またはその塩としては、グルタミン酸、アスパラギン酸あるいはそれらの塩からなる群から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００７８】
一般に、これら種々の増殖基質の中でも、ポリペプトンや糖類を用いるのがより好ましい。原料化合物と共存させる、これらの増殖基質は、通常、培地あたり０．１％〜５％（ｗ／ｖ）の範囲、より好ましくは、０．２％〜２％（ｗ／ｖ）の範囲にその含有率を選択することが望ましい。
【００７９】
微生物にＰＨＡを生産・蓄積させる培養方法としては、一旦十分に増殖させた後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態でさらに培養すると生産性が向上する場合がある。例えば、異なる培養条件からなる工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。
【００８０】
より具体的には、（工程１−１）として、一般式（６）で示される化合物、ならびに増殖基質となるポリペプトンを含む培地中で微生物を培養する工程を対数増殖後期から定常期の時点まで続け、一旦菌体を遠心分離等で回収した後、これに続き、（工程１−２）として、一般式（６）で示される化合物、ならびに増殖基質となる、上に例示したような有機酸またはその塩を含む（好ましくは、窒素源を含まない）培地中で、前段の工程１−１で培養・増殖した微生物の菌体をさらに培養する工程を行う二段階培養方法、あるいは、（工程１−３）として、一般式（６）で示される化合物、ならびに増殖基質となる糖類を含む培地中で微生物を培養する工程を対数増殖後期から定常期の時点まで続け、一旦菌体を遠心分離等で回収した後、これに続き、（工程１−４）として、一般式（６）で示される化合物、ならびに増殖基質となる糖類を含み、窒素源を含まない培地中で、前段の工程１−３で培養・増殖した微生物の菌体をされに培養する工程を行う二段階培養方法等を利用することが一層好ましい。この二段階培養方法では、前段において、原料の上記一般式（６）で示されるω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸から、対応する前記一般式（１）で示される、側鎖末端に［（置換フェニル）メチル］スルファニル基を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを生産させつつ、菌体の増殖を予め行い、後段では、窒素源を含まない培地中で、既に培養された菌体に、主にＰＨＡの生産を行わせる培養形態とすることで、細胞内に蓄積されるＰＨＡ量をさらに高くすることができる。
【００８１】
その際、培養温度は、上記の菌株が良好に増殖可能な温度であればよく、例えば、1５〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃の範囲、より好ましくは２０℃〜３０℃の範囲に選択することが適当である。
【００８２】
培養は、液体培養、固体培養など、利用する微生物が増殖し、培地中に含有される原料の一般式（６）の化合物から、前記一般式（１）で示されるユニットを含むＰＨＡを生産する培養方法ならば、いかなる培養方法をも用いることができる。さらには、原料、増殖基質、さらには酸素の供給が適正に行われるならば、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養などの種類も問わない。例えば、液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。
【００８３】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源（例えば、リン酸塩など）、窒素源（例えば、アンモニウム塩、硝酸塩など）等、微生物の増殖に必要な成分を含んでいる培地であればいかなるものでも良く、例えば、ＭＳＢ培地、Ｍ９培地等を挙げることができる。
【００８４】
例えば、後に述べる実施例において用いた無機塩培地：Ｍ９培地の組成を以下に示す。
【００８５】
［Ｍ９培地］
Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ６．２ｇ
ＫＨ₂ＰＯ₄ ３．０ｇ
ＮａＣｌ ０．５ｇ
ＮＨ₄Ｃｌ １．０ｇ
（培地１リットル中、ｐＨ７．０）
【００８６】
更に、良好な増殖と、それに伴うＰＨＡの生産のためには、上記の無機塩培地に、例えば、以下に示す微量成分溶液を０．３％（ｖ／ｖ）程度添加して、必須微量元素を補う必要がある。
【００８７】
［微量成分溶液］
ニトリロ三酢酸 ：１．５ｇ；
ＭｇＳＯ₄ ：３．０ｇ；
ＭｎＳＯ₄ ：０．５ｇ；
ＮａＣｌ ：１．０ｇ；
ＦｅＳＯ₄ ：０．１ｇ；
ＣａＣｌ₂ ：０．１ｇ；
ＣｏＣｌ₂ ：０．１ｇ；
ＺｎＳＯ₄ ：０．１ｇ；
ＣｕＳＯ₂ ：０．１ｇ；
ＡｌＫ（ＳＯ₄）₂：０．１ｇ；
Ｈ₃ＢＯ₃ ：０．１ｇ；
Ｎａ₂ＭｏＯ₄ ：０．１ｇ；
ＮｉＣｌ₂ ：０．１ｇ
（溶液１リットル中、ｐＨ７．０）
【００８８】
（ＰＨＡの回収工程）
本発明に用いる微生物は、このような培養方法により、上記一般式（１）で示される、側鎖末端に［（置換ファニル）メチル］スルファニル基を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを産生し、その菌体内に蓄積する。従って、本発明のＰＨＡの製造方法では、培養後、その培養菌体から、目的とするＰＨＡを回収する工程を設ける。
【００８９】
この菌体からのＰＨＡの回収には、溶媒抽出法を利用して、可溶化したＰＨＡを細胞由来の不溶成分と分離し、回収する手段を用いることができる。通常行われているクロロホルム抽出が最も簡便であるが、クロロホルム以外に、ジクロロメタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン等が用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤処理、リゾチーム等の酵素処理によって、ＰＨＡ以外の菌体内成分を可溶化・除去することによって、不溶性画分として、ＰＨＡのみを回収する方法を採ることもできる。さらには、超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧力破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法、凍結融解法等の微生物細胞を破壊する処理を行って、細胞中に蓄積されたＰＨＡのみを分離、回収する方法を採ることもできる。
【００９０】
なお、本発明のＰＨＡの製造方法において、微生物の培養、その間における、培養される微生物におけるＰＨＡの生産と菌体への蓄積を行う工程、ならびに、培養後、その菌体からのＰＨＡ回収を行う工程は、上記の方法に限定されるものではない。
【００９１】
本発明の方法により製造される、微生物産生のＰＨＡは、一般式（１）のユニットに加えて、培地中に添加する増殖基質を利用して、脂肪酸合成系を介して生合成する、一般式（２）で示される３−ヒドロキシアルカン酸ユニット、あるいは、一般式（３）で示される３−ヒドロキシアルカ−５−エン酸ユニットを含むこともある。なお、含まれる３−ヒドロキシアルカン酸ユニットは、いずれも、その３位の炭素原子は不斉炭素であるが、その絶対配置は同じくＲ−体であり、その生分解性を保持することは勿論のことである。一般式（１）のユニット中の、（フェニルメチル）スルファニル基部分に加えて、そのベンゼン環上に種々の置換基を有することで、ポリマーそのものに新たな物理化学的な性質が加わり、物性の改良が見込まれ、これまでに応用し得なかった分野への展開が期待できる。
【００９２】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。これら実施例は、本発明の最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら実施例により限定されうるものではない。なお、以下における「％」は特に表記した以外は重量基準である。
【００９３】
３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法
【００９４】
（実施例１）
ポリペプトン（販売元 和光純薬工業）０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【００９５】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１０６ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【００９６】
得られたＰＨＡの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８２２０、カラム；東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価した。その結果、数平均分子量 Ｍｎ＝３２０００、質量平均分子量 Ｍｗ＝９６０００であった。
【００９７】
更に、得られたＰＨＡの構造を特定するため、以下の条件でＮＭＲ分析を行った。
＜測定機器＞ ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ４００共鳴周波数：¹Ｈ＝４００ＭＨｚ、¹³Ｃ＝１００ＭＨｚ＜測定条件＞ 測定核種：¹Ｈ、¹³Ｃ使用溶媒：ＣＤＣｌ₃測定温度：室温図１に、測定された¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャートを示し、また、表１に、その同定結果を示す。図２に、測定された¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルチャートを示し、また、表２に、その同定結果を示す。
【００９８】
【表１】

【００９９】
【表２】

【０１００】
表１と表２に示す結果より、当該ＰＨＡは３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸モノマーユニットを含んでおり、加えて、それ以外のモノマーユニットとして、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸をも含んでおり、具体的には、その構成は
下記化学式（９）：
【０１０１】
【化３１】

【０１０２】
に示されるＰＨＡであることが確認された。また、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、得られたＰＨＡは３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを７６．７mol%含んでいることがわかった。
【０１０３】
（実施例２）
ノナン酸０．１％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１０４】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ８９ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１０５】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを２７．０mol%含むこともわかった。
【０１０６】
（実施例３）
酵母エキス（ＤＩＦＣＯ製）０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１０７】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ６９ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１０８】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、さらに、それ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを７６．７mol%含むこともわかった。
【０１０９】
（実施例４）
グルタミン酸ナトリウム０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１１０】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ６８ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１１１】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、さらに、それ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを９０．３mol%含むこともわかった。
【０１１２】
（実施例５）
Ｄ−グルコース０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ−グルコース０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ₄Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１１３】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１６４ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１１４】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを８５．９mol%含むこともわかった。
【０１１５】
（実施例６）
Ｄ−グルコース０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ−グルコース０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ₄Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１１６】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１３８ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１１７】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを９０．７mol%含むこともわかった。
【０１１８】
（実施例７）
Ｄ−グルコース０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・ジェッセニイ・ Ｐ１６１株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ−グルコース０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ₄Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１１９】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１３８ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１２０】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを８８．５mol%含むこともわかった。
【０１２１】
（実施例８）
ポリペプトン（販売元 和光純薬工業）０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ₄Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１２２】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１２５ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１２３】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを８９．５mol%含むこともわかった。
【０１２４】
（実施例９）
ポリペプトン（販売元 和光純薬工業）０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ₄Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１２５】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１５４ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１２６】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを９７．９mol%含むこともわかった。
【０１２７】
（実施例１０）
ポリペプトン（販売元 和光純薬工業）０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム０．５％、５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ₄Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１２８】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１５８ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１２９】
得られたＰＨＡについて、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（９）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットを９１．６mol%含むこともわかった。
【０１３０】
表３に、上記の実施例１〜１０における菌体乾燥重量、ポリマー乾燥重量、ポリマー乾燥重量／菌体乾燥重量比率、ならびに得られたＰＨＡポリマーの３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニット（３ＨＦＢｚｙＴＶ）ユニットの含有比率（mol%）をまとめて示す。
【０１３１】
【表３】

【０１３２】
３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法
【０１３３】
（実施例１１）
酵母エキス（ＤＩＦＣＯ製）０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１３４】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ４１ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１３５】
得られたＰＨＡの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８２２０、カラム；東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価した。その結果、数平均分子量 Ｍｎ＝１５３００、質量平均分子量 Ｍｗ＝３７１００であった。
【０１３６】
更に、得られたＰＨＡの構造を特定するため、以下の条件でＮＭＲ分析を行った。

図３に、測定された¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャートを示し、また、表４に、その同定結果を示す。
【０１３７】
【表４】

【０１３８】
表４に示す結果より、当該ＰＨＡは３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸モノマーユニットを含んでおり、加えて、それ以外のモノマーユニットとして、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸をも含んでおり、具体的には、その構成は
下記化学式（１０）：
【０１３９】
【化３２】

【０１４０】
に示されるＰＨＡであることが確認された。また、得られたＰＨＡは、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを８９.８mol%含んでいることがわかった。
【０１４１】
（実施例１２）
ノナン酸０．１％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１４２】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ４５ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１４３】
得られたＰＨＡについて、実施例１１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（１０）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを１０．６mol%含むこともわかった。
【０１４４】
（実施例１３）
グルタミン酸ナトリウム０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１４５】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１１ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１４６】
得られたＰＨＡについて、実施例１１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（１０）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを８４．１mol%含むこともわかった。
【０１４７】
（実施例１４）
Ｄ−グルコース０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ YN２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ−グルコース０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ₄Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１４８】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ１５３ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１４９】
得られたＰＨＡについて、実施例１１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（１０）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを68.5mol%含むこともわかった。
【０１５０】
（実施例１５）
ポリペプトン（販売元 和光純薬工業）０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・H４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ₄Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１５１】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ３８ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１５２】
得られたＰＨＡについて、実施例１１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（１０）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを43.1mol%含むこともわかった。
【０１５３】
（実施例１６）
Ｄ−グルコース０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ−グルコース０．５％、４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸０．１％を含み、窒素源（ＮＨ₄Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量（菌体乾燥重量）を秤量した。
【０１５４】
この凍結乾燥菌体ペレットを２０ｍｌクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量（回収量）を秤量した。本例では、ＰＨＡ４７ｍｇ（乾燥重量）が得られた。
【０１５５】
得られたＰＨＡについて、実施例１１と同様の条件でＮＭＲ分析、平均分子量の測定を行った。ＮＭＲ分析の結果から、本例のＰＨＡも、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを含み、且つそれ以外に、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸、または３−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式（１０）で示されるＰＨＡであることが確認された。なお、本例のＰＨＡは、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より、３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニットを48.7mol%含むこともわかった。
【０１５６】
表５に、上記の実施例１１〜１６における菌体乾燥重量、ポリマー乾燥重量、ポリマー乾燥重量／菌体乾燥重量比率、ならびに得られたＰＨＡポリマーの３−ヒドロキシ−４−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝酪酸ユニット（３ＨＦＢｚｙＴB）ユニットの含有比率（mol%）をまとめて示す。
【０１５７】
【表５】

【０１５８】
【発明の効果】
本発明のＰＨＡの製造方法においては、原料として、ω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸含む培地中で微生物を培養し、対応する３−ヒドロキシ−ω−｛［（置換フェニル）メチル］スルファニル｝アルカン酸ユニットを含む新規な生分解性ＰＨＡが効率的に製造される。本発明のＰＨＡの側鎖における芳香環上には、種々な基を置換し、新たな特性の導入がなされ、機能性ポリマーとして有用なポリヒドロキシアルカノエートであり、デバイス材料や医薬材料等の各分野への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られたＰＨＡについて測定された¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【図２】実施例１で得られたＰＨＡについて測定された¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【図３】実施例１１で得られたＰＨＡについて測定された¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャートを示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a polyhydroxyalkanoate (PHA) containing a novel structural unit and a method for producing the same. More specifically, a novel biodegradable PHA containing a 3-hydroxyalkanoic acid unit having a [(substituted phenyl) methyl] sulfanyl group at the end of the side chain, and a microorganism capable of producing PHA and accumulating it in the cells And a alkanoic acid having a (phenylmethyl) sulfanyl group having substitution on the benzene ring at the terminal, as a raw material.
[0002]
[Prior art]
Until now, it has been reported that many microorganisms produce poly-3-hydroxybutyric acid (hereinafter abbreviated as PHB) or other PHA and accumulate it in the microbial cells ("Biodegradable Plastic Handbook", biodegradation). Edited Plastic Research Group, NTS, P178-197 (1995)). These polymers can be used for production of various products by melt processing or the like, as with conventional plastics. Furthermore, because it is biodegradable, it has the advantage of being completely degraded by microorganisms in nature, so it remains in the natural environment and causes pollution like many conventional synthetic polymer compounds. There is no. Moreover, it is excellent in biocompatibility and is expected to be applied as a soft part material for medical use.
[0003]
Thus, it is known that a microorganism-produced PHA can have various compositions and structures depending on the type of microorganism used for production, medium composition, culture conditions, and the like. From such a viewpoint, research on the control of such composition and structure has been made. For example, Alcaligenes eutropus H16 strain (Alcaligenes eutropus H16, ATCC No. 17699) and its mutant strains can be obtained by changing the substrate during the cultivation thereof, thereby allowing 3-hydroxybutyric acid (hereinafter abbreviated as 3HB) and 3-hydroxy It has been reported that copolymers with herbic acid (hereinafter abbreviated as 3HV) are produced in various composition ratios (JP-A-6-15604, JP-A-7-14352, JP-A-8). -19227 publication etc.).
[0004]
In addition, Patent Publication No. 2642937 discloses a 3-hydroxyalkanoate having 6 to 12 carbon atoms by giving an acyclic aliphatic hydrocarbon as a substrate to Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 (Pseudomonas oleovorans ATCC 29347). The production of PHA as monomer units is disclosed.
[0005]
Japanese Patent Laid-Open No. 5-74492 discloses microorganisms of the genus Methylobacterium sp., Paracoccus sp., Alcaligenes sp., Pseudomonas sp. A method for producing a copolymer of 3HB and 3HV by contacting with 3 to 7 primary alcohols is disclosed.
[0006]
JP-A-5-93049 and JP-A-7-265065 disclose two components of 3HB and 3-hydroxyhexanoic acid by culturing Aeromonas caviae using oleic acid or olive oil as a substrate. It is disclosed to produce a copolymer.
[0007]
In JP-A-9-191893, Comamonas acidovorans IFO 13852 (Comamonas acidovorans IFO 13852) is obtained by culturing 3HB and 4-hydroxybutyric acid by culturing using gluconic acid and 1,4-butanediol as substrates. It is disclosed to produce polyester with monomer units.
[0008]
Furthermore, it has been reported that certain microorganisms produce PHA into which various substituents such as unsaturated hydrocarbons, ester groups, allyl groups, cyano groups, halogenated hydrocarbons, and epoxides are introduced. Attempts have also been made to improve the physical properties of microorganism-produced PHA by such a technique. For example, in Makromol. Chem., 191, 1957-1965, (1990), Macromolecules, 24, 5256-5260, (1991), Chirality, 3, 492-494, (1991), Pseudomonas oleovorans is 3-hydroxy It has been reported to produce PHA containing monomer units of -5-phenylvaleric acid (hereinafter abbreviated as 3HPV), including 3HPV
Changes in polymer physical properties, which are thought to be caused by this, are recognized.
[0009]
In addition, among PHAs in which a substituent is introduced into the side chain, development of PHA having a phenoxy group in the side chain has been active recently.
[0010]
In Macromol. Chem. Phys., 195, 1665-1672 (1994), Pseudomonas oleovorans was developed from 11-phenoxyundecanoic acid to 3-hydroxy-5-phenoxyvaleric acid and 3-hydroxy-9-phenoxy. It has been reported to produce PHA containing nonanoic acid as a unit.
[0011]
Macromolecules, 29, 3432-3435 (1996), using Pseudomonas oleovorans, 3-hydroxy-4-phenoxybutyric acid and 3-hydroxy-6-phenoxyhexanoic acid from 6-phenoxyhexanoic acid. PHA containing units as units from 8-phenoxyoctanoic acid to PHA containing 3-hydroxy-4-phenoxybutyric acid, 3-hydroxy-6-phenoxyhexanoic acid and 3-hydroxy-8-phenoxyoctanoic acid as units It has been reported that PHA containing 3-hydroxy-5-phenoxyvaleric acid and 3-hydroxy-7-phenoxyheptanoic acid as units is produced from phenoxyundecanoic acid, respectively.
[0012]
Can. J. Microbiol., 41, 32-43 (1995) uses Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 strain and Pseudomonas putida KT2422 strain, using octanoic acid and 6- (4- Cyanophenoxy) hexanoic acid or 6- (p-nitrophenoxy) hexanoic acid as a substrate, 3-hydroxy-6- (4-cyanophenoxy) hexanoic acid or 3-hydroxy-6- (4-nitrophenoxy) hexanoic acid It has been reported to produce PHA containing as monomer units.
[0013]
In addition, among PHAs in which substituents are introduced into the side chain, PHA having sulfide type (-S-) sulfur atoms in the side chain is described in Macromolecules., 32, 8315-8318 (1999) as Pseudomonas. Using Ptudomonas putida 27N01, octanoic acid and 11- (phenylsulfanyl) undecanoic acid as substrates, 3-hydroxy-5- (phenylsulfanyl) valeric acid and 3-hydroxy-7- (phenylsulfanyl) It has been reported to produce PHA containing heptanoic acid as a monomer unit. However, at that time, Pseudomonas putida 27N01 strain is pre-cultured in advance in a medium containing only octanoic acid as a growth substrate, and the culture solution is inoculated into a medium containing only 11- (phenylsulfanyl) undecanoic acid as a substrate. The method is used.
[0014]
Furthermore, Polymer Preprints, Japan Vol. 49, No. 5, 1034 (2000) uses Pseudomonas putida 27N01 strain and 3-hydroxy (hydroxyphenyl) sulfanyl] undecanoic acid as a substrate. It has been reported to produce PHA consisting of two monomer units of -5-[(phenylmethyl) sulfanyl] valeric acid and 3-hydroxy-7-[(phenylmethyl) sulfanyl] heptanoic acid. In this case, however, Pseudomonas putida 27N01 is pre-cultured in a medium containing only octanoic acid as a growth substrate, and inoculated into a medium containing only 11-[(phenylmethyl) sulfanyl] undecanoic acid using the culture solution as a substrate. Method is used.
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
Of these PHAs having functional groups on their side chains, focusing on PHA containing a 3-hydroxy-ω-[(phenylmethyl) sulfanyl] alkanoic acid unit, the biosynthesis of one example mentioned above is reported. There is only there.
[0016]
A PHA containing a 3-hydroxy-ω-{[(substituted phenyl) methyl] sulfanyl} alkanoic acid unit that substitutes various functional groups on the benzene ring of the terminal (phenylmethyl) sulfanyl group is As such, it is a PHA having new functionality, and is expected to be improved in physical properties, can be expanded to fields that could not be applied so far, and development of an efficient manufacturing method is desired.
[0017]
The present invention solves the above-mentioned problems, and an object of the present invention is to provide a novel polyhydroxyalkanoate containing a unit having a sulfide (-S-) structure in the side chain, and an efficient production method thereof. There is. More specifically, the object of the present invention is mainly to use a 3-hydroxy-ω-{[(substituted phenyl) methyl] sulfanyl} alkanoic acid unit having a [(substituted phenyl) methyl] sulfanyl group at the end of the side chain. It is an object to provide a novel PHA molecule as a component and an efficient production method thereof.
[0018]
[Means for Solving the Problems]
The outline of the present invention is as follows.
[0019]
That is, the polyhydroxyalkanoate of the present invention has the following general formula (1):
[0020]
Embedded image

[0021]
Wherein R is a halogen atom, CN, NO ₂ , COOR ', SO ₂ R ″ (where R ′ is H, Na, K, CH _Three , C ₂ H _Five R ″ represents OH, a halogen atom, ONa, OK, OCH _Three , OC ₂ H _Five And x represents any integer selected from 1 to 8 and can take one or more values in the polymer). A polyhydroxyalkanoate characterized in that it contains units in the polymer molecule.
[0022]
In addition to the unit represented by the general formula (1), the polyhydroxyalkanoate of the present invention includes:
The following general formula (2):
[0023]
Embedded image

[0024]
(Wherein y represents an arbitrary integer selected from 0 to 8 and can take one or more values in the polymer),
Alternatively, the following general formula (3):
[0025]
Embedded image

[0026]
(Wherein z represents an arbitrary integer selected from 3 and 5 and can take one or more values in the polymer), at least among 3-hydroxyalk-5-enoic acid units represented by One kind may be contained in the polymer molecule. The number average molecular weight of the polymer molecule is in the range of 5000 to 300000.
[0027]
The PHA of the present invention having the above configuration includes, for example, the following chemical formula (4):
[0028]
Embedded image

[0029]
The polyhydroxyalkanoate characterized by including the 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit shown by these is contained.
Or the following chemical formula (5):
[0030]
Embedded image

[0031]
The polyhydroxyalkanoate characterized by including the 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit shown by these is contained.
[0032]
The present invention also provides:
The following general formula (6):
[0033]
Embedded image

[0034]
Wherein R is a halogen atom, CN, NO ₂ , COOR ', SO ₂ R ″ (where R ′ is H, Na, K, CH _Three , C ₂ H _Five R ″ represents OH, a halogen atom, ONa, OK, OCH _Three , OC ₂ H _Five In a medium containing at least one compound represented by the following formula: x represents an integer selected from 1 to 8) Having a step of culturing a microorganism having an alkanoate-producing ability,
The following general formula (1):
[0035]
Embedded image

[0036]
Wherein R is a halogen atom, CN, NO ₂ , COOR ', SO ₂ R ″ (where R ′ is H, Na, K, CH _Three , C ₂ H _Five R ″ represents OH, a halogen atom, ONa, OK, OCH _Three , OC ₂ H _Five And x represents any integer selected from 1 to 8 and can take one or more values in the polymer). This is a method for producing a polyhydroxyalkanoate containing a unit in a molecule.
[0037]
The polyhydroxyalkanoate produced by the method of the present invention, in addition to the unit represented by the general formula (1),
The following general formula (2):
[0038]
Embedded image

[0039]
(Wherein y represents an arbitrary integer selected from 0 to 8 and can take one or more values in the polymer),
Alternatively, the following general formula (3):
[0040]
Embedded image

[0041]
(Wherein z represents an arbitrary integer selected from 3 and 5 and can take one or more values in the polymer), at least among 3-hydroxyalk-5-enoic acid units represented by One kind may be contained in the polymer molecule.
[0042]
In the method for producing PHA of the present invention, the medium used in the culturing step can contain polypeptone. Or the said culture medium utilized in a culture | cultivation process can contain the yeast extract. Further, the medium used in the culturing step may contain saccharides. In this case, the saccharides contained in the medium are glyceraldehyde, erythrose, arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, fructose, glycerol, erythritol, xylitol, gluconic acid, glucuronic acid, galacturonic acid, maltose, sucrose, lactose. Preferably, the compound is one or more compounds selected from the group consisting of:
[0043]
In addition, in the method for producing PHA of the present invention, the medium used in the culturing step may contain an organic acid or a salt thereof. In this case, the organic acid or salt thereof contained in the medium may be one or more compounds selected from the group consisting of pyruvic acid, malic acid, lactic acid, citric acid, succinic acid, and salts thereof. preferable. Or the said culture medium utilized in a culture | cultivation process can also contain the amino acid or its salt. For example, the amino acid or salt thereof contained in the medium is preferably one or more compounds selected from the group consisting of glutamic acid, aspartic acid, or salts thereof.
[0044]
In some cases, in the method for producing PHA of the present invention, the medium used in the culturing step may contain a linear alkanoic acid having 4 to 12 carbon atoms or a salt thereof.
[0045]
In the method for producing PHA of the present invention, the microorganism can be cultured in two or more stages. In this case, it is preferable that a nitrogen source is not contained in the culture medium in the second and subsequent cultures.
[0046]
Furthermore, in the method for producing PHA of the present invention, when culturing the microorganism in two or more stages,
(Step 1-1) The following general formula (6):
[0047]
Embedded image

[0048]
Wherein R is a halogen atom, CN, NO ₂ , COOR ', SO ₂ R ″ (where R ′ is H, Na, K, CH _Three , C ₂ H _Five R ″ represents OH, a halogen atom, ONa, OK, OCH _Three , OC ₂ H _Five And x represents an arbitrary integer selected from 1 to 8), and a medium containing polypeptone In the process of culturing a microorganism having polyhydroxyalkanoate-producing ability,
(Step 1-2) A step of further culturing the microorganism cultured in step 1-1 in a medium containing at least one compound represented by the general formula (6) and containing an organic acid or a salt thereof. It can be set as the manufacturing method which has these. At that time, the organic acid or salt thereof contained in the medium used in Step 1-2 is one or more selected from the group consisting of pyruvic acid, malic acid, lactic acid, citric acid, succinic acid, and salts thereof. It is preferable that it is a compound of these. In addition, it is more preferable that the nitrogen source is not contained in the culture medium utilized at the said process 1-2.
[0049]
Furthermore,
(Step 1-3) The following general formula (6):
[0050]
Embedded image

[0051]
Wherein R is a halogen atom, CN, NO ₂ , COOR ', SO ₂ R ″ (where R ′ is H, Na, K, CH _Three , C ₂ H _Five R ″ represents OH, a halogen atom, ONa, OK, OCH _Three , OC ₂ H _Five And x is an arbitrary integer selected from 1 to 8), and a medium containing a saccharide. A step of culturing a microorganism capable of producing polyhydroxyalkanoate, followed by (step 1-4) comprising at least one compound represented by the general formula (6), and further comprising a saccharide The production method may further include a step of further culturing the microorganism cultured in step 1-3 in the medium. At that time, the saccharides contained in the respective media used in Step 1-3 and Step 1-4 are glyceraldehyde, erythrose, arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, fructose, glycerol, erythritol, xylitol, glucone. One or more compounds selected from the group consisting of acid, glucuronic acid, galacturonic acid, maltose, sucrose, and lactose are preferable. In addition, it is more preferable that the nitrogen source is not contained in the culture medium utilized at the said process 1-4.
[0052]
Examples of the method for producing PHA of the present invention include the following chemical formula (7):
[0053]
Embedded image

[0054]
Culturing the microorganism in a medium containing 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid represented by
The following chemical formula (4):
[0055]
Embedded image

[0056]
A method for producing a polyhydroxyalkanoate comprising producing a polyhydroxyalkanoate comprising a 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit represented by formula (1) in a polymer molecule. included.
[0057]
Examples of the method for producing PHA of the present invention include the following chemical formula (8):
[0058]
Embedded image

[0059]
Culturing the microorganism in a medium containing 4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid represented by
The following chemical formula (5):
[0060]
Embedded image

[0061]
A method for producing a polyhydroxyalkanoate comprising producing a polyhydroxyalkanoate comprising a 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit represented by formula (1) in a polymer molecule is also provided. included.
[0062]
In addition, in the method for producing PHA of the present invention, in addition to the culturing step, a step of recovering polyhydroxyalkanoate from cultured cells can be provided. In this case, the step of recovering polyhydroxyalkanoate is a culture step. A process for solubilizing polyhydroxyalkanoate accumulated in cultured microbial cells, or a method for separating polyhydroxyalkanoate accumulated in cultured microbial cells, It is desirable that the production method includes a step of disrupting microbial cells.
[0063]
On the other hand, in the method for producing the PHA of the present invention that can take the various configurations described above, the microorganism to be used may be any microorganism as long as it can produce the PHA of the present invention by the culture method. Among them, a microorganism belonging to the genus Pseudomonas is particularly preferable. For example, the microorganisms belonging to the genus Pseudomonas are Pseudomonas chicoryai YN2 strain (Pseudomonas cichorii YN2; FERM BP-7735), Pseudomonas chicoryai strain H45 (Pseudomonas cichorii H45; FERM BP-1637) More preferably, the microorganism is selected from (Pseudomonas jessenii P161; FERM BP-7376).
[0064]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The novel polyhydroxyalkanoate of the present invention has a sulfide structure (-S-) and the aromatic ring structure in its side chain in the monomer unit of the hydroxyalkanoic acid contained, and has been known so far by this structure. It has significantly different physicochemical properties from some microbially produced polyhydroxyalkanoates. The novel polyhydroxyalkanoate of the present invention is used, for example, in a medium containing a growth substrate in addition to a microorganism having PHA production ability in addition to ω-{[(substituted phenyl) methyl] sulfanyl} alkanoic acid as a raw material. A step of culturing, a step of recovering a polyhydroxyalkanoate containing a unit having a [(substituted phenyl) methyl] sulfanyl group at the end of a side chain, which is produced by a microorganism in the culturing step and accumulates in the cell. It is manufactured through steps. In addition, PHA produced by such microorganisms includes all units of 3-hydroxyalkanoic acid unit including the unit represented by the general formula (1), and the 3-position carbon is an asymmetric carbon. It becomes R form and shows biodegradability.
[0065]
The halogen atom in the substituent R on the benzene ring in the general formula (1) and the general formula (6) includes fluorine, chlorine, and bromine.
[0066]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
[0067]
In the method for producing PHA of the present invention, the microorganism used for production of the target PHA containing the unit represented by the general formula (1) is ω-{[(substituted phenyl) represented by the general formula (6) of the raw material compound. When cultured in a medium containing [methyl] sulfanyl} alkanoic acid, PHA containing a 3-hydroxyalkanoic acid unit having a [(substituted phenyl) methyl] sulfanyl group at the corresponding side chain end is produced and accumulated in the cell. Any microorganism may be used as long as it is a microorganism. For example, microorganisms belonging to the genus Pseudomonas having the ability to produce PHA can be mentioned. Examples of suitable microorganisms belonging to the genus Pseudomonas include Pseudomonas chicoryii YN2 (Pseudomonas cichorii YN2; FERM BP-7735), Pseudomonas chicoryii H45 (Pseudomonas cichorii H45; FERM BP-7374), Pseudomonas cichorii H45; Examples include three strains of Jesseny P161 strain (Pseudomonas jessenii P161; FERM BP-7376). These three types of microorganisms were first deposited in Japan under the name of the applicant of the present application as the depositor, and then transferred from the original deposit to a deposit based on the Budapest Treaty. The Institute of Biotechnology, National Institute of Biotechnology (NIBH) has been given the same accession number, and is currently deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary. Moreover, it is a microorganism already described in Japanese Patent Application No. 11-371863 as a novel strain having PHA-producing ability.
[0068]
The mycological properties of the YN2 strain, H45 strain and P161 strain are shown below.
[0069]
<Mycological properties of YN2 strain>
(1) Morphological properties
Cell shape and size: Neisseria gonorrhoeae, 0.8 μm × 1.5-2.0 μm
Cell polymorphism: None
Motility: Yes
Sporulation: None
Gram staining: Negative
Colony shape: Circular, smooth all edges, low convex, smooth surface, gloss, translucent
(2) Physiological properties
Catalase: positive
Oxidase: positive
O / F test: Oxidized type (non-fermentable)
Nitrate reduction: Negative
Indole production: Positive
Glucose acidification: Negative
Arginine dihydrolase: Negative
Urease: Negative
Esculin hydrolysis: Negative
Gelatin hydrolysis: Negative
β-galactosidase: negative
Fluorescent dye production on King's B agar: Positive
Growth with 4% NaCl: Positive (weak growth)
Accumulation of poly-β-hydroxybutyric acid: negative (*)
Tween 80 hydrolysis: positive
* Judged by staining nutrient agar culture colonies with Sudan Black.
(3) Substrate utilization ability
Glucose: Positive
L-arabinose: positive
D-mannose: negative
D-mannitol: negative
N-acetyl-D-glucosamine: negative
Maltose: Negative
Potassium gluconate: positive
n-Capric acid: Positive
Adipic acid: Negative
dl-malic acid: positive
Sodium citrate: positive
Phenyl acetate: positive
<Mycological properties of H45 strain>
(1) Morphological properties
Cell shape and size: Neisseria gonorrhoeae, 0.8 μm × 1.0-1.2 μm
Cell polymorphism: None
Motility: Yes
Sporulation: None
Gram staining: Negative
Colony shape: Round, smooth all edges, low convex, smooth surface, gloss, cream
(2) Physiological properties
Catalase: positive
Oxidase: positive
O / F test: Oxidized type
Nitrate reduction: Negative
Indole production: Negative
Glucose acidification: Negative
Arginine dihydrolase: Negative
Urease: Negative
Esculin hydrolysis: Negative
Gelatin hydrolysis: Negative
β-galactosidase: negative
Fluorescent dye production on King's B agar: Positive
Growth with 4% NaCl: Negative
Accumulation of poly-β-hydroxybutyric acid: negative
(3) Substrate utilization ability
Glucose: Positive
L-arabinose: negative
D-mannose: positive
D-mannitol: positive
N-acetyl-D-glucosamine: positive
Maltose: Negative
Potassium gluconate: positive
n-Capric acid: Positive
Adipic acid: Negative
dl-malic acid: positive
Sodium citrate: positive
Phenyl acetate: positive
[0070]
<Mycological properties of P161 strain>

(2) Physiological properties
Catalase: positive
Oxidase: positive
O / F test: Oxidized type
Nitrate reduction: Positive
Indole production: Negative
Glucose acidification: Negative
Arginine dihydrolase: Positive
Urease: Negative
Esculin hydrolysis: Negative
Gelatin hydrolysis: Negative
β-galactosidase: negative
Fluorescent dye production on King's B agar: Positive
(3) Substrate utilization ability
Glucose: Positive
L-arabinose: positive
D-mannose: positive
D-mannitol: positive
N-acetyl-D-glucosamine: positive
Maltose: Negative
Potassium gluconate: positive
n-Capric acid: Positive
Adipic acid: Negative
dl-malic acid: positive
Sodium citrate: positive
Phenyl acetate: positive
[0071]
(Culture process)
The method for producing PHA according to the present invention comprises a microorganism having the PHA producing ability described above in a medium containing ω-{[(substituted phenyl) methyl] sulfanyl} alkanoic acid represented by the general formula (6) as a raw material. By culturing, PHA containing a 3-hydroxyalkanoic acid unit having a (substituted phenylmethyl) sulfanyl group at the end of the side chain represented by the corresponding general formula (1) is produced and accumulated in the cell.
[0072]
For normal culture of microorganisms, for example, production of conserved strains, growth to ensure the number of bacteria and activity required for PHA production, a medium containing components necessary for the growth of microorganisms to be used is appropriately used. Select and use. For example, as long as it does not adversely affect the growth and survival of microorganisms, any kind of medium such as a general natural medium (meat medium, yeast extract, etc.) or a synthetic medium to which a nutrient source is added can be used. Culture conditions such as temperature, aeration, and agitation are appropriately selected according to the microorganism used.
[0073]
On the other hand, using the PHA-producing microorganism as described above, a PHA containing a 3-hydroxyalkanoic acid unit having a (substituted phenylmethyl) sulfanyl group at the end of the side chain, represented by the target general formula (1), is produced. In this case, in addition to the ω-{[(substituted phenyl) methyl] sulfanyl} alkanoic acid represented by the general formula (6), which corresponds to the monomer unit, as a raw material for PHA production as a medium, An inorganic medium containing at least a growth substrate can be used. The compound represented by the general formula (6) of the raw material is in the range of 0.01% to 1% (w / v), more preferably in the range of 0.02% to 0.2% (w / v) per medium. It is desirable to select an initial content rate. The water solubility of ω-{[(substituted phenyl) methyl] sulfanyl} alkanoic acid represented by the general formula (6) of the raw material is not necessarily good, but in the present invention, when the above microorganism is used, it is suspended in the medium. There is no problem even if it is clouded.
[0074]
In addition, in order to improve dispersibility, the compound represented by the general formula (6) of the raw material may be dissolved in a solvent such as 1-hexadecene or n-hexadecane or may be in the form of a fine suspension. It can also be added to the medium. In that case, the concentration of the solvent such as 1-hexadecene or n-hexadecane used needs to be 3% (v / v) or less with respect to the medium.
[0075]
It is preferable to add separately to the medium a growth substrate used by microorganisms for growth. As the growth substrate, nutrients such as yeast extract, polypeptone, and meat extract can be used. Furthermore, saccharides, organic acids generated as intermediates in the TCA cycle, organic acids or salts thereof, amino acids or salts thereof, linear alkanes having 4 to 12 carbon atoms, which are generated from the TCA cycle through one or two-stage biochemical reactions The acid or a salt thereof can be appropriately selected according to the strain to be used in consideration of its usefulness as a growth substrate.
[0076]
Of these various growth substrates, saccharides include glyceraldehyde, erythrose, arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, aldose such as fructose, alditols such as glycerol, erythritol, xylitol,
One or more compounds selected from aldonic acids such as gluconic acid, uronic acids such as glucuronic acid and galacturonic acid, disaccharides such as maltose, sucrose and lactose can be suitably used.
[0077]
Further, as the organic acid or a salt thereof, one or more compounds selected from the group consisting of pyruvic acid, malic acid, lactic acid, citric acid, succinic acid, or salts thereof can be suitably used. On the other hand, as the amino acid or a salt thereof, one or more compounds selected from the group consisting of glutamic acid, aspartic acid or salts thereof can be suitably used.
[0078]
Generally, among these various growth substrates, it is more preferable to use polypeptone or saccharide. These growth substrates coexisting with the raw material compound are usually in the range of 0.1% to 5% (w / v), more preferably in the range of 0.2% to 2% (w / v) per medium. It is desirable to select the content.
[0079]
As a culture method for producing and accumulating PHA in microorganisms, after sufficient growth, the cells are transferred to a medium restricted with a nitrogen source such as ammonium chloride, and a compound serving as a substrate of the target unit is added. Further culturing may improve productivity. For example, it is possible to adopt a multi-stage system in which a plurality of steps consisting of different culture conditions are connected.
[0080]
More specifically, as (step 1-1), the step of culturing a microorganism in a medium containing the compound represented by the general formula (6) and polypeptone as a growth substrate is performed from the late logarithmic growth phase to the stationary phase. Subsequently, the cells are once collected by centrifugation or the like, and then, as (step 1-2), the compound represented by the general formula (6) and the organic acid as exemplified above, which becomes a growth substrate Or a two-stage culture method in which a step of further culturing the cells of the microorganism cultured and grown in the preceding step 1-1 in a medium containing a salt thereof (preferably not containing a nitrogen source), or (step As 1-3), the process of culturing a microorganism in a medium containing a compound represented by the general formula (6) and a saccharide serving as a growth substrate is continued from the late logarithmic growth phase to the stationary phase, and the cells are once centrifuged. After collecting with Following (Step 1-4), the compound represented by the general formula (6) and a saccharide serving as a growth substrate were cultured and grown in Step 1-3 of the preceding stage in a medium containing no nitrogen source. It is more preferable to use a two-stage culture method or the like in which a process of culturing microorganism cells is performed. In this two-stage culture method, in the preceding stage, from the ω-{[(substituted phenyl) methyl] sulfanyl} alkanoic acid represented by the general formula (6) of the raw material, the corresponding side represented by the general formula (1) is provided. While producing a PHA containing a 3-hydroxyalkanoic acid unit having a [(substituted phenyl) methyl] sulfanyl group at the chain end, the cells were proliferated in advance, and in the latter stage, they were already cultured in a medium not containing a nitrogen source. The amount of PHA accumulated in the cells can be further increased by adopting a culture form in which the produced bacterial cells mainly produce PHA.
[0081]
In that case, the culture temperature should just be the temperature which said strain | stump | stock can grow favorably, For example, it selects in the range of 15-40 degreeC, Preferably it is 20-35 degreeC, More preferably, it is the range of 20 degreeC-30 degreeC. It is appropriate to do.
[0082]
In the culture, microorganisms to be used such as liquid culture and solid culture grow, and PHA containing the unit represented by the general formula (1) is produced from the compound represented by the general formula (6) contained in the medium. Any culture method can be used as long as it is a culture method. Furthermore, any type of batch culture, fed-batch culture, semi-continuous culture, continuous culture, etc. may be used as long as the raw material, growth substrate, and oxygen are appropriately supplied. For example, as a form of liquid batch culture, there are a method of supplying oxygen by shaking with a shake flask, and a method of supplying oxygen by stirring aeration using a jar fermenter.
[0083]
The inorganic medium used in the above culture method is a medium containing components necessary for the growth of microorganisms such as a phosphorus source (for example, phosphate), a nitrogen source (for example, ammonium salt, nitrate, etc.), and the like. Any material may be used, and examples thereof include MSB medium and M9 medium.
[0084]
For example, the composition of an inorganic salt medium: M9 medium used in Examples described later is shown below.
[0085]
[M9 medium]
Na ₂ HPO _Four 6.2g
KH ₂ PO _Four 3.0g
NaCl 0.5g
NH _Four Cl 1.0g
(PH 7.0 in 1 liter of medium)
[0086]
Furthermore, in order to achieve good growth and accompanying PHA production, for example, about 0.3% (v / v) of the following trace component solution is added to the above-described inorganic salt medium, and essential trace elements are added. It is necessary to compensate.
[0087]
[Minor component solution]
Nitrilotriacetic acid: 1.5 g;
MgSO _Four : 3.0 g;
MnSO _Four : 0.5 g;
NaCl: 1.0 g;
FeSO _Four : 0.1 g;
CaCl ₂ : 0.1 g;
CoCl ₂ : 0.1 g;
ZnSO _Four : 0.1 g;
CuSO ₂ : 0.1 g;
AlK (SO _Four ) ₂ : 0.1 g;
H _Three BO _Three : 0.1 g;
Na ₂ MoO _Four : 0.1 g;
NiCl ₂ : 0.1g
(PH 7.0 in 1 liter of solution)
[0088]
(PHA recovery process)
The microorganism used in the present invention produces PHA containing a 3-hydroxyalkanoic acid unit having a [(substituted fanyl) methyl] sulfanyl group at the end of the side chain represented by the general formula (1) by such a culture method. And accumulate in the fungus body. Therefore, in the method for producing PHA of the present invention, a step of recovering the target PHA from the cultured cells after culturing is provided.
[0089]
For recovering PHA from the cells, a means for separating and recovering solubilized PHA from insoluble components derived from cells using a solvent extraction method can be used. Usually performed chloroform extraction is the simplest, but in addition to chloroform, dichloromethane, dioxane, tetrahydrofuran, acetonitrile, acetone, etc. may be used. In an environment where organic solvents are difficult to use, only PHA as an insoluble fraction can be obtained by solubilizing / removing intracellular components other than PHA by treatment with a surfactant such as SDS and enzyme treatment such as lysozyme. It is also possible to adopt a method of collecting In addition, treatment to destroy microbial cells such as ultrasonic crushing method, homogenizer method, pressure crushing method, bead impact method, grinding method, crushing method, freezing and thawing method, etc. Separation and recovery methods can also be employed.
[0090]
In addition, in the method for producing PHA of the present invention, a step of culturing microorganisms, a step of producing PHA in microorganisms to be cultured and accumulating them in the cells, and recovering PHA from the cells after the cultivation. The process is not limited to the above method.
[0091]
The microorganism-produced PHA produced by the method of the present invention is biosynthesized via a fatty acid synthesis system using a growth substrate added to the medium in addition to the unit of the general formula (1). It may contain a 3-hydroxyalkanoic acid unit represented by (2) or a 3-hydroxyalk-5-enoic acid unit represented by the general formula (3). The 3-hydroxyalkanoic acid unit included in each of the 3-hydroxyalkanoic acid units is an asymmetric carbon at the 3-position, but the absolute configuration is also the R-form, and of course maintains its biodegradability. That's it. In addition to the (phenylmethyl) sulfanyl group moiety in the unit of the general formula (1), by having various substituents on the benzene ring, new physicochemical properties are added to the polymer itself, and physical properties of Improvements are expected and expansion into fields that could not be applied so far can be expected.
[0092]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. Although these examples are examples of the best mode of the present invention, the present invention is not limited to these examples. In the following, “%” is based on weight unless otherwise indicated.
[0093]
3-Hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid monomer unit-containing process for producing polyhydroxyalkanoate
[0094]
Example 1
Inoculated Pseudomonas chicoryai YN2 strain into 200 ml of M9 medium containing 0.5% polypeptone (distributor: Wako Pure Chemical Industries) and 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid And cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0095]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 106 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0096]
The average molecular weight of the obtained PHA was evaluated by gel permeation chromatography (GPC; Tosoh HLC-8220, column; Tosoh TSK-GEL Super HM-H, solvent: chloroform, converted to polystyrene). As a result, the number average molecular weight was Mn = 32000, and the mass average molecular weight was Mw = 96000.
[0097]
Furthermore, in order to specify the structure of the obtained PHA, NMR analysis was performed under the following conditions.
<Measurement equipment> FT-NMR: Bruker DPX400 resonance frequency: ¹ H = 400 MHz, ¹³ C = 100 MHz <Measurement conditions> Measurement nuclide: ¹ H, ¹³ C solvent used: CDCl _Three Measurement temperature: room temperature measured in Figure 1 ¹ An H-NMR spectrum chart is shown, and Table 1 shows the identification results. Figure 2 shows the measured ¹³ A C-NMR spectrum chart is shown, and Table 2 shows the identification results.
[0098]
[Table 1]

[0099]
[Table 2]

[0100]
From the results shown in Table 1 and Table 2, the PHA contains 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid monomer unit, and in addition, as other monomer units, It also includes 3-hydroxyalkanoic acid having 4 to 12 carbon atoms, such as 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyvaleric acid, or 3-hydroxyalkenoic acid.
The following chemical formula (9):
[0101]
Embedded image

[0102]
It was confirmed that it is PHA shown in 1. Also, ¹ From the integral ratio of the 1 H-NMR spectrum, the obtained PHA was found to contain 76.7 mol% of 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit.
[0103]
(Example 2)
Pseudomonas chicoryai YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.1% nonanoic acid and 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid, and 30 strokes at 30 ° C. Cultured with shaking at / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0104]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 89 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0105]
The obtained PHA was subjected to NMR analysis and measurement of average molecular weight under the same conditions as in Example 1. From the results of NMR analysis, the PHA of this example also contains 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit, and in addition, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvalid It contains a monomer unit of 4-hydroxyalkanoic acid having 4 to 12 carbon atoms, such as valeric acid, or 3-hydroxyalkenoic acid, and thus the constitution thereof is confirmed to be PHA represented by the above chemical formula (9). It was. The PHA in this example is ¹ From the integral ratio of the 1 H-NMR spectrum, it was also found that 27.0 mol% of 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit was contained.
[0106]
(Example 3)
Pseudomonas chicoryi strain YN2 was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% yeast extract (manufactured by DIFCO) and 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid. The shaking culture was performed at 125 ° C./min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0107]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 69 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0108]
The obtained PHA was subjected to NMR analysis and measurement of average molecular weight under the same conditions as in Example 1. From the results of NMR analysis, the PHA of this example also contains 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit, and in addition, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxy It contains a monomer unit of 4-hydroxyalkanoic acid having 4 to 12 carbon atoms, such as valeric acid, or 3-hydroxyalkenoic acid. Therefore, the constitution is confirmed to be PHA represented by the above chemical formula (9). It was done. The PHA in this example is ¹ From the integral ratio of the 1 H-NMR spectrum, it was also found that 76.7 mol% of 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit was contained.
[0109]
(Example 4)
Pseudomonas chicoryai YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% sodium glutamate and 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid, and 125 strokes at 30 ° C. Cultured with shaking at / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0110]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 68 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0111]
The obtained PHA was subjected to NMR analysis and measurement of average molecular weight under the same conditions as in Example 1. From the results of NMR analysis, the PHA of this example also contains 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit, and in addition, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxy It contains a monomer unit of 4-hydroxyalkanoic acid having 4 to 12 carbon atoms, such as valeric acid, or 3-hydroxyalkenoic acid. Therefore, the constitution is confirmed to be PHA represented by the above chemical formula (9). It was done. The PHA in this example is ¹ From the integration ratio of the H-NMR spectrum, it was also found that 90.3 mol% of 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit was contained.
[0112]
(Example 5)
Pseudomonas chicoryai YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% D-glucose and 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid, Shake culture at stroke / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation and contained 0.5% D-glucose, 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid, and a nitrogen source (NH _Four The suspension was resuspended in 200 ml of M9 medium not containing Cl), and further cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0113]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 164 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0114]
The obtained PHA was subjected to NMR analysis and measurement of average molecular weight under the same conditions as in Example 1. From the results of NMR analysis, the PHA of this example also contains 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit, and in addition, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvalid It contains a monomer unit of 4-hydroxyalkanoic acid having 4 to 12 carbon atoms, such as valeric acid, or 3-hydroxyalkenoic acid, and thus the constitution thereof is confirmed to be PHA represented by the above chemical formula (9). It was. The PHA in this example is ¹ From the integral ratio of the 1 H-NMR spectrum, it was also found that the compound contained 85.9 mol% of 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit.
[0115]
(Example 6)
Pseudomonas chicoryai H45 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% D-glucose and 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid, Shake culture at stroke / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation and contained 0.5% D-glucose, 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid, and a nitrogen source (NH _Four The suspension was resuspended in 200 ml of M9 medium not containing Cl), and further cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0116]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 138 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0117]
The obtained PHA was subjected to NMR analysis and measurement of average molecular weight under the same conditions as in Example 1. From the results of NMR analysis, the PHA of this example also contains 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit, and in addition, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvalid It contains a monomer unit of 4-hydroxyalkanoic acid having 4 to 12 carbon atoms, such as valeric acid, or 3-hydroxyalkenoic acid, and thus the constitution thereof is confirmed to be PHA represented by the above chemical formula (9). It was. The PHA in this example is ¹ From the integration ratio of the H-NMR spectrum, it was also found that 90.7 mol% of 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit was contained.
[0118]
(Example 7)
Pseudomonas jessenii P161 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% D-glucose and 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid, Shake culture at stroke / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation and contained 0.5% D-glucose, 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid, and a nitrogen source (NH _Four The suspension was resuspended in 200 ml of M9 medium not containing Cl), and further cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0119]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 138 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0120]
The obtained PHA was subjected to NMR analysis and measurement of average molecular weight under the same conditions as in Example 1. From the results of NMR analysis, the PHA of this example also contains 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit, and in addition, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvalid It contains a monomer unit of 4-hydroxyalkanoic acid having 4 to 12 carbon atoms, such as valeric acid, or 3-hydroxyalkenoic acid, and thus the constitution thereof is confirmed to be PHA represented by the above chemical formula (9). It was. The PHA in this example is ¹ From the integral ratio of the 1 H-NMR spectrum, it was also found that 88.5 mol% of 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit was contained.
[0121]
(Example 8)
Inoculated Pseudomonas chicoryai YN2 strain into 200 ml of M9 medium containing 0.5% polypeptone (distributor: Wako Pure Chemical Industries) and 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid And cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation and contained 0.5% sodium pyruvate, 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid, and a nitrogen source (NH _Four The suspension was resuspended in 200 ml of M9 medium not containing Cl), and further cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0122]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 125 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0123]
The obtained PHA was subjected to NMR analysis and measurement of average molecular weight under the same conditions as in Example 1. From the results of NMR analysis, the PHA of this example also contains 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit, and in addition, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvalid It contains a monomer unit of 4-hydroxyalkanoic acid having 4 to 12 carbon atoms, such as valeric acid, or 3-hydroxyalkenoic acid, and thus the constitution thereof is confirmed to be PHA represented by the above chemical formula (9). It was. The PHA in this example is ¹ From the integral ratio of the 1 H-NMR spectrum, it was also found to contain 89.5 mol% of 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit.
[0124]
Example 9
Inoculate Pseudomonas chicoryai H45 strain into 200 ml of M9 medium containing 0.5% polypeptone (distributor: Wako Pure Chemical Industries) and 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid And cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation and contained 0.5% sodium pyruvate, 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid, and a nitrogen source (NH _Four The suspension was resuspended in 200 ml of M9 medium not containing Cl), and further cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0125]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 154 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0126]
The obtained PHA was subjected to NMR analysis and measurement of average molecular weight under the same conditions as in Example 1. From the results of NMR analysis, the PHA of this example also contains 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit, and in addition, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvalid It contains a monomer unit of 4-hydroxyalkanoic acid having 4 to 12 carbon atoms, such as valeric acid, or 3-hydroxyalkenoic acid, and thus the constitution thereof is confirmed to be PHA represented by the above chemical formula (9). It was. The PHA in this example is ¹ From the integral ratio of the 1 H-NMR spectrum, it was also found that 97.9 mol% of 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit was contained.
[0127]
(Example 10)
Inoculated Pseudomonas jessenii P161 strain into 200 ml of M9 medium containing 0.5% polypeptone (distributor: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid And cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation and contained 0.5% sodium pyruvate, 0.1% 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid, and a nitrogen source (NH _Four The suspension was resuspended in 200 ml of M9 medium not containing Cl), and further cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0128]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 158 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0129]
The obtained PHA was subjected to NMR analysis and measurement of average molecular weight under the same conditions as in Example 1. From the results of NMR analysis, the PHA of this example also contains 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit, and in addition, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvalid It contains a monomer unit of 4-hydroxyalkanoic acid having 4 to 12 carbon atoms, such as valeric acid, or 3-hydroxyalkenoic acid, and thus the constitution thereof is confirmed to be PHA represented by the above chemical formula (9). It was. The PHA in this example is ¹ From the integral ratio of the 1 H-NMR spectrum, it was also found that 91.6 mol% of 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit was contained.
[0130]
Table 3 shows the cell dry weight, polymer dry weight, polymer dry weight / cell dry weight ratio in Examples 1 to 10 above, and 3-hydroxy-5-{[(4-fluoro The content ratio (mol%) of (phenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit (3HFBzyTV) unit is shown collectively.
[0131]
[Table 3]

[0132]
Process for producing polyhydroxyalkanoates containing 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid monomer units
[0133]
(Example 11)
Pseudomonas chicoryai YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% yeast extract (manufactured by DIFCO) and 0.1% 4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid at 30 ° C. And shaking culture at 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0134]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 41 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0135]
The average molecular weight of the obtained PHA was evaluated by gel permeation chromatography (GPC; Tosoh HLC-8220, column; Tosoh TSK-GEL Super HM-H, solvent: chloroform, converted to polystyrene). As a result, the number average molecular weight was Mn = 15300, and the mass average molecular weight was Mw = 37100.
[0136]
Furthermore, in order to specify the structure of the obtained PHA, NMR analysis was performed under the following conditions.

Figure 3 shows the measured ¹ An H-NMR spectrum chart is shown, and Table 4 shows the identification results.
[0137]
[Table 4]

[0138]
From the results shown in Table 4, the PHA contains 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid monomer unit. In addition, as other monomer units, 3-hydroxybutyric acid is used. , 3-hydroxyalkanoic acid having 4 to 12 carbon atoms, such as 3-hydroxyvaleric acid, or 3-hydroxyalkenoic acid.
The following chemical formula (10):
[0139]
Embedded image

[0140]
It was confirmed that it is PHA shown in 1. The obtained PHA is ¹ From the integral ratio of the 1 H-NMR spectrum, it was found that 89.8 mol% of 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit was contained.
[0141]
Example 12
Pseudomonas chicoryai YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.1% nonanoic acid and 0.1% 4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid at 30 ° C., 125 strokes / Cultured with shaking for minutes. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0142]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 45 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0143]
The obtained PHA was subjected to NMR analysis and average molecular weight measurement under the same conditions as in Example 11. From the results of NMR analysis, the PHA of this example also contains a 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit, and in addition thereto, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvaleric acid And the like, and the monomer unit of 3-hydroxyalkanoic acid having 3 to 12 carbon atoms, such as 3-hydroxyalkanoic acid or 3-hydroxyalkenoic acid, was confirmed to be PHA represented by the above chemical formula (10). . It was also found that the PHA of this example contained 10.6 mol% of 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit.
[0144]
(Example 13)
Pseudomonas chicoryai YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% sodium glutamate and 0.1% 4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid, and 30 ° C., 125 strokes / Cultured with shaking for minutes. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0145]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 11 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0146]
The obtained PHA was subjected to NMR analysis and average molecular weight measurement under the same conditions as in Example 11. From the results of NMR analysis, the PHA of this example also contains a 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit, and in addition thereto, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvaleric acid And the like, and the monomer unit of 3-hydroxyalkanoic acid having 3 to 12 carbon atoms, such as 3-hydroxyalkanoic acid or 3-hydroxyalkenoic acid, was confirmed to be PHA represented by the above chemical formula (10). . The PHA in this example is ¹ From the integral ratio of the 1 H-NMR spectrum, it was also found that 84.1 mol% of 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit was contained.
[0147]
(Example 14)
Pseudomonas chicoryai YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% D-glucose and 0.1% 4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid, and 30 strokes at 125C. Cultured with shaking at / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation and contained 0.5% D-glucose, 0.1% 4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid, and a nitrogen source (NH _Four The suspension was resuspended in 200 ml of M9 medium not containing Cl), and further cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0148]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 153 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0149]
The obtained PHA was subjected to NMR analysis and average molecular weight measurement under the same conditions as in Example 11. From the results of NMR analysis, the PHA of this example also contains a 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit, and in addition thereto, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvaleric acid And the like, and the monomer unit of 3-hydroxyalkanoic acid having 3 to 12 carbon atoms, such as 3-hydroxyalkanoic acid or 3-hydroxyalkenoic acid, was confirmed to be PHA represented by the above chemical formula (10). . The PHA in this example is ¹ From the integral ratio of the 1 H-NMR spectrum, it was also found that 68.5 mol% of 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit was contained.
[0150]
(Example 15)
Pseudomonas chicoryai H45 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% polypeptone (distributor: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 0.1% 4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid. The culture was performed with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, and contained 0.5% sodium pyruvate, 0.1% 4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid, and a nitrogen source (NH _Four The suspension was resuspended in 200 ml of M9 medium not containing Cl), and further cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0151]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 38 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0152]
The obtained PHA was subjected to NMR analysis and average molecular weight measurement under the same conditions as in Example 11. From the results of NMR analysis, the PHA of this example also contains a 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit, and in addition thereto, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvaleric acid And the like, and the monomer unit of 3-hydroxyalkanoic acid having 3 to 12 carbon atoms, such as 3-hydroxyalkanoic acid or 3-hydroxyalkenoic acid, was confirmed to be PHA represented by the above chemical formula (10). . The PHA in this example is ¹ From the integral ratio of the 1 H-NMR spectrum, it was also found that 43.1 mol% of 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit was contained.
[0153]
(Example 16)
Pseudomonas jessenii P161 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% D-glucose and 0.1% 4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid, and 30 strokes at 125C. Cultured with shaking at / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation and contained 0.5% D-glucose, 0.1% 4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid, and a nitrogen source (NH _Four The suspension was resuspended in 200 ml of M9 medium not containing Cl), and further cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized. In addition, the weight of the lyophilized cells (the cell dry weight) was weighed.
[0154]
This freeze-dried cell pellet was suspended in 20 ml chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and then concentrated by a rotary evaporator. This concentrated solution was added to cold methanol to reprecipitate PHA. Further, only the precipitate was recovered, and then dried in vacuum, and then the dry weight (recovered amount) of the PHA polymer was weighed. In this example, 47 mg (dry weight) of PHA was obtained.
[0155]
The obtained PHA was subjected to NMR analysis and average molecular weight measurement under the same conditions as in Example 11. From the results of NMR analysis, the PHA of this example also contains a 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit, and in addition thereto, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvaleric acid And the like, and the monomer unit of 3-hydroxyalkanoic acid having 3 to 12 carbon atoms, such as 3-hydroxyalkanoic acid or 3-hydroxyalkenoic acid, was confirmed to be PHA represented by the above chemical formula (10). . The PHA in this example is ¹ From the integration ratio of the 1 H-NMR spectrum, it was also found that 48.7 mol% of 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit was contained.
[0156]
Table 5 shows the cell dry weight, polymer dry weight, polymer dry weight / cell dry weight ratio in Examples 11 to 16, and 3-hydroxy-4-{[(4-fluoro The content ratio (mol%) of the phenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit (3HFBzyTB) unit is shown collectively.
[0157]
[Table 5]

[0158]
【The invention's effect】
In the method for producing PHA of the present invention, a microorganism is cultured in a medium containing ω-{[(substituted phenyl) methyl] sulfanyl} alkanoic acid as a raw material, and the corresponding 3-hydroxy-ω-{[(substituted phenyl) A novel biodegradable PHA containing methyl] sulfanyl} alkanoic acid units is efficiently produced. The aromatic ring in the side chain of the PHA of the present invention is a polyhydroxyalkanoate which is useful as a functional polymer by substituting various groups and introducing new characteristics. Application to the field can be expected.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 measured for PHA obtained in Example 1 ¹ 1 shows an H-NMR spectrum chart.
FIG. 2 was measured for the PHA obtained in Example 1 ¹³ A C-NMR spectrum chart is shown.
FIG. 3 was measured for the PHA obtained in Example 11. ¹ 1 shows an H-NMR spectrum chart.

Claims (31)

The following general formula (1):

(In the formula, R represents a halogen atom, CN, NO ₂ , COOR ′, SO ₂ R ″ (where R ′ represents any one of H, Na, K, CH ₃ , C ₂ H ₅ , R '' Represents a group selected from OH, a halogen atom, ONa, OK, OCH ₃ , and OC ₂ H ₅ ), and x represents an arbitrary integer selected from 1 to 8 A polyhydroxyalkanoate characterized in that the polymer molecule contains a unit represented by the formula: In addition to the unit represented by the general formula (1),
The following general formula (2):

(Wherein y represents an arbitrary integer selected from 0 to 8 and can take one or more values in the polymer),
Alternatively, the following general formula (3):

(Wherein z represents an arbitrary integer selected from 3 and 5 and can take one or more values in the polymer), at least among 3-hydroxyalk-5-enoic acid units represented by The polyhydroxyalkanoate according to claim 1, wherein at least one kind is contained in the polymer molecule. The polyhydroxyalkanoate according to claim 1 or 2, wherein the number average molecular weight of the polymer molecule is in the range of 5000 to 300,000. The following chemical formula (4):

The polyhydroxyalkanoate according to any one of claims 1 to 3, comprising a 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit represented by the formula: The following general formula (5):

The polyhydroxyalkanoate according to any one of claims 1 to 3, comprising a 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit represented by: The following general formula (6):

(In the formula, R represents a halogen atom, CN, NO ₂ , COOR ′, SO ₂ R ″ (where R ′ represents any one of H, Na, K, CH ₃ , C ₂ H ₅ , R '' Represents a group arbitrarily selected from OH, a halogen atom, ONa, OK, OCH ₃ , and OC ₂ H ₅ ), and x is any group selected from 1 to 8 Represents an integer)
Having a step of culturing a microorganism having the ability to produce polyhydroxyalkanoate in a medium containing at least one compound represented by
The following general formula (1):

(In the formula, R represents a halogen atom, CN, NO ₂ , COOR ′, SO ₂ R ″ (where R ′ represents any one of H, Na, K, CH ₃ , C ₂ H ₅ , R '' Represents a group selected from OH, a halogen atom, ONa, OK, OCH ₃ , and OC ₂ H ₅ ), and x represents an arbitrary integer selected from 1 to 8 And a unit represented by the formula (1) which can take one or more values in the polymer). In addition to the unit represented by the general formula (1), the polyhydroxyalkanoate is
The following general formula (2):

(Wherein y represents an arbitrary integer selected from 0 to 8 and can take one or more values in the polymer),
Alternatively, the following general formula (3):

(Wherein z represents an arbitrary integer selected from 3 and 5 and may take one or more values in the polymer), at least among 3-hydroxyalk-5-enoic acid units represented by The production method according to claim 6, wherein at least one kind is contained in the polymer molecule. The production method according to claim 6 or 7, wherein the culture medium contains polypeptone. The production method according to claim 6 or 7, wherein the culture medium contains a yeast extract. The production method according to claim 6 or 7, wherein the medium contains saccharides. The saccharide contained in the medium is selected from the group consisting of glyceraldehyde, erythrose, arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, fructose, glycerol, erythritol, xylitol, gluconic acid, glucuronic acid, galacturonic acid, maltose, sucrose, and lactose. The production method according to claim 10, wherein the compound is one or more selected compounds. The production method according to claim 6 or 7, wherein the culture medium contains an organic acid or a salt thereof. The organic acid or salt thereof contained in the medium is one or more compounds selected from the group consisting of pyruvic acid, malic acid, lactic acid, citric acid, succinic acid, and salts thereof. The manufacturing method according to claim 12. The production method according to claim 6 or 7, wherein the medium contains an amino acid or a salt thereof. The production method according to claim 14, wherein the amino acid or a salt thereof contained in the medium is one or more compounds selected from the group consisting of glutamic acid, aspartic acid, and salts thereof. The production method according to claim 6 or 7, wherein the medium contains a linear alkanoic acid having 4 to 12 carbon atoms or a salt thereof. The method according to any one of claims 6 to 16, wherein the microorganism is cultured in at least two stages of culture. In the culture of the microorganism, the production method according to claim 17, wherein a nitrogen source is not contained in a medium in which the second and subsequent stages are cultured. Culture of the microorganisms
(Step 1-1) The following general formula (6):

(In the formula, R represents a halogen atom, CN, NO ₂ , COOR ′, SO ₂ R ″ (where R ′ represents any one of H, Na, K, CH ₃ , C ₂ H ₅ , R '' Represents a group selected from OH, a halogen atom, ONa, OK, OCH ₃ , and OC ₂ H ₅ ), and x represents an arbitrary integer selected from 1 to 8 To express)
A step of culturing a microorganism having the ability to produce polyhydroxyalkanoate in a medium containing at least one compound represented by the formula (1) and containing polypeptone;
(Step 1-2) A step of further culturing the microorganism cultured in step 1-1 in a medium containing at least one compound represented by the general formula (6) and containing an organic acid or a salt thereof. The manufacturing method of Claim 17 or 18 which has at least. The organic acid or salt thereof contained in the medium used in Step 1-2 is one or more compounds selected from the group consisting of pyruvic acid, malic acid, lactic acid, citric acid, succinic acid, and salts thereof. The manufacturing method according to claim 19, wherein: Culture of the microorganisms
(Step 1-3) The following general formula (6):

(In the formula, R represents a halogen atom, CN, NO ₂ , COOR ′, SO ₂ R ″ (where R ′ represents any one of H, Na, K, CH ₃ , C ₂ H ₅ , R '' Represents a group selected from OH, a halogen atom, ONa, OK, OCH ₃ , and OC ₂ H ₅ ), and x represents an arbitrary integer selected from 1 to 8 To express)
A step of culturing a microorganism having the ability to produce polyhydroxyalkanoate in a medium containing at least one kind of the compound represented by (1) and containing saccharides,
(Step 1-4) The method further comprises culturing the microorganism cultured in Step 1-3 in a medium containing at least one compound represented by the general formula (6) and containing a saccharide. The production method according to claim 17 or 18, wherein the culture is performed in at least two stages of culture. One type of saccharide selected from the group consisting of glyceraldehyde, erythrose, arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, fructose, glycerol, erythritol, xylitol, gluconic acid, glucuronic acid, galacturonic acid, maltose, sucrose, lactose 22. The production method according to 21, which is the above compound. The following chemical formula (7):

Culturing a microorganism in a medium containing 5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid represented by
The following chemical formula (4):

A polyhydroxyalkanoate comprising 3-hydroxy-5-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} valeric acid unit represented by the formula: is produced. Method for producing hydroxyalkanoate. The following chemical formula (8):

Culturing the microorganism in a medium containing 4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid represented by
The following chemical formula (5):

A polyhydroxyalkanoate containing a 3-hydroxy-4-{[(4-fluorophenyl) methyl] sulfanyl} butyric acid unit represented by the formula: is produced. Method for producing alkanoate. The production method according to any one of claims 6 to 24, further comprising a step of separating and collecting polyhydroxyalkanoate from the cultured microbial cells. The method according to claim 25, wherein the polyhydroxyalkanoate separation and recovery step includes a step of solubilizing and extracting polyhydroxyalkanoate accumulated in the cultured microbial cells with a solvent. The production method according to claim 26, wherein the solvent is at least one solvent selected from chloroform, dichloromethane, dioxane, tetrahydrofuran, acetonitrile, and acetone. 26. The method according to claim 25, wherein the polyhydroxyalkanoate separation and recovery step includes a step of disrupting microbial cells. The step of crushing the microbial cells is performed by any one of an ultrasonic crushing method, a homogenizer method, a pressure crushing method, a bead impact method, a grinding method, a crushing method, and a freeze-thawing method. 28. The production method according to 28. 30. The production method according to any one of claims 6 to 29, wherein the microorganism is a microorganism belonging to the genus Pseudomonas. The microorganisms belonging to the genus Pseudomonas are Pseudomonas chicoryai YN2 strain (Pseudomonas cichorii YN2; FERM BP-7735), Pseudomonas chicoryii H45 strain (Pseudomonas cichorii H45; FERM BP-7374), Pseudomonas 16 strain P. 31. The production method according to claim 30, wherein the microorganism is selected from the group consisting of jessenii P161; FERM BP-7376).

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