JP3768835B2 - Polyhydroxyalkanoate containing 3-hydroxy-substituted benzoylalkanoic acid as monomer unit and process for producing the same - Google Patents

Description

【００１４】
一方、上記(２)の先行技術に記載されている様に、グルコース等の糖類を基質とし、ＰＨＡを生合成する場合は、「脂肪酸合成経路」中に生じた「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」から変換された「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」が出発物質として行なわれるとされている。
ここで、「ＡＣＰ」とは「アシルキャリアプロテイン(acyl carrier protein)」のことである。
【００１５】
ところで、先に述べたとおり、上記(１)および(２)で合成されているＰＨＡは、いずれも側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡ、即ち、「usual ＰＨＡ」である。
【００１６】
《２》しかし、このような微生物産生ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したＰＨＡ(「unusual ＰＨＡ」)が極めて有用であることが期待される。置換基の例としては、芳香環を含むもの(フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基など)や、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシドなどが挙げられる。これらの中でも、特に、芳香環を有するＰＨＡの研究が盛んになされている。
【００１７】
(a)フェニル基もしくはその部分置換体を含むもの
Ｍakroｍol.Ｃheｍ.,１９１，1957-1965(1990)及びＭacroｍolecules,２４，5256-5260(1991)には、５-フェニル吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１８】
具体的には、シュードモナス・オレオボランスが５-フェニル吉草酸とノナン酸とを基質として(モル比２:１、総濃度 10ｍｍol/L)、３-ヒドロキシ吉草酸、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシノナン酸、３-ヒドロキシウンデカン酸、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をモノマーユニットとして、0.6：16.0：41.1：1.7：40.6 の量比で含むＰＨＡを、培養液１Lあたり 160ｍg(菌体に対する乾燥重量比 31.6％)生産し、また、５-フェニル吉草酸とオクタン酸とを基質として(モル比１:１、総濃度 10ｍｍol/L)、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をモノマーユニットとして、7.3：64.5：3.9：24.3 の量比で含むＰＨＡを、培養液１Lあたり 200ｍg(菌体に対する乾燥重量比 39.2％)生産することが報告されている。この報告におけるＰＨＡは、ノナン酸やオクタン酸が用いられていることからも主にβ酸化経路を経て合成されているものと考えられる。
【００１９】
関連する記述は、上記の他Ｃhirality,３,492-494(1991)にもあり、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸ユニットが含まれていることに起因すると思われる、ポリマー物性の変化が認められている。
【００２０】
Ｍacroｍolecules,２９，1762-1766(1996)には、５-(４'-トリル)吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-(４'-トリル)吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２１】
Ｍacroｍolecules,３２，2889-2895(1999)には、５-(２',４'-ジニトロフェニル)吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-(２',４'-ジニトロフェニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-５-(４'-ニトロフェニル)吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２２】
(b)フェノキシ基もしくはその部分置換体を含むもの
Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.,１９５，1665-1672(1994)には、11-フェノキシウンデカン酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸と３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸のＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。
【００２３】
また、Ｍacroｍolecules,２９，3432-3435(1996)には、シュードモナス・オレオボランスを用いて、６-フェノキシヘキサン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸および３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸をユニットとして含むＰＨＡを、８-フェノキシオクタン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸および３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸をユニットとして含むＰＨＡを、11-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸および３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。この報告におけるポリマーの収率を抜粋すると以下のとおりである。
【００２４】
【表１】

【００２５】
特許公報第 2989175号には、３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐ)ユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐ)ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐユニットあるいは３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーを合成するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた前記のポリマーの製造法に関する発明が開示されており、 特許第 2989175号公報には、３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐ)ユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐ)ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐユニットあるいは３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーを合成するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた前記のポリマーの製造法に関する発明が開示されている。
【００２６】
これらの生産は以下の様な「二段階培養」で行なわれている。
培養時間: 一段目、24時間 ； 二段目、96時間
各段における基質と得られるポリマーを以下に示す。
(１)得られるポリマー:３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエートホモポリマー
一段目の基質:クエン酸、イーストエキス
二段目の基質:モノフルオロフェノキシウンデカン酸
(２)得られるポリマー:３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエートホモポリマー
一段目の基質:クエン酸、イーストエキス
二段目の基質:ジフルオロフェノキシウンデカン酸
(３)得られるポリマー: ３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエートコポリマー
一段目の基質:オクタン酸あるいはノナン酸、イーストエキス
二段目の基質:モノフルオロフェノキシウンデカン酸
(４)得られるポリマー: ３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエートコポリマー
一段目の基質:オクタン酸あるいはノナン酸、イーストエキス
二段目の基質:ジフルオロフェノキシウンデカン酸
その効果としては、置換基をもつ中鎖脂肪酸を資化して、側鎖末端が１から２個のフッ素原子で置換されたフェノキシ基を有するポリマーを合成することができ、融点が高く良い加工性を保ちながら、立体規則性、撥水性を与えることができるとしている。
【００２７】
この様なフッ素基置換体以外に、シアノ基やニトロ基の置換体の研究もなされている。
【００２８】
Ｃan.J.Ｍicrobiol.,４１，32-43(1995)及び Ｐolyｍer International,３９，205-213(1996)には、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)ＡＴＣＣ 29347株及びシュードモナス プチダ(Pseudoｍonas putida)ＫＴ 2442株を用いて、オクタン酸とp-シアノフェノキシヘキサン酸或いはp-ニトロフェノキシヘキサン酸を基質として、３-ヒドロキシ-p-シアノフェノキシヘキサン酸或いは３-ヒドロキシ-p-ニトロフェノキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が報告されている。
【００２９】
これらの報告は側鎖がアルキル基である一般的なＰＨＡとは異なり、いずれもＰＨＡの側鎖に芳香環を有しており、それに由来する物性を有するポリマーを得る上で有益である。
【００３０】
(c)シクロヘキシル基をモノマーユニット中に含むＰＨＡは、通常の脂肪族ヒドロキシアルカン酸をユニットとして含むＰＨＡとは異なる高分子物性を示すことが期待されており、シュードモナス・オレオボランスによる生産の例が報告されている(Ｍacroｍolecules,30,1611-1615(1997))。
【００３１】
この報告によれば、シュードモナス・オレオボランスを、ノナン酸とシクロヘキシル酪酸あるいはシクロヘキシル吉草酸の共存する培地中で培養すると、シクロヘキシル基を含むユニットと、ノナン酸由来のユニットを含むＰＨＡが得られている(各割合は不明)。
【００３２】
その収率等に関しては、シクロヘキシル酪酸に対して、基質濃度トータル 20 ｍｍol/Lの条件で、シクロヘキシル酪酸とノナン酸の量比を変化させ、表２に示すような結果を得たと報告されている。
【００３３】
【表２】

【００３４】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)、ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)、収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
しかしながら、この例では、培養液当たりのポリマー収率は十分なものではなく、また、得られたＰＨＡ自体も、そのモノマーユニット中にはノナン酸由来の脂肪族ヒドロキシアルカン酸が混在しているものである。
【００３５】
《３》また新たなカテゴリーとして、単に物性の変化に留まらず、側鎖に適当な官能基を有するＰＨＡを生産し、その官能基を利用して新たな機能を生み出そうとする研究も行なわれている。
【００３６】
例えばＭacroｍolecules,３１，1480-1486(1996)及び、Journal of ＰolyｍerＳcience:Part Ａ:Ｐolyｍer Ｃheｍistry,３６，2381-2387(1998)などでは、側鎖の末端にビニル基を持つユニットを含むＰＨＡを合成した後、酸化剤によりエポキシ化し、側鎖末端に反応性の高いエポキシ基を含むＰＨＡを合成出来たと報告されている。
【００３７】
またビニル基以外にも、高い反応性が期待されるスルフィドを持つユニットを含むＰＨＡの合成例として、Ｍacroｍolecules,３２，8315-8318(1999)においては、シュードモナス プチダ(Pseudoｍonas putida)27Ｎ01株が 11-フェニルスルファニル吉草酸を基質とし、３-ヒドロキシ-５-(フェニルスルファニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-７-(フェニルスルファニル)ヘプタン酸のＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。
【００３８】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、微生物産生ＰＨＡにおいては、その製造に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等を変えることにより、各種の組成・構造のものが得られているが、プラスチックとしての応用を考えた場合、物性的に未だ十分であるとは言えない。微生物産生ＰＨＡの利用範囲をさらに拡大していくためには、物性の改良をより幅広く検討していくことが重要であり、そのためにはさらに多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡと、その製造方法、ならびに所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索が必須である。
【００３９】
一方、前述のような、置換基を側鎖に導入したタイプのＰＨＡ(unusual ＰＨＡ)は、導入した置換基を所望とする特性等に応じて選択することで、導入した置換基の特性等に起因する、極めて有用な機能や特性を具備した「機能性ポリマー」としての展開も期待でき、そのような機能性と生分解性とを両立可能であるような優れたＰＨＡと、その製造方法、ならびに、所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索もまた重要な課題である。
【００４０】
すなわち、様々な置換基を側鎖に導入したＰＨＡを微生物により生産しようとする場合、先に挙げたシュードモナス・オレオボランスの報告例等に見られるように、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法が用いられている。
【００４１】
しかしながら、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法は、当該アルカノエートからのβ酸化によるアセチルＣoＡの生成に基づくエネルギー源の供給が期待されており、このような方法においては、ある程度の鎖長を有する基質でないとβ酸化によりアセチルＣoＡを生成することができず、このためＰＨＡの基質として用いうるアルカノエートが限定されてしまう点が大きな課題である。また、一般的に、β酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった基質が新たに生成し、これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、合成されるＰＨＡは鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ異なるモノマーユニットからなる共重合体となることが多い。前述の報告例では、基質である８-フェノキシオクタン酸由来の３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸と、代謝産物由来の副生物である３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸の３種類のモノマーユニットからなる共重合体が生産される。この点で、単一のモノマーユニットからなるＰＨＡを得ようとする場合、この方法を用いることは極めて難しい。さらに、β酸化によるアセチルＣoＡの生成に基づいたエネルギー源の供給を前提とした方法では、微生物の増殖が遅く、ＰＨＡの合成に時間がかかる点、合成されたＰＨＡの収率が低くなりがちな点も大きな課題である。
【００４２】
このため、導入しようとする置換基を有するアルカノエートに加えて、増殖用炭素源として、オクタン酸やノナン酸といった中鎖の脂肪酸等を共存させた培地で微生物を培養したのち、ＰＨＡを抽出する方法が有効と考えられ、一般的に用いられている。
【００４３】
しかしながら、本発明者らの検討によれば、上記のようにオクタン酸やノナン酸といった中鎖の脂肪酸等を増殖用炭素源とし、β酸化経路を経て合成されたＰＨＡは、その純度が低く、得られるポリマーの 50％以上が、増殖用炭素源に由来するモノマーユニット(例えば、３-ヒドロキシオクタン酸や３-ヒドロキシノナン酸等)である、ｍclの３-ヒドロキシアルカン酸モノマーユニット(以下、ｍcl-３ＨＡと略す場合がある)、すなわち「usual ＰＨＡ」のユニットである。これらのｍcl-３ＨＡユニットは、単独の組成においては常温で粘着性のポリマーであり、本発明の目的とするＰＨＡに多量に混在した場合、ポリマーのガラス転移温度(Ｔg)を著しく降下させる。このため、常温で硬いポリマー物性を得ようとする場合、ｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在は望ましくない。また、このようなヘテロな側鎖構造は分子内あるいは分子間での側鎖構造に由来する相互作用を妨害し、結晶性あるいは配向性に大きな影響を与えることが知られている。
【００４４】
ポリマー物性の向上、機能性の付与を達成するにあたり、これらのｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在は大きな課題である。この課題の解決手段としては、特定の置換基を有するモノマーユニットのみで構成されたＰＨＡを取得するために、増殖用炭素源由来のｍcl-３ＨＡモノマーユニット等の「目的外」のモノマーユニットを分離/除去するための精製工程を設けることが挙げられる。しかしながら、操作が煩雑となる上、収率の大幅な低下も避けられない点が課題となる。
【００４５】
さらに大きな問題点は、目的のモノマーユニットと目的外のモノマーユニットとが共重合体を形成している場合、目的外のモノマーユニットのみを除去するのは極めて困難な点である。特に、不飽和炭化水素から得られる基、エステル基、アリル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン化炭化水素から得られる基、エポキシド等が導入された基を側鎖構造として有するようなモノマーユニットを含むＰＨＡの合成を目的とする場合、ｍcl-３ＨＡモノマーユニットは目的のモノマーユニットと共重合体を形成する場合が多く、ＰＨＡ合成後のｍcl-３ＨＡモノマーユニット除去は極めて困難である。
【００４６】
このため、本発明者らは、機能性ポリマーへの応用を考慮した場合、「unusual ＰＨＡ」を高純度で得られる生合成方法の開発が是非とも必要であるとの認識を持つに至った。よって、前記のような機能性と生分解性とを兼ね備えた優れたポリマーと、当該ポリマーを生産し菌体内に蓄積し得る微生物、並びに、当該ＰＨＡを高純度で効率的に生合成する方法の開発は極めて有用かつ重要であると考えられた。
【００４７】
本発明は前記の課題を解決するものであり、デバイス材料や医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡ(unusual ＰＨＡ)の提供、ならびに、当該「unusual ＰＨＡ」を微生物を利用して製造する方法の提供、特には、目的外のモノマーユニットの混在が少なく、目的とする「unusual ＰＨＡ」を高純度で得ることができ、しかも高収率な製造方法を提供することにある。
【００４８】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、デバイス材料や医用材料等として有用な官能基を側鎖に有するＰＨＡの開発を目指して、各種のＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物の探索、及び、このような微生物を用いた所望のＰＨＡの生産方法について鋭意研究を重ねてきた。その結果、化学式[７]、
【００４９】
【化 １６】

【００５０】
(ただし、式中nは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒはハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ₂,-ＣＨ₃,-Ｃ₂Ｈ₅,-Ｃ₃Ｈ₇,-ＣＦ₃,-Ｃ₂Ｆ₅,-Ｃ₃Ｆ₇からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される置換ベンゾイルアルカン酸を原料として、化学式[８]、
【００５１】
【化 １７】

【００５２】
(ただし、式中ｍはn,n-２,n-４,n-６からなる群より選択される少なくとも１つ以上でありかつ１以上の整数を表し、nは前記化学式[７]中のnと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒは前記化学式[７]中のＲと対応するハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ₂,-ＣＨ₃,-Ｃ₂Ｈ₅,-Ｃ₃Ｈ₇,-ＣＦ₃,-Ｃ₂Ｆ₅,-Ｃ₃Ｆ₇からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを含む新規なＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を見出し、さらに、これら微生物を前記化学式[７]で表される置換ベンゾイルアルカン酸と、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸,酵母エキスまたはポリペプトンの共存下で培養することにより、当該ＰＨＡを生合成することができること、それによって得られる当該ＰＨＡが比較的高純度であることを見出した。
【００５３】
詳しくは、例えば、化学式[９]、
【００５４】
【化 １８】

【００５５】
(ただし、式中Ｒはハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ₂,-ＣＨ₃,-Ｃ₂Ｈ₅,-Ｃ₃Ｈ₇,-ＣＦ₃,-Ｃ₂Ｆ₅,-Ｃ₃Ｆ₇からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される置換ベンゾイル吉草酸を原料として、化学式[５]、
【００５６】
【化 １９】

【００５７】
(ただし、式中Ｒは前記化学式[９]中のＲと対応するハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ₂,-ＣＨ₃,-Ｃ₂Ｈ₅,-Ｃ₃Ｈ₇,-ＣＦ₃,-Ｃ₂Ｆ₅,-Ｃ₃Ｆ₇からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される３-ヒドロキシ置換ベンゾイル吉草酸ユニットを含む新規なＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を見出し、さらに、これら微生物を前記化学式[９]で表される置換ベンゾイル吉草酸と、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸,酵母エキスまたはポリペプトンの共存下で培養することにより、当該ＰＨＡを生合成することができること、それによって得られる当該ＰＨＡが比較的高純度であることを見出した。
さらに詳しくは、例えば、化学式[10]、
【００５８】
【化 ２０】

【００５９】
で表される５-(４-フルオロベンゾイル)吉草酸(以下、ＦＢzＶＡと略す)を原料として、化学式[６]、
【００６０】
【化 ２１】

【００６１】
で表される３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロベンゾイル)吉草酸ユニット(以下、３ＨＦＢzＶと略す場合がある)を含む新規なＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を見出し、さらに、これら微生物を置換ベンゾイルアルカン酸と、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸,酵母エキスまたはポリペプトンとの共存下で培養することにより、当該ＰＨＡを生合成することができること、それによって得られる当該ＰＨＡが比較的高純度であることを見出し、本発明を為すに至った。
【００６２】
すなわち、本発明は、化学式[２]、
【００６３】
【化 ２２】

【００６４】
(ただし、式中nは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒはハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ₂,-ＣＨ₃,-Ｃ₂Ｈ₅,-Ｃ₃Ｈ₇,-ＣＦ₃,-Ｃ₂Ｆ₅,-Ｃ₃Ｆ₇からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットをモノマーユニットとして含むＰＨＡに関するものである。
なお、本発明のＰＨＡでは、目的とするモノマーユニットである前記化学式[２]で示されるもの以外のモノマーユニットは、すべて下記化学式[３]または下記化学式[４]で表されるモノマーユニットから選択される少なくとも１つ以上である。
【化３１】

(ただし、式中pは０から10の整数のいずれかを表す。)
【化３２】

(ただし、式中qは３または５の整数のいずれかを表す。)
本発明のＰＨＡにおいては前記化学式[２]で示されるモノマーユニットの割合は0.01以上１以下である。
さらに好ましくは本発明のＰＨＡは、前記化学式[２]で示されるモノマーユニットの一部として、下記化学式[５]で示されるモノマーユニットを含む。
【化３３】

(ただし、式中Ｒはハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ₂,-ＣＨ₃,-Ｃ₂Ｈ₅,-Ｃ₃Ｈ₇,-ＣＦ₃,-Ｃ₂Ｆ₅,-Ｃ₃Ｆ₇からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
また、本発明は、これらのＰＨＡの製造方法であって、置換ベンゾイルアルカン酸を利用して該組成を有するポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物である、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ２、ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Pseudoｍonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ -7376)からなる群から選択される少なくとも１つの株を、該置換ベンゾイルアルカン酸を含む培地で培養する工程と、
前記微生物が産生したポリヒドロキシアルカノエートを単離する工程とを有することを特徴とする。
好ましくは、化学式[７]、
【００６５】
【化 ２３】

【００６６】
(ただし、式中nは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒはハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ₂,-ＣＨ₃,-Ｃ₂Ｈ₅,-Ｃ₃Ｈ₇,-ＣＦ₃,-Ｃ₂Ｆ₅,-Ｃ₃Ｆ₇からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される置換ベンゾイルアルカン酸を含む培地で微生物を培養することで、該微生物に、下記化学式[８]、
【００６７】
【化 ２４】

【００６８】
(ただし、式中ｍはn,n-２,n-４,n-６からなる群より選択される少なくとも１つ以上でありかつ１以上の整数を表し、nは前記化学式[７]中のnと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒは前記化学式[７]中のＲと対応するハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ₂,-ＣＨ₃,-Ｃ₂Ｈ₅,-Ｃ₃Ｈ₇,-ＣＦ₃,-Ｃ₂Ｆ₅,-Ｃ₃Ｆ₇からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される、対応する３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを有するＰＨＡを産生させる工程を有することを特徴とする。
【００６９】
すなわち、本発明のＰＨＡの製造方法は、３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを生産する微生物を、置換ベンゾイルアルカン酸と、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸,酵母エキスまたはポリペプトンとの共存下で培養する工程を有することを特徴とする。
【００７０】
【発明の実施の形態】
本発明のＰＨＡは、デバイス材料や撥水性材料、医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡであり、より具体的には、置換ベンゾイル基を側鎖に有するＰＨＡである。また、本発明のＰＨＡの製造方法は、微生物を利用して高純度かつ高収率に所望のＰＨＡを製造することを可能とするものである。なお、本発明のＰＨＡは、一般にＲ体のみから構成される、アイソタクチックなポリマーである。
【００７１】
＜糖類ならびにＴＣＡサイクルに関与する有機酸 従来技術との差異＞
本発明のＰＨＡ製造方法の１つは、微生物を培養する際、培地に所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸に加えて、当該アルカン酸以外の炭素源として、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸を添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中に当該アルカン酸以外の炭素源として、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸のみを添加することにより得られている。
【００７２】
すなわち、発明者らは、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸を共存基質として、所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸と共に培養せしめたところ、ノナン酸やオクタン酸といったｍcl-アルカン酸を共存基質として用いた従来の方法に比べ、目的とするＰＨＡが格段に優れた収率および純度で得られること、そしてこのような効果が、微生物の炭素源ならびにエネルギー源であるアセチルＣoＡをβ酸化に拠らない方法により生成することが可能な培養方法であることにより得られるものであるとの知見を得て本発明に至ったものである。
【００７３】
本発明の方法においては、糖類化合物、例えばグルコースやフルクトース,マンノース等は、微生物の増殖基質として利用されることになり、生産されるＰＨＡは、糖類に共存させている所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートから構成され、グルコース等の糖類に由来するモノマーユニットが全く含まれないか、極めて少量しか含まれない。このような点で、本発明の方法は、従来のグルコースなどの糖類そのものをＰＨＡに導入するモノマーユニットの原料基質として用いるＰＨＡ微生物生産方法とは構成及び効果ともに根本的に異なるものである。
【００７４】
＜酵母エキス 従来技術との差異＞
本発明のＰＨＡ製造方法の１つは、微生物を培養する際、培地に所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸に加えて、当該アルカン酸以外の炭素源として酵母エキスのみを添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中に当該アルカン酸以外の炭素源として酵母エキスのみを添加することにより得られている。
【００７５】
微生物によるＰＨＡの製造に際して、培地に酵母エキスを利用する例として、特開平５-49487 号公報に記載の、ロドバクター属(Ｒhodobacter sp.)に属する微生物を用いた方法が挙げられる。しかしながら、この従来法は、置換基を有しないヒドロキシアルカノエートをモノマーユニットとする、一般的なＰＨＢおよびポリ-３-ヒドロキシ吉草酸(以下、ＰＨＶと略す場合もある)を製造する方法である。本発明が目的とするようなＰＨＡの合成経路は、ＰＨＢおよびＰＨＶを生産する合成経路とは独立した経路であることが知られており、特開平５-49487 号公報においては本発明が目的とするようなＰＨＡの合成経路における酵母エキスの効果については何ら言及がない。また、酵母エキスの効果も、微生物が一般的に生産するＰＨＡやＰＨＶに関して、酵母エキスを添加すると、単に菌体内のＰＨＡ蓄積量の増大が図られる効果があることを示すのみであり、増殖のために酵母エキスが添加されている訳ではないことが明記されている。
【００７６】
本発明は置換ベンゾイルアルカン酸と酵母エキスとを共存させることにより、増殖とともにＰＨＡの生産・蓄積を行なうものであり、酵母エキスの発揮する効果が全く異なる。さらに本発明の効果である、特定のモノマーユニットの優占化について何ら言及されておらず、本発明のように、微生物が生産するＰＨＡ組成における、置換ベンゾイル基を置換基として有する特定のモノマーユニットの優占化という効果は示されていない。
【００７７】
さらに、微生物によるＰＨＡの生産に酵母エキスを利用する例としては、特許第 2989175号公報に記載のシュードモナス・プチダ(Pseudoｍonas putida)を用いた方法が挙げられる。ここで開示されているＰＨＡの製造方法は２段階培養によるもののみであり、ＰＨＡの蓄積は２段階目の培養においてのみ、炭素源以外の栄養源の制限下で行なうことが開示されている。この点で、本発明における、置換ベンゾイルアルカン酸と酵母エキスとを含む培地での１段階培養のみで、所望のＰＨＡを合成・蓄積させる方法とは構成/効果ともに全く異なる。
【００７８】
また、特許第 2989175号公報における酵母エキスの効果は、２段階培養を用いる際、１段階目の培養において、単に２段階目の培養に用いる微生物の増殖のみを目的としたものであり、１段階目は栄養源の豊富な条件下で培養されると明記されている。ここで、ＰＨＡの基質は１段階目には共存していない。本発明における酵母エキスの効果は、置換ベンゾイルアルカン酸と酵母エキスとを共存させることにより、増殖とともにＰＨＡの生産・蓄積を行なうものであり、酵母エキスの発揮する効果が全く異なる。
【００７９】
また、特許第 2989175号公報では、１段階目の培養に、炭素源としてクエン酸、オクタン酸、ノナン酸のいずれかが共存しており、置換ベンゾイルアルカン酸と酵母エキスのみを共存させる本発明とは、構成においても異なるものである。
【００８０】
＜ポリペプトン 従来技術との差異＞
本発明のＰＨＡ製造方法の１つは、微生物を培養する際、培地に所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸に加えて、当該アルカン酸以外の炭素源としてポリペプトンのみを添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中に当該アルカン酸以外の炭素源として、ポリペプトンのみを添加することにより得られている。
【００８１】
なお、微生物によるＰＨＡの生産にポリペプトンを利用する例として、特開平５-49487号公報、特開平５-64591号公報、特開平５-214081号公報、特開平６-145311号公報、特開平６-284892号公報、特開平７-48438公報、特開平８-89264号公報、特開平９-191893号公報、特開平 11-32789号公報等に、ＰＨＡを微生物に生産させる際に、培地中にポリペプトンを含有させていることが開示されているが、いずれも前培養、つまり、菌体を単に増殖させる段階で用いており、前培養時にＰＨＡのモノマーユニットとなる基質は含まれていない。また、菌体にＰＨＡを生産させる工程でポリペプトンを用いた例はない。
【００８２】
これに対して、本発明は所望のモノマーユニット導入用のアルカン酸と、当該アルカン酸以外の炭素源として、ポリペプトンのみを共存させることにより、増殖とともにＰＨＡの生産・蓄積を行なうものであり、従来のポリペプトンを利用した例とは構成および効果が全く異なる。さらに本発明の効果である、特定のモノマーユニットの優占化について何ら言及されておらず、本発明のように、微生物が生産するＰＨＡ組成における、置換ベンゾイル基を置換基として有する特定のモノマーユニットの優占化という効果は示されていない。
【００８３】
以下に、本発明において利用される微生物、培養工程などについて説明する。
【００８４】
＜ＰＨＡモノマーユニット供給系＞
先ず、目的とするＰＨＡに混在してくるｍcl-３ＨＡモノマーユニットの供給系の１つである「脂肪酸合成経路」について詳細に説明する。
【００８５】
グルコース等の糖類を基質とした場合、細胞成分として必要なアルカン酸は、糖類から「解糖系」を経て生産されるアセチルＣoＡを出発物質とした「脂肪酸合成経路」から生合成される。なお、脂肪酸合成には新規(de novo)合成経路と炭素鎖延長経路があり、以下にこれらについて説明する。
【００８６】
(１)新規(de novo)合成経路
アセチルＣoＡカルボキシラーゼ(ＥＣ 6.4.1.2)と脂肪酸合成酵素(ＥＣ 2.3.1.85)の２つの酵素で触媒される。なお、アセチルＣoＡカルボキシラーゼは、ビオチンを介在し、最終的に以下の反応を触媒し、アセチルＣoＡからマロニルＣoＡを生成する酵素であり、反応は下記式で表わされる。
アセチルCoA+ATP+HCO₃ ^-⇔マロニルCoA+ADP+Pi
また、脂肪酸合成酵素は、転移-縮合-還元-脱水-還元の反応サイクルを触媒する酵素であり、全反応は次の反応式で示される。
アセチルCoA+nマロニルCoA+2nNADPH+2nH⁺ ⇒ CH₃(CH₂)_2nCOOH+nCO₂+2nNADP⁺+(n-1)CoA
なお、酵素の種類によって、反応産物が遊離酸、ＣoＡ誘導体、あるいはＡＣＰ誘導体の場合がある。ここで、アセチルＣoＡは以下の化学式で示され、
【００８７】
【化 ２５】

【００８８】
マロニルＣoＡは以下の化学式で示される。
【００８９】
【化 ２６】

【００９０】
また、ＣoＡとは補酵素Ａ(coenzyｍe Ａ)の略称であり、以下の化学式で示される。
【００９１】
【化 ２７】

【００９２】
本反応経路のうち、以下に示す経路により、ＰＨＡ生合成のモノマー基質となる「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＡＣＰ」が中間体として供給される。また、以下の反応式に示すように経路は炭素を２個ずつ付加しながら最終的にはパルミチン酸まで延長される。それゆえＰＨＡ生合成のモノマー基質としては「Ｄ-３-ヒドロブチリルＡＣＰ」から「Ｄ-３-ヒドロキシパルミチルＡＣＰ」の炭素数が偶数の７種類の「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＡＣＰ」が供給されることになる。
【００９３】
【化 ２８】

【００９４】
(２)炭素鎖延長経路
この経路は、アシルＡＣＰにマロニルＡＣＰが付加し、最終的に炭素鎖が２つ延長されたアシルＡＣＰ(及びＣＯ₂)となる経路(経路Ａとする)と、アシルＣoＡにアセチルＣoＡが付加し、最終的に炭素鎖が２つ延長されたアシルＣoＡとなる経路(経路Ｂとする)の２経路に大別される。以下に各経路について説明する。

・経路Ｂ
R-CO-CoA+アセチル-CoA→R-CO-CH₂-CO-CoA
R-CO-CH₂-CO-CoA→R-CHOH-CH₂-CO-CoA→
R-CH=CH-CO-CoA→R-CH₂-CH₂-CO-CoA
Ａ、Ｂいずれの系も、中間体として「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＣoＡ」あるいは「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＡＣＰ」が生じ、「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＣoＡ」はそのままＰＨＡ合成のモノマー基質として利用され、「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＡＣＰ」はＡＣＰ-ＣoＡ転移酵素により「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＣoＡ」に変換された後に、ＰＨＡ合成のモノマー基質として利用されると考えられる。
【００９５】
グルコース等の糖類を基質とした場合、微生物細胞中では以上のような「解糖系」及び「脂肪酸合成経路」を経由してｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されると考えられる。また、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸を基質とした場合、ピルビン酸からはピルビン酸デヒドロゲナーゼにより直接アセチルＣoＡが生成する。オキサロ酢酸からはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼによりホスホエノールピルビン酸がピルビン酸キナーゼにより触媒されてピルビン酸が生成し、さらに上記反応によりアセチルＣoＡが生成する。これらの反応により生成したアセチルＣoＡが「脂肪酸合成経路」を経由してｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されると考えられる。
【００９６】
ここで、例えばオクタン酸、ノナン酸等のｍcl-アルカン酸、あるいは、例えば、５-フェニル吉草酸、４-フェノキシ酪酸、４-シクロヘキシル酪酸といった、末端に直鎖脂肪族アルキル以外の官能基が付加されたアルカン酸はＣoＡリガーゼ(ＥＣ 6.2.1.3等)によりＣoＡ誘導体となり、β酸化系を担う酵素群により直接的にＰＨＡ生合成のモノマー基質となる「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＣoＡ」となると考えられる。
【００９７】
つまり、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸から生成するｍcl-３ＨＡモノマーユニットが、きわめて多段階の酵素反応を経て(つまり間接的に)生成されるのに比較し、ｍcl-アルカン酸からはきわめて直接的にｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されてくることになる。
【００９８】
ここで、微生物の増殖を担うアセチルＣoＡの生成について説明する。目的とするモノマーユニット導入用のアルカン酸に加えてｍcl-アルカン酸を共存させる方法では、これらのアルカン酸がβ酸化系を経由することによりアセチルＣoＡが生成する。一般に、バルキーな置換基を有するアルカン酸(フェニル基、フェノキシ基、シクロヘキシル基等の置換基を有するアルカン酸)に比較し、ｍcl-アルカン酸はβ酸化系の酵素群との基質親和性に優れていると考えられ、ｍcl-アルカン酸の共存により効果的にアセチルＣoＡが生成される。このため、アセチルＣoＡをエネルギー源及び炭素源として用いる微生物の増殖には有利となる。
【００９９】
しかしながら、β酸化系を経由するｍcl-アルカン酸が直接的にＰＨＡのモノマーユニットとなるために、生産されるＰＨＡは、目的のモノマーユニットに加えてｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在が多いものとなってしまうことが大きな課題である。
【０１００】
この課題を解決するためには、ｍcl-アルカン酸以外で、効果的にアセチルＣoＡあるいはエネルギー源及び炭素源を供給し得るような基質を選択し、目的とするアルカン酸と共存させる方法が望ましい。前述のように、アセチルＣoＡは脂肪酸合成経路を経ることによりＰＨＡのモノマーユニットとなり得るが、ｍcl-アルカン酸に比較すればより多段階の反応を経由する必要がある間接的なものであり、また、アセチルＣoＡを生成し得るような基質の濃度等、培養条件を適宜選択することにより、実質的にはｍcl-３ＨＡの混在のない、あるいは少ない製造方法の実現が可能である。
【０１０１】
また、１段階目で微生物の増殖のみを目的に培養し、２段階目においては炭素源として目的とするアルカン酸のみを培地に加える製造方法が汎用されている。ここで、当該アルカン酸をアシルＣoＡ化するβ酸化系の初発酵素であるアシルＣoＡリガーゼがＡＴＰを要求することから、発明者らの検討によれば２段階目においても微生物がエネルギー源として利用し得る基質を共存させる製造方法がより効果的であるとの結果を得て、本発明を完成した。
【０１０２】
本発明の方法におけるアセチルＣoＡあるいはエネルギー源および炭素源を効果的に供給し得る基質としては、グリセロアルデヒド,エリスロール,アラビノース,キシロース,グルコース,ガラクトース,マンノース,フルクトースといったアルドース、グリセロール,エリスリトール,キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸,グルクロン酸やガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース,スクロース,ラクトースといった二糖等の糖類のほか、乳酸,ピルビン酸,リンゴ酸,クエン酸,コハク酸,フマル酸及びその塩等のＴＣＡサイクルに関与する有機酸、さらには酵母エキス,ポリペプトン,肉エキス,カザミノ酸などの天然物由来の培地成分など、β酸化系を経ずにアセチルＣoＡあるいはエネルギー源および炭素源を供給し得る化合物であれば、いかなる化合物でも用いることができ、用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。また、ｍcl-３ＨＡの混入の少ない組み合わせであれば、複数の化合物を選択して用いることも可能である。
【０１０３】
＜微生物＞
本発明に用いる微生物としては、前記の置換ベンゾイルアルカン酸を原料とし、前記の３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを産生可能であれば、いかなる微生物をも使用することができる。また、本発明の目的を達成できる範囲内で、必要に応じて複数の微生物を混合して用いることもできる。
【０１０４】
本発明者らは、ＦＢzＶＡ等を基質として用いて、前記の３ＨＦＢzＶ等をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物の探索を行なった。その結果、本発明者らが土壌より分離した微生物であり、ＰＨＡの生産能力を有する、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45)、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Pseudoｍonas cichoriiＹＮ２)、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Pseudoｍonas jessenii Ｐ161)等が所望の能力を有することを見出した。なお、Ｈ45株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7374」として、ＹＮ２株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7375」として、Ｐ161株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7376」として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧経済産業省生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター）にそれぞれ寄託されている。
【０１０５】
前記のＨ45株、ＹＮ２株およびＰ161株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。また、Ｐ161株については、16srＲＮＡの塩基配列を配列番号:１に示す。
＜Ｈ45株の菌学的性質＞

(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陰性
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陰性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
＜ＹＮ２株の菌学的性質＞

(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陽性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陽性(弱い生育)
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性
Ｔｗeen 80 の加水分解 :陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陰性
Ｄ-マンニトール :陰性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陰性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
＜Ｐ161株の菌学的性質＞

(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陽性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陽性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
また、シュードモナス属に属する微生物に加えて、アエロモナス属(Ａeroｍonas sp.)、コマモナス属(Ｃoｍaｍonas sp.)、バークホルデリア属(Ｂurkholderia sp.)などに属し、前記の置換ベンゾイルアルカン酸を原料とし、前記の３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットをモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産する微生物を用いることも可能である。
【０１０６】
＜培養＞
これらの微生物を所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸と、本発明の増殖用基質とを含む培地で培養することで、目的とするＰＨＡを生産することができる。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０１０７】
本発明にかかるＰＨＡの製造方法に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地,酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【０１０８】
培養は液体培養、固体培養等該微生物が増殖し、ＰＨＡを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養,フェドバッチ培養,半連続培養,連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【０１０９】
前記したようなＰＨＡ生産微生物を用いて、３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを製造する場合は、ＰＨＡ生産用の原料としてそれぞれ対応する置換ベンゾイルアルカン酸と、微生物の増殖用炭素源とを少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。
増殖用炭素源としては、酵母エキス,ポリペプトン,肉エキス,カザミノ酸などの天然物由来の培地成分を用いることが可能であり、さらに、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸(ＴＣＡ回路中の中間体として生じる有機酸及びＴＣＡ回路から一段階ないしは二段階の生化学反応を経て生じる有機酸)或いはその塩等,β酸化サイクルを経ずにアセチルＣoＡを生じる化合物であれば、いかなる化合物でも用いることができ、用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。また、ｍcl-３ＨＡの混入の少ない組み合わせであれば、複数の化合物を選択して用いることも可能である。
【０１１０】
これらのうち、糖類としては、グリセロアルデヒド,エリスロース,アラビノース,キシロース,グルコース,ガラクトース,マンノース,フルクトースといったアルドース、グリセロール,エリスリトール,キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸,グルクロン酸,ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース,スクロース,ラクトースといった二糖等から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【０１１１】
また、有機酸或いはその塩としては、ピルビン酸,オキサロ酢酸,クエン酸,イソクエン酸,ケトグルタル酸,コハク酸,フマル酸,リンゴ酸,乳酸などがその例であり、或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
これらの中でも、特に糖類を用いるのが好ましく、中でもグルコース,フルクトース,マンノースからなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。
【０１１２】
微生物にＰＨＡを生産・蓄積させる方法としては、一旦十分に増殖させて後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると生産性が向上する場合がある。具体的には、前記の工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。例えば、Ｄ-グルコースを 0.05％から 5.0％程度、および、置換ベンゾイルアルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち、置換ベンゾイルアルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ、窒素源を制限した、あるいは実質的に存在しない無機培地でさらに培養する方法がある。
【０１１３】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩等)、窒素源(例えば、アンモニウム塩,硝酸塩等)等、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地、Ｅ培地(J.Ｂiol.Ｃheｍ.,２１８，97-106(1956))、Ｍ９培地等を挙げることができる。なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
Ｎa₂ＨＰＯ₄ : 6.2g
ＫＨ₂ＰＯ₄ : 3.0g
ＮaＣl : 0.5g
ＮＨ₄Ｃl : 1.0g
(培地１リットル中、pＨ 7.0)
更に、良好な増殖及びＰＨＡの生産のためには、上記の無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を 0.3％(v/v)程度添加するのが好ましい。
微量成分溶液
ニトリロ三酢酸: 1.5g
ＭgＳＯ₄ : 3.0g
ＭnＳＯ₄ : 0.5g
ＮaＣl : 1.0g
ＦeＳＯ₄ : 0.1g
ＣaＣl₂ : 0.1g
ＣoＣl₂ : 0.1g
ＺnＳＯ₄ : 0.1g
ＣuＳＯ₄ : 0.1g
ＡlＫ(ＳＯ₄)₂ : 0.1g
Ｈ₃ＢＯ₃ : 0.1g
Ｎa₂ＭoＯ₄ : 0.1g
ＮiＣl₂ : 0.1g
(１リットル中)
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 15〜40℃、好ましくは 20〜35℃、更に好ましくは 20℃から 30℃程度が適当である。
【０１１４】
具体的な例としては、Ｄ-グルコースを 0.05％から 5.0％程度、および、置換ベンゾイルアルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ無機培地等で培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない所望のＰＨＡを抽出することができる。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０１１５】
Ｄ-グルコースの代わりに同量のＴＣＡサイクルに関与する有機酸や、酵母エキス,ポリペプトンを与えても良い。また、それらの組み合わせを用いてもよい。
【０１１６】
＜ＰＨＡの回収＞
本発明にかかる培養液からのＰＨＡの取得には、通常行なわれている方法を適用することができる。ＰＨＡが培養液中に分泌される場合は、培養液からの抽出精製方法が、また、菌体に蓄積される場合は、菌体からの抽出精製方法が用いられる。例えば、微生物の培養菌体からのＰＨＡの回収には、通常行なわれているクロロホルムなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、クロロホルム以外にジオキサン,テトラヒドロフラン,アセトニトリル,アセトンが用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ等の薬剤による処理によってＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。
【０１１７】
なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるＰＨＡの生産と菌体への蓄積、並びに、本発明における菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１１８】
以下に実施例を示す。なお、以下における「％」は特に標記した以外は重量基準である。
【０１１９】
【実施例】
(参考例) ４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノンの合成
四つ口丸底フラスコに 100ｍlのテトラヒドロフランを入れ、４-フルオロベンゾイルクロライド 7.92 g(0.05 ｍol)及びトリス(アセチルアセトン)鉄(III)0.53 g(1.5 ｍｍol)を加え、窒素雰囲気下で攪拌した。この溶液に、室温においてペンチルマグネシウムブロマイドを加えて、室温 10 分間攪拌した。反応終了後、氷浴下において、希塩酸により酸性化し、ジエチルエーテルにより有機相を抽出した。さらに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて中和し、飽和塩化ナトリウム水溶液にて、有機相を洗浄した。有機相は、無水硫酸マグネシウムにて脱水後、ジエチルエーテルをロータリーエバポレーターにより留去し、真空ポンプにより乾燥し、粗製の４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノンを得た。
【０１２０】
精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒；n-ヘキサン:酢酸エチル＝ 30 :１)にて単離し、更にn-ヘキサンにより再結晶を行ない、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 5.23 gを得た。
【０１２１】
得られた化合物は、以下の条件でＮＭＲ分析を行なった。

¹Ｈ-ＮＭＲスペクトルを図１に、その帰属結果(化学式[11]参照)を表３にそれぞれ示した。
【０１２２】
【表３】

【０１２３】
【化 ２９】

【０１２４】
また、得られた精製物は、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、同定を行なった。そのＧＣ-ＭＳスペクトルデータを図２に示す。その結果、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノンは、ＧＣ-ＭＳ ＴIＣ エリア比で 87％であった。
(実施例１)
Ｄ-グルコース 0.5％、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 0.05％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。５日間後、菌体を遠心分離によって回収し、10％次亜塩素酸ナトリウム溶液に懸濁し、４℃で２時間振盪してＰＨＡを抽出した。抽出液を遠心分離して沈殿を回収し、これを水洗したのち、真空乾燥してＰＨＡを得た。
得られたＰＨＡについて、核磁気共鳴装置(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400)を用いて、下記の測定条件で分析した。
＜測定条件＞
測定核種:¹Ｈ
使用溶媒:ＣＤＣl₃(ＴＭＳ/ＣＤＣl₃をキャピラリ封入でreferenceとして使用)
共鳴周波数:¹Ｈ＝ 400 ＭＨz
¹Ｈ-ＮＭＲスペクトルを図３に、その帰属結果(化学式[12]参照)を表４にそれぞれ示した。
【０１２５】
【表４】

【０１２６】
【化 ３０】

【０１２７】
さらに、得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050,ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表５に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１２８】
【表５】

【０１２９】
このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8220、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝ 26,000、Ｍｗ＝ 142,000 であった。
【０１３０】
(実施例２)
Ｄ-グルコース 0.5％、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１３１】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１３２】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表６に示す。
【０１３３】
【表６】

【０１３４】
上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１３５】
(実施例３)
グルタミン酸ナトリウム 0.5％、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。７日間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１３６】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１３７】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表７に示す。
【０１３８】
【表７】

【０１３９】
上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１４０】
(実施例４)
グルタミン酸ナトリウム 0.5％、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１４１】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１４２】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表８に示す。
【０１４３】
【表８】

【０１４４】
上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１４５】
(実施例５)
Ｄ-グルコース 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＦＢzＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ₄Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍlに再懸濁して、更に 30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１４６】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１４７】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表９に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１４８】
【表９】

【０１４９】
このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8220、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μＭ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝ 30,000、Ｍｗ＝ 78,000 であった。
【０１５０】
(実施例６)
Ｄ-グルコース 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１５１】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１５２】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表 10 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１５３】
【表 １０】

【０１５４】
(実施例７)
リンゴ酸二ナトリウム 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。４日間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１５５】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１５６】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表 11 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１５７】
【表 １１】

【０１５８】
(実施例８)
酵母エキス(オリエンタル酵母工業(株)製)0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１５９】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１６０】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表12 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１６１】
【表 １２】

【０１６２】
(実施例９)
ポリペプトン(日本製薬(株)製)0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１６３】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１６４】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表 13 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１６５】
【表 １３】

【０１６６】
(実施例 10)
Ｄ-グルコース 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・Ｈ 45 株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＦＢzＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ₄Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍlに再懸濁して、更に 30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１６７】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１６８】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表 14 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１６９】
【表 １４】

【０１７０】
このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8220、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μＭ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝ 26,000、Ｍｗ＝ 61,000 であった。
【０１７１】
(実施例 11)
Ｄ-グルコース 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＦＢzＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ₄Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍlに再懸濁して、更に 30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１７２】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１７３】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表 15 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１７４】
【表１５】

【０１７５】
このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8220、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μＭ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝ 41,000、Ｍｗ＝ 110,000 であった。
【０１７６】
【発明の効果】
本発明により、デバイス材料や医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡ(unusual ＰＨＡ)の提供、ならびに、当該「unusual ＰＨＡ」を微生物を利用して製造する方法が可能となった。
【０１７７】
特に、目的外のモノマーユニットの混在が少なく、目的とする「unusual ＰＨＡ」を高純度で得ることができ、しかも高収率な製造方法の提供が可能となった。
【０１７８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】参考例における¹Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【図２】参考例において得られた４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノンをＧＣ-ＭＳ測定した際のＴIＣ及びマススペクトルを示す。
【図３】実施例１における¹Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel polyhydroxyalkanoate (hereinafter sometimes abbreviated as PHA). The present invention also relates to an extremely efficient method for producing the PHA using a microorganism having the ability to produce PHA and accumulate it in the microbial cells.
[0002]
[Prior art]
Until now, it has been reported that many microorganisms produce poly-3-hydroxybutyric acid (hereinafter sometimes abbreviated as PHB) or other PHA and accumulate it in the cells ("Biodegradable Plastic Handbook"). , Edited by Biodegradable Plastics Research Association, NTS, P178-197). These polymers can be used for production of various products by melt processing or the like, as in the case of conventional plastics. Furthermore, because it is biodegradable, it has the advantage of being completely degraded by microorganisms in nature, and unlike many conventional synthetic polymer compounds, it does not remain in the natural environment and cause pollution. Moreover, it is excellent in biocompatibility and is expected to be applied as a medical soft member.
[0003]
It is known that such microorganism-produced PHA can have various compositions and structures depending on the type of microorganisms used in the production, medium composition, culture conditions, etc., so far mainly improving the physical properties of PHA From such a viewpoint, research on the control of such composition and structure has been made.
[0004]
<< 1 >> First, biosynthesis of PHA obtained by polymerizing monomer units having a relatively simple structure including 3-hydroxybutyric acid (hereinafter abbreviated as 3HB) includes the following.
[0005]
For example, Alkaligenes eutropus H16 strain (Alcaligenes eutropus H16, ATCC No. 17699) and its mutant strains can be obtained by changing the carbon source during the cultivation to produce a copolymer of 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyvaleric acid. Have been reported to be produced at various composition ratios (Japanese Patent Publication No. 6-15604, Japanese Patent Publication No. 7-14352, Japanese Patent Publication No. 8-19227, etc.).
[0006]
In JP-A-5-74492, microorganisms belonging to the genus Methylobacterium sp., Paracoccus sp., Alcaligenes sp., Pseudomonas sp. To 7 to produce a copolymer of 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyvaleric acid.
[0007]
In JP-A-5-93049 and JP-A-7-265065, 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid are obtained by culturing Aeromonas caviae using oleic acid or olive oil as a carbon source. To produce a two-component copolymer of
[0008]
In JP-A-9-191893, Comamonas acidovorans IFO 13852 strain (Comamonas acidovorans IFO 13852) was obtained by culturing with gluconic acid and 1,4-butanediol as a carbon source. It is disclosed to produce polyesters having butyric acid as monomer units.
[0009]
In recent years, research on PHA composed of 3-hydroxyalkanoic acid having a medium chain length (abbreviated as mcl) of up to about 12 carbon atoms has been vigorously conducted. Such PHA synthesis pathways can be roughly classified into two, and specific examples are shown in the following (1) and (2).
(1) Synthesis using β-oxidation:
In Patent Publication No. 2642937, Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 is provided with an acyclic aliphatic hydrocarbon as a carbon source, thereby producing a 3-hydroxyalkanoic acid having 6 to 12 carbon atoms. It is disclosed that PHA having monomer units is produced. In Appl. Environ. Microbiol, 58 (2), 746 (1992), Pseudomonas resinovorans is prepared by using octanoic acid as a single carbon source, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyhexanoic acid, 3 Produces polyesters with monomer units of 3-hydroxyoctanoic acid and 3-hydroxydecanoic acid (quantity ratio 1: 15: 75: 9), and 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxy using hexanoic acid as a single carbon source It has been reported to produce polyesters whose units are hexanoic acid, 3-hydroxyoctanoic acid, and 3-hydroxydecanoic acid (quantity ratio 8: 62: 23: 7). Here, it is considered that the 3-hydroxyalkanoic acid monomer unit having a chain length longer than that of the starting fatty acid passes through the fatty acid synthesis pathway described in (2).
(2) Synthesis using fatty acid synthesis pathway
Int. J. Biol. Macromol., 16 (3), 119 (1994) includes Pseudomonas sp. 61-3 strain, which uses sodium gluconate as a single carbon source. 3-hydroxybutanoic acid, 3-hydroxyhexanoic acid, 3-hydroxyoctanoic acid, 3-hydroxydecanoic acid, 3-hydroxyalkanoic acid such as 3-hydroxydodecanoic acid, and 3-hydroxy-5-cis-decenoic acid, 3-hydroxy- It has been reported to produce polyesters with units of 3-hydroxyalkenoic acid such as 5-cis-dodecenoic acid.
[0010]
By the way, normally, biosynthesis of PHA is carried out by PHA synthase using “D-3-hydroxyacyl-CoA” generated as an intermediate of various intracellular metabolic pathways as a substrate.
[0011]
Here, “CoA” means “coenzyme A”. As described in the prior art of (1) above, when fatty acids such as octanoic acid and nonanoic acid are used as the carbon source, the biosynthesis of PHA is “D-3” generated during the “β oxidation cycle”. -Hydroxyacyl-CoA "is said to be performed as a starting material.
[0012]
The reaction until PHA is biosynthesized through the “β oxidation cycle” is shown below.
[0013]
[Chemical 15]

[0014]
On the other hand, as described in the prior art of (2) above, in the case where PHA is biosynthesized using a saccharide such as glucose as a substrate, the “D-3-hydroxyacyl- "D-3-hydroxyacyl-CoA" converted from "ACP" is said to be performed as a starting material.
Here, “ACP” means “acyl carrier protein”.
[0015]
By the way, as described above, the PHA synthesized in the above (1) and (2) is a PHA composed of a monomer unit having an alkyl group in the side chain, that is, “usual PHA”.
[0016]
<< 2 >> However, considering a wider range of applications of such microorganism-produced PHA, such as application as a functional polymer, PHA (“unusual PHA”) in which a substituent other than an alkyl group is introduced into the side chain is extremely Expected to be useful. Examples of the substituent include those containing an aromatic ring (phenyl group, phenoxy group, benzoyl group, etc.), unsaturated hydrocarbon, ester group, allyl group, cyano group, halogenated hydrocarbon, epoxide and the like. Among these, particularly, PHA having an aromatic ring has been actively studied.
[0017]
(a) including a phenyl group or a partially substituted product thereof
In Makromol. Chem., 191, 1957-1965 (1990) and Macromolecules, 24, 5256-5260 (1991), Pseudomonas oleovorans is 3-hydroxy-5-phenyl using 5-phenylvaleric acid as a substrate. It has been reported to produce PHA containing valeric acid as a unit.
[0018]
Specifically, Pseudomonas oleovorans uses 5-phenylvaleric acid and nonanoic acid as substrates (molar ratio 2: 1, total concentration 10 mmol / L), 3-hydroxyvaleric acid, 3-hydroxyheptanoic acid, 3-hydroxy 160 mg of PHA containing nonanoic acid, 3-hydroxyundecanoic acid, and 3-hydroxy-5-phenylvaleric acid as monomer units in an amount ratio of 0.6: 16.0: 41.1: 1.7: 40.6 per liter of culture solution (dried against cells) (31.6% by weight) and 5-phenylvaleric acid and octanoic acid as substrates (molar ratio 1: 1, total concentration 10 mmol / L), 3-hydroxyhexanoic acid, 3-hydroxyoctanoic acid, 3- Produces PHA containing hydroxydecanoic acid and 3-hydroxy-5-phenylvaleric acid as monomer units in a quantity ratio of 7.3: 64.5: 3.9: 24.3 per liter of culture solution (dry weight ratio 39.2%). It has been reported that. The PHA in this report is considered to be synthesized mainly through the β-oxidation pathway because nonanoic acid and octanoic acid are used.
[0019]
There is a related description in Chirality, 3,492-494 (1991) in addition to the above, and a change in polymer physical properties, which seems to be caused by the inclusion of 3-hydroxy-5-phenylvaleric acid unit, was observed. It has been.
[0020]
In Macromolecules, 29, 1762-1766 (1996), Pseudomonas oleovorans is united with 3-hydroxy-5- (4'-tolyl) valeric acid using 5- (4'-tolyl) valeric acid as a substrate. Has been reported to produce PHA containing.
[0021]
Macromolecules, 32, 2889-2895 (1999) includes 5- (2 ′, 4′-dinitrophenyl) valeric acid as a substrate and Pseudomonas oleovorans to 3-hydroxy-5- (2 ′, 4 ′). It has been reported to produce PHA containing -dinitrophenyl) valeric acid and 3-hydroxy-5- (4'-nitrophenyl) valeric acid as units.
[0022]
(b) Those containing a phenoxy group or a partially substituted product thereof
Macromol. Chem. Phys., 195, 1665-1672 (1994) include 11-phenoxyundecanoic acid as a substrate and Pseudomonas oleovorans as 3-hydroxy-5-phenoxyvaleric acid and 3-hydroxy-9- It has been reported to produce PHA copolymers of phenoxynonanoic acid.
[0023]
Macromoles, 29, 3432-3435 (1996) includes 6-phenoxyhexanoic acid to 3-hydroxy-4-phenoxybutyric acid and 3-hydroxy-6-phenoxyhexanoic acid as a unit using Pseudomonas oleovorans. PHA containing 8-phenoxyoctanoic acid to 3-hydroxy-4-phenoxybutyric acid, 3-hydroxy-6-phenoxyhexanoic acid and 3-hydroxy-8-phenoxyoctanoic acid as a unit from 11-phenoxyundecanoic acid It has been reported to produce PHA containing 3-hydroxy-5-phenoxyvaleric acid and 3-hydroxy-7-phenoxyheptanoic acid as units. The polymer yields in this report are extracted as follows.
[0024]
[Table 1]

[0025]
Japanese Patent Publication No. 2989175 comprises 3-hydroxy-5- (monofluorophenoxy) pentanoate (3H5 (MFP) P) unit or 3-hydroxy-5- (difluorophenoxy) pentanoate (3H5 (DFP) P) unit. Homopolymers, copolymers containing at least 3H5 (MFP) P units or 3H5 (DFP) P units; Pseudomonas putidas for synthesizing these polymers; inventions relating to methods for producing the aforementioned polymers using Pseudomonas are disclosed Patent No. 2989175 discloses from 3-hydroxy-5- (monofluorophenoxy) pentanoate (3H5 (MFP) P) unit or 3-hydroxy-5- (difluorophenoxy) pentanoate (3H5 (DFP) P) unit. Is a homopolymer, at least 3H5 (MFP) P unit The copolymers containing 3H5 (DFP) P units; discloses an invention relates to a process for the preparation of the polymers using the genus Pseudomonas; Pseudomonas putida synthesizing these polymers.
[0026]
These productions are carried out in the following “two-stage culture”.
Incubation time: 1st stage, 24 hours; 2nd stage, 96 hours
The substrate in each stage and the resulting polymer are shown below.
(1) Obtained polymer: 3-hydroxy-5- (monofluorophenoxy) pentanoate homopolymer
First substrate: citric acid, yeast extract
Second stage substrate: monofluorophenoxyundecanoic acid
(2) Polymer obtained: 3-hydroxy-5- (difluorophenoxy) pentanoate homopolymer
First substrate: citric acid, yeast extract
Second stage substrate: Difluorophenoxyundecanoic acid
(3) Obtained polymer: 3-hydroxy-5- (monofluorophenoxy) pentanoate copolymer
First substrate: octanoic acid or nonanoic acid, yeast extract
Second stage substrate: monofluorophenoxyundecanoic acid
(4) Obtained polymer: 3-hydroxy-5- (difluorophenoxy) pentanoate copolymer
First substrate: octanoic acid or nonanoic acid, yeast extract
Second stage substrate: Difluorophenoxyundecanoic acid
As an effect, it is possible to synthesize a polymer having a phenoxy group in which a side chain terminal is substituted with 1 to 2 fluorine atoms by assimilating a medium chain fatty acid having a substituent, and has a high melting point and good processability. It is said that stereoregularity and water repellency can be given while maintaining the above.
[0027]
In addition to such fluorine group-substituted products, studies on substituted products of cyano groups and nitro groups have also been made.
[0028]
Can. J. Microbiol., 41, 32-43 (1995) and Polymer International, 39, 205-213 (1996) include Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 and Pseudomonas putida KT 2442. PHA containing octanoic acid and p-cyanophenoxyhexanoic acid or p-nitrophenoxyhexanoic acid as a substrate and 3-hydroxy-p-cyanophenoxyhexanoic acid or 3-hydroxy-p-nitrophenoxyhexanoic acid as a monomer unit Production has been reported.
[0029]
These reports differ from general PHA whose side chain is an alkyl group, and each has an aromatic ring in the side chain of PHA, which is useful for obtaining a polymer having physical properties derived therefrom.
[0030]
(c) PHA containing a cyclohexyl group in the monomer unit is expected to exhibit different polymer properties from PHA containing ordinary aliphatic hydroxyalkanoic acid as a unit, and an example of production by Pseudomonas oleovorans is reported (Macromolecules, 30, 1611-1615 (1997)).
[0031]
According to this report, when Pseudomonas oleovorans was cultured in a medium in which nonanoic acid and cyclohexylbutyric acid or cyclohexylvaleric acid coexisted, a PHA containing a unit containing a cyclohexyl group and a unit derived from nonanoic acid was obtained ( (Each percentage is unknown).
[0032]
Regarding the yield and the like, it was reported that the amount of cyclohexylbutyric acid and nonanoic acid was changed with respect to cyclohexylbutyric acid under the conditions of a substrate concentration of 20 mmol / L and the results shown in Table 2 were obtained. .
[0033]
[Table 2]

[0034]
CDW: Dry cell weight (mg / L), PDW: Dry polymer weight (mg / L), Yield: PDW / CDW (%)
However, in this example, the polymer yield per culture solution is not sufficient, and the obtained PHA itself also contains nonanoic acid-derived aliphatic hydroxyalkanoic acid in the monomer unit. It is.
[0035]
<< 3 >> Also, as a new category, research has been conducted not only to change physical properties but also to produce PHA with appropriate functional groups in the side chain and to create new functions using these functional groups. Yes.
[0036]
For example, Macromolecules, 31, 1480-1486 (1996) and Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 36, 2381-2387 (1998), etc., synthesized PHA containing a unit having a vinyl group at the end of the side chain. Later, it was reported that PHA containing an epoxy group with high reactivity at the end of the side chain could be synthesized by epoxidation with an oxidizing agent.
[0037]
In addition to the vinyl group, as a synthesis example of PHA containing a unit having a sulfide that is expected to have high reactivity, Macromoncules, 32, 8315-8318 (1999), Pseudomonas putida 27N01 strain is 11- It has been reported that phenylsulfanylvaleric acid is used as a substrate to produce PHA copolymers of 3-hydroxy-5- (phenylsulfanyl) valeric acid and 3-hydroxy-7- (phenylsulfanyl) heptanoic acid.
[0038]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, in the microorganism-produced PHA, various compositions and structures have been obtained by changing the kind of microorganisms used in the production, medium composition, culture conditions, etc. In this case, it cannot be said that the physical properties are still sufficient. In order to further expand the range of utilization of microorganism-produced PHA, it is important to study the physical properties more broadly. For this purpose, PHA containing monomer units having various structures and production methods thereof In addition, it is essential to develop and search for microorganisms that can efficiently produce the desired PHA.
[0039]
On the other hand, the type of PHA (unusual PHA) in which a substituent is introduced into the side chain as described above can be selected according to the desired properties, etc. Due to the excellent PHA that can be expected to develop as a “functional polymer” having extremely useful functions and characteristics, and capable of satisfying both such functionality and biodegradability, In addition, the development and search for microorganisms that can efficiently produce the desired PHA is also an important issue.
[0040]
That is, when a PHA in which various substituents are introduced into the side chain is to be produced by a microorganism, an alkanoate having a substituent to be introduced, as seen in the above-mentioned reports of Pseudomonas oleovorans, In addition to use as a polymer raw material, a method of using it as a carbon source for growth is used.
[0041]
However, in the method of using the alkanoate having a substituent to be introduced as a carbon source for growth in addition to the use as a polymer raw material, the supply of an energy source based on the production of acetyl CoA by β oxidation from the alkanoate In such a method, acetyl CoA cannot be produced by β-oxidation unless the substrate has a certain chain length. For this reason, alkanoates that can be used as PHA substrates are limited. It is a big issue. Further, generally, a substrate whose chain length is shortened by two methylene chains by β-oxidation is newly generated, and these are incorporated as monomer units of PHA, so that the synthesized PHA has a chain length of methylene chain 2 In many cases, the copolymer is composed of different monomer units. In the above reported example, 3-hydroxy-8-phenoxyoctanoic acid derived from 8-phenoxyoctanoic acid as a substrate and 3-hydroxy-6-phenoxyhexanoic acid and 3-hydroxy-4 as metabolite-derived by-products. -A copolymer consisting of three monomer units of phenoxybutyric acid is produced. In this respect, it is extremely difficult to use this method when obtaining a PHA composed of a single monomer unit. Furthermore, in the method based on the supply of an energy source based on the production of acetyl-CoA by β-oxidation, the growth of microorganisms is slow, and it takes time to synthesize PHA, and the yield of synthesized PHA tends to be low. The point is also a big issue.
[0042]
Therefore, a method for extracting PHA after culturing a microorganism in a medium in which medium chain fatty acids such as octanoic acid and nonanoic acid coexist as a growth carbon source in addition to the alkanoate having a substituent to be introduced Is considered effective and is commonly used.
[0043]
However, according to the study by the present inventors, PHA synthesized through β-oxidation pathway using medium chain fatty acids such as octanoic acid and nonanoic acid as a growth carbon source as described above has low purity, More than 50% of the resulting polymer is a monomer unit derived from a carbon source for growth (eg, 3-hydroxyoctanoic acid, 3-hydroxynonanoic acid, etc.). -3HA), that is, a unit of “usual PHA”. These mcl-3HA units are adhesive polymers at room temperature in a single composition, and when they are mixed in a large amount in the target PHA of the present invention, the glass transition temperature (Tg) of the polymer is remarkably lowered. For this reason, when trying to obtain hard polymer properties at room temperature, mixing of mcl-3HA monomer units is not desirable. Further, it is known that such a hetero side chain structure hinders the interaction derived from the side chain structure in the molecule or between the molecules, and greatly affects the crystallinity or orientation.
[0044]
Mixing these mcl-3HA monomer units is a major issue in achieving improvement in polymer properties and imparting functionality. As a means of solving this problem, in order to obtain PHA composed only of monomer units having specific substituents, “untargeted” monomer units such as mcl-3HA monomer units derived from a growth carbon source are separated. / Providing a purification step for removal. However, the operation is complicated and a significant decrease in yield is unavoidable.
[0045]
Further, when the target monomer unit and the non-target monomer unit form a copolymer, it is extremely difficult to remove only the non-target monomer unit. In particular, a monomer unit having a group obtained from an unsaturated hydrocarbon, an ester group, an allyl group, a cyano group, a nitro group, a group obtained from a halogenated hydrocarbon, a group introduced with an epoxide or the like as a side chain structure. When the purpose is to synthesize PHA, the mcl-3HA monomer unit often forms a copolymer with the target monomer unit, and removal of the mcl-3HA monomer unit after PHA synthesis is extremely difficult.
[0046]
For this reason, the present inventors have come to realize that development of a biosynthetic method capable of obtaining “unusual PHA” with high purity is absolutely necessary when considering application to functional polymers. Therefore, an excellent polymer having both functionality and biodegradability as described above, a microorganism capable of producing the polymer and accumulating it in the fungus body, and a method for efficiently biosynthesizing the PHA with high purity. Development was considered extremely useful and important.
[0047]
The present invention solves the above-described problems, and provides a PHA (unusual PHA) containing monomer units having various structures having substituents useful as device materials, medical materials, and the like in the side chain, and the “unusual” Providing a method for producing "PHA" using microorganisms, in particular, a method for producing a target "unusual PHA" with high purity, with a small amount of unintended monomer units, and a high yield Is to provide.
[0048]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, the present inventors aim to develop a PHA having a functional group useful as a device material or a medical material in the side chain, and search for microorganisms having the ability to produce various PHA and accumulate in the microbial cells, and Efforts have been made to produce a desired PHA using such microorganisms. As a result, the chemical formula [7],
[0049]
[Chemical 16]

[0050]
(Wherein n represents an integer from 1 to 8, R represents a halogen atom, -CN, -NO₂, -CH_Three, -C₂H_Five, -C_ThreeH₇, -CF_Three, -C₂F_Five, -C_ThreeF₇Any one selected from the group consisting of )
A substituted benzoylalkanoic acid represented by the chemical formula [8],
[0051]
[Chemical 17]

[0052]
(In the formula, m is at least one selected from the group consisting of n, n-2, n-4, and n-6 and represents an integer of 1 or more, and n represents the chemical formula [7]. n represents an integer of 1 to 8 corresponding to n, and R is a halogen atom corresponding to R in the chemical formula [7], -CN, -NO₂, -CH_Three, -C₂H_Five, -C_ThreeH₇, -CF_Three, -C₂F_Five, -C_ThreeF₇Any one selected from the group consisting of )
A microorganism having the ability to produce and accumulate a novel PHA containing a 3-hydroxy-substituted benzoylalkanoic acid unit represented by the formula: And that the PHA can be biosynthesized by culturing in the presence of sugars, organic acids involved in the TCA cycle, yeast extract or polypeptone, and that the PHA obtained thereby has a relatively high purity. I found it.
[0053]
Specifically, for example, chemical formula [9],
[0054]
[Chemical Formula 18]

[0055]
(Where R is a halogen atom, -CN, -NO₂, -CH_Three, -C₂H_Five, -C_ThreeH₇, -CF_Three, -C₂F_Five, -C_ThreeF₇Any one selected from the group consisting of )
From the substituted benzoylvaleric acid represented by the chemical formula [5],
[0056]
[Chemical Formula 19]

[0057]
(Wherein R is a halogen atom corresponding to R in the chemical formula [9], -CN, -NO₂, -CH_Three, -C₂H_Five, -C_ThreeH₇, -CF_Three, -C₂F_Five, -C_ThreeF₇Any one selected from the group consisting of )
A microorganism having the ability to produce a novel PHA containing a 3-hydroxy-substituted benzoylvaleric acid unit represented by the formula (1) and accumulate it in the microbial cells; And that the PHA can be biosynthesized by culturing in the presence of sugars, organic acids involved in the TCA cycle, yeast extract or polypeptone, and that the PHA obtained thereby has a relatively high purity. I found it.
More specifically, for example, chemical formula [10],
[0058]
[Chemical Formula 20]

[0059]
As a raw material, 5- (4-fluorobenzoyl) valeric acid (hereinafter abbreviated as FBzVA) represented by the chemical formula [6],
[0060]
[Chemical 21]

[0061]
A novel microorganism capable of producing and accumulating new PHA containing 3-hydroxy-5- (4-fluorobenzoyl) valeric acid unit (hereinafter sometimes abbreviated as 3HFBzV) represented by The PHA can be biosynthesized by culturing these microorganisms in the presence of a substituted benzoylalkanoic acid and a saccharide, an organic acid involved in the TCA cycle, yeast extract or polypeptone, and the PHA obtained thereby. Was found to have a relatively high purity, leading to the present invention.
[0062]
That is, the present invention has the chemical formula [2],
[0063]
[Chemical Formula 22]

[0064]
(Wherein n represents an integer from 1 to 8, R represents a halogen atom, -CN, -NO₂, -CH_Three, -C₂H_Five, -C_ThreeH₇, -CF_Three, -C₂F_Five, -C_ThreeF₇Any one selected from the group consisting of )
The present invention relates to a PHA containing a 3-hydroxy-substituted benzoylalkanoic acid unit represented by:
  In the PHA of the present invention, all monomer units other than the target monomer unit represented by the chemical formula [2] are selected from the monomer units represented by the following chemical formula [3] or the following chemical formula [4]. At least one of which is performed.
Embedded image

(In the formula, p represents any integer from 0 to 10.)
Embedded image

(In the formula, q represents either an integer of 3 or 5.)
  In the PHA of the present invention, the ratio of the monomer unit represented by the chemical formula [2] is 0.01 or more and 1 or less.
  More preferably, the PHA of the present invention includes a monomer unit represented by the following chemical formula [5] as a part of the monomer unit represented by the chemical formula [2].
Embedded image

(Where R is a halogen atom, -CN, -NO₂, -CH_Three, -C₂H_Five, -C_ThreeH₇, -CF_Three, -C₂F_Five, -C_ThreeF₇Any one selected from the group consisting of )
  The present invention also relates to a method for producing these PHA, which is a microorganism capable of synthesizing a polyhydroxyalkanoate having the composition using a substituted benzoylalkanoic acid, Pseudomonas cichorii H45 strain (Pseudomonas cichorii H45) , FERM BP-7374), Pseudomonas chicoryai YN2 strain (Pseudomonas cichorii YN2, FERM BP-7375), Pseudomonas jessenii P161 strain (Pseudomonas jessenii P161), FERM BP -7376Culturing at least one strain selected from the group consisting of) in a medium containing the substituted benzoylalkanoic acid;
And a step of isolating the polyhydroxyalkanoate produced by the microorganism.
  Preferably, chemical formula [7],
[0065]
[Chemical Formula 23]

[0066]
(Wherein n represents an integer from 1 to 8, R represents a halogen atom, -CN, -NO₂, -CH_Three, -C₂H_Five, -C_ThreeH₇, -CF_Three, -C₂F_Five, -C_ThreeF₇Any one selected from the group consisting of )
By culturing a microorganism in a medium containing a substituted benzoylalkanoic acid represented by the following formula, the microorganism has the following chemical formula [8],
[0067]
[Chemical formula 24]

[0068]
(In the formula, m is at least one selected from the group consisting of n, n-2, n-4, and n-6 and represents an integer of 1 or more, and n represents the chemical formula [7]. n represents an integer of 1 to 8 corresponding to n, and R is a halogen atom corresponding to R in the chemical formula [7], -CN, -NO₂, -CH_Three, -C₂H_Five, -C_ThreeH₇, -CF_Three, -C₂F_Five, -C_ThreeF₇Any one selected from the group consisting of )
A PHA having a corresponding 3-hydroxy-substituted benzoylalkanoic acid unit represented by.
[0069]
That is, in the method for producing PHA of the present invention, a microorganism producing PHA containing a 3-hydroxy-substituted benzoylalkanoic acid unit is obtained by substituting a substituted benzoylalkanoic acid with a saccharide, an organic acid involved in the TCA cycle, a yeast extract or polypeptone. It has the process of culture | cultivating in coexistence.
[0070]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The PHA of the present invention is a PHA containing monomer units having various structures having substituents useful as device materials, water repellent materials, medical materials, etc. in the side chain, and more specifically, substituted benzoyl groups on the side chain. It is PHA which has. The method for producing PHA of the present invention makes it possible to produce a desired PHA with high purity and high yield using microorganisms. The PHA of the present invention is an isotactic polymer generally composed only of R isomers.
[0071]
<Sugars and organic acids involved in the TCA cycle>
One of the PHA production methods of the present invention is that when cultivating a microorganism, in addition to the desired alkanoic acid for introducing a monomer unit in the medium, as a carbon source other than the alkanoic acid, an organic substance involved in a saccharide or TCA cycle is used. In PHA produced and accumulated by microorganisms by adding an acid, the content of the target monomer unit is remarkably high, or only the target monomer unit is used. The effect of promoting the priority of the specific monomer unit is obtained by adding only a saccharide or an organic acid involved in the TCA cycle as a carbon source other than the alkanoic acid to the medium.
[0072]
In other words, the inventors cultivated saccharides or organic acids involved in the TCA cycle together with alkanoic acid for introducing a desired monomer unit, and then obtained mcl-alkanoic acids such as nonanoic acid and octanoic acid as coexistent substrates. Compared with the conventional method used as the base material, the target PHA can be obtained in a significantly superior yield and purity, and such an effect depends on β-oxidation of the microbial carbon source and the acetyl-CoA as the energy source. The present inventors have obtained the knowledge that it is a culture method that can be produced by a method that does not, and thus have reached the present invention.
[0073]
In the method of the present invention, saccharide compounds such as glucose, fructose, mannose and the like are used as a growth substrate for microorganisms, and the produced PHA is used for introducing a desired monomer unit coexisting with the saccharide. Monomer units derived from saccharides such as glucose, or very little. In this respect, the method of the present invention is fundamentally different from the conventional PHA microorganism production method used as a raw material substrate for a monomer unit that introduces a saccharide such as glucose itself into PHA, both in configuration and effect.
[0074]
<Differences from yeast extract conventional technology>
One of the PHA production methods of the present invention is to add only yeast extract as a carbon source other than the alkanoic acid in addition to the desired alkanoic acid for introducing the monomer unit in the medium when culturing the microorganism, The PHA produced and accumulated by microorganisms is characterized in that the content of the target monomer unit is extremely high or only the target monomer unit is used. The effect of promoting the priority of this specific monomer unit is obtained by adding only yeast extract as a carbon source other than the alkanoic acid to the medium.
[0075]
As an example of using yeast extract as a medium in the production of PHA by microorganisms, there is a method using microorganisms belonging to Rhodobacter sp. Described in JP-A-5-49487. However, this conventional method is a method for producing general PHB and poly-3-hydroxyvaleric acid (hereinafter sometimes abbreviated as PHV) having a hydroxyalkanoate having no substituent as a monomer unit. It is known that the synthesis route of PHA as intended by the present invention is a route independent of the synthesis route for producing PHB and PHV. JP-A-5-49487 discloses the purpose of the present invention. There is no mention of the effect of yeast extract in the PHA synthesis pathway. In addition, the effect of the yeast extract only shows that the addition of the yeast extract has an effect of increasing the amount of PHA accumulated in the microbial cells with respect to PHA and PHV generally produced by microorganisms. Therefore, it is specified that yeast extract is not added.
[0076]
In the present invention, the presence of the substituted benzoylalkanoic acid and the yeast extract allows production and accumulation of PHA as well as growth, and the effects exhibited by the yeast extract are completely different. Furthermore, no mention is made of the predominance of a specific monomer unit, which is an effect of the present invention, and a specific monomer unit having a substituted benzoyl group as a substituent in a PHA composition produced by a microorganism as in the present invention. The effect of dominating is not shown.
[0077]
Furthermore, as an example of using yeast extract for the production of PHA by microorganisms, there is a method using Pseudomonas putida described in Japanese Patent No. 2989175. The PHA production method disclosed here is only based on two-stage culture, and it is disclosed that PHA accumulation is performed only in the second-stage culture under the restriction of nutrient sources other than the carbon source. In this respect, the constitution / effect is completely different from the method of synthesizing and accumulating a desired PHA by only one-stage culture in a medium containing a substituted benzoylalkanoic acid and yeast extract in the present invention.
[0078]
In addition, the effect of the yeast extract in Japanese Patent No. 2989175 is intended only for the growth of microorganisms used for the second stage culture in the first stage culture when the two stage culture is used. It is specified that the eye is cultured under nutrient rich conditions. Here, the substrate of PHA does not coexist in the first stage. The effect of the yeast extract in the present invention is to produce / accumulate PHA along with growth by allowing the substituted benzoylalkanoic acid and the yeast extract to coexist, and the effects exhibited by the yeast extract are completely different.
[0079]
In addition, in Japanese Patent No. 2989175, any one of citric acid, octanoic acid, and nonanoic acid as a carbon source coexists in the first stage culture, and the present invention coexists only with substituted benzoylalkanoic acid and yeast extract. Are different in configuration.
[0080]
<Difference from Polypepton Conventional Technology>
One of the methods for producing PHA of the present invention is to add microorganism peptone as a carbon source other than the alkanoic acid in addition to the desired alkanoic acid for introducing monomer units into the medium when culturing the microorganism. Is characterized in that the content of the target monomer unit is remarkably high, or only the target monomer unit is used. The effect of promoting the priority of the specific monomer unit is obtained by adding only polypeptone as a carbon source other than the alkanoic acid to the medium.
[0081]
As examples of using polypeptone for the production of PHA by microorganisms, JP-A-5-49487, JP-A-5-64591, JP-A-5-214081, JP-A-6-145311, JP-A-6-6 -284892, JP-A-7-48438, JP-A-8-89264, JP-A-9-191893, JP-A-11-32789, etc., when PHA is produced by microorganisms, Although it is disclosed that polypeptone is contained, all of them are used in pre-culture, that is, in a stage where cells are simply grown, and do not contain a substrate that becomes a monomer unit of PHA during pre-culture. There is no example of using polypeptone in the process of producing PHA in cells.
[0082]
On the other hand, the present invention allows production and accumulation of PHA as well as growth by allowing only alkanoic acid for introducing a desired monomer unit and only polypeptone as a carbon source other than the alkanoic acid. The structure and effect are completely different from those of the examples using polypeptone. Furthermore, no mention is made of the predominance of a specific monomer unit, which is an effect of the present invention, and a specific monomer unit having a substituted benzoyl group as a substituent in a PHA composition produced by a microorganism as in the present invention. The effect of dominating is not shown.
[0083]
Hereinafter, microorganisms and culture processes used in the present invention will be described.
[0084]
<PHA monomer unit supply system>
First, the “fatty acid synthesis pathway” which is one of the supply systems of mcl-3HA monomer units mixed in the target PHA will be described in detail.
[0085]
When a saccharide such as glucose is used as a substrate, the alkanoic acid necessary as a cell component is biosynthesized from a “fatty acid synthesis pathway” starting from acetyl CoA produced from the saccharide via a “glycolytic system”. Fatty acid synthesis includes a de novo synthesis route and a carbon chain extension route, which will be described below.
[0086]
(1) De novo synthesis route
Catalyzed by two enzymes: acetyl CoA carboxylase (EC 6.4.1.2) and fatty acid synthase (EC 2.3.1.85). Acetyl CoA carboxylase is an enzyme that intervenes biotin and finally catalyzes the following reaction to produce malonyl CoA from acetyl CoA, and the reaction is represented by the following formula.
Acetyl CoA + ATP + HCO_Three ^-⇔ Malonyl CoA + ADP + Pi
The fatty acid synthase is an enzyme that catalyzes a reaction cycle of transfer-condensation-reduction-dehydration-reduction, and the entire reaction is represented by the following reaction formula.
Acetyl CoA + n Malonyl CoA + 2nNADPH + 2nH⁺ ⇒ CH_Three(CH₂)_2nCOOH + nCO₂+ 2nNADP⁺+ (n-1) CoA
Depending on the type of enzyme, the reaction product may be a free acid, a CoA derivative, or an ACP derivative. Here, acetyl CoA is represented by the following chemical formula:
[0087]
[Chemical Formula 25]

[0088]
Malonyl CoA is represented by the following chemical formula.
[0089]
[Chemical 26]

[0090]
CoA is an abbreviation for coenzyme A and is represented by the following chemical formula.
[0091]
[Chemical 27]

[0092]
Among these reaction routes, “D-3-hydroxyacyl ACP” serving as a monomer substrate for PHA biosynthesis is supplied as an intermediate by the route shown below. In addition, as shown in the following reaction formula, the route is extended to palmitic acid finally while adding two carbons at a time. Therefore, seven types of “D-3-hydroxyacyl ACP” having an even number of carbon atoms of “D-3-hydroxypalmityl ACP” are supplied from “D-3-hydrobutyryl ACP” as a monomer substrate for PHA biosynthesis. Will be.
[0093]
[Chemical 28]

[0094]
(2) Carbon chain extension pathway
This pathway involves the addition of malonyl ACP to acyl ACP, and finally acyl ACP (and CO 2 with two extended carbon chains).₂) (Route A) and acetyl CoA is added to acyl CoA, and finally the route becomes acyl CoA with two extended carbon chains (route B). The Each route will be described below.

・ Route B
R-CO-CoA + acetyl-CoA → R-CO-CH₂-CO-CoA
R-CO-CH₂-CO-CoA → R-CHOH-CH₂-CO-CoA →
R-CH = CH-CO-CoA → R-CH₂-CH₂-CO-CoA
In both systems A and B, “D-3-hydroxyacyl CoA” or “D-3-hydroxyacyl ACP” is generated as an intermediate, and “D-3-hydroxyacyl CoA” is directly used as a monomer substrate for PHA synthesis. It is considered that “D-3-hydroxyacyl ACP” is converted to “D-3-hydroxyacyl CoA” by ACP-CoA transferase and then used as a monomer substrate for PHA synthesis.
[0095]
When saccharides such as glucose are used as substrates, it is considered that mcl-3HA monomer units are produced in microbial cells via the “glycolytic system” and “fatty acid synthesis pathway” as described above. When an organic acid involved in the TCA cycle is used as a substrate, acetyl-CoA is directly generated from pyruvic acid by pyruvic acid dehydrogenase. From oxaloacetic acid, phosphoenolpyruvate is catalyzed by phosphoenolpyruvate carboxykinase to generate pyruvate, and acetyl CoA is generated by the above reaction. It is considered that acetyl CoA produced by these reactions produces an mcl-3HA monomer unit via the “fatty acid synthesis pathway”.
[0096]
Here, for example, mcl-alkanoic acids such as octanoic acid and nonanoic acid, or functional groups other than linear aliphatic alkyl, such as 5-phenylvaleric acid, 4-phenoxybutyric acid and 4-cyclohexylbutyric acid, are added to the terminal. The resulting alkanoic acid is converted into a CoA derivative by CoA ligase (EC 6.2.1.3, etc.), and becomes a “D-3-hydroxyacyl CoA” that directly becomes a monomer substrate for PHA biosynthesis by a group of enzymes responsible for β-oxidation. It is done.
[0097]
In other words, mcl-3HA monomer units generated from saccharides or organic acids involved in the TCA cycle are produced through a multi-stage enzymatic reaction (ie indirectly), compared to mcl-alkanoic acids. The mcl-3HA monomer unit is directly generated.
[0098]
Here, the production of acetyl CoA responsible for the growth of microorganisms will be described. In the method in which mcl-alkanoic acid is allowed to coexist in addition to the target alkanoic acid for introducing a monomer unit, acetyl CoA is produced by passing these alkanoic acids through a β-oxidation system. In general, compared to alkanoic acids having bulky substituents (alkanoic acids having substituents such as phenyl, phenoxy, and cyclohexyl groups), mcl-alkanoic acids have excellent substrate affinity with β-oxidation enzymes. Thus, acetyl CoA is effectively produced by the coexistence of mcl-alkanoic acid. For this reason, it is advantageous for the growth of microorganisms using acetyl-CoA as an energy source and a carbon source.
[0099]
However, since mcl-alkanoic acid that passes through the β-oxidation system directly becomes a monomer unit of PHA, the produced PHA contains many mcl-3HA monomer units in addition to the target monomer unit. It is a big problem.
[0100]
In order to solve this problem, it is desirable to select a substrate that can effectively supply acetyl-CoA or an energy source and a carbon source other than mcl-alkanoic acid, and coexist with the desired alkanoic acid. As described above, acetyl-CoA can become a monomer unit of PHA through a fatty acid synthesis pathway, but it is an indirect one that needs to go through a multi-step reaction as compared with mcl-alkanoic acid. By appropriately selecting the culture conditions such as the concentration of the substrate that can produce acetyl-CoA, it is possible to realize a production method that is substantially free of mcl-3HA or little.
[0101]
In addition, a production method is generally used in which culture is performed only for the growth of microorganisms in the first stage, and only the target alkanoic acid is added as a carbon source to the medium in the second stage. Here, since the acyl CoA ligase, which is a β-oxidation initial enzyme that converts the alkanoic acid to acyl-CoA, requires ATP, according to the study by the inventors, microorganisms are used as an energy source even in the second stage. The present invention was completed by obtaining a result that the production method in which the obtained substrate coexists was more effective.
[0102]
Examples of substrates that can effectively supply acetyl-CoA or energy source and carbon source in the method of the present invention include aldoses such as glyceraldehyde, erythrol, arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, fructose, glycerol, erythritol, xylitol, etc. Alditols, aldonic acids such as gluconic acid, uronic acids such as glucuronic acid and galacturonic acid, saccharides such as disaccharides such as maltose, sucrose, and lactose, as well as lactic acid, pyruvic acid, malic acid, citric acid, succinic acid, fumaric acid And organic acids involved in the TCA cycle such as salts thereof, and further, medium components derived from natural products such as yeast extract, polypeptone, meat extract, casamino acid, etc., without acetyl-CoA or energy source and carbon source without going through β-oxidation system Any compound that can supply May also be used any compound can be suitably selected in utility as substrates for strains to be used. In addition, it is possible to select and use a plurality of compounds as long as the combination is less mixed with mcl-3HA.
[0103]
<Microorganism>
As the microorganism used in the present invention, any microorganism can be used as long as it can produce PHA containing the 3-hydroxy-substituted benzoylalkanoic acid unit from the substituted benzoylalkanoic acid as a raw material. In addition, a plurality of microorganisms can be mixed and used as necessary within the range in which the object of the present invention can be achieved.
[0104]
The present inventors searched for microorganisms having the ability to produce PHA containing 3HFBzV or the like as a monomer unit and accumulate it in the cells using FBzVA or the like as a substrate. As a result, Pseudomonas chicory eye H45 strain (Pseudomonas cichorii H45), Pseudomonas chicory eye YN2 strain, Pseudomonas cichorii YN2 strain, Pseudomonas cichorii YN2 strain, which are microorganisms isolated from soil by the present inventors. P161 strain (Pseudomonas jessenii P161) and the like were found to have the desired ability. The H45 strain is deposited under the deposit number “FERM BP-7374”, the YN2 strain is deposited under the deposit number “FERM BP-7375”, and the P161 strain is deposited under the deposit number “FERM BP-7376”. Deposited at the Biological Depositary Center (formerly Patent Microorganism Depositary Center for Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry).
[0105]
The bacteriological properties of the aforementioned H45 strain, YN2 strain and P161 strain are listed as follows. For the P161 strain, the base sequence of 16srRNA is shown in SEQ ID NO: 1.
<Mycological properties of H45 strain>

(2) Physiological properties
Catalase: positive
Oxidase: Positive
O / F test: Oxidized type
Reduction of nitrate: negative
Indole formation: Negative
Glucose acidification: Negative
Arginine dihydrolase: Negative
Urease: Negative
Esculin hydrolysis: Negative
Gelatin hydrolysis: negative
β-galactosidase: negative
Fluorescent dye production on King's B agar: Positive
Growth with 4% NaCl: Negative
Accumulation of poly-β-hydroxybutyric acid: negative
(3) Substrate utilization ability
Glucose: Positive
L-arabinose: negative
D-mannose: positive
D-mannitol: positive
N-acetyl-D-glucosamine: positive
Maltose: Negative
Potassium gluconate: positive
n-Capric acid: Positive
Adipic acid: Negative
dl-malic acid: positive
Sodium citrate: positive
Phenyl acetate: positive
<Mycological properties of YN2 strain>

(2) Physiological properties
Catalase: positive
Oxidase: Positive
O / F test: Oxidized type
Reduction of nitrate: negative
Indole formation: Positive
Glucose acidification: Negative
Arginine dihydrolase: Negative
Urease: Negative
Esculin hydrolysis: Negative
Gelatin hydrolysis: negative
β-galactosidase: negative
Fluorescent dye production on King's B agar: Positive
Growth with 4% NaCl: Positive (weak growth)
Accumulation of poly-β-hydroxybutyric acid: negative
Tween 80 hydrolysis: positive
(3) Substrate utilization ability
Glucose: Positive
L-arabinose: positive
D-Mannose: Negative
D-mannitol: Negative
N-acetyl-D-glucosamine: negative
Maltose: Negative
Potassium gluconate: positive
n-Capric acid: Positive
Adipic acid: Negative
dl-malic acid: positive
Sodium citrate: positive
Phenyl acetate: positive
<Mycological properties of P161 strain>

(2) Physiological properties
Catalase: positive
Oxidase: Positive
O / F test: Oxidized type
Nitrate reduction: Positive
Indole formation: Negative
Glucose acidification: Negative
Arginine dihydrolase: Positive
Urease: Negative
Esculin hydrolysis: Negative
Gelatin hydrolysis: negative
β-galactosidase: negative
Fluorescent dye production on King's B agar: Positive
(3) Substrate utilization ability
Glucose: Positive
L-arabinose: positive
D-mannose: positive
D-mannitol: positive
N-acetyl-D-glucosamine: positive
Maltose: Negative
Potassium gluconate: positive
n-Capric acid: Positive
Adipic acid: Negative
dl-malic acid: positive
Sodium citrate: positive
Phenyl acetate: positive
In addition to microorganisms belonging to the genus Pseudomonas, they belong to the genus Aeromonas sp., Comamonas sp., Burkholderia sp., Etc., and the substituted benzoylalkanoic acid as a raw material, It is also possible to use a microorganism that produces PHA containing the 3-hydroxy-substituted benzoylalkanoic acid unit as a monomer unit.
[0106]
<Culture>
The target PHA can be produced by culturing these microorganisms in a medium containing the desired alkanoic acid for introducing a monomer unit and the growth substrate of the present invention. Such PHA is generally composed only of the R-isomer and is an isotactic polymer.
[0107]
For normal culture of microorganisms used in the method for producing PHA according to the present invention, for example, preparation of conserved strains, proliferation to ensure the number of bacteria and activity necessary for production of PHA, etc. A medium containing the necessary components is appropriately selected and used. For example, as long as it does not adversely affect the growth and survival of microorganisms, any type of medium such as a general natural medium (meat medium, yeast extract, etc.) or a synthetic medium supplemented with a nutrient source can be used.
[0108]
For the culture, any culture method can be used as long as the microorganism grows and produces PHA such as liquid culture and solid culture. Furthermore, the types such as batch culture, fed-batch culture, semi-continuous culture, and continuous culture are not limited. As a form of liquid batch culture, there are a method of supplying oxygen by shaking with a shake flask, and a method of supplying oxygen by stirring aeration using a jar fermenter. Further, a multistage system in which these steps are connected in a plurality of stages may be adopted.
[0109]
When a PHA containing a 3-hydroxy-substituted benzoylalkanoic acid unit is produced using a PHA-producing microorganism as described above, a corresponding substituted benzoylalkanoic acid as a raw material for PHA production, a carbon source for microorganism growth, An inorganic medium or the like containing at least can be used.
As a carbon source for growth, medium components derived from natural products such as yeast extract, polypeptone, meat extract, casamino acid, etc. can be used. Furthermore, sugars, organic acids involved in the TCA cycle (intermediate in the TCA cycle) Any compound that produces acetyl-CoA without undergoing β-oxidation cycle, such as organic acid generated as a body and organic acid generated from TCA cycle through one-step or two-step biochemical reaction) or its salts And can be appropriately selected depending on its usefulness as a substrate for the strain to be used. In addition, it is possible to select and use a plurality of compounds as long as the combination is less mixed with mcl-3HA.
[0110]
Among these, saccharides include aldose such as glyceraldehyde, erythrose, arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, fructose, alditol such as glycerol, erythritol, xylitol, aldonic acid such as gluconic acid, glucuronic acid, galacturonic acid, etc. One or more compounds selected from disaccharides such as uronic acid, maltose, sucrose, and lactose can be suitably used.
[0111]
Examples of organic acids or salts thereof include pyruvic acid, oxaloacetic acid, citric acid, isocitric acid, ketoglutaric acid, succinic acid, fumaric acid, malic acid, lactic acid, etc., or one selected from salts thereof. The above compounds can be suitably used.
Among these, it is particularly preferable to use a saccharide, and it is more preferable to use at least one selected from the group consisting of glucose, fructose, and mannose.
[0112]
As a method for producing and accumulating PHA in microorganisms, once the cells are sufficiently grown, the cells are transferred to a medium with a limited nitrogen source, such as ammonium chloride, and further added with a compound serving as a substrate of the target unit. Culturing may improve productivity. Specifically, it is possible to employ a multi-stage system in which the above steps are connected in a plurality of stages. For example, culture is performed from the late logarithmic growth phase to the stationary phase in an inorganic medium containing 0.05% to 5.0% D-glucose and 0.01% to 1.0% substituted benzoylalkanoic acid, and the cells are centrifuged. And then further culturing in an inorganic medium containing about 0.01% to 1.0% of substituted benzoylalkanoic acid, with a nitrogen source restricted or substantially absent.
[0113]
The inorganic medium used in the above culture method may be any medium that contains a microorganism-growing component such as a phosphorus source (for example, phosphate), a nitrogen source (for example, ammonium salt, nitrate, etc.). Examples of the inorganic salt medium include MSB medium, E medium (J. Biol. Chem., 218, 97-106 (1956)), M9 medium, and the like. The composition of the M9 medium used in the examples of the present invention is as follows.
Na₂HPO_Four : 6.2g
KH₂PO_Four  : 3.0g
NaCl: 0.5g
NH_FourCl: 1.0g
(PH 7.0 in 1 liter of medium)
Furthermore, for good growth and PHA production, it is preferable to add about 0.3% (v / v) of the following trace component solution to the above-mentioned inorganic salt medium.
Trace component solution
Nitrilotriacetic acid: 1.5g
MgSO_Four      : 3.0g
MnSO_Four      : 0.5g
NaCl: 1.0g
FeSO_Four       : 0.1g
CaCl₂        : 0.1g
CoCl₂        : 0.1g
ZnSO_Four       : 0.1g
CuSO_Four       : 0.1g
AlK (SO_Four)₂  : 0.1g
H_ThreeBO_Three       : 0.1g
Na₂MoO_Four     : 0.1g
NiCl₂        : 0.1g
(In 1 liter)
The culture temperature may be any temperature at which the above-mentioned strain can grow well.
[0114]
As a specific example, the cells are cultured in an inorganic medium or the like containing about 0.05% to 5.0% D-glucose and about 0.01% to 1.0% of substituted benzoylalkanoic acid. The desired PHA can be extracted by recovering the body and containing little or no unintended monomer units. Such PHA is generally composed only of the R-isomer and is an isotactic polymer.
[0115]
Instead of D-glucose, the same amount of organic acid involved in the TCA cycle, yeast extract, or polypeptone may be given. Moreover, you may use those combination.
[0116]
<Recovery of PHA>
For obtaining PHA from the culture solution according to the present invention, a conventional method can be applied. When PHA is secreted into the culture solution, an extraction and purification method from the culture solution is used. When PHA is accumulated in the bacterial cells, an extraction and purification method from the bacterial cells is used. For example, for the recovery of PHA from cultured cells of microorganisms, extraction with an organic solvent such as chloroform, which is usually performed, is the simplest, but dioxane, tetrahydrofuran, acetonitrile, acetone may be used in addition to chloroform. . In an environment where organic solvents are difficult to use, PHA is recovered by removing bacterial components other than PHA by treatment with a surfactant such as SDS, treatment with an enzyme such as lysozyme, or treatment with a chemical such as EDTA. It is also possible to use a method of
[0117]
The culture of the microorganism of the present invention, the production and accumulation of PHA by the microorganism of the present invention, and the recovery of PHA from the cells of the present invention are not limited to the above methods.
[0118]
Examples are shown below. In the following, “%” is based on weight unless otherwise specified.
[0119]
【Example】
(Reference example) Synthesis of 4'-fluoro-n-heptanophenone
100 ml of tetrahydrofuran was put into a four-necked round bottom flask, 7.92 g (0.05 mol) of 4-fluorobenzoyl chloride and 0.53 g (1.5 mmol) of tris (acetylacetone) iron (III) were added, and the mixture was stirred under a nitrogen atmosphere. To this solution, pentylmagnesium bromide was added at room temperature and stirred for 10 minutes at room temperature. After completion of the reaction, the mixture was acidified with dilute hydrochloric acid in an ice bath, and the organic phase was extracted with diethyl ether. Furthermore, it neutralized with saturated sodium hydrogencarbonate aqueous solution, and wash | cleaned the organic phase with saturated sodium chloride aqueous solution. The organic phase was dehydrated with anhydrous magnesium sulfate, and then diethyl ether was distilled off with a rotary evaporator and dried with a vacuum pump to obtain crude 4′-fluoro-n-heptanophenone.
[0120]
For purification, it is isolated by silica gel column chromatography (developing solvent; n-hexane: ethyl acetate = 30: 1), recrystallized with n-hexane, and 5.23 g of 4′-fluoro-n-heptanophenone is obtained. Obtained.
[0121]
The obtained compound was subjected to NMR analysis under the following conditions.

¹The H-NMR spectrum is shown in FIG. 1, and the assignment result (see chemical formula [11]) is shown in Table 3.
[0122]
[Table 3]

[0123]
[Chemical 29]

[0124]
The purified product thus obtained was analyzed and identified by a gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI method). The GC-MS spectrum data is shown in FIG. As a result, 4'-fluoro-n-heptanophenone was 87% in terms of GC-MS TIC area ratio.
(Example 1)
Pseudomonas chicory eye YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing D-glucose 0.5%, 4′-fluoro-n-heptanophenone 0.05%, and cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 5 days, the cells were collected by centrifugation, suspended in a 10% sodium hypochlorite solution, and shaken at 4 ° C. for 2 hours to extract PHA. The extract was centrifuged to collect a precipitate, which was washed with water and then vacuum dried to obtain PHA.
The obtained PHA was analyzed using a nuclear magnetic resonance apparatus (FT-NMR: Bruker DPX 400) under the following measurement conditions.
<Measurement conditions>
Measurement nuclide:¹H
Solvent used: CDCl_Three(TMS / CDCl_Three(Use as a reference in capillary encapsulation)
Resonance frequency:¹H = 400 MHz
¹The H-NMR spectrum is shown in FIG. 3, and the assignment result (see chemical formula [12]) is shown in Table 4.
[0125]
[Table 4]

[0126]
[Chemical 30]

[0127]
Further, the obtained PHA is subjected to methanolysis according to a conventional method, and then analyzed by a gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI method) to identify the methyl esterified product of the PHA monomer unit. Was done. As a result, as shown in Table 5, it was confirmed that the PHA was PHA containing 3HFBzV as a monomer unit.
[0128]
[Table 5]

[0129]
The molecular weight of this PHA was evaluated by gel permeation chromatography (GPC; Tosoh HLC-8220, column; Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5 μm), solvent; chloroform, converted to polystyrene). As a result, Mn = 26,000, Mw = 142,000. there were.
[0130]
(Example 2)
Pseudomonas chicory eye YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% D-glucose and 0.1% 4′-fluoro-n-heptanophenone, and cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and vacuum-dried.
[0131]
This vacuum-dried pellet was suspended in 20 ml of chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm and then concentrated with a rotary evaporator. The concentrate was reprecipitated in cold methanol, and only the precipitate was recovered and vacuum dried to obtain PHA.
[0132]
This PHA was subjected to methanolysis according to a conventional method and then analyzed by a gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI method) to identify the methyl esterified product of the PHA monomer unit. The results are shown in Table 6.
[0133]
[Table 6]

[0134]
From the above results, it was confirmed that the PHA was PHA containing 3HFBzV as a monomer unit.
[0135]
Example 3
Pseudomonas chicory eye YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% sodium glutamate, 0.1% 4′-fluoro-n-heptanophenone, and cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 7 days, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and vacuum-dried.
[0136]
This vacuum-dried pellet was suspended in 20 ml of chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm and then concentrated with a rotary evaporator. The concentrate was reprecipitated in cold methanol, and only the precipitate was recovered and vacuum dried to obtain PHA.
[0137]
This PHA was subjected to methanolysis according to a conventional method and then analyzed by a gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI method) to identify the methyl esterified product of the PHA monomer unit. The results are shown in Table 7.
[0138]
[Table 7]

[0139]
From the above results, it was confirmed that the PHA was PHA containing 3HFBzV as a monomer unit.
[0140]
Example 4
Pseudomonas chicory eye YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% sodium glutamate, 0.1% 4′-fluoro-n-heptanophenone, and cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and vacuum-dried.
[0141]
This vacuum-dried pellet was suspended in 20 ml of chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm and then concentrated with a rotary evaporator. The concentrate was reprecipitated in cold methanol, and only the precipitate was recovered and vacuum dried to obtain PHA.
[0142]
This PHA was subjected to methanolysis according to a conventional method and then analyzed by a gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI method) to identify the methyl esterified product of the PHA monomer unit. The results are shown in Table 8.
[0143]
[Table 8]

[0144]
From the above results, it was confirmed that the PHA was PHA containing 3HFBzV as a monomer unit.
[0145]
(Example 5)
Pseudomonas chicory eye YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% D-glucose and 0.1% FBzVA, and cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, and a nitrogen source (NH containing 0.5% D-glucose and 0.1% FBzVA) was used._FourThe suspension was resuspended in 200 ml of M9 medium not containing Cl) and further cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 40 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized.
[0146]
This freeze-dried pellet was suspended in 20 ml of chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm and then concentrated with a rotary evaporator. The concentrate was reprecipitated in cold methanol, and only the precipitate was recovered and vacuum dried to obtain PHA.
[0147]
The obtained PHA was subjected to methanolysis according to a conventional method, and then analyzed with a gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI method) to identify the methyl esterified product of the PHA monomer unit. It was. As a result, as shown in Table 9, it was confirmed that the PHA was PHA containing 3HFBzV as a monomer unit.
[0148]
[Table 9]

[0149]
The molecular weight of this PHA was evaluated by gel permeation chromatography (GPC; Tosoh HLC-8220, column; Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5 μM), solvent; chloroform, converted to polystyrene). As a result, Mn = 30,000 and Mw = 78,000. there were.
[0150]
Example 6
Pseudomonas chicory eye YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% D-glucose and 0.1% FBzVA, and cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and vacuum-dried.
[0151]
This vacuum-dried pellet was suspended in 20 ml of chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm and then concentrated with a rotary evaporator. The concentrate was reprecipitated in cold methanol, and only the precipitate was recovered and vacuum dried to obtain PHA.
[0152]
This PHA was subjected to methanolysis according to a conventional method, and then analyzed by a gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI method) to identify the methyl esterified product of the PHA monomer unit. As a result, as shown in Table 10, the PHA was confirmed to be PHA containing 3HFBzV as a monomer unit.
[0153]
[Table 10]

[0154]
(Example 7)
Pseudomonas chicory eye YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% disodium malate and 0.1% FBzVA, and cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 4 days, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and vacuum-dried.
[0155]
This vacuum-dried pellet was suspended in 20 ml of chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm and then concentrated with a rotary evaporator. The concentrate was reprecipitated in cold methanol, and only the precipitate was recovered and vacuum dried to obtain PHA.
[0156]
This PHA was subjected to methanolysis according to a conventional method, and then analyzed by a gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI method) to identify the methyl esterified product of the PHA monomer unit. As a result, as shown in Table 11, the PHA was confirmed to be PHA containing 3HFBzV as a monomer unit.
[0157]
[Table 11]

[0158]
(Example 8)
Pseudomonas chicory eye YN2 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% yeast extract (produced by Oriental Yeast Co., Ltd.) and 0.1% FBzVA, and cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and vacuum-dried.
[0159]
This vacuum-dried pellet was suspended in 20 ml of chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm and then concentrated with a rotary evaporator. The concentrate was reprecipitated in cold methanol, and only the precipitate was recovered and vacuum dried to obtain PHA.
[0160]
This PHA was subjected to methanolysis according to a conventional method, and then analyzed by a gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI method) to identify the methyl esterified product of the PHA monomer unit. The results are shown in Table 12. It was confirmed that the PHA was a PHA containing 3HFBzV as a monomer unit.
[0161]
[Table 12]

[0162]
Example 9
Pseudomonas chicory eye strain YN2 was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% polypeptone (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and 0.1% FBzVA, and cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and vacuum-dried.
[0163]
This vacuum-dried pellet was suspended in 20 ml of chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm and then concentrated with a rotary evaporator. The concentrate was reprecipitated in cold methanol, and only the precipitate was recovered and vacuum dried to obtain PHA.
[0164]
This PHA was subjected to methanolysis according to a conventional method, and then analyzed by a gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI method) to identify the methyl esterified product of the PHA monomer unit. As shown in Table 13, the PHA was confirmed to be PHA containing 3HFBzV as a monomer unit.
[0165]
[Table 13]

[0166]
(Example 10)
Pseudomonas chicory eye H 45 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% D-glucose and 0.1% FBzVA and cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, and a nitrogen source (NH containing 0.5% D-glucose and 0.1% FBzVA) was used._FourThe suspension was resuspended in 200 ml of M9 medium not containing Cl) and further cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 40 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized.
[0167]
This freeze-dried pellet was suspended in 20 ml of chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm and then concentrated with a rotary evaporator. The concentrate was reprecipitated in cold methanol, and only the precipitate was recovered and vacuum dried to obtain PHA.
[0168]
This PHA was subjected to methanolysis according to a conventional method, and then analyzed by a gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI method) to identify the methyl esterified product of the PHA monomer unit. As a result, as shown in Table 14, the PHA was confirmed to be PHA containing 3HFBzV as a monomer unit.
[0169]
[Table 14]

[0170]
The molecular weight of this PHA was evaluated by gel permeation chromatography (GPC; Tosoh HLC-8220, column; Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5 μM), solvent; chloroform, converted to polystyrene). As a result, Mn = 26,000, Mw = 61,000. there were.
[0171]
(Example 11)
Pseudomonas jessenii P161 strain was inoculated into 200 ml of M9 medium containing 0.5% D-glucose and 0.1% FBzVA and cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, and a nitrogen source (NH containing 0.5% D-glucose and 0.1% FBzVA) was used._FourThe suspension was resuspended in 200 ml of M9 medium not containing Cl) and further cultured with shaking at 30 ° C. and 125 strokes / min. After 40 hours, the cells were collected by centrifugation, washed once with cold methanol and lyophilized.
[0172]
This freeze-dried pellet was suspended in 20 ml of chloroform and stirred at 60 ° C. for 20 hours to extract PHA. The extract was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm and then concentrated with a rotary evaporator. The concentrate was reprecipitated in cold methanol, and only the precipitate was recovered and vacuum dried to obtain PHA.
[0173]
This PHA was subjected to methanolysis according to a conventional method, and then analyzed by a gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI method) to identify the methyl esterified product of the PHA monomer unit. As a result, as shown in Table 15, the PHA was confirmed to be PHA containing 3HFBzV as a monomer unit.
[0174]
[Table 15]

[0175]
The molecular weight of this PHA was evaluated by gel permeation chromatography (GPC; Tosoh HLC-8220, column; Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5 μM), solvent; chloroform, converted to polystyrene). As a result, Mn = 41,000 and Mw = 110,000. there were.
[0176]
【The invention's effect】
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, provision of PHA (unusual PHA) containing monomer units having various structures having substituents useful as device materials, medical materials, etc. in the side chain, and producing the “unusual PHA” using microorganisms A way to do it became possible.
[0177]
In particular, it is possible to obtain a target “unusual PHA” with high purity and to provide a high-yield production method with little inclusion of unintended monomer units.
[0178]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 in the reference example¹An H-NMR spectrum chart is shown.
FIG. 2 shows TIC and mass spectrum when 4′-fluoro-n-heptanophenone obtained in Reference Example is measured by GC-MS.
FIG. 3 shows a first embodiment.¹An H-NMR spectrum chart is shown.

Claims (4)

A polyhydroxyalkanoate having a monomer unit composition represented by the following formula [1].
A _x B _(1-x) [1]
(Wherein, A is at least one or more represented by the following chemical formula [2], and B is at least one or more selected from the monomer units represented by the following chemical formula [3] or the following chemical formula [4]. And x is not less than 0.01 and not more than 1.)

(Wherein n represents an integer of 1 to 8, R represents a halogen atom, —CN, —NO ₂ , —CH ₃ , —C ₂ H ₅ , —C ₃ H ₇ , —CF ₃ , This represents one selected from the group consisting of -C ₂ F ₅ and -C ₃ F _7. )

(In the formula, p represents any integer from 0 to 10.)

(In the formula, q represents either an integer of 3 or 5.) The polyhydroxyalkanoate according to claim 1, comprising a monomer unit represented by the chemical formula [5].

(In the formula, R is a halogen atom, —CN, —NO ₂ , —CH ₃ , —C ₂ H ₅ , —C ₃ H ₇ , —CF ₃ , —C ₂ F ₅ , —C ₃ F _7. (Represents any one selected from the group.) A method for producing a polyhydroxyalkanoate having a monomer unit composition represented by the following formula [1],
Pseudomonas chicory eye strain H45 (Pseudomonas cichorii H45, FERM BP-7374), Pseudomonas chicory eye strain YN2 (Pseudomonas cichorii), which are microorganisms capable of synthesizing polyhydroxyalkanoates having the above composition using substituted benzoylalkanoic acid YN2, FERM BP-7375), Pseudomonas jessenii P161 strain (Pseudomonas jessenii P161 , FERM) Culturing at least one strain selected from the group consisting of BP- 7376 ) in a medium containing the substituted benzoylalkanoic acid;
And a step of isolating the polyhydroxyalkanoate produced by the microorganism.
A _x B _(1-x) [1]
(Wherein, A is at least one or more represented by the following chemical formula [2], and B is at least one or more selected from the monomer units represented by the following chemical formula [3] or the following chemical formula [4]. And x is not less than 0.01 and not more than 1.)

(Wherein n represents an integer of 1 to 8, R represents a halogen atom, —CN, —NO ₂ , —CH ₃ , —C ₂ H ₅ , —C ₃ H ₇ , —CF ₃ , This represents one selected from the group consisting of -C ₂ F ₅ and -C ₃ F _7. )

(In the formula, p represents any integer from 0 to 10.)

(In the formula, q represents either an integer of 3 or 5.) The substituted benzoylalkanoic acid is a substituted benzoylalkanoic acid represented by the following chemical formula [7], and the polyhydroxyalkanoate is a polyhydroxyalkanoate containing a monomer unit represented by the following chemical formula [8]. A process for producing the polyhydroxyalkanoate described.

(Wherein n represents an integer of 1 to 8, R represents a halogen atom, —CN, —NO ₂ , —CH ₃ , —C ₂ H ₅ , —C ₃ H ₇ , —CF ₃ , This represents one selected from the group consisting of -C ₂ F ₅ and -C ₃ F _7. )

(In the formula, m is at least one selected from the group consisting of n, n-2, n-4, and n-6 and represents an integer of 1 or more, and n represents the chemical formula [7]. n represents an integer of 1 to 8 corresponding to n, and R represents a halogen atom, —CN, —NO ₂ , —CH ₃ , —C ₂ H ₅ , —C corresponding to R in the chemical formula [7]. _(It represents any one selected from the group consisting of ₃ H ₇ , —CF ₃ , —C ₂ F ₅ , and —C ₃ F _7. )

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