JP4245324B2

JP4245324B2 - How to collect and recover monocytes

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Publication number: JP4245324B2
Application number: JP2002296521A
Authority: JP
Inventors: 純人関; 幹智安武
Original assignee: Asahi Kasei Kuraray Medical Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Kuraray Medical Co Ltd
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2002-10-09
Publication date: 2009-03-25
Anticipated expiration: 2022-10-09
Also published as: JP2004129550A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、末梢血、臍帯血、骨髄等の細胞が浮遊する体液から単球を高純度に分離回収する方法及びこのようにして得られた単球を高純度に含む単球組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
単球／マクロファージは血液中あるいは組織中に含まれる有核細胞の一種であり、老朽化した自己細胞あるいは外来の細菌を食する作用を有する他、種々のサイトカインやプロテアーゼを産生する多機能細胞である。近年、これらの細胞を利用した細胞治療法が盛んに行われており、例えば、末梢血由来単球から分化誘導したマクロファージによる皮膚潰瘍や壊死／壊疽等の虚血性疾患に対する優れた治療効果が報告されている（例えば、非特許文献１等）。
【０００３】
また、単球を分化誘導することで得られる樹状細胞は、Ｔ細胞を抗原特異的に活性化する最も強力な抗原提示細胞であり、例えば、悪性腫瘍に対する治療効果が報告されている（例えば、非特許文献２）。これらの背景より、体内より単球／マクロファージを選択的あるいは特異的に分離・濃縮する技術が望まれるようになった。
【０００４】
近年、細胞分離技術が発達し、免疫学、細胞生物学、血液学、組織工学の分野で広範囲に用いられており、例えばモノクローナル標識抗体とフローサイトメーターを用いた細胞分離技術は、細胞特異的であり高純度な細胞集団を得ることができ、単球以外にも種々の細胞を分離できることが知られている。また、抗体結合フラスコ、磁気ビーズ、抗体ロゼット法は、フローサイトメーターのような高価な機器を用いずに比較的簡便な操作で高純度の目的細胞を分離できることができる。
【０００５】
例えば単球に特異的に抗原を認識する抗体を利用したポジティブセレクション、または単球以外の抗原を認識する抗体を利用したネガティブセレクションによって、単球を比較的高純度に分離することができる。しかし、これらの抗体は高価であり、また得られた細胞集団は抗体混入の可能性を回避することができないため、医療行為に用いるのは難しい。
【０００６】
エルトリエーション法は、傾斜を持つチャンバー内に細胞浮遊液を入れて遠心し、一方では緩衝液を遠心と逆方向に流すことで特定の細胞層を形成させる方法である。この方法は、高純度の単球を得る方法であるが、熟練の操作技術、また細胞分離に長時間を要し、実質的に無菌操作が難しいため、ルーチンの単球の採取に用いるのは難しい。
【０００７】
また近年では有核細胞、特に白血球を分離あるいは除去するフィルターが散見されるようになった。例えば特許文献１には、赤血球は通過するフィルターに造血幹細胞を捕捉させた後、最初の通液方向とは逆方向の液流を惹起させて造血幹細胞を回収する方法が開示されている。しかしながら、同公報は有核細胞を回収するフィルターであり、単球に対して選択性を有するものではない。また特許文献２には、単球および／又は単球由来のマクロファージ選択除去フィルター装置が開示されている。しかしながら、同公報は細胞浮遊液より単球および／又は単球由来のマクロファージを除去する装置であり、単球を選択的に回収する技術に関する記載は一切無い。また、特許文献３には、平均孔径25〜60μｍの多孔質フィルターが単球・顆粒球を選択的に捕捉・採取するのに適していることが開示されている。しかしながら、同公報は単球のみを選択的に採取するものではなく、また、実質的に回収した細胞集団には多量の顆粒球が混入することがわかった。
【０００８】
一方、単球を濃縮する最も一般的な方法としては、比重遠心分離法により単核球を分離した後、単球とリンパ球との基材への付着性の差を利用して、単球を選択的にプラスチックディッシュに付着させる方法が知られている。この方法は、実験室レベルの細胞数の処理に適し、また高価な機器や試薬を用いないが、非常に煩雑で長時間を要する操作であり、また大量の細胞数を一度に処理できないため、ルーチンの医療行為に用いるには難しい。
【０００９】
【特許文献１】
特開平８−１０４６４３号公報
【特許文献２】
特開平９−７５０７６号公報
【特許文献３】
特開昭５５−１３８４５８号公報
【非特許文献１】
ダビデ・ダノン（DAVID DANON)、「TREATMENT OF HUMAN ULCERS BY APPLICATION OF MACROPHAGES PREPARED FROM A BLOOD UNIT」、Experimental Gerontology、（米国）、Elsevier Science Inc.、1997年、第32巻、第6号、p.633-641
【非特許文献２】
高橋、「免疫細胞療法（樹状細胞療法）」、医学のあゆみ、医歯薬出版、平成12年12月、第195巻、第13号、p.848-849
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記の問題点を解決し、体液より簡便な操作で高純度の単球を選択的に、かつ高い回収率で採取する方法及び単球組成物を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らが鋭意検討した結果、フィルターの表面積1ｍｍ^２当たりの有核細胞総数として1000〜10000個の単核球浮遊液を、単球を捕捉し、リンパ球を通過するフィルターを充填してなるフィルター装置に流し、その後該フィルター装置に回収液を導入し、単球を回収することによって、驚くべきことに簡便な操作で高純度の単球分画を高い回収率で採取できることを見出し、本発明を得るに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）フィルターの表面積1ｍｍ^２当たりの有核細胞総数として1000〜10000個の単核球浮遊液を、充填密度が 0.22 〜 0.25 ｇ / ｃｍ ^３であり、平均繊維径が 2.3 〜 2.7 μｍである不織布であって、単球を捕捉し、リンパ球を通過するフィルターを充填してなる装置に流し、その後該フィルター装置に回収液を導入し、単球を回収することを特徴とする単球の分離回収方法。
（２）単核球浮遊液が、血液を連続遠心分離法または比重遠心分離法により、顆粒球および赤血球を除去した単核球分画である前記（１）記載の単球の分離回収方法。
（３）フィルター装置に単核球分画を流した後、該フィルター装置に洗浄液を流すことにより、リンパ球をフィルター装置外に流出させることを特徴とする前記（１）または（２）記載の単球の分離回収方法。
【００１２】
（４）単球回収時のフィルター装置内温度を2℃〜10℃とすることを特徴とする前記（１）乃至（３）のいずれかに記載の単球の分離回収方法。
に関する。
本発明によれば、体液より簡便操作で高純度の単球を選択的に、かつ高い回収率で採取することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で言う単核球とは、細胞内に核を１つ保有する有核細胞を指し、いわゆる単球およびリンパ球を指す。また、単核球分画とは単核球、すなわち単球とリンパ球からなる細胞集団であり、実質的には微量の顆粒球を含むものも指す。
【００１４】
本発明で言う単核球浮遊液とは、単核球分画を含む液体を指す。単核球を浮遊させる液体としては細胞に悪影響を及ぼさない液体であればいかなる液体も使用できるが、いくつか例示すると、血漿、血清、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）、ＨＢＳＳ（ハンクス液）などの緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０などの培地が挙げられる。これらの液体に、細胞保護、栄養補給、抗凝固性付与、凍結保存時の凍害防止等の目的で必要に応じ、血漿、血清、アルブミン、グロブリン、グルコース、サッカロース、トレハロース、クエン酸化合物、ＥＤＴＡ、ヘパリン、ジメチルスルホキシド、デキストラン、ポリビニルピロリドン、グリセリン、キチン誘導体、ヒドロキシエチルデンプン、ゼラチン等を添加してもよい。
【００１５】
本発明で言う「捕捉」とは、フィルター装置に導入する単球の50％以上がフィルターに捕捉される状態を指し、「通過」とは、フィルター装置に導入するリンパ球の50％以上がフィルターより流出する状態を指す。
【００１６】
本発明で言う連続遠心分離法とは、末梢血より必要な血球成分または血漿成分を体外循環により選択的に採取し、残りをドナーに返却する方法であり、この方法より血小板、血漿、単核球等を得ることができる。特に本発明では、単核球分画を得る目的で用いる方法であり、実質的に顆粒球を排除する。
【００１７】
本発明で言う比重遠心分離法とは、比重液に末梢血や骨髄等の細胞浮遊液を積層させて遠心操作することによって赤血球と顆粒球を沈殿させる方法である。特に本発明では、単核球分画を得る目的で用いる方法であり、実質的に顆粒球を排除する。
【００１８】
本発明で言う「顆粒球および赤血球を除去」とは、血液を連続遠心分離法または比重遠心分離法することにより、顆粒球の50％以上、赤血球の90％以上が排除された状態を指す。また、ここで言う血液とは、末梢血、臍帯血、骨髄を指す。
【００１９】
本発明で言うフィルター装置とは、少なくとも入口と出口を有する容器にフィルターを充填したものを指す。また入口とは単核球分画の導入口であり、出口とはフィルターを通過した単核球、特にリンパ球の流出口であるが、入口および出口はフィルターの洗浄および単球の回収のために導入する流体の導入口、流出口の役割も果す。
【００２０】
フィルターの材質としては単球を捕捉できればいかなる材質も使用できるが、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属が挙げられる。また、これらのフィルターはこのままでも用いることができるが、細胞や血小板、赤血球等を選択的に捕捉する、あるいは通過させる等の必要に応じて表面改質を施したものでもよい。
【００２１】
より具体的に例示すると、血小板通過性を高めるにＷＯ８７／０５８１２号公報で提案されている非イオン性親水基と塩基性含窒素官能基を有するポリマーをコートする等が挙げられるがこれに限定されない。またアミノ酸、ペプチド、糖類、糖タンパク（抗体、接着分子等のバイオリガンドを含む）等のリガンドをフィルター上に固定して、単球を選択的に捕捉しても良い。リガンドをフィルター上に固定する方法は、例えば特開平２−２６１８３３号公報で提案されているハロアセトアミド法により固定する方法が挙げられる。但し単球に親和性を持つリガンドを選択する場合には、なるべくバイオリガンドは避け、また、細胞と接触することによる悪影響が少なく、更に回収時に容易に回収できる程度の親和性であることが好ましい。
【００２２】
フィルターの形状は、多孔質状、粒子状、中空糸状、粉末状等いずれの形状も取れるが、中でも、多孔質体、または粒状体であることが好ましい。多孔質体とは例えば、繊維塊、織布、不織布、スポンジ等の発泡体等を指すがこれに限定されない。単核球分画の導入とリンパ球の流出、および単球を回収するための流体を導入する等の諸操作を行う理由で、適切なフィルター形状が求められるが、単球を捕捉する理由より、上記形状の中でも表面積の大きい形状、すなわち多孔質体が好ましく、更に表面積の大きい不織布、スポンジ等の発泡体が好ましく、繊維径および充填密度により比較的簡便にフィルターの孔径を調節できる不織布が最適である。
【００２３】
単球を捕捉し、リンパ球を通過するフィルターを不織布の場合でより具体的に例示すると、平均繊維径が1.5μｍ以上10μｍ未満、より好ましくは1.5μｍ以上8μｍ未満、更に好ましくは1.5μｍ以上6μｍ未満、かつフィルター装置に充填されるフィルターの充填密度が0.05〜0.5ｇ/ｃｍ^３である。平均繊維径が1.5μｍ未満では、充填密度を調節しても、実質的にリンパ球が通過しにくいために単球純度を上げることができず、また回収液が導入しにくい傾向になるため好ましくない。また、10μｍを超えると、充填密度を調節しても単球が繊維に捕捉されず素通りする割合が高くなる。平均繊維径1.5μｍ未満10μｍ以上のいずれの場合でも回収率の低下につながるおそれがあるので好ましくない。
【００２４】
また、フィルター装置内に充填されるフィルターは、0.05〜0.5ｇ/ｃｍ³の嵩密度で充填される。0.05ｇ/ｃｍ³未満では十分な大きさの細孔を安定して確保することが難しく、物理的に安定した強度を有するフィルター装置が実現しにくい。又、0.5ｇ/ｃｍ³を越える多孔質フィルターでは本発明の要件を満たす細孔を実現することは難しい。好ましい充填密度は0.1ｇ/ｃｍ³〜0.4ｇ/ｃｍ³、更に好ましくは0.15ｇ/ｃｍ³〜0.3ｍ³である。容器の大きさは処理対象細胞浮遊液の量と処理速度等を考慮して適宜設定する。
【００２５】
また、微小凝集物を含む溶液をフィルターに導入する場合は、凝集塊を除去するために、平均繊維径10μｍ〜50μｍのプレフィルターを、単核球の導入口側、すなわち入口側に充填しても良い。プレフィルターを用いる場合、前記フィルターの平均繊維径よりも大きい平均繊維径のものを使うことが好ましい。
【００２６】
なお、本発明における平均繊維径とは、以下の手順に従って求められる値をいう。即ちフィルターを構成する、実質的に均一と認められるフィルター要素の一部をサンプリングし、走査電子顕微鏡などを用いて、写真に撮る。サンプリングに際しては、フィルター要素の有効濾過断面積部分を、１辺が0.5〜1ｃｍの正方形によって区分し、その中から３ケ所以上、好ましくは５ケ所以上をランダムサンプリングする。
【００２７】
ランダムサンプリングするには、例えば上記各区分に番地を指定した後、乱数表を使うなどの方法で、必要ケ所以上の区分を選べば良い。またサンプリングした各区分について、３ケ所以上好ましくは５ケ所以上を写真に撮る。このようにして得た写真について、写っている全ての繊維の直径を測定する。ここで直径とは、繊維軸に対して直角方向の繊維の幅をいう。測定した全ての繊維の直径の和を、繊維の数で割った値を平均繊維径とする。但し、複数の繊維が重なり合っており、他の繊維の陰になってその幅が測定できない場合、また複数の繊維が溶融するなどして、太い繊維になっている場合、更に著しく直径の異なる繊維が混在している場合、等の場合には、これらのデータは削除する。以上の方法により、100本以上、好ましくは1000本以上のデータにより平均繊維径を求める。
【００２８】
本発明で言う回収液とは、フィルターに捕捉された単球を回収するためにフィルター装置より導入される流体を指す。ここで言う単球とは実質的には単球を含む細胞集団を指す。回収液としては細胞に悪影響を及ぼさない流体であればいかなる流体も使用できるが、いくつか例示すると、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）、ＨＢＳＳ（ハンクス液）などの緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０などの培地が挙げられる。これらの液体に、細胞保護、栄養補給、抗凝固性付与、凍結保存時の凍害防止、粘度向上（回収率向上に有効な場合がある）等の目的で必要に応じ、血漿、血清、アルブミン、グロブリン、グルコース、サッカロース、トレハロース、クエン酸化合物、ＥＤＴＡ、ヘパリン、ジメチルスルホキシド、デキストラン、ポリビニルピロリドン、グリセリン、キチン誘導体、ヒドロキシエチルデンプン、ゼラチン等を添加してもよい。
【００２９】
また、ここで言う流体とは、液体単体のみならず、空気、アルゴン、窒素など細胞に悪影響を及ぼさない気体を混合したものも含まれる。回収液の導入方向としては単核球分画の導入方向と同一方向あるいは逆方向が考えられるが、逆方向の方が高い回収率が得られる傾向にあるのでより好ましい。すなわち、回収液の導入手段は、フィルターの上流に設けても下流に設けてもよいが、回収率の点から下流に設ける方が好ましい。
【００３０】
また、フィルター装置内を2℃〜10℃の低温条件下において回収液を導入すると、細胞がフィルターより剥離しやすい傾向があり、更にフィルターとの剥離によって生じる細胞へのダメージの軽減効果も期待できる点で好ましい。例えば、回収する前に低温条件下にするためには、冷蔵庫や氷浴にフィルター装置を入れておく、あるいは単球の回収操作の前に低温の液体を導入しても良く、それがフィルターを洗浄するために導入する流体でも良い。いずれの場合も、低温条件下および回収操作を行う際にはフィルター装置内に何らかの流体が含まれていると、細胞へのダメージの軽減と回収率を高める効果があり好ましい。但し、捕捉された細胞とフィルターとの接着は、時間とともに強固になるため、回収操作前に冷蔵庫や氷浴に入れてフィルター装置を低温化させる場合は、5〜45分、より好ましくは5〜30分以内が良い。
【００３１】
本発明でいう洗浄液とは、単球以外の細胞をフィルター外に流出させるためにフィルター装置に導入される流体を指し、捕捉されたリンパ球を洗い流し、フィルターに捕捉されている全細胞中における単球の含有率を上げる役割を果す。また、赤血球、血小板を含む単核球分画をフィルターに導入する場合は、フィルターの洗浄は、赤血球、血小板を洗い流す効果もある。洗浄液としては細胞に悪影響を及ぼさない流体であればいかなる流体も使用できるが、いくつか例示すると、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）、ＨＢＳＳ（ハンクス液）などの緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０などの培地が挙げられる。これらの液体に、細胞保護、栄養補給、抗凝固性付与等の目的で必要に応じ、血漿、血清、アルブミン、グロブリン、グルコース、サッカロース、トレハロース、クエン酸化合物、ＥＤＴＡ、ヘパリン等を添加してもよい。また、ここで言う流体とは、液体単体のみならず、空気、アルゴン、窒素など細胞に悪影響を及ぼさない気体を混合したものも含まれる。流体の導入方向としては単核球分画の通液方向と同一方向あるいは逆方向が考えられるが、同一方向の方が、単球まで洗い流される可能性が低いため、回収率の点でより好ましい。
すなわち、フィルターを洗浄するために導入する流体の導入手段は、フィルターの上流に設けても下流に設けてもよいが、回収率の点から上流に設ける方が好ましい。
【００３２】
以下に本発明を実施する方法の具体例を記載するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
まず、少なくとも入口と出口を有する容器の入口側に凝集塊除去用のプレフィルター、出口側に単球分離用のフィルターを充填したものをフィルター装置とする。必要に応じて、出口側および入口側に回路を設けても良い。
連続遠心分離法または比重遠心分離法により得られた単核球分画を、入口側よりフィルター装置に流す。その方法としては、落差による方法、シリンジで押し込む方法、バッグを押しつぶす方法、ローラーポンプやシリンジポンプを用いる方法等が挙げられる。落差がより簡便な方法であるが、流量を制御したい場合はローラーポンプやシリンジポンプ等を用いると良い。
【００３３】
フィルター装置に導入する単核球浮遊液は、フィルターの表面積1ｍｍ^２当たりの細胞球総数として1000〜10000個、好ましくは1200〜9000個、より好ましくは1600〜8000個とする。フィルターの表面積1ｍｍ^２当たりの有核細胞総数が1000個未満であると、リンパ球の通過する割合が低く、回収される単球の純度が低くなるので適さない。また、フィルターの表面積1ｍｍ^２当たりの有核細胞総数が10000個より多いと、リンパ球だけでなく単球もフィルターより流出する割合が高くなり、単球純度は上がるものの、単球の回収率が低くなる傾向があり適さない。ここで言うフィルター表面積は、単球を捕捉し、リンパ球を通過するフィルターの表面積を指し、凝集塊除去のためのプレフィルターの表面積は含まれない。
【００３４】
フィルターの表面積は、平均繊維径、フィルター材質の比重、フィルターの総重量より求めることができ、以下の式で算出される。

【００３５】
また、単球とリンパ球をより効率的に分離するためには、単核球を適切な流速でフィルター装置に流す必要があるが、その範囲は線速0.1ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２以上5.0ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２未満、より好ましくは線速0.2ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２以上2.0ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２未満である。ここで言う線速とは、流速を細胞分離フィルターの有効濾過断面積で除したものである。線速が0.1ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２未満では、細胞を処理するのに時間がかかり過ぎるため好ましくない。また、線速が5.0ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２を超えると、単球とリンパ球の分離能が低下する傾向があるため好ましくない。
【００３６】
次に洗浄液を流してリンパ球を流出させる。その方法としては、落差による方法、シリンジで押し込む方法、バッグを押しつぶす方法、ローラーポンプやシリンジポンプを用いる方法等が挙げられる。落差がより簡便な方法であるが、流量を制御したい場合はローラーポンプやシリンジポンプ等を用いると良い。
【００３７】
洗浄液によりリンパ球を流すためには、適切な流速でフィルター装置に流す必要があり、その範囲は線速0.1ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２以上10.0ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２未満、より好ましくは線速0.2ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２以上3.0ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２未満である。線速が0.1ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２未満では、フィルターを洗浄するのに時間がかかり過ぎ、またフィルターより流出するリンパ球が少ないため好ましくない。また、線速が10.0ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２を超えると、リンパ球と同時に単球も流出する割合が高くなる傾向にあり、回収率が低くなる点で好ましくない。
【００３８】
最後に回収液を流して単球を回収する。その方法としては、落差による方法、シリンジで押し込む方法、バッグを押しつぶす方法、ローラーポンプやシリンジポンプを用いる方法等が挙げられる。落差がより簡便な方法であるが、より好ましくは流速を制御可能な、回収液を強力に押し出すバネ式装置あるいは圧力式装置により回収すると、より高い回収率が得られる点で好ましい。
【００３９】
回収液の流速は、せん断応力を高め、単球を高率で回収するためにより高流速が好ましいが、内圧上昇による細胞分離フィルターと回路の接続部のはずれや、細胞へのダメージを起こさない流速に制御することが好ましく、その範囲は線速50ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２以上1500ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２未満、より好ましくは線速100ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２以上1000ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２未満である。線速50ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２未満では、せん断応力が低く、細胞が十分に回収できないため好ましくない。また、線速1500ｍｌ/ｍｉｎ/ｃｍ^２以上では、内圧上昇により細胞へのダメージが起こる割合が高くなるため好ましくない。
【００４０】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
１．細胞分離フィルター作成
高さ23ｍｍ×直径6.8ｍｍφの円筒型ポリエチレンカラムの入口側から順番に平均繊維径33μｍ（目付約50ｇ/ｍ²）、12μｍ（目付約30ｇ/ｍ²）、2.7μｍ（目付約90ｇ/ｍ²）のポリエステル不織布をそれぞれ12枚、13枚、3枚ずつ充填し、細胞分離器とした。なお、高さ3ｍｍ×内径5ｍｍφ（外径7ｍｍφ）の中空状のシリコン製チューブを不織布上下で押さえ、不織布が動かないように固定した。有効濾過断面積36.3ｍｍ^２、2.7μｍ不織布の充填密度は約0.25ｇ/ｃｍ^３であった。また、この細胞分離器に血小板通過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（ヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートのモル比＝９７：３）の1％エタノール溶液を該フィルターの入口側から通液した後、窒素ガスを通して乾燥させた。
【００４１】
２．細胞分離操作
ＡＣＤ溶液を用いてヒト末梢血から連続遠心分離法（ＣＯＢＥＳＰＥＣＴＲＡ、ＣＯＢＥ−Ｌａｂ.Ｉｎｃ社製）により単核球分画を得た。単核球分画（6.8×10^７個/ｍｌ、単球純度24.4％）を0.5ｍｌ分取し、生理食塩水で4ｍｌに希釈し0.1ｍｌ/ｍｉｎの流速で細胞分離フィルターに流した後、0.5ｍｌ/ｍｉｎでＰＢＳ（−）6ｍｌで洗浄し、4℃の冷蔵庫で細胞分離フィルターごと15分冷やした後、細胞分離フィルター出口より10％デキストラン生理食塩水溶液（ミドリ十字社製「デキストラン４０注」）2ｍｌ、次いで空気5ｍｌを導入して細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約70分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積1ｍｍ^２当たりの有核細胞総数は、3230個であり、単球回収率48％、単球純度39.8％であった。なお、単球回収率および単球純度は、自動血球計数装置（ミクロセルカウンター、シスメックス社製）によって測定した有核細胞の比率から算出した。
【００４２】
【比較例１】
実施例１同様の細胞分離フィルターを作成した。
ＡＣＤ溶液を用いてヒト末梢血から連続遠心分離法（ＣＯＢＥＳＰＥＣＴＲＡ、ＣＯＢＥ−Ｌａｂ.Ｉｎｃ社製）により単核球分画を得た。単核球分画（6.8×10^７個/ｍｌ、単球純度24.4％）を2.5ｍｌ分取し、生理食塩水で4ｍｌに希釈し実施例１と同様の操作で細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約70分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積1ｍｍ当たりの有核細胞総数は、16150個であり、単球回収率15％、単球純度44.5％であった。
【００４３】
【実施例２】
実施例１同様の細胞分離フィルターを作成した。
ＡＣＤ溶液を用いてヒト末梢血から連続遠心分離法（ＣＯＢＥＳＰＥＣＴＲＡ、ＣＯＢＥ−Ｌａｂ.Ｉｎｃ社製）により単核球分画を得た。単核球分画（6.8×10^７個/ｍｌ、単球純度24.4％）を1.5ｍｌ分取し、生理食塩水で4ｍｌに希釈し実施例１と同様の操作で細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約70分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積1ｍｍ^２当たりの有核細胞総数は、9690個であり、単球回収率38％、単球純度41.1％であった。
【００４４】
【比較例２】
実施例１同様の細胞分離フィルターを作成した。
ＡＣＤ溶液を用いてヒト末梢血から連続遠心分離法（ＣＯＢＥＳＰＥＣＴＲＡ、ＣＯＢＥ−Ｌａｂ.Ｉｎｃ社製）により単核球分画を得た。単核球分画（6.8×10^７個/ｍｌ、単球純度24.4％）を0.1ｍｌ分取し、生理食塩水で4ｍｌに希釈し実施例１と同様の操作で細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約70分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積1ｍｍ^２当たりの有核細胞総数は、６４６個であり、単球回収率２４％、単球純度26.7％であった。
【００４５】
【実施例３】
実施例１同様の細胞分離フィルターを作成した。
ヒト末梢血（ＡＣＤ溶液：ヒト末梢血＝１：８）を採血した。この時点で単球純度7.2％であった。比重遠心分離法（ファルマシア社製「フィコール」、比重1.077ｇ/ｍｌ）により単核球分画を採取し、1×10^７個/ｍｌになるように10％血漿加ＰＢＳ（−）へ浮遊させた。この時点で単球の純度は18.4％であった。0.2ｍｌ/ｍｉｎの流速で単核球分画8ｍｌを細胞分離フィルターの入口より流した後、0.5ｍｌ/ｍｉｎでＰＢＳ（−）6ｍｌを流し、4℃の冷蔵庫で細胞分離フィルターごと15分冷やした後、細胞分離フィルター出口より10％デキストラン生理食塩水溶液（ミドリ十字社製「デキストラン４０注」）2ｍｌ、次いで空気5ｍｌを導入して細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約70分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積1ｍｍ^２当たりの有核細胞総数は、7600個であり、単球回収率47％、単球純度34.6％であった。
【００４６】
【比較例３】
実施例１同様の細胞分離フィルターを作成した。
ヒト末梢血（ＡＣＤ溶液：ヒト末梢血＝１：８）を採血した。この時点で単球純度7.2％であった。比重遠心分離法（ファルマシア社製「フィコール」、比重1.077ｇ/ｍｌ）により単核球分画を採取し、1×10⁶個/ｍｌになるように10％血漿加ＰＢＳ（−）へ浮遊させた。この時点で単球の純度は18.4％であった。単核球分画7.5ｍｌを実施例３と同様の操作で細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約70分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積1ｍｍ^２当たりの有核細胞総数は、712個であり、単球回収率15％、単球純度18.6％であった。
【００４７】
【実施例４】
【実施例４】
１．細胞分離フィルター作成
平均繊維径12μｍのポリエステル不織布（目付約100ｇ/ｍ²）16枚と平均繊維径2.3μｍのポリエステル不織布（目付約60ｇ/ｍ²）18枚を重ね、押し切りカッターで35ｍｍ角に切断し細胞分離フィルター材とした。この細胞分離フィルター材を容器外寸（縦×横×厚み）41×41×18ｍｍで液体流出口と液体流入口を対角線上に持つポリカーボネート製容器の出口側に平均繊維径2.3μｍのポリエステル不織布がくるように充填して細胞分離フィルターとした。なお、有効濾過断面積12.25ｃｍ^２、2.3μｍ不織布の充填密度は約0.22ｇ/ｃｍ^３であった。また、この細胞分離器に血小板通過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（ヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートのモル比＝９７：３）の１％エタノール溶液を該フィルターの入口側から通液した後、窒素ガスを通して乾燥させた。
【００４８】
２．細胞分離操作
ＡＣＤ溶液を用いてヒト末梢血から連続遠心分離法（ＣＯＢＥＳＰＥＣＴＲＡ、ＣＯＢＥ−Ｌａｂ.Ｉｎｃ社製）により単核球分画を得た。単核球分画（6.8×10^７個/ｍｌ、単球純度24.4％）を50ｍｌ分取し、5ｍｌ/ｍｉｎの流速で細胞分離フィルターに流した後、10ｍｌ/ｍｉｎでＰＢＳ（−）50ｍｌで洗浄し、4℃の冷蔵庫で細胞分離フィルターごと15分冷やした後、細胞分離フィルター出口より10％デキストラン生理食塩水溶液（ミドリ十字社製「デキストラン４０注」）10ｍｌ、次いで空気25ｍｌを導入して細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約40分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積1ｍｍ^２当たりの有核細胞総数は、2596個であり、単球回収率53％、単球純度41.3％であった。
【００４９】
【比較例４】
実施例４同様の細胞分離フィルターを作成した。
ＡＣＤ溶液を用いてヒト末梢血から連続遠心分離法（ＣＯＢＥＳＰＥＣＴＲＡ、ＣＯＢＥ−Ｌａｂ.Ｉｎｃ社製）により単核球分画を得た。単核球分画（6.8×10^７個/ｍｌ、単球純度24.4％）を5ｍｌ分取し、実施例４と同様の操作で細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約30分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積1ｍｍ^２当たりの有核細胞総数は、260個であり、単球回収率49％、単球純度25.1％であった。
【００５０】
【比較例５】
ＡＣＤ溶液1ｍｌを含んだチューブにヒト末梢血8ｍｌを採血した。この時点で単球純度は6.3％であった。比重遠心分離法（ファルマシア社製「フィコール」、比重1.077ｇ/ｍｌ）により単核球分画を採取し、5×10⁶個/ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）へ浮遊させた。この時点で単球の純度は17.9％であった。付着細胞培養用ディッシュに単核球分画を播種し、ＣＯ₂インキュベーター（37℃、5％ＣＯ₂）で2時間培養した。培地の上清を取り除き、温ＰＢＳ（−）で2回リンスして浮遊細胞を取り除いた後、再度ＰＢＳ（−）を少量加え、ラバーポリスマンを用いて、付着している細胞をディッシュより引き剥がした。この間の操作は、ＣＯ₂インキュベーターへディッシュを入れる以外は全てクリーンベンチ内で行った。単核球分画をディッシュに播種してから、単球を回収するまでに要した時間は、約190分であった。本細胞分離操作での単球回収率31％、単球純度27.8％であった。
【００５１】
これらの実施例１〜４及び比較例１〜５の細胞分離操作で得られた有核細胞総数/フィルター表面積、単球回収率、単球純度及び単球回収に要した時間を表に示した。
【表１】

【００５２】
また、これらの実施例１〜４及び比較例１〜４の有核細胞総数/フィルター表面積に対する単球回収率及び単球純度をプロットし、図１に示した。この図からみて、単球回収率及び単球純度が高くなるのは、フィルター表面積1ｍｍ^２当たり有核細胞総数1000〜10000個の範囲であり、この範囲より小さい場合は単球純度が低下（場合によっては単球回収率も低下する）し、この範囲より大きい場合は単球回収率が著しく低下した。
【００５３】
【発明の効果】
本発明によれば、高純度、かつ高収率の単球分画を採取することができる。
本発明によれば、フィルターを用いることにより大量の細胞を一度に処理でき、またフィルターを回路に組み込むことにより、密閉系で単球分画を採取できるため、実験室レベルの実験医療のみならず、ルーチンの医療行為への発展に大いに貢献することができる。
また、連続遠心分離法で採取した単核球分画は、凍結しておくと小分けに使用することができる。ドナーが不足している等の際は、連続遠心分離法で採取した単核球分画を、適宜に解凍し、本発明の方法により簡便操作で単球を得て、医療行為に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１〜４、および比較例１〜４の結果を表すグラフである。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a method for separating and recovering monocytes with high purity from body fluids in which cells such as peripheral blood, umbilical cord blood, and bone marrow float, and a monocyte composition containing monocytes thus obtained with high purity.
[0002]
[Prior art]
Monocytes / macrophages are a type of nucleated cells contained in the blood or tissues, and are multi-functional cells that produce a variety of cytokines and proteases, as well as having an effect of eating aging autologous cells or foreign bacteria. is there. In recent years, cell therapy using these cells has been actively performed. For example, excellent therapeutic effects on ischemic diseases such as skin ulcer and necrosis / gangrene due to macrophages differentiated from peripheral blood-derived monocytes have been reported. (For example, Non-Patent Document 1).
[0003]
Moreover, dendritic cells obtained by inducing differentiation of monocytes are the most powerful antigen-presenting cells that activate T cells in an antigen-specific manner, and for example, therapeutic effects on malignant tumors have been reported (for example, Non-Patent Document 2). From these backgrounds, a technique for selectively or specifically separating and concentrating monocytes / macrophages from the body has been desired.
[0004]
In recent years, cell separation technology has been developed and widely used in the fields of immunology, cell biology, hematology, and tissue engineering. For example, cell separation technology using a monoclonal antibody and a flow cytometer is cell-specific. It is known that a high-purity cell population can be obtained and various cells can be separated in addition to monocytes. In addition, antibody-binding flasks, magnetic beads, and antibody rosette methods can separate high-purity target cells with a relatively simple operation without using expensive equipment such as a flow cytometer.
[0005]
For example, monocytes can be separated with relatively high purity by positive selection using an antibody that specifically recognizes an antigen on monocytes, or negative selection using an antibody that recognizes an antigen other than monocytes. However, these antibodies are expensive and the resulting cell population is difficult to use in medical practice because the possibility of antibody contamination cannot be avoided.
[0006]
The elutriation method is a method in which a cell suspension is placed in a slanted chamber and centrifuged, and on the other hand, a specific cell layer is formed by flowing a buffer solution in the opposite direction to the centrifugation. Although this method is a method for obtaining high-purity monocytes, it requires a long time for skilled operation techniques and cell separation, and is substantially difficult to perform aseptic operation. difficult.
[0007]
In recent years, filters that separate or remove nucleated cells, particularly leukocytes, have become commonplace. For example, Patent Document 1 discloses a method of collecting hematopoietic stem cells by capturing hematopoietic stem cells on a filter through which erythrocytes pass, and then inducing a liquid flow in a direction opposite to the initial flow direction. However, this publication is a filter for recovering nucleated cells and does not have selectivity for monocytes. Patent Document 2 discloses a monocyte and / or monocyte-derived macrophage selective removal filter device. However, this publication is an apparatus for removing monocytes and / or monocyte-derived macrophages from the cell suspension, and there is no description regarding a technique for selectively collecting monocytes. Patent Document 3 discloses that a porous filter having an average pore diameter of 25 to 60 μm is suitable for selectively capturing and collecting monocytes and granulocytes. However, this publication does not selectively collect monocytes, and it has been found that a large amount of granulocytes is mixed in the substantially collected cell population.
[0008]
On the other hand, the most common method for concentrating monocytes is to separate the mononuclear cells by specific gravity centrifugation, and then use the difference in the adhesion of monocytes and lymphocytes to the base material. There is known a method for selectively adhering to a plastic dish. This method is suitable for the treatment of the number of cells at the laboratory level, and does not use expensive equipment or reagents, but it is a very complicated and time-consuming operation, and a large number of cells cannot be treated at one time. Difficult to use for routine medical practice.
[0009]
[Patent Document 1]
JP-A-8-104643
[Patent Document 2]
JP-A-9-75076
[Patent Document 3]
JP-A-55-138458
[Non-Patent Document 1]
DAVID DANON, “TREATMENT OF HUMAN ULCERS BY APPLICATION OF MACROPHAGES PREPARED FROM A BLOOD UNIT”, Experimental Gerontology, (USA), Elsevier Science Inc., 1997, Vol. 32, No. 6, p.633 -641
[Non-Patent Document 2]
Takahashi, "Immune cell therapy (dendritic cell therapy)", History of Medicine, Ishiyaku Shuppan, December 2000, Vol.195, No.13, p.848-849
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems and to provide a method and a monocyte composition for selectively collecting high-purity monocytes with a high recovery rate by a simpler operation than a body fluid.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies by the inventors, the surface area of the filter is 1 mm.²The total number of nucleated cells per 1,000 to 10,000 mononuclear cell suspension is passed through a filter device that captures monocytes and is filled with a filter that passes through lymphocytes, and then the recovered solution is introduced into the filter device. Then, by recovering monocytes, it was surprisingly found that a high-purity monocyte fraction can be collected at a high recovery rate by a simple operation, and the present invention was obtained.
[0011]
That is, the present invention
(1)Filter surface area 1mm²1,000 to 10,000 mononuclear cell suspensions as the total number of nucleated cells perPacking density is 0.22 ~ 0.25 g / cm ³ And the average fiber diameter is 2.3 ~ 2.7 a non-woven fabric that is μm,A method for separating and recovering monocytes, wherein monocytes are captured and flowed through a device filled with a filter that passes through lymphocytes, and then a recovery solution is introduced into the filter device to recover monocytes.
(2)The mononuclear cell suspension is a mononuclear cell fraction obtained by removing granulocytes and erythrocytes by continuous centrifugation or specific gravity centrifugation of blood (1)DescriptionMonocyte separation and recovery method.
(3)The mononuclear cell fraction according to the above (1) or (2), wherein a mononuclear cell fraction is allowed to flow through the filter device, and then a washing solution is passed through the filter device to cause lymphocytes to flow out of the filter device. Separation and recovery method.
[0012]
(4)(1) to (1) characterized in that the temperature in the filter device at the time of monocyte collection is 2 to 10 ° C.3The method for separating and collecting monocytes according to any one of the above.
About.
According to the present invention, high-purity monocytes can be selectively collected at a high recovery rate with a simpler operation than a body fluid.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The mononuclear cell referred to in the present invention refers to a nucleated cell having one nucleus in the cell, and refers to so-called monocytes and lymphocytes. The mononuclear cell fraction refers to a mononuclear cell, that is, a cell population composed of monocytes and lymphocytes, and substantially contains a minute amount of granulocytes.
[0014]
The mononuclear cell suspension referred to in the present invention refers to a liquid containing a mononuclear cell fraction. Any liquid can be used as a liquid that suspends mononuclear cells as long as it does not adversely affect cells. For example, plasma, serum, physiological saline, PBS (phosphate buffer), HBSS ( A buffer solution such as Hank's solution) and a medium such as RPMI-1640. To these liquids, plasma, serum, albumin, globulin, glucose, saccharose, trehalose, citrate compound, EDTA, as necessary for the purpose of cell protection, nutritional supplementation, anticoagulant imparting, frost damage prevention during cryopreservation, etc. Heparin, dimethyl sulfoxide, dextran, polyvinyl pyrrolidone, glycerin, chitin derivatives, hydroxyethyl starch, gelatin and the like may be added.
[0015]
In the present invention, “capture” refers to a state where 50% or more of monocytes introduced into the filter device are captured by the filter, and “pass” refers to a state where 50% or more of lymphocytes introduced into the filter device are filtered. It refers to the state of more outflow.
[0016]
The continuous centrifugation method referred to in the present invention is a method of selectively collecting necessary blood cell components or plasma components from peripheral blood by extracorporeal circulation and returning the rest to the donor. From this method, platelets, plasma, mononuclear cells are collected. A sphere or the like can be obtained. In particular, the present invention is a method used for the purpose of obtaining a mononuclear cell fraction and substantially excludes granulocytes.
[0017]
The specific gravity centrifugation method referred to in the present invention is a method for precipitating erythrocytes and granulocytes by laminating a cell suspension such as peripheral blood or bone marrow on a specific gravity solution and performing centrifugation. In particular, the present invention is a method used for the purpose of obtaining a mononuclear cell fraction and substantially excludes granulocytes.
[0018]
In the present invention, “removing granulocytes and erythrocytes” refers to a state in which 50% or more of granulocytes and 90% or more of erythrocytes have been excluded by subjecting blood to continuous centrifugation or specific gravity centrifugation. Moreover, the blood said here refers to peripheral blood, umbilical cord blood, and bone marrow.
[0019]
The filter device referred to in the present invention refers to a filter in which a container having at least an inlet and an outlet is filled. The inlet is the inlet for the mononuclear cell fraction, and the outlet is the outlet for mononuclear cells, especially lymphocytes, that have passed through the filter, but the inlet and outlet are for filter washing and monocyte collection. It also plays the role of the inlet and outlet of the fluid to be introduced.
[0020]
Any material can be used as the material of the filter as long as it can capture monocytes. Examples of preferable materials in terms of moldability, sterility and low cytotoxicity include polyester, polyethylene, polypropylene, polystyrene, acrylic resin, nylon and polycarbonate. Synthetic polymers such as polyacrylamide, polyurethane, natural polymers such as agarose, cellulose, cellulose acetate, chitin, chitosan, alginate, inorganic materials such as hydroxyapatite, glass, alumina, titania, stainless steel, titanium, aluminum, etc. A metal is mentioned. Further, these filters can be used as they are, but they may be subjected to surface modification as necessary, such as selectively capturing or passing cells, platelets, erythrocytes and the like.
[0021]
More specifically, for example, coating with a polymer having a nonionic hydrophilic group and a basic nitrogen-containing functional group proposed in WO87 / 05812 may be mentioned to increase platelet permeability, but it is not limited thereto. . Alternatively, monocytes may be selectively captured by fixing ligands such as amino acids, peptides, saccharides, glycoproteins (including bioligands such as antibodies and adhesion molecules) on the filter. Examples of the method for fixing the ligand on the filter include a method for fixing by the haloacetamide method proposed in JP-A-2-261833. However, when selecting a ligand that has an affinity for monocytes, it is preferable to avoid bioligands as much as possible, have little adverse effects due to contact with cells, and have affinity that can be easily recovered at the time of recovery. .
[0022]
The shape of the filter can be any shape such as a porous shape, a particle shape, a hollow fiber shape, and a powder shape. Among these, a porous material or a granular material is preferable. Examples of the porous body include, but are not limited to, a fiber lump, a woven fabric, a nonwoven fabric, a foamed material such as a sponge. Appropriate filter shape is required for various operations such as introduction of mononuclear cell fraction, lymphocyte outflow, and introduction of fluid for collecting monocytes, but from the reason for capturing monocytes Among the above shapes, a shape having a large surface area, that is, a porous material is preferable, and a non-woven fabric having a large surface area, a foam such as sponge is preferable, and a non-woven fabric that can adjust the pore size of the filter relatively easily by the fiber diameter and packing density is optimal. It is.
[0023]
More specifically, in the case of a nonwoven fabric, a filter that captures monocytes and passes through lymphocytes, the average fiber diameter is 1.5 μm or more and less than 10 μm, more preferably 1.5 μm or more and less than 8 μm, still more preferably 1.5 μm or more and 6 μm. Less than, and the packing density of the filter filled in the filter device is 0.05 to 0.5 g / cm³It is. If the average fiber diameter is less than 1.5 μm, even if the packing density is adjusted, the lymphocytes are substantially difficult to pass through, so the monocyte purity cannot be increased, and the recovery solution tends to be difficult to introduce. Absent. On the other hand, if it exceeds 10 μm, the rate at which monocytes pass through without being captured by the fibers even if the packing density is adjusted increases. Any case where the average fiber diameter is less than 1.5 μm and 10 μm or more is not preferable because it may lead to a decrease in the recovery rate.
[0024]
The filter filled in the filter device is 0.05 to 0.5 g / cm.^ThreeIt is filled with the bulk density. 0.05g / cm^ThreeIf it is less than this, it is difficult to stably secure sufficiently large pores, and it is difficult to realize a filter device having physically stable strength. 0.5g / cm^ThreeIt is difficult to realize pores satisfying the requirements of the present invention with a porous filter exceeding 10 mm. Preferred packing density is 0.1 g / cm^Three~ 0.4g / cm^ThreeMore preferably, 0.15 g / cm^Three~ 0.3m^ThreeIt is. The size of the container is appropriately set in consideration of the amount of cell suspension to be treated, the processing speed, and the like.
[0025]
In addition, when a solution containing microaggregates is introduced into the filter, in order to remove the aggregates, a prefilter having an average fiber diameter of 10 μm to 50 μm is filled on the inlet side of the mononuclear cells, that is, the inlet side. Also good. When using a prefilter, it is preferable to use a filter having an average fiber diameter larger than the average fiber diameter of the filter.
[0026]
In addition, the average fiber diameter in this invention means the value calculated | required according to the following procedures. That is, a part of a filter element constituting the filter, which is recognized as being substantially uniform, is sampled and photographed using a scanning electron microscope or the like. At the time of sampling, the effective filtration cross-sectional area portion of the filter element is divided by a square having a side of 0.5 to 1 cm, and 3 or more, preferably 5 or more are randomly sampled.
[0027]
In order to perform random sampling, for example, after specifying an address for each of the above-mentioned sections, it is sufficient to select more than the necessary sections by using a random number table. Also, for each sampled section, take a picture of 3 or more, preferably 5 or more. For the photograph thus obtained, the diameters of all the visible fibers are measured. Here, the diameter means the width of the fiber in the direction perpendicular to the fiber axis. A value obtained by dividing the sum of the diameters of all the measured fibers by the number of fibers is defined as an average fiber diameter. However, when multiple fibers overlap each other and their width cannot be measured behind other fibers, or when multiple fibers melt and become thick fibers, fibers with significantly different diameters If there is a mixture of these, these data are deleted. By the above method, the average fiber diameter is obtained from data of 100 or more, preferably 1000 or more.
[0028]
The recovery liquid referred to in the present invention refers to a fluid introduced from the filter device in order to recover monocytes captured by the filter. A monocyte as used herein refers to a cell population substantially containing monocytes. Any fluid can be used as the recovery fluid as long as it does not adversely affect the cells. For example, physiological saline, PBS (phosphate buffer solution), buffer solution such as HBSS (Hanks solution), RPMI Examples include media such as -1640. To these liquids, plasma, serum, albumin, as needed for purposes such as cell protection, nutritional supplementation, anticoagulant properties, prevention of freezing damage during cryopreservation, viscosity improvement (may be effective in improving recovery rate) Globulin, glucose, saccharose, trehalose, citrate compounds, EDTA, heparin, dimethyl sulfoxide, dextran, polyvinylpyrrolidone, glycerin, chitin derivatives, hydroxyethyl starch, gelatin and the like may be added.
[0029]
The fluid referred to here includes not only a single liquid but also a mixture of gases such as air, argon and nitrogen that do not adversely affect cells. As the introduction direction of the recovery liquid, the same direction or the opposite direction to the introduction direction of the mononuclear cell fraction can be considered, but the reverse direction is more preferable because a higher recovery rate tends to be obtained. That is, the recovery liquid introducing means may be provided upstream or downstream of the filter, but is preferably provided downstream from the viewpoint of the recovery rate.
[0030]
In addition, when the collected liquid is introduced into the filter device under a low temperature condition of 2 ° C. to 10 ° C., the cells tend to be detached more easily than the filter, and further, the effect of reducing the damage to the cells caused by the separation from the filter can be expected. This is preferable. For example, in order to bring it to a low temperature condition before recovery, a filter device may be placed in a refrigerator or ice bath, or a low temperature liquid may be introduced before the monocyte recovery operation, A fluid to be introduced for cleaning may be used. In any case, it is preferable that some kind of fluid is contained in the filter device under low temperature conditions and during the recovery operation, because this has the effect of reducing damage to cells and increasing the recovery rate. However, since the adhesion between the trapped cells and the filter becomes stronger with time, it is 5 to 45 minutes, more preferably 5 to 5 minutes when the filter device is cooled in a refrigerator or ice bath before the collection operation. Good within 30 minutes.
[0031]
The washing solution as used in the present invention refers to a fluid that is introduced into the filter device in order to allow cells other than monocytes to flow out of the filter. The captured lymphocytes are washed away, and the single cells in all the cells captured by the filter. Plays the role of increasing the sphere content. In addition, when a mononuclear cell fraction containing red blood cells and platelets is introduced into the filter, the washing of the filter also has an effect of washing out the red blood cells and platelets. Any fluid can be used as the washing fluid as long as it does not adversely affect the cells. For example, physiological saline, PBS (phosphate buffer solution), HBSS (Hanks solution) buffer solution, RPMI- A medium such as 1640 may be mentioned. Plasma, serum, albumin, globulin, glucose, saccharose, trehalose, citrate compound, EDTA, heparin, etc. may be added to these liquids as necessary for the purpose of cell protection, nutritional supplementation, anticoagulant imparting, etc. Good. The fluid referred to here includes not only a single liquid but also a mixture of gases such as air, argon and nitrogen that do not adversely affect cells. The direction of fluid introduction may be the same direction or the opposite direction to the flow direction of the mononuclear cell fraction, but the same direction is more preferable in terms of recovery rate because it is less likely to be washed out to monocytes. .
That is, the means for introducing the fluid to be introduced for cleaning the filter may be provided upstream or downstream of the filter, but is preferably provided upstream from the viewpoint of the recovery rate.
[0032]
Although the specific example of the method of implementing this invention is described below, this invention is not limited to these.
First, a filter device is prepared by filling a pre-filter for removing agglomerates on the inlet side of a container having at least an inlet and an outlet, and a filter for separating monocytes on the outlet side. If necessary, circuits may be provided on the outlet side and the inlet side.
The mononuclear cell fraction obtained by the continuous centrifugation method or the specific gravity centrifugation method is allowed to flow from the inlet side to the filter device. Examples of the method include a method using a drop, a method of pushing with a syringe, a method of crushing a bag, a method using a roller pump or a syringe pump, and the like. Although the drop is a simpler method, a roller pump, a syringe pump, or the like may be used to control the flow rate.
[0033]
The mononuclear cell suspension introduced into the filter device is 1mm in surface area of the filter.²The total number of cell spheres per unit is 1000 to 10,000, preferably 1200 to 9000, more preferably 1600 to 8000. Filter surface area 1mm²If the total number of nucleated cells per cell is less than 1000, the proportion of lymphocytes passing is low, and the purity of monocytes to be recovered is not suitable. The surface area of the filter is 1mm²If the total number of nucleated cells per unit is greater than 10,000, not only lymphocytes but also monocytes will flow out of the filter, and the monocyte purity will increase, but the recovery rate of monocytes tends to be low. . The filter surface area as used herein refers to the surface area of the filter that captures monocytes and passes through lymphocytes, and does not include the surface area of the prefilter for removing aggregates.
[0034]
The surface area of the filter can be determined from the average fiber diameter, the specific gravity of the filter material, and the total weight of the filter, and is calculated by the following equation.

[0035]
In addition, in order to more efficiently separate monocytes and lymphocytes, it is necessary to flow the mononuclear cells through the filter device at an appropriate flow rate, but the range is 0.1 ml / min / cm²5.0 ml / min / cm²Less, more preferably, linear velocity 0.2 ml / min / cm²2.0 ml / min / cm²Is less than. The linear velocity mentioned here is obtained by dividing the flow rate by the effective filtration cross-sectional area of the cell separation filter. Line speed is 0.1ml / min / cm²If it is less than 2, it takes too much time to treat the cells, which is not preferable. The linear velocity is 5.0 ml / min / cm²Exceeding this is not preferable because the separation ability of monocytes and lymphocytes tends to decrease.
[0036]
Next, a washing solution is poured to discharge lymphocytes. Examples of the method include a method using a drop, a method of pushing with a syringe, a method of crushing a bag, a method using a roller pump or a syringe pump, and the like. Although the drop is a simpler method, a roller pump, a syringe pump, or the like may be used to control the flow rate.
[0037]
In order to flow lymphocytes with the washing solution, it is necessary to flow through the filter device at an appropriate flow rate, and the range is 0.1 ml / min / cm²10.0 ml / min / cm or more²Less, more preferably, linear velocity 0.2 ml / min / cm²3.0 ml / min / cm²Is less than. Line speed is 0.1ml / min / cm²If it is less than 2, it takes too much time to wash the filter, and less lymphocytes flow out of the filter, which is not preferable. The linear velocity is 10.0 ml / min / cm²If the ratio exceeds 1, the proportion of monocytes that flow out simultaneously with lymphocytes tends to increase, which is not preferable in that the recovery rate decreases.
[0038]
Finally, the collection solution is poured to collect monocytes. Examples of the method include a method using a drop, a method of pushing with a syringe, a method of crushing a bag, a method using a roller pump or a syringe pump, and the like. The drop is a simpler method, but it is more preferable that the recovery is performed by a spring-type device or a pressure-type device that can control the flow rate and strongly pushes the recovered liquid.
[0039]
The flow rate of the recovered liquid is preferably a higher flow rate in order to increase shear stress and recover monocytes at a high rate, but the flow rate does not cause detachment of the connection between the cell separation filter and the circuit due to an increase in internal pressure, or damage to the cells. Preferably, the range is a linear velocity of 50 ml / min / cm.²1500ml / min / cm²Less, more preferably linear speed 100 ml / min / cm²1000ml / min / cm²Is less than. Linear speed 50ml / min / cm²If it is less than 1, the shear stress is low, and the cells cannot be sufficiently recovered, which is not preferable. Also, linear speed 1500ml / min / cm²The above is not preferable because the rate of damage to cells due to an increase in internal pressure increases.
[0040]
【Example】
  Examples of the present invention will be shown below, but the present invention is not limited thereto.
[Example 1]
1. Cell separation filter creation
  An average fiber diameter of 33 μm in order from the inlet side of a cylindrical polyethylene column with a height of 23 mm and a diameter of 6.8 mmφ (approx. 50 g / m)²), 12μm (approx. 30g / m)²), 2.7μm (approx. 90g / m)²) Polyester nonwoven fabric was filled in 12 sheets, 13 sheets and 3 sheets, respectively, to obtain cell separators. A hollow silicon tube having a height of 3 mm × inner diameter of 5 mmφ (outer diameter of 7 mmφ) was pressed up and down on the nonwoven fabric and fixed so that the nonwoven fabric did not move. Effective filtration cross section 36.3mm²The packing density of 2.7μm nonwoven fabric is about 0.25g / cm³Met. The cell separator was coated with a hydrophilic polymer for the purpose of imparting platelet permeability. That is, after passing a 1% ethanol solution of hydroxyethyl methacrylate / dimethylaminoethyl methacrylate copolymer (molar ratio of hydroxyethyl methacrylate and dimethylaminoethyl methacrylate = 97: 3) from the inlet side of the filter, nitrogen gas was passed through. Dried.
[0041]
2. Cell separation operation
A mononuclear cell fraction was obtained from human peripheral blood using an ACD solution by continuous centrifugation (COBE SPECTRA, manufactured by COBE-Lab. Inc.). Mononuclear cell fraction (6.8 × 10⁷0.5 ml / piece, monocyte purity 24.4%), diluted to 4 ml with physiological saline, passed through a cell separation filter at a flow rate of 0.1 ml / min, and then 6 ml of PBS (−) at 0.5 ml / min. After washing with a cell separation filter for 15 minutes in a refrigerator at 4 ° C., 2 ml of 10% dextran saline solution (“Dextran 40 Note” manufactured by Midori Cross Co., Ltd.) and then 5 ml of air were introduced from the outlet of the cell separation filter. Cells were harvested. It took about 70 minutes to collect the monocytes after flowing the mononuclear cell fraction through the filter. 1mm surface area of the filter in this cell separation operation²The total number of nucleated cells per cell was 3230, the monocyte recovery rate was 48%, and the monocyte purity was 39.8%. The monocyte recovery rate and monocyte purity were calculated from the ratio of nucleated cells measured by an automatic blood cell counter (Microcell counter, manufactured by Sysmex Corporation).
[0042]
[Comparative Example 1]
A cell separation filter similar to that of Example 1 was prepared.
A mononuclear cell fraction was obtained from human peripheral blood using an ACD solution by continuous centrifugation (COBE SPECTRA, manufactured by COBE-Lab. Inc.). Mononuclear cell fraction (6.8 × 10⁷2.5 ml of cells / ml, monocyte purity 24.4%) were collected, diluted to 4 ml with physiological saline, and cells were collected in the same manner as in Example 1. It took about 70 minutes to collect monocytes after flowing the mononuclear cell fraction through the filter. The total number of nucleated cells per 1 mm surface area of the filter in this cell separation operation was 16,150, the monocyte recovery rate was 15%, and the monocyte purity was 44.5%.
[0043]
[Example 2]
A cell separation filter similar to that of Example 1 was prepared.
A mononuclear cell fraction was obtained from human peripheral blood using an ACD solution by continuous centrifugation (COBE SPECTRA, manufactured by COBE-Lab. Inc.). Mononuclear cell fraction (6.8 × 10⁷1.5 ml of cells / ml, monocyte purity 24.4%) were collected, diluted to 4 ml with physiological saline, and the cells were collected in the same manner as in Example 1. It took about 70 minutes to collect the monocytes after flowing the mononuclear cell fraction through the filter. 1mm surface area of the filter in this cell separation operation²The total number of nucleated cells per cell was 9690, with a monocyte recovery rate of 38% and a monocyte purity of 41.1%.
[0044]
[Comparative Example 2]
A cell separation filter similar to that of Example 1 was prepared.
A mononuclear cell fraction was obtained from human peripheral blood using an ACD solution by continuous centrifugation (COBE SPECTRA, manufactured by COBE-Lab. Inc.). Mononuclear cell fraction (6.8 × 10⁷0.1 ml of cells / ml, monocyte purity 24.4%) were collected, diluted to 4 ml with physiological saline, and the cells were collected in the same manner as in Example 1. It took about 70 minutes to collect monocytes after flowing the mononuclear cell fraction through the filter. 1mm surface area of the filter in this cell separation operation²The total number of nucleated cells per cell was 646, the monocyte recovery rate was 24%, and the monocyte purity was 26.7%.
[0045]
[Example 3]
A cell separation filter similar to that of Example 1 was prepared.
Human peripheral blood (ACD solution: human peripheral blood = 1: 8) was collected. At this point, the monocyte purity was 7.2%. Mononuclear cell fractions were collected by specific gravity centrifugation (Ficoll, Pharmacia, specific gravity 1.077 g / ml).⁷The cells were suspended in PBS (-) supplemented with 10% plasma so that the number of cells / ml was increased. At this point, the purity of the monocytes was 18.4%. After flowing 8 ml of the mononuclear cell fraction from the inlet of the cell separation filter at a flow rate of 0.2 ml / min, 6 ml of PBS (−) was flowed at 0.5 ml / min, and the whole cell separation filter was cooled for 15 minutes in a refrigerator at 4 ° C. Thereafter, 2 ml of a 10% dextran physiological saline solution (“Dextran 40 Injection” manufactured by Midori Cross Co., Ltd.) and then 5 ml of air were introduced from the cell separation filter outlet, and the cells were collected. It took about 70 minutes to collect the monocytes after flowing the mononuclear cell fraction through the filter. 1mm surface area of the filter in this cell separation operation²The total number of nucleated cells per cell was 7,600, the monocyte recovery rate was 47%, and the monocyte purity was 34.6%.
[0046]
[Comparative Example 3]
A cell separation filter similar to that of Example 1 was prepared.
Human peripheral blood (ACD solution: human peripheral blood = 1: 8) was collected. At this point, the monocyte purity was 7.2%. Mononuclear cell fraction was collected by specific gravity centrifugation method (Fimac, manufactured by Pharmacia, specific gravity 1.077 g / ml).⁶The cells were suspended in PBS (-) supplemented with 10% plasma so that the number of cells / ml was increased. At this point, the purity of the monocytes was 18.4%. Cells were collected by the same procedure as in Example 3 using 7.5 ml of the mononuclear cell fraction. It took about 70 minutes to collect the monocytes after flowing the mononuclear cell fraction through the filter. 1mm surface area of the filter in this cell separation operation²The total number of nucleated cells per cell was 712, the monocyte recovery rate was 15%, and the monocyte purity was 18.6%.
[0047]
[Example 4]
[Example 4]
1. Cell separation filter creation
  Polyester nonwoven fabric with an average fiber diameter of 12μm (approx. 100g / m²) 16 non-woven fabrics with an average fiber diameter of 2.3μm (approx. 60g / m)²) 18 sheets were stacked and cut into 35 mm squares with a push cutter to obtain a cell separation filter material. This cell separation filter material has a container outer dimension (length x width x thickness) of 41 x 41 x 18 mm, and a polyester non-woven fabric having an average fiber diameter of 2.3 μm on the outlet side of a polycarbonate container having a liquid outlet and a liquid inlet on a diagonal line. A cell separation filter was prepared by packing the mixture. Effective filtration sectional area 12.25cm²The packing density of 2.3μm non-woven fabric is about 0.22g / cm³Met. The cell separator was coated with a hydrophilic polymer for the purpose of imparting platelet permeability. That is, after passing a 1% ethanol solution of hydroxyethyl methacrylate / dimethylaminoethyl methacrylate copolymer (molar ratio of hydroxyethyl methacrylate and dimethylaminoethyl methacrylate = 97: 3) from the inlet side of the filter, nitrogen gas was passed through. Dried.
[0048]
2. Cell separation operation
A mononuclear cell fraction was obtained from human peripheral blood using an ACD solution by continuous centrifugation (COBE SPECTRA, manufactured by COBE-Lab. Inc.). Mononuclear cell fraction (6.8 × 10⁷50 ml / ml, monocyte purity 24.4%), flow through a cell separation filter at a flow rate of 5 ml / min, wash with 50 ml of PBS (−) at 10 ml / min, and separate cells in a refrigerator at 4 ° C. After cooling the entire filter for 15 minutes, 10 ml of a 10% dextran physiological saline solution (“Dextran 40 injection” manufactured by Midori Cross Co., Ltd.) and then 25 ml of air were introduced from the outlet of the cell separation filter to collect the cells. The time required to collect monocytes after flowing the mononuclear cell fraction through the filter was about 40 minutes. 1mm surface area of the filter in this cell separation operation²The total number of nucleated cells per cell was 2596, the monocyte recovery rate was 53%, and the monocyte purity was 41.3%.
[0049]
[Comparative Example 4]
A cell separation filter similar to that of Example 4 was prepared.
A mononuclear cell fraction was obtained from human peripheral blood using an ACD solution by continuous centrifugation (COBE SPECTRA, manufactured by COBE-Lab. Inc.). Mononuclear cell fraction (6.8 × 10⁷5 ml of cells / ml, monocyte purity 24.4%) were collected, and cells were collected by the same operation as in Example 4. It took about 30 minutes to collect the monocytes after flowing the mononuclear cell fraction through the filter. 1mm surface area of the filter in this cell separation operation²The total number of nucleated cells per cell was 260, the monocyte recovery rate was 49%, and the monocyte purity was 25.1%.
[0050]
[Comparative Example 5]
8 ml of human peripheral blood was collected in a tube containing 1 ml of ACD solution. At this point, the monocyte purity was 6.3%. The mononuclear cell fraction was collected by specific gravity centrifugation (Ficoll, manufactured by Pharmacia, specific gravity 1.077 g / ml).⁶The cells were suspended in RPMI 1640 medium (manufactured by Gibco) so that the number of cells / ml was reached. At this point, the purity of the monocytes was 17.9%. A mononuclear cell fraction is seeded on an adherent cell culture dish, and CO₂Incubator (37 ℃, 5% CO₂) For 2 hours. Remove the supernatant of the medium, rinse twice with warm PBS (-) to remove floating cells, add a small amount of PBS (-) again, and peel off the attached cells from the dish using a rubber policeman. It was. During this time, CO₂Everything was done in a clean bench except putting the dish in the incubator. The time required for collecting monocytes after seeding the mononuclear cell fraction on the dish was about 190 minutes. The monocyte recovery rate in this cell separation operation was 31%, and the monocyte purity was 27.8%.
[0051]
The total number of nucleated cells / filter surface area, monocyte recovery rate, monocyte purity, and time required for monocyte recovery obtained in the cell separation operations of Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 5 are shown in the table. .
[Table 1]

[0052]
Moreover, the monocyte recovery rate and the monocyte purity with respect to the total number of nucleated cells / filter surface area of Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 4 were plotted and shown in FIG. From this figure, the monocyte recovery rate and monocyte purity are high because the filter surface area is 1 mm.²The total number of nucleated cells is 1,000 to 10,000 per cell, and if it is smaller than this range, the monocyte purity is decreased (in some cases, the monocyte recovery rate is also decreased). Remarkably reduced.
[0053]
【The invention's effect】
According to the present invention, a high-purity and high-yield monocyte fraction can be collected.
According to the present invention, a large amount of cells can be processed at once by using a filter, and a monocyte fraction can be collected in a closed system by incorporating the filter into a circuit. , Can greatly contribute to the development of routine medical practice.
Moreover, the mononuclear cell fraction collected by the continuous centrifugation method can be used for subdivision when it is frozen. When donors are deficient, etc., the monocyte fraction collected by continuous centrifugation can be thawed as appropriate, and monocytes can be easily obtained by the method of the present invention and used for medical practice. it can.
[Brief description of the drawings]
1 is a graph showing the results of Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 4. FIG.

Claims

A non-woven fabric having a packing density of 0.22 to 0.25 g / cm ³ and an average fiber diameter of 2.3 to 2.7 μm as a total of 1000 to 10,000 mononuclear cells suspended per 1 mm ^{2 of} filter surface area. A method for separating and recovering monocytes, wherein the monocytes are captured and flowed through a device filled with a filter that passes through lymphocytes, and then a recovery solution is introduced into the filter device to recover monocytes. .

The method for separating and recovering monocytes according to claim 1, wherein the mononuclear cell suspension is a mononuclear cell fraction obtained by removing granulocytes and red blood cells by continuous centrifugation or specific gravity centrifugation.

The method for separating and recovering monocytes according to claim 1 or 2, wherein the lymphocytes are caused to flow out of the filter device by flowing a mononuclear cell fraction through the filter device and then flowing a washing solution through the filter device. .

The method for separating and recovering monocytes according to any one of claims 1 to 3 , wherein the temperature in the filter device at the time of monocyte recovery is 2 ° C to 10 ° C.