JP2019506844A - ＣＤ３２ｂを標的とする抗体およびその使用方法 - Google Patents

ＣＤ３２ｂを標的とする抗体およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに選択的に結合する単離抗体およびその抗原結合性フラグメントに関する。本抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物、本抗体またはその抗原結合性フラグメントを使用する方法、ならびに本抗体またはその抗原結合性フラグメントを作製する方法もまた、本明細書に提供される。

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１６年１２月１５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５７０３６−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが４６７，２１６バイトである。
本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合する抗体およびその抗原結合性フラグメント、ならびにその組成物および使用方法に関する。
Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、ＩｇＧに結合するが、これらは、多くの免疫細胞によって発現されるため、自然免疫と体液性免疫とをつなぐものとしての機能を果たすことが可能となっている。活性化（activatory）ＦｃγＲは、その細胞内部分に直接、またはホモ二量体の共通のγ鎖などの関連するシグナル伝達単位の細胞質ドメインのいずれかに、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（immune-receptor tyrosine-based inhibitory mofit）（ＩＴＡＭ）を含む。これらのＩＴＡＭモチーフは、受容体に抗原−抗体複合体が架橋すると、リン酸化される。活性化ＦｃγＲは、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含むか、それと会合しており、このモチーフは、受容体に抗原−抗体複合体が架橋すると、リン酸化される。活性化されると、これらの受容体は、貪食および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を含む、免疫応答を媒介する（Nimmerjahn and Ravetch, Nature Rev. Immunol. 2008: 8(1) 34-47）。ＣＤ３２ｂは、唯一の阻害性ＦｃγＲであり、細胞内免疫受容体阻害性チロシンモチーフ（immune-receptor tyrosine-based inhibitory mofit）（ＩＴＩＭ）を含んでいる。ＣＤ３２ｂは、樹状細胞およびマクロファージを含む免疫細胞によって発現され（Nimmerjahn and Ravetch, Nature Rev. Immunol. 2008: 8(1) 34-47）、Ｂ細胞に発現される唯一のＦｃγＲである（Amigorena et al., Eur. J. Immunol. 1989:19(8) 1379-1385）。ＣＤ３２ｂの活性化およびＩＴＩＭリン酸化は、活性化ＦｃγＲ機能の阻害をもたらすか（Smith and Clatworthy, Nat. Rev. Immunol. 2010: (5) 328-343）、またはＢ細胞受容体に架橋した場合には、Ｂ細胞機能の低減をもたらす（Horton et al., J. Immunol. 2011: 186(7):4223-4233）。その阻害性の役割と一致して、Ｆｃ依存性活性／ＡＤＣＣ作用様式を有する治療用抗体は、ＣＤ３２ｂノックアウトマウスにおいて、野生型マウスにおけるものよりも頑強な抗腫瘍応答を有する（Clynes et al., Nat. Med. 2000: 6(4):443-6）。加えて、ＣＤ３２ｂ機能を損傷する多型は、自己免疫の発達と関連付けられている（Floto et al., Nat. Med. 2005: 11(10) 1056-1058）。
ＣＤ３２ｂは、ＣＤ３２ｂ１およびＣＤ３２ｂ２という２つのスプライスバリアントとして発現され、これらのバリアントは、類似の細胞外ドメインを有するが、内部移行の傾向を左右する細胞内ドメインが異なっている。完全長バリアントであるＣＤ３２ｂ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ３１９４４−１）は、リンパ系細胞に発現され、内部移行を防ぐ細胞内シグナル配列を有する。骨髄系細胞（myloid cell）に発現されるＣＤ３２ｂ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ３１９４４−２）は、このシグナル配列が欠如しており、そのため、内部移行がより生じやすい（Brooks et al., J. Exp. Med. 1989: 170(4) 1369-1385）。
Ｂ細胞成熟を通じて発現されることに加えて、ＣＤ３２ｂは、これらの細胞の悪性対応物に高度に発現することが見出されている。具体的には、ＣＤ３２ｂは、ＣＬＬ、ＮＨＬを含むＢ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫において発現されることが見出されており、ＣＤ３２ｂは、これらの適応症（例えば、Rankin et al., Blood 2006: 108(7) 2384-2391）および全身性軽鎖アミロイドーシスを含むその他のもの（Zhou et al., Blood 2008: 111(7) 3403-3406）の治療標的として提案されている。
腫瘍細胞におけるＣＤ３２ｂの発現は、リツキシマブを含む治療レジメンによる臨床上の利点の低減と相関性があることが示されている（Lim et al., Blood 2011: 118(9) 2530-2540）。さらに、ＣＤ３２ｂの発現は、Ｂ細胞性白血病モデルにおいて、インビボでアレムツズマブに対する耐性が発生した場合に増加することが見出されており、ＣＤ３２ｂのノックダウンにより、白血病細胞がアレムツズマブに媒介されるＡＤＣＣ活性に再度感受性となった（Pallasch et al., Cell 2014: 156(3) 590-602）。まとめると、これらのデータにより、Ｆｃ依存性（例えば、ＡＤＣＣ媒介性）の抗腫瘍活性を有する抗体に対する耐性機序としてのＣＤ３２ｂの役割が裏付けられる。この機序は、十分に理解されていないが、いくつかの仮説が存在する。Ｌｉｍら（Blood 2011: 118(9) 2530-2540）およびＶａｕｇｈａｎら（Blood 2014: 123(5) 669-677）は、リンパ腫細胞を用いて、ＣＤ３２ｂが、ＣＤ２０に結合したリツキシマブのＦｃに結合して３部構成の複合体の内部移行が生じ、最終的に、リンパ腫細胞の表面をコーティングするＣＤ２０に結合したリツキシマブの低減をもたらすことを実証した。さらに、リンパ腫細胞上のＣＤ３２ｂが、例えば、ＣＤ２０に結合したリツキシマブのＦｃ領域に、シス構成で結合し、リツキシマブのＦｃを効果的にマスクすることも提案されている。リツキシマブのＦｃのマスクの結果として、エフェクター細胞上の活性化ＦｃγＲへのトランス構成での結合の機会が低減することが想定される（Vaughan et al. Blood 2014: 123(5) 669-677）。ＦｃγＲが、この様式で作用し得るという証拠が、単純ヘルペスウイルス感染の際に示されており、ここで、ウイルスによりコードされるＦｃγＲが、感染細胞によって発現されるウイルス抗原に結合した抗体のＦｃ領域に結合し、それによって、抗体依存性細胞毒性から保護される（Van Vliet et al., Immunology 1992: 77(1) 109-115）。上記に概説したいずれの機序においても、ＣＤ３２ｂは、治療用モノクローナル抗体、例えば、リツキシマブのＦｃと、エフェクター細胞上の活性化ＦｃγＲとの間の相互作用を低減させ、免疫応答／ＡＤＣＣ活性の減少をもたらす。
本発明は、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、
（ａ）配列番号１、４、７、５３、５６、５９、１０５、１０８、１１１、１５７、１６０、１６３、２０９、２１２、２１５、２６１、２６４、２６７、３１３、３１６、３１９、３６５、３６８、３７１、４１７、４２０、４２３、４６９、４７２、４７５、５２１、５２４、５２７、５４７、５５０、５５３、５７３、５７６、５７９、６２５、６２８、および６３１のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２、５、８、５４、５７、６０、１０６、１０９、１１２、１５８、１６１、１６４、２１０、２１３、２１６、２６２、２６５、２６８、３１４、３１７、３２０、３６６、３６９、３７２、４１８、４２１、４２４、４７０、４７３、４７６、５２２、５２５、５２８、５４８、５５１、５５４、５７４、５７７、５８０、６２６、６２９、および６３２のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３、６、９、５５、５８、６１、１０７、１１０、１１３、１５９、１６２、１６５、２１１、２１４、２１７、２６３、２６６、２６９、３１５、３１８、３２１、３６７、３７０、３７３、４１９、４２２、４２５、４７１、４７４、４７７、５２３、５２６、５２９、５４９、５５２、５５５、５７５、５７８、５８１、６２７、６３０、および６３３のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１４、１７、２０、６６、６９、７２、１１８、１２１、１２４、１７０、１７３、１７６、２２２、２２５、２２８、２７４、２７７、２８０、３２６、３２９、３３２、３７８、３８１、３８４、４３０、４３３、４３６、４８２、４８５、４８８、５３４、５３７、５４０、５６０、５６３、５６６、５８６、５８９、５９２、６３８、６４１、６４４のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１５、１８、２１、６７、７０、７３、１１９、１２２、１２５、１７１、１７４、１７７、２２３、２２６、２２９、２７５、２７８、２８１、３２７、３３０、３３３、３７９、３８２、３８５、４３１、４３４、４３７、４８３、４８６、４８９、５３５、５３８、５４１、５６１、５６４、５６７、５８７、５９０、５９３、６３９、６４２、および６４５のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２、ならびに
（ｆ）配列番号１６、１９、２２、６８、７１、７４、１２０、１２３、１２６、１７２、１７５、１７８、２２４、２２７、２３０、２７６、２７９、２８２、３２８、３３１、３３４、３８０、３８３、３８６、４３２、４３５、４３８、４８４、４８７、４９０、５３６、５３９、５４２、５６２、５６５、５６８、５８８、５９１、５９４、６４０、６４３、および６４６のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含み、
抗体が、ヒトＣＤ３２ｂに選択的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の実施形態において、本出願は、抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、抗体が、配列番号１０、６２、１１４、１６６、２１８、２７０、３２２、３７４、４２６、４７８、５３０、５５６、５８２、および６３４のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２３、７５、１２７、１７９、２３１、２８３、３３５、３８７、４３９、４９１、５４３、５６９、５９５、および６４７のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、抗体が、ヒトＣＤ３２ｂに選択的に結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメントを開示する。
なおも別の実施形態において、本出願は、抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、抗体が、配列番号１２、６４、１１６、１６８、２２０、２７２、３２４、３７６、４２８、４８０、５８４、および６３６のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号２５、７７、１２９、１８１、２３３、２８５、３３７、３８９、４４１、４９３、５９７、および６４９のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、抗体が、ヒトＣＤ３２ｂに選択的に結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメントを開示する。
本出願は、さらに、抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、抗体が、配列番号３８、９０、１４２、１９４、２４６、２９８、３５０、４０２、４５４、５０６、５３２、５５８、６１０、および６６２のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号５１、１０３、１５５、２０７、２５９、３１１、３６３、４１５、４６７、５１９、５４５、５７１、６２３、および６７５のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、抗体が、ヒトＣＤ３２ｂに選択的に結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメントを開示する。
さらなる実施形態において、本出願は、抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、抗体が、
（ａ）それぞれ配列番号１、２、および３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｂ）それぞれ配列番号４、５、および６のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１７、１８、および１９のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｃ）それぞれ配列番号７、８、および９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２０、２１、および２２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｄ）それぞれ配列番号５３、５４、および５５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６６、６７、および６８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｅ）それぞれ配列番号５６、５７、および５８のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６９、７０、および７１のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｆ）それぞれ配列番号５９、６０、および６１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号７２、７３、および７４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｇ）それぞれ配列番号１０５、１０６、および１０７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１１８、１１９、１２０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｈ）それぞれ配列番号１０８、１０９、および１１０のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１２１、１２２、１２３のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｉ）それぞれ配列番号１１１、１１２、および１１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１２４、１２５、１２６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｊ）それぞれ配列番号１５７、１５８、および１５９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１７０、１７１、１７２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｋ）それぞれ配列番号１６０、１６１、および１６２のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１７３、１７４、１７５のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｌ）それぞれ配列番号１６３、１６４、および１６５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１７６、１７７、１７８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｍ）それぞれ配列番号２０９、２１０、および２１１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２２２、２２３、および２２４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｎ）それぞれ配列番号２１２、２１３、および２１４のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２２５、２２６、および２２７のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｏ）それぞれ配列番号２１５、２１６、および２１７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２２８、２２９、および２３０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｐ）それぞれ配列番号２６１、２６２、および２６３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２７４、２７５、および２７６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｑ）それぞれ配列番号２６４、２６５、および２６６のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２７７、２７８、および２７９のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｒ）それぞれ配列番号２６７、２６８、および２６９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２８０、２８１、および２８２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｓ）それぞれ配列番号３１３、３１４、および３１５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３２６、３２７、および３２８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｔ）それぞれ配列番号３１６、３１７、および３１８のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３２９、３３０、および３３１のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｕ）それぞれ配列番号３１９、３２０、および３２１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３３２、３３３、および３３４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｖ）それぞれ配列番号３６５、３６６、および３６７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３７８、３７９、および３８０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｗ）それぞれ配列番号３６８、３６９、および３７０のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３８１、３８２、および３８３のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｘ）それぞれ配列番号３７１、３７２、および３７３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３８４、３８５、および３８６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｙ）それぞれ配列番号４１７、４１８、および４１９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４３０、４３１、および４３２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｚ）それぞれ配列番号４２０、４２１、および４２２のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４３３、４３４、および４３５のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ａａ）それぞれ配列番号４２３、４２４、および４２５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４３６、４３７、および４３８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｂｂ）それぞれ配列番号４６９、４７０、および４７１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４８２、４８３、および４８４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｃｃ）それぞれ配列番号４７２、４７３、および４７４のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４８５、４８６、および４８７のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｄｄ）それぞれ配列番号４７５、４７６、および４７７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４８８、４８９、および４９０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｅｅ）それぞれ配列番号５２１、５２２、および５２３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５３４、５３５、および５３６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｆｆ）それぞれ配列番号５２４、５２５、および５２６のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５３７、５３８、および５３９のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｇｇ）それぞれ配列番号５２７、５２８、および５２９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５４０、５４１、および５４２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｈｈ）それぞれ配列番号５４７、５４８、および５４９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５６０、５６１、および５６２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｉｉ）それぞれ配列番号５５０、５５１、および５５２のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５６３、５６４、および５６５のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｊｊ）それぞれ配列番号５５３、５５４、および５５５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５６６、５６７、および５６８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｋｋ）それぞれ配列番号５７３、５７４、および５７５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５８６、５８７、および５８８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｌｌ）それぞれ配列番号５７６、５７７、および５７８のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５８９、５９０、および５９１のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｍｍ）それぞれ配列番号５７９、５８０、および５８１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５９２、５９３、および５９４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｎｎ）それぞれ配列番号６２５、６２６、および６２７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６３８、６３９、および６４０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
（ｏｏ）それぞれ配列番号６２８、６２９、および６３０のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６４１、６４２、および６４３のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、または
（ｐｐ）それぞれ配列番号６３１、６３２、および６３３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６４４、６４５、および６４６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを開示する。
追加の実施形態において、本出願は、
（ａ）配列番号１０のＶＨ配列および配列番号２３のＶＬ配列、
（ｂ）配列番号６２のＶＨ配列および配列番号７５のＶＬ配列、
（ｃ）配列番号１１４のＶＨ配列および配列番号１２７のＶＬ配列、
（ｄ）配列番号１６６のＶＨ配列および配列番号１７９のＶＬ配列、
（ｅ）配列番号２１８のＶＨ配列および配列番号２３１のＶＬ配列、
（ｆ）配列番号２７０のＶＨ配列および配列番号２８３のＶＬ配列、
（ｇ）配列番号３２２のＶＨ配列および配列番号３３５のＶＬ配列、
（ｈ）配列番号３７４のＶＨ配列および配列番号３８７のＶＬ配列、
（ｉ）配列番号４２６のＶＨ配列および配列番号４３９のＶＬ配列、
（ｊ）配列番号４７８のＶＨ配列および配列番号４９１のＶＬ配列、
（ｋ）配列番号５３０のＶＨ配列および配列番号５４３のＶＬ配列、
（ｌ）配列番号５５６のＶＨ配列および配列番号５６９のＶＬ配列、
（ｍ）配列番号５８２のＶＨ配列および配列番号５９５のＶＬ配列、または
（ｎ）配列番号６３４のＶＨ配列および配列番号６４７のＶＬ配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを開示する。
なおも別の実施形態において、本出願は、
（ａ）配列番号１２の重鎖配列および配列番号２５の軽鎖配列、
（ｂ）配列番号６４の重鎖配列および配列番号７７の軽鎖配列、
（ｃ）配列番号１１６の重鎖配列および配列番号１２９の軽鎖配列、
（ｄ）配列番号１６８の重鎖配列および配列番号１８１の軽鎖配列、
（ｅ）配列番号２２０の重鎖配列および配列番号２３３の軽鎖配列、
（ｆ）配列番号２７２の重鎖配列および配列番号２８５の軽鎖配列、
（ｇ）配列番号３２４の重鎖配列および配列番号３３７の軽鎖配列、
（ｈ）配列番号３７６の重鎖配列および配列番号３８９の軽鎖配列、
（ｉ）配列番号４２８の重鎖配列および配列番号４４１の軽鎖配列、
（ｊ）配列番号４８０の重鎖配列および配列番号４９３の軽鎖配列、
（ｋ）配列番号５８４の重鎖配列および配列番号５９７の軽鎖配列、または
（ｌ）配列番号６３６の重鎖配列および配列番号６４９の軽鎖配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを開示する。
一実施形態において、本出願は、
（ａ）配列番号３８の重鎖配列および配列番号５１の軽鎖配列、
（ｂ）配列番号９０の重鎖配列および配列番号１０３の軽鎖配列、
（ｃ）配列番号１４２の重鎖配列および配列番号１５５の軽鎖配列、
（ｄ）配列番号１９４の重鎖配列および配列番号２０７の軽鎖配列、
（ｅ）配列番号２４６の重鎖配列および配列番号２５９の軽鎖配列、
（ｆ）配列番号２９８の重鎖配列および配列番号３１１の軽鎖配列、
（ｇ）配列番号３５０の重鎖配列および配列番号３６３の軽鎖配列、
（ｈ）配列番号４０２の重鎖配列および配列番号４１５の軽鎖配列、
（ｉ）配列番号４５４の重鎖配列および配列番号４６７の軽鎖配列、
（ｊ）配列番号５０６の重鎖配列および配列番号５１９の軽鎖配列、
（ｋ）配列番号５３２の重鎖配列および配列番号５４５の軽鎖配列、
（ｌ）配列番号５５８の重鎖配列および配列番号５７１の軽鎖配列、
（ｍ）配列番号６１０の重鎖配列および配列番号６２３の軽鎖配列、または
（ｎ）配列番号６６２の重鎖配列および配列番号６７５の軽鎖配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを開示する。
本出願はまた、
（ａ）配列番号１５７、１６０、または１６３から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１５８、１６１、または１６４から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１５９、３１５、３６７、４１９、４７１、５２３、５４９、５７５、または６２７から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１７０、１７３、または１７６から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１７１、１７４、または１７７から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを開示する。
さらなる実施形態において、本出願は、
（ａ）配列番号１５７、１６０、または１６３から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１５８、１６１、または１６４から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＥＱＸ１ＰＸ２Ｘ３ＧＸ４ＧＧＸ５ＰＸ６ＥＡＭＤＶ（配列番号６８３）（Ｘ１がＤまたはＳであり、Ｘ２がＥまたはＳであり、Ｘ３がＹ、Ｆ、Ａ、またはＳであり、Ｘ４がＹまたはＦであり、Ｘ５がＦまたはＹであり、Ｘ６がＹまたはＦである）を含む、ＨＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１７０、１７３、または１７６から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１７１、１７４、または１７７から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを開示する。
別の実施形態において、本出願は、
（ａ）配列番号１５７、１６０、または１６３から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１５８、１６１、または１６４から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１５９、３１５、３６７、または４１９のアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ３
（ｄ）配列番号１７０、１７３、または１７６から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１７１、１７４、または１７７から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを開示する。
なおも別の実施形態において、本出願は、
（ａ）配列番号４１７から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号４１８から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号４１９のアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４３０から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４３１から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを開示する。
本出願の一実施形態において、
（ａ）配列番号４１７から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号４１８から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号４１９のアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４３０から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４３１から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ３を含む、非フコシル化抗体またはその抗原結合性フラグメントが提供される。
さらなる実施形態において、本出願は、配列番号４２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域、および配列番号４４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、非フコシル化抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の実施形態において、本出願は、配列番号４２８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４４１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、非フコシル化抗体またはその抗原結合性フラグメントを開示する。
本出願はまた、抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、配列番号１０、６２、１１４、１６６、２１８、２７０、３２２、３７４、４２６、４７８、５３０、５５６、５８２、および６３４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２３、７５、１２７、１７９、２３１、２８３、３３５、３８７、４３９、４９１、５４３、５６９、５９５、および６４７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、抗体が、ヒトＣＤ３２ｂタンパク質に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
本出願はさらに、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、配列番号１２、３８、６４、９０、１１６、１４２、１６８、１９４、２２０、２４６、２７２、２９８、３２４、３５０、３７６、４０２、４２８、４５４、４８０、５０６、５３２、５５８、５８４、６１０、６３６、および６６２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号２５、５１、７７、１０３、１２９、１５５、１８１、２０７、２３３、２５９、２８５、３１１、３３７、３６３、３８９、４１５、４４１、４６７、４９３、５１９、５４５、５７１、５９７、６２３、６４９、および６７５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、抗体が、ヒトＣＤ３２ｂタンパク質に特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
本出願は、上述の単離抗体またはその抗原結合性フラグメントの実施形態のうちの一部において、抗体を非フコシル化することを提供する。他の実施形態において、抗体のＦｃ部分は、ＡＤＣＣ活性を増強するように修飾されている。
本明細書に記載される実施形態のすべてにおいて、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒトＣＤ３２ａよりもヒトＣＤ３２ｂに選択的に結合する。
本出願において開示される一部の実施形態において、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択されるＩｇＧである。他の実施形態において、単離抗体または抗原結合性フラグメントは、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、およびｓｃＦｖからなる群から選択される。なおも他の実施形態において、本明細書に開示される単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、キメラ、ヒト化、または完全ヒト化である。
一実施形態において、本出願に開示される抗体またはその抗原結合性フラグメントは、免疫グロブリンＦｃドメインへのヒトＣＤ３２ｂの結合を阻害する。
さらなる実施形態において、本明細書に開示される単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、イムノコンジュゲートの成分である。
本出願の一部の実施形態において、多価抗体は、本明細書に開示される単離抗体またはその抗原結合性フラグメントのうちのいずれかを含む。さらなる実施形態において、多価抗体は、二重特異性抗体である。
さらに、本明細書に開示される単離抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または多価抗体を、細胞においてＣＤ３２ｂと共発現される細胞表面抗原に結合する１つまたは複数の追加の抗体と組み合わせて含む、組成物もまた、本明細書に開示される。細胞表面抗原およびＣＤ３２ｂは、Ｂ細胞に共発現され得る。一部の実施形態において、細胞表面抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＫｉＲ，ＣＤ１９、ＣＤ４０、Ｔｈｙ−１、Ｌｙ−６、ＣＤ４９、Ｆａｓ、Ｃｄ９５、ＡＰＯ−１、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＸＣＲ４、ＨＬＡ分子、ＧＭ１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ７４、またはＤＲＤからなる群から選択される。一部の実施形態において、追加の抗体は、リツキシマブ、エロツズマブ、オファツムマブ、オビヌツムマブ、ダラツムマブ、およびアレムツズマブからなる群から選択される。
なおも別の実施形態において、本明細書に開示される単離抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または多価抗体、あるいは本明細書に開示される単離抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または多価抗体を含む組成物は、追加の治療用化合物をさらに含み得る。一部の実施形態において、追加の治療用化合物は、免疫調節剤である。一実施形態において、免疫調節剤は、ＩＬ１５である。別の実施形態において、免疫調節剤は、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３リガンド、およびＳＴＩＮＧから選択される共刺激分子のアゴニストである。別の実施形態において、免疫調節剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、およびＩＤＯから選択される標的の阻害分子である。さらなる実施形態において、追加の治療用化合物は、オファツムマブ、イブルチニブ、ベリノスタット、ロミデプシン、ブレンツキシマブベドチン、オビヌツズマブ、プララトレキセート、ペントスタチン、デキサメタゾン、イデラリシブ、イキサゾミブ、リポソーム化ドキソルビシン、ポマリドミド、パノビノスタット、エロツズマブ、ダラツムマブ、アレムツズマブ、サリドマイド、およびレナリドマイドから選択される。
本出願はまた、本明細書に開示される単離抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、多価抗体、あるいは単離抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または多価抗体を含む組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
別の実施形態において、本出願は、ＣＤ３２ｂのＦｃ結合性ドメイン内でＣＤ３２ｂに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを開示する。一部の実施形態において、抗体は、ＣＤ３２ｂのアミノ酸残基１０７〜１２３（ＶＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦ）内に結合する。他の実施形態において、抗体は、Ｂ細胞においてＣＤ３２ｂと共発現される腫瘍抗原に結合する第２の抗体の免疫グロブリンＦｃドメインへのＣＤ３２ｂの結合を防止または低減する。一部の実施形態において、第２の抗体は、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＫｉＲ、ＣＤ１９、ＣＤ４０、Ｔｈｙ−１、Ｌｙ−６、ＣＤ４９、Ｆａｓ、Ｃｄ９５、ＡＰＯ−１、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＸＣＲ４、ＨＬＡ分子、ＧＭ１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ７４、またはＤＲＤからなる群から選択される腫瘍抗原に結合する。特定の実施形態において、第２の抗体は、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、およびＣＤ５２からなる群から選択される腫瘍抗原に結合する。さらなる実施形態において、第２の抗体は、リツキシマブ、エロツズマブ、オファツムマブ、オビヌツムマブ、ダラツムマブ、およびアレムツズマブからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＣＤ３２ｂのＦｃ結合性ドメイン内でＣＤ３２ｂに特異的に結合する単離抗体または抗原結合性フラグメントは、本明細書に開示される抗体である。
なおも別の実施形態において、本出願は、ＣＤ３２ｂに特異的に結合し、Ｂ細胞においてＣＤ３２ｂと共発現される腫瘍抗原に結合する第２の抗体によって媒介されるＣＤ３２ｂ免疫受容体阻害性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）シグナル伝達を阻害または低減する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを開示する。Ｂ細胞は、正常Ｂ細胞であってもよく、または悪性Ｂ細胞であってもよい。
さらなる実施形態において、本出願は、Ｂ細胞においてＣＤ３２ｂと共発現される腫瘍抗原に結合する治療用抗体の投与によって誘導されるＣＤ３２ｂ ＩＴＩＭシグナル伝達を阻害または低減する方法であって、ＣＤ３２ｂのＦｃ結合性ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与するステップを含む、方法を開示する。単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＩＴＩＭシグナル伝達を刺激しない。この方法の一部の実施形態において、治療用抗体は、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＫｉＲ、ＣＤ１９、ＣＤ４０、Ｔｈｙ−１、Ｌｙ−６、ＣＤ４９、Ｆａｓ、Ｃｄ９５、ＡＰＯ−１、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＸＣＲ４、ＨＬＡ分子、ＧＭ１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ７４、またはＤＲＤからなる群から選択される腫瘍抗原に結合する。この方法の他の実施形態において、治療用抗体は、リツキシマブ、エロツズマブ、オファツムマブ、オビヌツムマブ、ダラツムマブ、およびアレムツズマブからなる群から選択される。
本出願はまた、それを必要とする対象においてＣＤ３２ｂ関連状態を治療する方法であって、対象に、治療有効量の、本明細書に開示される抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、多価抗体、あるいは単離抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または多価抗体を含む組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。さらに、それを必要とする対象においてＣＤ３２ｂ関連状態を治療する際に使用するための、本明細書に開示される抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、多価抗体、あるいは単離抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または多価抗体を含む組成物を提供する。さらに、それを必要とする対象において行ＣＤ３２ｂ関連状態を治療するため、またはそれを必要とする対象においてＣＤ３２ｂ関連状態を治療するための医薬品の製造のための、本明細書に開示される抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、多価抗体、あるいは単離抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または多価抗体を含む組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、ＣＤ３２ｂ関連状態は、Ｂ細胞性悪性腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ種、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、小型リンパ球性リンパ腫、びまん性小型切れ込み細胞型リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、濾胞性リンパ腫、または全身性軽鎖アミロイドーシスから選択される。
本出願はまた、細胞においてＣＤ３２ｂと共発現される細胞表面抗原に結合する抗体を使用した治療に対して耐性または不応性である患者を治療する方法であって、この抗体を、本明細書に開示される単離抗ＣＤ３２ｂ抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または多価抗体のうちのいずれか１つと共投与するステップを含む、方法を開示する。本出願はまた、細胞においてＣＤ３２ｂと共発現される細胞表面抗原に結合する抗体を使用した治療に対して耐性または不応性である患者の治療であって、この抗体を、抗Ｃｄ３２ｂ抗体またはその抗原結合性フラグメントと共投与することを含む治療のための、本明細書に開示される単離抗ＣＤ３２ｂ抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または多価抗体のうちのいずれか１つの使用を開示する。本出願はさらに、細胞においてＣＤ３２ｂと共発現される細胞表面抗原に結合する抗体を使用した治療に対して耐性または不応性である患者の治療であって、この抗体を、抗Ｃｄ３２ｂ抗体またはその抗原結合性フラグメントと共投与することを含む治療のための、本明細書に開示される単離抗ＣＤ３２ｂ抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または多価抗体を開示する。
本出願はまた、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする核酸、ならびに核酸を含むベクター、ならびに核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。さらに、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性フラグメントを産生する方法であって、抗体をコードする核酸を発現する宿主細胞を培養するステップ、および培養物から抗体を収集するステップを含む、方法が提供される。
本出願はまた、表１に列挙されるＣＤＲを含むヒトＣＤ３２ｂ抗体に選択的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする、単離ポリヌクレオチドを提供する。
抗体ＮＯＶ１２１６の電気泳動図である。哺乳動物においてＩｇＧで発現されるＮＯＶ１２１６のキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）分析により、抗体が、３つの主要な種、未修飾、＋８０ダルトン、および＋１６０ダルトンとして存在していたことが明らかとなった。 キャピラリーゾーン電気泳動による８つのＣＤ３２ｂ結合性ＣＤＲ−Ｈ３変異体抗体の電気泳動図である。 フローサイトメトリーによって測定した、ＣＤ３２ｂ結合性抗体パネルのＣＤ３２ｂまたはＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ細胞への結合アッセイにより得られた結果を示す、一連のグラフである。 フローサイトメトリーによって測定した、ＣＤ３２ｂ結合性抗体パネルのヒトＣＤ１６およびＣＤ６４のバリアントを発現するＣＨＯ細胞への結合アッセイにより得られた結果を示す、一連のグラフである。 フローサイトメトリーによって測定した、ＣＤ３２ｂ結合性抗体パネルのヒトＢ細胞への結合アッセイにより得られた結果を示す、一連のグラフである。 フローサイトメトリーによって測定した、ＣＤ３２ｂ結合性抗体パネルのＢＪＡＢ細胞への結合アッセイにより得られた結果を示す、一連のグラフである。 図７ａおよび図７ｂは、ＣＤ３２ｂ結合性抗体の結合エピトープを特徴付けるように設計されている、野生型および変異体のＣＤ３２ｂタンパク質の一連の３Ｄモデルである。 図８ａ〜図８ｃは、抗体の結合エピトープを特徴付けるように設計されている、フローサイトメトリーによって測定した、ＣＤ３２ｂ結合性抗体パネルの野生型および変異体のＣＤ３２ｂタンパク質を発現するＣＨＯ細胞への結合特徴を示す、一連のグラフである。 ＣＤ３２ｂ結合性抗体パネルの、ある範囲のＣＤ３２ｂ発現、ＣＤ３２ａ発現、またはＣＤ３２ｂもしくはＣＤ３２ａの発現なしを特徴とする細胞株への結合特徴を示す、一連のグラフである。 ＣＤＲ−Ｈ３変異体ＣＤ３２ｂ結合性抗体パネルの、ある範囲のＣＤ３２ｂ発現、ＣＤ３２ａ発現、またはＣＤ３２ｂもしくはＣＤ３２ａの発現なしを特徴とする細胞株への結合特徴を示す、一連のグラフである。 図１１ａおよび図１１ｂは、初代ＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおける、野生型Ｆｃ領域（Ｆｃ野生型）を有するＣＤ３２ｂ結合性抗体パネルの活性を示す、一連のグラフである。 免疫無防備状態のマウスにおける、樹立された播種性マントル細胞性リンパ腫Ｊｅｋｏ１異種移植片に対するＦｃ野生型ＣＤ３２ｂ結合性抗体パネルのインビボ抗腫瘍活性を示す、グラフである。 免疫無防備状態のマウスにおける、樹立されたＤａｕｄｉ異種移植片に対するＦｃ野生型ＣＤ３２ｂ結合性抗体ＮＯＶ１２１６の用量応答性インビボ抗腫瘍活性を示す、一連のグラフである。 図１４ａ〜図１４ｄは、ＤａｕｄｉおよびＪｅｋｏ１を標的細胞として用いた初代ＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤ１６ａ活性化レポーターアッセイにおける、Ｆｃ野生型ＣＤ３２ｂ結合性抗体、ＡＤＣＣ増強型（ｅＡＤＣＣ）Ｆｃ変異体ＣＤ３２ｂ結合性抗体、非フコシル化ＣＤ３２ｂ結合性抗体、またはＮ２９７Ａ Ｆｃ変異体ＣＤ３２ｂ結合性抗体の活性を示す、一連のグラフである。 Ｊｅｋｏ１を標的細胞として用いた初代ＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおける、ＣＤ３２ｂ結合性抗体のＦｃ野生型バージョン、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体バージョン、およびＮ２９７Ａ Ｆｃ変異体バージョンの活性を示す、一連のグラフである。 ある範囲のＣＤ３２ｂ発現を呈する標的細胞を用いたＣＤ１６ａレポーターアッセイにおける、ＣＤ３２ｂ結合性抗体ＮＯＶ１２１６のＦｃ野生型バージョン、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体バージョン、およびＮ２９７Ａ Ｆｃ変異体バージョンの活性を示す、一連のグラフである。 ある範囲のＣＤ３２ｂ発現を呈する標的細胞を用いたＣＤ１６ａレポーターアッセイにおける、非フコシル化ＣＤ３２ｂ結合性ＣＤＲ−Ｈ３変異体抗体の活性を示す、一連のグラフである。 初代ＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおける、非フコシル化ＣＤ３２ｂ結合性ＣＤＲ−Ｈ３変異体抗体の活性を示す、一連のグラフである。 初代ＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおける、非フコシル化ＣＤ３２ｂ結合性ＣＤＲ−Ｈ３変異体抗体の活性を示す、グラフである。 樹立されたＤａｕｄｉ異種移植片に対する、ＣＤ３２ｂ結合性抗体ＮＯＶ１２１６のＦｃ野生型バージョン、Ｎ２９７Ａバージョン、およびｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体バージョンのインビボ抗腫瘍活性を示す、一連のグラフである。 樹立されたＤａｕｄｉ異種移植片に対する非フコシル化ＣＤＲ−Ｈ３変異体ＣＤ３２ｂ結合性抗体のインビボ抗腫瘍活性を示す、グラフである。 ＣＤ１６ａ活性化アッセイにおける、ＦｃサイレントＣＤ３２ｂ結合性抗体ＮＯＶ１２１６ Ｎ２９７Ａと組み合わせた場合のリツキシマブまたはオビヌツズマブの活性を示す、一連のグラフである。 ＣＤ１６活性化アッセイにおける、ＦｃサイレントＣＤ３２ｂ結合性ＣＤＲ−Ｈ３変異体抗体と組み合わせた場合のリツキシマブの活性の向上を示す、グラフである。 樹立されたＤａｕｄｉ異種移植片を保有するマウスにおける、ＣＤ３２ｂ結合性抗体ＮＯＶ１２１６ ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体と組み合わせた場合のリツキシマブまたはオビヌツズマブのインビボ抗腫瘍活性を示す、一連のグラフである。 ＣＤ１６ａ活性化アッセイにおける、ＦｃサイレントＣＤ３２ｂ結合性ＣＤＲ−Ｈ３変異体ＮＯＶ２１０８ Ｎ２９７Ａと組み合わせた場合のダラツムマブの活性の向上を示す、グラフである。 ヒトマクロファージによるＤａｕｄｉ標的細胞殺滅を媒介する、野生型ＮＯＶ１２１６および非フコシル化ＮＯＶ１２１６、ならびにＣＤＲ−Ｈ３変異体ＮＯＶ２１０８の能力を、野生型クローン１０抗体と比較して示す、グラフである。 初代ヒトＢ細胞における、ＣＤ３２ｂ結合性抗体２Ｂ６およびＮＯＶ１２１６が、基底および架橋型抗ＩｇＭにより刺激されるＣＤ３２ｂ ＩＴＩＭリン酸化に及ぼす影響を示す、一連のグラフである。 初代ヒトＢ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、およびＫａｒｐａｓ４２２細胞における、リツキシマブにより刺激されるＣＤ３２ｂ ＩＴＩＭリン酸化を調節する非フコシル化ＣＤ３２ｂ結合性抗体ＮＯＶ１２１６の能力を示す、グラフである。 フローサイトメトリーによって評価される、初代患者多発性骨髄腫サンプル、形質Ｂ細胞、および２つの樹立細胞株におけるＣＤ３２ｂの発現を示す、グラフである。 ヒトＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ標的細胞殺滅を媒介する、抗体ＮＯＶ２１０８のＦｃサイレントバージョン、Ｆｃ野生型バージョン、および非フコシル化バージョンの能力を、野生型クローン１０抗体と比較して示す、グラフである。 ＮＯＶ１２１６およびＮＯＶ２１０８の、野生型ｈｕＣＤ３２ｂおよびｈｕＣＤ３２ｂ変異体への結合を示す、一連のグラフである。 ＣＤ３２ｂ抗体ＮＯＶ２１０８の推定上の結合部位をマッピングするための、重水素交換実験において判定される、ヒトＣＤ３２ｂコンストラクト（アミノ酸１〜１７５）（配列番号６８２）のペプチド包括度マップを示す。チャート上の各バーは、重水素取込みをモニタリングしたペプチドを表す。 アミノ酸１から１７５までの、ヒトＣＤ３２ｂおよび抗体ＮＯＶ２１０８ Ｆａｂ複合体の重水素取込みにおける差分を示す、グラフである。 ヒトＣＤ３２ｂ結晶構造にマッピングした、抗体ＮＯＶ２１０８ Ｆａｂの結合時にヒトＣＤ３２ｂにおいて重水素交換から保護される部位を示す図である。 ＫＡＲＰＡＳ４２２細胞を使用したアッセイにおける、ＮＯＶ２１０８のＣＤＣ活性を示す、グラフである。 フローサイトメトリーによる細胞表面ＣＤ３２ｂ発現分析を示す、一連のグラフである。 ＮＫ細胞によるＮＯＶ２１０８抗体媒介性ＡＤＣＣに対する標的細胞として、マクロファージと比較したＤａｕｄｉ細胞の感受性を示すグラフである。 ４時間にわたる、Ｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ緑色で標識したマクロファージによって貪食された細胞の定量化を示す、グラフである。時間フレーム１つにつき、１ウェル当たり４つの位置の複製物を、平均した。 図３９ａ〜図３９ｃは、全血アッセイにおける、抗体ＮＯＶ２１０８（野生型および非フコシル化）がＢ細胞、単球、および顆粒球に及ぼす作用を示す、一連のグラフである。非フコシル化ＮＯＶ２１０８により、Ｂ細胞殺滅が増強され、単球および顆粒球の生存が保持される。 ＮＯＶ２１０８に媒介される初代ＮＫ細胞による多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株Ｋａｒｐａｓ６２０の溶解を示す、グラフである。 レナリドマイド（ＬＥＮ）でのＰＢＭＣの処置により、ＮＯＶ１２１６のＡＤＣＣ活性が増強されたことを示す、グラフである。そのような増強は、Ｔ細胞をＰＢＭＣから枯渇させた場合には、劇的に低減された。 ＫＭＳ−１２−ＢＭ多発性骨髄腫細胞株におけるＣＤ３２ｂ発現のＦＡＣＳ評価を示す、グラフである。 ＣＤ３２ｂ低ＫＭＳ−１２−ＢＭ ＭＭ皮下異種移植片を保有するマウスにおける、Ｆｃ増強型抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体とＨＤＡＣ阻害剤であるパノビノスタットとを組み合わせることに関する、インビボ抗腫瘍活性を示す、一連のグラフである。 皮下Ｄａｕｄｉ異種移植片を保有するヌードマウスに静脈内投与した非フコシル化ＮＯＶ２１０８の用量依存性抗腫瘍活性を示す、グラフである。 ＫＡＲＰＡＳ６２０ ＭＭ細胞株の皮下異種移植片を保有するヌードマウスにおける、非フコシル化ＮＯＶ２１０８の抗腫瘍活性を示す、グラフである。 ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体ＮＯＶ２１０８の静脈内投与が、ヌードマウスの皮下に植え込んだＤａｕｄｉ異種移植片におけるＦ４／８０陽性度に及ぼす影響を示す、グラフである。
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトＣＤ３２ｂタンパク質に特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメント、および医薬組成物、産生方法、ならびにそのような抗体および組成物の使用方法を提供する。
定義
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。
「ＣＤ３２Ａ」または「ＣＤ３２ａ」は、本明細書において使用されるとき、ヒトＦＣγ受容体２ＡまたはＦＣγＲ２ＡまたはＦＣＧＲ２ａまたはＦＣＧＲ２Ａとも称される、ヒトＣＤ３２ａタンパク質を意味する。Ｈ１３１およびＲ１３１（シグナル配列なしで参照される場合）またはＨ１６７およびＲ１６７（シグナル配列ありで参照される場合）として知られる２つのバリアントが存在する。Ｈ１６７バリアントのアミノ酸配列は、受託番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ１２３１８で寄託されており、以下に示される。
ＭＴＭＥＴＱＭＳＱＮＶＣＰＲＮＬＷＬＬＱＰＬＴＶＬＬＬＬＡＳＡＤＳＱＡＡＡＰＰＫＡＶＬＫＬＥＰＰＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＱＧＡＲＳＰＥＳＤＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＭＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫＳＱＫＦＳＨＬＤＰＴＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩＧＹＴＬＦＳＳＫＰＶＴＩＴＶＱＶＰＳＭＧＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＩＡＴＡＶＡＡＩＶＡＡＶＶＡＬＩＹＣＲＫＫＲＩＳＡＮＳＴＤＰＶＫＡＡＱＦＥＰＰＧＲＱＭＩＡＩＲＫＲＱＬＥＥＴＮＮＤＹＥＴＡＤＧＧＹＭＴＬＮＰＲＡＰＴＤＤＤＫＮＩＹＬＴＬＰＰＮＤＨＶＮＳＮＮ（配列番号６７７）
「ＣＤ３２Ｂ」または「ＣＤ３２ｂ」は、本明細書において使用されるとき、ヒトＦＣγ受容体２ＢまたはＦＣγＲ２ＢまたはＦＣＧＲ２ｂまたはＦＣＧＲ２Ｂとも称される、ヒトＣＤ３２ｂタンパク質を意味する。ＣＤ３２ｂバリアント１のアミノ酸配列は、受託番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ３１９９４−１で寄託されており、以下に示される。
ＭＧＩＬＳＦＬＰＶＬＡＴＥＳＤＷＡＤＣＫＳＰＱＰＷＧＨＭＬＬＷＴＡＶＬＦＬＡＰＶＡＧＴＰＡＡＰＰＫＡＶＬＫＬＥＰＱＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＲＧＴＨＳＰＥＳＤＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＶＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫＳＫＫＦＳＲＳＤＰＮＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩＧＹＴＬＹＳＳＫＰＶＴＩＴＶＱＡＰＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＴＧＩＡＶＡＡＩＶＡＡＶＶＡＬＩＹＣＲＫＫＲＩＳＡＬＰＧＹＰＥＣＲＥＭＧＥＴＬＰＥＫＰＡＮＰＴＮＰＤＥＡＤＫＶＧＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＭＨＰＤＡＬＥＥＰＤＤＱＮＲＩ（配列番号６７８）
ＣＤ３２ｂバリアント２のアミノ酸配列は、受託番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ３１９９４−２で寄託されており、以下に示される。
ＭＧＩＬＳＦＬＰＶＬＡＴＥＳＤＷＡＤＣＫＳＰＱＰＷＧＨＭＬＬＷＴＡＶＬＦＬＡＰＶＡＧＴＰＡＡＰＰＫＡＶＬＫＬＥＰＱＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＲＧＴＨＳＰＥＳＤＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＶＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫＳＫＫＦＳＲＳＤＰＮＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩＧＹＴＬＹＳＳＫＰＶＴＩＴＶＱＡＰＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＴＧＩＡＶＡＡＩＶＡＡＶＶＡＬＩＹＣＲＫＫＲＩＳＡＮＰＴＮＰＤＥＡＤＫＶＧＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＭＨＰＤＡＬＥＥＰＤＤＱＮＲＩ（配列番号６７９）
本明細書に記載されるとき、ＣＤ３２ｂに結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒトＣＤ３２ｂタンパク質に結合する。本明細書において使用されるとき、「ｈｕＣＤ３２ｂ」は、ヒトＣＤ３２ｂタンパク質またはそのフラグメントを指す。
「抗体」などの用語は、本明細書において使用されるとき、完全抗体およびそのあらゆる抗原結合性フラグメント（すなわち、「抗原結合性部分」）または一本鎖を含む。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含む、糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される保存性の高い領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに分割することができる。ＶＨおよびＶＬは、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端に、次の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主の組織または因子との結合を媒介し得る。
抗体の「抗原結合性フラグメント」、「その抗原結合性フラグメント」、「抗原結合性部分」などの用語は、本明細書において使用されるとき、所与の抗原（例えば、ＣＤ３２ｂ）に特異的に結合する能力を保持するインタクトな抗体の１つまたは複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、インタクトな抗体のフラグメントによって行われ得る。抗体の「抗原結合性部分」という用語に包含される結合性フラグメントの例としては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結され２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ）２フラグメント；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対合して一価分子を形成した単一のタンパク質鎖として作製することを可能にする人工的ペプチドリンカーによって、接合することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知であり、例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426、およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照されたい）。そのような一本鎖抗体は、抗体の１つまたは複数の「抗原結合性部分」を含む。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来的な技法を使用して、得ることができ、これらのフラグメントは、有用性に関して、インタクトな抗体と同じ様式でスクリーニングされる。
抗原結合性部分はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびビス−ｓｃＦｖに組み込むことができる（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136を参照されたい）。抗体の抗原結合性部分は、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）など、ポリペプチドに基づくスキャフォールドにグラフトすることができる（例えば、フィブロネクチンポリペプチドモノボディについて記載している米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。
抗原結合性部分は、タンデムＦｖセグメントの対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組み込むことができ、これが、相補性軽鎖ポリペプチドと一緒になって、抗原結合性領域の対を形成する（Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8 (10):1057-1062、および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
本明細書において使用されるとき、「親和性」という用語は、単一の抗原性部位における抗体と抗原との間の相互作用の強さを指す。各抗原性部位内において、抗体「アーム」の可変領域は、弱い非共有結合力によって、多数の部位にある抗原と相互作用するが、相互作用が多いほど親和性が強い。
本明細書において使用されるとき、「アビディティ」という用語は、抗体−抗原複合体の全体的な安定性または強度を示す手段を指す。これは、３つの主要な因子によって制御される：抗体のエピトープ親和性、抗原および抗体の両方の価数、ならびに相互作用する部分の構造的配置。最終的に、これらの因子が、抗体の特異性、すなわち、特定の抗体が的確な抗原エピトープに結合する可能性を定義する。
「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸および合成のアミノ酸、ならびに天然のアミノ酸に類似の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然のアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基が結合したアルファ炭素を有する、化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基を有する（例えば、ノルロイシン）か、または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然のアミノ酸に類似の様式で機能する、化学的化合物を指す。
「結合特異性」という用語は、本明細書において使用されるとき、１つの抗原決定基と反応し、異なる抗原決定基とは反応しない、個々の抗体の結合部位の能力を指す。抗体の結合部位は、分子のＦａｂ部分に位置し、重鎖および軽鎖の超可変領域から構築されている。抗体の結合親和性は、単一の抗原決定基と抗体上の単一の結合部位との間の反応の強さである。それは、抗原決定基と抗体の結合部位との間で作動する引力と斥力との合計である。
２つの実体間の特異的結合は、少なくとも１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、１０１３Ｍ−１、または１０１４Ｍ−１の平衡定数（ＫＡまたはＫＡ）での結合を意味する。抗原に「特異的に（または選択的に）結合する」という語句（例えば、ＣＤ３２ｂ結合性抗体）は、異種タンパク質および他の生物製剤の集団における同種抗原（例えば、ヒトＣＤ３２ｂタンパク質）の存在を決定付ける、結合反応を指す。本発明のＣＤ３２ｂ結合性抗体は、非特異的抗原（例えば、ＣＤ３２ａ）よりも高い親和性で、ＣＤ３２ｂに結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換可能に使用される。
「キメラ抗体」（またはその抗原結合性フラグメント）という用語は、（ａ）定常領域またはその一部分が、改変、置き換え、または交換されており、結果として、抗原結合性部位（可変領域）が、異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能、および／もしくは種の定常領域に、またはキメラ抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに連結されているか、あるいは（ｂ）可変領域またはその一部分が、異なるまたは改変された抗原特異性を有する可変領域に改変、置き換え、または交換されている、抗体分子（またはその抗原結合性フラグメント）である。例えば、マウス抗体は、その定常領域を、ヒト免疫グロブリン由来の定常領域と置き換えることによって、修飾することができる。ヒト定常領域との置換えに起因して、キメラ抗体は、抗原を認識するその特異性を保持することができ、同時に、もともとのマウス抗体と比較して、ヒトにおける抗原性が低減されている。
「保存的修飾バリアント」という用語は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的修飾バリアントは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべてが、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定されているすべての位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを改変することなく、記載された対応するコドンのいずれかに改変することができる。そのような核酸のバリエーションは、保存的に修飾されたバリエーションの一種である「サイレントバリエーション」である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるすべての核酸配列は、可能性のあるすべての核酸のサイレントバリエーションについても記述する。当業者であれば、核酸のそれぞれのコドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧは除く）を修飾して、機能的に同一の分子を得ることができることを理解するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のあらゆるサイレントバリエーションが、それぞれの記載の配列で黙示される。
ポリペプチド配列に関して、「保存的修飾バリアント」には、あるアミノ酸と化学的に類似のアミノ酸との置換をもたらすポリペプチド配列の個々の置換、欠失、または付加が含まれる。機能的に類似のアミノ酸をもたらす保存的置換の一覧は、当該技術分野において周知である。そのような保存的修飾バリアントは、本発明の多型バリアント、種間ホモログ、およびアレルに加えられ、それらを除外しない。以下の８つの群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。一実施形態において、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特徴に有意に影響を及ぼさないかまたはそれを改変しない、アミノ酸修飾を指して使用される。
「遮断する」という用語は、本明細書において使用されるとき、相互作用またはプロセスを停止または防止すること、例えば、リガンド依存性またはリガンド非依存性のシグナル伝達を停止させることを指す。
「認識する」という用語は、本明細書において使用されるとき、抗体、その抗原結合性フラグメントが、その構成的エピトープを見出し、それと相互作用（例えば、結合）することを指す。
「交差遮断する」、「交差遮断される」、「交差遮断すること」、「競合する」、「交差競合する」という用語、および関連する用語は、標準的な競合的結合アッセイにおいて、ある抗体または他の結合物質が、他の抗体または結合物質のＣＤ３２ｂへの結合を妨害する能力を意味して、本明細書において互換可能に使用される。
抗体または他の結合物質が、別の抗体または結合性分子のＣＤ３２ｂへの結合を妨害することができる能力またはその程度、ならびにしたがって、それが本発明によって交差遮断すると言えるかどうかは、標準的な競合的結合アッセイを使用して判定することができる。１つの好適なアッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅ技術の使用を伴い（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用することによる）、これにより、表面プラズモン共鳴技術を使用して、相互作用の程度を測定することができる。交差遮断を測定するための別のアッセイでは、ＥＬＩＳＡに基づくアプローチを使用する。これらの技法は、実質的に類似の結果を生じることが予測されるが、Ｂｉａｃｏｒｅ技法による測定が最も確実であると考えられる。
「中和する」という用語は、抗体が、その標的に結合したときに、標的の活性、レベル、または安定性を低減することを意味する。例えば、ＣＤ３２ｂ抗体は、ＣＤ３２ｂに結合したときに、ＣＤ３２ｂの活性、レベル、または安定性、例えば、抗体のＦｃ部分への結合におけるＣＤ３２ｂの役割を、少なくとも部分的に低減することによって、ＣＤ３２ｂを中和する。
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができる、タンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖など、化学的に活性な表面分子群からなり、通常、特定の三次元構造特徴ならびに特定の電荷特徴を有する。立体構造エピトープおよび非立体構造エピトープは、立体構造エピトープへの結合が変性溶媒の存在下において消失するが、非立体構造エピトープへの結合は消失しないという点で、区別される。
「エピトープ」という用語には、免疫グロブリンに特異的に結合することができるか、または別様に分子と相互作用することができる、あらゆるタンパク質決定基が含まれる。エピトープ決定基は、一般に、アミノ酸または炭水化物または糖側鎖などの化学的に活性な表面分子群からなり、特定の三次元構造特徴ならびに特定の電荷特徴を有し得る。エピトープは、「直鎖状」または「立体構造」であり得る。
「直鎖状エピトープ」という用語は、タンパク質と、相互作用する分子（例えば、抗体）との間の相互作用の点すべてが、タンパク質の一次アミノ酸配列（連続的）に沿って直線状で生じるエピトープを指す。
本明細書において使用されるとき、ＩｇＧ抗体に関する「高親和性」という用語は、抗体が、標的抗原、例えば、ＣＤ３２ｂに対して、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、または１０−１０Ｍ以下、または１０−１１Ｍ以下のＫＤを有することを指す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプについては変動し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに関する「高親和性」結合は、抗体が１０−７Ｍ以下または１０−８Ｍ以下のＫＤを有することを指す。
「ヒト抗体」（またはその抗原結合性フラグメント）という用語は、本明細書において使用されるとき、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する、可変領域を有する抗体（およびその抗原結合性フラグメント）を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もまた、そのようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系配列、またはヒト生殖細胞系配列の変異バージョンに由来する。本発明のヒト抗体およびその抗原結合性フラグメントは、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ランダムもしくは部位特異的変異生成によってインビトロで、または体細胞変異によってインビボで導入される変異）を含み得る。
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」（またはその抗原結合性フラグメント）という語句は、本明細書において使用されるとき、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または同じ遺伝子源に由来する、ポリペプチド（抗体、抗体フラグメント、二重特異性抗体などを含む）を指す。この用語はまた、単一の分子組成の抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を呈する。
「ヒトモノクローナル抗体」（またはその抗原結合性フラグメント）という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を呈する抗体（およびその抗原結合性フラグメント）を指す。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、非ヒトトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
「組換えヒト抗体」（またはその抗原結合性フラグメント）という語句には、本明細書において使用されるとき、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離された、すべてのヒト抗体（およびその抗原結合性フラグメント）、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子にとってトランスジェニックもしくはトランスクロモソーム（transchromosomal）である動物（例えば、マウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換を受けた宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマ（transfectoma）から単離された抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ならびにヒト免疫グロブリン遺伝子のすべてまたは一部分の配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体が含まれる。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する、可変領域を有する。一実施形態において、そのような組換えヒト抗体は、インビトロでの変異生成（またはヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックな動物を使用する場合、インビボでの体細胞変異生成）に供され、これによって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、それらに関連するが、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然には存在し得ない配列となる。
「ヒト化」抗体（またはその抗原結合性フラグメント）は、本明細書において使用されるとき、非ヒト抗体の反応性を保持しながら、ヒトにおける免疫原性が低い、抗体（またはその抗原結合性フラグメント）である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分をそれらのヒト対応物（すなわち、定常領域、ならびに可変領域のフレームワーク部分）と置き換えることによって、達成することができる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984、Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988、Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988、Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991、およびPadlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994を参照されたい。ヒト操作技術の他の例としては、米国特許第５，７６６，８８６号明細書に開示されているＸｏｍａ技術が挙げられるが、これに限定されない。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の配列または部分配列が同一であることを指す。２つの配列が、比較ウインドウまたは指定領域にわたって、最大の対応に関して比較しアライメントしたときに、以下の配列比較アルゴリズムのうちのいずれかを使用するかまたは手作業でのアライメントおよび目視検査によって測定される、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドが指定された割合（すなわち、指定領域または指定されていない場合は配列全体にわたって６０％の同一性、任意選択で、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）である場合に、これら２つの配列は、「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）である領域にわたって、またはより好ましくは、長さが１００〜５００、もしくは１０００ヌクレオチド以上（または２０、５０、２００アミノ酸以上）である領域にわたって、存在する。任意選択で、同一性は、長さが少なくとも５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）である領域にわたって、またはより好ましくは、長さが１００〜５００、もしくは１０００ヌクレオチド以上（または２０、５０、２００アミノ酸以上）である領域にわたって、存在する。
配列比較に関して、典型的に、１つの配列が参照配列としての機能を果たし、それに対して、試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列を、コンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムのプログラムパラメーターを指定する。デフォルトのプログラムパラメーターを使用してもよく、または代替的なパラメーターを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
「比較ウインドウ」は、本明細書において使用されるとき、２０〜６００、通例的には約５０〜約２００、より通例的には約１００〜約１５０からなる群から選択される数の連続した位置のいずれかのセグメントに関する言及を含み、このセグメントにおいて、ある配列が、同じ数の連続する位置の参照配列に対して、２つの配列を最適にアライメントした後に比較され得る。比較のための配列のアライメント方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970の相同性アライメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988の類似性の検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手作業でのアライメントおよび目視検査（例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)を参照されたい）によって、行うことができる。
配列同一性および配列類似性のパーセントを判定するのに好適なアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、問い合わせ配列において短い長さの文字列Ｗを特定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を特定することを伴い、これは、データベース配列において同じ長さの文字列とアライメントしたときに、何らかの陽性値となる閾値スコアＴに一致するかまたはそれを満たすかのいずれかである。Ｔは、近傍文字列スコア閾値と称される（Altschul et al.（上記））。これらの初回近傍文字列のヒットは、それらを含む、より長いＨＳＰを発見するための検索を開始するのためのシードとしての機能を果たす。文字列のヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一致する残基対に対するリワードスコア、常に０を上回る）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア、常に０未満）を使用して、計算される。アミノ酸配列については、スコア付けマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。各方向での文字列ヒットの伸長は、累積アライメントスコアが、その最大達成値から数量Ｘに落ちた場合、負のスコアとなる１つもしくは複数の残基アライメントの蓄積に起因して累積スコアがゼロ以下となった場合、またはいずれかの配列の末端に達した場合に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、およびＸにより、アライメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、文字列の長さ（Ｎ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、文字列の長さ３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリックス（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照されたい）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析も行う（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小確率総和（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸を比較した際の最小確率総和が約０．２未満である場合、より好ましくは約０．０１未満である場合、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、参照配列に類似であると考えられる。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントもまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988）を使用して、ＰＡＭ１２０重み付け残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用して、判定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）においてＧＡＰプログラムに組み込まれている、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970）アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを、ギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、または４、および長さ重み１、２、３、４、５、または６で使用して、判定することができる。
上述の配列同一性の割合以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記載されるように、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、ポリペプチドは、典型的に、例えば、２つのペプチドが、保存的置換のみが異なる場合に、第２のポリペプチドに実質的に同一的である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子またはそれらの相補体が、以下に記載されるように、ストリンジェントな条件下において、互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるさらに別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅させることができることである。
「単離抗体」（またはその抗原結合性フラグメント）という用語は、本明細書において使用されるとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（またはその抗原結合性フラグメント）を指す（例えば、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する単離抗体は、ＣＤ３２ｂ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によって提供される抗体のクラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）を指す。アイソタイプはまた、これらのクラスのうちのいずれかの修飾バージョンを含み、ここで、修飾は、Ｆｃ機能を改変するため、例えば、エフェクター機能またはＦｃ受容体への結合を増強または低減するために行われている。
「Ｋａｓｓｏｃ」、「Ｋａ」、または「Ｋｏｎ」という用語は、本明細書において使用されるとき、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すことを意図し、一方で「Ｋｄｉｓ」、「Ｋｄ」、または「Ｋｏｆｆ」という用語は、本明細書において使用されるとき、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すことを意図する。一実施形態において、「ＫＤ」という用語は、本明細書において使用されるとき、Ｋａに対するＫｄの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指すことを意図し、これは、モル濃度（Ｍ）で表される。抗体のＫＤ値は、当該技術分野において十分に確立された方法を使用して判定することができる。抗体のＫＤを判定するための方法は、表面プラズモン共鳴を使用するか、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによるものである。解離定数が、約１０−９Ｍ未満である場合には、溶液平衡動態除外ＫＤ測定（ＭＳＤ−ＳＥＴ）が、抗体のＫＤを判定するための好ましい方法である（例えば、参照により本明細書に組み込まれるFriquet,B., Chaffotte,A.F., Djavadi-Ohaniance,L., and Goldberg,M.E. (1985) Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. J Immnunol Meth 77, 305-319を参照されたい）。
「ＩＣ５０」という用語は、本明細書において使用されるとき、インビトロまたはインビボのいずれかのアッセイにおいて、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインとの中間の阻害応答を誘導する、抗体またはその抗原結合性フラグメントの濃度を指す。
「モノクローナル抗体」（またはその抗原結合性フラグメント）または「モノクローナル抗体」（またはその抗原結合性フラグメント）組成物」という用語は、本明細書において使用されるとき、単一の分子組成の抗体分子（またはその抗原結合性フラグメント）の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を呈する。
「エフェクター機能」という用語は、抗原結合性ドメイン以外の抗体のドメインを通じた結合によって媒介される、通常はエフェクター分子の結合によって媒介される、抗体分子の活性を指す。エフェクター機能は、補体に媒介されるエフェクター機能を含み、これは、例えば、補体のＣ１成分が抗体に結合することによって媒介される。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解に重要である。補体の活性化はまた、炎症応答を刺激し、自己免疫の過感受性にも関与し得る。エフェクター機能には、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）媒介性エフェクター機能も含まれ、これは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に抗体の定常ドメインが結合するとトリガーされ得る。細胞表面のＦｃ受容体への抗体の結合は、いくつかの重要かつ多様な生物学的応答をトリガーするが、これらには、抗体によりコーティングされた粒子の貪食および破壊、免疫複合体のクリアランス、抗体によりコーティングされた標的細胞のキラー細胞による溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性、またはＡＤＣＣと称される）、炎症媒介因子の放出、胎盤通過、ならびに免疫グロブリン産生の制御が含まれる。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ受容体または補体成分などのエフェクター分子に対する抗体の親和性を改変すること、例えば、増強または低減させることによって改変することができる。結合親和性は、一般に、エフェクター分子結合部位を修飾することによって変動し、この事例では、目的の部位の位置を決定し、好適な方式でその部位の少なくとも一部を修飾することが適切である。また、抗体上のエフェクター分子に対する結合部位の改変は、必ずしも全体的な結合親和性を著しく改変するものではなく、相互作用の幾何を変化させて、エフェクター機構を非産生的結合のように無効にし得ることも想定される。さらに、エフェクター機能は、エフェクター分子の結合に直接的に関与しないが、それ以外の点でエフェクター機能の性能に関与する部位を修飾することによっても改変することができることが想定される。
「核酸」という用語は、本明細書において、「ポリヌクレオチド」という用語と互換可能に使用され、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを指す。この用語は、合成、天然、または非天然であり、参照核酸に類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドに類似の様式で代謝される、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは連結部を含む、核酸を包含する。そのような類似体の例としては、限定することなく、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ホスホラミデート（phosphoramidate）、メチルホスホネート（methyl phosphonate）、キラル−メチルホスホネート（chiral-methyl phosphonate）、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
別途示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾バリアント（例えば、縮重コドン置換）、および相補配列、ならびに明確に示されている配列を黙示的に包含する。具体的には、以下に詳述されるように、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991、Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985、およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）。
「作動可能に連結されている」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係性を指す。典型的には、これは、転写制御配列と転写される配列との機能的関係性を指す。例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列は、適切な宿主細胞または他の発現系において、コーディング配列の転写を刺激または調節する場合、コーディング配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されているプロモーター転写制御配列は、転写される配列に物理的に連続している、すなわち、シスで作用する。しかしながら、エンハンサーなど、一部の転写制御配列は、必ずしも、それらが転写を増強するコーディング配列と物理的に連続していなくてもよく、または近傍に位置していなくてもよい。
本明細書において使用されるとき、「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列が、産生細胞または生物、一般に、真核生物細胞、例えば、Ｐｉｃｈｉａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように、改変されていることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られている開始ヌクレオチド配列によって本来コードされるアミノ酸配列を完全にまたは可能な限り維持するように操作されている。本明細書における最適化された配列は、哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されている。しかしながら、他の真核生物細胞または原核生物細胞におけるこれらの配列の最適化された発現もまた、本明細書において想定される。最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列もまた、最適化された、と称される。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーを指して互換可能に使用される。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然のアミノ酸ポリマー、および非天然のアミノ酸ポリマーに適用される。別途示されない限り、特定のポリペプチド配列はまた、それらの保存的修飾バリアントを黙示的に包含する。
「組換えヒト抗体」（またはその抗原結合性フラグメント）という用語には、本明細書において使用されるとき、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離された、すべてのヒト抗体（およびその抗原結合性フラグメント）、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子にとってトランスジェニックもしくはトランスクロモソームである動物（例えば、マウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換を受けた宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ならびにヒト免疫グロブリン遺伝子のすべてまたは一部分の配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体が含まれる。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する、可変領域を有する。一実施形態において、しかしながら、そのような組換えヒト抗体は、インビトロでの変異生成（またはヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックな動物を使用する場合、インビボでの体細胞変異生成）に供され、これによって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、それらに関連するが、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然には存在し得ない配列となる。
「組換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことを意図することを理解されたい。変異または環境的影響のいずれかに起因して、ある特定の修飾が、後代に生じ得るため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、依然として、本明細書において使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物には、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類が含まれる。示されている場合を除き、「患者」または「対象」は、本明細書において互換可能に使用される。
「治療する」、「治療される」、「治療すること」、および「治療」という用語は、疾患の症状、合併症、もしくは生化学的兆候の発生を予防もしくは遅延するための組成物もしくは抗体の投与、症状の緩和、または疾患、状態、もしくは障害のさらなる発症の停止もしくは阻害を含む。治療は、予防的（疾患の発症を予防もしくは遅延するため、またはその臨床的もしくは亜臨床的症状の現れを予防するため）であってもよく、または疾患が現れた後の症状の治療的抑制もしくは緩和であってもよい。治療は、本明細書に記載される治療的尺度によって測定することができる。本発明の「治療」方法には、線維性疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状の治癒、その重症度の低減、もしくはその緩和のため、そのような治療がなかった場合に予測される対象の健康状態もしくは生存期間の延長のための、対象へのＣＤ３２ｂ抗体またはその抗原結合性フラグメントの投与が含まれる。例えば、「治療」は、対象における疾患症状の少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の緩和を含む。
「ベクター」という用語は、連結している別のポリヌクレオチドを輸送することができるポリヌクレオチド分子を指すことを意図する。ベクターの１つの種類には、「プラスミド」があり、これは、追加のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターには、ウイルスベクターがあり、追加のＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムにライゲーションされ得る。ある特定のベクターは、導入された宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、作動可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単純に「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、互換可能に使用され得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
ＣＤ３２ｂ抗体およびその抗原結合性フラグメント
本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂタンパク質に対して、ヒトＣＤ３２ａタンパク質よりも高い親和性で結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。ＣＤ３２ａよりも高いＣＤ３２ｂに対する選択性は、ＣＤ３２ａ陽性免疫細胞（単球および好中球を含む）への結合を欠きながら、ＣＤ３２ｂ陽性Ｂ細胞悪性腫瘍およびＢ細胞への選択的な結合を確実にするために所望される。
本発明の抗体には、実施例を含め、本明細書に記載されるように単離された、ヒトおよびヒト化モノクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。
そのような抗ヒトＣＤ３２ｂ抗体の例としては、抗体ＮＯＶ０２８１、ＮＯＶ０３０８、ＮＯＶ０５６３、ＮＯＶ１２１６、ＮＯＶ１２１８、ＮＯＶ１２１９、ＮＯＶ２１０６、ＮＯＶ２１０７、ＮＯＶ２１０８、ＮＯＶ２１０９、ＮＯＶ２１１０、ＮＯＶ２１１１、ＮＯＶ２１１２、およびＮＯＶ２１１３（野生型のＦｃ領域を有する抗体またはＦｃ領域にＮ２９７Ａ変異を含む抗体を含む）が挙げられ、これらの配列は、表１に列挙されている。本明細書に記載される抗体の生成および特徴付けに関するさらなる詳細は、実施例に提供されている。
本発明は、ＣＤ３２ｂ（例えば、ヒトＣＤ３２ｂタンパク質）に特異的に結合する抗体であって、表１に列挙されるＶＨドメインを含む、抗体を提供する。本発明はまた、ＣＤ３２ｂタンパク質に特異的に結合する抗体であって、表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む、抗体を提供する。具体的には、本発明は、ＣＤ３２ｂタンパク質に特異的に結合する抗体であって、表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のＶＨ ＣＤＲを含む（または代替として、それからなる）、抗体を提供する。
本発明はまた、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み（または代替として、それらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）内の約１０個以下のアミノ酸が、変異されている（変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明はまた、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み（または代替として、それらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）内の１０個以下のアミノ酸が、変異されている（変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
本発明はまた、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み（または代替として、それらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）内の約２０個以下のアミノ酸が、変異されている（変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明はまた、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み（または代替として、それらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）内の２０個以下のアミノ酸が、変異されている（変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
本発明は、ＣＤ３２ｂタンパク質に特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントであって、表１に列挙されるＶＬドメインを含む、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明はまた、ＣＤ３２ｂタンパク質に特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントであって、表１に列挙されるＶＬ ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。具体的には、本発明は、ＣＤ３２ｂタンパク質に特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントであって、表１に列挙されるＶＬ ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のＶＬ ＣＤＲを含む（または代替として、それらからなる）、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
本発明はまた、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表１に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み（または代替として、それらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）内の約１０個以下のアミノ酸が、変異されている（変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明はまた、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表１に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み（または代替として、それらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）内の１０個以下のアミノ酸が、変異されている（変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
本発明はまた、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表１に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み（または代替として、それらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）内の約２０個以下のアミノ酸が、変異されている（変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明はまた、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表１に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み（または代替として、それらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）内の２０個以下のアミノ酸が、変異されている（変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
本発明の他の抗体およびその抗原結合性フラグメントは、変異されているが、依然として、ＣＤＲ領域に、表１に記載される配列において示されるＣＤＲ領域との６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの同一性を有する、アミノ酸を含む。一態様において、本発明の他の抗体およびその抗原結合性フラグメントは、表１に記載される配列において示されるＣＤＲ領域と比較した場合に、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸が、ＣＤＲにおいて変異されている、変異体アミノ酸配列を含む。
本発明はまた、ＣＤ３２ｂタンパク質に特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントのＶＨ、ＶＬ、完全長重鎖、および完全長軽鎖をコードする核酸配列を提供する。そのような核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のために最適化されていてもよい（例えば、表１は、抗体ＮＯＶ０２８１、ＮＯＶ０３０８、ＮＯＶ０５６３、ＮＯＶ１２１６、ＮＯＶ１２１８、ＮＯＶ１２１９、ＮＯＶ２１０６、ＮＯＶ２１０７、ＮＯＶ２１０８、ＮＯＶ２１０９、ＮＯＶ２１１０、ＮＯＶ２１１１、ＮＯＶ２１１２、およびＮＯＶ２１１３の重鎖（野生型Ｆｃ領域を有する抗体またはＦｃ領域にＮ２９７Ａ変異を含む抗体の配列を含む）および軽鎖の例示的な核酸配列を示す）。
本出願の本文全体を通じて、本明細書の文章（例えば、表１）と配列表との間に不一致があった場合には、本明細書の文章が優先されるものとする。
本発明の他の抗体およびその抗原結合性フラグメントは、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸は変異されているが、依然として、表１に記載される配列に対して少なくとも６０、７０、８０、９０、または９５パーセントの同一性を有するものを含む。一実施形態において、それは、表１に記載される配列において示される可変領域と比較した場合に、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸が、可変領域において変異されているが、残りは実質的に同じ治療活性を保持している、変異体アミノ酸配列を含む。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号１、２、および３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号４、５、および６のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１７、１８、および１９のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号７、８、および９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２０、２１、および２２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号５３、５４、および５５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６６、６７、および６８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号５６、５７、および５８のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６９、７０、および７１のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号５９、６０、および６１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号７２、７３、および７４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号１０５、１０６、および１０７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１１８、１１９、１２０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号１０８、１０９、および１１０のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１２１、１２２、１２３のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号１１１、１１２、および１１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１２４、１２５、１２６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号１５７、１５８、および１５９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１７０、１７１、１７２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号１６０、１６１、および１６２のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１７３、１７４、１７５のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号１６３、１６４、および１６５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１７６、１７７、１７８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号２０９、２１０、および２１１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２２２、２２３、および２２４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号２１２、２１３、および２１４のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２２５、２２６、および２２７のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号２１５、２１６、および２１７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２２８、２２９、および２３０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号２６１、２６２、および２６３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２７４、２７５、および２７６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号２６４、２６５、および２６６のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２７７、２７８、および２７９のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号２６７、２６８、および２６９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２８０、２８１、および２８２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号３１３、３１４、および３１５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３２６、３２７、および３２８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号３１６、３１７、および３１８のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３２９、３３０、および３３１のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号３１９、３２０、および３２１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３３２、３３３、および３３４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号３６５、３６６、および３６７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３７８、３７９、および３８０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号３６８、３６９、および３７０のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３８１、３８２、および３８３のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号３７１、３７２、および３７３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３８４、３８５、および３８６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号４１７、４１８、および４１９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４３０、４３１、および４３２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号４２０、４２１、および４２２のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４３３、４３４、および４３５のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号４２３、４２４、および４２５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４３６、４３７、および４３８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号４６９、４７０、および４７１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４８２、４８３、および４８４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号４７２、４７３、および４７４のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４８５、４８６、および４８７のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号４７５、４７６、および４７７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４８８、４８９、および４９０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号５２１、５２２、および５２３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５３４、５３５、および５３６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号５２４、５２５、および５２６のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５３７、５３８、および５３９のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号５２７、５２８、および５２９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５４０、５４１、および５４２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号５４７、５４８、および５４９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５６０、５６１、および５６２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号５５０、５５１、および５５２のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５６３、５６４、および５６５のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号５５３、５５４、および５５５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５６６、５６７、および５６８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号５７３、５７４、および５７５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５８６、５８７、および５８８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号５７６、５７７、および５７８のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５８９、５９０、および５９１のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号５７９、５８０、および５８１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５９２、５９３、および５９４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号６２５、６２６、および６２７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６３８、６３９、および６４０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号６２８、６２９、および６３０のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６４１、６４２、および６４３のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、それぞれ配列番号６３１、６３２、および６３３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６４４、６４５、および６４６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号１０のＶＨアミノ酸配列および配列番号２３のＶＬアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号６２のＶＨアミノ酸配列および配列番号７５のＶＬアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号１１４のＶＨアミノ酸配列および配列番号１２７のＶＬアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号１６６のＶＨアミノ酸配列および配列番号１７９のＶＬアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号２１８のＶＨアミノ酸配列および配列番号２３１のＶＬアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号２７０のＶＨアミノ酸配列および配列番号２８３のＶＬアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号３２２のＶＨアミノ酸配列および配列番号３３５のＶＬアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号３７４のＶＨアミノ酸配列および配列番号３８７のＶＬアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号４２６のＶＨアミノ酸配列および配列番号４３９のＶＬアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号４７８のＶＨアミノ酸配列および配列番号４９１のＶＬアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号５３０のＶＨアミノ酸配列および配列番号５４３のＶＬアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号５５６のＶＨアミノ酸配列および配列番号５６９のＶＬアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号５８２のＶＨアミノ酸配列および配列番号５９５のＶＬアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号６３４のＶＨアミノ酸配列および配列番号６４７のＶＬアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号１２の重鎖アミノ酸配列および配列番号２５の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号３８の重鎖アミノ酸配列および配列番号５１の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号６４の重鎖アミノ酸配列および配列番号７７の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号９０の重鎖アミノ酸配列および配列番号１０３の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号１１６の重鎖アミノ酸配列および配列番号１２９の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号１４２の重鎖アミノ酸配列および配列番号１５５の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号１６８の重鎖アミノ酸配列および配列番号１８１の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号１９４の重鎖アミノ酸配列および配列番号２０７の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号２２０の重鎖アミノ酸配列および配列番号２３３の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号２４６の重鎖アミノ酸配列および配列番号２５９の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号２７２の重鎖アミノ酸配列および配列番号２８５の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号２９８の重鎖アミノ酸配列および配列番号３１１の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号３２４の重鎖アミノ酸配列および配列番号３３７の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号３５０の重鎖アミノ酸配列および配列番号３６３の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号３７６の重鎖アミノ酸配列および配列番号３８９の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号４０２の重鎖アミノ酸配列および配列番号４１５の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号４２８の重鎖アミノ酸配列および配列番号４４１の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号４５４の重鎖アミノ酸配列および配列番号４６７の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号４８０の重鎖アミノ酸配列および配列番号４９３の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号５０６の重鎖アミノ酸配列および配列番号５１９の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号５３２の重鎖アミノ酸配列および配列番号５４５の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号５５８の重鎖アミノ酸配列および配列番号５７１の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号５８４の重鎖アミノ酸配列および配列番号５９７の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号６１０の重鎖アミノ酸配列および配列番号６２３の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号６３６の重鎖アミノ酸配列および配列番号６４９の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ３２ｂに結合し、配列番号６６２の重鎖アミノ酸配列および配列番号６７５の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
これらの抗体のそれぞれは、ＣＤ３２ｂに結合することができるため、ＶＨ、ＶＬ、完全長軽鎖、および完全長重鎖の配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を、「うまく組み合わせて（mixed and matched）」、本発明の他のＣＤ３２ｂ結合性抗体およびその抗原結合性フラグメントを作製することができる。そのような「うまく組み合わせた」ＣＤ３２ｂ結合性抗体は、当該技術分野において公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、および実施例の節に記載されている他のアッセイ）を使用して試験することができる。これらの鎖をうまく組み合わせる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＨ配列を、構造的に類似のＶＨ配列と置き換えるものとする。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対合に由来する完全長重鎖配列は、構造的に類似の完全長重鎖配列と置き換えるものとする。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＬ配列を、構造的に類似のＶＬ配列と置き換えるものとする。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対合に由来する完全長軽鎖配列は、構造的に類似の完全長軽鎖配列と置き換えるものとする。
別の態様において、本発明は、表１に記載される重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、またはそれらの組合せを含む、ＣＤ３２ｂ結合性抗体を提供する。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）を使用して、またはＣｈｏｔｈｉａシステム（Chothia et al. 1987 J. Mol. Biol. 196: 901-917;およびAl-Lazikani et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 927-948）を使用して、記述される。ＣＤＲ領域を記述する他の方法を、代替として使用してもよい。例えば、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲの定義を、ＣＤＲが、ヒトＶＨにおけるアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）、ならびにヒトＶＬにおけるアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）の一部またはすべてを含み得るように、組み合わせてもよい。
これらの抗体のそれぞれが、ＣＤ３２ｂに結合することができること、および抗原結合の特異性が、主として、ＣＤＲ１、２、および３領域によって提供されることを考慮すると、ＶＨ ＣＤＲ１、２、および３配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２、および３配列を、「うまく組み合わせる」ことができる（すなわち、異なる抗体からのＣＤＲを、うまく組み合わせることができるが、それぞれの抗体は、本発明の他のＣＤ３２ｂ結合性分子を作製するために、ＶＨ ＣＤＲ１、２、および３、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２、および３を含まなければならない）。そのような「うまく組み合わせた」ＣＤ３２ｂ結合性抗体は、当該技術分野において公知の結合アッセイおよび実施例に記載されるもの（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して、試験することができる。ＶＨ ＣＤＲ配列をうまく組み合わせる場合、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似のＣＤＲ配列と置き換えるものとする。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列をうまく組み合わせる場合、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似のＣＤＲ配列と置き換えるものとする。当業者であれば、１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域の配列を、本発明のモノクローナル抗体に関して本明細書に示されるＣＤＲ配列由来の構造的に類似の配列により変異させることによって、新規なＶＨ配列およびＶＬ配列を作製することができることを容易に理解するであろう。
したがって、本発明は、配列番号１、４、７、５３、５６、５９、１０５、１０８、１１１、１５７、１６０、１６３、２０９、２１２、２１５、２６１、２６４、２６７、３１３、３１６、３１９、３６５、３６８、３７１、４１７、４２０、４２３、４６９、４７２、４７５、５２１、５２４、５２７、５４７、５５０、５５３、５７３、５７６、５７９、６２５、６２８、および６３１のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２、５、８、５４、５７、６０、１０６、１０９、１１２、１５８、１６１、１６４、２１０、２１３、２１６、２６２、２６５、２６８、３１４、３１７、３２０、３６６、３６９、３７２、４１８、４２１；４２４、４７０、４７３、４７６、５２２、５２５、５２８、５４８、５５１、５５４、５７４、５７７、５８０、６２６、６２９、および６３２のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３、６、９、５５、５８、６１、１０７、１１０、１１３、１５９、１６２、１６５、２１１、２１４、２１７、２６３、２６６、２６９、３１５、３１８、３２１、３６７、３７０、３７３、４１９、４２２、４２５、４７１、４７４、４７７、５２３、５２６、５２９、５４９、５５２、５５５、５７５、５７８、５８１、６２７、６３０、および６３３のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１４、１７、２０、６６、６９、７２、１１８、１２１、１２４、１７０、１７３、１７６、２２２、２２５、２２８、２７４、２７７、２８０、３２６、３２９、３３２、３７８、３８１、３８４、４３０、４３３、４３６、４８２、４８５、４８８、５３４、５３７、５４０、５６０、５６３、５６６、５８６、５８９、５９２、６３８、６４１、６４４のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１５、１８、２１、６７、７０、７３、１１９、１２２、１２５、１７１、１７４、１７７、２２３、２２６、２２９、２７５、２７８、２８１、３２７、３３０、３３３、３７９、３８２、３８５、４３１、４３４、４３７、４８３、４８６、４８９、５３５、５３８、５４１、５６１、５６４、５６７、５８７、５９０、５９３、６３９、６４２、および６４５のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；ならびに配列番号１６、１９、２２、６８、７１、７４、１２０、１２３、１２６、１７２、１７５、１７８、２２４、２２７、２３０、２７６、２７９、２８２、３２８、３３１、３３４、３８０、３８３、３８６、４３２、４３５、４３８、４８４、４８７、４９０、５３６、５３９、５４２、５６２、５６５、５６８、５８８、５９１、５９４、６４０、６４３、および６４６のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合性領域を提供し、ここで、抗体は、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する。
本発明はまた、配列番号１０、６２、１１４、１６６、２１８、２７０、３２２、３７４、４２６、４７８、５３０、５５６、５８２、および６３４のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２３、７５、１２７、１７９、２３１、２８３、３３５、３８７、４３９、４９１、５４３、５６９、５９５、および６４７のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
本発明はまた、配列番号１２、３８、６４、９０、１１６、１４２、１６８、１９４、２２０、２４６、２７２、２９８、３２４、３５０、３７６、４０２、４２８、４５４、４８０、５０６、５３２、５５８、５８４、６１０、６３６、および６６２のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号２５、５１、７７、１０３、１２９、１５５、１８１、２０７、２３３、２５９、２８５、３１１、３３７、３６３、３８９、４１５、４４１、４６７、４９３、５１９、５４５、５７１、５９７、６２３、６４９、および６７５のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、表１に記載されている抗体である。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ０２８１である。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ０２８１＿Ｎ２９７Ａである。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ０３０８である。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ０３０８＿Ｎ２９７Ａである。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ０５６３である。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ０５６３＿Ｎ２９７Ａである。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ１２１６である。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ１２１６＿Ｎ２９７Ａである。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ１２１８である。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ１２１８＿Ｎ２９７Ａである。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ１２１９である。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ１２１９＿Ｎ２９７Ａである。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ２１０６である。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ０２１０６＿Ｎ２９７Ａである。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ２１０７である。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ２１０７＿Ｎ２９７Ａである。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ２１０８である。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ２１０８＿Ｎ２９７Ａである。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ２１０９である。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ２１０９＿Ｎ２９７Ａである。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ２１１０＿Ｎ２９７Ａである。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ２１１１＿Ｎ２９７Ａである。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ２１１２である。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ２１１２＿Ｎ２９７Ａである。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ２１１３である。一実施形態において、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体は、ＮＯＶ２１１３＿Ｎ２９７Ａである。
本明細書に開示されるＣＤ３２ｂ結合性抗体またはその抗原結合性フラグメントの一部の実施形態において、抗体は、野生型（ＷＴ）Ｆｃ配列を含む。一部の実施形態において、抗体は、非フコシル化されている。他の実施形態において、抗体は、抗体のＡＤＣＣ活性を増強する変異（ｅＡＤＣＣ）を含む、修飾されたＦｃ領域を含む。さらに他の実施形態において、抗体は、Ｆｃ領域のＡＤＣＣ活性を停止させる変異を含む、修飾されたＦｃ領域を含む（Ｆｃサイレント変異体）。
一実施形態において、ＣＤ３２ｂ結合性抗体は、野生型Ｆｃを含む、非フコシル化ＮＯＶ２１０８である。特定の実施形態において、ＣＤ３２ｂ結合性抗体は、それぞれ配列番号４１７、４１８、および４１９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号４３０、４３１、および４３２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ここで、抗体は、非フコシル化されている。別の特定の実施形態において、ＣＤ３２ｂ結合性抗体は、配列番号４２６のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＶＬを含み、ここで、抗体は、非フコシル化されている。さらに別の実施形態において、ＣＤ３２ｂ結合性抗体は、配列番号４２８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４４１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、ここで、抗体は、非フコシル化されている。
本明細書において使用されるとき、ヒト抗体は、抗体の可変領域または完全長の鎖が、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、特定の生殖細胞系配列の「産物」であるか、またはそれに「由来する」、重鎖もしくは軽鎖可変領域または完全長重鎖もしくは軽鎖を含む。そのような系には、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスを、目的の抗原で免疫化すること、または目的の抗原がファージに提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることが含まれる。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の「産物」であるかまたはそれに「由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較すること、ならびに配列がヒト抗体の配列と最も近似している（すなわち、同一性％が最も高い）ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することなどによって、特定することができる。特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の「産物」であるかまたはそれに「由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に生じる体細胞変異または部位特異的変異の意図的な導入に起因して、その生殖細胞系配列と比較して、アミノ酸の相違を含み得る。しかしながら、ＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域においては、選択されたヒト抗体は、典型的に、アミノ酸配列がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系配列）と比較した場合に、ヒト抗体をヒトとして特定するアミノ酸残基を含んでいる。ある特定の事例において、ヒト抗体は、アミノ酸配列が、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは少なくとも９５％、またはさらには少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。典型的には、組換えヒト抗体は、ＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは、１０個以下のアミノ酸の相違を呈する。ある特定の事例において、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは、５個以下、またはさらには４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の相違を呈し得る。
相同性抗体
なおも別の実施形態において、本発明は、表１に記載される配列に相同なアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、ＣＤ３２ｂに結合し、表１に記載される抗体の所望される機能特性を保持する、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
例えば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体（またはその機能的抗原結合性フラグメント）であって、重鎖可変領域が、配列番号１０、６２、１１４、１６６、２１８、２７０、３２２、３７４、４２６、４７８、５３０、５５６、５８２、および６３４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２３、７５、１２７、１７９、２３１、２８３、３３５、３８７、４３９、４９１、５４３、５６９、５９５、および６４７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、抗体が、ヒトＣＤ３２ｂタンパク質に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体（またはその機能的抗原結合性フラグメント）を提供する。
一実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬのアミノ酸配列は、表１に記載される配列に対して、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。一実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬのアミノ酸配列は、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸位におけるアミノ酸置換を除き、同一であり得る。表１に記載されるもののＶＨ領域およびＶＬ領域に対して高い（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨ領域およびＶＬ領域を有する抗体は、それぞれ、配列番号１０、６２、１１４、１６６、２１８、２７０、３２２、３７４、４２６、４７８、５３０、５５６、５８２、または６３４をコードする核酸分子、および２３、７５、１２７、１７９、２３１、２８３、３３５、３８７、４３９、４９１、５４３、５６９、５９５、または６４７をコードする核酸分子の変異生成（例えば、部位特異的変異生成またはＰＣＲ媒介型変異生成）、続いて、コードされる改変抗体を、本明細書に記載される機能性アッセイを使用して保持されている機能に関して試験することによって、得ることができる。
一実施形態において、完全長重鎖および／または完全長軽鎖のアミノ酸配列は、表１に記載される配列に対して５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。それぞれ、配列番号１２、３８、６４、９０、１１６、１４２、１６８、１９４、２２０、２４６、２７２、２９８、３２４、３５０、３７６、４０２、４２８、４５４、４８０、５０６、５３２、５５８、５８４、６１０、６３６、および６６２のうちのいずれかの完全長重鎖、ならびに配列番号２５、５１、７７、１０３、１２９、１５５、１８１、２０７、２３３、２５９、２８５、３１１、３３７、３６３、３８９、４１５、４４１、４６７、４９３、５１９、５４５、５７１、５９７、６２３、６４９、および６７５のうちのいずれかの完全長軽鎖に対して高い（すなわち、８０％以上の）同一性を有する完全長重鎖および完全長軽鎖を有する抗体は、それぞれ、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子の変異生成（例えば、部位特異的変異生成またはＰＣＲ媒介型変異生成）、続いて、コードされる改変抗体を本明細書に記載される機能性アッセイを使用して保持されている機能に関して試験することによって、得ることができる。
一実施形態において、完全長重鎖および／または完全長軽鎖のヌクレオチド配列は、表１に記載される配列に対して６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。
一実施形態において、重鎖および／または軽鎖のヌクレオチド配列の可変領域は、表１に記載される配列に対して６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。
本明細書において使用されるとき、２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列が共有する同一な位置の数の関数であり（すなわち、同一性％は、同一な位置の数／位置の総数×１００に等しい）、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの判定は、以下の非限定的な例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
追加または代替として、本発明のタンパク質配列は、さらに、例えば、関連する配列を特定するために公的データベースに対する検索を実施するための「クエリ配列」として使用することができる。例えば、そのような検索は、Altschul, et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。
保存的修飾を有する抗体
一実施形態において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、ここで、これらのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数は、本明細書に記載される抗体に基づく指定のアミノ酸配列またはその保存的修飾形態を有し、この抗体は、本発明のＣＤ３２ｂ結合性抗体およびその抗原結合性フラグメントの所望される機能特性を保持する。したがって、本発明は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域からなる単離モノクローナル抗体またはその機能的抗原結合性フラグメントであって、重鎖可変領域ＣＤＲ１が、配列番号１、４、７、５３、５６、５９、１０５、１０８、１１１、１５７、１６０、１６３、２０９、２１２、２１５、２６１、２６４、２６７、３１３、３１６、３１９、３６５、３６８、３７１、４１７、４２０、４２３、４６９、４７２、４７５、５２１、５２４、５２７、５４７、５５０、５５３、５７３、５７６、５７９、６２５、６２８、および６３１のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらの保存的バリアントを含み、重鎖可変領域ＣＤＲ２が、配列番号２、５、８、５４、５７、６０、１０６、１０９、１１２、１５８、１６１、１６４、２１０、２１３、２１６、２６２、２６５、２６８、３１４、３１７、３２０、３６６、３６９、３７２、４１８、４２１、４２４、４７０、４７３、４７６、５２２、５２５、５２８、５４８、５５１、５５４、５７４、５７７、５８０、６２６、６２９、および６３２のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらの保存的バリアントを含み、重鎖可変領域ＣＤＲ３が、配列番号３、６、９、５５、５８、６１、１０７、１１０、１１３、１５９、１６２、１６５、２１１、２１４、２１７、２６３、２６６、２６９、３１５、３１８、３２１、３６７、３７０、３７３、４１９、４２２、４２５、４７１、４７４、４７７、５２３、５２６、５２９、５４９、５５２、５５５、５７５、５７８、５８１、６２７、６３０、および６３３のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列、またそれらの保存的バリアントを含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１が、配列番号１４、１７、２０、６６、６９、７２、１１８、１２１、１２４、１７０、１７３、１７６、２２２、２２５、２２８、２７４、２７７、２８０、３２６、３２９、３３２、３７８、３８１、３８４、４３０、４３３、４３６、４８２、４８５、４８８、５３４、５３７、５４０、５６０、５６３、５６６、５８６、５８９、５９２、６３８、６４１、６４４のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列、またそれらの保存的バリアントを含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ２が、配列番号１５、１８、２１、６７、７０、７３、１１９、１２２、１２５、１７１、１７４、１７７、２２３、２２６、２２９、２７５、２７８、２８１、３２７、３３０、３３３、３７９、３８２、３８５、４３１、４３４、４３７、４８３、４８６、４８９、５３５、５３８、５４１、５６１、５６４、５６７、５８７、５９０、５９３、６３９、６４２、および６４５のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列、またそれらの保存的バリアントを含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ３が、配列番号１６、１９、２２、６８、７１、７４、１２０、１２３、１２６、１７２、１７５、１７８、２２４、２２７、２３０、２７６、２７９、２８２、３２８、３３１、３３４、３８０、３８３、３８６、４３２、４３５、４３８、４８４、４８７、４９０、５３６、５３９、５４２、５６２、５６５、５６８、５８８、５９１、５９４、６４０、６４３、および６４６のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列、またそれらの保存的バリアントを含み、ＣＤ３２ｂに特異的に結合し、マクロファージおよびＮＫ細胞の両方による、抗体が結合したＣＤ３２ｂ陽性標的細胞の殺滅を媒介する、単離モノクローナル抗体またはその機能的抗原結合性フラグメントを提供する。
一実施形態において、哺乳動物細胞における発現のために最適化された本発明の抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで、これらの配列のうちの１つまたは複数は、本明細書に記載される抗体に基づく指定のアミノ酸配列またはそれらの保存的修飾形態を有し、この抗体は、本発明のＣＤ３２ｂ結合性抗体およびその抗原結合性フラグメントの所望される機能特性を保持する。したがって、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、哺乳動物細胞における発現のために最適化された単離モノクローナル抗体であって、重鎖可変領域が、配列番号１０、６２、１１４、１６６、２１８、２７０、３２２、３７４、４２６、４７８、５３０、５５６、５８２、および６３４２のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列、ならびにそれらの保存的修飾形態を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２３、７５、１２７、１７９、２３１、２８３、３３５、３８７、４３９、４９１、５４３、５６９、５９５、および６４７のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列、ならびにそれらの保存的修飾形態を含み、この抗体が、ＣＤ３２ｂに特異的に結合し、マクロファージおよびＮＫ細胞の両方による、抗体が結合したＣＤ３２ｂ陽性標的細胞の殺滅を媒介する、単離モノクローナル抗体を提供する。
一実施形態において、哺乳動物細胞における発現のために最適化された本発明の抗体は、完全長重鎖配列および完全長軽鎖配列を含み、ここで、これらの配列のうちの１つまたは複数は、本明細書に記載される抗体に基づく指定のアミノ酸配列またはそれらの保存的修飾形態を有し、この抗体は、本発明のＣＤ３２ｂ結合性抗体およびその抗原結合性フラグメントの所望される機能特性を保持する。したがって、本発明は、完全長重鎖および完全長軽鎖を含む、哺乳動物細胞における発現のために最適化された単離モノクローナル抗体であって、完全長重鎖が、配列番号１２、３８、６４、９０、１１６、１４２、１６８、１９４、２２０、２４６、２７２、２９８、３２４、３５０、３７６、４０２、４２８、４５４、４８０、５０６、５３２、５５８、５８４、６１０、６３６、および６６２のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列、ならびにそれらの保存的修飾形態を含み、完全長軽鎖が、配列番号２５、５１、７７、１０３、１２９、１５５、１８１、２０７、２３３、２５９、２８５、３１１、３３７、３６３、３８９、４１５、４４１、４６７、４９３、５１９、５４５、５７１、５９７、６２３、６４９、および６７５のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列、ならびにそれらの保存的修飾形態を含み、この抗体が、ＣＤ３２ｂに特異的に結合し、マクロファージおよびＮＫ細胞の両方による、抗体が結合したＣＤ３２ｂ陽性標的細胞の殺滅を媒介する、単離モノクローナル抗体を提供する。
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１に列挙されるＣＤ３２ｂ結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。追加の抗体は、したがって、ＣＤ３２ｂ結合アッセイにおいて、本発明の他の抗体およびその抗原結合性フラグメントと交差競合する（例えば、統計学的に有意な様式で、その結合を競合的に阻害する）能力に基づいて、特定することができる。試験抗体が、本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントのＣＤ３２ｂタンパク質への結合を阻害する能力は、試験抗体が、ＣＤ３２ｂへの結合に関してその抗体と競合し得ることを示し、そのような抗体は、非限定的な理論によると、競合する抗体と同じかまたは関連する（例えば、構造的に類似または空間的に近傍の）ＣＤ３２Ｂ上のエピトープに結合し得る。ある特定の実施形態において、本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントと同じＣＤ３２Ｂ上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。そのようなヒトモノクローナル抗体は、本明細書に記載されるように調製および単離することができる。
抗原上の所望されるエピトープが決定されると、例えば、本発明に記載される技法を使用して、そのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。あるいは、発見プロセス中に、抗体の生成および特徴付けにより、望ましいエピトープに関する情報を解明することができる。この情報から、次いで、同じエピトープへの結合に関して、抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成するためのアプローチは、互いに競合的に結合する抗体、例えば、抗原への結合に関して競合する抗体を見出すための交差競合研究を実施することである。抗体をそれらの交差競合に基づいて「ビニング」するための高スループットのプロセスは、国際特許出願公開第２００３／４８７３１号パンフレットに記載されている。当業者によって理解されるように、抗体が特異的に結合し得るものは実質的にすべてが、エピトープであり得る。エピトープは、抗体が結合する残基を含み得る。
一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複合混合物中のその標的抗原上のエピトープを優先的に認識するであろう。
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当該技術分野において周知のいくつかのエピトープマッピング技法を使用して特定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jerseyを参照されたい。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、多数のペプチドを固体支持体上で同時に合成し、ペプチドをタンパク質分子の部分に対応させ、ペプチドが依然として支持体に付着している間に、ペプチドを抗体と反応させることによって、決定され得る。そのような技法は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号明細書、Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002、Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182、Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715に記載されている。同様に、立体構造エピトープは、例えば、水素／重水素交換、Ｘ線結晶構造解析、および二次元核磁気共鳴などによって、アミノ酸ＣＤ３２ｂの空間構造を決定することによって、容易に特定される。例えば、Epitope Mapping Protocols（上記）を参照されたい。タンパク質の抗原性領域はまた、標準的な抗原性および疎水性プロット、例えば、例として、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを使用して計算されるものなどを使用して、特定することができる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロファイルの判定にはＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ方法（Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828）を利用し、疎水性プロットには、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技法（Kyte et al., (1982) J.MoI. Biol. 157:105-132）を利用する。
操作および修飾された抗体
本発明の抗体は、さらに、本明細書に示されるＶＨ配列および／またはＶＬ配列のうちの１つまたは複数を有する抗体を、修飾された抗体を操作するための出発材料として使用して、調製することができ、この修飾された抗体は、出発抗体から改変された特性を有し得る。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を修飾することによって、操作することができる。追加または代替として、抗体は、例えは、抗体のエフェクター機能を改変するために、定常領域内の残基を修飾することによって操作することができる。
行うことができる可変領域操作の１つの種類は、ＣＤＲグラフトである。抗体は、主として、６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を通じて、標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも、個々の抗体間での多様性が高い。ＣＤＲ配列がほとんどの抗体−抗原相互作用を担うため、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列にグラフトされた特定の天然抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然の抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327、Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525、Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，２２５，５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎらに対する米国特許第５，５３０，１０１号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列または再配置された抗体配列を含む、公的ＤＮＡデータベースまたは公開されている参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベース（インターネットでｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにおいて利用可能）、ならびにKabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242、Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798、およびCox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836において、見出すことができ、これらのそれぞれの内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列および再配置された抗体配列は、「ＩＭＧＴ」データベースにおいて見出すことができる（インターネットでｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇにおいて利用可能；Lefranc, M.P. et al., 1999 Nucleic Acids Res. 27:209-212を参照されたい；これらのそれぞれの内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。
本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントにおいて使用するためのフレームワーク配列の例は、選択された本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントによって使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体によって使用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列に構造的に類似のものである。ＶＨ ＣＤＲ１、２、および３配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２、および３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子において見出されるものと同一の配列を有するフレームワーク領域にグラフトすることができるか、またはＣＤＲ配列は、生殖細胞系配列と比較して、１つまたは複数の変異を含むフレームワーク領域にグラフトすることができる。例えば、ある特定の事例において、抗体の抗原結合能力を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらに対する米国特許第５，５３０，１０１号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
別の種類の可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それによって、目的の抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することであり、これは、「親和性成熟」として知られている。変異を導入するために、部位特異的変異生成またはＰＣＲ媒介型変異生成を行うことができ、抗体結合に対する作用、または他の目的とされる機能特性は、本明細書に記載され、実施例に提供されているインビトロまたはインビボでのアッセイにおいて評価することができる。保存的修飾（上述の通り）を導入することができる。変異は、アミノ酸の置換、付加、または欠失であり得る。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下の残基が、改変される。
代替的なフレームワークまたはスキャフォールドへの抗原結合性ドメインのグラフト
結果として得られるポリペプチドが、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する少なくとも１つの結合領域を含む限り、広範な抗体／免疫グロブリンフレームワークおよびスキャフォールドを利用することができる。そのようなフレームワークまたはスキャフォールドには、ヒト免疫グロブリンの５つの主要なアイソタイプ、それらの抗原結合性フラグメントが含まれ、他の動物種の免疫グロブリン、好ましくはヒト化の態様を有するものが含まれる。ラクダにおいて特定されているものなど、単一重鎖抗体が、この点に関して、特に関心が高い。新規なフレームワーク、スキャフォールド、およびフラグメントの発見および開発が、当業者によって続けられている。
一態様において、本発明は、本発明のＣＤＲをグラフトすることができる非免疫グロブリンスキャフォールドを使用した、非免疫グロブリン系抗体を生成する方法に関する。標的ＣＤ３２ｂタンパク質に特異的な結合領域を含む限り、公知または将来的な非免疫グロブリンフレームワークおよびスキャフォールドを利用してもよい。公知の非免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドとしては、フィブロネクチン（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．およびＡｂｌｙｎｘ ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、小分子モジュラー免疫医薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＧ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ならびにアフィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（ＳｃｉＩ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。
フィブロネクチンスキャフォールドは、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型の第１０モジュール（１０ Ｆｎ３ドメイン））に基づく。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、２つのベータシート間に分配される７つまたは８つのベータ鎖を有し、これら自体が互いをパッケージングして、タンパク質のコアを形成し、さらに、ループ（ＣＤＲに類似）を含んでおり、このループは、ベータ鎖を互いに接続し、溶媒に露出されている。ベータシートサンドイッチの各縁部には少なくとも３つのそのようなループがあり、この縁部が、ベータ鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６，８１８，４１８号明細書を参照されたい）。これらのフィブロネクチン系スキャフォールドは、免疫グロブリンではないが、全体的な折りたたみは、最小の機能的抗体フラグメントであり、ラクダおよびラマのＩｇＧにおいては抗原認識ユニット全体を構成する、重鎖の可変領域のものに緊密に関連している。この構造のため、非免疫グロブリン抗体は、性質および親和性が抗体のものと同様である抗原結合特性を模倣する。これらのスキャフォールドは、インビボでの抗体の親和性成熟のプロセスに類似である、インビトロでのループランダム化およびシャッフリング戦略において使用され得る。これらのフィブロネクチン系分子を、スキャフォールドとして使用することができ、その場合、分子のループ領域は、標準的なクローニング技法を使用して、本発明のＣＤＲと置き換えることができる。
アンキリン技術は、異なる標的への結合のために使用することができる可変領域をもたらすために、アンキリン由来の繰り返しモチーフを有するタンパク質をスキャフォールドとして使用することに基づく。アンキリン繰り返しモチーフは、２つの逆平行アルファヘリックスおよびベータターンからなる３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、大部分が、リボソームディスプレイを使用して最適化される。
アビマーは、ＬＲＰ−１などの天然のＡドメイン含有タンパク質に由来する。これらのドメインは、本質的に、タンパク質−タンパク質相互作用のために使用され、ヒトにおいて、２５０個を上回るタンパク質が、構造的に、Ａドメインに基づいている。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結されたいくつかの異なる「Ａドメイン」モノマー（２個〜１０個）からなる。例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号明細書、同第２００５００５３９７３号明細書、同第２００５００４８５１２号明細書、および同第２００６０００８８４４号明細書に記載されている方法を使用して、標的抗原に結合することができるアビマーを、作製することができる。
アフィボディ親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合性ドメインのうちの１つのスキャフォールドに基づく３ヘリックスバンドルから構成される、小型の単純なタンパク質である。プロテインＡは、細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来の表面タンパク質である。このスキャフォールドドメインは、５８個のアミノ酸からなり、そのうちの１３個が、ランダム化されて、多数のリガンドバリアントを有するアフィボディライブラリーが得られる（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号明細書を参照されたい）。アフィボディ分子は、抗体を模倣するが、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、６ｋＤａの分子量を有する。その小さなサイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体のものに類似である。
アンチカリンは、Ｐｉｅｒｉｓ ＰｒｏｔｅｏＬａｂ ＡＧ社によって開発された製品である。それらは、化学的に感受性または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に通常関与する、小型かつ頑強なタンパク質の広範な群であるリポカリンに由来する。いくつかの天然のリポカリンは、ヒト組織または体液において生じる。タンパク質構造は、剛性フレームワークの上部に超可変ループがあり、免疫グロブリンを想起させる。しかしながら、抗体またはそれらの組換えフラグメントとは対照的に、リポカリンは、１６０個〜１８０個のアミノ酸残基を有する単一のポリペプチド鎖から構成され、単一の免疫グロブリンドメインよりもわずかに大きいだけである。結合ポケットを構成する４つのループのセットは、顕著な構造可塑性を示し、様々な側鎖を寛容する。結合部位は、したがって、異なる形状を有する所定の標的分子を高い親和性および特異性で認識するように、独自のプロセスにおいて再形成することができる。リポカリンファミリーの１つのタンパク質であるＰｉｅｒｉｓ Ｂｒａｓｓｉｃａｅのビリン結合性タンパク質（ＢＢＰ）が、４つのループのセットに変異生成を行うことによるアンチカリンの開発に使用されている。アンチカリンについて記載している特許出願の一例は、ＰＣＴ国際公開第１９９９１６８７３号パンフレットのものである。
アフィリン分子は、タンパク質および小分子に対する特定の親和性のために設計された、小さな非免疫グロブリンタンパク質である。新しいアフィリン分子は、それぞれが異なるヒト由来のスキャフォールドタンパク質に基づく、２つのライブラリーから非常に迅速に選択することができる。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対していずれの構造相同性も示さない。現在、２つのアフィリンスキャフォールドが利用されており、それらのうちの一方は、ヒト眼水晶体構造タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は、「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒトスキャフォールドも、非常に小さく、高温での安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高い安定性は、主として、タンパク質の拡張されたベータシート構造に起因する。ガンマクリスタリン由来のタンパク質の例は、国際公開第２００１０４１４４号パンフレットに記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は、国際公開第２００４１０６３６８号パンフレットに記載されている。
タンパク質エピトープ模倣体（ＰＥＭ）は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する主要な二次構造であるタンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する、中等度のサイズの環状ペプチド様分子（ＭＷ１〜２ｋＤａ）である。
ヒトＣＤ３２Ｂ結合性抗体は、当該技術分野において公知の方法を使用して生成することができる。例えば、非ヒト抗体を変換して操作型ヒト抗体にするために使用されるヒト化操作（humaneering）技術がある。米国特許出願公開第２００５０００８６２５号明細書は、非ヒト抗体のものと同じ結合特徴を維持するかまたはそれと比べてより良好な結合特徴を提供しながら、抗体内の非ヒト抗体可変領域を、ヒト可変領域と置き換えるためのインビボ方法について記載している。この方法は、非ヒト参照抗体の可変領域と完全ヒト抗体とのエピトープガイド型置換え（epitope-guided replacement）に依存する。結果として得られるヒト抗体は、概して、構造的には参照非ヒト抗体に関連しないが、参照抗体と同じ抗原上の同じエピトープに結合する。簡単に述べると、連続的エピトープガイド型相補性置換えアプローチは、試験抗体の抗原への結合に応答するレポーター系の存在下において、限られた量の抗原への結合に関して、細胞において「競合因子」と参照抗体の多様なハイブリッドのライブラリー（「試験抗体」）との間で競合を設定することによって、可能となる。競合因子は、参照抗体またはその誘導体、例えば、一本鎖Ｆｖフラグメントであり得る。競合因子はまた、参照抗体と同じエピトープに結合する抗原の天然または人工のリガンドであってもよい。競合因子の要件は、参照抗体と同じエピトープに結合すること、および抗原結合に関して参照抗体と競合することだけである。試験抗体は、非ヒト参照抗体に由来する１つの共通の抗原結合性Ｖ領域を有し、他のＶ領域は、ヒト抗体のレパートリーライブラリーなど、多様な源からランダムに選択される。参照抗体に由来する共通のＶ領域は、試験抗体を抗原上の同じエピトープに同じ配向で位置付けるガイドとして機能し、そのため、選択に、参照抗体に対する抗原結合の忠実性が最も高くなるようにバイアスがかかっている。
多くの種類のレポーター系が、試験抗体と抗原との間の所望される相互作用を検出するために使用可能である。例えば、相補的なレポーターフラグメントを、それぞれ、抗原および試験抗体に連結させ、試験抗体が抗原に結合したときにのみ、フラグメントの相補性によるレポーターの活性化が生じるようにしてもよい。試験抗体−レポーターフラグメントと抗原−レポーターフラグメントとの融合体が、競合因子と共発現される場合、レポーターの活性化は、試験抗体が競合因子と競合する能力に依存するようになり、この能力は、抗原に対する試験抗体の親和性に比例する。使用することができる他のレポーター系としては、米国特許出願第１０／２０８，７３０号明細書（公開第２００３０１９８９７１号明細書）に開示されている自己阻害型レポーター再活性化系の再活性化因子（ＲＡＩＲ）、または米国特許出願第１０／０７６，８４５号明細書（公開第２００３０１５７５７９号明細書）に開示されている競合的活性化系が挙げられる。
連続的エピトープガイド型相補性置換え系を用いる場合、単一の試験抗体を、競合因子、抗原、およびレポーター成分とともに発現する細胞を特定するように、選択が行われる。これらの細胞において、各試験抗体は、限られた量の抗原への結合に関して、競合因子と、１対１で競合する。レポーターの活性は、試験抗体に結合した抗原の量に比例し、これは、抗原に対する試験抗体の親和性および試験抗体の安定性に比例する。試験抗体は、まず、試験抗体として発現された場合の参照抗体のものと比較したそれらの活性に基づいて選択される。１回目の選択の結果は、「ハイブリッド」抗体のセットであり、これらのそれぞれは、参照抗体に由来する同じ非ヒトＶ領域およびライブラリーに由来するヒトＶ領域から構成され、これらのそれぞれは、参照抗体と同じ抗原上のエピトープに結合する。１回目に選択されたハイブリッド抗体のうちの１つまたは複数は、抗原に対して、参照抗体と同程度またはそれよりも高い親和性を有する。
第２のＶ領域置換えステップにおいて、第１のステップで選択したヒトＶ領域は、残りの非ヒト参照抗体のＶ領域と、多様な同種ヒトＶ領域のライブラリーとのヒト置換えの選択のためのガイドとして使用される。１回目で選択されたハイブリッド抗体もまた、２回目の選択のための競合因子として使用してもよい。２回目の選択の結果として、構造的には参照抗体と異なるが、同じ抗原への結合に関して参照抗体と競合する、完全ヒト抗体のセットが得られる。選択されたヒト抗体のうちのいくつかが、参照抗体と同じ抗原上の同じエピトープに結合する。これらの選択されたヒト抗体の中で、１つまたは複数が、参照抗体と同程度またはそれよりも高い親和性で同じエピトープに結合する。
加えて、ヒトＣＤ３２ｂ結合性抗体はまた、ヒト抗体を通例的に製造している企業、例えば、ＫａｌｏＢｉｏｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）から市販入手することもできる。
ラクダ抗体
ラマ種（アルパカ（Lama paccos）、ラマ（Lama glama）、およびビクーニャ（Lama vicugna））などの新世界メンバーを含むラクダおよびヒトコブラクダ（フタコブラクダ（Camelus bactrianus）およびヒトコブラクダ（Calelus dromaderius））ファミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造の複雑性、およびヒト対象に対する抗原性に関して、特徴付けられている。自然界において見られるこの哺乳動物ファミリーに由来するある特定のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠いており、したがって、他の動物に由来する抗体の２つの重鎖および２つの軽鎖を有する典型的な４つの鎖の四次構造とは構造がはっきりと異なっている。ＰＣＴ／ＥＰ第９３／０２２１４号明細書（１９９４年３月３日に公開された国際公開第９４／０４６７８号パンフレット）を参照されたい。
ＶＨＨとして特定されている小さな単一可変ドメインであるラクダ抗体の領域は、標的に対して高い親和性を有する小さなタンパク質をもたらすように遺伝子操作を行い、「ラクダナノボディ」として公知の低分子量の抗体由来のタンパク質を得ることによって、得ることができる。１９９８年６月２日に発行された米国特許第５，７５９，８０８号を参照されたい。また、Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261、Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788、Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448、Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62、およびLauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520も参照されたい。ラクダ抗体および抗体フラグメントの操作ライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販入手可能である。非ヒト起源の他の抗体およびその抗原結合性フラグメントと同様に、ラクダ抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列により近似する配列が得られるように組換えにより改変してもよい。すなわち、ナノボディは、「ヒト化」することができる。したがって、ラクダ抗体のヒトに対するもともと低い抗原性が、さらに低減され得る。
ラクダナノボディは、ヒトＩｇＧ分子のおよそ１０分の１の分子量を有し、このタンパク質は、わずか数ナノメートルの物理的な直径を有する。サイズが小さいことの１つの結果は、大きな抗体タンパク質では機能的に認識できない抗原性部位に結合するラクダナノボディの能力である。すなわち、ラクダナノボディは、古典的な免疫技法を使用して普通なら隠れている抗原を検出する試薬として、また可能性のある治療剤として、有用である。したがって、サイズが小さいことのなおも別の結果は、ラクダナノボディが、標的タンパク質の溝または狭い割れ目にある特定の部位に結合する結果として、標的タンパク質を阻害することが可能であり、したがって、古典的な抗体のものよりも、古典的な低分子量の薬物の機能によく似た能力を提供することができることである。
低分子量および小型のサイズは、さらに、結果として、熱安定性が極めて高く、極端なｐＨおよびタンパク質分解による消化に対して安定であり、さらには抗原性が非常に低いラクダナノボディをもたらす。別の結果は、ラクダナノボディが、循環系から組織に容易に移動し、さらには血液脳関門を通過し、神経組織に影響を及ぼす障害を治療することができることである。ナノボディは、さらに、血液脳関門を越える薬物輸送を促進することができる。２００４年８月１９日に公開された米国特許出願公開第２００４０１６１７３８号明細書を参照されたい。これらの特性を、ヒトに対する低い抗原性と組み合わせることにより、優れた治療可能性が示される。さらに、これらの分子は、大腸菌（E. coli）などの原核生物細胞において完全に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現され、かつ機能的である。
したがって、本発明の特性は、ＣＤ３２ｂに対して高い親和性を有するラクダ抗体またはナノボディである。本明細書における一実施形態において、ラクダ抗体またはナノボディは、ラクダ科動物において天然に産生される、すなわち、他の抗体について本明細書に記載される技法を使用して、ＣＤ３２ｂまたはそのペプチドフラグメントで免疫化した後に、ラクダによって産生される。あるいは、ＣＤ３２ｂ結合性ラクダナノボディは、操作される、すなわち、例えば、本明細書の実施例において記載されるように、ＣＤ３２ｂを標的として用いるパニング手順を使用して、適切に変異生成したラクダナノボディタンパク質を提示するファージライブラリーからの選択によって、産生される。操作されたナノボディは、さらに、レシピエント対象において、４５分間〜２週間の半減期を有するように遺伝子操作することによって、カスタマイズすることができる。特定の実施形態において、ラクダ抗体またはナノボディは、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ第９３／０２２１４号明細書に記載されているように、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、ナノボディまたは単一ドメイン抗体のフレームワーク配列にグラフトすることによって、得られる。
二重特異性分子および多価抗体
別の態様において、本発明は、本発明のＣＤ３２ｂ結合性抗体またはそのフラグメントを含む二重特異性分子または多重特異性分子を特徴とする。本発明の抗体またはその抗原結合性領域は、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成するように、誘導体化することができるか、または別の機能性分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質（例えば、別の抗体もしくは受容体のリガンド）に連結させることができる。本発明の抗体は、実際に、２つを上回る異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を生成するように、誘導体化することができるかまたは１つを上回る他の機能性分子に連結させることができ、そのような多重特異性分子もまた、本明細書において使用される「二重特異性分子」という用語に包含されることを意図する。本発明の二重特異性分子を作製するためには、本発明の抗体を、結果として、二重特異性分子が得られるように、１つまたは複数の他の結合性分子、例えば、別の抗体、抗体フラグメント、ペプチド、または結合性模倣体に機能的に連結させる（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合、またはその他の方法によって）ことができる。
したがって、本発明は、ＣＤ３２ｂに対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む、二重特異性分子を含む。例えば、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープとは異なるＣＤ３２ｂの別のエピトープである。
加えて、二重特異性分子が多重特異性である本発明について、この分子は、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含み得る。
一実施形態において、本発明の二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１つの抗体、または例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、もしくは一本鎖Ｆｖを含むその抗体フラグメントを含む。この抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖の二量体であってもよく、またはＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号明細書に記載されているＦｖまたは一本鎖コンストラクトなどのその任意の最小フラグメントであってもよい。
ダイアボディは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、一本のポリペプチド鎖に発現され、同じ鎖の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによって接続された、二価の二重特異性分子である。ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、別の鎖の相補性ドメインと対合し、それによって、２つの抗原結合性部位が作製される（例えば、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448、Poijak et al., 1994 Structure 2:1121-1123を参照されたい）。ダイアボディは、同じ細胞内で、構造ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ（ＶＨ−ＶＬ構成）またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ（ＶＬ−ＶＨ構成）のいずれかを有する２つのポリペプチド鎖を発現させることによって、産生することができる。これらのほとんどが、細菌において可溶性形態で発現され得る。一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、ダイアボディを形成する２つのポリペプチド鎖を、およそ１５個のアミノ酸残基のリンカーと接続することによって産生される（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (3-4):128-30、Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1):21-36を参照されたい）。ｓｃＤｂは、細菌において、可溶性の活性なモノマー形態で発現され得る（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (34): 128-30、Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1):21-36、Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3 (2): 83-105、Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9 (7):617-21を参照されたい）。ダイアボディを、Ｆｃに融合して、「ジダイアボディ（di-diabody）」を生成することができる（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279 (4):2856-65を参照されたい）。
本発明の二重特異性分子において利用することができる他の抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体である。
本発明の二重特異性抗体は、当該技術分野において公知の方法を使用して、構成要素である結合特異性をコンジュゲートすることによって調製することができる。例えば、二重特異性分子のそれぞれの結合特異性を、別個に生成し、次いで、互いにコンジュゲートすることができる。結合特異性が、タンパク質またはペプチドである場合、様々なカップリング剤または架橋剤を、共有結合によるコンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686、Liu, M A et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法としては、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132、Brennan et al., 1985 Science 229:81-83)、およびGlennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375)に記載されているものが挙げられる。コンジュゲーション剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれも、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）から入手可能である。
結合特異性が抗体である場合、これらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域をスルフヒドリル結合することによってコンジュゲートされ得る。特定の実施形態において、ヒンジ領域は、コンジュゲーションの前に、奇数、例えば、１つのスルフヒドロリ残基を含むように修飾される。
あるいは、両方の結合特異性が、同じベクターにおいてコードされて、同じ宿主細胞において発現され、アセンブルされてもよい。この方法は、二重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合性決定基を含む一本鎖分子であってもよく、または２つの結合性決定基を含む一本鎖二重特異性分子であってもよい。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号明細書、米国特許第５，４５５，０３０号明細書、米国特許第４，８８１，１７５号明細書、米国特許第５，１３２，４０５号明細書、米国特許第５，０９１，５１３号明細書、米国特許第５，４７６，７８６号明細書、米国特許第５，０１３，６５３号明細書、米国特許第５，２５８，４９８号明細書、および米国特許第５，４８２，８５８号明細書に記載されている。
二重特異性分子のそれらの特異的標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害）、またはウェスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイのそれぞれは、概して、目的とされる複合体に特異的な標識化された試薬（例えば、抗体）を利用して、特定の目的とされるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
別の態様において、本発明は、ＣＤ３２ｂに結合する本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントの少なくとも２つの同一な抗原結合性部分または異なる抗原結合性部分を含む、多価化合物を提供する。抗原結合性部分は、タンパク質融合または共有結合もしくは非共有結合による連結を介して、一緒に連結され得る。あるいは、連結の方法は、二重特異性分子に関して記載されている。四価化合物は、例えば、本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントを、本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントの定常領域、例えば、Ｆｃ領域またはヒンジ領域に結合する抗体または抗原結合性フラグメントと架橋することによって、得ることができる。
三量体形成ドメインは、例えば、Ｂｏｒｅａｎ欧州特許第１ ０１２ ２８０号明細書に記載されている。五量体形成モジュールは、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ第９７／０５８９７号明細書に記載されている。
延長された半減期を有する抗体
本発明は、延長されたインビボでの半減期を有する、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体を提供する。
多数の因子が、インビボでのタンパク質の半減期に影響を及ぼし得る。例えば、腎臓での濾過、肝臓での代謝、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による分解、および免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質の中和ならびにマクロファージおよび樹上細胞による取込み）がある。様々な戦略を使用して、本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントの半減期を延長することができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ ＰＥＧ、抗体スキャフォールド、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合性リガンド、および炭水化物シールドへの化学的結合によるもの；血清タンパク質、例えば、アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎ、およびトランスフェリン（transferring）に結合するタンパク質への遺伝子融合によるもの；血清タンパク質に結合する他の結合部分、例えば、ナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディ、およびアンチカリンへのカップリング（遺伝子的または化学的）によるもの；ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合性タンパク質、およびＦｃへの遺伝子融合によるもの；またはナノ担体、遅延放出製剤、もしくは医療デバイスへの組込みによるものがある。
抗体のインビボでの血清循環を延長するために、高分子量のＰＥＧなど、不活性ポリマー分子を、抗体のＮ末端もしくはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的コンジュゲーション、またはリジン残基に存在するイプシロン−アミノ基のいずれかを通じて、多官能性リンカーありまたはなしで、抗体またはそのフラグメントに結合させることができる。抗体をペグ化するために、抗体、その抗原結合性フラグメントを、典型的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１つまたは複数のＰＥＧ基が、抗体または抗体フラグメントに結合した状態となるような条件下において、反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行うことができる。本明細書において使用されるとき、「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質、例えば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを誘導するために使用されたＰＥＧのあらゆる形態を包含することを意図する。一実施形態において、ペグ化しようとする抗体は、非グリコシル化抗体である。生物学的活性の消失を最小限に抑える直鎖状または分枝状ポリマー誘導体化が使用されるであろう。コンジュゲーションの程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析法によって緊密にモニタリングして、抗体へのＰＥＧ分子の適切なコンジュゲーションを確実にすることができる。未反応のＰＥＧは、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによって、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。ＰＥＧ−誘導体化抗体は、当業者に周知の方法、例えば、本明細書に記載されるイムノアッセイを使用して、結合活性ならびにインビボでの有効性に関して試験することができる。タンパク質をペグ化する方法は、当該技術分野において公知であり、本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントに適用することができる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０ １５４ ３１６号明細書およびＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０ ４０１ ３８４号明細書を参照されたい。
他の修正されたペグ化技術としては、再構成化学的直交性直接操作技術（reconstituting chemically orthogonal directed engineering technology）（ＲｅＣＯＤＥ ＰＥＧ）が挙げられ、これは、ｔＲＮＡシンテターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成系を介して、化学的に指定された側鎖を生合成タンパク質に組み込む。この技術により、３０個を上回る新しいアミノ酸を、大腸菌（E. coli）、酵母、および哺乳動物細胞における生合成タンパク質に組み込むことが可能となる。ｔＲＮＡは、アンバーコドンが位置している任意の位置に規範的アミノ酸を組み込み、終止アンバーコドンを、化学的に指定されるアミノ酸の組込みをシグナル伝達するものへと変換する。
組換えペグ化技術（ｒＰＥＧ）もまた、血清半減期の延長に使用することができる。この技術は、３００〜６００個のアミノ酸の非構造化タンパク質尾部を、既存の薬学的タンパク質に遺伝子融合することを伴う。そのような非構造化タンパク質鎖の見かけ上の分子量は、その実際の分子量の約１５倍であるため、タンパク質の血清半減期が大幅に増加する。化学的コンジュゲーションおよび再精製を必要とする従来的なＰＥＧ化とは対照的に、製造プロセスは大幅に簡略化され、生成物は、均質である。
別の技術にはポリシアル化があり、これは、天然のポリマーであるポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して、活性寿命を延長し、治療用ペプチドおよびタンパク質の安定性を改善する。ＰＳＡは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチド薬の送達に使用される場合、ポリシアル酸は、コンジュゲーションに対して保護的な微小環境をもたらす。これにより、循環中の治療用タンパク質の活性寿命が増加し、免疫系によって認識されるのを予防する。ＰＳＡポリマーは、ヒトの体内に天然に見られる。ＰＳＡは、数百万年にわたって進化したある特定の細菌によって、細菌壁をコーティングするために採用された。その後、これらの天然にポリシアル化された細菌は、分子擬態により、体内の防御系から逃れることが可能となった。天然の究極のステルス技術であるＰＳＡは、そのような細菌から大量に、かつ所定の物理的特徴を有して、容易に産生することができる。細菌ＰＳＡは、ヒト体内におけるＰＳＡと化学的に同一であるため、タンパク質に結合した場合であっても、完全に非免疫原性である。
別の技法としては、抗体に連結したヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用が挙げられる。ＨＥＳは、ろう様のトウモロコシデンプンに由来する修飾された天然のポリマーであり、体内の酵素によって代謝され得る。ＨＥＳ溶液は、通常、不足した血液量の代用として、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性を増加させること、ならびに腎臓クリアランスを低減させることによっても、循環半減期の延長を可能にし、生物学的活性の増加をもたらす。ＨＥＳの分子量などの様々なパラメーターを変化させることによって、広範なＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズすることができる。
増加したインビボ半減期を有する抗体はまた、１つまたは複数のアミノ酸修飾（すなわち、置換、挿入、または欠失）を、ＩｇＧ定常ドメイン、またはそのＦｃＲｎ結合性フラグメント（好ましくは、ＦｃまたはヒンジＦｃドメインフラグメント）に導入することによって、生成することができる。例えば、国際公開第９８／２３２８９号パンフレット、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット、および米国特許第６，２７７，３７５号明細書を参照されたい。
さらに、抗体または抗体フラグメントを、インビボでより安定にするため、またはインビボでの半減期をより長くするために、抗体を、アルブミンにコンジュゲートすることができる。これらの技法は、当該技術分野において周知であり、例えば、国際公開第９３／１５１９９号パンフレット、同第９３／１５２００号パンフレット、および同第０１／７７１３７号パンフレット、ならびに欧州特許第４１３，６２２号明細書を参照されたい。
半減期を増加させるための戦略は、ナノボディ、フィブロネクチンに基づく結合因子、およびインビボでの半減期の増加が所望される他の抗体またはタンパク質において、特に有用である。
抗体コンジュゲート
本発明は、異種タンパク質またはポリペプチド（またはその抗原結合性フラグメント、好ましくは、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、または少なくとも１００個のアミノ酸のポリペプチド）に組換えによって融合されたかまたは化学的にコンジュゲート（共有結合および非共有結合の両方によるコンジュゲーションを含む）されて融合タンパク質を生成する、ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。具体的には、本発明は、本明細書に記載される抗体の抗原結合性フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ ＣＤＲ）、および異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む、融合タンパク質を提供する。タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、抗体または抗体フラグメントに融合またはコンジュゲートするための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、および同第５，１１２，９４６号明細書、欧州特許第３０７，４３４号明細書および欧州特許出願公開第３６７，１６６号明細書、国際公開第９６／０４３８８号パンフレットおよび同第９１／０６５７０号パンフレット、Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539、Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600、ならびにVil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341を参照されたい。
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（集合的に、「ＤＮＡシャッフリング」と称される）の技法を通じて、生成され得る。ＤＮＡシャッフリングを利用して、本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントの活性を改変することができる（例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体およびその抗原結合性フラグメント）。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、同第５，８３４，２５２号明細書、および同第５，８３７，４５８号明細書、Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33、Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2):76-82、Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76、ならびにLorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24 (2):308-313を参照されたい（これらの特許および刊行物のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。抗体およびその抗原結合性フラグメント、またはコードされる抗体およびその抗原結合性フラグメントは、組換えの前に、エラープローンＰＣＲによるランダム変異生成、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法に供することによって、改変され得る。ＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体、その抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の異種分子の１つまたは複数の成分、モチーフ、セクション、部、ドメイン、フラグメントなどにより、組換えが行われ得る。
さらに、抗体およびその抗原結合性フラグメントは、精製を容易にするために、ペプチドなどのマーカー配列に融合することができる。一実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、市販入手可能な多くのものの中でもとりわけ、ヘキサヒスチジンペプチド（配列番号６８４）、例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ．、９１３１１）において提供されるタグである。例えば、Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載されるように、ヘキサヒスチジン（配列番号６８４）は、融合タンパク質の便宜的な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグとしては、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する赤血球凝集素「ＨＡ」タグ（Wilson et al., 1984, Cell 37:767）および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるがこれらに限定されない。
一実施形態において、本発明のＣＤ３２ｂ結合性抗体およびその抗原結合性フラグメントは、診断剤または検出可能な薬剤にコンジュゲートされ得る。そのような抗体は、特定の治療法の有効性を判定するなど、臨床試験手順の一部として、疾患または障害の発症、発達、進行、および／または重症度のモニタリングまたは予後診断に有用であり得る。そのような診断および検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定されない様々な酵素；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどであるがこれらに限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光材料；ルミノールなどであるがこれに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどであるがこれらに限定されない生物発光材料；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどであるがこれらに限定されない放射性材料；ならびに様々なポジトロン放出断層撮影法を使用したポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出可能な物質に、抗体を結合させることによって、達成することができる。
本発明は、さらに、治療用分子にコンジュゲートした抗体およびその抗原結合性フラグメントの使用を包含する。抗体、その抗原結合性フラグメントは、治療用部分、例えば、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤、治療剤、または放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体にコンジュゲートされ得る。細胞毒素または細胞毒性剤には、細胞にとって有害な任意の薬剤が含まれる。
さらに、抗体、その抗原結合性フラグメントは、所与の生物学的応答を修飾する、治療用部分または薬物部分にコンジュゲートされてもよい。治療用部分または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されるとみなされるものではない。例えば、薬物部分は、所望される生物学的活性を有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血管新生剤などのタンパク質または例えば、リンホカインなどの生体応答修飾物質を挙げることができる。
さらに、抗体は、治療用部分、例えば、放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体、例として、２１３Ｂｉ、または１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含むがこれらに限定されない放射性金属イオンをポリペプチドにコンジュゲートするのに有用な大環状キレート物質に、コンジュゲートすることができる。一実施形態において、大環状キレート物質は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）であり、これは、リンカー分子を介して抗体に結合させることができる。そのようなリンカー分子は、当該技術分野において広く知られており、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4 (10):2483-90、Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10 (4):553-7、およびZimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26 (8):943-50に記載されており、それぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
治療用部分を抗体にコンジュゲートする技法は、周知であり、例えば、Amon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)、Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)、Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)、”Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。
抗体はまた、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用である、固体支持体に結合させてもよい。そのような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の抗体を産生する方法
抗体をコードする核酸
本発明は、上述のＣＤ３２ｂ結合性抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のうちのいくつかは、配列番号１０、６２、１１４、１６６、２１８、２７０、３２２、３７４、４２６、４７８、５３０、５５６、５８２、もしくは６３４のうちのいずれかに示される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および／または配列番号２３、７５、１２７、１７９、２３１、２８３、３３５、３８７、４３９、４９１、５４３、５６９、５９５、もしくは６４７のうちのいずれかに示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態において、核酸分子は、表１に特定されるものである。いくつかの他の本発明の核酸分子は、表１に特定されるもののヌクレオチド配列に対して実質的に（例えば、少なくとも６５、８０％、９５％、または９９％）同一であるヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現されると、これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、ＣＤ３２ｂ抗原結合能力を呈することができる。
表１に記載されるＣＤ３２ｂ結合性抗体の重鎖または軽鎖に由来する少なくとも１つのＣＤＲ領域および通常は３つすべてのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明において提供される。いくつかの他のポリヌクレオチドは、表１に記載されるＣＤ３２ｂ結合性抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域配列のすべてまたは実質的にすべてをコードする。コードの縮重性のため、様々な核酸配列が、免疫グロブリンアミノ酸配列のそれぞれをコードするであろう。
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードし得る。本発明の核酸配列のうちのいくつかは、配列番号１２、３８、６４、９０、１１６、１４２、１６８、１９４、２２０、２４６、２７２、２９８、３２４、３５０、３７６、４０２、４２８、４５４、４８０、５０６、５３２、５５８、５８４、６１０、６３６、または６６２のうちのいずれかに記載される成熟重鎖可変領域配列に対して同一であるかまたは実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一である成熟重鎖可変領域配列をコードするヌクレオチドを含む。本発明の核酸配列のうちのいくつかは、配列番号２５、５１、７７、１０３、１２９、１５５、１８１、２０７、２３３、２５９、２８５、３１１、３３７、３６３、３８９、４１５、４４１、４６７、４９３、５１９、５４５、５７１、５９７、６２３、６４９、および６７５のうちのいずれかに記載される成熟軽鎖可変領域配列に対して同一であるかまたは実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一である成熟軽鎖可変領域配列をコードするヌクレオチドを含む。
ポリヌクレオチド配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成によって、またはＣＤ３２ｂ結合性抗体またはその結合性フラグメントをコードする既存の配列（例えば、以下の実施例に記載される配列）のＰＣＲ変異生成によって、産生され得る。核酸の直接的な化学合成は、当該技術分野において公知の方法、例えば、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90のホスホトリエステル法、Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979のホスホジエステル法、Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホスホラミダイト法、および米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固体支持法によって、達成することができる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異の導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif., 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991、およびEckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991に記載されるように行うことができる。
上述のＣＤ３２ｂ結合性抗体を産生するための発現ベクターおよび宿主細胞もまた、本発明において提供される。様々な発現ベクターを利用して、ＣＤ３２ｂ結合性抗体鎖または結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスに基づく発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターの両方を、哺乳動物宿主細胞において抗体を産生させるために使用することができる。非ウイルスベクターおよび非ウイルス系には、プラスミド、典型的にはタンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを伴うエピソーマルベクター、およびヒト人工染色体が含まれる（例えば、Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞におけるＣＤ３２ｂ結合性ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、Ｂ、およびＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、Ｂ、およびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＭＰＳＶベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための当該技術分野において公知の多数の他のベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルスに基づくベクター、ならびにセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。Brent et al.（上記）、Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995、およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照されたい。
発現ベクターの選択は、そこでベクターを発現させようと意図される宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、ＣＤ３２ｂ結合性の抗体鎖の抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターおよび他の制御配列（例えば、エンハンサー）を含む。一実施形態において、誘導条件下を除き、挿入された配列の発現を防止するために、誘導的プロモーターが利用される。誘導的プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターが挙げられる。形質転換された生物の培養物は、集団を、発現産物が宿主細胞によって寛容されたほうがよいコーディング配列に偏らせることなく、非誘導条件下において増殖させることができる。プロモーターに加えて、他の制御エレメントもまた、ＣＤ３２ｂ結合性の抗体鎖の抗原結合性フラグメントの効率的な発現に必要とされるかまたは所望される場合がある。これらのエレメントとしては、典型的に、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接するリボソーム結合部位または他の配列が挙げられる。加えて、発現の効率性は、使用している細胞系に適切なエンハンサーを含めることによって、増強することができる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０ エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させることができる。
発現ベクターはまた、挿入されたＣＤ３２ｂ結合性抗体配列によってコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置も提供し得る。挿入されたＣＤ３２ｂ結合性抗体配列は、ベクターに含める前に、シグナル配列に連結されることが多い。ＣＤ３２ｂ結合性抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする配列を受容するために使用しようとするベクターは、定常領域またはその一部をコードする場合もある。そのようなベクターにより、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現が可能となり、それによって、インタクトな抗体およびその抗原結合性フラグメントの産生につながる。典型的には、そのような定常領域は、ヒトのものである。
ＣＤ３２ｂ結合性抗体鎖を保有し、発現させるための宿主細胞は、原核生物のものであっても真核生物のものであってもよい。大腸菌（E. coli）は、本発明のポリヌクレオチドのクローニングおよび発現に有用な１つの原核生物宿主である。使用に好適な他の微生物宿主としては、桿菌、例えば、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、ならびに他の腸内細菌、例えば、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、および様々なシュードモナス属（Pseudomonas）種が挙げられる。これらの原核生物宿主において、宿主細胞と適合性のある発現制御配列（例えば、複製起点）を典型的に含む、発現ベクターを作製することもできる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダ由来のプロモーター系といった、任意の数の様々な周知のプロモーターが、存在する。プロモーターは、任意選択で、オペレーター配列により発現を制御することが典型的であるが、転写および翻訳を開始して完了させるためのリボソーム結合部位配列などを有する。他の微生物、例えば、酵母もまた、本発明のＣＤ３２ｂ結合性ポリペプチドを発現させるために用いることができる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞もまた、使用することができる。
一実施形態において、哺乳動物宿主細胞が、本発明のＣＤ３２ｂ結合性ポリペプチドを発現させ、産生させるために使用される。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株であってもよく、または外因性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞株であってもよい。それらには、任意の正常非不死化（mortal）動物もしくはヒト細胞、または正常もしくは異常不死化動物もしくはヒト細胞が含まれる。例えば、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞、およびハイブリドーマを含む、インタクトな免疫グロブリンを分泌することができるいくつかの好適な宿主細胞株が開発されている。ポリペプチドを発現させるために哺乳動物組織細胞培養物を使用することは、概して、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987において総説されている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターには、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、およびエンハンサー（例えば、Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照されたい）、ならびに必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列が含まれ得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含む。好適なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、段階特異的、および／または調節可能もしくは制御可能なものであり得る。有用なプロモーターとしては、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導的ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏＩＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導的ＣＭＶプロモーター（ヒト最初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当該技術分野において公知のプロモーター−エンハンサーの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿主の種類に応じて変動する。例えば、原核生物細胞については、塩化カルシウムトランスフェクションが広く利用されており、一方で、他の細胞宿主については、リン酸カルシウム処置またはエレクトロポレーションが、使用され得る。（全般的には、Sambrook, et al.（上記）を参照されたい）。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処置、リポソーム媒介型形質転換、注射およびマイクロインジェクション、遺伝子銃法（ballistic method）、ウイロソーム（virosome）、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２への融合（Elliot and O’Hare, Cell 88:223, 1997）、薬剤によるＤＮＡ取り込みの増強、ならびにエキソビボ形質導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生のためには、安定な発現が所望されることが多いであろう。例えば、ＣＤ３２ｂ結合性抗体鎖または結合性フラグメントを安定に発現する細胞株は、ウイルス複製起点または内因性発現エレメント、および選択可能なマーカー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターを導入した後、細胞を、強化培地において１〜２日間成長させた後、選択培地に切り替えてもよい。選択可能なマーカーの目的は、選択に対する耐性を付与し、その存在により細胞の成長が可能となり、それによって、導入された配列を選択培地において発現させることに成功することである。耐性であり安定にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適した組織培養技法を使用して、増殖させることができる。
本発明のモノクローナル抗体の生成
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来的なモノクローナル抗体手法を含む様々な技法、例えば、Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技法によって、産生させることができる。モノクローナル抗体を産生させるための多数の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルス形質転換または発がん性形質転換が、利用され得る。
ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの産生は、十分に確立された手順である。融合のために免疫化脾細胞を単離するための免疫化のプロトコルおよび技法は、当該技術分野において公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順もまた、公知である。
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体およびその抗原結合性フラグメントは、上述のように調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のマウスハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学技法を使用して、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域を、当該技術分野において公知の方法を使用して、ヒト定常領域に連結させることができる（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらに対する米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）。ヒト化抗体を作製するために、マウスＣＤＲ領域を、当該技術分野において公知の方法を使用して、ヒトフレームワークに挿入してもよい。例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，２２５，５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎに対する同第５，５３０，１０１号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、および同第６１８０３７０号明細書を参照されたい。
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ＣＤ３２ｂを対象とするそのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の部分を有するトランスジェニックマウスまたはトランスクロモソームマウスを使用して、生成することができる。これらのトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソームマウスには、それぞれ、本明細書においてＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称されるマウスが含まれ、本明細書において集合的に「ヒトＩｇマウス」と称される。
ＨｕＭＡｂ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内因性ミュー鎖およびカッパ鎖遺伝子座を不活性化する標的化変異とともに、再配列されていないヒト重鎖（ミューおよびガンマ）ならびにカッパ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む（例えば、Lonberg, et al., 1994 Nature 368 (6474): 856-859を参照されたい）。したがって、このマウスは、マウスＩｇＭまたはＫの発現の低減を呈し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧカッパモノクローナル抗体をもたらす（Lonberg, N. et al., 1994（上記）、Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101において総説、Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93、およびHarding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546）。ＨｕＭＡｂマウスの調製および使用、ならびにそのようなマウスによって保持されるゲノムの修飾は、さらに、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295、Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656、Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724、Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123、Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830、Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920、Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591、およびFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851に記載されており、これらのすべての内容は、参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる。さらに、すべてＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに対する米国特許第５，５４５，８０６号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，７８９，６５０号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書、同第５，８１４，３１８号明細書、同第５，８７４，２９９号明細書、および同第５，７７０，４２９号明細書、Ｓｕｒａｎｉらに対する米国特許第５，５４５，８０７号明細書、すべてのＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに対するＰＣＴ国際公開第９２１０３９１８号パンフレット、同第９３／１２２２７号パンフレット、同第９４／２５５８５号パンフレット、同第９７１１３８５２号パンフレット、同第９８／２４８８４号パンフレット、および同第９９／４５９６２号パンフレット、ならびにＫｏｒｍａｎらに対するＰＣＴ国際公開第０１／１４４２４号パンフレットを参照されたい。
別の実施形態において、本発明のヒト抗体は、導入遺伝子および導入染色体にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保有するマウスを使用して、得ることができる。そのようなマウスは、本明細書において「ＫＭ」マウスと称され、Ｉｓｈｉｄａらに対するＰＣＴ国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに詳述されている。
なおもさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的なトランスジェニック動物系が、当該技術分野において入手可能であり、これを使用して、本発明のＣＤ３２ｂ結合性抗体およびその抗原結合性フラグメントを得ることができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と称される代替的なトランスジェニック系を使用することができる。そのようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらに対する米国特許第５，９３９，５９８号明細書、同第６，０７５，１８１号明細書、同第６，１１４，５９８号明細書、同第６，１５０，５８４号明細書、および同第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的なトランスクロモソーム動物系が、当該技術分野において入手可能であり、これを使用して、本発明のＣＤ３２ｂ結合性抗体を得ることができる。例えば、「ＴＣマウス」と称される、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を保有するマウスを使用することができ、そのようなマウスは、Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を保有するウシが、当該技術分野において説明されており（Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894）、これを使用して、本発明のＣＤ３２ｂ結合性抗体を得ることができる。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ法は、当該技術分野において確立されているか、または以下の実施例に記載されている。例えば、Ｌａｄｎｅｒらに対する米国特許第５，２２３，４０９号明細書、同第５，４０３，４８４号明細書、および同第５，５７１，６９８号明細書、Ｄｏｗｅｒらに対する米国特許第５，４２７，９０８号明細書および同第５，５８０，７１７号明細書、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらに対する米国特許第５，９６９，１０８号明細書および同第６，１７２，１９７号明細書、ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらに対する米国特許第５，８８５，７９３号明細書、同第６，５２１，４０４号明細書、同第６，５４４，７３１号明細書、同第６，５５５，３１３号明細書、同第６，５８２，９１５号明細書、および同第６，５９３，０８１号明細書を参照されたい。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化したときにヒト抗体応答が生じ得るように、ヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを使用して調製することができる。そのようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらに対する米国特許第５，４７６，９９６号明細書および同第５，６９８，７６７号明細書に記載されている。
フレームワークまたはＦｃの操作
本発明の操作抗体およびその抗原結合性フラグメントには、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に、例えば、抗体の特性を改善するための修飾がなされているものが含まれる。典型的には、そのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系配列に「復帰変異」することである。より具体的には、体細胞変異を受けた抗体は、その抗体が由来する生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を含む場合がある。そのような残基は、抗体のフレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系配列と比較することによって、特定することができる。フレームワーク領域の配列を、それらの生殖細胞系構成に戻すために、体細胞変異を、例えば、部位特異的変異生成によって、生殖細胞系配列に「復帰変異」させることができる。そのような「復帰変異」抗体もまた、本発明に包含されることが意図される。
別の種類のフレームワーク修飾には、フレームワーク領域内またはさらには１つもしくは複数のＣＤＲ領域内において、１つまたは複数の残基を、変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の潜在的な免疫原性を低減することが含まれる。このアプローチは、「脱免疫化」とも称され、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書にさらに詳細に記載されている。
フレームワーク領域またはＣＤＲ領域内において行われる修飾に加えて、またはその代替として、本発明の抗体は、典型的には、抗体の１つまたは複数の機能特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞毒性を改変するような、Ｆｃ領域内における修飾を含むように操作され得る。さらに、本発明の抗体は、ここでも、抗体の１つまたは複数の機能特性を改変するように、化学修飾され得るか（例えば、１つまたは複数の化学的部分を抗体に結合させてもよい）またはそのグリコシル化を改変するように修飾され得る。これらの実施形態のそれぞれは、以下にさらに詳述される。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
一実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数を改変するように、例えば、増加または減少するように、修飾される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリを容易にするように、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるように、改変されている。
別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるように変異している。より具体的には、抗体が、天然のＦｃヒンジドメインのブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合と比較して、損傷されたＳｐＡ結合を有するように、１つまたは複数のアミノ酸変異が、ＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメインの境界領域に導入されている。このアプローチは、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳細に記載されている。
別の実施形態において、抗体は、生物学的半減期を増加させるように修飾されている。様々なアプローチが可能である。例えば、以下の変異のうちの１つまたは複数を導入することができる：Ｗａｒｄに対する米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載されている、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、抗体は、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書および同第６，１２１，０２２号明細書に記載されているように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られたサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内において改変することができる。
一実施形態において、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を改変するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置き換えることによって、改変されている。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対して改変された親和性を有するが親抗体の抗原結合能力は保持するように、１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基と置き換えることができる。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、いずれもＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号明細書および同第５，６４８，２６０号明細書にさらに詳細に記載されている。
別の実施形態において、アミノ酸残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸は、抗体が、改変されたＣ１ｑ結合および／または低減もしくは消失された補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を有するように、異なるアミノ酸残基と置き換えられ得る。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号明細書にさらに詳細に記載されている。
別の実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸残基は、補体と結合する抗体の能力を改変させるように、改変されている。このアプローチは、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ国際公開第９４／２９３５１号パンフレットにさらに記載されている。
さらに別の実施形態において、Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させるように、および／またはＦｃガンマ受容体に対する抗体の親和性を増加させるように、１つまたは複数のアミノ酸を修飾することによって修飾されている。このアプローチは、例えば、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公開第００／４２０７２号パンフレットおよびLazar et al., 2006 PNAS 103(110): 4005-4010にさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１におけるＦｃガンマＲＩ、Ｆｃ−ガンマＲＩＩ、Ｆｃ−ガンマＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎへの結合部位が、マッピングされており、改善された結合を有するバリアントが、説明されている（Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604を参照されたい）。
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化が、修飾されている。例えば、非グリコシル化抗体を、作製することができる（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗体の「抗原」に対する親和性を増加させるために改変することができる。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を改変することによって達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによって、その部位におけるグリコシル化を排除する、１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができる。そのような非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。そのようなアプローチは、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号明細書および同第６，３５０，８６１号明細書にさらに詳細に記載されている。
追加または代替として、改変型のグリコシル化を有する抗体、例えば、低減された量のフコシル残基を有する低フコシル化もしくは非フコシル化抗体、または二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体を、作製することができる。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。そのような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって、達成することができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当該技術分野において説明されており、本発明の組換え抗体を発現させる宿主細胞として使用して、それによって改変されたグリコシル化を有する抗体を産生することができる。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株について記載しており、結果として、そのような細胞株において発現される抗体は、低フコシル化を呈することになる。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットは、Ａｓｎ（２９７）に結合した炭水化物にフコースを結合させる能力が低減しており、結果として、その宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化をもたらす、バリアントＣＨＯ細胞株、ＬｅｃＩ３細胞について記載している（Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ国際公開第９９／５４３４２号パンフレットは、操作された細胞株において発現される抗体が、二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造の増加を呈し、それにより抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらすような、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株について記載している（Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180もまた、参照されたい）。Von Horsten et al. 2010 Glycobiology 20(12):1607-18もまた、ＣＨＯ細胞における抗体とＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼとの共発現によって非フコシル化抗体を産生する方法について記載している。
改変された抗体を操作する方法
上述のように、本明細書に示されるＶＨ配列およびＶＬ配列または完全長重鎖配列および完全長軽鎖配列を有するＣＤ３２ｂ結合性抗体を使用して、完全長重鎖配列および／もしくは完全長軽鎖配列、ＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列、またはそれらに結合される定常領域を修飾することによって、新しいＣＤ３２ｂ結合性抗体を作製することができる。したがって、本発明の別の態様において、本発明のＣＤ３２ｂ結合性抗体の構造特性は、本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントの少なくとも１つの機能特性、例えば、ヒトＣＤ３２ｂへの結合およびＣＤ３２ｂの１つまたは複数の機能特性の阻害を保持する、構造的に関連したＣＤ３２ｂ結合性抗体を作製するために使用される。
例えば、本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントの１つまたは複数のＣＤＲ領域、またはそれらの変異形態を、上述のように、組換えにより公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み合わせて、さらなる組換え操作された本発明のＣＤ３２ｂ結合性抗体およびその抗原結合性フラグメントを作製することができる。他の種類の修飾には、前述の節に記載のものが含まれる。操作方法のための出発材料は、本明細書に提供されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列、またはその１つもしくは複数のＣＤＲ領域のうちの１つまたは複数である。操作抗体を作製するために、本明細書に提供されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域のうちの１つまたは複数を有する抗体を、必ずしも実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）必要はない。むしろ、配列内に含まれる情報を、出発材料として使用して、元の配列に由来する「第２世代」の配列を作製し、次いで、この「第２世代」の配列を、調製し、タンパク質として発現させる。
改変された抗体配列は、米国特許出願公開第２００５０２５５５５２号明細書に記載されるように、ＣＤＲ３配列または最小限の不可欠な結合性決定基が固定され、ＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列には多様性がある抗体ライブラリーをスクリーニングすることによっても調製することができる。スクリーニングは、ファージディスプレイ技術など、抗体ライブラリーから抗体をスクリーニングするのに適切な任意のスクリーニング技術に従って行うことができる。
標準的な分子生物学技法を使用して、改変された抗体配列を調製し、発現させることができる。改変された抗体配列によってコードされる抗体は、本明細書に記載されるＣＤ３２ｂ結合性抗体の機能特性のうちの１つ、いくつか、またはすべてを保持するものであり、この機能特性には、ヒトＣＤ３２ｂタンパク質に特異的に結合すること、および／またはＣＤ３２ｂの１つもしくは複数の機能特性を阻害することが含まれるが、これらに限定されない。
改変された抗体の機能特性は、当該技術分野において利用可能であるおよび／または本明細書に記載されている標準的なアッセイ、例えば、実施例に記載されているもの（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して評価することができる。
本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントを操作する方法の一実施形態において、変異を、ＣＤ３２ｂ結合性抗体のコーディング配列のすべてまたは一部にランダムまたは選択的に導入することができ、結果として得られる修飾されたＣＤ３２ｂ結合性抗体を、結合活性および／または本明細書に記載される他の機能特性に関して、スクリーニングすることができる。変異方法は、当該技術分野において説明されている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ国際公開第０２／０９２７８０号パンフレットは、飽和変異生成、合成ライゲーションアセンブリ、またはそれらの組合せを使用して、抗体の変異形態を作製し、スクリーニングする方法について記載している。あるいは、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ国際公開第０３／０７４６７９号パンフレットは、抗体の物理化学的特性を最適化するためにコンピュータによるスクリーニング方法を使用する方法について記載している。
本発明の抗体の特徴付け
本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントは、様々な機能性アッセイによって特徴付けることができる。例えば、それらは、ＣＤ３２ｂを阻害する能力によって特徴付けることができる。
抗体がＣＤ３２ｂに結合する能力は、目的の抗体を直接的に標識することによって検出することができ、または抗体は未標識であってもよく、当該技術分野において公知の様々なサンドイッチアッセイ形式を使用して間接的に結合を検出してもよい。
一実施形態において、本発明のＣＤ３２ｂ結合性抗体およびその抗原結合性フラグメントは、参照ＣＤ３２ｂ結合性抗体とＣＤ３２ｂポリペプチドとの結合を遮断するか、またはそれと競合する。これらは、上述の完全ヒトまたはヒト化ＣＤ３２ｂ結合性抗体であり得る。これらはまた、参照抗体と同じエピトープに結合する他のヒト、マウス、キメラ、またはヒト化ＣＤ３２ｂ結合性抗体であってもよい。参照抗体の結合を遮断するかまたはそれと競合する能力は、試験しているＣＤ３２ｂ結合性抗体が、参照抗体によって定義されるものと同じかもしくは類似のエピトープに結合するか、参照ＣＤ３２ｂ結合性抗体が結合するエピトープの十分に近傍にあるエピトープに結合することを示す。そのような抗体は、参照抗体に関して特定されている有利な特性を共有する可能性が特に高い。参照抗体を遮断するかまたはそれと競合する能力は、例えば、競合的結合アッセイによって判定することができる。競合的結合アッセイでは、試験下にある抗体は、参照抗体と共通の抗原、例えば、ＣＤ３２ｂポリペプチドとの特異的な結合を阻害する能力に関して試験される。試験抗体は、過剰量の試験抗体が、参照抗体の結合を実質的に阻害する場合、抗原への特異的な結合に関して、参照抗体と競合する。実質的な阻害とは、試験抗体が、通常、参照抗体の特異的な結合を少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または９０％低減させることを意味する。
特定のタンパク質、この事例ではＣＤ３２ｂへの結合に関して、ある抗体と参照抗体との競合を評価するために使用することができる公知の競合的結合アッセイが、いくつか存在する。これらには、例えば、直接的または間接的固相放射免疫測定法（ＲＩＡ）、直接的または間接的固相酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983を参照されたい）、直接的固相ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986を参照されたい）、直接的固相標識アッセイ、直接的固相標識サンドイッチアッセイ（Harlow & Lane（上記）を参照されたい）、Ｉ−１２５標識を使用した直接的固相標識ＲＩＡ（Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988を参照されたい）、直接的固相ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990を参照されたい）、および直接的標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990）が挙げられる。典型的には、このようなアッセイは、これらの未標識試験ＣＤ３２ｂ結合性抗体および標識化参照抗体のいずれかを保有する固体表面または細胞に結合した精製抗原の使用を伴う。競合的阻害は、試験抗体の存在下において、固体表面また細胞に結合した標識の量を判定することによって測定される。通常、試験抗体は、過剰に存在する。競合アッセイ（競合抗体）によって特定される抗体には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、および参照抗体が結合するエピトープに、立体障害が生じるのに十分に近傍に隣接するエピトープに結合する抗体が含まれる。
選択されたＣＤ３２ｂ結合性モノクローナル抗体が、固有のエピトープに結合するかどうかを判定するために、それぞれの抗体を、市販入手可能な試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．からの試薬）を使用して、ビオチン標識してもよい。未標識モノクローナル抗体およびビオチン標識したモノクローナル抗体を使用した競合研究は、ＣＤ３２ｂポリペプチドをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを使用して行うことができる。ビオチン標識したモノクローナル抗体の結合は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプローブにより検出することができる。精製されたＣＤ３２ｂ結合性抗体のアイソタイプを判定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを行ってもよい。例えば、マイクロタイタープレートのウェルを、４℃において一晩、１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧでコーティングしてもよい。１％ＢＳＡでブロッキングした後、プレートを、周囲温度において１〜２時間、１μｇ／ｍｌ以下のＣＤ３２ｂ結合性モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプ対照と反応させる。ウェルを、次いで、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭに特異的なアルカリホスファターゼがコンジュゲートしたプローブと反応させることができる。次いで、精製された抗体のアイソタイプを判定することができるように、プレートを現像し、分析する。
ＣＤ３２ｂ結合性モノクローナル抗体のＣＤ３２ｂポリペプチドを発現する生細胞への結合を実証するために、フローサイトメトリーを使用することができる。簡単に述べるとＣＤ３２ｂを発現する細胞（標準的な成長条件下において成長させたもの）を、０．１％ＢＳＡおよび１０％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ中において、様々な濃度のＣＤ３２ｂ結合性抗体と混合し、３７℃で１時間インキュベートすることができる。洗浄した後、細胞を、一次抗体染色と同じ条件下において、フルオレセイン標識した抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。サンプルは、単一細胞に対してゲーティングを行うように光散乱および側方散乱特性を使用して、ＦＡＣＳｃａｎ機器によって分析することができる。蛍光顕微鏡法を使用した代替的なアッセイを、（フローサイトメトリーアッセイに加えてまたはその代わりに）使用してもよい。細胞は、上述のように正確に染色し、蛍光顕微鏡法によって試験することができる。この方法は、個々の細胞の視覚化を可能にするが、抗原の密度に応じて感度が低下している場合がある。
本発明のＣＤ３２ｂ結合性抗体およびその抗原結合性フラグメントは、さらに、ウェスタンブロッティングによってＣＤ３２ｂポリペプチドまたは抗原性フラグメントとの反応性に関して試験することができる。簡単に述べると、精製されたＣＤ３２ｂポリペプチドもしくは融合タンパク質、またはＣＤ３２ｂを発現する細胞由来の細胞抽出物を、調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動の後に、分離した抗原を、ニトロセルロース膜に移し、１０％ウシ胎児血清でブロッキングし、試験しようとするモノクローナル抗体でプローブする。ヒトＩｇＧの結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）で現像することができる。
機能性アッセイの例は、以下の実施例の節にも記載されている。
予防的使用および治療的使用
本発明は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の任意の抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与することによって、ＣＤ３２ｂの活性または発現の増加と関連する疾患または障害を治療する方法を提供する。具体的な実施形態において、本発明は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、小型リンパ球性リンパ腫、びまん性小型切れ込み細胞型リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、および濾胞性リンパ腫を含むＢ細胞性悪性腫瘍、ならびに全身性軽鎖アミロイドーシスを含む他の疾患を含むがこれらに限定されない適応症を治療する方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントを投与することによって、ＣＤ３２ｂ関連疾患または障害を治療する方法を提供する。開示されるＣＤ３２ｂ結合性抗体またはその抗原結合性フラグメントが有用であり得る公知のＣＤ３２ｂ関連疾患または障害の例としては、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、小型リンパ球性リンパ腫、びまん性小型切れ込み細胞型リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、および濾胞性リンパ腫を含むＢ細胞性悪性腫瘍、ならびに全身性軽鎖アミロイドーシスを含む他の疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
加えて、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、とりわけ、他の抗体の有効性を増加させるために、ＣＤ３２ｂと共発現される細胞表面抗原に結合する別の抗体と組み合わせて、使用することができる。一部の実施形態において、ＣＤ３２ｂおよび細胞表面抗原は、Ｂ細胞において共発現される。一部の実施形態において、細胞表面抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＫｉＲ、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ４０、Ｔｈｙ−１、Ｌｙ−６、ＣＤ４９、Ｆａｓ、Ｃｄ９５、ＡＰＯ−１、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＸＣＲ４、ＨＬＡ分子、ＧＭ１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ７４、またはＤＲＤからなる群から選択される。一部の実施形態において、本発明の他のＣＤ３２ｂ結合性抗体またはその抗原結合性フラグメントは、リツキシマブ、オビヌツムマブ、オファツムマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、アレムツズマブ、またはＣＤ３２ｂを共発現する細胞表面抗原を標的とする任意の他の抗体からなる群から選択される抗体と組み合わせて、使用される。本発明の抗ＣＤ３２ｂ抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ＣＤ３２ｂと共発現される細胞表面抗原に結合する他の抗体の活性を増強するという見解の説明としては、抗ＣＤ３２ｂ抗体がＣＤ３２ｂに結合し、細胞表面抗原に結合する抗体のＦｃ領域にＣＤ３２ｂが結合するのを遮断し、それによって、細胞表面抗原に結合する抗体が、免疫エフェクター細胞に結合し、細胞殺滅機能を（例えば、ＡＤＣＣを介して）媒介することが可能となり、可能性としては、細胞表面抗原に結合する抗体が、細胞に内部移行され、したがって細胞殺滅を（例えば、ＡＤＣＣを介して）媒介しなくなることが防止されることである。
さらに、本発明のＣＤ３２ｂ結合性抗体またはその抗原結合性フラグメントは、とりわけ、ＣＤ３２ｂと共発現される細胞表面抗原に結合する抗体を使用した治療に対して耐性または不応性となった患者の疾患を治療するため、例えば、その進行の予防、遅延、または逆転を行うために使用することができる。本明細書に開示されるＣＤ３２ｂ結合性抗体またはその抗原結合性フラグメントを用いてＣＤ３２ｂを遮断することによって、細胞表面抗原に結合する抗体の有効性が増強され得、したがって、そのような抗体に対する耐性が、完全にまたは部分的に、逆転され得る。
一実施形態において、本明細書に記載される単離抗ＣＤ３２ｂ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、それを必要とする患者に、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において公知のものといった治療方法または手順とともに、投与され得る。加えて、単独またはＣＤ３２ｂと共発現される細胞表面抗原に結合する１つもしくは複数の抗体と組み合わせてのいずれかで、本開示の抗ＣＤ３２ｂ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、以下に記載されるように、別の治療剤とさらに組み合わせることができる。
例えば、組合せ療法としては、１つまたは複数の追加の治療剤、例えば、１つまたは複数の抗がん剤、細胞毒性剤もしくは細胞増殖抑制剤、ホルモン治療、ワクチン、および／または他の免疫療法と共製剤化および／または共投与される、本発明の組成物を挙げることができる。他の実施形態において、抗体分子は、外科手術、放射線、凍結外科手術、および／または温熱療法を含む、他の治療的治療モダリティと組み合わせて投与される。そのような組合せ療法は、投与される治療剤を低い投薬量で有利に用いることができ、したがって、様々な単剤療法に付随する可能性のある毒性または問題を回避することができる。
「と組み合わせて」とは、治療法または治療剤が、同時に投与される、および／または一緒に送達するために製剤化される必要があることを示唆することを意図するものではないが、これらの送達方法は、本明細書に記載される範囲内に含まれる。抗ＣＤ３２ｂ抗体分子は、１つまたは複数の他の追加の治療薬または治療剤と同時に、その前に、またはその後で、投与され得る。抗ＣＤ３２ｂ抗体分子および他の薬剤もしくは治療プロトコルは、任意の順序で投与され得る。一般に、各薬剤は、その薬剤の所定の用量および／または時間スケジュールで投与されるであろう。この組合せにおいて用いられる追加の治療剤が、単一の組成物において一緒に投与されてもよく、または異なる組成物において別個に投与されてもよいことが、さらに理解されるであろう。一般に、組み合わせて用いられる追加の治療剤は、個別に用いられるレベルを超えないレベルで用いられることが予測される。一部の実施形態において、組み合わせて用いられるレベルは、個別に用いられるものよりも低くなるであろう。
本開示の抗ＣＤ３２ｂ抗体またはその抗原結合性フラグメントの例示的な組合せとしては、そのような抗体を、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、および慢性リンパ球性リンパ腫を含む血液系悪性腫瘍を治療するための標準的な治療剤である化合物、例えば、オファツムマブ、イブルチニブ、ベリノスタット、ロミデプシン、ブレンツキシマブベドチン、オビヌツズマブ、プララトレキセート、ペントスタチン、デキサメタゾン、イデラリシブ、イキサゾミブ、リポソーム化ドキソルビシン（doxyrubicin）、ポマリドミド、パノビノスタット、エロツズマブ、ダラツムマブ、アレムツズマブ、サリドマイド、およびレナリドマイドと組み合わせて使用することを含む。
一実施形態において、抗ＣＤ３２ｂ抗体分子は、共刺激分子の調節物質、例えば、アゴニストと組み合わせて投与される。一実施形態において、調節物質は、ＩＬ１５である。一実施形態において、共刺激分子のアゴニストは、ＳＴＩＮＧ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、またはＣＤ８３リガンドのアゴニスト（例えば、アゴニスト抗体またはその抗原結合性フラグメント、または可溶性融合体）から選択される。
例示的なＧＩＴＲアゴニストとしては、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体）、例えば、米国特許第６，１１１，０９０号明細書、欧州特許第０９０５０５号明細書、米国特許第８，５８６，０２３号明細書、ＰＣＴ国際公開第２０１０／００３１１８号パンフレット、および同第２０１１／０９０７５４号パンフレットに記載されているＧＩＴＲ融合タンパク質、または例えば、米国特許第７，０２５，９６２号明細書、欧州特許第１９４７１８３号明細書、米国特許第７，８１２，１３５号明細書、米国特許第８，３８８，９６７号明細書、米国特許第８，５９１，８８６号明細書、欧州特許出願公開第１８６６３３９号明細書、ＰＣＴ国際公開第２０１１／０２８６８３号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第２０１３／０３９９５４号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第２００５／００７１９０号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第２００７／１３３８２２号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第２００５／０５５８０８号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第９９／４０１９６号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第２００１／０３７２０号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第９９／２０７５８号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第２００６／０８３２８９号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第２００５／１１５４５１号パンフレット、米国特許第７，６１８，６３２号明細書、およびＰＣＴ国際公開第２０１１／０５１７２６号パンフレットに記載されている抗ＧＩＴＲ抗体などが挙げられる。
一実施形態において、抗ＣＤ３２ｂ抗体分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、およびＩＤＯ（インドールアミン−２，３ジオキシゲナーゼ）から選択される阻害性（または免疫チェックポイント）分子の阻害剤と組み合わせて投与される。阻害性分子の阻害は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質レベルでの阻害によって行われ得る。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ３２ｂ分子は、当該技術分野において公知のＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２の１つまたは複数の阻害剤と組み合わせて投与される。阻害剤は、抗体、その抗原結合性フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであり得る。
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、国際公開第２０１５／１１２９００号パンフレットに開示される抗体、ＭＤＸ−１１０６、Ｍｅｒｃｋ ３４７５、またはＣＴ−０１１のうちのいずれかから選択される。一部の実施形態において、ＰＤ−１阻害剤は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合したＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の細胞外部分またはＰＤ−１結合性部分を含むイムノアドヘシン）である。一部の実施形態において、ＰＤ−１阻害剤は、ＡＭＰ−２２４である。一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。一部の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ、またはＭＤＸ−１１０５から選択される。ＢＭＳ−９３６５５９としても知られているＭＤＸ−１１０５は、国際公開第２００７／００５８７４号パンフレットに記載されている抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列は、それぞれ、配列番号２０および２１に示されている）は、国際公開第２０１０／０７７６３４号パンフレットに記載されている抗ＰＤ−Ｌ１である。
ＭＤＸ−１１０６−０４、ＯＮＯ−４５３８、またはＢＭＳ−９３６５５８としても知られているＭＤＸ−１１０６は、国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットに記載されている抗ＰＤ−１抗体である。ＭＫ−３４７５またはＳＣＨ−９００４７５としても知られているＭｅｒｃｋ ３７４５は、国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットに記載されている抗ＰＤ−１抗体である。ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、Ｃｕｒｅ Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレットに開示されている。他の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブである。ペンブロリズマブ（商標名Ｋｅｙｔｒｕｄａ（以前のランブロリズマブ）、ＭＫ−３４７５としても知られている）は、例えば、Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44に開示されている。ＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣＩｇ、Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ、例えば、国際公開第２０１０／０２７８２７号パンフレットおよび同第２０１１／０６６３４２号パンフレットに開示されている）は、ＰＤ−１とＢ７−Ｈ１との間の相互作用を遮断する、ＰＤ−Ｌ２ Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ−１抗体としては、とりわけ、例えば、米国特許第８，６０９，０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１００２８３３０号明細書、および／または同第２０１２０１１４６４９号明細書に開示されている抗ＰＤ−１抗体であるＡＭＰ ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）が挙げられる。
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ＭＤＸ−１１０６である。ＭＤＸ− １１０６の別名としては、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＯＮＯ−４５３８、ＢＭＳ−９３６５５８、またはニボルマブが挙げられる。一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４−９４−４）である。ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６とも称される、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）は、ＰＤ−１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ニボルマブ（クローン５Ｃ４）およびＰＤ−１に特異的に結合する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第８，００８，４４９号明細書および国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットに開示されている。ランブロリズマブ（ペンブロリズマブまたはＭＫ０３４７５とも称される、Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１抗体は、米国特許第８，３５４，５０９号明細書および国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットに開示されている。他の抗ＰＤ１抗体としては、とりわけ、例えば、米国特許第８，６０９，０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１００２８３３０号明細書、および／または同第２０１２０１１４６４９号明細書に開示されている抗ＰＤ１抗体であるＡＭＰ ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）が挙げられる。
ＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）は、ＰＤ−Ｌ１に結合する、ヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０ＡおよびＰＤ−Ｌ１に対する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号および米国公開第２０１２００３９９０６号明細書に開示されている。他の抗ＰＤ−Ｌ１結合物質としては、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、国際公開第２０１０／０７７６３４号パンフレットにおいて配列番号２０および２１に示されている）ならびにＭＤＸ−１１０５（ＢＭＳ−９３６５５９とも称され、例えば、国際公開第２００７／００５８７４号パンフレットに開示されている抗ＰＤ−Ｌ１結合物質である）が挙げられる。
一部の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃである。ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ａ０９−２４６−２とも称される、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ）は、ＰＤ−Ｌ１に結合するモノクローナル抗体である。ペンブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、国際公開第２０１３／０７９１７４号パンフレットに開示されている。
ＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣＩｇ、Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ、例えば、国際公開第２０１０／０２７８２７号パンフレットおよび同第２０１１／０６６３４２号パンフレットに開示されている）は、ＰＤ１とＢ７−Ｈ１との間の相互作用を遮断する、ＰＤ−Ｌ２ Ｆｃ融合可溶性受容体である。
一部の実施形態において、抗ＬＡＧ−３抗体は、ＢＭＳ−９８６０１６である。ＢＭＳ−９８６０１６（ＢＭＳ９８６０１６とも称される、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）は、ＬＡＧ−３に結合するモノクローナル抗体である。ＢＭＳ−９８６０１６および他のヒト化抗ＬＡＧ−３抗体は、米国特許出願公開第２０１１／０１５０８９２号明細書、国際公開第２０１０／０１９５７０号パンフレット、および同第２０１４／００８２１８号パンフレットに開示されている。
一実施形態において、阻害剤は、可溶性リガンド（例えば、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ）、またはＣＴＬＡ４に結合する抗体もしくは抗体フラグメントである。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体としては、トレメリムマブ（以前はチシリムマブとして知られていたＰｆｉｚｅｒから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、ＣＰ−６７５，２０６）、およびイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０としても知られているＣＴＬＡ−４抗体、ＣＡＳ番号４７７２０２−００−９）が挙げられる。
一実施形態において、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、−３、および／または−５）の阻害剤は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。癌胎児性抗原細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）、例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５は、少なくとも部分的に、抗腫瘍免疫応答の阻害を媒介すると考えられている（例えば、Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10、Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71、Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200、Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30、Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10、Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529を参照されたい）。例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１は、ＴＩＭ−３のヘテロ親和性リガンドとして、またＴＩＭ−３に媒介されるＴ細胞寛容およびＴ細胞消耗において役割を果たすとして記載されている（例えば、国際公開第２０１４／０２２３３２号パンフレット、Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＴＩＭ−３の同時遮断が、異種移植片結腸直腸がんモデルにおいて抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている（例えば、国際公開第２０１４／０２２３３２号パンフレット、Huang, et al. (2014)（上記）を参照されたい）。他の実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＰＤ−１の同時遮断は、例えば、国際公開第２０１４／０５９２５１号パンフレットに記載されているように、Ｔ細胞寛容を低減させる。例示的な抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体は、国際公開第２０１０／１２５５７１号パンフレット、国際公開第２０１３／０８２３６６号パンフレット、および国際公開第２０１４／０２２３３２号パンフレットに記載されており、例えば、モノクローナル抗体３４Ｂ１、２６Ｈ７、および５Ｆ４であるか、または例えば、米国特許出願公開第２００４／００４７８５８号明細書、米国特許第７，１３２，２５５号明細書、および国際公開第９９／０５２５５２号パンフレットに記載されているそれらの組換え形態である。他の実施形態において、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146）に記載されているように、ＣＥＡＣＡＭ−５に結合するか、例えば、国際公開第２０１３／０５４３３１号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１８号明細書に記載されているようにＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５と交差反応する。
抗ＣＤ３２ｂ抗体分子（単独または他の刺激剤との組合せ）とがん標準治療との例示的な組合せとしては、少なくとも以下のものが挙げられる。
放射線療法は、体外照射療法、内照射療法、組織内照射（implant radiation）、定位放射線手術、全身放射線療法、放射線療法、および恒久的もしくは一時的組織内近接照射療法を含むがこれらに限定されないいくつかの方法のうちの１つ、または方法の組合せを通じて施される。「近接照射療法」という用語は、体内の腫瘍または他の増殖性組織疾患部位またはそれらの付近に挿入された、空間的に制限された放射性物質によって送達される、放射線療法を指す。この用語は、限定することなく、放射性同位体（例えば、Ａｔ−２１１、Ｉ−１３１、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｓｍ−１５３、Ｂｉ−２１２、Ｐ−３２、およびＬｕの放射性アイソトープ）への曝露を含むことを意図する。本発明の細胞調節物質として使用するのに好適な放射線源には、固体および液体の両方が含まれる。非限定的な例として、放射線源は、放射性核種、例えば、固体源としてＩ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−１６９、Ｉｒ−１９２、固体源としてＩ−１２５であってもよく、または光子、ベータ粒子、ガンマ線、または他の治療用放射線を放出する他の放射性核種であってもよい。放射性材料はまた、放射性核種の任意の溶液、例えば、Ｉ−１２５もしくはＩ−１３１の溶液から作製された流体であってもよく、または放射性流体は、Ａｕ−１９８、Ｙ−９０などの固体放射性核種の小粒子を含有する好適な流体のスラリーを使用して生成してもよい。さらに、放射性核種は、ゲルまたは放射性マイクロスフェアに封入することもできる。
単独またはＣＤ３２ｂと共発現される細胞表面抗原に結合する抗体および／もしくは免疫調節剤（例えば、抗ＰＤ１抗体分子、抗ＬＡＧ３抗体分子、抗ＰＤ−Ｌ１、もしくは抗ＴＩＭ−３抗体分子）と組み合わせた抗ＣＤ３２ｂ抗体分子は、外科手術、放射線療法（例えば、照射の範囲が設計される三次元原体照射、局所照射（例えば、事前に選択した標的もしくは器官を対象とする照射）、または集束放射を伴う体外照射療法）を含むがこれらに限定されない、がんを治療するための既存のモダリティのうちの１つまたは複数と組み合わせて使用することができる。集束照射は、定位放射線手術、部分的定位放射線手術、および強度変調放射線療法からなる群から選択され得る。集束照射は、例えば、国際公開第２０１２／１７７６２４号パンフレットに記載されるように、粒子線（光子）、コバルト−６０（光子）、および線形加速装置（ｘ線）からなる群から選択される照射源を有し得る。
当業者には理解されるように、表１に記載されるものを含め、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組合せ療法は、上述の複数のクラスの薬剤を含む組合せ療法を含み得る。本発明の治療剤が、１つまたは複数の別の薬剤と一緒に投与される場合、２つ（またはそれ以上の）薬剤は、任意の順序で逐次的に投与されてもよく、または同時に投与されてもよい。一部の態様において、本発明の抗体は、１つまたは複数の他の薬剤または方法による治療法も受けている対象に投与される。他の態様において、結合性分子は、外科処置と併せて投与される。組合せ療法レジメンは、相加的であってもよく、または相乗的結果をもたらす場合もある。
診断的使用
一態様において、本発明は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の文脈において、または疾患もしくは障害を罹患している固体からの、ＣＤ３２ｂおよび／または核酸の発現、ならびにＣＤ３２ｂ機能を判定するための診断アッセイを包含する。
診断アッセイ、例えば、競合的アッセイは、標識した類似体（「トレーサー」）が、共通の結合パートナーにおける限られた数の結合部位に関して、試験サンプル検体と競合する能力に依存する。結合パートナーを、通常、競合の前または後に不溶化させ、次いで、結合パートナーに結合したトレーサーおよび検体を、未結合のトレーサーおよび検体から分離する。この分離は、デカンテーションによって（結合パートナーが事前に不溶化されている場合）または遠心分離によって（結合パートナーを競合反応の後に沈殿させた場合）達成される。試験サンプル検体の量は、マーカー物質の量によって測定される、結合したトレーサーの量に反比例する。試験サンプル中に存在する検体の量を定量的に判定するために、既知の量の検体による用量応答曲線を準備し、試験結果と比較する。これらのアッセイは、酵素を検出可能なマーカーとして使用する場合、ＥＬＩＳＡ系と称される。この形態のアッセイにおいて、抗体とＣＤ３２ｂ結合性抗体との間の競合的結合は、結合したＣＤ３２ｂ、好ましくは本発明のＣＤ３２ｂエピトープをもたらし、これが、血清サンプル中の中和抗体を含む、血清サンプル中の抗体の尺度である。
アッセイの顕著な利点は、測定が、中和抗体（すなわち、ＣＤ３２ｂ、具体的には、エピトープの結合と干渉する）に関して直接的に行われることである。そのようなアッセイは、特に、ＥＬＩＳＡ試験の形態で、臨床環境および慣例的な血液スクリーニングにおいて、相当な用途を有する。
ＣＤ３２ｂと関連する障害を有する患者の臨床診断またはモニタリングにおいて、正常な対象に由来する対応する生物学的サンプルにおけるレベルと比較して、上昇したレベルのＣＤ３２ｂタンパク質またはｍＲＮＡの検出は、ＣＤ３２ｂと関連する障害を有する患者の指標である。
インビボでの診断または撮像は、米国特許出願公開第２００６／００６７９３５号明細書に記載されている。簡単に述べると、これらの方法は、一般に、患者に、非侵襲的な方法によって検出可能なマーカーまたはラベルに作動可能に連結された、診断有効量のＣＤ３２ｂ結合性抗体分子を、投与または導入することを含む。抗体−マーカーコンジュゲートを、十分な時間、局在化させ、ＣＤ３２ｂに結合させる。患者を、次いで、検出デバイスに曝露して、検出可能なマーカーを特定し、それによって、患者の組織におけるＣＤ３２ｂ結合性分子の位置の画像を形成する。ＣＤ３２ｂ結合性抗体またはその抗原結合性フラグメントの存在は、抗体−マーカーが組織の成分に結合するかどうかを判定することによって、検出される。正常な固体と比較して、増加したレベルのＣＤ３２ｂタンパク質またはタンパク質の組合せの検出は、ＣＤ３２ｂと関連する障害の素因および／または発症を示し得る。本発明のこれらの態様はまた、組織撮像方法ならびに診断方法および治療方法の組合せにおいて使用するためでもある。
本発明はまた、診断アッセイ、予後診断アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床試験のモニタリングを、予後診断（予測）の目的で使用して、それによって個体を予防的に治療する、予測医薬の分野にも関する。
本発明はまた、個体が、ＣＤ３２ｂの制御不全と関係する障害を発症する危険性にあるかどうかを判定するための予後診断（または予測）アッセイも提供する。例えば、ＣＤ３２ｂ遺伝子における変異を、生物学的サンプルにおいてアッセイすることができる。そのようなアッセイは、予後診断または予測目的で使用され、それによって、ＣＤ３２ｂ、核酸の発現または活性を特徴とするかまたはこれらと関連する障害の発症前に、個体を予防的に治療することができる。
本発明の別の態様は、個体におけるＣＤ３２ｂの核酸発現またはＣＤ３２ｂの活性を判定し、それによって、その個体に適した治療剤または予防剤を選択するための方法を提供する（本明細書において、「薬理ゲノミクス」と称される）。薬理ゲノミクスにより、個体の遺伝子型（例えば、特定の薬剤に対して個体が応答する能力を判定するために試験される、個体の遺伝子型）に基づいて、個体の治療的治療または予防的治療の薬剤（例えば、薬物）の選択を可能にする。
本発明のさらに別の態様は、臨床試験においてＣＤ３２ｂの発現または活性に対する薬剤（例えば、薬物）の影響をモニタリングする方法を提供する。
医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された、ＣＤ３２ｂ結合性抗体またはその結合性フラグメントを含む、医薬組成物を提供する。組成物は、ＣＤ３２ｂ関連疾患（例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、小型リンパ球性リンパ腫、びまん性小型切れ込み細胞型リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、および濾胞性リンパ腫を含む、Ｂ細胞性悪性腫瘍、ならびに全身性軽鎖アミロイドーシスを含む他の疾患）を治療または予防するのに好適な１つまたは複数の他の治療剤を追加で含有し得る。薬学的に許容される担体は、組成物を増強もしくは安定させるか、組成物の調製を容易にし得る。薬学的に許容される担体としては、生理学的に適合性のある溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。
本発明の医薬組成物は、当該技術分野において公知の様々な方法によって投与され得る。投与の経路および／または様式は、所望される結果に応じて変動する。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、もしくは皮下であり得るか、または標的の部位の近傍に投与されてもよい。薬学的に許容される担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に好適なものであるべきである。投与の経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、二重特異性分子、および多重特異性分子は、化合物を不活性化し得る酸の作用および他の自然条件から、化合物を保護するような材料にコーティングされ得る。
組成物は、滅菌かつ流体であるべきである。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの事例において、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール類、例えば、マンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを、組成物中に含めることが好適である。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含めることによって、もたらすことができる。
本発明の医薬組成物は、当該技術分野において周知であり、慣例的に実施されている方法に従って調製することができる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000およびSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件下において製造される。典型的には、治療有効用量または治療効果用量のＣＤ３２ｂ結合性抗体が、本発明の医薬組成物において用いられる。ＣＤ３２ｂ結合性抗体は、当業者に公知の従来的な方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化される。投薬レジメンは、所望される最適な応答（例えば、治療応答）をもたらすように調節される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、複数回の分割用量が経時的に投与されてもよく、または用量は、治療状況の緊急性によって示されるように比例的に低減もしくは増加されてもよい。投与の容易さおよび投薬の均一性のため、非経口組成物を投薬単位形態で製剤化することが、特に有利である。本明細書において使用される投薬単位形態は、治療しようとする対象にとって単一投薬量として好適な物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体とともに、所望される治療効果をもたらすように計算された、所定の量の活性化合物を含有する。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとって毒性とはならず、特定の患者、組成物、および投与様式に所望される治療応答を達成するのに有効な活性成分の量が得られるように、変動し得る。選択される投薬量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、用いられる特定の化合物の排出速度、治療の期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態、およびこれまでの病歴、ならびに同等の因子を含む、様々な薬物動態因子に依存する。
医師または獣医師は、医薬組成物中に用いられる本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントの投薬量を、所望される治療効果を達成するために必要なものよりも低いレベルで開始し、所望される効果が達成されるまで、投薬量を徐々に増加させることができる。一般に、本明細書に記載されるアレルギー性炎症障害の治療に有効な本発明の組成物の用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の医薬、および治療が予防的であるか治療的であるかを含む、多数の異なる因子に応じて変動する。治療投薬量は、安全性および有効性を最適化するために、滴定する必要がある。抗体の全身投与については、投薬量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／宿主体重ｋｇ、より一般的には０．０１〜１５ｍｇ／宿主体重ｋｇの範囲に及ぶ。例示的な治療レジメンは、２週間に１回、または１カ月に１回、または３〜６カ月ごとに１回の全身投与を伴う。
抗体は、通常、複数回投与される。単回の投薬の間の間隔は、週ごと、月ごと、または年ごとであり得る。間隔はまた、患者においてＣＤ３２ｂ結合性抗体の血中レベルを測定することによって示されるように、不規則であってもよい。全身投与の一部の方法において、投薬は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、一部の方法では２５〜５００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調節される。あるいは、抗体は、持続放出製剤として投与されてもよく、その場合、必要とされる投与の頻度はより低くなる。投薬量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変動する。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体のものよりも長い半減期を示す。投薬量および投与の頻度は、治療が予防的であるか治療的であるかに応じて変動し得る。予防的適用においては、比較的低い投薬量が、比較的低頻度の間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は、残りの寿命の間、治療を受け続ける。治療的適用においては、疾患の進行が低減または停止されるまで、好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的または完全な緩和を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い投薬量が、必要とされることが多い。その後、患者は、予防的レジメンを投与されてもよい。
以下の実施例は、本発明をさらに例証するために提供されるものであり、その範囲を制限するものではない。本発明の他の変化形は、当業者には容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲によって包含される。
[実施例１]
ＣＤ３２ｂ抗体の特定
ＭｏｒｐｈｏｓｙｓのＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージライブラリーパニングにより得られる抗体
ヒトＣＤ３２ｂ（ヒトＦＣＧＲ２Ｂ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ３１９９４、アミノ酸４３〜２２２（配列番号６８０）、ＡＰＰおよびａｖｉタグを有する）を特異的に認識するが、ヒトＣＤ３２ａ−Ｒ（ヒトＦＣＧＲ２Ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ１２３１８バリアントＨ１６７Ｒ、アミノ酸３４〜２１８（配列番号６８１）、ＡＰＰおよびａｖｉタグを有する）は認識しない抗体の選択のために、ＭｏｒｐｈｏｓｙｓのＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリーを使用した。ファージミドライブラリーは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）の概念（Knappik et al., 2000, J Mol Biol 296: 57-86）に基づくものであり、ファージ表面におけるＦａｂの提示のためのＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を用いる（国際公開第０１／０５９５０号パンフレット）。液相パニング戦略を使用して、最終的にヒトＣＤ３２ｂ特異的抗体が得られるパニング戦略を選択した。
ヒトＣＤ３２ｂにおける液相パニング
ビオチン標識したヒトＣＤ３２ｂを使用して、抗原選択プロセスを、３回にわたって行った。ファージ溶液を、ブロッキング試薬でブロッキングした後、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎをコーティングしたウェルにおいて可能性のあるＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ結合物質の溶液を枯渇させた。回収したファージを、ビオチン標識したヒトＣＤ３２ｂとともに１時間インキュベートした後、ファージ−抗原複合体を、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎコーティングウェルに捕捉した。未結合のファージを、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎを補充したＰＢＳ）を使用して洗い流した後、ＰＢＳを使用して洗い流した。特異的に結合したファージの溶出のために、２５ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を、室温で１０分間添加した。ＤＴＴ溶出液を、大腸菌（エシェリキア・コリ（Escherichia coli））ＴＧ−Ｆ＋細胞の感染に使用した。感染させた後、細菌を、遠心分離し、ペレットを、１００ｍｌ ２ＹＴ（酵母−トリプトン）培地／Ｃａｍ（クロラムフェニコール）／１％グルコース中に再懸濁させ、３７℃で一晩インキュベートし、２２０ｒｐｍで振盪（shcacked）させた。一晩培養したものを、ファージレスキュー、選択したクローンのポリクローナル増幅、および次回のファージ産生に使用した。２回目および３回目の液相パニングを、１回目のプロトコルに従って行ったが、より洗浄条件がストリンジェントあったことを除く。
ヒトＣＤ３２ａ−Ｒに結合するものではなく、ヒトＣＤ３２ｂに特異的な抗体を選択するために、４回目の解析パニングを行った。４回目は、３回目のヒトＣＤ３２ｂに関するパニングの出力に基づくものであり、３つすべての異なるタンパク質に対して行った。この４回目の解析の出力には、古典的なＥＬＩＳＡスクリーニングではなく、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析をかけた。
ＥＬＩＳＡスクリーニング
ＥＬＩＳＡスクリーニングを使用して、ヒトＣＤ３２ｂに特異的に結合し、ヒトＣＤ３２ａ−Ｒには特異的に結合しない単一のＦａｂクローンを特定した。Ｆａｂは、Ｆａｂを含有する大腸菌（E. coli）粗ライセートを使用して試験する。
ヒトＣＤ３２ｂ抗原結合性Ｆａｂフラグメントの特定のために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）（Ｎｕｎｃ）３８４ウェルプレートに、１０ｕｇ／ｍｌのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎをコーティングした後、ビオチン標識した抗原：ヒトＣＤ３２ｂおよびヒトＣＤ３２ａ−Ｒを添加した。プレートをＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋでブロッキングした後、Ｆａｂを含有する大腸菌（E. coli）ライセートを、添加した。Ｆａｂの結合を、ＡＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＦａｂ特異的抗体（Ｆａｂ形式）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって検出した。ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質を添加し、５３５ｎｍでの蛍光放出を、４３０ｎｍでの励起で記録した。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析
４回目の解析パニングのＤＮＡを抽出し、ＨＣＤＲ３領域を、２回の連続したＰＣＲ反応において増幅させた。ＰＣＲ反応はまた、ＰＣＲフラグメントの３’末端および５’末端にＩｌｌｕｍｉｎａのアダプター配列を付加するためにも使用した。加えて、シーケンシング反応のためにサンプルを倍増させるために、Ｉｌｌｕｍｉｎａインデックスを、一方のアダプター領域に付加した。
ＦａｓｔＱ形式の未加工データを使用して、アミノ酸配列を抽出し、配列をアライメントし、個々の配列の発生を計数した。異なるパニング戦略に由来する個々のクローンの発生を比較することによって、所望される結合プロファイル（ヒトＣＤ３２ｂが濃縮されており、ヒトＣＤ３２ａ−Ｒが枯渇している）を有するクローンを、特定することができる。
目的とされるクローンを、ポリクローナル出力プールから、アセンブリＰＣＲによって単離した。軽鎖および重鎖に隣接するプライマー、ならびにＨＣＤＲ３特異的プライマーを使用して、所望されるクローンを回収した。
ＩｇＧへの変換およびＩｇＧの発現
ＣＡＰ−Ｔ細胞において完全長ＩｇＧを発現させるために、重鎖の可変ドメインフラグメント（ＶＨ）および軽鎖の可変ドメインフラグメント（ＶＬ）を、Ｄｉｓｐｌａｙベクター（ｐＭＯＲＰＨｘ３０）から、ヒトＩｇＧ１に適切なｐＭｏｒｐｈ（登録商標）＿ｈＩｇベクターにサブクローニングした。細胞培養上清を、トランスフェクションの７日後に採取した。滅菌濾過した後、溶液を、液体ハンドリングステーションを使用して、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーに供した。サンプルを、５０ｎＭクエン酸、１４０ｎＭ ＮａＯＨ中に溶出させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液でｐＨを中和し、滅菌濾過した（細孔サイズ０．２μｍ）。タンパク質濃度を、ＵＶ−分光光度計によって２８０ｎｍで判定し、ＩｇＧの純度を、変性還元条件下において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
パニング戦略およびスクリーニングの概要
古典的なファージディスプレイパニングに続いてＥＬＩＳＡスクリーニングを行うことに加えて、４回目の解析パニングを使用し、続いてＮＧＳ分析を行うという新しいアプローチを行った。古典的なアプローチを使用して、２つの抗体：ＮＯＶ０２８１およびＮＯＶ０３０８が特定された。新規なＮＧＳ分析アプローチを使用して、さらに３つの抗体：ＮＯＶ０５６３、ＮＯＶ０６２７、およびＮＯＶ０６２８（以下に記載される）が特定された。
[実施例２]
ＮＯＶ０６２７およびＮＯＶ０６２８の操作
ＮＯＶ０６２８のフレームワーク領域を生殖細胞系列化して、最も近似するヒト生殖細胞系列（ＶＨ３−２３およびＶラムダ−３ｊ）にした。加えて、ＣＤＲ−Ｈ２における潜在的なアスパラギン酸（asparate）異性化部位（ＳＹＤＧＳＥ）を、ＤＧからＤＡに変化させて、抗体ＮＯＶ１２１８を得、ＤＧからＥＧに変化させて、抗体ＮＯＶ１２１９を得た。
ＮＯＶ０６２７のフレームワーク領域を生殖細胞系列化して、最も近似するヒト生殖細胞系列（ＶＨ１−６９およびＶラムダ−３ｊ）にして、抗体ＮＯＶ１２１６を得た。哺乳動物においてＩｇＧで発現させたＮＯＶ１２１６のキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）分析により、抗体が、未修飾、＋８０ダルトン、および＋１６０ダルトンの３つの主要な種として存在していたことが明らかとなった（図１、表２）。ＣＺＥ分析は、未コーティングの溶融シリカキャピラリーを用いてＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰＡ８００ Ｅｎｈａｎｃｅｄ機器において行った。キャピラリーの全長は、４０ｃｍであり、内径は５０μｍであり、注入口から検出装置までのキャピラリーの長さは３０ｃｍである。電気泳動の泳動緩衝液は、２ｍＭトリエチレンテトラミンおよび０．０３％ポリソルベート２０を有する４００ｍＭの６−アミノカプロン酸／酢酸（ｐＨ５．７）からなる。１ｍｇ／ｍＬのサンプルを、１５℃でオートサンプラーに保持し、０．５ｐｓｉで１２秒間注入した。分離を、２５℃で３０分間、分離電圧２０ｋＶで行った。検出は、２１４ｎｍでのＵＶ吸光によって行った。注入の間に、キャピラリーには、２０ｐｓｉで３分間、電気泳動の泳動緩衝液を流した。
哺乳動物によりＩｇＧ形式で発現させたＮＯＶ１２１６の質量分析により、ＣＤＲ−Ｈ３（ＥＱＤＰＥＹＧＹＧＧＹＰＹＥＡＭＤＶ、配列番号１５９）における４つのチロシンのうちの１つが、硫酸化を介した翻訳後修飾を受けやすいことが明らかとなった。これは、＋８０ダルトン種および＋１６０ダルトン種の源であるという仮説を立てた。ＣＤＲ−Ｈ３における特定の残基を変異させることによって、ＰＴＭを除去する試みを開始した。チロシン硫酸化に関する共通の認識配列は存在しないが、酸性アミノ酸または小型アミノ酸が隣接しているチロシンは、硫酸化をより受けやすいという報告がある（Nedumpully-Govindan et al., 2014, Bioinformatics 30:2302-2309）。表３は、生成したＣＤＲ−Ｈ３変異体の概略を示す。簡単に述べると、酸性アミノ酸および小型アミノ酸が隣接している１つ目のチロシンを、フェニルアラニン（ＮＯＶ２１０６）、アラニン（ＮＯＶ２１０７）、およびセリン（ＮＯＶ２１０８）と交換し、２つ目から４つ目のチロシンを、フェニルアラニン（ＮＯＶ２１０９、２１１０、２１１１）と交換した。加えて、１つ目のチロシンの前にある２つの酸性アミノ酸を、セリンと交換した（ＮＯＶ２１１２および２１１３）。
表３に概説したＣＤＲ−Ｈ３変異体のキャピラリーゾーン電気泳動を、図２および表４に要約する。１つ目のチロシンと、フェニルアラニン（ＮＯＶ２１０６）、アラニン（ＮＯＶ２１０７）、またはセリン（ＮＯＶ２１０８）との置換えにより、硫酸化事象を防止することに成功し、＋８０ダルトンおよび＋１６０ダルトンの修飾形態を欠くＩｇＧ１抗体が得られた。残りのＣＤＲ−Ｈ３変異体は、ＮＯＶ１２１６と一致する様式で＋８０ダルトン種および＋１６０ダルトン種を保持し、ＣＤＲ−Ｈ３における１つ目のチロシンのみが修飾されていたという仮説を裏付けた。同様に、１つ目のチロシンの前の２つ目の酸性アミノ酸の変異（ＮＯＶ１２１３）によって、＋８０種および＋１６０種が解決されることはなかった。１つ目のチロシンの前の１つ目のアミノ酸の変異（ＮＯＶ１２１２）は、チロシン硫酸化を防止することはなかったが、＋１６０Ｄａによって修飾された画分を低減させた（図２、表４）。
[実施例３]
非フコシル化ＩｇＧ抗体の産生
ＧｌｙｍａｘＸ技術（Ｐｒｏｂｉｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ．）を適用することによって、非フコシル化ＩｇＧ抗体を産生させた。手短に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、抗体の軽鎖および重鎖の両方をコードする発現プラスミドを一過的にトランスフェクトした。同時に、酵素ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（Ｐｒｏｂｉｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎによって提供されている「ＲＭＤ」、「偏向酵素（deflecting enzyme）」）をコードする発現プラスミドを、細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションが成功した細胞における酵素の活性により、フコースのデノボ合成経路の阻害がもたらされる。酵素およびＩｇＧ遺伝子の両方を発現する細胞は、非フコシル化ＩｇＧタンパク質を産生する。ポリエチレンイミンを、トランスフェクション試薬として使用した。細胞培養上清を、遠心分離によって採取し、ＩｇＧタンパク質を、ポリッシングのためにプロテインＡおよびサイズ排除分取を使用した標準的なクロマトグラフィー方法によって精製した（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥ、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅおよびＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ）。ＩｇＧの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは変性条件下、還元条件下、および非還元条件下において、ならびにＨＰ−ＳＥＣによってそのままの状態で、分析した。コアフコースのないＮ−グリカン構造を有する重鎖の割合を、質量分析法によって判定した。
非フコシル化ＩｇＧ抗体は、ＣＨＯ細胞によっても産生した。ＣＨＯ細胞を、アミノ酸、ビタミン類、および微量のエレメントを富化した化学的に定義された培地（１０ｎＭ ＭＴＸを有する培養培地）を含有するシェーカーにおいて培養した。バッチ培養を、３７℃の温度で、振盪させながら行った。１４日間のバッチ培養プロセスの後、バッチ培養物のサンプルを採取して、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存率分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、生存細胞の密度および生存率を判定し、細胞培養培地におけるタンパク質力価を判定した。バッチの終了時（１４日目）に、培養プロセスを停止させた。振盪フラスコ（３０ｍｌ培養物）から条件培地を採取し、０．２２μｍ Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルターを使用して濾過した。
ＩｇＧタンパク質を、ポリッシングのためにプロテインＡおよびサイズ排除分取を使用した標準的なクロマトグラフィー方法によって精製した（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥ、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅおよびＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ）。ＩｇＧの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは変性条件下、還元条件下、および非還元条件下において、ならびにＨＰ−ＳＥＣによってそのままの状態で、分析した。コアフコースのないＮ−グリカン構造を有する重鎖の割合を、質量分析法によって判定した。
[実施例４]
ｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体の、ｈｕＣＤ３２ａまたはｈｕＣＤ３２ｂバリアントを発現するＣＨＯ細胞への結合
ｈｕＣＤ３２ｂおよびｈｕＣＤ３２ａは、高い度合いの配列相同性を有する。ｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体の特異性を評価するために、それらの結合を、野生型ｈｕＣＤ３２ａバリアント（すなわち、ｈｕＣＤ３２ａＨ１３１もしくはｈｕＣＤ３２ａＲ１３１）または野生型ヒトＣＤ３２ｂ１を発現する安定なＣＨＯ細胞株を使用して、フローサイトメトリーによって評価した。ＣＨＯ細胞を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳでの脱離後に採取し、ペレットにした。細胞ペレットを、ＰＢＳ中で１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ１倍、２％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ ＮａＮ３を含有）中に再懸濁させ、計数し、１ｍｌ当たり０．２５×１０６個の細胞で懸濁させた。５０，０００個の細胞／ウェル（２００μｌ）を、次いで、Ｖ底９６ウェルプレートに分注した。プレートを、１６００ｒｐｍで５分間遠心させ、上清を廃棄した。細胞を、次いで、示される濃度のｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体（すべてヒトＩｇＧ１［Ｎ２９７Ａ］スキャフォールド）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回続けて洗浄した後、細胞を、１／１００希釈のＦ（ａｂ’）２抗ヒトＦ（ａｂ’）２−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、番号１０９−１１６−０９７）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、４℃で３０分間、さらにインキュベートした。細胞を２回洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで取得した（生細胞ゲートにおいて５０００個の細胞の取得）。幾何平均蛍光（ＰＥチャネルにおけるＧＭＦＩ）を、各抗体の結合強度の尺度として使用した。図３は、ｈｕＣＤ３２ｂとｈｕＣＤ３２ａバリアントとの間で異なる程度の区別を呈するｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体の例を示す。すべてのｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体は、ｈｕＣＤ３２ａバリアントよりもｈｕＣＤ３２ｂに対してより頑強な結合を有する。
[実施例５]
ＨｕＣＤ３２ｂ結合性抗体の、ＨｕＣＤ１６バリアントおよびＨｕＣＤ６４を発現するＣＨＯ細胞への結合
ｈｕＣＤ３２ｂ特異性抗体を、低親和性ヒトＣＤ１６バリアント（すなわち、ｈｕＣＤ１６ａまたはｈｕＣＤ１６ｂバリアント）および高親和性ｈｕＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）を発現する安定なＣＨＯ細胞株を使用して、フローサイトメトリーによって評価した。ｈｕＣＤ１６ａバリアントをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に、表面発現を可能にするために、共通Ｆｃγ鎖もトランスフェクトした。ＣＨＯ細胞を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳでの脱離後に採取し、ペレットにした。細胞ペレットを、ＰＢＳ中で１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ１倍、２％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ ＮａＮ３を含有）中に再懸濁させ、計数し、１ｍｌ当たり０．２５×１０６個の細胞で懸濁させた。５０，０００個の細胞／ウェル（２００μｌ）を、次いで、Ｖ底９６ウェルプレートに分注した。プレートを、１６００ｒｐｍで５分間遠心させ、上清を廃棄した。次いで、細胞を、示される濃度のｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体（すべて、ヒトＩｇＧ１［Ｎ２９７Ａ］スキャフォールド）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回続けて洗浄した後、細胞を、１／１００希釈のＦ（ａｂ’）２抗ヒトＦ（ａｂ’）２−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、番号１０９−１１６−０９７）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、４℃で３０分間、さらにインキュベートした。細胞を２回洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで取得した（生細胞ゲートにおいて５０００個の細胞の取得）。幾何平均蛍光（ＰＥチャネルにおけるＧＭＦＩ）を、各抗体の結合強度の尺度として使用した。試験したすべてのｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体は、ｈｕＣＤ１６バリアントを発現するＣＨＯ細胞に対して反応性を呈さず、高親和性ｈｕＣＤ６４受容体に対しては部分的な用量依存的結合を呈した（図４）。ｈｕＣＤ６４受容体への用量依存性結合は、抗体のエピトープ特異性とは独立して生じたため、試験した抗体のＦｃ部分とｈｕＣＤ６４の高親和性Ｆｃ結合性ドメインとの結合を介して生じた可能性が高いが、ＣＨＯ−ｈｕＣＤ６４細胞とヒトＩｇＧ１との事前インキュベーションによって遮断された（データは示されない）。
[実施例６]
ヒトＣＤ３２ｂ結合性抗体のヒト初代Ｂ細胞への結合
ＣＤ３２ｂは、Ｂ細胞に発現される唯一のＦｃ受容体である。ｈｕＣＤ３２ｂ特異的抗体の、初代ヒトＢ細胞への結合を、ヒトＢ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号１９０５４）を供給業者の説明に従って使用して、陰性選択によって軟膜から単離した精製されたＢ細胞に対するフローサイトメトリーによって評価した。精製されたＢ細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ１倍、２％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有）中に懸濁させ、計数し、１ｍｌ当たり０．５×１０６個の細胞で懸濁させた。１００，０００個の細胞／ウェル（２００μｌ）を、次いで、Ｖ底９６ウェルプレートに分注した。プレートを、１５００ｒｐｍで５分間遠心させ、上清を廃棄した。細胞を、次いで、示される濃度のビオチン標識したｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体（すべて、ヒトＩｇＧ１［Ｎ２９７Ａ］スキャフォールド）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、４℃で２０分間インキュベートした。抗体のビオチン標識は、Ｉｎｎｏｖａ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＬｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋビオチンコンジュゲーションキット（Ａ型）（カタログ番号７０４−００１０）を供給業者の説明に従って使用して、行った。ＦＡＣＳ緩衝液で２回続けて洗浄した後、細胞を、１／５００希釈のストレプトアビジン−ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓ２１３８８）および１μｌのＡＰＣコンジュゲート抗ｈｕＣＤ２０抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０２３１０からのクローン２Ｈ７）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、４℃で２０分間さらにインキュベートした。細胞を２回洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで取得した。ＣＤ２０＋Ｂ細胞ゲートでの幾何平均蛍光（ＰＥチャネルにおけるＧＭＦＩ）を、各抗体の結合強度の尺度として使用した。すべてのｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体が、ヒトＢ細胞への頑強な結合を呈し、ＮＯＶ１２１６、ＮＯＶ０２８１、およびＮＯＶ０３０８が、最も高い結合親和性を有した（それぞれ、１．４、５．４、および８．７ｎＭ、図５）。
[実施例７]
ｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体のヒトＢＪＡＢ細胞への結合
ｈｕＣＤ３２ｂ特異的抗体のＢＪＡＢ細胞株への結合を、フローサイトメトリーによって評価した。ＢＪＡＢ細胞を、採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ１倍、２％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有）中に懸濁させ、計数し、１ｍｌ当たり０．２５×１０６個の細胞で懸濁させた。５０，０００個の細胞／ウェル（２００μｌ）を、次いで、Ｖ底９６ウェルプレートに分注した。プレートを、１５００ｒｐｍで５分間遠心させ、上清を廃棄した。細胞を、次いで、示される濃度のビオチン標識したｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体（すべて、ヒトＩｇＧ１［Ｎ２９７Ａ］スキャフォールド）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、４℃で２０分間インキュベートした。抗体のビオチン標識は、Ｉｎｎｏｖａ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＬｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋビオチンコンジュゲーションキット（Ａ型）（カタログ番号７０４−００１０）を供給業者の説明に従って使用して、行った。ＦＡＣＳ緩衝液で２回続けて洗浄した後、細胞を、１／５００希釈のストレプトアビジン−ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓ２１３８８）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、４℃で２０分間、さらにインキュベートした。細胞を２回洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで取得した。幾何平均蛍光（ＰＥチャネルにおけるＧＭＦＩ）を、各抗体の結合強度の尺度として使用した。すべてのｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体が、親ＢＪＡＢ細胞への頑強な結合を呈し、ＮＯＶ１２１６、ＮＯＶ０２８１、ＮＯＶ０３０８、およびＮＯＶ０５６３が、最も高い結合親和性を有した（図６）。
[実施例８]
抗ヒトＣＤ３２ｂ結合性抗体によるエピトープ認識。
ａ）ＦＡＣＳ結合によるエピトープ分析
抗ＣＤ３２ｂ抗体の結合エピトープを特徴付けるために使用した、野生型および変異体のｈｕＣＤ３２ｂがトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の概要
野生型ヒトＣＤ３２ｂまたは以下に記載されるアミノ酸変異を含むＣＤ３２ｂを発現する安定なＣＨＯ細胞株を、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）技術を使用して生成した。安定な細胞のトランスフェクタントを、ハイグロマイシンＢを使用して選択した。ヒトＣＤ３２ｂの３Ｄ構造モデルにおいて黒色で強調されている残基は、ｈｕＣＤ３２ｂとｈｕＣＤ３２ａとの間で異なるアミノ酸を強調して示す（図７ａ）。ＥＤＩ１０３、ＥＤＩ１０４、ＥＤＩ１０５、ＥＤＩ１０６、およびＥＤＩ１０７ ＣＨＯ細胞は、示されているアミノ酸をヒトＣＤ３２ａにおける対応するアミノ酸に戻す特定のアミノ酸変異を有するｈｕＣＤ３２ｂを発現する。各細胞株における修飾されたアミノ酸を、対応する３Ｄ構造において白抜きの丸で強調表示し（Sondermann et al., The EMBO Journal (1999) 18, 1095-1103）、各細胞株について示す。ｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体の、これらの異なるｈｕＣＤ３２ｂバリアントへの結合の評価により、抗体によって認識される主要なエピトープ領域の特定が可能となる。ｈｕＣＤ３２ｂ構造の左側の部分を、エピトープＩとして定義したが、これは、ｈｕＣＤ３２ｂのＦｃ結合性ドメインに対応する。右側は、エピトープＩＩとして定義し、これは、Ｆｃ結合には関与しない。ＥＤＩ１０３、ＥＤＩ１０４、およびＥＤＩ１０５変異体において、エピトープＩＩを、ｈｕＣＤ３２ａと同一にすることによって破壊した（図７ａ）。ＥＤＩ１０６およびＥＤＩ１０７変異体においては、ｈｕＣＤ３２ｂのエピトープＩを、ｈｕＣＤ３２ａと同一にすることによって破壊した（図７ｂ）。
抗ｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体によって認識される結合エピトープを特徴付けるように設計されたＦＡＣＳ結合実験
ｈｕＣＤ３２ｂ特異的抗体の結合エピトープを、野生型ヒトＣＤ３２ｂまたは変異体ＣＤ３２ｂを発現する安定なＣＨＯ細胞株を使用して、フローサイトメトリーによって評価したが、ここで、Ｆｃ結合性ドメイン（エピトープＩ）もしくはＣＤ３２ｂ分子の反対側（エピトープＩＩ）において、ｈｕＣＤ３２ｂとｈｕＣＤ３２ａとの間で異なるアミノ酸は、特定のｈｕＣＤ３２ｂ残基をＣＤ３２ａにおける対応するアミノ酸に戻すことによって無効となった。ＥＤＩ１０３、ＥＤＩ１０４、およびＥＤＩ１０５ ＣＨＯバリアントは、エピトープ２のアミノ酸がｈｕＣＤ３２ａと同一なｈｕＣＤ３２ｂ変異体を発現し、一方でＥＤＩ１０６およびＥＤＩ１０７は、エピトープＩのアミノ酸がヒトＣＤ３２ａと同一であるｈｕＣＤ３２ｂを発現する（図７ａ）。ＣＨＯ細胞を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳでの脱離後に採取し、ペレットにした。細胞ペレットを、ＰＢＳ中で１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ１倍、２％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ ＮａＮ３を含有）中に再懸濁させ、計数し、１ｍｌ当たり０．２５×１０６個の細胞で懸濁させた。５０，０００個の細胞／ウェル（２００μｌ）を、次いで、Ｖ底９６ウェルプレートに分注した。プレートを、１６００ｒｐｍで５分間遠心させ、上清を廃棄した。次いで、細胞を、示される濃度のｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体（すべて、ヒトＩｇＧ１［Ｎ２９７Ａ］スキャフォールド）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回続けて洗浄した後、細胞を、１／１００希釈のＦ（ａｂ’）２抗ヒトＦ（ａｂ’）２−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、番号１０９−１１６−０９７）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、４℃で３０分間、さらにインキュベートした。細胞を２回洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで取得した（生細胞ゲートにおいて５０００個の細胞の取得）。幾何平均蛍光（ＰＥチャネルにおけるＧＭＦＩ）を、各抗体の結合強度の尺度として使用した。図８は、特定のｈｕＣＤ３２ｂ変異体を発現するＣＨＯ細胞に対する結合の低減に基づいて異なる結合エピトープを提示する、ｈｕＣＤ３２ｂ結合性抗体の例を示す。ＮＯＶ０２８１およびＮＯＶ１２１６は、エピトープＩが欠損したＥＤＩ１０６およびＥＤＩ１０７のｈｕＣＤ３２ｂ変異体への結合の低減を呈し、これらの抗体が、エピトープＩ（すなわち、Ｆｃ結合性ドメイン領域）を主に認識することを示す（図８ａ、図８ｂ）。抗体ＮＯＶ０５６３は、試験したすべてのｈｕＣＤ３２ｂ ＣＨＯバリアントに対して類似の結合を呈し、そのような抗体が、エピトープＩによってカバーされる領域とエピトープＩＩによってカバーされる領域との間のエピトープを認識するか、あるいは、ｈｕＣＤ３２ｂとｈｕＣＤ３２ａとの間の別の単一のアミノ酸相違を含む、本明細書においてエピトープＩＩＩと定義される３Ｄ ｈｕＣＤ３２ｂ構造の後ろにある追加の領域を認識するかのいずれかであることを示唆する（図８ｃ）。図８ａ、図８ｂ、および図８ｃにおける結合データの概要を、表５Ａに示す。
ＮＯＶ２１０８は、ＣＤ３２ｂ Ｆｃ結合性ドメイン（エピトープＩ）を認識する
ｈｕＣＤ３２ｂ特異的抗体ＮＯＶ２１０８およびＮＯＶ１２１６の結合エピトープを、野生型ヒトＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、または変異体ＣＤ３２ｂバリアントを発現する安定なＣＨＯ細胞株を使用して、フローサイトメトリーによって評価したが、ここで、Ｆｃ結合性ドメイン（エピトープＩ）もしくはＣＤ３２ｂ分子の反対側（エピトープＩＩ）において、ｈｕＣＤ３２ｂとｈｕＣＤ３２ａとの間で異なるアミノ酸は、特定のｈｕＣＤ３２ｂ残基をＣＤ３２ａにおける対応するアミノ酸に戻すことによって無効となった。ＥＤＩ１０３およびＥＤＩ１０５変異体において、エピトープＩＩは、ｈｕＣＤ３２ａと同一にすることによって破壊された（図７ａ）。ＥＤＩ１０６およびＥＤＩ１０７変異体においては、ｈｕＣＤ３２ｂのエピトープＩは、ｈｕＣＤ３２ａと同一にすることによって破壊された（図７ｂ）。接着ＣＨＯ細胞株を、ＤＭＥＭ（Ｌｏｎｚａカタログ番号１２−６０４Ｆ）、１０％ＦＢＳ（Ｓｅｒａｄｉｇｍ Ｐｒｏｄ．番号１５００−５００、ロット番号１１２Ｂ１５）、６００μｇ／ｍｌ ハイグロマイシンＢ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ １０６８７−０１０）において成長させた。コンフルエントな細胞を、ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａカタログ番号１７−５１６Ｆ）ですすぎ、培養液において０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ ２５２００−０５６）で処置することによって、採取した。脱離後に、細胞をペレットにし、ＰＢＳ中において１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ１倍、２％ＦＢＳ含有）中に再懸濁させた。各細胞株を、２×１０６個の細胞／ｍｌで再懸濁させた後、９６ウェルのｕ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ ３５１１７７）に、１００μｌ／ウェルでアリコートをとった。プレートを、１２００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、上清を廃棄した。次いで、細胞を、示される濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ａ２０１８６）ｈｕＣＤ３２ｂ反応性抗体（すべて、ヒトＩｇＧ１［Ｎ２９７Ａ］スキャフォールド）を含有する１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、４℃で３０分間インキュベートした。図３１については、１００ｕｇ／ｍｌで開始する１：１０の４点連続希釈物を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７標識したＮＯＶ１２１６およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７標識したＮＯＶ２１０８に関して調製した。各ＣＨＯ細胞株を、図に示されるように、１つの抗体とともに、別個にインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回続けて洗浄した後、細胞を、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させた。最後の洗浄の後、細胞を、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで取得した（生細胞ゲートで５０００個の細胞の取得）。幾何平均蛍光強度（ＡＦ６４７チャネルにおけるＧＭＦＩ）を、各抗体の結合強度の尺度として使用した。
ＮＯＶ２１０８およびＮＯＶ１２１６は、エピトープＩが欠損したＥＤＩ１０６およびＥＤＩ１０７のｈｕＣＤ３２ｂ変異体への結合の低減を呈し（図３１）、これらの抗体が、エピトープＩ（すなわち、Ｆｃ結合性ドメイン）を認識することを示す。いずれの抗体も、野生型ＣＤ３２ｂならびにエピトープＩＩが欠損したＥＤＩ１０３および１０５のｈｕＣＤ３２ｂ変異体に対して類似の結合を示し、エピトープＩＩが、２つの抗体の結合には必要ではないことが示された。結合データの概要を、表５Ｂに要約する。
ｂ）水素−重水素交換によるｈｕＣＤ３２ｂにおけるＮＯＶ２１０８のエピトープマッピング
質量分析法（ＭＳ）と組み合わせた水素−重水素交換（ＨＤｘ）（Woods VL, Hamuro Y (2001) High Resolution, High-Throughput Amide Deuterium Exchange-Mass Spectrometry (DXMS) Determination of Protein Binding Site Structure and Dynamics: Utility in Pharmaceutical Design. J. Cell. Biochem. Supp.; 84(37): 89-98）を使用して、ヒトＣＤ３２ｂ（アミノ酸１〜１７５）（配列番号６８２）におけるＦａｂ抗体ＮＯＶ２１０８の推定上の結合部位をマッピングした。ＨＤｘでは、タンパク質の交換可能なアミド水素を、重水素と置き換える。このプロセスは、タンパク質構造／動態および溶媒接触可能性に感受性であり、したがって、リガンド結合の際に重水素の取込みの減少を受ける位置を報告することが可能である。重水素取込みの変化は、直接的な結合およびアロステリック事象の両方に感受性である。
文献（Chalmers MJ, Busby SA, Pascal BD, He Y, Hendrickson CL, Marshall AG, Griffin PR (2006), Probing protein Ligand Interactions by Automated Hydrogen/deuterium Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem.; 78(4): 1005-1014）に記載されているものに類似の方法を使用して、ＨＤｘ−ＭＳ実験を行った。これらの実験において、ヒトＣＤ３２ｂ（アミノ酸１〜１７５）の重水素取り込みを、Ｆａｂ形式の抗体ＮＯＶ２１０８の不在下および存在下において、測定した。抗体の結合の際に重水素取込みの減少を示すヒトＣＤ３２ｂにおける領域（アミノ酸１〜１７５）は、エピトープに関与する可能性が高いが、測定の性質に起因して、直接的な結合部位とはかけ離れた変化を検出することも可能である（アロステリック作用）。通常、最も多くの量の保護を有する領域は、直接的な結合に関与するが、これは、常に必ずしもそうとは限らない場合がある。直接的な結合事象をアロステリック作用と区別するために、直交的測定（例えば、Ｘ線結晶構造解析、アラニン変異生成など）が必要とされる。
ヒトＣＤ３２ｂ（アミノ酸１〜１７５）のエピトープマッピング実験を、Ｗａｔｅｒｓ ＨＤｘ−ＭＳプラットフォームにおいて行ったが、これには、ＬＥＡＰオートサンプラー、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ、およびＳｙｎａｐｔ Ｇ２質量分析計が含まれる。重水素によるヒトＣＤ３２ｂ（アミノ酸１〜１７５）のタンパク質骨格の標識に使用した重水素緩衝液は、１２５ｍＭ ＰＢＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２であり、溶液中の重水素の全体的な割合は、９５％であった。抗体の不在下におけるヒトＣＤ３２ｂ（アミノ酸１〜１７５）重水素標識実験については、９μｌ体積の１７５ｐｍｏｌのヒトＣＤ３２ｂ（アミノ酸１〜１７５）を、１００μｌの重水素緩衝液を使用して、４℃で２５分間希釈した。次いで、標識化反応を、２℃で１００μｌの低温反応停止緩衝液を５分間使用して停止させた後、自動化ペプシン消化およびペプチド分析のために、ＬＣ−ＭＳ系に注入した。ＮＯＶ２１０８の存在下におけるヒトＣＤ３２ｂ（アミノ酸１〜１７５）の重水素標識実験については、１７５ｐｍｏｌのヒトＣＤ３２ｂ（アミノ酸１〜１７５）を、２１０ｐｍｏｌのＦａｂ形式のＮＯＶ２１０８抗体と、総体積９μｌで混合する。溶液を、次いで、４℃で２５分間、１００μｌの重水素緩衝液を使用して、希釈する。次いで、標識化反応を、２℃で１００μｌの低温反応停止緩衝液を５分間使用して停止させた後、自動化ペプシン消化およびペプチド分析のために、ＬＣ−ＭＳ系に注入した。
すべての実験は、最低３つの解析三連物を使用して行う。すべての重水素交換実験は、０．５Ｍ ＴＣＥＰおよび３Ｍ尿素（ｐＨ＝２．５）を使用して反応停止処理を行った。反応停止処理の後、抗原を、ＵＰＬＣ系に注入した。１２℃で配置されたペプシン消化に供した後、４０ｕＬ／分の流速で、Ｗａｔｅｒｓ ＣＳＨ Ｃ１８ １×１００ｍｍカラム（１℃に維持）で、８分間で２〜３５％の高速アセトニトリル勾配にかけた。
ヒトＣＤ３２ｂ（アミノ酸１〜１７５）については、配列の９４％を、図３２に示されるように、重水素交換実験によってモニタリングした。この図において、各バーは、すべての重水素交換実験においてモニタリングしたペプチドを表す。
抗体ＮＯＶ２１０８のＦａｂが結合した状態と未結合状態との間の差別的実験については、これら２つの状態間での重水素取込みにおける差を試験することが有益である。図３３において、負の値は、ヒトＣＤ３２ｂ抗体複合体が、ヒトＣＤ３２ｂと比較して、低い重水素取込みを受けることを示す。重水素取込みの減少は、領域の交換可能な重水素からの保護または水素結合ネットワークの安定化に起因し得る。対照的に、正の値は、複合体が、ヒトＣＤ３２ｂと比較して、高い重水素取込みを受けることを示す。重水素取込みの増加は、水素結合ネットワークの脱安定化（すなわち、タンパク質のアンフォールディングの局在化）に起因し得る。これらの実験において、ＮＯＶ２１０８ ＦａｂのＣＤ３２ｂへの結合に起因するいずれの有意な脱安定化も観察されなかった。
２つの異なる状態、例えば、未結合のヒトＣＤ３２ｂと、抗体ＮＯＶ２１０８と複合体を形成したヒトＣＤ３２ｂとの間における重水素交換の差別的変化を試験する場合、変化が有意であるかどうかを判定する方法を用いる。１つの方法（Houde et al., J Pharm Sci 100(6):2071-2086 (2011)）においては、差が０．５Ｄａ（図３３において破線で示される）よりも大きい限り、差は、有意であると考えられる。前述の方法を使用して、抗体ＮＯＶ２１０８ Ｆａｂの結合の際、アミノ酸１０７〜１２３（ＶＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦ（配列番号６８５））の単一の領域が、有意に保護された状態となる。これまでに公開されているデータは、いくつかの残基が、Ｆｃ結合にとって極めて重要であることを示唆する：アミノ酸１１２〜１１９（ＳＷＫＤＫＰＬＶ （配列番号６８６））およびアミノ酸１３３〜１３８（ＳＲＳＤＰＮＦ（配列番号６８７））（Hulett MD, Witort E, Brinkworth RI, McKenzie IF, and Hogarth PM. (1995), Multiple Regions of Human FcgRII (CD32) Contribute to the Binding of IgG. The J. Bio Chem.; 36 (270): 21188-21194）。アミノ酸１１２〜１１９（ＳＷＫＤＫＰＬＶ（配列番号６８６））の領域は、ＨＤｘ−ＭＳ実験において、ＮＯＶ２１０８結合によって保護される。１３３〜１３８（ＳＲＳＤＰＮＦ（配列番号６８７））に対応する領域は、ＨＤｘ−ＭＳ実験ではモニタリングすることができない。この領域は、Ｃ’／Ｅループに対応している。図３４において、抗体ＮＯＶ２１０８によって保護される領域（黒色）を、公開されているヒトＣＤ３２ｂ結晶構造にマッピングする（Sondermann P., Huber R. and Jacob U. (1999), Crystal structure of the soluble form of the human fcgamma-receptor IIb: a new member of the immunoglobulin superfamily at 1.7 Åresolution. The EMBO J.; 5(18):1095-1103）。この領域は、Ｂ／Ｃループ構造、ならびにＢ＋Ｃ β−シートを含む。これらのデータは、ＮＯＶ２１０８が、ＣＤ３２ｂ Ｆｃ結合性ドメインに結合することを示す機能性アッセイからの観察を裏付ける。
[実施例９]
ヒトＣＤ３２ｂ結合性抗体の、ある範囲のヒトＣＤ３２ｂ発現を特徴とする細胞への結合の判定。
抗ＣＤ３２ｂ抗体の、様々なレベルのＣＤ３２ｂ発現を特徴とする細胞への結合を判定するために、ＦＡＣＳ分析を、ｈｕＣＤ３２ｂを内因的に発現するＫＡＲＰＡＳ４２２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ０６１０１７０２）ヒトがん細胞株；ＢＪＡＢ （ＤＳＭＺ、ＡＣＣ ７５７）において行った。ＣＤ３２ｂおよびＣＤ２３ａを発現する安定なＣＨＯ細胞株もまた、評価し、ＣＤ３２ｂおよびＣＤ３２ａの両方を欠くＲＡＭＯＳ細胞も同様に評価した。接着ＣＨＯ細胞株については、細胞を、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ ２５２００−０５６）を有する培養液中で処理することによって、懸濁させた。細胞が剥離されたら、細胞を、ＭＡＣｓ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ １３０−０９１−２２２、ＢＳＡストック含有（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ １３０−０９１−３７６））で洗浄し、再懸濁させた。懸濁株（Ｋａｒｐａｓ４２２、ＢＪＡＢ、Ｒａｍｏｓ）細胞については、１１×１０６個の細胞を、遠心沈降させ、ＭＡＣｓ緩衝液で洗浄し、再懸濁させた。すべての細胞株を、４×１０６個の細胞／ｍｌに再懸濁させた後、９６ウェルの丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ ２９４４２−０６６）に５０μｌ／ウェルでアリコートをとった。Ａｌｅｘａ−６４７標識した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ａ２０１８６）Ｎ２９７Ａ抗体を１：３で７点連続希釈したものを、調製し、２５μｌを各ウェルに添加した。非標的化ＩｇＧ１［Ｎ２９７Ａスキャフォールド］抗体を、陰性対照として使用した。細胞を、抗体（すべて、ヒトＩｇＧ１［Ｎ２９７Ａ］スキャフォールド）とともに、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、次いで、７ＡＡＤ（ｅＢｉｏｃｉｅｎｃｅ ００−６９９３−５０）を含有する１００μｌのＭＡＣｓ緩衝液中に１０μｌ／ｍｌで再懸濁させ、ＢＤ ＦＡＣｓ Ｃａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。すべてのＣＤ３２ｂ陽性細胞株に関して、ＣＤ３２ｂ結合性抗体の結合は、用量依存性であった（図９）。抗体は、ＣＤ３２ｂ陰性のＲａｍｏｓ細胞株またはＣＨＯ＿ＣＤ３２ａ細胞株に対して、限られた結合を呈した。想定した通り、非標的化アイソタイプ対照抗体は、細胞に結合しなかった。
[実施例１０]
ＣＤＲ−Ｈ３変異体ヒトＣＤ３２ｂ結合性抗体の、ある範囲のヒトＣＤ３２ｂ発現、ＣＤ３２ａ発現、またはいずれのＦｃγ受容体も発現しないことを特徴とする細胞への結合の判定
ＣＤＲ−Ｈ３変異体抗ＣＤ３２ｂ抗体の細胞への結合を判定するために、ＦＡＣＳ分析を、ｈｕＣＤ３２ｂを内因的に発現するＫＡＲＰＡＳ４２２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ０６１０１７０２）、ＤＡＵＤＩ（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２１３）、および親ＢＪＡＢ（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ ７５７）ヒトがん細胞株、ならびにＣＤ３２ｂを発現する安定なＢＪＡＢ細胞株およびＣＨＯ細胞株において行った。ＣＤ３２ａを発現する安定なＣＨＯ細胞株もまた、評価し、ＣＤ３２ｂおよびＣＤ３２ａの両方を欠く親ＣＨＯ細胞も同様に評価した。
ＫＡＲＰＡＳ４２２、ＤＡＵＤＩ、およびＢＪＡＢ細胞株については、１１×１０６個の細胞を、遠心沈降させ、ＭＡＣｓ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ １３０−０９１−２２２、ＢＳＡストック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ １３０−０９１−３７６）含有）で洗浄し、再懸濁させた。接着ＣＨＯ細胞株については、細胞を、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ ２５２００−０５６）を有する培養液中で処理することによって、懸濁させた。細胞が剥離されたら、細胞を、ＭＡＣｓ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ １３０−０９１−２２２、ＢＳＡストック含有（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ １３０−０９１−３７６））で洗浄した後、再懸濁させた。すべての細胞株を、４×１０６個の細胞／ｍｌに再懸濁させた後、９６ウェルの丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ ２９４４２−０６６）に５０μｌ／ウェルでアリコートをとった。Ａｌｅｘａ−６４７標識した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ａ２０１８６）抗体（すべて、ヒトＩｇＧ１［Ｎ２９７Ａ］スキャフォールド）を１：３で８点連続希釈したものを、調整し、２５μｌを各ウェルに添加した。非標的化抗体（ヒトＩｇＧ１［Ｎ２９７Ａ］スキャフォールド）を、陰性対照として使用した。細胞を、抗体とともに氷上で３０分間インキュベートし、次いで、洗浄し、７ＡＡＤ（ｅＢｉｏｃｉｅｎｃｅ ００−６９９３−５０）を含有するＭＡＣｓ緩衝液中に１０μｌ／ｍｌで再懸濁させ、Ｎｏｖｏｃｔｙｅ ３０００（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１００１１）で分析した。サンプルごとのシグナルの幾何平均を、Ｗｅａｓｅｌソフトウェアを使用して判定した。すべてのヒトＣＤ３２ｂ陽性細胞株については、ＨＣＤ−Ｒ３変異体ＮＯＶ２１０７およびＮＯＶ２１０８が、最も頑強な結合を示し、これは、親抗体ＮＯＶ１２１６に類似していた（図１０）。試験したすべての抗体について、ヒトＣＤ３２ａがトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対しては、ヒトＣＤ３２ｂを発現する細胞と比較して、最低限の結合しか観察されず、ＣＤ３２ａ／ＣＤ３２ｂヌルＣＨＯ親細胞に対しては結合が全くなかった／最低限しかなかった。これらのデータは、抗体のヒトＣＤ３２ｂへの特異性を示す。
[実施例１１]
Ｆｃ野生型抗ＣＤ３２ｂ抗体によって媒介される、初代ＮＫ細胞により作動されるＪｅｋｏ−１がん細胞株およびＫＡＲＰＡＳ４２２がん細胞株に対する特異的ＡＤＣＣ活性の評価
Ｆｃ野生型抗ＣＤ３２ｂ抗体（ヒトＩｇＧ１）を、それらの活性について、初代ＮＫ細胞に基づく抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）アッセイにおいて、評価した。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、フィコール勾配によってドナーの血液から単離した。ＮＫ細胞を、次いで、Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ（カタログ番号１３０−０９２−６５７）を使用して、陰性選択した。これらのエフェクター細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ Ｉｌ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００−０２）で一晩刺激した。翌日、Ｊｅｋｏ−１細胞およびＫａｒｐａｓ４２２細胞を、カルセインアセトキシ−メチルエステル（カルセイン−ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ｃ３１００ＭＰ）で染色し、２回洗浄し、９６ウェルのＵ底マイクロタイタープレートに、１ウェル当たり１０，０００個の細胞の濃度で移した。細胞を、次いで、上述の抗体の連続希釈物とともに２０分間事前インキュベートした後、エフェクター細胞を、エフェクター対標的の比３：１で添加した。共インキュベーションの後に、マイクロタイタープレートに遠心分離を行い、上清流体のアリコートを、別のマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９０４）に移し、溶液中の遊離カルセインの濃度を、蛍光計数装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて判定した。
標的細胞の抗体特異的溶解を計算するために、抗体またはエフェクター細胞なしで標的細胞を並行してインキュベートして、ベースライン対照（自発的放出）として機能させ、一方で、陽性対照または最大放出は、１％トリトン−Ｘ １００溶液のみでの標的細胞の溶解によって判定した。特異的溶解パーセントは、この式を使用して計算した：（サンプル−自発的）／（最大放出−自発的）×１００％。
すべてのＦｃ野生型抗ＣＤ３２ｂ抗体は、図１１ａおよび図１１ｂに例示されるように評価される、両方のがん細胞株の濃度依存的特異的細胞溶解を示した。抗体ＮＯＶ１２１６は、Ｊｅｋｏ１に対して、プロファイリングした他の抗体と比較して、著しく増加した活性を示した（図１１ａ）。ＫＡＲＰＡＳ４２２細胞株に対しては、ＮＯＶ１２１６、ＮＯＶ０２８１、ＮＯＶ０３０８、およびＮＯＶ０５６３は、ほぼ同様の活性を示し、ＮＯＶ１２１６が、わずかにより活性であった（図１１ｂ）。想定した通り、非標的化ＩｇＧ１ Ｆｃ野生型陰性対照抗体は、これらのアッセイにおいて、活性ではなかった。
[実施例１２]
樹立された播種性Ｊｅｋｏ１異種移植片におけるＦｃ野生型ヒトＣＤ３２ｂ結合性抗体のインビボ抗腫瘍活性。
５つのＦｃ野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＤ３２ｂ結合性抗体の抗腫瘍活性を、樹立されたマントル細胞性リンパ腫Ｊｅｋｏ１播種性異種移植片を保有するＳＣＩＤ．Ｂｅｉｇｅマウスにおいて評価した。雌性ＳＣＩＤ．Ｂｅｉｇｅマウスに、ルシフェラーゼ発現を作動させる構成的に活性なプロモーターが安定にトランスフェクトされた１×１０６個のＪｅｋｏ１細胞を、尾静脈から静脈内注射した。細胞を、ＰＢＳ中に懸濁させ、マウスに、最終体積０．２ｍｌの細胞懸濁液を、静脈に接種した。マウスに、１０ｍｌ／ｋｇのルシフェリン（１５ｍｇ／ｍｌ）を腹腔内注射し、ルシフェリン投与の１０分後にＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ−２００光学インビボ撮像システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて撮像を開始することによって、大部分が骨髄腔（例えば、後肢大腿骨、椎骨、下顎骨、データは示されない）に限定されており、相対発光単位（ＲＬＵ）として表される、全身腫瘍量を、評価した。バックグラウンドＲＬＵは、ルシフェリンを投与しなかったマウスを撮像することによって評価した。
マウスは、細胞接種の１０日後に撮像し、平均腫瘍量１．２×１０６ ＲＬＵで、研究に登用した。５つの群のうちの１つにランダムに割り当てた後（ｎ＝５匹／群）、マウスに、ＰＢＳ、ＮＯＶ０２８１、ＮＯＶ１２１６、ＮＯＶ０３０８、またはＮＯＶ０５６３の単回の５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射を投与した。マウスは、週２回、体重を計測し、撮像して、体重および全身腫瘍量の変化を評価した。
腫瘍量を、細胞埋込みの２２日後（処置投与の１０日後）に評価し、Ｔ／Ｃパーセント（非標的化ＩｇＧ１処置マウスのデルタＲＬＵを処置マウスのデルタＲＬＵで除したもの）として表した。想定した通り、腫瘍量は、非標的化陰性対照抗体の投与後に急速に増加した。すべてのＣＤ３２ｂ結合性抗体は、単回静脈内注射後の腫瘍成長の制御に有効であり、ＮＯＶ１２１６およびＮＯＶ０５６３が、最も活性であった（それぞれ、３％および２％Ｔ／Ｃ）（図１２）。
[実施例１３]
樹立されたＤａｕｄｉ異種移植片を有するマウスにおけるＦｃ野生型ＮＯＶ１２１６のインビボでの有効性研究における用量応答
Ｆｃ野生型ＮＯＶ１２１６のインビボ活性をさらに評価するために、用量応答有効性研究を、樹立されたバーキットリンパ腫Ｄａｕｄｉ異種移植片を有するマウスにおいて行った。雌性のヌードマウスに、ＰＢＳで希釈した５０％フェノールレッド不含マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に懸濁した５×１０６個のＤａｕｄｉ細胞（注射体積１００μｌ）を皮下に埋め込んだ。マウスは、埋込みの１８日後に、平均腫瘍体積１４０ｍｍ３で研究に登用した。５つの実験群のうちの１つにランダムに割り当てた後（ｎ＝６匹／群）、マウスに、以下のうちの１つを週１回静脈内注射で投与した：ＰＢＳ、ＦｃサイレントＮＯＶ１２１６ Ｎ２９７Ａ（２０ｍｇ／ｋｇ、週１回×１２回）、またはＦｃ野生型ＮＯＶ１２１６（５、１０、もしくは２０ｍｇ／ｋｇ、週１回×１２回）。腫瘍量を、細胞埋込みの３５日後および処置投与の１８日後に評価し、Ｔ／Ｃパーセント（ＰＢＳ処置マウスのデルタ腫瘍体積を、処置マウスのデルタ腫瘍体積で除したのもの）として表した。腫瘍が８００ｍｍ３に達するとして定義される、エンドポイントまでの時間もまた、評価した。
用量依存的抗腫瘍活性およびエンドポイントまでの時間を、Ｆｃ野生型ＮＯＶ１２１６を用いて観察した。最も高い用量が、最も頑強な抗腫瘍活性（埋込み３５日後に４％Ｔ／Ｃ）およびエンドポイントまでの最も長い時間を示した（図１３）。ＦｃサイレントＮＯＶ１２１６ Ｎ２９７Ａ抗体は、腫瘍体積に対する効果およびエンドポイントまでの時間が非常に限定されていた。これらのデータは、ＮＯＶ１２１６が、ヌードマウスにおいて樹立されたバーキットリンパ腫Ｄａｕｄｉ異種移植片に対して、頑強かつ持続性のＦｃ依存性抗腫瘍活性を有することを示す。
[実施例１４]
レポーターアッセイにおけるＣＤ１６ａ活性化または初代ＮＫ細胞によって作動される細胞溶解に対するＦｃ修飾の評価
非フコシル化（上述の実施例３に記載されるコアフコースのないＮ−グリカン構造を有する抗体を産生させた）またはＦｃ操作（ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）のいずれかによってＮＯＶ１２１６のＡＤＣＣ機能を増強する能力を、インビトロで調査した。Ｆｃ活性を、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーターアッセイおよび初代ＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおいて評価した。
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター系における、Ｆｃ野生型、非フコシル化、およびＦｃ修飾型（ｅＡＤＣＣまたはＮ２９７Ａ）のＣＤ３２ｂ結合性ＮＯＶ１２１６が、ヒトＣＤ１６ａを活性化する能力
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３２ｂ結合性抗体がＣＤ３２ｂ陽性標的細胞に結合し、続いてＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞上のＣＤ１６ａを活性化する能力を、評価した。様々な量のＣＤ３２ｂ発現を有する標的細胞株（ＤＡＵＤＩ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１３およびＪｅｋｏ−１；ＤＳＭＺ ＡＣＣ５３３）を、使用した。ＮＯＶ１２１６ Ｆｃ野生型および複数のＦｃ操作戦略を用いたバージョンを、このアッセイにおいてプロファイリングした。これらには、ＮＯＶ１２１６のＦｃ増強バージョン（非フコシル化およびｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異）ならびにＦｃサイレント（Ｎ２９７Ａ）バージョンが含まれた。細胞株を採取し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １４１９０−１４４）中で洗浄し、０．５×１０６個の細胞／ｍｌまでアッセイ培地（ＲＰＭＩ Ｇｌｕｔａｍａｘ（６１８７０−０３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ２６１４０−０７９））中に再懸濁し、３０μｌ／ウェルのアリコートを９６ウェルの白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３９１７）に入れた。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株を採取し、ＰＢＳ中で洗浄し、３×１０６個の細胞／ｍｌまでアッセイ培地中に再懸濁させ、３０μｌ／ウェルでアリコートをとり、最終的なエフェクター対標的の比６：１にした。各抗体（Ｆｃ野生型、Ｎ２９７Ａ、またはｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体）の１：１０での７点連続希釈物を、三連に調製した。対照ウェルには、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞単独、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株および抗体、またはＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株およびＣＤ３２ｂ陽性標的細胞株が含まれた。Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ番号Ｅ２６２０）を、適切な陰性対照ウェルを除いて各ウェルに添加し（６０μｌ／ウェル）、プレートを、続いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。結果として得られた発光シグナルを、細胞株内で各抗体の最も高いシグナルに対して正規化する。この最も高いシグナルを、「１００」と指定し、細胞株内のすべての他の抗体のシグナルを、それに対して正規化した。Ｄａｕｄｉ標的細胞株およびＪｅｋｏ−１標的細胞株の両方で、非フコシル化およびｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体ＮＯＶ１２１６が、類似のＣＤ１６ａ活性化をもたらし、これは、Ｆｃ野生型ＮＯＶ１２１６で観察されたものよりも高かった（図１４ａ、図１４ｂ）。想定した通り、ＦｃサイレントＮＯＶ１２１６ Ｎ２９７Ａは、このレポーターアッセイにおいて、ＣＤ１６ａを活性化することはなかった。
Ｆｃ野生型およびＦｃ修飾型（非フコシル化またはＮ２９７Ａ）のＣＤ３２ｂ結合性ＮＯＶ１２１６が、ＣＤ３２ｂ陽性標的細胞に対して初代ＮＫ細胞によって作動されるＡＤＣＣ活性を誘起する能力
ＣＤ３２ｂ抗体のＦｃ依存性のＡＤＣＣ活性を、単離ヒトナチュラルキラー細胞がＣＤ３２ｂ陽性標的細胞を殺滅させる能力によって測定した。このアッセイにおいて使用したＣＤ３２ｂ標的細胞は、ＤＡＵＤＩ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１３）およびＪｅｋｏ−１ （ＤＳＭＺ ＡＣＣ５３３）であった。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、フィコール勾配（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７−１４４０−０２）によってＬｅｕｋｏｐａｋ（ＨｅｍａＣａｒｅ、カタログ番号ＰＢ００１Ｆ−３）から単離した。ＮＫ細胞を、次いで、Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ（カタログ番号１３０−０９２−６５７）を使用して陰性選択した後、基礎培地において一晩インキュベートした（ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ／１％抗有糸分裂薬／抗生物質）。翌日、ＣＤ３２ｂ陽性標的細胞を、カルセインアセトキシ−メチルエステル（カルセイン−ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ｃ３１００ＭＰ）で染色し、２回洗浄し、９６ウェルのＵ底マイクロタイタープレートに、１ウェル当たり１０，０００個の細胞の濃度で移した。細胞を、次いで、抗体の連続希釈物とともに２０分間事前インキュベートした後、エフェクター細胞を、エフェクター対標的の比２０：１で添加した。４．０時間の共インキュベーションの後に、マイクロタイタープレートに遠心分離を行い、上清流体のアリコートを、別のマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９０４）に移し、溶液中の遊離カルセインの濃度を、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて判定した。
標的細胞の抗体特異的溶解を計算するために、抗体またはエフェクター細胞なしで標的細胞を並行してインキュベートして、ベースライン対照（自発的放出）として機能させ、一方で、陽性対照または最大放出は、１％トリトン−Ｘ １００溶液のみでの標的細胞の溶解によって判定した。特異的溶解パーセントは、この式を使用して計算した：（サンプル−自発的）／（最大放出−自発的）×１００％。評価した両方の細胞株において、ＮＯＶ１２１６の非フコシル化バージョンは、Ｆｃ野生型バージョンよりも活性であった（図１４ｃ、図１４ｄ）。想定した通り、ＮＯＶ１２１６のＦｃサイレントＮ２９７Ａバージョンは、活性ではなかった。
Ｆｃ野生型およびＦｃ修飾型（ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体またはＮ２９７Ａ）のＣＤ３２ｂ結合性抗体が、ＣＤ３２ｂ陽性Ｊｅｋｏ−１細胞に対して初代ＮＫ細胞によって作動されるＡＤＣＣ活性を誘起する能力
第３の実験において、ＣＤ３２ｂ抗体パネルのＦｃ依存性のＡＤＣＣ活性を、単離ヒトナチュラルキラー細胞がＣＤ３２ｂ陽性Ｊｅｋｏ−１細胞（ＤＳＭＺ ＡＣＣ５３３）を殺滅させる能力によって測定した。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、フィコール勾配（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７−１４４０−０２）によってＬｅｕｋｏｐａｋ（ＨｅｍａＣａｒｅ、カタログ番号ＰＢ００１Ｆ−３）から単離した。ＮＫ細胞を、次いで、Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ（カタログ番号１３０−０９２−６５７）を使用して、陰性選択した。これらのエフェクター細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ Ｉｌ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ番号２００−０２）で一晩刺激した。翌日、Ｊｅｋｏ−１細胞を、カルセインアセトキシ−メチルエステル（カルセイン−ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ｃ３１００ＭＰ）で染色し、２回洗浄し、９６ウェルのＵ底マイクロタイタープレートに、１ウェル当たり１０，０００個の細胞の濃度で移した。細胞を、次いで、抗体の連続希釈物とともに２０分間事前インキュベートした後、エフェクター細胞を、エフェクター対標的の比３：１で添加した。共インキュベーションの後に、マイクロタイタープレートに遠心分離を行い、上清流体のアリコートを、別のマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９０４）に移し、溶液中の遊離カルセインの濃度を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて判定した。
標的細胞の抗体特異的溶解を計算するために、抗体またはエフェクター細胞なしで標的細胞を並行してインキュベートして、ベースライン対照（自発的放出）として機能させ、一方で、陽性対照または最大放出は、１％トリトン−Ｘ １００溶液のみでの標的細胞の溶解によって判定した。特異的溶解パーセントは、この式を使用して計算した：（サンプル−自発的）／（最大放出−自発的）×１００％。プロファイリングした各抗体（ＮＯＶ０２８１、ＮＯＶ１２１６、およびＮＯＶ１２１８）の事例において、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ修飾により、Ｆｃ野生型ＩｇＧ１のものよりもＡＤＣＣ活性が増加した（図１５）。想定した通り、抗体のＦｃサイレントＮ２９７Ａバージョンは、このアッセイにおいて、活性が最小限であった。
[実施例１５]
ある範囲のヒトＣＤ３２ｂ発現を特徴とする標的細胞を用いたレポーターアッセイにおける、ＮＯＶ１２１６のＦｃ野生型バージョン、ｅＡＤＣＣ ＦＣ変異体バージョン、およびＮ２９７ＡバージョンによるＣＤ１６ａの活性化の評価
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ある範囲のヒトＣＤ３２ｂ発現を特徴とする標的細胞株のパネルを用いて、ＣＤ３２ｂ結合性抗体がＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞上のＣＤ１６ａを活性化する能力を評価した。ＣＤ３２ｂ陽性標的細胞株は、次の通りであった：Ｌａｍａ−８４（ＤＳＭＺ ＡＣＣ１６８）、Ｊｅｋｏ−１（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ５５３）、Ｋａｒｐａｓ−６２０（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ５１４）、ＭＯＬＰ−２（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ６０７）、およびＲａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８６）。ＣＤ３２ｂ陰性Ｒａｍｏｓ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９６）は、陰性対照としての機能を果たした。ＮＯＶ１２１６のＦｃ野生型バージョン、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体バージョン（Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）、およびＮ２９７Ａバージョンを、この実験においてプロファイリングした。
簡単に述べると、細胞株を採取し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １４１９０−１４４）中で洗浄し、０．５×１０６個の細胞／ｍｌまでアッセイ培地（ＲＰＭＩ Ｇｌｕｔａｍａｘ（６１８７０−０３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ２６１４０−０７９））中に再懸濁し、３０μｌ／ウェルのアリコートを９６ウェルの白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３９１７）に入れた。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株を採取し、ＰＢＳ中で洗浄し、３×１０６個の細胞／ｍｌまでアッセイ培地中に再懸濁させ、３０μｌ／ウェルでアリコートをとり、最終的なエフェクター対標的の比６：１にした。各抗体（Ｆｃ野生型、Ｎ２９７Ａ、またはｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体）の１：１０での７点連続希釈物を、三連に調製した。対照ウェルには、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞単独、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株および抗体、またはＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株およびＣＤ３２ｂ陽性標的細胞株が含まれた。Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ番号Ｅ２６２０）を、適切な陰性対照ウェルを除いて６０μｌ／ウェルで各ウェルに添加し、プレートを、続いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。結果として得られた発光シグナルを、細胞株内で各抗体の最も高いシグナルに対して正規化する。この最も高いシグナルを、「１００」と指定し、細胞株内のすべての他の抗体のシグナルを、それに対して正規化した。ＮＯＶ１２１６のＦｃ野生型バージョンおよびｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体バージョンの両方が、このアッセイにおいてＣＤ１６ａの活性化を誘起したが、後者のＦｃ増強バージョンが、より頑強なシグナルをもたらした（図１６）。これは、ＣＤ３２ｂ陰性Ｒａｍｏｓ細胞株を除き、プロファイリングしたすべての細胞株で観察された。想定した通り、ＦｃサイレントＮＯＶ１２１６ Ｎ２９７Ａは、このレポーターアッセイにおいて、ＣＤ１６ａを活性化することはなかった。
[実施例１６]
ある範囲のヒトＣＤ３２ｂ発現を特徴とする標的細胞を用いたレポーターアッセイにおける、非フコシル化ＣＤＲ−Ｈ３変異体ＣＤ３２ｂ結合性抗体によるＣＤ１６ａの活性化の評価。
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ある範囲のヒトＣＤ３２ｂ発現を特徴とする標的細胞株のパネルを用いて、非フコシル化（ａｆｕｃ）ＣＤ３２ｂ結合性ＣＤＲ−Ｈ３抗体がＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞上のＣＤ１６ａを活性化する能力を評価した。ＣＤ３２ｂ陽性標的細胞株は、次の通りであった：Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１３）、親ＢＪＡＢ（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ ７５７）、およびＫＡＲＰＡＳ４２２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ０６１０１７０２）、ならびにヒトＣＤ３２ｂを発現する安定なＢＪＡＢ細胞。
簡単に述べると、細胞株を採取し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １４１９０−１４４）中で洗浄し、０．５×１０６個の細胞／ｍｌまでアッセイ培地（ＲＰＭＩ Ｇｌｕｔａｍａｘ（６１８７０−０３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ２６１４０−０７９））中に再懸濁し、３０μｌ／ウェルのアリコートを９６ウェルの白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３９１７）に入れた。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株を採取し、ＰＢＳ中で洗浄し、３×１０６個の細胞／ｍｌまでアッセイ培地中に再懸濁させ、３０μｌ／ウェルでアリコートをとり、最終的なエフェクター対標的の比６：１にした。各非フコシル化抗体（ＮＯＶ１２１６、ＮＯＶ２１０６、ＮＯＶ２１０７、ＮＯＶ２１０８）の１：１０での５点連続希釈物を、三連に調製した。対照ウェルには、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞単独、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株および抗体、またはＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株およびＣＤ３２ｂ陽性標的細胞株が含まれた。Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ番号Ｅ２６２０、６０μｌ）を、適切な陰性対照ウェルを除いてすべてのウェルに添加し、プレートを、続いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。３つすべての非フコシル化ＣＤ３２ｂ結合性ＣＤＲ−Ｈ３変異体（ＮＯＶ２１０６、ＮＯＶ２１０７、ＮＯＶ２１０８）、ならびに非フコシル化ＮＯＶ１２１６は、ＣＤ１６ａを強力に活性化した（図１７）。頑強なＣＤ１６ａ活性化は、３つのＣＤ３２ｂ陽性細胞株のそれぞれにわたって観察された。想定した通り、ＮＯＶ１２１６のＮ２９７Ａ Ｆｃサイレントバージョンは、このレポーターアッセイにおいて、ＣＤ１６ａを活性化することはなかった。
[実施例１７]
初代ＮＫ細胞アッセイにおける非フコシル化ＣＤＲ−Ｈ３変異体抗体のＡＤＣＣ活性の評価。
初代ＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおける、非フコシル化ＮＯＶ１２１６、ならびにＣＤＲ−Ｈ３変異体ＮＯＶ２１０６、ＮＯＶ２１０７、およびＮＯＶ２１０８の活性
初代ＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイを利用して、非フコシル化ＣＤＲ−Ｈ３変異体および非フコシル化ＮＯＶ１２１６のＦｃ依存性活性を評価した。ＣＤ３２ｂ陽性Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１３）およびＫＡＲＰＡＳ４２２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ０６１０１７０２）細胞は、標的細胞としての機能を果たした。
簡単に述べると、ＰＢＭＣを、フィコール勾配によってＬｅｕｋｏｐａｋ（ＨｅｍａＣａｒｅ、カタログ番号ＰＢ００１Ｆ−３）から単離した。ＮＫ細胞を、次いで、Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ（カタログ番号１３０−０９２−６５７）を使用して陰性選択した後、基礎培地において一晩インキュベートした（ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ／１％抗有糸分裂薬／抗生物質）。翌日、Ｄａｕｄｉ細胞およびＫａｒｐａｓ４２２細胞を、カルセインアセトキシ−メチルエステル（カルセイン−ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ｃ３１００ＭＰ）で染色し、２回洗浄し、９６ウェルのＵ底マイクロタイタープレートに、１ウェル当たり１０，０００個の細胞の濃度で移した。細胞を、次いで、抗体の連続希釈物とともに２０分間事前インキュベートした後、エフェクター細胞を、エフェクター対標的の比２０：１で添加した。共インキュベーションの後に、マイクロタイタープレートに遠心分離を行い、上清流体のアリコートを、別のマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９０４）に移し、溶液中の遊離カルセインの濃度を、蛍光計数装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて判定した。
標的細胞の抗体特異的溶解を計算するために、抗体またはエフェクター細胞なしで標的細胞を並行してインキュベートして、ベースライン対照（自発的放出）として機能させ、一方で、陽性対照または最大放出は、１％トリトン−Ｘ １００溶液のみでの標的細胞の溶解によって判定した。特異的溶解パーセントは、この式を使用して計算した：（サンプル−自発的）／（最大放出−自発的）×１００％。３つすべての非フコシル化ＣＤＲ−Ｈ３変異体抗体（ＮＯＶ２１０６、ＮＯＶ２１０７、およびＮＯＶ２１０８）ならびに非フコシル化ＮＯＶ１２１６は、Ｄａｕｄｉ標的細胞株およびＫａｒｐａｓ４２２標的細胞株の両方の頑強な特異的細胞溶解を示した（図１８）。想定した通り、非標的化非フコシル化抗体は、このアッセイにおいて、活性ではなかった。
初代ＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおける、非フコシル化ＮＯＶ１２１６、ならびにＣＤＲ−Ｈ３変異体ＮＯＶ２１０７およびＮＯＶ２１０８の活性
さらなる実験において、初代ＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイを利用して、非フコシル化ＣＤＲ−Ｈ３変異体抗体および非フコシル化ＮＯＶ１２１６のＦｃ依存性活性を評価した。ＣＤ３２ｂ陽性Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１３）細胞は、標的細胞としての機能を果たした。
簡単に述べると、ＰＢＭＣを、フィコール勾配によって、外注のＬｅｕｋｏｐａｋ（ＨｅｍａＣａｒｅカタログ番号ＰＢ００１Ｆ−３）から単離した。ＮＫ細胞を、次いで、Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ（カタログ番号１３０−０９２−６５７）を使用して陰性選択し、１００ｐｇ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ番号２００−０２）で一晩刺激した。翌日、Ｄａｕｄｉ細胞およびＫａｒｐａｓ４２２細胞を、カルセインアセトキシ−メチルエステル（カルセイン−ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ｃ３１００ＭＰ）で染色し、２回洗浄し、９６ウェルのＵ底マイクロタイタープレートに、１ウェル当たり１０，０００個の細胞の濃度で移した。細胞を、次いで、抗体の連続希釈物とともに２０分間事前インキュベートした後、エフェクター細胞を、エフェクター対標的の比３：１で添加した。共インキュベーションの後に、マイクロタイタープレートに遠心分離を行い、上清流体のアリコートを、別のマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９０４）に移し、溶液中の遊離カルセインの濃度を、蛍光計数装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて判定した。
標的細胞の抗体特異的溶解を計算するために、抗体またはエフェクター細胞なしで標的細胞を並行してインキュベートして、ベースライン対照（自発的放出）として機能させ、一方で、陽性対照または最大放出は、１％トリトン−Ｘ １００溶液のみでの標的細胞の溶解によって判定した。特異的溶解パーセントは、この式を使用して計算した：（サンプル−自発的）／（最大放出−自発的）×１００％。非フコシル化ＣＤＲ−Ｈ３変異体抗体ＮＯＶ２１０７およびＮＯＶ２１０８、ならびに非フコシル化ＮＯＶ１２１６のいずれもが、Ｄａｕｄｉ標的細胞の頑強な特異的細胞溶解を示した（図１９）。
[実施例１８]
ＤＡＵＤＩ異種移植片モデルに対する、ＮＯＶ１２１６のＦｃ野生型バージョン、ｅＡＤＣＣ ＦＣ変異体バージョン、およびＮ２９７Ａバージョンのインビボ活性。
ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異（Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）がインビボでのＮＯＶ１２１６活性に及ぼす作用を探究するために、樹立されたバーキットリンパ腫Ｄａｕｄｉ異種移植片を有するマウスにおいて、有効性研究を行った。雌性のヌードマウスに、ＰＢＳで希釈した５０％フェノールレッド不含マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に懸濁した５×１０６個のＤａｕｄｉ細胞（注射体積１００μｌ）を皮下に埋め込んだ。マウスは、埋込みの１８日後に、平均腫瘍体積１４０ｍｍ３で研究に登用した。４つの実験群のうちの１つにランダムに割り当てた後（ｎ＝６匹／群）、マウスに、以下のうちの１つを週１回静脈内注射で投与した：ＰＢＳ、ＦｃサイレントＮＯＶ１２１６ Ｎ２９７Ａ（２０ｍｇ／ｋｇ、週１回×１２回）、Ｆｃ野生型ＮＯＶ１２１６（１０ｍｇ／ｋｇ、週１回×１２回）、またはＮＯＶ１２１６ ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体（１０ｍｇ／ｋｇ、週１回×３回）。腫瘍量を、細胞埋込みの３５日後および処置投与の１８日後に評価し、Ｔ／Ｃパーセント（ＰＢＳ処置マウスのデルタ腫瘍体積を、処置マウスのデルタ腫瘍体積で除したのもの）として表した。腫瘍が８００ｍｍ３に達するとして定義される、エンドポイントまでの時間もまた、評価した。
インビトロでの観察と一致して、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異を有するＮＯＶ１２１６は、細胞埋込みの３４日後時点でのより小さな腫瘍量およびエンドポイントまでの時間によって示されるように、インビボにおいて、Ｆｃ野生型ＮＯＶ１２１６よりも活性が高かった（図２０）。ＦｃサイレントＮＯＶ１２１６ Ｎ２９７Ａ抗体は、腫瘍体積に対する効果およびエンドポイントまでの時間が非常に限定されていた。これらのデータは、Ｆｃ増強型ＮＯＶ１２１６ ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体は、樹立されたインビボ異種移植片モデルにおいて、Ｆｃ野生型ＮＯＶ１２１６よりも活性が高かったことを示す。重要なことに、ＮＯＶ１２１６ ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体の抗腫瘍応答は、３回の静脈内投与、すなわち、週１回×３回しか受けていないにもかかわらず、週１回で１２回投薬された他の実験群と比較して、エンドポイントまでの時間が延長されたという事実によって裏付けられるように、極めて持続時間が長かった。
[実施例１９]
ＤＡＵＤＩ異種移植片に対する、非フコシル化ＮＯＶ１２１６および非フコシル化ＣＤＲ−Ｈ３変異体のインビボ抗腫瘍活性
ＣＤ３２ｂ結合性非フコシル化ＮＯＶ１２１６抗体、ならびに非フコシル化ＣＤＲ−Ｈ３変異体抗体ＮＯＶ２１０６、ＮＯＶ２１０７、およびＮＯＶ２１０８のインビボ活性を評価するために、樹立されたバーキットリンパ腫Ｄａｕｄｉ異種移植片における複数回用量の有効性研究を行った。雌性のヌードマウスに、ＰＢＳ中に５０％フェノールレッド不含マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液（総注射体積１００μｌ）中の５×１０６個のＤａｕｄｉ細胞を、皮下に埋め込んだ。マウスは、埋込みの１３日後に、平均腫瘍体積１９７ｍｍ３で研究に登用した。４つの群のうちの１つにランダムに割り当てた後（ｎ＝６匹／群）、マウスに、ＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ、週１回×３回）、または以下の非フコシル化抗体ＮＯＶ１２１６、ＮＯＶ２１０６、ＮＯＶ２１０７、もしくはＮＯＶ２１０８のうちの１つ（２０ｍｇ／ｋｇ、週１回×３回）を週１回静脈内注射で投与した。４つすべてのＣＤ３２ｂ結合性抗体が活性であり、頑強な腫瘍成長制御をもたらした（図２１）。
[実施例２０]
レポーターアッセイにおいて、ＣＤ３２ｂをＦｃサイレントＮＯＶ１２１６ Ｎ２９７Ａで遮断することにより、リツキシマブおよびオビヌツズマブがＣＤ１６ａを活性化する能力が増強される。
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーターアッセイにおいて、ＣＤ２０陽性細胞によるヒトＣＤ３２ｂ発現が、リツキシマブおよびオビヌツズマブがＣＤ１６ａを活性化する能力に及ぼす影響を評価するために、研究を行った。ＦｃサイレントＮＯＶ１２１６とリツキシマブまたはオビヌツズマブとを組み合わせることが、ＣＤ１６ａを活性化する能力に対して及ぼす結果もまた、評価した。
ＣＤ３２ｂ陰性親Ｒａｍｏｓ細胞を、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１５９６）から入手し、ヒトＣＤ３２ｂを安定に発現するＲａｍｏｓ細胞を、生成した。簡単に述べると、ヒトＣＤ３２ｂを外因的に発現する安定なＲａｍｏｓ細胞株の生成のために、Ｇａｔｅｗａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して、完全長ヒトＣＤ３２ｂ１配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ３１９９４−１）を、Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩ Ｅｎｚｙｍｅミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１７９１−０２０）を有するレンチウイルス発現ベクターＯＰＳ＿ｖ１９＿ｐＬｅｎｔｉ６．３−ＥＦ１ａ−ｇｗに挿入した。ウイルスを生成するために、ｈｕＣＤ３２ｂ１／Ｖ１９プラスミドを、次いで、ＴｒａｎｓＩＴ−１９３トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ ＭＩＲ２７００）およびＯｐｔｉｍｅｍ血清不含培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号１１０５８０２１）において、パッケージングベクターＰＣＧおよびＶＳＶ−Ｇと混合した。混合物を、室温で２０分間インキュベートした後、Ｂｉｏｃｏａｔ Ｃｏｌｌａｇｅｎをコーティングした１０ｃｍプレート（ＢＤ番号３５６４５０）上のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に添加した。翌日、培地を、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ １１９６５−０９２）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ２６１４０−０７９）＋１×ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ １１９６５−０９２）に交換し、７２時間で３７℃に戻した。ウイルス採取の際に、上清を採取し、プールし、０．４５ｕＭ酢酸セルロースフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ番号４３０３１４）を通して濾過した。
安定なＲａｍｏｓ細胞株にウイルスを形質導入するために、１×１０６個の細胞を、平底２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５２６）に播種した。この細胞に、３７℃に温めた１ｍｌのＣＤ３２ｂ１／Ｖ１９ウイルスを、８ｕｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ Ｈ９２６８）とともに添加した。細胞を、室温で１．５時間、２２５０ｒｐｍで遠心沈降させた。次いで、ウイルス上清を除去し、３ｍｌの新しい培地を細胞に添加し、これを、６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５１６）に移した。細胞を、３７℃で２日間インキュベートした後、Ｔ２５フラスコに移した。細胞を完全に回収した後、ブラストサイジンを含有する選択培地を適用した。最終的な安定株は、フローサイトメトリーによって判定すると、形質導入されていない親株と比較して、高いレベルのヒトＣＤ３２ｂ１を均質に発現するプール集団であった。
細胞株を構築した後、それらを採取し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １４１９０−１４４）中で洗浄し、０．５×１０６個の細胞／ｍｌまでアッセイ培地（ＲＰＭＩ Ｇｌｕｔａｍａｘ（６１８７０−０３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ２６１４０−０７９））中に再懸濁し、３０μｌ／ウェルのアリコートを９６ウェルの白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３９１７）に入れた。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株を採取し、ＰＢＳ中で洗浄し、３×１０６個の細胞／ｍｌまでアッセイ培地中に再懸濁させ、３０μｌ／ウェルでアリコートをとり、最終的なエフェクター対標的の比６：１にした。リツキシマブまたはオビヌツズマブの１：１０での７点連続希釈物を、三連に調製した。ＦｃサイレントＮＯＶ１２１６ Ｎ２９７Ａは、リツキシマブもしくはオビヌツズマブのみを含有する対照ウェルから除外して、ベースライン対照として機能させたか、または３０μｇ／ｍｌでリツキシマブもしくはオビヌツズマブと組み合わせた。すべての連続希釈物を、三連に播種した。対照ウェルには、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞単独、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株および抗体、またはＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株および標的陽性標的細胞株が含まれた。Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ番号Ｅ２６２０）を、適切な陰性対照ウェルを除いてすべてのウェルに６０μｌ／ウェルで添加し、プレートを、続いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。
リツキシマブおよびオビヌツズマブのいずれも、効率的にＲａｍｏｓ細胞に結合し、レポーター細胞上のＣＤ１６ａを活性化させたが、この活性化は、ヒトＣＤ３２ｂがＲａｍｏｓ細胞に過剰発現している場合には弱くなり、ＣＤ３２ｂが、ＣＤ２０を標的とするリツキシマブ（図２２、上のパネル）およびオビヌツズマブ（図２２、下のパネル）によるＣＤ１６ａの活性化を妨害していることを示唆する。Ｒａｍｏｓ ｈｕＣＤ３２ｂ細胞単独とともにインキュベートした場合、ＮＯＶ１２１６ Ｎ２９７Ａ（Ｆｃサイレント）は、レポーター細胞におけるＣＤ１６ａを活性化することができなかった。しかしながら、リツキシマブまたはオビヌツズマブと組み合わせた場合、ＮＯＶ１２１６ Ｎ２９７Ａは、Ｒａｍｏｓ ｈｕＣＤ３２ｂによるＣＤ１６ａの活性化を、リツキシマブまたはオビヌツズマブ単独とともにインキュベートした細胞よりも、増加させた。これらのデータを合わせると、ＮＯＶ１２１６ Ｎ２９７Ａは、ＣＤ３２ｂおよびＣＤ２０が、同じ標的細胞において共発現される場合、リツキシマブおよびオビヌツズマブによるＣＤ１６ａ活性化を増強させることが示された。増強は、リツキシマブおよびオビヌツズマブのＦｃ部分へのＣＤ３２ｂの結合の遮断に起因すると考えられる。
[実施例２１]
ＦｃサイレントＮＯＶ１２１６ Ｎ２９７ＡまたはＦｃサイレントＮ２９７Ａ ＣＤＲ−Ｈ３変異体抗体でのＣＤ３２ｂの遮断により、リツキシマブがＣＤ１６ａを活性化する能力が増強される。
ＣＤ２０およびＣＤ３２ｂ陽性ＢＪＡＢ細胞を標的細胞株として使用して、ＦｃサイレントＮＯＶ１２１６、ならびにＦｃサイレントＣＤＲ−Ｈ３変異体抗体ＮＯＶ２１０６、ＮＯＶ２１０７、およびＮＯＶ２０１８を、リツキシマブと組み合わせることが、ＣＤ１６ａを活性化するリツキシマブの能力に及ぼす影響を評価するために、研究を行った。
ＢＪＡＢ細胞を、入手し（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ ７５７）、ヒトＣＤ３２ｂ１を安定に発現するように操作した（実施例２０に概説されるものと同じ方法を使用して産生させた）。簡単に述べると、細胞株を採取し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １４１９０−１４４）中で洗浄し、０．５×１０６個の細胞／ｍｌまでアッセイ培地（ＲＰＭＩ Ｇｌｕｔａｍａｘ（６１８７０−０３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ２６１４０−０７９））中に再懸濁し、３０μｌ／ウェルのアリコートを９６ウェルの白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３９１７）に入れた。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株を採取し、ＰＢＳ中で洗浄し、３×１０６個の細胞／ｍｌまでアッセイ培地中に再懸濁させ、３０μｌ／ウェルでアリコートをとり、最終的なエフェクター対標的の比６：１にした。リツキシマブの１：１０での７点連続希釈物を、三連に調製した。ＮＯＶ１２１６、ＮＯＶ２１０６、ＮＯＶ２１０７、またはＮＯＶ２１０８のＦｃサイレントＮ２９７Ａバリアントは、リツキシマブのみを含有する対照ウェルから除外して、ベースライン対照として機能させたか、または３０μｇ／ｍｌでリツキシマブと組み合わせた。対照ウェルには、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞単独、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株および抗体、またはＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株および標的陽性標的細胞株が含まれた。Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ番号Ｅ２６２０）を、適切な陰性対照ウェルを除いて各ウェルに６０μｌ／ウェルで添加し、プレートを、続いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。リツキシマブは、ｈＣＤ３２ｂ ＢＪＡＢ細胞に効率的に結合し、レポーター細胞上のＣＤ１６ａを活性化させた。リツキシマブと組み合わせた場合、ＮＯＶ１２１６、ＮＯＶ２１０６、ＮＯＶ２１０７、またはＮＯＶ２１０８のＦｃサイレントＮ２９７Ａバリアントは、リツキシマブ単独とともにインキュベートした細胞よりも、ＢＪＡＢ ｈｕＣＤ３２ｂによるＣＤ１６ａの活性化を増加させた（図２３）。これらのデータを合わせると、ＦｃサイレントのＣＤ３２ｂ標的化抗体は、ＣＤ３２ｂおよびＣＤ２０が、同じ標的細胞において共発現される場合、リツキシマブによるＣＤ１６ａの活性化を増強させることが示された。増強は、リツキシマブのＦｃ部分へのＣＤ３２ｂの結合の遮断に起因することが、１つの説明である。
[実施例２２]
Ｄａｕｄｉ異種移植片モデルにおける、単剤としてまたはリツキシマブもしくはオビヌツズマブとの組合せでのＮＯＶ１２１６ ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体のインビボ抗腫瘍活性。
上述のインビトロでの所見は、ＣＤ３２ｂの発現が、リツキシマブ（Ｉ型）およびオビヌツズマブ（ＩＩ型）の両方のＣＤ２０を標的とする治療薬のＦｃ依存性活性を低減すること、ならびにＣＤ３２ｂを標的とする抗体が、これらのＣＤ２０を標的とする治療薬のそれぞれと頑強に組み合わさることを示す。これらの観察をインビボで探求するために、樹立されたバーキットリンパ腫Ｄａｕｄｉ異種移植片を保有するマウスにおいて、組合せ有効性研究を行った。雌性のヌードマウスに、５×１０６個のＤａｕｄｉ細胞を皮下に埋め込んだ。細胞を、ＰＢＳ中に５０％フェノールレッド不含マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液に、懸濁させた。懸濁液中の細胞を含有する総注射体積は、１００μｌであった。マウスは、埋込みの１８日後に、平均腫瘍体積２０１ｍｍ３で研究に登用した。６つの群のうちの１つにランダムに割り当てた後（ｎ＝７匹／群）、マウスに、週１回、（１０ｍｇ／ｋｇ、週１回で）リツキシマブ、オビヌツズマブ、ＮＯＶ１２１６ ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）、リツキシマブ＋ＮＯＶ１２１６ ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体（１０ｍｇ／ｋｇ、それぞれ週１回）、またはオビヌツズマブ＋ＮＯＶ１２１６ ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体（１０ｍｇ／ｋｇ、それぞれ週１回）の静脈内注射を投与した。腫瘍量を、細胞埋込みの３１日後および処置投与の１８日後に評価し、Ｔ／Ｃパーセント（ＰＢＳ処置マウスのデルタ腫瘍体積を、処置マウスのデルタ腫瘍体積で除したのもの）として表した。腫瘍が８００ｍｍ３に達するとして定義される、エンドポイントまでの時間もまた、評価した。
処置開始３１日後に、リツキシマブまたはオビヌツズマブの単剤では限られた抗腫瘍活性が観察されたが（それぞれ、６９および５５％Ｔ／Ｃ）、一方でＮＯＶ１２１６ ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体は、頑強な抗腫瘍活性（１７％Ｔ／Ｃ）を示した（図２４）。これが、エンドポイントまでの時間の差につながった。ＮＯＶ１２１６ ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体と、リツキシマブまたはオビヌツズマブのいずれかとの組合せにより、それぞれ単剤と比較して、エンドポイントまでの時間の増加がもたらされた（図２４）。
[実施例２３]
ＦｃサイレントＮ２９７Ａ ＣＤＲ−Ｈ３変異体抗体ＮＯＶ２１０８でのＣＤ３２ｂの遮断により、ダラツムマブがＣＤ１６ａを活性化する能力が増強される。
ＣＤ３８は、多発性骨髄腫細胞に発現され、抗ＣＤ３８抗体ダラツムマブは、近年、多発性骨髄腫の治療用としてＦＤＡに承認されている。ＣＤ３２ｂおよびＣＤ３８が、同じ細胞において共発現される場合、ＣＤ３２ｂが、ダラツムマブのＦｃに結合することで、治療用抗体の内部移行をもたらし得るか、またはダラツムマブのＦｃがエフェクター細胞に発現されるＦｃγＲを活性化することを封鎖し得ることが起こり得る。この実施例では、ＮＯＶ２１０８が、ＣＤ３２ｂがダラツムマブのＦｃに結合するのを遮断し、それによってダラツムマブによるＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）のより頑強な活性化が可能となり得るかについて評価する。
ＭＭ１．Ｓ細胞を、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２９７４）から入手した。親ＭＭ１．Ｓ細胞およびヒトＣＤ３２ｂ１を安定に発現するＭＭ１．Ｓ細胞（実施例２０に概説されるものと同じ方法を使用して産生させた）を採取し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １４１９０−１４４）中で洗浄し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ ６１８７０−０３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ２６１４０−０７９））中に再懸濁させ、９６ウェルの白色プレート（ｃｏｓｔａｒ番号３９１７）に１５，０００個の細胞／ウェルでアリコートをとった。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｖ１５８レポーター細胞株を、各ウェルに、９０，０００個の細胞／ウェルで添加した。ダラツムマブの１：１０での８点連続希釈物を、開始濃度１０ｕｇ／ｍｌで調製した。ダラツムマブおよびＮＯＶ２１０８の組合せを含有する各ウェルに、飽和量のＮＯＶ２１０８−Ｎ２９７Ａ抗体を、１０ｕｇ／ｍｌで添加した。すべての条件を、三連で播種した。対照ウェルには、レポーター細胞単独、レポーター細胞および抗体、またはレポーター細胞およびＭＭ１．ＳもしくはＭＭ１．Ｓ ｈｕＣＤ３２ｂ細胞が含まれた。プレートを、５％ＣＯ２において４時間、３７℃のインキュベーターでインキュベートした。共インキュベーションの後に、Ｂｒｉｔｅｌｉｔｅ ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６０６６７６９、７０μｌ）を、各ウェルに添加したが、バックグラウンド対照ウェルは除く。結果として生じる発光を、次いで、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取った後、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してプロットした。ダラツムマブは、効率的にＭＭ１．Ｓ細胞に結合し、レポーター細胞上のＣＤ１６ａを活性化したが、この活性化は、ヒトＣＤ３２ｂがＭＭ１．Ｓ細胞に過剰発現している場合には弱くなり、ＣＤ３２ｂが、ダラツムマブによるＣＤ１６ａの活性化を妨害していることを示唆する（図２５）。ＭＭ１．Ｓ ｈｕＣＤ３２ｂ細胞単独とともにインキュベートした場合、ＮＯＶ２１０８−Ｎ２９７Ａ（Ｆｃサイレント）は、レポーター細胞上のＣＤ１６ａを活性化することができなかった。しかしながら、ダラツムマブと組み合わせた場合には、ＮＯＶ２１０８−Ｎ２９７Ａは、ＭＭ１．Ｓ ｈｕＣＤ３２ｂによるＣＤ１６ａの活性化を、ダラツムマブ単独とともにインキュベートした細胞よりも、増加させた。これらのデータを合わせると、ＮＯＶ２１０８−Ｎ２９７Ａは、ＣＤ３２ｂおよびＣＤ３８が、同じ標的細胞において共発現される場合、ダラツムマブによるＣＤ１６ａ活性化を増強させることが示された。観察された増強の１つの説明としては、抗ＣＤ３２ｂ抗体が、ダラツムマブのＦｃ部分へのＣＤ３２ｂの結合を遮断し、Ｆｃ部分が、活性なＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６ａ）との相互作用に利用可能となることである。
[実施例２４]
野生型およびＦｃ増強型のＮＯＶ１２１６およびＮＯＶ２１０８は、ヒトマクロファージによるＤａｕｄｉ標的細胞の殺滅を効率的に媒介する。
マクロファージは、抗体に媒介される腫瘍細胞クリアランスの強力なエフェクター細胞として示されている（Uchida et al., J Exp Med. 199(12):1659-69 (2004)、Pallasch et al., Cell 156(3):590-602 (2014); Overdijk et al., MAbs 7(2):311-21 (2015)、Dilillo et al., Cell 161(5):1035-45 (2015)を参照されたい）。この実施例では、抗体ＮＯＶ１２１６のＦｃ野生型バージョン、ＦｃサイレントＮ２９７Ａ変異体バージョン、および非フコシル化バージョン；抗体ＮＯＶ２１０８のＦｃ野生型バージョン、ＦｃサイレントＮ２９７Ａ変異体バージョン、および非フコシル化バージョン；ならびに国際公開第２０１２／０２２９８５号パンフレットからの抗ＣＤ３２ｂ抗体クローン１０のＦｃ野生型バージョンおよびＦｃサイレントＮ２９７Ａバージョンが、マクロファージによる標的細胞殺滅を媒介する効率性を、評価した。抗体クローン１０のＣＤＲ、ＶＨ、およびＶＬ配列は、国際公開第２０１５／１７３３８４号パンフレットからの抗体６Ｇ１１と同一であると見られる。
ヒト単球由来マクロファージ（ｈＭＤＭ）が、オプソニン化ＣＤ３２ｂ＋ルシフェラーゼ標識Ｄａｕｄｉ細胞を殺滅させる能力を測定するために、マクロファージ媒介型細胞殺滅アッセイを行った。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、フィコール勾配遠心分離を使用して、Ｌｅｕｋｏｐａｋ（ＨｅｍａＣａｒｅ、カタログ番号ＰＢ００１Ｆ−３）から単離した。単球を、次いで、Ｍｉｌｔｅｎｙｉヒト単球単離キットＩＩ（カタログ番号１３０−０９１−１５３）を使用して、陰性選択した。単離した単球を、さらに、９６ウェルの平底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５９６）に、１ウェル当たり３００，０００個の細胞の濃度で蒔き、１０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号３００−２５）を補充した完全マクロファージ培地［（Ｘ−ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４−７４４Ｑ）＋１０％ＦＢＳ）］において７日間培養した。ルシフェラーゼ標識Ｄａｕｄｉ細胞を、採取し、抗体の連続希釈物とともに、１０分間事前インキュベートした。これらの標的細胞を、対応する抗体とともに、１０，０００個の細胞／ウェルで、ｈＭＤＭプレートに移した。抗体ありまたはなし（マクロファージなし）の標的細胞を、対照として含めた。プレートを、５％ＣＯ２において４時間、３７℃のインキュベーターでインキュベートした。共インキュベーションの後に、Ｂｒｉｔｅｌｉｔｅ ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６０６６７６９、７０μｌ）を、各ウェルに添加したが、バックグラウンド対照ウェル（Ｄａｕｄｉ細胞のみ）は除く。Ｂｒｉｔｅｌｉｔｅを有する標的細胞は、最大シグナル対照としての機能を果たし、一方で、Ｂｒｉｔｅｌｉｔｅなしの標的細胞は、バックグラウンド対照としての機能を果たした。上清流体のアリコートを、別のマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９１７）に移し、発光シグナルを、続いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）において測定した。標的細胞の殺滅パーセントを、以下の式を使用して計算した：［１−（サンプル−バックグラウンド）／最大）］×１００％。
Ｆｃ野生型抗体ＮＯＶ１２１６またはＮＯＶ２１０８は、Ｄａｕｄｉ細胞の頑強な殺滅を媒介したが、一方で野生型クローン１０抗体は、最小限の作用を示した（図２６）。非フコシル化により、ＮＯＶ１２１６またはＮＯＶ２１０８によるマクロファージ媒介型標的細胞殺滅がさらに増強された。アイソタイプ（抗ニワトリリゾチーム抗体）対照とともにインキュベートしたＤａｕｄｉ細胞には、マクロファージ媒介型殺滅は観察されず、細胞殺滅が、Ｄａｕｄｉ細胞に発現されるＣＤ３２ｂに対する抗体の特異的結合を必要とすることを示す。加えて、Ｆｃサイレンシング型（Ｎ２９７Ａ）変異体抗体（ＮＯＶ１２１６、ＮＯＶ２１０８、またはクローン１０）は、マクロファージによる標的細胞殺滅を媒介しなかったため、マクロファージＦｃγ受容体の活性化が、このアッセイにおける細胞殺滅に必要であることを示唆する。
[実施例２５]
初代ヒトＢ細胞における、ＣＤ３２ｂ結合性抗体２Ｂ６およびＮＯＶ１２１６（Ｆｃ野生型およびＦｃ修飾型）が、基底ｐＣＤ３２ｂレベルおよび架橋した抗ＩｇＭにより刺激されるｐＣＤ３２ｂレベルに及ぼす影響。
架橋したＩｇＭは、Ｂ細胞を活性化させ、続いて、ＣＤ３２ｂ ＩＴＩＭのリン酸化をもたらすことが知られている。様々なＣＤ３２ｂ結合性抗体が、基底ｐＣＤ３２ｂレベル（チロシン２９２）、ならびに抗ＩｇＭにより刺激されるｐＣＤ３２レベルに及ぼす影響を評価するために、一連の実験を行った。
簡単に述べると、ＰＢＭＣを、フィコール勾配によってドナーヒト全血から単離した。Ｂ細胞を、次いで、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ １３０−０９１−１５１）およびプロトコルを使用して、単離した。Ｂ細胞を、１×１０６個の細胞／ウェルで、ＲＰＭＩにおいて２４ウェルプレート（ｃｏｓｔａｒ ３５２６）に蒔いた。実験ウェルでは、最終濃度５ｎＭで、ＣＤ３２ｂ結合性抗体２Ｂ６（Rankin et al., 2006 Blood 108(7):2384-2391および米国特許第７，５２１，５４２号明細書を参照されたい）またはＮＯＶ１２１６抗体（Ｆｃ野生型バージョン、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体バージョン（Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）、非フコシル化バージョン、およびＮ２９７Ａバージョン）が、架橋した抗ＩｇＭの存在下または不在下におけるｐＣＤ３２ｂレベルに及ぼす影響を評価するように、設定した。対照ウェルは、処置なし、架橋した抗ＩｇＭのみ、ＣＤ３２ｂ結合性抗体のみ、または非フコシル化非標的化抗体のみ（アイソタイプ対照）を有した。３７℃で１０分間インキュベートした後、Ｂ細胞を採取し、Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ７８４３０）およびＰｈｏｓｐｈｏｓｔｏｐ（Ｒｏｃｈｅ ０４−９０６−８３７−００１）を含有するＲｉｐａ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ ＢＰ−１１５）で溶解させた。タンパク質ライセートを還元し、ＰＶＤＦゲル（ＢｉｏＲａｄ １７０−４１５７）に流し、ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ ５６７−１０８４）に移し、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（Ｌｉｃｏｒ ９２７−４００００）でブロッキングした。膜を、いずれも１：２５０００希釈のｐＣＤ３２ｂ（Ａｂａｍ ａｂ６８４２３）およびベータアクチン（Ａｂｃａｍ ａｂ８２２６）一次抗体で一晩プローブした。４回洗浄した後（Ｔｗｅｅｎ含有Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳＴ）、Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ １ＢＢ−１８１Ｘ）、二次抗体（ＩＲ８００抗マウス、Ｌｉｃｏｒ ９２５−３２２１０およびＩＲ６８０抗ウサギ、Ｌｉｃｏｒ ９２５−６８０７１）を、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液に１：１００００希釈で添加した。膜を、続いて、洗浄し（ＴＢＳＴ中で４回、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ ＢＭ−３０ＩＸ）中で１回）、次いで、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘで読み取った。ｐＣＤ３２ｂシグナルを、ベータ−アクチンに対して正規化し、１００に設定されている抗ＩｇＭ処置のみに対する比として表した。想定した通り、架橋した抗ＩｇＭは、ＣＤ３２ｂ ＩＴＩＭリン酸化の増加をもたらした（図２７）。抗体２Ｂ６（Ｆｃ野生型バージョン、Ｎ２９７Ａバージョン、およびｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体バージョン）は、ｐＣＤ３２ｂレベルの著しい増加によって示されるように、ＣＤ３２ｂ ＩＴＩＭの強力なアゴニストであった（図２７、左パネル）。これは、頑強なｐＣＤ３２ｂアゴニスト活性が欠如していたＮＯＶ１２１６（Ｆｃ野生型バージョン、Ｎ２９７Ａバージョン、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体バージョン、および非フコシル化バージョン）とは対照的である（図２７、右パネル）。２Ｂ６のアゴニスト活性は、結合性Ｆｃに依存することが見出された。すなわち、ＦｃサイレントＮ２９７Ａバージョンは、ＣＤ３２ｂ ＩＴＩＭリン酸化をもたらさなかった。ＮＯＶ１２１６のすべてのバージョンが、架橋した抗ＩｇＭによるＣＤ３２ｂの活性化をわずかに低減させる能力を有した（図２７）。これは、２Ｂ６では観察されなかった。
[実施例２６]
初代Ｂ細胞、ＤＡＵＤＩ細胞、およびＫＡＲＰＡＳ４２２細胞において、リツキシマブによって刺激されるＣＤ３２ｂ ＩＴＩＭを調節するＣＤ３２ｂ結合性抗体ＮＯＶ１２１６の能力。
リツキシマブは、ヒトＢ細胞およびＣＤ２０陽性がん細胞株におけるＣＤ３２ｂ ＩＴＩＭリン酸化を引き起こすことが知られている。初代Ｂ細胞ならびにＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉがん細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２１３）およびＫａｒｐａｓ４２２がん細胞株（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ０６１０１７０２）において、非フコシル化ＣＤ３２ｂ結合性抗体ＮＯＶ１２１６が、このリツキシマブによって作動されるｐＣＤ３２ｂの増加を調節する能力について探究するために、いくつかの実験を行った。これらの細胞におけるＣＤ３２ｂ ＩＴＩＭリン酸化の基底レベルに対する非フコシル化ＮＯＶ１２１６の作用もまた、調査した。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、フィコール分離によって全血から単離した。Ｂ細胞を、次いで、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ １３０−０９１−１５１）およびプロトコルを使用して、ＰＢＭＣから単離した。Ｂ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、およびＫａｒｐａｓ４２２細胞を、１×１０６個の細胞／ウェルで、ＲＰＭＩにおいて２４ウェルプレート（ｃｏｓｔａｒ ３５２６）に蒔いた。実験ウェルのうち半数を、リツキシマブ（５０ｎＭ）で刺激した。非フコシル化ＮＯＶ１２１６を、５０ｎＭの最終濃度で、未処置ウェルまたはリツキシマブ刺激ウェルの両方に添加した。対照ウェルは、未処置、リツキシマブのみ、または非フコシル化ＮＯＶ１２１６のみからなっていた。
３７℃で３０分間インキュベートした後、細胞を採取し、Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ７８４３０）およびＰｈｏｓｐｈｏｓｔｏｐ（Ｒｏｃｈｅ ０４−９０６−８３７−００１）を含有するＲｉｐａ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ ＢＰ−１１５）で溶解させた。タンパク質ライセートを還元し、ＰＶＤＦゲル（ＢｉｏＲａｄ １７０−４１５７）に流し、ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ ５６７−１０８４）に移し、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（Ｌｉｃｏｒ ９２７−４００００）でブロッキングした。膜を、いずれも１：２５０００希釈のｐＣＤ３２ｂ（Ａｂａｍ ａｂ６８４２３）およびベータアクチン（Ａｂｃａｍ ａｂ８２２６）一次抗体で一晩プローブした。４回洗浄した後（Ｔｗｅｅｎ含有Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳＴ）、Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ １ＢＢ−１８１Ｘ）、二次抗体（ＩＲ８００抗マウス、Ｌｉｃｏｒ ９２５−３２２１０およびＩＲ６８０抗ウサギ、Ｌｉｃｏｒ ９２５−６８０７１）を、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液に１：１００００希釈で添加した。膜を、続いて、洗浄し（ＴＢＳＴ中で４回、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ ＢＭ−３０ＩＸ）中で１回）、次いで、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘで読み取った。
図２８において見られるように、非フコシル化ＮＯＶ１２１６は、未処置対照と比較して、ＣＤ３２ｂ ＩＴＩＭリン酸化に対する影響がほとんどなかったか、または全くなかった。想定した通り、これらの細胞集団へのリツキシマブの添加は、ｐＣＤ３２ｂレベルにおける増加によって裏付けられるように、ＣＤ３２ｂの頑強なアゴニズムをもたらした。非フコシル化ＣＤ３２ｂ結合性ＮＯＶ１２１６と、リツキシマブとの共インキュベーションによって、リツキシマブによって作動されるｐＣＤ３２ｂレベルの増加が著しく低減された（図２８）。これは、初代Ｂ細胞、ならびにＣＤ２０およびＣＤ３２陽性Ｄａｕｄｉがん細胞株およびＫａｒｐａｓ４２２がん細胞株において、見られた。
[実施例２７]
初代患者多発性骨髄腫サンプルおよび２つの樹立細胞株におけるＣＤ３２ｂタンパク質の発現
ＣＤ３２ｂ Ｆｃ受容体は、正常形質細胞および悪性形質細胞の両方に発現される。新しい未処理骨髄由来の正常ヒト形質細胞サンプル（Ｌｏｎｚａ）および多発性骨髄腫の骨髄単核細胞患者サンプル（Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ）へのｈｕＣＤ３２ｂ特異的抗体の結合を、フローサイトメトリーによって評価した。未処理の骨髄を、ＰＢＳで洗浄した後、ＲＢＣ溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で処置して、あらゆる混入赤血球を除去した。正常形質細胞を、Ｐｌａｓｍａ Ｃｅｌｌ単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０−０９３−６２８）を製造業者の説明に従って使用して、骨髄単核細胞から単離した。多発性骨髄腫患者サンプルを、３７℃の水浴で急速解凍し、予熱したＲＰＭＩ培地に滴下希釈した。サンプルを、ＲＰＭＩ培地で洗浄した後、ＲＢＣ溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で処置して、あらゆる混入赤血球を除去した。腫瘍Ｂ細胞株ＪｅＫｏ−１（マントル細胞性リンパ腫）およびＭＯＬＰ−２（多発性骨髄腫）を、対照として使用して、ｈｕＣＤ３２ｂ染色を評価した。
正常形質細胞サンプルおよび悪性形質細胞サンプルを、２０％ＦＢＳを補充した０．５ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（２％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）中に再懸濁させ、９６ウェルの丸底プレートに分注した（１ウェル当たり１００ｕｌ）。対照腫瘍サンプルを計数し、１ウェル当たり２×１０５個の細胞を、９６ウェルの丸底プレートに分注した。次いで、サンプルを、ＦＩＴＣ−ＣＤ３８、ＰＥ−ＣＤ１３８、ＰＥ−Ｃｙ７−ＣＤ４５、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７−ＣＤ３２ｂクローン２Ｂ６［Ｎ２９７Ａ］またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７−ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照［Ｎ２９７Ａ］を含有する等量の２倍抗体カクテル中で染色した。サンプルを、氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回続けて洗浄した後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液に希釈した７−ＡＡＤ染色溶液中に再懸濁させ、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターで取得した。ＣＤ４５＋ＣＤ３８＋ＣＤ１３８＋ゲートでの平均蛍光強度（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７チャネルにおけるＭＦＩ）を、ＣＤ３２ｂ抗体の結合強度の尺度として使用した。正常形質細胞は、対照腫瘍Ｂ細胞株よりも強くないＣＤ３２ｂ染色を有し、一方で、５つの多発性骨髄腫患者サンプル中４つが、対照腫瘍Ｂ細胞株および正常形質細胞のいずれよりも強いＣＤ３２ｂ染色を有した（図２９）。これらのデータは、ＣＤ３２ｂが、多発性骨髄腫を含むＢ細胞悪性腫瘍を治療するための望ましい標的であり得ることを示す。
[実施例２８]
野生型およびＦｃ増強型ＮＯＶ２１０８は、ヒトＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ標的細胞の殺滅を効率的に媒介する
この実施例においては、実施例２４において上述の抗ＣＤ３２ｂ抗体クローン１０およびＮＯＶ２１０８を、ＮＫ細胞によるＡＤＣＣを媒介する能力に関して試験した。非フコシル化（Ａｆｕｃ）、野生型（ＷＴ）、およびＮ２９７Ａ（サイレンシング）形式のＮＯＶ２１０８、ならびにクローン１０（野生型およびＮ２９７Ａ）を、ＡＤＣＣアッセイにおいて、ＤＡＵＤＩ細胞を殺滅させる単離ヒトナチュラルキラー細胞を用いて試験した。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、フィコール勾配（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７−１４４０−０２）によってＬｅｕｋｏｐａｋ（ＨｅｍａＣａｒｅ、カタログ番号ＰＢ００１Ｆ−３）から単離した。ＮＫ細胞を、次いで、Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ（カタログ番号１３０−０９２−６５７）を使用して陰性選択した後、ＩＬ２を含有する培地（ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ、０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を含有）において、一晩インキュベートした。ルシフェラーゼ標識Ｄａｕｄｉ細胞を、９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９１７）において、１ウェル当たり１０，０００個の細胞の濃度で、抗体の連続希釈物とともに２０分間事前インキュベートした。ＮＫ細胞を、次いで、エフェクター対標的の比３：１で添加した。２時間の共インキュベーションの後に、Ｂｒｉｔｅｌｉｔｅ ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６０６６７６９、７０μｌ）を、各ウェルに添加したが、バックグラウンド対照ウェル（Ｄａｕｄｉ細胞のみ）は除く。Ｂｒｉｔｅｌｉｔｅを有する標的細胞（抗体またはＮＫなし）は、最大シグナル対照としての機能を果たし、一方で、Ｂｒｉｔｅｌｉｔｅなしの標的細胞は、バックグラウンド対照としての機能を果たした。発光シグナルを、続いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）において測定した。標的細胞の殺滅パーセントを、以下の式を使用して計算した：［１−（サンプル−バックグラウンド）／最大）］×１００％。ＮＯＶ２１０８−野生型は、クローン１０−野生型抗体よりも強力なＡＤＣＣを媒介したが、一方で、非フコシル化ＮＯＶ２１０８は、さらに増強されたＤａｕｄｉ細胞の殺滅を示した（図３０）。
ＮＫ媒介型殺滅アッセイおよびマクロファージ媒介型殺滅アッセイ（実施例２４）の両方において、同一のＦｃ形式（野生型）を有するＮＯＶ２１０８およびクローン１０を比較すると、ＮＯＶ２１０８−野生型は、いずれのエフェクター細胞型によっても、クローン１０−野生型よりも頑強な標的細胞殺滅を媒介した。したがって、ＮＯＶ２１０８は、クローン１０と比較すると、改善された抗ＣＤ３２ｂ ＡＤＣＣ抗体である。
[実施例２９]
ＧＭＢ白血病モデルの骨髄におけるアレムツズマブ耐性またはリツキシマブ耐性を調節することにおける、異なるＦｃ機能変異を有する抗ＣＤ３２ｂ抗体の役割の評価
Leskov et al. “Rapid generation of human B-cell lymphomas via combined expression of Myc and Bcl2 and their use as a preclinical model for biological therapies,”Oncogene 32(8):1066-72” (Leskov et al., 2013)は、ヒト化マウスにおける発生中のＢ細胞において、ヒトがん原遺伝子ｍｙｃおよびｂｃｌ−２の両方を共発現させることによる、攻撃的なヒトＢ細胞性白血病モデルＧＭＢについて報告している。ＧＭＢ白血病細胞は、ヒトＣＤ５２に特異的なヒト化モノクローナル抗体であるアレムツズマブに感受性であり、脾臓、肝臓、および血液からそれらの排除をもたらすが、ＮＳＧマウスの骨髄からは排除しない。このモデルを使用して、マクロファージが、不応性骨髄微小環境において抗体に媒介される細胞毒性の重要な決定因子であることが示された。興味深いことに、アレムツズマブ療法に対する耐性の１つの機序は、脾臓ではなく、骨髄における白血病細胞上のＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）の上方制御であることが示されており、特定の微小環境因子がＡＤＣＣ活性を制御することを示している（Pallasch et al (2014) “Sensitizing protective tumor microenvironments to antibody mediated therapy.” Cell 156: 590-162）。さらに、アレムツズマブ耐性ＧＢＭ細胞におけるｓｈＲＮＡを介してＣＤ３２ｂをノックダウンすると、細胞が、アレムツズマブ媒介型ＡＤＣＣ殺滅に対して再度感受性となった。これらのデータは、ＣＤ３２ｂ発現の増加が、アレムツズマブに対する耐性の機序であることを示唆する。ＣＤ３２ｂ Ｆｃ結合性ドメインを遮断するモノクローナル抗体によりＣＤ３２ｂを標的化することは、ｓｈＲＮＡを介してＣＤ３２ｂを枯渇させることと同様の結果をもたらし得ると仮定される。さらに、アレムツズマブ（または、Ｆｃ依存性の作用様式を有する他のモノクローナル抗体）および抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体の共投与により、耐性の発生を遅延することができる。
ＧＭＢ白血病細胞は、マクロファージ依存性様式で、アレムツズマブに媒介される殺滅を受けやすい（Pallasch et al. 2014）。公開されている研究において、ＧＭＢ白血病細胞を、ヒト免疫細胞が欠如した非ヒト化ＮＳＧマウスに移入した。アレムツズマブは、ＧＭＢ白血病細胞を、ＮＳＧマウスの脾臓、肝臓、および血液から排除することに成功したが、骨髄からは排除できなかった。
アレムツズマブ耐性またはリツキシマブ耐性を調節することにおける抗ＣＤ３２ｂ抗体（ＮＯＶ１２０６野生型、Ｆｃサイレント、ＡＤＣＣ増強（Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ Ｆｃ増強型変異体））の役割を、ＧＭＢ白血病モデルにおいて、抗ＣＤ３２ｂ標的化モノクローナル抗体を投薬し、ＣＤ３２ｂを標的として、インビボでアレムツズマブに対する白血病細胞の感受性を回復させることによるＧＭＢインビボ白血病モデルにおけるアレムツズマブ耐性もしくはリツキシマブ耐性の遅延または防止を測定することによって、モニタリングする。アレムツズマブが入手可能でない場合は、リツキシマブを代わりに使用し、ＢＭにおけるリツキシマブ耐性ＧＢＭ細胞が、ＣＤ３２ｂ発現の上方制御を示すという確認は保留する。
この実施例において、ＮＳＧマウスに、ＧＭＢ白血病細胞を接種し、以下の実験アームのうちの１つにランダムに割り当てる。
群１：ＰＢＳ
群２：アレムツズマブ（またはリツキシマブ）、Ｐａｌｌａｓｃｈらの論文の通りに投薬
群３：抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体（Ｆｃサイレンシング変異Ｎ２９７Ａを有する）［２０ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与、週１回］
群４：抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体（Ｆｃ増強型または野生型Ｆｃ）［２０ｍｇ／ｋｇ、静脈内、週１回］
群５：抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体（Ｆｃ増強型または野生型Ｆｃ）［２０ｍｇ／ｋｇ、静脈内、週１回］＋アレムツズマブまたはリツキシマブ
群６：抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体（Ｆｃサイレンシング変異Ｎ２９７Ａを有する）［２０ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与、週１回］＋アレムツズマブまたはリツキシマブ
群７：アレムツズマブ（またはリツキシマブ）とシクロホスファミド、Ｐａｌｌａｓｃｈらの論文の通りに投薬
ＧＭＢ細胞を、アレムツズマブに対する耐性時に群２のマウスの骨髄から採取し、ＦＡＣＳによってＣＤ３２ｂ発現に関して評価する（時間を一致させた未処置マウスのコホートが、対照としての機能を果たす）。群３は、Ｆｃ非依存性の抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体単剤活性を評価するための対照である。群５および６により、特に、骨髄腔において、Ｆｃ野生型（もしくはＦＣ増強型）またはＦｃサイレント（Ｎ２９７Ａ）モノクローナル抗体によるＣＤ３２ｂの標的化が、ＧＭＢ疾患負荷および応答の持続性に及ぼす治療的影響が明らかとなるはずである。群６により、ＣＤ３２ｂ抗体のＦｃ機能の不在下で、特に、骨髄において、ＣＤ３２ｂを標的とする抗体（ＣＤＲ特異的活性）でのＣＤ３２ｂの遮断が、アレムツズマブまたはリツキシマブに対する応答の深度および持続性に対して及ぼす特定の影響が明らかとなるはずである。これは、抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体のＦｃ依存性およびＣＤＲ依存性（Ｆｃ非依存性）活性により生じる治療的利点の解明に役立つであろう。
ＮＳＧマウスに、ＧＭＢ白血病細胞を接種し、Pallasch et al. (2014)によって記載されているように、骨髄における耐性が発生するまで、アレムツズマブまたはリツキシマブで処置する。アレムツズマブが入手可能でない場合は、リツキシマブを代わりに使用し、ＢＭにおけるリツキシマブ耐性細胞が、ＣＤ３２ｂ発現の上方制御を示すという確認は保留する。骨髄におけるアレムツズマブまたはリツキシマブ耐性の発生時に、マウスを、以下の実験処置群のうちの１つにランダムに割り当てる。加えて、この時点で、マウスのコホートを安楽死させ、骨髄腔におけるＧＭＢ白血病細胞を、ＦＡＣＳによるＣＤ３２ｂ発現の評価のために採取し、未処置マウスのものと比較する。Ｐａｌｌａｓｃｈの論文による所見に基づくと、骨髄におけるアレムツズマブ耐性ＧＭＢ細胞は、ＣＤ３２ｂ発現の増加を有することが想定される。
群１：ＰＢＳ
群２：アレムツズマブまたはリツキシマブ
群３：抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体（Ｎ２９７Ａ）
群４：抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体（Ｆｃ増強型または野生型Ｆｃ）
群５：抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体（Ｆｃ増強型または野生型Ｆｃ）＋アレムツズマブ
群６：抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体（Ｎ２９７Ａ）＋アレムツズマブまたはリツキシマブ
群７：アレムツズマブまたはリツキシマブ＋シクロホスファミド
群１、２、および３は、対照群であり、疾患の経過に影響を及ぼすことは想定されていない。群４により、Ｆｃ増強型抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体によるアレムツズマブまたはリツキシマブ耐性ＧＭＢの処置の治療的利点が明らかとなるはずである。群５および６により、骨髄ニッチにおけるアレムツズマブまたはリツキシマブ耐性を逆転させるＦｃ野生型（またはＦｃ増強型）およびＦｃサイレント（それぞれ）の抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体の潜在性が明らかとなるはずである。Ｆｃサイレンシング変異を有する後者の群により、ＣＤ３２ｂ Ｆｃ結合性ドメイン遮断（抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体のＣＤＲ特異的活性）が、特に、アレムツズマブまたはリツキシマブに対するＧＭＢ細胞の応答に及ぼす潜在的作用が明らかとなるはずである。
[実施例３０]
抗ＣＤ３２ｂ抗体の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）活性の評価
非フコシル化ＮＯＶ２１０８が、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）によってＣＤ３２ｂ陽性細胞を殺滅させる能力を評価するために、一連のインビトロ研究を行った。ＣＤＣアッセイにおいて、ＫＡＲＰＡＳ−４２２細胞を、異なる抗体濃度および固定濃度のウサギ補体とともにインキュベートした。２時間後に、ＫＡＲＰＡＳ−４２２細胞の濃度依存性殺滅を、細胞内ＡＴＰ濃度、すなわち、ＡＴＰを消費するルシフェリン−ルシフェラーゼ系によって産生される発光により、細胞の生存率を測定することによって、分析する。
ＫＡＲＰＡＳ−４２２細胞を採取し、１．７×１０５個の細胞／ｍＬの濃度となるように調節し、５０μｌの懸濁液を、白色の平底９６ウェルのマイクロタイタープレートのすべてのウェルに添加した。次いで、アッセイ緩衝液中の非フコシル化ＮＯＶ２１０８（６２．８ｍｇ／ｍＬ）およびＭａｂＴｈｅｒａ（ロット番号Ｈ０１６５Ｂ０９、１０ｍｇ／ｍＬ）の８回連続希釈物を、Ｕ底マイクロタイタープレートにおいて、最終アッセイ濃度３０，０００ｎｇ／ｍＬ、６０００ｎｇ／ｍＬ、１２００ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、４８ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、および０．４ｎｇ／ｍＬとなるように三連に調製し、５０μｌの希釈物を、ＫＡＲＰＡＳ−４２２細胞を含有するアッセイプレートに移した。最後に、アッセイ緩衝液中１：８に希釈した５０μｌのウサギ補体を、アッセイプレートに添加し、プレートを、プレートシェーカーにおいて、６０秒間、緩徐に揺すった。
対照として、アッセイ緩衝液を、サンプルと同様に擬似希釈した。加えて、サンプルおよび補体なしの細胞を含むブランク対照、抗体を含まない陰性対照、および抗体を含まないが細胞の完全な溶解のために１％トリトンＸ−１００を含む陽性対照を、八連で含めた。
３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした後、１００μＬの再構成したＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ溶液を、すべてのウェルに添加し、プレートを、室温で３０分間、最初の１５分の間は緩徐に振盪させながらインキュベートした。最後に、発光を測定した。
ＮＯＶ２１０８および陽性対照のＭａｂＴｈｅｒａは、このＣＤＣアッセイにおいて、ＫＡＲＰＡＳ−４２２細胞の用量依存性殺滅を示した（図３５）。これらのデータは、非フコシル化ＮＯＶ２１０８が、補体に結合し、ＣＤ３２ｂ陽性細胞をＣＤＣによって殺滅させることができることを示す。予想した通り、緩衝液対照は、この実験において、生存細胞の数を低減させることはなかった。
[実施例３１]
マクロファージは、ＣＤ３２ｂ陽性であるが、抗ＣＤ３２ｂ抗体に媒介される溶解（ＮＫ細胞による）または貪食（他のマクロファージによる）に対してより耐性である
マクロファージは、ＣＤ３２ｂ、ならびにＦｃγＲファミリーの他のメンバーを発現することが知られている。マクロファージが、抗ＣＤ３２ｂ抗体によって標的とされ、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰ機序を介して殺滅され得ることが起こり得る。
マクロファージは、ＣＤ３２ｂを発現する。
まず、抗ＣＤ３２ｂ抗体が、マクロファージに結合するかどうかを判定した。ヒト単球由来のマクロファージを、実施例２４に記載のように分化させた。９６ウェルの平底プレートに付着させたマクロファージを、Ａｌｅｘａｆｌｏｕｒ ６４７標識した抗ＣＤ３２ｂ抗体２Ｂ６（Ｎ２９７Ａ Ｆｃサイレンシング型変異体）とともに、０．５ｕｇ／ｍｌ染色溶液ＰＢＳ＋２％ＩＦＳで、氷上において３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回続けて洗浄した後、細胞を、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで取得した。Ｄａｕｄｉ細胞を、陽性対照として使用し、同じ染色条件で懸濁細胞として染色した。Ａｌｅｘａｆｌｏｕｒ６４７標識した抗ニワトリリゾチーム抗体（Ｎ２９７Ａ変異体）を、ＩｇＧ対照として使用した。ＦＡＣＳヒストグラムは、記録した事象の数（ｙ軸）に対するＭＦＩとしての相対染色レベル（ｘ軸）を示す。抗ＣＤ２３ｂ抗体２Ｂ６による染色（実線）を、ＩｇＧ対照のもの（黒塗りの破線）と重ねている。マクロファージは、複数のＦｃγＲ、特に、高親和性Ｆｃ受容体であるＦｃγＲＩにより予想される通り、ＩｇＧ対照へのバックグラウンド結合を示した（図３６ａ）。マクロファージへの２Ｂ６の結合は、ＩｇＧ対照よりも高く、マクロファージが、ＣＤ３２ｂ陽性であることを示す。しかしながら、マクロファージの２Ｂ６およびＩｇＧ対照の間のシフトは、Ｄａｕｄｉ細胞よりも小さい（図３６ａ、図３６ｂ）。
マクロファージは、Ｄａｕｄｉよりも、ＮＫ細胞による抗ＣＤ３２ｂ抗体媒介性ＡＤＣＣに対する感受性が低い。
次に、抗ＣＤ３２ｂ抗体ＮＯＶ２１０８（非フコシル化）を用いたインビトロＡＤＣＣアッセイにおいて、マクロファージとＤａｕｄｉとを比較した。ＮＫ細胞を、実施例１７に記載されるように、異なるドナーから単離した。付着マクロファージを、９６ウェルの平底プレート（１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ中４ｕｇ／ｍｌ、６０ｕｌ／ウェル）において、１時間、カルセインＡＭで標識した。マクロファージまたはＤａｕｄｉに対する標的細胞の数は、６０，０００個／ウェルであり、１２０，０００個のＮＫ細胞／ウェルを、エフェクター：標的の比２：１に使用した。ＡＤＣＣアッセイを、実施例１７に記載されるように行った。標的細胞の溶解を、２時間後に測定した。Ｄａｕｄｉ細胞は、ＮＫ細胞によって効率的に溶解されたが、マクロファージは、ＡＤＣＣに対してより耐性であり（図３７）、高濃度の非フコシル化ＮＯＶ２１０８においてのみ、低いレベルの溶解が観察された。
マクロファージは、抗ＣＤ３２ｂ抗体に媒介されるＡＤＣＰに対して耐性である
ＮＯＶ２１０８は、ＡＤＣＰ機序を介して、ＣＤ３２ｂ陽性細胞株Ｄａｕｄｉ（実施例２４）の効率的な殺滅を媒介し得る。マクロファージは、ＣＤ３２ｂ陽性であるため、マクロファージが、抗ＣＤ３２ｂ抗体の存在下において互いに貪食を起こし得るかどうかを判定しようと試みた。低速度共焦点撮像を使用して、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した細胞の貪食を可視化した。マクロファージの区別のために、ペトリ皿を使用して、細胞が表面に付着するのを低減させた。エフェクター細胞のマクロファージを、血清不含ＲＰＭＩ培地において、１０分間、０．２μＭ Ｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ緑色（カタログ番号Ｃ７０２５）で標識した。標的細胞のｄａｕｄｉまたはマクロファージを、０．５ｕＭ Ｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ赤色（カタログ番号Ｃ３４５５２）で１０分間標識した。エフェクターマクロファージ（緑色）を、撮像の１日前に、標識し、８ウェルのマイクロスライド（Ｉｂｉｄｉ、カタログ番号８０８２６）に蒔き、一方で標的細胞は、撮像の直前に標識した。
撮像は、４０×／１．３０ Ｏｉｌ Ｐｈ３対物レンズを備えるＺｅｉｓｓスピニングディスク共焦点顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１）で行った。全細胞を画像化するために、Ｚ軸スタック画像を撮った（横方向分解能約０．５ｕｍ、軸方向分解能約２ｕｍ）。レーザー出力を、４０５ｎｍ（ＳＹＴＯＸ（登録商標）青色）、４８８ｎｍ（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）緑色ＣＭＦＤＡ色素）、５６１ｎｍ（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）赤色ＣＭＴＰＸ色素）、および６３３ｎｍ（抗体標識Ａｌｅｘａ−６４７）のレーザーについて、それぞれ、３．００％、３．５０％、５．８０％、および４．００％に設定した。カメラの露光は、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、および６３３ｎｍのチャネルについて、それぞれ、３０ミリ秒、４０ミリ秒、６０ミリ秒、および３５ミリ秒の露光に設定した。顕微鏡用インキュベーターを使用して、細胞を、全撮像時間の間、摂氏３７度、５％ＣＯ２に保った。画像は、１ウェル当たり４つの位置で、１０分間隔で４時間にわたって取得した。すべての画像取得および画像処理は、Ｚｅｎ Ｂｌｕｅソフトウェアを用いて行った。貪食された細胞の数を定量するために、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）赤色ＣＭＴＰＸで標識したＤａｕｄｉ細胞またはマクロファージを、最大２４０分間（２４個の時点で）、フレームごとに手作業で計数した。次いで、フレームごとの貪食された細胞の割合を、計算した。最後に、１ウェル当たり３〜４つの位置の時点ごとの割合を、平均化して、処置ウェルごとの貪食の平均割合を得た。図３８に示されているすべてのデータは、各処置条件で１ウェル当たり４つの位置の複製を表す。
赤色で標識したＤａｕｄｉ細胞は、緑色のマクロファージによって効率的に貪食された（３０分以内に８０％に達し、６０分までに９５％に達する）。４時間の実験の間、互いに貪食したマクロファージの検出数は最小限であり、非フコシル化ＮＯＶ２１０８を添加した場合およびＩｇＧ対照を添加した場合でも、ウェル間に差はなかった。
[実施例３２]
ＣＤ３２ｂに対する抗ＣＤ３２ｂ抗体の結合親和性
ｈｕＣＤ３２ｂに対するＩｇＧの結合親和性を判定するために、バイオセンサーに共有結合で固定したＩｇＧおよび検体として機能するｈｕＣＤ３２ｂ受容体を用いて、３回の独立した直接的結合アッセイを行った。続いて、すべてのフローセルに、検体希釈系列を注入することによって、動態データを得た。フローセル１（チップ１）は、参照としての機能を果たした。
５５０ＲＵの非フコシル化ＮＯＶ２１０８およびＦｃサイレントＮＯＶ２１０８［Ｎ２９７Ａ］を、標準的なアミンカップリング化学反応を使用して、ＣＭ５センサーチップに固定した。加えて、Ｆｃ部分を介したＣＤ３２ｂへの結合を除外するために、陰性対照として使用したサイレント型の抗ニワトリ−リゾチーム−ｈＩｇＧ１［Ｎ２９７Ａ］を、チップに固定した。泳動緩衝液中の脱グリコシル化ｈｕＣＤ３２ｂの希釈系列、０．６１〜５０００ｎＭ（１：２希釈系列）を、表面上に注入した（流速：３０μｌ／分、結合時間：６０秒、解離時間：１２０秒）。チップの表面は、各検体を注入する前に、１回の基本的な洗浄ステップにより再生させた（３０μｌ／分、接触時間：３０秒、安定化期間：２５０秒）。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン１．０を使用して評価した。未加工のデータを、二重参照した。すなわち、測定するフローセルの応答を、参照フローセルの応答に対して補正し、第２のステップで、ブランク注入の応答を、差し引いた。外れ値のセンサグラムは、必要に応じて除去した。センサグラムは、１：１結合モデルを適用して、動態速度定数および解離平衡定数を計算することによって、当てはめた。Ｒｍａｘを、グローバルに設定し、一方で、ＲＩは部分的に当てはめた。データを、各実行ごとに個別に処理した。生成された値を使用して、それぞれの動態定数の平均値および標準偏差を計算した。
ＮＯＶ２１０８（Ｎ２９７Ａ）のＦｃサイレントバージョンは、１８±３ｎＭのＫＤでＣＤ３２ｂに結合する（表６を参照されたい）。ＮＯＶ２１０８（非フコシル化形式）は、１回の実験で、ＦｃサイレントＮＯＶ２１０８と同様の親和性を示し、ＫＤは１６ｎＭであった。サイレンシング型抗ニワトリ−リゾチームＩｇＧのヒトＣＤ３２ｂとの相互作用に関して、結合は観察されなかった。したがって、Ｆｃ部分を介したＣＤ３２ｂへの結合は、除外することができる。
[実施例３３]
ＮＯＶ２１０８の非フコシル化により、Ｂ細胞殺滅の増強が促進され、単球および顆粒球の生存が保持される
ヒト全血におけるＦｃ野生型および非フコシル化抗ｈｕ ＣＤ３２ｂ反応性モノクローナル抗体ＮＯＶ２１０８によって誘導される殺滅の選択性の評価
Ｆｃ野生型および非フコシル化の抗ｈｕ ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体ＮＯＶ２１０８がＣＤ３２ａ／ｂ陽性免疫細胞サブセットの殺滅を誘導する潜在性を、ヒト全血において評価した。様々な濃度の試験抗体および対照抗体（アイソタイプが一致するＦｃ野生型および非フコシル化（ａｆｕｃ））を、１０人の異なる健常ドナーに由来するヘパリン処理した全血とともに、２４時間インキュベートした。Ｂ細胞、単球、および顆粒球の絶対数を、生存性色素を使用して死細胞を除外した後、ＣＤ１９、ＣＤ１４、およびＣＤ４５に対するマーカー抗体で刺激した全血の免疫表現型判定を行った後に、フローサイトメーターで測定した。枯渇の割合を、緩衝液対照を用いて測定された絶対数と比較した、試験抗体によって誘導された絶対数の変化に基づいて、計算した：１００−（絶対数（試験条件×１００／絶対数（緩衝液））。ＮＯＶ２１０８の非フコシル化Ｆｃバリアントは、全体的に、Ｆｃ野生型バリアントと比較して強いＢ細胞殺滅を誘導し（図３９ａ）、単球（図３９ｂ）および顆粒球（図３９ｃ）の生存数には影響を及ぼさなかった。
[実施例３４]
Ｆｃ野生型およびＦｃ修飾型の抗ＣＤ３２ｂ抗体による、初代ＮＫ細胞によって作動されるＫａｒｐａｓ６２０がん細胞株に対する特異的ＡＤＣＣ活性の評価
初代ＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイを利用して、ＣＤ３２ｂ陽性Ｋａｒｐａｓ６２０細胞に対するＣＤ３２ｂ反応性抗体のＦｃ依存性活性を評価した。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、フィコール勾配によって、Ｌｅｕｋｏｐａｋ（ＨｅｍａＣａｒｅ、カタログ番号ＰＢ００１Ｆ−３）から単離した。ＮＫ細胞を、次いで、Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ（カタログ番号１３０−０９２−６５７）を使用して陰性選択した後、１００ｐｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号２００−０２）の存在下において、基礎培地（ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ／１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１％Ｌ−グルタミン／１％ペニシリンストレプトマイシン）において、一晩インキュベートした。翌日、Ｋａｒｐａｓ６２０細胞を、カルセインアセトキシ−メチルエステル（カルセイン−ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ｃ３１００ＭＰ）で染色し、２回洗浄し、９６ウェルのＵ底マイクロタイタープレートに、１ウェル当たり１０，０００個の細胞の濃度で移した。細胞を、次いで、抗体の連続希釈物とともに２０分間事前インキュベートした後、エフェクター細胞を、エフェクター対標的の比５：１で添加した。共インキュベーションの後に、マイクロタイタープレートに遠心分離を行い、上清流体のアリコートを、別のマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９０４）に移し、溶液中の遊離カルセインの濃度を、蛍光計数装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて判定した。標的細胞のみ、および１％トリトン（Ｓｉｇｍａ、９３４４３）を含む標的細胞を、対照として含めた。標的細胞のみは、自発的放出の機能を果たし、一方で１％トリトンを有する標的細胞は、最大放出の機能を果たした。標的細胞特異的溶解パーセントを、以下の式を使用して計算した：［（サンプル−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）］×１００％。
抗ＣＤ３２ｂ抗体ＮＯＶ２１０８の３つのバージョンを試験した：Ｆｃ野生型、非フコシル化（Ｆｃ増強型）、およびＮ２９７Ａ（Ｆｃサイレンシング型）。Ｆｃ野生型ＮＯＶ２１０８は、Ｋａｒｐａｓ６２０細胞において効率的なＡＤＣＣを媒介し、活性は、非フコシル化ＮＯＶ２１０８によって増強された（図４０）。予測した通り、ＮＯＶ２１０８のＦｃサイレントＮ２９７Ａバージョンは、ＩｇＧアイソタイプと同様に不活性であり、ＮＫ細胞活性化およびＭＭ細胞溶解には、機能性Ｆｃが必要であることが確認された。
[実施例３５]
レナリドマイドでのＰＢＭＣの事前処置により、ＮＯＶ１２１６−ａｆｕｃのＡＤＣＣ活性が強化される
免疫調節薬であるレナリドマイド（ＬＥＮ）は、リンパ球機能の抗腫瘍作用を調節することができ、これにより、ＮＫ細胞が活性化され、細胞毒性の増加をもたらす。ＬＥＮが、ＡＤＣＣ活性を強化させ得るかどうかを判定するために、ＰＢＭＣまたはＴ細胞枯渇ＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用し、Ｄａｕｄｉを、標的として使用した。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、フィコール勾配によって、Ｌｅｕｋｏｐａｋ（ＨｅｍａＣａｒｅ、カタログ番号ＰＢ００１Ｆ−３）から単離した。Ｔ細胞は、ＣＤ３ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０５０−１０１）を使用することによって、ＰＢＭＣから陽性枯渇させた。ＰＢＭＣまたはＴ細胞枯渇ＰＢＭＣを、３μＭ ＬＥＮまたは等体積のＤＭＳＯ（擬似）を補充した組換えＩＬ−２を含まない基礎培地（ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ／１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１％Ｌ−グルタミン／１％ペニシリンストレプトマイシン）において、７２時間インキュベートした後、ＮＫ細胞の単離およびＡＤＣＣアッセイを行った（実施例１７に記載の通り）。ＬＥＮで事前処置したＰＢＭＣから単離したＮＫ細胞は、抗ＣＤ３２ｂ抗体非フコシル化ＮＯＶ１２１６の存在下において、擬似処置したＰＢＭＣからのＮＫ細胞よりも高いＤａｕｄｉに対するＡＤＣＣ活性を示した（図４１）。このデータは、ＣＤ３２ｂ＋リンパ腫および骨髄腫の処置における抗ＣＤ３２ｂ抗体とレナリドマイドとの組合せに対する裏付けを提供する。
ＬＥＮが、Ｔ細胞を活性化させ、Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌を増加させ得、これが、ＮＫ細胞を活性化することが、示唆されている。したがって、単離の際にＰＢＭＣからＴ細胞を枯渇させ、ＬＥＮでの７２時間の事前処置を繰り返した。Ｔ細胞枯渇単独では、擬似処置ＰＢＭＣから単離したＮＫ細胞によるＮＯＶ１２１６に媒介されるＡＤＣＣ活性に対して、最小限の作用のみを有した。ＡＤＣＣアッセイにおいてエフェクター細胞として使用したのはＮＫ細胞だけであったため、ＮＫ細胞の活性に対するＬＥＮの直接的な作用は、有意ではない。しかしながら、ＬＥＮでのＰＢＭＣの事前処置によって増強されるＡＤＣＣ活性は、ＬＥＮ処置の前にＴ細胞を枯渇させた場合には大幅に抑止され、ＬＥＮおよびＮＫ細胞の活性化に応じたＴ細胞の重要な役割を裏付ける。
[実施例３６]
ＣＤ３２ｂ低ＫＭＳ−１２−ＢＭ皮下異種移植片を保有するマウスにおける抗ＣＤ３２ｂ ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体抗体およびＨＤＡＣ阻害剤パノビノスタットを組み合わせることに伴うインビボ活性
この実施例では、ＣＤ３２ｂ低ＭＭ異種移植片ＫＭＳ−１２−ＢＭを保有するマウスにおける、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体ＣＤ３２ｂ標的化抗体を市販のＨＤＡＣ阻害剤であるパノビノスタットと組み合わせることの治療的利点を探求する。
ＫＭＳ−１２−ＢＭ細胞株におけるＣＤ３２ｂ発現のレベルを、２Ｂ６抗体を使用したフローサイトメトリーによって判定した。ＫＭＳ−１２−ＢＭ細胞を計数し、１ｍｌ当たり１×１０６個の細胞で、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ１×）中に懸濁させた。２００，０００個の細胞／ウェル（２００μｌ）を、次いで、Ｕ底９６ウェルプレートに分注した。プレートを、１２００ｒｐｍで５分間回転させ、上清を廃棄した。細胞を、次いで、１ｕｇ／ｍｌの２Ｂ６抗体またはＩｇＧ対照を含有する１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回続けて洗浄した後、細胞を、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで取得した。ＦＡＣＳヒストグラムは、記録した事象の数（ｙ軸）に対するＭＦＩとしての相対染色レベル（ｘ軸）を示す。抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体による染色（実線）を、ＩｇＧ対照のもの（黒塗りの破線）と重ねている（図４２）。これらのデータは、ＫＭＳ−１２−ＢＭが、ＣＤ３２ｂをほとんど発現しないことを示す。
雌性のヌードマウスに、ＰＢＳで希釈した５０％フェノールレッド不含マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に懸濁した１０×１０６個のＫＭＳ−１２−ＢＭ細胞（注射体積１００μｌ）を皮下に埋め込んだ。マウスは、埋込みの７日後に、平均腫瘍体積２１０ｍｍ３で研究に登用した。４つの実験群（ｎ＝７匹／群）のうちの１つにランダムに割り当てた後、マウスに、以下の処置を静脈内投与した：（１）ＰＢＳ、（２）ＮＯＶ２１０８（ｅＡＤＣＣマウスＩｇＧ２ａ（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）、１０ｍｇ／ｋｇ、２週間に１回）、（３）パノビノスタット（１２ｍｇ／ｋｇ、１４日のサイクルで２日に１回×５回、続いて４日間の休薬）、ならびに前述の用量およびスケジュールで（１）＋（３）の組合せ。腫瘍量および体重を、１週間に２回、評価した。腫瘍が８００ｍｍ３に達するとして定義される、エンドポイントまでの時間もまた、評価した。ＮＯＶ２１０８のｅＡＤＣＣマウスＩｇＧ２ａバージョンを、マウス免疫エフェクター細胞における治療用抗体ＦｃとＦｃγＲとの間の最適な相互作用に関連する治療潜在性を反映するために、利用した。
ＮＯＶ２１０８（ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体マウスＩｇＧ２ａ）およびパノビノスタットの単剤処置は、平均腫瘍体積に対する影響が限定されていたい（図４３）。これら２つの処置の組合せは、抗腫瘍活性の増加をもたらした。具体的には、組合せ処置により、単剤群よりも有意な（Ｐ＜０．０５）抗腫瘍活性（腫瘍体積変化パーセント）をもたらした（３つすべての実験群が処置継続のままとなった場合には、２８日目が、最終時点を表す）。組合せはまた、エンドポイント（８００ｍｍ３）までの時間も増加させた。これらのデータは、ＨＤＡＣ阻害剤であるパノビノスタットが、ＣＤ３２ｂ低ＭＭ異種移植片を、ＣＤ３２ｂ標的化ＮＯＶ２１０８（ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体マウスＩｇＧ２ａ）に対して感受性にすることを示す。データは、ＭＭを有する患者において、抗ＣＤ３２ｂ標的化抗体およびＨＤＡＣ阻害剤、例えば、パノビノスタットの組合せを試験することに関する論理的根拠を提供する。
[実施例３７]
ＤＡＵＤＩ異種移植片を保有するヌードマウスにおける非フコシル化抗ＣＤ３２Ｂ抗体ＮＯＶ２１０８のインビボでの用量応答活性
非フコシル化抗ＣＤ３２ｂ ＮＯＶ２１０８ヒトＩｇＧ１の用量依存性抗腫瘍活性を探究するために、インビボ有効性実験を、皮下Ｄａｕｄｉ異種移植片を保有するヌードマウスにおいて行った。ＮＯＶ１２１６もまた、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）マウスＩｇＧ２ａフレームワークとして、この実験に含めた。雌性のヌードマウスに、ＰＢＳで希釈した５０％フェノールレッド不含マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に懸濁した５×１０６個のＤａｕｄｉ細胞（注射体積１００μｌ）を皮下に埋め込んだ。マウスは、埋込みの１０日後に、平均腫瘍体積およそ２２０ｍｍ３で研究に登用した。６つの実験群（ｎ＝７匹／群）のうちの１つにランダムに割り当てた後、マウスに、以下の処置を静脈内投与した：（１）ＰＢＳ、（２）非標的化非フコシル化アイソタイプ対照（３０ｍｇ／ｋｇ、週１回）、（３）非フコシル化ＮＯＶ２１０８（３ｍｇ／ｋｇ、週１回）、（４）非フコシル化ＮＯＶ２１０８（１０ｍｇ／ｋｇ、週１回）、（５）非フコシルＮＯＶ２１０８（３０ｍｇ／ｋｇ、週１回）、および（６）ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体マウスＩｇＧ２ａ ＮＯＶ１２１６（１０ｍｇ／ｋｇ、３週間に１回）。腫瘍体積および体重を、１週間に２回、評価した。ＮＯＶ１２１６のｅＡＤＣＣマウスＩｇＧ２ａバージョンを、マウス免疫エフェクター細胞における治療用抗体ＦｃとＦｃγＲとの間の最適な相互作用に関連する治療能力を反映するために、利用した。
非フコシル化ＮＯＶ２１０８は、皮下に植え込んだＤａｕｄｉ異種移植片を保有するマウスにおいて、用量依存性の抗腫瘍性活性を示した（図４４）。ＮＯＶ１２１６ ｅＡＤＣＣ ｍＩｇＧ２ａ群からの１匹のマウスは、処置に応答することができなかったため、２８日目で、過剰な腫瘍体積に起因して研究から除外した。週１回で３ｍｇ／ｋｇの用量を投与したマウスの腫瘍成長は、ＰＢＳまたは非標的化対照抗体（３０ｍｇ／ｋｇ、週１回）を投与したマウスのものと区別できなかった。しかしながら、１０または３０ｍｇ／ｋｇで週１回投与した非フコシル化ＮＯＶ２１０８は、著しい腫瘍成長の阻害をもたらした。ＮＯＶ２１０８のものと高度に類似する可変領域を有し、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体マウスＩｇＧ２ａとして投与された、ＮＯＶ１２１６は、より高い用量（３０ｍｇ／ｋｇ、週１回）で、非フコシル化ＮＯＶ２１０８で観察されたものとほぼ同様の著しい抗腫瘍活性をもたらした。これらのデータは、宿主免疫エフェクター細胞ＦｃγＲｓと治療用モノクローナル抗体Ｆｃ領域との間の最適化相互作用と関連して、治療的利点を強調する。
[実施例３８]
ＫＡＲＰＡＳ６２０ ＭＭ皮下異種移植片を保有するヌードマウスにおける非フコシル化ＮＯＶ２１０８の抗腫瘍活性
非フコシル化抗ＣＤ３２ｂ ＮＯＶ２１０８ヒトＩｇＧ１の用量依存性抗腫瘍活性を探究するために、インビボ有効性実験を、皮下ＫＡＲＰＡＳ６２０ ＭＭ異種移植片を保有するヌードマウスにおいて行った。雌性のヌードマウスに、ＰＢＳで希釈した５０％フェノールレッド不含マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に懸濁した１×１０６個のＫＡＲＰＡＳ６２０細胞（注射体積１００μｌ）を皮下に埋め込んだ。マウスは、埋込みの１０日後に、平均腫瘍体積およそ２２０ｍｍ３で研究に登用した。３つの実験群（ｎ＝８匹／群）のうちの１つにランダムに割り当てた後、マウスに、以下の処置を静脈内投与した：（１）ＰＢＳ、（２）非フコシル化ＮＯＶ２１０８（１０ｍｇ／ｋｇ、週１回）、および（３）非フコシル化ＮＯＶ２１０８（３０ｍｇ／ｋｇ、週１回）。腫瘍体積および体重を、１週間に２回、評価した。
非フコシル化ＮＯＶ２１０８は、皮下に植え込んだＫＡＲＰＡＳ６２０異種移植片を保有するマウスにおいて、顕著な抗腫瘍性活性を示した（図４５）。両方の用量レベルで同様の抗腫瘍効果が観察され、これが、達成可能な最大の抗腫瘍活性であり得ることが示唆された。これらのデータは、非フコシル化ＮＯＶ２１０８がＭＭを有する患者において有し得る治療的利点の根拠を提供する。
[実施例３９]
Ｄａｕｄｉ異種移植片を保有するヌードマウスにおいて、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体ＮＯＶ２１０８の静脈内投与が腫瘍内マクロファージ含量に対して及ぼす影響
ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体ＮＯＶ２１０８（Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）の静脈内投与が、Ｆ４／８０ ＩＨＣ陽性によって判定される腫瘍内マクロファージ含量に対して有する影響を探究するために、皮下Ｄａｕｄｉ異種移植片を保有するヌードマウスにおいて、インビボ実験を行った。雌性のヌードマウスに、ＰＢＳで希釈した５０％フェノールレッド不含マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に懸濁した５×１０６個のＤａｕｄｉ細胞（注射体積１００μｌ）を皮下に埋め込んだ。マウスは、埋込みの１０日後に、平均腫瘍体積およそ２００ｍｍ３で研究に登用した。実験は、２つの部からなった。第１のコホート（ｎ＝３匹／群）には、（１）ＰＢＳ、（２）ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体非標的化アイソタイプ対照、１０ｍｇ／ｋｇ、週１回×２回、または（３）ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体ＮＯＶ２１０８、１０ｍｇ／ｋｇ、週１回×２回を受容させた。２回目の投薬の３日後（１回目の投薬の１０日後）に、腫瘍を採取し、ＩＨＣによってＦ４／８０免疫反応性に関して評価した。第２のコホートには、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体ＮＯＶ２１０８の単回静脈内投与を受容させた。続いて、投薬の７日後、１０日後、１４日後、および２１日後（１時点につきｎ＝３匹）に、腫瘍を採取し、ＩＨＣによってＦ４／８０免疫反応性に関して評価した。
所定の時点それぞれにおいて、腫瘍を、即座に切除し、１０％緩衝ホルマリン中に２４時間固定し、処理まで７０％ＥｔＯＨ中に移した（日常的な組織学的手順を使用して、パラフィン中に包埋し、組織切片を、３．５ｕｍに切断した）。ウサギモノクローナル抗マウスＦ４／８０ ＩｇＧ（クローンＳＰ１１５、Ｓｐｒｉｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。正常なマウスリンパ系組織が、陽性対照の機能を果たした。
最適化されたＩＨＣプロトコル（Ｖｅｎｔａｎａビオチン不含ＤＡＢ検出系、Ｖｅｎｔａｎａ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＸＴ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐｌａｔｆｏｒｍ）には、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ＃１抗原賦活化試薬への標準的な曝露が含まれた。一次抗体を、ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ中で１：２００の濃度に希釈し、１００ｕｌ体積で適用し、室温で６０分間インキュベートした。続いて、Ｖｅｎｔａｎａ ＯｍｎｉＭａｐ事前希釈済みＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ二次抗体（カタログ番号７６０−４３１１）とのインキュベーションを、４分間行った。次いで、二次抗体を、ＣｈｒｏｍｏＭａｐ ＤＡＢキットを使用して検出し、スライドを、Ｖｅｎｔａｎａヘマトキシリンで４分間対比染色した後、Ｖｅｎｔａｎａ Ｂｌｕｉｎｇ試薬で４分間対比染色した。スライドを、漸増濃度のエタノール（９５〜１００％）において脱水した後、キシレン中で脱水し、その後、カバーガラスをかけた。カバーガラスをかけたスライドを、光学顕微鏡によって評価し、Ｌｅｉｃａ／Ａｐｅｒｉｏ ＳｃａｎＳｃｏｐｅスライドスキャナー（Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）によってスキャニングした。次いで、デジタル画像を、Ｌｅｉｃａ ｅＳｌｉｄｅ Ｍａｎａｇｅｒ／Ａｐｅｒｉｏ Ｓｐｅｃｔｒｕｍからの画像を起動させるＩｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ ＨＡＬＯ（Ｃｏｒｒａｌｅｓ、ＮＭ）によって、確認し、分析した。代表的な組織学的画像を、Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ ＨＡＬＯ（Ｃｏｒｒａｌｅｓ、ＮＭ）内の図面マーカーモジュールを使用して捕捉した。染色したスライドをスキャニングした画像を、搭載されたＬｅｉｃａ ｅＳｌｉｄｅ Ｍａｎａｇｅｒ／Ａｐｅｒｉｏ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）の開口部から、Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ ＨＡＬＯ（Ｃｏｒｒａｌｅｓ、ＮＭ）に上げた。データは、陽性組織パーセントとして表す。
ＰＢＳ処置対照と比較して、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体ＮＯＶ２１０８は、１０ｍｇ／ｋｇ、週１回×２回の投薬レジメンの後に、ＤＡＵＤＩ異種移植片におけるＦ４／８０免疫反応性の増加をもたらした（図４６）。この図において、白抜きの図形は、１匹の動物からのデータを表し、一方で、黒塗りの図形は、処置を表す。これらのデータは、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体ＮＯＶ２１０８の静脈内投与が、腫瘍内マクロファージ数の増加をもたらすことを示す。これは、非標的化ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体の陰性対照抗体を投与したマウスにおいては観察されておらず、ＣＤＲに媒介されるＤａｕｄｉ細胞上のＣＤ３２ｂへの結合が、マクロファージを腫瘍に動員するには必要であったことが確認された。加えて、単回の１０ｍｇ／ｋｇ静脈内用量として投与した場合に、ｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体ＮＯＶ２１０８は、投薬の７日後に腫瘍内マクロファージ数の増加をもたらした。腫瘍内マクロファージ含量は、後続の時点では減少し、投薬後の後半の時点ではほぼ投薬前のレベルとなった。これらのデータは、インビボでのｅＡＤＣＣ Ｆｃ変異体ＮＯＶ２１０８のＦｃおよびＣＤＲ依存性活性を媒介することにおけるマウスマクロファージの役割を裏付ける。データはまた、投薬スケジュールを誘導するために、バイオマーカーとして腫瘍内免疫細胞浸潤を使用することに関する論理的根拠も提供する。
別途定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する分野に精通した専門家によって通常理解されているものと同じ意味を有する。
別途示されない限り、当業者には明らかであろうように、具体的に詳述されていないすべての方法、ステップ、技法、および操作は、本質的に公知の様式で実行することができ、実行されている。さらに、例えば、標準的な教本および本明細書に記載されている一般的な背景技術、ならびにそこに引用されているさらなる参考文献への参照がなされる。別途示されない限り、本明細書に引用されている参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる。
本発明に対する特許請求の範囲は、非限定的であり、以下に提供される。
特定の態様および特許請求の範囲を、本明細書に詳細に開示しているが、これは、例証のみを目的とする例として行われたものであり、添付の特許請求の範囲または特許請求される主題の対応する今後のあらゆる適用の範囲に関して、限定的であることを意図するものではない。特に、特許請求の範囲によって定められる本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な置換、変更、および修正が、本開示になされ得ることが、本発明者らによって企図される。核酸出発物質、目的のクローン、またはライブラリーの種類の選択は、本明細書に記載されている態様の理解があれば、当業者の日常的な事柄であると考えられる。他の態様、利点、および修正が、以下の特許請求の範囲内に含まれると考えられる。当業者であれば、日常的な実験を使用するだけで、本明細書に記載されている本発明の特定の態様の多数の均等物を認識するか、または解明することが可能であろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。今後出願される対応する出願における特許請求の範囲の書き直しが、各国の特許法による制限に起因して生じる可能性があるが、特許請求の範囲の主題を放棄すると解釈されるものではない。

Claims (67)

  1. 単離抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、
    （ａ）配列番号１、４、７、５３、５６、５９、１０５、１０８、１１１、１５７、１６０、１６３、２０９、２１２、２１５、２６１、２６４、２６７、３１３、３１６、３１９、３６５、３６８、３７１、４１７、４２０、４２３、４６９、４７２、４７５、５２１、５２４、５２７、５４７、５５０、５５３、５７３、５７６、５７９、６２５、６２８、および６３１のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号２、５、８、５４、５７、６０、１０６、１０９、１１２、１５８、１６１、１６４、２１０、２１３、２１６、２６２、２６５、２６８、３１４、３１７、３２０、３６６、３６９、３７２、４１８、４２１、４２４、４７０、４７３、４７６、５２２、５２５、５２８、５４８、５５１、５５４、５７４、５７７、５８０、６２６、６２９、および６３２のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２、
    （ｃ）配列番号３、６、９、５５、５８、６１、１０７、１１０、１１３、１５９、１６２、１６５、２１１、２１４、２１７、２６３、２６６、２６９、３１５、３１８、３２１、３６７、３７０、３７３、４１９、４２２、４２５、４７１、４７４、４７７、５２３、５２６、５２９、５４９、５５２、５５５、５７５、５７８、５８１、６２７、６３０、および６３３のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｄ）配列番号１４、１７、２０、６６、６９、７２、１１８、１２１、１２４、１７０、１７３、１７６、２２２、２２５、２２８、２７４、２７７、２８０、３２６、３２９、３３２、３７８、３８１、３８４、４３０、４３３、４３６、４８２、４８５、４８８、５３４、５３７、５４０、５６０、５６３、５６６、５８６、５８９、５９２、６３８、６４１、６４４のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
    （ｅ）配列番号１５、１８、２１、６７、７０、７３、１１９、１２２、１２５、１７１、１７４、１７７、２２３、２２６、２２９、２７５、２７８、２８１、３２７、３３０、３３３、３７９、３８２、３８５、４３１、４３４、４３７、４８３、４８６、４８９、５３５、５３８、５４１、５６１、５６４、５６７、５８７、５９０、５９３、６３９、６４２、および６４５のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２、ならびに
    （ｆ）配列番号１６、１９、２２、６８、７１、７４、１２０、１２３、１２６、１７２、１７５、１７８、２２４、２２７、２３０、２７６、２７９、２８２、３２８、３３１、３３４、３８０、３８３、３８６、４３２、４３５、４３８、４８４、４８７、４９０、５３６、５３９、５４２、５６２、５６５、５６８、５８８、５９１、５９４、６４０、６４３、および６４６のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含み、
    前記抗体が、ヒトＣＤ３２ｂに選択的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  2. 前記抗体が、配列番号１０、６２、１１４、１６６、２１８、２７０、３２２、３７４、４２６、４７８、５３０、５５６、５８２、および６３４のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２３、７５、１２７、１７９、２３１、２８３、３３５、３８７、４３９、４９１、５４３、５６９、５９５、および６４７のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  3. 前記抗体が、配列番号１２、６４、１１６、１６８、２２０、２７２、３２４、３７６、４２８、４８０、５８４、および６３６のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号２５、７７、１２９、１８１、２３３、２８５、３３７、３８９、４４１、４９３、５９７、および６４９のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  4. 前記抗体が、配列番号３８、９０、１４２、１９４、２４６、２９８、３５０、４０２、４５４、５０６、５３２、５５８、６１０、および６６２のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号５１、１０３、１５５、２０７、２５９、３１１、３６３、４１５、４６７、５１９、５４５、５７１、６２３、および６７５のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  5. 前記抗体が、
    （ａ）それぞれ配列番号１、２、および３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１４、１５、および１６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｂ）それぞれ配列番号４、５、および６のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１７、１８、および１９のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｃ）それぞれ配列番号７、８、および９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２０、２１、および２２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｄ）それぞれ配列番号５３、５４、および５５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６６、６７、および６８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｅ）それぞれ配列番号５６、５７、および５８のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６９、７０、および７１のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｆ）それぞれ配列番号５９、６０、および６１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号７２、７３、および７４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｇ）それぞれ配列番号１０５、１０６、および１０７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１１８、１１９、１２０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｈ）それぞれ配列番号１０８、１０９、および１１０のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１２１、１２２、１２３のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｉ）それぞれ配列番号１１１、１１２、および１１３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１２４、１２５、１２６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｊ）それぞれ配列番号１５７、１５８、および１５９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１７０、１７１、１７２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｋ）それぞれ配列番号１６０、１６１、および１６２のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１７３、１７４、１７５のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｌ）それぞれ配列番号１６３、１６４、および１６５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１７６、１７７、１７８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｍ）それぞれ配列番号２０９、２１０、および２１１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２２２、２２３、および２２４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｎ）それぞれ配列番号２１２、２１３、および２１４のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２２５、２２６、および２２７のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｏ）それぞれ配列番号２１５、２１６、および２１７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２２８、２２９、および２３０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｐ）それぞれ配列番号２６１、２６２、および２６３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２７４、２７５、および２７６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｑ）それぞれ配列番号２６４、２６５、および２６６のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２７７、２７８、および２７９のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｒ）それぞれ配列番号２６７、２６８、および２６９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号２８０、２８１、および２８２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｓ）それぞれ配列番号３１３、３１４、および３１５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３２６、３２７、および３２８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｔ）それぞれ配列番号３１６、３１７、および３１８のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３２９、３３０、および３３１のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｕ）それぞれ配列番号３１９、３２０、および３２１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３３２、３３３、および３３４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｖ）それぞれ配列番号３６５、３６６、および３６７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３７８、３７９、および３８０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｗ）それぞれ配列番号３６８、３６９、および３７０のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３８１、３８２、および３８３のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｘ）それぞれ配列番号３７１、３７２、および３７３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号３８４、３８５、および３８６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｙ）それぞれ配列番号４１７、４１８、および４１９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４３０、４３１、および４３２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｚ）それぞれ配列番号４２０、４２１、および４２２のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４３３、４３４、および４３５のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ａａ）それぞれ配列番号４２３、４２４、および４２５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４３６、４３７、および４３８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｂｂ）それぞれ配列番号４６９、４７０、および４７１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４８２、４８３、および４８４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｃｃ）それぞれ配列番号４７２、４７３、および４７４のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４８５、４８６、および４８７のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｄｄ）それぞれ配列番号４７５、４７６、および４７７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４８８、４８９、および４９０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｅｅ）それぞれ配列番号５２１、５２２、および５２３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５３４、５３５、および５３６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｆｆ）それぞれ配列番号５２４、５２５、および５２６のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５３７、５３８、および５３９のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｇｇ）それぞれ配列番号５２７、５２８、および５２９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５４０、５４１、および５４２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｈｈ）それぞれ配列番号５４７、５４８、および５４９のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５６０、５６１、および５６２のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｉｉ）それぞれ配列番号５５０、５５１、および５５２のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５６３、５６４、および５６５のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｊｊ）それぞれ配列番号５５３、５５４、および５５５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５６６、５６７、および５６８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｋｋ）それぞれ配列番号５７３、５７４、および５７５のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５８６、５８７、および５８８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｌｌ）それぞれ配列番号５７６、５７７、および５７８のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５８９、５９０、および５９１のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｍｍ）それぞれ配列番号５７９、５８０、および５８１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号５９２、５９３、および５９４のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｎｎ）それぞれ配列番号６２５、６２６、および６２７のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６３８、６３９、および６４０のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、
    （ｏｏ）それぞれ配列番号６２８、６２９、および６３０のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６４１、６４２、および６４３のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、または
    （ｐｐ）それぞれ配列番号６３１、６３２、および６３３のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６４４、６４５、および６４６のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  6. （ａ）配列番号１０のＶＨ配列および配列番号２３のＶＬ配列、
    （ｂ）配列番号６２のＶＨ配列および配列番号７５のＶＬ配列、
    （ｃ）配列番号１１４のＶＨ配列および配列番号１２７のＶＬ配列、
    （ｄ）配列番号１６６のＶＨ配列および配列番号１７９のＶＬ配列、
    （ｅ）配列番号２１８のＶＨ配列および配列番号２３１のＶＬ配列、
    （ｆ）配列番号２７０のＶＨ配列および配列番号２８３のＶＬ配列、
    （ｇ）配列番号３２２のＶＨ配列および配列番号３３５のＶＬ配列、
    （ｈ）配列番号３７４のＶＨ配列および配列番号３８７のＶＬ配列、
    （ｉ）配列番号４２６のＶＨ配列および配列番号４３９のＶＬ配列、
    （ｊ）配列番号４７８のＶＨ配列および配列番号４９１のＶＬ配列、
    （ｋ）配列番号５３０のＶＨ配列および配列番号５４３のＶＬ配列、
    （ｌ）配列番号５５６のＶＨ配列および配列番号５６９のＶＬ配列、
    （ｍ）配列番号５８２のＶＨ配列および配列番号５９５のＶＬ配列、または
    （ｎ）配列番号６３４のＶＨ配列および配列番号６４７のＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  7. （ａ）配列番号１２の重鎖配列および配列番号２５の軽鎖配列、
    （ｂ）配列番号６４の重鎖配列および配列番号７７の軽鎖配列、
    （ｃ）配列番号１１６の重鎖配列および配列番号１２９の軽鎖配列、
    （ｄ）配列番号１６８の重鎖配列および配列番号１８１の軽鎖配列、
    （ｅ）配列番号２２０の重鎖配列および配列番号２３３の軽鎖配列、
    （ｆ）配列番号２７２の重鎖配列および配列番号２８５の軽鎖配列、
    （ｇ）配列番号３２４の重鎖配列および配列番号３３７の軽鎖配列、
    （ｈ）配列番号３７６の重鎖配列および配列番号３８９の軽鎖配列、
    （ｉ）配列番号４２８の重鎖配列および配列番号４４１の軽鎖配列、
    （ｊ）配列番号４８０の重鎖配列および配列番号４９３の軽鎖配列、
    （ｋ）配列番号５８４の重鎖配列および配列番号５９７の軽鎖配列、または
    （ｌ）配列番号６３６の重鎖配列および配列番号６４９の軽鎖配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  8. （ａ）配列番号３８の重鎖配列および配列番号５１の軽鎖配列、
    （ｂ）配列番号９０の重鎖配列および配列番号１０３の軽鎖配列、
    （ｃ）配列番号１４２の重鎖配列および配列番号１５５の軽鎖配列、
    （ｄ）配列番号１９４の重鎖配列および配列番号２０７の軽鎖配列、
    （ｅ）配列番号２４６の重鎖配列および配列番号２５９の軽鎖配列、
    （ｆ）配列番号２９８の重鎖配列および配列番号３１１の軽鎖配列、
    （ｇ）配列番号３５０の重鎖配列および配列番号３６３の軽鎖配列、
    （ｈ）配列番号４０２の重鎖配列および配列番号４１５の軽鎖配列、
    （ｉ）配列番号４５４の重鎖配列および配列番号４６７の軽鎖配列、
    （ｊ）配列番号５０６の重鎖配列および配列番号５１９の軽鎖配列、
    （ｋ）配列番号５３２の重鎖配列および配列番号５４５の軽鎖配列、
    （ｌ）配列番号５５８の重鎖配列および配列番号５７１の軽鎖配列、
    （ｍ）配列番号６１０の重鎖配列および配列番号６２３の軽鎖配列、または
    （ｎ）配列番号６６２の重鎖配列および配列番号６７５の軽鎖配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  9. （ａ）配列番号１５７、１６０、または１６３から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号１５８、１６１、または１６４から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ２、
    （ｃ）配列番号１５９、３１５、３６７、４１９、４７１、５２３、５４９、５７５、または６２７から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ３、
    （ｄ）配列番号１７０、１７３、または１７６から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、
    （ｅ）配列番号１７１、１７４、または１７７から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ２、および
    （ｆ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  10. （ａ）配列番号１５７、１６０、または１６３から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号１５８、１６１、または１６４から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ２、
    （ｃ）アミノ酸配列ＥＱＸ１ＰＸ２Ｘ３ＧＸ４ＧＧＸ５ＰＸ６ＥＡＭＤＶ（配列番号６８３）（Ｘ１がＤまたはＳであり、Ｘ２がＥまたはＳであり、Ｘ３がＹ、Ｆ、Ａ、またはＳであり、Ｘ４がＹまたはＦであり、Ｘ５がＦまたはＹであり、Ｘ６がＹまたはＦである）を含む、ＨＣＤＲ３、
    （ｄ）配列番号１７０、１７３、または１７６から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、
    （ｅ）配列番号１７１、１７４、または１７７から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ２、および
    （ｆ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  11. （ａ）配列番号１５７、１６０、または１６３から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号１５８、１６１、または１６４から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ２、
    （ｃ）配列番号１５９、３１５、３６７、または４１９のアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ３、
    （ｄ）配列番号１７０、１７３、または１７６から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、
    （ｅ）配列番号１７１、１７４、または１７７から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ２、および
    （ｆ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ３を含む、請求項１０に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  12. （ａ）配列番号４１７から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号４１８から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ２、
    （ｃ）配列番号４１９のアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ３、
    （ｄ）配列番号４３０から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、
    （ｅ）配列番号４３１から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ２、および
    （ｆ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ３を含む、請求項１０に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  13. （ａ）配列番号４１７から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号４１８から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ２、
    （ｃ）配列番号４１９のアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ３、
    （ｄ）配列番号４３０から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、
    （ｅ）配列番号４３１から選択されるアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ２、および
    （ｆ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ３を含む、非フコシル化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  14. 配列番号４２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域および配列番号４４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１３に記載の非フコシル化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  15. 配列番号４２８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４４１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１３に記載の非フコシル化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  16. 単離抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、配列番号１０、６２、１１４、１６６、２１８、２７０、３２２、３７４、４２６、４７８、５３０、５５６、５８２、および６３４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２３、７５、１２７、１７９、２３１、２８３、３３５、３８７、４３９、４９１、５４３、５６９、５９５、および６４７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、前記抗体が、ヒトＣＤ３２ｂタンパク質に特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  17. 単離抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、配列番号１２、３８、６４、９０、１１６、１４２、１６８、１９４、２２０、２４６、２７２、２９８、３２４、３５０、３７６、４０２、４２８、４５４、４８０、５０６、５３２、５５８、５８４、６１０、６３６、および６６２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号２５、５１、７７、１０３、１２９、１５５、１８１、２０７、２３３、２５９、２８５、３１１、３３７、３６３、３８９、４１５、４４１、４６７、４９３、５１９、５４５、５７１、５９７、６２３、６４９、および６７５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記抗体が、ヒトＣＤ３２ｂタンパク質に特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  18. 前記抗体が、非フコシル化されている、請求項１、２、３、５、６、７、９、１０、１１、または１２のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  19. 前記抗体のＦｃ部分が、ＡＤＣＣ活性を増強するように修飾されている、請求項１、２、３、５、６、８、９、１０、１１、または１２のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  20. ヒトＣＤ３２ａよりもヒトＣＤ３２ｂに選択的に結合する、先行請求項のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  21. ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択されるＩｇＧである、先行請求項のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  22. モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、およびｓｃＦｖからなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  23. キメラ、ヒト化、または完全ヒトである、先行請求項のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  24. ヒトＣＤ３２ｂと免疫グロブリンＦｃドメインとの結合を阻害する、先行請求項のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  25. イムノコンジュゲートの成分である、先行請求項のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  26. 一方のアームが請求項１から２４のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性フラグメントのいずれかを含む、多価抗体。
  27. 二重特異性抗体である、請求項２６に記載の多価抗体。
  28. 請求項１から２５のいずれか一項に記載の単離抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは請求項２６もしくは２７に記載の多価抗体を、細胞においてＣＤ３２ｂと共発現される細胞表面抗原に結合する１つまたは複数の追加の抗体と組み合わせて含む、組成物。
  29. 前記細胞表面抗原およびＣＤ３２ｂが、Ｂ細胞において共発現される、請求項２８に記載の組成物。
  30. 前記細胞表面抗原が、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＫｉＲ、ＣＤ１９、ＣＤ４０、Ｔｈｙ−１、Ｌｙ−６、ＣＤ４９、Ｆａｓ、Ｃｄ９５、ＡＰＯ−１、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＸＣＲ４、ＨＬＡ分子、ＧＭ１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ７４、またはＤＲＤからなる群から選択される、請求項２８に記載の組成物。
  31. 前記細胞表面抗原が、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、およびＣＤ５２からなる群から選択される、請求項２８に記載の組成物。
  32. 前記追加の抗体が、リツキシマブ、エロツズマブ、オファツムマブ、オビヌツムマブ、ダラツムマブ、およびアレムツズマブからなる群から選択される、請求項２８に記載の組成物。
  33. 追加の治療用化合物をさらに含む、請求項２８に記載の組成物。
  34. 請求項１から２５のいずれか一項に記載の単離抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは請求項２６もしくは２７に記載の多価抗体を、追加の治療用化合物と組み合わせて含む、組成物。
  35. 前記追加の治療用化合物が、免疫調節剤である、請求項３３または３４に記載の組成物。
  36. 前記免疫調節剤が、ＩＬ１５であるか、または前記免疫調節剤が、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３リガンド、およびＳＴＩＮＧから選択される共刺激分子のアゴニストである、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記免疫調節剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、およびＩＤＯから選択される標的の阻害分子である、請求項３５に記載の組成物。
  38. 前記追加の治療用化合物が、オファツムマブ、イブルチニブ、ベリノスタット、ロミデプシン、ブレンツキシマブベドチン、オビヌツズマブ、プララトレキセート、ペントスタチン、デキサメタゾン、イデラリシブ、イキサゾミブ、リポソーム化ドキソルビシン、ポマリドミド、パノビノスタット、エロツズマブ、ダラツムマブ、アレムツズマブ、サリドマイド、およびレナリドマイドから選択される、請求項３４に記載の組成物。
  39. 前記追加の治療用化合物が、イブルチニブ、ベリノスタット、ロミデプシン、ブレンツキシマブベドチン、プララトレキセート、ペントスタチン、デキサメタゾン、イデラリシブ、イキサゾミブ、リポソーム化ドキソルビシン、ポマリドミド、パノビノスタット、サリドマイド、およびレナリドマイドから選択される、請求項３３に記載の組成物。
  40. 請求項１から２５のいずれか一項に記載の単離抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは請求項２６もしくは２７に記載の多価抗体または請求項２８から３９に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  41. 請求項１から２５のいずれか一項に記載の単離抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは請求項２６もしくは２７に記載の多価抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  42. それを必要とする対象においてＣＤ３２ｂ関連状態を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは請求項２６もしくは２７に記載の多価抗体または請求項２８から３９に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
  43. それを必要とする対象においてＣＤ３２ｂ関連状態を治療する際に使用するための、請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは請求項２６もしくは２７に記載の多価抗体または請求項２８から３９に記載の組成物。
  44. それを必要とする対象においてＣＤ３２ｂ関連状態を治療するための、請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは請求項２６もしくは２７に記載の多価抗体または請求項２８から３９に記載の組成物の使用。
  45. それを必要とする対象においてＣＤ３２ｂ関連状態を治療するための医薬品の製造における、請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは請求項２６もしくは２７に記載の多価抗体または請求項２８から３９に記載の組成物の使用。
  46. 前記ＣＤ３２ｂ関連状態が、Ｂ細胞性悪性腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ種、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、小型リンパ球性リンパ腫、びまん性小型切れ込み細胞型リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、濾胞性リンパ腫、または全身性軽鎖アミロイドーシスから選択される、請求項４２に記載の方法、請求項４３に記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または請求項４４および４５に記載の使用。
  47. 請求項１から２５に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする、核酸。
  48. 請求項４７に記載の核酸を含む、ベクター。
  49. 請求項４７に記載の核酸または請求項４８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  50. 請求項１から２５に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントを産生する方法であって、前記抗体をコードする核酸を発現する宿主細胞を培養するステップ、および前記培養物から前記抗体を収集するステップを含む、方法。
  51. 表１に列挙されるＣＤＲを含むヒトＣＤ３２ｂ抗体に選択的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする、単離ポリヌクレオチド。
  52. 細胞においてＣＤ３２ｂと共発現される細胞表面抗原に結合する抗体を使用した治療に対して耐性または不応性である患者を治療する方法であって、前記抗体を、請求項１から２５に記載の単離抗ＣＤ３２ｂ抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは請求項２６もしくは２７に記載の多価抗体のうちのいずれか１つと共投与するステップを含む、方法。
  53. 細胞においてＣＤ３２ｂと共発現される細胞表面抗原に結合する抗体を使用した治療に対して耐性または不応性である患者の治療であって、前記抗体を、前記抗Ｃｄ３２ｂ抗体またはその抗原結合性フラグメントと共投与することを含む治療のための、請求項１から２５に記載の単離抗ＣＤ３２ｂ抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは請求項２６もしくは２７に記載の多価抗体のいずれか１つの使用。
  54. 細胞においてＣＤ３２ｂと共発現される細胞表面抗原に結合する抗体を使用した治療に対して耐性または不応性である患者の治療であって、前記抗体を、前記抗ＣＤ３２ｂ抗体またはその抗原結合性フラグメントと共投与することを含む治療のための、請求項１から２５に記載の単離抗ＣＤ３２ｂ抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは請求項２６もしくは２７に記載の多価抗体。
  55. ＣＤ３２ｂのＦｃ結合性ドメイン内でＣＤ３２ｂに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  56. 前記抗体が、ＣＤ３２ｂのアミノ酸残基１０７〜１２３（ＶＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦ（配列番号６８５））内に結合する、請求項５５に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  57. 前記抗体が、Ｂ細胞においてＣＤ３２ｂと共発現される腫瘍抗原に結合する第２の抗体の免疫グロブリンＦｃドメインへのＣＤ３２ｂの結合を防止または低減する、請求項５５に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  58. 前記第２の抗体が、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＫｉＲ、ＣＤ１９、ＣＤ４０、Ｔｈｙ−１、Ｌｙ−６、ＣＤ４９、Ｆａｓ、Ｃｄ９５、ＡＰＯ−１、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＸＣＲ４、ＨＬＡ分子、ＧＭ１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ７４、またはＤＲＤからなる群から選択される腫瘍抗原に結合する、請求項５７に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  59. 前記第２の抗体が、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、およびＣＤ５２からなる群から選択される腫瘍抗原に結合する、請求項５７に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  60. 前記第２の抗体が、リツキシマブ、エロツズマブ、オファツムマブ、オビヌツムマブ、ダラツムマブ、およびアレムツズマブからなる群から選択される、請求項５７に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  61. 請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体を含む、請求項５５から６０のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  62. ＣＤ３２ｂに特異的に結合し、Ｂ細胞においてＣＤ３２ｂと共発現される腫瘍抗原に結合する第２の抗体によって媒介されるＣＤ３２ｂ免疫受容体阻害性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）シグナル伝達を阻害または低減する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  63. Ｂ細胞においてＣＤ３２ｂと共発現される腫瘍抗原に結合する治療用抗体の投与によって誘導されるＣＤ３２ｂ ＩＴＩＭシグナル伝達を阻害または低減する方法であって、ＣＤ３２ｂのＦｃ結合性ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与するステップを含む、方法。
  64. 前記単離抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ＩＴＩＭシグナル伝達を刺激しない、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記治療用抗体が、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＫｉＲ、ＣＤ１９、ＣＤ４０、Ｔｈｙ−１、Ｌｙ−６、ＣＤ４９、Ｆａｓ、Ｃｄ９５、ＡＰＯ−１、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＸＣＲ４、ＨＬＡ分子、ＧＭ１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ７４、またはＤＲＤからなる群から選択される腫瘍抗原に結合する、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記治療用抗体が、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、およびＣＤ５２からなる郡から選択される腫瘍抗原に結合する、請求項６３に記載の方法。
  67. 前記治療用抗体が、リツキシマブ、エロツズマブ、オファツムマブ、オビヌツムマブ、ダラツムマブ、およびアレムツズマブからなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
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