JP2016519939A - 多能性ヒト脂肪成体幹細胞:単離、キャラクタリゼーションおよび臨床的意味 - Google Patents
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Abstract
Description
幹細胞(stammzellen)という用語は、1世紀前にわたってドイツの科学者Ernst Haeckelにより確立され(38−40)、自己再生能力および様々な細胞型に分化する能力を有する細胞を示す。3つの胚性生殖細胞系統の成体組織を生じさせるそれらの能力に基づき、異なる型の幹細胞が存在する。
PASCの分化および増殖への1つの限定されないアプローチは、以下で記載され、および図4−5で概略的に図示されるように実施することができる。簡単に言うと、脂肪組織は任意の性別、年齢および人種の被験体(例えば、ヒト、非ヒト哺乳類)から、局所麻酔下での脂肪吸引により収集することができる。組織は、皮下腹部組織または/および脂肪を含む身体の他の部分(例えばタイツ(tights))から簡単な手順により、例えば、手作業で特定のシリンジを使用して、または自動脂肪吸引器を使用して、標準プロトコルに従い収集される。吸引脂肪組織材料中に普通存在する血液は、PBS(または他の緩衝液)を用いた複数回の洗浄により除去される。吸引脂肪組織材料は、その後、遠心分離に供せられ、油(上層(top lawyer))およびチューメンセント溶液(下層(low lawyer))が脂肪組織(中層(middle lawyer))から除去される。濃縮された脂肪組織はその後、タンパク質分解酵素、例えば0.02−1%コラゲナーゼ、典型的には0.1%コラゲナーゼで消化され、37℃で30分、振盪インキュベーターを使用して100rpmでインキュベートされる。消化された材料はその後、2−12℃、典型的には4℃で、約4、6、8、10、12、16、18、20、22、24、26、28、または30時間、好ましくは約6−8時間維持される(図5)。そのプロセス中、試料は、わずかに振盪(20−30rpm)または角度を回転させることができる(90°−180°、脂肪細胞画分とSVF画分の間の細胞−細胞接触を最大にする)。低酸素条件は典型的には0.01%〜10%酸素の環境を意味する。1つの実施形態では、低酸素条件は0.01%〜5%酸素、例えば、例えば、約1%酸素の環境である。
脂肪組織から得られる脂肪細胞および間質血管細胞群では、PASCが非常に豊富である(図1)。PASCは、ヒトにおいて自己組織工学および再生医学のために使用される可能性がある。さらに、PASCは3つの生殖系列細胞から前駆体だけでなく、成熟細胞に分化する可能性がある(体内に存在する全ての種類の細胞)。PASCは多くの障害の治療のため、ならびに新しい薬物の試験のために使用することができる。
発明は、被験体において組織損傷を寛解する方法を提供する。発明はさらに、被験体において患部または損傷組織を修復または再生する方法を提供する。別の実施形態では、発明は、組織機能を増強させる方法および/またはサイトカインを被験体の組織に送達させる方法を提供する。典型的には、方法は発明の組成物を被験体に投与することを含む。組成物がPASCを含む場合、任意で、これは、組成物のPASCが分裂し、組織損傷部位に集合することを可能にする条件下で投与される。PASCにより放出される因子が治療効果を提供するので、PASCの損傷部位への移動は全ての実施形態では要求されない。
ミューズ細胞、細胞ストレスに抵抗性のある別の多能性幹細胞は単離され、細胞選別され、100%CD105(+)/SSEA3(+)細胞の集団が得られている。ミューズ細胞は成体組織の1−3%しか構成しないので、ミューズ細胞は他の起源、例えば皮膚線維芽細胞および骨髄からの低い収率により妨害されてきた。さらに、ミューズ細胞単離には、細胞選別だけでなく、細胞の増殖手順もまた必要とされ、これにより、1,000,000のミューズ細胞を得るには最大6週まで要求される。対照的に、およそ1億のPASCがたったの1−2リットルの組織から抽出することができ、抽出可能なPASCの数は増強され、細胞の増殖手順および/または細胞選別は必要ない。
(1)多能性幹細胞を脂肪組織から、脂肪吸引により収集することは、これらの細胞を骨髄細胞から収集するよりも痛みが少ない;
(2)PASCは、ストレス細胞処理で自然に生じ、多くのPASCのクラスターが少量の脂肪組織から形成され得る;
(3)多くのPASCは、簡単な技術により、非常に短い期間で、細胞選別または他の細胞選択技術の必要なく、高度に精製することができる;
(4)細胞単離の迅速な手順および高い収率のために、PASCは、細胞の増殖の必要なく、患者に再注入することができる;
(5)あるいは、PASCは、標準細胞培養技術に従い、培養下で維持され、増殖され得る;
(6)(i)PASC、(ii)PASCに由来する前駆体および(iii)PASCに由来する成熟細胞を単離することが可能であり、これにより、PASC/前駆体/成熟細胞のいずれかを使用した細胞治療が可能である;ならびに
(7)PASCを細胞分化の異なる段階で使用して、新しい薬物をスクリーニングすることが可能である。
腫瘍増殖は自己再生能力および高い腫瘍化効力を有する細胞の小集団により駆動され得る。これらの細胞は癌始原または癌幹細胞(CSC)と呼ばれる。これらの細胞は化学および放射線療法、ならびに環境因子に対しより抵抗性がある。それらは腫瘍増殖を維持し、治療後のその再発の一因となる。PASCは細胞ストレスに非常に抵抗性があり、癌様抵抗性を示すそのような内在性細胞集団の単離およびキャラクタリゼーションが可能である(図25)。さらに、マイクロアレイデータは、ADSCに比べPASCにおいてわずかに過剰発現される、半ダースを超える癌原遺伝子の活性化を示す。これらの癌原遺伝子の発現のレベルは、多能性胚性幹細胞および人工多能性幹細胞(iPS)に比べ、PASCでは、著しく低いレベル(何桁か)で発現されるであろう(23)。
不妊症の重大な原因は、体外受精(IVF)療法を受けた女性の卵母細胞における低減したミトコンドリア機能である。PASCは、通常、静止状態で存在し、重度の細胞ストレスにより活性化される。PASCは高齢(AMA)卵巣の高まる環境の厳しさに対して本質的に弾力的であり、この場合、卵母細胞ミトコンドリアは低酸素およびアポトーシスの有害な効果に対して高度の感受性を示す。そのため、PASCは、それらの内因性ストレス耐久性および胚細胞系統を採用する可能性のために、不妊症のAMA女性の卵母細胞への自己ミトコンドリア移入に寄与することができる。これにより、第三者および体細胞移入を用いた前の試行において生じた有害な異種性は回避されるであろう。
下記実施例は本発明を説明し、これを製造し、使用するのに当業者を補助するために提示される。実施例は本発明の範囲を制限することをいかなる意味においても意図されない。
この実施例は、PASCの単離およびキャラクタリゼーションを記載する。要約すると、実施例は下記を示す:PASCは懸濁液中で個々の細胞および胚性幹細胞クラスターによく似ている細胞球として増殖し、自己再生のための能力を有することができるが、中程度の速度で増殖する(図7)。核型研究により、PASCは23対の染色体を有することが示され、これらは正常な完全性を示す(図8)。少ないパーセンテージのPASC(10−20%)が、CD90(胸腺細胞のためのマーカー)、CD73(リンパ球分化のためのマーカー)、CD34(造血幹細胞のためのマーカー)、CD45(造血幹細胞のためのマーカー)、CD44(活性化Tリンパ球のためのマーカー)、およびHLA−DR(HLAクラスIIのためのマーカー)により認識され得る(図9A−B)。対照的に、60−70%のPASCがCD105、CD29(T細胞のためのマーカー)およびHLA−ABC(HLAクラスIのためのマーカー)により認識された(図9A−B)。これらの結果から、PASCは、同種移植のための細胞治療において使用される可能性があり、異なる個体間での、免疫拒絶反応なしでのPASC細胞移植の可能性を開くことが確認される。さらに、これらの結果は、PASCとミューズ細胞、細胞ストレスに抵抗性があり、CD105/SSEA3細胞選別により単離された別の多能性幹細胞の間の表現型の違いを明確に示す。
脂肪吸引された脂肪からのPASCの単離
吸引脂肪組織(50ml−2000ml)は、脂肪吸引を受ける女性の皮下腹部脂肪から取得した。吸引脂肪組織を、血液が組織から完全に除去されるまで繰り返してPBSで洗浄した。50ml−2000mlの吸引脂肪組織を、コラゲナーゼ(0.1%、Sigma Aldrich)を含む等体積のダルベッコ変法イーグル培地1x(DMEM、CellGro、MediatechInc、Manassas、VA)と、50ml管内で混合し、30分間、37℃で振盪インキュベーターにて110rpmでインキュベートした。脂肪組織が完全に消化されなかった場合、インキュベーションを同じ条件下でさらに10−15分間続け、続いて、4℃で、コラゲナーゼおよび栄養欠乏培地(FCSなし)において静かに6時間インキュベートした。このために、50ml管を、通常の4℃冷蔵庫に移し、温度を、徐々に37℃から4℃に降下させた。これらの重度の細胞ストレス条件(長期コラゲナーゼインキュベーション、栄養分の欠乏、低温および高度低酸素)下では、吸引脂肪組織消化材料中の存在する全ての細胞が、そのようなストレスに非常に抵抗性があるPASCを除き、死滅した。消化された材料をその後、1500rpmで10分分間4℃にて遠心分離した。脂肪細胞デブリ(細胞成分の中でもとりわけ、死亡した脂肪細胞、マクロファージ、赤血球、脂肪幹細胞)を含む上清を、吸引により除去し、残った細胞ペレットを合わせ、新しい50ml管に移した。細胞ペレットをその後、それぞれの回に25mlDMEMで3回洗浄し、確実に、全てのコラゲナーゼを細胞ペレットから完全に除去した。細胞を10%ウシ胎仔血清(FBS;Thermo Scientific Hyclone、Logan、UT)および5%抗生物質−抗真菌薬溶液(CellGro、Mediatech Inc、Manassas、VA)を含むDMEMに再懸濁させ、懸濁液中の細胞として、ならびに接着細胞として蒔き、さらにPASCの純度および多能性を特徴付けた。PASCが動物モデルに注入される場合、新たに単離したPASCを少量の生理食塩水溶液に再懸濁させ、標準プロトコルに従い、損傷した領域に直接、または静注を介して注入する。
PASCの細胞の増殖およびクローン性を8つの異なる継代後に決定した。細胞クラスター球が新たに単離したPASCを非接着皿に蒔いた数時間後に形成した(第一世代)。いったん、ほとんどの細胞球がサイズ>50μmに到達すると、細胞クラスターをピペット操作により脱凝集させ、新しい非接着皿に移した(第二世代)。PASCを増殖させ、前のように、1−1/2日/細胞分裂の増殖速度で新しい細胞−クラスターを形成させた(第三世代)。全ての増殖した細胞の核型をキナクリン−ヘキスト染色により標準プロトコルに従い決定した。
浮遊PASCを、DMEM/10%FCS中で8時間培養し、続いて、FACS分析を実施した。細胞を2%不活性化FCS/0.05%ナトリウムアジド/PBS中で洗浄し、100μlの同じ緩衝液に再懸濁させ、4℃で1時間、一次非結合ラット抗ヒトSSEA3(EMD Millipore;Billerica、Massachusetts)の存在下、または非存在下でインキュベートした。細胞をその後2回、同じ緩衝液で洗浄し、対応する二次FITC結合抗ラットIgM(BD Biosciences;San Diego、CA)と共に45分間4℃でインキュベートした。細胞をその後洗浄し、200μlの同じ緩衝液に再懸濁させた。数および細胞型の分析をFACS CaliburフローサイトメーターおよびcEllQuest Proソフトウェアを使用して実施した。さらにPASCを特徴づけるために、他のマーカー、例えばCD105(間葉系幹細胞のマーカー)、CD90(胸腺細胞のためのマーカー)、CD73(リンパ球分化のためのマーカー)、CD34(造血幹細胞のためのマーカー)、CD45(造血幹細胞のためのマーカー)、CD44(活性化Tリンパ球のためのマーカー)、HLA−DR(HLAクラスIIのためのマーカー)を、FACSのために、標準プロトコルに従い使用した。
細胞を、4%パラホルムアルデヒド中で固定し(20分、R/T)、PBSで洗浄し、その後、0.2%トリトン中で20分間インキュベートした。PBSでの2連続洗浄後、細胞を10%正常ヤギ血清を含む1%BSA溶液で60分間、R/Tにてブロックした。細胞をその後、一次抗体と共に一晩4℃でインキュベートした。下記多能性幹細胞マーカーを使用した:ラット抗ヒトステージ特異的胎児抗原(SSEA3、Millipore、Billerica、MA)、マウス抗ヒト八量体結合転写因子3および4(Oct3/4、Santa Cruz Biotech、Santa Cruz、CA)、ウサギ抗ヒトNanog(Millipore、Billerica、MA)、ウサギ抗ヒトSRY−box2(Sox2、Millipore、Billerica、MA)、およびマウス抗ヒトTRA−1−60(Abcam、Cambridge、MA);間葉系細胞系統では:ウサギ抗ヒト前脂肪細胞因子1(Pref−1、[a.k.a. delta−like 1 homolog(ショウジョウバエ)、DLK1]前脂肪細胞マーカー、Santa Cruz Biotech、Santa Cruz、CA);マウス抗ヒトミオシンD(MyoD、筋細胞マーカー、R&D Systems、Minneapolis、MN)、およびマウス抗ヒト平滑筋アクチン(SMA、筋細胞マーカー、Thermo Scientific、Waltham MA);内胚葉細胞系統では:マウス抗ヒトパンケラチン(Santa Cruz、CA);ウサギ抗ヒトα−フェトプロテイン(Dako、Santa Clara、CA);ならびにマウス抗ヒトサイトケラチン7(Millipore、Billerica、MA);ならびに外胚葉細胞系統では:マウス抗ヒト神経特異的エノラーゼ(NSE、Millipore、Billerica、MA);ウサギ抗ヒトグルタミン酸受容体(Abcam、Cambridge、MA);ウサギ抗ヒトNeuroD(Chemicon、Temecula CA);マウス抗ヒトネスチン(Chemicon、Temecula CA);ならびにウサギ抗ヒト微小管結合タンパク質2(MAP2、AbDSerotech、Raleigh、NC)。全ての一次抗体を、1:200でPBS/0.1%BSA溶液中で希釈した。一次抗体による処理後、細胞を3回PBSで洗浄し、1時間R/Tで二次免疫蛍光抗体(1:1000)Alexa Fluor488結合色素(マウスまたはラット、Invitrogen、Carlsbad、CA)またはTexas Red結合色素(ウサギ、Invitrogen、Carlsbad、CA)を含むPBS/0.1%BSAと共にインキュベートした。細胞を4回PBSで洗浄し、PBS/0.2%DAPIで10分処理した。細胞をその後3回PBSで洗浄した。画像をEvos免疫蛍光法倒立顕微鏡(Advanced Microscopy、Mill Creek、WA)を用いて取得した。
I−脂肪吸引されたヒト脂肪組織からのPASC単離
脂肪組織は脂肪細胞(成熟細胞)および脂肪組織マクロファージ(ATM)、脂肪幹細胞(ASC)、間葉系幹細胞、および線維芽細胞を含む細胞の不均一集団を含有する間質血管細胞群(SVF)から構成される(24−25)。単離したPASCをそれらの静止状態から、それらを細胞ストレスに曝露することにより活性化した(図4−5)。
PASCは少なくとも8つの異なる継代に対し自己再生のための能力を有する。細胞クラスター球が、PASCを非接着皿に蒔いた数時間後に形成する(第一世代)。いったん、ほとんどの細胞球がサイズ>50μmに到達すると、細胞クラスターをピペット操作により脱凝集させ、新しい非接着皿に移した(第二世代)。PASCを増殖させ、前のように、1−1/2日/細胞分裂の増殖速度で新しい細胞−クラスターを形成させた(第三世代)。これにより、PASCは非常に低い低い増殖速度を有することが示される(図7)。
全ての増殖細胞の核型は、正常であり、染色体異常を示さなかった。23対の染色体は、性染色体XX(女性ドナー)を含み、正常な完全性を示した(図8)
SSEA3、ヒトES細胞を検出するため、およびミューズ細胞を骨髄および真皮から精製するために頻繁に使用される細胞−表面スフィンゴ糖脂質(61)およびCD105、間葉系幹細胞の古典的マーカー(43)に対する特異抗体をFACS分析のために使用した。およそ40−50%のPASCが両方のマーカーに対して陽性であった。興味深いことに、細胞選別により単離したミューズ細胞(細胞ストレスに抵抗性のある別の多能性幹細胞)はSSEA3およびCD105抗体の両方に対して100%陽性であった(22−23)。
免疫蛍光染色のためにチェンバースライドに移動、接着させると、PASC細胞クラスターおよび個々のPASCのどちらも、検査された特徴的な多能性幹細胞マーカーの全てを強く発現した。これらは下記を含んだ:SSEA3、ヒトES細胞を検出し、ミューズ細胞を骨髄および真皮から精製するために頻繁に使用される細胞−表面スフィンゴ糖脂質(61、22−23);Oct3/4、ヒトES細胞の自己再生に関与するタンパク質;Nanog、ヒトES細胞の自己再生に関与する転写因子;Sox2、胚発生に関与する遺伝子を制御する転写因子;ならびにTRA−1−60(胚性生殖細胞およびES細胞の表面上の抗原TRA−1−60と反応する)(図10A−B)。比較上、同じ脂肪吸引された組織に由来するADSCはこれらの多能性幹細胞マーカーに対して陰性または弱陽性のいずれかであった(図10A−B)。
材料および方法
免疫細胞化学
固定したPASCを免疫細胞化学研究に供し、それらの生殖系列細胞起源を決定した。内胚葉細胞系統では:マウス抗ヒトパンケラチン(Santa Cruz、CA);ウサギ抗ヒトα−フェトプロテイン(Dako、Santa Clara、CA);ならびにマウス抗ヒトサイトケラチン7(Millipore、Billerica、MA);ならびに外胚葉細胞系統では:マウス抗ヒト神経特異的エノラーゼ(NSE、Millipore、Billerica、MA);ウサギ抗ヒトグルタミン酸受容体(Abcam、Cambridge、MA);ウサギ抗ヒトNeuroD(Chemicon、Temecula CA);マウス抗ヒトネスチン(Chemicon、Temecula CA);ならびにウサギ抗ヒト微小管結合タンパク質2(MAP2、AbDSerotech、Raleigh、NC)。一次抗体は全て1:200でPBS/0.1%BSA溶液中にて希釈した。一次抗体による処理後、細胞を3回PBSで洗浄し、1時間R/Tで、二次免疫蛍光抗体(1:1000)Alexa Fluor488結合色素(マウスまたはラット、Invitrogen、Carlsbad、CA)またはTexas Red結合色素(ウサギ、Invitrogen、Carlsbad、CA)を含むPBS/0.1%BSAと共にインキュベートした。細胞を4回PBSで洗浄し、PBS/0.2%DAPIで10分間処理した。細胞をその後3回PBSで洗浄した。画像をEvos免疫蛍光倒立顕微鏡(Advanced Microscopy、Mill Creek、WA)により取得した。
様々な分化培地をミューズ細胞−ATの3つの生殖系列細胞系統への分化を誘導するために使用した。
I−PASCの中胚葉分化
脂肪組織は間葉系細胞系統:脂肪細胞、軟骨細胞、筋細胞および骨芽細胞に分化する能力を有するASCを抱えることが示されている[16,20]。しかしながら、適切な分化培地中のASCは成熟脂肪細胞を発達させるのにおよそ2と1/2週を要し、特徴的には融合核を有する筋細胞分化は、およそ3週かかる(24−25)。
PASCの内胚葉系統(肝細胞)への自発的分化がDMEM/10%FCS中で3日間培養したPASCにおいて観察された。PASCはα−フェトプロテイン(全DAPI陽性細胞の19±7%)(内胚葉および肝細胞の前駆体の発生中に発現される)(68)およびパンケラチン(全DAPI陽性細胞の21±8%)、胆道上皮細胞に特徴的な線維のためのマーカー[27]により認識された(図12A)。細胞のクラスターでは、α−フェトプロテインは、ヒト肝芽腫細胞株HepG2において前に記載されたように(68)、PASCの細胞質および細胞膜の両方に局在する二量体および三量体形態の脂肪酸を強く認識した(図12A)。対照的に、ASCはこれらの内胚葉細胞マーカーに対して陰性であった(図12A)。
PASCを3日間DMEM/10%FCS中、外胚葉細胞マーカー、例えば神経特異的エノラーゼ(NSE)、新皮質ニューロン前駆体を検出するために使用されるマーカー(69−70)、代謝型グルタミン酸受容体(Glut−R)、ミクログリアおよび神経様細胞を検出するために使用されるマーカー(71−72)およびNeuroD、新皮質前駆細胞を検出するために使用されるマーカーにより特徴付けられる抗体と共に培養した。再び、PASCはこれらのマーカー全ての著しい発現を示し、全DAPI陽性細胞の30±5%(Glut−R)および15±5%(NeuroD)であり(図13A)、対照ASCとは対照的に、外胚葉細胞に自然に分化するそれらの可能性が確認される(図13A)。
材料および方法
マイクロアレイ分析
PASCおよびASCを3人の異なる患者の吸引脂肪組織材料から単離した。RNAをRNeasy Miniキット(Qiagen)を用いて抽出し、Hokkaido System Science Co. Ltd.により分析した。アレイシグナルを処理し、GeneSpring GXバージョン12.1.0(Agilent Technologies)を用いて正規化した。データをGene Expression Omnibusデータバンクにアクセス番号GSE46353を用いて寄託した。差次的に発現された遺伝子を選択するための判断基準は、方向+統計学的有意性のいずれかにおける少なくとも2倍の差として予め設定された(P<0.05、独立t検定)。マイクロアレイ分析を、ソフトウェアプログラムIPAを用いてIngenuity(analysis(dot)ingenuity(dot)com)へのライセンスにより実施し、分析された比較および上流制御因子において変化した遺伝子に由来する関連遺伝子の機能経路(細胞機能、生理的機能、疾患)、古典的シグナル経路ネットワークを同定した(1)。遺伝子機能に関するさらなる情報が、プログラムGeneDecks V3からgenecards(dot)orgで得られた[20]。統計分析をフィッシャーの正確確率検定により実施した(ソフトウェアにより自動的に実施される)。どの遺伝子がPASCまたはASCのいずれかにおいてのみ発現されるかの決定では、全ての試料(3通りで実施された)は均一な検出(少なくとも100標準単位で示される)またはなし(せいぜい30の標準単位)を、P値<0.05と共に示さなければならなかった。
I−ASCと比較したPASCの遺伝子発現
表S1−2は3人の異なる患者から取得したRNAにおいてマイクロアレイにより実施した、ASCと比較したPASC細胞遺伝子発現を示す。それぞれ、435の上方および434の下方制御された遺伝子においてミューズ−AT細胞対ASC間の少なくとも2倍の変化の差次発現が観察された(p<0.05、表S1−S2)。PASC対ASCの最も顕著な上方制御された遺伝子はCXCL2(777.8倍)、ESCM2(153.2倍)DLL1(147.4倍)、NR4A2(139.2倍)、ADAMTS9(115.3倍)、BMX(91.5倍)、MYZAP(87.6倍)、ALDH1A2(47.1倍)およびSOD2(41.4倍)を含み、これらの遺伝子はそうでなければ、ASCにおいてオフにされまたは抑制されたことが示される(表S1)。最も顕著な下方制御された遺伝子はAK5(136.6倍)、GREM2(115.2倍)、CEP55(93.6倍)、BUB1B(66.4倍)、CDCA3(62.5倍)、NUF2(54.8倍)およびDEPDC1(52倍)(表S2)を含んだ(26)。(本明細書で参照される表S1−S6の各々が参考文献26において見出され得る)。
ジーンオントロジー分析を実施し、PASCにおいて観察された差次発現は細胞機能のカテゴリと強く相関し、最も統計的に有意なのは下記である:細胞死および生存(p=2.04E−05〜3.15E−02)、胚発生(p=5.92E−05〜3.15E−02)、組織発達(p=5.92E−05〜3.15E−02)、細胞構築および組織化(p=1.07E−04〜3.15E−02)、細胞機能および維持(p=4.04E−04〜3.15E−02)、DNA複製、組換えおよび修復(p=1E−0.3〜3.15E−0.2)、細胞周期(p=1.12E−0.3〜3.15E−0.2)、臓器発生(p=1.54E−0.3〜3.15E−0.2)および生命体生存(p=2.63E−0.3〜2.63E−0.3)(図15、参考文献(26)の表S1−S2)。
最も高く発現された古典的経路は、胚性幹細胞多能性におけるOct4の役割(SOX2、NR6A1、BRCA1、ASH2L、POU5F1)、DNA損傷および遺伝性乳癌シグナル伝達におけるBRCA1(POLRJ2/POLR2J3、FANCB、POLR2J、CDK6、RPA1、PIK3R2、RFC5、BLM、BRCA1、RFC3)、染色体複製の細胞周期制御(MCM6、ORC3、CDK6、RPA1)、DNA修復(RPA1、RFC5、RFC3)、アルギニン分解(ALDH4A1、OAT)、および胚性幹細胞の心臓系統への分化(SOX2、POU5DF1)を含む(図17)。これらのデータはDNA修復、細胞周期、酸化ストレス、癌細胞制御、ならびにそれらの内因多能性における潜在的役割PASCへのさらなる洞察を提供する。
マイクロRNA Let−7はASCに対してPASCにおいて存在する最も重要な上流制御因子である。Let−7は、下記と関連する11の下流遺伝子を制御する:細胞周期分裂の減少(例えばCDCA3、CDC16)、細胞分化(DZIP1)、細胞成長および増殖(SSR1)、DNA複製(MCM6)、複製因子および癌(RFC3、RFC5)ならびに細胞死および生存(NUF2、BRCA1、BUB1B、CDC16)(図18)。
材料および方法
脂肪細胞と間質血管細胞群の間の共培養後のPASCの形成
ヒト脂肪組織を細かくミンチにし、コラゲナーゼで60分間37℃で、輸送緩衝液中で処理した。細胞懸濁液をその後、予め湿らせた150ミクロンナイロンメッシュ(Small Parts Inc.、Miami Lakes、FL)に通して濾過し、2分間50×gでRTにて遠心分離した。上相(浮遊脂肪細胞)を、下相(SVF)から分離した。脂肪細胞画分を2回洗浄し、脂肪細胞培地(DMEM、1%BSA、3%FCS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)で希釈した。下相を5分間500×gで遠心分離に供した。細胞ペレット(SVF)をPBS中に再懸濁させ、フィコール密度勾配に供し、SVFをさらに精製した。SVF画分を含む界面を除去し、5mlのPBSでRTにて洗浄した。5分間の500×gでの最終遠心分離後、細胞ペレットを培地(10%FCS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mML−グルタミン、1%NEAA、1%ピルビン酸ナトリウム、および10ng/mlGM−CSFが補充されたRPMI培地)に再懸濁させた。SVF画分からの細胞(106/ml)および脂肪細胞画分からの細胞(106/ml)を別々に一晩、それらの個々の細胞培地中で平衡化させた。カバーガラスをその後、各ウェル内で免疫蛍光法研究のために置いた。24時間後、再懸濁させた脂肪細胞画分をSVF画分を含むウェルに、約1:1比で添加した。プールした細胞を2−24時間37℃で、5%CO2にて共培養した。インキュベーション期間の終わりに、脂肪細胞画分を再懸濁させ、ピペットにより移動させ、1mlの脂肪細胞培地を含む別のウェルに入れた(以上を参照されたい)。残りのSFV画分を5回、1mlのPBSで洗浄し、さらに2日間、新しい標準培地中で培養し(以上を参照されたい)、カバーガラスをその後、免疫蛍光法のために収集した(以下を参照されたい)。脂肪細胞およびSVF画分もまた別々に、以上で記載した同じ条件下で培養した。免疫組織化学法を、標準プロトコル、および異なるマーカーを用いて実施し、S−100およびDLK(Santa Cruz、CA)、前脂肪細胞のためのマーカー;造血幹細胞および脂肪幹細胞の初期形成のためのCD34マーカー(Zymed、San Francisco、CA)および異なる多能性幹細胞マーカー(Nanog、SOX2、Oct3/4、以上を参照されたい)を使用した。
NOD BDC2.5トランスジェニックマウスの脾細胞を、標準条件を使用して単離した。これらの脾細胞はCD4(+)T細胞を含み、これらは、ミメトープ(Mim)という名の特異ペプチドのみを認識する(その配列はクロモグラニンA(ChgA)の一部である)(76)。脾細胞(5×105細胞)を、24ウェルクラスターにおいて、ミメトープと共に72時間PASC(103−105細胞/ウェル)の存在下(共培養)で、またはこれなしで培養した。脾細胞の数(細胞増殖)をFACSにより、染色されたカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル(CFSE)脾細胞に対して、Mim±PASCとのインキュベーション前後で決定した。IFNγ生成を、それぞれ、FACSおよびRIAにより決定した。
106のPASCを非接着皿において、DMEM/10%FCS中で培養した。条件培地を48時間後に収集した。NOD BDC2.5トランスジェニックマウスから単離された脾細胞(5×105細胞)を、24ウェルクラスターにおいてミメトープと共に72時間、PASC条件培地の存在下、または非存在下で、異なる希釈(1/2〜1/500希釈)で培養した。脾細胞定量化のために、CFSE標識脾細胞をMim±PASC条件培地と共にインキュベートした。CFSE希釈をFACSにより分析し、細胞増殖を決定した。IFNγ生成を、RIAにより決定した。
(A)NODscidマウスをストレプトゾトシン(STZ)の複数回(45mg/kg、4連続日)注入により糖尿病にした。PASCを糖尿病(血糖>240mg/dl)NODscidマウスに1回または2回(示される通り)注入した(106細胞、腹腔内)。血糖および体重をゼロ時間、ならびに注入後異なる時間に、標準条件を使用して決定した。(B)糖尿病NODマウスは自然糖尿病が起こるマウス系統である。NODマウスにおいて高血糖症の発症直後に、PASCを注入した(106細胞、腹腔内)。血糖および体重をゼロ時間ならびに注入後異なる時間に標準条件を使用して決定した。いくらかの動物が2回目のPASCの注入(106細胞、腹腔内)を受けた。
I−PASCの食作用活性
PASCの形成を、脂肪細胞画分(浮遊細胞)および間質血管細胞群(接着細胞)の共培養後に検出した(59)。前脂肪細胞(S−100(+)細胞)とPASC(SSEA3(+)細胞、赤色)の間には明確な相互作用がある。(図18A)PASCは前脂肪細胞のおよそ3分の1にしっかりと接着する。この接着は外見上選択的であり、というのも、一見すると同一の前脂肪細胞がPASCに完全に貪食されるからである。(図18B)有糸分裂を受けている前脂肪細胞はPASCにより乱されていないままであったが、真上の前脂肪細胞はPASCにより貪食され、DAPI陽性核のみが被覆されずに残る。前脂肪細胞およびPASCはどちらもS−100+およびSSEA3であり、(図18C−a、C−b)により、前脂肪細胞は1−2秒の蛍光曝露で陽性S−100染色を示し、PASCはたった1ミリ秒曝露時間で陽性結果を表すであろうことが示される。曝露強度における大きな食い違いにより、PASCは、S−100をずっと高いレベルで発現する、またはより容易にS−100抗体をそのドメインに結合させることが示唆される。個々のPASCは元々、それらの小核の明確なDAPI染色により同定された。ずっと小さなPASCによる前脂肪細胞の食作用が存在する。前脂肪細胞は、貪られる異なる段階で明確に見ることができるであろう。全細胞を貪食するマクロファージとは異なり、PASCは前脂肪細胞の核をそのまま残し、(図18A)、しばしば、前脂肪細胞核は培養中に裸で残される(図18B)。
PASCはミメトープにより刺激されたBDC2.5脾細胞の数を用量応答様式で著しく低減させた。103−104のPASCが細胞増殖において最大阻害を生成させた(図20A−D)。ミメトープにより刺激されたBDC2.5脾細胞によるINFγ分泌に対するPASCの効果はより劇的であった。103のPASCがINFγレベルを完全に阻害した(図20E)。
PASCの効果を、糖尿病がストレプトゾトシンの複数回の注入により誘導されたNODscidマウスにおいて、最初に分析した。PBSを受けた全ての糖尿病NODscidマウス(対照群)は第5日までに血糖≧500mg/dlを有し、第1の注入後第6日に死亡し、または瀕死となった(図22C)。対照的に、ほとんどのPASC処置マウス効果(106細胞、腹腔内)は長期間、体重増加をほぼ6週まで維持して生き残った(図22A)。7匹のうち6匹のマウスは移植後8週間生き延び、7匹中5匹は、処置後第11週に到達した(図22A)。PASC処置マウスのほとんどは、変動する血糖を、500mg/dl未満で処置後少なくとも6週の間維持した(図22B)。これらの結果により、PASCは、少なくとも6週の処置後、体重損失およびグルコースレベルを劇的に改善したことが明確に示される。これらの効果は糖尿病動物モデルにおいてPASCの新しい膵臓および腎臓細胞を再生する能力と関連する可能性がある。
参考文献
1.Evans MJ and Kaufman MH. Nature 1981, 292: 154−6。
2.Martin GR. Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78: 7634−8。
3.Thomson JA, et al. Science 1998, 282: 1145−7。
4.Przyborski SA. Stem Cells 2005, 23: 1242−50。
5.Takahashi K and Yamanaka S. Cell 2006, 126: 663−76。
6.Stadtfeld M and Hochedlinger K. Genes Dev 2010, 24: 2239−63。
7.Okita K, Yamanaka S. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2011, 1575:2198−207。
8.Budniatzky, I. Nat Rev Genet 2011, 12:253−65。
10.Gutierrez−Aranda I, et al. Stem Cells 2010, 28: 1568−1570。
11.Lee AS, et al. Nat Med 2013, 19:998−1004。
12.Fong CY, et al. J Cell Biochem 2010, 111 :769−81。
13.Kim, K, et al. Nature, 2010, 467:285−290。
14.Trosko JE. Stem Cell Rev 2008, 4:81 −8。
15.Trosko JE. Anat Rec (Hoboken) 2014, 297: 161−73。
16.Kim D, et al. Cell Stem Cell 2009, 4:472−6。
17.Yu J, et al. Science 2009, 324: 797−801。
18.Jiang Y, et al. Nature 2002, 418:41−9。
19.Dimomeletis I, et al. Exp Hematol 2010, 38: 1 105−14。
20.Kucia M, et al.. Expert Opin Biol Ther 2007, 7: 1499−514。
21.Obokata, H, et al. Nature 2014, 505: 641−47
22.Kuroda Y, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2010, 107:8639−43。
23.Wakao S, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 201 1 , 108:9875−80。
24.Gimble JM, et al. Circ Res 2007, 100: 1249−1260。
25.Zuk PA, et al. Mol Biol Cell 2002, 13:4279−4295。
26.Heneidi S, et al. PLoS One 2013, 8:e6475224。
27.Vasiliou V, Nebert DW. Hum Genomics 2005, 2: 138−143。
28.Fukai T, et al. Antioxid Redox Signal. 2011 ; 15 : 1583−1606.28。
29.Huang J, et al. Circ Res 2010, 106: 1753− 1762。
30.Hristov M, et al. Circ Res 2007, 100:590−597。
31.Tai MH, et al. Carcinogenesis 2005, 26:495−502。
32.Kultz D. Annu Rev Physiol 2005, 67:225−57。
33.Meier P, et al. Nature 2000, 407: 796−801。
34.Blanpain C, et al. Cell 2004, 1 18:635−35. Li L, Bhatia R。
35.Clin Cancer Res 2011, 17:4936−41。
36.Medici D, et al.. Nat Med 2010,16: 1400−1406。
37.Xiao N, J et al. Blood 2012, 1 19: 4898−4907。
38.Haeckel E. Anthropogenic oder Entwickelungsgeschichte des Menschen, 3rd edn. In: Engelmann W, editor. Leipzig 1877, p. 144。
39.Brunt KR, et al. Can J Physiol Pharmacol 2012, 90:327−35。
40.Maehle AH 2011. Notes Rec R Soc Lond 201 1 , 65:359−78。
41.Majo F, et al. Nature 2008, 456:250−4。
42.Kolf CM, et al. Arthritis Res Ther 2007, 9:204。
43.Uccelli A, et al. Nat Rev Immunol 2008, 8:726−36。
44.Zuk PA, et al. Tissue Eng 2001, 7:211−28。
45.Seydoux G, et al. Cell 2006, 127:891−904。
46.Mitalipov S, Wolf D. Adv Biochem Eng Biotechnol 2009, 114: 185−99。
47.Greenberg, A.S. and M.S. Obin, Am J Clin Nutr 2006, 83:461S−465S。
48.Fantuzzi, G. J Allergy Clin Immunol 2005, 115: 911−9。
49.Farmer SR. Cell Metab 2006, 4:263−273。
50.Rosen ED, MacDougald OA. Nat Rev Mol Cell Biol 2006, 7: 885−896。
51.Siersbaek R, Mandrup S. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 201 1 , 76:247−255。
52.Cristancho AG, Lazar MA. Nat Rev Mol Cell Biol 2011, 12:722−734。
53.Sugihara, H., et al. Differentiation 1986, 31 :42−9。
54.Sonoda, E., et al. Endocrinology 2008,149: 4794−8。
55.Jumabay, M., et al. J Mol Cell Cardiol 2009, 47: 565−75。
56.Jumabay, M., et al. Cardiovasc Res 2010, 85: 17−27。
57.Cousin, B, et al. Faseb J 1999, 13:305−12。
58.Prunet−Marcassus, B., et al. Exp Cell Res 2006, 312:727−36。
59.Chazenbalk G, et al. PLoS One 201 1, 6: el 7834。
60.Blanpain C, et al. Cell 2004, 118:635−48。
60.Bhang, S H, et al. Molecular Therapy 2014, 22:862−72。
61.Byrne, J. Journal of Cellular Biotechnology 201 1 , l :eP3
62.Oyagi S, et al. J Hepatol 2006, 44:742−748。
63.Hermann A, et al. J Cell Sci 2004,117:441 1−4422。
64.Listenberger LL, Brown DA. Curr Protoc Cell Biol Chapter 2007, 24: Unit 24。
65.Fink T, Zachar V. Methods Mol Biol 2011, 698:243−251。
66.Di Rocco G, et al. J Cell Sci 2006, 119:2945−295
67.Beier JP, et al. Cell Biol Int 2011, 35:397−406。
68.Carlini P, et al. Biometals 2007, 20:869−878。
69.Gottlieb DI, et al. Cells Tissues Organs 1999,165: 165−172。
70.Karumbayaram S, et al. Stem Cells 2009, 27:806−811。
71.Li M, et al. Curr Biol 1998, 8:971−974。
72.Reubinoff BE, et al. Nat Biotechnol 2001, 19: 1134−1140。
73.Zhang SC, et al. Nat Biotechnol 2001, 19: 1129−1133。
74.Suzuki S, et al. J Histochem Cytochem 2010, 58:721 −730。
75.Thornton JE, Gregory RI. Trends Cell Biol 2012, 22:474−82。
76.Hendy GN, et al. Clinical and investigative medicine 1995, 18:47−65。
Claims (20)
- 多能性幹細胞(PSC)を脂肪組織から単離する方法であって、
(a)脂肪組織試料を提供すること;
(b)前記試料中の細胞をストレス条件に供すること;
(c)脂肪細胞および間質血管細胞群を2−36時間共培養すること;
(d)生細胞を回収すること;ならびに
(e)任意で回収された細胞を培養すること
を含む、方法。 - 前記工程(b)のストレス条件は、前記細胞をタンパク質分解酵素を含む培地でインキュベートすることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素はコラゲナーゼである、請求項2に記載の方法。
- 前記工程(c)の共培養はタンパク質分解酵素の存在下で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素はコラゲナーゼである、請求項4に記載の方法。
- 前記共培養は血清なしで実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記共培養は4−24時間実施される、請求項1に記載の方法。
- 細胞選別なしで実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記共培養は低酸素条件下で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(d)の回収は、少なくとも100,000のPASCを回収することを含む、請求項1に記載の方法。
- 請求項1−10のいずれかに記載の方法により単離したPASC、またはその後代、および治療的に許容される培地を含み、前記PSCは培地に懸濁される、組成物。
- 前記細胞は、SSEA−3、SSEA−4、Oct3/4、Sox2、Tra1−60、およびNanogを発現する、請求項11に記載の組成物。
- 請求項1−10のいずれかに記載の方法により単離した細胞、またはその後代の培養物から培地を回収することにより調製した条件培地を含む、細胞を含まない組成物。
- 被験体において組織損傷を寛解する方法であって、
請求項11または12に記載の組成物を前記被験体に、前記組成物のPSCが分裂し、組織損傷部位に集合することができる条件下で、投与すること
を含む、方法。 - 前記組織損傷は外傷性障害または疾患関連損傷を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記外傷性障害は低酸素症、骨損傷、裂傷、銃撃創傷、または脳卒中を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記疾患関連損傷は、糖尿病、血管疾患、感染、変性神経疾患、癌、または自己免疫疾患と関連する損傷を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記組成物は、脂肪吸引から単離されたPASCを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記脂肪吸引は、前記組成物が投与される被験体に対して実施される、請求項18に記載の方法。
- 前記組成物は前記被験体に脂肪吸引の6時間以内に投与される、請求項18に記載の方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2022013072A (ja) * | 2020-07-03 | 2022-01-18 | 富士フイルム株式会社 | 滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法および関節治療用細胞製剤の製造方法 |
Families Citing this family (4)
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---|---|---|---|---|
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WO2017177140A1 (en) * | 2016-04-07 | 2017-10-12 | Rowan University | Methods and kits for detecting myo/nog cells in human adipose tissue and methods of use thereof |
CN112074282A (zh) * | 2018-05-09 | 2020-12-11 | 株式会社生命科学研究所 | 脊髓损伤的治疗剂 |
CN117187174B (zh) * | 2023-11-08 | 2024-02-06 | 广州正源生物技术有限公司 | 一种Muse细胞培养基以及一种脂肪Muse细胞的提取方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012133942A1 (ja) * | 2011-03-30 | 2012-10-04 | 株式会社Clio | 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できる多能性幹細胞 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030082152A1 (en) | 1999-03-10 | 2003-05-01 | Hedrick Marc H. | Adipose-derived stem cells and lattices |
ATE426016T1 (de) | 1999-09-24 | 2009-04-15 | Cybios Llc | Pluripotent embryonale stammzellen-ahnliche zellen, zusammensetzungen und ihre vervendungen |
JP2003523767A (ja) * | 2000-02-26 | 2003-08-12 | アーテイセル・サイエンスイーズ・インコーポレイテツド | 脂肪組織由来の間質細胞から生成した多能性幹細胞およびその用途 |
DE10326750B4 (de) * | 2003-06-13 | 2006-07-27 | Gerlach, Jörg, Dr.med. | Verfahren zur Herstellung einer Zellpräparation und derart hergestellte Zellpräparationen |
EP1830862B1 (en) | 2004-12-30 | 2012-12-19 | PrimeGen Biotech LLC | Adipose-derived stem cells for tissue regeneration and wound healing |
KR100679642B1 (ko) * | 2005-11-16 | 2007-02-06 | 주식회사 알앤엘바이오 | 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 및 이를 함유하는세포치료제 |
US20090304644A1 (en) * | 2006-05-30 | 2009-12-10 | Cytori Therapeutics, Inc. | Systems and methods for manipulation of regenerative cells separated and concentrated from adipose tissue |
WO2008103807A2 (en) | 2007-02-21 | 2008-08-28 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods of producing preadipocytes and increasing the proliferation of adult adipose stem/progenitor cells |
WO2010069008A1 (en) | 2008-12-19 | 2010-06-24 | Griffith University | A germline competent cell derived from adult tissue |
US20100330047A1 (en) * | 2009-06-26 | 2010-12-30 | Life & Light Ltd. | Mesenchymal Stem Cells Grown Under Hypoxic Conditions: Compositions, Methods and Uses Therefor |
US9550975B2 (en) * | 2009-07-15 | 2017-01-24 | Mari Dezawa | SSEA-3 pluripotent stem cell isolated from body tissue |
US9399758B2 (en) * | 2009-07-15 | 2016-07-26 | Mari Dezawa | SSEA3(+) pluripotent stem cell that can be isolated from body tissue |
US8501397B2 (en) * | 2009-07-24 | 2013-08-06 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Enrichment of stem cells from adult tissues |
EP2482761A4 (en) | 2009-09-30 | 2014-03-19 | Brigham & Womens Hospital | TISSUE TRANSPLANT COMPOSITIONS AND METHOD FOR THEIR USE |
US9234179B2 (en) | 2009-12-18 | 2016-01-12 | Shanghai Icell Biotechnology Co., Ltd. | Materials and methods for generating pluripotent stem cells |
US20120028933A1 (en) * | 2010-07-28 | 2012-02-02 | Baust John M | Cell Culture Media Supplement and Method of Molecular Stress Control |
-
2014
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-
2015
- 2015-11-19 CL CL2015003402A patent/CL2015003402A1/es unknown
-
2018
- 2018-11-02 US US16/179,798 patent/US11066647B2/en active Active
-
2021
- 2021-07-08 US US17/305,483 patent/US11913027B2/en active Active
-
2023
- 2023-11-15 US US18/509,960 patent/US20240076623A1/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012133942A1 (ja) * | 2011-03-30 | 2012-10-04 | 株式会社Clio | 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できる多能性幹細胞 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
CHAZENBALK G ET AL., NOVEL PATHWAY OF ADIPOGENESIS THROUGH CROSS-TALK BETWEEN ADIPOSE TISSUE MACROPH, JPN6018027867, ISSN: 0003842080 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2022013072A (ja) * | 2020-07-03 | 2022-01-18 | 富士フイルム株式会社 | 滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法および関節治療用細胞製剤の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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EP2999780B1 (en) | 2019-10-09 |
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