CN117187174B - 一种Muse细胞培养基以及一种脂肪Muse细胞的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种Muse细胞培养基以及一种脂肪Muse细胞的提取方法，属于Muse细胞培养技术领域。本发明提供的Muse细胞培养基由基础培养基和添加剂组成；基础培养基中含有特定配比的Lonza基础培养基和甲基纤维素基础培养基；添加剂包括血清替代物、表皮生长因子和非必需氨基酸，解决了现有技术中无法快速提取大量Muse细胞的问题。通过本发明提供的培养基能够实现脂肪Muse细胞的快速大量提取，可有效避免提取过程中Muse细胞死亡。
Description
技术领域
本发明涉及Muse细胞培养技术领域，尤其涉及一种Muse细胞培养基以及一种脂肪Muse细胞的提取方法。
背景技术
多系分化应激耐受(multilineage-differentiating stress-enduring，Muse)细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能、可向3个胚层分化的细胞，能从皮肤、脂肪、骨髓中获得，也可从间充质干细胞中分离得到，有不断自我更新能力、低端粒酶活性和非致瘤性，而且在体内能整合到损伤部位，具有较强的组织修复能力，是组织工程、细胞移植及基因治疗领域的理想种子细胞。Muse细胞克服了ESCs、iPSCs、NSCs及其他成体定向干细胞在体内移植治疗中的许多不足之处，具有以下特征：1)有应激耐受力；2)表现为SSEA-3和CD105双阳性；3)单细胞能形成细胞球，表达多能干细胞标志物；4)可以自我更新；5)能分化为3个胚层的细胞；6)在裸鼠体内不形成畸胎瘤。这些特征使其成为再生医学领域最具临床应用潜力的种子细胞之一。
中国专利CN112852727A公开了一种人脐带来源Muse细胞的培养方法，但是具有以下缺点：通过长时间的酶解才能从间充质干细胞中提取出来；步骤繁琐，不利于工业化生产应用；由于Muse细胞在组织中含量低、提取量也较低，不利于后续扩增。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Muse细胞培养基以及一种脂肪Muse细胞的提取方法，能够用于快速提取数量更多的Muse细胞。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种Muse细胞培养基，由基础培养基和添加剂组成；
所述基础培养基中含有Lonza基础培养基和甲基纤维素基础培养基；
所述添加剂包括血清替代物、表皮生长因子和非必需氨基酸；
所述Lonza基础培养基和甲基纤维素基础培养基的体积比为80~120:1。
优选的，所述血清替代物在Muse细胞培养基中的终体积比例为3~8%。
优选的，所述表皮生长因子在Muse细胞培养基中的终浓度为5~15ng/mL。
优选的，所述非必需氨基酸在Muse细胞培养基中的添加浓度倍数为1~3×，初始浓度倍数为100×。
本发明还提供了上述Muse细胞培养基在Muse细胞体外培养中的应用。
本发明还提供了一种脂肪Muse细胞的提取方法，包括以下步骤：
将脂肪组织进行破碎、过筛，得到筛下组分；
将筛下组分与复合酶混合，进行酶解处理，终止消化后得到酶解产物；
将酶解产物进行离心，得到细胞沉淀物；
将细胞沉淀物接种至上述muse细胞培养基中，进行悬浮培养7~15d；
选出直径25μm以上的细胞集落，进行贴壁培养，得到单细胞层；
消化收集所述单细胞层，完成脂肪Muse细胞的提取。
优选的，所述过筛的目数为40~60目。
优选的，所述复合酶中含有胶原酶、胰蛋白酶和酪蛋白激酶，所述复合酶中胶原酶、胰蛋白酶和酪蛋白激酶的体积比为1:0.8~1.2:0.8~1.2；
所述筛下组分与复合酶的体积比为1:2~3。
优选的，以体积百分比浓度计，所述胶原酶的初始浓度为0.1~0.3%，所述胰蛋白酶的初始浓度为0.1~0.4%，所述酪蛋白激酶的初始浓度为0.1~0.3%；
所述酶解处理的温度为30~42℃，所述酶解的时间为1~3h。
优选的，所述离心的转速为100~300g；
所述离心的时间为3~10min。
本发明的有益效果：
本发明提供的Muse细胞培养基由基础培养基和添加剂组成；基础培养基中含有特定配比的Lonza基础培养基和甲基纤维素基础培养基；添加剂包括血清替代物、表皮生长因子和非必需氨基酸，通过此培养基能够实现脂肪Muse细胞的快速大量提取，可有效避免提取过程中Muse细胞死亡。
本发明提供的脂肪Muse细胞的提取方法能够高效分解脂肪组织，且不会有损Muse细胞的活性，分解彻底、为后续提取数量充足的muse细胞提供了保证。
附图说明
图1脂肪间充质干细胞染色结果图；
图2为脂肪来源muse细胞染色结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种Muse细胞培养基，由基础培养基和添加剂组成；所述基础培养基中含有Lonza基础培养基和甲基纤维素基础培养基；
所述添加剂包括血清替代物、表皮生长因子和非必需氨基酸；
所述Lonza基础培养基和甲基纤维素基础培养基的体积比为80~120:1，进一步优选为90~110:1。
所述血清替代物在Muse细胞培养基中的终体积比例优选为3~8%，进一步优选为4~6%。
所述表皮生长因子在Muse细胞培养基中的终浓度优选为5~15ng/mL，进一步优选为8~12ng/mL；
所述非必需氨基酸在Muse细胞培养基中的添加浓度倍数为1~3×，初始浓度倍数为100×。
本发明中，培养基中的各个组分相互配合，共同组成最有利于Muse细胞存活扩增的体系。
本发明还提供了上述Muse细胞培养基在Muse细胞体外培养中的应用。
本发明还提供了一种脂肪Muse细胞的提取方法，包括以下步骤：
将脂肪组织进行破碎、过筛，得到筛下组分；
将筛下组分与复合酶混合，进行酶解处理，终止消化后得到酶解产物；
将酶解产物进行离心，得到细胞沉淀物；
将细胞沉淀物接种至上述muse细胞培养基中，进行悬浮培养7~15d；
选出直径25μm以上的细胞集落，进行贴壁培养，至细胞集落铺展成单细胞层；
消化收集所述单细胞层，完成脂肪Muse细胞的提取。
本发明所述破碎、过筛优选采用以下方法：将清洗干净脂肪组织先进行40目过筛（筛孔尺寸：0.425 mm），然后将2个螺纹注射器通过1.4 mm孔径的转接头连接，将脂肪组织按照10mL/s、1min的推注速度和推注时间，在2个螺纹注射器间连续来回推注，最后进行60目过筛（筛孔尺寸：0.250mm）。
所述复合酶中优选含有胶原酶、胰蛋白酶和酪蛋白激酶，所述复合酶中胶原酶、胰蛋白酶和酪蛋白激酶的体积比优选为1:0.8~1.2:0.8~1.2，进一步优选为1:0.9~1.1:0.9~1.1；所述筛下组分与复合酶的体积比优选为1:2~3，进一步优选为1:2.3~2.7；以体积百分比浓度计，所述胶原酶的初始浓度优选为0.1~0.3%，所述胰蛋白酶的初始浓度优选为0.1~0.4%，所述酪蛋白激酶的初始浓度优选为0.1~0.3%，也即，将上述初始浓度的胶原酶、胰蛋白酶和酪蛋白激酶按体积比混合，得到复合酶。
本发明中，所述酶解处理的温度优选为30~42℃，进一步优选为33~38，所述酶解的时间优选为1~3h，进一步优选为1.5~2.5h；所述酶解优选伴随震荡处理，所述震荡处理的转速优选为200~300r/min。
本发明中，所述终止消化优选采用含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养基作为终止剂；所述离心的转速优选为100~300g，进一步优选为150~250g；所述离心的时间优选为3~10min，进一步优选为5~7min；所述细胞沉淀物接种至上述muse细胞培养基中的接种量优选为2~8×103cells/mL，本发明所述的完成脂肪Muse细胞的提取之后可优选将单细胞层进行消化、扩增培养，也可直接进行应用或保存。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例中试剂来源：
Lonza基础培养基 供应商：重庆华雅思创，货号：12-725F；
甲基纤维素基础培养基 供应商：默克公司，货号：M7027；
血清替代物 供应商：赛默飞公司，货号：10828028；
表皮生长因子 供应商：默克公司，货号：E9644；
必需氨基酸 供应商：默克公司，货号：M7145。
实施例1
将脂肪组织分装至50mL离心管中，每管20mL，加入等体积的生理盐水，充分混匀；转移至离心机，300g离心5min；用10mL一次性移液管插入底部吸弃生理盐水，重复两次后得到清洗干净的脂肪组织。
将清洗干净的脂肪组织进行过筛（一层筛网，筛孔尺寸：0.425 mm，标准目数：40目），将两个螺纹注射器（10mL）通过1.4mm孔径的转接头连接，将脂肪组织按照10 mL/s、1min的推注速度和推注时间在2个螺纹注射器间连续来回推注，最后再次过筛（筛孔尺寸：0.250 mm，标准目数：60目）。
配制复合酶：浓度为0.2%的胶原酶Ⅰ、浓度为0.25%的胰蛋白酶、浓度为0.2%的酪蛋白激酶2蛋白，按体积比为1:1:1混匀，得到复合酶。
向离心管中以组织体积:复合酶=1:2.5的体积比加入过筛后的脂肪组织和复合酶，置于摇床内，在37℃、250 r/min条件下振荡2h，然后加入含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养基终止消化，以转速200g离心5min，得到沉淀细胞。
配制悬浮培养基：
在Lonza基础培养基中加入以下终浓度的组分：
5%KnockOut 血清替代物、1%甲基纤维素基础培养基H4230、10ng/mL的表皮生长因子（EGF）、1×NEAA（原液浓度为100×）；
将沉淀细胞用悬浮培养基重悬，以5×103cells/mL细胞浓度接种至超低吸附培养板，每孔0.5mL，隔天补液，培养7d，将直径大于25μm的细胞集落用玻璃吸管拣出，接种于普通培养板进行贴壁培养，待细胞集落铺展成单细胞层后，用0.25%含EDTA的胰酶消化并收集细胞，得到的细胞沉淀再次利用上述悬浮培养基，培养于超低吸附培养皿中，完成Muse细胞的提取和扩增。
实施例2
将脂肪组织分装至50mL离心管中，每管20mL，加入等体积的生理盐水，充分混匀；转移至离心机，300g离心5min；用10mL一次性移液管插入底部吸弃生理盐水，重复两次后得到清洗干净的脂肪组织。
将清洗干净的脂肪组织进行过筛（一层筛网，筛孔尺寸：0.425 mm，标准目数：40目），将两个螺纹注射器（10mL）通过1.4mm孔径的转接头连接，将脂肪组织按照10 mL/s、1min的推注速度和推注时间在2个螺纹注射器间连续来回推注，最后再次过筛（筛孔尺寸：0.250 mm，标准目数：60目）。
配制复合酶：浓度为0.2%的胶原酶Ⅰ、浓度为0.25%的胰蛋白酶、浓度为0.2%的酪蛋白激酶2蛋白，按体积比为1:0.8:1.2混匀，得到复合酶。
向离心管中以组织体积:复合酶=1:3的体积比加入过筛后的脂肪组织和复合酶，置于摇床内，在37℃、250 r/min条件下振荡2h，然后加入含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养基终止消化，以转速200g离心5min，得到沉淀细胞。
配制悬浮培养基：
在Lonza基础培养基中加入以下终浓度的组分：
8%KnockOut 血清替代物、1.5%甲基纤维素基础培养基H4230、15ng/mL的表皮生长因子（EGF）、1×NEAA（原液浓度为100×）；
将沉淀细胞用悬浮培养基重悬，以5×103cells/mL细胞浓度接种至超低吸附培养板，每孔0.5mL，隔天补液，培养7d，将直径大于25μm的细胞集落用玻璃吸管拣出，接种于普通培养板进行贴壁培养，待细胞集落铺展成单细胞层后，用0.25%含EDTA的胰酶消化并收集细胞，得到的细胞沉淀再次利用上述悬浮培养基，培养于超低吸附培养皿中，完成Muse细胞的提取和扩增。
对比例1
参照《人脐带与人脂肪间充质干细胞中应激耐受多系分化细胞的分离鉴定及分化能力比较.中国组织工程研究[J].2022.26(24):3802~3807》，将悬浮培养基替换为：
在α-MEM培养基中加入以下终浓度的组分：
体积分数为10%胎牛血清、10ng/mL重组碱性成纤维细胞生长因子、10ng/mL表皮生长因子、1%基础甲基纤维素培养基H4100、200 μmol/L谷氨酰胺。
实验例
将实施例1和对比例1悬浮培养的Muse细胞集落接种到普通培养板12h后，采用 显色试剂盒（BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒，品牌：碧云天；产品编号C3206）检测细胞表达。以间充质干细胞做对照染色，结果如图1和图2所示。
由图1和图2可知，脂肪间充质干细胞贴壁生长，细胞未见染色；而脂肪来源的Muse细胞呈团状生长，Muse细胞被染色；由于脂肪间充质干细胞并未表达碱性磷酸酯酶，而Muse细胞表达了碱性磷酸酯酶，说明本发明成功获得了Muse细胞。
随机选取10μL实施例1和对比例1悬浮培养的Muse细胞悬液，加入10μL 0.4%台盼蓝染料，按照1:1体积比轻柔充分混合均匀，加入细胞计数板中，经countstar检测细胞活率，结果如下表1所示。
表1 细胞数量及活力检测结果（n≥3）
*与对比例1相比，存在显著性差异，p<0.05
从上表可知，通过本发明提供的培养基能够获得数量更多、活率更高的Muse细胞。
将脂肪间充质干细胞和脂肪muse细胞按照1×106/100μL加入1μL大鼠抗人IgM的SSEA-3一抗(1:100)4 ℃孵育30 min，PBS 洗涤3次，加入FITC标记的山羊抗大鼠IgM，4℃孵育30 min，PBS洗涤3次，流式细胞仪检测SSEA-3的表达，结果如表2所示。
表2.脂肪间充质干细胞和Muse细胞SSEA-3检测结果（n≥3）
由表2可知，3批次的脂肪间充质干细胞的SSEA-3表达率分别为1.13%、1.46%、1.37%；表达率均低于1.50%；而本发明得到的Muse细胞SSEA-3的表达率分别为87.52%、90.36%、89.04%；表达率在87.0%~91.0%，高表达SSEA-3；说明本发明得到的Muse细胞能特异性的表达全能干细胞的表面标记物，具备全能干细胞的特性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种Muse细胞培养基，其特征在于，由基础培养基和添加剂组成；
所述基础培养基由Lonza基础培养基和甲基纤维素基础培养基组成；
所述添加剂由血清替代物、表皮生长因子和非必需氨基酸组成；
所述血清替代物为KnockOut血清替代物；
所述KnockOut血清替代物在Muse细胞培养基中的终体积比例为5%；
所述表皮生长因子在Muse细胞培养基中的终浓度为10ng/mL；
所述甲基纤维素基础培养基在Muse细胞培养基中的终体积比例为1%；
所述非必需氨基酸在Muse细胞培养基中的添加浓度倍数为1×。
2.权利要求1所述的Muse细胞培养基在Muse细胞体外培养中的应用。
3.一种脂肪Muse细胞的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
将脂肪组织进行破碎、过筛，得到筛下组分；
将筛下组分与复合酶混合，进行酶解处理，终止消化后得到酶解产物；
将酶解产物进行离心，得到细胞沉淀物；
将细胞沉淀物接种至权利要求1所述的Muse细胞培养基中，进行悬浮培养7d；
选出直径25μm以上的细胞集落，进行贴壁培养，得到单细胞层；
消化收集所述单细胞层，完成脂肪Muse细胞的提取；
所述复合酶中含有胶原酶、胰蛋白酶和酪蛋白激酶，所述复合酶中胶原酶、胰蛋白酶和酪蛋白激酶的体积比为1:1:1；
所述筛下组分与复合酶的体积比为1:2.5；
以体积百分比浓度计，所述胶原酶的初始浓度为0.2%，所述胰蛋白酶的初始浓度为0.25%，所述酪蛋白激酶的初始浓度为0.2%；
所述酶解处理的温度为37℃，所述酶解的时间为2h；
所述离心的转速为200g；
所述离心的时间为5min。
4.根据权利要求3所述的脂肪Muse细胞的提取方法，其特征在于，所述过筛的目数为40~60目。
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