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Die vorliegende Erfindung betrifft antibakterielle Mittel und insbesondere antibakteriell einsetzbare Arzneimittelpräparate.
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Der menschliche Körper ist von einer großen Zahl an Bakterien besiedelt. Bakterien finden sich beispielsweise im Darm, auf der Haut und in der Mundhöhle. Auch in seiner Umwelt ist der Mensch zahllosen Bakterien ausgesetzt, die beispielsweise über die Atmung oder durch Nahrungsmittel aufgenommen werden können.
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Neben wichtigen Funktionen, die Bakterien am und im menschlichen Körper erfüllen, können sie als Krankheitserreger bei Infektionen von Wunden, Infektionen von Organen oder dem Auslösen einer Sepsis auftreten. Neben der Haut sind oftmals die Schleimhäute der Atemwege oder des Verdauungstrakts betroffen.
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Bakterien können bei geschädigten Barrieren in den menschlichen Körper eindringen, jedoch auch intakte Barrieren überwinden (z. B. Haut oder Schleimhäute), wobei sie sich spezialisierter Mechanismen bedienen. Sind die Abwehrkräfte des Körpers geschwächt, kann auch die normale bakterielle Flora auf den äußeren oder inneren Oberflächen des Körpers zu opportunistischen Erkrankungen führen, obwohl die entsprechenden Bakterien normalerweise apathogen sind.
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Eine Vielzahl bakterieller Infektionen verläuft harmlos. In Abhängigkeit vom spezifischen Keim, von der Lokalisation der Infektion und von dem Immunstatus des Patienten können bakterielle Infektionen zu schwerwiegenden Krankheiten führen.
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Bakterielle Infektionen werden heutzutage in der Regel durch Gabe von Antibiotika bekämpft. Ein wachsendes Problem beim Antibiotikaeinsatz stellt jedoch die zunehmende Zahl an Resistenzen dar. Viele Antibiotika sind gegen bestimmte Bakterien unwirksam geworden. Besondere medizinische Probleme sind multiresistente Keime, die resistent gegen mehrere Arten von Antibiotika sind und die Übertragung von Resistenzgenen von Bakterium zu Bakterium.
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Problematisch beim Einsatz von Antibiotika kann außerdem sein, dass nicht nur pathogene, sondern auch nützliche und erwünschte Bakterien beeinträchtigt oder abgetötet werden können. Wird etwa durch eine Behandlung mit einem Antibiotikum die Darmflora gestört, stellt das nicht nur eine Unannehmlichkeit dar. In einem solchen Fall kann auch ein Bakterium, das normalerweise aufgrund der Konkurrenz durch die gesunde Darmflora nicht in nennenswerter Zahl vorliegt, jedoch gegen viele Antibiotika resistent ist (etwa Clostridium) sich ungestört vermehren und seinerseits Krankheiten auslösen.
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Dem Einsatz von Antibiotika können zudem Unverträglichkeiten und Allergien im Wege stehen. Ein häufiger Fall ist die Penicillinallergie. Allergische Reaktionen können von einer Hautrötung bis zum anaphylaktischen Schock reichen.
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Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein alternatives antibakterielles Mittel zu Verfügung zu stellen, das vorzugsweise einen oder mehrere der oben angeführten mit dem Einsatz von Antibiotika verbundenen Nachteile vermeidet. Vorteilhafterweise ist ein solches Mittel einfach, kostengünstig, sicher und/oder schnell herzustellen. Vorteilhaft ist auch, wenn ein solches Mittel eine besonders gute Körperverträglichkeit aufweist.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Arzneimittelpräparat zur Verwendung als antibakterielles Mittel, wobei das Arzneimittelpräparat herstellbar ist durch ein Verfahren umfassend die folgenden Schritte: Kontaktieren einer einem Patienten entnommenen Vollblutprobe mit einem Gefäß oder Behältnis und Inkubation der Vollblutprobe.
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Der Begriff „umfassend” hat gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die Bedeutung „bestehend aus”. Entsprechendes gilt für sprachliche Varianten dieser Wörter.
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Durch die Inkubation entsteht eine konditionierte Vollblutprobe. Durch Abtrennung der Zellbestandteile kann konditioniertes Plasma erhalten werden, und daraus nach Blutgerinnung konditioniertes Serum.
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Es ist bekannt, dass konditioniertes menschliches Vollblut Exosomen enthält. Exosomen sind kleine Vesikel, die von Zellen an ihre Umgebung abgegeben werden. Exosomen finden sich in biologischen Flüssigkeiten wie etwa Serum, Urin und Synovialflüssigkeiten. Die meisten Zelltypen sind zur Sekretion von Exosomen in der Lage. Die Sekretion erfolgt durch Abspaltung von der zellulären Plasmamembran. Exosomen enthalten in Abhängigkeit von der sie bildenden Zelle unter anderem eine variable Zusammensetzung an Proteinen. Exosomen in konditioniertem menschlichen Vollblut und ihr therapeutischer Einsatz sind im Dokument
WO 2006/007529 A2 beschrieben, insbesondere in Beispiel 14. Als Einsatzgebiete werden dort allgemein die Inhibierung von Immunreaktionen und beispielhaft lumbale radikuläre Schmerzen, rheumatoide Arthritis, juveniler Morbus Still (systemische juvenile idiopathische Arthritis), Heuschnupfen und Gras- und Pollenallergie beschrieben.
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Überraschenderweise wurde nun eine antibakterielle Wirkung eines durch Inkubation einer Vollblutprobe erhältlichen Arzneimittelpräparats festgestellt. Diese Erkenntnis stellt die Grundlage der vorliegenden Erfindung dar.
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Die antibakterielle Wirkung des erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparats kann auf einfache Weise beispielsweise mittels eines Hemmhoftests nachgewiesen werden, mit dem die Empfindlichkeit von Bakterien gegen antibakterielle Wirkstoffe getestet wird. Hierbei wird auf einer Agarplatte die Entstehung eines Bakterienrasens um Filterblättchen gehemmt, die mit einem wirksamen antibakteriellen Stoff getränkt wurden, da dieser in den Agar diffundiert.
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Ebenfalls einfach nachgewiesen werden kann die antibakterielle Wirkung des erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparats mittels der Kulturhemmung.
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Aufgrund seiner antibakteriellen Wirkung kann ein solches Arzneimittelpräparat zur Therapie (einschließlich Prophylaxe) einer Erkrankung oder eines Leidens eingesetzt werden, die/das durch Bakterien verursacht wird, insbesondere von durch Bakterien verursachten Infektionserkrankungen. Es kann alleine oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen eingesetzt werden. Auf diese Weise stellt das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat eine Alternative zum Einsatz von Antibiotika dar.
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Das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat kann zudem beispielsweise eine einfache, kostengünstige, sichere und/oder schnelle Herstellung ermöglichen. Durch eine Reihe unkomplizierter Schritte kann beispielsweise ohne aufwendige Geräte und Materialien mit einem Minimum an Handgriffen in wenigen Stunden ein verwendungsfähiges Arzneimittelpräparat erhalten werden, ohne dass bei der Herstellung des Arzneimittelpräparats körperfremde Stoffe zugesetzt und gegebenenfalls wieder abgetrennt werden müssen. Durch eine Verwendung ausschließlich körpereigener Substanzen kann etwa ein besonders körperverträgliches antibakterielles Mittel erhalten werden. Das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat eröffnet auch die Möglichkeit, die oben beschriebenen Probleme beim Einsatz von Antibiotika zu umgehen, etwa durch eine Vermeidung von Resistenzen oder eine Vermeidung oder Verringerung von Nebenwirkungen.
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Das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat enthält vorzugsweise Exosomen. Ein besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Arzneimittelpräparat enthält Exosomen, die während der Inkubation der Vollblutprobe in dem Gefäß/Behältnis gebildet werden. Es ist eine Erkenntnis der vorliegenden Erfindung, dass ein Exosomen enthaltendes erfindungsgemäßes Arzneimittelpräparat besonders wirksam ist.
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Der anhand von Transmissionselektronenmikroskopie bestimmte Mittelwert des Durchmessers der Exosomen in einem erfindungsgemäßen Exosomen enthaltenden Arzneimittelpräparat liegt vorzugsweise zwischen 30 und 200 nm, insbesondere zwischen 50 und 190 nm, zwischen 70 und 180 nm, zwischen 80 und 170 nm, zwischen 90 und 160 nm oder zwischen 100 und 150 nm. Exosomen dieser Größe führen zu einer besonders guten Wirksamkeit, während größere Vesikel zu einem wesentlichen Teil beschädigte Exosomen und Aggregate darstellen.
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Das Verfahren, durch das ein erfindungsgemäßes Exosomen enthaltendes Arzneimittelpräparat herstellbar ist, umfasst vorzugsweise ferner den folgenden Schritt: Aufkonzentrieren der Exosomen nach der Inkubation. Hierdurch kann die antibakterielle Wirksamkeit weiter erhöht werden.
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Exosomen können beispielsweise durch eine Zentrifugation bei 100.000 g aufkonzentriert werden, da solch hohe Zentrifugalbeschleunigungen besonders geeignet sind, um Exosomen zu konzentrieren. Eine solche Zentrifugation wird vorzugsweise mindestens 30 min, insbesondere mindestens 60 min durchgeführt, da das Aufkonzentrieren dann besonders effektiv ist. Das durch eine solche Zentrifugation gebildete Pellet enthält die Exosomen. Das Pellet kann in Flüssigkeit aufgenommen und optional filtriert werden, beispielsweise durch einen 0,2 μm Filter.
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Das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat enthält vorzugsweise Serum oder Plasma. Eine Anwesenheit von Serum oder Plasma zusätzlich zu den Exosomen verstärkt die antibakterielle Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparats.
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Während die möglichen Bestandteile des erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparats, Serum/Plasma bzw. Exosomen, jeweils bereits isoliert voneinander antibakteriell wirksam sind, ist eine Kombination des Serums oder Plasmas mit den Exosomen besonders stark wirksam.
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Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Arzneimittelpräparat enthält somit eine Kombination von Serum oder Plasma mit Exosomen. Ein besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Arzneimittelpräparat enthält eine Kombination von Serum oder Plasma mit während der Inkubation gebildeten Exosomen.
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Alternativ kann aber das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat auch Exosomen, aber kein Serum oder Plasma umfassen und insbesondere aus Exosomen bestehen. Wie vorliegend herausgefunden wurde, besteht die antibakterielle Wirksamkeit der Exosomen im erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparat unabhängig von sämtlichen Serums- oder Plasma-Bestandteilen.
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Gemäß einer weiteren Alternative kann das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat auch Serum oder Plasma, aber keine Exosomen umfassen und insbesondere aus Serum oder Plasma bestehen.
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Gemäß diesen (weniger bevorzugten) Alternativen umfasst das Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparats somit das Abtrennen vorhandener Exosomen oder das Abtrennen des Serums oder Plasmas nach der Inkubation. Exosomen können beispielsweise mittels differenzieller Ultrazentrifugation, Saccharosegradient und/oder Saccharose-Kissen isoliert werden.
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Optional kann ein Exosomen enthaltendes erfindungsgemäßes Arzneimittelpräparat, insbesondere eines, das aus Exosomen besteht, auch so modifiziert werden, dass die Exosomen aufgeschlossen werden, beispielsweise durch hypotone Lyse (etwa mittels Aufnehmen der Exosomen im Wasser). Dies führt dazu, dass die Exosomen ihre Inhaltsstoffe freisetzen.
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Das Serum oder Plasma in einem Serum oder Plasma enthaltenden erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparat enthält vorzugsweise Cytokine und/oder Wachstumsfaktoren.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren, durch das das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat herstellbar ist ferner den folgenden Schritt: Abtrennen der zellulären Bestandteile der Vollblutproben nach der Inkubation. Zum Abtrennen der zellulären Bestandteile eignet sich beispielsweise eine Zentrifugation (beispielsweise eine kurzzeitige und niedertourige Zentrifugation, etwa 10 min bei 1000 g) oder eine Filtration.
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Die Inkubation der Vollblutprobe in dem Gefäß oder Behältnis erfolgt vorzugsweise während eines Zeitraums von bis zu 72 h, insbesondere während eines Zeitraums von 1–48 h, 2–24 h, 3–12 h, 4–10 h, 5–8 h oder 6 h. Es hat sich gezeigt, dass die beste antibakterielle Wirksamkeit bei einer Inkubation von etwa 6 h erzielt wird. Die bei einer solchen Inkubationszeit gebildeten konditionierten Präparate verfügen über eine maximale Menge intakter Exosomen. Bei längeren Inkubationszeiten nimmt oftmals der Anteil an Aggregaten und schadhaften Exosomen zu. Bei kürzeren Inkubationszeiten ist zuweilen die Menge an Exosomen noch nicht optimal.
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Die Inkubation erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von 0°C bis 45°C, bevorzugt bei einer Temperatur von 10°C bis 43°C, 20°C bis 41°C, 30°C bis 40°C, 35°C bis 39°C, 36°C bis 38°C oder 37°C. Bei diesen Temperaturen ist die Bildung antibakterieller Aktivität in dem erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparat besonders effektiv. Insbesondere lässt sich dabei regelmäßig eine vermehrte Entstehung von Exosomen beobachten.
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Geeignete Gefäße bzw. Behältnisse zur Durchführung des Verfahrens, durch das das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat herstellbar ist, sind beispielsweise Spritzen, Röhrchen wie etwa Vakuumröhrchen, Mikrotiterplatten und Transfusionsbeutel. Das Gefäß oder Behältnis umfasst vorzugsweise eine Oberfläche zur Kontaktierung der Vollblutprobe, die Glas, Kunststoff, Korund oder Quarz oder eine Kombination davon umfasst. Ein bevorzugter Kunststoff ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polycarbonat, Polyethylen und Polypropylen.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind in dem Gefäß oder Behältnis makroskopische Partikel enthalten und die Vollblutprobe steht während der Inkubation in Kontakt mit den makroskopischen Partikeln. Unter makroskopischen Partikeln werden vorliegend Partikel verstanden, die mit bloßem Auge sichtbar sind. Die makroskopischen Partikel dienen dazu, die Oberfläche zur Kontaktierung der Vollblutprobe zu vergrößern und können beispielsweise die Form von Kugeln, Granulat, Mehl, Gelen oder Wolle haben. Bevorzugte Materialien hierfür sind Glas, Kunststoff, Korund und/oder Quarz. Besonders bevorzugt sind Glaskugeln. Die Oberfläche der makroskopischen Partikel kann optional modifiziert werden, beispielsweise durch Inkubation in einem ätzenden Agens wie etwa 50% v/v CrSO4 und nachfolgendes wiederholtes Waschen. Bei der Verwendung der genannten Gefäße/Behältnisse und/oder bei der Verwendung der genannten makroskopischen Partikel kommt es zu einer Verbesserung der Konditionierung und zu einer Verstärkung der antibakteriellen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparats.
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Hinsichtlich der Gewinnung eines Exosomen enthaltenden konditionierten Vollbluts, Plasmas oder Serums wird ergänzend auf das Dokument
WO 2006/007529 A2 Bezug genommen, insbesondere auf Beispiel 14 daraus.
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Konditioniertes Serum ist auch unter dem Namen Orthokin bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Orthokin als erfindungsgemäßes Arzneimittelpräparat eingesetzt.
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Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat zur Verwendung bei dem Patienten bestimmt, dem die Vollblutprobe entnommen worden ist. Es ist also vorzugsweise ein autologes und kein allogenes Arzneimittelpräparat. Dies ist insbesondere aus Gründen der Sicherheit bevorzugt.
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Das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat kann zur lokalen oder systemischen Verabreichung bestimmt sein. Dies ist unter anderem von der Zugänglichkeit des betroffenen Körperkompartiments und von der Art und der Lokalisation der Bakterien abhängig, gegen die sich die antibakterielle Wirkung richten soll.
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Geeignete Verabreichungsformen sind z. B. parenteral (insbesondere intravenös, intraarteriell, intramuskulär, intraartikulär, epi/peridural, subkutan oder intraperitoneal), topisch, pulmonal, nasal, rektal, dermal, konjunktival oder otisch.
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Das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat kann zur Therapie lokaler und/oder systemischer Erkrankungen eingesetzt werden. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat zur Therapie einer Erkrankung eingesetzt, die auf eines oder mehrere der folgenden Bakterien zurückgeht: Bordetellen, Borrelien, Brucellen, Campylobakterien, Chlamydien, Clostridien, Corynebakterien, Enterobakterien, Enterokokken, Francisellen, Haemophilus influenzae, Klebsiellen, Legionellen, Leptospira, Listerien, Mykobakterien, Mykoplasmen, Neisserien, Proteus, Pseudomonaden, Rickettsien, Salmonellen, Shigellen, Staphylokokken, Streptokokken, Treponema pallidum, Ureaplasmen, Vibrionen und Yersinien.
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Als Erkrankungen sind etwa zu nennen: Infektionen wie septische Infektionen, Knocheninfektionen, Gelenkinfektionen, Hautinfektionen, Infektionen von Wunden (z. B. postoperative Wundinfektionen oder Infektionen von Brandwunden), Infektionen im Mundbereich, Genitalinfektionen, Harnwegsinfektionen und Augeninfektionen, Abszesse, Phlegmone, Mastitis, Tonsillitis, Dermatitis, Pneumonie, Salmonellose oder Diarrhoe.
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Das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat ist optional zur Verwendung in einer Kombinationstherapie mit einem weiteren antibakteriellen Mittel vorgesehen, das gleichzeitig oder im zeitlichen Abstand zum erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparat verabreicht werden kann. Für die Kombinationstherapie eignen sich dem Fachmann an sich bekannte weitere antibakterielle Mittel, insbesondere Antibiotika.
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Ein bevorzugtes Antibiotikum zur Verwendung in einer Kombinationstherapie ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminoglycoside, β-Lactame, Chinolone, Glycopeptide, Polyketide, Polypeptid-Antibiotika und Sulfonamide. Das Antibiotikum wird in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise verabreicht.
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Patienten im Sinne der Erfindung können Menschen sowie Tiere sein, bei denen eine bakteriell bedingte Erkrankung oder ein bakteriell bedingtes Leiden auftritt oder bei denen dies verhindert werden soll. Somit können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen vorgesehen sein für die Therapie eines Menschen und/oder eines Tieres wie zum Beispiel eines Hundes, einer Katze, eines Pferdes, eines Rinds, eines Schweins, einer Ziege oder eines Kamels.
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Kurzbeschreibung der Figuren
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1 zeigt das Ergebnis von Versuchen mit Flüssigkulturen von E. coli K12 zur Wachstumshemmung durch das erfindungsgemäße Arzneimittelpräparat In 1A ist die Wachstumskurve einer Testkultur gezeigt, die mit einem erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparat (Inkubation 6 h) versetzt wurde (Rautensymbole) und daneben die Wachstumskurve einer entsprechenden Vergleichskultur ohne Zusatz (Quadratsymbole). Auf der x-Achse ist die Zeit in Minuten aufgetragen und auf der y-Achse die bei 560 nm gemessene optische Dichte. 1B entspricht 1A, mit dem Unterschied, dass die Inkubation während eines Zeitraums von 24 h erfolgte.
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2 zeigt das Ergebnis von Versuchen wie bei 1, mit dem Unterschied, dass für die Flüssigkultur Salmonella 1535 eingesetzt wurde.
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Beispiele
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Beispiel 1: Herstellung des erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparats
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Gesunden Probanden wurden jeweils 50 ml Vollblut in einer 60 ml-Spritze (Orthogen) abgenommen. Die Spritzen enthielten jeweils eine Anzahl von ca. 200 Glaskugeln eines Durchmessers von 3,5 mm, die folglich eine Gesamtoberfläche von ca. 7700 mm2 aufwiesen.
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Die Kugeln waren zuvor mit destilliertem Wasser gewaschen worden, bis der pH-Wert des Wassers nach dem Spülen identisch zu dem vor dem Spülen war und sich die Leitfähigkeit des Waschwassers nicht mehr veränderte.
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Unmittelbar nach der Blutabnahme wurde das Blut bei 37°C in der jeweiligen aseptisch verschlossenen Spritze inkubiert. Die Inkubationszeiten betrugen in verschiedenen Messreihen 3, 6, 12 bzw. 24 h.
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Beispiel 2: Analyse der Exosomen
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2.1 Isolation der Exosomen
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Die Exosomen wurden durch bekannte Standardprozeduren mittels differenzieller Ultrazentrifugation, Saccharosegradient und/oder Saccharose-Kissen (40% Saccharose) isoliert. Die Exosomen-Pellets wurden in 200 μl PBS-Puffer aufgenommen. In einigen Experimenten wurden die Exosomen zum Aufschließen in 200 μl Wasser aufgenommen.
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2.2 Transmissionselektronenmikroskopie
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Die Exosomen wurden mittels eines Transmissionselektronenmikroskops visualisiert (Kupfer-Grid, Färbung mit Uranylacetat) und durch Messungen mit NanoSight (NTA) (NanoSight Ltd., Wiltshire, UK) quantifiziert.
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Es zeigte sich, dass die höchste Anzahl an intakten Exosomen (2,89 × 108/ml) mit einem Mittelwert des Durchmessers von 100–150 nm nach einer Inkubationszeit von 6 h vorlag.
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Die 24-stündige Inkubation führte ebenfalls zu einer großen Menge von Exosomen, deren Mittelwert des Durchmessers über 180 nm lag. Dies könnte darauf hinweisen, dass hier möglicherweise ein gewisser Anteil an Aggregaten und beschädigten Exosomen vorliegt.
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2.3 Analyse des Proteingehalts
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Der Proteingehalt wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gradientengele und Western Blots unter Verwendung von anti-CD63-Antikörpern nachgewiesen.
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Es ist bekannt, dass CD63 ein Marker für Exosomen ist.
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Aus den Western Blots war anhand der Stärke der CD63-Bande bei Proben verschiedener Inkubationszeiten zu erkennen, dass im Lauf der Inkubation tatsächlich Exosomen neu gebildet werden.
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Beispiel 3: Agardiffusionstest: Hemmhoftest
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Die antibakterielle Wirkung des erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparats (Inkubationszeiten 3, 6, 12 bzw. 24 h) wurde anhand eines Agardiffusionstests mit Todd-Hewitt-Agar getestet.
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Isolierte und in Puffer aufgenommene Exosomen (ohne Serum oder Plasma) sowie der entsprechende Überstand der Isolation (ohne Exosomen) wurden jeweils separat getestet.
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Runde Filterplättchen wurden mit 10, 20 und 30 μl der jeweiligen Lösungen getränkt und auf je einen Sektor einer Agarplatte gelegt.
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Bei den Filterplättchen, die mit dem Überstand getränkt worden waren, wurde bei Proben aller Inkubationszeiten Hemmhöfe beobachtet, deren Größe mit der eingesetzten Menge des Überstandes anwuchs.
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Bei den mit den Exosomen-Proben getränken Filterplättchen wurden ebenfalls Hemmhöfe beobachtet, die von der aufgetragenen Menge abhängig waren. Der größte Hemmhof war bei der Probe feststellbar, die 6 h inkubiert worden war.
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Die höchste Zahl intakter und aktiver Exosomen wird somit nach 6-stündiger Inkubation der Vollblutprobe erzielt. Exosomen und Überstände von Proben anderer Inkubationszeiten sind jedoch ebenfalls brauchbar.
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Es wurden auch erfindungsgemäße Arzneimittelpräparate getestet, die sowohl Serum als auch Exosomen enthielten. Diese riefen die größten Hemmhöfe hervor.
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Beispiel 4: Wachstumshemmung von Flüssigkulturen
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Zur Prüfung eines bakteriostatischen oder bakteriziden Effekts des erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparats wurden Flüssigkulturen von Salmonella 1535 und Escherichia coli K12 verwendet.
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Den Testkulturen wurde erfindungsgemäßes Arzneimittelpräparat zugesetzt, bei dem die Inkubation für 6 h bzw. 24 h durchgeführt worden war und das sowohl Serum als auch Exosomen enthielt. Einer Kontrollkultur wurde eine Kontrolllösung zugesetzt, die wie diese erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparate gewonnen worden war mit der Ausnahme, dass keine Inkubation durchgeführt worden war. Die jeweiligen Vergleichskulturen wurden ohne Zusatz herangezogen.
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Alle Kulturen wurden nach Standardverfahren kultiviert. Nach dem Zusatz des erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparats bzw. der Kontrolllösung wurde das Wachstum der Testkulturen bzw. der Kontrollkultur über einen sechsstündigen Beobachtungszeitraum durch das Messen der optischen Dichte verfolgt, ebenso wie das Wachstum der Vergleichskulturen.
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Die Ergebnisse sind in den 1 und 2 gezeigt.
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Während die Vergleichskulturen während des Beobachtungszeitraums annähernd bis zur Sättigung wuchsen, blieb bei den Testkulturen die optische Dichte im Bereich des Werts zu Beginn des Beobachtungszeitraums oder sank sogar leicht ab.
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Die Kontrollkultur wuchs während des Beobachtungszeitraums bis zur gleichen Sättigungsdichte heran wie die entsprechende Vergleichskultur.
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Dies zeigte, dass durch die Inkubation eine antibakterielle Aktivität im erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparat gebildet wird.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- WO 2006/007529 A2 [0013, 0036]
