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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Präparation zytotoxischer IgM Antikörper, welche im Wesentlichen frei ist von nicht-zytotoxischen IgM Antikörpern und von Antikörpern anderer Klassen, ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Präparation zytotoxischer IgM Antikörper sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine erfindungsgemäße Präparation zytotoxischer IgM Antikörper, welche vorzugsweise zur Behandlung von Krebserkrankungen eingesetzt wird.
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Die Tatsache, dass in humanem Serum zytotoxische Bestandteile gegen eine Reihe von Tumorzellen vorhanden sind, ist lange bekannt (Bolande, 1960). Die Geschwindigkeit, mit der der Zelltod durch solche Bestandteile eingeleitet wird, legt eine komplementvermittelte Zelllyse im Zusammenspiel mit IgMs nahe. So wurden in gesunden Blutspendern sogenannte natürliche IgM Antikörper gegen Neuroblastom (NB) gefunden, jedoch nicht in an Neuroblastom erkrankten Patienten (Erttmann et al., 1996, Ollert et al., 1996). Die Verwendung von anti-NB IgM haltigen Seren oder aufgereinigten Antikörpern führte in Nacktratten zum Tumorwachstumsstopp nach Inokulation menschlicher Neuroblastomzellen (David et al., 1996, Ollert et al., 1997). Schmitt et al. (1999), melden aus einer klinischen Phase I/II Studie vorläufige Daten von 6 Neuroblastompatienten, dass nach Plasmapherese zytotoxischer anti-NB Antikörper die Serumtoxizität stark anstieg und in 2 Patienten Tumornekrose zu verzeichnen war. Auch bei anderen Tumorarten ist der Einsatz zytotoxischer IgM Antikörper beschrieben. In einer Melanompatientin führte die Injektion zytotoxischen Plasmas in Metastasen zu rapider Tumornekrose, was auf massive lokale Komplement-Aktivierung zurückgeführt wurde (Schwartz-Albiez, 2007, Schwartz-Albiez et al., 2008). Neben Seren gesunder Spender wurden auch schon rekombinante monoklonale IgM Antikörper entwickelt und klinisch eingesetzt. Ein solcher Antikörper wurde in einer klinischen Studie in 50 Magenkarzinompatienten erprobt und führte in 80% der Fälle zu Apoptose von Tumorzellen innerhalb des Tumorgewebes.
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Mit Hilfe eines eigens dafür entwickelten zellbasierten Screening-Verfahrens konnte gezeigt werden, dass je nach Tumorart, ca. 0,25 bis 5% der Spender-Plasmen spezifische zytotoxische IgM Antikörper gegen verschiedene Tumore enthielten (Schwartz-Albiez, 2007).
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Die bisherige Strategie zur Herstellung eines klinisch-nutzbaren Präparates beruht auf dem Poolen individuell identifizierter zytotoxischer Plasmen. Eine wesentliche Limitation dieses Verfahrens ist das kostenintensive Screeningverfahren, welches insbesondere bei Tumorarten, gegen die in nur niedriger Frequenz zytotoxische Seren gefunden werden, nicht genügend Material zur längerfristigen Therapie größerer Patientenkollektive bereitgestellt werden kann.
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Solche zytotoxische IgM Antikörper finden sich jedoch in gleicher Prävalenz wie in der Bevölkerung in den gepoolten Plasmafraktionen aller Blutproduktehersteller, ohne bisher verwendet werden zu können.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung lag daher darin, zum einen durch selektive Anreicherung von zytotoxischen Antikörpern aus den nicht verwendeten Nebenfraktionen der konventionellen Blutplasmafraktionierung einen großen Pool an tumorspezifischen Antikörpern zur Verfügung zu stellen, der zur Entwicklung von Tumortherapeutika genutzt werden kann. Insbesondere lag die Aufgabe darin, Isolierungsmethoden bereitzustellen, welche es erlauben, spezifisch die zytotoxischen IgMs aus ungenutzten Blutplasmafraktionen zu nutzen und damit eine ökonomisch effiziente Erschließung des Rohstoffpools ungenutzter Blutplasmafraktionen zu ermöglichen. Zum anderen lag die Aufgabe darin, pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die eine grundsätzliche Behandlung von Patienten mit Tumoren verschiedenster Formen ermöglichen.
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Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellung von Präparationen zytotoxischer IgM Antikörper, welche im Wesentlichen frei sind von nicht-zytotoxischen IgM Antikörpern und von Antikörpern anderer Klassen.
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Im Wesentlichen frei von nicht-zytotoxischen IgM Antikörpern und von Antikörpern anderer Klassen bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die zytotoxischen IgM Antikörper in einer Reinheit von mehr als 80% vorliegen und andere Blutplasmabestandteile zu nicht mehr als 20% in der Präparation vorhanden sind.
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In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Reinheit der zytotoxischen IgM Antikörper in der erfindungsgemäßen Präparation mehr als 85% und besonders bevorzugt mehr als 90% gemäß obiger Definition. Die Reinheit wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere durch HPLC-Analyseverfahren bestimmt.
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Wie oben bereits ausgeführt, ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, insbesondere ein neuartiges Aufreinigungsverfahren bereitzustellen, welches die Isolierung von natürlichen und humanen Immunglobulinen des Typs IgM erlaubt, wobei zytotoxische IgM Antikörper derart isoliert und aufkonzentriert werden, dass sie sich besonders gut zur Behandlung von Krebserkrankungen eignen. Die zytotoxische Wirkung der erfindungsgemäßen IgM Präparationen kann in Zellkulturmodellen mit humanen Krebszellen nachgewiesen werden.
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Im Stand der Technik ist die gezielte Abtrennung und Aufreinigung der natürlichen zytotoxischen IgM Fraktion nicht beschrieben. Vielmehr wurde bisher üblicherweise die IgM Fraktion insgesamt isoliert und vorwiegend als Immunstimulanz verwendet. Für die Krebsforschung wurden auf der anderen Seite hauptsächlich rekombinant hergestellte, monoklonale zytotoxische IgMs verwendet. Man weiß auch, dass von ca. 100 individuell getesteten Plasmen mehr als 90% keine natürliche Zytotoxizität im Zellkulturassay aufweisen. Ferner sind bisher lediglich Verfahren zur Aufreinigung der kompletten IgM Fraktion bekannt, also keine Verfahren zur speziellen Aufreinigung von zytotoxischen IgM Fraktionen. Die Isolation normaler IgM Fraktionen erfolgt wie oben dargestellt nach der Methode von Pool, 1965 und Cohn, 1940 und beruhen auf der klassischen Plasmafraktionierung, bei der nach Durchführung bestimmter Schritte auch eine IgM-haltige Fraktion erhalten wird, welche allerdings nur in äußerst geringem Umfang zytotoxische IgM Antikörper enthält.
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1 zeigt ein Schema der klassischen Plasmafraktionierung der bekannten Verfahren nach Pool und Cohn. Demgegenüber werden erfindungsgemäße Präparationen zytotoxischer IgM Antikörper durch eine Kombination von chromatographischen Methoden und Screeningmethoden isoliert. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind daher zytotoxische IgM Antikörper Präparationen, welche erhältlich sind durch Isolierung aus Blut, Serum oder Plasma von Spendern, insbesondere gesunden Spendern, bei welchem die flüssigen Blutbestandteile in geeigneter Weise einer ersten chromatographischen Auftrennung unterworfen werden, Chromatographiefraktionen auf ihre Zytotoxizität in einem Zellkulturassay mit Tumorzellen untersucht werden, zytotoxische Fraktionen gegebenenfalls weiteren Reinigungs- und Trennschritten unterworfen werden und durch erneute chromatographische Auftrennung eine Fraktion isoliert wird, welche zu mehr als 80% an vorhandenen Blutplasmabestandteilen zytotoxische IgM Antikörper aufweist.
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Die Vorgehensweise bzw. das Verfahren, durch welches die erfindungsgemäße zytotoxische IgM Antikörperpräparation erhältlich ist, wählt im Vergleich zu Methoden des Standes der Technik zwar ähnliche Schritte, sie zielt jedoch bereits im Wesentlichen in ihrem ersten Schritt auf die Isolierung einer zytotoxischen Fraktion, um die Isolierung gerade der zytotoxischen IgM Antikörper zu optimieren. Neben weiteren Reinigungsschritten ermöglicht die in einem weiteren chromatographischen, insbesondere Größenausschlusschromatographischen Schritt vorgenommene weitere Aufspaltung dieser Fraktion, lediglich die zytotoxischen IgM Antikörper hoch aufzukonzentrieren und zu isolieren. Während also bei der konventionellen Aufreinigung von Blutplasma zwar prinzipiell eine zytotoxische Gesamtfraktion erhalten wird, in der auch zytotoxische IgMs enthalten sind, befinden sich diese in unreiner und nicht aufkonzentrierter Form und diese Fraktionen werden bei der üblichen Plasmafraktionierung verworfen. Die erfindungsgemäße Vorgehensweise ermöglicht die Erzielung sowohl einer größtmöglichen zytotoxischen Fraktion und hieraus dann die Anreicherung speziell der zytotoxischen IgM Antikörper. Ohne begleitendes Screening über einen Zellkulturassay, in dem die Zytotoxizität der nach der ersten chromatographischen Behandlung erhaltenen Fraktionen untersucht wird, ist eine ausreichende Aufreinigung und Anreicherung zytotoxischer IgM Antikörper nicht möglich.
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, als erste chromatographische Behandlung eine Ionenaustauschchromatographie mit Anionenaustauschermaterialien durchzuführen, insbesondere bevorzugt ist die Verwendung von Diethylaminoethylcellulose als Chromatographiematerial. Diethylaminoethylcellulose (DEAE-C) ist ein häufig verwendeter, schwach basischer Anionenaustauscher, der insbesondere auch zur chromatographischen Trennung und Reinigung von hochmolekularen Eiweißstoffen eingesetzt werden kann und auch bei der klassischen Plasmafraktionierung für den ersten Chromatographieschritt verwendet wird. Mithilfe des ersten chromatographischen Aufreinigungsschrittes ist eine grobe Auftrennung des Blutplasmas in Fraktionen erfolgt. 2 zeigt ein DEAE-Chromatogramm und die hieraus gewonnenen Fraktionen, welche mit den Zahlen 1 bis 22 bezeichnet sind.
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Derartige Chromatographiefraktionen werden dann mithilfe eines Zytotoxizitätstests untersucht. Hierzu wird die Wirkung der isolierten Fraktion auf eine oder mehrere Krebszelllinien untersucht. 3 zeigt beispielhaft die Durchführung eines entsprechenden Tests mit der Neuroblastom-Krebszelllinie Kelly. Kelly-Zellen sind öffentlich verfügbar, z. B. von der Firma Sigma-Aldrich®, Nr, 92110411.
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Hierzu wird bevorzugt ein Propidiumjodid(PI)-Assay mit den selektierten Plasmen durchgeführt und im Vergleich zur Kontrolle oder negativen Plasmen oder Negativantikörpern zur Beurteilung der mittleren Zytotoxizität verwendet. Fraktionen mit deutlich gegenüber Kontrolle erhöhten mittleren Zytotoxizitäten, bevorzugt mit mittlerer Zytotoxizität von mindestens 30 und besonders bevorzugt mindestens 40% im PI-Assay werden zur weiteren Aufreinigung verwendet.
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Erfindungsgemäß können sich an die erste chromatographische Auftrennung und nach Auswahl der weiter zu verwendenden Fraktionen weitere Reinigungsschritte anschließen, wie beispielsweise Ultrafiltrationen oder/und Ethanolfällungen. Im weiteren erfindungsgemäß durchgeführten Chromatographieschritt, insbesondere im weiteren Größenausschluss-Chromatographieschritt, werden dann die zytotoxischen IgM Antikörper nochmals von anderen Plasmabestandteile und insbesondere von nicht-zytotoxischen IgM Antikörpern getrennt. 4 zeigt eine Darstellung einer SEC-Chromatographie und den Peak des aktiven, zytotoxischen IgM Antikörperanteils. Die Isolierung der entsprechenden, zu diesem Peak zugeordneten Fraktionen führt zu einer hochaufgereinigten und hochkonzentrierten Präparation zytotoxischer IgM Antikörper. Bevorzugt wird nach der Chromatographie nur ein solcher Anteil der Fraktionen weiter verwendet, dass die gewünschten zytotoxischen IgM Antikörper zu mehr als 80, bevorzugt mehr als 85 und besonders bevorzugt mehr als 90%, bezogen auf weitere Plasmaproteinanteile, in diesen Fraktionen vorhanden sind.
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Die so erhaltene Präparation zytotoxischer IgM Antikörper ist ganz besonders gut zu pharmazeutischen Zwecken einsetzbar. Für die erfindungsgemäße Aufreinigungsmethode ist die Verwendung von Blutplasma oder Serum eines einzelnen Spenders ebenso möglich wie die Verwendung ganzer Plasmapools. Insbesondere bei einzelnen Spendern, deren Blut bekanntermaßen hohe Konzentrationen an zytotoxischen IgM Antikörpern aufweisen, macht die Aufreinigung hieraus Sinn. Allerdings haben lediglich 0,25 bis 5% der gesunden Blutplasmaspender spezifische zytotoxische IgM Antikörper gegen verschiedene Tumore (Schwartz-Albiez, 2007). Insofern ist das Screening einzelner Spender auf das Vorliegen spezifischer zytotoxischer IgM Antikörper äußerst aufwendig und ergibt keine hohe Positivrate. Daher ist es bevorzugt, auf die vorhandenen Blutplasmapools zurückzugreifen, der aufgrund der heterogenen Spenderzusammensetzung auch ein entsprechender Anteil von Spenderblut bzw. Spenderplasmen mit zytotoxischen IgM Antikörpern zu erwarten ist. Das erfindungsgemäße Aufreinigungsverfahren ermöglicht, gerade auch aus hohen Volumen von Blut, Plasma oder Serum diejenigen Fraktionen sicher zu isolieren, welche IgM Antikörper aufweisen und die Antikörper hieraus aufzukonzentrieren und zu reinigen.
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Die erfindungsgemäßen zytotoxischen IgM Antikörperpräparationen sind ganz besonders bevorzugt nach einem optimierten Verfahren erhältlich, bei dem aus einem Blutprodukt, insbesondere Plasma, nach Aufkonzentrieren und entsprechender Pufferung eine DEAE-Chromatographie bei einem pH-Wert von 7,8 bis 8,8, bevorzugt 8 bis 8,5 und besonders bevorzugt 8,2 bis 8,3 durchgeführt wird. Die erhaltenen, zytotoxische IgM Antikörper enthaltenden Fraktionen werden durch den vorgenannten Zytotoxizitätstest mit Krebszelllinien bestimmt, derartige Chromatographie-Fraktionen mit geeigneten Zytotoxizitätswerten, welche auf die Anwesenheit von zytotoxischen IgM Antikörpern schließen lassen, weiteren Reinigungsschritten unterworfen. Bevorzugt wird dabei zuerst eine Ultrafiltration gemäß Standardverfahren durchgeführt, bei der ein geeigneter Größenausschluss eingestellt wird, der eine Aufreinigung der IgM Antikörper ermöglicht, welche aufgrund ihrer pentameren oder hexameren Struktur und ihrem Molekulargewicht von etwa 900 kD ermöglichen.
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In bevorzugten Ausführungsformen schließt sich an die Ultrafiltration eine Ethanolfällung an. Diese Ethanolfällung wird in wässriger, 7 bis 11%iger ethanolischer Lösung und bevorzugt 9 bis 10%iger Ethanollösung mit pH von 4,5 bis 6,5 und bevorzugt 4,8 bis 5,8, besonders bevorzugt 5,1 bis 5,3 durchgeführt.
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Hier schließt sich in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine erneute Ultrafiltration des Überstandes der Ethanolfällung an, für welche die gleichen Bedingungen wie für die oben genannte erste Ultrafiltration im Hinblick auf ihren Größenausschluss gelten. Mit einer besonders bevorzugten zweiten Ethanolfällung wird mit höherer Ethanolkonzentration eine erneute Ethanolfällung, nunmehr in 20 bis 30%iger ethanolischer Lösung, bevorzugt 22 bis 27%iger und besonders bevorzugt 23 bis 25%iger Lösung, bei einem pH bevorzugt von 5,9 bis 8,5, besonders bevorzugt 7 bis 7,5 und ganz besonders bevorzugt 7,2 bis 7,3.
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Nach Zentrifugation und anschließendem Lösen der Sedimente in einer wässrigen Pufferlösung, vorzugsweise einer Natriumacetatlösung, bei einem pH von vorzugsweise 5 bis 6,5, besonders bevorzugt 5,5 bis 6,2 und ganz besonders bevorzugt 5,8 bis 5,9 werden die so erhaltenen Proben einer Größenausschlusschromatographie (SEC-Chromatographie) unterworfen. Hierbei werden diejenigen Fraktionen, die dem zytotoxische IgM enthaltenden Teil der Blutplasmafraktion zugeordnet werden können, isoliert und gegebenenfalls erneut durch geeignete Verfahren, wie z. B. Ultrafiltration, aufkonzentriert zum entsprechenden Endprodukt. Die Größenausschlusschromatographie kann mit geeigneten Puffern durchgeführt werden, welche sowohl von ihren Inhaltsstoffen als von ihrem pH-Wert eine letztendliche Verwendung der aufkonzentrierten gewählten IgM Fraktionen zur direkten Verabreichung an einen Patienten ermöglicht.
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Die erfindungsgemäßen Präparationen sind somit leicht mithilfe von Standardverfahren aus in großen Mengen zur Verfügung stehenden Quellen herstellbar. Aufgrund der in ihnen enthaltenen relativ hohen Konzentrationen von zytotoxischen IgM Antikörpern ist eine effektive Behandlung von Patienten, insbesondere von Tumorpatienten, mithilfe dieser Präparationen möglich. Die Tatsache, dass die erfindungsgemäßen zytotoxischen IgM Antikörperpräparationen hohe Reinheit aufweisen und nur in äußerst geringem Umfang andere Blut- bzw. Plasmabestandteile enthalten, machen diese Präparationen auch zu einem sehr sicheren Mittel zur Behandlung von Patienten.
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Abgesehen von der besonders bevorzugten Methode, die Präparationen zytotoxischer IgM Antikörper aus Spenderblut, -plasma oder -serum von einzelnen Personen oder von den Plasmapools von Blutspendediensten zu erhalten, besteht erfindungsgemäß auch die Möglichkeit, von Spendern mit bekanntermaßen vorhandenen hohen Konzentrationen von zytotoxischen IgM Antikörpern B-Zellen zu isolieren und diese B-Zellen zu kultivieren und aus ihnen gezielt zytotoxische IgM Antikörper zu isolieren.
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Gegenüber monoklonalen Antikörpern des IgM Typs haben die zytotoxischen IgM Antikörper der vorliegenden Erfindung den Vorteil, dass sie polyklonal sind, sie hiermit gegen eine höhere Zahl von Tumorerkrankungen eingesetzt werden können. Aufgrund der Polyklonalität sind sie auch multispezifisch.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Präparation zytotoxischer IgM Antikörper, wie es oben bereits im Rahmen der entsprechenden Präparationen beschrieben ist. Dort beschriebene bevorzugte Ausgestaltungen gelten selbstverständlich auch für das Verfahren an sich.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Präparationen zytotoxischer IgM Antikörper der hierin beschriebenen Art enthalten. Vorzugsweise werden diese zytotoxischen IgM Antikörper zusammen mit pharmazeutisch geeigneten Hilfs- und Zusatzstoffen formuliert. Wie vorstehend bereits beschrieben, sind derartige pharmazeutische Zusammensetzungen insbesondere geeignet zur Verwendung bei Behandlung von Tumorerkrankungen. Zytotoxische IgM Antikörper binden insbesondere an Zelloberflächenstrukturen, wie sie Tumorzellen, jedoch auch Bakterien aufweisen. Die Glykosylierung dieser Zellen verursacht vermutlich die Bindung der Antikörper hieran, wogegen an normale Zellen in der Regel keine oder nur geringe Bindung stattfindet. In Zusammenwirkung mit Komplement bewirken die zytotoxischen IgM Antikörper eine Zerstörung der Tumorzellen. Die erfindungsgemäß mit der pharmazeutischen Zusammensetzung verabreichten zytotoxischen IgM Antikörper wirken mit dem im Körper vorhandenen Komplement zusammen, die Wände der Tumorzellen werden hierbei perforiert, was letztendlich zu einer Lyse der Zellen führt. Die 5 und 6 zeigen einen Trypanblau-Assay mit der Kelly-Zelllinie zur Wirkung von IgM auf diese Zellen. Die dunklen Zellen (blaue Zellen) stellen tote Zellen dar. Aus diesem Test ist erkennbar, dass das Zusammenwirken von IgM und Komplement zu einer Tötung der Tumorzellen führt. Weder IgM alleine noch Komplement alleine führen zum Abtöten der Zellen in nennenswertem Umfang.
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6 zeigt eine Langzeitstudie zur IgM Zytotoxizität bei dem acht Plasmapräparationen eines individuellen Spenders über einen bestimmten Zeitraum gesammelt wurden und die Zytotoxizität hieraus in einem PI-Assay auf Kelly-Zellen bestimmt wurde. Es kann daraus erkannt werden, dass die Zytotoxizität in den Plasmen über einen Zeitraum von mehr als 30 Monaten etwa konstant blieb, dieser Spender also etwa gleiche Mengen an zytotoxischen IgM produziert.
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Zusammenfassend stellt die vorliegende Erfindung die Erschließung neuer Produkte für die Krebstherapie aus der Rohstoffquelle Blutplasma zur Verfügung. Das erfindungsgemäß besonders bevorzugte Verfahren der Isolierung besonders reiner und hochkonzentrierter zytotoxischer IgM Antikörperpräparationen aus Blutplasma ist kompatibel mit der klassischen Plasmafraktionierung, sodass bisher ungenutzte Anteile des Blutplasmas nun einer gewinnbringenden und heilenden Verwendung zugeführt werden können.
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Die Tatsache, dass natürliche IgM Antikörper gesunder Spender, also von Personen, die als Blutspender in Frage kommen, verwendet werden können, lässt die Befürchtung von Nebenwirkungen in den Hintergrund treten. Der polyklonale Ansatz, der durch Verwendung der Rohstoffquelle Blutplasma aus Blutspendepools ermöglicht wird, führt zu einer Minimierung des Resistenzrisikos, da eine Vielzahl immunologischer Targets erkannt werden. Selbstverständlich ist die vorliegende Erfindung auch mit der Anwendung monoklonaler Antikörper oder anderer konventioneller bzw. immunologischer Therapien bei Tumorpatienten kombinierbar. Der Aufbau einer Datenbank ermöglicht den Zugang zu Spendern mit hohen Spiegeln an zytotoxischen IgM Antikörpern.
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Die Erfindung stellt ein optimiertes Verfahren zum Erhalt aufgereinigter und hochkonzentrierter zytotoxischer IgM Antikörperpräprationen bereit. Die wesentlichen Schritte sind hierbei die Verwendung der zytotoxischen Fraktionen, welche aus der Vielzahl von Plasmaproben nach bevorzugt DEAE-Adsorption und Elution als geeignete Chromatographiefraktionen über einen selektiven Screeningassay identifiziert werden. In einem zweiten wesentlichen Schritt werden aus dieser zytotoxischen Fraktion die IgMs isoliert und von nicht-zytotoxischen IgMs getrennt. Das Verfahren ermöglicht eine hohe Reinheit der zytotoxischen IgM Antikörperpräparationen und einen geringstmöglichen Verlust von Zytotoxizität im Vergleich zu den Ausgangsmaterialien.
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Zur Charakterisierung der IgM Antikörper können diese durch Anti-IgM Antikörper nachgewiesen werden. Die Zytotoxizität wird generell durch Zellkulturassays überprüft. Die Erfindung ist als ökonomisch effizient anzusehen, weil neben der klassischen Plasmafraktionierung bisher ungenutzte Seitenfraktionen erschlossen werden können und von den großen Blutprodukteherstellern in ihre Prozesse implementiert werden können.
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Die folgenden Beispiele illustrieren die Verfahrensschritte in besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren:
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BEISPIELE
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Aufreinigungsprozess von humanen natürlichen zytotoxischen IgM Antikörpern 1. Schematische Darstellung der Aufreinigung
2. Kryopräzipitation und Ultrafiltration 2.1. Durchführung Kryopräzipitation:
| Gerät: | Minifuge/RT |
| Probe: | Plasma |
| Bedingungen: | 13000 Upm/10 min/RT |
| Entnahme: | Überstände vereinigen |
2.1. Durchführung Ultrafiltration:
| Gerät: | Amicon Zelle |
| Membran: | Pall Omega K30 | OM030076/30k |
| Zielpuffer: | 20 mM Tris/40 mM NaCl/pH 8.2 |
| Durchführung: | 20 mL ÜS aus KP | einengen auf | < 5 mL | +50 mL Puffer |
| | > 55 mL | einengen auf | < 5 mL | |
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| Entnahme: | < 5 mL tatsächliches Volumen |
| | Ultrafiltrationskammer ausspülen mit 5 mL Zielpuffer |
| | Volumen vereinigen auf 11 mL auffüllen |
| | |
| Filtration: | 11 mL filtrieren über 0,45 μm Nalgene Spritzenfilter |
| | Entspricht dem Ausgangsmaterial der DEAE |
3. DEAE Chromatographie 3.1. Durchführung:
| Gerät: | ÄKTA Explorer 100 |
| Säule: | DEAE CV28ml |
| Eluent A: | 20 mM Tris/40 mM NaCl/pH 82 |
| Eluent B: | 20 mM Tris/250 mM NaCl/pH 8.2 |
| Methode: | zum jetzigen Zeitpunkt manuelle Durchführung; |
| Fluß: | 3 mL/min |
| Auftrag: | 5 mL Probenschleife |
| Probe: | 10 mL Plasma nach Ultrafiltration/AM DEAE |
| Stufengradient: | je 10% Schritte Zugabe Eluent B; mit visueller Beurteilung der |
| | Elutionspeaks |
| Fraktionen: | 10 mL |
| Probennahme: | AM/DL/Fraktionen/IgM Fraktionspool (akt. Bereich) |
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3.2. Chromatogramm:
Siehe Fig. 2
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4. Ultrafiltration/Fällung 9% 4.1. Durchführung Ultrafiltration:
| Gerät: | Amicon Zelle |
| Membran: | Pall Omega K30 | OM030076/30k |
| Zielpuffer: | 50 mM Phosphat/100 mM NaCl/pH 5.3 |
| Durchführung: | 20 mL Fraktionspool aus DEAE Chromatographie |
| | einengen auf | < 5 mL | +50 mL Puffer |
| | < 55 mL | einengen auf | < 3 mL |
| | |
| Entnahme: | < 3 mL tatsächliches Volumen |
| | Ultrafiltrationskammer ausspülen mit 1 mL Zielpuffer |
| | Volumen vereinigen |
4.2. Durchführung Fällung 9% Ethanol:
| Fällung: | Im Verhältnis 1365 μL Probe plus 135 μL Ethanol (–20°C) |
| | Inkubation bei KS für > 2 Stunden |
| | Mehrfach vorsichtig mischen |
5. Zentrifugation/Ultrafiltration/Fällung 25% 5.1. Durchführung Zentrifugation
| Gerät: | Minifuge/RT |
| Probe: | Vial aus 9% Fällung |
| Bedingungen: | 13000 Upm/10 min/RT |
| Entnahme: | Überstand der Vials aus 9% Fällung vereinigen |
5.2. Durchführung Ultrafiltration:
| Gerät: | Amicon Zelle |
| Membran: | Pall Omega K30 | OM030076/30k |
| Zielpuffer: | 20 mM Tris/150 mM NaCl/pH 7.3 |
| Durchführung: | vereinigte Überstände aus 9% Fällung |
| | einengen auf Puffer | < 3 mL | +50 mL |
| | < 53 mL | einengen auf | < 8 mL |
| | |
| Entnahme: | < 8 mL tatsächliches Volumen |
| | Ultrafiltrationskammer ausspülen mit 1 mL Zielpuffer |
| | Volumen vereinigen |
5.3. Durchführung Fällung 25% Ethanol:
| Fällung: | Im Verhältnis 750 μL Probe plus 250 μL Ethanol (–20°C) |
| | Inkubation bei KS für > 3 Stunden |
| | Mehrfach vorsichtig mischen |
6. Zentrifugation und anschließendes Lösen der Sedimente 6.1. Durchführung Zentrifugation:
| Gerät: | Minifuge/RT |
| Probe: | Vial aus 25% Fällung |
| Bedingungen: | 13000 Upm/10 min/RT |
| Entnahme: | Überstände aus 25% Fällung verwerfen |
6.2. Durchführung lösen der Sedimente:
| Puffer: | 0.1 M Natriumacetat pH 5.9 |
| Sedimente: | Sedimente lösen in ca 500 μl/0.1 M Natriumacetat pH 5.9 |
| | Inkubation bei KS für > 3 Stunden |
7. Zentrifugation und Filtration 7.1. Durchführung Zentrifugation:
| Gerät: | Minifuge/RT |
| Probe: | Sedimente gelöst in 0.1 M Natriumacetat pH 5.9 |
| Bedingungen: | 13000 Upm/10 min/RT |
| Entnahme: | Überstande vereinigen |
7.1. Durchführung Filtration:
| Filtration: | filtrieren über 0,45 μm Nalgene Spritzenfilter |
| | Entspricht dem Ausgangsmaterial der SEC |
SEC Chromatographie 8.1. Durchführung:
| Gerät: | ÄKTA Explorer 100 |
| Säule: | SEC 1660 Superdex 200 |
| Eluent: | 20 mM Tris/150 mM NaCl pH 7.2 |
| Methode: | zum jetzigen Zeitpunkt manuelle Durchführung; |
| Fluß: | 1.5 mL/min |
| Auftrag: | 2 mL Probenschleife |
| Probe: | 2 mL gelöste IgM Sedimente |
| Fraktionen: | 4 mL |
| Probennahme: | AM/Fraktionen/IgM Fraktionspool (akt. Bereich) |
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8. Durchführung: siehe Fig. 3
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9. Ultrafiltration/Aufkontration zum Endprodukt 9.1. Durchführung:
| Gerät: | Amicon Zelle |
| Membran: | Pall Omega K30 | OM030076/30k |
| Zielpuffer: | 20 mM Tris/150 mM NaCl/pH 7.3 |
| Durchführung: | Fraktionspool aus SEC Chromatographie |
| | einengen auf | < 3 mL |
| Entnahme: | < 3 mL tatsächliches Volumen |
| | Ultrafiltrationskammer ausspülen mit 1 mL Zielpuffer |
| | Volumen vereinigen |
| | Endprodukt Aliquotieren |
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10. Analytik und Ergebnis
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- 10.1. zur Analytik verwendete Methoden
CBB Assay/PI Bio-Assay auf Kelly Zellen/Coomassie PAAGE/Western Blot
- 10.2. Coomassie PAAGE
Endprodukt
Siehe 7
- 10.3. Coomassie PAAGE
Verlaufsgel
Siehe 8
Ergebnis: Im DSP-Verlaufsgel sind in Spur 5 als auch in Spur 8 Banden auf IgM Höhe zu sehen.
- 10.4. Western Blot
IgM Verlauf
Siehe 9
Ergebnis: Im DSP-Verlaufsgel wird im WB sowohl in Spur 5 als auch in Spur 8 IgM nachgewiesen.
- 10.5. Western Blot IgM/IgG
Endprodukt
Siehe 10
Ergebnis: Im Endprodukt wird im WB IgM nachgewiesen
Im Endprodukt sind im WB keine Banden mit anti IgG AK nachzuweisen
- 10.6. Kelly PI Assay
Verlauf
Siehe 11
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11. Verwendete Puffer
| DEAE: | 20 mM Tris/40 mM NaCl/pH 8.2 |
| | 20 mM Tris/250 mM NaCl/pH 8.2 |
| Fällung 9%: | 50 mM Phosphat/100 mM NaCl pH 5.3 |
| Fällung 25%: | 20 mM Tris/150 mM NaCl/pH 7.2 |
| Lösen vor SEC: | 0.1 M Natriumacetat pH 5.9 |
| SEC: | 20 mM Tris/150 mM NaCl/pH 7.2 |
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V. Schlüsselpublikationen
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- Cohn E. J. et al. (1944) CHEMICAL, CLINICAL, AND IMMUNOLOGICAL STUDIES ON THE PRODUCTS OF HUMAN PLASMA FRACTIONATION. I. THE CHARACTERIZATION OF THE PROTEIN FRACTIONS OF HUMAN PLASMA. J Clin Invest. 4: 417–32.
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Bolande, R. P. (1960) Cytotoxic action of normal human serum on atypical mammalian cell lines Lab. Invest, 9: 475–489
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Erttmann at al. (1996) Naturally occurring humoral cytotoxicity against neuroblastoma (NB) cells in healthy persons and NB patients Pediatr. Hematol. Oncol. 13: 545–548
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David et al. (1996) Growth arrest of solid human neuroblastoma xenografts in nude rats by natural IgM from healthy humans Nature Medicine, 2: 686–689
- Laban S. (2008) Seren und Plasmen gesunder Blutspender lysieren komplemntabhängig Melanomzellen. Dissertation Medizinische Fakultät Mannheim der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg.
- Ollert, M. W. et al. (1996) Normal human serum contains a natural IgM antibody cytotoxic for human neuroblastoma cells. Prc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4498–4503.
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Ollert, M. W. et al. (1997) Mechanism of in vivo antineuroblastoma activity of human natural IgM. Europ. J. of Cancer, 35: 1942–1948
- Pool, J. G. (1965) Preparation and testing of antihemophilic globulin (Factor 8) sources for transfusion therapy in hemophilia. Description of a new sterile concentrate process for blood banks. Scand J Clin Lab Invest. 1965; 17: Suppl 84: 70–7.
- Schmitt et al. (1999) Natürliche humane IgM-Antikörper in der Therapie des Neuroblastoms: Vorläufige Ergebnisse einer Phase I/II-Therapiestudie. Klin. Pädiatr. 211: 314–318.
- Schultz et al. (1975) Detection in colorectal carcinoma patients of antibody cytotoxic to established cell strains derived from carcinoma of the human colon and rectum. Int J Cancer. 1975 Jul 15; 16(1): 16–23.
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Schwartz-Albiez, R. (2007) Natural anti-tumour cytotoxic antibodies: A novel strategy for tumour therapy Meeting Abstract, Naturally Occuring antibodies in Health and Disease, Bern, 19.–20. October, 2007, p. 23
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Schwartz-Albiez et al. (2008) Cytotoxic natural antibodies against human tumours: an option for anti-cancer immunotherapy? Autoimmun Rev, 7: 491–495
- Tatum AH. Large scale recovery of biologically active IgM (95% pure) from human plasma obtained by therapeutic plasmapheresis. J Immunol Methods. 1993 Jan 14; 158(1): 1–4.
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Die folgenden Erläuterungen beziehen sich auf die beigefügten Figuren:
3 zeigt einen Zytotox-Assay mit Neuroblastom-Krebszelllinie (Kelly). Ein Propidiumjodid (PI) Assay auf Kelly Zellen wurde mit ausselektierten Plasmen isolierten zytotoxischen IgM Antikörpern durchgeführt. Die Zytotoxizität ist in Prozent (Mittelwert von drei Werten) zur Gesamtanalyste der Zellen dargestellt. Der PI Assay wurde wie folgt durchgeführt:
- • Aussaat Zellen
- • Inkubation üN, 37°C, 5% CO2
- • Zugabe IgMs
- • Inkubation 1–2 h, 37°C, 5% CO2
- • Überstand abnehmen
- • Zugabe Komplementquelle
- • Inkubation 1 h, 37°C, 5% CO2
- • Zugabe PI und 1. Messung
- • Zugabe Triton-X und 2. Messung (100% Lyse)
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Es kann erkannt werden, dass aus Plasma isolierte zytotoxische IgMs ihre Aktivität behalten und Krebszellen (Kelly) töten.
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5 zeigt einen Trypanblau-Assay mit Neuroblastom-Krebszelllinien (Kelly). Zytotoxische IgM Antikörper IgM0810 lysieren in Anwesenheit einer Komplementquelle Neuroblastom-Krebszellen. Tote Zellen sind blau gefärbt, lebende Zellen nehmen den Farbstoff nicht auf. Die Methode wird wie folgt durchgeführt:
- • IgM (100 μg/ml), 30 min, 4°C
- • absaugen
- • Komplement, 2 h, 37°C
- • absaugen
- • Trypanblau, 5 min, RT
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6 zeigt den Test von acht Plasmen eines individuellen Spenders, gespendet im Zeitraum 07.07.2009 bis 10.01.2012, getestet auf Zytotoxizität im PI Assay auf Kelly Zellen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Bolande, 1960 [0002]
- Erttmann et al., 1996, Ollert et al., 1996 [0002]
- David et al., 1996, Ollert et al., 1997 [0002]
- Schmitt et al. (1999) [0002]
- Schwartz-Albiez, 2007, Schwartz-Albiez et al., 2008 [0002]
- Schwartz-Albiez, 2007 [0003]
- Pool, 1965 [0011]
- Cohn, 1940 [0011]
- Schwartz-Albiez, 2007 [0018]
