CN110062764A - 结肠类器官及其制备和使用方法 - Google Patents

结肠类器官及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了通过调节信号传导途径将前体细胞体外分化成定形内胚层的方法，所述定形内胚层可进一步分化成人类结肠类器官(HCO)。进一步公开了HCO和使用HCO的方法，其可以使用，例如，对于HCO可以用于确定潜在治疗剂对选自结肠炎、结肠癌、息肉综合征和/或肠易激综合征的疾病的功效和/或毒性。

Description

结肠类器官及其制备和使用方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2016年12月5日提交的美国临时申请序列号62/429,948的权益，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
背景技术
虽然由多能干细胞(PSC)产生胃和小肠类器官已经彻底改变了人类胃肠(GI)发育和疾病的研究，但是产生大肠类器官的努力已经落后，部分原因是由于缺乏对后肠管发育的稳健理解。
发明内容
本文公开了通过调节信号传导途径将前体细胞体外分化成定形内胚层的方法，所述定形内胚层可进一步分化成人类结肠类器官(HCO)。进一步公开了HCO和使用HCO的方法，其可以使用，例如，对于HCO可以用于确定潜在治疗剂对选自结肠炎、结肠癌、息肉综合征和/或肠易激综合征的疾病的功效和/或毒性。
附图说明
本申请文件含有至少一个彩色绘图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由主管局提供。
本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明目的。附图并不旨在以任何方式限制本教导的范围。
图1.Bmp信号传导调节小鼠和青蛙胚胎中的Satb2表达。(A)对e8.5小鼠胚胎进行的整体pSmad158(红色)和Foxa2(绿色)染色，其示出在发育中的后肠周围的核染色(n＝6)。(B)来自(A)中的加框区域的光学切片的插图，其示出在后肠中胚层和内胚层(D，背侧；V，腹侧)中进行的pSmad1/5/8染色。(C)在头褶阶段分离并在使用或不用DMH-1进行Bmp抑制的情况下培养2天的小鼠胚胎的示意图。(D，E)在培养48小时后，对DMSO(0)和DMH-1(E)处理的胚胎进行的整体pSmad1/5/8(红色)和Foxa2(绿色)染色。(F)在于DMSO或DMH-1中培养的胚胎中进行的pSmad1/5/8和pSmad2/3染色相对于Cdx2的量化(每种条件，n＝3个胚胎)。(G-J)在于DMSO(G，H)或DMH-1(I，J)中培养2天后，对小鼠胚胎进行的Cdx2(绿色)、Satb2(红色)和Foxa2(白色)的整体免疫染色(对于每种条件，n＝6)。H-J中的箭头指向卵黄柄的大致位置(BA1，第一臂肱弓)。(K)用DMSO或DMH-1处理的小鼠胚胎中Satb2表达的量化。(L)热带爪蟾胚胎中Bmp抑制的示意图。用DMSO(M)或DMH-1(R)处理的热带爪蟾胚胎中Satb2的原位杂交。(M)和(R)中的白色虚线描绘了使用后续分析的截面平面。mx和md＝第一臂肱弓的上颌突和下颌突。Cba＝尾侧臂肱弓。来自用DMSO(N-Q)或DMH-1(S-V)处理的热带爪蟾胚胎的Satb2(红色)、pSmad1/5/8(绿色)、DAPI(蓝色)和颜色合并图像的免疫荧光。比例尺在G-H中为＝100μm，在所有其它图中为50μm。对于双尾t检验，**p<0.01和***p 0.001。
图2.BMP2在人类肠管球状体中诱导SATB2和后HOX代码。(A)肠管球状体模式化方案的示意图。(B-D)通过对用NOGGIN(B)处理、无处理(C)和BMP2(D)处理12小时的球状体进行的pSMAD1/5/8(红色)染色测量的BMP信号传导水平。(E)对成年小鼠结肠进行的pSmad1/5/8染色，其示出在隐窝顶部处增加的BMP信号传导。(F-H)用NOGGIN(F)处理、无处理(G)和BMP2(H)处理72小时的球状体中的SATB2表达。(I)模式化后SATB2+CDH1+上皮的百分比的量化。(J)新生球状体和模式化3天后的球状体的主成分分析。(K)对在BMP对比NOG处理的球状体之间差异表达基因的基因本体分析。(L)模式化之前和之后的球状体的TPM(每百万中的转录物)值的图。分析的样品是在模式化之前的球状体(n＝2)，和在模式化后3天的NOGGIN、对照物和BMP2处理的球状体(每组n＝4)。为了在I中量化，检查来自至少3个实验的20个类器官。误差线表示SD。比例尺＝50微米。****p s 0.0001，通过双尾t检验确定。
图3.在延长的体外培养后，在人类肠类器官中维持区域模式化。(A-D)28天龄的类器官的借助近端标记物ONECUTI(绿色)进行整体免疫荧光和QPCR分析，其中所述28天龄的类器官由最初3天用NOGGIN、对照物或BMP2处理球状体产生。用CDX2(红色)和DAPI(蓝色)染色也用于检测上皮和间充质。(E-H)通过IF和通过QPCR检测的后标记物SATB2(红色)的表达。(I-L)通过IF和通过QPCR分析泛杯状细胞标记物MUC2(红色)。(M-P)通过IF分析结肠特异性杯状细胞标记物MUC5B(红色)。在(P)中量化MUC5B+细胞的数量。(Q-S)在分离的间充质培养物中的图案标记物相对于整个类器官的分析。在完整类器官中和在来源于NOGGIN、对照物或BMP2处理的类器官的间充质培养物中CDH1(Q)、近端HOX基因HOXD3(R)和远端HOX基因HOXA13(S)的QPCR分析。仅在含有上皮细胞的完整类器官中观察到CDH1。误差线表示SEM。对于IF，针对每种条件检查来自至少3个不同实验的最少10个类器官。对于QPCR，检查来自2个独立实验的最少5个生物学重复。比例尺＝100微米。**p 5 0.01和****p 5 0.0001，通过双尾t检验确定。
图4.响应于促分泌(proendocrine)转录因子NEUROGENIN 3的表达，HCO而非HIO产生结肠特异性肠内分泌细胞。(A-B)用于产生IPSC72.3诱导型NEUROG3系的多西环素(doxycycline)诱导型NEUROG3慢病毒构建体和多西环素诱导方案的示意图。用NOGGIN(C，F)、未处理(D，G)或BMP(E，H)模式化的35天龄类器官的用嗜铬粒蛋白A(绿色)、CDX2(红色)和INSL5(白色)进行整体染色。(C-E)未处理的类器官(-Dox)和(F-H)具有表达的NEUROG3的类器官(+Dox)。E和H中的插图显示了INSL5染色的放大视图。(I，J)如通过CHGA(I)测量的和对于INSL5(J)表达，在HIO和HCO中肠内分泌细胞的NEUROG3诱导的QPCR分析。数据代表用NOGGIN(n＝3)、对照物(n＝3)或BMP(n＝6)处理的类器官的2个不同实验。误差线表示SEM。比例尺＝50微米。*p<0.05，通过双尾t检验确定。
图5.HIO和HCO在体内移植后保持区域特性。(A-E)来自人类空肠和结肠的活组织检查以及移植到小鼠肾囊下并在体内生长8-10周的NOGGIN衍生得到的HIO、对照HIO和BMP2衍生得到的HCO的H&E染色。用近端肠标记物GATA4(F-J)、远端肠标记物SATB2(K-0)、潘氏(Paneth)细胞标记物DEFAS(P-T)和结肠特异性杯状细胞标记物MUC5B(U-Y)染色相同条件的样品。注意，尽管GATA4和SATB2双染色是在不同的通道中进行的，但在图(F-0)的相同载玻片上进行，它们显示为单独的伪彩色(红色)图像。对于人类活组织检查，n＝2。对于移植的NOGGIN处理的类器官，n＝12，对于对照类器官，n＝7，并且对于BMP2处理的类器官，n＝16。比例尺＝50pm。
图6.体内生长的类器官表达区域特异性激素。在小鼠肾囊下生长8-10周的HIO和HCO中的区域表达激素(A-D)胃饥饿素(GHRL)、胃动素(MLN)、(E-H)GIP、(I-L)GLP-1、(M-P)PYY和(Q-T)INSL5的表达的分析。近端富集的激素GHRL、GIP和MLN富集在NOGGIN和对照HIO(A-H)中。远端富集的激素GLP-1和PYY富集在BMP2衍生得到的HCO(1-0)中。结肠特异性激素INSL5仅存在于HCO(Q-T)中。数据代表每种条件最少5个移植的类器官。(A)和(B)中的插图显示GHRL和MLN双阳性细胞。(D，H，L，P，T)GHRL、MLN、GIP、GLP1、PYY和INSL5的FPKM值来自RNA-seq数据。FPKM值表示每种条件3个生物学重复。比例尺＝30微米。
图7.HIO和HCO的全面转录分析以及与人类小肠和结肠的比较。(A)主成分分析，人类成人和胎儿小肠和结肠与移植的HIO和HCO相比较。(B)将人类成人小肠与HIO并将人类成人结肠与HCO进行比较的超几何平均值测试。(C)比较在人类小肠和结肠中与HIO和HCO相比进行差异表达的转录物的4向散点图。
图8.Gata4和Satb2在小肠和大肠发育期间标记离散的区域边界。(A)在e9.5小鼠胚胎中Gata4(绿色)和Satb2(红色)的整体染色，其示出在卵黄柄(n＝9)处的表达边界。(B)描绘Gata4和Satb2表达域e11.5肠的模型，其示出低Gata4和低Satb2表达的过渡区。在e11.5小鼠胚胎中Gata4和Satb2的整体染色，其示出在卵黄柄处的Gata4的后边界和Satb2的前边界(n＝3)。(F-H)在e12.5小鼠胚胎中Satb2和Foxa2的整体染色，其示出维持了Satb2表达的前边界(n＝3)。(I)在从e16.5小鼠胚胎分离的近端肠中Gata4和Satb2的整体染色(n＝6)。(J)在从e16.5小鼠胚胎分离的远端小肠和大肠中Gata4和Satb2的整体染色(n＝6)。在(K)人类空肠(n＝2)和(L)结肠(n＝2)的切片中GATA4和SATB2的染色。比例尺＝50μm(B-D)和100 1Am(E-M)。(C)和(F)中的虚线表示脐的大致位置。缩写：ys，卵黄柄；cb，盲肠芽；tz，过渡带；mx，第一臂肱弓的上颌部分；和md，第一臂肱弓的下颌部分；ti，末端回肠；icj，回盲部。
图9.SATB2在GATA4阴性人类小肠和大肠中表达。在人类成人十二指肠、小肠、阑尾、结肠和直肠中的SATB2染色显示SATB2表达存在于远端小肠和整个大肠中。从来自人类成人和胎儿肠样品的公开的RNA-seq数据分析GATA4和SATB2。绘制的样品包括人类成人十二指肠(HuSI_Duo_A)、十二指肠远端的人类成人小肠(HuSI_Dist_A)、人类成人结肠(HuColon_A)和人类胎儿小肠(HuSI_F)。(C)由Wang等人2015年针对来自在空气液体界面(ALI)中生长的十二指肠(Duo)、空肠(Jej)、回肠(lle)、升结肠(AC)、横结肠(TC)和降结肠的胎儿肠干细胞生成的微阵列数据分析GATA4和SATB2表达。使用Excel中的CORREL函数确定r2值。
图10.BMP介导后HOX基因的SHH激活。(A)后HOX基因的SHH介导的激活的先前模型。(B)后HOX基因的SHH介导的激活和内胚层HOX基因的BMP介导的激活的新模型。(C)在用NOGGIN、对照物、Smoothened激动剂(SAG)或BMP2处理后的HOX因子的QPCR分析。(D)由SAG诱导的HOX13基因的BMP4依赖性激活的模型。(E)在对照物、5μM SAG、5μM SAG+NOG和BMP2处理的类器官中3天后HOXA13的QPCR分析。(F)由外源重组人类BMP2诱导的HOX13基因的SHH独立激活的模型。(G)在对照物、BMP和BMP+环巴胺(Cyclopamine)处理的类器官中3天后HOXA13的QPCR分析(每种条件n＝6)。
图11.延长的体外培养允许杯状细胞成熟。(A)在模式化并随后重新模式化的类器官中CDX2+SATB2+细胞的百分比的量化。在28天龄类器官中的HOXB13(B)和HOXD13(C)的QPCR分析。来自44天龄NOGGIN、对照物和BMP处理的类器官的用CDH1(绿色)、CDX2(红色)和MUC2(白色)进行的(D-F)整体和(G-l)横截面染色。(J-L)来自44天龄BMP2处理的类器官的切片的染色。白色箭头指向处于分泌粘蛋白2的过程中的杯状细胞。对于QPCR，检查来自2个独立实验的最少5个生物学重复。对于IF，检查每种条件最少10个类器官。比例尺＝50pm。
图12.类器官的BMP模式化在体外和体内是稳定的。(A)NOGGIN、对照物和BMP模式化的类器官的类器官植入的效率。在移植的模式化类器官中GATA4+CDX2+细胞(B)和SATB2+CDX2+细胞(C)的百分比的量化。对在移植的类器官中的GATA4(D)SATB2(E)DEFAS(F)和MUCSB(G)的FPKM值来自RNA-seq数据。(H-I)人类空肠和结肠活组织检查(每个区域n＝2)和(J-L)移植的类器官(每个条件n＝5)的MUC2(红色)染色。比例尺＝50微米。
图13.体外和体内生长的类器官含有肠祖细胞。来自用NOGGIN、对照物或BMP处理的H9-LGR5-GFP衍生得到的类器官的CDH1和GFP的代表性整体(A，F，K)和切片部分(B，G，L)图像。在来自(C-E)NOGGIN、(H-J)对照物或(M-O)BMP2处理的类器官的切片上的CDX2(红色)和SOX9(绿色)染色。CDX2和LGR5-GFP(P，S，V)、CDX2和SOX9(Q，T，W)以及来源于NOGGIN、对照物或BMP处理的H9-LGR5-GFP类器官的类器官体内染色的CDH1和KI67(R，U，X)的代表性图像。(Y-A')显微照片显示分别来源于NOGGIN、对照物或BMP移植物的类肠(enteroid)。(B'-D')在对照类肠(来自2个移植物的>100个合并的类肠)和BMP2处理的类结肠(来自1个移植物的>50个类结肠)的近端和远端基因的QPCR分析。比例尺＝50μm。
图14.核糖体和免疫细胞特征在移植的类器官和原代人类组织之间差异表达。(A)模式化移植的类器官和人类成人和胎儿小肠和结肠的主成分分析。(B)在移植物与人类原代组织中上调的基因的基因本体分析。(C)在人类原代组织与移植物中上调的基因的基因本体分析。
图15.(A)在Matrigel中生长15天后HCO的整体免疫荧光染色。针对内皮标记物CD31(绿色)和后肠上皮标记物CDX2(红色)对HCO培养物进行染色。还针对造血细胞标记物PU.1(红色右图)对培养物进行染色。(B)造血祖细胞分析的示意图。从HCO收集细胞，离心并使用Giemsa Wright染色或接种在Methocult培养基中以分析造血细胞分化。(C)GiemsaWright染色的细胞的代表性图像，其形态与分化为巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞一致。(D)在Methocult中14天后形成的菌落的代表性图像。红细胞、巨噬细胞和粒细胞菌落存在于来源于HCO的细胞中，但不存在于来源于NOGGIN处理的HIO的细胞中。
图16.(A)人类结肠活组织检查或在Matrigel中生长28天的HCO的免疫荧光染色。对CD68进行染色，其是巨噬细胞的标记物。(B)在HIO和HCO中的CD14和CD16的CYTOF分析图。小百分比的CD14+/CD16+细胞存在于HCO(蓝色方块)中，但不存在于HIO中。另外，CD16单阳性细胞存在于HCO中，表明单核细胞存在于培养物中。(C)从14和28天龄HIO和HCO收集的上清液的Luminex阵列分析。在28天龄HCO(BMP)中检测到IL6和IL8，但在HIO中未检测到。(D)从14和28天龄HIO和HCO收集的上清液的Luminex阵列分析。在14和28天龄HCO(BMP)中检测到巨噬细胞特异性细胞因子MIP1A和MIP1B，但在14或28天龄HIO中未检测到。
具体实施方式
定义。
除非另有说明，否则术语应根据相关领域普通技术人员的常规用法来理解。
术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，例如，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1或大于1的标准偏差内。替代地，“约”可表示给定值的最多20％、或最多10％、或最多5％、或最多1％的范围。替代地，特别是对于生物系统或过程，该术语可以表示数值的数量级，优选地在5倍内，更优选地在2倍内。在申请和权利要求中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意味着在特定值的可接受误差范围内。
如本文所用，术语“全能(totipotent)干细胞”(也称为全能(omnipotent)干细胞)是可以分化成胚胎和胚胎外细胞类型的干细胞。这类细胞可以构建完整的、有活力的生物体。这些细胞是由卵子和精子细胞融合而成。由受精卵的前几次分裂产生的细胞也是全能的。
如本文所用，术语“多能干细胞(PSC)”，通常也称为PS细胞，涵盖可以分化成几乎所有细胞的任何细胞，即源自三个胚层(生发上皮)中的任何一个的细胞，所述三个胚层包括内胚层(内部胃壁、胃肠道、肺部)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)和外胚层(表皮组织和神经系统)。PSC可以是全能细胞的后代，源自胚胎干细胞(包括胚胎生殖细胞)或通过诱导非多能细胞(如成体体细胞)通过强制某些基因的表达而获得。
如本文所用，术语“诱导的多能干细胞(iPSC)”，也通常缩写为iPS细胞，是指通过诱导某些基因的“强制”表达由正常非多能细胞(如成体体细胞)人工衍生得到的一类多能干细胞。
如本文所用，术语“胚胎干细胞(ESC)”，也通常缩写为ES细胞，是指多能并且源自胚泡的内细胞团(即早期胚胎)的细胞。出于本发明的目的，术语“ESC”有时也广泛用于涵盖胚胎生殖细胞。
如本文所用，术语“前体细胞”涵盖可用于本文所述方法中的任何细胞，通过该细胞，一种或多种前体细胞获得自我更新或分化成一种或多种特化细胞类型的能力。在一些方面，前体细胞是多能的或具有变成多能的能力。在一些方面，前体细胞经受外部因子(例如，生长因子)的处理以获得多能性。在一些方面，前体细胞可以是全能(或全能)干细胞；多能干细胞(诱导或非诱导)；多能干细胞；寡能干细胞和单能干细胞。在一些方面，前体细胞可以来自胚胎、婴儿、儿童或成人。在一些方面，前体细胞可以是经受处理的体细胞，使得通过遗传操作或蛋白质/肽处理赋予多能性。
在发育生物学中，细胞分化是较不特化的细胞变成较特化的细胞类型的过程。如本文所用，术语“定向分化”描述了一种过程，通过该过程，较不特化的细胞变成特定的特化靶细胞类型。特化靶细胞类型的特殊性可以通过可用于定义或改变初始细胞命运的任何适用方法来确定。示例性方法包括但不限于遗传操作、化学处理、蛋白质处理和核酸处理。
如本文所用，术语“细胞成分”是单个基因、蛋白质、mRNA表达基因，和/或任何其它可变的细胞组分或蛋白质活性，例如蛋白质修饰程度(例如，磷酸化)，其通常本领域技术人员在生物学实验中测量(例如，通过微阵列或免疫组织化学)。涉及有关生命系统、常见人类疾病以及基因发现和结构确定的复杂生化过程网络的重大发现现在可归因于细胞成分丰度数据作为研究过程的一部分的应用。细胞成分丰度数据可以帮助识别生物标记物、区分疾病亚型并鉴定毒性机制。
如本文所述，使用一定时间序列的生长因子操作来建立方法和系统，以模拟培养物中的胚胎肠发育。具体地说，建立了方法和系统以定向人类胚胎干细胞(hESC)和诱导多能干细胞(iPSC)的PSC体外分化成肠组织
由多能干细胞(PSC)产生胃和小肠类器官已经彻底改变了研究人类胃肠道(GI)发育和疾病。然而，产生大肠类器官的努力已经落后，部分原因在于对后肠管发育的稳健分子理解。在这里，申请人已经发现脐带后面的肠上皮在整个发育过程中和出生后表达Satb2。申请人进一步发现BMP信号传导在蛙和小鼠胚胎中建立Satb2+结构域，并且BMP信号传导的短暂激活足以激活后HOX代码并将人类PSC衍生得到的肠管培养物导入结肠类器官(HCO)中。体外生长的HCO具有标记谱和与结肠特性一致的独特细胞类型。在移植到小鼠中后，HCO经历形态发生和成熟，形成具有人类结肠的分子、细胞和形态学特性的组织。所公开的结肠类器官可用于结肠炎和结肠癌的未来研究中。
在一个方面，公开了诱导人类结肠类器官形成的方法。方法可以包含以下步骤：(a)使定形内胚层(DE)与FGF信号传导途径激活物和WNT信号传导途径激活物(例如，CHIRON/GSK2抑制剂)接触持续足以使所述DE形成中-后肠球状体的时间段，和(b)使步骤(a)的中-后肠球状体与BMP激活物和EGF信号传导途径激活物接触持续足以形成所述人类结肠类器官的时间段，其中所述人类结肠类器官表达SATB2。
在一个方面，DE可以源自选自以下的前体细胞：胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、诱导多能干细胞、中胚层细胞、定形内胚层细胞、后内胚层细胞、后肠细胞或其组合。
在一个方面，FGF信号传导途径激活物可选自小分子或蛋白质FGF信号传导途径激活物、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23或其组合。WNT信号传导途径激活物可选自小分子或蛋白质Wnt信号传导途径激活物，优选氯化锂；2-氨基-4,6-二取代嘧啶(杂)芳基嘧啶；IQ1；QS11；NSC668036；DCAβ-连环蛋白；2-氨基-4-[3,4-(亚甲二氧基)-苄基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、GSK3抑制剂，优选CHIRON，或其组合。在一个方面，BMP激活物可以选自BMP2、BMP4、BMP7、BMP9、激活BMP途径的小分子、激活BMP途径的蛋白质，并且可以包括以下：Noggin、Dorsomorphin、LDN189、DMH-1、ventromophin及其组合。
在一个方面，对于所述DE足以形成中-后肠球状体的时间段可以通过步骤(a)的所述中-后肠球状体表达CDX2来确定。使用常规方法，这类测量在本领域普通技术人员的能力范围内。
在一个方面，对于中-后肠球状体足以形成人类结肠类器官的时间段通过所述人类结肠类器官的细胞的SATB2和CDX2表达来确定，其中当表达SATB2和CDX2时，中-后肠球状体已形成人类结肠类器官。可以使用这类测量来代替时间测量，因为上面列出的基因的表达表明步骤(a)和(b)已经进行了足够的持续时间。
在一个方面，公开了根据本文描述的方法获得的HCO。本发明的HCO可以以各种不同的方式表征。在一个方面，HCO的特征可在于存在结肠肠内分泌细胞(EEC)。在一个方面，HCO的特征可在于存在隐窝并且基本上不含绒毛。在一个方面，HCO的特征可在于存在结肠特异性杯状细胞。在一个方面，HCO的特征可在于基本上不含潘氏细胞。在一个方面，HCO的特征可在于分泌结肠特异性激素INSL5的能力。肠类器官可以不含免疫功能、神经分布、血管、绒毛和潘氏细胞中的一种或多种。
在一个方面，公开了形成结肠组织的方法，其中所述发明的HCO可以植入哺乳动物，优选啮齿动物，优选免疫受损的啮齿动物，优选免疫受损的小鼠的肾囊下。
在一个方面，本文公开的HCO可用于确定潜在治疗剂对选自结肠炎、结肠癌、息肉综合征和/或肠易激综合征的疾病的功效和/或毒性。方法可包含使潜在治疗剂与如本文所述的HCO接触持续足以确定所述潜在治疗剂的功效和/或毒性的时间段的步骤。
在一个方面，考虑了源自自任何前述权利要求的HCO的肠类结肠。
在一些方面，可以使用多能或可以诱导成为多能的干细胞。在一些方面，多能干细胞源自胚胎干细胞，胚胎干细胞又源自早期哺乳动物胚胎的全能细胞并且能够在体外无限制、未分化的增殖。胚胎干细胞是源自胚泡的内细胞团(即早期胚胎)的多能干细胞。从胚细胞衍生得到胚胎干细胞的方法是本领域熟知的。例如，三种细胞系(H1、H13和H14)具有正常的XY核型，并且两种细胞系(H7和H9)具有正常的XX核型。人类胚胎干细胞H9(H9-hESC)用于本申请中描述的示例性方面，但是本领域技术人员将理解，本文描述的方法和系统适用于任何干细胞。
可以在根据本发明的方面中使用的另外的干细胞包括但不限于由以下提供或在以下中描述的那些：由位于旧金山加利福尼亚大学(UCSF)的人类胚胎干细胞研究中心，国家干细胞库(NSCB)主办的数据库；位于Wi细胞研究所的WISC细胞库；威斯康星大学干细胞与再生医学中心(UW-SCRMC)；Novocell公司(Novocell,Inc.)(加利福尼亚州圣地亚哥(SanDiego,California))；Cellartis AB(瑞典哥德堡(Sweden))；ES CellInternational Pte Ltd(新加坡(Singapore))；位于以色列技术学院的以色列理工学院(以色列海法(Haifa,Israel))；和由普林斯顿大学和宾夕法尼亚大学主办的干细胞数据库。可以在根据本发明的方面中使用的示例性胚胎干细胞包括但不限于SA01(SA001)；SA02(SA002)；ES01(HES-1)；ES02(HES-2)；ES03(HES-3)；ES04(HES-4)；ES05(HES-5)；ES06(HES-6)；BG01(BGN-01)；BG02(BGN-02)；BG03(BGN-03)；TE03(I3)；TE04(I4)；TE06(I6)；UC01(HSF1)；UC06(HSF6)；WA01(H1)；WA07(H7)；WA09(H9)；WA13(H13)；WA14(H14)。
在一些方面，进一步修饰干细胞以并入额外的特性。示例性的修饰细胞系包括但不限于H1OCT4-EGFP；H9Cre-LoxP；H9hNanog-pGZ；H9hOct4-pGZ；H9inGFPhES；和H9Syn-GFP。
关于胚胎干细胞的更多细节可以在以下中找到：例如Thomson等人,1998,“源自人类胚泡的胚胎干细胞系(Embryonic Stem Cell Lines Derived from HumanBlastocysts),”《科学(Science)》282(5391):1145-1147；Andrews等人,2005,“胚胎干(ES)细胞和胚胎癌(EC)细胞：同一枚硬币的两面(Embryonic stem(ES)cells and embryonalcarcinoma(EC)cells:opposite sides of the same coin,”《生化学会学报(Biochem SocTrans)》33:1526–1530；Martin1980,“《畸胎癌和哺乳动物胚胎发生(Teratocarcinomasand mammalian embryogenesis),”.《科学》209(4458):768-776；Evans和Kaufman,1981,“在小鼠胚胎中培养多能细胞(Establishment in culture of pluripotent cells frommouse embryos),”《自然(Nature)》292(5819):154–156；Klimanskaya等人,2005,“在无饲养细胞的情况下衍生得到的人类胚胎干细胞(Human embryonic stem cells derivedwithout feeder cells),”《柳叶刀(Lancet)》365(9471):1636–1641；其中每个的全部内容在此通过引用并入本文。
替代地，多能干细胞可以源自胚胎生殖细胞(EGC)，胚胎生殖细胞是产生有性繁殖的生物体的配子的细胞。EGC源自存在于晚期胚胎的性腺脊中的原始生殖细胞，具有胚胎干细胞的许多特性。胚胎中的原始生殖细胞发育成在成人体内产生生殖配子(精子或卵子)的干细胞。在小鼠和人类中，有可能在适当的条件下在组织培养物中培养胚胎生殖细胞。EGC和ESC都是多能的。出于本发明的目的，术语“ESC”有时广泛用于涵盖EGC。
诱导多能干细胞(iPSC)
在一些方面，通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞(例如成体成纤维细胞)中来衍生得到iPSC。转染可以通过病毒载体实现，如逆转录病毒。转染的基因包括主转录调节因子Oct-3/4(Pouf51)和Sox2，但有人提出其它基因可以提高诱导效率。3-4周后，少量转染细胞开始在形态学和生物化学上与多能干细胞变得类似，并且通常通过形态学选择、倍增时间或通过报告基因和抗生素选择来分离。如本文所用，iPSC包括但不限于第一代iPSC、小鼠中的第二代iPSC和人类诱导的多能干细胞。
在一些方面，可以采用基于非病毒的技术来产生iPSC。在一些方面，腺病毒可用于将必需的四种基因转运到小鼠的皮肤和肝细胞的DNA中，产生与胚胎干细胞相同的细胞。由于腺病毒不将其任何自身基因与靶向宿主组合，因此消除了产生肿瘤的危险。在一些方面，重编程可以通过质粒完成，而根本不需任何病毒转染系统，但效率非常低。在其它方面，蛋白质的直接递送用于产生iPSC，因此消除了对病毒或遗传修饰的需要。在一些实施例中，使用类似的方法产生小鼠iPSC是可能的：用通过聚精氨酸锚定引入细胞的某些蛋白质重复处理细胞足以诱导多能性。在一些方面，还可以通过在低氧条件下用FGF2处理体细胞来增加多能性诱导基因的表达。
关于胚胎干细胞的更多细节可以在以下中找到：例如，Kaji等人,2009,“病毒自由诱导多能性并随后切除重编程因子(Virus free induction of pluripotency andsubsequent excision of reprogramming factors),”《自然》458:771-775；Woltjen等人,2009,“piggyBac转座将成纤维细胞重新编程为诱导多能干细胞(piggyBac transpositionreprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells),”《自然》458:766-770；Okita等人,2008,“在没有病毒载体的情况下产生小鼠诱导多能干细胞(Generation ofMouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors),”《科学》322(5903):949-953；Stadtfeld等人,2008,“在无病毒整合的情况下产生诱导多能干细胞(InducedPluripotent Stem Cells Generated without Viral Integration),”Science322(5903):945-949；和Zhou等人.,2009,“使用重组蛋白产生诱导多能干细胞(Generation ofInduced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins),”《细胞干细胞(CellStem Cell)》4(5):381-384；其中每个的全部内容在此通过引用并入本文。
在一些方面，示例性iPS细胞系包括但不限于iPS-DF19-9；iPS DF19-9；iPS DF4-3；iPS DF6-9；的iPS(包皮)；iPS(IMR90)；和iPS(IMR90)。
定形内胚层
本公开的HCO可以源自称为定形内胚层(DE)的简单细胞片。如D'Armour等人2005和Spence等人所教导的，用于从前体细胞获得定形内胚层的方法是本领域熟知的。前DE形成前肠及其相关器官，包括肝脏和胰腺，并且后DE形成中肠和后肠，其形成小肠和大肠以及泌尿生殖系统的部分。使用小鼠、小鸡和青蛙胚胎的研究表明，在原肠胚阶段建立DE中的前-后模式是后续前肠和后肠发育的先决条件。Wnt和FGF信号传导途径被认为是该过程的关键，并且起到促进后内胚层和后肠命运并抑制前内胚层和前肠命运的作用。后肠的简单立方形上皮首先发育成假复层柱状上皮，然后发育成绒毛，其含有极化柱状上皮和绒毛基部的增殖区，其对应于假定的祖细胞结构域。
申请人在本文中描述了定向DE体外分化成肠组织，具体地人类结肠组织的稳健且有效的方法。可以通过选择性激活iPSC和/或DE细胞中的某些信号传导途径来实现定向分化。
有关肠发育的途径的另外细节通常可在以下中找到：例如，Sancho等人,2004,“肠道发育和癌症中的信号传导途径(Signaling Pathways in Intestinal Development andCancer),”《细胞和发育生物学年鉴(Annual Review of Cell and DevelopmentalBiology)》20:695-723；Logan和Nusse,2004,“发育和疾病中的Wnt信号途径(The WntSignaling Pathway in Development and Disease),”《细胞和发育生物学年鉴》20:781-810；Taipale1和Beachy1,2001,“癌症中的Hedgehog和Wnt信号途径(The Hedgehog andWnt signalling pathways in cancer),”《自然》411:349-354；Gregorieff和Clevers,2005,“肠上皮中的Wnt信号传导：从内胚层到癌症(Wnt signaling in the intestinalepithelium:from endoderm to cancer),”《基因与生长(Genes&Dev.)》19:877-890；其中每个的全部内容在此通过引用并入本文。关于与DE发育有关的信号传导途径的功能的更多细节可以在以下中找到：例如，Zorn和Wells,2009,“脊椎动物内胚层发育和器官的形成(Vertebrate endoderm development and organ formation),”《细胞发育生物学年鉴(Annu Rev Cell Dev Biol)》25:221-251；Dessimoz等人,2006,“FGF信号传导对于在体内沿前后轴建立肠管结构域是必要的(FGF signaling is necessary for establishinggut tube domains along the anterior-posterior axis in vivo),”《发育机理(MechDev)》123:42–55；McLin等人,2007,“在前内胚层中抑制Wnt/{β}–连环蛋白信号传导对于肝脏和胰腺的发育至关重要(Repression of Wnt/{beta}-catenin signaling in theanterior endoderm is essential for liver and pancreas development).《发育(Development)》,”134:2207–2217；Wells和Melton,2000,《发育》127:1563-1572；de SantaBarbara等人,2003,“肠上皮的发育和分化(Development and differentiation of theintestinal epithelium),”《细胞和分子生命科学(Cell Mol Life Sci)》60(7):1322-1332；其中每个的全部内容在此通过引用并入本文。
用于从多能细胞(例如，iPSC或ESC)产生定形内胚层的任何方法都适用于本文所述的方法。在一些方面，多能细胞源自桑椹胚。在一些方面，多能干细胞是干细胞。在这些方法中使用的干细胞可包括但不限于胚胎干细胞。胚胎干细胞可以源自胚胎内细胞团或源自胚胎性腺脊。胚胎干细胞或生殖细胞可以源自多种动物物种，包括但不限于包括人类在内的各种哺乳动物物种。在一些方面，人类胚胎干细胞用于产生定形内胚层。在一些方面，人类胚胎生殖细胞用于产生定形内胚层。在一些方面，iPSC用于产生定形内胚层。
在一些方面，一种或多种生长因子用于从多能干细胞到DE细胞的分化过程中。用于分化过程中的一种或多种生长因子可包括来自TGF-β超家族的生长因子。在这类方面，一种或多种生长因子可包含TGF-β超家族生长因子的Nodal/激活素和/或BMP亚组。在一些方面，一种或多种生长因子选自以下组成的组：Nodal、激活素A、激活素B、BMP4、Wnt3a或任何这些生长因子的组合。在一些方面，胚胎干细胞或生殖细胞和iPSC用一种或多种生长因子处理6小时或更长时间；12小时或更长时间；18小时或更长时间；24小时或更长时间；36小时或更长时间；48小时或更长时间；60小时或更长时间；72小时或更长时间；84小时或更长时间；96小时或更长时间；120小时或更长时间；150小时或更长时间；180小时或更长时间；或240或更长时间。在一些方面，胚胎干细胞或生殖细胞和iPSC用一种或多种生长因子以如下浓度处理：10ng/ml或更高；20ng/ml或更高；50ng/ml或更高；75ng/ml或更高；100ng/ml或更高；120ng/ml或更高；150ng/ml或更高；200ng/ml或更高；500ng/ml或更高；1,000ng/ml或更高；1,200ng/ml或更高；1,500ng/ml或更高；2,000ng/ml或更高；5,000ng/ml或更高；7,000ng/ml或更高；10,000ng/ml或更高；或15,000ng/ml或更高。在一些方面，在整个处理过程中，生长因子的浓度维持在恒定水平。在其它方面，在处理过程期间改变生长因子的浓度。在一些方面，生长因子悬浮在包括具有不同HyClone浓度的胎牛血清(FBS)的培养基中。本领域技术人员将理解，本文描述的方案以单独或组合形式适用于任何已知的生长因子。当使用两种或更多种生长因子时，每种生长因子的浓度可以独立地变化。
在一些方面，使用富含定形内胚层细胞的细胞群。在一些方面，定形内胚层细胞是分离的或基本上纯化的。在一些方面，分离的或基本上纯化的定形内胚层细胞表达SOX17、FOXA2和/或CXRC4标记物的程度大于表达OCT4、AFP、TM、SPARC和/或SOX7标记物。还考虑了用定形内胚层富集细胞群的方法。在一些方面，可以通过使细胞与结合存在于定形内胚层细胞表面上但不存在于混合细胞群中的其它细胞表面上的分子的试剂接触，然后分离与试剂结合的细胞，从混合细胞群中分离或基本上纯化定形内胚层细胞。在某些方面，存在于定形内胚层细胞表面上的细胞成分是CXCR4。
用于获得或产生可用于本发明的DE细胞的另外方法包括但不限于以下中描述的那些：D'Amour等人的美国专利第7,510,876号；Fisk等人的美国专利第7,326,572号；Kubo1等人,2004,“从培养的胚胎干细胞形成定形内胚层(Development of definitiveendoderm from embryonic stem cells in culture),”《发育》131:1651-1662；D'Amour等人,2005,“人类胚胎干细胞有效分化成定形内胚层(Efficient differentiation ofhuman embryonic stem cells to definitive endoderm),”《自然生物技术(NatureBiotechnology)23:1534-1541；和Ang等人,1993,“小鼠中定形内胚层谱系的形成和维持：HNF3/叉头蛋白的参与(The formation and maintenance of the definitive endodermlineage in the mouse:involvement of HNF3/forkhead proteins),”《发育》119:1301-1315；其中每个的全部内容在此通过引用并入本文。
定形内胚层到中/后肠球状体
在一些方面，DE的后部内胚层细胞进一步发育成一种或多种特化细胞类型。激活素诱导的定形内胚层(DE)可以进一步经历FGF/Wnt诱导的后内胚层模式化、后肠特化和形态发生，最后是促肠培养系统，其促进肠道生长、形态发生和细胞分化成功能性肠细胞类型，包括肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞。在一些方面，人类PSC被有效地导向体外分化成肠上皮，其可包括分泌细胞、内分泌细胞和吸收细胞类型。应当理解，可以将如生长因子的分子添加到发育的任何阶段以促进特定类型的肠组织形成。
PSC，如ESC和iPSC，以逐步或非逐步的方式经历定向分化，首先分化成定形内胚层(DE)，然后分化成中/后肠上皮和间充质(例如，后肠球状体)，并且然后分化成肠组织。在一些方面，定形内胚层细胞和hESC用一种或多种生长因子处理。
在一些方面，可溶性FGF和Wnt配体用于模拟培养物中的早期后肠特化，以通过定向分化将从iPSC或ESC形成的DE转化为后肠上皮，其有效地产生所有主要肠细胞类型。在人类中，通过选择性激活对肠发育重要的某些信号传导途径来实现DE的定向分化。本领域技术人员将理解，改变任何Wnt信号传导蛋白与任何FGF配体组合的表达可以产生如本文所述的定向分化。
更多细节在以下中找到：例如，Liu等人,“Wnt信号途径的小分子激动剂(A small-molecule agonist of the Wnt signaling pathway),”《德国应用化学国际版(AngewChem Int Ed Engl.)》44(13):1987-1990(2005)；Miyabayashi等人,“Wnt/β-连环蛋白/CBP信号传导维持长期小鼠胚胎干细胞多能性(Wnt/beta-catenin/CBP signaling maintainslong-term murine embryonic stem cell pluripotency),”《美国国家科学院院报(ProcNatl Acad Sci U S A.)》104(13):5668-5673(2007)；Zhang等人,“Wnt/β-连环蛋白信号途径的小分子增效剂(Small-molecule synergist of the Wnt/beta-catenin signalingpathway),”《美国国家科学院院报》104(18):7444-7448(2007)；Neiiendam等人,“一种NCAM衍生得到的FGF受体激动剂(FGL-肽)在原代大鼠神经元中诱导神经突向外生长和神经元存活(An NCAM-derived FGF-receptor agonist,the FGL-peptide,induces neuriteoutgrowth and neuronal survival in primary rat neurons),”《神经化学杂志(JNeurochem.)》91(4):920-935(2004)；Shan等人,“鉴定蓬乱的PDZ结构域的特异性抑制剂(Identification of a specific inhibitor of the dishevelled PDZ domain),”《生物化学(Biochemistry)》44(47):15495-15503(2005)；Coghlan等人,“糖原合酶激酶-3的选择性小分子抑制剂调节糖原代谢和基因转录(Selective small molecule inhibitors ofglycogen synthase kinase-3modulate glycogen metabolism and genetranscription),”《生物化学(Chem Biol.)》7(10):793-803(2000)；Coghlan等人,“糖原合酶激酶-3的选择性小分子抑制剂调节糖原代谢和基因转录(Selective small moleculeinhibitors of glycogen synthase kinase-3modulate glycogen metabolism and genetranscription),”《生物化学(Chemistry&Biology)》7(10):793-803；和Pai等人,“脱氧胆酸激活β-连环蛋白信号途径并增加结肠细胞癌的生长和侵袭力(Deoxycholic acidactivates beta-catenin signaling pathway and increases colon cell cancergrowth and invasiveness),”《分子细胞生物学(Mol Biol Cell.)》15(5):2156-2163(2004)；其中每个的全部内容在此通过引用并入。
在一些方面，靶向与Wnt和/或FGF信号传导途径相关的细胞成分的siRNA和/或shRNA用于激活这些途径。
Wnt信号传导途径的调节剂/激活物包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16。在一些方面，途径的调节可以通过使用小分子调节剂或蛋白质调节剂来激活上述途径或激活上述途径的蛋白质。例如，Wnt途径的小分子调节剂包括但不限于氯化锂；2-氨基-4,6-二取代嘧啶(杂)芳基嘧啶；IQ1；QS11；NSC668036；DCAβ-连环蛋白；2-氨基-4-[3,4-(亚甲二氧基)-苄基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶。Wnt信号传导的示例性天然抑制剂包括但不限于Dkk1、SFRP蛋白和FrzB。在一些方面，外在分子包括但不限于小分子，如WAY-316606；SB-216763；或BIO(6-溴靛玉红-3'-肟)。在一些方面，靶向与Wnt和/或FGF信号传导途径相关的细胞成分的siRNA和/或shRNA可用于激活这些途径。本领域技术人员将理解，靶细胞成分包括但不限于SFRP蛋白；GSK3、Dkk1和FrzB。另外的调节剂包括抑制GSK3的分子或蛋白质，其激活Wnt信号传导途径。示例性GSK3抑制剂包括但不限于：例如，Chiron/CHIR99021，其抑制GSK3β。本领域普通技术人员将认出适合于实施所公开方法的GSK3抑制剂。GSK3抑制剂可以约1uM至约100uM，或约2uM至约50uM，或约3uM至约25uM的量施用。本领域普通技术人员将容易理解适当的量和持续时间。
成纤维细胞生长因子(FGF)是参与血管生成、伤口愈合和胚胎发育的生长因子家族。在一些方面，本领域技术人员将理解，任何FGF可以与来自Wnt信号传导途径的蛋白质结合使用。在一些方面，可溶性FGF包括但不限于FGF4、FGF2和FGF3。在一些实施例中，通过使前体细胞与选自以下组成的组的一种或多种分子接触来激活FGF信号传导途径：FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22和FGF23。在一些实施例中，靶向与FGF信号传导途径相关的细胞成分的siRNA和/或shRNA可用于激活这些途径。本领域技术人员将理解，与Wnt和FGF信号传导途径有关的本文所述的方法和组合物通过实例的方式提供。类似的方法和组合物适用于本文公开的其它信号传导途径。
在一些方面，用本文所述的信号传导途径的一种或多种调节剂处理DE培养物6小时或更长时间；12小时或更长时间；18小时或更长时间；24小时或更长时间；36小时或更长时间；48小时或更长时间；60小时或更长时间；72小时或更长时间；84小时或更长时间；96小时或更长时间；120小时或更长时间；150小时或更长时间；180小时或更长时间；200小时或更长时间、240小时或更长时间；270小时或更长时间；300小时或更长时间；350小时或更长时间；400小时或更长时间；500小时或更长时间；600小时或更长时间；700小时或更长时间；800小时或更长时间；900小时或更长时间；1000小时或更长时间；1,200或更多小时；或者1,500小时或更长时间。
在一些方面，以如下浓度用本文所述的信号传导途径的一种或多种调节剂处理DE培养物：10ng/ml或更高；20ng/ml或更高；50ng/ml或更高；75ng/ml或更高；100ng/ml或更高；120ng/ml或更高；150ng/ml或更高；200ng/ml或更高；500ng/ml或更高；1,000ng/ml或更高；1,200ng/ml或更高；1,500ng/ml或更高；2,000ng/ml或更高；5,000ng/ml或更高；7,000ng/ml或更高；10,000ng/ml或更高；或15,000ng/ml或更高。在一些方面，在整个处理过程中，信号传导分子的浓度保持恒定。在其它方面，在处理过程期间，信号传导途径的调节剂的浓度是变化的。在一些方面，将根据本发明的信号传导分子悬浮在包含DMEM和胎牛血清丝氨酸(FBS)的培养基中。FBS浓度可为2％和更高；5％和更高；10％或更高；15％或更高；20％或更高；30％或更高；或者50％或更高。本领域技术人员将理解，本文描述的方案以单独或组合形式适用于任何已知的本文所述的信号传导途径的调节剂，包括但不限于Wnt和FGF信号传导途径中的任何分子。
在使用两种或更多种信号传导分子来处理DE培养物的方面，信号传导分子可以同时或分开加入。当使用两种或更多种分子时，每种分子的浓度可以独立地变化。
CDX2的表达可用于揭示在DE与FGF信号传导激活物和Wnt信号传导激活物(例如FGF4和Wnt3a)一起温育一段时间之后，后肠形成的趋势，所述一段时间例如12小时或更长时间；18小时或更长时间；24小时或更长时间；36小时或更长时间；48小时或更长时间；60小时或更长时间；或90小时或更长时间。在一些方面，需要更长的温育期以实现稳定的后内胚层表型，如通过CDX2的延长表达所测量。在这类方面，温育期可以是60小时或更长时间；72小时或更长时间；84小时或更长时间；96小时或更长时间；108小时或更长时间；120小时或更长时间；140小时或更长时间；160小时或更长时间；180小时或更长时间；200小时或更长时间；240小时或更长时间；或300小时或更长时间。
替代地，在一些方面，不存在细胞成分，如前肠标记物Sox2、Pdx1、Cldn18和白蛋白，可用于揭示定向后肠形成。在一些方面，肠转录因子CDX2、KLF5和SOX9可用于代表肠发育。在一些方面，GATA6蛋白表达可用于代表肠发育。在这些方面，温育期可以是12小时或更长时间；18小时或更长时间；24小时或更长时间；36小时或更长时间；48小时或更长时间；60小时或更长时间；或90小时或更长时间。替代地，温育期可以是60小时或更长时间；72小时或更长时间；84小时或更长时间；96小时或更长时间；108小时或更长时间；120小时或更长时间；140小时或更长时间；160小时或更长时间；180小时或更长时间；200小时或更长时间；240小时或更长时间；或300小时或更长时间。
在一些方面，通过使用靶向相关信号传导途径中的分子的一抗和/或二抗的免疫组织化学来确定细胞成分的丰度数据，例如蛋白质和/或基因表达水平。在其它方面，通过微阵列分析确定细胞成分的丰度数据，例如蛋白质和/或基因表达水平。
替代地，形态学变化可用于表示定向分化的进展。在一些方面，后肠球状体进一步经受3维培养条件以进一步成熟。在其它方面，在后肠球状体形成后可以观察到被间充质细胞包围的高度卷曲的上皮。另外，在以下时间内观察到肠类器官；极化柱状上皮；杯状细胞；或平滑肌细胞：6天或更长时间；7天或更长时间；9天或更长时间；10天或更长时间；12天或更长时间；15天或更长时间；20天或更长时间；25天或更长时间；28天或更长时间；32天或更长时间；36天或更长时间；40天或更长时间；45天或更长时间；50天或更长时间；或60天或更长时间。
中/后肠球状体到结肠类器官
已经确定，除了FGF和WNT信号传导之外，骨形态发生蛋白(BMP)，具体地BMP2和BMP4，能够促进后/后肠命运并抑制前肠命运。另外，BMP信号传导调节不同区域类型的肠的形成。在后肠阶段后用noggin抑制BMP促进近端肠命运(十二指肠/空肠)。在后肠阶段后BMP信号传导的激活促进更远端的肠细胞命运(盲肠/结肠)。
BMP的激活可以通过使中/后肠球状体与BMP激活物和EGF信号传导途径激活物接触持续足以形成所述人类结肠类器官的时间段来进行。温育期的分界可以通过人类结肠器官类型表达SATB2的时间点来限定。本领域普通技术人类员将容易了解合适的BMP激活物和EGF信号传导途径激活物。合适的BMP激活物可包括例如BMP2、BMP4、BMP7、BMP9和蛋白质或小分子激动剂如ventromorphins(Genthe等人2017)或用作激动剂的蛋白质。BMP激活物和EGF信号传导途径激活物可以与中-/后肠球状体接触约1天至约3天。可以在前三天内激活BMP信号传导。在一个方面，BMP激活物和EGF信号传导途径激活物的接触步骤为24小时至约10天、或约48小时至约9天、或约3天至约8天、或约4天至约8天、或约5天至约7天。合适的EGF激活物可包括例如TGFα、HB-EGF、双调蛋白、Epigen、β细胞素和小分子如db-cAMP。EGF激活物可以以约10ng/mL至10,000ng/ML的浓度与中-/后肠球状体接触，持续约24小时至约10天、或约48小时至约9天、或约3天至约8天、或约4天至约8天、或约5天至约7天的时间段。
中/后肠球状体可以与BMP激活物和/或EGF激活物接触，其浓度为5ng/ml或更高；20ng/ml或更高；50ng/ml或更高；75ng/ml或更高；100ng/ml或更高；120ng/ml或更高；150ng/ml或更高；200ng/ml或更高；500ng/ml或更高；1,000ng/ml或更高；1,200ng/ml或更高；1,500ng/ml或更高；2,000ng/ml或更高；5,000ng/ml或更高；7,000ng/ml或更高；10,000ng/ml或更高；或15,000ng/ml或更高，单独或组合使用。在一些实施例中，在整个处理过程中，信号传导分子的浓度保持恒定。在其它实施例中，在处理过程期间，信号传导途径的分子浓度变化。在一些实施例中，将根据本发明的信号传导分子悬浮在包含DMEM和胎牛血清丝氨酸(FBS)的培养基中。FBS浓度可为2％和更高；5％和更高；10％或更高；15％或更高；20％或更高；30％或更高；或者50％或更高。本领域技术人员将理解，本文描述的方案以单独或组合形式适用于任何已知的本文所述的信号传导途径分子。
实例
提供以下非限制性实例以进一步说明本文公开的本发明的方面。本领域技术人员应了解，以下实例中公开的技术代表已经发现在本发明的实践中很好地起作用的方法，因此可以认为是构成其实践的模式的实例。然而，根据本公开，本领域技术人员应了解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的特定方面进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。
胃肠道的上皮来源于定形内胚层，其是在原肠胚形成期间建立的主要胚层之一。肠管形态发生的过程将定形内胚层转化为具有前肠、中肠和后肠的原始肠管。中肠产生小的近端大肠，并且后肠产生远端大肠和直肠(Zorn和Wells，2009)。小肠进一步细分为3段：参与营养物质的吸收和铁的摄取的十二指肠、参与营养物质的消化和吸收的空肠，以及参与吸收胆汁酸和维生素-B12的回肠(Jeejeebhoy，2002)。大肠细分为盲肠、结肠和直肠，它们都参与吸收水和电解质(Jeejeebhoy，2002)。尽管最近的进展已经阐明了小肠的发育(Finkbeiner等人，2015；Spence等人，2011；Watson等人，2014)，但对人类大肠/结肠的发育知之甚少。此外，影响胃肠(GI)道这一区域的疾病、结肠炎、结肠癌、息肉综合征和肠易激综合征是普遍的(Molodecky等人，2012；Siegel等人，2014；Zbuk和Eng，2007)。息肉综合症和肠癌的动物模型是有限的，因为息肉和肿瘤优先在小肠中形成，很少在结肠或直肠中形成(Haramis等人，2004；He等人，2004；Moser等人，1990)。
申请人先前描述了一种方法，其中人类多能干细胞可以通过近似小肠胚胎发育的定向分化步骤分化成肠组织。首先，通过用激活素A处理，多能干细胞分化为定形内胚层。定形内胚层暴露于高水平的Wnt和FGF诱导形态发生成中/后肠管球状体。一旦形成，这些中肠/后肠球状体，当在有利于肠生长的条件下在3维培养物中生长时，过渡通过近似体内小肠发育的阶段并形成人类肠类器官(HIO)(Spence等人，2011)。HIO具有小的肠特性并且已证明对小肠生物学建模非常有用(Bouchi等人，2014；Finkbeiner等人，2015；Watson等人，2014；Xue等人，2013)。然而，到目前为止，尚未开发出PSC衍生得到的大肠类器官，并且考虑到大肠中疾病的普遍，这类系统将允许在胃肠道这一区域中询问发育和疾病机制。
为了开发产生大肠类器官的方法，申请人首先将Satb2鉴定为青蛙、小鼠和人类中假定的大肠上皮的确定标记物。使用Satb2作为标记物，申请人已经表明BMP信号传导是青蛙和小鼠的后肠内胚层的特化所必需的，这与BMP在后腹侧发育中的已知作用一致(Kumar等人，2003；Roberts等人，1995；Sherwood等人，2011；Tiso等人，2002；Wills等人，2008)。此外，在PSC衍生得到的肠管培养物中刺激BMP信号传导3天足以诱导后HOX代码和表达SATB2的结肠类器官的形成。人类结肠类器官(HCO)具有标记谱和与大肠一致的细胞类型。此外，HCO，但不是HIO，响应于NEUROG3的表达形成结肠肠内分泌细胞(EEC)，证明HCO在功能上致力于结肠区域。此外，HCO植入免疫受损小鼠的肾囊下并在体内生长8-10周，保持其区域识别，形成具有结肠形态的组织，含有结肠特异性细胞类型，具有增殖和分化区，以及形成良好的平滑肌层。源自体内生长的类器官的肠类肠和类结肠保持区域识别。最后，RNA-seq分析表明，HIO和HCO经历了实质性成熟，并分别表达了与小肠和大肠特性相一致的区域标记物。总的来说，申请人在青蛙和小鼠中确定了进化上保守的BMP-HOX途径，并用它来指导后肠模式化和人类结肠类器官的形成。
结果
SATB2表达标记后胚胎和成年肠的肠内胚层。
建立中肠、后肠、假定的小肠和大肠的分子途径知之甚少，部分原因是由于缺乏明确的标记物。这限制了指导人类PSC分化成区域不同的肠类器官，特别是大肠类器官的能力。申请人因此鉴定了区分小鼠胚胎肠管的不同结构域的标记物，并使用它们来询问模仿早期肠的信号传导途径。与先前的报道一致，申请人发现，在e9.5小鼠胚胎中，Gata4标记了从后前肠到卵黄柄的肠内胚层(图8A)(Aronson等人，2014；Battle等人，2008；Beuling等人，2008a；Beuling等人，2007a；Beuling等人，2007b；Beuling等人，2010；Beuling等人，2008b；Bosse等人，2007；Kohlnhofer等人，2016；Patankar等人，2012a；Patankar等人，2012b；Sherwood等人，2009；Walker等人，2014)。在发育的后期阶段(e11.5-e16.5)，Gata4继续明显标记前部而不是后部肠(图8B-D、I-J)。该表达结构域在小鼠(未示出)和人类(图8K-L)中保持完整到成年期。
为了鉴定后胎肠的标记物，申请人采用了公共表达数据库，如针对结肠富集的基因的GNCProTM、TiGER和人类蛋白质图谱(在材料和方法部分中描述)，并发现Satb2是大肠的潜在标记物。Satb2是同源框基因的CUT类成员(Holland等人，2007)，其结合核基质附着区并参与染色质重塑(Gyorgy等人，2008)。免疫染色示出Satb2蛋白首先在e9-9.5的小鼠胚胎的后内胚层中检测到，并且在卵黄柄处与Gata4(图8A)形成离散的表达边界，表明Satb2+结构域标记后肠，比先前鉴定的更广泛的表达域(Dobreva等人，2006)。Satb2表达在整个发育(e11.5-16.5)过程中继续标记后肠内胚层(图8B、C、E、F、H、J)以及在小鼠(未示出)和人类(图8L)的出生后结肠。使用已发表的人类蛋白质组和RNA-seq数据，申请人证实GATA4和SATB2分别差异地标记人类胎儿和成人肠道的近端和远端区域(Bernstein等人，2010；Fagerberg等人，2014)(Wang等人，2015)(图9A-C)。这些数据表明Gata4和Satb2表达边界是在小鼠发育早期建立的，并且标记小鼠和人类中发育的小肠和大肠的未来边界。
在胚胎后肠内胚层中Satb2表达需要BMP信号传导。
申请人接下来使用Satb2作为标记物来鉴定促进胚胎中后肠命运的途径。申请人首先确定BMP信号在后肠管中是否活跃，这是考虑到其在斑马鱼、爪蟾、鸡和小鼠的几个发育阶段中模式化内胚层的已知作用(Kumar等人，2003；Roberts等人，1995；Sherwood等人，2011；Tiso等人，2002；Wills等人，2008)。申请人观察到，通过磷酸化的Smad1/5/8(pSMAD1/5/8)测量，BMP信号传导在e8.5小鼠胚胎的后肠管的内胚层和中胚层中高度活跃(图1A-B)。为了确定后肠管的模式化是否需要BMP信号传导，申请人将早期头褶阶段小鼠胚胎(e7.5)培养在BMP信号传导抑制剂DMH-1中(图1C)。在48小时的DMH-1处理后，申请人发现pSmad1/5/8水平显著降低并且后肠管中Satb2表达丧失(图2D-K)。此外，在DMH-1处理的胚胎的第一臂肱弓中Satb2表达丧失，与之前在斑马鱼中的研究一致(Sheehan-Rooney等人，2013)。如通过pSmad2/3水平测量，DMH-1对TGFβ3信号传导没有影响(图1F)。考虑到Satb2在脊椎动物物种中的进化保守性(Li等人，2006)，申请人研究了在青蛙胚胎的后肠中Satb2表达是否需要BMP(图2L)。与小鼠类似，用DMH-1处理爪蟾胚胎(图1M-V)，或BMP-拮抗剂Noggin(未显示)的转基因表达导致在后肠和臂肱弓中Satb2表达的丧失。已经示出BMP信号传导通过Smad1/5与保守增强子的直接结合直接调节小鼠胚胎下颌骨中的Satb2表达(Bonilla-Claudio等人，2012)，表明Satb2也可能是肠中的直接BMP靶标。综合起来，这些结果揭示了脊椎动物中的保守途径，其中产生远端回肠和大肠的限定发育中的肠管的后部大部分区域需要BMP信号传导。
在人类肠管培养物中BMP信号传导促进后部命运。
申请人接下来使用如前所述的源自人类PSC的新生CDX2+肠管球状体(Spence等人，2011)，研究BMP信号传导是否可以用于促进人类的后肠管命运。申请人分别使用BMP抑制剂NOGGIN或BMP2来抑制或激活BMP信号传导(图2A)，并通过核pSMAD1/5/8的累积来监测BMP信号传导水平。对照培养物具有低水平的pSMAD1/5/8蛋白质，并且添加NOGGIN消除了该染色(图2B-D)。相比之下，添加BMP2导致pSMAD158在上皮细胞和中胚层细胞中快速累积，表明两种细胞类型对BMP信号的响应类似于申请人在小鼠胚胎中观察到的(图1A-B)。使用成年小鼠结肠确认pSmad1/5/8染色的特异性，其示出pSmad1/5/8染色局限于上部隐窝的分化区室(图2E)，如先前报道的(Hardwick等人，2004；van Dop等人，2009；Whissell等人，2014)。对类器官的进一步分析揭示，与NOGGIN和对照培养物相比，3天的BMP2处理足以在上皮中诱导高水平的SATB2蛋白(图2F-I)。这表明BMP活性的短脉冲足以将球状内胚层模式化为后肠管命运。
虽然已知BMP信号传导调节内胚层的前后模式化，但对于最终赋予哺乳动物中沿A-P轴的位置特性的转录网络知之甚少。申请人使用人类肠管球状体和RNA-seq来鉴定BMP信号传导如何在发育中的人类肠道中建立后域。主成分分析揭示用BMP处理3天的肠管球状体与NOGGIN和对照物处理的类器官分开聚类(图2J)。基因本体项(GO项)的检查揭示了BMP信号传导的调节影响多种生物过程，包括器官形态发生、细胞-细胞信号传导、模式特化和对BMP信号传导的细胞应答(图2K)。A-P模式化的最确定的调节剂是HOX基因，并且申请人发现BMP激活导致前HOX基因的下调和后HOX基因的上调(图2L)。具体来说，申请人在HOX10、11、12和13组的多个旁系同源物中观察到BMP介导的增加。这些结果表明BMP信号传导在人类体肠管的模式化期间广泛地调节A-P hox代码，并且提出了远端胃肠道初始特化的机制。
BMP信号在SHH的下游起作用以诱导后HOX代码。
先前的研究表明，Sonic Hedgehog(Shh)在鸡胚胎中的后肠模式化期间在Bmp4和Hox13表达的上游起作用(图10A)(Roberts等人，1995)。然而，由于中肠和后肠中Bmp4过表达引起的胚胎致死性，未研究BMP和Hox13之间的相对上位关系(图10B)(De Santa Barbara等人，2005；Roberts等人，1995)。申请人使用人类肠管培养物来更好地对SHH-BMP-HOX13在后肠管模式化期间的上位关系进行建模。用平滑的激动剂SAG激活hedgehog信号传导导致BMP信号传导靶基因MSX2和间充质HOX因子HOXA13和HOXD13的浓度依赖性激活(图10C)。然而，这些因子的SAG介导的激活仅是BMP2介导的激活的一部分(图10C)。申请人进一步示出HH信号传导激活HOXA13的能力完全依赖于BMP(图10D-E)，证实BMP信号传导在SHH下游起作用，如先前报道的那样(Shyer等人，2015；Walton等人，2012；Walton等人，2009；Walton等人，2016)。尚未确定BMP信号是否足以激活HH信号传导下游的后HOX程序。因此，申请人在SHH抑制剂环巴胺的存在下检查了BMP对HOXA13的诱导，并发现当SHH信号被抑制时BMP2足以诱导HOXA13(图10F-G)。与此一致，在BMP模式化期间激活SHH信号传导并不改进SATB2表达(图11A)。爪蟾的实验证实了SHH和BMP之间的这种上位关系(数据未示出)，表明这种机制在进化上是保守的。总的来说，申请人的数据表明BMP信号传导足以激活后HOX代码并且在HH信号传导的下游这样做。
体外培养的BMP衍生得到的类器官保持远端特性。
申请人接下来研究了3天的BMP处理是否足以在延长的类器官培养25天后赋予稳定的区域特性(图3)。ONGUT1(近端小肠的标记物)的水平在NOGGIN和对照处物理的类器官中最高，而在BMP2处理的类器官中不存在(图3A-D)。相反，SOGB2在NOGGIN和对照物处理的类器官的上皮中不存在，但在BMP2处理的类器官的几乎所有CDX2+上皮细胞中广泛表达(图3E-H，图11A)。重要的是，BMP信号传导的调节对多种人类PSC系具有相似的近端-远端模式化效应，包括胚胎干细胞系H1和H9以及诱导多能干细胞系(IPSC 54.1和IPSC 72.3)(如下所示)。申请人经常在NOGGIN和对照类器官中观察到非上皮SATB2表达(数据未示成)，可能是由于已知存在于体外HIO中的其它细胞类型的存在(Spence等人，2011)。分别在后上皮和间充质中表达的HOXB13和HOXD13的检查进一步揭示BMP处理的类器官在体外延长培养后保持后部模式化(图11B-C)。
杯状细胞以从近端小肠到远端大肠的低至高梯度分布(Rodriguez-Pineiro等人，2013)，并且申请人研究了杯状细胞数量是否在近端类器官中较低并且在远端类器官中较高。28天时的MUC2染色分析揭示，与更近端的NOGGIN处理的类器官和对照类器官(其仅具有稀少的细胞内MUC2染色)相比，BMP2处理的类器官具有高数量的高杯状细胞，如通过细胞内MUC2可见(图3I-L)。申请人使用标记物MUC5B进一步证实了杯状细胞的区域特性，所述标记物MUC5B由结肠中的杯状细胞子集表达但不在小肠中表达(van Klinken等人，1998)。在Noggin和对照物处理的28天类器官中不存在MUC5B染色，但存在于BMP2处理的类器官中(图4M-P)。杯状细胞形态在较老的类器官中变得更成熟(图11D-I)，其中在44天龄的BMP处理的类器官中，申请人在将粘液分泌到类器官的内腔中的过程中观察到杯状细胞(图11J-L)。在BMP处理的类器官中观察粘液分泌的能力表明该类器官系统可用于研究粘液分泌和粘液在肠道病理生理学中的作用。
虽然类器官的区域模式在培养28天后是稳定的，但申请人想要研究在最初的3天处理后是否完全建立早期模式化。为此，申请人将3天NOGGIN处理的球状体转移至含BMP2的培养基中3天，并相反地将3天BMP处理的球状体转移至含有NOGGIN的培养基中3天。用NOGGIN产生的近端类器官未响应于BMP2表达SATB2，证明在模式化3天后近端命运是稳定的(图11A)。在相反的实验中，虽然3天的BMP2处理足以诱导稳定的远端命运，但是响应于NOGGIN处理，一部分类器官丧失了SATB2表达(图11A)。虽然3天的BMP2处理足以诱导在体外和体内稳定的结肠命运(图12)，但在早期后肠管中仍然存在可塑性。这与妊娠中期大鼠胚胎的结肠内胚层比小肠内胚层更具区域性可塑性的观察结果(Ratineau等人，2003)是一致的。
BMP信号途径对类器官间充质的模式化。
虽然BMP信号传导的刺激赋予类器官上皮细胞区域特性，但申请人还在模式化期间观察到BMP2处理的类器官的非上皮区室中的pSMAD1/5/8，以及已知在间充质中表达的后HOX因子的上调。为了确定间充质模式化是否稳定，或是否需要从上皮输入的继续模式化，申请人分离并扩增间充质细胞培养物2-3周并分析它们的区域HOX基因的表达。间充质培养物缺乏表达E-钙粘蛋白的细胞，表明它们主要由间充质构成(图3Q)。对富集在近端肠间充质中的HOXD3的分析(Yahagi等人，2004)证实来自NOGGIN和对照物处理的类器官的间充质具有稳定的近端特性，而BMP处理的类器官具有降低的HOXD3的表达(图3R)和高水平HOXA13(图3S)，其继续在人类结肠成纤维细胞中表达(Higuchi等人，2015)。总的来说，这些数据表明BMP信号传导的早期调节模式化上皮和间充质两者，并且即使在没有上皮的情况下，间充质模式化也是稳定的。
结肠肠内分泌细胞的诱导局限于BMP2处理的类器官。
几种ECC亚型的发育在区域上局限于小肠和大肠的特定区段。例如，蛋白质INSL5的表达局限于结肠EEC(Burnicka-Turek等人，2012；Thanasupawat等人，2013)。作为结肠特性的功能测试，申请人确定结肠EEC标记物INSL5的实验诱导是否局限于BMP2处理的远端类器官。为此，申请人使用含有多西环素(DOX)诱导型NEUROG3表达盒的iPSC系诱导地表达促分泌转录因子NEUROG3(图4A)，如前所述(McCracken等人，2017；McCracken等人，2014)。申请人进行6小时的DOX脉冲，并且在培养另外7天后观察到通过CHGA阳性细胞测量的EEC的稳健诱导(图4B-I)。然而，申请人仅在BMP2处理的类器官中观察到INSL5阳性细胞，并通过QPCR分析证实了这一点(图4C-H，J)。鉴于INSL5表达细胞仅在结肠中，申请人的数据强烈表明BMP2处理的类器官在功能上致力于结肠命运。远端标记物如SATB2、MUC5B和HOXA13的表达以及产生结肠特异性ECC的能力支持以下结论，即BMP2处理的类器官是结肠的并且因此将被称为人类结肠类器官(HCO)。
在体内维持模式化类器官的区域特性。
先前对小鼠和人类胎儿肠的研究已经证明，在免疫受损小鼠中原位移植和生长后，肠的不同区域的区域特性和组织形态得以维持(Duluc等人，1994；Savidge等人，1995)。为了确定在体外模式化的HIO和HCO是否会保持区域特性并生长成小肠和大肠组织，申请人将它们移植到小鼠肾囊下6-10周，申请人先前已证明其导致HIO成熟为小肠组织(Watson等人，2014)。申请人观察到，NOGGIN和对照物HIO的植入比HCO更有效(图12A)。与其区域特性一致，移植的HIO和HCO分别发育成形态上类似于小肠或大肠的成熟组织(图5A-E)。NOGGIN和对照类器官的上皮形成界限清楚的隐窝和高绒毛，与人类小肠相当。相比之下，BMP2处理的类器官含有隐窝但缺乏绒毛，类似于结肠。
除了它们与小肠或大肠的形态相似外，移植的HIO和HCO表达不同的区域标记物并含有区域富集的细胞类型。例如，NOGGIN和对照HIO的大部分上皮表达近端标记物GATA4并且不表达大肠标记物SATB2(图5F-I，K-N，图12B-E)。相反，HCO上皮细胞均匀地表达SATB2+，但不表达GATA4(图5J，0，图12B-E)。此外，表达DEFA5的潘氏细胞存在于NOGGIN和对照HIO的隐窝中，但是不存在与人类结肠相似的HCO(图5P-T，图12F)(Wehkamp等人，2006)。申请人使用结肠杯状细胞标记物MUC5B(van Klinken等人，1998)进一步证实了HCO的结肠特性，所述MUC5B由HCO的杯状细胞子集表达但在NOGGIN或对照HIO中不可检测(图5U-Y，图12G)。另外，HCO中MUC2+杯状细胞的数量远高于HIO，与人类结肠中看到的杯状细胞的丰度一致(图12H-L)。模式化标记物、表达MUC5B的杯状细胞的存在以及潘氏细胞的缺失都支持移植的HCO具有结肠上皮的结论。
体内成熟的HIO和HCO表达区域肠内分泌激素。
在胃肠道的不同区域中发现至少12种主要的EEC亚型，并且申请人分析了HIO和HCO是否存在区域EEC。发现胃饥饿素和胃动素主要在近端肠中，并且相应地这些激素主要在NOGGIN和对照HIO中表达，但不在HCO中表达(图6A-D)。类似地，在NOGGIN和对照HIO中发现GIP，但在HCO中不存在，所述GIP存在于小肠的K细胞中但在结肠中不存在(图6E-H)。然后申请人通过分析结肠中更丰富的GLP-1和PYY的表达来检查HCO中远端富集的EEC的存在。申请人观察到相较于HIO，HCO中的GLP-1和PYY细胞数量较多，并且前胰高血糖素原和PYY的表达更高(图61-P)。另外，申请人发现结肠特异性激素INSL5(Burnicka-Turek等人，2012；Thanasupawat等人，2013)的表达仅在HCO中(图6Q-T)。
体内外HIO和HCO中干细胞和祖细胞的分析。
为了确定体外衍生得到的HIO和HCO是否表达干细胞和祖细胞的标记物，申请人使用先前已描述的H9-BAC-LGR5-eGFP转基因系(McCracken等人，2014；Watson等人，2014)。在类器官中检查LGR5-eGFP表达揭示了在早期e13.5中与Lgr5-eGFP小鼠中的表达模式相似的广泛上皮结构域中的表达(Shyer等人，2015)(图13A、B、F、G、K、L)。如通过组织学和FACS分析所确定的，GFP表达在类器官上皮外也是明显的，这揭示了GFP+EPCAM-细胞群(数据未示出)。另外，申请人检查了SOX9的表达，SOX9是胎儿和成体肠中祖细胞的标记物，并且发现它在HIO和HCO的上皮中表达(图13C-E，H-J，M-0)。这些数据表明，由LGR5-eGFP和SOX9标记的胚胎/胎儿肠祖细胞在体外存在于HIO和HCO中。
在肠道发育的后期阶段，祖细胞被限制在发育绒毛的基部，在这里它们将最终促成利氏肠腺窝(crypts of Lieberkuhn)的肠干细胞(ISCs)。为了确定申请人体外观察到的祖细胞是否将经历这种发育转变，申请人移植HIO和HCO并监测LGR5-eGFP、SOX9和KI67蛋白。在体内类器官成熟后，申请人观察到LGR5-eGFP、SOX9和KI67限于基部假定隐窝(图13P-X)。此外，在HEC的绒毛中和在结肠上皮移植的HCO的袖带中的EEC中也观察到SOX9，与这些细胞类型中的SOX9表达一致。鉴于Sox9和Lgr5标记能够在小鼠中形成类肠和类结肠的肠和结肠干细胞(Gracz等人，2010；Ramalingam等人，2012)，申请人研究了移植的类器官的上皮是否可以被分离并用于产生类肠和类结肠。HIO和HCO均产生上皮类器官的培养物，其生长并且可以传代(图13Y-A')。此外，HCO衍生得到的上皮培养物表达结肠标记物CKB、FXYD3、SATB2和HOXB13，但不表达近端小肠标记物PDX1或GATA4，表明保持了区域特性(图13B'-D')。这些数据表明体内生长的HIO和HCO含有祖细胞和干细胞。
HIO和HCO的全面转录分析。
为了广泛询问HIO和HCO的区域特性和成熟，申请人对体内生长的HIO和HCO进行了RNA-seq分析，并将其与已发表的人类胎儿和成人小肠和大肠的数据集进行了比较。主成分分析揭示，从成人和胎儿肠分离的原代组织沿主成分1(PC1)轴聚集在一起，其占样品之间累积变异的36.5％(图14A)。GO分析揭示，这种变异是由于仅存在于原代组织而非PSC衍生得到的移植物中的细胞类型。例如，存在于人类原代组织中并且在移植物中不存在的前10个生物过程中的6个与免疫细胞相关(图14B-C)。第二主成分(PC2)占累积变异的17.7％并根据成熟度分离样品(图7A)。该成分揭示移植的类器官比人类胎儿肠和胎儿结肠更成熟，但不如成人结肠和肠成熟。第三主成分(PC3)占累积变异的6.7％并根据区域特性分离样品，并且显示HCO与结肠更相似，而HIO与小肠聚类(图7A)。有趣的是，人类胎儿样本并没有根据区域特性(小肠对比结肠)聚类，这表明这些样品可能没有从胃肠道的指定区域干净地分离。
申请人接下来使用超几何平均值测试来确定HIO和HCO共享区域特异性基因表达小肠和结肠的相似模式的概率(图7B)。与结肠或BMP2处理的HCO相比，在小肠和NOGGIN处理的HIO中表达总共341个转录物，这一比例几乎不可能(P＝1.5×10-143)。类似地，在对照HIO中上调的基因组与相对于成人结肠在成人小肠中上调的基因组具有高度显著的相似性(P＝2.5×10-203)。相反，在HCO中上调的基因组高度富集相对于小肠在结肠中上调的基因(分别地P＝4.1×10-53和P＝6.0×1073)。该分析得出结论，HIO模式化与人类小肠最相似，HCO模式化是结肠的。为了进一步探索HIO(NOG和对照物处理的)和HCO的性质，申请人进行了差异表达分析(成人小肠对比成人结肠；HIO对比HCO)。申请人产生了4向散点图，这也表明高比例的在结肠中上调的基因在HCO中也上调，并且大多数在小肠中上调的基因在HIO中也上调(图7C，表1)。最后，对富集的生物过程的分析揭示成人结肠和移植的HCO具有高度活跃的Wnt信号传导和类似的HOX代码(图7D)。总的来说，这些数据表明申请人已经开发出一种将PSC分化为人类结肠组织的稳健方法。
表格1。在成人小肠和结肠中上调的基因也分别在HIO和HCO中上调。第1栏，在NOGHIO对比HCO和成人小肠对比成人结肠中通常上调的，第2栏，在对照HIO对比HCOs和成人小肠对比成人结肠中通常上调的，第3栏，在HCO对比NOG HIO和成人结肠对比成人小肠中通常上调的，第4栏，在HCO对比对照HIO和成人结肠对比成人小肠中通常上调的
讨论
从历史上看，前肠、中肠和后肠的分类是基于肠前门和后肠门的发育以及肠系膜血供的来源(Uppal等人，2011)。已经提出了中肠和后肠的替代定义，其中中肠是源自脐前部的肠的部分，并且后肠来源于脐的后部(Johnston，1913；Savin等人，2011)。在任何一种情况下，历史上依赖于解剖学标志，以及缺乏更精确的分子标记物来区分前、中和后肠，使得难以开发从PSC体外产生这些细胞/组织的方法。因此，鉴定清楚划分发育中肠和后肠区域的标记物是必不可少的。
申请人使用CDX2、GATA4、ONECUT1和SATB2的组合来鉴定在爪蟾、小鼠和人类的中肠和后肠发育的早期阶段建立不同的分子边界。有趣的是，GATA4和SATB2表达结构域在小鼠的卵黄柄/假定脐带中形成边界，并且在整个发育过程和成人肠中保持该边界。GATA4表达标记脐的前部的肠，而SATB2表达标记着脐后部的区域，表明脐是中肠和后肠之间的边界(Johnston，1913；Savin等人，2011)。
虽然HIO中的ONECUT1表达和SATB2表达是HCO分别与其近端和远端特性一致，但是GATA4在体外近端HIO中的表达不如其胚胎表达所预期的那样鲁棒(数据未示出)。相比之下，GATA4在HIO的体内成熟后并且在患者活组织检查产生的类肠中鲁棒地表达(数据未示出)。这可能表明GATA4表达中涉及的因子在培养条件下不存在或者体内成熟是GATA4上皮表达所必需的。该数据还表明，高水平的GATA4表达对于肠的早期区域化可能是不必要的，与保持正常Onecut因子表达的肠Gata4敲除小鼠一致(Battle等人，2008)。此外，一小部分BMP处理的类器官丧失了CDX2表达并激活了膀胱标记物角蛋白13和Uroplakin 1a的表达(数据未示出)。这与具有后肠命运的BMP类器官一致，因为尿路上皮组织来源于后肠/泄殖腔(Georgas等人，2015)。
SATB2在远端回肠和大肠的整个发育过程中表达，但是不知道SATB2是否是远端肠发育所必需的。小鼠敲除研究集中于颅面和皮质神经元发育，因为SATB2中的突变与2q32-q33缺失和玻璃综合征相关的腭裂有关(FitzPatrick等人，2003)。然而，有间接证据表明SATB2可能起作用人类结肠生理学。SATB2已在基因组广泛关联研究中被鉴定为溃疡性结肠炎易感基因(McGovern等人，2010)。此外，已显示SATB2表达的丧失与结肠直肠癌患者的不良预后相关(Eberhard等人，2012)。使用HCO进行的未来研究可以允许鉴定发育中的结肠中的SATB2靶标，这可以提供对溃疡性结肠炎和结肠直肠癌的病理学的了解。
模型生物体中的一些研究已经涉及在后肠发育过程中对内胚层进行模式化中的BMP信号途径在(Kumar等人，2003；Roberts等人，1995；Sherwood等人，2011；Tiso等人，2002；Wills等人，2008)。与此一致，申请人已经证明人类定形内胚层的后部模式化依赖于BMP信号传导，因为BMP的抑制消除了WNT和FGF促进后内胚层命运的能力(McCracken等人，2014)。然而，BMP信号传导在肠发育过程中发挥其它暂时不同的作用也就不足为奇了。例如，在建立近端-远端区域性结构域后，BMP信号传导起到在肠和结肠中建立隐窝-绒毛轴的作用(Li，2005)。因此，对于模式化的时间要求允许胚胎使用相同的信号传导途径用于肠道发育的多种目的，如在果蝇中肠中已经报道的(Driver和Ohlstein，2014；Guo等人，2013)。在人类疾病背景下，BMPR1A中的突变与患有少年息肉综合征的患者的子集相关。HCO系统非常适合于在早期发育期间鉴定BMP下游的HOX代码，并且确定具有BMPR1A突变的错构瘤性息肉是否已经改变HOX基因表达可能是有趣的。
申请人先前报道了HIO的体外定向分化和体内移植(Spence等人，2011；Watson等人，2014)，其是小肠。鉴于影响大肠的独特生理学和病理学条件，必须开发一种结肠模型系统来询问结肠特有的病理生理学问题。在发展方面，该系统提供了研究如何建立区域特性的基本问题的机会。HIO和HCO形成独特的细胞类型，如HIO中的潘氏细胞和HCO中的结肠特异性杯状细胞。此外，HIO和HCO具有有区别的一组EEC，它们通常分别在小肠和大肠中富集。区域化类器官应为未来研究肠道的不同区域如何产生区域化干细胞提供平台。此外，HCO的产生将允许对影响结肠的疾病(如溃疡性结肠炎和结肠直肠癌)进行建模。
材料和方法
动物。8-16周龄的免疫缺陷型NOD-SCID IL-2Rynu"(NSG)小鼠用于移植实验(获自综合小鼠和癌症核心机构(Comprehensive Mouse and Cancer Core Facility)，俄亥俄州辛辛那提(Cincinnati,Ohio))。野生型小鼠用于研究小鼠胎儿肠。将所有小鼠圈养在辛辛那提儿童医院医疗中心(Cincinnati Children's Hospital Medical Center，CCHMC)的动物机构中。所有实验均在CCHMC的机构动物护理和使用委员会的批准下进行。
青蛙和小鼠胚胎中的BMP抑制。如前所述进行热带爪蟾胚胎培养和小分子处理(Rankin等人，2012；Rankin等人，2015)。将DMH-1(Sigma D8946)溶解在DMSO中，并以20pM的终浓度使用；在同胞胚胎上使用等浓度的DMSO载体。将抑制剂处理实验重复两次，对所分析的标记物具有类似的效果。对于爪蟾原位杂交分析，使用线性化的全长cDNA质粒模板产生DIG标记的反义RNA探针(X.tropicalis satb2购自ATCC，克隆7720194；HinDIII，T7用于探针；X.laevis satb2是Tyler Square和Daniel Medeiros的赠品，科罗拉多大学博尔德分校(University of Colorado-Boulder)；Xbal，Sp6用于探测器。)Xenbase上提供了描述探针合成和原位杂交方案的完整细节(hftp://wiki.xenbase.orq/xenwiki/index.php/Protocols)。
对于小鼠全胚胎培养物，将e7.5胚胎在Ham's F12培养基和含有N-2补充物(英杰(Invitrogen))的全胚胎培养大鼠血清(哈伦实验室(Harlan Labs))的1:1混合物中培养。将容器置于辊式培养装置(BTC工程(BTC Engineering)，英国剑桥(Cambridge,UK))上并在37℃下保持2天并用20％02和5％CO2充气。用5pM DMH-1处理抑制BMP信号传导，其中DMSO用作载体对照。
生成人类中肠/后肠球状体。如前所述产生并维持人类肠类器官(Watson等人，2014)。人类胚胎干细胞和诱导的多能干细胞在涂有Matrigel(基底膜基质，BD生物科学(BDBiosciences))的六孔Nunclon表面板(Nunc)中在无饲养条件下生长，并保持在mTESR1培养基(干细胞技术(Stem Cell Technologies))中。为了诱导定形内胚层(DE)，用Accutase(英杰)传代人类ES或iPS细胞，并以每孔100,000个细胞的密度接种在涂布Matrigel的Nunclon表面24孔板中。对于Accutase分裂细胞，第一天将10pM Y27632化合物(西格玛(Sigma))加入培养基中。第一天后，将培养基更换为mTESR1，并使细胞再生长24小时。然后如前所述(Spence等人，2011)，用100ng/mL激活素A处理细胞3天。然后用后肠诱导培养基(RPMI1640，2mM L-谷氨酰胺，2％去补体FBS，青霉素(penicillin)-链霉素(streptomycin)和100ng/mL激活素A)处理DE4天，用50 0ng/mL FGF4(R&D)和3pM Chiron 99021(托克里斯(Tocris))处理以诱导形成中-后肠球状体。
将中肠/后肠球状体模式化为HIO和HCO。从24孔板收集球状体并接种在Matrigel(BD)中。为了产生近端HIO，用补充有单独100ng/mL EGF(R&D)或者100ng/mL EGF和100ng/ml NOGGIN(R&D)的肠生长培养基(Advanced DMEM/F-12，N2，B27，15mM HEPES，2mM L-谷氨酰胺，青霉素-链霉素)覆盖球状体。为了产生HCO，用100ng/mL EGF加100ng/mL BMP(R&D)覆盖球状体。对于SHH实验，将1pM SAG(托克里斯)、5pM SAG或2.5pM环巴胺(托克里斯)加入对照培养基中持续最初3天，之后收集RNA样品。在3天时更换培养基，对于所有模式化条件，仅EGF保持在培养基中。然后每周更换培养基两次。每14天将HIO和HCO重新接种在新鲜的Matrigel中。
NEUROGENIN3诱导系的产生。为了产生多西环素诱导型NEUROG3系，申请人用pINDUCER21-NEUROG3慢病毒转导IPSC 72.3细胞，并使用250g/mL的G418进行选择。IPSC72.3细胞系和诱导型NEUROG3都已在前面描述过(McCracken等人，2014)。将稳定转导的细胞分化成中/后肠球状体，然后模式化成HIO或HCO。使球状体生长28天，并用0.5ug/mL多西环素脉冲8小时。在第35天，收集类器官并通过QPCR和IF进行分析。
类器官间充质的生长。来自附着于24孔板底部的类器官的间充质细胞附着并以2维生长。为了扩展来自类器官的间充质细胞，将DMEM 10％FBS+L-谷氨酰胺+青霉素-链霉素加入已在14天收获类器官的孔中。每周更换培养基两次，持续共2-3周，直至达到接近100％汇合。
人类肠道类器官的移植。将NSG小鼠保持抗生素食物(275p.p.m.磺胺甲恶唑和1,365ppm甲氧苄啶；测试饮食)。在手术前后随意提供食物和水。从Matrigel中取出单个HIO，在体外成熟28天的，用冷的磷酸盐缓冲盐水(DPBS；Gibco)洗涤，并在手术前12小时包埋到纯化的I型胶原蛋白(大鼠尾胶原蛋白；BD生物科学)中以允许用于形成凝固的凝胶塞。然后将这些塞子在补充有100ng/mL EGF(R&D)的肠生长培养基(Advanced DMEM/F-12，B27，15mMHEPES，2mM L-谷氨酰胺，青霉素-链霉素)中放入标准生长培养基中过夜。然后如先前报道，将HIO移植到肾囊下(Watson等人，2014)。简单来说，用2％吸入的异氟烷(Butler Schein)麻醉小鼠，然后用异丙醇和聚维酮碘以无菌方式准备小鼠的左侧。做一个小的左后肋下切口以暴露肾脏。产生囊下袋，然后将胶原蛋白包埋的HIO置于袋中。然后将肾返回腹膜腔并给予小鼠IP冲洗Zosyn(100mg/kg；辉瑞公司(Pfizer Inc.))。以双层方式闭合皮肤，给小鼠皮下注射Buprenex(0.05mg/kg；中西部兽医供应(Midwest Veterinary Supply))。在植入后8-10周，然后对小鼠进行人道安乐死或进行进一步的实验。
组织处理、免疫荧光和显微镜检查。根据组织的大小，将组织在冰上在4％多聚甲醛(PFA)中固定1-3小时。在OCT中冷冻类器官和移植植入物。使用驴血清(1X PBS中加0.5％Triton-X的5％血清)封闭OCT切片30分钟，并在4℃下与一抗一起温育过夜。然后将载玻片用1X PBS加0.5％Triton-X洗涤3次，并在二抗中与于封闭缓冲液中的DAPI一起在室温下温育2小时。有关抗体和相应稀释度的列表，请参见表2。然后将载玻片用1X PBS加0.5％Triton-X洗涤2次，然后在1X PBS中最后洗涤。然后使用Fluoromount-(SouthernBiotech)安装盖玻片。在Nikon Al共聚焦显微镜上捕获图像并使用Imaris成像软件(Bitplane)进行分析。对于整体染色，如上类似地处理组织，然后在Murray溶液中清除。用Nikon Al共聚焦显微镜进行成像。
表2.使用的QPCR引物。参见图3和4。
基因 序列
CDH1 FWD GACCGGTGCAATCTTCAAA
CDH1 REV TTGACGCCGAGAGCTACAC
CHGA FWD TGTGTCGGAGATGACCTCAA
CHGA REV GTCCTGGCTCTTCTGCTCTG
CKB FWD CCCACACCAGGAAGGTCTTA
CKB REV CCTCTTCGACAAGCCCGT
FXYD3 FWD AGGGTCACCTTCTGCATGTC
FXYD3 REV CTTCGGATAAACGCAGGACT
GATA4 FWD TAGCCCCACAGTTGACACAC
GATA4 REV GTCCTGCACAGCCTGCC
HOXA13 FWD GCACCTTGGTATAAGGCACG
HOXA13 REV CCTCTGGAAGTCCACTCTGC
HOXB13 FWD GCTGTACGGAATGCGTTTCT
HOXB13 REV AACCCACCAGGTCCCTTTT
HOXD13 FWD CCTCTTCGGTAGACGCACAT
HOXD13 REV CAGGTGTACTGCACCAAGGA
HOXD3 FWD CACCTCCAATGTCTGCTGAA
HOXD3 REV CAAAATTCAAGAAAACACACACA
INSL5 FWD GAAGGTTTTGCGCTGGATT
INSL5 REV GATCCCTCAAGCTCAGCAAG
MSX2 FWD GGTCTTGTGTTTCCTCAGGG
MSX2 REV AAATTCAGAAGATGGAGCGG
MUC2 FWD TGTAGGCATCGCTCTTCTCA
MUC2 REV GACACCATCTACCTCACCCG
ONECUT1 Fwd TTTTTGGGTGTGTTGCCTCT
ONECUT1 Rev AGACCTTCCGGAGGATGTG
PDX1 FWD CGTCCGCTTGTTCTCCTC
PDX1 REV CCTTTCCCATGGATGAAGTC
PPIA(CPHA)FWD CCCACCGTGTTCTTCGACATT
PPIA(CPHA)REV GGACCCGTATGCTTTAGGATGA
SATB2 FWD CCACCTTCCCAGCTTGATT
SATB2 REV TTAGCCAGCTGGTGGAGACT
免疫荧光图像的量化。通过将图像分成分离的通道并且然后使用ImageJ(NIH)测量像素面积来完成整个胚胎的图像量化。确定每个通道的像素面积，确定通道之间的比率，并将对照处理的胚胎的比率表示为100。如上所解释，在捕获图像的切片上进行体外和体内生长的类器官的量化。使用在用人类活组织检查样品校准后的[marls中的斑点函数量化CDX2、GATA4和SATB2阳性细胞核的数量。
RNA分离和QPCR。使用RNA提取试剂盒(Macharey-Nagel)提取RNA，并根据制造商的方案使用Superscript VILO(英杰)逆转录成cDNA。使用qPrimerDepot网络工具(primerdepot.nci.nih.gov)设计QPCR引物。引物序列列于表3中。使用QuantitectGreenPCR试剂盒(凯杰(Qiagen))和QuantStudio TM 6Flex Real-Time PCR系统(应用生物系统(Applied Biosystems))进行QPCR。
表3.使用的抗体。参见图1-6。
鉴定SATB2作为大肠标记物。
为了鉴定大肠的标记物，申请人首先使用GNCPro http://gncpro.sabiosciences.comigncpro/expression_grapherphp基于东京大学数据库来鉴定结肠中上调的转录因子(与其它组织相比)。基于此搜索，SATB2是结肠中排名第6的基因。为了证实SATB2确实在结肠中上调，申请人使用TiGER数据库(hftp://bioinfo.wilmer.ihu.edu/tiger/db gene/SATB2-index.html)搜索SATB2表达。为了进一步证实SATB2在结肠中的表达，并检查多种组织中的蛋白质表达，申请人使用了人类蛋白质图谱(http://www.proteinatlas.org/search/satb2)。类似的方法用于鉴定大肠/结肠的其它标记物。
公共RNA-seq登录号。从公共数据库E-MTAB-1733下载成人小肠和大肠RNA-seq数据。这些数据集代表整个器官组织，其包括上皮和肌肉层。小肠样品的登录号：ERR315344、ERR315381、ERR315409、ERR315442、ERR315461。大肠样品的登录号：ERR315348、ERR315357、ERR315484。对于图9B，从https://qithub.com/hilldr/Finkbeiner StemCellReports2015下载处理的FPKM数据。这些数据包括来自E-MTAB-1733的上文所列的成人十二指肠(ERS326992、ERS326976)和小肠样品以及来自GSE18927的人类胎儿肠(也是整个器官)样品。人类胎儿小肠的登录号是GSM1059508、GSM1059521、GSM1059486、GSM1059507、GSM1059517、GSM1220519。对于图9C，数据从GEO登录号GSE66749平台GLP5175获得。使用以下样品：GSM1385160、GSM1385161、GSM1385162、GSM1385163、GSM1385164、GSM1385165、GSM1385166、GSM1385167、GSM1385168、GSM1385169、GSM1385170、GSM1385171、GSM1614646、GSM1614646。使用GEO2R“轮廓图”功能并通过其ID号(分别为3086100和2594089)搜索GATA4和SATB2来确定样品值。
RNA-seq序列组装丰度估计。使用Illumina HiSeq2500平台，由辛辛那提儿童医院DNA测序核心进行RNA文库构建和RNA测序。通过使用FastQC版本0.10.1http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc分析每个样品的FASTQ数据来评估Illumina测序运行的质量，以鉴定可能指示质量问题的数据的特征(例如，低质量分数、过度代表的序列、不适当的GC含量等)。QC分析未发现重大问题。申请人使用软件包Tuxedo Suite进行比对、差异表达分析和后分析诊断。简言之，申请人使用TopHat版本2.0.13和Bowtie版本2.2.5(Langmead等人，2009)对参考转录组(UCSC hg19)进行比对读数。申请人使用默认参数设置进行比对，但“—b2-非常-灵敏(—b2-very-sensitive)”除外，以最大化读数比对的准确性，以及“—非-覆盖-搜索(—no-coverage-search)”和“—非-新颖-juncs(—no-novel-juncs)”将读数映射限制为已知的转录本。Cufflinks 2.2.1版(Trapnell等，2012)用于RNA丰度估计。UCSC hgl9.fa用作参考基因组序列，并且UCSC hgl9.gtf用于转录组注释。申请人在Cufflinks中应用以下参数：“—多次-读数校正(—multi-read-correct)”以调整映射在多个基因座中的读数的表达计算，并使用“—相容-命中-范数(—compatible-hits-norm)”和“—上-四分点—范数(—upper-quartile—norm)”进行标准化表达值。使用CuffNorm函数生成标准化的FPKM表。使用64位Debian Linux稳定版本7.10(“Wheezy”)平台进行RNA序列组装和转录分析。
差异表达分析。
所有图和统计分析均在R版本3.3.1(2016-06-21)中进行。使用R包‘ggplot2’(Ginestet，2011)生成图。用R包‘SeqRetriever’‘SeqRetriever’版本0.6https://github.com/hilldr/SeqRetrieyer完成对Cufflinks输出的差异表达分析和统计测试。超几何平均值测试使用R包‘GeneOverlap’http://shenlab-sinai.cithub.io/shenlab-sinai/，用于评估组间共享基因表达特征的相对富集。完整的RNA-seq FASTQ处理流水线和分析脚本可在https://qithub.com/hilldr/Munera2016获得。
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除非另有说明，否则所有百分比和比率均按重量计算。除非另有说明，否则所有百分比和比率均基于总组合物计算。
应理解，在整个说明书中给出的每个最大数值限制包括每个较低的数值限制，如同这类较低的数值限制在本文中明确写出一样。在整个说明书中给出的每个最小数值限制将包括每个较高的数值限制，如同这类较高的数值限制在本文中明确写出一样。在整个本说明书中给出的每个数值范围将包括落入这类较宽的数值范围内的每个较窄的数值范围，如同这类较窄的数值范围都在本文中明确写出一样。
本文公开的尺寸和值不应理解为严格限于所述的精确数值。相反，除非另有说明，否则每个这类尺寸旨在表示所述值和围绕所述值的功能等效范围。例如，公开为“20mm”的尺寸旨在表示“约20mm”。
除非明确排除或以其它方式限制，否则本文引用的每个文件，包括任何交叉引用的或相关的专利或申请，其全部内容通过引用的方式并入本文。任何文件的引用并不是承认它是关于本文公开或要求保护的任何发明的现有技术或者单独或与任何其它参考文献的任何组合，教导、暗示或公开任何这类发明。此外，如果本文件中术语的任何含义或定义与通过引用并入的文件中的相同术语的任何含义或定义相冲突，则以本文件中赋予该术语的含义或定义为准。
虽然已经说明和描述了本发明的特定实施例，但是对于本领域技术人类员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种其它变化和修改。因此，旨在在所附权利要求中覆盖在本发明范围内的所有这类变化和修改。

Claims (18)

1.一种诱导人类结肠类器官形成的方法，其包含以下步骤：
a.使定形内胚层(DE)与FGF信号传导途径激活物和WNT信号传导途径激活物(例如，CHIRON/GSK2抑制剂)接触持续足以使所述DE形成中-后肠球状体的时间段；
b.使步骤(a)的所述中-后肠球状体与BMP激活物和EGF信号传导途径激活物接触持续足以形成所述人类结肠类器官的时间段，其中所述人类结肠类器官表达SATB2。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DE源自选自以下的前体细胞：胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、诱导多能干细胞、中胚层细胞、定形内胚层细胞、后内胚层细胞、后肠细胞或其组合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述FGF信号传导途径激活物选自小分子FGF信号传导途径激活物、基于蛋白质的FGF信号传导途径激活物、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23或其组合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述WNT信号传导途径激活物选自蛋白质Wnt信号传导途径激活物、小分子Wnt信号传导途径激活物，优选氯化锂；2-氨基-4,6-二取代嘧啶(杂)芳基嘧啶；IQ1；QS11；NSC668036；DCA β-连环蛋白；2-氨基-4-[3,4-(亚甲二氧基)-苄基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、GSK3抑制剂，优选CHIRON，或其组合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述BMP激活物选自BMP2、BMP4、BMP7、BMP9、激活BMP途径的小分子、激活BMP途径的蛋白质Noggin、Dorsomorphin、LDN189、DMH-1、ventromophin及其组合。
6.据前述权利要求中任一项所述的方法，其中足以使所述DE形成中-后肠球状体的所述时间段通过步骤(a)的所述中-后肠球状体的CDX2表达来确定。
7.据前述权利要求中任一项所述的方法，其中足以使所述中-后肠球状体形成所述人类结肠类器官的所述时间段通过所述人类结肠类器官的细胞的SATB2和CDX2表达。
8.据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HCO的特征在于存在结肠肠内分泌细胞(EEC)。
9.据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HCO的特征在于存在隐窝并且基本上不含绒毛。
10.据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HCO包含结肠特异性杯状细胞。
11.据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HCO基本上不含潘氏(Paneth)细胞。
12.据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HCO分泌结肠特异性激素INSL5。
13.一种HCO，其根据权利要求1至7中任一项所述的方法获得。
14.一种形成结肠组织的方法，其包含在哺乳动物，优选啮齿动物，优选免疫受损的啮齿动物，优选免疫受损的小鼠的肾囊下植入根据权利要求1至7中任一项所述的HCO。
15.一种确定潜在治疗剂对选自结肠炎、结肠癌、息肉综合征和/或肠易激综合征的疾病的功效和/或毒性的方法，其包含使所述潜在治疗剂与根据权利要求1至12中任一项所述的HCO接触持续足以确定所述潜在治疗剂的功效和/或毒性的时间段。
16.一种免疫受损的啮齿动物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的HCO。
17.一种肠类结肠(intestinal colonoid)，其源自根据前述权利要求中任一项所述的HCO。
18.根据权利要求17的所述肠类器官，其中所述肠类器官不含免疫功能、神经分布、血管、绒毛和潘氏细胞中的一种或多种。
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