CN108472354A - 呼吸道合胞病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及呼吸道合胞病毒(RSV)核糖核酸(RNA)疫苗，以及使用所述疫苗的方法和包含所述疫苗的组合物。

Description

呼吸道合胞病毒疫苗
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2015年10月22日提交的美国临时申请第62/245,208号、2015年10月28日提交的美国临时申请第62/247,563号和2015年10月29日提交的美国临时申请第62/248,250号的权益，各临时申请以引用方式整体并入本文中。本申请还根据35U.S.C.§119(e)要求2015年10月22日提交的美国临时申请第62/245,031号的权益，该临时申请以引用方式整体并入本文中。
背景技术
人呼吸道合胞病毒(RSV)是肺炎病毒亚科(Pneumovirinae)和副粘病毒科(Paramyxoviridae)的一种反义单链RNA病毒。在成年人中的症状通常类似鼻窦感染或普通感冒，但感染也可能无症状。在老年成年人(例如，＞60岁)中，RSV感染可能会发展成毛细支气管炎或肺炎。在儿童中的症状往往更严重，包括毛细支气管炎和肺炎。据估计在美国，大多数儿童在三岁时感染RSV。RSV病毒体由包含与核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)结合的病毒RNA的内部核衣壳组成。核衣壳由基质蛋白(M)包围且由合并有病毒融合(F)蛋白和附着(G)蛋白以及小疏水性蛋白(SH)的脂质双层囊封。病毒基因组还编码抑制I型干扰素活性的两种非结构蛋白(NS1和NS2)以及M-2蛋白。
脱氧核糖核酸(DNA)疫苗接种是一种用于刺激对于外来抗原(诸如RSV抗原)的体液和细胞免疫反应的技术。向活宿主直接注入经遗传改造的DNA(例如，裸质粒DNA)导致少量宿主细胞直接产生抗原，从而产生保护性免疫反应。然而，利用此技术产生潜在问题，包括可能发生插入诱变，此可导致致癌基因活化或对肿瘤抑制基因的抑制作用。
发明内容
本公开的RNA疫苗可用于诱发针对RSV的平衡免疫反应(包括细胞免疫性与体液免疫性二者)，而无例如插入诱变可能性的风险。
RNA(例如，mRNA)疫苗根据感染的发病率或未满足医疗需求的程度或水平而可用于不同情境中。RNA疫苗可用于治疗和/或预防RSV的各种基因型、毒株和分离株的感染。如本文所提供的RNA疫苗的优越特性在于其与市售抗病毒治疗处理相比产生大得多的抗体效价且更早地产生反应。尽管不希望受理论束缚，但认为本公开的RNA疫苗被更好地设计成在RNA疫苗指派天然细胞机制时在翻译后产生适当的蛋白构型。与离体制造且可能触发不希望的细胞反应的传统疫苗不同，如本文所提供的RNA疫苗以更自然的方式提供给细胞系统。
本公开的一些实施方案提供呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包括(i)至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码至少一种RSV抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能够引起针对RSV的免疫反应的免疫原性片段)的开放阅读框；和(ii)药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸具有至少一个化学修饰。
在一些实施方案中，抗原性多肽为糖蛋白G或其免疫原性片段。
在一些实施方案中，抗原性多肽为糖蛋白F或其免疫原性片段。
在一些实施方案中，至少一种抗原性多肽为糖蛋白F且至少一种抗原性多肽选自G、M、N、P、L、SH、M2、NS1和NS2。
在一些实施方案中，至少一种抗原性多肽为糖蛋白F且至少两种抗原性多肽选自G、M、N、P、L、SH、M2、NS1和NS2。
在一些实施方案中，RNA疫苗还包含佐剂。
在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由至少一种如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述的核酸序列，或与如SEQ IDNO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述的核酸序列具有至少80％同一性的同源物编码。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由至少一种如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述的核酸序列，或与如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述的核酸序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.8％或99.9％)同一性的同源物编码。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述的核酸序列的至少一个片段(例如，具有至少一种抗原性序列或至少一个表位的片段)编码。
在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸包含至少一种如SEQ ID NO：260至280中的任一个所述的核酸序列，或与如SEQ ID NO：260至280中的任一个所述的核酸序列具有至少80％同一性的同源物。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸包含至少一种如SEQID NO：260至280中的任一个所述的核酸序列，或与如SEQ ID NO：260至280中的任一个所述的核酸序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.8％或99.9％)同一性的同源物。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸包含如SEQID NO：260至280中的任一个所述的核酸序列的至少一个片段(例如，具有至少一种抗原性序列或至少一个表位的片段)。
在一些实施方案中，RSV抗原性多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列，或为所述氨基酸序列的片段，或为与所述氨基酸序列具有至少80％(例如，85％、90％、95％、98％、99％)同一性的同源物。
在一些实施方案中，RSV抗原性多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245所述的氨基酸序列，或为所述氨基酸序列的片段，或为与所述氨基酸序列具有至少80％(例如，85％、90％、95％、98％、99％)同一性的同源物。
在一些实施方案中，至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码与本公开的氨基酸序列具有至少90％同一性且具有膜融合活性的抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码与本公开的氨基酸序列具有至少95％同一性且具有膜融合活性的抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码与本公开的氨基酸序列具有至少96％同一性且具有膜融合活性的抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码与本公开的氨基酸序列具有至少97％同一性且具有膜融合活性的抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码与本公开的氨基酸序列具有至少98％同一性且具有膜融合活性的抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码与本公开的氨基酸序列具有至少99％同一性且具有膜融合活性的抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码与本公开的氨基酸序列具有95至99％同一性且具有膜融合活性的抗原性多肽。
在一些实施方案中，至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码具有本公开的氨基酸序列的抗原性多肽且为密码子优化的mRNA。
在一些实施方案中，至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码具有本公开的氨基酸序列的抗原性多肽且与(相应)野生型mRNA序列具有小于80％同一性。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码具有本公开的氨基酸序列的抗原性多肽且与野生型mRNA序列具有小于75％、85％或95％同一性。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码具有本公开的氨基酸序列的抗原性多肽且与野生型mRNA序列具有30至80％、40至80％、50至80％、60至80％、70至80％、75至80％或78至80％同一性。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码具有本公开的氨基酸序列的抗原性多肽且与野生型mRNA序列具有30至85％、40至85％、50至85％、60至85％、70至85％、75至85％或80至85％同一性。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码具有本公开的氨基酸序列的抗原性多肽且与野生型mRNA序列具有30至90％、40至90％、50至90％、60至90％、70至90％、75至90％、80至90％或85至90％同一性。
在一些实施方案中，至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸由与本公开的核酸序列具有至少90％同一性的核酸(例如，DNA)编码。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由与本公开的核酸序列具有至少95％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由与本公开的核酸序列具有至少96％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由与本公开的核酸序列具有至少97％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由与本公开的核酸序列具有至少98％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由与本公开的核酸序列具有至少99％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由与本公开的核酸序列具有95至99％同一性的核酸编码。
在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸由具有本公开的序列的核酸编码且与野生型mRNA序列具有小于80％同一性。在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸由具有本公开的序列的核酸编码且与野生型mRNA序列具有小于75％、85％或95％同一性。在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸由具有本公开的序列的核酸编码且与野生型mRNA序列具有小于30至80％、40至80％、50至80％、60至80％、70至80％、75至80％或78至80％同一性。在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸由具有本公开的序列的核酸编码且与野生型mRNA序列具有小于30至85％、40至85％、50至85％、60至85％、70至85％、75至85％或80至85％同一性。在一些实施方案中，至少一种mRNA多核苷酸由具有本公开的序列的核酸编码且与野生型mRNA序列具有小于30至90％、40至90％、50至90％、60至90％、70至90％、75至90％、80至90％或85至90％同一性。
在一些实施方案中，至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码具有本公开的氨基酸序列且与野生型mRNA序列具有至少80％同一性的抗原性多肽，但不包括野生型mRNA序列。
在一些实施方案中，RSV疫苗包括至少一种具有编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，所述RNA多核苷酸具有至少一个化学修饰。
在一些实施方案中，RSV疫苗包括至少一种具有编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，所述RNA多核苷酸具有至少一个化学修饰和至少一个5′端帽，其中RSV疫苗是在脂质纳米粒子中配制。
在一些实施方案中，5′端帽为7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp。
在一些实施方案中，至少一个化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4′-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2′-O-甲基尿苷。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含阳离子型脂质、经PEG修饰的脂质、固醇和非阳离子型脂质。在一些实施方案中，阳离子型脂质为可电离的阳离子型脂质且非阳离子型脂质为中性脂质，且固醇为胆固醇。在一些实施方案中，阳离子型脂质选自由以下组成的组：2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)。
在一些实施方案中，脂质为
在一些实施方案中，脂质为
本公开的一些实施方案提供一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包括至少一种具有编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸，其中所述开放阅读框中至少80％的尿嘧啶具有化学修饰，任选地其中所述RSV疫苗是在脂质纳米粒子中配制。
在一些实施方案中，开放阅读框中100％的尿嘧啶具有化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰位于尿嘧啶的5位。在一些实施方案中，化学修饰为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，化学修饰为位于尿嘧啶的5位的N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，开放阅读框中100％的尿嘧啶经修饰以包括N1-甲基假尿苷。
本公开的一些实施方案提供在受试者中诱发抗原特异性免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用有效产生抗原特异性免疫反应的量的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。
在一些实施方案中，抗原特异性免疫反应包括T细胞反应或B细胞反应或两者。
在一些实施方案中，一种产生抗原特异性免疫反应的方法涉及单次施用RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用加强剂量的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。根据本发明的加强疫苗可包含本文所公开的任何RSV RNA(例如，mRNA)疫苗且可与初始施用的RSV RNA疫苗相同。在一些实施方案中，每年在每个RSV季节施用相同的RSV RNA疫苗。
在一些实施方案中，通过皮内、鼻内或肌内注射向受试者施用RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。在一些实施方案中，通过肌内注射向受试者施用RSV RNA疫苗。
本文还提供用于在受试者中诱发抗原特异性免疫反应的方法中的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗，所述方法包括向受试者施用有效产生抗原特异性免疫反应的量的所述RSV疫苗。
本文还提供RSV RNA(例如，mRNA)疫苗在制造用于在受试者中诱发抗原特异性免疫反应的方法中的药物中的用途，所述方法包括向所述受试者施用有效产生抗原特异性免疫反应的量的所述RSV疫苗。
本公开的一些方面提供以在受试者中产生抗原特异性免疫反应的有效量来配制的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。
本公开的其他方面提供在受试者中诱发抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用在受试者中产生抗原特异性免疫反应的有效量的本文所述的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。
在一些实施方案中，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加至少1log。在一些实施方案中，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加1至3log。
在一些实施方案中，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加至少2倍。在一些实施方案中，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加至少5倍。在一些实施方案中，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加至少10倍。在一些实施方案中，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加2至10倍。
在一些实施方案中，对照物为抗-RSV抗原性多肽在未经施用RSV疫苗的受试者中产生的抗体效价。在一些实施方案中，对照物为抗-RSV抗原性多肽在经施用减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗的受试者中产生的抗体效价。在一些实施方案中，对照物为抗-RSV抗原性多肽在经施用重组或纯化的RSV蛋白疫苗的受试者中产生的抗体效价。在一些实施方案中，对照物为抗-RSV抗原性多肽在经施用RSV类病毒粒子(VLP)疫苗的受试者中产生的抗体效价。
在一些实施方案中，有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少2倍的剂量，其中抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或纯化的RSV蛋白疫苗、减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
在一些实施方案中，有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少4倍的剂量，其中抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或纯化的RSV蛋白疫苗、减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
在一些实施方案中，有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少10倍的剂量，其中抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或纯化的RSV蛋白疫苗、减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSVVLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
在一些实施方案中，有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少100倍的剂量，其中抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或纯化的RSV蛋白疫苗、减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSVVLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
在一些实施方案中，有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少1000倍的剂量，其中抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或纯化的RSV蛋白疫苗、减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSVVLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
在一些实施方案中，有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少2倍至1000倍的剂量，其中抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或纯化的RSV蛋白疫苗、减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSVVLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
在一些实施方案中，有效量为25μg至1000μg或50μg至1000μg或25至200μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为50μg、100μg、200μg、400μg、800μg或1000μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为总计两次向受试者施用的25μg的剂量。在一些实施方案中，有效量为总计两次向受试者施用的50μg的剂量。在一些实施方案中，有效量为总计两次向受试者施用的100μg的剂量。在一些实施方案中，有效量为总计两次向受试者施用的200μg的剂量。在一些实施方案中，有效量为总计两次向受试者施用的400μg的剂量。在一些实施方案中，有效量为总计两次向受试者施用的500μg的剂量。
在一些实施方案中，向受试者施用的有效量为50μg至1000μg的总剂量(RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的总剂量)。
在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗针对RSV的功效(或有效性)大于60％。
疫苗功效可使用标准分析来评估(参见例如，Weinberg等人，J Infect Dis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)。举例来说，疫苗功效可通过双盲、随机化、临床对照试验来测量。疫苗功效可表示为在未接种疫苗(ARU)与接种疫苗(ARV)研究小组之间疾病发作率(AR)的按比例降低且可使用以下公式由来自接种疫苗组的疾病相对风险(RR)计算：
功效＝(ARU-ARV)/ARU×100；和
功效＝(1-RR)×100。
同样，疫苗有效性可使用标准分析来评估(参见例如，Weinberg等人，J InfectDis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)。疫苗有效性为对在群体中疫苗(其可能已经证明具有高疫苗功效)如何减少疾病的评估。此测量可评估在自然野外条件下而非在对照临床试验中疫苗接种计划而不仅仅疫苗本身的益处与不利影响的净平衡。疫苗有效性与疫苗功效(效力)成正比，但还受群体中的目标组经免疫接种的程度如何，以及受影响住院治疗、门诊或成本的‘现实世界’结果的其他非疫苗相关因素影响。举例来说，可使用回顾性病例对照分析，其中在一组感染病例和适当对照物中比较疫苗接种比率。疫苗有效性可使用用于尽管进行疫苗接种仍发展感染的比值比(OR)表示为比率差：
有效性＝(1-OR)×100。
在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗针对RSV的功效(或有效性)大于65％。在一些实施方案中，疫苗针对RSV的功效(或有效性)大于70％。在一些实施方案中，疫苗针对RSV的功效(或有效性)大于75％。在一些实施方案中，疫苗针对RSV的功效(或有效性)大于80％。在一些实施方案中，疫苗针对RSV的功效(或有效性)大于85％。在一些实施方案中，疫苗针对RSV的功效(或有效性)大于90％。
在一些实施方案中，疫苗使受试者对RSV免疫长达1年(例如用于单个RSV季节)。在一些实施方案中，疫苗使受试者对RSV免疫长达2年。在一些实施方案中，疫苗使受试者对RSV免疫2年以上。在一些实施方案中，疫苗使受试者对RSV免疫3年以上。在一些实施方案中，疫苗使受试者对RSV免疫4年以上。在一些实施方案中，疫苗使受试者对RSV免疫5至10年。
在一些实施方案中，经施用RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的受试者为约5岁或5岁以下，介于约1岁与约5岁之间(例如，约1、2、3、4、5或6岁)，介于约6个月与约1岁之间(例如，约6、7、8、9、10、11或12个月)，为约6个月或6个月以下，或为约12个月或12个月以下(例如，12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2个月或1个月)。在一些实施方案中，受试者为足月出生(例如，约37至42周)。在一些实施方案中，受试者在妊娠约36周或更早时(例如，约36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26或25周)早产，受试者在妊娠约32周或更早时早产，或受试者在妊娠约32周与约36周之间早产。
在一些实施方案中，当施用RSV RNA(例如，mRNA)疫苗时，受试者为孕妇(例如，在前期、中期或后期)。RSV引起下呼吸道感染，主要在婴儿和幼儿中。三分之一的RSV相关死亡发生在生命的第一年中，其中这些死亡中的99％发生在资源匮乏的国家。几乎所有儿童在其第二个生日之前感染病毒在美国很普遍。因此，本公开提供用于产妇免疫以改善针对RSV的保护作用的母婴传播的RSV疫苗。
在一些实施方案中，受试者患有慢性肺病(例如，慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘)。COPD的两种形式包括慢性支气管炎，其涉及长期咳嗽并伴有粘液；以及肺气肿，其涉及随时间对肺部的损伤。因此，经施用RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的受试者可能患有慢性支气管炎或肺气肿。
在一些实施方案中，受试者已暴露于RSV，感染(具有)RSV，或存在感染RSV的风险。
在一些实施方案中，受试者免疫受损(具有受损的免疫系统，例如具有免疫病症或自身免疫病症)。
在一些实施方案中，受试者为约60岁、约70岁或70岁以上(例如，约60、65、70、75、80、85或90岁)的老年受试者。
在一些实施方案中，受试者为介于约20岁与约50岁之间(例如，约20、25、30、35、40、45或50岁)的年轻成年人。
本公开的一些方面提供呼吸道合胞病毒(RSV)RNA(例如，mRNA)疫苗，其含有连接至RSV抗原性多肽的信号肽。因此，在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗含有至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码连接至RSV抗原性肽的信号肽的开放阅读框。本文还提供编码本文所公开的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的核酸。
在一些实施方案中，RSV抗原性肽为RSV附着蛋白(G)或其免疫原性片段。在一些实施方案中，RSV抗原性肽为RSV融合(F)糖蛋白或其免疫原性片段。在一些实施方案中，RSV抗原性肽为核蛋白(N)或其免疫原性片段。在一些实施方案中，RSV抗原性肽为磷蛋白(P)或其免疫原性片段。在一些实施方案中，RSV抗原性肽为大聚合酶蛋白(L)或其免疫原性片段。在一些实施方案中，RSV抗原性肽为基质蛋白(M)或其免疫原性片段。在一些实施方案中，RSV抗原性肽为小疏水性蛋白(SH)或其免疫原性片段。在一些实施方案中，RSV抗原性肽为非结构蛋白1(NS1)或其免疫原性片段。在一些实施方案中，RSV抗原性肽为非结构蛋白2(NS2)或其免疫原性片段。
在一些实施方案中，信号肽为IgE信号肽。在一些实施方案中，信号肽为IgE HC(Ig重链ε-1)信号肽。在一些实施方案中，信号肽具有序列MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO：281)。在一些实施方案中，信号肽为IgGκ信号肽。在一些实施方案中，信号肽具有序列METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：282)。在一些实施方案中，信号肽由序列TGGAGACTCCCGCTCAGCTGCTGTTTTTGCTCCTCCTATGGCTGCCGGATACCACCGGC(SEQ ID NO：287)或AUGGAGACUCCCGCUCAGCUGCUGUUUUUGCUCCUCCUAUGGCUGCCGGAUACCACCGGC(SEQ ID NO：288)编码。在一些实施方案中，信号肽选自：日本脑炎PRM信号序列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS；SEQ ID NO：283)、VSVg蛋白信号序列(MKCLLYLAFLFIGVNCA；SEQ ID NO：284)和日本脑炎JEV信号序列(MWLVSLAIVTACAGA；SEQ ID NO：285)。在一些实施方案中，信号肽为MELLILKANAITTILTAVTFC(SEQ ID NO：289)。
本文还提供呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，所述疫苗包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码膜结合RSV F蛋白、膜结合DS-CaV1(稳定化的融合前RSV F蛋白)或膜结合RSV F蛋白与膜结合DS-Cav1的组合的开放阅读框；和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，RNA多核苷酸包含SEQ ID NO：5的序列和/或SEQ ID NO：7的序列。
在一些实施方案中，有效量的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗(例如，单一剂量的RSV疫苗)导致针对RSV的血清中和抗体相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加2倍至200倍(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200倍)。在一些实施方案中，单一剂量的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗导致针对RSV的血清中和抗体相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加约5倍、50倍或150倍。在一些实施方案中，单一剂量的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗导致针对RSV的血清中和抗体相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加约2倍至10倍或约40至60倍。
在一些实施方案中，血清中和抗体为针对RSV A和/或RSV B。
在一些实施方案中，RSV疫苗是在MC3脂质纳米粒子中配制(参见例如，美国公开第2013/0245107 A1号和国际公开第WO 2010/054401号)。
本文还提供在受试者中诱发抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用在受试者中产生抗原特异性免疫反应的有效量的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗，所述疫苗包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码膜结合RSV F蛋白、膜结合DS-Cav1(稳定化的融合前RSV F蛋白)或膜结合RSV F蛋白与膜结合DS-Cav1的组合的开放阅读框；和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用加强剂量的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。在一些实施方案中，所述方法还包括施用第二加强剂量的RSV疫苗。
在一些实施方案中，当与鞭毛蛋白佐剂组合时，尤其一种或多种编码抗原的mRNA与编码鞭毛蛋白的mRNA组合时，RNA疫苗RNA(例如，mRNA)的功效可显著增强。
与鞭毛蛋白佐剂(例如，mRNA编码的鞭毛蛋白佐剂)组合的RNA(例如，mRNA)疫苗的优越特性在于其与市售疫苗制剂相比可产生更大的抗体效价且更早地产生反应。尽管不希望受理论束缚，但认为RNA疫苗(例如，mRNA多核苷酸)被更好地设计成在RNA(例如，mRNA)疫苗指派天然细胞机制时对于抗原与佐剂两者而言在翻译后产生适当的蛋白构型。与离体制造且可能触发不希望的细胞反应的传统疫苗不同，RNA(例如，mRNA)疫苗以更自然的方式提供给细胞系统。
本公开的一些实施方案提供RNA(例如，mRNA)疫苗，其包括至少一种具有编码至少一种抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能够诱发针对原性多肽的免疫反应的免疫原性片段)的开放阅读框的RNA(例如，mRNA)多核苷酸和至少一种具有编码鞭毛蛋白佐剂的开放阅读框的RNA(例如，mRNA多核苷酸)。
在一些实施方案中，至少一种鞭毛蛋白多肽(例如，经编码的鞭毛蛋白多肽)为鞭毛蛋白。在一些实施方案中，至少一种鞭毛蛋白多肽(例如，经编码的鞭毛蛋白多肽)为免疫原性鞭毛蛋白片段。在一些实施方案中，至少一种鞭毛蛋白多肽和至少一种抗原性多肽由单一RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码。在其他实施方案中，至少一种鞭毛蛋白多肽和至少一种抗原性多肽各自由不同RNA多核苷酸编码。
在一些实施方案中，至少一种鞭毛蛋白多肽与具有SEQ ID NO：173至175的序列的鞭毛蛋白多肽具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗经化学修饰。在其他实施方案中，核酸疫苗未经修饰。
其他方面提供对受试者进行疫苗接种的组合物和方法，所述方法包括向所述受试者施用核酸疫苗，所述疫苗包含一种或多种具有编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中所述RNA多核苷酸不包括稳定化元件，且其中佐剂不与所述疫苗共配制或共施用。
在其他方面，本发明是对受试者进行疫苗接种的组合物或方法，所述方法包括向所述受试者施用核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中向所述受试者施用剂量介于10μg/kg与400μg/kg之间的所述核酸疫苗。在一些实施方案中，所述RNA多核苷酸的剂量为每剂量1至5μg、5至10μg、10至15μg、15至20μg、10至25μg、20至25μg、20至50μg、30至50μg、40至50μg、40至60μg、60至80μg、60至100μg、50至100μg、80至120μg、40至120μg、40至150μg、50至150μg、50至200μg、80至200μg、100至200μg、120至250μg、150至250μg、180至280μg、200至300μg、50至300μg、80至300μg、100至300μg、40至300μg、50至350μg、100至350μg、200至350μg、300至350μg、320至400μg、40至380μg、40至100μg、100至400μg、200至400μg或300至400μg。在一些实施方案中，通过皮内或肌内注射向所述受试者施用所述核酸疫苗。在一些实施方案中，在第0天向所述受试者施用所述核酸疫苗。在一些实施方案中，在第21天向所述受试者施用第二剂量的所述核酸疫苗。
在一些实施方案中，在向受试者施用的核酸疫苗中包括剂量为25微克的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，在向受试者施用的核酸疫苗中包括剂量为100微克的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，在向受试者施用的核酸疫苗中包括剂量为50微克的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，在向受试者施用的核酸疫苗中包括剂量为75微克的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，在向受试者施用的核酸疫苗中包括剂量为150微克的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，在向受试者施用的核酸疫苗中包括剂量为400微克的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，在向受试者施用的核酸疫苗中包括剂量为200微克的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，RNA多核苷酸在局部淋巴结中以相较于远端淋巴结高100倍的水平聚积。在其他实施方案中，核酸疫苗经化学修饰，而在其他实施方案中，核酸疫苗未经化学修饰。
本发明的多个方面提供包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，其中所述RNA多核苷酸不包括稳定化元件；以及药学上可接受的载体或赋形剂，其中在所述疫苗中不包含佐剂。在一些实施方案中，稳定化元件是组蛋白茎环。在一些实施方案中，稳定化元件是相对于野生型序列具有增加的GC含量的核酸序列。
本发明的多个方面提供包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，其中所述RNA多核苷酸存在于用于体内施用给宿主的制剂中，其赋予优于对于可接受百分比的人受试者的第一抗原的血清保护标准。在一些实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的抗体效价是中和抗体效价。在一些实施方案中，中和抗体效价大于蛋白疫苗。在其他实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的中和抗体效价大于佐剂化蛋白疫苗。在其他实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的中和抗体效价为1,000至10,000、1,200至10,000、1,400至10,000、1,500至10,000、1,000至5,000、1,000至4,000、1,800至10,000、2,000至10,000、2,000至5,000、2,000至3,000、2,000至4,000、3,000至5,000、3,000至4,000或2,000至2,500。中和效价通常表示为实现斑块数量减少50％所需的最高血清稀释度。
还提供包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，其中所述RNA多核苷酸存在于用于体内施用给宿主的制剂中，用于引发比由具有稳定化元件或与佐剂一起配制并编码所述第一抗原性多肽的mRNA疫苗引发的抗体效价更持久的高抗体效价。在一些实施方案中，配制RNA多核苷酸以在单次施用后一周内产生中和抗体。在一些实施方案中，佐剂选自阳离子肽和免疫刺激性核酸。在一些实施方案中，阳离子肽是鱼精蛋白。
多个方面提供包含一种或多种RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述RNA多核苷酸具有包含至少一个化学修饰或任选地没有核苷酸修饰的开放阅读框，所述开放阅读框编码第一抗原性多肽，其中所述RNA多核苷酸存在于用于体内施用给宿主的制剂中，使得宿主中的抗原表达水平显著超过具有稳定化元件或与佐剂一起配制并编码第一抗原性多肽的mRNA疫苗产生的抗原表达水平。
其他方面提供包含一种或多种RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述RNA多核苷酸具有包含至少一个化学修饰或任选地没有核苷酸修饰的开放阅读框，所述开放阅读框编码第一抗原性多肽，其中所述疫苗比未经修饰的mRNA疫苗产生等同抗体效价所需的RNA多核苷酸少至少10倍。在一些实施方案中，RNA多核苷酸以25至100微克的剂量存在。
本发明的多个方面还提供使用疫苗的单位，其包含10μg至400μg的一种或多种RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸具有包含至少一个化学修饰或任选地没有核苷酸修饰的开放阅读框，所述开放阅读框编码第一抗原性多肽；和药学上可接受的载体或赋形剂，所述疫苗被配制成递送给人类受试者。在一些实施方案中，疫苗还包含阳离子型脂质纳米粒子。
本发明的多个方面提供在个体或个体群体中产生、维持或恢复呼吸道病毒株的抗原性记忆的方法，所述方法包括向所述个体或群体施用抗原性记忆加强核酸疫苗，其包含(a)至少一种RNA多核苷酸，所述多核苷酸包含至少一个化学修饰或任选地没有核苷酸修饰以及两个或更多个密码子优化的开放阅读框，所述开放阅读框编码一组参考抗原性多肽，和(b)任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，疫苗经由选自由肌内施用、皮内施用和皮下施用组成的组的途径施用于个体。在一些实施方案中，施用步骤包括使受试者的肌肉组织与适于注射组合物的装置接触。在一些实施方案中，施用步骤包括联合电穿孔使受试者的肌肉组织与适用于注射所述组合物的装置接触。
本发明的多个方面提供对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括以对受试者进行疫苗接种的有效量向受试者施用单次剂量介于25μg/kg与400μg/kg之间的核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框。
其他方面提供包含一种或多种RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述RNA多核苷酸具有包含至少一个化学修饰的开放阅读框，所述开放阅读框编码第一抗原性多肽，其中所述疫苗比未经修饰的mRNA疫苗产生等同抗体效价所需的RNA多核苷酸少至少10倍。在一些实施方案中，RNA多核苷酸以25至100微克的剂量存在。
其他方面提供包含LNP配制的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述RNA多核苷酸具有不包含核苷酸修饰的开放阅读框(未经修饰)，所述开放阅读框编码第一抗原性多肽，其中所述疫苗比未配制在LNP中的未经修饰的mRNA疫苗产生等同抗体效价所需的RNA多核苷酸少至少10倍。在一些实施方案中，RNA多核苷酸以25至100微克的剂量存在。
实施例中给出的数据表明使用本发明的制剂显著增强免疫反应。经化学修饰的和未经化学修饰的RNA疫苗都可用于本发明。令人惊讶的是，与现有技术报道相比，优选使用在载体中配制的未经化学修饰的mRNA来生产疫苗，本文对其进行了说明，经化学修饰的mRNA-LNP疫苗需要比未经修饰的mRNA低得多的有效mRNA剂量，即当配制在除LNP以外的载体中时比未经修饰的mRNA低10倍。本发明的经化学修饰和未经化学修饰的RNA疫苗都比配制在不同脂质载体中的mRNA疫苗产生更好的免疫反应。
在其他方面，本发明涵盖治疗60岁或60岁以上的老年受试者的方法，所述方法包括以对受试者进行疫苗接种的有效量向受试者施用包含一种或多种RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述RNA多核苷酸具有编码呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框。
在其他方面，本发明涵盖治疗17岁或更年轻的年轻受试者的方法，所述方法包括以对受试者进行疫苗接种的有效量向受试者施用包含一种或多种RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述RNA多核苷酸具有编码呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框。
在其他方面，本发明涵盖治疗成年受试者的方法，所述方法包括以对受试者进行疫苗接种的有效量向受试者施用包含一种或多种RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述RNA多核苷酸具有编码呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框。
在一些方面，本发明是用包含至少两种编码呼吸道抗原的核酸序列的组合疫苗对受试者进行疫苗接种的方法，其中疫苗的剂量是组合治疗剂量，其中编码抗原的每种个别核酸的剂量是亚治疗剂量。在一些实施方案中，组合剂量是施用给受试者的核酸疫苗中的25微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，组合剂量是施用给受试者的核酸疫苗中的100微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，组合剂量是施用给受试者的核酸疫苗中的50微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，组合剂量是施用给受试者的核酸疫苗中的75微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，组合剂量是施用给受试者的核酸疫苗中的150微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，组合剂量是施用给受试者的核酸疫苗中的400微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，编码抗原的每种个别核酸的亚治疗剂量是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20微克。在其他实施方案中，核酸疫苗经化学修饰，而在其他实施方案中，核酸疫苗未经化学修饰。
在一些实施例中，RNA多核苷酸是SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259中的一个，且包括至少一个化学修饰。在其他实施例中，RNA多核苷酸是SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259中的一个且不包括任何核苷酸修饰，或未经修饰。在其他实施例中，至少一种RNA多核苷酸编码SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245中的任一个的抗原性蛋白且包括至少一个化学修饰。在其他实施例中，RNA多核苷酸编码SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245中的任一个的抗原性蛋白且不包括任何核苷酸修饰，或未经修饰。
本发明的各实施方案的详情是在以下描述中陈述。本发明的其他特征、目标和优势将从描述和图式以及权利要求书显而易知。
附图说明
如在不同视图中类似参考字符是指相同部分的附图中所说明，前述和其他目标、特征和优势将从以下本发明的特定实施方案的描述而明了。图式不一定按照比例，反而着重于说明本发明的各实施方案的原理。
图1展示来自对小鼠的免疫原性研究的数据，该研究经设计以评估与蛋白抗原相比对使用与MC3 LNP一起配制的各种mRNA疫苗递送的RSV疫苗抗原的免疫反应。数据显示强的中和抗体效价。
图2展示RNA/LNP疫苗产生与蛋白抗原相比高得多的细胞免疫反应。
图3A至3C展示来自测试小鼠中的免疫原性的细胞内细胞因子染色检定的数据，其显示RSV-F mRNA/NLP疫苗和RSV-G mRNA/LNP疫苗，而非DS-CAV1蛋白抗原，在小鼠中引发稳健的Th1偏向性CD4+免疫反应。
图4A至4C展示来自测试小鼠中的免疫原性的细胞内细胞因子染色检定的数据，其显示RSV-F mRNA/NLP疫苗和RSV-G mRNA/LNP疫苗，而非DS-CAV1蛋白抗原，在小鼠中引发稳健的Th1偏向性CD8+免疫反应。
图5展示来自对小鼠的免疫原性研究的数据，其显示强的中和抗体效价，等于使用以作为佐剂的蛋白抗原达成的那些效价。
图6A至6C展示来自测试小鼠中的免疫原性的细胞内细胞因子染色检定的数据，其显示RSV-F mRNA/LNP疫苗和RSV-G mRNA/LNP疫苗，而非DS-CAV1蛋白抗原，在小鼠中引发稳健的Th1偏向性CD4+免疫反应。
图7A至7C展示来自测试小鼠中的免疫原性的细胞内细胞因子染色检定的数据，其证实RSV-F mRNA/LNP疫苗，而非RSV-G mRNA/LNP疫苗或DS-CAV1蛋白抗原，在小鼠中引发稳健的TH1偏向性CD8+免疫反应。
图8展示来自检定的数据，其显示从经与MC3 LNP一起配制的RSV mRNA疫苗免疫接种的任何小鼠的肺部未发现病毒，且在较低剂量的DS-CAV1蛋白/疫苗下仅一只动物在鼻部具有可检测到的任何病毒。
图9展示来自对棉鼠的免疫原性研究的数据，其显示在经与MC3 LNP一起配制的各种RSV mRNA疫苗免疫接种的动物中强的中和抗体效价。
图10展示来自棉鼠竞争ELISA的数据，其表征对各种RSV mRNA疫苗的抗原性和抗原性位点II反应。
图11展示来自棉鼠攻毒检定的数据，其显示与MC3 LNP一起配制的RSV mRNA疫苗的保护性作用。
图12展示代表在非洲绿猴中由RSV mRNA疫苗和对照制剂诱发的针对RSV A的血清中和抗体效价(NT50个别和GMT，95％信赖区间)的图表。
图13A至13B展示代表在第10周所测量(PD3 2周)的针对帕利珠单抗(palivizumab)(位点II)(图13A)和D25(位点)(图13B)的血清抗体竞争ELISA效价(IT50个别和GMT，95％信赖区间)的图表。
图14A至14B展示代表在95％信赖区间下在非洲绿猴中攻毒后所检测到的平均肺部病毒血症(图13A)和攻毒后所检测到的平均鼻部病毒血症(图13B)的图表。
图15展示代表在疫苗接种后2周经历RSV的非洲绿猴中由各种RSV mRNA疫苗和对照制剂诱发的针对RSV A的血清中和抗体效价(NT50个别和GMT，95％信赖区间)的图表。
图16展示代表在经历RSV的非洲绿猴中由各种RSV mRNA疫苗和对照制剂诱发的针对RSV A的血清中和抗体效价(GMT，95％信赖区间)的图表。
图17A至17B展示代表在基线和免疫接种后4周所测量的针对帕利珠单抗(位点II)(图17A)和D25(位点)(图17B)的血清抗体竞争ELISA效价(IT50个别和GMT，95％信赖区间)的图表。
图18A至18B展示代表在经历RSV的非洲绿猴中由各种疫苗和对照制剂诱发的RSVF特异性CD4+(图18A)和CD8+(图18B)T细胞反应的图表。
图19展示代表在第4周(针对RSV A(圆形)和RSV B(方形)的剂量1后4周)和第8周(针对RSV A(向上指的三角形)和RSV B(向下指的三角形)的剂量2后4周)棉鼠中由各种疫苗和对照制剂诱发的针对RSVA和RSV B的血清中和抗体效价(NT50个别和GMT，95％信赖区间)的图表。
图20展示代表在95％信赖区间下以RSV B 18357攻毒后所测量的棉鼠中平均肺部(圆形)和鼻部(方形)病毒拷贝数的图表。
具体实施方式
本公开的实施方案提供RNA(例如，mRNA)疫苗，其包括(至少一种)编码呼吸道合胞病毒(RSV)抗原的多核苷酸。RSV是肺炎病毒亚科的反义单链RNA病毒。此种病毒存在至少两种抗原性亚组，称为A组和B组，主要因为表面G糖蛋白的差异。两种RSV表面糖蛋白G和糖蛋白F介导与呼吸道上皮细胞附着和附着至呼吸道上皮细胞。F表面糖蛋白介导相邻细胞的聚结。此导致形成合胞细胞。RSV是毛细支气管炎的最常见原因。大多数受感染的成年人发展成类似轻微感冒的症状，诸如充血、低热和喘息。婴儿和幼儿可能会罹患更严重的症状，诸如毛细支气管炎和肺炎。该疾病可经由与呼吸道分泌物接触而在人中间传播。
RSV的基因组编码至少三种表面糖蛋白(包括F、G和SH)、四种核衣壳蛋白(包括L、P、N和M2)和一种基质蛋白M。糖蛋白F通过病毒体与宿主膜之间的融合引导病毒穿透。糖蛋白G为II型跨膜糖蛋白且为主要附着蛋白。SH为短的膜内在蛋白质。基质蛋白M存在于脂质双层的内层中且辅助病毒体形成。核衣壳蛋白L、P、N和M2调节RSV基因组的复制和转录。人们认为糖蛋白G在支气管上皮细胞的表面上系栓和稳定化病毒粒子，而糖蛋白F与细胞糖胺聚糖相互作用以介导RSV病毒体内含物融合和递送至宿主细胞中(Krzyzaniak MA等人PLoSPathog 2013；9(4))。
如本文所提供的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗可用于诱发平衡免疫反应(包括细胞免疫性和体液免疫性)，而无许多与DNA疫苗接种相关的风险。
国际申请第PCT/US2015/02740号的整个内容以引用的方式并入本文中。
已经发现，本文所述的mRNA疫苗以几种方式优于目前的疫苗。首先，脂质纳米粒子(LNP)递送优于其他制剂(包括文献中描述的基于鱼精蛋白的方法)，并且不需要额外的佐剂。LNP的使用能够有效递送经化学修饰或未经化学修饰的mRNA疫苗。此外，本文已经证明，经修饰的和未经修饰的LNP配制的mRNA疫苗在很大程度上优于常规疫苗。在一些实施方案中，本发明的mRNA疫苗优于常规疫苗至少10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、500倍或1,000倍数量级。
尽管已经尝试生产功能性RNA疫苗，包括mRNA疫苗和自我复制RNA疫苗，但是这些RNA疫苗的治疗功效尚未完全确立。令人相当惊讶的是，根据本发明的多个方面，发明人发现了一类用于体内递送mRNA疫苗的制剂，其导致显著增强且在许多方面协同增效的免疫反应，包括增强的抗原产生和具有中和能力的功能性抗体产生。即使当施用与其他类别的基于脂质的制剂中使用的mRNA剂量相比显著更低剂量的mRNA时，也可以实现这些结果。本发明的制剂已显示出足以建立功能性mRNA疫苗作为预防剂和治疗剂的效力的明显意想不到的体内免疫反应。此外，自我复制RNA疫苗依靠病毒复制途径向细胞递送足够的RNA以产生免疫原性反应。本发明的制剂不需要病毒复制来产生足够的蛋白质以产生强烈的免疫反应。因此，本发明的mRNA不是自我复制的RNA并且不包含病毒复制所必需的组分。
在一些方面，本发明涉及令人惊讶的发现，即脂质纳米粒子(LNP)制剂显著增强mRNA疫苗(包括经化学修饰的和未经化学修饰的mRNA疫苗)的效力。使用几种不同的抗原在体内检查配制在LNP中的mRNA疫苗的功效。本文呈现的结果证明配制在LNP中的mRNA疫苗比其他商业可用疫苗具有意想不到的优越功效。
除了提供增强的免疫反应之外，本发明的制剂与其他测试的疫苗相比用更少剂量的抗原产生更快速的免疫反应。与配制在不同载体中的疫苗相比，本发明的mRNA-LNP制剂还产生了定量和定性更好的免疫反应。
本文所述的数据表明，本发明的制剂产生比现有抗原疫苗显著出乎意料的改善。另外，即使当mRNA的剂量低于其他疫苗时，本发明的mRNA-LNP制剂也优于其他疫苗。将用MC3 LNP配制的各种mRNA疫苗在小鼠中与蛋白抗原接种进行比较。数据表明，与现有疫苗相比，mRNA疫苗产生更强的中和抗体效价，比蛋白抗原高得多的细胞免疫反应，引发小鼠中强效Th1偏向性CD4+和CD8+免疫反应以及肺中病毒的减少。没有从用MC3 LNP配制的RSV mRNA疫苗免疫的任何小鼠的肺中回收到病毒，相比之下，在较低剂量的蛋白/佐剂疫苗制剂中仅有一只动物如此。在大鼠和猴中也获得了显著的中和抗体效价。
本文所述研究中使用的LNP先前已用于在各种动物模型以及人类中递送siRNA。鉴于与LNP制剂的siRNA递送相关的观察结果，LNP适用于疫苗的事实是相当令人惊讶的。已经观察到配制在LNP中的siRNA的治疗性递送引起与瞬时IgM反应相关的不希望的炎症反应，通常导致抗原产生减少和免疫反应受损。与利用siRNA观察到的发现相比，本发明的LNP-mRNA制剂在本文中被证实可提高IgG水平，足以用于预防性和治疗性方法而不是瞬时IgM反应。
核酸/多核苷酸
如本文所提供的RSV疫苗包含至少一种(一种或多种)核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框。术语“核酸”最义上包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。这些聚合物称为多核苷酸。
在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由至少一种如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述的核酸序列，或与如SEQ IDNO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述的核酸序列具有至少80％同一性的同源物编码。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由至少一种如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述的核酸序列，或与如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述的核酸序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.8％或99.9％)同一性的同源物编码。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述的核酸序列的至少一个片段(例如，具有至少一种抗原性序列或至少一个表位的片段)编码。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸具有至少一个化学修饰。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸为mRNA多核苷酸，其中mRNA多核苷酸的每一尿嘧啶(100％的尿嘧啶)皆经化学修饰。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸为mRNA多核苷酸，其中mRNA多核苷酸的每一尿嘧啶(100％的尿嘧啶)皆经化学修饰以包括N1-甲基假尿苷。
在一些实施方案中，RSV抗原性多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245所述的氨基酸序列，或为如SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245所述的氨基酸序列的(抗原性)片段，或为与如SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245所述的氨基酸序列具有至少80％(例如，85％、90％、95％、98％、99％)同一性的同源物。
核酸(也称为多核苷酸)可为或可包括例如核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2′-氨基官能化作用的2′-氨基-LNA和具有2′-氨基官能化作用的2′-氨基-α-LNA)、乙烯核酸(ENA)、环己烯基核酸(CeNA)或其嵌合体或组合。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸充当信使RNA(mRNA)。“信使RNA”(mRNA)是指编码(至少一种)多肽(天然存在、非天然存在或经修饰的氨基酸聚合物)且可经翻译以体外、体内、原位或离体产生经编码的多肽的任何多核苷酸。技术人员将了解，除了另外规定，本申请中所陈述的多核苷酸序列将在代表性DNA序列中列举“T”，但当序列表示RNA(例如，mRNA)时，“T”将被取代为“U”。因此，由以特定序列识别号识别的DNA编码的任何RNA多核苷酸还可包含由DNA编码的对应RNA(例如，mRNA)序列，其中DNA序列的每个“T”皆被“U”取代。
mRNA分子的基本组分通常包括至少一个编码区、5′未翻译区(UTR)、3′UTR、5′端帽和poly-A尾。本公开的多核苷酸可充当mRNA，但在其功能性和/或结构设计特征方面可有别于野生型mRNA，所述特征用以使用基于核酸的疗法来克服有效多肽表达的现有问题。
在一些实施方案中，RSV疫苗的RNA多核苷酸(例如，mRNA)编码2至10种、2至9种、2至8种、2至7种、2至6种、2至5种、2至4种、2至3种、3至10种、3至9种、3至8种、3至7种、3至6种、3至5种、3至4种、4至10种、4至9种、4至8种、4至7种、4至6种、4至5种、5至10种、5至9种、5至8种、5至7种、5至6种、6至10种、6至9种、6至8种、6至7种、7至10种、7至9种、7至8种、8至10种、8至9种或9至10种抗原性多肽。在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的RNA多核苷酸(例如，mRNA)编码至少10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或100种抗原性多肽。在一些实施方案中，RSV疫苗的RNA多核苷酸(例如，mRNA)编码至少100种抗原性多肽，或至少200种抗原性多肽。在一些实施方案中，RSV疫苗的RNA多核苷酸(例如，mRNA)编码1至10种、5至15种、10至20种、15至25种、20至30种、25至35种、30至40种、35至45种、40至50种、1至50种、1至100种、2至50种或2至100种抗原性多肽。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，mRNA)经密码子优化。密码子优化方法在本领域中已知且可如本文所提供来使用。在一些实施方案中，密码子优化可用于匹配标靶和宿主有机体的密码子频率以确保适当折叠；偏向GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；使可损害基因构造或表达的串联重复密码子或碱基运作最小化；定制转录和翻译控制区；插入或移除蛋白运输序列；在所编码蛋白(例如，糖基化位点)中移除/添加翻译后修饰位点；添加、移除或改组蛋白结构域；插入或删除限制位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调节翻译速率以使得蛋白的各种结构域可适当折叠；或减少或消除多核苷酸内有问题的二级结构。密码子优化工具、算法和服务在本领域中已知，非限制性实例包括来自GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)和/或专利方法的服务。在一些实施方案中，使用优化算法优化开放阅读框(ORF)序列。
在一些实施方案中，密码子优化序列与天然存在或野生型序列(例如，编码所关注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)的天然存在或野生型mRNA序列)共有小于95％序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化序列与天然存在或野生型序列(例如，编码所关注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)的天然存在或野生型mRNA序列)共有小于90％序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化序列与天然存在或野生型序列(例如，编码所关注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)的天然存在或野生型mRNA序列)共有小于85％序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化序列与天然存在或野生型序列(例如，编码所关注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)的天然存在或野生型mRNA序列)共有小于80％序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化序列与天然存在或野生型序列(例如，编码所关注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)的天然存在或野生型mRNA序列)共有小于75％序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化序列与天然存在或野生型序列(例如，编码所关注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)的天然存在或野生型mRNA序列)共有介于65％与85％之间(例如，介于约67％与约85％之间或介于约67％与约80％之间)的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化序列与天然存在或野生型序列(例如，编码所关注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)的天然存在或野生型mRNA序列)共有介于65％与75％或约80％之间的序列同一性。
在一些实施方案中，RSV疫苗包括至少一种RNA多核苷酸，其具有编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框，具有至少一个修饰、至少一个5′端帽，且在脂质纳米粒子中配制。根据制造商的方案，多核苷酸的5′封端可在体外转录反应期间使用以下化学RNA帽类似物来同时完成以产生5′-鸟苷帽结构：3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G[ARCA帽]；G(5′)ppp(5′)A；G(5′)ppp(5′)G；m7G(5′)ppp(5′)A；m7G(5′)ppp(5′)G(New England BioLabs，Ipswich，MA)。经修饰的RNA的5′封端可在转录后使用牛痘病毒封端酶完成以产生“帽0”结构：m7G(5′)ppp(5′)G(New England BioLabs，Ipswich，MA)。帽1结构可使用牛痘病毒封端酶与2′-O甲基-转移酶来产生以产生：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基。帽2结构可由帽1结构产生，随后使用2′-O甲基-转移酶对5′倒数第三个核苷酸进行2′-O-甲基化。帽3结构可由帽2结构产生，随后使用2′-O甲基-转移酶对5′倒数第三个核苷酸进行2′-O-甲基化。酶可源自重组来源。
当转染至哺乳动物细胞中时，经修饰的mRNA具有介于12至18小时之间，或大于18小时，例如24、36、48、60、72小时或大于72小时的稳定性。
在一些实施方案中，密码子优化的RNA可为其中G/C含量增强的RNA。核酸分子(例如，mRNA)的G/C含量可影响RNA的稳定性。鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的量增加的RNA在功能方面可比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的RNA更稳定。举例来说，WO02/098443公开一种药物组合物，其含有在翻译区通过序列修饰稳定化的mRNA。由于遗传密码的退化，修饰通过以促进更大RNA稳定性而不改变所得氨基酸的那些密码子取代现有密码子来起作用。所述方法局限于RNA的编码区。
抗原/抗原性多肽
已知存在RSV的至少两种抗原性亚组(A和B)。此抗原性二态性是主要归因于表面G糖蛋白的差异。两种表面糖蛋白G和F存在于包膜中且介导与呼吸道上皮细胞的附着和融合。F蛋白还介导相邻细胞聚结形成特征性合胞细胞，病毒由此而得名。RSV的两种抗原性变体的流行病学和生物学意义尚不确定。尽管如此，有一些证据表明A组感染倾向于更严重。
RSV基因组的长度为～15,000个核苷酸且由具有负极性的单链RNA构成。其具有编码11种蛋白的10个基因，存在M2的2个开放阅读框。所述基因组从NS1至L依序转录，而表达水平沿其长度降低。
NS1和NS2抑制I型干扰素活性。在一些实施方案中，RSV疫苗包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，其具有编码NS1、NS2或其免疫原性片段的产物的开放阅读框。
N编码形成核衣壳的与基因组RNA相关的核衣壳蛋白。在一些实施方案中，RSV疫苗包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，其具有编码核衣壳蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框。
M编码病毒组装所需的基质蛋白。在一些实施方案中，RSV疫苗包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，其中具有编码基质蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框。
SH、G和F形成病毒外壳。G蛋白为高度糖基化的表面蛋白且充当附着蛋白。F蛋白为介导融合的另一种重要表面蛋白，从而允许病毒进入细胞质且还允许形成合胞体。F蛋白在RSV的两种亚型中为同源的；针对F蛋白的抗体为中和抗体。相比之下，G蛋白在两种亚型之间显著不同。在一些实施方案中，RSV疫苗包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，其具有编码SH、G或F蛋白或其组合或其免疫原性片段的开放阅读框。
细胞表面处的核仁素为RSV融合蛋白的受体。已显示核仁素-RSV融合蛋白相互作用的干扰在细胞培养物和动物模型中针对RSV感染具有治疗性。在一些实施方案中，RSV疫苗包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，其具有编码核仁素或其免疫原性片段的开放阅读框。
M2为转录还所需的第二基质蛋白且编码M2-1(伸长因子)和M2-2(转录调控)。M2含有CD8表位。在一些实施方案中，RSV疫苗包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，其具有编码第二基质蛋白或其免疫原性片段的开放阅读框。
L编码RNA聚合酶。在一些实施方案中，RSV疫苗包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，其具有编码RNA聚合酶(L)或其免疫原性片段的开放阅读框。
磷蛋白P为L蛋白的辅因子。在一些实施方案中，RSV疫苗包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，其具有编码磷蛋白P或其免疫原性片段的开放阅读框。
本公开的一些实施方案提供RSV疫苗，所述疫苗包括至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，其具有编码糖蛋白G或其免疫原性片段(例如，能够对RSV引起免疫反应的免疫原性片段)的开放阅读框。
本公开的一些实施方案提供RSV疫苗，所述疫苗包括至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，其具有编码糖蛋白F或其免疫原性片段(例如，能够对RSV引起免疫反应的免疫原性片段)的开放阅读框。
本发明的一些实施方案公开RSV疫苗，所述疫苗包括至少一种RNA(例如mRNA)多核苷酸，其具有编码呈融合后形式的多肽或其免疫原性片段的开放阅读框。本发明的其他实施方案公开RSV疫苗，所述疫苗包括至少一种RNA(例如mRNA)多核苷酸，其具有编码呈融合前形式的多肽或其免疫原性片段的开放阅读框。在一些实施方案中，多肽或其抗原性片段包含呈融合前构型的糖蛋白，例如但不限于融合前糖蛋白F或DS-CAV1。尽管不希望受理论束缚，但特定多肽或其抗原性片段在呈融合前构型时可含有更多表位以用于中和与相同蛋白或其免疫原性片段的融合后构型有关的抗体。举例来说，融合前糖蛋白F或其免疫原性片段在其膜远程顶点处具有独特抗原位点(“抗原性位点0”)。抗原性位点0可(但不一定)包含RSV F蛋白序列的残基62至69和196至209。在诸如(但不限于)融合前糖蛋白F或其免疫原性片段的一些情况下，融合前多肽或其免疫原性片段可展现比以融合后多肽或其免疫原性片段所达成的那些免疫反应大许多倍的免疫反应。融合前RSV糖蛋白和其使用方法在WO/2014/160463中描述，该专利以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，RSV疫苗包括至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，其具有编码从RSV毒株A2(RSV A2)获得的糖蛋白F或糖蛋白G或其免疫原性片段的开放阅读框。本公开涵盖其他RSV毒株，包括亚型A毒株和亚型B毒株。
在一些实施方案中，RSV疫苗具有至少一种RNA(例如，mRNA)，其具有至少一个修饰，包括但不限于至少一个化学修饰。
在一些实施方案中，RSV抗原性多肽长于25个氨基酸且短于50个氨基酸。因此，多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述各物的其他等效物、变体和类似物。多肽可为单分子或可为多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。多肽还可包含单链或多链多肽，诸如抗体或胰岛素，且可缔合或连接。最常见地，在多链多肽中可见二硫键联。术语多肽还可适用于氨基酸聚合物，其中至少一个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
术语“多肽变体”是指其氨基酸序列不同于天然或参考序列的分子。氨基酸序列变体与天然或参考序列相比可在氨基酸序列内的特定位置具备取代、删除和/或插入。通常，变体与天然或参考序列具备至少50％同一性。在一些实施方案中，变体与天然或参考序列共有至少80％或至少90％同一性。
在一些实施方案中，提供“变体模拟物”。如本文所用，“变体模拟物”含有至少一个将模拟活化序列的氨基酸。举例来说，谷氨酸可充当磷基-苏氨酸和/或磷基-丝氨酸的模拟物。或者，变体模拟物可导致去活化或导致含有模拟物的失活产物。举例来说，苯丙氨酸可充当酪氨酸的失活取代，或丙氨酸可充当丝氨酸的失活取代。
“直系同源物”是指不同物种中通过物种形成由共同祖先基因进化而来的基因。通常，直系同源物在进化过程中保留相同功能。直系同源物的识别对于最新测序的基因组中基因功能的可靠性预测至关重要。
“类似物”意欲包括因一种或多种氨基酸改变而不同的多肽变体，例如仍保留母体或起始多肽的一种或多种特性的对氨基酸残基的取代、添加或删除。
“旁系同源物”为基因组中通过复制而有关联的基因(或蛋白)。直系同源物在进化过程中保留相同功能，而旁系同源物进化出新功能，即使这些功能与原始功能有关。
本发明提供若干类型的基于多核苷酸或多肽的组合物，包括变体和衍生物。这些变体和衍生物包括例如取代、插入、删除和共价变体和衍生物。术语“衍生物”与术语“变体”同义使用，但通常是指相对于参考分子或起始分子而言以任何反式修饰和/或改变的分子。
因此，本公开的范围内包括编码相对于参考序列而言含有取代、插入和/或添加、删除和共价修饰的肽或多肽(特定言的为本文所公开的多肽序列)的多核苷酸。举例来说，序列标签或氨基酸(诸如一种或多种赖氨酸)可添加至肽序列中(例如，在N末端或C末端)。序列标签可用于肽检测、纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽溶解性或允许生物素化。或者，位于肽或蛋白的氨基酸序列的羧基和氨基末端区域的氨基酸残基可任选地删除，提供截短序列。特定氨基酸(例如，C末端或N末端残基)可或者视序列的用途而删除，例如将序列表达为可溶性或连接至固体支撑物的较大序列的一部分。在替代性实施方案中，(或编码)信号序列、终止序列、跨膜结构域、接头、多聚化结构域(例如，折叠子区域)及其类似物的序列可由达成相同或类似功能的替代序列取代。此类序列对于本领域技术人员易于识别。还应了解，本文所提供的一些序列含有例如在用于制备RNA(例如，mRNA)疫苗之前可删除的序列标签或末端肽序列(例如，在N末端或C末端)。
当提及多肽时，“取代变体”为在天然或起始序列中移除至少一个氨基酸残基且在其相同位置的处插入不同氨基酸的那些取代变体。取代可为单次的，其中分子中仅一个氨基酸被取代，或取代可为多次的，其中同一分子中两个或两个以上氨基酸被取代。
如本文所用，术语“保守性氨基酸取代”是指以具有类似大小、电荷或极性的不同氨基酸取代序列中通常存在的氨基酸。保守性取代的实例包括以一种非极性(疏水性)残基(诸如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸)取代另一种非极性残基。同样，保守性取代的实例包括以一种极性(亲水性)残基取代另一种残基，诸如精氨酸与赖氨酸之间、谷酰氨酸与天冬酰氨酸之间和甘氨酸与丝氨酸之间。另外，以诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸的碱性残基取代另一者，或以诸如天冬氨酸或谷氨酸的一种酸性残基取代另一种酸性残基为保守性取代的其他实例。非保守性取代的实例包括以诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、蛋氨酸的非极性(疏水性)氨基酸残基取代诸如半胱氨酸、谷酰氨酸、谷氨酸或赖氨酸的极性(亲水性)残基和/或以极性残基取代非极性残基。
当提及多肽或多核苷酸时，“特征”分别定义为分子的基于不同氨基酸序列或基于核苷酸的组分。由多核苷酸编码的多肽的特征包括表面表达、局部构型形状、折叠、环、半环、结构域、半结构域、位点、末端或其任何组合。
如本文所用，当提及多肽时，术语“结构域”是指具有一种或多种可识别的结构或功能性特征或特性(例如，结合能力，充当蛋白与蛋白相互作用的位点)的多肽的基序。
如本文所用，当提及多肽时，术语“位点”在其涉及基于氨基酸的实施方案时与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”同义使用。如本文所用，当提及多核苷酸时，术语“位点”在其涉及基于核苷酸的实施方案时与“核苷酸”同义使用。位点表示基于多肽或多核苷酸的分子中可经修饰、操作、变更、衍生或改变的肽或多肽或多核苷酸中的位置。
如本文所用，当提及多肽或多核苷酸时，术语“末端(termini或terminus)”分别是指多肽或多核苷酸的端点。此类端点不仅局限于多肽或多核苷酸的第一或最终位点，而且可包括末端区域中的其他氨基酸或核苷酸。基于多肽的分子可表征为具有N末端(由具有游离氨基(NH2)的氨基酸封端)和C末端(由具有游离羧基(COOH)的氨基酸封端)。蛋白在一些情况下由通过二硫键或通过非共价力(多聚体、寡聚体)结合在一起的多个多肽链组成。这些蛋白具有多个N末端和C末端。或者，任选地而定，多肽的末端可经修饰以便其可由基于非多肽的部分开始或结束，诸如有机缀合物。
如本领域技术人员所公认，蛋白片段、功能性蛋白结构域和同源蛋白也视为在所关注多肽的范围内。举例来说，本文提供长度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或大于100个氨基酸的参考蛋白的任何蛋白片段(意谓比参考多肽序列短但其他方面均一致的具有至少一个氨基酸残基的多肽序列)。在另一实例中，根据本公开可使用与本文所述的任何序列40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％一致的包括具有20、30、40、50或100个氨基酸的延伸段的任何蛋白。在一些实施方案中，多肽包括如本文所提供或提及的任何序列中所示的2、3、4、5、6、7、8、9、10种或10种以上突变。在一些实施方案中，蛋白片段长于25个氨基酸且短于50个氨基酸。
本公开的多肽或多核苷酸分子可与参考分子(例如，参考多肽或参考多核苷酸)，例如与本领域所述的分子(例如，经工程化或设计的分子或野生型分子)共有一定程度的序列类似性或同一性。如本领域中已知，术语“同一性”是指如通过对比序列所测定的两种或两种以上多肽或多核苷酸的序列之间的关系。在本领域中，同一性还意谓如由两个或两个以上氨基酸残基或核酸残基串之间的匹配数所测定的其间的序列相关程度。同一性测量两种或两种以上序列中具有由特定数学模型或计算机程序(例如，“算法”)提出之间隙比对(如果存在)的较小者之间的一致匹配百分比。“同一性％”在适用于多肽或多核苷酸序列时定义为在比对序列和必要时引入间隙以达成最大同一性百分比后，候选氨基酸或核酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基一致的残基(氨基酸残基或核酸残基)百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域中熟知。应了解，同一性取决于同一性百分比的计算，但由于计算中引入之间隙和罚分而其值可不同。通常，如通过本文所述且本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所测定，特定多核苷酸或多肽的变体与彼特定参考多核苷酸或多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、但小于100％的序列同一性。用于比对的此类工具包括BLAST试剂盒的那些工具(Stephen F.Altschul，等人(1997)，“GappedBLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs”，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。另一种受欢迎的局部比对技术是基于Smith-Waterman算法(Smith，T.F.和Waterman，M.S.(1981)“Identification of commonmolecular subsequences.”J.Mol.Biol.147：195-197)。基于动态程序设计的通用全局比对技术为Needleman-Wunsch算法(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)“A generalmethod applicable to the search for similarities in the amino acid sequencesof two proteins.”J.Mol.Biol.48：443-453)。最近已研发出一种快速优化全局序列比对算法(Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm，FOGSAA)，据称其比其他优化全局比对方法(包括Needleman-Wunsch算法)更快地产生对核苷酸和蛋白序列的全局比对。本文中描述其他工具，尤其在下文“同一性”的定义中。
如本文所用，术语“同源性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子之间的总体相关性。共有通过匹配残基的比对所测定的临界水平的类似性或同一性的聚合分子(例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子)被称为同源。同源性为描述分子之间的关系的定性术语且可基于定量的类似性或同一性。类似性或同一性为定义两种比较序列之间的序列匹配程度的定量术语。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％一致或类似，则认为其彼此“同源”。术语“同源”必定是指至少两种序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。如果两种多核苷酸序列编码的多肽对于至少一个具有至少20个氨基酸的延伸段而言至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％，则认为两种序列同源。在一些实施方案中，同源多核苷酸序列由编码具有至少4至5个独特规定氨基酸的延伸段的能力表征。对于长度小于60个核苷酸的多核苷酸序列而言，同源性由编码具有至少4至5个独特规定氨基酸的延伸段的能力来测定。如果两种蛋白对于至少一个具有至少20个氨基酸的延伸段而言至少50％、60％、70％、80％或90％一致，则认为两种蛋白序列同源。
同源性暗示比较序列在进化中自共同起源偏离。术语“同源物”是指第一氨基酸序列或核酸序列(例如，基因(DNA或RNA)或蛋白序列)与第二氨基酸序列或核酸序列因来自共同祖先序列的血统而有关联。术语“同源物”可适用于因物种形成事件隔开的基因和/或蛋白之间的关系或因基因复制事件隔开的基因和/或蛋白之间的关系。
多蛋白和多组分疫苗
本公开涵盖包含各自编码单一抗原性多肽的多种RNA(例如，mRNA)多核苷酸的RSV疫苗，以及包含编码一种以上抗原性多肽(例如，融合多肽)的单一RNA多核苷酸的RSV疫苗。因此，应了解，一种包含具有编码第一RSV抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸和具有编码第二RSV抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸的疫苗组合物涵盖(a)包含编码第一RSV抗原性多肽的第一RNA多核苷酸和编码第二RSV抗原性多肽的第二RNA多核苷酸的疫苗，和(b)包含编码第一和第二RSV抗原性多肽(例如，融合多肽)的单一RNA多核苷酸的疫苗。在一些实施方案中，本公开的RSV RNA疫苗包含2至10种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10种)或10种以上具有开放阅读框的RNA多核苷酸，其各自编码不同RSV抗原性多肽(或编码2至10种或10种以上不同RSV抗原性多肽的单一RNA多核苷酸)。在一些实施方案中，RSV RNA疫苗包含具有编码融合(F)糖蛋白的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸，具有编码附着(G)蛋白的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸，具有编码核蛋白(N)的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸，具有编码磷蛋白(P)的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸，具有编码大聚合酶蛋白(L)的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸，具有编码基质蛋白(M)的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸，具有编码小疏水性蛋白(SH)的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸，具有编码非结构蛋白1(NS1)的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸，和具有编码非结构蛋白2(NS2)的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸。在一些实施方案中，RSV RNA疫苗包含具有编码融合(F)蛋白的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸和具有编码附着蛋白(G)的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸。在一些实施方案中，RSVRNA疫苗包含具有编码F蛋白的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸。在一些实施方案中，RSVRNA疫苗包含具有编码N蛋白的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸。在一些实施方案中，RSVRNA疫苗包含具有编码M蛋白的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸。在一些实施方案中，RSVRNA疫苗包含具有编码L蛋白的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸。在一些实施方案中，RSVRNA疫苗包含具有编码P蛋白的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸。在一些实施方案中，RSVRNA疫苗包含具有编码SH蛋白的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸。在一些实施方案中，RSVRNA疫苗包含具有编码NS1蛋白的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸。在一些实施方案中，RSVRNA疫苗包含具有编码NS2蛋白的开放阅读框的RSV RNA多核苷酸。
在一些实施方案中，RNA多核苷酸编码与信号肽(例如，SEQ ID NO：281或SEQ IDNO：282)融合的RSV抗原性多肽。因此，提供RSV疫苗，所述疫苗包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码连接至RSV抗原性肽的信号肽的开放阅读框。
本文还提供RSV疫苗，其包含与信号肽融合的本文所公开的任何RSV抗原性多肽(例如，F、G、M、N、L、P、SH、NS1、NS2或其任何抗原性片段)。所述信号肽可与RSV抗原性多肽的N或C末端融合。
信号肽
在一些实施方案中，由RSV多核苷酸编码的抗原性多肽包含信号肽。信号肽(其包含蛋白的N末端15至60个氨基酸)通常为以分泌途径跨膜转运所需的，且因此普遍地控制真核细胞和原核细胞中的大多数蛋白进入分泌途径。信号肽通常包括三个区域：具有不同长度的N末端区域，其通常包含带正电荷的氨基酸；疏水性区域；和短羧基末端肽区域。在真核细胞中，初生前体蛋白(前蛋白)的信号肽将核糖体导向糙面内质网(ER)膜且开始使生长中的肽链跨膜运输。然而，信号肽并不负责成熟蛋白的最终目的地。在其序列中不含其他地址标签的分泌型蛋白默认分泌至外部环境。信号肽通过内质网(ER)驻留信号肽酶从前体蛋白裂解或其保持不裂解且充当膜锚。近年来，关于信号肽已演变出一种更先进的观点，表明某些信号肽的功能和免疫优势比先前预期的更多样得多。
信号肽通常起促使新合成的蛋白靶向内质网(ER)以便加工的作用。ER加工产生成熟的包膜蛋白，其中信号肽通常由宿主细胞的信号肽酶裂解。信号肽还可促使蛋白靶向细胞膜。本公开的RSV疫苗可包含例如编码人工信号肽的RNA多核苷酸，其中信号肽编码序列可操作性地连接至RSV抗原性多肽的编码序列且与其同框。因此，在一些实施方案中，本公开的RSV疫苗产生包含与信号肽融合的RSV抗原性多肽的抗原性多肽。在一些实施方案中，信号肽与RSV抗原性多肽的N末端融合。在一些实施方案中，信号肽与RSV抗原性多肽的C末端融合。
在一些实施方案中，与RSV抗原性多肽融合的信号肽为人工信号肽。在一些实施方案中，与由RSV RNA(例如，mRNA)疫苗编码的RSV抗原性多肽融合的人工信号肽是从免疫球蛋白获得，例如IgE信号肽或IgG信号肽。在一些实施方案中，与由RSV RNA(例如，mRNA)疫苗编码的RSV抗原性多肽融合的信号肽为具有以下序列Ig重链ε-1信号肽(IgE HC SP)：MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO：281)。在一些实施方案中，与由RSV RNA(例如，mRNA)疫苗编码的RSV抗原性多肽融合的信号肽为具有序列METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：282)的IgGk链V-III区域HAH信号肽(IgGk SP)。在一些实施方案中，由RSV RNA(例如，mRNA)疫苗编码的RSV抗原性多肽具有与SEQ ID NO：281或SEQ ID NO：282的信号肽融合的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：28中的一者所述的氨基酸序列。本文所公开的实例不欲限制且根据本公开可使用在本领域中已知用于促使蛋白靶向ER以便加工和/或蛋白靶向细胞膜的任何信号肽。
信号肽可具有15至60个氨基酸的长度。举例来说，信号肽可具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸的长度。在一些实施方案中，信号肽可具有20至60、25至60、30至60、35至60、40至60、45至60、50至60、55至60、15至55、20至55、25至55、30至55、35至55、40至55、45至55、50至55、15至50、20至50、25至50、30至50、35至50、40至50、45至50、15至45、20至45、25至45、30至45、35至45、40至45、15至40、20至40、25至40、30至40、35至40、15至35、20至35、25至35、30至35、15至30、20至30、25至30、15至25、20至25或15至20个氨基酸的长度。
信号肽通常在ER加工期间在裂解连接处由初生多肽裂解。由本公开的RSV RNA疫苗产生的成熟RSV抗原性多肽通常不包含信号肽。
化学修饰
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如，mRNA)疫苗包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码至少一种呼吸道合胞病毒(RSV)抗原性多肽的开放阅读框，其中所述RNA包含至少一个化学修饰。
术语“化学修饰”和“经化学修饰”是指关于腺苷(A)、鸟苷(G)、尿苷(U)、胸苷(T)或胞苷(C)核糖核苷或脱氧核糖核苷对其位置、模式、百分比或群体中至少一者的修饰。通常，这些术语并非指天然存在的5′末端mRNA帽部分的核糖核苷酸修饰。
多核苷酸的修饰包括但不限于本文所述的那些修饰，且包括(但不明确限于)包含化学修饰的那些修饰。多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)可包含天然存在、非天然存在的修饰或多核苷酸可包含天然存在的修饰与非天然存在的修饰的组合。多核苷酸可包括对例如糖、核碱基或核苷间键联(例如，对连接磷酸酯，对磷酸二酯键联或对磷酸二酯主链)的任何适用的修饰。
关于多肽，术语“修饰”是指关于典型20个氨基酸的组的修饰。如果如本文所提供的多肽含有氨基酸取代、插入或取代与插入的组合，则也将其视为“经修饰”。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含多种(一种以上)不同的修饰。在一些实施方案中，多核苷酸的特定区域含有一种、两种或两种以上(任选地不同的)核苷或核苷酸修饰。在一些实施方案中，引入细胞或有机体中的经修饰的RNA多核苷酸(例如，经修饰的mRNA多核苷酸)在细胞或有机体中相对于未经修饰的多核苷酸分别展现降解减少。在一些实施方案中，引入细胞或有机体中的经修饰的RNA多核苷酸(例如，经修饰的mRNA多核苷酸)在细胞或有机体中可分别展现免疫原性减小(例如，先天性反应减少)。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含在多核苷酸合成期间或在多核苷酸合成后引入的经非天然修饰的核苷酸以达成所需的功能或特性。修饰可呈现于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。修饰可经化学合成或经聚合酶在链末端或链的任意其他处引入。多核苷酸的任何区域均可经化学修饰。
本公开提供多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)的经修饰的核苷和核苷酸。“核苷”是指与有机碱基(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文中也称为“核碱基”)组合的含有糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物的化合物。“核苷酸”是指核苷，包括磷酸酯基。经修饰的核苷酸可通过诸如化学、酶促或重组的任何适用方法合成，以包括一种或多种经修饰或非天然的核苷。多核苷酸可包含所连接核苷的一个或多个区域。此类区域可具有可变的主链键联。键联可为标准磷酸二酯键联，在此情况下多核苷酸将包含核苷酸的区域。
经修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且涵盖在核苷酸和/或经修饰的核苷酸之间形成的碱基对，包含非标准或经修饰的碱基，其中氢键供体和氢键受体的排列允许在非标准碱基与标准碱基之间或在两个互补非标准碱基结构(举例来说，诸如具有至少一个化学修饰的那些多核苷酸中)之间进行氢键结。此类非标准碱基配对的一个实例为经修饰的核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或接头的任何组合均可并入本公开的多核苷酸中。
适用于本公开的组合物、疫苗、方法和合成工艺中的多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)修饰(包括但不限于化学修饰)包括但不限于以下：2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷；2-甲硫基-N6-甲基腺苷；2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；N6-甘氨酸基氨基甲酰基腺苷；N6-异戊烯基腺苷；N6-甲基腺苷；N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；1，2′-O-二甲基腺苷；1-甲基腺苷；2′-O-甲基腺苷；2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；2-甲基腺苷；2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷；2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷；2′-O-甲基腺苷；2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；异戊烯基腺苷；N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷；N6，2′-O-二甲基腺苷；N6，2′-O-二甲基腺苷；N6，N6，2′-O-三甲基腺苷；N6，N6-二甲基腺苷；N6-乙酰基腺苷；N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷；N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；2-甲基腺苷；2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷；7-去氮杂-腺苷；N1-甲基-腺苷；N6，N6(二甲基)腺嘌呤；N6-顺-羟基-异戊烯基-腺苷；α-硫基-腺苷；2(氨基)腺嘌呤；2(氨基丙基)腺嘌呤；2(甲硫基)N6(异戊烯基)腺嘌呤；2-(烷基)腺嘌呤；2-(氨基烷基)腺嘌呤；2-(氨基丙基)腺嘌呤；2-(卤代)腺嘌呤；2-(卤代)腺嘌呤；2-(丙基)腺嘌呤；2′-氨基-2′-脱氧基-ATP；2′-叠氮基-2′-脱氧基-ATP；2′-脱氧基-2′-a-氨基腺苷TP；2′-脱氧基-2′-a-叠氮基腺苷TP；6(烷基)腺嘌呤；6(甲基)腺嘌呤；6-(烷基)腺嘌呤；6-(甲基)腺嘌呤；7(去氮杂)腺嘌呤；8(烯基)腺嘌呤；8(炔基)腺嘌呤；8(氨基)腺嘌呤；8(硫烷基)腺嘌呤；8-(烯基)腺嘌呤；8-(烷基)腺嘌呤；8-(炔基)腺嘌呤；8-(氨基)腺嘌呤；8-(卤代)腺嘌呤；8-(羟基)腺嘌呤；8-(硫烷基)腺嘌呤；8-(硫醇基)腺嘌呤；8-叠氮基-腺苷；氮杂腺嘌呤；去氮杂腺嘌呤；N6(甲基)腺嘌呤；N6-(异戊基)腺嘌呤；7-去氮杂-8-氮杂-腺苷；7-甲基腺嘌呤；1-去氮杂腺苷TP；2′氟-N6-Bz-脱氧基腺苷TP；2′-OMe-2-氨基-ATP；2′O-甲基-N6-Bz-脱氧基腺苷TP；2′-a-乙炔基腺苷TP；2-氨基腺嘌呤；2-氨基腺苷TP；2-氨基-ATP；2′-a-三氟甲基腺苷TP；2-叠氮基腺苷TP；2′-b-乙炔基腺苷TP；2-溴腺苷TP；2′-b-三氟甲基腺苷TP；2-氯腺苷TP；2′-脱氧基-2′，2′-二氟腺苷TP；2′-脱氧基-2′-a-巯基腺苷TP；2′-脱氧基-2′-a-硫基甲氧基腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氨基腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-叠氮基腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-溴腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氯腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氟腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-碘腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-巯基腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-硫基甲氧基腺苷TP；2-氟腺苷TP；2-碘腺苷TP；2-巯基腺苷TP；2-甲氧基-腺嘌呤；2-甲硫基-腺嘌呤；2-三氟甲基腺苷TP；3-去氮杂-3-溴腺苷TP；3-去氮杂-3-氯腺苷TP；3-去氮杂-3-氟腺苷TP；3-去氮杂-3-碘腺苷TP；3-去氮杂腺苷TP；4′-叠氮基腺苷TP；4′-碳环腺苷TP；4′-乙炔基腺苷TP；5′-高-腺苷TP；8-氮杂-ATP；8-溴-腺苷TP；8-三氟甲基腺苷TP；9-去氮杂腺苷TP；2-氨基嘌呤；7-去氮杂-2，6-二氨基嘌呤；7-去氮杂-8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤；7-去氮杂-8-氮杂-2-氨基嘌呤；2，6-二氨基嘌呤；7-去氮杂-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-2-氨基嘌呤；2-硫基胞苷；3-甲基胞苷；5-甲酰基胞苷；5-羟甲基胞苷；5-甲基胞苷；N4-乙酰基胞苷；2′-O-甲基胞苷；2′-O-甲基胞苷；5，2′-O-二甲基胞苷；5-甲酰基-2′-O-甲基胞苷；赖胞苷；N4，2′-O-二甲基胞苷；N4-乙酰基-2′-O-甲基胞苷；N4-甲基胞苷；N4，N4-二甲基-2′-OMe-胞苷TP；4-甲基胞苷；5-氮杂-胞苷；假-异-胞苷；吡咯并-胞苷；α-硫基-胞苷；2-(硫基)胞嘧啶；2′-氨基-2′-脱氧基-CTP；2′-叠氮基-2′-脱氧基-CTP；2′-脱氧基-2′-a-氨基胞苷TP；2′-脱氧基-2′-a-叠氮基胞苷TP；3(去氮杂)5(氮杂)胞嘧啶；3(甲基)胞嘧啶；3-(烷基)胞嘧啶；3-(去氮杂)5(氮杂)胞嘧啶；3-(甲基)胞苷；4，2′-O-二甲基胞苷；5(卤代)胞嘧啶；5(甲基)胞嘧啶；5(丙炔基)胞嘧啶；5(三氟甲基)胞嘧啶；5-(烷基)胞嘧啶；5-(炔基)胞嘧啶；5-(卤代)胞嘧啶；5-(丙炔基)胞嘧啶；5-(三氟甲基)胞嘧啶；5-溴-胞苷；5-碘-胞苷；5-丙炔基胞嘧啶；6-(偶氮基)胞嘧啶；6-氮杂-胞苷；氮杂胞嘧啶；去氮杂胞嘧啶；N4(乙酰基)胞嘧啶；1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷；1-甲基-假异胞苷；2-甲氧基-5-甲基-胞苷；2-甲氧基-胞苷；2-硫基-5-甲基-胞苷；4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷；4-甲氧基-假异胞苷；4-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷；4-硫基-1-甲基-假异胞苷；4-硫基-假异胞苷；5-氮杂-泽布拉林(zebularine)；5-甲基-泽布拉林；吡咯并-假异胞苷；泽布拉林；(E)-5-(2-溴-乙烯基)胞苷TP；2，2′-脱水-胞苷TP盐酸盐；2′氟-N4-Bz-胞苷TP；2′氟-N4-乙酰基-胞苷TP；2′-O-甲基-N4-乙酰基-胞苷TP；2′O-甲基-N4-Bz-胞苷TP；2′-a-乙炔基胞苷TP；2′-a-三氟甲基胞苷TP；2′-b-乙炔基胞苷TP；2′-b-三氟甲基胞苷TP；2′-脱氧基-2′，2′-二氟胞苷TP；2′-脱氧基-2′-a-巯基胞苷TP；2′-脱氧基-2′-a-硫基甲氧基胞苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氨基胞苷TP；2′-脱氧基-2′-b-叠氮基胞苷TP；2′-脱氧基-2′-b-溴胞苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氯胞苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氟胞苷TP；2′-脱氧基-2′-b-碘胞苷TP；2′-脱氧基-2′-b-巯基胞苷TP；2′-脱氧基-2′-b-硫基甲氧基胞苷TP；2′-O-甲基-5-(1-丙炔基)胞苷TP；3′-乙炔基胞苷TP；4′-叠氮基胞苷TP；4′-碳环胞苷TP；4′-乙炔基胞苷TP；5-(1-丙炔基)阿糖-胞苷TP；5-(2-氯-苯基)-2-硫基胞苷TP；5-(4-氨基-苯基)-2-硫基胞苷TP；5-氨基烯丙基-CTP；5-氰基胞苷TP；5-乙炔基阿糖-胞苷TP；5-乙炔基胞苷TP；5′-高-胞苷TP；5-甲氧基胞苷TP；5-三氟甲基-胞苷TP；N4-氨基-胞苷TP；N4-苄酰基-胞苷TP；假异胞苷；7-甲基鸟苷；N2，2′-O-二甲基鸟苷；N2-甲基鸟苷；怀俄苷；1，2′-O-二甲基鸟苷；1-甲基鸟苷；2′-O-甲基鸟苷；2′-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)；2′-O-甲基鸟苷；2′-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)；7-氨甲基-7-去氮杂鸟苷；7-氰基-7-去氮杂鸟苷；古嘌苷；甲基怀俄苷；N2，7-二甲基鸟苷；N2，N2，2′-O-三甲基鸟苷；N2，N2，7-三甲基鸟苷；N2，N2-二甲基鸟苷；N2，7，2′-O-三甲基鸟苷；6-硫基-鸟苷；7-去氮杂-鸟苷；8-氧代-鸟苷；N1-甲基-鸟苷；α-硫基-鸟苷；2(丙基)鸟嘌呤；2-(烷基)鸟嘌呤；2′-氨基-2′-脱氧基-GTP；2′-叠氮基-2′-脱氧基-GTP；2′-脱氧基-2′-a-氨基鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-a-叠氮基鸟苷TP；6(甲基)鸟嘌呤；6-(烷基)鸟嘌呤；6-(甲基)鸟嘌呤；6-甲基-鸟苷；7(烷基)鸟嘌呤；7(去氮杂)鸟嘌呤；7(甲基)鸟嘌呤；7-(烷基)鸟嘌呤；7-(去氮杂)鸟嘌呤；7-(甲基)鸟嘌呤；8(烷基)鸟嘌呤；8(炔基)鸟嘌呤；8(卤代)鸟嘌呤；8(硫烷基)鸟嘌呤；8-(烯基)鸟嘌呤；8-(烷基)鸟嘌呤；8-(炔基)鸟嘌呤；8-(氨基)鸟嘌呤；8-(卤代)鸟嘌呤；8-(羟基)鸟嘌呤；8-(硫烷基)鸟嘌呤；8-(硫醇基)鸟嘌呤；氮杂鸟嘌呤；去氮杂鸟嘌呤；N(甲基)鸟嘌呤；N-(甲基)鸟嘌呤；1-甲基-6-硫基-鸟苷；6-甲氧基-鸟苷；6-硫基-7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷；6-硫基-7-去氮杂-鸟苷；6-硫基-7-甲基-鸟苷；7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷；7-甲基-8-氧代-鸟苷；N2，N2-二甲基-6-硫基-鸟苷；N2-甲基-6-硫基-鸟苷；1-Me-GTP；2′氟-N2-异丁基-鸟苷TP；2′O-甲基-N2-异丁基-鸟苷TP；2′-a-乙炔基鸟苷TP；2′-a-三氟甲基鸟苷TP；2′-b-乙炔基鸟苷TP；2′-b-三氟甲基鸟苷TP；2′-脱氧基-2′，2′-二氟鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-a-巯基鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-a-硫基甲氧基鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氨基鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-叠氮基鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-溴鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氯鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氟鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-碘鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-巯基鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-硫基甲氧基鸟苷TP；4′-叠氮基鸟苷TP；4′-碳环鸟苷TP；4′-乙炔基鸟苷TP；5′-高-鸟苷TP；8-溴-鸟苷TP；9-去氮杂鸟苷TP；N2-异丁基-鸟苷TP；1-甲基肌苷；肌苷；1，2′-O-二甲基肌苷；2′-O-甲基肌苷；7-甲基肌苷；2′-O-甲基肌苷；环氧基辫苷；半乳糖基-辫苷；甘露糖基辫苷；辫苷；烯丙基氨基-胸苷；氮杂胸苷；去氮杂胸苷；脱氧基-胸苷；2′-O-甲基尿苷；2-硫尿苷；3-甲基尿苷；5-羧甲基尿苷；5-羟基尿苷；5-甲基尿苷；5-牛磺酸甲基-2-硫尿苷；5-牛磺酸甲基尿苷；二氢尿苷；假尿苷；(3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷；1-甲基-3-(3-氨基-5-羧丙基)假尿苷；1-甲基假尿苷；1-乙基-假尿苷；2′-O-甲基尿苷；2′-O-甲基假尿苷；2′-O-甲基尿苷；2-硫基-2′-O-甲基尿苷；3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷；3，2′-O-二甲基尿苷；3-甲基-假-尿苷TP；4-硫尿苷；5-(羧基羟甲基)尿苷；5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯；5，2′-O-二甲基尿苷；5，6-二氢-尿苷；5-氨甲基-2-硫尿苷；5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷；5-羧基羟甲基尿苷；5-羧基羟甲基尿苷甲酯；5-羧基甲基氨甲基-2′-O-甲基尿苷；5-羧基甲基氨甲基-2-硫尿苷；5-羧基甲基氨甲基尿苷；5-羧基甲基氨甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷TP；5-甲氧羰基甲基-2′-O-甲基尿苷；5-甲氧羰基甲基-2-硫尿苷；5-甲氧羰基甲基尿苷；5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷；5-甲基-2-硫尿苷；5-甲基氨甲基-2-硒基尿苷；5-甲基氨甲基-2-硫尿苷；5-甲基氨甲基尿苷；5-甲基二氢尿苷；5-氧基乙酸-尿苷TP；5-氧基乙酸-甲酯-尿苷TP；N1-甲基-假-尿嘧啶；N1-乙基-假-尿嘧啶；尿苷5-氧基乙酸；尿苷5-氧基乙酸甲酯；3-(3-氨基-3-羧丙基)-尿苷TP；5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫尿苷TP；5-(异戊烯基氨甲基)-2′-O-甲基尿苷TP；5-(异戊烯基氨甲基)尿苷TP；5-丙炔基尿嘧啶；α-硫基-尿苷；1(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫基)假尿嘧啶；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4(硫基)假尿嘧啶；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫基)假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-4(硫基)假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶；1取代的2(硫基)-假尿嘧啶；1取代的2，4-(二硫基)假尿嘧啶；1取代的4(硫基)假尿嘧啶；1取代的假尿嘧啶；1-(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2-(硫基)-假尿嘧啶；1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷TP；1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假-UTP；1-甲基-假-UTP；1-乙基-假-UTP；2(硫基)假尿嘧啶；2′脱氧基尿苷；2′氟尿苷；2-(硫基)尿嘧啶；2，4-(二硫基)假尿嘧啶；2′甲基、2′氨基、2′叠氮基、2′氟-鸟苷；2′-氨基-2′-脱氧基-UTP；2′-叠氮基-2′-脱氧基-UTP；2′-叠氮基-脱氧基尿苷TP；2′-O-甲基假尿苷；2′脱氧基尿苷；2′氟尿苷；2′-脱氧基-2′-a-氨基尿苷TP；2′-脱氧基-2′-a-叠氮基尿苷TP；2-甲基假尿苷；3(3氨基-3羧基丙基)尿嘧啶；4(硫基)假尿嘧啶；4-(硫基)假尿嘧啶；4-(硫基)尿嘧啶；4-硫基尿嘧啶；5(1，3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5(2-氨基丙基)尿嘧啶；5(氨基烷基)尿嘧啶；5(二甲基氨基烷基)尿嘧啶；5(胍鎓烷基)尿嘧啶；5(甲氧羰基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶；5(甲氧羰基-甲基)尿嘧啶；5(甲基)2(硫基)尿嘧啶；5(甲基)2，4(二硫基)尿嘧啶；5(甲基)4(硫基)尿嘧啶；5(甲基氨甲基)-2(硫基)尿嘧啶；5(甲基氨甲基)-2，4(二硫基)尿嘧啶；5(甲基氨甲基)-4(硫基)尿嘧啶；5(丙炔基)尿嘧啶；5(三氟甲基)尿嘧啶；5-(2-氨基丙基)尿嘧啶；5-(烷基)-2-(硫基)假尿嘧啶；5-(烷基)-2，4(二硫基)假尿嘧啶；5-(烷基)-4(硫基)假尿嘧啶；5-(烷基)假尿嘧啶；5-(烷基)尿嘧啶；5-(炔基)尿嘧啶；5-(烯丙基氨基)尿嘧啶；5-(氰基烷基)尿嘧啶；5-(二烷氨基烷基)尿嘧啶；5-(二甲基氨基烷基)尿嘧啶；5-(胍鎓烷基)尿嘧啶；5-(卤代)尿嘧啶；5-(1，3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5-(甲氧基)尿嘧啶；5-(甲氧羰基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶；5-(甲氧羰基-甲基)尿嘧啶；5-(甲基)2(硫基)尿嘧啶；5-(甲基)2，4(二硫基)尿嘧啶；5-(甲基)4(硫基)尿嘧啶；5-(甲基)-2-(硫基)假尿嘧啶；5-(甲基)-2，4(二硫基)假尿嘧啶；5-(甲基)-4(硫基)假尿嘧啶；5-(甲基)假尿嘧啶；5-(甲基氨甲基)-2(硫基)尿嘧啶；5-(甲基氨甲基)-2，4(二硫基)尿嘧啶；5-(甲基氨甲基)-4-(硫基)尿嘧啶；5-(丙炔基)尿嘧啶；5-(三氟甲基)尿嘧啶；5-氨基烯丙基-尿苷；5-溴-尿苷；5-碘-尿苷；5-尿嘧啶；6(偶氮基)尿嘧啶；6-(偶氮基)尿嘧啶；6-氮杂-尿苷；烯丙基氨基-尿嘧啶；氮杂尿嘧啶；去氮杂尿嘧啶；N3(甲基)尿嘧啶；假-UTP-1-2-乙酸；假尿嘧啶；4-硫基-假-UTP；1-羧甲基-假尿苷；1-甲基-1-去氮杂-假尿苷；1-丙炔基-尿苷；1-牛磺酸甲基-1-甲基-尿苷；1-牛磺酸甲基-4-硫基-尿苷；1-牛磺酸甲基-假尿苷；2-甲氧基-4-硫基-假尿苷；2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷；2-硫基-1-甲基-假尿苷；2-硫基-5-氮杂-尿苷；2-硫基-二氢假尿苷；2-硫基-二氢尿苷；2-硫基-假尿苷；4-甲氧基-2-硫基-假尿苷；4-甲氧基-假尿苷；4-硫基-1-甲基-假尿苷；4-硫基-假尿苷；5-氮杂-尿苷；二氢假尿苷；(±)1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(2R)-1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(2S)-1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)阿糖-尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)阿糖-尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP；1-(2，2，2-三氟乙基)-假-UTP；1-(2，2，3，3，3-五氟丙基)假尿苷TP；1-(2，2-二乙氧基乙基)假尿苷TP；1-(2，4，6-三甲基苄基)假尿苷TP；1-(2，4，6-三甲基-苄基)假-UTP；1-(2，4，6-三甲基-苯基)假-UTP；1-(2-氨基-2-羧基乙基)假-UTP；1-(2-氨基-乙基)假-UTP；1-(2-羟基乙基)假尿苷TP；1-(2-甲氧基乙基)假尿苷TP；1-(3，4-双-三氟甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(3，4-二甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(3-氨基-3-羧丙基)假-UTP；1-(3-氨基-丙基)假-UTP；1-(3-环丙基-丙-2-炔基)假尿苷TP；1-(4-氨基-4-羧基丁基)假-UTP；1-(4-氨基-苄基)假-UTP；1-(4-氨基-丁基)假-UTP；1-(4-氨基-苯基)假-UTP；1-(4-叠氮基苄基)假尿苷TP；1-(4-溴苄基)假尿苷TP；1-(4-氯苄基)假尿苷TP；1-(4-氟苄基)假尿苷TP；1-(4-碘苄基)假尿苷TP；1-(4-甲磺酰基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基-苄基)假-UTP；1-(4-甲氧基-苯基)假-UTP；1-(4-甲基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲基-苄基)假-UTP；1-(4-硝基苄基)假尿苷TP；1-(4-硝基-苄基)假-UTP；1(4-硝基-苯基)假-UTP；1-(4-硫基甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲基苄基)假尿苷TP；1-(5-氨基-戊基)假-UTP；1-(6-氨基-己基)假-UTP；1，6-二甲基-假-UTP；1-[3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基]假尿苷TP；1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-丙酰基}假尿苷TP；1-乙酰基假尿苷TP；1-烷基-6-(1-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-(2-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙炔基-假-UTP；1-烷基-6-高烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙烯基-假-UTP；1-烯丙基假尿苷TP；1-氨甲基-假-UTP；1-苄酰基假尿苷TP；1-苄氧基甲基假尿苷TP；1-苄基-假-UTP；1-生物素基-PEG2-假尿苷TP；1-生物素基假尿苷TP；1-丁基-假-UTP；1-氰基甲基假尿苷TP；1-环丁基甲基-假-UTP；1-环丁基-假-UTP；1-环庚基甲基-假-UTP；1-环庚基-假-UTP；1-环己基甲基-假-UTP；1-环己基-假-UTP；1-环辛基甲基-假-UTP；1-环辛基-假-UTP；1-环戊基甲基-假-UTP；1-环戊基-假-UTP；1-环丙基甲基-假-UTP；1-环丙基-假-UTP；1-乙基-假-UTP；1-己基-假-UTP；1-高烯丙基假尿苷TP；1-羟甲基假尿苷TP；1-异-丙基-假-UTP；1-Me-2-硫基-假-UTP；1-Me-4-硫基-假-UTP；1-Me-α-硫基-假-UTP；1-甲磺酰基甲基假尿苷TP；1-甲氧基甲基假尿苷TP；1-甲基-6-(2，2，2-三氟乙基)假-UTP；1-甲基-6-(4-吗啉基)-假-UTP；1-甲基-6-(4-硫基吗啉基)-假-UTP；1-甲基-6-(被取代的苯基)假-UTP；1-甲基-6-氨基-假-UTP；1-甲基-6-叠氮基-假-UTP；1-甲基-6-溴-假-UTP；1-甲基-6-丁基-假-UTP；1-甲基-6-氯-假-UTP；1-甲基-6-氰基-假-UTP；1-甲基-6-二甲基氨基-假-UTP；1-甲基-6-乙氧基-假-UTP；1-甲基-6-羧酸乙酯-假-UTP；1-甲基-6-乙基-假-UTP；1-甲基-6-氟-假-UTP；1-甲基-6-甲酰基-假-UTP；1-甲基-6-羟基氨基-假-UTP；1-甲基-6-羟基-假-UTP；1-甲基-6-碘-假-UTP；1-甲基-6-异-丙基-假-UTP；1-甲基-6-甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-甲基氨基-假-UTP；1-甲基-6-苯基-假-UTP；1-甲基-6-丙基-假-UTP；1-甲基-6-第三丁基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲基-假-UTP；1-吗啉基甲基假尿苷TP；1-戊基-假-UTP；1-苯基-假-UTP；1-三甲基乙酰基假尿苷TP；1-丙炔基假尿苷TP；1-丙基-假-UTP；1-丙炔基-假尿苷；1-对甲苯基-假-UTP；1-第三丁基-假-UTP；1-硫基甲氧基甲基假尿苷TP；1-硫基吗啉基甲基假尿苷TP；1-三氟乙酰基假尿苷TP；1-三氟甲基-假-UTP；1-乙烯基假尿苷TP；2，2′-脱水-尿苷TP；2′-溴-脱氧基尿苷TP；2′-F-5-甲基-2′-脱氧基-UTP；2′-OMe-5-Me-UTP；2′-OMe-假-UTP；2′-a-乙炔基尿苷TP；2′-a-三氟甲基尿苷TP；2′-b-乙炔基尿苷TP；2′-b-三氟甲基尿苷TP；2′-脱氧基-2′，2′-二氟尿苷TP；2′-脱氧基-2′-a-巯基尿苷TP；2′-脱氧基-2′-a-硫基甲氧基尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氨基尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-叠氮基尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-溴尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氯尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氟尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-碘尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-巯基尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-硫基甲氧基尿苷TP；2-甲氧基-4-硫基-尿苷；2-甲氧基尿苷；2′-O-甲基-5-(1-丙炔基)尿苷TP；3-烷基-假-UTP；4′-叠氮基尿苷TP；4′-碳环尿苷TP；4′-乙炔基尿苷TP；5-(1-丙炔基)阿糖-尿苷TP；5-(2-呋喃基)尿苷TP；5-氰基尿苷TP；5-二甲基氨基尿苷TP；5′-高-尿苷TP；5-碘-2′-氟-脱氧基尿苷TP；5-苯基乙炔基尿苷TP；5-三氘甲基-6-氘尿苷TP；5-三氟甲基-尿苷TP；5-乙烯基阿糖尿苷TP；6-(2，2，2-三氟乙基)-假-UTP；6-(4-吗啉基)-假-UTP；6-(4-硫基吗啉基)-假-UTP；6-(被取代的苯基)-假-UTP；6-氨基-假-UTP；6-叠氮基-假-UTP；6-溴-假-UTP；6-丁基-假-UTP；6-氯-假-UTP；6-氰基-假-UTP；6-二甲基氨基-假-UTP；6-乙氧基-假-UTP；6-羧酸乙酯-假-UTP；6-乙基-假-UTP；6-氟-假-UTP；6-甲酰基-假-UTP；6-羟基氨基-假-UTP；6-羟基-假-UTP；6-碘-假-UTP；6-异-丙基-假-UTP；6-甲氧基-假-UTP；6-甲基氨基-假-UTP；6-甲基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-丙基-假-UTP；6-第三丁基-假-UTP；6-三氟甲氧基-假-UTP；6-三氟甲基-假-UTP；α-硫基-假-UTP；假尿苷1-(4-甲基苯磺酸)TP；假尿苷1-(4-甲基苯甲酸)TP；假尿苷TP1-[3-(2-乙氧基)]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-乙氧基)-乙氧基}-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸二乙酯；假-UTP-N1-3-丙酸；假-UTP-N1-4-丁酸；假-UTP-N1-5-戊酸；假-UTP-N1-6-己酸；假-UTP-N1-7-庚酸；假-UTP-N1-甲基-对苯甲酸；假-UTP-N1-对-苯甲酸；怀丁苷；羟基怀丁苷；异怀俄苷；过氧基怀丁苷；未完全修饰的羟基怀丁苷；4-去甲基怀俄苷；2，6-(二氨基)嘌呤；1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-啡噻嗪-1-基；1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；1，3，5-(三氮杂)-2，6-(二氧杂)-萘；2(氨基)嘌呤；2，4，5-(三甲基)苯基；2′甲基、2′氨基、2′叠氮基、2′氟-胞苷；2′甲基、2′氨基、2′叠氮基、2′氟-腺嘌呤；2′甲基、2′氨基、2′叠氮基、2′氟-尿苷；2′-氨基-2′-脱氧基核糖；2-氨基-6-氯-嘌呤；2-氮杂-肌苷基；2′-叠氮基-2′-脱氧基核糖；2′氟-2′-脱氧基核糖；经2′-氟-修饰的碱基；2′-O-甲基-核糖；2-氧代-7-氨基吡啶并嘧啶-3-基；2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基；2-吡啶酮；3硝基吡咯；3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮；3-(甲基)异喹诺酮；4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)吲哚基；4，6-(二甲基)吲哚基；5硝基吲哚；5被取代的嘧啶；5-(甲基)异喹诺酮；5-硝基吲哚；6-(氮杂)嘧啶；6-(偶氮基)胸腺嘧啶；6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基；6-氯-嘌呤；6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡噻嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-啡噻嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(氮杂)吲哚基；7-(胍鎓烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-吩噁嗪-基；7-(胍鎓烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡噻嗪-1-基；7-(胍鎓烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(胍鎓烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(胍鎓烷基-羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-啡噻嗪-1-基；7-(胍鎓烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(丙炔基)异喹诺酮；7-(丙炔基)异喹诺酮，丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；7-去氮杂-肌苷基；7-取代的1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-取代的1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；9-(甲基)-咪唑并吡啶基；氨基吲哚基；蒽基；双-原-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；双-邻位被取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；二氟甲苯基；次黄嘌呤；咪唑并吡啶基；肌苷基；异喹诺酮；异鸟苷；N2-取代的嘌呤；N6-甲基-2-氨基-嘌呤；N6-取代的嘌呤；N-烷基化衍生物；萘基；硝基苯并咪唑基；硝基咪唑基；硝基吲唑基；硝基吡唑基；努布拉林(Nubularine)；O6-取代的嘌呤；O-烷基化衍生物；邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；邻位被取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；氧代间型霉素TP；对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；对位被取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；并五苯基；苯蒽基；苯基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；芘基；吡啶并嘧啶-3-基；吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基；吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；吡咯并嘧啶基；吡咯并吡嗪基；芪基；被取代的1，2，4-三唑；并四苯基；杀结核菌素(Tubercidine)；黄嘌呤；黄嘌呤核苷酸-5′-TP；2-硫基-泽布拉林；5-氮杂-2-硫基-泽布拉林；7-去氮杂-2-氨基-嘌呤；吡啶-4-酮核糖核苷；2-氨基-核糖苷基-TP；间型霉素A TP；间型霉素B TP；吡咯核苷TP(Pyrrolosine TP)；2′-OH-阿糖-腺苷TP；2′-OH-阿糖-胞苷TP；2′-OH-阿糖-尿苷TP；2′-OH-阿糖-鸟苷TP；5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷TP；和N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)腺苷TP。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包括至少两种(例如，2种、3种、4种或4种以上)前述经修饰的核碱基的组合。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)中经修饰的核碱基选自由以下组成的组：假尿苷(ψ)、2-硫尿苷(s2U)、4′-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2′-O-甲基尿苷、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、α-硫基-鸟苷、α-硫基-腺苷、5-氰基尿苷、4′-硫基尿苷7-去氮杂-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)和2，6-二氨基嘌呤、(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、7-去氮杂-鸟苷、7-氰基-7-去氮杂-鸟苷(preQ0)、7-氨甲基-7-去氮杂-鸟苷(preQ1)、7-甲基-鸟苷(m7G)、1-甲基-鸟苷(m1G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、2，8-二甲基腺苷、2-香叶基硫尿苷、2-赖胞苷、2-硒基尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)-5，6-二氢尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷、3-甲基假尿苷、5-(羧基羟甲基)-2′-O-甲基尿苷甲酯、5-氨甲基-2-香叶基硫尿苷、5-氨甲基-2-硒基尿苷、5-氨甲基尿苷、5-氨基甲酰基羟甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨甲基-2-香叶基硫尿苷、5-羧基甲基氨甲基-2-硒基尿苷、5-氰基甲基尿苷、5-羟基胞苷、5-甲基氨甲基-2-香叶基硫尿苷、7-氨基羧基丙基-去甲基怀俄苷、7-氨基羧基丙基怀俄苷、7-氨基羧基丙基怀俄苷甲酯、8-甲基腺苷、N4，N4-二甲基胞苷、N6-甲酰基腺苷、N6-羟甲基腺苷、胍丁胺胞苷(agmatidine)、环状N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、谷氨酰基-喹啉、甲基化修饰不完全的羟基怀丁苷、N4，N4，2′-O-三甲基胞苷、香叶基化5-甲基氨甲基-2-硫尿苷、香叶基化5-羧基甲基氨甲基-2-硫尿苷、Qbase、preQ0base、preQ1base及其两种或两种以上的组合。在一些实施方案中，至少一种经化学修饰的核苷选自由以下组成的组：假尿苷、1-甲基-假尿苷、1-乙基-假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷及其组合。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA聚核糖核苷酸，诸如mRNA聚核糖核苷酸)包括至少两种(例如，2种、3种、4种或4种以上)前述经修饰的核碱基的组合。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包括至少两种(例如，2种、3种、4种或4种以上)前述经修饰的核碱基的组合。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)中的经修饰的核碱基选自由以下组成的组：1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫基-鸟苷和α-硫基-腺苷。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸包括至少两种(例如，2种、3种、4种或4种以上)前述经修饰的核碱基的组合。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含1-乙基-假尿苷(e1ψ)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含1-乙基-假尿苷(e1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含2-硫尿苷(s2U)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含2-硫尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含2′-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含2′-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)经均匀修饰(例如，完全修饰、在整个序列中经修饰)以用于特定修饰。举例来说，多核苷酸可经1-甲基-假尿苷均匀修饰，意谓mRNA序列中的所有尿苷残基经1-甲基-假尿苷置换。类似地，多核苷酸可通过经诸如上文所述的那些残基的经修饰的残基置换而经均匀修饰为序列中存在的任何类似的核苷残基。
具有经修饰的胞嘧啶的例示性核碱基和核苷包括N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羟甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、2-硫基-胞苷(s2C)和2-硫基-5-甲基-胞苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基为经修饰的尿苷。具有经修饰的尿苷的例示性核碱基和核苷包括1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基尿苷、2-硫基尿苷、5-氰基尿苷、2′-O-甲基尿苷和4′-硫基尿苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基为经修饰的腺嘌呤。具有经修饰的腺嘌呤的例示性核碱基和核苷包括7-去氮杂-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)和N6-甲基-腺苷(m6A)。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基为经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的例示性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、7-去氮杂-鸟苷、7-氰基-7-去氮杂-鸟苷(preQ0)、7-氨甲基-7-去氮杂-鸟苷(preQ1)、7-甲基-鸟苷(m7G)、1-甲基-鸟苷(m1G)、8-氧代-鸟苷和7-甲基-8-氧代-鸟苷。
本公开的多核苷酸沿分子的整个长度可经部分或完全修饰。举例来说，在本发明的多核苷酸中，或在其特定预定序列区域中(例如，在包括或不包括polyA尾的mRNA中)，一种或多种或所有或特定类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任何一种或多种或全部)可经均匀修饰。在一些实施方案中，在本公开的多核苷酸中(或在其特定序列区域中)所有核苷酸X均为经修饰的核苷酸，其中X可为核苷酸A、G、U、C中的任一个，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一个。
多核苷酸可含有约1％至约100％经修饰的核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一种或多种)或任何介于中间的百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。应了解，任何其余百分比为未经修饰的A、G、U或C的存在所占。
多核苷酸可含有最小1％和最大100％经修饰的核苷酸，或任何介于中间的百分比，诸如至少5％经修饰的核苷酸、至少10％经修饰的核苷酸、至少25％经修饰的核苷酸、至少50％经修饰的核苷酸、至少80％经修饰的核苷酸或至少90％经修饰的核苷酸。举例来说，多核苷酸可含有经修饰的嘧啶，诸如经修饰的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶由经修饰的尿嘧啶(例如，5-取代的尿嘧啶)置换。经修饰的尿嘧啶可由具有单一独特结构的化合物置换，或可由多种具有不同结构(例如，2、3、4或4种以上独特结构)的化合物置换。在一些实施方案中，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶由经修饰的胞嘧啶(例如，5-取代的胞嘧啶)置换。经修饰的胞嘧啶可由具有单一独特结构的化合物置换，或可由多种具有不同结构(例如，2、3、4或4种以上独特结构)的化合物置换。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基为经修饰的尿嘧啶。具有经修饰的尿嘧啶的例示性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-尿苷(s2U)、4-硫基-尿苷(s4U)、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧基乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧基乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧羰基甲基-2-硫基-尿苷(mcm5s2U)、5-氨甲基-2-硫基-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲基氨甲基-2-硫基-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨甲基-2-硒基-尿苷(mnm5se2U)、5-氨基甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨甲基-2-硫基-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫基-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫基-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，即具有核碱基脱氧胸苷)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲基-2-硫基-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫基-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫基-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5，6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫基-尿苷(inm5s2U)、α-硫基-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5，2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫基-2′-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3，2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)和5-(异戊烯基氨甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫基-尿苷、脱氧胸苷、2′-F-阿糖-尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)]尿苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基为经修饰的胞嘧啶。具有经修饰的胞嘧啶的例示性核碱基和核苷包括5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲酰基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羟甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫基-胞苷(s2C)、2-硫基-5-甲基-胞苷、4-硫基-假异胞苷、4-硫基-1-甲基-假异胞苷、4-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷、1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷、泽布拉林、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫基-泽布拉林、2-硫基-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖胞苷(k2C)、α-硫基-胞苷、2′-O-甲基-胞苷(Cm)、5，2′-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2′-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4，2′-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2′-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4，N4，2′-O-三甲基-胞苷(m4 2Cm)、1-硫基-胞苷、2′-F-阿糖-胞苷、2′-F-胞苷和2′-OH-阿糖-胞苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基为经修饰的腺嘌呤。具有经修饰的腺嘌呤的例示性核碱基和核苷包括2-氨基-嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤代-嘌呤(例如，2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤代-嘌呤(例如，6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-2-氨基-嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-去氮杂-2，6-二氨基嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲硫基-N6-异戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘氨酸基氨基甲酰基-腺苷(g6A)、N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(m6t6A)、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(ms2g6A)、N6，N6-二甲基-腺苷(m6 2A)、N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺苷(hn6A)、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫基-腺苷、2′-O-甲基-腺苷(Am)、N6，2′-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6，N6，2′-O-三甲基-腺苷(m6 2Am)、1，2′-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫基-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2′-F-阿糖-腺苷、2′-F-腺苷、2′-OH-阿糖-腺苷和N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基为经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的例示性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OhyW)、未完全修饰的羟基怀丁苷(OhyW*)、7-去氮杂-鸟苷、辫苷(Q)、环氧基辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖-辫苷(manQ)、7-氰基-7-去氮杂-鸟苷(preQ0)、7-氨甲基-7-去氮杂-鸟苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-硫基-鸟苷、6-硫基-7-去氮杂-鸟苷、6-硫基-7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m7G)、6-硫基-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m1G)、N2-甲基-鸟苷(m2G)、N2，N2-二甲基-鸟苷(m2 2G)、N2，7-二甲基-鸟苷(m2，7G)、N2，N2，7-二甲基-鸟苷(m2，2，7G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫基-鸟苷、N2-甲基-6-硫基-鸟苷、N2，N2-二甲基-6-硫基-鸟苷、α-硫基-鸟苷、2′-O-甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2，N2-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2 2Gm)、1-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2，7-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2，7Gm)、2′-O-甲基-肌苷(Im)、1，2′-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2′-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)(Gr(p))、1-硫基-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、2′-F-阿糖-鸟苷和2′-F-鸟苷。
在一些实施方案中，RNA疫苗包含5′UTR元件、任选地经密码子优化的开放阅读框和3′UTR元件、poly(A)序列和/或聚腺苷酸化化信号，其中RNA未经化学修饰。
RSV RNA疫苗-RNA(例如，mRNA)的体外转录
本公开的RSV疫苗包含至少一种RNA多核苷酸，诸如mRNA(例如，经修饰的mRNA)。举例来说，mRNA从模板DNA体外转录，称为“体外转录模板”。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸具有至少一个化学修饰。至少一个化学修饰可包括(但不明确限于)本文所述的任何修饰。
RNA的体外转录在本领域中已知且在国际公开WO/2014/152027中描述，该专利以引用方式整体并入本文中。举例来说，在一些实施方案中，在体外转录反应中使用非扩增、线性化DNA模板产生RNA转录物以产生RNA转录物。在一些实施方案中，RNA转录物经由酶促封端来封端。在一些实施方案中，RNA转录物经由色谱方法纯化，例如使用寡聚dT底物。一些实施方案不包括使用DNA酶。在一些实施方案中，经由酶促体外转录反应，利用所需化学性质的T7噬菌体RNA聚合酶和核苷酸三磷酸，从编码所关注基因的非扩增、线性DNA模板合成RNA转录物。任何数目的RNA聚合酶或变体可用于本发明的方法中。聚合酶可选自(但不限于)噬菌体RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNa聚合酶)，和/或突变聚合酶，诸如(但不限于)能够合并经修饰的核酸和/或经修饰的核苷酸(包括经化学修饰的核酸和/或核苷酸)的聚合酶。
在一些实施方案中，利用非扩增、线性化质体DNA作为体外转录的模板DNA。在一些实施方案中，模板DNA为分离的DNA。在一些实施方案中，模板DNA为cDNA。在一些实施方案中，cDNA通过RNA多核苷酸的逆转录形成，例如(但不限于)RSV RNA，例如RSV mRNA。在一些实施方案中，将细胞(例如，细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)，例如DH-1细胞)用质体DNA模板转染。在一些实施方案中，培养经转染的细胞以复制质体DNA，随后将其分离并纯化。在一些实施方案中，DNA模板包括RNA聚合酶启动子，例如位于所关注基因的5′和可操作性地连接至所关注基因的T7启动子。
在一些实施方案中，体外转录模板编码5′非翻译(UTR)区，含有开放阅读框，且编码3′UTR和polyA尾。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度将取决于由模板所编码的mRNA。
“5′非翻译区”(UTR)是指直接位于起始密码子(即，由核糖体翻译的mRNA转录物的第一密码子)上游(即，5′)的不编码多肽的mRNA区域。
“3′非翻译区”(UTR)是指直接位于终止密码子(即，传导翻译终止信号的mRNA转录物的密码子)下游(即，3′)的不编码多肽的mRNA区域。
“开放阅读框”为以起始密码子(例如，蛋氨酸(ATG))开始且以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)结束并编码多肽的DNA的连续延伸段。
“polyA尾”为位于含有多个连续单磷酸腺苷的3′UTR下游，例如直接位于其下游(即，3′)的mRNA区域。polyA尾可含有10至300个单磷酸腺苷。举例来说，polyA尾可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，polyA尾含有50至250个单磷酸腺苷。在相关生物学情境中(例如，在细胞中、体内)，poly(A)尾用以保护mRNA以免酶促降解，例如在细胞质中，且有助于转录终止和/或mRNA从细胞核输出和翻译。
在一些实施方案中，多核苷酸包括200至3,000个核苷酸。举例来说，多核苷酸可包括200至500、200至1000、200至1500、200至3000、500至1000、500至1500、500至2000、500至3000、1000至1500、1000至2000、1000至3000、1500至3000或2000至3000个核苷酸)。
治疗方法
本文提供用于在人和其他哺乳动物中预防和/或治疗RSV的组合物(例如，药物组合物)、方法、试剂盒和试剂。RSV RNA(例如mRNA)疫苗可用作治疗剂或预防剂。其可用于药物中来预防和/或治疗传染病。在例示性方面，本公开的RSV RNA疫苗用于提供针对RSV的预防性保护作用。在施用本公开的RSV RNA疫苗后可达成针对RSV的预防性保护作用。疫苗可施用一次、两次、三次、四次或四次以上，但可能施用一次疫苗(任选地随后单次加强)即足够。尽管较不理想，但可能向受感染受试者施用疫苗来达成治疗性反应。给药可需要相应调整。
在本发明的多个方面中提供一种在受试者中引发针对RSV的免疫反应的方法。所述方法涉及向受试者施用RSV RNA疫苗，所述疫苗包含至少一种具有编码至少一种RSV抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA多核苷酸，由此在受试者中诱发对RSV抗原性多肽或其免疫原性片段具有特异性的免疫反应，其中受试者中的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对RSV的传统(例如，非核酸)疫苗进行疫苗接种的受试者中的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加。“抗-抗原性多肽抗体”为特异性结合抗原性多肽的血清抗体。
预防有效剂量为以临床上可接受的水平预防病毒感染的治疗有效剂量。在一些实施方案中，治疗有效剂量为疫苗的包装插页中所列的剂量。如本文所用，传统疫苗是指除本发明的mRNA疫苗以外的疫苗。举例来说，传统疫苗包括但不限于活微生物疫苗、死微生物疫苗、亚单位疫苗、蛋白抗原疫苗、DNA疫苗等。
在一些实施方案中，受试者中的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对RSV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加1log至10log。
在一些实施方案中，受试者中的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对RSV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加1log。
在一些实施方案中，受试者中的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对RSV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加2log。
在一些实施方案中，受试者中的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对RSV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加3log。
在一些实施方案中，受试者中的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对RSV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加5log。
在一些实施方案中，受试者中的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对RSV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加10log。
本发明的其他方面提供一种在受试者中引发针对RSV的免疫反应的方法。所述方法涉及向受试者施用RSV RNA疫苗，所述疫苗包含至少一种具有编码至少一种RSV抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA多核苷酸，由此在受试者中诱发对RSV抗原性多肽或其免疫原性片段具有特异性的免疫反应，其中受试者中的免疫反应等于在经相对于RNA疫苗而言2倍至100倍剂量水平的针对RSV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于在经相对于RSV RNA疫苗而言两倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于在经相对于RSV RNA疫苗而言三倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于在经相对于RSV RNA疫苗而言4倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于在经相对于RSV RNA疫苗而言5倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于在经相对于RSV RNA疫苗而言10倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于在经相对于RSV RNA疫苗而言50倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于在经相对于RSV RNA疫苗而言100倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于在经相对于RSV RNA疫苗而言10倍至1000倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于在经相对于RSV RNA疫苗而言100倍至1000倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。
在其他实施方案中，通过测定受试者中的[蛋白]抗体效价来评估免疫反应。
在其他方面，本发明是在受试者中引起针对RSV的免疫反应的方法，其通过向受试者施用RSV RNA疫苗，所述疫苗包含至少一种具有编码至少一种RSV抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA多核苷酸，由此在受试者中诱发对RSV抗原性多肽或其免疫原性片段具有特异性的免疫反应，其中受试者中的免疫反应相对于在经预防有效剂量的针对RSV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中所诱发的免疫反应早2天至10周诱发。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应是在经相对于RNA疫苗而言2倍至100倍剂量水平的预防有效剂量的传统疫苗免疫接种的受试者中诱发。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应相对于在经预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中诱发的免疫反应早2天诱发。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应相对于在经预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中诱发的免疫反应早3天诱发。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应相对于在经预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中诱发的免疫反应早1周诱发。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应相对于在经预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中诱发的免疫反应早2周诱发。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应相对于在经预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中诱发的免疫反应早3周诱发。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应相对于在经预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中诱发的免疫反应早5周诱发。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应相对于在经预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中诱发的免疫反应早10周诱发。
广谱RSV疫苗
预期可存在人具有感染一种以上RSV毒株的风险的情形。RNA(例如，mRNA)治疗性疫苗由于多种因素而尤其符合组合疫苗接种方法，包括但不限于制造速度、快速调整疫苗以适应可见的地理威胁的能力及类似因素。此外，因为疫苗利用人体来产生抗原性蛋白，故疫苗符合产生更大、更复杂抗原性蛋白，从而允许在人类受试者中适当折叠、表面表达、抗原呈现等。为提供针对RSV毒株的保护作用，可施用组合疫苗，其包括编码第一RSV的至少一种抗原性多肽蛋白(或其抗原性部分)的RNA且还包括编码第二RSV的至少一种抗原性多肽蛋白(或其抗原性部分)的RNA。RNA(mRNA)可例如在单一脂质纳米粒子(LNP)中共配制，或可在单独LNP中配制，目的在于共施用。
鞭毛蛋白佐剂
鞭毛蛋白是约500个氨基酸的单体蛋白，其聚合形成与细菌运动相关的鞭毛。鞭毛蛋白是由多种有鞭毛的细菌(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))以及无鞭毛的细菌(诸如大肠杆菌)表达。先天性免疫系统细胞(树枝状细胞、巨噬细胞等)对鞭毛蛋白的感知由Toll样受体5(TLR5)以及Nod样受体(NLR)Ipaf和Naip5介导。TLR和NLR已经鉴定为在先天性免疫反应和适应性免疫反应的活化中起作用。因此，鞭毛蛋白在疫苗中提供佐剂作用。
编码已知鞭毛蛋白多肽的核苷酸和氨基酸序列是在NCBI GenBank数据库中公开可得。已知来自鼠伤寒沙门氏菌、幽门螺旋杆菌(H.Pylori)、霍乱弧菌(V.Cholera)、粘质沙雷氏菌(S.marcesens)、弗氏志贺氏菌(S.flexneri)、梅毒螺旋菌(T.Pallidum)、嗜肺军团菌(L.pneumophila)、伯氏疏螺旋菌(B.burgdorferei)、艰难梭状芽孢杆菌(C.difficile)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)、根癌农杆菌(A.tumefaciens)、羽扇豆根瘤菌(R.lupini)、克氏巴尔通体(B.clarridgeiae)、奇异变形杆菌(P.Mirabilis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilus)、单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogene)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)和大肠杆菌的鞭毛蛋白序列。
如本文所用，鞭毛蛋白多肽是指全长鞭毛蛋白、其免疫原性片段和与鞭毛蛋白或其免疫原性片段具有至少50％序列同一性的肽。例示性鞭毛蛋白包括来自伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)(UniPro Entry编号：Q56086)、鼠伤寒沙门氏菌(A0A0C9DG09)、肠炎沙门氏菌(enteritidis)(A0A0C9BAB7)和猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)(Q6V2X8)和SEQ ID NO：173至175的鞭毛蛋白。在一些实施方案中，鞭毛蛋白多肽与鞭毛蛋白或其免疫原性片段具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％、98％、或99％序列同一性。
在一些实施方案中，鞭毛蛋白多肽为免疫原性片段。免疫原性片段为鞭毛蛋白中引发免疫反应的一部分。在一些实施方案中，免疫反应为TLR5免疫反应。免疫原性片段的实例为其中铰链区的全部或一部分已删除或由其他氨基酸置换的鞭毛蛋白。举例来说，抗原性多肽可插入铰链区中。铰链区为鞭毛蛋白的高变区。鞭毛蛋白的铰链区也称为“D3结构域或区域”、“螺旋桨构域或区域”、“高变结构域或区域”和“可变结构域或区域”。如本文所用，“铰链区的至少一部分”是指鞭毛蛋白的铰链区的任何部分，或整个铰链区。在其他实施方案中，鞭毛蛋白的免疫原性片段为鞭毛蛋白的20、25、30、35或40个氨基酸的C末端片段。
鞭毛蛋白单体由结构域D0至D3形成。形成茎秆的D0和D1由串联的长α螺旋构成且在不同细菌中高度保守。D1结构域包括适用于TLR5活化的数个氨基酸延伸段。整个D1结构域或结构域中的一或多个活性区域为鞭毛蛋白的免疫原性片段。D1结构域中的免疫原性区域的实例包括残基88至114和残基411至431(在鼠伤寒沙门氏菌FliC鞭毛蛋白中)。在88至100区域中的13个氨基酸中，在沙门氏菌(Salmonella)鞭毛蛋白与仍然保持TLR5活化的其他鞭毛蛋白之间允许至少6个取代。因此，鞭毛蛋白的免疫原性片段包括类鞭毛蛋白序列，其活化TLR5且含有与沙门氏菌序列在FliC的88至100(LQRVRELAVQSAN；SEQ ID NO：286)中53％或53％以上相同的13个氨基酸的基序。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗包括编码鞭毛蛋白与一种或多种抗原性多肽的融合蛋白的RNA。如本文所用，“融合蛋白”是指连接构建体的两种组分。在一些实施方案中，抗原性多肽的羧基末端与鞭毛蛋白多肽的氨基末端融合或连接。在其他实施方案中，抗原性多肽的氨基末端与鞭毛蛋白多肽的羧基末端融合或连接。融合蛋白可包括例如连接至一种、两种、三种、四种、五种、六种或六种以上抗原性多肽的一种、两种、三种、四种、五种、六种或六种以上鞭毛蛋白多肽。当两种或两种以上鞭毛蛋白多肽和/或两种或两种以上抗原性多肽连接时，此种构建体可称为“多聚体”。
融合蛋白的每一组分可直接相互连接或其可经由接头连接。举例来说，接头可为氨基酸接头。由RNA(例如，mRNA)疫苗编码以连接融合蛋白的组分的氨基酸接头可包括例如至少一种选自由以下组成的组的成员：赖氨酸残基、谷氨酸残基、丝氨酸残基和精氨酸残基。在一些实施方案中，接头的长度为1至30、1至25、1至25、5至10、5、15或5至20个氨基酸。
在其他实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗包括至少两种单独RNA多核苷酸，一种编码一种或多种抗原性多肽且另一种编码鞭毛蛋白多肽。至少两种RNA多核苷酸可在诸如脂质纳米粒子的载体中共配制。
治疗性和预防性组合物
本文提供用于例如在人和其他哺乳动物中预防、治疗或诊断RSV的组合物(例如，药物组合物)、方法、试剂盒和试剂。RSV RNA(例如，mRNA)疫苗可用作治疗剂或预防剂。其可用于医学中以预防和/或治疗传染病。在一些实施方案中，本发明的RSV疫苗可预期用于引发免疫效应细胞，例如用于离体活化外周血单核细胞(PBMC)，这些细胞随后输注(再输注)至受试者中。
在例示性实施方案中，含有如本文所述的RNA多核苷酸的RSV疫苗可向受试者(例如，哺乳动物受试者，诸如人类受试者)施用，且RNA多核苷酸经体内翻译以产生抗原性多肽。
RSV RNA疫苗可经诱发用于在细胞、组织或有机体中翻译多肽(例如，抗原或免疫原)。在例示性实施方案中，此种翻译发生在体内，但可预期存在此种翻译发生在离体、在培养物中或在体外的实施方案。在例示性实施方案中，使细胞、组织或有机体与有效量的含有RSV RNA疫苗的组合物接触，所述疫苗含有具有至少一种编码抗原性多肽的可翻译区的多核苷酸。
“有效量”的RSV RNA疫苗是至少部分基于标靶组织、标靶细胞类型、施用方式、多核苷酸的物理特征(例如，经修饰核苷的大小和程度)和RSV RNA疫苗的其他组分和其他决定因素来提供。一般来说，有效量的RSV RNA疫苗组合物提供随细胞中的抗原产生而变化的诱发或加强的免疫反应。一般来说，有效量的含有具有至少一个化学修饰的RNA多核苷酸的RSV RNA疫苗优选比含有编码相同抗原或肽抗原的相应未经修饰的多核苷酸的组合物更有效。抗原产生增加可由细胞转染增加(经RNA疫苗转染的细胞的百分比)、从多核苷酸的蛋白翻译增加、核酸降解减少(如例如通过从经修饰的多核苷酸进行蛋白翻译的持续时间增加所示)或宿主细胞的抗原特异性免疫反应改变来证明。
术语“药物组合物”是指活性药剂与惰性或活性载体的组合，从而产生尤其适于体内或离体诊断性或治疗性用途的组合物。“药学上可接受的载体”在向或对受试者施用后不会引起不合需要的生理作用。药物组合物中的载体在其与活性成分相容且可能够使其稳定化的意义上还必须为“可接受的”。一种或多种增溶剂可用作药学载体以递送活性药剂。药学上可接受的载体的实例包括但不限于生物相容性媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂以达成可用作剂型的组合物。其他载体的实例包括胶态二氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和十二烷基硫酸钠。其他合适的药学载体和稀释剂以及有关其使用的药学辅料在Remington′sPharmaceutical Sciences中描述。
在一些实施方案中，根据本公开的RNA疫苗(包括多核苷酸及其编码的多肽)可用于治疗或预防RSV。
RSV RNA疫苗可作为主动免疫接种流程的一部分向健康受试者或在感染早期在潜伏期或在症状发作后的活动性感染期预防性或治疗性地施用。在一些实施方案中，提供给细胞、组织或受试者的本公开的RNA疫苗的量可为对于免疫预防有效的量。
RSV RNA(例如，mRNA)疫苗可与其他预防性或治疗性化合物一起施用。作为非限制性实例，预防性或治疗性化合物可为佐剂或加强剂。如本文所用，当提及预防性组合物(诸如疫苗)时，术语“加强剂”是指额外施用预防性(疫苗)组合物。加强剂(或加强剂疫苗)可在早期施用预防性组合物后给予。初始施用预防性组合物与加强剂间的施用时间可为(但不限于)1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或99年以上。在例示性实施方案中，初始施用预防性组合物与加强剂间的施用时间可为(但不限于)1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。
在一些实施方案中，RSV RNA疫苗可类似于本领域中已知的灭活疫苗的施用肌内、鼻内或皮内施用。
RSV RNA疫苗取决于感染的发病率或未满足医学需求的程度或水平而可用于各种情境中。作为非限制性实例，RNA疫苗可用于治疗和/或预防多种传染病。在许多情况下，RNA疫苗的优越特性在于其与市售抗病毒剂相比产生大得多的抗体效价且更早地产生反应。
本文提供药物组合物，其包括RSV RNA疫苗和RNA疫苗组合物和/或任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的复合物。
RSV RNA(例如，mRNA)疫苗可单独配制或施用或与一种或多种其他组分结合配制或施用。举例来说，RSV RNA疫苗(疫苗组合物)可包含其他组分，包括但不限于佐剂。
在一些实施方案中，RSV RNA疫苗不包括佐剂(其不含佐剂)。
RSV RNA(例如，mRNA)疫苗可与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合配制或施用。在一些实施方案中，疫苗组合物包含至少一种其他活性物质，例如治疗活性物质、预防活性物质或两者的组合。疫苗组合物可为无菌的、不含热原质或无菌又不含热原质。药物制剂(诸如疫苗组合物)的配制和/或制造中的一般考虑因素可例如见于Remington：TheScience and Practice of Pharmacy第21版，Lippincott Williams&Wilkins，2005(其全文以引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，向人、人类患者或受试者施用RSV RNA疫苗。出于本公开的目的，词组“活性成分”通常是指RNA疫苗或其中所含的多核苷酸，例如编码抗原性多肽的RNA多核苷酸(例如，mRNA多核苷酸)。
本文所述的疫苗组合物的制剂可通过已知或后来在药理学技术中研发的任何方法来制备。一般来说，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分(例如，mRNA多核苷酸)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，且随后，必要和/或需要时，将产物分份、成形和/或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
根据本公开内容，药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量将根据受治疗受试者的身份、体型和/或病况且进一步根据组合物的施用途径而变化。举例来说，组合物可包含介于0.1％与100％之间，例如介于0.5与50％之间、介于1至30％之间、介于5至80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
RSV RNA疫苗可使用一种或多种赋形剂来配制以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如，来自储存制剂)；(4)改变生物分布(例如，靶向特异性组织或细胞类型)；(5)增加所编码蛋白的体内翻译；和/或(6)改变所编码蛋白(抗原)的体内释放概况。除了诸如任何和所有溶剂、分散液培养基、稀释剂或其他液体媒介物的传统赋形剂以外，分散液或悬浮液助剂、表面活性剂、等张剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、赋形剂可包括(不限于)类脂质、脂质体、脂质纳米粒子、聚合物、脂质体复合物(lipoplex)、核壳纳米粒子、肽、蛋白、经RSV RNA疫苗转染的细胞(例如，用于移植至受试者中)、透明质酸酶、纳米粒子仿真物及其组合。
稳定化元件
已发现天然存在的真核mRNA分子除了诸如5′-端帽结构或3′-poly(A)尾的其他结构特征以外还含有稳定化元件，其包括但不限于位于其5′-末端的非翻译区(UTR)(5′UTR)和/或位于其3′-末端的非翻译区(UTR)(3′UTR)。5′UTR与3′UTR两者通常均由基因组DNA转录且为未成熟mRNA的元件。通常在mRNA加工期间向经转录(未成熟)的mRNA中增加成熟mRNA的特征性结构特征，诸如5′-端帽和3′-poly(A)尾。3′-poly(A)尾通常为添加至经转录的mRNA的3′-末端的腺嘌呤核苷酸的延伸段。其可包含多达约400个腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，3′-poly(A)尾的长度可为相对于个别mRNA的稳定性而言的必需元件。
在一些实施方案中，RNA疫苗可包括一种或多种稳定化元件。稳定化元件可包括例如组蛋白茎环。已识别茎环结合蛋白(SLBP)，一种32kDa蛋白。其与位于核与细胞质中的组蛋白信使的3′-末端的组蛋白茎环缔合。其表达水平由细胞周期来调节；其在S期期间达到峰值，此时组蛋白mRNA含量也升高。已显示蛋白为由U7 snRNP对组蛋白前mRNA的3′-末端进行有效加工所必需的。SLBP在加工后继续与茎环缔合，且随后刺激成熟组蛋白mRNA在细胞质中翻译为组蛋白。SLBP的RNA结合结构域在后生动物和原生动物中是保守的；其与组蛋白茎环的结合取决于环的结构。最小结合位点相对于茎环而言包括至少三个核苷酸5′和两个核苷酸3′。
在一些实施方案中，RNA疫苗包括编码区、至少一个组蛋白茎环和任选地存在的poly(A)序列或聚腺苷酸化化信号。poly(A)序列或聚腺苷酸化化信号通常应增强所编码蛋白的表达水平。在一些实施方案中，所编码蛋白并非组蛋白、报告子蛋白(例如，荧光素酶、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶、EGFP)或标记或选择蛋白(例如，α-球蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤：鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。
在一些实施方案中，poly(A)序列或聚腺苷酸化化信号与至少一个组蛋白茎环的组合尽管实际上均表示替代机制，但仍协同作用以增加蛋白表达超越由任一个别元件所观察到的水平。已发现，poly(A)与至少一个组蛋白茎环的组合的协同作用并不取决于元件的次序或poly(A)序列的长度。
在一些实施方案中，RNA疫苗不包含组蛋白下游元件(HDE)。“组蛋白下游元件”(HDE)包括位于天然存在的茎环的3′的约15至20个核苷酸的富含嘌呤的多核苷酸延伸段，表示U7 snRNA的结合位点，其在将组蛋白前mRNA加工为成熟组蛋白mRNA中有所涉及。在一些实施方案中，核酸不包括内含子。
在一些实施方案中，RNA疫苗可含有或可不含增强子和/或启动子序列，其可经修饰或未经修饰或可为活化或未活化的。在一些实施方案中，组蛋白茎环通常源自组蛋白基因，且包括由间隔基分开、由短序列组成的两个相邻的部分或完全反向互补序列的分子内碱基配对，其形成所述结构的环。非配对环区域通常无法与茎环元件的任一者进行碱基配对。其更常发生在RNA中，因其是多种RNA二级结构的重要组分，但还可存在于单链DNA中。茎环结构的稳定性通常取决于长度、错配或凸起的数量和配对区域的碱基组成。在一些实施方案中，可产生不稳定的碱基配对(非Watson-Crick碱基配对)。在一些实施方案中，至少一个组蛋白茎环序列包含15至45个核苷酸的长度。
在其他实施方案中，RNA疫苗可移除一个或多个富含AU的序列。这些序列(有时称为AURES)是在3′UTR中发现的去稳定化序列。AURES可从RNA疫苗移除。或者，AURES可保留在RNA疫苗中。
在一些实施方案中，RNA多核苷酸不包括稳定化元件。
纳米粒子制剂
在一些实施方案中，RSV RNA疫苗(例如，mRNA)是在纳米粒子中配制。在一些实施方案中，RSV RNA疫苗是在脂质纳米粒子中配制。在一些实施方案中，RSV RNA疫苗是在脂质-聚阳离子复合物(称为阳离子型脂质纳米粒子)中配制。脂质纳米粒子的形成可通过本领域中已知的方法和/或如美国公开第20120178702号中所述的方法来实现，该专利以引用方式整体并入本文中。作为非限制性实例，阳离子型脂质纳米粒子可包括阳离子型肽或多肽，诸如(但不限于)聚赖氨酸、聚鸟氨酸和/或聚精氨酸和国际公开第WO2012013326号或美国专利公开第US20130142818号中所述的阳离子型肽；其各自以引用方式整体并入本文中。在一些实施方案中，RSV RNA疫苗是在包括非阳离子型脂质，诸如(但不限于)胆固醇或二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)的脂质纳米粒子中配制。
脂质纳米粒子制剂可受(但不限于)阳离子型脂质组分的选择、阳离子型脂质的饱和程度、PEG化的性质、所有组分的比率和生物物理学参数(诸如尺寸)的影响。在Semple等人(Nature Biotech.2010 28：172-176；其以引用方式整体并入本文中)的一个实例中，脂质纳米粒子制剂由57.1％阳离子型脂质、7.1％二棕榈酰基磷脂酰胆碱、34.3％胆固醇和1.4％PEG-c-DMA组成。作为另一实例，显示改变阳离子型脂质的组成更有效地将siRNA递送至各种抗原呈递细胞(Basha等人Mol Ther.2011 19：2186-2200；其以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂可包含35至45％阳离子型脂质、40％至50％阳离子型脂质、50％至60％阳离子型脂质和/或55％至65％阳离子型脂质。在一些实施方案中，脂质纳米粒子中的脂质与RNA(例如，mRNA)的比率可为5∶1至20∶1、10∶1至25∶1、15∶1至30∶1和/或至少30∶1。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂中PEG的比率可增加或减少，和/或PEG脂质的碳链长度可从C14修饰为C18以改变脂质纳米粒子制剂的药物动力学和/或生物分布。作为非限制性实例，脂质纳米粒子制剂可含有与阳离子型脂质、DSPC和胆固醇相比脂质摩尔比为0.5％至3.0％、1.0％至3.5％、1.5％至4.0％、2.0％至4.5％、2.5％至5.0％和/或3.0％至6.0％的PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺)(本文中也称为PEG-DOMG)。在一些实施方案中，PEG-c-DOMG可由PEG脂质替代，诸如(但不限于)PEG-DSG(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油)和/或PEG-DPG(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇)。阳离子型脂质可选自本领域中已知的任何脂质，诸如(但不限于)DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200和DLin-KC2-DMA(参见例如美国公开第20130245107 A1号)。
在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗制剂为包含至少一种脂质的纳米粒子。脂质可选自(但不限于)DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、PEG化脂质和氨基醇脂质。在一些实施方案中，脂质可为阳离子型脂质，诸如(但不限于)DLin-DMA、DLin-D-DMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA和氨基醇脂质。氨基醇阳离子型脂质可为美国公开第US20130150625号中所述和/或由其中所述的方法制得的脂质，该专利以引用方式整体并入本文中。作为非限制性实例，阳离子型脂质可为2-氨基-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z，2Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物1)；2-氨基-3-[(9Z)-十八-9-烯-1-基氧基]-2-{[(9Z)-十八-9-烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物2)；2-氨基-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-2-[(辛基氧基)甲基]丙-1-醇(US20130150625中的化合物3)；和2-(二甲基氨基)-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物4)；或其任何药学上可接受的盐或立体异构体。
脂质纳米粒子制剂通常包含脂质，尤其为可电离的阳离子型脂质，例如2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺(L608)或N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)，且还包含中性脂质、固醇和能够减少粒子聚集的分子，例如PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂基本上由以下组成：(i)至少一种选自以下各物组成的组的脂质：2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)；(ii)选自DSPC、DPPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质；(iii)固醇，例如胆固醇；和(iv)PEG-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，其摩尔比为20至60％阳离子型脂质：5至25％中性脂质：25至55％固醇；0.5至15％PEG-脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括以摩尔浓度计25％至75％选自由2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)组成的组的阳离子型脂质，例如以摩尔浓度计35至65％、45至65％、60％、57.5％、50％或40％。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括以摩尔浓度计0.5％至15％中性脂质，例如以摩尔浓度计3至12％、5至10％或15％、10％或7.5％。中性脂质的实例包括(不限于)DSPC、POPC、DPPC、DOPE和SM。在一些实施方案中，制剂包括以摩尔浓度计5％至50％固醇(例如，以摩尔浓度计15至45％、20至40％、40％、38.5％、35％或31％)。固醇的非限制性实例为胆固醇。在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括以摩尔浓度计0.5％至20％PEG或经PEG修饰的脂质(例如，以摩尔浓度计0.5至10％、0.5至5％、1.5％、0.5％、1.5％、3.5％或5％)。在一些实施方案中，PEG或经PEG修饰的脂质包含平均分子量为2,000Da的PEG分子。在一些实施方案中，PEG或经PEG修饰的脂质包含平均分子量小于2,000，例如约1,500Da、约1,000Da或约500Da的PEG分子。经PEG修饰的脂质的非限制性实例包括PEG-二硬脂酰基甘油(PEG-DMG)(本文中也称为PEG-C14或C14-PEG)、PEG-cDMA(在Reyes等人J.ControlledRelease，107，276-287(2005)中进一步论述，其内容以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括以摩尔浓度计25至75％选自由2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)组成的组的阳离子型脂质、0.5至15％中性脂质、5至50％固醇和0.5至20％PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括以摩尔浓度计35至65％选自由2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)组成的组的阳离子型脂质、3至12％中性脂质、15至45％固醇和0.5至10％PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括以摩尔浓度计45至65％选自由2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)组成的组的阳离子型脂质、5至10％中性脂质、25至40％固醇和0.5至10％PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括以摩尔浓度计60％选自由2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)组成的组的阳离子型脂质、7.5％中性脂质、31％固醇和1.5％PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括以摩尔浓度计50％选自由2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)组成的组的阳离子型脂质、10％中性脂质、38.5％固醇和1.5％PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括以摩尔浓度计50％选自由2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)组成的组的阳离子型脂质、10％中性脂质、35％固醇、4.5％或5％PEG或经PEG修饰的脂质和0.5％标靶脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括以摩尔浓度计40％选自由2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)组成的组的阳离子型脂质、15％中性脂质、40％固醇和5％PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括以摩尔浓度计57.2％选自由2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)组成的组的阳离子型脂质、7.1％中性脂质、34.3％固醇和1.4％PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂包括以摩尔浓度计57.5％阳离子型脂质(选自PEG脂质，其为PEG-cDMA，PEG-cDMA在Reyes等人(J.Controlled Release，107，276-287(2005)中进一步论述，其内容以引用方式整体并入本文中))、7.5％中性脂质、31.5％固醇和3.5％PEG或经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂基本上由摩尔比为20至70％阳离子型脂质：5至45％中性脂质：20至55％胆固醇：0.5至15％经PEG修饰的脂质的脂质混合物组成。在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂基本上由摩尔比为20至60％阳离子型脂质：5至25％中性脂质：25至55％胆固醇：0.5至15％经PEG修饰的脂质的脂质混合物组成。
在一些实施方案中，脂质的摩尔比为50/10/38.5/1.5(mol％阳离子型脂质/中性脂质，例如DSPC/Chol/经PEG修饰的脂质，例如PEG-DMG、PEG-DSG或PEG-DPG)、57.2/7.1134.3/1.4(mol％阳离子型脂质/中性脂质，例如DPPC/Chol/经PEG修饰的脂质，例如PEG-cDMA)、40/15/40/5(mol％阳离子型脂质/中性脂质，例如DSPC/Chol/经PEG修饰的脂质，例如PEG-DMG)、50/10/35/4.5/0.5(mol％阳离子型脂质/中性脂质，例如DSPC/Chol/经PEG修饰的脂质，例如PEG-DSG)、50/10/35/5(阳离子型脂质/中性脂质，例如DSPC/Chol/经PEG修饰的脂质，例如PEG-DMG)、40/10/40/10(mol％阳离子型脂质/中性脂质，例如DSPC/Chol/经PEG修饰的脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)、35/15/40/10(mol％阳离子型脂质/中性脂质，例如DSPC/Chol/经PEG修饰的脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)或52/13/30/5(mol％阳离子型脂质/中性脂质，例如DSPC/Chol/经PEG修饰的脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)。
脂质纳米粒子组合物及其制备方法的非限制性实例例如在Semple等人(2010)Nat.Biotechnol.28：172-176；Jayarama等人(2012)，Angew.Chem.Int.编，51：8529-8533；和Maier等人(2013)Molecular Therapy 21，1570-1578(其各自的内容以引用方式整体并入本文中)中描述。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂可包含阳离子型脂质、PEG脂质和结构脂质且任选地包含非阳离子型脂质。作为非限制性实例，脂质纳米粒子可包含40至60％阳离子型脂质、5至15％非阳离子型脂质、1至2％PEG脂质和30至50％结构脂质。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含50％阳离子型脂质、10％非阳离子型脂质、1.5％PEG脂质和38.5％结构脂质。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含55％阳离子型脂质、10％非阳离子型脂质、2.5％PEG脂质和32.5％结构脂质。在一些实施方案中，阳离子型脂质可为本文所述的任何阳离子型脂质，诸如(但不限于)DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA、L319、L608和L520。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子制剂可为4组分脂质纳米粒子。脂质纳米粒子可包含阳离子型脂质、非阳离子型脂质、PEG脂质和结构脂质。作为非限制性实例，脂质纳米粒子可包含40至60％阳离子型脂质、5至15％非阳离子型脂质、1至2％PEG脂质和30至50％结构脂质。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含50％阳离子型脂质、10％非阳离子型脂质、1.5％PEG脂质和38.5％结构脂质。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子可包含55％阳离子型脂质、10％非阳离子型脂质、2.5％PEG脂质和32.5％结构脂质。在一些实施方案中，阳离子型脂质可为本文所述的任何阳离子型脂质，诸如(但不限于)DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA、L319、L608和L520。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子制剂可包含阳离子型脂质、非阳离子型脂质、PEG脂质和结构脂质。作为非限制性实例，脂质纳米粒子包含50％阳离子型脂质DLin-KC2-DMA、10％非阳离子型脂质DSPC、1.5％PEG脂质PEG-DOMG和38.5％结构脂质胆固醇。作为非限制性实例，脂质纳米粒子包含50％阳离子型脂质DLin-MC3-DMA、10％非阳离子型脂质DSPC、1.5％PEG脂质PEG-DOMG和38.5％结构脂质胆固醇。作为非限制性实例，脂质纳米粒子包含50％阳离子型脂质DLin-MC3-DMA、10％非阳离子型脂质DSPC、1.5％PEG脂质PEG-DMG和38.5％结构脂质胆固醇。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子包含55％阳离子型脂质L319、L608和L520、10％非阳离子型脂质DSPC、2.5％PEG脂质PEG-DMG和32.5％结构脂质胆固醇。
疫苗组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量可根据受治疗受试者的身份、体型和/或病况且进一步根据组合物的施用途径而变化。举例来说，组合物可包含介于0.1％与99％(w/w)之间的活性成分。举例来说，组合物可包含介于0.1％与100％之间，例如介于0.5与50％之间、介于1与30％之间、介于5与80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
在一些实施方案中，RNA疫苗组合物可包含配制在包含DLin-MC3-DMA、胆固醇、DSPC和PEG2000-DMG的脂质纳米粒子中的本文所述的多核苷酸、柠檬酸三钠缓冲液、蔗糖和注射用水。作为非限制性实例，组合物包含：2.0mg/mL药物物质(例如，编码RSV的多核苷酸)、21.8mg/mL MC3、10.1mg/mL胆固醇、5.4mg/mL DSPC、2.7mg/mL PEG2000-DMG、5.16mg/mL柠檬酸三钠、71mg/mL蔗糖和1.0mL注射用水。
在一些实施方案中，纳米粒子(例如，脂质纳米粒子)具有10nm至500nm、20nm至400nm、30nm至300nm、40nm至200nm的平均直径。在一些实施方案中，纳米粒子(例如，脂质纳米粒子)具有50nm至150nm、50nm至200nm、80nm至100nm或80nm至200nm的平均直径。
脂质体、脂质体复合物和脂质纳米粒子
在一些实施方案中，RNA疫苗药物组合物可在脂质体中配制，所述脂质体诸如(但不限于)DiLa2脂质体(Marina Biotech，Bothell，WA)、(MarinaBiotech，Bothell，WA)、基于中性DOPC(1，2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱)的脂质体(例如，用于卵巢癌的siRNA递送(Landen等人Cancer Biology&Therapy 2006 5(12)1708-1713)；其以引用方式整体并入本文中)和涂有透明质酸的脂质体(Quiet Therapeutics，Israel)。
在一些实施方案中，RNA疫苗可在如美国公开第US2012060293号中所述的冻干的凝胶相脂质体组合物中配制，该专利以引用方式整体并入本文中。
纳米粒子制剂可包含磷酸酯缀合物。磷酸酯缀合物可增加体内循环时间和/或增加纳米粒子的靶向递送。用于本发明的磷酸酯缀合物可通过国际公开第WO2013033438号或美国公开第US20130196948号中所述的方法制得，其各自的内容以引用方式整体并入本文中。作为非限制性实例，磷酸酯缀合物可包括国际公开第WO2013033438号中所述的任何一种式的化合物，该专利以引用方式整体并入本文中。
纳米粒子制剂可包含聚合物缀合物。聚合物缀合物可为水溶性缀合物。聚合物缀合物可具有如美国公开第20130059360号中所述的结构，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。在一些方面，具有本发明的多核苷酸的聚合物缀合物可使用美国公开第20130072709号中所述的方法和/或分段聚合试剂制得，该专利以引用方式整体并入本文中。在其他方面，聚合物缀合物可具有包含环部分的悬垂侧基，诸如(但不限于)美国公开第US20130196948号中所述的聚合物缀合物，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
纳米粒子制剂可包含增强本发明的纳米粒子在受试者中的递送的缀合物。此外，缀合物可抑制纳米粒子在受试者中的吞噬细胞清除。在一些方面，缀合物可为自人膜蛋白CD47设计的“自身”肽(例如，由Rodriguez等人(Science 2013，339，971-975)所述的“自身”粒子，其以引用方式整体并入本文中)。如由Rodriguez等人所示，自身肽延迟纳米粒子的巨噬细胞介导的清除，从而增强纳米粒子的递送。在其他方面，缀合物可为膜蛋白CD47(例如，参见Rodriguez等人Science 2013，339，971-975，其以引用方式整体并入本文中)。Rodriguez等人展示，类似于“自身”肽，与乱序肽和涂有PEG的纳米粒子相比，CD47可增加受试者中的循环粒子比率。
在一些实施方案中，本发明的RNA疫苗是在包含增强本发明的纳米粒子在受试者中的递送的缀合物的纳米粒子中配制。缀合物可为CD47膜或缀合物可衍生自CD47膜蛋白，诸如先前所述的“自身”肽。在其他实施方案中，纳米粒子可包含PEG和CD47或其衍生物的缀合物。在其他实施方案中，纳米粒子可包含上文所述的“自身”肽与膜蛋白CD47两者。
在一些实施方案中，“自身”肽和/或CD47蛋白可缀合成类病毒粒子或假病毒体，如本文所述用于递送本发明的RNA疫苗。
在其他实施方案中，RNA疫苗药物组合物包含本发明的多核苷酸和可具有可降解的键联的缀合物。缀合物的非限制性实例包括包含可电离的氢原子的芳族部分、间隔基部分和水溶性聚合物。作为非限制性实例，包含具有可降解的键联的缀合物的药物组合物和用于递送此类药物组合物的方法在美国公开第US20130184443号中描述，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
纳米粒子制剂可为包含碳水化合物载体和RNA疫苗的碳水化合物纳米粒子。作为非限制性实例，碳水化合物载体可包括但不限于经酸酐修饰的植物糖原或糖原型物质、辛烯基琥珀酸植物糖原、植物糖原β-糊精、经酸酐修饰的植物糖原β-糊精。(参见例如，国际公开第WO2012109121号，其内容以引用方式整体并入本文中)。
本发明的纳米粒子制剂可涂有界面活性剂或聚合物以改善粒子的递送。在一些实施方案中，纳米粒子可涂有亲水性涂层，诸如(但不限于)PEG涂层和/或具有中性表面电荷的涂层。亲水性涂层可有助于在中枢神经系统中递送具有较大净荷的纳米粒子，诸如(但不限于)RNA疫苗。作为非限制性实例，包含亲水性涂层的纳米粒子和制备此类纳米粒子的方法在美国公开第US20130183244号中描述，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的脂质纳米粒子可为亲水性聚合物粒子。亲水性聚合物粒子和制备亲水性聚合物粒子的方法的非限制性实例在美国公开第US20130210991号中描述，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在其他实施方案中，本发明的脂质纳米粒子可为疏水性聚合物粒子。
脂质纳米粒子制剂可通过用称为快速消除的脂质纳米粒子(reLNP)的生物可降解的阳离子型脂质替代阳离子型脂质来改善。已显示可电离的阳离子型脂质，诸如(但不限于)DLinDMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA，随时间累积在血浆和组织且可为潜在毒性来源。快速消除的脂质的快速代谢可使脂质纳米粒子的耐受性和治疗指数在大鼠中从1mg/kg剂量至10mg/kg剂量改善一个数量级。包含酶促降解的酯键联可改善阳离子型组分的降解和代谢概况，而仍然保持reLNP制剂的活性。酯键联可位于脂质链内部或其可位于脂质链的末端。内部酯键联可置换脂质链中的任何碳。
在一些实施方案中，内部酯键联可位于饱和碳的任一侧。
在一些实施方案中，免疫反应可通过递送可包括纳米物质、聚合物和免疫原的脂质纳米粒子来引发。(美国公开第20120189700号和国际公开第WO2012099805号，其各自以引用方式整体并入本文中)。
聚合物可囊封纳米物质或部分囊封纳米物质。免疫原可为重组蛋白、经修饰的RNA和/或本文所述的多核苷酸。在一些实施方案中，脂质纳米粒子可经配制用于疫苗中，诸如(但不限于)针对病原体的疫苗。
脂质纳米粒子可经工程化以改变粒子的表面特性，故脂质纳米粒子可穿透粘膜屏障。粘液位于粘膜组织上，诸如(但不限于)口腔(例如，颊和食道膜和扁桃体组织)、眼部、胃肠(例如，胃部、小肠、大肠、结肠、直肠)、鼻部、呼吸道(例如，鼻部、咽部、气管和支气管膜)、生殖器(例如，阴道、宫颈和尿道膜)。一直认为对于较高药物囊封效率和提供大量药物的持续递送的能力优选的大于10至200nm的纳米粒子过大以至于无法快速扩散通过粘膜屏障。粘液连续分泌，流出，丢弃或消化和再循环，故大部分所捕获的粒子可在数秒内或在数小时内从粘膜组织移除。已密集地涂有低分子量聚乙二醇(PEG)的大的聚合纳米粒子(直径为200nm至500nm)扩散通过粘液比相同粒子在水中的扩散低仅4至6倍(Lai等人PNAS 2007104(5)：1482-487；Lai等人Adv Drug Deliv Rev.2009 61(2)：158-171；其各自以引用方式整体并入本文中)。纳米粒子的运输可使用穿透率和/或荧光显微镜检查技术(包括但不限于光漂泊荧光恢复术(FRAP)和高分辨率多粒子跟踪(MPT))来测定。作为非限制性实例，可穿透粘膜屏障的组合物可如美国专利第8,241,670号或国际公开第WO2013110028号中所述制得，其各自的内容以引用方式整体并入本文中。
经工程化以穿透粘液的脂质纳米粒子可包含聚合物质(例如，聚合核心)和/或聚合物-维生素缀合物和/或三嵌段共聚物。聚合物质可包括但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨酯、聚脲、聚碳酸酯、聚(苯乙烯)、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳酯。聚合物质可为生物可降解和/或生物相容性的。生物相容性聚合物的非限制性实例在国际公开第WO2013116804号中描述，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。聚合物质可另外经照射。作为非限制性实例，聚合物质可经γ照射(参见例如，国际公开第WO201282165号，其以引用方式整体并入本文中)。特异性聚合物的非限制性实例包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D，L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D，L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D，L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-PEO-共-D，L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-PPO-共-D，L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、聚乙烯二醇、聚-L-谷氨酸、聚(羟酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烯烃(诸如聚乙烯和聚丙烯)、聚烷二醇(诸如聚(乙二醇)(PEG))、聚环氧烷烃(PEO)、聚对苯二甲酸烷二酯(诸如聚(对苯二甲酸乙二酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯(诸如聚(乙酸乙烯酯))、聚卤化乙烯(诸如聚(氯乙烯)(PVC))、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯、衍生化纤维素(诸如烷基纤维素)、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸聚合物(诸如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷酯)及其共聚物和混合物)、聚二氧环己酮及其共聚物、聚羟基烷酸酯、聚富马酸丙二醇酯、聚甲醛、泊洛沙姆(poloxamer)、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、PEG-PLGA-PEG和三亚甲基碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮。脂质纳米粒子可涂有共聚物或与共聚物缔合，诸如(但不限于)嵌段共聚物(诸如国际公开第WO2013012476号中所述的支链聚醚-聚酰胺嵌段共聚物，该专利以引用方式整体并入本文中)，和(聚(乙二醇))-(聚(氧化丙烯))-(聚(乙二醇))三嵌段共聚物(参见例如，美国公开20120121718、美国公开20100003337和美国专利第8,263,665号，其各自以引用方式整体并入本文中)。共聚物可为通常视为安全(GRAS)的聚合物且可以不产生新化学实体的方式形成脂质纳米粒子。举例来说，脂质纳米粒子可包含涂有泊洛沙姆的PLGA纳米粒子而不形成新化学实体，所述纳米粒子仍然能够快速穿透人的粘液(Yang等人Angew.Chem.Int.Ed.2011 50：2597-2600，其内容以引用方式整体并入本文中)。产生可穿透人的粘液的纳米粒子的非限制性可扩展方法由Xu等人描述(参见例如，J ControlRelease 2013，170(2)：279-86，其内容以引用方式整体并入本文中)。
聚合物-维生素缀合物的维生素可为维生素E。缀合物的维生素部分可被其他合适的组分取代，诸如(但不限于)维生素A、维生素E、其他维生素、胆固醇、疏水性部分或其他界面活性剂的疏水性组分(例如，固醇链、脂肪酸、烃链和环氧烷烃链)。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗药物组合物可在脂质体中配制，所述脂质体诸如(但不限于)DiLa2脂质体(Marina Biotech，Bothell，WA)、(Marina Biotech，Bothell，WA)、基于中性DOPC(1，2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱)的脂质体(例如，用于卵巢癌的siRNA递送(Landen等人Cancer Biology&Therapy 2006 5(12)1708-1713，其以引用方式整体并入本文中))和涂有透明质酸的脂质体(QuietTherapeutics，Israel)。
在一些实施方案中，RNA疫苗可在如美国公开第US2012060293号中所述的冻干的凝胶相脂质体组合物中配制，该专利以引用方式整体并入本文中。
纳米粒子制剂可包含磷酸酯缀合物。磷酸酯缀合物可增加体内循环时间和/或增加纳米粒子的靶向递送。用于本发明的磷酸酯缀合物可通过国际公开第WO2013033438号或美国公开第20130196948号中所述的方法制得，其各自的内容以引用方式整体并入本文中。作为非限制性实例，磷酸酯缀合物可包括国际公开第WO2013033438号中所述的任何一种式的化合物，该专利以引用方式整体并入本文中。
纳米粒子制剂可包含聚合物缀合物。聚合物缀合物可为水溶性缀合物。聚合物缀合物可具有如美国申请第20130059360号中所述的结构，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。在一些方面，具有本发明的多核苷酸的聚合物缀合物可使用美国专利申请第20130072709号中所述的方法和/或分段聚合试剂制得，该专利以引用方式整体并入本文中。在其他方面，聚合物缀合物可具有包含环部分的悬垂侧基，诸如(但不限于)美国公开第US20130196948号中所述的聚合物缀合物，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
纳米粒子制剂可包含增强本发明的纳米粒子在受试者中的递送的缀合物。此外，缀合物可抑制纳米粒子在受试者中的吞噬细胞清除。在一些方面，缀合物可为自人膜蛋白CD47设计的“自身”肽(例如，由Rodriguez等人(Science 2013，339，971-975)所述的“自身”粒子，其以引用方式整体并入本文中)。如由Rodriguez等人所示，自身肽延迟纳米粒子的巨噬细胞介导的清除，从而增强纳米粒子的递送。在其他方面，缀合物可为膜蛋白CD47(例如，参见Rodriguez等人Science 2013，339，971-975，其以引用方式整体并入本文中)。Rodriguez等人展示，类似于“自身”肽，与乱序肽和涂有PEG的纳米粒子相比，CD47可增加受试者中的循环粒子比率。
在一些实施方案中，本发明的RNA疫苗是在包含增强本公开的纳米粒子在受试者中的递送的缀合物的纳米粒子中配制。缀合物可为CD47膜或缀合物可衍生自CD47膜蛋白，诸如先前所述的“自身”肽。在其他方面，纳米粒子可包含PEG和CD47或其衍生物的缀合物。在其他方面，纳米粒子可包含上文所述的“自身”肽与膜蛋白CD47两者。
在其他方面，“自身”肽和/或CD47蛋白可缀合成类病毒粒子或假病毒体，如本文所述用于递送本发明的RNA疫苗。
在其他实施方案中，RNA疫苗药物组合物包含本发明的多核苷酸和可具有可降解的键联的缀合物。缀合物的非限制性实例包括包含可电离的氢原子的芳族部分、间隔基部分和水溶性聚合物。作为非限制性实例，包含具有可降解的键联的缀合物的药物组合物和用于递送此类药物组合物的方法在美国公开第US20130184443号中描述，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
纳米粒子制剂可为包含碳水化合物载体和RNA(例如，mRNA)疫苗的碳水化合物纳米粒子。作为非限制性实例，碳水化合物载体可包括但不限于经酸酐修饰的植物糖原或糖原型物质、辛烯基琥珀酸植物糖原、植物糖原β-糊精、经酸酐修饰的植物糖原β-糊精。(参见例如，国际公开第WO2012109121号；其内容以引用方式整体并入本文中)。
本发明的纳米粒子制剂可涂有界面活性剂或聚合物以改善粒子的递送。在一些实施方案中，纳米粒子可涂有亲水性涂层，诸如(但不限于)PEG涂层和/或具有中性表面电荷的涂层。亲水性涂层可有助于在中枢神经系统中递送具有较大净荷的纳米粒子，诸如(但不限于)RNA疫苗。作为非限制性实例，包含亲水性涂层的纳米粒子和制备所述纳米粒子的方法在美国公开第US20130183244号中描述，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的脂质纳米粒子可为亲水性聚合物粒子。亲水性聚合物粒子和制备亲水性聚合物粒子的方法的非限制性实例在美国公开第US20130210991号中描述，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在其他实施方案中，本发明的脂质纳米粒子可为疏水性聚合物粒子。
脂质纳米粒子制剂可通过用称为快速消除的脂质纳米粒子(reLNP)的生物可降解的阳离子型脂质替代阳离子型脂质来改善。已显示可电离的阳离子型脂质，诸如(但不限于)DLinDMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA，随时间累积在血浆和组织且可为潜在毒性来源。快速消除的脂质的快速代谢可使脂质纳米粒子的耐受性和治疗指数在大鼠中从1mg/kg剂量至10mg/kg剂量改善一个数量级。包含酶促降解的酯键联可改善阳离子型组分的降解和代谢概况，而仍然保持reLNP制剂的活性。酯键联可位于脂质链内部或其可位于脂质链的末端。内部酯键联可置换脂质链中的任何碳。
在一些实施方案中，内部酯键联可位于饱和碳的任一侧。
在一些实施方案中，免疫反应可通过递送可包括纳米物质、聚合物和免疫原的脂质纳米粒子来引发。(美国公开第20120189700号和国际公开第WO2012099805号，其各自以引用方式整体并入本文中)。
脂质纳米粒子可经工程化以改变粒子的表面特性，故脂质纳米粒子可穿透粘膜屏障。粘液位于粘膜组织上，诸如(但不限于)口腔(例如，颊和食道膜和扁桃体组织)、眼部、胃肠(例如，胃部、小肠、大肠、结肠、直肠)、鼻部、呼吸道(例如，鼻部、咽部、气管和支气管膜)、生殖器(例如，阴道、宫颈和尿道膜)。一直认为对于较高药物囊封效率和提供大量药物的持续递送的能力优选的大于10至200nm的纳米粒子过大以至于无法快速扩散通过粘膜屏障。粘液连续分泌，流出，丢弃或消化和再循环，故大部分所捕获的粒子可在数秒内或在数小时内从粘膜组织移除。已密集地涂有低分子量聚乙二醇(PEG)的大的聚合纳米粒子(直径为200nm至500nm)扩散通过粘液比相同粒子在水中的扩散低仅4至6倍(Lai等人PNAS 2007104(5)：1482-487；Lai等人Adv Drug Deliv Rev.2009 61(2)：158-171；其各自以引用方式整体并入本文中)。纳米粒子的运输可使用穿透率和/或荧光显微镜检查技术(包括但不限于光漂泊荧光恢复术(FRAP)和高分辨率多粒子跟踪(MPT))来测定。作为非限制性实例，可穿透粘膜屏障的组合物可如美国专利第8,241,670号或国际公开第WO2013110028号中所述制得，其各自的内容以引用方式整体并入本文中。
经工程化以穿透粘液的脂质纳米粒子可包含聚合物质(即，聚合核心)和/或聚合物-维生素缀合物和/或三嵌段共聚物。聚合物质可包括但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨酯、聚脲、聚碳酸酯、聚(苯乙烯)、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳酯。聚合物质可为生物可降解和/或生物相容性的。生物相容性聚合物的非限制性实例在国际公开第WO2013116804号中描述，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。聚合物质可另外经照射。作为非限制性实例，聚合物质可经γ照射(参见例如，国际公开第WO201282165号，其以引用方式整体并入本文中)。特异性聚合物的非限制性实例包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D，L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D，L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D，L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-PEO-共-D，L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-PPO-共-D，L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、聚乙烯二醇、聚-L-谷氨酸、聚(羟酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烯烃(诸如聚乙烯和聚丙烯)、聚烷二醇(诸如聚(乙二醇)(PEG))、聚环氧烷烃(PEO)、聚对苯二甲酸烷二酯(诸如聚(对苯二甲酸乙二酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯(诸如聚(乙酸乙烯酯))、聚卤化乙烯(诸如聚(氯乙烯)(PVC))、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯、衍生化纤维素(诸如烷基纤维素)、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸聚合物(诸如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷酯)及其共聚物和混合物)、聚二氧环己酮及其共聚物、聚羟基烷酸酯、聚富马酸丙二醇酯、聚甲醛、泊洛沙姆、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、PEG-PLGA-PEG和三亚甲基碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮。脂质纳米粒子可涂有共聚物或与共聚物缔合，诸如(但不限于)嵌段共聚物(诸如国际公开第WO2013012476号中所述的支链聚醚-聚酰胺嵌段共聚物，该专利以引用方式整体并入本文中)，和(聚(乙二醇))-(聚(氧化丙烯))-(聚(乙二醇))三嵌段共聚物(参见例如，美国公开20120121718和美国公开20100003337以及美国专利第8,263,665号，其各自以引用方式整体并入本文中)。共聚物可为通常视为安全(GRAS)的聚合物且可以不产生新化学实体的方式形成脂质纳米粒子。举例来说，脂质纳米粒子可包含涂有泊洛沙姆的PLGA纳米粒子而不形成新化学实体，所述纳米粒子仍然能够快速穿透人的粘液(Yang等人Angew.Chem.Int.Ed.2011 50：2597-2600，其内容以引用方式整体并入本文中)。产生可穿透人的粘液的纳米粒子的非限制性可扩展方法由Xu等人描述(参见例如，J ControlRelease 2013，170(2)：279-86，其内容以引用方式整体并入本文中)。
聚合物-维生素缀合物的维生素可为维生素E。缀合物的维生素部分可被其他合适的组分取代，诸如(但不限于)维生素A、维生素E、其他维生素、胆固醇、疏水性部分或其他界面活性剂的疏水性组分(例如，固醇链、脂肪酸、烃链和环氧烷烃链)。
经工程化以穿透粘液的脂质纳米粒子可包括表面改变剂，诸如(但不限于)多核苷酸、阴离子型蛋白(例如，牛血清白蛋白)、界面活性剂(例如，阳离子型界面活性剂，例如二甲基二(十八烷基)溴化铵)、糖或糖衍生物(例如，环糊精)、核酸、聚合物(例如，肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、粘液溶解剂(例如，N-乙酰基半胱氨酸、艾蒿、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、大青属植物、乙酰基半胱氨酸、溴己新(bromhexine)、羧甲司坦(carbocisteine)、依普拉酮(eprazinone)、美司钠(mesna)、氨溴索(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奥醇(domiodol)、来托司坦(letosteine)、司替罗宁(stepronin)、硫普罗宁(tiopronin)、凝溶胶蛋白(gelsolin)、胸腺素β4链道酶α、奈替克新(neltenexine)、厄多司坦(erdosteine))和各种DNA酶(包括rhDNA酶)。表面改变剂可嵌入或陷入粒子表面或置于(例如，通过涂覆、吸附、共价键联或其他过程)脂质纳米粒子的表面上(参见例如，美国公开20100215580和美国公开20080166414和US20130164343，其各自的内容以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，穿透粘液的脂质纳米粒子可包含至少一种本文所述的多核苷酸。多核苷酸可囊封于脂质纳米粒子中和/或置于粒子表面上。多核苷酸可与脂质纳米粒子共价偶合。穿透粘液的脂质纳米粒子的制剂可包含多种纳米粒子。此外，制剂可含有可与粘液相互反应且改变周围粘液的结构和/或粘着特性的粒子以减少粘液粘附，从而可增加穿透粘液的脂质纳米粒子递送至粘膜组织。
在其他实施方案中，穿透粘液的脂质纳米粒子可为低渗性制剂，包含粘膜穿透增强涂层。制剂对于其所递送至的上皮而言可为低渗性的。
低渗性制剂的非限制性实例可见于国际公开第WO2013110028号，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，为了增强递送穿过粘膜屏障，RNA疫苗制剂可包含或为低渗性溶液。发现低渗性溶液增加诸如(但不限于)粘液穿透粒子的粘膜惰性粒子能够到达阴道上皮表面的速率(参见例如，Ensign等人Biomaterials 2013，34(28)：6922-9，其内容以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，RNA疫苗被配制为脂质体复合物，诸如(但不限于)来自Silence Therapeutics(London，United Kingdom)的ATUPLEXTM系统、DACC系统、DBTC系统和其他siRNA-脂质体复合物技术，来自(Cambridge，MA)的STEMFECTTM，和基于聚乙烯亚胺(PEI)或鱼精蛋白的核酸的靶向和非靶向递送(Aleku等人Cancer Res.200868：9788-9798；Strumberg等人Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50：76-78；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1222-1234；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1360-1370；Gutbier等人，Pulm Pharmacol.Ther.2010 23：334-344；Kaufmann等人Microvasc Res 2010 80：286-293；Weide等人J Immunother.2009 32：498-507；Weide等人J Immunother.2008 31：180-188；Pascolo，Expert Opin.Biol.Ther.4：1285-1294；Fotin-Mleczek等人，2011J.Immunother.34：1-15；Song等人，Nature Biotechnol.2005，23：709-717；Peer等人，ProcNatl Acad Sci USA.2007 6；104：4095-4100；deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19：125-132；其各自以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，此类制剂还可进行构建或为经改变以使得其在体内被动或主动地导向不同细胞类型的组合物，所述细胞类型包括但不限于肝细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、抗原呈递细胞和白细胞(Akinc等人Mol Ther.2010 18：1357-1364；Song等人，Nat Biotechnol.2005 23：709-717；Judge等人，J Clin Invest.2009 119：661-673；Kaufmann等人，Microvasc Res 2010 80：286-293；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1222-1234；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1360-1370；Gutbier等人，PulmPharmacol.Ther.2010 23：334-344；Basha等人，Mol.Ther.2011 19：2186-2200；Fenske和Cullis，Expert Opin Drug Deliv.2008 5：25-44；Peer等人，Science.2008 319：627-630；Peer和Lieberman，Gene Ther.2011 18：1127-1133；其各自以引用方式整体并入本文中)。将制剂被动靶向至肝细胞的一个实例包括基于DLin-DMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA的脂质纳米粒子制剂，已显示其结合至载脂蛋白E且在体内促进这些制剂结合和摄入肝细胞中(Akinc等人Mol Ther.2010 18：1357-1364；其以引用方式整体并入本文中)。制剂可还经由其表面上的如由(但不限于)叶酸盐、转铁蛋白、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)所例示的不同配体的表达，和抗体靶向方法来选择性靶向(Kolhatkar等人，Curr Drug DiscovTechnol.2011 8：197-206；Musacchio和Torchilin，Front Biosci.2011 16：1388-1412；Yu等人，Mol Membr Biol.2010 27：286-298；Patil等人，Crit Rev Ther Drug CarrierSyst.2008 25：1-61；Benoit等人，Biomacromolecules.2011 12：2708-2714；Zhao等人，Expert Opin Drug Deliv.2008 5：309-319；Akinc等人，Mol Ther.2010 18：1357-1364；Srinivasan等人，Methods Mol Biol.2012 820：105-116；Ben-Arie等人，Methods MolBiol.2012 757：497-507；Peer 2010 J Control Release.20：63-68；Peer等人，Proc NatlAcad Sci USA.2007 104：4095-4100；Kim等人，Methods Mol Biol.2011 721：339-353；Subramanya等人，Mol Ther.2010 18：2028-2037；Song等人，Nat Biotechnol.2005 23：709-717；Peer等人，Science.2008 319：627-630；Peer和Lieberman，Gene Ther.2011 18：1127-1133；其各自以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗被配制为固体脂质纳米粒子。固体脂质纳米粒子(SLN)可为具有介于1000nm之间的平均直径的球形。SLN具备可溶解亲脂性分子且可经界面活性剂和/或乳化剂稳定化的固体脂质核心基质。在其他实施方案中，脂质纳米粒子可为自组装脂质-聚合物纳米粒子(参见Zhang等人，ACS Nano，2008，2(8)，第1696-1702页；其内容以引用方式整体并入本文中)。作为非限制性实例，SLN可为国际公开第WO2013105101号中所述的SLN，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。作为另一非限制性实例，SLN可通过国际公开第WO2013105101号中所述的方法或工艺制得，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
脂质体、脂质体复合物或脂质纳米粒子可用于改善引导蛋白产生的多核苷酸的功效，因为这些制剂可能能够通过RNA疫苗增加细胞转染；和/或增加所编码蛋白的翻译。一个此种实例涉及使用脂质囊封来使得能够达成polyplex质体DNA的有效全身性递送(Heyes等人，Mol Ther.2007 15：713-720；其以引用方式整体并入本文中)。脂质体、脂质体复合物或脂质纳米粒子还可用于增加多核苷酸的稳定性。
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可经配制用于控制释放和/或靶向递送。如本文所用，“控制释放”是指遵循特定释放模式以实现治疗性结果的药物组合物或化合物释放概况。在一些实施方案中，RNA疫苗可被囊封至本文所述和/或本领域中已知用于控制释放和/或靶向递送的递送药剂。如本文所用，术语“囊封”意谓包封、包围或包裹。因为其涉及本发明的化合物的制剂，囊封可为大量、全部或部分。术语“经大量囊封”意谓至少大于50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.9或大于99.999％的本发明的药物组合物或化合物可经包封、包围或包裹在递送药剂中。“经部分囊封”意谓小于10、10、20、30、40、50或50以下的本发明的药物组合物或化合物可经包封、包围或包裹在递送药剂中。有利地，囊封可通过使用荧光和/或电子显微照片测量本发明的药物组合物或化合物的逃逸或活性来测定。举例来说，至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99或大于99.99％的本公开的药物组合物或化合物被囊封在递送药剂中。
在一些实施方案中，控制释放制剂可包括但不限于三嵌段共聚物。作为非限制性实例，制剂可包括两种不同类型的三嵌段共聚物(国际公开第WO2012131104号和第WO2012131106号；其各自的内容以引用方式整体并入本文中)。
在其他实施方案中，RNA疫苗可被囊封至脂质纳米粒子或快速消除的脂质纳米粒子中且脂质纳米粒子或快速消除的脂质纳米粒子可随后被囊封至本文所述和/或本领域中已知的聚合物、水凝胶和/或手术密封胶中。作为非限制性实例，聚合物、水凝胶或手术密封胶可为PLGA、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、(Nanotherapeutics，Inc.Alachua，FL)、(Halozyme Therapeutics，San Diego CA)、诸如纤维蛋白原聚合物的手术密封胶(Ethicon Inc.Comelia，GA)、(BaxterInternational，Inc Deerfield，IL)、基于PEG的密封胶和(BaxterInternational，Inc Deerfield，IL)。
在其他实施方案中，脂质纳米粒子可被囊封至本领域中已知的任何聚合物中，其可形成注入受试者中的凝胶。作为另一非限制性实例，脂质纳米粒子可被囊封至可为生物可降解的聚合物基质中。
在一些实施方案中，用于控制释放和/或靶向递送的RNA疫苗制剂还可包括至少一种控制释放涂层。控制释放涂层包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、EUDRAGIT和纤维素衍生物(诸如乙基纤维素水性分散液(和))。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗控制释放和/或靶向递送制剂可包含至少一种可降解的聚酯，其可含有聚阳离子型侧链。可降解的聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)及其组合。在其他实施方案中，可降解的聚酯可包括PEG结合以形成PEG化聚合物。
在一些实施方案中，包含至少一种多核苷酸的RNA疫苗控制释放和/或靶向递送制剂可包含如美国专利第8,404,222号中所述的至少一种PEG和/或PEG相关聚合物衍生物，该专利以引用方式整体并入本文中。
在其他实施方案中，包含至少一种多核苷酸的RNA疫苗控制释放递送制剂可为美国公开第20130130348号中所述的控制释放聚合物系统，该专利以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可被囊封于治疗性纳米粒子中，本文称为“治疗性纳米粒子RNA疫苗”。治疗性纳米粒子可通过本文所述和本领域中已知的方法来配制，诸如(但不限于)国际公开第WO2010005740号、第WO2010030763号、第WO2010005721号、第WO2010005723号、第WO2012054923号、美国公开第US20110262491号、第US20100104645号、第US20100087337号、第US20100068285号、第US20110274759号、第US20100068286号、第US20120288541号、第US20130123351号和第US20130230567号和美国专利第8,206,747号、第8,293,276号、第8,318,208号和第8,318,211号，其各自的内容以引用方式整体并入本文中。在其他实施方案中，治疗性聚合物纳米粒子可通过美国公开第US20120140790号中所述的方法来鉴定，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子RNA疫苗可经配制用于持续释放。如本文所用，“持续释放”是指在特定的时间段内遵循释放速率的药物组合物或化合物。所述时间段可包括但不限于数小时、数天、数周、数月和数年。作为非限制性实例，持续释放纳米粒子可包含聚合物和治疗性药剂，诸如(但不限于)本发明的多核苷酸(参见国际公开第2010075072号和美国公开第US20100216804号、第US20110217377号和第US20120201859号，其各自以引用方式整体并入本文中)。在另一非限制性实例中，持续释放制剂可包含允许持续生物可用性的药剂，诸如(但不限于)晶体、大分子凝胶和/或颗粒悬浮液(参见美国公开第US20130150295号，其内容以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子RNA疫苗可经配制以具有标靶特异性。作为非限制性实例，治疗性纳米粒子可包括皮质类固醇(参见国际公开第WO2011084518号，其以引用方式整体并入本文中)。作为非限制性实例，治疗性纳米粒子可在国际公开第WO2008121949号、第WO2010005726号、第WO2010005725号、第WO2011084521号和美国公开第US20100069426号、第US20120004293号和第US20100104655号中所述的纳米粒子中配制，各专利以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的纳米粒子可包含聚合基质。作为非限制性实例，纳米粒子可包含两种或两种以上聚合物，诸如(但不限于)聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羟酸、聚丙基富马酸酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙二胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)或其组合。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子包含二嵌段共聚物。在一些实施方案中，二嵌段共聚物可包括与聚合物组合的PEG，所述聚合物诸如(但不限于)聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羟酸、聚丙基富马酸酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙二胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)或其组合。在其他实施方案中，二嵌段共聚物可为高X二嵌段共聚物，诸如国际公开第WO2013120052号中所述的那些共聚物，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
作为非限制性实例，治疗性纳米粒子包含PLGA-PEG嵌段共聚物(参见美国公开第US20120004293号和美国专利第8,236,330号，其各自以引用方式整体并入本文中)。在另一非限制性实例中，治疗性纳米粒子为包含PEG和PLA或PEG和PLGA的二嵌段共聚物的隐形纳米粒子(参见美国专利第8,246,968号和国际公开第WO2012166923号，其各自的内容以引用方式整体并入本文中)。在另一非限制性实例中，治疗性纳米粒子为如美国公开第20130172406号中所述的隐形纳米粒子或标靶特异性隐形纳米粒子，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含多嵌段共聚物(参见例如，美国专利第8,263,665号和第8,287,910号和美国公开第20130195987号，其各自的内容以引用方式整体并入本文中)。
在另一非限制性实例中，脂质纳米粒子包含嵌段共聚物PEG-PLGA-PEG(参见例如，热敏性水凝胶(PEG-PLGA-PEG)，其在Lee等人.“Thermosensitive Hydrogel as a Tgf-β1Gene Delivery Vehicle Enhances Diabetic Wound Healing.”PharmaceuticalResearch，2003 20(12)：1995-2000用作TGF-β1基因递送媒介物；和在Li等人“ControlledGene Delivery System Based on Thermosensitive Biodegradable Hydrogel”Pharmaceutical Research 2003 20(6)：884-888；和Chang等人，“Non-ionic amphiphilicbiodegradable PEG-PLGA-PEG copolymer enhances gene delivery efficiency in ratskeletal muscle.”J Controlled Release.2007 118：245-253中用作控制基因递送系统；其各自以引用方式整体并入本文中)。本公开的RNA(例如，mRNA)疫苗可在包含PEG-PLGA-PEG嵌段共聚物脂质纳米粒子中配制。
在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物可包括在包含非聚合微胞和嵌段共聚物的聚离子复合物中。(参见例如，美国公开第20120076836号，其以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种丙烯酸类聚合物。丙烯酸类聚合物包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯及其组合。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种聚(乙烯基酯)聚合物。聚(乙烯基酯)聚合物可为共聚物，诸如无规共聚物。作为非限制性实例，无规共聚物可具有结构，诸如国际公开第WO2013032829号或美国公开第20130121954号中所述的那些结构，这些公开的内容以引用方式整体并入本文中。在一些方面，聚(乙烯基酯)聚合物可与本文所述的多核苷酸结合。在其他方面，可用于本发明中的聚(乙烯基酯)聚合物可为所述的那些聚合物。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种二嵌段共聚物。二嵌段共聚物可为(但不限于)聚(乳)酸-聚(亚乙基)二醇共聚物(参见例如，国际公开第WO2013044219号；其以引用方式整体并入本文中)。作为非限制性实例，治疗性纳米粒子可用于治疗癌症(参见国际公开第WO2013044219号，其以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含本文所述和/或本领域中已知的至少一种阳离子型聚合物。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种含胺聚合物，诸如(但不限于)聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(酰胺-胺)树枝状聚合物、聚(β-氨基酯)(参见例如，美国专利第8,287,849号，其以引用方式整体并入本文中)及其组合。在其他实施方案中，本文所述的纳米粒子可包含胺阳离子型脂质，诸如国际公开第WO2013059496号中所述的那些脂质，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。在一些方面，阳离子型脂质可具有氨基-胺或氨基-酰胺部分。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种可降解的聚酯，其可含有聚阳离子型侧链。可降解的聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)及其组合。在其他实施方案中，可降解的聚酯可包括PEG结合以形成PEG化聚合物。
在其他实施方案中，治疗性纳米粒子可包括至少一种靶向配体的结合。靶向配体可为本领域中已知的任何配体，诸如(但不限于)单克隆抗体(Kirpotin等人，CancerRes.2006 66：6732-6740，其以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可在水性溶液中配制，其可用于目标癌症(参见国际公开第WO2011084513号和美国公开第20110294717号，其各自以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子RNA疫苗(例如包含至少一种RNA疫苗的治疗性纳米粒子)可使用由Podobinski等人的美国专利第8,404,799号所述的方法来配制，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗可囊封在合成纳米载体中，与合成纳米载体连接和/或缔合。合成纳米载体包括但不限于国际公开第WO2010005740号、第WO2012149454号和第WO2013019669号和美国公开第US20110262491号、第US20100104645号、第US20100087337号和第US20120244222号中所述的那些合成纳米载体，各专利以引用方式整体并入本文中。合成纳米载体可使用本领域中已知和/或本文所述的方法来配制。作为非限制性实例，合成纳米载体可通过国际公开第WO2010005740号、第WO2010030763号和第WO201213501号和美国公开第US20110262491号、第US20100104645号、第US20100087337号和第US2012024422号中所述的方法来配制，各专利以引用方式整体并入本文中。在其他实施方案中，合成纳米载体制剂可通过国际公开第WO2011072218号和美国专利第8,211,473号中所述的方法冻干，其各自的内容以引用方式整体并入本文中。在其他实施方案中，本发明的制剂，包括但不限于合成纳米载体，可通过美国公开第20130230568号中所述的方法来冻干或复原，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，合成纳米载体可含有反应性基团以释放本文所述的多核苷酸(参见国际公开第WO20120952552号和美国公开第US20120171229号，其各自以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，合成纳米载体可含有免疫刺激剂以增强由递送合成纳米载体所产生的免疫反应。作为非限制性实例，合成纳米载体可包含Th1免疫刺激剂，其可增强免疫系统的基于Th1的反应(参见国际公开第WO2010123569号和美国公开第20110223201号，其各自以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，合成纳米载体可经配制用于靶向释放。在一些实施方案中，合成纳米载体经配制以在指定pH值下和/或在所需时间间隔后释放多核苷酸。作为非限制性实例，合成纳米粒子可经配制以在24小时后和/或在pH 4.5下释放RNA疫苗(参见国际公开第WO2010138193号和第WO2010138194号和美国公开第US20110020388号和第US20110027217号，其各自以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，合成纳米载体可经配制用于本文所述的多核苷酸的控制和/或持续释放。作为非限制性实例，用于持续释放的合成纳米载体可通过本领域中已知、本文所述和/或如国际公开第WO2010138192号和美国公开第20100303850号中所述的方法来配制，各专利以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，RNA疫苗可经配制用于控制和/或持续释放，其中制剂包含至少一种为结晶侧链(CYSC)聚合物的聚合物。CYSC聚合物在美国专利第8,399,007号中描述，其以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，合成纳米载体可经配制以用作疫苗。在一些实施方案中，合成纳米载体可囊封至少一种编码至少一种抗原的多核苷酸。作为非限制性实例，合成纳米载体可包括至少一种抗原和用于疫苗剂型的赋形剂(参见国际公开第WO2011150264号和美国公开第20110293723号，其各自以引用方式整体并入本文中)。作为另一非限制性实例，疫苗剂型可包括具有相同或不同抗原和赋形剂的至少两种合成纳米载体(参见国际公开第WO2011150249号和美国公开第20110293701号，其各自以引用方式整体并入本文中)。疫苗剂型可通过本文所述、本领域中已知和/或国际公开第WO2011150258号和美国公开第US20120027806号中所述的方法来选择，各专利以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，合成纳米载体可包含至少一种编码至少一种佐剂(例如，鞭毛蛋白)的多核苷酸。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含至少一种佐剂。作为非限制性实例，佐剂可包含二甲基二(十八烷基)溴化铵、二甲基二(十八烷基)氯化铵、二甲基二(十八烷基)磷酸铵或二甲基二(十八烷基)乙酸铵(DDA)和分枝杆菌的全部脂质萃取物的非极性馏分或所述非极性馏分的一部分(参见例如，美国专利第8,241,610号；其以引用方式整体并入本文中)。在其他实施方案中，合成纳米载体可包含至少一种多核苷酸和佐剂。作为非限制性实例，包含、任选地包含佐剂的合成纳米载体可通过国际公开第WO2011150240号和美国公开第US20110293700号中所述的方法来配制，各专利以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，合成纳米载体可囊封至少一种编码来自病毒的肽、片段或区域的多核苷酸。作为非限制性实例，合成纳米载体可包括但不限于国际公开第WO2012024621号、第WO201202629号、第WO2012024632号和美国公开第US20120064110号、第US20120058153号和第US20120058154号中所述的纳米载体，各专利以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，合成纳米载体可偶合至可为能够触发体液和/或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的多核苷酸(参见例如，国际公开第WO2013019669号，其以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，RNA疫苗可囊封在两性离子脂质中，与两性离子脂质连接和/或缔合。两性离子脂质的非限制性实例和使用两性离子脂质的方法在美国公开第20130216607号中描述，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。在一些方面，两性离子脂质可用于本文所述的脂质体和脂质纳米粒子中。
在一些实施方案中，RNA疫苗可在如美国公开第20130197100号中所述的胶态纳米载体中配制，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，纳米粒子可经优化用于经口施用。纳米粒子可包含至少一种阳离子型生物聚合物，诸如(但不限于)壳聚糖或其衍生物。作为非限制性实例，纳米粒子可通过美国公开第20120282343号中所述的方法来配制；该专利以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，LNP包含脂质KL52(美国申请公开第2012/0295832号中所公开的氨基-脂质，该专利明确地以引用方式整体并入本文中)。LNP施用的活性和/或安全性(如通过检查ALT/AST、白细胞计数和细胞因子诱导中的一个或多个所测量)可通过合并此类脂质来改善。包含KL52的LNP可经静脉内和/或以一次或多次剂量施用。在一些实施方案中，与包含MC3的LNP相比，施用包含KL52的LNP导致相等或改善的mRNA和/或蛋白表达。
在一些实施方案中，RNA疫苗可使用较小LNP递送。此类粒子可包含低于0.1μm至100nm的直径，诸如(但不限于)小于0.1μm、小于1.0μm、小于5μm、小于10μm、小于15μm、小于20μm、小于25μm、小于30μm、小于35μm、小于40μm、小于50μm、小于55μm、小于60μm、小于65μm、小于70μm、小于75μm、小于80μm、小于85μm、小于90μm、小于95μm、小于100μm、小于125μm、小于150μm、小于175μm、小于200μm、小于225μm、小于250μm、小于275μm、小于300μm、小于325μm、小于350μm、小于375μm、小于400μm、小于425μm、小于450μm、小于475μm、小于500μm、小于525μm、小于550μm、小于575μm、小于600μm、小于625μm、小于650μm、小于675μm、小于700μm、小于725μm、小于750μm、小于775μm、小于800μm、小于825μm、小于850μm、小于875μm、小于900μm、小于925μm、小于950μm或小于975μm。
在其他实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗可使用较小LNP递送，其可包含如下直径：约1nm至约100nm、约1nm至约10nm、约1nm至约20nm、约1nm至约30nm、约1nm至约40nm、约1nm至约50nm、约1nm至约60nm、约1nm至约70nm、约1nm至约80nm、约1nm至约90nm、约5nm至约100nm、约5nm至约10nm、约5nm至约20nm、约5nm至约30nm、约5nm至约40nm、约5nm至约50nm、约5nm至约60nm、约5nm至约70nm、约5nm至约80nm、约5nm至约90nm、约10至约50nm、约20至约50nm、约30至约50nm、约40至约50nm、约20至约60nm、约30至约60nm、约40至约60nm、约20至约70nm、约30至约70nm、约40至约70nm、约50至约70nm、约60至约70nm、约20至约80nm、约30至约80nm、约40至约80nm、约50至约80nm、约60至约80nm、约20至约90nm、约30至约90nm、约40至约90nm、约50至约90nm、约60至约90nm和/或约70至约90nm。
在一些实施方案中，此类LNP是使用包含微流体混合器的方法来合成。例示性微流体混合器可包括但不限于分开指叉型微混合器，包括但不限于由Microinnova(Allerheiligen bei Wildon，Austria)制造的那些混合器和/或交错鲱鱼骨式微混合器(SHM)(Zhigaltsev，I.V.等人，Bottom-up design and synthesis of limit size lipidnanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecondmicrofluidic mixing have been published(Langmuir.2012.28：3633-40；Belliveau，N.M.等人，Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipidnanoparticles for in vivo delivery of siRNA.Molecular Therapy-NucleicAcids.2012.1：e37；Chen，D.等人，Rapid discovery of potent siRNA-containing lipidnanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.J Am ChemSoc.2012.134(16)：6948-51；其各自以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，包含SHM的LNP产生方法还包括混合至少两个输入流，其中混合通过微结构诱发的混沌对流(MICA)发生。根据此方法，流体流流过以鲱鱼骨图案存在的通道，从而引起旋转流且在彼此周围叠加。此方法还可包括用于流体混合的表面，其中所述表面改变流体循环期间的取向。使用SHM产生LNP的方法包括美国申请公开第2004/0262223号和第2012/0276209号中所公开的那些方法，各专利明确地以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的RNA疫苗可在使用微混合器制造的脂质纳米粒子中配制，所述微混合器诸如(但不限于)来自Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH(MainzGermany)的分开指叉型微结构混合器(SIMM-V2)或标准分开指叉型微混合器(SSIMM)或履带式(CPMM)或碰撞流型(IJMM)。
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如，mRNA)疫苗可在使用微流体技术制造的脂质纳米粒子中配制(参见Whitesides，George M.The Origins and the Future ofMicrofluidics.Nature，2006 442：368-373；和Abraham等人Chaotic Mixer forMicrochannels.Science，2002 295：647-651；其各自以引用方式整体并入本文中)。作为非限制性实例，对照微流体制剂包括用于在低雷诺数(Reynolds number)下将稳定压力驱动流混合于微通道中的被动方法(参见例如，Abraham等人Chaotic Mixer forMicrochannels.Science，2002 295：647651；其以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可在使用微混合器芯片制造的脂质纳米粒子中配制，所述微混合器芯片诸如(但不限于)来自Harvard Apparatus(Holliston，MA)或Dolomite Microfluidics(Royston，UK)的那些微混合器芯片。微混合器芯片可用于以分开和重组机制快速混合两个或两个以上流体流。
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可经配制用于使用国际公开第WO2013063468号或美国专利第8,440,614号中所述的药物囊封微球体递送，各专利以引用方式整体并入本文中。微球体可包含如国际公开第WO2013063468号中所述的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。在其他方面，氨基酸、肽、多肽、脂质(APPL)适用于将本发明的RNA疫苗递送至细胞(参见国际公开第WO2013063468号，该专利的内容以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如，mRNA)疫苗可在具有约10至约100nm的直径的脂质纳米粒子中配制，所述直径诸如(但不限于)约10至约20nm、约10至约30nm、约10至约40nm、约10至约50nm、约10至约60nm、约10至约70nm、约10至约80nm、约10至约90nm、约20至约30nm、约20至约40nm、约20至约50nm、约20至约60nm、约20至约70nm、约20至约80nm、约20至约90nm、约20至约100nm、约30至约40nm、约30至约50nm、约30至约60nm、约30至约70nm、约30至约80nm、约30至约90nm、约30至约100nm、约40至约50nm、约40至约60nm、约40至约70nm、约40至约80nm、约40至约90nm、约40至约100nm、约50至约60nm、约50至约70nm约50至约80nm、约50至约90nm、约50至约100nm、约60至约70nm、约60至约80nm、约60至约90nm、约60至约100nm、约70至约80nm、约70至约90nm、约70至约100nm、约80至约90nm、约80至约100nm和/或约90至约100nm。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子可具有约10至500nm的直径。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子可具有大于100nm、大于150nm、大于200nm、大于250nm、大于300nm、大于350nm、大于400nm、大于450nm、大于500nm、大于550nm、大于600nm、大于650nm、大于700nm、大于750nm、大于800nm、大于850nm、大于900nm、大于950nm或大于1000nm的直径。
在一些方面，脂质纳米粒子可为国际公开第WO2013059922号中所述的极限尺寸脂质纳米粒子，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。极限尺寸脂质纳米粒子可包含包围水性核心或疏水性核心的脂质双层；其中脂质双层可包含磷脂，诸如(但不限于)二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂、脑苷脂、C8-C20脂肪酸二酰基磷脂酰胆碱和1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(POPC)。在其他方面，极限尺寸脂质纳米粒子可包含聚乙二醇-脂质诸如(但不限于)DLPE-PEG、DMPE-PEG、DPPC-PEG和DSPE-PEG。
在一些实施方案中，RNA疫苗可使用国际公开第WO2013063530号中所述的递送方法在特定位置递送、定位和/或集中，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。作为非限制性实例，可在将RNA疫苗递送至受试者之前、同时或之后向受试者施用空心聚合粒子。空心聚合粒子一旦与受试者接触后经历体积变化且变成存放、嵌入、固定或俘获在受试者中的特定位置。
在一些实施方案中，RNA疫苗可在活性物质释放系统中配制(参见例如，美国公开第US20130102545号，其内容以引用方式整体并入本文中)。活性物质释放系统可包含1)至少一种键结至与催化活性核酸杂交的寡多核苷酸抑制剂链的纳米粒子，和2)键结至至少一种键结至治疗活性物质(例如，本文所述的多核苷酸)的底物分子的化合物，其中治疗活性物质是通过催化活性核酸裂解底物分子来释放。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗可在包含含非细胞物质的内部核心和含细胞膜的外部表面的纳米粒子中配制。细胞膜可源自细胞或源自病毒的膜。作为非限制性实例，纳米粒子可通过国际公开第WO2013052167号中所述的方法制得，该专利以引用方式整体并入本文中。作为另一非限制性实例，国际公开第WO2013052167号中所述的纳米粒子可用于递送本文所述的RNA疫苗，该专利以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，RNA疫苗可在多孔纳米粒子支撑的脂质双层(原始细胞)中配制。原始细胞是在国际公开第WO2013056132号中描述，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，本文所述的RNA疫苗可在如美国专利第8,420,123号和第8,518,963号和欧洲专利第EP2073848B1号中所述的聚合纳米粒子中配制或通过这两个专利中所述的方法制得，其各自的内容以引用方式整体并入本文中。作为非限制性实例，聚合纳米粒子可具有高玻璃化转变温度，诸如美国专利第8,518,963号中所述的纳米粒子或通过该专利中所述的方法所制得的纳米粒子，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。作为另一非限制性实例，用于口服和非经肠制剂的聚合物纳米粒子可通过欧洲专利第EP2073848B1号中所述的方法制得，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在其他实施方案中，本文所述的RNA(例如，mRNA)疫苗可在用于成像的纳米粒子中配制。纳米粒子可为脂质体纳米粒子，诸如美国公开第20130129636号中所述的那些脂质体纳米粒子，该专利以引用方式整体并入本文中。作为非限制性实例，脂质体可包含钆(III)2-{4，7-双-羧甲基-10-[(N，N-二硬脂酰基酰胺基甲基-N′-酰胺基-甲基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸和中性、完全饱和磷脂组分(参见例如，美国公开第US20130129636号，其内容以引用方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，可用于本发明中的纳米粒子是通过美国专利申请第20130130348号中所述的方法来形成，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
本发明的纳米粒子可还包括营养物，诸如(但不限于)缺乏可导致从贫血至神经管缺陷的健康危害的那些营养物(参见例如，国际专利公开第WO2013072929号中所述的纳米粒子，该专利的内容以引用方式整体并入本文中)。作为非限制性实例，营养物可为亚铁盐、铁盐或元素铁形式的铁、碘、叶酸、维生素或微量营养物。
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可在可溶胀纳米粒子中配制。可溶胀纳米粒子可为(但不限于)美国专利第8,440,231号中所述的那些纳米粒子，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。作为非限制性实施方案，可溶胀纳米粒子可用于将本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗递送至肺部系统(参见例如，美国专利第8,440,231号，其内容以引用方式整体并入本文中)。
本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可在聚酸酐纳米粒子中配制，诸如(但不限于)美国专利第8,449,916号中所述的那些纳米粒子，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。本发明的纳米粒子和微粒子可经几何学工程化以调节巨噬细胞和/或免疫反应。在一些方面，经几何学工程化的粒子可具有各种形状、尺寸和/或表面电荷以合并本发明的多核苷酸用于靶向递送，诸如(但不限于)肺部递送(参见例如，国际公开第WO2013082111号，其内容以引用方式整体并入本文中)。几何学工程化粒子可具有的其他物理特征包括但不限于可改变与细胞和组织的相互作用的开窗、角度臂、不对称性和表面粗糙度、电荷。作为非限制性实例，本发明的纳米粒子可通过国际公开第WO2013082111号中所述的方法制得，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的纳米粒子可为水溶性纳米粒子，诸如(但不限于)国际公开第WO2013090601号中所述的那些纳米粒子，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。纳米粒子可为无机纳米粒子，其具有紧密和两性离子配体以展现良好水溶性。纳米粒子还可具有小流体动力学直径(HD)，相对于时间、pH值和盐度的稳定性，和低程度的非特异性蛋白结合。
在一些实施方案中，本发明的纳米粒子可通过美国公开第US20130172406号中所述的方法来研发，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的纳米粒子为隐形纳米粒子或标靶特异性隐形纳米粒子，诸如(但不限于)美国公开第20130172406号中所述的那些纳米粒子，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。本发明的纳米粒子可通过美国公开第20130172406号中所述的方法制得，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
在其他实施方案中，隐形或标靶特异性隐形纳米粒子可包含聚合基质。聚合基质可包含两种或两种以上聚合物，诸如(但不限于)聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羟酸、聚丙基富马酸酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚酯、聚酸酐、聚醚、聚氨酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯或其组合。
在一些实施方案中，纳米粒子可为具有高密度核酸层的纳米粒子-核酸杂交结构。作为非限制性实例，纳米粒子-核酸杂交结构可通过美国公开第20130171646号中所述的方法制得，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。纳米粒子可包含核酸，诸如(但不限于)本文所述和/或本领域中已知的多核苷酸。
本发明的纳米粒子中的至少一个可为嵌入纳米结构的核心或涂有低密度多孔3-D结构或涂层，其能够在纳米结构内或表面上带有至少一个净荷或与其缔合。包含至少一种纳米粒子的纳米结构的非限制性实例在国际公开第WO2013123523号中描述，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
疫苗施用模式
RSV RNA(例如，mRNA)疫苗可通过产生治疗有效结果的任何途径来施用。这些途径包括但不限于皮内、肌内、鼻内和/或皮下施用。本公开提供包括向有需要的受试者施用RNA疫苗的方法。所需的精确量将取决于受试者的物种、年龄和总体状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用模式、其活性模式及其类似因素而在受试者之间变化。RSV RNA(例如，mRNA)组合物通常配制为单位剂型以便于施用和剂量的均一性。然而，应了解，RSV RNA(例如，mRNA)组合物的每日总用量可由主治医师在合理医学判断的范围内决定。对于任何特定患者的特异性治疗有效、预防有效或适当成像剂量水平将取决于各种因素，包括受治疗的病症和病症的严重程度；所采用的特定化合物的活性、所采用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所采用的特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的特定化合物组合或同步使用的药物；和医学领域中熟知的类似因素。
在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗组合物可以足以递送每天按受试者体重计0.0001mg/kg至100mg/kg、0.001mg/kg至0.05mg/kg、0.005mg/kg至0.05mg/kg、0.001mg/kg至0.005mg/kg、0.05mg/kg至0.5mg/kg、0.01mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至40mg/kg、0.5mg/kg至30mg/kg、0.01mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg或1mg/kg至25mg/kg的剂量水平每天、每周、每月等施用一次或多次，以获得所需的治疗、诊断、预防或成像作用(参见例如，国际公开第WO2013078199号中所述的单位剂量范围，其全文以引用方式并入本文中)。所需剂量可按每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天、每三天、每周、每两周、每三周、每四周、每2个月、每三个月、每6个月等递送。在某些实施方案中，所需剂量可使用多次施用来递送(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或十四次以上施用)。当采用多次施用时，可使用诸如本文所述的那些分开给药方案。在例示性实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗组合物可以足以递送0.0005mg/kg至0.01mg/kg、例如约0.0005mg/kg至约0.0075mg/kg、例如约0.0005mg/kg、约0.001mg/kg、约0.002mg/kg、约0.003mg/kg、约0.004mg/kg或约0.005mg/kg的剂量水平施用。
在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗组合物可以足以递送0.025mg/kg至0.250mg/kg、0.025mg/kg至0.500mg/kg、0.025mg/kg至0.750mg/kg或0.025mg/kg至1.0mg/kg的剂量水平施用一次或两次(或两次以上)。
在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗组合物可以0.0100mg、0.025mg、0.050mg、0.075mg、0.100mg、0.125mg、0.150mg、0.175mg、0.200mg、0.225mg、0.250mg、0.275mg、0.300mg、0.325mg、0.350mg、0.375mg、0.400mg、0.425mg、0.450mg、0.475mg、0.500mg、0.525mg、0.550mg、0.575mg、0.600mg、0.625mg、0.650mg、0.675mg、0.700mg、0.725mg、0.750mg、0.775mg、0.800mg、0.825mg、0.850mg、0.875mg、0.900mg、0.925mg、0.950mg、0.975mg或1.0mg的总剂量或以足以递送所述总剂量的剂量水平施用两次(例如，第0天和第7天、第0天和第14天、第0天和第21天、第0天和第28天、第0天和第60天、第0天和第90天、第0天和第120天、第0天和第150天、第0天和第180天、第0天和3个月后、第0天和6个月后、第0天和9个月后、第0天和12个月后、第0天和18个月后、第0天和2年后、第0天和5年后或第0天和10年后)。本公开涵盖更高和更低的施用剂量和频率。举例来说，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗组合物可施用三次或四次。
在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗组合物可以0.010mg、0.025mg、0.100mg或0.400mg的总剂量或以足以递送所述总剂量的剂量水平施用两次(例如，第0天和第7天、第0天和第14天、第0天和第21天、第0天和第28天、第0天和第60天、第0天和第90天、第0天和第120天、第0天和第150天、第0天和第180天、第0天和3个月后、第0天和6个月后、第0天和9个月后、第0天和12个月后、第0天和18个月后、第0天和2年后、第0天和5年后或第0天和10年后)。
在一些实施方案中，用于对受试者进行疫苗接种的方法中的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗是以对受试者进行疫苗接种的有效量向受试者施用单次剂量介于10μg/kg与400μg/kg之间的核酸疫苗。在一些实施方案中，用于对受试者进行疫苗接种的方法中的RNA疫苗是以对受试者进行疫苗接种的有效量向受试者施用单次剂量介于10μg与400μg之间的核酸疫苗。在一些实施方案中，用于对受试者进行疫苗接种的方法中的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗是以25至1000μg的单次剂量(例如，单次剂量的编码RSV抗原的mRNA)向受试者施用。在一些实施方案中，RSV RNA疫苗是以25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg的单次剂量向受试者施用。举例来说，RSV RNA疫苗可以25至100、25至500、50至100、50至500、50至1000、100至500、100至1000、250至500、250至1000或500至1000μg的单次剂量向受试者施用。在一些实施方案中，用于对受试者进行疫苗接种的方法中的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗是以两次剂量向受试者施用，其组合等于25至1000μg的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。
本文所述的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗药物组合物可被配制成本文所述的剂型，诸如鼻内、气管内或可注射(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、皮内、心脏内、腹膜内和皮下)。
RSV RNA疫苗制剂和使用方法
本公开的一些方面提供RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的制剂，其中RSV RNA疫苗以在受试者中产生抗原特异性免疫反应(例如，产生对抗-RSV抗原性多肽具有特异性的抗体)的有效量配制。“有效量”为有效产生抗原特异性免疫反应的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的剂量。本文还提供在受试者中诱发抗原特异性免疫反应的方法。
在一些实施方案中，抗原特异性免疫反应是通过测量抗-RSV抗原性多肽在经施用如本文所提供的RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的受试者中产生的抗体效价来表征。抗体效价是对受试者中的抗体的量的度量，例如对特定抗原(例如，抗-RSV抗原性多肽)或抗原的表位具有特异性的抗体。抗体效价通常表述为提供正结果的最大稀释度的倒数。酶联免疫吸附剂检定(ELISA)是例如用于测定抗体效价的常用检定。
在一些实施方案中，抗体效价用于评估受试者是否感染或确定是否需要免疫接种。在一些实施方案中，抗体效价用于确定自身免疫反应的强度、确定是否需要加强免疫接种、确定先前的疫苗是否有效和鉴别任何最近或先前的感染。根据本公开，抗体效价可用于确定由RSV RNA(例如，mRNA)疫苗在受试者中诱发的免疫反应的强度。
在一些实施方案中，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加至少1log。举例来说，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言可增加至少1.5、至少2、至少2.5或至少3log。在一些实施方案中，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加1、1.5、2、2.5或3log。在一些实施方案中，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加1至3log。举例来说，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言可增加1至1.5、1至2、1至2.5、1至3、1.5至2、1.5至2.5、1.5至3、2至2.5、2至3或2.5至3log。
在一些实施方案中，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加至少2倍。举例来说，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言可增加至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些实施方案中，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施方案中，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言增加2至10倍。举例来说，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价相对于对照物(例如，对照疫苗)而言可增加2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9或9至10倍。
在一些实施方案中，对照物为抗-RSV抗原性多肽在未经施用RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的受试者中产生的抗体效价。在一些实施方案中，对照物为抗-RSV抗原性多肽在经施用减毒活RSV疫苗的受试者中产生的抗体效价。减毒疫苗为通过降低活疫苗(活的)的致病性所产生的疫苗。减毒病毒是以使其相对于活的未经修饰病毒而言无害或低致病性的方式进行改变。在一些实施方案中，对照物为抗-RSV抗原性多肽在经施用灭活的RSV疫苗的受试者中产生的抗体效价。在一些实施方案中，对照物为抗-RSV抗原性多肽在经施用重组或纯化的RSV蛋白疫苗的受试者中产生的抗体效价。重组蛋白疫苗通常包括在异源表达系统(例如，细菌或酵母)中产生或从大量病原性有机体纯化的蛋白抗原。在一些实施方案中，对照物为抗-RSV抗原性多肽在经施用RSV类病毒粒子(VLP)疫苗(例如，含有病毒衣壳蛋白但缺少病毒基因组且因此无法复制/产生后代病毒的粒子)的受试者中产生的抗体效价。在一些实施方案中，对照物为包含融合前或融合后F蛋白或包含两者组合的VLP RSV疫苗。
在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量为与重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量相比减少的剂量。如本文所提供的“护理标准”是指医学或心理学治疗准则且可为一般或特定的。“护理标准”基于在对既定病况的治疗中涉及的医学专业人员之间的科学证据和协作来指定适当治疗。其为医师/临床医师对于某种类型的患者、疾病或临床情形应遵循的诊断和治疗过程。如本文所提供的“护理标准剂量”是指医师/临床医师或其他医学专业人员将向受试者施用来治疗或预防RSV或RSV相关病况，同时遵循用于治疗或预防RSV或RSV相关病况的护理标准准则的重组或纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的剂量。
在一些实施方案中，抗-RSV抗原性多肽在经施用有效量的RSV RNA疫苗的受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量为等于比重组或纯化的RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少2倍的剂量。举例来说，RSV RNA疫苗的有效量可为等于比重组或纯化的RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍的剂量。在一些实施方案中，RSV RNA疫苗的有效量为等于比重组或纯化的RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少100倍、至少500倍或至少1000倍的剂量。在一些实施方案中，RSV RNA疫苗的有效量为等于比重组或纯化的RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍、250倍、500倍或1000倍的剂量。在一些实施方案中，抗-RSV抗原性多肽在经施用有效量的RSV RNA疫苗的受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或蛋白RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量为等于比重组或纯化的RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少2倍至1000倍(例如，2倍至100倍、10倍至1000倍)的剂量，其中抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少2至1000倍、2至900倍、2至800倍、2至700倍、2至600倍、2至500倍、2至400倍、2至300倍、2至200倍、2至100倍、2至90倍、2至80倍、2至70倍、2至60倍、2至50倍、2至40倍、2至30倍、2至20倍、2至10倍、2至9倍、2至8倍、2至7倍、2至6倍、2至5倍、2至4倍、2至3倍、3至1000倍、3至900倍、3至800倍、3至700倍、3至600倍、3至500倍、3至400倍、3至300倍、3至200倍、3至100倍、3至90倍、3至80倍、3至70倍、3至60倍、3至50倍、3至40倍、3至30倍、3至20倍、3至10倍、3至9倍、3至8倍、3至7倍、3至6倍、3至5倍、3至4倍、4至1000倍、4至900倍、4至800倍、4至700倍、4至600倍、4至500倍、4至400倍、4至300倍、4至200倍、4至100倍、4至90倍、4至80倍、4至70倍、4至60倍、4至50倍、4至40倍、4至30倍、4至20倍、4至10倍、4至9倍、4至8倍、4至7倍、4至6倍、4至5倍、4至4倍、5至1000倍、5至900倍、5至800倍、5至700倍、5至600倍、5至500倍、5至400倍、5至300倍、5至200倍、5至100倍、5至90倍、5至80倍、5至70倍、5至60倍、5至50倍、5至40倍、5至30倍、5至20倍、5至10倍、5至9倍、5至8倍、5至7倍、5至6倍、6至1000倍、6至900倍、6至800倍、6至700倍、6至600倍、6至500倍、6至400倍、6至300倍、6至200倍、6至100倍、6至90倍、6至80倍、6至70倍、6至60倍、6至50倍、6至40倍、6至30倍、6至20倍、6至10倍、6至9倍、6至8倍、6至7倍、7至1000倍、7至900倍、7至800倍、7至700倍、7至600倍、7至500倍、7至400倍、7至300倍、7至200倍、7至100倍、7至90倍、7至80倍、7至70倍、7至60倍、7至50倍、7至40倍、7至30倍、7至20倍、7至10倍、7至9倍、7至8倍、8至1000倍、8至900倍、8至800倍、8至700倍、8至600倍、8至500倍、8至400倍、8至300倍、8至200倍、8至100倍、8至90倍、8至80倍、8至70倍、8至60倍、8至50倍、8至40倍、8至30倍、8至20倍、8至10倍、8至9倍、9至1000倍、9至900倍、9至800倍、9至700倍、9至600倍、9至500倍、9至400倍、9至300倍、9至200倍、9至100倍、9至90倍、9至80倍、9至70倍、9至60倍、9至50倍、9至40倍、9至30倍、9至20倍、9至10倍、10至1000倍、10至900倍、10至800倍、10至700倍、10至600倍、10至500倍、10至400倍、10至300倍、10至200倍、10至100倍、10至90倍、10至80倍、10至70倍、10至60倍、10至50倍、10至40倍、10至30倍、10至20倍、20至1000倍、20至900倍、20至800倍、20至700倍、20至600倍、20至500倍、20至400倍、20至300倍、20至200倍、20至100倍、20至90倍、20至80倍、20至70倍、20至60倍、20至50倍、20至40倍、20至30倍、30至1000倍、30至900倍、30至800倍、30至700倍、30至600倍、30至500倍、30至400倍、30至300倍、30至200倍、30至100倍、30至90倍、30至80倍、30至70倍、30至60倍、30至50倍、30至40倍、40至1000倍、40至900倍、40至800倍、40至700倍、40至600倍、40至500倍、40至400倍、40至300倍、40至200倍、40至100倍、40至90倍、40至80倍、40至70倍、40至60倍、40至50倍、50至1000倍、50至900倍、50至800倍、50至700倍、50至600倍、50至500倍、50至400倍、50至300倍、50至200倍、50至100倍、50至90倍、50至80倍、50至70倍、50至60倍、60至1000倍、60至900倍、60至800倍、60至700倍、60至600倍、60至500倍、60至400倍、60至300倍、60至200倍、60至100倍、60至90倍、60至80倍、60至70倍、70至1000倍、70至900倍、70至800倍、70至700倍、70至600倍、70至500倍、70至400倍、70至300倍、70至200倍、70至100倍、70至90倍、70至80倍、80至1000倍、80至900倍、80至800倍、80至700倍、80至600倍、80至500倍、80至400倍、80至300倍、80至200倍、80至100倍、80至90倍、90至1000倍、90至900倍、90至800倍、90至700倍、90至600倍、90至500倍、90至400倍、90至300倍、90至200倍、90至100倍、100至1000倍、100至900倍、100至800倍、100至700倍、100至600倍、100至500倍、100至400倍、100至300倍、100至200倍、200至1000倍、200至900倍、200至800倍、200至700倍、200至600倍、200至500倍、200至400倍、200至300倍、300至1000倍、300至900倍、300至800倍、300至700倍、300至600倍、300至500倍、300至400倍、400至1000倍、400至900倍、400至800倍、400至700倍、400至600倍、400至500倍、500至1000倍、500至900倍、500至800倍、500至700倍、500至600倍、600至1000倍、600至900倍、600至800倍、600至700倍、700至1000倍、700至900倍、700至800倍、800至1000倍、800至900倍或900至1000倍的剂量。在一些实施方案(诸如前述实施方案)中，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。在一些实施方案中，有效量为等于(或等于至少)比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、1280倍、190倍、200倍、210倍、220倍、230倍、240倍、250倍、260倍、270倍、280倍、290倍、300倍、310倍、320倍、330倍、340倍、350倍、360倍、370倍、380倍、390倍、400倍、410倍、420倍、430倍、440倍、450倍、4360倍、470倍、480倍、490倍、500倍、510倍、520倍、530倍、540倍、550倍、560倍、5760倍、580倍、590倍、600倍、610倍、620倍、630倍、640倍、650倍、660倍、670倍、680倍、690倍、700倍、710倍、720倍、730倍、740倍、750倍、760倍、770倍、780倍、790倍、800倍、810倍、820倍、830倍、840倍、850倍、860倍、870倍、880倍、890倍、900倍、910倍、920倍、930倍、940倍、950倍、960倍、970倍、980倍、990至或1000倍的剂量。在一些实施方案(诸如前述实施方案)中，抗-RSV抗原性多肽在受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量为50至1000μg的总剂量。在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量为50至1000、50至900、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100、50至90、50至80、50至70、50至60、60至1000、60至900、60至800、60至700、60至600、60至500、60至400、60至300、60至200、60至100、60至90、60至80、60至70、70至1000、70至900、70至800、70至700、70至600、70至500、70至400、70至300、70至200、70至100、70至90、70至80、80至1000、80至900、80至800、80至700、80至600、80至500、80至400、80至300、80至200、80至100、80至90、90至1000、90至900、90至800、90至700、90至600、90至500、90至400、90至300、90至200、90至100、100至1000、100至900、100至800、100至700、100至600、100至500、100至400、100至300、100至200、200至1000、200至900、200至800、200至700、200至600、200至500、200至400、200至300、300至1000、300至900、300至800、300至700、300至600、300至500、300至400、400至1000、400至900、400至800、400至700、400至600、400至500、500至1000、500至900、500至800、500至700、500至600、600至1000、600至900、600至900、600至700、700至1000、700至900、700至800、800至1000、800至900或900至1000μg的总剂量。在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量为50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为总计两次向受试者施用的25至500μg的剂量。在一些实施方案中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量为总计两次向受试者施用的25至500、25至400、25至300、25至200、25至100、25至50、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100、100至500、100至400、100至300、100至200、150至500、150至400、150至300、150至200、200至500、200至400、200至300、250至500、250至400、250至300、300至500、300至400、350至500、350至400、400至500或450至500μg的剂量。在一些实施方案中，RSVRNA(例如，mRNA)疫苗的有效量为总计两次向受试者施用的25、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μg的总剂量。
其他实施方案
1.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其具有5′端帽、编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框和3′polyA尾。
2.如第1段的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由经SEQ ID NO：257标识的序列编码。
3.如第1段的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由经SEQ ID NO：258标识的序列编码。
4.如第1段的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由经SEQ ID NO：259标识的序列编码。
5.如第1段的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含经SEQ ID NO：278标识的序列。
6.如第1段的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含经SEQ ID NO：279标识的序列。
7.如第1段的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含经SEQ ID NO：280标识的序列。
8.如第1段至第7段中任一段的疫苗，其中所述5′端帽为或包含7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp。
9.如第1段至第8段中任一段的疫苗，其中所述开放阅读框中100％的尿嘧啶经修饰以在尿嘧啶的5位处包括N1-甲基假尿苷。
10.如第1段至第9段中任一段的疫苗，其中所述疫苗是在脂质纳米粒子中配制，所述脂质纳米粒子包含：DLin-MC3-DMA；胆固醇；1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)；和聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
11.如第10段的疫苗，其中所述脂质纳米粒子还包含柠檬酸钠缓冲液、蔗糖和水。
12.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp、经SEQ ID NO：278标识的序列和3′polyA尾，其中所述经SEQ ID NO：278标识的序列的尿嘧啶核苷酸经修饰以在尿嘧啶核苷酸的5位处包括N1-甲基假尿苷，任选地其中所述疫苗是在脂质纳米粒子中配制，所述脂质纳米粒子包含DLin-MC3-DMA、胆固醇、1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)和聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
13.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp、经SEQ ID NO：279标识的序列和3′polyA尾，其中所述经SEQ ID NO：279标识的序列的尿嘧啶核苷酸经修饰以在尿嘧啶核苷酸的5位处包括N1-甲基假尿苷，任选地其中所述疫苗是在脂质纳米粒子中配制，所述脂质纳米粒子包含DLin-MC3-DMA、胆固醇、1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)和聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
14.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp、经SEQ ID NO：280标识的序列和3′polyA尾，其中所述经SEQ ID NO：280标识的序列的尿嘧啶核苷酸经修饰以在尿嘧啶核苷酸的5位处包括N1-甲基假尿苷，任选地其中所述疫苗是在脂质纳米粒子中配制，所述脂质纳米粒子包含DLin-MC3-DMA、胆固醇、1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)和聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
15.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其具有5′端帽、编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框和3′polyA尾。
16.如第15段的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由经SEQ ID NO：5标识的序列编码。
17.如第15段的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含经SEQ ID NO：262标识的序列。
18.如第15段的疫苗，其中所述至少一种RSV抗原性多肽包含经SEQ ID NO：6标识的序列。
19.如第15段的疫苗，其中所述至少一种RSV抗原性多肽包含经SEQ ID NO：290标识的序列。
20.如第15段的疫苗，其中所述mRNA多核苷酸由经SEQ ID NO：7标识的序列编码。
21.如第15段的疫苗，其中所述mRNA多核苷酸包含经SEQ ID NO：263标识的序列。
22.如第15段的疫苗，其中所述至少一种RSV抗原性多肽包含经SEQ ID NO：8标识的序列。
23.如第15段的疫苗，其中所述至少一种RSV抗原性多肽包含经SEQ ID NO：291标识的序列。
24.如第15段至第23段中任一段的疫苗，其中所述5′端帽为或包含7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp。
25.如第15段至第24段中任一段的疫苗，其中所述开放阅读框中100％的尿嘧啶经修饰以在尿嘧啶的5位处包括N1-甲基假尿苷。
26.如第15段至第25段中任一段的疫苗，其中所述疫苗是在脂质纳米粒子中配制，所述脂质纳米粒子包含：DLin-MC3-DMA；胆固醇；1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)；和聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
27.如第26段的疫苗，其中所述脂质纳米粒子还包含柠檬酸钠缓冲液、蔗糖和水。
28.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp、经SEQ ID NO：262标识的序列和3′polyA尾，其中所述经SEQ ID NO：262标识的序列的尿嘧啶核苷酸经修饰以在尿嘧啶核苷酸的5位处包括N1-甲基假尿苷，任选地其中所述疫苗是在脂质纳米粒子中配制，所述脂质纳米粒子包含DLin-MC3-DMA、胆固醇、1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)和聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
29.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp、经SEQ ID NO：263标识的序列和3′polyA尾，其中所述经SEQ ID NO：263标识的序列的尿嘧啶核苷酸经修饰以在尿嘧啶核苷酸的5位处包括N1-甲基假尿苷，任选地其中所述疫苗是在脂质纳米粒子中配制，所述脂质纳米粒子包含DLin-MC3-DMA、胆固醇、1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)和聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
本发明不限于下文描述中所述或图式中所说明的构建详情和组分配置。本发明能够具有其他实施方案且能够以多种方式实行或进行。此外，本文所用的词组和术语是出于描述的目的且不应理解为限制。本文中使用“包括/包含(including/comprising)”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式意欲涵盖下文所列的项目及其等效物以及其他项目。
实施例
实施例1：多核苷酸的制造
根据本公开，可利用标题为“Manufacturing Methods for Production of RNATranscripts”的国际公开WO2014/152027中所教导的方法来实现多核苷酸和/或其部分或区域的制造，该专利的内容以引用方式整体并入本文中。
纯化方法可包括国际公开WO2014/152030和国际公开WO2014/152031中所教导的那些方法，各专利以引用方式整体并入本文中。
多核苷酸的检测和表征方法可如国际公开WO2014/144039中所教导来进行，该专利以引用方式整体并入本文中。
本公开的多核苷酸的表征可为实现使用多核苷酸绘图、逆转录物酶测序、电荷分布分析、检测RNA杂质或前述两者或两者以上的任何组合。“表征”包括例如测定RNA转录物序列、测定RNA转录物的纯度或测定RNA转录物的电荷异质性。此类方法是在例如国际公开WO2014/144711和国际公开WO2014/144767中教导，其各自的内容以引用方式整体并入本文中。
实施例2：嵌合多核苷酸合成
根据本公开，嵌合多核苷酸的两个区域或部分可使用三磷酸酯化学物接合或连接。100个或100个以下核苷酸的第一区域或部分是例如由5′单磷酸酯和末端3′desOH或嵌段OH化学合成而得到。如果该区域长于80个核苷酸，则其可合成为用于连接的两个链。
如果第一区域或部分是使用体外转录(IVT)来合成为非定位修饰的区域或部分，则随后可转化5′单磷酸酯，随后对3′末端进行封端。
单磷酸酯保护基可选自本领域中已知的那些单磷酸酯保护基中的任一种。
嵌合多核苷酸的第二区域或部分可使用化学合成或IVT方法来合成。IVT方法可包括可利用具有经修饰帽的引物的RNA聚合酶。或者，具有多达130个核苷酸的帽可经化学合成且与IVT区域或部分偶合。
对于连接方法而言，由DNA T4连接酶连接，继而由DNA酶处理应易于避免串接。
整个嵌合多核苷酸无需由磷酸酯-糖骨架来制造。如果此区域或部分之一编码多肽，则此区域或部分可包含磷酸酯-糖骨架。
随后使用任何已知的键击化学、邻位键击化学、溶联或本领域人员已知的其他生物结合化学方法来进行连接。
合成途径
嵌合多核苷酸可使用一系列起始区段制得。此类区段包括：
(a)包含正常3′OH的经封端且受保护的5′区段(SEG.1)
(b)可包括多肽的编码区和正常3′OH的5′三磷酸酯区段(SEG.2)
(c)用于包含虫草素或无3′OH的嵌合多核苷酸的3′末端(例如，尾部)的5′单磷酸酯区段(SEG.3)
在合成(化学或IVT)之后，可用虫草素处理区段3(SEG..3)且随后用焦磷酸酶处理以产生5′单磷酸酯。
随后可使用RNA连接酶使区段2(SEG.2)连接至SEG.3。随后纯化所连接的多核苷酸且用焦磷酸酶处理使二磷酸酯裂解。随后可纯化经处理的SEG.2-SEG.3构建体且使SEG.1连接至5′末端。可进行嵌合多核苷酸的进一步纯化步骤。
当嵌合多核苷酸编码多肽时，所连接或接合的区段可表示为：5′UTR(SEG.1)、开放阅读框或ORF(SEG.2)和3′UTR+PolyA(SEG.3)。
每一步骤的产率可多达90-95％。
实施例3：用于cDNA产生的PCR
使用Kapa Biosystems(Wobum，MA)的2x KAPA HIFITM HotStart ReadyMix进行用于制备cDNA的PCR程序。此系统包括2x KAPA ReadyMix 12.5μl；正向引物(10μM)0.75μl；反向引物(10μM)0.75μl；模板cDNA 100ng；和稀释至25.0μl的dH2O。反应条件可为在95℃下5分钟。反应可进行25个循环的98℃下20秒，随后58℃下15秒，随后72℃下45秒，随后72℃下5分钟，随后4℃下终止反应。
根据制造商的说明，可使用Invitrogen的PURELINKTM PCR微试剂盒(Carlsbad，CA)清理反应(至多5μg)。较大的反应可能需要使用具有较大容量的产品来清理。清理之后，可使用NANODROPTM对cDNA定量且通过琼脂糖凝胶电泳进行分析以确认cDNA为预期大小。随后可提交cDNA用于测序分析，之后继续进行体外转录反应。
实施例4：体外转录(IVT)
体外转录反应产生RNA多核苷酸。此类多核苷酸可包含本公开的多核苷酸的区域或部分，包括经化学修饰的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。经化学修饰的RNA多核苷酸可为经均匀修饰的多核苷酸。体外转录反应利用核苷酸三磷酸(NTP)的定制混合物。NTP可包含经化学修饰的NTP，或天然和经化学修饰的NTP的混合物，或天然NTP。
典型体外转录反应包括以下：
粗IVT混合物可在4℃下储存隔夜以供第二天清理。随后可使用1U无RNA酶的DNA酶消化初始模板。在37℃下培育15分钟后，根据制造商的说明，可使用Ambion的MEGACLEARTM试剂盒(Austin，TX)纯化mRNA。此试剂盒可纯化多达500μg RNA。清理之后，可使用NANODROPTM对RNA多核苷酸定量且通过琼脂糖凝胶电泳进行分析以确认RNA多核苷酸为适当大小且RNA未发生降解。
实施例5：酶促封端
如下进行RNA多核苷酸的封端，其中混合物包括：IVT RNA 60μg至180μg和dH2O至多72μl。在65℃下培育混合物5分钟以使RNA变性，且随后立即转移至冰上。
该方案随后涉及混合10×封端缓冲液(0.5M Tris-HCl(pH 8.0)、60mM KCl、12.5mM MgCl2)(10.0μl)；20mM GTP(5.0μl)；20mM S-腺苷蛋氨酸(2.5μl)；RNA酶抑制剂(100U)；2′-O-甲基转移酶(400U)；牛痘封端酶(鸟苷酰基转移酶)(40U)；dH2O(至多28μl)；和对于60μg RNA而言在37℃下培育30分钟或对于180μg RNA而言培育至多2小时。
根据制造商的说明，随后可使用Ambion的MEGACLEARTM试剂盒(Austin，TX)纯化RNA多核苷酸。清理之后，可使用NANODROPTM(ThermoFisher，Waltham，MA)对RNA定量且通过琼脂糖凝胶电泳进行分析以确认RNA多核苷酸为适当大小且RNA未发生降解。RNA多核苷酸产物还可通过进行逆转录PCR以产生测序用cDNA来进行测序。
实施例6：Poly-A加尾反应
在cDNA中无聚胸苷酸(poly-T)的情况下，必须在清洁最终产物之前进行poly-A加尾反应。此是通过混合经封端的IVT RNA(100μl)；RNA酶抑制剂(20U)；10x加尾缓冲液(0.5MTris-HCl(pH 8.0)、2.5M NaCl、100mM MgCl2)(12.0μl)；20mM ATP(6.0μl)；Poly-A聚合酶(20U)；dH2O至多123.5μl来进行且在37℃下培育30分钟。如果poly-A尾已在转录物中，则可跳过加尾反应且直接用Ambion的MEGACLEARTM试剂盒(Austin，TX)(至多500μg)进行清理。Poly-A聚合酶可为在酵母中表达的重组酶。
应了解，polyA加尾反应的持续性或完整性可能不会总产生精确大小的polyA尾。因此，具有约40至200个核苷酸，例如约40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、150至165、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164或165个核苷酸的polyA尾在本公开的范围内。
实施例7：封端检定
蛋白表达检定
可在相等浓度下将含有本文教导的任何帽的多核苷酸(例如，mRNA)编码多肽转染至细胞中。可在转染后6、12、24和/或36小时通过ELISA检定分泌至培养基中的蛋白量。将较高水平的蛋白分泌至培养基中的合成多核苷酸对应于具有较高翻译能力帽结构的合成多核苷酸。
纯度分析合成
可使用变性琼脂糖-尿素凝胶电泳或HPLC分析比较含有本文教导的任何帽的编码多肽的RNA(例如，mRNA)多核苷酸的纯度。与具有多个条带或拖尾条带的多核苷酸相比，通过电泳得到单个统一条带的RNA多核苷酸对应于较高纯度产物。具有单一HPLC峰值的经化学修饰的RNA多核苷酸也对应于较高纯度产物。具有较高效率的封端反应提供更纯的多核苷酸群体。
细胞因子分析
可在多种浓度下将含有本文教导的任何帽的编码多肽的RNA(例如，mRNA)多核苷酸转染至细胞中。在转染后6、12、24和/或36小时通过ELISA检定分泌至培养基中的促炎细胞因子(诸如TNF-α和IFN-β)的量。使较高水平的促炎细胞因子分泌至培养基中的RNA多核苷酸对应于含有免疫活化帽结构的多核苷酸。
封端反应效率
可在核酸酶处理后通过LC-MS分析含有本文教导的任何帽的编码多肽的RNA(例如，mRNA)多核苷酸的封端反应效率。对经封端的多核苷酸的核酸酶处理产生通过LC-MS可检测到的游离核苷酸与经封端的5′-5-三磷酸酯帽结构的混合物。在LC-MS谱图上封端产物的量可表示为由反应而得的总多核苷酸百分比且对应于封端反应效率。根据LC-MS，具有较高封端反应效率的帽结构具有较高量的封端产物。
实施例8：经修饰的RNA或RT PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
根据制造商方案，可将个别RNA多核苷酸(20μl体积中200至400ng)或经逆转录的PCR产物(200至400ng)加载于非变性1.2％琼脂糖E-Gel(Invitrogen，Carlsbad，CA)上的孔中且跑胶12至15分钟。
实施例9：NANODROPTM经修饰的RNA定量和UV光谱数据
对于NANODROPTM UV吸光度读数使用TE缓冲液(1μl)中的经化学修饰的RNA多核苷酸以对由化学合成或体外转录反应而得的每一多核苷酸的产量进行定量。
实施例10：使用类脂质配制经修饰的mRNA
可在添加至细胞之前通过在设定比率下混合多核苷酸与类脂质来配制RNA(例如，mRNA)多核苷酸以用于体外实验。体内制剂可需要添加额外成分以促使整个身体内的循环。为测试这些类脂质形成适于体内作用的粒子的能力，可使用用于siRNA-类脂质制剂的标准配制过程作为起点。形成粒子后，添加多核苷酸且允许与复合物整合。使用标准染料排除检定测定囊封效率。
实施例11：RSV RNA疫苗
RSV RNA(例如，mRNA)疫苗可包含例如至少一种由以下序列中的至少一个或由以下序列的至少一个片段或由其衍生物和变体编码的RNA多核苷酸。RSV RNA疫苗可包含例如至少一种具有至少一个化学修饰的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，例如RSV疫苗可包含例如至少一种由以下(DNA)序列中的至少一个或由以下序列的至少一个片段或由其衍生物或变体编码的经化学修饰的RNA(例如，mRNA)多核苷酸：
RSV#1
RSV#2
RSV疫苗可包含例如至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，其具有编码以下抗原性多肽序列中的至少一个或以下序列的至少一个片段的开放阅读框：
RSV#1
下划线区域表示信号肽序列。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或其可被删除。
RSV#2
下划线区域表示信号肽序列。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或其可被删除。
实施例12：小鼠免疫原性
在本实施例中，进行检定以评估与蛋白抗原相比对使用mRNA/LNP平台递送的RSV疫苗抗原的免疫反应。
向雌性Balb/c(CRL)小鼠(6至8周龄；N＝每组10只小鼠)施用RSV mRNA疫苗或蛋白疫苗。产生mRNA疫苗且在MC3脂质纳米粒子中配制。本研究中所评估的mRNA疫苗包括：
MRK-1膜结合RSV F蛋白
MRK-4膜结合DS-CAV1(稳定化的融合前F蛋白)
MRK-5 RSV F构建体
MRK-6 RSV F构建体
MRK-7 RSV F构建体
MRK8 RSV F构建体
MRK9膜结合RSV G蛋白
MRK11截短RSV F蛋白(仅胞外域)；经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列的构建体
MRK12 DS-CAV1(非膜结合形式)；经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列
经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列的MRK13：MRK-5构建体
经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列的MRK14：MRK-6构建体
经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列的MRK16：MRK-8构建体
下文列出编码上文所提及的12种mRNA的DNA序列和相关氨基酸序列。
MRK-1膜结合RSV F蛋白/MRK_01_F(全长，Merck A2毒株)/SQ-030268：
下划线区域表示信号肽序列。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除，如下文所示。
MRK-4膜结合DS-CAV1(稳定化的融合前F蛋白)/MRK_04_融合前F/DS-CAV1(全长，S155C/S290C/S190F/V207L)/SQ-030271：
下划线区域表示信号肽序列。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除，如下文所示。
MRK-5 RSV F构建体：
下划线区域表示信号肽序列。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或其可被删除，如下文所示。
MRK-6 RSV F构建体：
下划线区域表示编码折叠子的序列。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除。
第一下划线区域表示信号肽序列。第一下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或其可被删除，如下文所示。第二下划线区域表示折叠子。第二下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代。
MRK-7 RSV F构建体：
下划线区域表示信号肽序列。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或其可被删除，如下文所示。
MRK8 RSV F构建体：
下划线区域表示编码GCN4的区域。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代。
第一下划线区域表示信号肽序列。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或其可被删除，如下文所示。第二下划线区域表示GCN4。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除。
MRK9膜结合RSV G蛋白：
下划线区域表示编码跨膜结构域的区域。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除。
下划线区域表示跨膜结构域。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代。
MRK11截短RSV F蛋白(仅胞外域)；经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列的构建体：
第一下划线区域表示编码人Igκ信号肽的区域，第二下划线区域表示编码折叠子的区域。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除。
第一下划线区域表示人Igκ信号肽，第二下划线区域表示折叠子。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除，如下文所示。
MRK12 DS-CAV1(非膜结合形式)；经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列：
第一下划线区域表示编码人Igκ信号肽的区域，第二下划线区域表示编码折叠子的区域。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除。
第一下划线区域表示人Igκ信号肽，第二下划线区域表示折叠子。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除，如下文所示。
经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列的MRK13 MRK-5构建体：
下划线区域表示编码人Igκ信号肽的区域。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除。
下划线区域表示人Igκ信号肽。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除，如下文所示。
经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列的MRK14 MRK-6构建体：
第一下划线区域表示编码人Igκ信号肽的区域，第二下划线区域表示编码折叠子的区域。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除。
第一下划线区域表示人Igκ信号肽，第二下划线区域表示折叠子。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除，如下文所示。
经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列的MRK16 MRK-8构建体：
第一下划线区域表示编码人Igκ信号肽的区域，第二下划线区域表示编码GCN4的区域。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除。
第一下划线区域表示人Igκ信号肽，第二下划线区域表示GCN4。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或可被删除，如下文所示。
本研究中所评估的蛋白疫苗为如McLellan等人Science 342，592(2013)中所述的DS-CAV1稳定化的融合前F蛋白(1mg/mL)。将所述蛋白在50mM Hepes、300mM NaCl中进行缓冲且与Adju-phos一起配制。
简单来说，用以下疫苗对各组的10只小鼠进行肌内免疫接种：
在实验的第0天和第21天对动物进行免疫接种。在第14天和第35天，从每只动物抽血且用于血清学检定。在第42天和第49天，处死一个子集的动物且收获脾脏以支援ELISPOT和细胞内细胞因子染色研究。
A.RSV中和检定：
汇集来自每一组的小鼠血清且使用以下程序对RSV-A(Long毒株)的中和进行评估：
1.通过置于设定为56℃的干式恒温箱中30分钟来对所有血清样品进行热灭活。随后将样品和对照血清以1∶3稀释于病毒稀释剂(含2％FBS的EMEM)中且将重复样品添加至检定培养盘中并进行连续稀释。
2.从冰箱移出RSV-Long病毒储备液且在37℃水浴中快速解冻。在病毒稀释剂中将病毒稀释至2000pfu/mL
3.将经稀释的病毒添加至96孔培养盘的每一孔中，除了一个柱的细胞。
4.用胰蛋白酶处理HEp-2细胞，洗涤，以1.5×105个细胞/ml再悬浮于病毒稀释剂中，且将100mL经悬浮的细胞添加至96孔培养盘的每一孔中。随后在37℃、5％CO2下将培养盘培育72小时。
5.培育72小时之后，用PBS洗涤细胞，且在16至24℃下使用溶解于PBS中的80％丙酮固定10至20分钟。移除固定剂且使培养盘风干。
6.随后用PBS+0.05％Tween彻底洗涤培养盘。将检测单克隆抗体143-F3-1B8和34C9稀释成2.5倍，随后用PBS+0.05％50彻底洗涤培养盘，随后用PBS+0.彻底洗涤96孔培养盘的孔。随后在16至24℃下将培养盘在湿度箱中在振荡器上培育60至75分钟
7.培育之后，彻底洗涤培养盘。
8.将经生物素标记的马抗-小鼠IgG以1∶200稀释于检定稀释剂中且添加至96孔培养盘的每一孔中。如上文培育培养盘并洗涤。
9.在检定稀释剂中制备IRDye 800CW抗生物素蛋白链菌素(1∶1000最终稀释液)、Sapphire 700(1∶1000稀释液)和5mM DRAQ5溶液(1∶10,000稀释液)的混合液且将50mL混合液添加至96孔培养盘的每一孔中。如上文在黑暗中培育培养盘，洗涤，且使其风干。
10.随后使用Aerius Imager读取培养盘。随后在Graphpad Prism中使用4参数曲线拟合计算血清中和效价。
在图1中展示剂量1后(PD1)和剂量2后(PD2)所测量的用于小鼠免疫原性研究的血清中和抗体效价。下文还以表格形式提供PD2血清中和抗体效价：
描述 10μg剂量 2μg剂量
mF(MRK01) 4075 1391
mDS-CAV1(MRK04) 3160 846
MRK05 600 331
MRK06 465 178
MRK07 2259 2168
MRK08 2318 656
mG(MRK09) 86 39
IgSP_sF(MRK11) 4559 3597
IgSP_sDS-CAV1(MRK12) 3458 2007
MRK13 750 269
MRK14 471 116
MRK16 1077 1088
DS-CAV1蛋白/adju phos 692 1166
未处理 ＜4
结果指示中和抗体效价为稳健的且mRNA疫苗中的数种(包括RSV mF疫苗和RSVmDS-CAV1 mRNA疫苗)引发比DS-CAV1蛋白/adjuv-phos疫苗高的中和抗体效价。
B.用于细胞免疫反应的检定：
小鼠IFN-γELISPOT检定程序
I.制备脾细胞：
将脾脏置于60-mm组织培养皿中且用注射器手柄上下触摸以移除细胞。随后将切碎的脾脏转移至15-mL试管中，在1200rpm下离心10分钟，再悬浮于氯化铵钾(ACK)细胞溶解缓冲液中且在室温下培育5分钟。将R10培养基添加至试管中且在1200rpm下将细胞离心10分钟，且随后用R10培养基再洗涤一次。第二次离心之后，将细胞再悬浮于10mL R10培养基中且经由70μm耐纶细胞滤网过滤至50mL离心管中。用另外10mL培养基冲洗滤网且将此添加至细胞中。在血细胞计数器上对细胞计数且在各组之间对细胞浓度进行标准化。
II.ELISPOT检定：
1)用以10μg/ml PBS在Bio-Hood(1∶100稀释液)中的MABTECH纯化的抗-小鼠IFN-γ、克隆AN18涂覆96孔MultiScreen-IP无菌白色过滤板且在4℃下培育隔夜
2)第二天早晨，用无菌PBS洗涤培养盘且在37℃下用R10培养基阻断4小时。
3)将脾细胞以4×105个细胞/孔添加至培养盘中，且对于RSV-F和RSV-G用肽汇集物刺激细胞。肽汇集物如下。
对于RSV-F：
对于RSV-G：
4)在37℃、5％CO2下将培养盘培育20至24小时。
5)第二天，彻底洗涤培养盘且将100μL/孔MABTECH检测抗体即克隆R4-6A2添加至每一孔中达在PSB/1％FBS(1∶4000稀释液)中的0.25μg/ml。将培养盘培育2小时且随后用PBS/0.05％Tween 20彻底洗涤
6)将抗生物素蛋白链菌素-AP以1∶3000稀释于PSB/1％FBS中且对各孔均添加100μL。
7)在室温下将培养盘培育60分钟且用PBS/Tween 20(0.05％)彻底洗涤。
8)将100μl 1步NBT/BCIP添加至每一孔中，在室温下将培养盘保持数分钟，用自来水洗涤，且使其干燥隔夜。
9)使用AID成像仪系统使培养盘成像且处理数据以计算每百万个脾细胞中IFN-γ分泌细胞的数目。
数据显示RNA/LNP疫苗产生与用明矾配制的蛋白抗原相比高得多的细胞免疫反应，所述蛋白抗原引发极少至无可检测到的细胞免疫反应。参见图2，其中具有*的柱指示各组干扰素γ的数目过高以至于无法精确计数。
III.细胞内细胞因子染色：
如上文所述收获脾细胞。在R10培养基中以1×107个细胞/mL使刚刚收获的脾细胞静置隔夜。第二天早晨，根据培养盘模板，对于1×106个细胞/孔的最终数目，将100μL细胞添加至每一孔中。使用汇集的RSV-F或RSV-G肽刺激细胞。RSV-F肽汇集物如上文所述。RSV-G肽汇集物如上文所述或购自JPT(目录PM-RSV-MSG)。在37℃下将细胞培育1小时，且将BFA和莫能菌素添加至每一孔中达各自5μg的最终浓度。
为了使细胞染色，将20μL 20mM EDTA添加至每一细胞孔中，且在室温(RT)下将细胞培育15分钟。在500xg下将培养盘离心5分钟且吸出上清液。随后用PBS洗涤培养盘且再次离心。用DMSO复原ViVidye且稀释于PBS中。将125μL经稀释的Vividye添加至每一孔中且在室温下培育15分钟。将培养盘离心，移除上清液且用175μL FACSWash再次洗涤培养盘。将BDcytofix/cytoperm溶液添加至每一孔中，且在2至8℃下将培养盘培育20至25分钟。随后将培养盘离心并用BD perm wash缓冲液洗涤两次。最后，以每孔125mL的体积添加FC block至在BD perm wash缓冲液中0.01mg/mL的最终浓度。用如下制得的细胞内抗体混合液使细胞染色：
a)IL-10 FITC：
b)IL-17A PE：
c)IL-2 PCF594：
d)CD4 PerCPcy5.5：
e)TNF PE Cy7：
f)IFNg APC：
g)CD8a BV510：
h)CD3 APC Cy7：
i)Perm Wash：
在2至8℃下将细胞与抗体混合液(每测试孔20μL)一起培育35分钟，用BD permwash缓冲液洗涤两次，且再悬浮于每孔200μL BD稳定化固定剂中。在LSRII上获得样品且使用Flojo软件分析数据。对肽汇集物产生反应且产生Ifn-γ、IL-2或TNFα的CD4+脾细胞百分比展示于图3A、3B和3C中且对肽汇集物产生反应且产生Ifn-γ、IL-2或TNFα的CD8+脾细胞百分比展示于图4A、4B和4C中。数据为RSV-F mRNA/LNP疫苗和RSV-G mRNA/LNP疫苗而非DS-CAV1蛋白抗原在小鼠中引发稳健的Th1偏向性CD4+免疫反应。另外，RSV-F mRNA/LNP疫苗而非RSV-G mRNA/LNP疫苗或DS-CAV1蛋白抗原在小鼠中引发稳健的Th1偏向性CD8+免疫反应。
实施例13：小鼠免疫原性
在本实施例中，进行其他检定以评估与蛋白抗原相比对使用mRNA/LNP平台递送的RSV疫苗抗原的免疫反应。
此外，向雌性Balb/c(CRL)小鼠(6至8周龄；N＝每组10只小鼠)施用mRNA疫苗或蛋白疫苗。产生mRNA疫苗且在MC3脂质纳米粒子中配制。本研究中所评估的mRNA疫苗包括以下：
MRK-1膜结合RSV F蛋白
MRK-2分泌RSV F蛋白
MRK-3分泌DS-CAV1
MRK-4膜结合DS-CAV1(稳定化的融合前F蛋白)
MRK-5 RSV F构建体
MRK-7 RSV F构建体
MRK8 RSV F构建体
MRK9膜结合RSV G蛋白
流感病毒M1
下文列出编码用于MRK-2、MRK-3和流感病毒M1的mRNA序列的DNA序列。还展示了相应氨基酸序列。本文别处提供所有其他序列。
MRK-2非膜结合形式RSV F蛋白/MRK_02_F(可溶性，Merck A2毒株)/
下划线区域表示编码折叠子的区域。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代。
第一下划线区域表示信号肽序列。第一下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或其可被删除。第二下划线区域表示折叠子。第二下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代。
MRK-3非膜结合形式DS-CAV1(稳定化的融合前F蛋白)//MRK_03_DS-CAV1(可溶性，S155C/S290C/S190F/V207L)/SQ-030271：
下划线区域表示编码折叠子的区域。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代。
第一下划线区域表示信号肽序列。第一下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代，或其可被删除。第二下划线区域表示折叠子。第二下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代。
流感病毒M-1(A/加利福尼亚/04/2009(H1N1)，ACP44152)+hIgκ
下划线区域表示编码人Igκ信号肽的区域。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代。
下划线区域表示人Igκ信号肽。下划线区域可由达成相同或类似功能的替代序列取代。
将流感病毒M1 mRNA与MRK-1、MRK-4或MRK-9组合，以努力通过使摄取mRNA的细胞制造类病毒粒子(VLP)来增加免疫反应。
本研究中所评估的蛋白疫苗为如McLellan等人Science 342，592(2013)中所述的DS-CAV1稳定化的融合前F蛋白；1mg/mL。将所述蛋白在50mM Hepes、300mM NaCl中进行缓冲且与Adju-phos一起配制。
用100μL疫苗对具有10只小鼠的组进行肌内免疫接种，以50μL注射液递送至每一四头肌中。用以下疫苗对各组进行疫苗接种：
表1.疫苗
在实验的第0天和第21天对动物进行免疫接种。在第14天和第35天，从每只动物抽血且用于血清学检定。在第42天，处死一个子集的动物且收获脾脏以支援ELISPOT和细胞内细胞因子染色研究。
在第27天，以1×106PFU RSV A2对小鼠经鼻内进行攻毒。接种后四天，通过CO2吸入处死动物且移出肺和鼻甲并在湿冰上在10体积的含有SPG的汉氏平衡盐溶液(HanksBalanced Salt Solution)(Lonza)中进行匀浆化。通过在2000rpm下离心10分钟来使样品澄清，将试样等分，速冻，且立即在-70℃下冷冻储存。
A.RSV中和检定：
如上文所述测定中和抗体效价。效价展示于图5中(PD1＝剂量1后取得的样品，PD2＝剂量2后取得的样品)。如先前实验中所证明，结果显示mRNA/LNP疫苗具有强免疫原性且引发高中和抗体效价。对通过将表达流感病毒M1的mRNA与表达膜结合蛋白抗原的mRNA共递送来产生显著较高的中和抗体的尝试并未成功。
B.细胞内细胞因子染色。
以上文实施例13中所述的相同方式进行细胞内细胞因子染色。对RSV-F和G肽汇集物的CD4 ICS反应展示于图6A、6B和6C中。如先前研究中，ICS结果显示表达RSV-F和RSV-G的mRNA疫苗引发稳健的Th1-偏向性CD4免疫反应。
CD8 ICS反应展示于图7A、7B和7C中。数据证实了先前的观察结果，即表达RSV-F抗原的mRNA而非表达RSV-G的mRNA或DS-CAV1蛋白/adju phos引发稳健的Th1偏向性CD8反应。
C.小鼠攻毒结果
下文概述用于测量病毒效价的程序。简单来说，将样品稀释且一式两份添加至含有汇合HEp-2细胞单层的24孔培养盘中。在37℃下将培养盘培育一小时。培育一小时之后，吸出样品接种物且添加1ml含有0.75％甲基纤维素的覆盖层。在37℃下将培养盘培育5天。培育5天之后，将细胞固定且用结晶紫/戊二醛溶液进行染色。对溶菌斑进行计数且效价表示为pfu/g组织。如图8中所示，从经与MC3 LNP一起配制的mRNA疫苗免疫接种的任何小鼠的肺部未发现病毒且在较低剂量的DS-CAV1蛋白/adju phos疫苗下仅一只动物在鼻部具有可检测到的任何病毒。
实施例14：棉鼠免疫原性和功效
在本实施例中，进行检定以测试mRNA/LNP疫苗在棉鼠RSV攻毒模型中的免疫原性和功效。
更具体来说，使用雌性棉鼠(SAGE)且在3至7周龄时开始免疫接种。产生所用的mRNA疫苗且在MC3脂质纳米粒子中配制。本研究中所评估的mRNA疫苗包括：
MRK-1膜结合RSV F蛋白
MRK-2分泌RSV F蛋白(截短胞外域)
MRK-3分泌DS-CAV1(三聚胞外域)
MRK-4膜结合DS-CAV1(稳定化的融合前F蛋白)
MRK9膜结合RSV G蛋白
流感病毒M1蛋白
本研究中所评估的蛋白疫苗为如McLellan等人Science 342，592(2013)中所述的DS-CAV1稳定化的融合前F蛋白；1mg/mL。将蛋白在50mM Hepes、300mM NaCl中进行缓冲且与Adju-phos一起配制。
用120μL疫苗对各组的10只棉鼠进行肌内免疫接种，以60μL注射液递送至每一四头肌中。用以下如表2中所示的疫苗对各组进行疫苗接种：
表2.被测试在棉鼠中的免疫原性的疫苗制剂
在实验的第0天和第28天对动物进行免疫接种。在第28和56天，从每只动物抽血且用于血清学检定。在第56天，以1×105.5PFU RSV A2对棉鼠经鼻内进行攻毒。接种后四天，通过CO2吸入处死动物且移出肺(左叶)和鼻甲并在湿冰上在10体积的含有SPG的汉氏平衡盐溶液(Lonza)中进行匀浆化。通过在2000rpm下离心10分钟使样品澄清，将试样等分，速冻，且立即在-70℃下冷冻储存。
A.RSV中和检定
如上文所述来测定中和抗体效价。
剂量1后和剂量2后所测定的效价展示于图9中。在单次免疫接种后中和效价在棉鼠中为稳健的且总体比通过与adju-phos一起配制的DS-CAV1蛋白抗原引发或经RSV A2病毒感染的那些效价高数倍。最高中和抗体效价通过表达全长RSV-F蛋白、截短F-蛋白(胞外域)、mDS-CAV1(含有RSV F跨膜结构域的稳定化的融合前F蛋白)和sDS-CAV1(稳定化的融合前F蛋白的截短形式)的RNA疫苗以及包括全长F蛋白和流感病毒M1(在上文图表中称为“VLP/mF”)的mRNA组合引发。
剂量二后所测定的效价指示，总体来说，对于mRNA疫苗和DS-CAV1蛋白比较物而言中和抗体效价相当高。令人惊讶地，在本研究中，如在两项小鼠免疫原性研究中，在第二剂量的疫苗后对于mG和mG+流感病毒M1 mRNA疫苗组观察到相对高的中和抗体效价。在用于递送RSV-G抗原的其他疫苗形态情况下，据报告除非检定中包括补充物，否则体外未观察到中和抗体活性。
B.竞争ELISA
表征对用于中和抗体的RSV F-蛋白上的特异性表位的免疫反应。抗原性位点II为用于帕利珠单抗的结合位点，帕利珠单抗是一种经研发用于在处于风险中的婴儿和幼儿中预防下呼吸道RSV感染的单克隆抗体。抗原性位点为用于通过天然RSV感染引发的更有效力的中和抗体的结合位点。已开发竞争ELISA来表征对各种基于mRNA的疫苗的抗原性位点和抗原性位点II反应。
方法
用融合前F蛋白或融合后F蛋白涂覆ELISA培养盘(McLellan等人，2013)。涂覆后，洗涤培养盘且用阻断缓冲液(PBST/3％脱脂奶粉)阻断。随后用阻断缓冲液稀释来自棉鼠攻毒研究的测试血清且在ELISA培养盘中滴定。将经生物素标记的D25(结合至抗原性位点的单克隆抗体)或经生物素标记的帕利珠单抗(结合至抗原性位点II的单克隆抗体)稀释于阻断缓冲液中且添加至ELISA培养盘的每一孔中(仅将经生物素标记的D25用于涂有融合前F蛋白的培养盘；可将经生物素标记的帕利珠单抗用于涂有融合前或融合后F蛋白的培养盘，因为抗原性位点II存在于两种形式的抗原上)。培育之后，洗涤培养盘且将抗生物素蛋白链菌素标记的马辣根过氧化酶添加至ELISA培养盘的每一孔中。在室温下将培养盘培育1小时，洗涤，且与TMB底物(ThermoScientific)一起培育。使颜色显影10分钟且随后用100μL2N硫酸淬灭并在微量盘读取器上在450nM下读取培养盘。结果展示于图10中。图10说明棉鼠血清与结合至融合前F蛋白的D25或结合至融合后F蛋白的帕利珠单抗竞争的能力。
在未处理小鼠中和在经mG或经VLP/mG(其均不会表达由D25或帕利珠单抗结合的表位)免疫接种的那些小鼠中可见背景结合效价。在实验中包括未标记的单克隆抗体作为阳性对照物且那些数据展示于图10的右栏中。在经MRK01、MRK02、MRK09、MRK10+MRK01或MRK10+MRK9免疫接种的棉鼠中明显无D25竞争性效价。仅使用编码DS-CAV1序列(MRK04、MRK03和MRK10+MRK04)的mRNA进行免疫接种引发D25竞争性抗体效价，说明这些mRNA产生主要呈融合前构型的形式的RSV F蛋白。相比之下，帕利珠单抗竞争性效价在经MRK01或MKR02mRNA免疫接种的动物中远远高得多，说明这些mRNA在棉鼠中以融合后RSV F蛋白产生。
C.棉鼠攻毒结果
如上文对于小鼠所述遵循用于在棉鼠鼻部测量RSV效价的程序。鼻部效价展示于图11中。在此检定中，检测极限为40pfu/g组织。发现仅一只接种疫苗的动物(一只用与MC3LNP一起囊封的mDS-CAV1(MRK4)mRNA进行疫苗接种的小鼠)在鼻部存在可检测到的任何病毒。相比之下，RSV A2病毒在未接种疫苗但在同一研究中进行攻毒的动物中的几何平均效价为＞10,000pfu/g组织。
实施例15：非洲绿猴免疫原性和功效
在本实施例中，进行检定以测试mRNA/LNP疫苗在非洲绿猴RSV攻毒模型中的免疫原性和功效。
更具体来说，使用体重在1.3至3.75kg范围内的雄性和雌性成年非洲绿猴，通过中和抗体效价证实其呈RSV阴性。产生所用的mRNA疫苗且在MC3脂质纳米粒子中配制。本研究中所评估的mRNA疫苗包括：
MRK01膜结合RSV F蛋白
MRK04膜结合DS-Cav1(稳定化的融合前F蛋白)
用1000μL疫苗对各组的四只非洲绿猴进行肌内免疫接种，以500μL注射液递送至每一三角肌中。用以下如表3中所示的疫苗对各组进行疫苗接种。
表3.被测试在在非洲绿猴中的免疫原性的疫苗制剂
在实验的第0天、第28天和第56天对动物进行免疫接种。在第0、14、28、42、56和70天，从每只动物抽血且用于血清学检定。在第70天，用1×105.5PFU RSV A2对非洲绿猴经鼻内进行攻毒。在第1至12、14天和在攻毒后第18天收集鼻咽部拭子，且在攻毒后第3、5、7、9、12、14和18天收集肺灌洗样品以测试病毒复制。
A.RSV中和检定
如上文所述测定中和抗体效价(NT50)。在剂量1后和剂量2后所测定的NT50效价展示于图12中。对于接受mRNA疫苗的两组以及接受RSV A2的组而言可见效价在每一剂量后增加。在第10周(剂量3后2周)使用mRNA疫苗获得的GMT比接受RSV A2的动物高2个以上数量级。
B.竞争ELISA
使用上文所述的竞争检定表征对用于中和抗体的RSV F-蛋白上的特异性表位的免疫反应。
在第10周(PD3 2周)测量的帕利珠单抗和D25竞争性抗体效价呈现于图13A至13B中。GMT帕利珠单抗竞争性效价在接受mF或mF+mDS-Cav1组合的组中与接受mDS-Cav1的组相比高5倍。而GMT D25竞争性抗体效价在接受mDS-Cav1或mF+mDS-Cav1组合的组中比在接受mF mRNA的组中高2倍。融合前F稳定化的抗原(mDS-Cav1)能够引发融合前特异性反应。
C.非洲绿猴攻毒结果
如上文所提及，为了评估疫苗功效，在疫苗接种后第70天以1×105.5PFU RSV A2对非洲绿猴经鼻内进行攻毒且在攻毒后收集鼻咽部拭子和肺灌洗样品以测试病毒的存在。
为了测量在非洲绿猴鼻咽部拭子和肺灌洗样品中的RSV效价，如下进行用以检测RSV A的RSV RT-qPCR检定：
1)设备和材料：
A.设备
1.Stratagene Mx3005P实时PCR系统和MxPro软件
2.Jouan GR422离心机或等效物
3.Jouan培养盘承载物或等效物
B.试剂
1.探针Rt-PCR试剂盒(1000)，目录号204445
2.水，分子生物学级，无DNA酶和无蛋白酶，5优级，目录号2900136
3.TE缓冲液，10mM Tris，1mM EDTA ph 8.0，Fisher Bioreagents，目录号BP2473-100
4.病毒引物：RSV A正向和反向引物，Sigma定制，经HPLC纯化。在分子级水中将引物储备液复原至100μM且在-20℃下储存。
5.RSV双标记探针，Sigma定制，经HPLC纯化。在TE缓冲液中将探针储备液复原至100μM且在-20℃下避光储存。
6.在内部产生RSV A标准物且在-20℃下储存。通过对RSV A的N基因设计引物对来产生用于检定的标准物。RSV A标准物的产物长度为885bp。使用QIAGEN OneStep RT-PCR产生此标准物。
表4.引物
7.Promega，16病毒总核酸纯化试剂盒(产品#AS1150
C.补充物
1.Stratagene Optical 8连管盖，目录号401425
2.Stratagene Mx3000P 96孔培养盘，有衬边，目录号401334
3.ART过滤型吸管尖
2)RT-PCR反应和设置
A.制备完全主体混合物
1.遵循以下用于50μL最终反应体积的设置制备完全主体混合物。下表为每孔体积。最终引物浓度为300nM且最终探针浓度为200nM。
表5.试剂
试剂 mL
2X主体混合物 25
RSV AF 100μm 0.2
RSV AR 100μm 0.2
RSV A FAM 100μm 0.1
RT酶混合物 0.5
水 19
2.将45μL完全主体混合物添加至每一孔中。用培养盘盖覆盖培养盘且以铝箔包裹以避光。
B.制备标准曲线
1.将标准物移离-20℃。
2.使用10倍稀释液将标准物稀释至1×106个拷贝/5μL至1个拷贝/5μL的最终浓度。
C.样品制备
1.制备鼻咽部拭子和肺灌洗样品以用于使用16病毒总核酸纯化试剂盒(Promega，产品#AS1150)进行RT-PCR反应
2.遵循制造商的方案萃取200μL样品且溶离至50μL中以用于PCR反应。
D.添加样品
1.将5μL经萃取的样品添加至适当孔中。添加样品之后，在添加标准曲线之前小心地对样品孔加盖。
2.将5μL经稀释的标准物添加至适当孔中并加盖。
3.将5μL分子级水添加至无模板对照(NTC)孔中。
4.以铝箔包裹培养盘且将培养盘转移至离心机中。
5.在100rpm下将培养盘离心2分钟以拉下可能位于孔侧面的任何样品或主体混合物。
6.以铝箔包裹培养盘且转移至Stratagene仪器中。
E.热循环仪：Stratagene MX 3005P
1.将培养盘置于Stratagene Mx3005P且设置热概况条件：
表6.热循环仪步骤
步骤 时间 温度
逆转录 30分钟 50
PCR初始活化步骤 15分钟 95
2步循环：
变性 16秒 94
合并的退火/延伸 60秒 62
循环次数 40
2.使用Stratagene Mx3005p软件分析结果
在肺部和鼻部样品中所检测到的平均RNA拷贝数呈现于图14A至14B中。类似于经RSV A2免疫接种的对照组，接受在MC3中配制的编码mF、mDS-Cav1或mF+mDS-Cav1的mRNA的动物在肺部显示得到完全保护(未检测到病毒)。接受mRNA疫苗的动物还显示在大部分检定日在鼻部所检测到的病毒与无疫苗对照组相比减少2log以上。
实施例16：在经历过RSV的非洲绿猴中的免疫原性
在经历过RSV的非洲绿猴中测试在MC3 LNP中配制的mRNA疫苗的免疫原性。
选择通过ELISA和中和抗体效价证实为RSV血清阳性、重量超过1.3kg的任意性别的健康成年非洲绿猴(每组n＝5)来用于研究。选择用于本研究的动物集合已在先前疫苗研究中以实验方式感染RSV且基于其预先研究RSV中和效价而分布在研究组中，以使得所有组均将在研究开始时具有类似组GMT。经历过RSV的动物提供对疫苗接种的免疫记忆回忆反应模型，其可反映可在血清阳性成年人中预测到的反应。
在第0周通过肌内(IM)途径向每一动物施用单次疫苗剂量。研究设计中还包括仅接受MC3 LNP的对照组。如表7中所述施用疫苗。疫苗接种之后，针对接种位点的任何改变或活力或摄食习性的其他改变，每天观察动物，所述改变可指示对疫苗的不良反应，但未注意到任何改变。收集血清样品以用于评估RSV中和抗体效价，以及帕利珠单抗(位点II)和D25(位点)竞争性抗体效价。收集PBMC样品以评估细胞介导的免疫反应。
表7.被测试在RSV血清阳性非洲绿猴中的免疫原性的疫苗制剂
在基线和疫苗接种后2周使用上文所述的方法所收集的血清样品中测量个别动物NT50效价，且结果展示于图15中。用mRNA疫苗进行疫苗接种导致血清中和效价平均增加150倍。对于所有mRNA疫苗而言增加倍数为类似的。在仅LNP疫苗对照组中观察到效价未增加。通过在疫苗接种后每2至4周测量效价来评估血清中和效价的持久性。在疫苗接种后第24周所测量出的每一组的GMT呈现于图16中。效价在第24周仍比基线高约50倍。
为了评估接种疫苗动物中的加强反应的质量，测定帕利珠单抗(位点II)与D25(位点)竞争性抗体效价。如上文所述，抗原性位点II为存在于F蛋白的融合前与融合后构型上的中和表位，而位点为融合前特异性中和表位。在疫苗接种后4周使用上文所述的方法所测量的帕利珠单抗(位点II)和D25(位点)竞争性抗体效价总结于图17A至17B中。所有mRNA疫苗均导致帕利珠单抗竞争性效价自基线升高约7倍。尽管在免疫接种之前，在所有动物中，除了仅MC3 LNP对照组中的一只动物，D25竞争性抗体效价均低于检定检测的极限，但在接受基于mRNA的疫苗的所有动物中均引发D25竞争性抗体效价。GMT在接受mDS-Cav1或mF+mDS-Cav1组合的组中为最高。在仅LNP对照组中可见帕利珠单抗或D25(位点)竞争性抗体效价未增加。
如在疫苗接种后6周通过ICS检定所测定，还发现mRNA疫苗在经历过RSV的非洲绿猴中增强T细胞反应(图18A至18B)。
如下进行用于非洲绿猴的ICS检定：
A.第1天：将PBMC解冻
1.从液氮移出PBMC小瓶且置于干冰上直至准备解冻。
2.在37℃设定点水浴中在轻柔搅动下将细胞快速解冻。
3.对于每一受试者，使用血清学移液管将细胞悬浮液转移至经适当标记的15mL或50mL试管中。
4.将约0.5mL R10培养基缓慢添加至细胞中，随后使其轻柔地涡旋以混合培养基与细胞悬浮液。
5.随后将三倍冷冻细胞体积的R10培养基逐滴添加至每一试管中，在添加0.5mL至1.0mL R10培养基后使每一者涡旋。
6.随后以一次1.0mL至2.0mL的速率添加R10培养基直至将约10至15mL添加至每一试管中。
7.使试管涡旋以混合培养基与细胞悬浮液，且随后在室温下在250xg(设定点)下离心8至10分钟。
8.移除上清液且将细胞轻轻地再悬浮于5mL R10培养基中。
9.随后将细胞悬浮液转移至12孔组织培养盘中。
10.将组织培养盘置于37℃+/-2℃、4％至6％CO2培育箱中隔夜。
B.第2天：用于PBMC的计数和刺激程序
PBMC计数
1.将来自12孔组织培养盘的每一孔的PBMC置于经标记的50mL圆锥管中。
2.随后通过在血细胞计数器上进行锥虫蓝排除法或通过Guava PC对细胞进行计数且再悬浮至1×107个细胞/mL。
刺激设置
1.随后将100μL再悬浮的PBMC添加至96孔无菌U型底组织培养盘的每一孔中以达1×106个细胞/孔的最终数目。
2.如下产生对应于RSV F蛋白序列的肽汇集物。为了得到最佳结果，将肽组合于两个汇集物RSV F1和RSV F2中。RSVF1包括以下清单中的头71种肽，且RSV F2包括以下70种肽：
表8.肽
3.将肽汇集物(RSV F1或RSV F2汇集物)添加至细胞中达2.5μg/mL的最终浓度。
4.为每一受试者准备一个模拟孔。将对应于肽汇集物体积的DMSO体积添加至模拟孔中。
5.用PMA(20ng/mL)/离子霉素(1.25μg/mL)溶液刺激阳性对照孔。
6.将CD28/CD49d混合物以2μg/mL的最终浓度添加至每一孔中。
7.添加肽和CD28/CD49d混合物之后，将培养盘在37度培育箱中培育30至60分钟。
8.随后将5mL布雷菲德菌素A(0.5mg/mL)添加至每一孔中，且随后将培养盘在37℃5％CO2培育箱中再培育4至5小时。
9.随后移出培养盘且将20μL 20mM EDTA(溶解于1X PBS中)添加至每一细胞孔中。
10.随后将培养盘保持在4℃下隔夜。
C.第3天：染色
1.在500x g下将培养盘离心5分钟，且移除上清液。
2.用175mL FACS Wash洗涤每一孔，且再次在500x g下将培养盘离心5分钟，且移除上清液。
3.根据制造商所推荐的体积，如下用细胞外抗体将PBMC染色：
i.CD8 APCH7： 每次测试5μL
ii.CD3 PE： 每次测试20μL
iii.CD4 PCF594： 每次测试5μL
iv.ViViDye： 每次测试3μL
4.将混合液添加至所有孔中之后，将120μL FACSwash添加至每一孔中并混合。在室温下将培养盘在黑暗中培育25至30分钟。
5.随后对培养盘在500xg下进行培养盘离心5分钟并用每孔175μL FACS wash洗涤。
6.将200μL BD Cytofix/cytoperm溶液添加至每一孔中且将培养盘在4℃下培育20至25分钟。
7.随后对培养盘在500xg下进行培养盘离心5分钟并用每孔175μL PD perm wash缓冲液洗涤两次。
8.随后如下用细胞内抗体将PBMC染色：
i.IFN-g FITC 每次测试20μL
ii.TNF PEcy7 每次测试5μL
iii.IL-2 APC 每次测试20μL
9.将混合液添加至所有孔中之后，将120μL BD Perm Wash添加至每一孔中，且在室温下将培养盘在黑暗中培育25分钟。
10.培育之后，将培养盘在500xg下离心5分钟，用175μL BD perm wash缓冲液洗涤且随后将细胞再悬浮于每孔200μL BD稳定化固定剂中。随后在4℃下将样品储存隔夜且在固定24小时内在LSRII上获得。
如于图18A至18B中所示，mRNA疫苗(mF、mDS-Cav1或mF+mDS-Cav1)导致对于IFN-γ、IL-2和TNF-α呈阳性的RSV F特异性CD4+和CD8+ T细胞反应增加。总体来说，所述反应在所有mRNA疫苗组中均为类似的。T细胞反应在仅MC3 LNP对照组中未升高。
实施例17：在棉鼠中针对RSV-B的免疫原性和功效；经MC3囊封的mRNA疫苗的有效性
在棉鼠中测试针对用RSV-B攻毒的实验性mRNA RSV疫苗制剂的免疫原性和功效。本研究比较囊封于MC3脂质纳米粒子中的编码不同形式的RSV-F蛋白的mRNA。
更具体来说，使用雌性棉鼠(SAGE)且在3至7周龄时开始免疫接种。本研究中所评估的mRNA疫苗包括：
MRK01膜结合RSV F蛋白
MRK04膜结合DS-Cav1(稳定化的融合前F蛋白)
研究中所包括的组总结于表9中。研究以25mg的单次剂量评估所有mRNA疫苗。研究中所包括的对照组接受RSV A2(1×105.5pfu)或不接受疫苗。向每一动物(在第0和4周)施用两次剂量的疫苗，除了接受RSV A2的组，其在第0周接受单一鼻内接种物。收集血清样品以用于评估RSV中和抗体效价。在第8周，以RSV B毒株RSV 18537对棉鼠经鼻内进行攻毒。攻毒四天后，使动物安乐死且收集鼻部和肺部组织以通过测量组织中的RSV水平评估疫苗功效。
表9.被测试在棉鼠中的免疫原性和功效的疫苗制剂
在第4周(剂量1后4周)和第8周(剂量2后4周；攻毒日)收集的血清样品中测量个别动物中和抗体(NT50)效价。在第4周，所有动物均对用mRNA疫苗和用RSV A2攻毒的疫苗接种产生反应。在第二次免疫接种后，效价在两个mRNA疫苗组中皆增加。mRNA疫苗与RSV A2感染皆导致针对RSV A和RSV B的大约相等的中和抗体效价。在第4和8周(剂量1后(PD1)4周和剂量2后(PD2；攻毒日)4周)所测量的个别动物和组几何平均NT50效价呈现于图19中。
在使用上文所述的方法以RSV B毒株18537进行攻毒后，通过在经免疫接种的棉鼠的肺部和鼻部通道中测量对病毒复制的抑制来评估各种疫苗制剂的体内功效。数据展示于图20中。在经wt RSV A2免疫接种的棉鼠的肺部和鼻部中观察到病毒复制受到完全抑制。尽管基于来自RSV A的序列进行设计，mF与mDS-Cav1 mRNA仍完全保护肺部与鼻部不受RSV B18537攻毒。当mF与mDS-Cav1 mRNA疫苗与MC3脂质纳米粒子一起配制时，其针对RSV B攻毒同样有效。
本文所述的各序列涵盖经化学修饰的序列或不包括核苷酸修饰的未经修饰的序列。
实施例18：小鼠免疫原性
在本实施例中，进行检定以评估与蛋白抗原相比对使用经化学修饰的mRNA/LNP平台递送的RSV疫苗抗原的免疫反应。
向雌性Balb/c(CRL)小鼠(6至8周龄；N＝每组10只小鼠)施用RSV mRNA疫苗或蛋白疫苗。产生mRNA疫苗且在MC3脂质纳米粒子中配制。本研究中所评估的mRNA疫苗包括(各自呈经化学修饰的形式)：
MRK-1膜结合RSV F蛋白
MRK-4膜结合DS-CAV1(稳定化的融合前F蛋白)
MRK-5 RSV F构建体
MRK-6 RSV F构建体
MRK-7 RSV F构建体
MRK8 RSV F构建体
MRK9膜结合RSV G蛋白
MRK11截短RSV F蛋白(仅胞外域)；经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列的构建体
MRK12 DS-CAV1(非膜结合形式)；经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列
经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列的MRK13：MRK-5构建体
经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列的MRK14：MRK-6构建体
经修饰以包括Ig分泌物肽信号序列的MRK16：MRK-8构建体
在实验的第0天和第21天对动物进行免疫接种。在第14天和第35天，从每只动物抽血且用于血清学检定。在第42天和第49天，处死一个子集的动物且收获脾脏以支援ELISPOT和细胞内细胞因子染色研究。
A.RSV中和检定：
汇集来自每一组的小鼠血清且使用以下程序对RSV-A(Long毒株)的中和进行评估：
11.通过置于设定为56℃的干式恒温箱中30分钟来对所有血清样品进行热灭活。随后将样品和对照血清以1∶3稀释于病毒稀释剂(含2％FBS的EMEM)中且将重复样品添加至检定培养盘中并进行连续稀释。
12.从冰箱移出RSV-Long病毒储备液且在37℃水浴中快速解冻。在病毒稀释剂中将病毒稀释至2000pfu/mL
13.将经稀释的病毒添加至96孔培养盘的每一孔中，除了一个柱的细胞。
14.用胰蛋白酶处理HEp-2细胞，洗涤，以1.5×105个细胞/ml再悬浮于病毒稀释剂中，且将100mL经悬浮的细胞添加至96孔培养盘的每一孔中。随后在37℃、5％CO2下将培养盘培育72小时。
15.培育72小时之后，用PBS洗涤细胞，且在16至24℃下使用溶解于PBS中的80％丙酮固定10至20分钟。移除固定剂且使培养盘风干。
16.随后用PBS+0.05％Tween彻底洗涤培养盘。将检测单克隆抗体143-F3-1B8和34C9稀释成2.5倍，随后用PBS+0.05％50彻底洗涤培养盘，随后用PBS+0.彻底洗涤96孔培养盘的孔。随后在16至24℃下将培养盘在湿度箱中在振荡器上培育60至75分钟
17.培育之后，彻底洗涤培养盘。
18.将经生物素标记的马抗-小鼠IgG以1∶200稀释于检定稀释剂中且添加至96孔培养盘的每一孔中。如上文培育培养盘并洗涤。
19.在检定稀释剂中制备IRDye 800CW抗生物素蛋白链菌素(1∶1000最终稀释液)、Sapphire 700(1∶1000稀释液)和5mM DRAQ5溶液(1∶10,000稀释液)的混合液且将50mL混合液添加至96孔培养盘的每一孔中。如上文在黑暗中培育培养盘，洗涤，且使其风干。
20.随后使用Aerius Imager读取培养盘。随后在Graphpad Prism中使用4参数曲线拟合计算血清中和效价。
在剂量1后(PD1)和剂量2后(PD2)测量用于小鼠免疫原性研究的血清中和抗体效价。
表10.鞭毛蛋白核酸序列
表11.鞭毛蛋白氨基酸序列
其他mRNA疫苗
MRK_04
SQ-030271
MRK_04_无AAALys
SQ-038059
MRK_04_无4A
SQ-038058
MRK_04_无polyA_3mut
SQ-038057
表12.RSV mRNA序列
等效内容
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验法确定本文所述的本公开的具体实施方案的许多等效内容。此类等效内容意欲由所附权利要求书涵盖。
本文所公开的所有参考文献(包括专利文件)均以引用方式整体并入本文中。

Claims (167)

1.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包含：
至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码至少一种RSV抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框，和
药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的RSV疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽为糖蛋白G或其免疫原性片段。
3.如权利要求1所述的RSV疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽为糖蛋白F或其免疫原性片段。
4.如权利要求1至3中任一项所述的RSV疫苗，其还包含佐剂。
5.如权利要求1所述的RSV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸由至少一种选自由SEQID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27组成的组的核酸序列编码，和/或其中所述至少一种RNA多核苷酸包含SEQ ID NO：260至280中的任一个的至少一种核酸序列。
6.如权利要求1所述的RSV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸由选自由SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27组成的组的核酸序列的至少一个片段编码，和/或其中所述至少一种RNA多核苷酸包含SEQ ID NO：260至280中的任一个的核酸序列的至少一个片段。
7.如权利要求1所述的RSV疫苗，其中所述RSV抗原性多肽的氨基酸序列是选自由SEQID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28组成的组的氨基酸序列。
8.如权利要求1至7中任一项所述的RSV疫苗，其中所述开放阅读框是经密码子优化的。
9.如权利要求1至8中任一项所述的RSV疫苗，其中所述疫苗是多价的。
10.如权利要求1至9中任一项所述的RSV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸编码至少2种抗原性多肽。
11.如权利要求10所述的RSV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸编码至少10种抗原性多肽。
12.如权利要求11所述的RSV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸编码至少100种抗原性多肽。
13.如权利要求1至9中任一项所述的RSV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸编码2至100种抗原性多肽。
14.如权利要求1至13中任一项所述的RSV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸包含至少一个化学修饰。
15.如权利要求14所述的RSV疫苗，其中所述化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4′-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2′-O-甲基尿苷。
16.如权利要求1至15中任一项所述的RSV疫苗，其是在纳米粒子中配制。
17.如权利要求16所述的RSV疫苗，其中所述纳米粒子具有50nm至200nm的平均直径。
18.如权利要求16或17所述的RSV疫苗，其中所述纳米粒子为脂质纳米粒子。
19.如权利要求18所述的RSV疫苗，其中所述脂质纳米粒子包含阳离子型脂质、经PEG修饰的脂质、固醇和非阳离子型脂质。
20.如权利要求19所述的RSV疫苗，其中所述阳离子型脂质为可电离的阳离子型脂质且所述非阳离子型脂质为中性脂质，且所述固醇为胆固醇。
21.如权利要求20所述的RSV疫苗，其中所述阳离子型脂质选自由2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)组成的组。
22.如权利要求16至21中任一项所述的RSV疫苗，其中所述纳米粒子具有小于0.4的多分散性值。
23.如权利要求16至21中任一项所述的RSV疫苗，其中所述纳米粒子在中性pH值下具有净中性电荷。
24.一种RSV疫苗，其包含：
至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框、至少一个5′端帽和至少一个化学修饰，所述RSV疫苗是在脂质纳米粒子中配制。
25.如权利要求24所述的RSV疫苗，其中所述5′端帽为7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp。
26.如权利要求24或25所述的RSV疫苗，其中所述至少一个化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4′-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2′-O-甲基尿苷。
27.如权利要求16至26中任一项所述的RSV疫苗，其中所述脂质纳米粒子包含阳离子型脂质、经PEG修饰的脂质、固醇和非阳离子型脂质。
28.如权利要求27所述的RSV疫苗，其中所述阳离子型脂质为可电离的阳离子型脂质且所述非阳离子型脂质为中性脂质，且所述固醇为胆固醇。
29.如权利要求28所述的RSV疫苗，其中所述阳离子型脂质选自由2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)组成的组。
30.一种RSV疫苗，其包含：
至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框，其中所述开放阅读框中至少80％的尿嘧啶具有化学修饰。
31.如权利要求30所述的RSV疫苗，其中所述开放阅读框中100％的尿嘧啶具有化学修饰。
32.如权利要求30或31所述的RSV疫苗，其中所述化学修饰位于尿嘧啶的5位。
33.如权利要求30至32中任一项所述的RSV疫苗，其中所述化学修饰为N1-甲基假尿苷。
34.如权利要求30至33中任一项所述的RSV疫苗，其中所述疫苗是在脂质纳米粒子中配制。
35.一种在受试者中诱发抗原特异性免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用有效产生抗原特异性免疫反应的量的如权利要求1至34中任一项所述的RSV疫苗。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述抗原特异性免疫反应包括T细胞反应。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述抗原特异性免疫反应包括B细胞反应。
38.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述诱发抗原特异性免疫反应的方法涉及单次施用所述RSV疫苗。
39.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其还包括施用加强剂量的所述疫苗。
40.如权利要求35至39中任一项所述的方法，其中通过皮内或肌内注射向所述受试者施用所述疫苗。
41.如权利要求1至34中任一项所述的RSV疫苗，其用于在受试者中诱发抗原特异性免疫反应的方法中，所述方法包括向所述受试者施用有效产生抗原特异性免疫反应的量的所述RSV疫苗。
42.如权利要求1至34中任一项所述的RSV疫苗，其用于制造用于在受试者中诱发抗原特异性免疫反应的方法中的药物，所述方法包括向所述受试者施用有效产生抗原特异性免疫反应的量的所述RSV疫苗。
43.如权利要求3所述的RSV疫苗，其中所述糖蛋白F或其免疫原性片段被设计为保持融合前构型。
44.如权利要求1至34中任一项所述的RSV疫苗，其以在受试者中产生抗原特异性免疫反应的有效量配制。
45.如权利要求44所述的RSV疫苗，其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价相对于对照物而言增加至少1log。
46.如权利要求45所述的RSV疫苗，其中所述抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价相对于对照物而言增加1log至3log。
47.如权利要求44所述的RSV疫苗，其中所述抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价相对于对照物而言增加至少2倍。
48.如权利要求47所述的RSV疫苗，其中所述抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价相对于对照物而言增加至少5倍。
49.如权利要求48所述的RSV疫苗，其中所述抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价相对于对照物而言增加至少10倍。
50.如权利要求47所述的RSV疫苗，其中所述抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价相对于对照物而言增加2至10倍。
51.如权利要求44至50中任一项所述的RSV疫苗，其中所述对照物为抗-RSV抗原性多肽在未经施用RSV疫苗的受试者中产生的抗体效价。
52.如权利要求44至50中任一项所述的RSV疫苗，其中所述对照物为抗-RSV抗原性多肽在经施用减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗的受试者中产生的抗体效价。
53.如权利要求44至50中任一项所述的RSV疫苗，其中所述对照物为抗-RSV抗原性多肽在经施用重组或经纯化的RSV蛋白疫苗的受试者中产生的抗体效价。
54.如权利要求44至50中任一项所述的RSV疫苗，其中所述对照物为抗-RSV抗原性多肽在经施用RSV类病毒粒子(VLP)疫苗的受试者中产生的抗体效价。
55.如权利要求44至54中任一项所述的RSV疫苗，其中所述有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少2倍的剂量，且其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或经纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
56.如权利要求55所述的RSV疫苗，其中所述有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少4倍的剂量，且其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或经纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
57.如权利要求56所述的RSV疫苗，其中所述有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少10倍的剂量，且其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或经纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
58.如权利要求57所述的RSV疫苗，其中所述有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少100倍的剂量，且其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或经纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
59.如权利要求58所述的RSV疫苗，其中所述有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少1000倍的剂量，且其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或经纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
60.如权利要求55所述的RSV疫苗，其中所述有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少2至1000倍的剂量，且其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或经纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
61.如权利要求44至60中任一项所述的RSV疫苗，其中所述有效量为25μg至1000μg或50μg至1000μg的总剂量。
62.如权利要求61所述的RSV疫苗，其中所述有效量为100μg的总剂量。
63.如权利要求61所述的RSV疫苗，其中所述有效量为总计两次向所述受试者施用的25μg的剂量。
64.如权利要求61所述的RSV疫苗，其中所述有效量为总计两次向所述受试者施用的100μg的剂量。
65.如权利要求61所述的RSV疫苗，其中所述有效量为总计两次向所述受试者施用的400μg的剂量。
66.如权利要求61所述的RSV疫苗，其中所述有效量为总计两次向所述受试者施用的500μg的剂量。
67.如权利要求44至66中任一项所述的RSV疫苗，其中所述有效量的所述RSV疫苗导致针对RSV的血清中和抗体相对于对照物而言增加5至200倍。
68.如权利要求67所述的RSV疫苗，其中单次剂量的所述RSV疫苗导致针对RSV的血清中和抗体相对于对照物而言增加约2至10倍。
69.如权利要求68所述的RSV疫苗，其中单次剂量的所述RSV疫苗导致针对RSV的血清中和抗体相对于对照物而言增加约5倍。
70.如权利要求35所述的方法，其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价相对于对照物而言增加至少1log。
71.如权利要求70所述的方法，其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价相对于对照物而言增加1log至3log。
72.如权利要求70所述的方法，其中所述抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价相对于对照物而言增加至少2倍。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价相对于对照物而言增加至少5倍。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价相对于对照物而言增加至少10倍。
75.如权利要求72所述的方法，其中所述抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价相对于对照物而言增加2至10倍。
76.如权利要求70至75中任一项所述的方法，其中所述对照物为抗-RSV抗原性多肽在未经施用RSV疫苗的受试者中产生的抗体效价。
77.如权利要求70至75中任一项所述的方法，其中所述对照物为抗-RSV抗原性多肽在经施用减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗的受试者中产生的抗体效价。
78.如权利要求70至75中任一项所述的方法，其中所述对照物为抗-RSV抗原性多肽在经施用重组或经纯化的RSV蛋白疫苗的受试者中产生的抗体效价。
79.如权利要求70至75中任一项所述的方法，其中所述对照物为抗-RSV抗原性多肽在经施用RSV VLP疫苗的受试者中产生的抗体效价。
80.如权利要求70至75中任一项所述的方法，其中所述有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少2倍的剂量，且其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少4倍的剂量，且其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或经纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少10倍的剂量，且其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或经纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少100倍的剂量，且其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或经纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少至少1000倍的剂量，且其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或经纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
85.如权利要求80所述的方法，其中所述有效量为等于比重组RSV蛋白疫苗的护理标准剂量减少2至1000倍的剂量，且其中抗-RSV抗原性多肽在所述受试者中产生的抗体效价等于抗-RSV抗原性多肽在经施用护理标准剂量的重组或经纯化的RSV蛋白疫苗或减毒活RSV疫苗或灭活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗体效价。
86.如权利要求70至85中任一项所述的方法，其中所述有效量为50μg至1000μg的总剂量。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述有效量为100μg的总剂量。
88.如权利要求86所述的方法，其中所述有效量为总计两次向所述受试者施用的25μg的剂量。
89.如权利要求86所述的方法，其中所述有效量为总计两次向所述受试者施用的100μg的剂量。
90.如权利要求86所述的方法，其中所述有效量为总计两次向所述受试者施用的400μg的剂量。
91.如权利要求86所述的方法，其中所述有效量为总计两次向所述受试者施用的500μg的剂量。
92.如权利要求70至91中任一项所述的方法，其中所述疫苗针对RSV的功效大于60％。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述疫苗针对RSV的功效大于65％。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述疫苗针对RSV的功效大于70％。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述疫苗针对RSV的功效大于75％。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述疫苗针对RSV的功效大于80％。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述疫苗针对RSV的功效大于85％。
98.如权利要求97所述的方法，其中所述疫苗针对RSV的功效大于90％。
99.如权利要求70至98中任一项所述的方法，其中所述疫苗使所述受试者对RSV免疫长达1年或长达2年。
100.如权利要求70至98中任一项所述的方法，其中所述疫苗使所述受试者对RSV免疫2年以上。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述疫苗使所述受试者对RSV免疫3年以上。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述疫苗使所述受试者对RSV免疫4年以上。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述疫苗使所述受试者对RSV免疫5至10年。
104.如权利要求70至103中任一项所述的方法，其中所述受试者为约5岁或5岁以下，其中受试者介于约1岁与约5岁之间，其中受试者介于约6个月与约1岁之间，其中所述受试者为约6个月或6个月以下，或其中所述受试者为约12个月或12个月以下。
105.如权利要求70至103中任一项所述的方法，其中所述受试者为约60岁、约70岁或70岁以上的老年受试者。
106.如权利要求70至103中任一项所述的方法，其中所述受试者为介于约20岁与约50岁之间的年轻成年人。
107.如权利要求70至106中任一项所述的方法，其中所述受试者为足月出生。
108.如权利要求70至106中任一项所述的方法，其中所述受试者在妊娠约36周或更早时早产，其中所述受试者在妊娠约32周或更早时早产，或其中所述受试者在妊娠约32周与约36周之间早产。
109.如权利要求70至106中任一项所述的方法，其中所述受试者为孕妇。
110.如权利要求70至109中任一项所述的方法，其中所述受试者患有慢性肺病(例如，慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘)。
111.如权利要求70至110中任一项所述的方法，其中所述受试者已暴露于RSV，其中所述受试者已感染RSV，或其中所述受试者存在感染RSV的风险。
112.如权利要求70至111中任一项所述的方法，其中所述受试者免疫受损。
113.如权利要求70至112中任一项所述的方法，其还包括施用第二(加强)剂量和任选地第三剂量的所述RSV疫苗。
114.如权利要求70至113中任一项所述的方法，其中所述有效量的所述RSV疫苗导致针对RSV的血清中和抗体相对于对照物而言增加5至200倍。
115.如权利要求114所述的方法，其中单次剂量的所述RSV疫苗导致针对RSV的血清中和抗体相对于对照物而言增加约2至10倍。
116.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包含与RSV抗原性多肽连接的信号肽。
117.如权利要求116所述的RSV疫苗，其中所述抗原性多肽为融合(F)糖蛋白或其免疫原性片段、附着(G)蛋白或其免疫原性片段、核蛋白(N)或其免疫原性片段、磷蛋白(P)或其免疫原性片段、大聚合酶蛋白(L)或其免疫原性片段、基质蛋白(M)或其免疫原性片段、小疏水性蛋白(SH)或其免疫原性片段、非结构蛋白1(NS1)或其免疫原性片段或非结构蛋白2(NS2)及其免疫原性片段。
118.如权利要求116或117所述的RSV疫苗，其中所述信号肽为IgE信号肽或IgGκ信号肽。
119.如权利要求118所述的RSV疫苗，其中所述IgE信号肽为IgE HC(Ig重链ε-1)信号肽。
120.如权利要求119所述的RSV疫苗，其中所述IgE HC信号肽具有序列MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO：281)。
121.如权利要求118所述的RSV疫苗，其中所述IgGκ信号肽具有序列METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：282)。
122.如权利要求116至119中任一项所述的RSV疫苗，其中所述信号肽选自：日本脑炎PRM信号序列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS；SEQ ID NO：283)、VSVg蛋白信号序列(MKCLLYLAFLFIGVNCA；SEQ ID NO：284)、日本脑炎JEV信号序列(MWLVSLAIVTACAGA；SEQ IDNO：285)和MELLILKANAITTILTAVTFC(SEQ ID NO：289)。
123.一种编码如权利要求116至122中任一项所述的RSV疫苗的核酸。
124.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，所述疫苗包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码与RSV抗原性肽连接的信号肽的开放阅读框。
125.如权利要求124所述的RSV疫苗，其中所述RSV抗原性肽为RSV附着蛋白(G)或其免疫原性片段。
126.如权利要求124所述的RSV疫苗，其中所述RSV抗原性肽为RSV融合(F)糖蛋白或其免疫原性片段。
127.如权利要求124所述的RSV疫苗，其中所述RSV抗原性肽为核蛋白(N)或其免疫原性片段。
128.如权利要求124所述的RSV疫苗，其中所述RSV抗原性肽为磷蛋白(P)或其免疫原性片段。
129.如权利要求124所述的RSV疫苗，其中所述RSV抗原性肽为大聚合酶蛋白(L)或其免疫原性片段。
130.如权利要求124所述的RSV疫苗，其中所述RSV抗原性肽为基质蛋白(M)或其免疫原性片段。
131.如权利要求124所述的RSV疫苗，其中所述RSV抗原性肽为小疏水性蛋白(SH)或其免疫原性片段。
132.如权利要求124所述的RSV疫苗，其中所述RSV抗原性肽为非结构蛋白1(NS1)或其免疫原性片段。
133.如权利要求124所述的RSV疫苗，其中所述RSV抗原性肽为非结构蛋白2(NS2)或其免疫原性片段。
134.如权利要求124至133中任一项所述的RSV疫苗，其中所述信号肽为IgE信号肽或IgGκ信号肽。
135.如权利要求134所述的RSV疫苗，其中所述IgE信号肽为IgE HC(Ig重链ε-1)信号肽。
136.如权利要求135所述的RSV疫苗，其中所述IgE HC信号肽具有序列MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO：281)。
137.如权利要求134所述的RSV疫苗，其中所述IgGκ信号肽具有序列METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：282)。
138.如权利要求124至137中任一项所述的RSV疫苗，其中所述信号肽选自：日本脑炎PRM信号序列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS；SEQ ID NO：283)、VSVg蛋白信号序列(MKCLLYLAFLFIGVNCA；SEQ ID NO：284)和日本脑炎JEV信号序列(MWLVSLAIVTACAGA；SEQ IDNO：285)。
139.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包含：
至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码膜结合RSV F蛋白、膜结合DS-Cav1(稳定化的融合前RSV F蛋白)或膜结合RSV F蛋白与膜结合DS-Cav1的组合的开放阅读框，和
药学上可接受的载体。
140.如权利要求139所述的RSV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸包含如SEQ IDNO：5所述的序列。
141.如权利要求139或140所述的RSV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸包含如SEQID NO：7、257、258或259所述的序列。
142.如权利要求139至141中任一项所述的RSV疫苗，其中单次剂量的所述RSV疫苗导致针对RSV的血清中和抗体相对于对照物而言增加2至10倍。
143.如权利要求142所述的RSV疫苗，其中单次剂量的所述RSV疫苗导致针对RSV的血清中和抗体相对于对照物而言增加约5倍。
144.如权利要求142或143所述的RSV疫苗，其中所述血清中和抗体是针对RSVA和/或RSV B。
145.如权利要求139至144中任一项所述的RSV疫苗，其中所述RSV疫苗是在MC3脂质纳米粒子中配制。
146.一种在受试者中诱发抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用在受试者中产生抗原特异性免疫反应的有效量的如权利要求139至145中任一项所述的RSV疫苗。
147.如权利要求146所述的方法，其还包括施用加强剂量的所述RSV疫苗。
148.如权利要求147所述的方法，其还包括施用第二加强剂量的所述RSV疫苗。
149.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其具有5′端帽、编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框和3′polyA尾。
150.如权利要求149所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由经SEQ ID NO：5标识的序列编码。
151.如权利要求149所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含经SEQ ID NO：262标识的序列。
152.如权利要求149所述的疫苗，其中所述至少一种RSV抗原性多肽包含经SEQ ID NO：6标识的序列。
153.如权利要求149所述的疫苗，其中所述至少一种RSV抗原性多肽包含经SEQ ID NO：290标识的序列。
154.如权利要求149所述的疫苗，其中所述mRNA多核苷酸由经SEQ ID NO：7标识的序列编码。
155.如权利要求149所述的疫苗，其中所述mRNA多核苷酸包含经SEQ ID NO：263标识的序列。
156.如权利要求149所述的疫苗，其中所述至少一种RSV抗原性多肽包含经SEQ ID NO：8标识的序列。
157.如权利要求149所述的疫苗，其中所述至少一种RSV抗原性多肽包含经SEQ ID NO：291标识的序列。
158.如权利要求149至157中任一项所述的疫苗，其中所述5′端帽为或包含7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp。
159.如权利要求149至158中任一项所述的疫苗，其中所述开放阅读框中100％的尿嘧啶经修饰以在尿嘧啶的5位处包括N1-甲基假尿苷。
160.如权利要求149至159中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗是在脂质纳米粒子中配制，所述脂质纳米粒子包含：DLin-MC3-DMA；胆固醇；1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)；和聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
161.如权利要求160所述的疫苗，其中所述脂质纳米粒子还包含柠檬酸钠缓冲液、蔗糖和水。
162.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp、经SEQID NO：262标识的序列和3′polyA尾，所述疫苗是在脂质纳米粒子中配制，所述脂质纳米粒子包含DLin-MC3-DMA、胆固醇、1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)和聚乙二醇(PEG)2000-DMG，其中所述经SEQ ID NO：262标识的序列的尿嘧啶核苷酸经修饰以在尿嘧啶核苷酸的5位处包括N1-甲基假尿苷。
163.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp、经SEQID NO：263标识的序列和3′polyA尾，所述疫苗是在脂质纳米粒子中配制，所述脂质纳米粒子包含DLin-MC3-DMA、胆固醇、1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)和聚乙二醇(PEG)2000-DMG，其中所述经SEQ ID NO：263标识的序列的尿嘧啶核苷酸经修饰以在尿嘧啶核苷酸的5位处包括N1-甲基假尿苷。
164.一种用于受试者的疫苗接种的药物组合物，其包含
有效剂量的编码呼吸道合胞病毒(RSV)抗原的mRNA，
其中在施用后1至72小时在所述受试者的血清中测量时，所述有效剂量足以产生可检测水平的抗原。
165.如权利要求164所述的组合物，其中所述抗原的临界值指数为1至2。
166.一种用于受试者的疫苗接种的药物组合物，其包含
有效剂量的编码呼吸道合胞病毒(RSV)抗原的mRNA，
其中在施用后1至72小时在所述受试者的血清中测量时，所述有效剂量足以产生1,000至10,000的由针对所述抗原的中和抗体产生的中和效价。
167.一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其包含5′端帽，所述5′端帽为7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp；经SEQ ID NO：260至280中的任一个标识的序列和3′polyA尾。
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