CN106255911B - 自动聚焦系统 - Google Patents
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Abstract
一种自动聚焦装置，能够探测显微镜上样品的位置。所述样品可以包括安装在显微镜载玻片与盖玻片之间的样本或孔板内的样本。所述装置通过识别菲涅耳反射中折射率的界限来追踪样品的位置。折射率的变化可以与盖玻片的上部或底部、载玻片的上部、孔板的底部或孔板里面孔的底部相对应。使用光学相干断层扫描技术(OCT)，这些反射用于形成样品的深度扫描，其给出了相对物镜的这些表面的位置。所述装置通过补偿样品到物镜焦平面的任何位置变量，起到自动聚焦系统的作用。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年4月10日提交的美国临时申请号61/978,087，以及于2014年6月3日提交的美国临时申请号62/006,972的优先权。美国临时申请号61/978,087，以及美国临时申请号62/006,972的公开内容通过引用方式并入本文。
技术领域
本申请一般涉及显微镜装置，尤其涉及用于自动调节平台位置以保持合适焦距的技术。
背景技术
正如所有光学系统一样，显微镜会随着成像镜头(物镜)的放大倍率和NA(数值孔径)的变大而减小景深。当使用显微镜时，用户通过移动相对物镜的样品而负责达到对样品的合适焦距。当显微镜是自动的且用户不再潜心于观看每一个画面，就需要一种自动聚焦方法。在相关领域中，描述了通过测量前置物镜与容器底部(例如载玻片、孔板等)之间的距离来完成自动聚焦的技术。这些技术是基于由第一表面反射一束光束并测量反射距离。然而，这些技术的缺陷在于，例如在大多数塑料制品中，如果放置样品的容器具有不连续的厚度，则产生的图像因衬底的偏差量导致离焦。
细胞成像依赖于细胞在玻璃或塑料衬底底部的生长。细胞平行于表面生长并分泌使它们粘附于衬底上的蛋白。为了维持细胞生长，加入了营养丰富的液体培养基来喂养细胞并维持合适的生理条件。在这种情况下，塑料表面被覆盖在水溶液中，这能被用于探测细胞的位置。能使用低噪声、高灵敏度的反射光装置来找出塑料和液体之间的折射率变化。
发明内容
在一实施例中，提供了一种自动聚焦显微镜装置。所述装置包括：光源；光耦合器，所述光耦合器具有第一端口、第二端口、第三端口和第四端口；其中来自光源的光输出被耦合至第一端口并分裂为第一光束和第二光束，所述第一光束输出至第二端口且所述第二光束输出至第三端口，且其中第四端口被耦合至分光仪的输入端；第一光纤准直器，所述第一光纤准直器用于通过分光镜和显微镜物镜来将第一光束从光耦合器第二端口引导射到样品上，其中样品被放在由可调显微镜平台支撑的衬底上；第二光纤准直器，所述第二光纤准直器用于将第二光束从光耦合器第三端口引导射到反光镜上；其中从样品反射回来的第一光束被引导回到第二端口并从第四端口射出，且从反光镜反射回来的第二光束被引导回到第三端口并从第四端口射出；其中基于来自反射的第一和第二光束的干扰信号，所述分光仪输出控制信号来控制所述可调显微镜平台。
在另一实施例中，提供了一种操作显微镜装置的方法。所述方法包括：将光耦合器在第一端口处耦合至光源的光信号输出端，在第二端口处耦合至第一光纤准直器，在第三端口处耦合至第二光纤准直器；由经过反射镜和显微镜物镜的光束准直器来将第一光束从光耦合器第二端口引导射到样品上，其中样品被放在由可调显微镜平台支撑的衬底上；将第二光束从光耦合器第三端口引导射到反光镜上；捕获由衬底反射的第一光束，并通过第一光纤准直器将其发送至分光仪并进入光耦合器的第二端口且从第四端口出来；捕获由反光镜反射的第二光束，并通过第二光纤准直器将其发送至所述分光仪并进入光耦合器的第三端口且从第四端口出来；产生控制信号，所述控制信号用于基于来自反射的第一和第二光束的干扰信号来移动所述可调显微镜平台的位置。
附图说明
图1是根据一实施例的自动聚焦装置的示意图；
图2是根据一实施例的自动聚焦算法的示意图。
具体实施方式
本文描述了就目前考虑的实施本发明的一个最佳模式或多个模式。本说明书并不意在以限制性的方式来被理解，而是以说明目的来提供了本发明的例子，用于通过结合附图告知本领域技术人员本发明的优势和结构。在附图的各种视图中，相同的参考字符指示相同或相似的零件。值得注意的是，所有光纤系统可用自由空间等价物替代。
在显微镜中，被检测的样品物体被放在载玻片上并被盖玻片覆盖。调节显微镜的物镜，以得到放大物体的聚焦图像。当在具有第一折射率的第一介质中传播的光入射至具有第二反射率的第二介质中时，在两种介质的边界处发生发射。在边界处被反射的光的数量与被传播的光的数量取决于两种介质的折射率。在显微镜中，通常有许多不同的边界，例如，空气——玻璃、玻璃——水、水——玻璃以及玻璃——空气，因此有对应这些边界的不同反射强度水平。
根据一个实施例的装置，其能够探测显微镜上样品的位置。所述样品包括安装在显微镜载玻片与盖玻片之间的样本或孔板内的样本。所述装置通过识别菲涅耳(Fresnel)反射中的折射率的界限来追踪样品的位置。折射率的改变能与盖玻片的上部或底部、载玻片的上部、孔板的底部或孔板里面孔的底部相对应。使用光学相干断层扫描技术(OCT)，这些反射用于形成样品的深度扫描，所述样品的深度扫描给出了相对物镜的这些表面的位置。所述装置通过补偿样品到物镜焦平面的任何位置变量，起到自动聚焦系统的作用。
所述装置具有5个主要组件：
1.显微镜，所述显微镜用于对安装在Z轴压电台上的样品成像。
2.样品臂，所述样品臂是两个臂中的一个，用于产生位置探测所需要的干扰信号。这能在显微镜上的镜筒透镜之前或之后引入。
3.参考臂，所述参考臂是第二个臂，用于产生干扰信号。这个臂也用于补偿由不同物镜引入的不同路径长度以及分离自相关信号的物理性质。
4.基本单元，所述基本单元通过使用OCT而提供表面探测。所述基本单元包括用于获取及分析样品深度扫描所需的元件。
5.计算机，所述计算机包括NI-DAQ卡和软件，用于获取及分析信号。基于软件中的测量，校正信号能被应用到z轴压电台以保持样品在物镜的焦平面。
图1显示了带有成像路径和样品臂路径的显微镜和样品臂。所述成像路径包括光源101，例如半导体激光二极管(SLD)，所述光源101给放在样品台102上的样品提供照明。样品台能够在x、y和z方向上移动。例如，样品台包括电动x-y平台和z轴压电平台。物镜103能包括一系列类型和放大倍率，用于特定观察需求。镜筒透镜104引导光束进入相机105，如CCD，用于对样品成像。
在一个实施例中，样品臂包括来自基本单元的780HP AFC掺杂光纤、桨偏振控制器、可调AFC准直器106、平凹透镜107、传播可见光并反射红外线(IR)的分光镜108。所述分光镜能或者在相机与镜筒透镜之间引入，或者在镜筒透镜与物镜之间引入。对于后者不需要平凹透镜。图1也显示了快门109。
在一个实施例中，参考臂包括来自基本单元的780HP APC掺杂光纤、桨偏振控制器、固定焦距的APC准直器110、改变反光镜111路径长度的电动平台。
在一个实施例中，基本单元包括超辐射光源。例如，光源优选地具有2.5毫瓦的输出功率、930纳米的中心波长以及90纳米的光谱范围。基本单元还包括50:50的光纤耦合器112，所述光纤耦合器112通过它的第一端口耦合至SLD，通过它的第二端口耦合至样品臂，通过它的第三端口耦合至参考臂，并通过它的第四端口耦合至反光镜的准直器。在一个实施例中，基本单元还包括驱动电子产品，所述驱动电子产品提供恒流驱动给SLD、伺服回路控制珀尔帖(Peltier)冷却器、加热驱动以及分光仪图像传感驱动。在一个实施例中，分光仪包括光纤准直器113、衍射光栅114、物镜115以及相机116。在一个实施例中，系统计算机包括NI-PCIe-6351DAQ控制器以及配置为进行信号探测与控制的应用软件。
图2所示为根据一实施例的自动聚焦系统的运作流程图。在步骤201中，图像被调整到相机的焦点处。在步骤202中，参考臂被扫描以匹配样品臂的光学路径长度。一旦峰值可见，则扫描参考臂以使最强峰值进入A型扫描的视图。步骤203为图像处理步骤，其中将信号解调频，移除直流频谱，和在40次循环内对频谱求平均。
然后进行切趾法(Apodization)。在步骤204中，关闭机械快门以在样品臂中在准直器后阻挡激光。在步骤205，通过软件对频谱切趾。
然后进行色散补偿。在步骤206中，在频谱上识别最大峰值。在这种情况下，定位分辨率受限于像素宽度(3.35流明)。在步骤207中，抛物线被拟合到最大数据点和两个邻接数据点以提供亚像素分辨率。在步骤209中，测量峰值宽度。在步骤209中，针对峰值宽度改变并描绘数值的二次离散系数。在步骤201中，设置离散系数以给出最小峰值宽度。
然后进行样品峰值探测。在步骤211中，识别三个最大峰值。在步骤212中，抛物线拟合方法被应用到如上所述的所有三个峰值。
然后进行峰值追踪。在步骤213中，用户调节物镜以聚焦图像在相机上。用户控制软件追踪载玻片的上部的当前位置(在A型扫描的第三峰值)。这个位置成为步骤214中的设定点，载玻片的上部的位置被检测到。这个位置是过程变量。所述过程变量从设定点被减去以产生误差值。
当峰值位置改变误差就改变以反映样品离物镜焦平面的位移。在步骤215中，PID控制回路用于基于误差给Z压电平台提供电压。电压改变样品的位置。电压被改变以使误差值最小化。误差最小化使得样品保留在物镜的焦平面处。
虽然本发明结合几个上述实施例相当详细地描述了一些特性，其并不意在本发明应受限于任何此类细节或实施例或任何具体实施例，但其理解为通过引用附加声明以便于结合现有技术从而提供此类声明最广泛地可能的解释，并因此有效地包含本发明的预期范围。进一步，上文结合由发明人预见的可用于描述的实施例来描述本发明，虽然目前不能预见本发明的非实质性修改，但可以变现其同等变形。
Claims (13)
1.自动聚焦装置，包括：
光源(101)；
光耦合器(112)，所述光耦合器具有第一端口、第二端口、第三端口和第四端口；其中从光源(101)输出的光束耦合至第一端口并分裂为第一光束和第二光束，所述第一光束输出至第二端口且所述第二光束输出至第三端口，且其中第四端口被耦合至分光仪的输入端；
第一光纤准直器(106)，所述第一光纤准直器(106)用于通过分光镜(108)和显微镜物镜(103)将第一光束从光耦合器(112)的第二端口引导到样品上，其中该样品放在由可调显微镜平台(102)支撑的衬底上；
第二光纤准直器(110)，所述第二光纤准直器(110)用于将第二光束从光耦合器(112)的第三端口引导到反光镜(111)上；
其中，从样品反射回来的第一光束被引导回到第二端口并从第四端口射出，且从反光镜(111)反射回来的第二光束被引导回到第三端口并从第四端口射出；
其中，基于来自反射的第一光束和第二光束的干扰信号，所述分光仪输出控制信号来控制所述可调显微镜平台(102)。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述反光镜的位置能够调节，以使第二光束的光程与第一光束的光程相匹配。
3.根据权利要求1所述的装置，其中所述可调显微镜平台包括电动x-y平台和z轴压电平台。
4.根据权利要求1所述的装置，其中所述光耦合器为50:50光纤耦合器。
5.根据权利要求1所述的装置，其中所述分光仪包括引导光束至衍射光栅的光纤准直器、使相机上衍射光聚焦的物镜。
6.根据权利要求1所述的装置，其进一步包括机械快门，所述机械快门在关闭时以在样品臂中在第一光纤准直器后阻挡第一光束。
7.一种用于自动操作自动聚焦系统的方法，所述方法包括：
将光耦合器(112)在第一端口处耦合至光源(101)的光信号输出端，在第二端口处耦合至第一光纤准直器(106)，并在第三端口处耦合至第二光纤准直器(110)；
经由第一光纤准直器(106)并通过分光镜(108)和显微镜物镜(103)来将第一光束从光耦合器(112)的第二端口引导到样品上，其中该样品被放在由可调显微镜平台(102)支撑的衬底上；
将第二光束从光耦合器(112)的第三端口引导到反光镜(111)上；
捕获由衬底反射的第一光束，并通过第一光纤准直器(106)将其发送至分光仪并进入光耦合器(112)的第二端口且从第四端口射出；
捕获由反光镜(111)反射的第二光束，并通过第二光纤准直器(110)将其发送至所述分光仪并进入光耦合器(112)的第三端口且从第四端口射出；
产生控制信号，所述控制信号用于基于来自反射的第一光束和第二光束的干扰信号来移动所述可调显微镜平台(102)的位置，
其中第一光束和第二光束是由来自同一光源发出的同一光束经光耦合器后分成的两束光。
8.根据权利要求7所述的方法，其进一步包括调节所述反光镜的位置以使得第二光束的光程与第一光束的光程相匹配。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述分光仪包括引导光束至衍射光栅的光纤准直器、使相机上衍射光聚焦的物镜。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述控制信号基于干扰信号的峰值而产生。
11.根据权利要求7所述的方法，其进一步包括关闭机械快门以在第一光纤准直器后阻挡第一光束进入样品臂。
12.根据权利要求7所述的方法，其中在干扰信号中识别三个峰值。
13.根据权利要求12所述方法，其进一步包括：
设置样品的位置与作为设定点的峰值相对应；
监测样品位置；
从设定点减去样品的当前位置以生成误差值；
移动可调显微镜平台的位置以使误差值最小化。
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