CN104685050B

CN104685050B - 哺乳动物的胚胎或受精卵的非冻结低温保存方法

Info

Publication number: CN104685050B
Application number: CN201280075376.8A
Authority: CN
Inventors: 出田笃司; 青柳敬人
Original assignee: National Federation of Agricultural Cooperative Associations
Current assignee: National Federation of Agricultural Cooperative Associations
Priority date: 2012-08-21
Filing date: 2012-08-21
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2032-08-21
Also published as: WO2014030211A1; US10392599B2; JPWO2014030211A1; CN104685050A; US20150218511A1; BR112015003253B1; BR112015003253A2; CA2882728C; CA2882728A1; JP6023812B2

Abstract

本发明公开了一种与以往相比可以长期在非冻结状态下良好地保存哺乳动物的胚胎和受精卵、并且可以高度维持保存后的胚胎的孵化能力或受胎率的新手段。本发明的哺乳动物的胚胎或受精卵的保存方法包括：将哺乳动物的胚胎或受精卵浸在含有20～80%(V/V)的血清和10～100mM的Good’s缓冲液的培养基中，在非冻结低温下保存上述胚胎或受精卵。另外，本发明的哺乳动物的胚胎或受精卵的保存液本质上由含有20～80%(V/V)的血清和10～100mM的Good’s缓冲液的培养基构成。Good’s缓冲液优选为HEPES。

Description

哺乳动物的胚胎或受精卵的非冻结低温保存方法

技术领域

本发明涉及在非冻结低温下保存哺乳动物的胚胎或受精卵的方法和保存液。

背景技术

仅在日本国内每年就有6万个以上的牛胚胎在流通。而且，在北美、南美、欧州以及亚洲地区牛胚胎的需求逐年增加。因此，全球都在进行关于牛胚胎冻结保存的研究，开发了多种缓慢冻结法或急速冻结法，得到了比较稳定的受胎率(受孕率)。但是，根据目前的技术水平，只能得到50%左右的受胎率，在此20年以前尚未报道进一步提高受胎率的大的改善对策。这也许暗示了：哺乳类胚胎的冻结保存方法达到了某种程度的技术极限。

另外，可以耐受冻结·融解损伤的胚胎仅限于高品质的胚胎，即使通过过剩排卵处理生产了多个胚胎，也会因各种要因(例如供卵牛的体质或供试精子的活力等)而只得到低品质胚胎，此类例子也非常多。但是，这些低品质胚胎如果经过冻结处理，也可以移植到受胎牛的子宫中生产小牛。

倘若有在短期内在非冻结状态下抑制由供卵牛回收的牛胚胎的发育同时使其继续存活的方法，则可以利用送货上门等的运输方法，将没有受到冻结·解冻所伴随的损伤的胚胎以极高的效率用于小牛生产。另外，当供卵牛与受卵牛的发情周期为数天时，可以根据受卵牛的发情周期调整移植时期。而且，如果开发了如上所述的胚胎保存方法，则认为不需要液氮或深度冷冻器等昂贵的冷冻设备。即，可以使用家庭用冰箱来保存胚胎。

迄今为止，有报道称：牛胚胎的非冻结保存以3天(非专利文献1)为限，羊胚胎的非冻结保存以4天(非专利文献2)为限。另外，据报道，Zoarces elongatus Kner(长绵鳚)这种鱼种所具有的热滞后蛋白(Nfe8)以及热滞后类似蛋白Nfe11和Nfe6在低温环境下发挥细胞延寿功能(专利文献1)，期待着作为细胞延寿剂的实用化。

作为非冻结低温胚胎保存对象来研究的动物种有小鼠、猪、绵羊、牛、稀有物种等，但每个动物种的胚胎性质大不相同。由此，胚胎保存中有效成分或它们的混合率、有效浓度范围也大不相同，每个动物种均需查明保存液成分。关于牛胚胎在非冻结低温下的保存方法，很久以来从受胎率的提高、供卵牛-受卵牛间的发情同期化问题和低品质胚胎的利用方面进行了研究，但尚未开发出有效的保存方法。

在这种状况下，期待着开发一种哺乳动物胚胎保存液，所述保存液在非冻结低温下更有效地保护或保存哺乳动物胚胎，不仅延长它们的寿命，还保持孵化能力或带来高受胎率。另外，还强烈希望开发哺乳动物胚胎的保存方法，所述保存方法可以在运输所需的天数内保存，并且还兼具实现用耗能少的通用性设备或容器进行保存或运输的条件。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2010-248160号公报；

非专利文献

非专利文献1：Lindner GM and Ellis DE. Refrigeration of bovine embryos.Theriogenology 1985; 23: 202.；

非专利文献2：Baguisi A, Arav A, Crosby TF, Roche JF, Boland MP.Hypothermic storage of sheep embryos with antifreeze proteins: development invitro and in vivo. Theriogenology 1997; 48: 1017-1024。

发明内容

发明所要解决的课题

因此，本发明的目的在于提供一种与以往相比可以长期在非冻结状态下良好地保存哺乳动物的胚胎和受精卵、而且还可以高度维持保存后的胚胎的孵化能力或受胎率的手段。

用于解决课题的手段

本申请发明人深入研究的结果发现：通过将血清和Good’s缓冲液以特定浓度组合使用，而不使用Nfe11等这样的细胞延寿肽，可以在非冻结状态下长期保存哺乳动物细胞胚胎，尤其是使用HEPES时得到了特别优异的效果，即使是在长达7天的时间内非冻结保存哺乳动物胚胎时，也可以实现非常高的存活率和受胎率，完成了本申请发明。

即，本发明提供哺乳动物的胚胎或受精卵的保存方法，该方法包括：将哺乳动物的胚胎或受精卵浸在含有20～80%(V/V)的血清和10～100mM的Good’s缓冲液的培养基中，在非冻结低温下保存上述胚胎或受精卵。本发明还提供哺乳动物的胚胎或受精卵的保存液，所述保存液本质上由含有20～80%(V/V)的血清和10～100mM的Good’s缓冲液的培养基构成。

发明效果

根据本发明，不使用特殊成分作为保存液成分，与现有方法相比可以长期在非冻结状态下保存哺乳动物胚胎和受精卵。在使用HEPES作为Good’s缓冲液时，得到了特别优异的效果，即使是在长达7天的期间内非冻结保存哺乳动物胚胎时，也可以实现非常高的存活率和受胎率。迄今为止尚不存在实现长达7天的哺乳动物的胚胎或受精卵的非冻结保存的例子，如下所述，本发明对优良家畜的培育作出了巨大贡献。

以往，商品用的家畜受精卵(例如黑毛日本牛的7日龄胚胎(桑椹胚))是以浸在保存液中的状态封入被称作吸管(ストロー)的直径为2mm、长15cm左右的筒中，再将该吸管浸在液氮中，将这种状态的受精卵作为商品流通。在浸在液氮中的状态下，根据航空法的规定无法搭载在飞机上进行运输，而是通过货车或卡车的陆运配送至需要者(畜产团体或畜产农家)，出现因运输成本增加而导致家畜受精卵的价格上涨的问题。根据本发明，可以长期非冻结低温保存，无需使用液氮，例如可以在装入小型冷却箱等中的状态下运输受精卵(胚胎)，还可以通过飞机进行空运，可以以低成本更快速地将受精卵运送到远方各地。在胚胎的冻结保存下在冻结和融解时胚胎会受到物理损伤，但如果是非冻结保存，则没有这样的担心，因此还可以期待受胎率的提高。

另外，以往在商品用牛受精卵的制造中，由于供卵牛与受卵牛的发情期不一致或低品质，大约20%的牛胚胎被废弃。由于可以在非冻结状态下保存家畜胚胎，所以无法耐受冻结·融解的物理损伤的低品质胚胎也可以有效利用。而且，即使在供卵母牛与受卵母牛的发情周期相差数天的情况下，也可以根据受卵母牛的发情周期调整移植时期。根据本发明，因发情期不一致或低品质而被废弃的家畜胚胎也可以有效地实际应用。

而且，根据本发明的方法，不用清洗浸在保存液中的浸渍胚胎或受精卵，可以连同保存液一起移植到受卵动物的子宫内。本申请发明人之前发现：通过结合使用具有细胞延寿效果的特殊肽(成熟型Nfe11)和浓度为20～50%(V/V)左右的血清，可以在非冻结低温下保存牛胚胎最长达5天，作为具有细胞延寿活性的肽，当为产业应用时，通常使用通过基因工程学方法在大肠杆菌等中表达、纯化而获得的肽。但是，在充分进行重组肽的安全性评价之前，无法连同包含重组肽的保存液一起移植到受卵动物的子宫中，需要在移植前清洗胚胎或受精卵。在本发明中，由于不用清洗重组肽，所以可以将低温保存后的胚胎不经清洗而直接移植到受卵母牛中，更简便而且还可以减小对胚胎的物理损伤。

附图简述

图1是显示使用本发明的保存液将牛胚胎封入吸管内进行非冻结低温保存时的一个具体例子的图。

具体实施方式

在本发明的方法中，将哺乳动物的胚胎或受精卵浸在以特定浓度含有血清和Good’s缓冲液的培养基中，在非冻结低温下保存胚胎或受精卵。

Good’s缓冲液具有不易透过生物体膜、在水中的溶解性高、与金属离子形成络合物的能力小等共通的特长，认为其除了在胚胎和受精卵的保存中稳定培养基的pH以外，还具有保护非冻结低温保存中的胚胎和受精卵的细胞膜的作用。如下述实施例所记载，关于Good’s缓冲液所产生的非冻结低温下的胚胎和受精卵的延寿效果，在保存中稳定培养基(保存液)的pH这本身并不重要，推测所述延寿效果来自pH稳定化以外的细胞膜保护作用。

作为Good’s缓冲液而已知的缓冲剂的具体例子，可以列举以下的缓冲液。

MES [2-吗啉代乙磺酸]；

Bis-Tris [双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷]；

ADA [N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸]；

PIPES [哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)]；

ACES [N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸]；

MOPSO [2-羟基-3-吗啉代丙磺酸]；

BES [N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸]；

MOPS [3-吗啉代丙磺酸]；

TES [N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸]；

HEPES [4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸]；

DIPSO [3-[N,N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基-1-丙磺酸]；

TAPSO [3-(N-三[羟甲基]甲基氨基)-2-羟基丙磺酸]；

POPSO [哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)]；

HEPPSO [N-(羟乙基)哌嗪-N’-2-羟基丙磺酸]；

EPPS [3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸]；

Tricine [N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸]；

Bicine [N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸]；

TAPS [N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸]；

CHES [N-环己基-2-氨基乙磺酸]；

CAPSO [N-环己基-2-羟基-3-氨基丙磺酸]；以及

CAPS [N-环己基-3-氨基丙磺酸]。

在本发明中，上述公知的Good’s缓冲液均可使用，但细胞通常以pH6.8～7.2作为最适pH，理想的是保持该pH范围，因此优选能够使用在非冻结低温下、在中性范围(pH6～8)可以发挥合适的缓冲能力的Good’s缓冲液。作为这样的能够优选使用的Good’s缓冲液，例如可以列举选自MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine和TAPS的至少一种、或者选自HEPES、PIPES和MOPS的至少一种。在本发明中，特别可以优选使用HEPES。Good’s缓冲液可以只使用1种，也可以组合使用两种以上。

培养基中的血清浓度(终浓度)为20～80%(V/V)，例如可以是25～80%(V/V)、30～80%(V/V)、35～80%(V/V)、40～80%(V/V)、45～80%(V/V)、20～60%(V/V)、25～60%(V/V)、30～60%(V/V)、35～60%(V/V)、40～60%(V/V)、45～60%(V/V)或45～55%(V/V)。

培养基中的Good’s缓冲液浓度(终浓度)为10～100mM，例如可以是12.5～100mM、15～100mM、20～100mM、22.5～100mM、12.5～80mM、15～80mM、20～80mM、22.5～80mM、20～60mM、22.5～60mM、20～55mM、22.5～55mM或22.5～52.5mM。单独使用HEPES时，培养基中的HEPES浓度可以优选从上述浓度范围内选择。使用其他的Good’s缓冲液时也一样。组合使用两种以上的Good’s缓冲液时，只要总浓度在上述范围内即可。

但是，即使在上述浓度范围内，当使用低浓度的Good’s缓冲液时，也优选提高血清浓度。例如，当以不足15mM的浓度使用Good’s缓冲液时，优选使血清浓度达到30%(V/V)左右以上、例如40%(V/V)左右以上。

通过以上述浓度组合使用血清和Good’s缓冲液，可以在非冻结低温下长期保存哺乳动物的胚胎和受精卵。在本发明中，不使用如专利文献1等所记载的具有细胞延寿活性的肽，可以提高胚胎和受精卵的非冻结低温保存后的存活率、孵化率等。

具有细胞延寿活性的肽(以下，有时称作“细胞延寿肽”)是指，在非冻结低温条件下使该肽与细胞共存保存时，与在该肽的非共存下保存时相比以明显高的比例维持细胞存活的肽。作为这种肽的具体例子，可以列举专利文献1中也记载的Nfe11蛋白。本申请发明人之前发现了：通过结合使用成熟型Nfe11和浓度为20～50%(V/V)左右的血清，可以在非冻结低温下保存牛胚胎最长达5天，进行了专利申请。成熟型Nfe11是指由除去了前体Nfe11蛋白N末端侧22个残基的分泌信号序列的66个残基的氨基酸序列构成的肽，其氨基酸序列见SEQID NO: 2。SEQ ID NO: 1是编码成熟型Nfe11的cDNA的核苷酸序列。除了由与SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列同源的氨基酸序列构成的肽以外，只要具有细胞延寿活性，由在该氨基酸序列中有少数(例如1～数个、2～5个、或2～3个)氨基酸残基被取代、缺失、插入或添加而获得的氨基酸序列构成的、与原始的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有80%以上、例如85%以上、90%以上、95%以上或98%以上的同源性的肽也包含在“具有细胞延寿活性的肽”中。

需要说明的是，任意的肽是否具有细胞延寿活性，例如可以如下评价：在肽的存在下培养细胞，并与该肽不存在下的对照细胞相比，根据是否显著维持细胞的存活来评价。该评价可以通过下述方法进行：例如通过组合使用活细胞染色荧光色素(例如Calcein-AM)和死细胞染色用荧光色素(例如Propidium Iodide)来测定存活率的方法(De Clerck等人,Journal of Immunological Methods, 1994, 172(1), 第115-124页；Nicoletti等人，Journal of Immunological Methods，1991, 139(2), 第271-279页)；以乳酸脱氢酶(LDH)的量为指标，通过定量细胞毒(即细胞膜毒性)来测定细胞存活率的方法(T. Decker和M.L.L. Matthes，Journal of Immunological Methods, 1988, 115(1), 第61-69页)等方法。

在本发明中，由于是通过组合特定浓度的血清和Good’s缓冲液来达到长期的非冻结低温保存效果，所以不需要在培养基中添加具有细胞延寿活性的肽。例如，作为本发明方法的一个方案，可以列举如下方法，该方法包括：将哺乳动物的胚胎或受精卵浸在含有20～80%(V/V)的血清和10～100mM的Good’s缓冲液、而不含有下述(a)和(b)中的任一种肽的培养基中，在非冻结低温下保存上述胚胎或受精卵。

(a) 肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；

(b) 肽，该肽与SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列具有80%以上的同源性、且具有细胞延寿活性。

作为本发明中使用的血清的具体例子，可以列举牛血清、猪血清、山羊血清、马血清等，但没有特别限定，可以优选使用牛血清。牛血清可以是胎牛血清、小牛血清或成牛血清。

对通过本发明的方法保存的哺乳动物的胚胎或受精卵没有特别限定，优选为牛、猪、山羊、马等家畜的胚胎或受精卵，其中，对牛的胚胎或受精卵可以优选实施本发明的方法。在本发明的方法中，卵裂开始前的受精卵和卵裂开始后的受精卵(胚胎)均作为对象。

本发明的方法中使用的培养基可以是通常用于培养哺乳动物胚胎的培养基。作为可用于培养哺乳动物胚胎的市售培养基的具体例子，可以列举以下的培养基，但并不限于这些。另外，下述各成分的浓度是代表性的市售品中的例子，成分浓度并不仅限于下述的具体例子。

＜medium199培养基＞

组成：200mg/L的氯化钙、0.7mg/L的三硝酸铁9水合物、400mg/L的氯化钾、97.67mg/L的硫酸镁、6.1～6.8g/L的氯化钠、2.2g/L的碳酸氢钠、1mM的磷酸二氢钠(无水物或1水合物)、10mg/L的腺嘌呤硫酸盐、1mg/L的腺苷-5-三磷酸、0.2mg/L的腺苷-5-磷酸、0.2mg/L的胆固醇、0.5mg/L的脱氧核糖、1g/L的D-葡萄糖、0.05mg/L的还原型谷胱甘肽、0.3mg/L的盐酸鸟嘌呤、0mM或25mM的HEPES(任意成分)、0.4mg/L的次黄嘌呤钠、20mg/L的酚红、0.5mg/L的核糖、50mg/L的乙酸钠、0.3mg/L的胸腺嘧啶、20mg/L的吐温80、0.3mg/L的尿嘧啶、0.34mg/L的黄嘌呤钠、25mg/L的L-丙氨酸、70mg/L的盐酸L-精氨酸、30mg/L的L-天冬氨酸、0.1mg/L的盐酸L-半胱氨酸1水合物、26mg/L的L-胱氨酸2盐酸盐、75mg/L的L-谷氨酸、50mg/L的甘氨酸、21.88mg/L的盐酸L-组氨酸1水合物、10mg/L的L-羟基脯氨酸、40mg/L的L-异亮氨酸、60mg/L的L-亮氨酸、70mg/L的盐酸L-赖氨酸、15mg/L的L-甲硫氨酸、25mg/L的L-苯丙氨酸、40mg/L的L-脯氨酸、25mg/L的L-丝氨酸、30mg/L的L-苏氨酸、10mg/L的L-色氨酸、58mg/L的L-酪氨酸二钠2水合物、25mg/L的L-缬氨酸、0.05mg/L的抗坏血酸、0.01mg/L的α-生育酚磷酸、0.01mg/L的d-生物素、0.1mg/L的钙化醇、0.01mg/L的D-泛酸钙、0.5mg/L的氯化胆碱、0.01mg/L的叶酸、0.05mg/L的异肌醇、0.01mg/L的甲萘醌、0.025mg/L的烟酸、0.025mg/L的烟酰胺、0.05mg/L的对氨基苯甲酸、0.025mg/L的盐酸吡哆醛、0.025mg/L的盐酸吡哆辛、0.01mg/L的核黄素、0.01mg/L的盐酸硫胺和0.1mg/L的维生素A。

＜作为改良medium199培养基的CR1aa培养基＞

组成：6.653g/L的氯化钠、0.233g/L的氯化钾、2.200g/L的碳酸氢钠、0.545g/L的乳酸钙、0.044g/L的丙酮酸钠、0.146g/L的L-谷氨酰胺、20mL/L的MEM必需氨基酸溶液、10mL/L的MEM非必需氨基酸溶液和0.2～0.5%牛血清白蛋白；

＜HP-M199培养基＞

组成：从medium199中除去了吐温80和对氨基苯甲酸而获得的组成、不含HEPES。

另外，还可以在通常用于培养哺乳动物胚胎的培养基中混合其他的培养基类、例如BME培养基、CMRL1066培养基、MEM培养基、NCSU培养基或它们的改良培养基等进行使用。需要说明的是，当市售培养基组成中已经包含Good’s缓冲液或血清时，只要包括该Good’s缓冲液浓度和血清浓度在内的总浓度在上述的Good’s缓冲液浓度和血清浓度的范围内即可。

根据需要，可以在培养基中适当添加抗氧化剂、稳定化剂等添加剂。作为这样的成分，可以列举：磷酸盐、枸橼酸盐、丙酮酸盐或其他有机酸；抗氧化剂(例如SOD、维生素E或谷胱甘肽)；pH调节剂(例如盐酸、乙酸、氢氧化钠)；低分子量多肽；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；维生素类(例如维生素A、维生素B类、维生素C、维生素D类、生物素、叶酸)；单糖类、二糖类和多糖类的化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂(例如EDTA)；糖醇(例如甘露醇或山梨糖醇)；成盐抗衡离子(例如钠)；非离子性表面活性剂(例如聚氧乙烯·脱水山梨糖醇酯(Tween(商标))、聚氧乙烯·聚氧丙烯嵌段共聚物(プルロニック(pluronic、商标))或聚乙二醇)等。

而且，在用于保存胚胎的培养基中，根据需要，还可以适当添加碳酸氢盐缓冲液、磷酸缓冲液或它们的改良液等公知的缓冲盐类溶液或抗生素等。

哺乳动物的胚胎和受精卵可以利用该领域公知的方法进行准备。例如，将从哺乳动物的卵巢吸引采集的卵胞卵子进行体外培养，与该哺乳动物的精子进行共培养(授精)使其受精，从而可以得到受精卵，通过使该受精卵进一步发育，可以得到胚胎。通常，以商品形式流通的胚胎在形态上是桑椹期～胚泡期的胚胎。在形态上是桑椹期～胚泡期的胚胎，这可由本领域技术人员容易地进行判定。例如，通过将胚胎的显微镜图像与国际胚胎移植学会(IETS)手册所公示的图像进行比较，可以容易地进行判定。

作为用于保存胚胎或受精卵的容器，只要是精液冻结用吸管、受精卵移植用吸管、采样管、冷冻管、细胞培养皿、细胞培养板、各种小瓶等对哺乳动物的胚胎或受精卵不会显示出毒性的容器，则可以使用任何容器。另外，为了保持非冻结低温环境，可以使用恒温器、恒温容器、保温容器(方式可以是气槽式(通常为空气)、也可以说液槽式(通常为水))、保温袋、低温室、家庭用冰箱等。在胚胎或受精卵的保存中优选尽量避光，但根据为了保持非冻结低温环境而采用的一般手段，通常是形成暗环境，所以往往不需要特别担心。

在本发明中，将哺乳动物的胚胎或受精卵浸在以上述的特定浓度含有血清和Good’s缓冲液的培养基中，在此状态下封入适当的保存容器内，在非冻结低温环境下保存。非冻结低温是指培养基和哺乳动物的胚胎或受精卵不会冻结的低温，例如-1～15℃、2～10℃、或4～5℃的温度。

根据本发明的方法，不使用成熟型Nfe11等细胞延寿肽，可以在非冻结低温下保存哺乳动物的胚胎或受精卵长达7天的时间。例如，在下述实施例中确认到：在含有50%(V/V)的胎牛血清和作为Good’s缓冲液的25mM或50mM的HEPES的medium199中，胚胎的保存成效(保存后的胚胎的存活率、孵化率和受胎率)格外优异。因此，作为本发明方法的特别优选的方案，可以列举使用45～55%(V/V)的血清、且22.5～52.5mM的作为Good’s缓冲液的HEPES的方案，但并不限于此。

本发明的保存方法中使用的、以上述的特定浓度含有血清和Good’s缓冲液的培养基可以以哺乳动物的胚胎或受精卵的非冻结低温保存用保存液的形式提供。即，本发明还提供：本质上由含有20～80%(V/V)的血清和10～100mM的Good’s缓冲液的培养基构成的哺乳动物的胚胎或受精卵的保存液。

由于是通过特定浓度的血清和Good’s缓冲液的组合来实现长期的非冻结低温保存效果，所以不需要在培养基中添加具有细胞延寿活性的肽。例如，作为本发明的保存液的一个方案，可以列举：本质上由含有20～80%(V/V)的血清和10～100mM的Good’s缓冲液、而不含有下述(a)和(b)中的任一种肽的培养基构成的保存液。

(a) 肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；

“本质上构成(essentially consisting of)”是指，只要不影响发明的效果则可以包含其他成分。在本发明的保存液中，只要培养基中含有特定浓度的血清和特定浓度的Good’s缓冲液，则在该培养基中可以包含除具有细胞延寿活性的肽以外的任意成分。关于能够任意包含的其他成分如上所述。关于血清浓度、血清种类和Good’s缓冲液浓度等的优选条件也如上所述。

保存液在调制后可以适当通过滤器灭菌(通常只要使用孔径为0.2μm左右的滤器即可)等进行灭菌，使用之前在冷暗处保存。

实施例

以下，根据实施例来更具体地说明本发明。但本发明并不限于下述实施例。

＜材料和方法＞

1. 牛胚胎的制作

按照国际受精卵移植学会的规定(IETS manual. Manual of the internationalembryo transfer society. In: Stringfellow DA, Seidel SM, editors. Savoy,Illinois, USA: IETS 1998.)，对从过剩排卵处置后的黑毛日本种或荷尔斯坦因(Holstein)种供卵牛中回收的胚胎进行品质评价，将低品质胚胎在非冻结保存7天后供给体外培养试验，将高品质胚胎移植到受卵牛中之后进行受胎率调查。

牛胚胎的保存如下进行(图1)。首先，只吸引保存液到容量为0.25ml的吸管内，接着隔着空气层吸引包含牛胚胎的保存液。然后，隔着空气层再次只吸引保存液，之后封入吸管内。接着，将吸引了牛胚胎的吸管浸在事先冷却至4～5℃的聚酯容器(塑料管)内的水中，连同聚酯容器一起在冰箱内于4～5℃下保存7天。

在该非冻结保存后，将牛胚胎浸在含有5%(V/V)胎牛血清(FBS)的PBS(+)中3次来进行清洗。将清洗后的牛胚胎在5% CO₂和38℃的条件下、在包含5%(V/V) FBS的CR1aa培养基中培养48小时。在立体显微镜下进行形态观察，在可以确认通过培养进行卵裂、而且细胞质膜没有破裂时判断胚胎存活。关于存活胚胎，确认是否观察到来自透明体的孵化。另外，将用包含5%(V/V) FBS的PBS(+)清洗后的牛胚胎通过非外科手术移植到发情周期(以发情日作为第0天)第6～8天的受卵牛的黄体侧子宫角深部，在发情周期的第30天和第60天进行妊娠诊断。用于验证本发明的胚胎保存液效果的显著差别检验采用χ²检验。

2. 非冻结保存液的调制

向添加了抗生素(青霉素G钾和硫酸链霉素)的medium199(インビトロジェン)中添加FBS使达到20～50%(V/V)、而且HEPES浓度达到0～100mM。在受胎试验中，还设置了添加了具有低温保护效果的特殊肽(成熟型Nfe11、SEQ ID NO: 2)的区。另外，为了确认HEPES以外的Good’s缓冲液的效果，还调制了以FBS浓度达到50%(V/V)、Good’s缓冲液(PIPES、MOPS)达到25mM的方式添加在medium199中的保存液。使这些保存液通过孔径为0.2μm的滤器进行灭菌处理，使用之前在冰箱内保管。

需要说明的是，特殊肽(成熟型Nfe11)使用按照以下顺序制作的肽。

按照专利文献1所记载的顺序，构建将编码成熟型Nfe11(SEQ ID NO: 2)的DNA序列(SEQ ID NO: 1)插入pET20b(Novagen)中而获得的质粒pET20NFE11，通过该表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3) (Novagen)。得到的转化体在含有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中、在28℃下振荡培养24小时。

振荡培养24小时后，将以体积比计为1/100量的培养液接种在新调制的含有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中，在28℃进行振荡培养。在培养液的浊度达到O.D.₆₀₀＝0.5的时间点，向培养液中添加IPTG(异丙基-β-D(-)-硫代半乳糖苷)使终浓度达到0.5mM，诱导Nfe11的表达，再培养18小时。

将上述培养液在5000rpm、4℃下离心分离15分钟，回收菌体。向其中添加培养液的1/20量的TE缓冲液(10mM的Tris-HCl/1mM的EDTA pH8.0)和PMSF(苯甲基磺酰氟)使其达到0.1mM，悬浮菌体。

接着，将悬浮液一度冻结，融解后，使用超声波装置将菌体破碎。得到的破碎液在11,000rpm、4℃下离心分离20分钟，回收上清。将枸橼酸一水合物(13.2g/L)和氯化钠(29.2g/L)溶解于该上清中，在4℃下放置1小时。该放置后，产生的沉淀物在6,000rpm、4℃下离心分离30分钟，回收含有目标蛋白的上清。

使上述的含有目标蛋白的上清通过流动相使用了5mM的枸橼酸钠溶液、且内径为5.0cm和高26cm(容量500ml)的Sephadex G-25凝胶过滤柱(GE Healthcare)，从而得到置换成了5mM的枸橼酸钠溶液的蛋白溶液。接着，使用枸橼酸溶液将该蛋白溶液的pH调节至2.9，在4℃下静置一夜，从而使夹杂蛋白发生酸变性和沉淀。通过6,000rpm、4℃、30分钟的离心分离除去该沉淀物，得到含有目标蛋白的上清。

接着，先利用50mM的枸橼酸钠缓冲液(pH2.9)使内径为5.0cm和高4.6cm(容量90ml)的阳离子交换High-S柱(Bio-Rad)达到平衡，再使回收的含有目标蛋白的上清通过该柱。用50mM的枸橼酸钠/330mM的NaCl(pH2.9)洗脱吸附在树脂上的目标蛋白，进行回收。再将纯化物的水溶液用10倍量的超纯水透析5次，之后经过冻结干燥，得到成熟型Nfe11纯化物的冻结干燥粉末。

＜结果和考察＞

1. 含HEPES的保存液的胚胎保存效果

如表1所示可知：通过将HEPES浓度调整至12.5～100mM以用作低品质牛胚胎的非冻结保存液，与不含HEPES的区相比，保存7天后的存活率升高。特别是来自HEPES浓度调整至25～50mM、且FBS浓度调整至50%(V/V)的保存液的透明带的孵化率变高。

[表1]

含有HEPES的非冻结保存液的保存结束时的pH为6.9～7.4的范围内，相对于此，不含HEPES的区的pH为7.7～7.9。细胞通常以pH6.8～7.2作为最适pH，理想的是保持该pH范围。已知HEPES是Good’s缓冲液的一种，其缓冲能力高，充分溶解于水溶液中使pH稳定化。另外，认为Good’s缓冲液并不会简单地通过细胞膜。于是，为了验证经常与HEPES一同用作缓冲剂的、不是Good’s缓冲液的缓冲剂三羟甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane、以下记作Tris)的低温保护效果，在添加了25mM Tris的含50%(V/V) FBS的medium199(用盐酸将pH调节至7.2)中低温保存牛胚胎7天时，之后的存活率和孵化率极低，分别低至10.0%、5.0%。低温保存结束后的pH为7.2。由此显示：HEPES虽然具有非冻结保存液的pH稳定化效果，但pH稳定化本身对于提高胚胎的非冻结保存成效并不重要，HEPES有可能具有除pH稳定化效果以外的低温保存中的细胞膜保护效果。

2. 受胎性调查

接下来，调查已非冻结保存了7天的高品质牛胚胎的受胎性。通常，用于细胞培养时的HEPES浓度推荐为10～25mM(Luo S等人, Effect of HEPES buffer on the uptakeand transport of P-glycoprotein substrates and large neutral amino acids. MolPharm 2010; 7: 412-420.)，因此本次受胎性确认试验中使用的非冻结保存液的HEPES浓度为25mM。而且，通过在添加了25mM HEPES的含有50%(V/V) FBS的medium199中添加具有低温保护效果的基因重组特殊肽(成熟型Nfe11肽)，调查受胎性的改善。结果见表2。

[表2]

在HEPES浓度调整至25mM的含有50%(V/V) FBS的medium199中非冻结保存了7天的高品质牛胚胎的受胎率高达75.0%。没有确认到妊娠第30天～第60天的早期胚胎的死亡，可以确认到正常小牛的诞生。另外，没有确认到本研究中的特殊肽的受胎促进效果。本研究成果意味着：可以用HEPES或血清代替基因重组特殊肽的效果。

3. HEPES以外的Good’s缓冲液的效果确认

为了确认HEPES以外的Good’s缓冲液的效果，除HEPES以外，还使用下述表3所示的Good’s缓冲液来进行以下的实验。

使用添加了Good’s缓冲液使其达到25mM的medium199(FBS浓度为50%(V/V) FBS)，将牛胚胎低温保存7天，利用上述方法研究存活率和孵化率。作为对照，使用没有添加Good’s缓冲液、且FBS浓度为50%(V/V) FBS的medium199。结果见表3。表3中的“pH”显示7天冷藏保存结束时的培养基的pH。

[表3]

即使是在使用HEPES以外的Good’s缓冲液的情况下，保存7天后的胚胎的存活率和孵化率也存在上升的趋势。确认到了：虽然HEPES的效果最优异，但除HEPES以外的Good’s缓冲液还具有在非冻结低温保存中保护胚胎的效果。

符号说明

10：牛胚胎；

12：保存液；

14：吸管；

16：塑料管；

18：空气层；

20：水。

Claims

1.哺乳动物的胚胎或受精卵的保存方法，该方法包括：将哺乳动物的胚胎或受精卵浸在含有20～80%V/V的血清和15～100mM的Good’s缓冲液的培养基中，在非冻结低温下保存上述胚胎或受精卵，其中，上述Good’s缓冲液为选自HEPES、TES、PIPES、MOPS和EPPS的至少一种，上述非冻结低温为-1℃～15℃的温度，上述胚胎或受精卵是未经过冻结的胚胎或受精卵。

2.哺乳动物的胚胎或受精卵的保存方法，该方法包括：在运输胚胎或受精卵的期间中，将哺乳动物的胚胎或受精卵浸在含有20～80%V/V的血清和15～100mM的Good’s缓冲液的培养基中，在非冻结低温下保存上述胚胎或受精卵，其中，上述Good’s缓冲液为选自HEPES、TES、PIPES、MOPS和EPPS的至少一种，上述非冻结低温为-1℃～15℃的温度。

3.权利要求1或2所述的方法，其中，上述Good’s缓冲液为选自HEPES、PIPES和MOPS的至少一种。

4.权利要求1或2所述的方法，其中，上述Good’s缓冲液为HEPES。

5.权利要求1或2所述的方法，其中，上述培养基为不含具有细胞延寿活性的肽的培养基。

6.权利要求1或2所述的方法，其中，上述培养基为不含下述(a)和(b)中的任一种肽的培养基：

(a) 肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；

(b) 肽，该肽与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性、且具有细胞延寿活性。

7.权利要求1或2所述的方法，其中，上述血清为牛血清。

8.权利要求1或2所述的方法，其中，上述哺乳动物为牛。

9.权利要求1或2所述的方法，其中，上述胚胎为桑椹期～胚泡期的胚胎。