CN104487055A - 脂质衍生的中性纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了新型脂质、使用该化合物制备的脂质体组合物以及中和或以其他方式改性此类脂质体组合物的相关方法。本文所述的脂质可用作例如脂质体媒介物来促进囊封的多核苷酸向靶细胞的传递，以及随后此类靶细胞的转染。在某些实施方案中，包括脂质体传递媒介物的一种或多种化合物可以被中和或进一步改性，使得脂质体传递媒介物的性质被改性。

Description

脂质衍生的中性纳米颗粒
相关申请
本申请要求2012年3月29日提交的美国临时申请No.61/617,478的权益，该申请的公开内容以引用方式并入本文。
背景技术
使用脂质体传递媒介物来促进治疗剂的位点特异性传递代表了快速发展的药品传递领域；然而治疗剂高效传递至靶细胞和组织、以及随后转染这些靶细胞和组织仍具有技术上的挑战。尽管多种脂质和脂质体基传递系统在促进治疗剂向靶细胞和组织的传递中具有可利用性，但是在体内和体外应用中仍有许多挑战。例如脂质体基传递系统的突出缺点涉及脂质体的构建，其中所述的脂质体具有足够的稳定性，以及此类脂质体能够高效地将它们囊封的内容物释放至靶细胞和组织的能力。
就用于传递核酸的脂质体传递媒介物的研发而言，引入阳离子脂质作为脂质体媒介物的成分代表了重要的进步。阳离子脂质体的性质(包括例如它们的稳定性、尺寸和表面电荷)使得它们成为用于将负电荷核酸囊封并传递至靶细胞和组织的理想载体。包括此类阳离子脂质体媒介物的阳离子成分(例如阳离子脂质和/或阳离子聚合物)会促进脂质体的脂质双层与负电荷核酸之间的相互作用，并由此增加此类阳离子脂质体媒介物的囊封效率。所制备的包括阳离子脂质(例如l,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP))的脂质体部分由于它们的正的表面电荷，已经证明了高效地装载负电荷核酸的能力，并且使用阳离子脂质体媒介物可以促进浓度适当超过使用中性脂质体媒介物所取得的浓度的核酸被囊封。例如在某些情况下，阳离子脂质纳米颗粒系统可以表征为当装载负电荷核酸时，囊封效率接近100％(例如参见Li,et al.Pharm Res.,2007,24:438-449)。
但是，用于构建此类脂质体媒介物的许多阳离子脂质通常是有毒的，因此特别在传递治疗有效量的囊封内容物(例如核酸)所需的量方面，可以限定使用。进一步限定电荷脂质体系统的使用，则在将它们给予受试对象后，此类电荷系统可以快速地由系统性的循环中清除，由此限制了它们在靶细胞和组织中的分布和累积。为了克服与阳离子脂质体媒介物的使用相关的技术挑战，已经使用了多成分脂质体传递系统。具体而言，使用可电离的脂质来制备脂质体媒介物已经用作响应于脂质体所暴露的环境pH(例如生理pH)的变化来调控脂质体电荷的手段。因此，此类可电离的脂质容许它们表面电荷中的变化，这种变化可以被操纵，从而例如增加脂质体的囊封效率。
尽管之前所述的限制，以及脂质体基的媒介物促进囊封物质向靶细胞的传递的能力，脂质体基的媒介物是用于治疗剂的有吸引力的载体，并将该主题保持为不断研发的努力。尽管就囊封和稳定性而言，包括阳离子成分的脂质体基媒介物已经显示出有前途的结果，但是仍非常需要改善的脂质体基传递系统。
与电荷脂质体基媒介物相反，中性脂质体媒介物通常表征为具有相对改善的药代动力学性质。而且，部分由于使用中性脂质体观察到囊封的效率低，所以实施有限的研究来调查中性脂质体将治疗剂传递至靶细胞的用途。仍需要新型的脂质，该脂质引入了用于传递囊封的核酸和多核苷酸的多功能方法。特别需要保持了中性和电荷脂质体传递系统的一些有利特征的脂质纳米颗粒。
发明概述
本发明描述了新型脂质及包括此类脂质的脂质体组合物。此外，本发明公开了使用此类脂质(例如可切割的阳离子脂质)作为脂质体组合物的成分、从而有助于将一种或多种治疗剂(例如治疗多核苷酸)囊封于此类脂质体组合物中的方法。此外，本发明还公开了制备中性脂质体组合物的方法，其中所述的中性脂质体组合物可表征为具有高的囊封效率(例如相对传统的中性脂质体组合物而言)。本发明所述的新方法、脂质和组合物使用了多功能策略来促进将一种或多种治疗剂囊封于中性脂质体组合物中，以及随后使用此类脂质体组合物转染一种或多种靶细胞。
本发明公开了新型脂质及使用此类脂质来调控例如脂质体媒介物(例如脂质纳米颗粒)(其中引入了此类新型脂质)的性质(例如表明电荷)的相关方法。例如在某些实施方案中，本发明涉及操纵脂质体媒介物(例如脂质纳米颗粒)的方法，其中所述的脂质体媒介物包括至少一种具有可释放的极性头部基团的脂质，所述的方法包括脂质体媒介物与一种或多种试剂接触从而使极性头部基团由所述的至少一种脂质上释放的步骤。在一些实施方案中，在此类极性头部基团由脂质上释放时，剩余脂质体媒介物的表面电荷被改变。例如在极性头部基团由脂质上释放后，脂质体媒介物可以具有总体为中性的表面电荷(例如大约-2.5至大约+2.5mV的净表面电荷或zeta电位)。备选地，在极性头部基团由脂质上释放后，脂质体媒介物可以具有总体为负的表面电荷(例如低于大约-25mV的净表面电荷或zeta电位)。
在某些实施方案中，本发明公开的脂质通常包括极性头部基团(例如以R1基团表示)，其通过连接基团与亲脂性尾部基团(例如以R2基团表示)结合。在一些实施方案中，连接基团(或者包括功能基团，该功能基团)在暴露于一种或多种试剂或环境(例如在暴露于酸性环境或还原条件时)时容易进行化学或酶切割(例如通过还原或水解)。在一个实施方案中，本发明涉及中和或以其他方法改变脂质体组合物的方法。通常，此类脂质体组合物包括至少一种脂质，该脂质具有可释放的头部基团、尾部基团以及具有式I结构的可切割的连接基团：
其中R1为可释放的(极性)头部基团，并且选自咪唑、胍盐、亚胺、烯胺、氨基、可任选地取代的烷基氨基(例如烷基氨基，如二甲基氨基)和可任选地取代的吡啶基(例如吡啶或硝基吡啶基)；其中R2为亲脂性或非极性基团，其选自：
其中R3和R4均独立地选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20烷基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20酰基；其中x为包括功能基团的可切割的连接基团，其中所述的功能基团选自二硫化物、酯、腙、亚胺、缩醛、缩酮、cis-乌头酰基、原酸酯、酐、β-硫代丙酸酯、乙烯醚、氨基磷酸酯、GLFG、Val-Cit、GG、AA、GGGF和PVGLIG；并且其中n为0或任何正整数。
在某些实施方案中，本发明公开的方法包括以下步骤：使脂质或脂质体组合物与一种或多种试剂接触，这样极性头部基团(R1)可以由一种或多种可切割的脂质(包括脂质体组合物)上切割或以其他方式释放(例如通过还原可切割的连接基团)，由此使亲脂性R2基团保持为脂质体组合物的成分。由脂质上切割和/或释放极性R1使得剩余脂质(和脂质作为其成分的脂质体组合物)的总体电荷被改变，在某些情况下，使得脂质体组合物被中和。
在某些实施方案中，在脂质与试剂或环境(例如还原剂或酸性条件)接触时，可切割的连接基团被还原或切割，并且极性头部基团被释放。所考虑的试剂包括还原剂，例如水性溶液，包括三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、β-巯基乙醇(β-ΜΕ)、二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽和二硫赤藓醇中的一种或多种。可以根据包括脂质的可切割的连接基团的本性来选择合适的还原剂。例如易于被酶消化的、包括连接基团的脂质可以与合适的酶接触或者以其他方式暴露于合适的酶，从而促进极性头部基团由脂质上切割。例如在某些实施方案中，此类酶可以包括一种或多种选自以下的酶：碱性磷酸酶、羧基肽酶G2、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、β-葡萄糖苷酸酶、α-半乳糖苷酶、硫氧还蛋白和γ干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)。备选地，在其他的实施方案中，可切割的连接基团可以包括酯功能基团，并且相应的试剂可以包括能够容易地水解此类酯功能基团的化合物或试剂。
在一些实施方案中，脂质体组合物的性质(例如表面电荷或平均zeta电位)被改变的程度为脂质体组合物所暴露的所选还原剂和/或此类暴露过程的函数。在一些实施方案中，脂质体组合物与还原剂接触大约5分钟至大约24小时(例如至少大于1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、12分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、3小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时或更长)。例如根据本发明制备的脂质纳米颗粒在脂质纳米颗粒与一种或多种还原剂接触之前可以具有至少大约+25mv的平均zeta电位(Zave)。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒的正电荷可以促进一种或多种治疗剂特别是负电荷治疗剂(例如编码功能蛋白质或酶的治疗核酸)的囊封或装载。例如根据本发明公开的方法制备的脂质体组合物可以证明高的囊封效率(例如至少50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,87.5％,90％,92.5％,95％,97.5％,98％,99％,99.5％或更高)。类似地，根据本发明公开的方法制备的脂质体组合物可以针对囊封于此类组合物中的一种或多种治疗剂的平均浓度来表征。例如在某些实施方案中，囊封于根据本发明制备的脂质体组合物中的治疗剂的平均浓度为大约0.025μg/mL至大约250μg/mL(例如至少大约0.05μg/mL,0.1μg/mL,0.25μg/mL,0.5μg/mL,1μg/mL,2.5μg/mL,5μg/mL,10μg/mL,15μg/mL,20μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,75μg/mL,100μg/mL,150μg/mL,200μg/mL或更高)。
一旦装载有一种或多种治疗剂，脂质体组合物的物理性质则可以被进一步修改。例如根据一个或多个目的(例如靶细胞或阻止的特征)，正电荷脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒具有大于大约+20mV的Zave)的表面电荷可以减少或被中和(例如将Zave减小至不到大约+10mV)。在某些实施方案中，脂质体组合物的物理性质可以通过使脂质体组合物与包括一种或多种还原剂的水性溶液接触来调控。脂质体组合物与此类还原剂接触使得脂质的一个或多个可切割的连接基团被切割，从而使极性头部基团(R1)与脂质的亲脂性基团(R2)解离，并相应地降低剩余脂质体组合物的Zave。在某些实施方案中，在暴露于还原剂后，脂质体组合物的Zave为大约+10mV至大约-20mV(例如+10mV,+7.5mV,+5mV,+4mV,+3mV,+2.5mV,+2mV,+lmV,+0.5mV,0mV,-0.5mV,-lmV,-2mV,-2.5mV,-3mV,-4mV,-5mV,-7.5mV,-l0mV,-12.5mV,-15mV或-20mV)。在某些实施方案中，在暴露于还原剂后，脂质体组合物的Zave为大约-50mV至大约-5mV。
调控脂质体组合物的一种或多种物理性质的能力(例如降低Zave的能力)涉及包括此类组合物的构成脂质的组成，并且特别涉及包括构成脂质(其包括此类脂质体组合物)的一个或多个可切割的连接基团的存在情况。在某些实施方案中，包括脂质体组合物的一种或多种构成脂质包括可切割的二硫化物(S-S)连接基团，其通过例如以下结构表示：
其中R1为可释放的(极性)头部基团，其选自咪唑、胍盐、亚胺、烯胺、氨基、可任选地取代的烷基氨基(例如烷基氨基，如二甲基氨基)和可任选地取代的吡啶或吡啶基(例如吡啶或硝基吡啶基)；其中R2为尾部基团，其选自：
其中R3和R4均独立地选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20烷基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20酰基；并且其中n为0或任何正整数。
在脂质(或包括此类脂质的脂质体组合物)与一种或多种试剂(例如水性溶液，其包括至少一种能够还原性地切割二硫化物连接基团的试剂)接触时，二硫化物连接基团由脂质上切割下来，并释放由以下结构所表示的极性基团：
其中R1为可释放的头部基团，其选自咪唑、胍盐、亚胺、烯胺、氨基、可任选地取代的烷基氨基(例如烷基氨基，如二甲基氨基)和可任选地取代的吡啶基；并且脂质(以及脂质作为一种成分的脂质体组合物)的物理性质由此被改变(例如中和)。
在某些实施方案中，在脂质(具体为包括脂质的可切割的二硫化物连接基团)暴露于一种或多种还原剂(例如β-巯基乙醇(β-ΜΕ))后，巯基(由以下结构表示)仍保持为脂质体组合物的成分：
其中R2选自：
其中R3和R4均独立地选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20烷基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20酰基。
此外，本发明还公开了进一步改变一种或多种脂质的物理和化学性质的其他手段，其中所述的一种或多种脂质已经被还原性地改变或中和。在某些实施方案中，包括脂质的剩余的巯基的硫氢基可以进一步与一种或多种其他的化合物反应，从而进一步改变还原脂质体组合物的物理和/或化学性质。因此，在某些实施方案中，在还原性地中和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的脂质成分后，覆盖在被改变的(例如中和的)脂质体组合物的外表面上的剩余的硫氢基可以进一步反应，从而引入其他的化学物质或功能基团。例如被改变的或中性脂质的剩余的巯基可以与由以下结构表示的第二试剂、结构或化合物接触或以其他方式反应：
其中R5为靶向配体，其选自肽、适体、维生素和寡核苷酸。在某些实施方案中，还原的脂质在氧化条件下与第二试剂或结构接触，这样形成二硫键，并由此进一步改变中性脂质。改变的脂质可以由以下结构表示：
其中R5选自聚合物(例如聚乙二醇)、肽、靶向配体(例如阿朴脂蛋白-B、阿朴脂蛋白-E、葡萄糖、半乳糖和/或甘露糖)、烷基(例如可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C1-C20烷基)和加帽结构；其中n为0或任何正整数；并且其中R2选自：
其中R3和R4均独立地选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20烷基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20酰基。
例如在某些实施方案中，改性的脂质可以由一种以下的结构来表：
其中R5选自聚合物(例如聚乙二醇)、肽、靶向配体(例如阿朴脂蛋白-B、阿朴脂蛋白-E、葡萄糖、半乳糖和/或甘露糖)、烷基(例如可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C1-C20烷基)和加帽结构；并且其中n为0或任何正整数。在其他的实施方案中，可以在合适的条件(例如氧化条件)下使改性的或中性脂质的巯基与第二试剂、结构或化合物接触或以其他方式反应，其中所述的第二试剂、结构和化合物由上文所示的结构(IX)和/或(X)中的一种或多种来表示。
在某些实施方案中，可切割的脂质与在共有的美国申请No.61/494,745(代理人案号No.:SHIR-022-001)中所公开的脂质化合物和相关方法中的一种或多种有关，该申请的公开内容以引用方式全文并入本文。例如在一些实施方案中，可切割的脂质为化合物5-(((10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-lH-环戊[a]菲-3-基)二硫基)甲基)-lH-咪唑，其具有式XI的结构(在本发明中称为“HGT4001”)。
在一些实施方案中，可切割的脂质为化合物l-(2-(((3S,10R,13R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-lH-环戊[a]菲-3-基)二硫基)乙基)胍，其具有式XII的结构(在本发明中称为“HGT4002”)。
在一些实施方案中，可切割的脂质为化合物2-((2,3-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-l-基氧基)丙基)二硫基)-N,N-二甲基乙胺，其具有式XIII的结构(在本发明中称为“HGT4003”)。
在其他的实施方案中，可切割的脂质为化合物5-(((2,3-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-l-基氧基)丙基)二硫基)甲基)-1H-咪唑，其具有式XIV的结构(在本发明中称为“HGT4004”)。
在其他的实施方案中，可切割的脂质为化合物1-(((2,3-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-l-基氧基)丙基)二硫基)甲基)胍，其具有式XV的结构(在本发明中称为“HGT4005”)。
本发明所述的方法、脂质和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)可以用于将一种或多种治疗剂传递至靶细胞、器官和组织(例如肝细胞)。在某些实施方案中，所考虑的治疗剂包括一种或多种治疗核酸或多核苷酸(例如DNA或RNA)。因此，本发明公开了用于调控一种或多种核酸在受试对象中的表达的方法和组合物。在某些实施方案中，此类治疗核酸包括RNA(例如mRNA、siRNA、snoRNA或microRNA)或由RNA组成。
此外，本发明公开了将一种或多种治疗剂囊封于中性脂质体组合物中的方法。此类方法通常包括以下步骤：使用一种或多种治疗剂装载脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒包括可切割的脂质HGT4002、DMG-PEG2000、胆固醇和DOPE)并使脂质体组合物与一种或多种还原剂接触，这样脂质体组合物被改性或中和。在优选的实施方案中，根据此类方法制备的脂质体组合物(例如包括一种或多种可切割的脂质、PEG改性的脂质和辅助脂质的脂质纳米颗粒)在与还原剂接触之前或以其他方式进一步改性(例如中和)之前装载有一种或多种治疗剂。
在某些实施方案中，本发明公开的脂质化合物为阳离子和/或可电离的脂质，其可以用作脂质体组合物，或者备选地用作脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的成分。在某些实施方案中，本发明公开的化合物用于富集脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)，由此赋予此类富集的脂质体组合物以改善的性质(例如囊封的多核苷酸向一种或多种靶细胞的传递得以改善和/或脂质体组合物的体内毒性降低)。因此，还考虑了包括本发明公开的一种或多种脂质的脂质体组合物，具体而言为脂质体纳米颗粒。在某些实施方案中，此类脂质体组合物包括PEG改性的脂质、非阳离子侄子和辅助脂质中的一种或多种。
在某些实施方案中，本发明所述的一种或多种脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)包括一种或多种其他的脂质。包括或以其他方式富集有本发明公开的一种或多种可切割的脂质化合物的脂质纳米颗粒可以进一步包括DOTAP(l,2-二油基-3-三甲基铵丙烷)、DODAP(1,2-二油基-3-二甲基铵丙烷)、DOTMA(l,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷)、DLinDMA、DLin-KC2-DMA、C12-200和ICE中的一种或多种。在一个实施方案中，脂质体组合物为包括HGT4001、DOPE和DMG-PEG2000的脂质纳米颗粒。在另一个实施方案中，脂质体组合物为包括HGT4003、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000的脂质纳米颗粒。
在某些实施方案中，本发明所述的一种或多种脂质体组合物可以包括一种或多种PEG改性的脂质。例如包括或以其他方式富集有本发明公开的一种或多种脂质化合物的脂质纳米颗粒可以进一步包括一种或多种EPG改性的脂质，该脂质包括长度至多为5kDa、与包括一个或多个C6-C20烷基的脂质共价连接的聚乙二醇链。
类似地，本发明公开的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)可以包括或者可以以其他方式富集有一种或多种本发明公开的脂质化合物，并且可以进一步包括一种或多种辅助脂质，其选自DSPC(1,2-二硬脂酰-锡-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰-锡-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1,2-二油基-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPE(1,2-二棕榈酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二肉豆蔻酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(2-二油酰基-锡-甘油-3-二氧磷基-(1'-rac-甘油))、DOPE(1,2-二油酰基-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DSPE(1,2-二硬脂酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DLPE(1,2-二月桂酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPS(1,2-二棕榈酰-锡-甘油-3-二氧磷基-L-丝氨酸)、神经酰胺、鞘磷脂和胆固醇。
在某些实施方案中，可切割的脂质以及包括此类脂质的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)包括一种或多种多核苷酸(例如囊封的DNA或RNA)。在其他的实施方案中，一种或多种多核苷酸包括至少一种锁核酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、16、18、20或更多的锁核酸残基或单体)。其中一种或多种囊封多核苷酸包括RNA，此类RNA可以包括例如mRNA、siRNA、snoRNA、microRNA和它们的组合。
在某些实施方案中，囊封于药物和其脂质体组合物中的多核苷酸包括编码例如功能多肽、蛋白质或酶的mRNA，并且在被一个或多个靶细胞表达(即，翻译)时，产生功能多肽产物(例如蛋白质或酶)，并且在一些情况下，被靶细胞分泌到受试对象的外周循环中。在某些实施方案中，包括(或者以其他方式装载或囊封于)本发明所述的化合物以及药物和脂质体组合物的一种或多种多核苷酸编码了被受试对象异常表达的核酸(例如多肽)。在某些实施方案中，包括所述的化合物或脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的一种或多种囊封的多核苷酸编码了功能蛋白质或酶，例如尿素循环酶(例如鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)、精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)和精氨酸酶1(ARG1))。在某些实施方案中，一种或多种囊封的多核苷酸包括mRNA，其编码了与溶酶体储存紊乱有关的酶(例如囊封的多核苷酸为编码α-半乳糖苷酶A、艾杜糖酸酯-2-硫酸酯酶、艾杜糖酸酯硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、β-葡萄糖苷酶和半乳糖脑苷脂酶中的一种或多种的mRNA)。在其中核酸包括mRNA的其他的实施方案中，此类mRNA可以编码一种或多种蛋白质或酶，例如可以是受试对象中缺陷的蛋白质或酶(例如选自红细胞生成素、人类生长激素、囊性纤维化跨膜转运调节因子(CFTR)、α-L-艾杜糖苷酸酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶、α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、葡萄糖脑苷脂酶、硫酸乙酰肝素硫酸脂酶、肝素-N-硫酸酯酶、溶酶体酸脂酶、α-葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶A和透明质酸酶)。
此外，本发明还考虑了药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)，其包括本发明公开的一种或多种脂质化合物，以及一种或多种多核苷酸(例如反义寡核苷酸)，具体为包括一种或多种化学改性的多核苷酸。例如在其中多核苷酸为mRNA的那些实施方案中，此类化学改性使mRNA更稳定，并且可以包括例如mRNA的5’或3’非翻译区的末端封闭改性。在某些实施方案中，化学改性包括将CMV即刻早基因1(IE1)的部分序列包含到mRNA的5’非翻译区。在其他的实施方案中，化学改性包括将poly A尾部包含到mRNA的3’非翻译区。此外，还考虑了将Cap1结构包含到mRNA的5’非翻译区的化学改性。在其他实施方案中，化学改性包括将编码人类生长激素(hGH)的序列包含到mRNA的3’非翻译区。
本发明所述的脂质和脂质体组合物可以配制成特异性地靶向和/或转染一种或多种靶细胞、组织和器官。在某些实施方案中，此类脂质和脂质体组合物通过一种或多种机制来促进此类靶细胞的转染(例如靶细胞的脂质双层膜的膜融合基的释放和/或质子海绵介导的破裂)。所考虑的靶细胞包括例如选自以下的一种或多种细胞：肝细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、骨细胞、干细胞、间充质细胞、神经细胞、心脏细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、β细胞、垂体细胞、滑膜衬里细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、网状细胞、白细胞、粒细胞和肿瘤细胞。
此外，还公开了治疗受试对象的疾病(例如与基因或核酸的异常表达有关的疾病)的方法，其中所述的方法包括向受试对象给予本发明所述的化合物和/或药物组合物的一种或多种。此外，还考虑了使用一种或多种多核苷酸转染一种或多种靶细胞的方法，其中所述的方法包括使一种或多种靶细胞与本发明所述的脂质或脂质体组合物接触，使得一种或多种靶细胞被囊封于其中的一种或多种多核苷酸转染。
通过参照下文的发明详述(此时再联系随后的实施例)，上文所讨论的以及本发明的许多其他特征及伴随而来的益处将被更好地理解。本发明所述的多种实施方案是互补的，并且可以与本领域的技术人员根据本发明所包含的教导而理解的方式结合或一起使用。
附图说明
图1示出了本发明的一个实施方案，其中包括可切割的二硫化物(S-S)阳离子脂质并装载有一种或多种治疗剂的脂质纳米颗粒与还原剂接触。如图1所示，在脂质纳米颗粒与还原剂接触之前，脂质纳米颗粒的表面通过可切割的脂质的可电离阳离子头部基团而带正电荷。脂质纳米颗粒与还原剂接触使得待切割的阳离子脂质的二硫键(S-S)和可切割的脂质的阳离子氨基头部基团由脂质纳米颗粒上解离。在所示的是实施方案中，使所得的脂质纳米颗粒的表面被中和。
图2示出了本发明的一个实施方案，其中包括可切割的二硫化物(S-S)阳离子脂质并装载有一种或多种治疗剂的脂质纳米颗粒与还原剂接触。中和的脂质被进一步改性，从而引入不同的功能基团或化学物质。如图2所示，在脂质纳米颗粒与还原剂接触之前，脂质纳米颗粒的表面通过可切割的脂质的可电离阳离子头部基团而带正电荷。脂质纳米颗粒与还原剂接触使得待切割的阳离子脂质的二硫键(S-S)和可切割的脂质的阳离子氨基头部基团由脂质纳米颗粒上解离。使所得的脂质纳米颗粒的表面被中和，并且如图所示，装载有硫氢基(-SH)功能基团，该基团可以进一步反应从而引入其他的功能基团或化学物质。如图2所示，中和的脂质纳米颗粒与功能R基团接触，该功能R基团能够与覆盖在脂质纳米颗粒表面上的硫氢基(-SH)功能基团反应，由此使功能R基团通过新形成的二硫键与脂质纳米颗粒表面结合。
发明详述
本发明提供了新型脂质及使用该新型脂质制备的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)。本发明公开的组合物解决了许多与传统的表面电荷中性脂质体传递系统有关的局限，例如囊封效率差，这通常与电荷中性脂质有关。在某些情况下，本文所述的发明通常涉及新型可切割的脂质(例如可切割的阳离子脂质)及使用此类脂质来促进一种或多种治疗剂(例如多核苷酸)高效地囊封于脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中的方法。
系统性给予的脂质或脂质体基组合物(例如脂质纳米颗粒)达到靶细胞、器官或组织的药代动力学性质和能力通常受到此类组合物的表面电荷的影响。例如在系统性给予受试对象之后，具有高表面电荷的脂质体组合物更可能在外周循环中与某些细胞、器官或大分子接触，并由此在此类脂质体组合物达到靶细胞或组织之前快速分泌这些组合物。结果，一些脂质体基组合物及囊封于其中的治疗剂的效力和用途可能受到很大的限制。
可以表征为相对电荷中性的脂质和脂质体基组合物(例如脂质纳米颗粒)相对它们的电荷配对物，通常证明了改善的药代动力学特征；然而，此类电荷中性的脂质体组合物通常烦恼的是它们的囊封效率较差，特别是相对于核酸或多核氨酸的囊封而言。例如中性脂质和由此类脂质制备的表面电荷中性的脂质体组合物证明了特别低的囊封效率，其相对于核酸基疗法而言，通常低于10％。本领域仍公开承认需要脂质纳米颗粒，其携带相对中性的表面电荷并证明了高的囊封效率。
本发明公开了新型的脂质、脂质体组合物和相关的使用方法，其中所述的方法证明了改善的囊封效率，所述的脂质和脂质体组合物的表面电荷可以被中和或以其他方式改性。本发明所述的脂质和相关方法因此保持了通常与电荷脂质有关的有利性质(例如高的囊封效率)，并且在某些实施方案中，可以被设计成携带相对中性的表面电荷。
通常，本发明公开的脂质包括亲水性(极性)头部基团，其通过中间体连接基团与亲脂性(非极性)基团连接。此类脂质可以用于制备适用于囊封一种或多种治疗剂(例如编码功能蛋白质或酶的多核苷酸)的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)。在某些实施方案中，包括本发明的脂质的连接基团可以通过例如使脂质暴露于还原剂或还原环境而被切割，并且亲水性头部基团被释放由此中和或以其他方式改性了脂质或脂质体组合物的表面电荷。在优选的实施方案中，本发明的脂质被配制成脂质体组合物的成分，并且该组合物的表面电荷在治疗剂被囊封于此类组合物中之后被中和或以其他方式改性。在此类组合物的表面带电荷的同时将治疗剂囊封于脂质体组合物中改善了囊封效率。
在某些实施方案中，本发明公开的方法包括以下步骤：使脂质(或者该脂质作为一种成分的脂质体组合物)与一种或多种试剂接触，使得脂质的极性头部基团(R1)可以由一种或多种可切割的脂质(包括脂质体组合物)上切割下来或者以其他方式由所述的脂质上释放(例如通过还原可切割的连接基团)，由此使亲脂性R2基团仍作为脂质纳米颗粒的成分。极性头部基团(R1)由脂质上的切割和/或释放使得剩余脂质(和脂质作为一种成分的脂质体组合物)的总电荷被改变，在某些情况下，使得脂质纳米颗粒被中和。
如本文所用，术语“中性”和“中和”是指表面电荷基本上是中性的、或者根据本发明提供的方法使得表面电荷基本上为中性的脂质，特别是脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)。例如在某些实施方案中，本发明公开的阳离子脂质可以用于制备具有正表面电荷(例如Zave为大约+30mV)并且囊封一种或多种多核苷酸的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)。可以根据本发明提供的教导来改性所述的脂质组合物，使得该组合物是相对中性的(例如Zave为大约-3.0mV至+3.0mV)。在某些实施方案中，本发明所述的中性脂质纳米颗粒可以表征为Zave为-10.0mV至+10.0mV(例如大约+10mV,+8mV,+7.5mV,+6mV,+5mV,+4mV,+3mV,+2.5mV,+2mV,+lmV,+0.5mV,+0.25mV,0mV,-0.25mV,-0.5mV,-lmV,-2mV,-2.5mV,-3mV,-4mV,-5mV,-7.5mV或-l0mV)，或者优选为大约-2.5mV至+2.5mV。备选地，在某些实施方案中，本发明所述的改性脂质纳米颗粒可以表征为Zave为-5mV至-50mV。
平均zeta电位(Zave)表明脂质体组合物群体的平均表面电荷，并且代表了此类脂质体组合物的平均电荷的量度。Zave影响了脂质体组合物的粒径、颗粒稳定性、囊封效率和药代动力学性质。在其中待囊封的治疗剂包括阴离子多核苷酸(例如编码功能酶的mRNA)的某些实施方案中，可以更有效地将此类多核苷酸囊封于引入了本发明的一种或多种阳离子脂质的脂质体组合物中。在此类实施方案中，阴离子多核苷酸与脂质体组合物的阳离子脂质双层相互作用并将阴离子多核苷酸囊封于所述的阳离子脂质双层中可以增强脂质体组合物的囊封效率。在某些实施方案在，一旦治疗被囊封，便可以根据本发明的教导改性(例如中和)脂质体组合物的表面电荷。
在某些实施方案中，本发明公开的脂质具有式I所示的结构：
其中R1表示亲水性(极性)基团，而R2表示亲脂性(非极性)基团。在某些实施方案中，R1选自咪唑、胍盐、亚胺、烯胺、氨基、可任选地取代的烷基氨基(例如烷基氨基，如二甲基氨基)和可任选地取代的吡啶基。在某些实施方案中，R2选自：
并且R3和R4均独立地选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20烷基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20酰基。在某些实施方案中，n为0或任意的正整数(例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或更多)。本发明公开的脂质通常包括可切割的连接基团，由式I中的x表示。
如本文所用，术语“烷基”是指支链或支链的C1-C40碳氢化合物(例如C6-C20碳氢化合物)，并且包括饱和的和不饱和的碳氢化合物。在某些实施方案中，烷基可以包括一种或多种环烷基和/或一种或多种杂原子，例如氧、氮或硫，并且可以可任选地被取代基取代(例如烷基、卤代、烷氧基、羟基、氨基、芳基、醚、酯或酰胺中的一种或多种)。在某些实施方案中，所考虑的烷基包括(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯。使用诸如“C6-C20”之类的名称是指具有所述范围的碳原子的烷基(例如直链或直链，并包括烯烃和烷基)。如本文所用，术语“芳基”是指环部分包括6至10个碳的芳香基(例如单环、双环和三环结构)。芳基可以可任选地通过可利用的碳原子取代，并且在某些实施方案中，可以包括一个或多个杂原子，例如氧、氮或硫。
如本文所用，短语“连接基团”是指与亲水性(极性)头部基团和亲脂性(非极性)尾部基团共价连接的有机功能部分。根据本发明的某些实施方案，连接基团可以在与一种或多种试剂接触是被切割(例如通过水解、还原或酶作用)，由此使头部基团与剩余的尾部基团解离。应该注意的是，如本文所用，本发明用于描述本发明的脂质(特别是包括此类脂质的功能基团)的术语“头部基团”和“尾部基团”为了方便起见，用于描述一种或多种功能基团相对于其他功能基团的取向。例如在某些实施方案中，亲水性头部基团(例如胍基)与可切割的连接基团(例如二硫化物基团)连接(例如通过氢键、范德华力、离子相互作用和共价键中的一种或多种)，可切割的连接基团转而与疏水性尾部基团(例如胆固醇)连接。
在某些实施方案中，包括本发明公开的脂质的至少一种功能基团或部分在本质上是疏水性的(例如包括天然形成的脂质(例如胆固醇)的疏水性尾部基团)。如本文所用，术语“疏水性”在定性术语中用于功能基团是避开水的，并且此类基团通常不是水溶性的。例如本发明公开了包括可切割的功能基团(例如二硫化物(S-S)基团)的化合物，其中所述的基团与一种或多种疏水性基团连接，其中此类疏水性基团包括一种或多种天然形成的脂质(例如胆固醇)，和/或可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20烷基，和/或可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20酰基。
在某些实施方案中，包括本发明公开的脂质的至少一种功能基团或部分在本质上是亲水性的(例如包括阳离子咪唑部分的亲水性头部基团)。如本文所用，术语“亲水性”在定性的术语中用于指功能基团是喜欢水的，并且通常此类基团是水溶性的。例如本发明公开了包括可切割的二硫化物(S-S)功能基团的化合物，其中所述的基团与一种或多种亲水性基团(例如亲水性头部基团)连接，其中此类亲水性基团包括或选自咪唑、胍盐、氨基、亚胺、烯胺、可任选地取代的烷基氨基(例如烷基氨基，如二甲基氨基)和吡啶基。在某些实施方案中，脂质的亲水性头部基团是带电荷的(例如阳离子咪唑头部基团)。在将此类带电荷的连接基团由根据本发明的教导的脂质上切割下来时，与脂质连接的亲水性头部基团由该脂质上释放，并且剩余的脂质(此类剩余的脂质作为一种成分的脂质体组合物)的性质由此被改性(例如被中和)。
在一个实施方案中，本发明涉及中和或以其他方式改性脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)使得该组合物的表面电荷被改性的方法。通常此类脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)包括至少一种脂质，其具有与连接基团连接(例如共价连接)的头部基团(例如阳离子头部基团)。在一些实施方案中，连接基团为(或者包括)易于切割(例如化学或酶法切割)的功能基团。此类切割可以再暴露于一种或多种试剂、环境或条件时被催化(例如通过还原、水解或本领域的那些技术人员已知的许多合适的机制)。极性头部基团由脂质上解离(例如在连接基团被切割时可以观察到)使得此类脂质(或者此类脂质作为一种成分的脂质体组合物)的电荷被改性。在某些实施方案中，连接基团包括酯功能基团。
在某些实施方案中，本发明公开的脂质化合物通常包括一种或多种可切割的连接基团。例如此类连接基团可以包括或有一种或多种二硫化物(S-S)功能基团组成，如下式IV中所示：
其中R1表示亲水性(极性)头部基团，而R2表示亲脂性(非极性)尾部基团。在某些实施方案中，R1选自咪唑、胍盐、亚胺、烯胺、氨基、可任选地取代的烷基氨基(例如烷基氨基，如二甲基氨基)和可任选地取代的吡啶基。在某些实施方案中，R2可以选自：
并且R3和R4均独立地选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20烷基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20酰基。在某些实施方案中，n为1(这样烷基为乙基)、2(这样烷基为甲基)、3(这样烷基为例如丙基或异丙基)、4(这样烷基为例如丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基)、5(这样烷基为例如戊烷)、6(这样烷基为例如己烷)、7(这样烷基为例如庚烷)、8(这样烷基为例如辛烷)、9(这样烷基为例如壬烷)、或10(这样烷基为例如癸烷)。
如本文对脂质或连接基团使用的那样，术语“切割”和“可切割的”通常是指题述功能基团(例如二硫化物连接基团)中或与题述功能基团相邻的原子之间一个或多个化学键(例如共价键、氢键、范德华力和/或离子相互作用中的一种或多种)断裂(例如水解、还原或氧化)，或者能够在暴露于所选的试剂或条件时断裂。例如酸不稳定的连接基团可以在暴露于酸性条件(例如pH小于大约7.0)时是可切割的。在某些实施方案中，可切割的基团为二硫化物功能基团，在具体的实施方案中，为在暴露于所选的生物条件(例如细胞内条件)时能够被切割的二硫化物基团。在某些实施方案中，可切割的基团为在暴露于所选的生物条件时能够被切割的酯功能基团。例如二硫化物功能基团可以通过酶法或水解、或者备选地在暴露于还原条件时被切割。在此类二硫化物功能基团被切割时，可以释放与其连接的一个或多个功能部分或基团(例如头部基团)。示例性的可切割的基团可以包括但不限于二硫化物基团、酯基、醚基及其任何衍生物(例如烷基和芳香酯)。在某些实施方案中，可切割的基团并非为酯基或醚基。
酶可切割的基团已经用于许多药品传递系统中，并且大部分的此类系统是前药的内容(Sherwood,R.F.Adv.Drug Del.Rev.1996,22,269-288)。在某些实施方案中，此类酶还可以用于切割本发明公开的组合物的一种或多种功能基团。在前药的内容中使用的并且还可以用于切割一种或多种功能基团的示例性酶可以包括但不限于碱性磷酸酶、羧基肽酶G2、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、β-葡萄糖苷酸酶、α-半乳糖苷酶、硫氧还蛋白和γ干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)。此外，许多酶可切割的基团涉及特异性地识别肽序列。本发明所考虑的示例性的酶可切割的序列(及它们相应的酶)包括但不限于Val-Cit dipeptide(Cathepsin B)(Toki,et al.J.Org.Chem.2002,67:1866-1872；Yoneda,et al.Bioorg.Med.Chem.Lett.2008,18:1632-1636),GFLG(Cathepsin B)(ori,et al.Bioconj.Chem.2003,14:44-50；Veronese,et al.Bioconj.Chem,2005,16:775-784),GGGF(Cathepsin B)(DeNardo,et al.Clin.Cane.Res.2003,9:3665s-3972s),PVGLIG(MMP)(Chau,et al.J.Pharm.Sci.2006,95:542-551),AAN(legumain)(Stern et al.Bioconj.Chem.2009,20:500-510)。
在某些实施方案中，可切割的基团可以为酸不稳定的功能基团。例如用于增强药品由许多药品传递系统(例如前药缀合物、聚合物缀合物、纳米颗粒和脂质基系统)上释放的、酸不稳定的功能基团可以用于本发明公开的组合物和方法中。所考虑的酸不稳定的功能基团或键可以包括例如腙部分、亚胺键、缩醛部分、缩酮部分、cis-乌头酰基系统、原酯、硫代丙酸酯、马来酐、烯胺和乙烯醚。
在某些实施方案中，可切割的基团可以用于由本发明公开的组合物上释放一种或多种试剂。例如在切割例如二硫化物功能基团时考虑使用一种或多种试剂或荷重(例如小分子、蛋白质或核酸)。
本发明所述的可切割的基团通常与一种或多种功能部分或基团(例如至少一个头部基团和至少一个尾部基团)连接(例如通过氢键、范德华力、离子相互作用和共价键中的一种或多种来连接)。在某些实施方案中，功能部分或基团中的至少一种是亲水性的(例如包括咪唑、胍盐、氨基、亚胺、烯胺、可任选地取代的烷基氨基和吡啶基中的一种或多种的亲水性头部基团)。在其中本发明的脂质组合物被引入到脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中的某些实施方案中，连接基团的切割使得亲水性头部基团由脂质上解离，而亲脂性尾部基团仍保留作为脂质体组合物的固定成分。例如图1所示，在可切割的二硫化物(S-S)阳离子脂质与还原剂接触时，二硫键(S-S)被切割，并且可切割的脂质的阳离子氨基头部基团由脂质纳米颗粒上解离，而亲脂性尾部基团仍作为脂质体媒介物的成分。在所描绘的实施方案中，二硫化物连接基团的切割使得所得的脂质纳米颗粒的表面被中和。
本发明考虑通过将所述的连接基团与一种或多种合适的试剂接触来切割连接基团。如本文所用，术语“试剂”是指一种或多种试剂、化合物或条件，本发明的脂质可以与这些情况接触和/或相互作用(或者施加这些情况)，从而催化或以其他方式诱导一种或多种连接基团的切割。在某些实施方案中，所述的试剂为在氧化还原反应中能够提供电子的还原剂。所考虑的试剂包括还原剂，例如包括三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、β-巯基乙醇(β-ΜΕ)、二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽和二硫赤藓醇中的一种或多种的水性溶液。备选地，在其他的实施方案中，所述的试剂可以为在氧化还原反应中能够接受电子的氧化剂。在其他的实施方案中，所述的试剂可以包括能够酶切连接基团的一种或多种酶。优选地，合适试剂(例如还原剂)的选择是基于包括脂质的可切割的连接基团的本性，并且在本领域的任一技术人员的范围内。例如包括连接基团(易于酶消化)的脂质可以与合适的酶接触或者以其他方式暴露于合适的酶，从而有助于连接基团的切割及极性头部基团由脂质上的释放。备选地，在其他的实施方案中，可切割的连接基团可以包括酯功能基团，并且相应的试剂可以包括能够容易地水解此类酯功能基团的化合物或试剂。在其他的实施方案中，可切割的连接基团可以包括在暴露于酸性条件时可切割的酸不稳定的基团。
在某些实施方案中，连接基团可以在脂质与合适的试剂(例如包括还原剂β-巯基乙醇(β-ΜΕ)的水性溶液)接触时在体外被切割。例如包括本发明的一种或多种可切割的脂质的脂质纳米颗粒可以在装载一种或多种治疗剂(例如编码功能蛋白质或酶的多核苷酸)之后迅速与还原剂接触，从而中和脂质纳米颗粒。备选地，包括一种或多种可切割的脂质的脂质纳米颗粒在给予受试对象之前立即与还原剂接触。由于携带高表面电荷(例如Zave高于大约+30mV且低于大约-30mV)的脂质纳米颗粒的表面电荷起到抵制相似的带电荷颗粒的作用，所以该颗粒通常被认为是更稳定的，从而减小了相似的带电荷颗粒聚集在一起的可能性。通过延迟脂质纳米颗粒的中和使得表面中和在将脂质纳米颗粒给予受试对象之前即刻发生(例如在不到6周、4周、3周、2周、1周，或者不到72小时、48小时、24小时、18小时、12小时、9小时、6小时、3小时、2小时、1小时、30分钟、15分钟、10分钟、5分钟、1分钟或更短)，脂质纳米颗粒的稳定性可以被保持或者以其他方式被延长。类似地，在某些实施方案中，可以在例如暴露于体循环中存在的循环酶或条件并由此使得脂质组合物的表面电荷被改性或中和时，在体内诱导连接基团的切割。例如可以制备使用本发明公开的一种或多种脂质(例如阳离子脂质HGT4002)制备的脂质纳米颗粒，并使其装载有效量的治疗剂，然后在正的表面电荷下给予受试对象，在将所述的颗粒给予受试对象后，其将在体内被中和(例如通过酶法切割易受影响的连接基团)。应该注意的是在某些实施方案中，脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的性质(例如表面电荷)被修改的程度为该脂质体组合物所暴露的所选还原剂和/或此类暴露的持续时间的函数。
尽管在本发明所述的一些实施方案中，术语“改性的”和“调控的”在与脂质体组合物的表面电荷有关时，是指脂质体组合物的中和(例如调控Zave，使得其为大约-2.5mV至+2.5mV)，但是本发明无需局限于中和。而且当术语“改性的”和“调控的”用于指脂质体组合物的表面电荷时，其在广义上是指此类脂质体组合物的物理或化学性质(例如调控脂质体组合物的净的正表面电荷，使得净的表面电荷为负电荷)。所选的试剂以及脂质体组合物暴露于此类试剂的持续时间代表了2个重要的变量，这2个变量可以由本领域的任一技术人员操纵，使得脂质体组合物的表面电荷可以被改性或调控至所需的程度(例如Zave小于大约-5mV)。因此，在某些实施方案中，使脂质纳米颗粒与所选的还原剂接触所选的足以取得所需结果(例如表面电荷减少至少大约1-99％)的持续时间。在某些实施方案中，脂质体组合物可以与所选的试剂接触大约5分钟至大约72小时或更长(例如至少大约15分钟、30分钟、45分钟、1小时、3小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、24小时、48小时、72小时或更长)，从而取得一个或多个所需的成果或结果。
在某些实施方案中，在脂质体组合物暴露于所选的试剂的持续时间与随之产生的脂质体组合物的表面电荷的变化之间存在直接的关系。例如通过延长具有净的正表面电荷的脂质纳米颗粒暴露于一种或多种试剂(例如还原剂)的持续时间，此类脂质纳米颗粒随之产生的表面电荷可以被中和或减少至更高的程度(例如将平均zeta电位降低至低于大约-0.5mV,-l.0mV,-2.5mV,-5.0mV,-7.0mV,-10.0mV,-12.5mV,-15.0mV,-17.5mV,-20mV,-25mV,-30mV,-40mV,-50mV或更低)。在一些实施方案中，可以通过本发明公开的方法来调控的脂质体组合物的净表面电荷的程度还可以为包括此类脂质体组合物的脂质成分(例如一种或多种辅助脂质或PEG衍生的脂质)的性质的函数。因此，本发明提供了基于例如一种或多种所需的物理性质、靶器官或组织来控制脂质体组合物(特别是囊封了一种或多种治疗剂的脂质体组合物)的表面电荷的手段。之前所述不仅特别用于促进脂质体组合物靶向特定的细胞、组织或器官，而且在某些实施方案中还可以起到减轻与一些脂质体组合物(特别是阳离子脂质体组合物)有关的毒性。例如在一些实施方案中，减少本发明公开的脂质体组合物的表面电荷可以通过降低免疫原性或减少与补体激活有关的事件来降低与此类脂质体组合物有关的毒性。
在脂质与一种或多种试剂(例如包括至少一种试剂的水性溶液)接触时，连接基团由脂质上切割下来，并释放亲水性头部基团，从而留下亲脂性(非极性)尾部基团作为脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的成分。在其中可切割的脂质包括二硫化物(S-S)连接基团的实施方案，在暴露于还原剂(例如三(2-羧基乙基)膦(TCEP)和/或β-巯基乙醇(β-ΜΕ)的水性溶液)时，释放由以下结构所表示的亲水性头部基团：
其中R1表示亲水性头部基团(例如咪唑、胍盐、亚胺、烯胺、氨基、可任选地取代的烷基氨基和吡啶基)。类似地，在脂质(特别是包括该脂质的可切割的二硫化物连接基团)暴露于一种或多种还原剂之后，由以下结构表示的巯基仍保持为脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的固定成分：
其中R2表示尾部基团，并且选自可任选地取代的吡啶基(例如吡啶或硝基吡啶基)或以下结构的一种：
其中R3和R4均独立地选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20烷基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20酰基，并仍保持为脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的成分。如图2所示，在脂质体组合物暴露于还原剂之后，覆盖在改性的或中和的组合物的表面上的、剩余的巯基功能基团可以进一步被操纵。在图2所示的实施方案中，巯基表示可以与其他的有机化合物、聚合物、肽或配体反应从而进一步改性脂质体组合物的表面的底物。
因此，本发明还公开的组合物及进一步改性本发明的脂质和脂质体组合物从而引入其他的功能基团或化学物质的方法。因此，在某些实施方案中，在术语“改性的”用于表征已经被中和的脂质时，其还可以指此类中性脂质的进一步改性或定制。在此类实施方案中，术语“改性的”可以用于相对中性脂质来表征改性的脂质，其中改性的脂质由所述的中性脂质制备得到。例如在某些实施方案中，之前所述考虑了本发明公开的脂质的改性，使得第一极性头部基团由脂质上移除(例如在连接基团被切割时，从而产生中和的脂质)，随后被所关注的第二功能基团替代，从而产生改性的脂质。对脂质改性从而引入其他的功能基团和/或赋予其他的功能，可以用作使脂质纳米颗粒进一步靶向所关注的组织的手段。因此，本发明还提供了进一步改性一种或多种脂质的物理和化学性质的其他的手段，其中所述的脂质之前已经根据本发明被改性或中和。例如在某些实施方案中，包括脂质(其已经根据本发明的教导以还原方式中和)的剩余巯基的硫氢基可以进一步与一种或多种其他的功能基团或化合物反应，从而进一步改性脂质和/或脂质体组合物(此类脂质作为该组合物的一种成分)的物理和/或化学性质。如图2所示，在中和的或改性的脂质体组合物的表面电荷之后，覆盖在改性或中和脂质的外表面上的、剩余的硫氢基可以进一步反应，从而引入其他的化学物质或功能基团。改性的或中性脂质的剩余的巯基可以与以下结构所表示的第二试剂、结构或化合物接触或者以其他方式发生反应：
其中R5表示第二功能基团或化学物质，并且其中n为0或正整数。在某些实施方案中，第二功能基团为靶向配体，其可以用于介导脂质纳米颗粒向靶细胞、组织或器官的分布，或者鼓励此类脂质纳米颗粒在某些靶细胞或靶组织中的定位。
靶组织对靶向配体的识别会主动促进向靶细胞和组织的组织分布以及靶细胞和组织对脂质纳米颗粒和/或它们的内容物的细胞吸收。例如在某些实施方案中，脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)可以发生第二改性，使得靶向配体(包括阿朴脂蛋白-E靶向配体)与此类组合物的表面连接，从而促进或鼓励此类组合物被例如肝细胞所表达的内源低密度脂蛋白受体识别和结合。如本发明所提供的那样，所述的组合物可以包括能够增强该组合物与一种或多种靶细胞的亲和性的靶向配体。选择合适的靶向配体使得靶细胞的独特特征被利用，由此允许脂质体组合物区分靶细胞和非靶细胞。例如本发明的组合物可以携带表面标志物(例如阿朴脂蛋白-B或阿朴脂蛋白-E)，其可以选择性地增强肝细胞的识别或与肝细胞的亲和性(例如通过此类表面标志物的受体介导的识别和与此类表面标志物结合)。此外，预计使用半乳糖作为靶向配体可以使本发明的组合物定向于肝实质细胞，或者备选地预计使用包括糖残基的甘露糖作为靶向配体可以使本发明的组合物定向于肝内皮细胞(例如包括糖残基的甘露糖，其可以优选地与肝细胞中存在的无唾液酸糖蛋白受体结合)(参见Hillery AM,et al."DrugDelivery and Targeting:For Pharmacists and Pharmaceutical Scientists"(2002)Taylor&Francis,Inc.)。因此，此类靶向配体(其已经与本发明的脂质体组合物的表面缀合)的存在会促进一种或多种靶细胞和组织对此类脂质体组合物的识别和吸收。合适的靶向配体的实例包括一种或多种肽、蛋白质、适体、维生素和寡核苷酸。
在某些实施方案中，在促进二硫键形成的条件(例如氧化条件)下将还原的脂质与第二试剂、化合物或功能基团接触，并由此进一步改性中性脂质。进一步改性的脂质可以由以下结构表示：
其中R5表示新引入的第二功能基团或化学物质，R2表示亲脂性尾部基团，而n为0或正整数。新引入的第二功能基团(R5)可以选自聚合物(例如聚乙二醇)、肽、靶向配体(例如阿朴脂蛋白-B、阿朴脂蛋白-E、葡萄糖、半乳糖和/或甘露糖)、烷基(例如可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C1-C20烷基)和加帽结构。在某些实施方案中，亲脂性尾部基团(R2)选自可任选地取代的吡啶基(例如吡啶或硝基吡啶基)或以下结构的一种：
其中R3和R4均独立地选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20烷基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20酰基。因此之前所述提供了使用例如可切割的二硫化物阳离子脂质来创建中性巯基覆盖的纳米颗粒的方法。然后，此类巯基功能基团可以作为可以原样使用的底物，或者该底物可以被其他部分(聚合物(PEG)、靶向试剂或假冒结构)进一步改性。
例如在某些实施方案中，改性的脂质可以通过以下结构的一种来表示：
其中R5选自聚合物(例如聚乙二醇)、肽、靶向配体(例如阿朴脂蛋白-B、阿朴脂蛋白-E、葡萄糖、半乳糖和/或甘露糖)、烷基(例如可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C1-C20烷基)和加帽结构，并且其中n为0或任何正整数。在其他的实施方案中，可以在合适的条件(例如氧化条件)下将改性的或中性脂质的巯基与第二试剂、结构或化合物接触或以其他方式反应，其中所述的第二试剂、结构或化合物由上文所述的结构(IX)和/或(X)中的一个或多个来表示。
本发明公开的方法提供了制备中性或微小电荷的脂质的手段，其中所述的脂质证明了高的囊封效率。如本文所用，短语“囊封效率”是指相对于脂质相中存在的治疗剂的初始级份而言，被有效地囊封于脂质体基媒介物中的治疗剂的级份。在某些实施方案中，在脂质体组合物(例如证明了正表面电荷的脂质纳米颗粒)与试剂(例如还原剂)接触之前装载该脂质体组合物时，取得高的囊封效率。通过装载带电荷状态的脂质体媒介物，带相反电荷的治疗剂的囊封被促进。因此，在优选的实施方案中，脂质化合物及由其制备得到的脂质体媒介物在与试剂(例如还原剂)接触之前装载有一种或多种治疗剂。在某些实施方案中，脂质组合物及由其制备得到的脂质纳米颗粒表现出囊封效率为至少50％(例如55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,87.5％,90％,92.5％,95％,97.5％,98％,99％或更高)。
根据本发明公开的方法制备的脂质体组合物可以针对囊封于该组合物中的一种或多种治疗剂的平均浓度来表征。例如在某些实施方案中，囊封于根据本发明制备的脂质体组合物中的治疗剂的平均浓度为大约0.025μg/mL至大约250μg/mL(例如至少大约0.05μg/mL,0.1μg/mL,0.25μg/mL,0.5μg/mL,1μg/mL,2.5μg/mL,5μg/mL,l0μg/mL,15μg/mL,20μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,75μg/mL,100μg/mL,150μg/mL,200μg/mL或更高)。
在某些实施方案中，脂质及使用该脂质制备的脂质体组合物是稳定的。如本发明表征脂质体组合物所用，术语“稳定的”是指此类组合物的物理稳定性，并且同时是指该组合物在推断的预定时期和/或储存条件下适用于给予受试对象(例如在标准室温和湿度下储存至少2年)。在某些实施方案中，组合物中基本不存在沉淀、混浊和/或其他微粒物质(例如在45℃下储存至少2个月)可以表明其稳定性。在其他的实施方案中，基本不存在颗粒聚集体或集结可以表明本发明公开的脂质体组合物的稳定性。
在某些实施方案中，所述的脂质化合物，特别是本发明所述的咪唑基化合物(例如HGT4001和HGT4004)，还可以通过它们降低的毒性(特别是相对于传统的阳离子脂质而言)来表征。在一些实施方案中，本发明所述的药物和脂质体组合物包括一种或多种咪唑基阳离子脂质化合物，这样在此类药物或脂质体组合物中的其他毒性更强的阳离子脂质的相对浓度可以被减少或以其他方式消除。咪唑基化合物或脂质(例如HGT4001和/或HGT4004)在本发明所述的一种或多种药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中可以用作唯一的阳离子脂质，或者备选地可以与传统的阳离子脂质(例如LIPOFECTIN或LIPOFECTAMI E)、非阳离子脂质、PEG改性的脂质和/或辅助脂质结合。在某些实施方案中，脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)占此类药物或脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中存在的总脂质的大约1％至大约90％、大约2％至大约70％、大约5％至大约50％、大约10％至大约40％的摩尔比，或者优选地占此类药物或脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中存在的总脂质的大约20％至大约70％。
本发明所述的可切割的脂质(特别是二硫化物可切割的脂质)可以由在共有的美国申请No.61/494,745(代理人案号No.:SHIR-022-001)中公开的一种或多种化合物组成，该申请的公开内容以引用方式全文并入本文。例如在某些实施方案中，本发明涉及化合物5-(((10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-lH-环戊[a]菲-3-基)二硫基)甲基)-lH-咪唑，其具有式XI的结构(在本发明中称为“HGT4001”)。
在某些实施方案中，本发明涉及化合物l-(2-(((3S,10R,13R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-lH-环戊[a]菲-3-基)二硫基)乙基)胍，其具有式XII的结构(在本发明中称为“HGT4002”)。
在其他的实施方案中，本发明涉及化合物2-((2,3-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-l-基氧基)丙基)二硫基)-N,N-二甲基乙胺，其具有式XIII的结构(在本发明中称为“HGT4003”)。
在其他的实施方案中，本发明涉及化合物5-(((2,3-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-l-基氧基)丙基)二硫基)甲基)-1H-咪唑，其具有式XIV的结构(在本发明中称为“HGT4004”)。
在其他的实施方案中，本发明涉及化合物1-(((2,3-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-l-基氧基)丙基)二硫基)甲基)胍，其具有式XV的结构(在本发明中称为“HGT4005”)。
本发明所述的脂质化合物可以用于构建脂质体组合物，该组合物会促进或增强囊封物质(例如一种或多种治疗多核苷酸)向一种或多种靶细胞的传递和释放(例如通过渗透或与此类靶细胞的脂质膜融合)。在某些实施方案中，本发明的化合物表征为具有一种或多种性质，这些性质赋予此类化合物以相对于其他相似类别的脂质而言的优点。例如在某些实施方案中，本发明公开的脂质允许控制和裁制脂质体组合物(此类脂质作为一种成分)的物理性质。具体而言，可以根据本发明提供的教导容易地定制包括本发明公开的脂质化合物的脂质体组合物的表面电荷。例如可以使脂质体组合物的表面电荷在暴露于合适的试剂(例如还原剂，如TCEP)时呈中性。此类改性可以用作调控脂质体组合物的药代动力学性质的手段(例如通过增加循环半衰期或者通过促进此类组合物向一种或多种靶细胞、器官或组织的分布)。在某些实施方案中，本发明公开的脂质化合物以及中和的或改性的脂质体组合物表现出增强的(例如增加的)转染一种或多种靶细胞的能力。如本文所用，术语“转染”或“转移感染(trans fection)”是指将一种或多种囊封物质(例如核酸和/或多核苷酸)细胞内引入到细胞中，或者优选地引入到靶细胞中。
本发明的方法、脂质和脂质体组合物可以用于促进多种物质和治疗剂向靶细胞、器官和组织的传递。因此，本发明所述的脂质和脂质体组合物可以用于囊封任何数量的适用于细胞内传递的物质。在某些实施方案中，此类囊封的物质能够赋予细胞(此类物质被传递至其中)以治疗或诊断益处，并且可以包括任何药品、生物学和/或诊断学。所述的物质可以是有机或无机的。有机分子可以为肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、固醇、核酸(包括肽核酸)或它们的任意的组合。在某些实施方案中，本发明所述的药物和脂质体组合物可以包括或以其他方式囊封多于一种类型的物质，例如编码蛋白质、酶和/或类固醇的2种或多种不同的多核苷酸序列。在某些实施方案中，囊封的物质为一种或多种多核苷酸和核酸。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”可以交换使用，其是指遗传物质(例如DNA和RNA)，当该术语用于本发明所述的化合物和组合物(例如脂质纳米颗粒)时，其通常是指被此类化合物和组合物(例如脂质纳米颗粒)囊封的遗传物质。在一些实施方案中，所述的多核苷酸为RNA。合适的RNA包括mRNA、siRNA、miRNA、snRNA和snoRNA。此外，所考虑的多核苷酸包括大的基因间的非编码RNA(lincRNA)，其通常不编码蛋白质，但在例如免疫信号传递、干细胞生物学和疾病的发展中发挥作用(例如参见Guttman,et al.,458:223-227(2009)；and Ng,et al.,Nature Genetics 42:1035-1036(2010)，该文献的内容以引用方式并入本文)。在某些实施方案中，被本发明的脂质化合物或脂质体组合物囊封的多核苷酸包括RNA或编码蛋白质或酶的稳定的RNA(例如编码α-半乳糖苷酶A或低密度脂蛋白受体的mRNA)。本发明考虑了此类多核苷酸(具体为RNA或稳定的RNA)作为能够被靶细胞表达从而促进该靶细胞产生(在某些情况下为排泄)功能酶或蛋白质的治疗制剂的用途，例如在国际申请No.PCT/US2010/058457和2011年6月8日提交的美国临时申请No.61/494,881(代理人案号No.SHIR-025-001)中公开的那样，这些文献的教导均以引用方式全文并入本文。例如在某些实施方案中，在靶细胞表达一种或多种多核苷酸时，可以观察到生产出受试对象缺陷的功能或生物活性酶或蛋白质(例如尿素循环酶或与溶酶体储存紊乱有关的酶)。
此外，本发明还还考虑了多核苷酸或核酸的改性。如本文描述本发明所述的一种或多种多核苷酸或核酸(例如mRNA)使用的那样，术语“改性”和“改性的”在与本发明公开的多核苷酸或核酸有关时，是指一种或多种变化、改变或取代，其会改善或增强此类多核苷酸或核酸(例如mRNA)的稳定性和/或表达(例如翻译)，例如包含起启始蛋白质翻译作用的序列(例如Kozac共有序列)(Kozak,M.,核酸s Res 15(20):8125-48(1987))。在一些实施方案中，本发明的核酸经历了化学或生物学改性，使得它们更稳定。对核酸的示例性改性包括碱基的清除(例如通过删除或一个核苷酸取代另一个核苷酸)或碱基的改性，例如碱基的化学改性。如本文描述本发明的核酸或多核苷酸使用的那样，短语“化学改性”是指引入了化学物质的改性，其中所述的化学物质与在天然形成的核酸中所见的那些不同，例如共价改性，如引入了改性的核苷酸(例如核苷酸类似物或包含在此类核酸分子中不能天然发现的侧基)。例如在某些实施方案中，本发明公开的多核苷酸(例如mRNA多核苷酸)可以包括至少一个改性的或化学改性的核苷酸，其独立地选自5-甲基胞核嘧啶、异胞核嘧啶、假异胞核嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、假尿苷、2-硫脲嘧啶、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤胞核嘧啶。
此外，合适的多核苷酸改性包括密码子的一个或多个核苷酸的改变，使得密码子编码相同的氨基酸，但是比在野生型核酸中发现的密码子更稳定。例如已经证明RNA的稳定性与较高数量的胞苷(C')和/或尿苷(U')残基之间的反向关系，并且已经发现缺乏C和U残基的RNA对大部分的RNase更稳定(Heidenreich,et al.J Biol Chem 269,2131-8(1994))。在一些实施方案中，mRNA序列中的C和/或U残基的数量被减少。在另一个实施方案中，C和/或U残基的数量通过编码特定氨基酸的一个密码子取代编码相同或相关氨基酸的另一个密码子取代而减少。此外，所考虑的对被本发明的mRNA核酸的改性还包括引入假尿苷。向本发明的mRNA核酸中引入假尿苷可以增强稳定性和翻译能力，以及降低体内的免疫源性(例如参见Karikó,K.,et al.,Molecular Therapy 16(11):1833–1840(2008))。对本发明的核酸进行取代和改性可以通过本领域的人员或普通技术人员容易了解的方法来实施。
与非翻译区相比，在mRNA的编码区内，减少序列中C和U残基的数量的限制可能更多(即，不可能消除信使中存在的所有C和U残基，同时仍保留信使编码所需氨基酸序列的能力)。但是，遗传密码的简并性提供了这样的机会：允许在待减少的序列中存在的一定数量的C和/或U残基，同时保持相同的编码能力(即，根据密码子编码的氨基酸的种类，用于RNA序列的改性的多种不同的可能是可行的)。例如用于Gly的密码子可以改变为GGA或GGG，而代替GGU或GGC。
此外，术语改性还包括例如将非核苷酸键或改性的核苷酸引入到本发明的多核苷酸序列中(例如对编码功能蛋白质或酶的mRNA分子的3'和/或5'末端进行改性)。此类改性包括将碱基加入到核酸序列中(例如包含poly A尾或更长的poly A尾)，改变3'UTR或5'UTR，使核酸与试剂(例如蛋白质或互补性核酸分子)络合，以及包含改变核酸分子结构(例如其形成了二级结构)的元件。
poly A尾被认为可以稳定天然信使和合成的正义RNA。因此，在一个实施方案中，可以将长的poly A尾加入到mRNA分子中，由此使RNA更稳定。可以使用本领域公认的多种技术来加入poly A。例如可以使用poly A聚合酶将长的poly A尾加入到合成的或体外转录的RNA中(Yokoe,et al.Nature Biotechnology.1996；14:1252-1256)。此外，转录载体还可以编码长的poly A尾。此外，可以通过由PCR产物直接转录来加入poly A尾。此外，还可以使用RNA连接酶将poly A与正义RNA的3'末端连接(例如参见Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.,ed.by Sambrook,Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1991edition))。在一个实施方案中，poly A尾的长度为至少大约20,30,40,50,60,75,80,90,100,200,300,400或至少500核苷酸。在一个实施方案中，poly A尾的长度经过调解，从而控制本发明的经改性的正义mRNA分子的稳定性，并由此控制蛋白质的转录。例如由于poly A尾的长度可以影响正义mRNA分子的半衰期，所以poly A尾的长度可以经过调解，从而改变mRNA对核酸酶的抗性的水平，并由此控制在细胞中蛋白质表达的时间过程。在一个实施方案中，稳定的核酸分子足以抵抗体内降解(例如核酸酶的降解)，这样它们可以在不具有转移媒介物的条件下被传递至靶细胞。
在一个实施方案中，可以通过引入3′和/或5′非翻译(UTR)序列来改性编码蛋白质的核酸，其中所述的序列不能天然地在野生型核酸中发现。在一个实施方案中，天然地位于mRNA的侧翼并编码第二不相关蛋白质的3′和/或5′侧翼序列可以被引入到编码治疗或功能蛋白质的mRNA分子的核苷酸序列中，以便将其改性。例如由稳定的mRNA分子(例如球蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)得到的3′和/或5′序列可以被引入到正义mRNA核酸分子的3′和/或5′区域中，从而增加正义mRNA分子的稳定性。
此外，本发明还考虑了对核酸序列的改性，该改性是对核酸的3′和5′末端中的一者或二者进行的。例如本发明考虑了对核酸(例如mRNA)的3′和5′末端中的一者或二者进行改性，从而包括CMV即早1(IE1)基因的至少部分序列或其片段，由此改善了核酸酶抗性和/或改善了核酸的半衰期。除了增加mRNA核酸序列的稳定性以外，已经惊奇地发现在5′末端包含CMV即早1(IE1)基因的部分序列会增强mRNA的翻译以及功能蛋白质或酶的表达。此外，还考虑了将编码人类生长激素(hGH)的序列或其片段包含到核酸(例如mRNA)的3′和5′末端中的一者或二者中，从而进一步稳定核酸。通常，相对于未经改性的配对物，优选的改性会改善核酸的稳定性和/或药代动力学性质(例如半衰期)，并且包括例如这样的改性，进行此改性会改善此类核酸对体内核酸酶消化的抗性。
在某些实施方案中，所考虑的多核苷酸改性包括核苷酸的改变，从而引入具有2'-取代基的糖部分，或者引入可以提供增加的核酸酶抗性的桥接或锁核酸(LNA)结构。在一些实施方案中，优选的改性包括包含一种或多种LNA，例如氧基-LNA(例如β-D-氧基-LNA和α-L-氧基-LNA)、和/或氨基-LNA(例如β-D-氨基-LNA和α-L-氨基-LNA)、和/或硫代-LNA(例如β-D-硫代-LNA和α-L-硫代-LNA)、和/或ENA(例如β-D-ENA和α-L-ENA)。最优选的是β-D-氧基-LNA。
在一些实施方案中，多核苷酸改性独立地选自：2'-O-烷基-RNA单元、2'-氨基-DNA单元、2'-氟代-DNA单元、LNA单元、阿拉伯核酸(ANA)单元、2'-氟代-ANA单元、HNA单元、IΝΑ(如Christensen,et al,Nucl.Acids.Res.(2002)30:4918-4925所讨论加入核酸单元)和2'MOE单元。在一些实施方案中，上述类型的改性中，仅一种类型存在于本发明的寡核苷酸中。在一些实施方案中，多核苷酸仅包括LNA核苷酸和天然形成的核苷酸(例如RNA)，其可任选地具有一个或多个改性的核苷酸间连键，例如硫代磷酸酯。
本发明所述的多核苷酸(例如mRNA)的核苷酸单体通过连键基团而偶联在一起。合适的是，各核苷酸单体通过连键基团与3'相邻的单体连接。具有本领域普通技术的人员将理解的是在本发明的内容中，在寡核苷酸的末端的5'单体不包括5'连键基团，但是其可以包括或不包括5'末端基团。
如本文所用，短语“连键基团”和“核苷酸间连键”是指能够将2个核苷酸共价连接在一起的基团。具体且优选的实例包括磷酸酯基团和硫代磷酸酯基团。在某些实施方案中，本发明公开的多核苷酸在各核苷酸间连键处具有硫代磷酸酯核苷酸间连键。本发明的多核苷酸的核苷酸单体或其相邻的核苷酸序列通过连键基团偶联在一起。合适的是各核苷酸通过连键基团与3'相邻的核苷酸连接。合适的核苷酸间连键包括在国际申请WO2007/031091中列出的那些，例如在WO2007/031091第34页第一段中列出的核苷酸间连键。
在某些实施方案中，本发明所述的脂质化合物和脂质体组合物被配制为共混的配制物或组合物。例如在一个实施方案中，脂质体组合物包括共混的配制物，其包括含有HGT4003的第一脂质纳米颗粒和含有HGT4001的第二脂质纳米颗粒，其中第一脂质纳米颗粒与第二脂质纳米颗粒的比例为3:1。因此，本发明还提供了共混的脂质体组合物，以及用于调控多核苷酸在一种或多种靶细胞和组织中的表达的相关方法，例如在2011年6月8日提交的美国临时申请No.61/494,714(代理人案号No.SHIR-021-001)中所公开的那样，这些文献的教导均以引用方式全文并入本文。此外，还考虑了用于调控(例如增高或协同增高)一种或多种靶细胞生产和/或分泌例如一种或多种功能多肽、蛋白质或酶的方法，其中所述的功能多肽、蛋白质或酶由囊封于此类共混的脂质体组合物中的一种或多种多核苷酸(例如mRNA)所编码，其也在美国临时申请No.61/494,714(代理人案号No.SHIR-021-001)中公开。
在某些实施方案中，本发明提供的脂质和脂质体组合物能够调控在一种或多种靶细胞和组织中异常表达的核酸和多核苷酸。因此，本发明还提供了通过向受试对象给予有效量的本发明所述的脂质化合物和/或脂质体组合物来治疗受试对象的疾病的方法。在某些实施方案中，此类方法可以增强(例如增多)多核苷酸的表达，和/或增多功能多肽产物在一种或多种靶细胞和组织(例如肝细胞)中的生产和分泌。在一些实施方案中，靶细胞或组织异常表达了被本发明所述的脂质化合物或脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中的一者或多者所囊封的多核苷酸。此外，本发明还提供了增多一种或多种多核苷酸(例如mRNA)在一种或多种靶细胞、组织和器官中的表达的方法。通常，此类方法包括将靶细胞与一种或多种脂质和/或脂质体组合物相接触，其中所述的脂质和/或脂质体组合物包括或以其他方式囊封了一种或多种多核苷酸。
在某些实施方案中，本发明公开的脂质可以用作脂质体或脂质体的成分。具体而言，在某些实施方案中，本发明公开的化合物可以用作脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的脂质(例如阳离子脂质)成分。此类脂质体可以用于囊封物质及促进此类物质向一种或多种靶细胞、组织和器官的传递。如本文所用，术语“脂质体”通常是指由脂质(例如两性脂质)构成的囊泡，其中所述的脂质排布于一个或多个球形双层中。在某些实施方案中，脂质体为脂质纳米颗粒(例如包括本发明公开的一种或多种阳离子脂质化合物的脂质纳米颗粒)。此类脂质体可以是单层的或多层的囊泡，该囊泡具有由亲脂性物质形成的膜，和包括有囊封的物质(例如多核苷酸)的水性内心，其中所述的囊封的物质将被传递至一种或多种靶细胞、组织和器官。在某些实施方案中，本发明所述的药物和脂质体组合物包括一种或多种脂质纳米颗粒。所考虑的脂质体包括脂质纳米颗粒。可以用于形成特此考虑的脂质体和脂质纳米颗粒的、合适的脂质(例如阳离子脂质)的实例包括包括本发明公开的一种或多种化合物(例如HGT4001,HGT4002,HGT4003,HGT4004和/或HGT4005)。此类脂质体和脂质纳米颗粒还可以包括其他的阳离子脂质，例如C12-200、DLin-KC2-DMA、DOPE、DMG-PEG-2000、非阳离子脂质、胆固醇基脂质、辅助脂质、PEG改性的脂质、磷脂酰化合物(例如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂类、脑苷脂和神经节苷脂)、以及这些化合物的组合或混合物。
多种阳离子脂质已经在文献中有所描述，很多是市售可得的。在某些实施方案中，本发明所述的药物或脂质体组合物除了本发明公开的一种或多种化合物或脂质(例如HGT4003)以外，还包括所述的阳离子脂质。在一些实施方案中，使用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵氯化物或“DOTMA”(Felgner et al.(Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美国专利No.4,897,355)。DOTMA可以单独配制或者可以与二油酰基磷脂酰乙醇胺、“DOPE”或者其他阳离子或非阳离子脂质结合到脂质纳米颗粒中。其他合适的阳离子脂质包括例如C12-200，5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺或“DOGS”，2,3-二油基氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵或“DOSPA”(Behr et al.Proc.Nat.'l Acad.Sci.86,6982(1989)；美国专利No.5,171,678；美国专利No.5,334,761)，1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷或“DODAP”，1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷或“DOTAP”。此外，所考虑的阳离子脂质还包括1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DSDMA”，1,2-二油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DODMA”，1,2-二亚油醇基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLinDMA”，1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLenDMA”，N-二油基-N,N-二甲基铵氯化物或“DODAC”，N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基铵溴化物或“DDAB”，N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟基乙基铵溴化物或“DMRIE”，3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(cis,cis-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷或“CLinDMA”，2-[5′-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3′-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(cis,cis-9′,1-2′-十八碳二烯氧基)丙烷或“CpLinDMA”，N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄基胺或“DMOBA”，1,2-N,N′-二油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DOcarbDAP”，2,3-二亚麻酰基氧基-N,N-二甲基丙基胺或“DLinDAP”，1,2-N,N′-二亚油醇基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLincarbDAP”，1,2-二亚麻酰基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLinCDAP”，2,2-二亚油醇基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二恶茂烷或“DLin-K-DMA”，2,2-二亚油醇基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二恶茂烷或“DLin-K-XTC2-DMA”，或它们的混合物(Heyes,J.,et al.,J Controlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,DV.,et al.,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；PCT公开WO2005/121348A1)。此外，本发明还考虑了胆固醇基阳离子脂质配制所述的组合物(例如脂质纳米颗粒)的用途。此类胆固醇基阳离子脂质可以单独使用，或者与其他的阳离子或非阳离子组合使用。合适的胆固醇基阳离子脂质包括例如DC-Chol(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇)，1,4-双(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪(Gao,et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf et al.BioTechniques 23,139(1997)；美国专利No.5,744,335)。
此外，多种用于增强转染效率的试剂是市售可得的。合适的实施例包括LIPOFECTIN(DOTMA:DOPE)(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)、LIPOFECT胺(DOSPA:DOPE)(Invitrogen)、LIPOFECTAMINE2000(Invitrogen)、FUGENE、TRANSFECTAM(DOGS)和EFFECTENE。此外，还考虑了阳离子脂质，例如二烷基氨基基、咪唑基和胍盐基脂质。例如，还考虑了阳离子脂质(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊烯[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸或“ICE”的用途，如在国际申请No.PCT/US2010/058457中所公开的那样，该文献的教导以引用方式全文并入本文。
此外，还考虑了聚乙二醇(PEG)改性的二氧磷基脂质和衍生的脂质(例如衍生的神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8PEG-2000神经酰胺))在本发明所述的脂质体组合物中的用途，并将该聚乙二醇(PEG)改性的二氧磷基脂质和衍生的脂质包含在本发明所述的脂质体组合物中，优选的是，所述的聚乙二醇(PEG)改性的二氧磷基脂质和衍生的脂质与本发明公开的一种或多种化合物和脂质结合。所考虑的PEG改性的脂质包括但不限于长度至多5kDa的聚乙二醇链，其使用长度为C6-C20的烷基链与脂质共价连接。加入此类成分可以防止络合物聚集，还可以提供用于增加循环寿命及增加脂质-多核苷酸组合物向靶组织传递的手段(Klibanov et al.(1990)FEBS Letters,268(1):235–237)，或者可以选择所述的成分，从而快速地将配制物由体内换出(参见美国专利No.5,885,613)。特别有用的可交换的脂质为酰基链较短(例如C14或C18)的PEG-神经酰胺。本发明的PEG改性的二氧磷基脂质和衍生的脂质占在脂质体的脂质纳米颗粒中存在的总脂质的摩尔比可以为大约0％至大约20％、大约0.5％至大约20％、大约1％至大约15％、大约4％至大约10％、或者大约2％。
此外，本发明还考虑了非阳离子脂质在一种或多种药物或脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中的用途。此类非阳离子脂质优选地与本发明公开的一种或多种化合物和脂质组合使用。如本文所用，短语“非阳离子脂质”是指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文所用，短语“阴离子脂质”是指在所选的pH(例如生理学pH)下携带净的负电荷的多种脂质的任意一种。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、DLPE(1,2-二月桂酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPS(1,2-二棕榈酰-锡-甘油-3-二氧磷基-L-丝氨酸)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、神经酰胺、鞘磷脂、胆固醇或它们的混合物。此类非阳离子脂质可以单独使用，但优选的是与其他赋形剂(例如本发明公开的一种或多种阳离子脂质，例如HGT4001,HGT4002,HGT4003,HGT4004和/或HGT4005)组合使用。当与阳离子脂质组合使用时，非阳离子脂质占脂质纳米颗粒中所存在的总脂质的摩尔比为5％至大约90％，或者优选地大约10％至大约70％。
此外，还考虑了将聚合物包含在脂质纳米颗粒中，该脂质纳米颗粒包括本发明所述的药物或脂质体组合物。合适的聚合物可以包括例如聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚乳酸、聚乳酸-聚乙交酯共聚物、聚己酸内酯、右旋糖苷、白蛋白、凝胶、藻酸酯、胶原蛋白、壳聚糖、环式糊精和聚乙烯亚胺。此类聚合物可以单独使用，但是优选的是与其他赋形剂组合使用，所述的赋形剂例如为本发明公开的一种或多种阳离子脂质(例如HGT4001,HGT4002,HGT4003,HGT4004和/或HGT4005)。
在某些实施方案中，可以配置和改性脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)，从而促进靶细胞的转染(例如多核苷酸)。在另一个实施方案中，可以选择、制备和改性(例如中和)脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)，从而优化多核苷酸向靶细胞、组织或器官的传递。例如如果靶细胞为肝细胞，则药物和/或脂质体组合物的性质(例如大小、表面电荷和/或pH)可以优化，从而有效地将此类组合物(例如脂质纳米颗粒)传递至靶细胞或器官，降低免疫清除，和/或促进在靶器官中的保留。备选地，如果靶组织为中枢神经系统，则药物和脂质体组合物的选择和制备必须考虑血脑屏障的渗透，在血脑屏障中的保留，和/或将此类组合物(例如脂质纳米颗粒)直接传递至此类靶组织的备选手段(例如通过脑血管内或膜内给予)的用途。在某些实施方案中，本发明所述的脂质体组合物可以与促进囊封物质转移的络合物(例如破坏或改善血脑屏障的渗透性并由此增强此类囊封多核苷酸向靶细胞的转移的络合物)结合。在本发明所述的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)可以促进囊封物质(例如一种或多种多核苷酸)引入到靶细胞中的同时，将聚阳离子(例如聚L-赖氨酸和精蛋白)加入到例如包括脂质体组合物作为共聚物的一种或多种脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中还可以促进，并且在一些情况下在体外和体内会显著增强多种类型的阳离子脂质体在多种细胞系中的转染效率(2-28倍)(参见N.J.Caplen,etal.,Gene Ther.1995；2:603；S.Li,et al.,Gene Ther.1997；4,891)。
在本发明的某些实施方案中，药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)被制备成囊封了一种或多种物质或治疗剂(例如多核苷酸)。将所需的治疗剂(例如mRNA)并入到脂质体或脂质纳米颗粒中的过程在本文中称为“装载”或“囊封”(Lasic,et al.,FEBS Lett.,312:255-258,1992)。脂质纳米颗粒所装载或囊封的物质(例如多核苷酸)可以全部或部分定位于脂质纳米颗粒的内部空间，脂质纳米颗粒的双层膜上，或者与脂质纳米颗粒的外部表面有关。
将例如多核苷酸装载或囊封于脂质纳米颗粒中可以保护多核苷酸与一定的环境隔离，其中所述的环境可以包括降解此类多核苷酸的酶或化学品(例如血清)，和/或导致此类多核苷酸被快速排泄的系统或受体。因此，在一些实施方案中，本发明所述的组合物能够增强由此囊封的多核苷酸的稳定性(具体而言是对此类多核苷酸所暴露的环境)。此外，将诸如多核苷酸之类的物质囊封于本发明所述的一种或多种脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中还会促进此类多核苷酸向靶细胞和组织的传递。在某些实施方案中，本发明所述的脂质体组合物在被改性和中和之前装载有一种或多种治疗剂。
在某些实施方案中，本发明所述的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)可以通过将多种脂质成分(例如本发明公开的一种或多种脂质化合物)与一种或多种聚合物成分结合来制备。例如可以使用HGT4003、DOPE、CHOL和DMG-PEG2000来制备脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒可以由脂质以多种比例形成的其他的组合构成(包括例如HGT4001、DOPE和DMG-PEG2000)。可以基于所选的脂质的特征、预期靶细胞或组织的本性和有待被脂质纳米颗粒传递的物质或多核苷酸的特征来选择阳离子脂质、非阳离子脂质和/或PEG改性的脂质(其包括脂质纳米颗粒，以及此类脂质彼此的相对摩尔比)。其他考虑包括例如所选脂质的烷基链的饱和情况，以及所选脂质的大小、电荷、pH、pKa、融合性和毒性。
用于本发明的药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)可以通过本领域目前已知的多种技术来制备。多薄片状囊泡(MLV)可以通过传统技术来制备，例如通过将所选的脂质溶解于合适的溶剂中将该脂质沉积在合适容器或器皿的内壁上，然后蒸发溶剂或通过喷雾干燥，从而使薄膜留在器皿的内壁上。然后，可以在涡旋运动下，将水性相加入到器皿中，这使得MLV形成。然后，可以通过多薄片状囊泡(ULV)的均化作用、超声作用或挤出作用来形成单薄片状囊泡。此外，可以通过洗涤剂除去技术来形成单薄片状囊泡。
在某些实施方案中，本发明的药物和脂质体组合物包括脂质纳米颗粒，其中囊封的多核苷酸(例如mRNA)结合在脂质纳米颗粒的两个表面上，并被囊封于相同的脂质纳米颗粒中。例如在本发明的组合物的制备过程中，本发明所述的并作为脂质体组合物的成分的一种或多种脂质可以通过多核苷酸的静电相互作用而与该多核苷酸(例如mRNA)结合。
此外，在本发明所述的脂质体组合物的制备过程中，还可以通过将水溶性的载体试剂包含在水合溶液中而使其被囊封于水性内部，并且可以通过将亲脂性分子包含在脂质配制物中而将其引入到脂质双层中。在某些分子(例如阳离子或阴离子亲脂性多核苷酸)的情况下，例如可以通过在美国专利No.4,946,683中所述的方法将多核苷酸装载到配制的脂质纳米颗粒或脂质体中，其中所述的文献的公开内容以引用方式并入本文。在囊封多核苷酸之后，可以通过诸如凝胶色谱、膜渗滤或超滤对脂质纳米颗粒之类的方法对脂质纳米颗粒进行处理，从而除去未囊封的mRNA。例如如果想要由本发明所述的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的表面上除去外部结合的多核苷酸，则可以使此类脂质纳米颗粒经过二乙氨基乙基SEPHACEL柱。
有多种方法用于减小本发明公开的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的大小或对该组合物进行“分选”，并且当分选作为本发明的一部分时，通常可以使用这些方法的任一方法。挤出法为脂质体分选的一种方法(Hope,M J et al.Reduction of Liposome Size and Preparation of UnilamellarVesicles by Extrusion Techniques.In:Liposome Technology(G.Gregoriadis,Ed.)Vol.1.p 123(1993))。所述的方法由将脂质体挤出通过小孔聚碳酸酯膜或不对称的陶瓷膜组成，从而将脂质体大小减小至相对明确定义的大小的分布。通常，悬浮物一次或多处循环通过膜，直至得到所需的脂质体大小分布。脂质体可以通过孔连续变小的膜挤出，从而使得脂质体的大小逐渐减小。
本领域已知多种备选方法可用于分选脂质纳米颗粒群体。一种此类分选方法在美国专利No.4,737,323中有所描述，该文献以引用方式并入本文。通过浴式或探针式超声作用对脂质体或脂质纳米颗粒的悬浮物进行超声处理会产生大小连续减小至较小的ULV(直径小于大约0.05微米)。均化作用为另一种方法，其依赖于剪切能量，从而将大的脂质体破碎成较小的脂质体。在典型的均化作用过程中，MLV通过标准的乳化均化器再循环，直至观察到所选的脂质体大小，通常为大约0.1至0.5微米。如Bloomfield,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,10:421–450(1981)所述，可以通过准电光散射(QELS)测定脂质纳米颗粒的大小，该文献以引用方式并入本文。可以通过对所形成的脂质纳米颗粒实施超声作用来减小脂质纳米颗粒的平均直径。间歇式超声循环可以与QELS评估交替，从而指导有效的脂质体合成。
本发明所述的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的合适大小的选择必须考虑靶细胞或组织的位点，及某种程度上制备脂质纳米颗粒的用途。如本文所用，短语“靶细胞”是指本发明所述的一种或多种药物和脂质体组合物所定向或靶向的细胞。在一些实施方案中，靶细胞包括特定的组织或器官。在一些实施方案中，靶细胞缺乏所关注的蛋白质或酶。例如在需要将多核苷酸传递至肝细胞的情况下，肝细胞代表靶细胞。在一些实施方案中，本发明的药物或脂质体组合物(例如其中囊封的多核苷酸物质)以差异化的方式转染靶细胞(即，不会转染非靶细胞)。可以制备本发明的组合物和方法来优选地靶向多种靶细胞，这些细胞包括但不限于肝细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、肺泡细胞、骨细胞、干细胞、间充质细胞、神经细胞(例如脑膜、星细胞、运动神经元、背根神经节和前角运动神经元的细胞)、光感受器细胞(例如视杆和视锥)、视网膜色素上皮细胞、分泌细胞、心脏细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、β细胞、垂体细胞、滑膜衬里细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、网状细胞、白细胞、粒细胞和肿瘤细胞。
在一种或多种靶细胞被例如囊封于本发明公开的一种或多种脂质脂质体组合物中的多核苷酸转染后，可以优选地刺激由此类多核苷酸所编码的产物(例如多肽或蛋白质)的生产，并增强此类靶细胞表达多核苷酸及生产例如所关注的多肽或蛋白质的能力。例如靶细胞被囊封有mRNA的一种或多种脂质体组合物转染将会增强(即，增多)由此类mRNA所编码的蛋白质或酶的生产。
在一些实施方案中，理想的是限制多核苷酸对某些细胞或组织的转染。例如肝脏由于其在蛋白质的新陈代谢和生产中的中心作用而代表了本发明的组合物的重要靶器官，因此由于肝脏特异性基因产物的缺陷所导致的疾病(例如尿素循环紊乱)可以受益于细胞(例如肝细胞)的特异性靶向。因此，在本发明的某些实施方案中，可以利用靶组织的结构特征使本发明的药物和脂质体组合物(例如HGT4001基脂质纳米颗粒)定向分布于此类靶组织中。例如为了靶向肝细胞，可以使包括本发明所述的药物或脂质体组合物的一种或多种脂质纳米颗粒具有一定的大小或者使它们的表面电荷被改性，这样它们能够容易地渗透此类内皮细胞窗孔，而到达靶肝细胞。备选地，可以使脂质纳米颗粒具有一定的大小或者使它们的表面电荷被改性，这样脂质体的维度具有足够的直径来限制或明显地避免分布于某些细胞或组织中。例如可以使包括本发明所述的药物和脂质体组合物的脂质纳米颗粒具有一定的大小，使得它们比肝窦内膜的内皮细胞层的窗孔更小，由此限定了脂质体的脂质纳米颗粒向肝细胞的分布。在此类实施方案中，较大的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)不会容易地渗透内皮细胞窗孔，反而将被肝窦内膜的巨噬Kupffer细胞所清除。例如脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的分选因此可以提供这样的机会：进一步操纵及精确地控制囊封多核苷酸的表达在一种或多种靶细胞中增强的程度。通常，包括本发明的药物和脂质体组合物的至少一种脂质纳米颗粒的大小在大约25至250nm，优选的是小于大约250nm,175nm,150nm,125nm,100nm,75nm,50nm,25nm或10nm的范围内。
类似地，可以制备本发明的组合物，从而优选地分布于其他的靶组织、细胞或器官中，例如心脏、肺、肾、脾脏。例如可以制备本发明的脂质纳米颗粒，从而取得增强的向靶细胞和组织的传递。因此，本发明的组合物可以使其他的阳离子、非阳离子和PEG改性的脂质富集于其他的靶组织或细胞中。
在一些实施方案中，本发明所述的脂质化合物、以及药物和脂质体组合物(例如HGT4002基脂质纳米颗粒)分布于肝细胞和组织中，从而增强其中囊封的多核苷酸(例如mRNA)的传递、传染和随后被肝脏的细胞和组织(例如肝细胞)的表达，以及由此类多核苷酸所编码的多肽或蛋白质的相应生产。尽管此类组合物可以优选地分布于肝脏的细胞和组织，但是所表达的多核苷酸的治疗效果和由其编码的蛋白质的随后的生产不必局限于靶细胞和组织。例如靶向的肝细胞可以起到能够表达或生产、以及系统性或在外周上排泄功能蛋白质或酶的“储存器”或“仓库”的作用，例如在国际申请No.PCT/US2010/058457(代理人案号No.SHIR-004-WO1)和美国临时申请No.61/494,881(代理人案号No.SHIR-025-001)中所公开的那样，这些文献的教导均以引用方式全文并入本文。应该理解的是本发明公开的脂质组合物、脂质体媒介物和相关的方法可以用于靶向任何细胞和/或组织，这样这些靶向的细胞和/或组织可以起到能够表达、生产或以其他方式分泌功能蛋白质或酶的储存器或仓库的作用。例如本发明公开的组合物可以优选地靶向或分布于肺、心、肾、肝脏和/或脾脏的细胞和组织中，从而使这些细胞能够表达(例如翻译)多核苷酸(例如mRNA多核苷酸)所编码的功能蛋白质或酶，其中所述的多核苷酸被囊封于本发明公开的脂质体媒介物(例如脂质纳米颗粒)中。因此，在本发明的某些实施方案中，包括本发明所述的药物和脂质体组合物(例如HGT4005基脂质纳米颗粒)的一种或多种脂质纳米颗粒可以靶向肝细胞和/或优选地在传递时分布于肝脏的细胞和组织。在靶肝细胞被囊封于一种或多种此类脂质纳米颗粒中的多核苷酸所转染之后，此类多核苷酸表达(例如翻译)，并且功能产物(例如多肽或蛋白质)被排泄并系统性地分布，其中此类功能产物可以赋予所需的治疗作用。
囊封于本发明所述的一种或多种脂质化合物或者脂质体组合物中的多核苷酸可以被传递至和/或转染靶细胞或组织。在一些实施方案中，囊封的多核苷酸能够被表达，并且功能多肽产物被靶细胞所生产(并且在一些情况下被排泄)，由此赋予例如靶细胞或组织以有利的性质。此类囊封的多核苷酸可以编码例如激素、酶、受体、多肽、肽或其他所关注的蛋白质。在某些实施方案中，此类囊封的多核苷酸还可以编码小干扰RNA(siRNA)或反义RNA，以便调控或者以其他方式减少或消除内源核酸或基因的表达。在某些实施方案中，此类囊封的多核苷酸可以是天然的，或天然重组的，并且可以利用它们的正义或反义作用机制而赋予它们治疗活性(例如通过调控靶基因或核酸的表达)。
在一些实施方案中，囊封的多核苷酸(例如编码缺陷蛋白质的mRNA)可以可任选地包括化学或生物学改性，其例如改善了此类多核苷酸的稳定性和/或半衰期，或者其改善或以其他方式促进此类多核苷酸的翻译。
此外，本发明还考虑了通过本发明所述的脂质或脂质体组合物将一种或多种独特的多核苷酸共传递至靶细胞中，例如通过将2种独特的治疗剂或多核苷酸结合至单一的脂质纳米颗粒中。此外，还考虑了将一种或多种囊封的多核苷酸传递至一种或多种白细胞中，从而治疗单一的紊乱或缺陷，其中各种此类多核苷酸通过不同的作用机制起作用。例如本发明的药物或脂质体组合物可以包括第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述的第一多核苷酸例如被囊封于脂质纳米颗粒中，并将纠正内源蛋白质或酶的缺陷，而所述的第二多核苷酸将灭活或“敲除”功能障碍的内源多核苷酸及其蛋白质或酶产物。此类囊封的多核苷酸可以编码例如mRNA和siRNA。
尽管体外转录的多核苷酸(例如mRNA)可以被转染到靶细胞中，但是此类多核苷酸可以容易且高效地被体内细胞降解，因此使此类多核苷酸无效。此外，一些多核苷酸在体液(具体为人类血清)中是不稳定的，并且甚至可以在到达靶细胞之前被降解或消化掉。此外，在细胞中，天然mRNA可以在30分钟至几天的半衰期内衰退。因此，在某些实施方案中，本发明提供的囊封的多核苷酸，特别是本发明提供的mRNA多核苷酸，优选地保留至少一些被表达或翻译的能力，从而在一种或多种靶细胞内生产功能蛋白质或酶。
如本文所用，术语“受试对象”是指可以给予本发明的脂质、化合物或脂质体组合物、以及方法的任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长动物、啮齿动物等。通常，就人类受试对象而言，术语“受试对象”和“患者”在本文中可交换使用。
本发明所述的脂质、化合物和/或脂质体组合物调控或增强囊封的多核苷酸的表达以及多肽或蛋白质的生产的能力提供了实施体内生产用于治疗多种疾病或病理学状况的多肽和蛋白质的、新型且更有效的手段。此类脂质纳米颗粒组合物特别适用于治疗与编码蛋白质或酶的核酸异常表达有关的疾病或病理学状况。例如将诸如mRNA之类的多核苷酸成功传递至诸如肝脏之类的靶器官(特别是肝细胞)可以用于治疗或纠正定位于肝脏中的先天性代谢缺陷。因此，本发明所述的脂质、化合物、脂质体组合物和相关方法可以用于治疗多种疾病或病理学状况，特别是由于蛋白质或酶缺陷的那些疾病。被本发明所述的脂质或者脂质体组合物(例如HGT4004基脂质纳米颗粒)囊封多核苷酸可以编码功能产物(例如蛋白质、酶、多肽、肽、功能RNA和/或反义分子)，并且优选地编码需要在体内生产的产物。
本发明的脂质、脂质体组合物及相关方法可以广泛地用于传递治疗剂，例如多核苷酸，特别是mRNA，从而治疗多种紊乱。具体而言，本发明的此类化合物、组合物和相关方法适用于治疗与蛋白质和/或酶的缺陷有关的疾病或紊乱。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒囊封的多核苷酸(例如编码激素和神经传递素的mRNA)编码了功能蛋白质或酶，其被一种或多种靶细胞排泄或分泌至周围的细胞外液中。备选地，在另一个实施方案中，被本发明的脂质和/或脂质体组合物囊封的多核苷酸(例如编码了与尿素循环或溶酶体储存代谢紊乱有关的酶的mRNA)编码了保持在一种或多种靶细胞的细胞溶胶中的功能蛋白质或酶。可以使用本发明的脂质、化合物、脂质体组合物和相关方法的其他紊乱包括但不限于以下的紊乱，例如：SMN1相关的脊髓性肌萎缩(SMA)；侧索硬化(ALS)；GALT相关的半乳糖血症；囊性纤维化(CF)；SLC3A1相关的紊乱，包括胱氨酸尿症；COL4A5相关的紊乱，包括Alport综合症；半乳糖脑苷脂酶缺乏症；X连锁的肾上腺脑白质营养不良和肾上腺脊髓神经病；Friedreich共济失调；Pelizaeus-Merzbacher病；TSC1和TSC2相关的结节性脑硬化；Sanfilippo B综合症(MPS IIIB)；CTNS相关的胱氨酸储积症；FMR1相关的紊乱，包括脆性X综合症、脆性X相关的震颤/共济失调综合症和脆性X卵巢早衰综合症；Prader-Willi综合症；Fabry疾病；遗传性出血性毛细血管扩张(AT)；Niemann-Pick疾病C1型；神经元蜡样脂褐质沉积症有关的疾病，包括少年神经元蜡样脂褐质沉积症(JNCL)、少年Batten疾病、Santavuori-Haltia疾病、Jansky-Bielschowsky疾病、以及PTT-1和TPP1缺陷；EIF2B1,EIF2B2,EIF2B3,EIF2B4和EIF2B5相关的儿童共济失调伴中枢神经系统髓鞘化不良/白质消失；CACNA1A和CACNB4相关的2型周期性共济失调；MECP2相关的紊乱，包括Classic Rett综合症；MECP2相关的重度新生儿脑病和PPM-X综合症；CDKL5相关的非典型Rett综合症；Kennedy疾病(SBMA)；Notch-3相关的显性遗传性脑血管病伴皮层下梗死和白质脑病(CADASIL)；SCN1A和SCN1B相关的发作性疾病；聚合酶G相关的紊乱，包括Alpers-Huttenlocher综合症、POLG相关的感觉性共济失调神经病变、构音障碍和、ophthalmoparesis和常染色体显性和隐性进行性眼外肌麻痹伴线粒体DNA缺失；X连锁的肾上腺发育不全；X连锁的无丙种球蛋白血症；和Wilson病。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸，特别是mRNA，可以编码功能蛋白质或酶。例如本发明的组合物可以包括编码鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)、精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)或精氨酸酶1(ARG1)、囊性纤维化跨膜转运调节因子(CFTR)、酸性α葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、α-半乳糖苷酶A、红细胞生成素、α1-抗胰蛋白酶、羧肽酶N、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖酸酯-2-硫酸酯酶、艾杜糖酸酯硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶、α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、葡萄糖脑苷脂酶、硫酸乙酰肝素硫酸脂酶、肝素-N-硫酸酯酶、溶酶体酸脂酶、透明质酸酶、半乳糖脑苷脂酶、人类生长激素、存活运动神经元、因子VIII、因子IX和低密度脂蛋白受体的mRNA。
在一个实施方案中，mRNA编码选自以下的蛋白质或酶：人类生长激素、红细胞生成素、α1-抗胰蛋白酶、酸性α葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、羧肽酶N、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖酸酯-2-硫酸酯酶、艾杜糖酸酯硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶、α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、葡萄糖脑苷脂酶、硫酸乙酰肝素硫酸脂酶、肝素-N-硫酸酯酶、溶酶体酸脂酶、透明质酸酶、半乳糖脑苷脂酶、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)、精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)、精氨酸酶1(ARG1)、囊性纤维化跨膜转运调节因子(CFTR)、存活运动神经元(SMN)、因子VIII、因子IX和低密度脂蛋白受体(LDLR)。
可以将本发明所述的脂质、化合物和脂质体组合物给予受试对象。在一些实施方案中，所述的组合物与一种或多种其他的多核苷酸、载体、靶向配体、稳定剂或其他合适的赋形剂组合配制。用于配制和给予药品的技术可以在“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,latest edition中找到。
本发明的脂质和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)可以根据当前的医疗实践给予和制定一剂的剂量，其中所述的医疗实践考虑了受试对象的临床状况、囊封物质的本性、给予的位点和方法、给予的时间安排、受试对象的年龄、性别、体重和与本领域普通技术人员的门诊医生有关的其他因素。用于本发明目的的“有效量”可以通过此类相关的考虑来确定，所述的相关考虑是试验性临床研究、药理学、临床和医药领域中那些普通技术人员已知的。在一些实施方案中，给予的量可以有效地取得症状和其他指示剂的至少一些稳定、改善或消除，其中所述的症状和指示剂被本领域的那些技术人员选作疾病进程、衰退或改善的合适的量度。例如合适的量和定量给药方案为可以使一种或多种多核苷酸在靶细胞中至少短暂地表达的量和定量给药方案。
本发明公开的脂质、化合物和脂质体组合物的合适的给予途径包括例如：口服、直肠、阴道、经粘膜或肠道给予；肠胃外传递，包括肌肉内、皮下、髓内注射；以及膜内、侧脑室、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内注射或输注。在某些实施方案中，将本发明所述的脂质、化合物或脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)给予受试对象会促进此类化合物或组合物与一种或多种靶细胞、组织或器官接触。
备选地，本发明的脂质、化合物和脂质体组合物可以以局部方式而非系统的方式给予，例如通过将脂质体组合物优选地以储存式或缓释配制物的方式直接注射或输注至靶组织中，从而进一步促进靶细胞与构成的脂质纳米颗粒的接触。可以根据待靶向的组织以多种方式提供局部传递。例如包括本发明的组合物的气溶胶可以被吸入(用于经鼻、气管或支气管传递)；例如本发明的组合物可以被注入到创伤、疾病显露或疼痛的位点；组合物可以以锭剂的形式提供用于口服、气管或食道用途；可以以液体、片剂或胶囊形式提供，以给予胃或肠；可以以栓剂形式提供，以用于直肠或阴道用途；或者甚至可以通过使用乳脂、滴剂或者甚至注射来传递至眼睛。包括本发明的脂质化合物(其与治疗分子或配体络合)的配制物甚至可以与例如聚合物或者其他结构或物质(其可以允许组合物由植入位点扩散至周围的细胞中)通过外科手术联合给予。备选地，此类组合物可以在未使用聚合物或支持物的条件下通过外科手术给予。
优选的是，本发明的脂质和脂质体组合物(例如根据本发明提供的教导中和或以其他方式改性的脂质纳米颗粒)是稳定的(例如当在冷冻条件下储存至少一年)。在某些实施方案中，可以通过冻干本发明提供的脂质和脂质体组合物来延长该组合物的稳定性。因此，本发明还考虑了包括本发明公开的一种或多种脂质化合物的冻干的脂质体组合物，及使用该冻干的组合物的相关方法，例如在2011年6月8日提交的美国临时申请No.61/494,882(代理人案号No.SHIR-023-001)所公开的那样，该文献的教导以引用方式全文并入本文。
在某些实施方案中，配制本发明的组合物，使得它们适用于延迟释放例如其中囊封的多核苷酸或核酸。此类延迟释放的组合物可以以延迟的定量给药间隔方便地给予受试对象。例如在某些实施方案中，本发明的组合物每天2次、每天或每隔一天给予受试对象。在某些实施方案中，本发明的组合物每周2次、每周1次、每10天、每2周、每3周给予受试对象，或者更优选地每4周、每个月1次、每6周、每8周、每隔1个月、每3个月、每4个月、每6个月、每8个月、每9个月或每年1次给予受试对象。此外，还考虑了组合物和脂质纳米颗粒，其被配制用于储存式给予(例如肌肉内、皮下、玻璃体内)，从而经过延迟的时间传递或释放多核苷酸(例如mRNA)。优选地，所采用的延迟释放的手段与引入到多核苷酸中的改性(例如化学改性)结合，以增强稳定性。
尽管根据某些实施方案特异地描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但是以下实施例仅用于说明本发明的化合物，并无意于限定该化合物。用于描述本发明的背景及对其实施提供额外的详细描述的、本发明所参考的公开、参考材料等均以引用方式全文并入本文。
除非清楚地作出相反的指示，如说明书和权利要求书中所用，不定冠词“a”和“an”应该被理解为包括复数的指示物。除非作出相反的指示或者以其他方式由内容中显而易见的，则如果1、多于1或者所有组中的成员存在于给定产物或过程中，在给定产物或过程中使用，或者以其他方式与给定产物或过程相关，认为在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求书或说明书是令人满意的。本发明包括多个实施方案，其中组中的确定的1个成员存在于给定产物或过程中，在给定产物或过程中使用，或者以其他方式与给定产物或过程相关。此外，本发明还包括多个实施方案，其中多于1个或者组的全部成员均存在于给定产物或过程中，在给定产物或过程中使用，或者以其他方式与给定产物或过程相关。此外，应该理解的是本发明涵盖所有的变体、组合和排列，其中除非另外指示，或者除非出现的矛盾或不一致对于本领域的一名普通技术人员是显而易见的，否则根据相同的基础权利要求(或者相关的任何其他的权利要求)，由一个或多个所列的权利要求得到的一个或多个限定、元件、原因、描述术语等被引入到另一个权利要求中。在元件被列于列表中(例如在Markush组中或相似的形式中)的条件下，应该理解的是元件的每个亚组也都被公开，并且任何元件可以由组中除去。应该理解的是，一般情况下，在本发明或本发明的方面是指包括具体的原件、特征等的条件下，本发明的某些实施方案或本发明的方面由或者基本上由此类原件、特征等组成。为了简便，这些实施方案在各种情况下均未特异地明确列出。此外，还应该理解的是，不管说明书中是否叙述了具体的排除，本发明的任何实施方案或方面都可以明确地由权利要求书中排除。用于描述本发明的背景及对其实施提供额外的详细描述的、本发明所参考的公开和其他参考材料均以引用方式并入本文。
实施例
实施例1
本实施例示出HGT4002基脂质纳米颗粒在装载mRNA多核苷酸构建体之后可以以还原方式中和。HGT4002基脂质纳米颗粒通过以下所述的标准乙醇注射方法形成(Ponsa,et al,Int.J.Pharm.(1993)95:51-56)。提前制备浓度为50mg/mL的脂质乙醇原液，并储存在-20℃下。
密码子优化的萤火虫荧光酶(CO-FFL)mRNA通过由质粒DNA模板在体外转录来合成，然后加入5'帽结构(Cap1)(Fechter,P.et al,J.Gen.Virology(2005)86:1239-1249)和通过凝胶电泳测定的长度为大约200个核苷酸的3'poly(A)尾。在各mRNA产物中存在的5'和3'非翻译区分别由SEQID NO:1的X和Y所示，如下文所示。
密码子优化的萤火虫荧光酶(FFL)mRNA：SEQ ID NO:1
XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGA
CCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCC
UUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCG
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AUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAY
X＝GGGAUCCUACC(SEQ ID NO:2)
Y＝UUUGAAUU(SEQ ID NO:3)
然后，使用加热块，通过在70℃下将0.25mg FFL mRNA加热5分钟使其变性。制备3mL体积的水性缓冲剂(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl,pH 4.5)，并通过将15mL不含RNase的圆锥管放置在热水浴中加热该管，然后向水性缓冲剂中立即加入FFL mRNA，从而得到最终浓度为0.25mg/3mL的FFL mRNA。
通过Ribogreen测试(Invitrogen)测定所有mRNA的浓度。通过在0.1％Triton-X 100存在或不存在下实施Ribogreen测试来计算囊封的mRNA。使用Malvern Zetasizer仪器，分别在1x PBS和1mM KCl溶液中测定颗粒大小(动态光散射(DLS))和zeta电位。
为了制备脂质纳米颗粒，按照下表1所示混合HGT4002、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000的50mg/mL乙醇溶液等分液，加热以确保溶解，并使用乙醇稀释。在N/P比为4下，所得的脂质溶液适用于0.25mg mRNA。
表1
脂质成分 摩尔比 MW μmol 重量(mg) 体积(μL)
DMG-PEG2000 6 2509.19 1.04 2.6 52.2
HGT4002 18 506 3.12 1.6 31.6
CHOL 20 386.65 3.47 1.3 26.8
DOPE 56 744.03 9.71 7.2 144.4
总计 100 - 17.33 12.8 255.0
将0.5mL乙醇脂质溶液快速注射到加热(70℃)的水性mRNA/缓冲溶液中，摇动并将所得的悬浮物快速返回至70℃的水浴中。将所得的纳米颗粒悬浮物浓缩，再次悬浮于硼酸钠缓冲剂(pH8.0)中，通过MUSTANGQ膜(Pall Life Sciences)，使用1x PBS(pH7.4)过滤和渗滤，并进一步浓缩。所得脂质纳米颗粒的Zave为159.4nm(Dv(50)＝147nm；Dv(90)＝299nm)，并且平均Zeta电位为28.0mV。脂质纳米颗粒证明囊封效率为大约82％。
然后，将脂质纳米颗粒暴露于包括还原剂β-巯基乙醇(β-ΜΕ)的水性溶液中，并估计脂质纳米颗粒的Zeta电位。脂质纳米颗粒在250μL(100X)β-ΜΕ溶液中暴露1小时使得脂质纳米颗粒的Zeta电位降低至15.8mV。脂质纳米颗粒在250μL(100X)β-ΜΕ溶液中暴露3小时使得脂质纳米颗粒的Zeta电位降低至-0.26mV。脂质纳米颗粒在25μL(10X)β-ΜΕ溶液中暴露22小时使得脂质纳米颗粒的Zeta电位降低至1.59mV。
之前所述支持了这样的结论：在暴露于还原剂时，HGT4002基脂质纳米颗粒的电荷(即，Zeta电位)可以被调控，并且在某些情况下被中和。
实施例2
本实施例示出HGT4002基脂质纳米颗粒在装载mRNA多核苷酸构建体之后可以以还原方式中和。HGT4002基脂质纳米颗粒通过以下所述的标准乙醇注射方法形成(Ponsa,et al,Int.J.Pharm.(1993)95:51-56)。提前制备浓度为50mg/mL的脂质乙醇原液，并储存在-20℃下。
密码子优化的萤火虫荧光酶(CO-FFL)mRNA通过由质粒DNA模板在体外转录来合成，然后加入5'帽结构(Cap1)(Fechter,P.et al,J.Gen.Virology(2005)86:1239-1249)和通过凝胶电泳测定的长度为大约200个核苷酸的3'poly(A)尾。在各mRNA产物中存在的5'和3'非翻译区分别由SEQID NO:1的X和Y所示，如下文所示。
密码子优化的萤火虫荧光酶(FFL)mRNA：SEQ ID NO:1
XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGA
CCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCC
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X＝GGGAUCCUACC(SEQ ID NO:2)
Y＝UUUGAAUU(SEQ ID NO:3)
然后，使用加热块，通过在70℃下将0.25mg FFL mRNA加热5分钟使其变性。制备2mL体积的水性缓冲剂(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl,pH 4.5)，并通过将不含RNase的圆锥管放置在热水浴中加热该管，然后向加热的水性缓冲剂中立即加入FFL mRNA，从而得到最终浓度为0.25mg/2mL的FFL mRNA。
通过Ribogreen测试(Invitrogen)测定所有mRNA的浓度。通过在0.1％Triton-X 100存在或不存在下实施Ribogreen测试来计算囊封的mRNA。使用Malvern Zetasizer仪器，分别在1x PBS和1mM KCl溶液中测定颗粒大小(动态光散射(DLS))和zeta电位。
为了制备脂质纳米颗粒，按照下表2所示混合HGT4002、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000的50mg/mL乙醇溶液等分液，加热以确保溶解，并使用乙醇稀释。在N/P比为4下，所得的脂质溶液适用于0.25mg mRNA。
表2
脂质成分 摩尔比 MW μmol 重量(mg) 体积(μL)
DMG-PEG2000 6 2509.19 1.04 2.6 52.2
HGT4002 18 506 3.12 1.6 31.6
CHOL 20 386.65 3.47 1.3 26.8
DOPE 56 744.03 9.71 7.2 144.4
总计 100 - 17.33 12.8 255.0
将0.5mL乙醇脂质溶液快速注射到加热(70℃)的水性mRNA/缓冲溶液中，摇动并将所得的悬浮物快速返回至70℃的水浴中。将所得的纳米颗粒悬浮物浓缩，再次悬浮于硼酸钠缓冲剂(pH8.0)中，通过MUSTANGQ膜(Pall Life Sciences)，使用1x PBS(pH7.4)过滤和渗滤，并进一步浓缩。所得脂质纳米颗粒的Zave为155.5nm(Dv(50)＝92.1nm；Dv(90)＝162nm)，并且平均Zeta电位为29.1mV。脂质纳米颗粒证明囊封效率为大约80％。
然后，将脂质纳米颗粒暴露于包括还原剂β-巯基乙醇(β-ΜΕ)的水性溶液中，并估计脂质纳米颗粒的Zeta电位。脂质纳米颗粒在25μL(10X)β-ΜΕ溶液中暴露18小时使得脂质纳米颗粒的Zeta电位降低至-3.50mV。脂质纳米颗粒在250μL(100X)β-ΜΕ溶液中暴露1小时使得脂质纳米颗粒的Zeta电位降低至14.8mV。脂质纳米颗粒在250μL(100X)β-ΜΕ溶液中暴露2个半小时使得脂质纳米颗粒的Zeta电位降低至2.85mV。脂质纳米颗粒在250μL(100X)β-ΜΕ溶液中暴露3小时使得脂质纳米颗粒的Zeta电位降低至-3.40mV。之前所述支持了这样的结论：通过将带电荷的脂质纳米颗粒暴露于还原剂，脂质纳米颗粒的电荷(即，Zeta电位)可以被调控，并且在某些情况下被中和。
实施例3
本实施例进一步示出HGT4002基脂质纳米颗粒在装载mRNA多核苷酸构建体之后可以以还原方式中和。HGT4002基脂质纳米颗粒通过以下所述的标准乙醇注射方法形成(Ponsa,et al,Int.J.Pharm.(1993)95:51-56)。提前制备浓度为50mg/mL的脂质乙醇原液，并储存在-20℃下。
密码子优化的萤火虫荧光酶(CO-FFL)mRNA通过由质粒DNA模板在体外转录来合成，然后加入5'帽结构(Cap1)(Fechter,P.et al,J.Gen.Virology(2005)86:1239-1249)和通过凝胶电泳测定的长度为大约200个核苷酸的3'poly(A)尾。在各mRNA产物中存在的5'和3'非翻译区分别由SEQID NO:1的X和Y所示，如下文所示。
密码子优化的萤火虫荧光酶(FFL)mRNA：SEQ ID NO:1
XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGA
CCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCC
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X＝GGGAUCCUACC(SEQ ID NO:2)
Y＝UUUGAAUU(SEQ ID NO:3)
然后，使用加热块，通过在70℃下将0.25mg FFL mRNA加热5分钟使其变性。制备3mL体积的水性缓冲剂(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl,pH 4.5)，并通过将不含RNase的圆锥管放置在热水浴中加热该管，然后向加热的水性缓冲剂中立即加入FFL mRNA，从而得到最终浓度为0.25mg/3mL的FFL mRNA。
通过Ribogreen测试(Invitrogen)测定所有mRNA的浓度。通过在0.1％Triton-X 100存在或不存在下实施Ribogreen测试来计算囊封的mRNA。使用Malvern Zetasizer仪器，分别在1x PBS和1mM KCl溶液中测定颗粒大小(动态光散射(DLS))和zeta电位。
为了制备脂质纳米颗粒，按照下表3所示混合HGT4002、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000的50mg/mL乙醇溶液等分液，加热以确保溶解，并使用乙醇稀释。在N/P比为4下，所得的脂质溶液适用于0.25mg mRNA。
表3
脂质成分 摩尔比 MW μmol 重量(mg) 体积(μL)
DMG-PEG2000 6 2509.19 1.04 2.6 52.2
HGT4002 18 506 3.12 1.6 31.6
CHOL 20 386.65 3.47 1.3 26.8
DOPE 56 744.03 9.71 7.2 144.4
总计 100 - 17.33 12.8 255.0
将0.5mL乙醇脂质溶液快速注射到加热(70℃)的水性mRNA/缓冲溶液中，摇动并将所得的悬浮物快速返回至70℃的水浴中。将所得的纳米颗粒悬浮物浓缩，再次悬浮于硼酸钠缓冲剂(pH8.0)中，通过MUSTANGQ膜(Pall Life Sciences)，使用1x PBS(pH7.4)过滤和渗滤，并进一步浓缩。所得脂质纳米颗粒的平均Zeta电位为25.7mV。
通过将28.7mg TCEP溶解于1mL水中来制备包括还原剂三(2-羧基乙基)膦(TCEP)的0.1M原液。然后，将脂质纳米颗粒暴露于包括TCEP的水性溶液中，并估计脂质纳米颗粒的Zeta电位。脂质纳米颗粒在19.5μL(5X)TCEP溶液中暴露5分钟使得脂质纳米颗粒的Zeta电位升高至26.1mV。脂质纳米颗粒在19.5μL(5X)TCEP溶液中暴露2小时使得脂质纳米颗粒的Zeta电位降低至14.5mV。脂质纳米颗粒在19.5μL(5X)TCEP溶液中暴露4小时使得脂质纳米颗粒的Zeta电位降低至5.65mV。TCEP溶液的浓度和暴露的持续时间可能有助于在相对短时间内观察到的zeta电位的可见的变化。
之前所述支持了这样的结论：在暴露于还原剂时，HGT4002基脂质纳米颗粒的电荷(即，Zeta电位)可以被调控，并且在某些情况下被中和。
实施例4
本实施例示出HGT4002基脂质纳米颗粒在装载mRNA多核苷酸构建体之后可以以还原方式中和。HGT4002基脂质纳米颗粒通过以下所述的标准乙醇注射方法形成(Ponsa,et al,Int.J.Pharm.(1993)95:51-56)。提前制备浓度为50mg/mL的脂质乙醇原液，并储存在-20℃下。
密码子优化的萤火虫荧光酶(CO-FFL)mRNA通过由编码基因的质粒DNA模板在体外转录来合成，然后加入5'帽结构(Cap1)(Fechter,P.etal,J.Gen.Virology(2005)86:1239-1249)和通过凝胶电泳测定的长度为大约200个核苷酸的3'poly(A)尾。在各mRNA产物中存在的5'和3'非翻译区分别由SEQ ID NO:1的X和Y所示，如下文所示。
密码子优化的萤火虫荧光酶(FFL)mRNA：SEQ ID NO:1
XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGA
CCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCC
UUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCG
GCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCG
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CGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGG
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ACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCA
CGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCU
UCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUC
ACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAA
GGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCC
GUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGAC
AAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAU
CGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGG
AGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGAC
GAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAA
GGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUG
UGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAG
AUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAY
X＝GGGAUCCUACC(SEQ ID NO:2)
Y＝UUUGAAUU(SEQ ID NO:3)
然后，使用加热块，通过在70℃下将0.25mg FFL mRNA加热5分钟使其变性。制备1mL体积的水性缓冲剂(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl,pH 4.5)，并通过将50mL不含RNase的圆锥管放置在热水浴中加热该管，然后向加热的水性缓冲溶液中立即加入变性的CO-FFL mRNA，从而得到最终浓度为1mg/1mL的FFL mRNA。
通过Ribogreen测试(Invitrogen)测定所有mRNA的浓度。通过在0.1％ Triton-X 100存在或不存在下实施Ribogreen测试来计算囊封的mRNA。使用Malvern Zetasizer仪器，分别在1x PBS和1mM KCl溶液中测定颗粒大小(动态光散射(DLS))和zeta电位。
为了制备脂质纳米颗粒，按照下表4所示混合HGT4002、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000的50mg/mL乙醇溶液等分液，加热以确保溶解，并使用乙醇稀释。在N/P比为4下，所得的脂质溶液适用于0.25mg mRNA。
表4
脂质成分 摩尔比 MW μmol 重量(mg) 体积(μL)
DMG-PEG2000 10 2509.19 2.50 6.3 125.5
HGT4002 50 506 12.50 6.3 126.5
CHOL 20 386.65 5.0 1.9 38.7
DOPE 20 744.03 5.0 3.7 74.4
总计 100 - 25.00 18.3 365.0
将3.0mL乙醇脂质溶液快速注射到加热(70℃)的水性mRNA/缓冲溶液中，摇动并将所得的悬浮物快速返回至70℃的水浴中。将所得的纳米颗粒悬浮物浓缩，再次悬浮于硼酸钠缓冲剂(pH8.0)中，通过MUSTANGQ膜(Pall Life Sciences)，使用1x PBS(pH7.4)过滤和渗滤，并进一步浓缩。所得脂质纳米颗粒的Zave为58.40nm(Dv(50)＝44.7nm；Dv(90)＝65.1nm)，并且平均Zeta电位为+7.8mV。通过在0.1％Triton-X 100存在或不存在下实施Ribogreen测试来计算囊封的mRNA。
通过将28.7mg TCEP溶解于1mL水中来制备包括还原剂三(2-羧基乙基)膦(TCEP)的0.1M原液。然后，将脂质纳米颗粒暴露于包括TCEP的水性溶液中，并估计脂质纳米颗粒的Zeta电位。脂质纳米颗粒在39μL(10X)TCEP溶液中暴露3小时使得脂质纳米颗粒的Zeta电位降低至-17.1mV。脂质纳米颗粒在19.5μL(5X)TCEP溶液中暴露1小时使得脂质纳米颗粒的Zeta电位降低至-4.15mV。之前所述支持了这样的结论：在暴露于还原剂时，HGT4002基脂质纳米颗粒的电荷(即，Zeta电位)可以被调控，并且在某些情况下被中和。
实施例5
本实施例示出HGT4002基脂质纳米颗粒在装载mRNA多核苷酸构建体之后可以以还原方式中和。HGT4002基脂质纳米颗粒通过以下所述的标准乙醇注射方法形成(Ponsa,et al,Int.J.Pharm.(1993)95:51-56)。提前制备浓度为50mg/mL的脂质乙醇原液，并储存在-20℃下。
密码子优化的萤火虫荧光酶(CO-FFL)mRNA通过由编码基因的质粒DNA模板在体外转录来合成，然后加入5'帽结构(Cap1)(Fechter,P.etal,J.Gen.Virology(2005)86:1239-1249)和通过凝胶电泳测定的长度为大约200个核苷酸的3'poly(A)尾。在各mRNA产物中存在的5'和3'非翻译区分别由SEQ ID NO:1的X和Y所示，如下文所示。
密码子优化的萤火虫荧光酶(FFL)mRNA：SEQ ID NO:1
XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGA
CCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCC
UUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCG
GCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCG
AGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCC
CCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCAC
CGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGA
UCAUACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUAC
ACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUU
CGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGG
GCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUC
GGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGG
CAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCG
AGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCC
ACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCA
CGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCU
UCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUC
ACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAA
GGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCC
GUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGAC
AAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAU
CGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGG
AGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGAC
GAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAA
GGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUG
UGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAG
AUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAY
X＝GGGAUCCUACC(SEQ ID NO:2)
Y＝UUUGAAUU(SEQ ID NO:3)
然后，使用加热块，通过在70℃下将0.25mg FFL mRNA加热5分钟使其变性。制备1mL体积的水性缓冲溶液(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl,pH 4.5)，并通过将50mL不含RNase的圆锥管放置在热水浴中加热该管，然后向加热的水性缓冲溶液中立即加入变性的CO-FFL mRNA，从而得到最终浓度为1mg/1mL的FFL mRNA。
通过Ribogreen测试(Invitrogen)测定所有mRNA的浓度。通过在0.1％Triton-X 100存在或不存在下实施Ribogreen测试来计算囊封的mRNA。使用Malvern Zetasizer仪器，分别在1x PBS和1mM KCl溶液中测定颗粒大小(动态光散射(DLS))和zeta电位。
为了制备脂质纳米颗粒，按照下表5所示混合HGT4002、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000的50mg/mL乙醇溶液等分液，加热以确保溶解，并使用乙醇稀释。在N/P比为4下，所得的脂质溶液适用于0.25mg mRNA。
表5
将3.0mL乙醇脂质溶液快速注射到加热(70℃)的水性mRNA/缓冲溶液中，摇动并将所得的悬浮物快速返回至70℃的水浴中。将所得的纳米颗粒悬浮物浓缩，再次悬浮于硼酸钠缓冲剂(pH8.0)中，通过MUSTANGQ膜(Pall Life Sciences)，使用1x PBS(pH7.4)过滤和渗滤，并进一步浓缩。所得脂质纳米颗粒的Zave为66.43nm(Dv(50)＝38.7nm；Dv(90)＝67.9nm)，并且平均Zeta电位为大约25.0mV。通过在0.1％Triton-X 100存在或不存在下实施Ribogreen测试来计算囊封的mRNA，并测定为70.79％。
通过将28.7mg TCEP溶解于1mL水中来制备包括还原剂三(2-羧基乙基)膦(TCEP)的0.1M原液。然后，将脂质纳米颗粒暴露于包括TCEP的水性溶液中，并估计脂质纳米颗粒的Zeta电位。脂质纳米颗粒在19.5μL(5X)TCEP溶液中暴露1小时使得脂质纳米颗粒的Zeta电位降低至14.9mV。之前所述支持了这样的结论：在暴露于还原剂时，HGT4002基脂质纳米颗粒的电荷(即，Zeta电位)可以被调控，并且在某些情况下被中和。

Claims (110)

1.一种中和脂质纳米颗粒的方法，其中所述的脂质纳米颗粒包括至少一种具有可释放的极性头部基团的脂质，所述的方法包括使所述的脂质纳米颗粒与一种或多种试剂接触的步骤，从而使所述的极性头部基团由所述的脂质上释放并使所述的脂质纳米颗粒由此被中和。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的脂质具有以下结构：
其中R1为所述的可释放的极性头部基团，并且选自咪唑、胍盐、亚胺、烯胺、氨基、可任选地取代的烷基氨基和可任选地取代的吡啶基；其中R2选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的烷基，可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的酰基，可任选地取代的吡啶基，
其中R3和R4均独立地选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20烷基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20酰基；并且
其中n为0或任何正整数。
3.权利要求2所述的方法，其中所述的一种或多种试剂能够以还原方式切割所述的脂质的二硫键。
4.权利要求3所述的方法，其中在以还原方式切割所述的脂质的二硫键时，由所述的脂质上释放：
并且所述的脂质由此被中和。
5.权利要求3所述的方法，其中在以还原方式切割所述的脂质的二硫键时，剩余的中性脂质具有以下结构：
6.权利要求5所述的方法，其进一步包括改性所述的剩余的中性脂质的步骤，从而形成改性的脂质；
其中所述的改性的脂质具有以下结构：
其中R5选自聚合物，肽，靶向配体，可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的烷基，及加帽结构；以及
其中n为0或任何正整数。
7.权利要求6所述的方法，其中所述的改性中性脂质的步骤包括在氧化条件下使所述的中性脂质与具有以下结构的第二化合物接触，从而形成二硫键并由此使所述的中性脂质被改性：
8.权利要求6所述的方法，其中所述的改性中性脂质的步骤包括使所述的中性脂质与具有以下结构的第二化合物接触：
其中R5选自聚合物，肽，靶向配体，可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的烷基，及加帽结构；以及
其中n为0或任何正整数。
9.权利要求6所述的方法，其中所述的改性中性脂质的步骤包括使所述的中性脂质与具有以下结构的第二化合物接触：
其中R5选自聚合物，肽，靶向配体，可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的烷基，及加帽结构；以及
其中n为0或任何正整数。
10.权利要求6所述的方法，其中R5为靶向配体，其选自肽、适体、维生素和寡核苷酸。
11.权利要求6所述的方法，其中R5为靶向配体，其选自阿朴脂蛋白-B、阿朴脂蛋白-E、葡萄糖、半乳糖和甘露糖。
12.权利要求6所述的方法，其中R5为聚乙二醇。
13.权利要求6所述的方法，其中R5为可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C1-C20烷基。
14.权利要求1所述的方法，其中所述的一种或多种试剂为还原剂。
15.权利要求14所述的方法，其中所述的还原剂选自三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、β-巯基乙醇(β-ΜΕ)、二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽、二硫赤藓醇和它们的组合。
16.权利要求15所述的方法，其中所述的还原剂为溶液形式。
17.权利要求15所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触至少大约5分钟。
18.权利要求15所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触至少大约1小时。
19.权利要求15所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触至少大约3小时。
20.权利要求15所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触至少大约24小时。
21.权利要求15所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒的zeta电位在该脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触之前为至少大约25mV，而在该脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触之后为低于大约5mV。
22.权利要求15所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒的zeta电位在该脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触之后为大约-25.0mV至大约5.0mV。
23.权利要求21所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒的zeta电位在该脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触之后为大约-5.0mV至大约5.0mV。
24.权利要求1所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒进一步包括选自PEG改性的脂质、非阳离子脂质和辅助脂质中的一种或多种化合物。
25.权利要求1所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒囊封了一种或多种治疗剂。
26.权利要求1所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒在中和该脂质纳米颗粒之前装载一种或多种治疗剂。
27.权利要求25所述的方法，其中所述的治疗剂包括一种或多种多核苷酸。
28.权利要求27所述的方法，其中所述的一种或多种多核苷酸包括mRNA。
29.权利要求28所述的方法，其中所述的mRNA包括选自锁核酸(LNA)、2'-O-烷基-RNA单元、2'-OMe-RNA单元、2'-氨基-DNA单元和2'-氟代-DNA单元中的一种或多种核苷酸改性。
30.权利要求27所述的方法，其中所述的中和的脂质纳米颗粒包括至少0.1μg囊封的多核苷酸。
31.权利要求27所述的方法，其中所述的中和的脂质纳米颗粒包括至少0.5μg囊封的多核苷酸。
32.权利要求27所述的方法，其中所述的一种或多种多核苷酸选自反义寡核苷酸、siRNA、miRNA、snRNA、snoRNA和它们的组合。
33.权利要求27所述的方法，其中所述的一种或多种多核苷酸包括一种或多种LNA。
34.权利要求27所述的方法，其中所述的一种或多种多核苷酸包括DNA。
35.权利要求27所述的方法，其中所述的一种或多种多核苷酸包括RNA。
36.权利要求35所述的方法，其中所述的RNA选自mRNA、siRNA、snoRNA、microRNA和它们的组合。
37.权利要求35所述的方法，其中所述的RNA编码了蛋白质或酶。
38.权利要求37所述的方法，其中所述的蛋白质或酶选自人类生长激素、红细胞生成素、α1-抗胰蛋白酶、酸性α葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶、羧基肽酶N、α半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖酸酯-2-硫酸酯酶、艾杜糖酸酯硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶、α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、葡萄糖脑苷脂酶、硫酸乙酰肝素硫酸脂酶、肝素-N-硫酸酯酶、溶酶体酸脂酶、透明质酸酶、半乳糖脑苷脂酶、编码鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)、精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)、精氨酸酶1(ARG1)、囊性纤维化跨膜转运调节因子(CFTR)、存活运动神经元(SMN)、因子IX、因子VIII和低密度脂蛋白受体。
39.一种根据权利要求1所述的方法制备的中性脂质纳米颗粒。
40.权利要求39所述的中性脂质纳米颗粒，其进一步包括一种或多种治疗剂。
41.一种根据权利要求9所述的方法制备的改性的脂质纳米颗粒。
42.权利要求41所述的改性的脂质纳米颗粒，其进一步包括一种或多种治疗剂。
43.一种治疗方法，其包括将权利要求40或42所述的脂质纳米颗粒给予受试对象。
44.一种将一种或多种治疗剂囊封于中性脂质纳米颗粒中的方法，该方法包括以下步骤：(a)使用所述的一种或多种治疗剂装载包括至少一种可还原的阳离子脂质的脂质纳米颗粒；以及(b)使所述的脂质纳米颗粒与一种或多种还原剂接触，使得所述的脂质纳米颗粒被中和。
45.权利要求44所述的方法，其中所述的中性脂质纳米颗粒的囊封效率为至少50％。
46.权利要求44所述的方法，其中所述的中性脂质纳米颗粒的囊封效率为至少75％。
47.权利要求44所述的方法，其中所述的中性脂质纳米颗粒的囊封效率为至少90％。
48.权利要求44所述的方法，其中所述的可还原的阳离子脂质具有以下结构：
49.权利要求44所述的方法，其中所述的可还原的阳离子脂质具有以下结构：
50.权利要求44所述的方法，其中所述的可还原的阳离子脂质具有以下结构：
51.权利要求44所述的方法，其中所述的一种或多种还原剂选自三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、β-巯基乙醇(β-ΜΕ)、二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽、硫赤藓醇和它们的组合。
52.权利要求44所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触至少大约5分钟。
53.权利要求44所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触至少大约1小时。
54.权利要求44所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触至少大约3小时。
55.权利要求44所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触至少大约24小时。
56.权利要求44所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒的zeta电位在该脂质纳米颗粒与所述的一种或多种还原剂接触之前为至少大约25mV，而在该脂质纳米颗粒与所述的一种或多种还原剂接触之后为低于大约5mV。
57.权利要求56所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒的zeta电位在该脂质纳米颗粒与所述的一种或多种还原剂接触之后为大约-25.0mV至大约5.0mV。
58.权利要求56所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒的zeta电位在该脂质纳米颗粒与所述的一种或多种还原剂接触之后为大约-10.0mV至大约5.0mV。
59.权利要求44所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒进一步包括选自PEG改性的脂质、非阳离子脂质和辅助脂质中的一种或多种化合物。
60.权利要求44所述的方法，其中所述的治疗剂包括一种或多种多核苷酸。
61.权利要求60所述的方法，其中所述的一种或多种多核苷酸选自反义寡核苷酸、siRNA、miRNA、snRNA、snoRNA和它们的组合。
62.权利要求60所述的方法，其中所述的一种或多种多核苷酸包括一种或多种LNA。
63.权利要求60所述的方法，其中所述的一种或多种多核苷酸包括DNA。
64.权利要求60所述的方法，其中所述的一种或多种多核苷酸包括RNA。
65.权利要求64所述的方法，其中所述的RNA为mRNA并且其中所述的mRNA包括选自锁核酸(LNA)、2'-O-烷基-RNA单元、2'-OMe-RNA单元、2'-氨基-DNA单元和2'-氟代-DNA单元中的一种或多种核苷酸改性。
66.权利要求64所述的方法，其中所述的RNA选自mRNA、siRNA、snoRNA、microRNA和它们的组合。
67.权利要求64所述的方法，其中所述的RNA编码了蛋白质和酶。
68.一种根据权利要求44所述的方法制备的中性脂质纳米颗粒。
69.一种治疗方法，其包括将权利要求68所述的中性脂质纳米颗粒给予受试对象。
70.一种中和脂质纳米颗粒的方法，其中所述的脂质纳米颗粒包括至少一种具有可释放的极性头部基团的脂质，所述的方法包括使所述的脂质纳米颗粒与一种或多种试剂接触的步骤，从而使所述的极性头部基团由所述的脂质上释放并使所述的脂质纳米颗粒由此被中和；其中所述的脂质具有以下结构：
其中R1为所述的可释放的极性头部基团，并且选自咪唑、胍盐、亚胺、烯胺、氨基、可任选地取代的烷基氨基和可任选地取代的吡啶基；其中R2选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的烷基，可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的酰基，可任选地取代的吡啶基，
其中R3和R4均独立地选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20烷基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和的C6-C20酰基；
其中x为可切割的连接基团，其选自二硫化物、酯、腙、亚胺、缩醛、缩酮、cis-乌头酰基、原酸酯、酐、β-硫代丙酸酯、乙烯醚、氨基磷酸酯、GLFG、Val-Cit、GG、AA、GGGF和PVGLIG；以及
其中n为0或任何正整数。
71.权利要求70所述的方法，其中所述的可切割的连接基团为二硫化物。
72.权利要求71所述的方法，其中所述的一种或多种试剂为还原剂。
73.权利要求72所述的方法，其中所述的还原剂选自三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、β-巯基乙醇(β-ΜΕ)、二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽、二硫赤藓醇和它们的组合。
74.权利要求72所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触至少大约5分钟。
75.权利要求72所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触至少大约1小时。
76.权利要求72所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触至少大约3小时。
77.权利要求72所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触至少大约24小时。
78.权利要求72所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒的zeta电位在该脂质纳米颗粒与所述的一种或多种还原剂接触之前为至少大约25mV，而在该脂质纳米颗粒与所述的一种或多种还原剂接触之后为低于大约5mV。
79.权利要求78所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒的zeta电位在该脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触之后为大约-25.0mV至大约5.0mV。
80.权利要求78所述的方法，其中所述的脂质纳米颗粒的zeta电位在该脂质纳米颗粒与所述的还原剂接触之后为大约-5.0mV至大约5.0mV。
81.权利要求71所述的方法，其中所述的一种或多种试剂为酶。
82.权利要求81所述的方法，其中所述的酶选自碱性磷酸酶、羧基肽酶G2、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、β-葡萄糖苷酸酶、a-半乳糖苷酶、硫氧还蛋白和γ干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)。
83.权利要求71所述的方法，其中所述的脂质具有以下结构：
84.权利要求71所述的方法，其中所述的脂质具有以下结构：
85.权利要求71所述的方法，其中所述的脂质具有以下结构：
86.权利要求70所述的方法，其中所述的可切割的连接基团为酯。
87.权利要求86所述的方法，其中所述的一种或多种试剂在接触所述的脂质纳米颗粒时水解所述的酯。
88.一种根据权利要求70所述的方法制备的脂质纳米颗粒。
89.权利要求88所述的脂质纳米颗粒，其中所述的脂质纳米颗粒的囊封效率为至少50％。
90.权利要求88所述的脂质纳米颗粒，其中所述的脂质纳米颗粒的囊封效率为至少75％。
91.权利要求88所述的脂质纳米颗粒，其中所述的脂质纳米颗粒的囊封效率为至少90％。
92.权利要求88所述的脂质纳米颗粒，其进一步包括一种或多种治疗剂。
93.权利要求92所述的脂质纳米颗粒，其中所述的治疗剂为mRNA。
94.权利要求92所述的脂质纳米颗粒，其中所述的脂质纳米颗粒包括至少0.1μg囊封的治疗剂。
95.权利要求92所述的脂质纳米颗粒，其中所述的脂质纳米颗粒包括至少0.5μg囊封的治疗剂。
96.权利要求93所述的脂质纳米颗粒，其中所述的mRNA包括选自锁核酸(LNA)、2'-O-烷基-RNA单元、2'-OMe-RNA单元、2'-氨基-DNA单元和2'-氟代-DNA单元中的一种或多种核苷酸改性。
97.权利要求93所述的脂质纳米颗粒，其中所述的mRNA包括一种或多种硫代磷酸酯核苷酸间连键基团。
98.权利要求93所述的脂质纳米颗粒，其中所述的mRNA包括所有硫代磷酸酯核苷酸间连键基团。
99.权利要求93所述的脂质纳米颗粒，其中所述的mRNA包括独立地选自5-甲基胞核嘧啶、异胞核嘧啶、假异胞核嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、假尿苷、2-硫脲嘧啶、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤胞核嘧啶中的至少一种改性的核苷酸。
100.一种调控脂质体媒介物的表面电荷的方法，其中所述的脂质体媒介物包括至少一种含有可释放的极性头部基团的脂质；所述的方法包括使所述的脂质体媒介物与至少一种试剂接触的步骤；其中在所述的脂质体媒介物与所述的至少一种试剂接触时，所述的极性头部基团由所述的脂质上释放，并且所述的脂质体媒介物的表面电荷由此被调控。
101.权利要求100所述的方法，其中所述的脂质体媒介物进一步包括选自PEG改性的脂质、非阳离子脂质和辅助脂质中的一种或多种化合物。
102.权利要求101所述的方法，其中所述的脂质体媒介物的净表面电荷在该脂质体媒介物与所述的至少一种试剂接触之前为至少大约+25mV，而在该脂质纳米颗粒与所述的至少一种试剂接触之后为低于大约-5.0mV。
103.权利要求101所述的方法，其中所述的脂质体媒介物为脂质纳米颗粒。
104.权利要求100所述的方法，其中所述的经调控的脂质体媒介物的净表面电荷为低于大约-25mV。
105.权利要求100所述的方法，其中所述的经调控的脂质体媒介物的净表面电荷为低于大约-50mV至大约-10mV。
106.权利要求100所述的方法，其中所述的经调控的脂质体媒介物的净表面电荷为低于大约-5.0mV至大约+5.0mV。
107.权利要求100所述的方法，其中所述的试剂为选自三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、β-巯基乙醇(β-ΜΕ)、二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽、二硫赤藓醇和它们的组合中的还原剂。
108.权利要求100所述的方法，其中所述的脂质具有以下结构：
109.权利要求100所述的方法，其中所述的脂质具有以下结构：
110.权利要求100所述的方法，其中所述的脂质具有以下结构：
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