KR20140097143A - 알데히드 데히드로게나제를 침묵시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알데히드 데히드로게나제 (ALDH) 유전자 발현을 표적으로 하는 간섭 RNA (예를 들어, dsRNA, 예컨대 siRNA)와 같은 치료 핵산을 포함하는 조성물, 하나 이상 (예를 들어, 칵테일)의 치료 핵산을 포함하는 지질 입자, 지질 입자의 제조 방법, 및 (예를 들어, 인간에서 알콜중독을 치료하기 위해) 지질 입자를 전달 및/또는 투여하는 방법을 제공한다.

Description

알데히드 데히드로게나제를 침묵시키기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR SILENCING ALDEHYDE DEHYDROGENASE}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2012년 2월 15일 출원된 미국 특허 가출원 61/599,238 및 2011년 10월 5일 출원된 미국 특허 가출원 61/543,700의 미국 특허법 35 USC §119(e) 하의 이익을 주장하며, 상기 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록에 대한 언급

본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 형태 대신에 텍스트 포맷으로 제공되고, 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 명칭은 TEKM_074_02WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 12 KB이고, 2012년 10월 4일 작성되었으며, EFS-Web을 통해 전자 제출되었다.

알콜중독은 과도한 양의 알콜 음료, 예컨대 맥주, 포도주 및 증류 주정의 음용에 대한 중독 또는 의존성이다. 알콜중독은 때때로 알콜 남용 또는 알콜 의존성으로도 언급된다.

알콜중독을 뒷받침하는 생물학적 메카니즘은 불명확하지만, 위험 인자는 스트레스, 정신 건강 문제 및 유전적 소인을 포함한다. 장기간에 걸친 알콜 남용은 알콜 소비의 중단시에 알콜 금단 증후군을 야기하는 뇌 내의 생리학적 변화를 생성한다. 알콜은 거의 모든 신체 장기를 손상시키고, 알콜중독자는 의학적 및 정신적 질환에 걸릴 위험이 있다.

알콜중독의 치료는 문제가 많고, 대개 알콜중독자가 음주를 중단하도록 하기 위한 알콜 해독을 포함한다. 벤조디아제핀과 같은 신경 활성 약물을 알콜 금단 증상을 관리하기 위해 사용할 수 있다. 금주를 유지하기 위해 정신 요법과 같은 의학적 치료 후 보호가 대체로 요구된다.

디술피람은 섭취한 알콜 (에탄올)에 대한 급성 감수성을 일으키는 약물이고, 때때로 만성 알콜중독의 치료에 사용된다. 알콜은 간에서 효소 알콜 데히드로게나제에 의해 아세트알데히드로 파괴되고, 이어서 이것은 효소 아세트알데히드 데히드로게나제에 의해 아세트산으로 전환된다. 디술피람은 효소 아세트알데히드 데히드로게나제를 차단한다. 따라서, 디술피람은 알콜을 소비한 인간의 혈액 내에서 아세트알데히드의 농도가, 디술피람의 부재 하에 동량의 알콜을 소비한 사람의 혈액 내에서 발견되는 것보다 실질적으로 더 높도록 (예를 들어, 5 내지 10배 더 높도록) 할 수 있다. 아세트알데히드는 "숙취" 증상의 주요 원인 중 하나이고, 따라서 디술피람 소비는 알콜에 대한 심각한 부정적 반응을 일으킨다. 증상은 피부 홍조, 심장 박동 증가, 숨가쁨, 오심, 구토, 욱신거리는 두통, 시각 이상, 정신 착란, 체위성 실신 및 순환계 허탈을 포함한다.

그러나, 디술피람은 환자에 의한 불량한 복약순응도 및 넓은 범위의 부작용, 예컨대 졸음, 두통 및 덜 빈번하지만 신경독성 때문에 임상적인 제한이 있다. 디술피람은 효과적이기 위해서 대체로 매일 투여되고, 따라서, 환자가 약물 복용을 중단하기가 쉽다.

따라서, 포유동물, 특히 인간에서 알콜 대사에 관련된 아세트알데히드 데히드로게나제의 활성을 억제, 감소 및/또는 제거하기 위한 조성물 및 방법이 계속 필요하다. 그러한 조성물 및 방법은 예를 들어, 알콜중독의 치료에 사용될 수 있다. 특히, 인간 대상체가 그러한 비교적 장기 작용성 ALDH 억제제를 소비한 후에 알콜 혐오 요법을 중단하기 어렵게 만들도록, 디술피람의 유효 기간보다 유의하게 더 긴 시간 (예를 들어 수주 또는 수개월) 동안 아세트알데히드 데히드로게나제의 활성을 억제, 감소 및/또는 제거하는 조성물 및 방법이 필요하다. 디술피람보다 부작용이 더 적거나 덜 심각하고, 아세트알데히드 데히드로게나제의 활성을 억제, 감소 및/또는 제거하는 조성물 및 방법이 또한 특히 필요하다.

발명의 간단한 개요

본원에서 보다 충분히 설명되는 바와 같이, 아세트알데히드 데히드로게나제는 보다 넓은 부류의 알데히드 데히드로게나제 (ALDH) 효소의 구성원이다. 인간의 간에서 아세트알데히드를 아세트산으로 전환시키는 것을 주로 담당하는 것으로 생각되는 ALDH 패밀리의 구성원은 알데히드 데히드로게나제 2 (ALDH2) 효소이지만, 다른 이소형의 ALDH, 예컨대 ALDH1도 또한 인간에서 알콜 대사에 관여한다. 본 발명의 목적은 하나 이상의 ALDH 효소, 특히 ALDH2 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다. 억제는 RNA 간섭 메카니즘을 통해 이루어진다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 아세트알데히드의 아세트산으로의 전환을 억제하거나 차단하여 알콜을 소비한 사람의 신체 내에 아세트알데히드의 양을 증가시키고, 결과적으로 신체 내에 아세트알데히드 존재와 연관된 유해 효과 (예를 들어, 두통 및 오심)를 강화함으로써 인간에서 알콜중독을 치료하기 위해 유용하다.

따라서, 본 발명은 알데히드 데히드로게나제 (ALDH) 유전자 발현을 표적으로 하는 간섭 RNA (예를 들어, dsRNA, 예컨대 siRNA)와 같은 치료 핵산을 포함하는 조성물, 하나 이상 (예를 들어, 칵테일 (cocktail))의 치료 핵산을 포함하는 지질 입자, 지질 입자의 제조 방법, 및 (예를 들어, 알콜중독을 치료하기 위해) 지질 입자를 전달 및/또는 투여하는 방법을 제공한다.

보다 특히, 본 발명은 ALDH 유전자 발현을 억제하거나 침묵시키는 비변형된 및 화학적으로 변형된 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 하나 이상 (예를 들어, 칵테일)의 간섭 RNA (예를 들어, siRNA), 양이온성 지질, 및 비-양이온성 지질을 포함하는, 혈청에서 안정성인 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP) 및 그의 제제를 제공하고, 이것은 입자의 응집을 억제하는 접합 지질을 추가로 포함할 수 있다. 간섭 RNA 분자의 예는 이중 가닥 RNA (dsRNA), 예컨대 siRNA, 다이서 (Dicer)-기질 dsRNA, shRNA, aiRNA, 프리 (pre)-miRNA, 및 이들의 조합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

한 측면에서, 본 발명은 ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 간섭 RNA를 제공하고, 여기서 간섭 RNA는 센스 가닥 및 상보성 안티센스 가닥을 포함하고, 간섭 RNA는 약 15 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이의 이중 가닥 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 ALDH 게놈의 동일한 및/또는 상이한 영역을 표적으로 하는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 간섭 RNA 분자의 조합물 (예를 들어, 칵테일)을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 간섭 RNA는 시험관 내에서 및 생체 내에서 ALDH 유전자 발현을 억제하거나 침묵시킬 수 있다.

예를 들어, ALDH2 유전자 발현을 억제하는 siRNA 분자의 설계에서 사용할 수 있는 ALDH2 전사체 서열의 비제한적인 예는 진뱅크 (Genbank) (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)에 등록 번호 NM_000690.3 (유전자 ID 217, 이소형 1) 및 NM 001204889.1 (유전자 ID 217, 이소형 2)로서 기재되어 있다.

예를 들어, ALDH1 유전자 발현을 억제하는 siRNA 분자의 설계에서 사용할 수 있는 ALDH1 전사체 서열의 비제한적인 예는 진뱅크 (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)에 등록 번호 NM_000689.4 (ALDH1A1, 유전자 ID 216), 및 NM_000692.4 (ALDH1B1, 유전자 ID 219)로서 기재되어 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 알데히드 데히드로게나제 (ALDH) 유전자 발현을 표적으로 하는 간섭 RNA를 제공하고, 여기서 간섭 RNA는 센스 가닥 및 상보성 안티센스 가닥을 포함하고, 간섭 RNA는 약 15 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이의 이중 가닥 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 ALDH 유전자의 동일한 및/또는 상이한 영역을 표적으로 하는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 간섭 RNA 분자의 조합물 (예를 들어, 칵테일)을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 간섭 RNA는 시험관 내에서 및 생체 내에서 ALDH 유전자 발현을 억제하거나 완전히 침묵시킬 수 있다.

본 발명의 조성물 내에 존재하는 각각의 간섭 RNA 서열은 독립적으로 예를 들어, 이중 가닥 영역의 센스 및/또는 안티센스 가닥 내에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 2'OMe 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오티드는 2'OMe 뉴클레오티드로 변형된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 내에 존재하는 각각의 간섭 RNA 서열은 센스 및/또는 안티센스 가닥 내에 적어도 하나의 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드를 포함한다.

ALDH2 유전자 발현을 억제하기 위한 본 발명의 실시에서 유용한 이중 가닥 siRNA 분자의 예는 본원의 실시예 4의 표 A에 기재된 화학적으로 변형된 센스 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 이중 가닥 siRNA 분자 (1 내지 6으로 번호를 붙임)를 포함한다. 실시예 4의 표 A에 기재된 이중 가닥 siRNA 분자는 문자 "m"으로 확인된 리보뉴클레오티드 단위 상의 2'-O-메틸 모이어티 (moiety)의 존재에 의해 화학적으로 변형된다. 본 발명은 또한 실시예 4의 표 A에 기재된 센스 및 안티센스 서열을 갖는 이중 가닥 siRNA 분자를 포함하고, 여기서 센스 및 안티센스 가닥은 화학적으로 변형되지 않는다. 본 발명은 또한 실시예 4의 표 A에 기재된 임의의 하나의 센스 가닥 서열 (화학적으로 변형된 또는 화학적으로 변형되지 않은)을 갖는 단리된 단일 가닥의 핵산 분자를 포함한다. 본 발명은 또한 실시예 4의 표 A에 기재된 임의의 하나의 안티센스 가닥 서열 (화학적으로 변형된 또는 화학적으로 변형되지 않은)을 갖는 단리된 단일 가닥의 핵산 분자를 포함한다.

본 발명은 또한 ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) 분자의 하나 또는 칵테일, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 핵산-지질 입자를 제공한다. 핵산-지질 입자는 대개 ALDH 유전자 발현을 침묵시키는, 하나 이상의 비변형된 및/또는 변형된 간섭 RNA, 양이온성 지질, 및 비-양이온성 지질을 포함한다. 특정한 경우에, 핵산-지질 입자는 입자의 응집을 억제하는 접합 지질을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 핵산-지질 입자는 ALDH 유전자 발현을 침묵시키는 하나 이상의 비변형된 및/또는 변형된 간섭 RNA, 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 입자의 응집을 억제하는 접합 지질을 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 간섭 RNA 분자는 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP) 내에 완전히 캡슐화된다. 간섭 RNA의 칵테일을 포함하는 제제에 있어서, 상이한 종류의 간섭 RNA 분자들은 동일한 핵산-지질 입자 내에 동시-캡슐화될 수 있거나, 칵테일 내에 존재하는 각각의 종류의 간섭 RNA 종은 그 자신의 입자 내에 캡슐화될 수 있다.

본 발명은 또한 핵산-지질 입자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 핵산-지질 입자는 하나 이상의 ALDH 유전자 (예를 들어, ALDH2 유전자)의 발현을 침묵시키는 간섭 RNA (예를 들어, dsRNA) 분자의 예방적 또는 치료적 전달을 위해 유용하다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 간섭 RNA 분자는 핵산-지질 입자로 제제화되고, 입자는 치료를 요구하는 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 투여된다. 특정한 경우에, 치료 유효량의 핵산-지질 입자는 포유동물, 예를 들어, 인간에서 알콜중독을 예방하거나 치료하기 위해 투여될 수 있다. 본 발명의 핵산-지질 입자는 인간에서 대부분의 ALDH2 유전자 발현의 부위인 간 세포를 표적화하기 위해 특히 유용하다. 핵산-지질 입자의 투여는 예를 들어, 경구, 비내, 정맥내, 복강내, 근내, 관절내, 병변내, 기관내, 피하, 또는 피부내와 같은 당업계에 공지된 임의의 경로에 의할 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산-지질 입자는 예를 들어, 장관 또는 비경구 투여 경로를 통해 전신 투여된다.

몇몇 실시양태에서, ALDH 유전자 발현의 하향조절은 핵산-지질 입자 투여 후에 포유동물로부터 생물학적 샘플 내의 ALDH RNA 또는 단백질 수준을 검출함으로써 결정된다. 다른 실시양태에서, ALDH 유전자 발현의 하향조절은 핵산-지질 입자 투여 후에 포유동물로부터 생물학적 샘플 내의 ALDH mRNA 또는 단백질 수준을 검출함으로써 결정된다. 특정 실시양태에서, ALDH 또는 ALDH 유전자 발현의 하향조절은 입자 투여 후에 포유동물에서 알콜 금단과 연관된 증상을 모니터링함으로써 검출된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포를 본 발명의 핵산-지질 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는, ALDH 유전자 발현을 침묵시키는 간섭 RNA를 세포 내로 도입하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 ALDH 유전자 발현의 침묵을 필요로 하는 포유동물에게 본 발명의 핵산-지질 입자를 투여하는 단계를 각각 포함하는, 상기 포유동물 (예를 들어, 인간)에서 ALDH 유전자 발현을 침묵시키는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 인간에게 치료 유효량의 본 발명의 핵산-지질 입자를 투여하는 단계를 각각 포함하는, 인간에서 알콜중독과 연관된 하나 이상의 증상을 치료 및/또는 개선하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 ALDH 발현의 억제를 필요로 하는 포유동물에게 치료 유효량의 본 발명의 핵산-지질 입자를 투여하는 단계를 각각 포함하는, 상기 포유동물 (예를 들어, 알콜중독에 걸린 인간)에서 ALDH 발현을 억제하는 방법을 제공한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 인간에게 치료 유효량의 본 발명의 핵산-지질 입자를 투여하는 단계를 각각 포함하는, 인간에서 알콜중독을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음 상세한 설명 및 도면으로부터 당업자에게 자명할 것이다.

발명의 상세한 설명

I. 도입

본원에 기재된 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) 약물 요법은 유리하게는 인간에서 알콜중독을 치료하기 위한 중요한 새로운 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 실시태양은 예를 들어, 매주 1회, 매주 1회, 또는 수주마다 1회 (예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6주마다 1회) 투여될 수 있다. 수일 또는 수주 동안 ALDH를 억제하는데 효과적인 본 발명의 조성물을 소비한 후에 알콜중독자가 알콜 혐오 요법을 중단하기가 더 어려울 수 있다.

더욱이, 본원에 기재된 지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 신체 내에서 표적 조직 및 세포 내로 핵산 약물, 예컨대 간섭 RNA의 효과적인 전달을 가능하게 한다. 지질 입자의 존재는 혈류 내에서 뉴클레아제 분해로부터 보호를 부여하여, 표적 조직 내에 우선적인 축적을 허용하고, siRNA가 RNA 간섭의 의도된 기능을 수행할 수 있는 세포성 세포질 내로 약물 도입의 수단을 제공한다.

II . 정의

본원에서 사용되는 바와 같이, 다음 용어는 달리 명시하지 않으면 그에 대해 명시된 의미를 갖는다.

용어 "알데히드 데히드로게나제" (ALDH로서 약칭함)는 알데히드 (예를 들어, 아세트알데히드)의 카르복실산 (예를 들어, 아세트산)으로의 산화 (탈수소)를 촉매하는 효소를 의미한다. 구조상 및 기능상 관련 알데히드 데히드로게나제의 패밀리가 포유동물에 존재하고, 인간에서 아세트알데히드의 아세트산으로의 전환을 주로 담당하는 것으로 생각되는, 미토콘드리아에 위치한 효소인 알데히드 데히드로게나제 2 (ALDH2)를 포함한다.

용어 "간섭 RNA" 또는 "RNAi" 또는 "간섭 RNA 서열"은 본원에서 사용될 때, 간섭 RNA가 표적 유전자 또는 서열과 동일한 세포 내에 있을 때 (예를 들어, 간섭 RNA 서열에 상보성인 mRNA의 분해를 매개하거나 그 mRNA의 번역을 억제함으로써) 표적 유전자 또는 서열의 발현을 감소 또는 억제할 수 있는 단일 가닥 RNA (예를 들어, 성숙 miRNA, ssRNAi 올리고뉴클레오티드, ssDNAi 올리고뉴클레오티드) 또는 이중 가닥 RNA (즉, 이중체 RNA, 예컨대 siRNA, 다이서-기질 dsRNA, shRNA, aiRNA, 또는 프리-miRNA)를 포함한다. 따라서, 간섭 RNA는 표적 mRNA 서열에, 또는 2개의 상보성 가단에 의해 또는 단일의 자가-상보성 가닥에 의해 형성된 이중 가닥 RNA에 상보성인 단일 가닥 RNA를 나타낸다. 간섭 RNA는 표적 유전자 또는 서열에 실질적인 또는 완전한 동일성을 가질 수 있거나, 미스매치 (mismatch)의 영역 (즉, 미스매치 모티프 (motif))를 포함할 수 있다. 간섭 RNA의 서열은 전장 표적 유전자, 또는 그의 하위서열에 상응할 수 있다. 바람직하게는, 간섭 RNA 분자는 화학적으로 합성된다.

간섭 RNA는 "소형 간섭 RNA" 또는 "siRNA", 예를 들어, 약 15-60, 15-50, 또는 15-40 (이중체) 뉴클레오티드 길이, 보다 일반적으로 약 15-30, 15-25, 또는 19-25 (이중체) 뉴클레오티드 길이의 간섭 RNA를 포함하고, 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23 (이중체) 뉴클레오티드 길이이다 (예를 들어, 이중 가닥 siRNA의 각각의 상보성 서열은 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 또는 19-25개 뉴클레오티드 길이이고, 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23개 뉴클레오티드 길이이고, 이중 가닥 siRNA는 약 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 또는 19-25 염기쌍 길이, 바람직하게는 약 18-22, 19-20, 또는 19-21 염기쌍 길이이다). siRNA 이중체는 약 1 내지 약 4개 뉴클레오티드 또는 약 2 내지 약 3개 뉴클레오티드의 3' 오버행 (overhang), 및 5' 포스페이트 말단을 포함할 수 있다. siRNA의 예는 비제한적으로, 2개의 별개의 가닥의 분자로부터 조립된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자 (여기서, 하나의 가닥은 센스 가닥이고 다른 것은 상보성 안티센스 가닥이다); 단일 가닥의 분자로부터 조립된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자 (여기서, 센스 및 안티센스 영역은 핵산-기반 또는 비-핵산-기반 링커에 의해 연결된다); 자가-상보성 센스 및 안티센스 영역을 갖는 헤어핀 (hairpin) 2차 구조를 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자; 및 자가-상보성 센스 및 안티센스 영역을 갖는 줄기 (stem) 및 2개 이상의 루프 구조를 갖는 원형 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 분자 (여기서, 원형 폴리뉴클레오티드는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 처리되어 활성 이중 가닥 siRNA 분자를 생성할 수 있다)를 포함한다.

바람직하게는, siRNA는 화학적으로 합성한다. siRNA는 또한 이. 콜라이 (E. coli) RNase III 또는 다이서를 사용하여 보다 긴 dsRNA (예를 들어, 약 25개 초과 뉴클레오티드 길이의 dsRNA)의 절단에 의해 생성할 수 있다. 이들 효소는 dsRNA를 생물학적 활성 siRNA로 처리한다 (예를 들어, 문헌 [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:9942-9947 (2002)]; [Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 14236 (2002)]; [Byrom et al., Ambion TechNotes, 10(l):4-6 (2003)]; [Kawasaki et al., Nucleic Acids Res., 31:981-987 (2003)]; [Knight et al., Science, 293:2269-2271 (2001)]; 및 [Robertson et al., J. Biol. Chem., 243:82 (1968)] 참조). 바람직하게는, dsRNA는 적어도 50개 뉴클레오티드 내지 약 100, 200, 300, 400, 또는 500개 뉴클레오티드 길이이다. dsRNA는 1000, 1500, 2000, 5000개 뉴클레오티드 길이, 또는 그 이상만큼 길 수 있다. dsRNA는 전체 유전자 전사체 또는 부분적 유전자 전사체를 코딩할 수 있다. 특정한 경우에, siRNA는 플라스미드에 의해 코딩될 (예를 들어, 헤어핀 루프를 갖는 이중체로 자동으로 접히는 서열로서 전사될) 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "미스매치 모티프 또는 "미스매치 영역"은 그의 표적 서열에 100% 상보성을 갖지 않는 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) 서열의 부분을 나타낸다. 간섭 RNA는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 미스매치 영역을 가질 수 있다. 미스매치 영역은 연속적일 수 있거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 미스매치 모티프 또는 영역은 단일 뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 2, 3, 4, 5개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

어구 "표적 유전자의 발현을 억제하는"은 표적 유전자 (예를 들어, ALDH 유전자)의 발현을 침묵시키거나 감소시키거나 억제하는 본 발명의 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)의 능력을 나타낸다. 유전자 침묵의 정도를 검사하기 위해, 시험 샘플 (예를 들어, 표적 유전자를 발현하는 관심있는 유기체로부터 생물학적 샘플, 또는 표적 유전자를 발현하는 배양액 내의 세포의 샘플)을 표적 유전자의 발현을 침묵시키거나 감소시키기나 억제하는 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)와 접촉시킨다. 시험 샘플 내의 표적 유전자의 발현을 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)와 접촉되지 않은 대조군 샘플 (예를 들어, 표적 유전자를 발현하는 관심있는 유기체의 생물학적 샘플, 또는 표적 유전자를 발현하는 배양액 내의 세포의 샘플) 내의 표적 유전자의 발현과 비교한다. 대조군 샘플 (예를 들어, 표적 유전자를 발현하는 샘플)에 100% 값을 배정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 유전자의 발현의 침묵, 억제, 또는 감소는 대조군 샘플에 비해 시험 샘플의 값이 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5%, 또는 0%일 때 달성된다. 적합한 검정은 비제한적으로 예를 들어, 도트 블롯 (dot blot), 노던 블롯 (Northern blot), 계내 (in situ) 혼성화, ELISA, 면역침전, 효소 기능과 같은 당업자에게 공지된 기술뿐만 아니라 당업자에게 공지된 표현형 검정을 이용하는 단백질 또는 mRNA 수준의 검사를 포함한다.

치료 핵산, 예컨대 간섭 RNA의 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 목적하는 효과, 예를 들어, 간섭 RNA의 부재 하에 검출된 정상 발현 수준에 비해 표적 서열의 발현의 억제를 생성하기 위해 충분한 양이다. 특정 실시양태에서, 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현의 억제는 대조군에 비해 간섭 RNA를 사용하여 얻어진 값이 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 0%일 때 달성된다. 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현을 측정하기 위한 적합한 검정은 예를 들어, 도트 블롯, 노던 블롯, 계내 혼성화, ELISA, 면역침전, 효소 기능과 같은 당업자에게 공지된 기술뿐만 아니라 당업자에게 공지된 표현형 검정을 이용하는 단백질 또는 mRNA 수준의 검사를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

간섭 RNA에 의해 면역 반응을 "줄이다," "줄이는," "감소시키다," 또는 "감소시키는" 것은 주어진 간섭 RNA (예를 들어, 변형된 간섭 RNA)에 대한 면역 반응의 검출가능한 감소를 의미하도록 의도된다. 변형된 간섭 RNA에 의한 면역 반응의 감소의 양은 비변형된 간섭 RNA의 존재 하의 면역 반응의 수준에 상대적으로 결정할 수 있다. 검출가능한 감소는 비변형된 간섭 RNA의 존재 하에 검출된 면역 반응보다 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 그 이상 더 낮을 수 있다. 간섭 RNA에 대한 면역 반응의 감소는 대개 간섭 RNA의 투여 후에 시험관 내에서 응답자 (responder) 세포에 의한 시토카인 생산 (예를 들어, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-6, 또는 IL-12)의 감소, 또는 포유동물 대상체의 혈청 내에서 시토카인 생산의 감소에 의해 측정된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "응답자 세포"는 면역자극성 간섭 RNA, 예컨대 비변형된 siRNA와 접촉될 때 검출가능한 면역 반응을 생성하는 세포, 바람직하게는 포유동물 세포를 나타낸다. 예시적인 응답자 세포는 예를 들어, 수지상 세포, 대식세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 비장세포 등을 포함한다. 검출가능한 면역 반응은 예를 들어, 시토카인 또는 성장 인자, 예컨대 TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, TGF, 및 이들의 조합물의 생산을 포함한다. 검출가능한 면역 반응은 또한 예를 들어, 테트라트리코펩티드 반복체 1 (IFIT1) mRNA을 사용한 인터페론-유도된 단백질의 유도를 포함한다.

"실질적인 동일성"은 엄격한 조건 하에 참조 서열에 혼성화하는 서열, 또는 참조 서열의 명시된 영역에 걸쳐 명시된 % 동일성을 갖는 서열을 나타낸다.

어구 "엄격한 혼성화 조건"은 그 조건 하에 대개 핵산의 복합체 혼합물 내에서 핵산이 그의 표적 서열에 혼성화하지만 다른 서열에는 혼성화하지 않는 조건을 나타낸다. 엄격한 조건은 서열-의존성이고, 상이한 환경에서 상이할 것이다. 보다 긴 서열은 보다 고온에서 특이적으로 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 광대한 안내는 문헌 [Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 발견된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 pH에서 구체적인 서열에 대한 열 용융점 (T_m)보다 약 5-10℃ 더 낮도록 선택된다. T_m은 그 온도에서 표적에 상보성인 프로브의 50%가 평형에서 표적 서열에 혼성화하는 (표적 서열이 과량으로 존재할 때, T_m에서, 프로브의 50%가 평형에서 점유되는) 온도 (규정된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도 하에)이다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화제, 예컨대 포름아미드의 첨가에 의해 달성할 수 있다. 선택적인 또는 특이적인 혼성화에 대해, 양성 신호는 배경의 적어도 2배, 바람직하게는 배경 혼성화의 10배이다.

예시적인 엄격한 혼성화 조건은 다음과 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5xSSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이팅, 또는 5xSSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이팅, 이어서, 0.2x SSC, 및 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척. PCR을 위해, 약 36℃의 온도가 낮은 엄격도 증폭을 위해 대표적이지만, 어닐링 (annealing) 온도는 프라이머 길이에 따라 약 32℃ 내지 48℃로 변할 수 있다. 높은 엄격도 PCR 증폭을 위해, 약 62℃의 온도가 대표적이지만, 높은 엄격도 어닐링 온도는 프라이머 길이 및 특이성에 따라 약 50℃ 내지 약 65℃ 범위일 수 있다. 높은 및 낮은 엄격도 증폭 모두를 위한 대표적인 사이클 조건은 30 sec 내지 2 min 동안 90℃-95℃의 변성 시기, 30 sec 내지 2 min 지속하는 어닐링 시기, 및 1 내지 2 min 동안 약 72℃의 연장 시기를 포함한다. 낮은 및 높은 엄격도 증폭 반응에 대한 프로토콜 및 가이드라인은 예를 들어, 문헌 [Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)]에 제공되어 있다.

엄격한 조건 하에 서로 혼성화하지 않는 핵산은 그들의 코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하면 여전히 실질적으로 동일하다. 이것은, 예를 들어, 유전자 코드에 의해 허용된 최대 코돈 축퇴성을 이용하여 핵산의 카피가 생성될 때 일어난다. 그러한 경우에, 핵산은 대개 중등도 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화한다. 예시적인 "중등도 엄격한 혼성화 조건"은 37℃에서 40% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS의 완충제 내에서 혼성화, 및 45℃에서 1X SSC 내에서 세척을 포함한다. 양성 혼성화는 배경의 적어도 2배이다. 당업자는 별도의 혼성화 및 세척 조건이 유사한 엄격도의 조건을 제공하기 위해 사용될 수 있음을 쉽게 알 것이다. 혼성화 파라미터를 결정하기 위한 추가의 가이드라인은 수많은 참고문헌, 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds]에 제공되어 있다.

2개 이상의 핵산의 맥락에서 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "실질적인 동일성"은 다음 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하여 또는 수동 정렬 및 시각 검사에 의해 측정할 때 지정된 영역, 또는 비교창 위에서 최대 상응성을 위해 비교하고 정렬될 때 동일하거나 동일한 명시된 백분율 (즉, 명시된 영역에 걸쳐 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성)의 뉴클레오티드를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 나타낸다. 상기 정의는 문맥이 지시할 때 또한 유사하게 서열의 상보체를 나타낸다. 바람직하게는, 실질적인 동일성은 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60개 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐 존재한다.

서열 비교를 위해, 대개 하나의 서열이 참조 서열로서 작용하고, 그에 대해 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 서열 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우에 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 (default) 프로그램 파라미터를 사용할 수 있거나, 별도의 파라미터를 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기반하여 참조 서열에 상대적으로 시험 서열에 대해 % 서열 동일성을 계산한다.

"비교창"은 본원에서 사용될 때, 약 5 내지 약 60, 대체로 약 10 내지 약 45, 보다 대체로 약 15 내지 약 30으로 이루어진 군 중에서 선택된 많은 연속적인 위치 중 하나의 분절에 대한 참조를 포함하고, 여기서 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후에 동일한 수의 연속적인 위치의 참조 서열에 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어, 문헌 [Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol, 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988)]의 유사성에 대한 탐색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 전산 실행 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 (Wisconsin Genetics Software Package; 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group; 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575)) 내의 GAP, BESALDHIT, FASTA, 및 ALDHASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각 검사 (예를 들어, [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (1995 supplement)] 참조)에 의해 수행할 수 있다.

% 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 위한 적합한 알고리즘의 비제한적인 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이것은 문헌 [Altschul et al., Nuc. Acids Res., 25:3389-3402 (1977)] 및 [Altschul et al., J. Mol. Biol, 215:403-410 (1990)]에 각각 설명되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0을 본 발명의 핵산에 대한 % 서열 동일성을 결정하기 위해 본원에 기재된 파라미터를 이용하여 사용한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 공개적으로 이용가능하다. 또 다른 예는 % 서열 동일성을 결정하기 위한 전반적 정렬 알고리즘, 예컨대 단백질 또는 뉴클레오티드 (예를 들어, RNA) 서열을 정렬하기 위한 니들만-분쉬 (Needleman-Wunsch) 알고리즘이다.

BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성의 통계 분석을 수행한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 척도는 최소 합 확률 (P(N))이고, 이것은 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 매치가 우연히 발생할 확률의 지시를 제공한다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 참조 서열에 유사한 것으로 간주된다.

용어 "핵산"은 본원에서 사용될 때, 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 적어도 2개의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 함유하는 중합체를 나타내고, DNA 및 RNA를 포함한다. DNA는 예를 들어, 안티센스 분자, 플라스미드 DNA, 예비응축된 DNA, PCR 생성물, 벡터 (P1, PAC, BAC, YAC, 인공 염색체), 발현 카세트, 키메라 (chimeric) 서열, 염색체 DNA, 또는 이들 군의 유도체 및 조합물의 형태로 존재할 수 있다. RNA는 소형 간섭 RNA (siRNA), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA (shRNA), 비대칭 간섭 RNA (aiRNA), 마이크로RNA (miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, tRNA, 바이러스 RNA (vRNA), 및 이들의 조합물의 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 합성, 천연 발생 및 비-천연 발생이고 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는, 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 (backbone) 잔기 또는 연결기를 함유하는 핵산을 포함한다. 그러한 유사체의 예는 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄 (chiral)-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 및 펩티드-핵산 (PNA)를 포함한다. 구체적으로 제한하지 않으면, 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오티드의 공지의 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지시하지 않으면, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적 변형 변이체 (예를 들어, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전사, 오르토로그 (ortholog), SNP, 및 상보성 서열과 명백히 지시된 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성할 수 있다 (문헌 [Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991)]; [Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985)]; [Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)]). "뉴클레오티드"는 당 데옥시리보스 (DNA) 또는 리보스 (RNA), 염기, 및 포스페이트기를 함유한다. 뉴클레오티드는 포스페이트기를 통해 함께 연결된다. "염기"는 천연 화합물 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신, 및 천연 유사체를 추가로 포함한 퓨린 및 피리미딘, 및 비제한적으로 아민, 알콜, 티올, 카르복실레이트 및 알킬할라이드와 같은 새로운 반응성 기를 놓는 변형을 포함하고 이로 제한되지 않는 퓨린 및 피리미딘의 합성 유도체를 포함한다.

용어 "유전자"는 폴리펩티드 또는 전구체 폴리펩티드의 생산을 위해 필요한 부분적 길이 또는 전체 길이 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열을 나타낸다.

"유전자 생성물"은 본원에서 사용될 때, 유전자의 생성물, 예컨대 RNA 전사체 또는 폴리펩티드를 나타낸다.

용어 "지질"은 지방산의 에스테르를 포함하고 이로 제한되지 않고, 물에 불용성이지만 많은 유기 용매에 가용성인 것을 특징으로 하는 유기 화합물의 군을 나타낸다. 이들은 대체로 적어도 3개의 부류로 나누어진다: (1) 지방 및 오일과 또한 왁스를 포함한 "단순 지질"; (2) 인지질 및 당지질을 포함한 "복합 지질"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도 지질".

용어 "지질 입자"는 치료 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA)을 관심있는 표적 부위 (예를 들어, 세포, 조직, 장기 등)에 전달하기 위해 사용할 수 있는 지질 제제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 지질 입자는 핵산-지질 입자이고, 이것은 대개 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 임의로 입자의 응집을 방해하는 접합 지질로부터 형성된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 치료 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA)은 입자의 지질 부분 내에 캡슐화될 수 있어서, 효소적 분해로부터 보호된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "SNALP"는 안정한 핵산-지질 입자를 나타낸다. SNALP는 지질 (예를 들어, 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 임의로 입자의 응집을 방해하는 접합 지질)로부터 제조된 입자를 나타내고, 여기서 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA)은 지질 내에 완전히 캡슐화된다. 특정한 경우에, SNALP는 정맥내 (i.v.) 주사 후에 연장된 혈류 수명을 보일 수 있고, 원위 부위 (예를 들어, 투여 부위로부터 물리적으로 분리된 부위)에 축적할 수 있고, 이들 원위 부위에서 유전자 발현의 침묵을 매개할 수 있으므로 전신 용도를 위해 매우 유용하다. 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 PCT 공개 WO 00/03683에 기재된 바와 같이, 핵산은 응축제와 복합되고 SNALP 내에 캡슐화될 수 있다.

본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 대개 평균 직경이 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 또는 150 nm이고, 실질적으로 무독성이다. 추가로, 핵산은 본 발명의 지질 입자 내에 존재할 때, 수용액 내에서 뉴클레아제 분해에 대해 저항성이다. 핵산-지질 입자 및 그의 제조 방법은 예를 들어, 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 20040142025 및 20070042031은 개시되어 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "지질 캡슐화된"은 완전 캡슐화, 부분 캡슐화, 또는 둘 모두의 상태로 치료 핵산, 예컨대 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)를 제공하는 지질 입자를 나타낼 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA)은 (예를 들어, SNALP 또는 다른 핵산-지질 입자를 형성하도록) 지질 입자 내에 완전히 캡슐화된다.

용어 "지질 접합체"는 지질 입자의 응집을 억제하는 접합 지질을 나타낸다. 그러한 지질 접합체는 PEG-지질 접합체, 예컨대, 디알킬옥시프로필에 결합된 PEG (예를 들어, PEG-DAA 접합체), 디아실글리세롤에 결합된 PEG (예를 들어, PEG-DAG 접합체), 콜레스테롤에 결합된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 결합된 PEG, 및 세라미드에 접합된 PEG (예를 들어, 미국 특허 5,885,613 참조), 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린 (POZ)-지질 접합체 (예를 들어, POZ-DAA 접합체; 예를 들어, 2010년 1월 13일 출원된 미국 특허 가출원 61/294,828, 및 2010년 1월 14일 출원된 미국 특허 가출원 61/295,140 참조), 폴리아미드 올리고머 (예를 들어, ATTA-지질 접합체), 및 이들의 혼합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다. POZ-지질 접합체의 추가의 예는 PCT 공개 WO 2010/006282에 기재되어 있다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 접합될 수 있거나, 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 비함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티를 비롯한, PEG 또는 POZ를 지질에 결합시키기 위한 적합한 임의의 링커 모이어티를 사용할 수 있다. 바람직한 특정 실시양태에서, 에스테르 비함유 링커 모이어티, 예컨대 아미드 또는 카르바메이트를 사용한다. 상기 특허 문헌의 각각의 개시내용은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.

용어 "양친매성 지질"은 부분적으로, 지질 물질의 소수성 부분이 소수성 상으로 배향하는 반면, 친수성 부분은 수성상을 향해 배양하는 임의의 적합한 물질을 나타낸다. 친수성 특징은 극성 또는 하전된 기, 예컨대 탄수화물, 포스페이트, 카르복실, 술페이토, 아미노, 술프히드릴, 니트로, 히드록실, 및 다른 유사한 기의 존재로부터 유래한다. 소수성은 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소기, 및 하나 이상의 방향족, 지환족, 또는 헤테로사이클 기(들)에 의해 치환된 그러한 기를 포함하고 이로 제한되지 않는 무극성기의 포함에 의해 부여할 수 있다. 양친매성 화합물의 예는 인지질, 아미노지질, 및 스핑고지질을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

인지질의 대표적인 예는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 및 디리놀레오일포스파티딜콜린을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 인이 결여된 다른 화합물, 예컨대 스핑고지질, 당스핑고지질 패밀리, 디아실글리세롤, 및 β-아실옥시산이 또한 양친매성 지질로서 지정된 군 내에 있다. 추가로, 상기 설명된 양친매성 지질은 트리글리세리드 및 스테롤을 비롯한 다른 지질과 혼합될 수 있다.

용어 "중성 지질"은 선택된 pH에서 하전되지 않은 또는 중성 쯔비터이온 (zwitterion) 형태로 존재하는 임의의 많은 지질 종을 나타낸다. 생리학적 pH에서, 그러한 지질은 예를 들어, 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로시드, 및 디아실글리세롤을 포함한다.

용어 "비-양이온성 지질"은 임의의 양친매성 지질뿐만 아니라 임의의 다른 중성 지질 또는 음이온성 지질을 나타낸다.

용어 "음이온성 지질"은 생리학적 pH에서 음하전된 임의의 지질을 나타낸다. 이들 지질은 포스파티딜글리세롤, 카르디오리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤 (POPG), 및 중성 지질에 연결된 다른 음이온성 변경기를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

용어 "소수성 지질"은 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소기, 및 임의로 하나 이상의 방향족, 지환족, 또는 헤테로사이클족 기(들)에 의해 치환된 그러한 기를 포함하고 이로 제한되지 않는 무극성기를 갖는 화합물을 나타낸다. 적합한 예는 디아실글리세롤, 디알킬글리세롤, N,N-디알킬아미노, 1,2-디아실옥시-3-아미노프로판, 및 1,2-디알킬-3-아미노프로판을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

용어 "양이온성 지질" 및 "아미노 지질"은 1, 2, 3개 이상의 지방산 또는 지방 알킬 쇄 및 pH-적정가능 아미노 헤드기 (head group) (예를 들어, 알킬아미노 또는 디알킬아미노 헤드기)를 갖는 지질 및 그의 염을 포함하도록 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 양이온성 지질은 대개 양이온성 지질의 pKa 미만의 pH에서 양성자화되고 (즉, 양하전되고), pKa를 초과하는 pH에서 실질적으로 중성이다. 본 발명의 양이온성 지질은 또한 적정가능 양이온성 지질로서 부를 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 양이온성 지질은 양성자화가능한 삼급 아민 아민 (예를 들어, pH-적정가능) 헤드기; C₁₈ 알킬 쇄 (여기서, 각각의 알킬 쇄는 독립적으로 0 내지 3 (예를 들어, 0, 1, 2, 또는 3)개의 이중 결합을 갖는다); 및 헤드기 및 알킬 쇄 사이에 에테르, 에스테르, 또는 케탈 연결기를 포함한다. 그러한 양이온성 지질은 DSDMA, DODMA, DLinDMA, DLenDMA, γ-DLenDMA, DLin-K-DMA, DLin-K-C2-DMA (또한 DLin-C2K-DMA, XTC2, 및 C2K로서 공지됨), DLin-K-C3-DMA, DLin-K-C4-DMA, DLen-C2K-DMA, y-DLen-C2K-DMA, DLin-M-C2-DMA (또한 MC2로서 공지됨), 및 DLin-M-C3-DMA (또한 MC3으로서 공지됨)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

용어 "염"은 임의의 음이온성 및 양이온성 복합체, 예컨대 양이온성 지질 및 하나 이상의 음이온 사이에 형성된 복합체를 포함한다. 음이온의 비제한적인 예는 무기 및 유기 음이온, 예를 들어, 히드라이드, 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 옥살레이트 (예를 들어, 헤미옥살레이트), 포스페이트, 포스포네이트, 수소 포스페이트, 이수소 포스페이트, 옥시드, 카르보네이트, 비카르보네이트, 니트레이트, 니트라이트, 니트라이드, 비술파이트, 술피드, 술파이트, 비술페이트, 술페이트, 티오술페이트, 수소 술페이트, 보레이트, 포르메이트, 아세테이트, 벤조에이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 아크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 푸마레이트, 말레에이트, 이타코네이트, 글리콜레이트, 글루코네이트, 말레이트, 만델레이트, 티글레이트, 아스코르베이트, 살리실레이트, 폴리메타크릴레이트, 퍼클로레이트, 클로레이트, 클로라이트, 하이포클로라이트, 브로메이트, 하이포브로마이트, 아이오데이트, 알킬술포네이트, 아릴술포네이트, 아르세네이트, 아르세나이트, 크로메이트, 디크로메이트, 시아나이드, 시아네이트, 티오시아네이트, 히드록시드, 페록시드, 퍼망가네이트, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 양이온성 지질의 염은 결정질 염이다.

용어 "알킬"은 1 내지 24개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형, 비환형 또는 환형, 포화 지방족 탄화수소를 포함한다. 대표적인 포화 직쇄 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 반면, 포화 분지형 알킬은 비제한적으로 이소프로필, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 이소펜틸 등을 포함한다. 대표적인 포화 환형 알킬은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 반면, 불포화 환형 알킬은 비제한적으로 시클로펜테닐, 시클로헥세닐 등을 포함한다.

용어 "알케닐"은 인접한 탄소 원자 사이에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하는, 상기 정의한 바와 같은 알킬을 포함한다. 알케닐은 시스 및 트랜스 이성질체를 모두 포함한다. 대표적인 직쇄 및 분지형 알케닐은 에틸레닐, 프로필레닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

용어 "알키닐"은 인접한 탄소 사이에 적어도 하나의 삼중 결합을 추가로 함유하는, 상기 정의한 바와 같은 임의의 알킬 또는 알케닐을 포함한다. 대표적인 직쇄 및 분지형 알키닐은 비제한적으로, 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1 부티닐 등을 포함한다.

용어 "아실"은 부착 위치에서 탄소가 아래에서 정의되는 바와 같은 옥소기로 치환되는 임의의 알킬, 알케닐, 또는 알키닐을 포함한다. 다음은 아실기의 비제한적인 예이다: -C(=O)알킬, -C(=O)알케닐, 및 -C(=O)알키닐.

용어 "헤테로사이클"은 포화, 불포화, 또는 방향족이고, 질소, 산소 및 황 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 함유하는 5- 내지 7-원 일환형, 또는 7- 내지 10-원 이환형, 헤테로사이클 고리를 포함하고, 여기서 질소 및 황 헤테로원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있고, 임의의 상기 헤테로사이클이 벤젠 고리에 융합된 이환형 고리를 포함한다. 헤테로사이클은 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자를 통해 부착될 수 있다. 헤테로사이클은 아래에서 정의되는 바와 같은 헤테로아릴, 및 모르폴리닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페리지닐, 하이단토이닐, 발레로락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로피리디닐, 테트라히드로피리미디닐, 테트라히드로티오페닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로피리미디닐, 테트라히드로티오페닐, 테트라히드로티오피라닐 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

용어 "임의로 치환된 알킬", "임의로 치환된 알케닐", "임의로 치환된 알키닐", "임의로 치환된 아실", 및 "임의로 치환된 헤테로사이클"은 치환될 때, 적어도 하나의 수소 원자가 치환기로 교체되는 것을 의미한다. 옥소 치환기 (=O)의 경우에, 2개의 수소 원자가 교체된다. 이와 관련하여, 치환기는 옥소, 할로겐, 헤테로사이클, -CN, -OR^x, -NR^xR^y, -NR^xC(=O)R^y, -NR^xSO₂R^y, -C(=O)R^x, -C(=O)OR^x, -C(=O)NR^xR^y, -SO_nR^x, 및 -SO_nNR^xR^y (여기서, n은 0, 1, 또는 2이고, R^x 및 R^y는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 수소, 알킬, 또는 헤테로사이클이고, 각각의 알킬 및 헤테로사이클 치환기는 하나 이상의 옥소, 할로겐, -OH, -CN, 알킬, -OR^x, 헤테로사이클, -NR^xR^y, -NR^xC(=O)R^y, -NR^xSO₂R^y, -C(=O)R^x, -C(=O)OR^x, -C(=O)NR^xR^y, -SO_nR^x, 및 -SO_nNR^xR^y로 추가로 치환될 수 있다)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 용어 "임의로 치환된"은 치환기의 목록에 앞서 사용될 때, 목록 내의 각각의 치환기가 본원에 설명된 바와 같이 임의로 치환될 수 있음을 의미한다.

용어 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모, 및 아이오도를 포함한다.

용어 "융합가능성 (fusogenic)"은 세포의 막과 융합하는 지질 입자, 예컨대 SNALP의 능력을 나타낸다. 막은 형질막, 또는 소기관, 예를 들어, 엔도솜, 핵 등을 둘러싸는 막일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수용액"은 전적으로 또는 부분적으로 물을 포함하는 조성물을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유기 지질 용액"은 전적으로 또는 부분적으로 지질을 갖는 유기 용매를 포함하는 조성물을 나타낸다.

"원위 부위"는 본원에서 사용될 때, 물리적으로 분리된 부위를 나타내고, 이것은 인접한 모세혈관상에 제한되지 않고, 대신에 유기체 전체에 넓게 분포된 부위를 포함한다.

핵산-지질 입자, 예컨대 SNALP와 관련하여 "혈청에서 안정성인"은 입자가 유리 DNA 또는 RNA를 유의하게 분해시킬 혈청 또는 뉴클레아제 검정에 노출된 후 유의하게 분해되지 않음을 의미한다. 적합한 검정은 예를 들어, 표준 혈청 검정, DNAse 검정, 또는 RNAse 검정을 포함한다.

"전신 전달"은 본원에서 사용될 때, 유기체 내에서 활성제, 예컨대 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)의 넓은 생물분포를 일으키는 지질 입자의 전달을 나타낸다. 일부 투여 기술은 특정 약제의 전신 전달을 일으킬 수 있지만, 다른 것은 그렇지 않다. 전신 전달은 유효량, 바람직하게는 치료 유효량의 약제가 신체의 대부분의 부위에 노출되는 것을 의미한다. 넓은 생물분포를 얻기 위해서는 일반적으로 투여 부위에서 먼 질환 부위에 도달하기 전에 약제가 (예컨대, 초회 통과 장기 (간, 폐 등)에 의해 또는 신속한 비특이적 세포 결합에 의해) 신속하게 분해되거나 제거되지 않도록 혈액 수명이 요구된다. 지질 입자의 전신 전달은 예를 들어, 정맥내, 피하, 및 복강내를 비롯한 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 달성할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 지질 입자의 전신 전달은 정맥내 전달에 의해 달성한다.

"국소 전달"은 본원에서 사용될 때, 유기체 내에서 표적 부위에 직접적인 활성제, 예컨대 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)의 전달을 나타낸다. 예를 들어, 약제는 질환 부위, 다른 표적 부위 또는 표적 장기, 예컨대 간, 심장, 췌장, 신장 등에 직접 주사에 의해 국소 전달될 수 있다.

용어 "포유동물"은 임의의 포유동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 개, 고양이, 햄스터, 기니 피그, 토끼, 가축 등을 나타낸다.

용어 "세망내피계" 또는 "RES"는 단핵세포 및 대식세포와 같은 망상 결합 조직 내에 위치하는 포식 세포를 비롯한 세망내피 세포를 포함한 면역계의 일부를 나타낸다. 이들 세포는 대개 림프절 및 비장에 축적한다. 간의 쿠퍼 (Kupffer) 세포 및 조직의 조직구가 또한 RES의 일부이다. RES는 일차 및 이차 림프계 장기로 나누어진다. 일차 ("중심") 림프계 장기는 RES의 세포가 생산되는 부위이다. RES의 세포는 골수에서 생산된다. 흉선이 또한 T 세포 성숙을 위해 요구되는 부위이므로 포함된다. 이차 ("말초") 림프계 장기는 RES의 세포가 기능을 하는 부위이다. 이것은 림프절, 편도선, 비장, 및 "MALT" (점막-연관 림프계 조직)를 포함한다. MALT는 "GALT" (장-연관 림프계 조직) 및 "BALT" (기관지-연관 림프계 조직)으로 추가로 나누어진다. 간의 쿠퍼 세포는 상기 시스템의 일부로서 작용하지만, 조직 내로 조직화되지 않고; 대신에 간 굴모양혈관을 통해 분산된다. 중추 신경계 (CNS)의 소교세포는 RES의 일부로서 간주될 수 있다. 이들은 CNS 손상에 반응하여 증식하는 스캐빈저 (scavenger) 세포이다.

III . 실시태양의 설명

본 발명은 ALDH 유전자, 특히 ALDH2 유전자의 발현을 표적으로 하는 간섭 RNA (예를 들어, dsRNA, 예컨대 siRNA)와 같은 치료 핵산, 하나 이상 (예를 들어, 칵테일)의 치료 핵산을 포함하는 지질 입자, 지질 입자의 제조 방법, 및 (예를 들어, 인간에서 알콜중독의 치료를 위해) 지질 입자를 전달 및/또는 투여하는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 간섭 RNA 분자를 제공한다. 간섭 RNA 분자의 비제한적인 예는 siRNA, 다이서-기질 dsRNA, shRNA, aiRNA, 프리-miRNA, 및 이들의 혼합물과 같은 RNAi를 매개할 수 있는 이중 가닥 RNA를 포함한다. 특정한 경우에, 본 발명은 ALDH 유전자의 상이한 영역을 표적으로 하는 간섭 RNA의 조합물 (예를 들어, 칵테일, 풀 (pool), 또는 혼합물)을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정한 경우에, 본 발명의 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) 분자는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 ALDH 유전자 발현을 침묵시키고/거나 ALDH를 불활성화하거/하거나 ALDH의 복제를 억제할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 ALDH 유전자 발현을 침묵시키는 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)를 제공하고, 여기서 간섭 RNA는 센스 가닥 및 상보성 안티센스 가닥을 포함하고, 간섭 RNA는 약 15 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 약 15-60, 15-30, 15-25, 19-30, 19-25, 20-60, 20-55, 20-50, 20-45, 20-40, 20-35, 20-30, 20-25, 21-30, 21-29, 22-30, 22-29, 22-28, 23-30, 23-28, 24-30, 24-28, 25-60, 25-55, 25-50, 25-45, 25-40, 25-35, 또는 25-30개 뉴클레오티드 길이, 또는 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개 뉴클레오티드 길이)의 이중 가닥 영역을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)는 예를 들어, 간섭 RNA의 이중 가닥 영역 내에서 센스 및/또는 안티센스 가닥 내에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 2'OMe 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 간섭 RNA 내의 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오티드는 2'OMe 뉴클레오티드로 변형된다. 특정한 경우에, 간섭 RNA는 센스 및 안티센스 가닥 모두 내에 2'OMe 뉴클레오티드를 함유하고, 이중 가닥 영역 내에 적어도 하나의 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 간섭 RNA의 센스 및/또는 안티센스 가닥은 예를 들어, 간섭 RNA의 이중 가닥 영역 내에 변형된 (예를 들어, 2'OMe-변형된) 아데노신 및/또는 변형된 (예를 들어, 2'OMe-변형된) 시토신 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) 분자는 하나의 또는 두 가닥 모두에서 1, 2, 3, 또는 4개 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다. 특정한 경우에, 간섭 RNA는 적어도 하나의 블런트 말단부 (blunt end)를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 간섭 RNA의 하나의 또는 두 가닥 내의 3' 오버행은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 또는 4개의 변형된 및/또는 비변형된 데옥시티미딘 ("t" 또는 "dT") 뉴클레오티드, 1, 2, 3, 또는 4개의 변형된 (예를 들어, 2'OMe) 및/또는 비변형된 우리딘 ("U") 리보뉴클레오티드, 또는 표적 서열 또는 그의 상보성 가닥에 상보성을 갖는 1, 2, 3, 또는 4개의 변형된 (예를 들어, 2'OMe) 및/또는 비변형된 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 하나 이상 (예를 들어, 칵테일)의 간섭 RNA 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP)를 제공한다. 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 대개 본원에 기재된 하나 이상 (예를 들어, 칵테일)의 간섭 RNA, 양이온성 지질, 및 비-양이온성 지질을 포함한다. 특정한 경우에, 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 입자의 응집을 억제하는 접합 지질을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 본원에 기재된 하나 이상 (예를 들어, 칵테일)의 간섭 RNA, 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 입자의 응집을 억제하는 접합 지질을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)는 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP) 내에 완전히 캡슐화된다. 간섭 RNA 칵테일을 포함하는 제제에 관하여, 칵테일 내에 존재하는 상이한 종류의 간섭 RNA 종 (예를 들어, 상이한 서열을 갖는 간섭 RNA 화합물)은 동일한 입자 내에 동시-캡슐화될 수 있거나, 칵테일 내에 존재하는 각각의 종류의 간섭 RNA 종들은 별개의 입자 내에 캡슐화될 수 있다. 간섭 RNA 칵테일은 동일한, 유사한, 또는 상이한 농도 또는 몰비로 2개 이상의 개별적인 간섭 RNA (각각 특유한 서열을 갖는)의 혼합물을 사용하여 본원에 기재된 입자 내에 제제화될 수 있다. 한 실시양태에서, 간섭 RNA의 칵테일 (상이한 서열을 갖는 복수의 간섭 RNA에 상응하는)은 동일한, 유사한, 또는 상이한 농도 또는 몰비의 각각의 간섭 RNA 종을 사용하여 제제화되고, 상이한 종류의 간섭 RNA는 동일한 입자 내에 동시-캡슐화된다. 또 다른 실시양태에서, 칵테일 내에 존재하는 각각의 종류의 간섭 RNA 종은 동일한, 유사한, 또는 상이한 간섭 RNA 농도 또는 몰비에서 상이한 입자 내에 캡슐화되고, 이렇게 형성된 입자 (각각 상이한 간섭 RNA 적재물 (payload)을 함유함)는 따로 투여되거나 (예를 들어, 치료 공식에 따라 상이한 시간에), 단일 단위 용량으로서 함께 합해지고 투여된다 (예를 들어, 제약상 허용되는 담체와 함께). 본원에 기재된 입자는 혈청에서 안정성이고, 뉴클레아제 분해에 대해 저항성이고, 포유동물, 예컨대 인간에 대해 실질적으로 무독성이다.

본 발명의 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP) 내의 양이온성 지질은 예를 들어, 본원에 기재된 화학식 I-III의 하나 이상의 양이온성 지질 또는 임의의 다른 양이온성 지질 종을 포함할 수 있다. 하나의 특정 실시양태에서, 양이온성 지질은 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLenDMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (γ-DLenDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-C2-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA), 디리놀레일메틸-3-디메틸아미노프로피오네이트 (DLin-M-C2-DMA), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트 (DLin-M-C3-DMA), 이들의 염, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된다.

본 발명의 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP) 내의 비-양이온성 지질은 예를 들어, 하나 이상의 음이온성 지질 및/또는 중성 지질을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 비-양이온성 지질은 다음 중성 지질 성분 중 하나를 포함한다: (1) 인지질 및 콜레스테롤 또는 그의 유도체의 혼합물; (2) 콜레스테롤 또는 그의 유도체; 또는 (3) 인지질. 바람직한 특정 실시양태에서, 인지질은 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 비-양이온성 지질은 DPPC 및 콜레스테롤의 혼합물이다.

본 발명의 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP) 내의 지질 접합체는 입자의 응집을 억제하고, 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 지질 접합체를 포함할 수 있다. 하나의 특정 실시양태에서, 지질 접합체는 PEG-지질 접합체를 포함한다. PEG-지질 접합체의 예는 PEG-DAG 접합체, PEG-DAA 접합체, 및 이들의 혼합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 지질 입자 내의 PEG-DAA 접합체는 PEG-디데실옥시프로필 (C₁₀) 접합체, PEG-디라우릴옥시프로필 (C₁₂) 접합체, PEG-디미리스틸옥시프로필 (C₁₄) 접합체, PEG-디팔미틸옥시프로필 (C₁₆) 접합체, PEG-디스테아릴옥시프로필 (C₁₈) 접합체, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 지질 접합체는 POZ-지질 접합체, 예컨대 POZ-DAA 접합체를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명은 (a) ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 하나 이상 (예를 들어, 칵테일)의 간섭 RNA 분자; (b) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 50 몰% 내지 약 85 몰%를 차지하는 하나 이상의 양이온성 지질 또는 그의 염; (c) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 13 몰% 내지 약 49.5 몰%를 차지하는 하나 이상의 비-양이온성 지질; 및 (d) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 0.5 몰% 내지 약 2 몰%를 차지하는, 입자의 응집을 억제하는 하나 이상의 접합 지질을 포함하는 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP)를 제공한다.

본 실시양태의 한 측면에서, 핵산-지질 입자는 (a) ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 하나 이상 (예를 들어, 칵테일)의 간섭 RNA 분자; (b) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 52 몰% 내지 약 62 몰%를 차지하는 양이온성 지질 또는 그의 염; (c) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 36 몰% 내지 약 47 몰%를 차지하는 인지질 및 콜레스테롤 또는 그의 유도체의 혼합물; 및 (d) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 1 몰% 내지 약 2 몰%를 차지하는 PEG-지질 접합체를 포함한다. 핵산-지질 입자의 상기 실시양태는 일반적으로 본원에서 "1:57" 제제로서 칭해진다. 하나의 특정 실시양태에서, 1:57 제제는 약 1.4 몰% PEG-지질 접합체 (예를 들어, PEG2000-C-DMA), 약 57.1 몰% 양이온성 지질 (예를 들어, DLin-K-C2-DMA) 또는 그의 염, 약 7.1 몰% DPPC (또는 DSPC), 및 약 34.3 몰% 콜레스테롤 (또는 그의 유도체)을 포함하는 4-성분 시스템이다.

본 실시양태의 또 다른 측면에서, 핵산-지질 입자는 (a) ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 하나 이상 (예를 들어, 칵테일)의 간섭 RNA 분자; (b) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 56.5 몰% 내지 약 66.5 몰%를 차지하는 양이온성 지질 또는 그의 염; (c) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 31.5 몰% 내지 약 42.5 몰%를 차지하는 콜레스테롤 또는 그의 유도체; 및 (d) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 1 몰% 내지 약 2 몰%를 차지하는 PEG-지질 접합체를 포함한다. 핵산-지질 입자의 상기 실시양태는 일반적으로 본원에서 "1:62" 제제로서 칭해진다. 하나의 특정 실시양태에서, 1:62 제제는 인지질이 없고, 약 1.5 몰% PEG-지질 접합체 (예를 들어, PEG2000-C-DMA), 약 61.5 몰% 양이온성 지질 (예를 들어, DLin-K-C2-DMA) 또는 그의 염, 및 약 36.9 몰% 콜레스테롤 (또는 그의 유도체)을 포함하는 3-성분 시스템이다.

1:57 및 1:62 제제에 관련된 추가의 실시양태는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 PCT 공개 WO 09/127060 및 미국 특허 출원 공개 US 2011/0071208 A1에 기재되어 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 하나 이상 (예를 들어, 칵테일)의 간섭 RNA 분자; (b) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 2 몰% 내지 약 50 몰%를 차지하는 하나 이상의 양이온성 지질 또는 그의 염; (c) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 90 몰%를 차지하는 하나 이상의 비-양이온성 지질; 및 (d) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 0.5 몰% 내지 약 20 몰%를 차지하는, 입자의 응집을 억제하는 하나 이상의 접합 지질을 포함하는 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP)를 제공한다.

본 실시양태의 한 측면에서, 핵산-지질 입자는 (a) ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 하나 이상 (예를 들어, 칵테일)의 간섭 RNA 분자; (b) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 30 몰% 내지 약 50 몰%를 차지하는 양이온성 지질 또는 그의 염; (c) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 47 몰% 내지 약 69 몰%를 차지하는 인지질 및 콜레스테롤 또는 그의 유도체의 혼합물; 및 (d) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 1 몰% 내지 약 3 몰%를 차지하는 PEG-지질 접합체를 포함한다. 핵산-지질 입자의 상기 실시양태는 일반적으로 본원에서 "2:40" 제제로서 칭해진다. 하나의 특정 실시양태에서, 2:40 제제는 약 2 몰% PEG-지질 접합체 (예를 들어, PEG2000-C-DMA), 약 40 몰% 양이온성 지질 (예를 들어, DLin-K-C2-DMA) 또는 그의 염, 약 10 몰% DPPC (또는 DSPC), 및 약 48 몰% 콜레스테롤 (또는 그의 유도체)을 포함하는 4-성분 시스템이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 (a) ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 하나 이상 (예를 들어, 칵테일)의 간섭 RNA 분자; (b) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 50 몰% 내지 약 65 몰%를 차지하는 하나 이상의 양이온성 지질 또는 그의 염; (c) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 25 몰% 내지 약 45 몰%를 차지하는 하나 이상의 비-양이온성 지질; 및 (d) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 10 몰%를 차지하는, 입자의 응집을 억제하는 하나 이상의 접합 지질을 포함하는 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP)를 제공한다.

본 실시양태의 한 측면에서, 핵산-지질 입자는 (a) ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 하나 이상 (예를 들어, 칵테일)의 간섭 RNA 분자; (b) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 50 몰% 내지 약 60 몰%를 차지하는 양이온성 지질 또는 그의 염; (c) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 35 몰% 내지 약 45 몰%를 차지하는 인지질 및 콜레스테롤 또는 그의 유도체의 혼합물; 및 (d) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 10 몰%를 차지하는 PEG-지질 접합체를 포함한다. 핵산-지질 입자의 상기 실시양태는 일반적으로 본원에서 "7:54" 제제로서 칭해진다. 특정한 경우에, 7:54 제제 내의 비-양이온성 지질 혼합물은 (i) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 10 몰%의 인지질; 및 (ii) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 25 몰% 내지 약 35 몰%의 콜레스테롤 또는 그의 유도체를 포함한다. 하나의 특정 실시양태에서, 7:54 제제는 약 7 몰% PEG-지질 접합체 (예를 들어, PEG750-C-DMA), 약 54 몰% 양이온성 지질 (예를 들어, DLin-K-C2-DMA) 또는 그의 염, 약 7 몰% DPPC (또는 DSPC), 및 약 32 몰% 콜레스테롤 (또는 그의 유도체)을 포함하는 4-성분 시스템이다.

본 실시양태의 또 다른 측면에서, 핵산-지질 입자는 (a) ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 하나 이상 (예를 들어, 칵테일)의 간섭 RNA 분자; (b) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 55 몰% 내지 약 65 몰%를 차지하는 양이온성 지질 또는 그의 염; (c) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 30 몰% 내지 약 40 몰%를 차지하는 콜레스테롤 또는 그의 유도체; 및 (d) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 10 몰%를 차지하는 PEG-지질 접합체를 포함한다. 핵산-지질 입자의 상기 실시양태는 일반적으로 본원에서 "7:58" 제제로서 칭해진다. 하나의 특정 실시양태에서, 7:58 제제는 인지질이 없고, 약 7 몰% PEG-지질 접합체 (예를 들어, PEG750-C-DMA), 약 58 몰% 양이온성 지질 (예를 들어, DLin-K-C2-DMA) 또는 그의 염, 및 약 35 몰% 콜레스테롤 (또는 그의 유도체)을 포함하는 3-성분 시스템이다.

7:54 및 7:58 제제에 관련된 추가의 실시양태는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 공개 US 2011/0076335 A1에 기재되어 있다.

본 발명은 또한 핵산-지질 입자, 예컨대 SNALP 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 하나 이상의 ALDH 유전자의 발현을 침묵시키는 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)의 치료적 전달을 위해 유용하다. 몇몇 실시양태에서, ALDH 유전자의 상이한 영역 (예를 들어, 중첩 (overlapping) 및/또는 비-중첩 서열)을 표적으로 하는 간섭 RNA의 칵테일은 동일한 또는 상이한 핵산-지질 입자로 제제화되고, 입자는 상기한 치료를 치료로 하는 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 투여된다. 특정한 경우에, 치료 유효량의 핵산-지질 입자는 예를 들어, 인간에서 알콜중독을 치료하기 위해 포유동물에게 투여될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 세포를 본원에 기재된 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP 제제)와 접촉시킴으로써, 본원에 기재된 하나 이상의 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) 분자를 세포 내로 도입하기 위한 방법을 제공한다. 하나의 특정 실시양태에서, 세포는 세망내피 세포 (예를 들어, 단핵세포 또는 대식세포), 섬유모세포, 내피 세포, 또는 혈소판 세포이다.

몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 다음 투여 경로 중 하나에 의해 투여된다: 경구, 비내, 정맥내, 복강내, 근내, 관절내, 병변내, 기관내, 피하, 및 피부내. 특정 실시양태에서, 핵산-지질 입자는 예를 들어, 장관 또는 비경구 투여 경로를 통해 전신 투여된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 예를 들어, 급성 또는 만성 알콜중독의 치료를 위해 간섭 RNA (예를 들어, dsRNA)와 같은 적재물을 다른 조직에 비해 간에 우선적으로 전달할 수 있다.

특정한 측면에서, 본 발명은 ALDH 유전자 발현의 침묵을 필요로 하는 포유동물 (예를 들어, 인간)에서 ALDH 유전자 발현을 침묵시키기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 포유동물에게, 본원에 기재된 하나 이상의 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) (예를 들어, 하나 이상의 ALDH 유전자를 표적으로 하는 siRNA)를 포함하는 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP 제제)의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 ALDH 간섭 RNA를 포함하는 핵산-지질 입자의 투여는 ALDH RNA 수준을 간섭 RNA의 부재 하에 검출된 ALDH RNA 수준 (예를 들어, 완충제 대조군 또는 비관련 비-ALDH 표적화 간섭 RNA 대조군)에 비해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 내부의 임의의 범위) 감소시킨다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 ALDH-표적화 간섭 RNA를 포함하는 핵산-지질 입자의 투여는 음성 대조군, 예컨대, 완충제 대조군 또는 비관련 비-ALDH 표적화 간섭 RNA 대조군에 비해 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100일 또는 그 이상 (또는 그 내부의 임의의 범위) 동안 ALDH RNA 수준을 감소시킨다.

다른 측면에서, 본 발명은 ALDH 유전자 발현의 침묵을 필요로 하는 포유동물 (예를 들어, 인간)에서 ALDH 유전자 발현을 침묵시키기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 포유동물에게, 본원에 기재된 하나 이상의 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) (예를 들어, ALDH 유전자의 하나 이상의 영역을 표적으로 하는 siRNA)를 포함하는 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP 제제)의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 ALDH 간섭 RNA를 포함하는 핵산-지질 입자의 투여는 ALDH mRNA 수준을 간섭 RNA의 부재 하에 검출된 ALDH mRNA 수준 (예를 들어, 완충제 대조군 또는 비관련 비-ALDH 표적화 간섭 RNA 대조군)에 비해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 내부의 임의의 범위) 감소시킨다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 ALDH-표적화 간섭 RNA를 포함하는 핵산-지질 입자의 투여는 ALDH mRNA 수준을 음성 대조군, 예컨대, 완충제 대조군 또는 비관련 비-ALDH 표적화 간섭 RNA 대조군에 비해 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100일 또는 그 이상 (또는 그 내부의 임의의 범위) 동안 감소시킨다.

다른 측면에서, 본 발명은 치료 등을 필요로 하는 포유동물 (예를 들어, 인간)에서 알콜중독과 연관된 하나 이상의 증상을 치료하고/하거나, 예방하고/하거나, 발병의 위험 또는 가능성을 감소시키고/시키거나 (예를 들어, 그에 대한 감수성을 감소시키고/시키거나), 그의 발현을 지연시키고/시키거나 그를 개선하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 포유동물에게, ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 본원에 기재된 하나 이상의 간섭 RNA 분자 (예를 들어, siRNA)를 포함하는 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP 제제)의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 ALDH의 불활성화를 필요로 하는 포유동물 (예를 들어, 인간) (예를 들어, 알콜중독에 걸린 인간)에서 ALDH를 불활성화시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 포유동물에게, ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 본원에 기재된 하나 이상의 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)를 포함하는 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP 제제)의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 ALDH-표적화 간섭 RNA를 포함하는 핵산-지질 입자의 투여는 ALDH 효소 수준을 간섭 RNA의 부재 하에 검출된 ALDH 효소 수준 (예를 들어, 완충제 대조군 또는 비관련 비-ALDH 표적화 간섭 RNA 대조군)에 비해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 내부의 임의의 범위) 낮추거나 감소시키거나 줄인다.

한 예로서, ALDH2 mRNA는 분지형 DNA 검정 (퀀티젠(QuantiGene)^®; 아피메트릭스 (Affymetrix))을 이용하여 측정할 수 있다. 분지형 DNA 검정은 포획된 표적 RNA로부터 신호를 증폭하기 위해 bDNA 분자를 이용하는 샌드위치 (sandwich) 핵산 혼성화 방법이다. 다시 한 예로서, ALDH 효소적 활성은 NAD 및 기질 (예를 들어, 아세트알데히드)를 단백질 샘플에 첨가하고, 340 nm에서 NADH의 형성을 측정함으로써 분광광도법에 의해 측정할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sheppard, Albersheim & McClearn, J. Biol. Chem. 1970 245(11):2876]; [Arolfo et al Alcoholism: Clinical and Experimental Research 2009 33(11): 1935]; [Garver et al., Alcohol & Alcoholism 2000 35(5):435)] 참조).

IV . 치료 핵산

용어 "핵산"은 임의의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 60개까지의 뉴클레오티드를 함유하는 단편을 일반적으로 올리고뉴클레오티드로 칭하고, 보다 긴 단편을 폴리뉴클레오티드로 칭한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 약 15 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 실시양태에서, 핵산은 담체 시스템, 예컨대 본원에 기재된 지질 입자와 회합된다. 특정 실시양태에서, 핵산은 지질 입자 내에 완전히 캡슐화된다. 핵산은 본 발명의 지질 입자 내에서 단독으로 투여될 수 있거나, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 소분자, 예컨대 통상적인 약물을 포함하는 지질 입자와 조합물로 투여될 (예를 들어, 동시-투여될) 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 천연 발생 염기, 당 및 당사이 (백본) 연결기로 이루어지는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단량체의 중합체 또는 올리고머를 나타낸다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 또한 유사하게 기능하는 비-천연 발생 단량체, 또는 그의 일부를 포함하는 중합체 또는 올리고머를 포함한다. 그러한 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 뉴클레아제의 존재 하에 향상된 세포성 섭취, 감소된 면역원성, 및 증가된 안정성과 같은 특성 때문에 천연 형태에 비해 종종 바람직하다.

올리고뉴클레오티드는 일반적으로 데옥시리보올리고뉴클레오티드 또는 리보올리고뉴클레오티드로서 분류된다. 데옥시리보올리고뉴클레오티드는 교대하는, 비분지형 중합체를 형성하도록 당의 5' 및 3' 탄소에서 포스페이트에 공유 연결된 데옥시리보스로 불리는 5-탄소 당으로 이루어진다. 리보올리고뉴클레오티드는 5-탄소 당이 리보스인 유사한 반복 구조로 이루어진다.

핵산은 단일 가닥 DNA 또는 RNA, 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, 또는 DNA-RNA 혼성체일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산은 이중 가닥 RNA이다. 이중 가닥 RNA의 예는 본원에 기재되어 있고, 예를 들어, siRNA 및 다른 RNAi 물질, 예컨대 다이서-기질 dsRNA, shRNA, aiRNA, 및 프리-miRNA를 포함한다. 다른 실시양태에서, 핵산은 단일 가닥이다. 단일 가닥 핵산은 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 성숙 miRNA, 및 삼중체-형성 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 핵산은 일반적으로 핵산의 특정 형태에 따라 다양한 길이일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 플라스미드 또는 유전자는 약 1,000 내지 약 100,000개 뉴클레오티드 잔기 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 약 100개 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있다. 다양한 관련 실시양태에서, 단일 가닥, 이중 가닥 및 삼중 가닥의 올리고뉴클레오티드는 모두 약 10 내지 약 60개 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 60개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 30개 뉴클레오티드, 또는 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 (또는 그의 가닥)는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화하거나 그에 상보성이다. 용어 "특이적으로 혼성화가능한" 및 "상보성"은 본원에서 사용될 때, DNA 또는 RNA 표적 및 올리고뉴클레오티드 사이에서 안정하고 특이적인 결합이 일어나도록 충분한 정도의 상보성을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화가능하기 위해 그의 표적 핵산 서열에 100% 상보성일 필요가 없음이 이해된다. 바람직한 실시양태에서, 표적 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합이 유용성 또는 그로부터 발현의 상실을 일으키도록 표적 서열의 정상 기능을 저해할 때 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화가능하고, 특이적인 결합이 요구되는 조건 하에, 즉, 생체내 검정 또는 치료적 처치의 경우에 생리학적 조건 하에, 또는 시험관내 검정의 경우에 검정이 수행되는 조건 하에 비-표적 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 비-특이적 결합을 피하기 위해 충분한 정도의 상보성이 존재한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 그가 표적화하는 또는 그가 특이적으로 혼성화하는, 유전자 또는 mRNA 서열의 영역에 비해 1, 2, 3개 이상의 염기 치환을 포함할 수 있다.

A. siRNA

본 발명의 비변형된 및 변형된 siRNA 분자는 ALDH 유전자 발현을 침묵시킬 수 있다. siRNA 이중체의 각각의 가닥은 대개 약 15 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 약 15 내지 약 30개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, siRNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 siRNA는 일반적으로 상응하는 비변형된 siRNA 서열보다 면역자극성이 더 적고, 관심있는 표적 유전자에 대한 RNAi 활성을 보유한다. 몇몇 실시양태에서, 변형된 siRNA는 적어도 하나의 2'OMe 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드, 예컨대 2'OMe-구아노신, 2'OMe-우리딘, 2'OMe-아데노신, 및/또는 2'OMe-시토신 뉴클레오티드를 함유한다. 변형된 뉴클레오티드는 siRNA의 하나의 가닥 (즉, 센스 또는 안티센스) 내에 또는 두 가닥 내에 모두 존재할 수 있다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오티드는 siRNA의 하나의 가닥 (즉, 센스 또는 안티센스) 내에 또는 두 가닥 모두 내에서 변형된다 (예를 들어, 2'OMe-변형된다). 이들 실시양태에서, 변형된 siRNA는 하나 이상의 변형된 (예를 들어, 2'OMe-변형된) 아데노신 및/또는 변형된 (예를 들어, 2'OMe-변형된) 시토신 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단지 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오티드가 siRNA의 하나의 가닥 (즉, 센스 또는 안티센스) 내에 또는 두 가닥 모두에서 변형된다 (예를 들어, 2'OMe-변형된다). siRNA 서열은 오버행 (예를 들어, 문헌 [Elbashir et al., Genes Dev., 15:188 (2001)] 또는 [Nykanen et al., Cell, 107:309 (2001)]에 기재된 바와 같은 3' 또는 5' 오버행)을 가질 수 있거나, 오버행이 결여될 수 있다 (즉, 블런트 말단부를 가질 수 있다).

특정 실시양태에서, siRNA의 하나 또는 두 가닥의 이중 가닥 영역 내로 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 2'OMe 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오티드의 선택적인 포함은 그 siRNA 분자에 대한 면역 반응을 감소시키거나 완전히 제거한다. 특정한 경우에, 특이적 siRNA 서열의 면역자극성 특성 및 유전자 발현을 침묵시키는 이들의 능력은 siRNA 이중체의 이중 가닥 영역 내에서 최소의 및 선택적인 2'OMe 변형의 도입에 의해 균형을 이루거나 최적화될 수 있다. 이것은 시토카인 유도, 독성, 및 비변형된 siRNA의 사용과 연관된 표적 이탈 (off-target) 효과 없이 치료상 실행가능한 siRNA 용량에서 달성할 수 있다.

변형된 siRNA는 일반적으로 siRNA 이중체의 이중 가닥 영역 내에 약 1% 내지 약 100% (예를 들어, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 다른 실시양태에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 몇몇 또는 모든 변형된 뉴클레오티드는 서로 떨어진 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 뉴클레오티드이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 변형된 뉴클레오티드는 서로 인접하지 않다 (예를 들어, 각각의 변형된 뉴클레오티드 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 비변형된 뉴클레오티드의 갭 (gap)이 존재한다).

몇몇 실시양태에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 약 50% 미만 (예를 들어, 약 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 또는 36% 미만, 바람직하게는 약 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 또는 30% 미만)의 뉴클레오티드는 변형된 (예를 들어, 2'OMe) 뉴클레오티드를 포함한다. 이들 실시양태의 한 측면에서, siRNA의 하나의 또는 두 가닥 모두의 이중 가닥 영역 내의 약 50% 미만의 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오티드는 선택적으로 (예를 들어, 유일하게) 변형된다. 이들 실시양태의 또 다른 측면에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 약 50% 미만의 뉴클레오티드는 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 siRNA는 siRNA의 두 가닥 모두에서 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, siRNA는 적어도 하나의 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드를 포함하고, 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드 및 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드는 이중 가닥 영역 내에 존재하는 유일한 2'OMe 뉴클레오티드이다. 이들 실시양태의 또 다른 측면에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 약 50% 미만의 뉴클레오티드는 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 siRNA는 변형된 siRNA의 두 가닥 모두에서 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, siRNA는 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드, 2'OMe-아데노신 뉴클레오티드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, siRNA는 이중 가닥 영역 내에 2'OMe-시토신 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 이들 실시양태의 추가의 측면에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 약 50% 미만의 뉴클레오티드는 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 siRNA는 siRNA의 두 가닥 모두에서 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, siRNA는 적어도 하나의 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드를 포함하고, siRNA는 이중 가닥 영역 내에 2'OMe-시토신 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 이들 실시양태의 또 다른 측면에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 약 50% 미만의 뉴클레오티드는 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 siRNA는 변형된 siRNA의 두 가닥 모두에서 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, siRNA는 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드, 2'OMe-아데노신 뉴클레오티드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, 이중 가닥 영역 내의 2'OMe 뉴클레오티드는 서로 인접하지 않는다.

다른 실시양태에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 약 1% 내지 약 50% (예를 들어, 약 5%-50%, 10%-50%, 15%-50%, 20%-50%, 25%-50%, 30%-50%, 35%-50%, 40%-50%, 45%-50%, 5%-45%, 10%-45%, 15%-45%, 20%-45%, 25%-45%, 30%-45%, 35%-45%, 40%-45%, 5%-40%, 10%-40%, 15%-40%, 20%-40%, 25%-40%, 25%-39%, 25%-38%, 25%-37%, 25%-36%, 26%-39%, 26%-38%, 26%-37%, 26%-36%, 27%-39%, 27%-38%, 27%-37%, 27%-36%, 28%-39%, 28%-38%, 28%-37%, 28%-36%, 29%-39%, 29%-38%, 29%-37%, 29%-36%, 30%-40%, 30%-39%, 30%-38%, 30%-37%, 30%-36%, 31%-39%, 31%-38%, 31%-37%, 31%-36%, 32%-39%, 32%-38%, 32%-37%, 32%-36%, 33%-39%, 33%-38%, 33%-37%, 33%-36%, 34%-39%, 34%-38%, 34%-37%, 34%-36%, 35%-40%, 5%-35%, 10%-35%, 15%-35%, 20%-35%, 21%-35%, 22%-35%, 23%-35%, 24%-35%, 25%-35%, 26%-35%, 27%-35%, 28%-35%, 29%-35%, 30%-35%, 31%-35%, 32%-35%, 33%-35%, 34%-35%, 30%-34%, 31%-34%, 32%-34%, 33%-34%, 30%-33%, 31%-33%, 32%-33%, 30%-32%, 31%-32%, 25%-34%, 25%-33%, 25%-32%, 25%-31%, 26%-34%, 26%-33%, 26%-32%, 26%-31%, 27%-34%, 27%-33%, 27%-32%, 27%-31%, 28%-34%, 28%-33%, 28%-32%, 28%-31%, 29%-34%, 29%-33%, 29%-32%, 29%-31%, 5%-30%, 10%-30%, 15%-30%, 20%-34%, 20%-33%, 20%-32%, 20%-31%, 20%-30%, 21%-30%, 22%-30%, 23%-30%, 24%-30%, 25%-30%, 25%-29%, 25%-28%, 25%-27%, 25%-26%, 26%-30%, 26%-29%, 26%-28%, 26%-27%, 27%-30%, 27%-29%, 27%-28%, 28%-30%, 28%-29%, 29%-30%, 5%-25%, 10%-25%, 15%-25%, 20%-29%, 20%-28%, 20%-27%, 20%-26%, 20%-25%, 5%-20%, 10%-20%, 15%-20%, 5%-15%, 10%-15%, 또는 5%-10%)의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 이들 실시양태의 한 측면에서, siRNA의 하나의 또는 두 가닥 모두의 이중 가닥 영역 내의 약 1% 내지 약 50%의 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오티드는 선택적으로 (예를 들어, 유일하게) 변형된다. 이들 실시양태의 또 다른 측면에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 약 1% 내지 약 50%의 뉴클레오티드는 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 siRNA는 siRNA의 두 가닥 모두에서 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, siRNA는 적어도 하나의 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드를 포함하고, 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드 및 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드는 이중 가닥 영역 내에 존재하는 유일한 2'OMe 뉴클레오티드이다. 이들 실시양태의 또 다른 측면에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 약 1% 내지 약 50%의 뉴클레오티드는 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 siRNA는 변형된 siRNA의 두 가닥 모두에서 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, siRNA는 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드, 2'OMe-아데노신 뉴클레오티드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, siRNA는 이중 가닥 영역 내에 2'OMe-시토신 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 이들 실시양태의 추가의 측면에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 약 1% 내지 약 50%의 뉴클레오티드는 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 siRNA는 siRNA의 두 가닥 모두에서 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, siRNA는 적어도 하나의 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드를 포함하고, siRNA는 이중 가닥 영역 내에 2'OMe-시토신 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 이들 실시양태의 또 다른 측면에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 약 1% 내지 약 50%의 뉴클레오티드는 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 siRNA는 변형된 siRNA의 두 가닥 모두에서 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, siRNA는 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드, 2'OMe-아데노신 뉴클레오티드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하고, 이중 가닥 영역 내의 2'OMe 뉴클레오티드는 서로 인접하지 않는다.

siRNA 내로 도입될 수 있는 변형의 추가의 범위, 비율 및 패턴은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 20070135372에 기재되어 있다.

1. siRNA 서열의 선택

적합한 siRNA 서열은 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여 확인될 수 있다. 일반적으로, 문헌 [Elbashir et al., Nature, 411:494-498 (2001)] 및 [Elbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001])에 기재된 방법이 문헌 [Reynolds et al., Nature Biotech., 22(3):326-330 (2004)]에 제시된 합리적인 설계 규칙과 조합된다.

비제한적인 예로서, 관심있는 표적 유전자로부터의 전사체의 AUG 출발 코돈의 3'의 뉴클레오티드 서열은 디뉴클레오티드 서열 (예를 들어, AA, NA, CC, GG, 또는 UU, 여기서 N = C, G, 또는 U)에 대해 스캐닝될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Elbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001)] 참조). 디뉴클레오티드 서열의 3'에 바로 위치하는 뉴클레오티드는 잠재적인 siRNA 서열 (즉, 표적 서열 또는 센스 가닥 서열)로서 확인된다. 일반적으로, 디뉴클레오티드 서열의 3'에 바로 위치하는 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드는 잠재적인 siRNA 서열로서 확인된다. 몇몇 실시양태에서, 디뉴클레오티드 서열은 AA 또는 NA 서열이고, AA 또는 NA 디뉴클레오티드의 3'에 바로 위치하는 19개의 뉴클레오티드는 잠재적인 siRNA 서열로서 확인된다. siRNA 서열은 대체로 표적 유전자의 길이를 따라 상이한 위치에서 이격된다. siRNA 서열의 침묵 효율을 추가로 향상시키기 위해, 잠재적인 siRNA 서열은 예를 들어 표적 세포 또는 유기체에서 다른 코딩 서열에 상동성인 영역을 함유하지 않는 부위를 확인하기 위해 분석될 수 있다. 예를 들어, 약 21개 염기쌍의 적합한 siRNA 서열은 일반적으로 표적 세포 또는 유기체에서 코딩 서열에 상동성인 16-17개 초과의 연속적인 염기쌍을 갖지 않을 것이다. siRNA 서열이 RNA Pol III 프로모터로부터 발현될 경우, 4개 초과의 연속적인 A 또는 T가 결여된 siRNA 서열이 선택된다.

일단 잠재적인 siRNA 서열이 확인되면, 상보성 서열 (즉, 안티센스 가닥 서열)이 설계될 수 있다. 또한, 잠재적인 siRNA 서열은 당업계에 공지된 다양한 기준을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 이들의 침묵 효율을 향상시키기 위해, siRNA 서열은 하나 이상의 다음 특징을 갖는 서열을 확인하기 위해 합리적인 설계 알고리즘에 의해 분석될 수 있다: (1) G/C 함량: 약 25% 내지 약 60% G/C; (2) 센스 가닥의 위치 15-19의 적어도 3개의 A/U; (3) 내부 반복체의 부재; (4) 센스 가닥의 위치 19의 A; (5) 센스 가닥의 위치 3의 A; (6) 센스 가닥의 위치 10의 U; (7) 센스 가닥의 위치 19의 G/C 부재; 및 (8) 센스 가닥의 위치 13의 G의 부재. 각각의 상기 특징의 적합한 값을 할당하는 알고리즘을 포함하고 siRNA의 선택을 위해 유용한 siRNA 설계 도구는 예를 들어 http://ihome.ust.hk/~bokcmho/siRNA/siRNA.html에서 볼 수 있다. 당업자는 하나 이상의 상기 특징을 갖는 서열이 추가의 분석 및 잠재적인 siRNA 서열로서의 시험을 위해 선택될 수 있음을 이해할 것이다.

추가로, 하나 이상의 다음 기준을 갖는 잠재적인 siRNA 서열은 종종 siRNA에서 제외될 수 있다: (1) 연속적으로 4개 또는 그 초과의 동일한 염기의 스트레치 (stretch)를 포함하는 서열; (2) G의 단일중합체를 포함하는 서열 (즉, 이들 중합체의 구조적 특징에 의한 가능한 비-특이적 효과를 감소시키기 이한); (3) 삼중 염기 모티프 (예를 들어, GGG, CCC, AAA, 또는 TTT)를 포함하는 서열; (4) 연속적으로 7개 또는 그 초과의 G/C의 스트레치를 포함하는 서열; 및 (5) 내부 재폴딩 (fold-back) 구조를 생성하는, 후보 내의 4개 또는 그 초과의 염기의 직접적인 반복체를 포함하는 서열. 그러나, 당업자는 하나 이상의 상기 특징을 갖는 서열이 추가의 분석 및 잠재적인 siRNA 서열로서의 시험을 위해 선택될 수 있음을 이해할 것이다.

몇몇 실시양태에서, 잠재적인 siRNA 서열은 예를 들어 문헌 [Khvorova et al., Cell, 115:209-216 (2003)]; 및 [Schwarz et al., Cell, 115:199-208 (2003)]에 기재된 siRNA 이중체 비대칭을 기초로 하여 추가로 분석될 수 있다. 다른 실시양태에서, 잠재적인 siRNA 서열은 예를 들어 문헌 [Luo et al., Biophys. Res. Commun., 318:303-310 (2004)]에 기재된 바와 같이 표적 부위의 2차 구조를 기초로 하여 추가로 분석될 수 있다. 예를 들어, 표적 부위의 2차 구조는 염기쌍 형성 및 줄기-루프의 형태의 2차 구조가 보다 적게 존재하는 표적 부위에서의 이용가능성에 유리한 siRNA 서열을 선택하기 위해 Mfold 알고리즘 (http://mfold.burnet.edu.au/rna_form에서 이용가능함)을 사용하여 모델링될 수 있다.

일단 잠재적인 siRNA 서열이 확인되면, 서열은 예를 들어 시험관 내 시토카인 검정 또는 생체 내 동물 모델을 사용하여 임의의 면역자극성 특성의 존재에 대해 분석될 수 있다. 또한, siRNA 서열의 센스 및/또는 안티센스 가닥 내의 모티프, 예컨대 GU-풍부 모티프 (예를 들어, 5'-GU-3', 5'-UGU-3', 5'-GUGU-3', 5'-UGUGU-3' 등)는, 서열이 면역자극성일 수 있는지의 여부에 대한 지표를 제공할 수 있다. 일단 siRNA 분자가 면역자극성인 것으로 밝혀지면, 이것은 이어서 본원에 설명된 바와 같이 그의 면역자극성 특성을 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 비제한적인 예로서, siRNA 서열은 세포가, siRNA가 면역자극성 또는 비-면역자극성 siRNA인지 결정하기 위한 검출가능한 면역 반응을 생성하도록 하는 조건 하에 포유동물 응답자 세포와 접촉될 수 있다. 포유동물 응답자 세포는 나이브 (naive) 포유동물 (즉, siRNA 서열의 유전자 생성물과 이전에 접촉하지 않은 포유동물)의 세포일 수 있다. 포유동물 응답자 세포는 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 대식세포 등일 수 있다. 검출가능한 면역 반응은 시토카인 또는 성장 인자, 예컨대, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-6, IL-12, 또는 이들의 조합의 생산을 포함할 수 있다. 이어서, 면역자극성으로 확인된 siRNA 분자는 센스 및/또는 안티센스 가닥 상의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 변형된 뉴클레오티드로 교체함으로써 그의 면역자극성 특성을 감소시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, siRNA 이중체의 이중 가닥 영역 내의 약 30% 미만 (예를 들어, 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만)의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 2'OMe 뉴클레오티드로 교체될 수 있다. 이어서, 변형된 siRNA는 그의 면역자극성 특성이 감소되거나 제거되었음을 확인하기 위해 상기 설명된 바와 같이 포유동물 응답자 세포와 접촉될 수 있다.

면역 반응을 검출하기 위한 적합한 시험관 내 검정은 데이비드 (David) 등의 이중 모노클로날 항체 샌드위치 면역검정 기술 (미국 특허 4,376,110); 모노클로날-폴리클로날 항체 샌드위치 검정 (문헌 [Wide et al., Kirkham and Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh (1970)]); 고돈 (Gordon) 등의 "웨스턴 블롯 (Western blot)" 방법 (미국 특허 4,452,901); 표지된 리간드의 면역침전 (문헌 [Brown et al., J. Biol. Chem., 255:4980-4983 (1980)]); 예를 들어, 문헌 [Raines et al., J. Biol. Chem., 257:5154-5160 (1982)]에 기재된 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA); 형광단의 사용을 포함하는 면역세포화학 기술 (문헌 [Brooks et al., Clin. Exp. Immunol, 39:477 (1980)]); 및 활성의 중화 (문헌 [Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :2396-2400 (1984)])를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 설명된 면역검정에 추가로, 미국 특허 3,817,827; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 및 4,098,876에 기재된 것을 비롯한 많은 다른 면역검정이 이용가능하다. 상기 참고문헌의 개시내용은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.

면역 반응을 검출하기 위한 생체 내 모델의 비제한적인 예는 예를 들어 문헌 [Judge et al., Mol. Ther., 13:494-505 (2006)]에 기재된 생체내 마우스 시토카인 유도 검정을 포함한다. 특정 실시양태에서, 검정은 다음과 같이 수행될 수 있다: (1) siRNA는 측면 꼬리 정맥에서 표준 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있고; (2) 혈액은 투여 약 6시간 후에 심장 천자에 의해 수집되고, 시토카인 분석을 위해 혈장으로서 처리될 수 있고; (3) 시토카인은 제조자의 지시에 따라 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 정량할 수 있다 (예를 들어, 마우스 및 인간 IFN-α (피비엘 바이오메디칼 (PBL Biomedical); 미국 뉴저지주 피스카타웨이); 인간 IL-6 및 TNF-α (이바이오사이언스 (eBioscience); 미국 캘리포니아주 샌디에고); 및 마우스 IL-6, TNF-α, 및 IFN-γ (비디 바이오사이언시스 (BD Biosciences); 미국 캘리포니아주 샌디에고)).

시토카인 및 성장 인자에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체는 여러 공급처로부터 상업적으로 이용가능하고 당업계에 공지된 방법을 이용하여 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975)] 및 [Harlow and Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publication, New York (1999)] 참조). 모노클로날 항체의 생성은 이전에 문헌에 설명된 바 있고, 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다 (문헌 [Buhring et al., Hybridoma, Vol. 10, No. 1, pp. 77-78 (1991)]). 몇몇 방법에서, 모노클로날 항체는 검출을 용이하게 하기 위해 표지된다 (예를 들어, 분광, 광화학적, 생화학적, 전기적, 광학적, 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물을 사용하여).

2. siRNA 분자의 생성

siRNA는 예를 들어 하나 이상의 단리된 소형 간섭 RNA (siRNA) 이중체, 보다 긴 이중 가닥 RNA (dsRNA), 또는 DNA 플라스미드 내의 전사 카세트로부터 전사된 siRNA 또는 dsRNA를 포함하는 여러 형태로 제공될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, siRNA는 효소에 의해 또는 부분적인/완전한 유기 합성에 의해 생산될 수 있고, 변형된 리보뉴클레오티드는 시험관 내에서의 효소에 의한 또는 유기 합성에 의해 도입될 수 있다. 특정한 경우에, 각각의 가닥은 화학적으로 제조된다. RNA 분자의 합성 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Verma and Eckstein (1998)]에 기재된 또는 본원에 설명된 바와 같은 화학적 합성 방법이다.

RNA 집단은 긴 전구체 RNA를 제공하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 선택된 표적 서열에 대한 실질적인 또는 완전한 동일성을 갖는 긴 전구체 RNA가 siRNA를 제조하기 위해 사용될 수 있다. RNA는 세포 또는 조직으로부터 단리되고/되거나, 당업자에게 잘 공지된 방법에 따라 합성 및/또는 클로닝될 수 있다. RNA는 혼합된 집단 (세포 또는 조직으로부터 얻거나, cDNA로부터 전사되거나, 빼거나, 선택되는 것 등)일 수 있거나, 또는 단일 표적 서열을 나타낼 수 있다. RNA는 천연 발생 (예를 들어, 조직 또는 세포 샘플로부터 단리된), 시험관 내에서 합성 (예를 들어, T7 또는 SP6 중합효소 및 PCR 생성물 또는 클로닝된 cDNA 사용), 또는 화학적으로 합성된 것일 수 있다.

합성 RNA에서, 긴 dsRNA를 형성하기 위해 상보체는 또한 시험관 내에서 전사되고, 혼성화되어 dsRNA를 형성한다. 천연 발생 RNA 집단이 사용되면, RNA 상보체가 또한, 예를 들어 RNA 집단에 대응하는 cDNA를 전사하거나 RNA 중합효소를 이용함으로써 제공된다 (예를 들어, 이. 콜라이 RNAse III 또는 다이서에 의한 소화를 위한 dsRNA를 형성하기 위해). 이어서, 전구체 RNA는 혼성화되어 소화를 위한 이중 가닥 RNA를 형성한다. dsRNA는 대상체에게 직접 투여될 수 있거나, 투여 전에 시험관 내에서 소화될 수 있다.

RNA를 단리하고, RNA를 합성하고, 핵산을 혼성화하고, cDNA 라이브러리를 제조 및 스크리닝하고, PCR을 수행하는 방법은 PCR 방법 (미국 특허 4,683,195 및 4,683,202; 문헌 [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)] 참조)처럼 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Gubler and Hoffman, Gene, 25:263-269 (1983)]; [Sambrook et al., 상기 문헌]; [Ausubel et al., 상기 문헌] 참조). 또한, 발현 라이브러리도 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명에서의 일반적인 사용 방법을 개시하고 있는 추가의 기본 교재는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)]을 포함한다. 상기 참고문헌의 개시내용은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.

바람직하게는, siRNA는 화학적으로 합성된다. 본 발명의 siRNA 분자를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 문헌 [Usman et al., J. Am. Chem. Soc, 109:7845 (1987)]; [Scaringe et al., Nucl. Acids Res., 18:5433 (1990)]; [Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23:2677-2684 (1995)]; 및 [Wincott et al., Methods Mol. Bio., 74:59 (1997)]에 기재된 것과 같이 당업계에 공지된 임의의 다양한 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 합성은 통상적인 핵산 보호 및 커플링 기, 예컨대 5'-말단의 디메톡시트리틸 및 3'-말단의 포스포르아미다이트를 이용한다. 비제한적인 예로서, 소규모 합성이 0.2 μmol 규모 프로토콜을 사용하여 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) 합성기에서 수행될 수 있다. 별법으로, 0.2 μmol 규모에서의 합성은 프로토젠 (Protogene, 미국 캘리포니아주 팔로 알토)의 96-웰 플레이트 합성기에서 수행할 수 있다. 그러나, 보다 크거나 보다 작은 규모의 합성도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 적합한 시약, RNA 탈보호 방법, 및 RNA 정제 방법은 당업자에게 알려져 있다.

siRNA 분자는 또한 직렬식 (tandem) 합성 기술을 통해 합성될 수 있고, 여기서 두 가닥은 모두 절단가능한 링커에 의해 분리된 하나의 연속적인 올리고뉴클레오티드 단편 또는 가닥으로서 합성된 후 절단되어 별개의 단편 또는 가닥을 제공하고, 이들은 혼성화하여 siRNA 이중체를 형성한다. 링커는 폴리뉴클레오티드 링커 또는 비-뉴클레오티드 링커일 수 있다. siRNA의 직렬식 합성은 배치 (batch) 반응기, 합성 칼럼 등을 사용하여 다중웰/다중플레이트 합성 플랫폼 및 대규모 합성 플랫폼 둘 모두에 대해 쉽게 조정될 수 있다. 별법으로, siRNA 분자는 2개의 구분되는 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있고, 여기서 하나의 올리고뉴클레오티드는 siRNA의 센스 가닥을 포함하고, 다른 하나는 안티센스 가닥을 포함한다. 예를 들어, 각각의 가닥은 별개로 합성되고, 합성 및/또는 탈보호 후에 혼성화 또는 라이게이션에 의해 함께 연결된다. 특정한 다른 예에서, siRNA 분자는 하나의 연속적인 올리고뉴클레오티드 단편으로서 합성될 수 있고, 여기서 자가-상보성 센스 및 안티센스 영역은 혼성화하여 헤어핀 2차 구조를 갖는 siRNA 이중체를 형성한다.

3. siRNA 서열의 변형

특정 측면에서, siRNA 분자는 2개의 가닥, 및 이중 가닥 영역 내에 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 이중체를 포함하고, 여기서 각각의 가닥은 약 15 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이이다. 유리하게는, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형된 siRNA 서열보다 면역자극성이 더 작지만, 표적 서열의 발현을 침묵시키는 능력을 보유한다. 바람직한 실시양태에서, siRNA 분자 내로 도입된 화학적 변형의 정도는 siRNA의 면역자극성 특성의 감소 또는 제거 및 RNAi 활성의 보유 사이의 균형에 영향을 준다. 비제한적인 예로서, 관심있는 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자는 표적 유전자 발현을 침묵시키는 그의 능력을 보유하면서 siRNA에 의해 생성되는 면역 반응을 제거하기 위해 siRNA 이중체 내의 선택적인 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오티드에서 최소로 변형될 수 있다 (예를 들어, 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만 변형).

본 발명에 사용하기 적합한 변형된 뉴클레오티드의 예는 2'-O-메틸 (2'OMe), 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'F), 2'-데옥시, 5-C-메틸, 2'-O-(2-메톡시에틸) (MOE), 4'-티오, 2'-아미노, 또는 2'-C-알릴기를 갖는 리보뉴클레오티드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또한, 예컨대 문헌 [Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag Ed. (1984)]에 기재된 것과 같은 노던 입체형태를 갖는 변형된 뉴클레오티드도 siRNA 분자에 사용하기 적합하다. 상기 변형된 뉴클레오티드는 비제한적으로, 잠금 (locked) 핵산 (LNA) 뉴클레오티드 (예를 들어, 2'-0, 4'-C-메틸렌-(D-리보푸라노실) 뉴클레오티드), 2'-O-(2-메톡시에틸) (MOE) 뉴클레오티드, 2'-메틸-티오-에틸 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'F) 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-클로로 (2'Cl) 뉴클레오티드, 및 2'-아지도 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 경우에, 본원에 기재된 siRNA 분자는 하나 이상의 G-클램프 (clamp) 뉴클레오티드를 포함한다. G-클램프 뉴클레오티드는 변형이 이중체 내의 상보성 구아닌 뉴클레오티드의 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 및 훅스틴 페이스 (Hoogsteen face) 둘 모두에 수소 결합하는 능력을 부여하는 변형된 시토신 유사체를 의미한다 (예를 들어, 문헌 [Lin et al., J. Am. Chem. Soc, 120:8531-8532 (1998)] 참조). 추가로, 뉴클레오티드 염기 유사체, 예컨대, C-페닐, C-나프틸, 다른 방향족 유도체, 이노신, 아졸 카르복스아미드, 및 니트로아졸 유도체, 예컨대 3-니트로피롤, 4-니트로인돌, 5-니트로인돌, 및 6-니트로인돌을 갖는 뉴클레오티드 (예를 들어, 문헌 [Loakes, Nucl. Acids Res., 29:2437-2447 (2001)] 참조)가 siRNA 분자 내에 도입될 수 있다.

특정 실시양태에서, siRNA 분자는 하나 이상의 화학적 변형, 예컨대 말단 캡 (cap) 모이어티, 포스페이트 백본 변형 등을 추가로 포함할 수 있다. 말단 캡 모이어티의 예는 비제한적으로, 역전된 (inverted) 데옥시 무염기성 (abasic) 잔기, 글리세릴 변형, 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드, 1-(β-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드, 4'-티오 뉴클레오티드, 카르보시클릭 뉴클레오티드, 1,5-안히드로헥시톨 뉴클레오티드, L-뉴클레오티드, α-뉴클레오티드, 변형된 염기 뉴클레오티드, 쓰레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드, 비시클릭 (acyclic) 3',4'-세코 (seco) 뉴클레오티드, 비시클릭 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드, 비시클릭 3,5-디히드록시펜틸 뉴클레오티드, 3'-3'-역전된 뉴클레오티드 모이어티, 3'-3'-역전된 무염기성 모이어티, 3'-2'-역전된 뉴클레오티드 모이어티, 3'-2'-역전된 무염기성 모이어티, 5'-5'-역전된 뉴클레오티드 모이어티, 5'-5'-역전된 무염기성 모이어티, 3'-5'-역전된 데옥시 무염기성 모이어티, 5'-아미노-알킬 포스페이트, 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트, 3-아미노프로필 포스페이트, 6-아미노헥실 포스페이트, 1,2-아미노도데실 포스페이트, 히드록시프로필 포스페이트, 1,4-부탄디올 포스페이트, 3'-포스포르아미데이트, 5'-포스포르아미데이트, 헥실포스페이트, 아미노헥실 포스페이트, 3'-포스페이트, 5'-아미노, 3'-포스포로티오에이트, 5'-포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 및 가교 또는 비-가교 메틸포스포네이트 또는 5'-메르캅토 모이어티를 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 5,998,203; [Beaucage et al., Tetrahedron 49: 1925 (1993)] 참조). 포스페이트 백본 변형 (즉, 변형된 뉴클레오티드간 연결을 생성하는)의 비제한적인 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 모르폴리노, 아미데이트, 카르바메이트, 카르복시메틸, 아세트아미데이트, 폴리아미드, 술포네이트, 술폰아미드, 술파메이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 및 알킬실릴 치환을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Hunziker et al., Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417 (1995)]; [Mesmaeker et al., Novel Backbone Replacement for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39 (1994)] 참조). 상기 화학적 변형은 siRNA의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 모두의 5'-말단 및/또는 3'-말단에서 일어날 수 있다. 이들 참고문헌은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.

몇몇 실시양태에서, siRNA 분자의 센스 및/또는 안티센스 가닥은 약 1 내지 약 4개 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개)의 2'-데옥시 리보뉴클레오티드, 변형된 (예를 들어, 2'OMe) 및/또는 비변형된 우리딘 리보뉴클레오티드, 및/또는 변형된 (예를 들어, 2'OMe) 및 비변형된 뉴클레오티드의 임의의 다른 조합을 갖는 3'-말단 오버행을 추가로 포함할 수 있다.

변형된 뉴클레오티드 및 siRNA 분자 내로 도입될 수 있는 화학적 변형의 종류의 추가의 예는 예를 들어 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 UK 특허 GB 2,397,818 B 및 미국 특허 공개 20040192626, 20050282188, 및 20070135372에 기재되어 있다.

본원에 기재된 siRNA 분자는 임의로 siRNA의 한 가닥 또는 두 가닥 모두에서 하나 이상의 비-뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비-뉴클레오티드"는 당 및/또는 포스페이트 치환을 비롯하여 하나 이상의 뉴클레오티드 단위 대신에 핵산 쇄 내로 포함되고 나머지 염기가 그의 활성을 보이도록 할 수 있는 임의의 기 또는 화합물을 나타낸다. 기 또는 화합물은 통상적으로 인식되는 뉴클레오티드 염기, 예컨대 아데노신, 구아닌, 시토신, 우라실, 또는 티민을 함유하지 않고, 따라서 1'-위치에서 염기가 결여된다는 점에서 무염기성이다.

다른 실시양태에서, siRNA의 화학적 변형은 접합체를 siRNA 분자에 부착시키는 것을 포함한다. 접합체는 공유 부착, 예컨대, 생분해성 링커를 통해 siRNA의 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5' 및/또는 3'-말단에서 부착될 수 있다. 접합체는 또한 예를 들어 카르바메이트기 또는 다른 연결기를 통해 siRNA에 부착될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 20050074771, 20050043219, 및 20050158727 참조). 특정한 경우에, 접합체는 세포 내로 siRNA의 전달을 용이하게 하는 분자이다. siRNA에 대한 부착에 적합한 접합체 분자의 예는 비제한적으로, 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤, 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 인간 혈청 알부민 (HSA), 지방산, 카로테노이드, 테르펜, 담즙산, 엽산염 (예를 들어, 엽산, 엽산염 유사체 및 그의 유도체), 당 (예를 들어, 갈락토스, 갈락토사민, N-아세틸 갈락토사민, 글루코스, 만노스, 프럭토스, 푸코스 등), 인지질, 펩티드, 세포 흡수를 매개할 수 있는 세포성 수용체에 대한 리간드, 및 이들의 조합을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 공개 20030130186, 20040110296, 및 20040249178; 미국 특허 6,753,423 참조). 다른 예는 미국 특허 공개 20050119470 및 20050107325에 기재된 친지성 모이어티, 비타민, 중합체, 펩티드, 단백질, 핵산, 소분자, 올리고당, 탄수화물 클러스터 (cluster), 삽입제 (intercalator), 마이너 그루브 (minor groove) 결합제, 절단제, 및 가교결합제 접합체 분자를 포함한다. 또 다른 예는 미국 특허 공개 20050153337에 기재된 2'-O-알킬 아민, 2'-O-알콕시알킬 아민, 폴리아민, C5-양이온성 변형 피리미딘, 양이온성 펩티드, 구아니디늄기, 아미디니늄기, 양이온성 아미노산 접합체 분자를 포함한다. 추가의 예는 미국 특허 공개 20040167090에 기재된 소수성기, 막 활성 화합물, 세포 투과 화합물, 세포 표적화 신호, 상호작용 변형제, 및 입체 안정화제 접합체 분자를 포함한다. 추가의 예는 미국 특허 공개 20050239739에 기재된 접합체 분자를 포함한다. 사용된 접합체의 종류 및 siRNA 분자에 대한 접합의 정도는 RNAi 활성을 보유하면서 siRNA의 개선된 약동학적 프로파일, 생체이용률, 및/또는 안정성에 대해 평가할 수 있다. 따라서, 당업자는 임의의 다양한 잘 공지된 시험관 내 세포 배양액 또는 생체 내 동물 모델을 사용하여 개선된 특성 및 완전한 RNAi 활성을 갖는 것을 확인하기 위해 그에 부착된 다양한 접합체를 갖는 siRNA 분자를 스크리닝할 수 있다. 상기한 특허 문헌의 개시내용은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.

4. 예시적인 siRNA 실시태양

몇몇 실시양태에서, siRNA 분자의 각각의 가닥은 약 15 내지 약 60개의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 약 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 또는 19-25개의 뉴클레오티드 길이, 또는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오티드 길이)를 포함한다. 하나의 특정 실시양태에서, siRNA는 화학적으로 합성된다. 본 발명의 siRNA 분자는 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 표적 서열의 발현을 침묵시킬 수 있다.

다른 실시양태에서, siRNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, siRNA는 이중 가닥 영역 내에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 약 50% 미만 (예를 들어, 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만)의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, siRNA의 이중 가닥 영역 내의 약 1% 내지 약 50% (예를 들어, 약 5%-50%, 10%-50%, 15%-50%, 20%-50%, 25%-50%, 30%-50%, 35%-50%, 40%-50%, 45%-50%, 5%-45%, 10%-45%, 15%-45%, 20%-45%, 25%-45%, 30%-45%, 35%-45%, 40%-45%, 5%-40%, 10%-40%, 15%-40%, 20%-40%, 25%-40%, 30%-40%, 35%-40%, 5%-35%, 10%-35%, 15%-35%, 20%-35%, 25%-35%, 30%-35%, 5%-30%, 10%-30%, 15%-30%, 20%-30%, 25%-30%, 5%-25%, 10%-25%, 15%-25%, 20%-25%, 5%-20%, 10%-20%, 15%-20%, 5%-15%, 10%-15%, 또는 5%-10%)의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.

추가의 실시양태에서, siRNA는 2'-O-메틸 (2'OMe) 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'F) 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-O-(2-메톡시에틸) (MOE) 뉴클레오티드, 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드, 및 이들의 혼합물을 포함하고 이로 제한되지 않는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, siRNA는 2'OMe 뉴클레오티드 (예를 들어, 2'OMe 퓨린 및/또는 피리미딘 뉴클레오티드), 예컨대, 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드, 2'OMe-아데노신 뉴클레오티드, 2'OMe-시토신 뉴클레오티드, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 하나의 특정 실시양태에서, siRNA는 적어도 하나의 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 특정한 경우에, siRNA는 2'OMe-시토신 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, siRNA는 헤어핀 루프 구조를 포함한다.

특정 실시양태에서, siRNA는 siRNA 분자의 이중 가닥 영역의 하나의 가닥 (즉, 센스 또는 안티센스)에서 또는 두 가닥 모두에서 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오티드는 siRNA 이중체의 이중 가닥 영역 내의 선택적인 위치에서 변형된다. 우리딘 뉴클레오티드 변형의 경우, 센스 및/또는 안티센스 가닥 내의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 우리딘 뉴클레오티드는 변형된 우리딘 뉴클레오티드, 예컨대 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥 내의 모든 우리딘 뉴클레오티드는 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드이다. 구아노신 뉴클레오티드 변형에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥 내의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 구아노신 뉴클레오티드는 변형된 구아노신 뉴클레오티드, 예컨대 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥 내의 모든 구아노신 뉴클레오티드는 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드이다.

특정 실시양태에서, siRNA 서열 내의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 그 초과의 5'-GU-3' 모티프는 예를 들어 5'-GU-3' 모티프를 제거하기 위해 미스매치를 도입함으로써 및/또는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 2'OMe 뉴클레오티드를 도입함으로써 변형될 수 있다. 5'-GU-3' 모티프는 siRNA 서열의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 모두에 존재할 수 있다. 5'-GU-3' 모티프는 서로 인접할 수 있거나, 별법으로, 이들은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 초과의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 변형된 siRNA 분자는 상응하는 비변형된 siRNA 서열보다 면역자극성이 더 작다. 그러한 실시양태에서, 감소된 면역자극성 특성을 갖는 변형된 siRNA 분자는 유리하게는 표적 서열에 대한 RNAi 활성을 보유한다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 siRNA 분자의 면역자극성 특성 및 표적 유전자 발현을 침묵시키는 그의 능력은 siRNA 서열 내에서, 예컨대, siRNA 이중체의 이중 가닥 영역 내에서 최소의 및 선택적인 2'OMe 변형의 도입에 의해 균형을 이루거나 최적화될 수 있다. 특정한 경우에, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형된 siRNA보다 면역자극성이 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 더 작다. 변형된 siRNA 분자 및 상응하는 비변형된 siRNA 분자의 면역자극성 특성은 예를 들어 포유동물에서 전신 투여 또는 적절한 지질-기반 전달 시스템 (예컨대 본원에 개시된 SNALP 전달 시스템)을 사용한 포유동물 응답자 세포의 형질감염 약 2 내지 약 12시간 후에 INF-α 및/또는 IL-6 수준을 측정함으로써 결정할 수 있음이 당업자에게 쉽게 이해될 것이다.

다른 실시양태에서, 변형된 siRNA 분자는 상응하는 비변형된 siRNA의 10배보다 작거나 그와 동등한 IC₅₀ (즉, 최대 억제 농도의 1/2)를 갖는다 (즉, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형 siRNA의 IC₅₀의 10배보다 작거나 그와 동등한 IC₅₀을 갖는다). 다른 실시양태에서, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형된 siRNA 서열의 3배보다 작거나 그와 동등한 IC₅₀을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형된 siRNA의 2배보다 작거나 그와 동등한 IC₅₀을 갖는다. 당업자는 용량-반응 곡선이 생성될 수 있고, 변형된 siRNA 및 상응하는 비변형된 siRNA에 대한 IC₅₀ 값이 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 쉽게 결정될 수 있음을 쉽게 알 것이다.

또 다른 실시양태에서, 비변형된 또는 변형된 siRNA 분자는 음성 대조군 (예를 들어, 완충제 단독, 상이한 유전자를 표적으로 하는 siRNA 서열, 스크램블드 (scrambled) siRNA 서열 등)에 비해 표적 서열의 발현을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 침묵시킬 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 변형된 siRNA 분자는 상응하는 비변형된 siRNA 서열에 비해 표적 서열의 발현을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 침묵시킬 수 있다.

몇몇 실시양태에서, siRNA 분자는 예를 들어 이중 가닥 영역의 센스 및/또는 안티센스 가닥에 포스페이트 백본 변형을 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, siRNA는 예를 들어 이중 가닥 영역의 센스 및/또는 안티센스 가닥 내에 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 포스페이트 백본 변형을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, siRNA는 포스페이트 백본 변형을 포함하지 않는다.

추가의 실시양태에서, siRNA는 예를 들어 이중 가닥 영역의 센스 및/또는 안티센스 가닥 내에 2'-데옥시 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 추가의 실시양태에서, siRNA는 예를 들어 이중 가닥 영역의 센스 및/또는 안티센스 가닥 내에 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 2'-데옥시 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, siRNA는 2'-데옥시 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.

특정한 경우에, 센스 및/또는 안티센스 가닥 내의 이중 가닥 영역의 3'-말단에서 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드가 아니다. 특정한 다른 예에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥 내의 이중 가닥 영역의 3'-말단 근처의 (예를 들어, 3'-말단의 1, 2, 3, 또는 4개의 뉴클레오티드 내의) 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드가 아니다.

본원에 기재된 siRNA 분자는 이중 가닥 영역의 하나의 또는 두 측면 상에 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 가질 수 있거나, 이중 가닥 영역의 하나 또는 두 측면 상에 오버행이 결여될 수 있다 (즉, 블런트 말단부를 가질 수 있다). 특정 실시양태에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥 상의 3' 오버행은 독립적으로 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 2'OMe 뉴클레오티드 및/또는 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 다른 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.

특정 실시양태에서, ALDH RNA 또는 ALDH mRNA를 표적으로 하는 siRNA는 담체 시스템, 예컨대 핵산-지질 입자를 이용하여 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 핵산-지질 입자는 (a) ALDH를 표적으로 하는 하나 이상의 siRNA 분자; (b) 양이온성 지질 (예를 들어, DLinDMA, DLenDMA, DLin-K-C2-DMA, 및/또는 γ-DLenDMA); 및 (c) 비-양이온성 지질 (예를 들어, DPPC, DSPC, DSPE, 및/또는 콜레스테롤)를 포함한다. 특정한 경우에, 핵산-지질 입자는 입자의 응집을 방해하는 접합 지질 (예를 들어, PEG-DAA 및/또는 POZ-DAA)을 추가로 포함할 수 있다.

치료 목적을 위해 임의의 상기 기재된 ALDH 유전자의 발현을 침묵시키는데 있어서 그의 유용성 이외에, 본원에 기재된 siRNA는 또한 연구 및 개발 용도 및 진단적, 예방적, 예후, 임상, 및 다른 보건 용도에서 유용하다. 비제한적인 예로서, siRNA는 ALDH 유전자 패밀리의 특정 구성원이 치료 표적이 될 가능성을 갖는지 시험하는 것을 목적으로 하는 표적 확인 연구에 사용될 수 있다.

B. 다이서 -기질 dsRNA

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "다이서-기질 dsRNA" 또는 "전구체 RNAi 분자"는 표적 유전자의 RNA 간섭을 위해 RISC 복합체 내로 포함되는 활성 siRNA를 생산하도록 다이서에 의해 생체 내에서 처리되는 임의의 전구체 분자를 포함하도록 의도된다.

한 실시양태에서, 다이서-기질 dsRNA는 siRNA를 생산하기 위해 다이서에 의해 처리되기에 충분한 길이를 갖는다. 본 실시양태에 따르면, 다이서-기질 dsRNA는 (i) 약 25 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 약 25-60, 25-55, 25-50, 25-45, 25-40, 25-35, 또는 25-30개 뉴클레오티드 길이), 바람직하게는 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드 길이)인 제1 올리고뉴클레오티드 서열 (또한 센스 가닥으로 칭한다), 및 (ii) 생물학적 조건, 예컨대 세포의 세포질 내에서 발견되는 조건 하에 제1 서열에 어닐링하는 제2 올리고뉴클레오티드 서열 (또한 안티센스 가닥으로 칭한다)을 포함한다. 제2 올리고뉴클레오티드 서열은 약 25 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 약 25-60, 25-55, 25-50, 25-45, 25-40, 25-35, 또는 25-30개 뉴클레오티드 길이)일 수 있고, 바람직하게는 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드 길이)이다. 추가로, 다이서-기질 dsRNA의 서열 중의 하나의, 특히 안티센스 가닥의 영역은 RNAi 반응을 촉발하기 위해 표적 유전자로부터 생산된 RNA의 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보성인 적어도 약 19개 뉴클레오티드, 예를 들어, 약 19 내지 약 60개 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 19-60, 19-55, 19-50, 19-45, 19-40, 19-35, 19-30, 또는 19-25개 뉴클레오티드), 바람직하게는 약 19 내지 약 23개 뉴클레오티드 (예를 들어, 19, 20, 21, 22, 또는 23개 뉴클레오티드)의 서열 길이를 갖는다.

제2 실시양태에서, 다이서-기질 dsRNA는 다이서에 의한 그의 처리를 향상시키는 몇몇 특성을 갖는다. 본 실시양태에 따르면, dsRNA는 siRNA를 생산하기 위해 다이서에 의해 처리되기에 충분한 길이를 갖고, 적어도 하나의 다음 특성을 갖는다: (i) dsRNA는 비대칭이고, 예를 들어, 안티센스 가닥 상에 3'-오버행을 갖고/갖거나; (ii) dsRNA는 다이서 결합의 배향 및 dsRNA의 활성 siRNA로의 처리를 유도하기 위해 센스 가닥 상에 변형된 3'-말단부를 갖는다. 상기 후자의 실시양태에 따르면, 센스 가닥은 약 22 내지 약 28개 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 약 24 내지 약 30개 뉴클레오티드를 포함한다.

한 실시양태에서, 다이서-기질 dsRNA는 안티센스 가닥의 3'-말단부 상에 오버행을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 센스 가닥은 다이서 결합 및 센스 가닥의 3'-말단부에 위치한 적합한 변형제에 의한 처리를 위해 변형된다. 적합한 변형제는 뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보뉴클레오티드, 비시클로뉴클레오티드 등, 및 입체 장애 분자, 예컨대 형광 분자 등을 포함한다. 뉴클레오티드 변형제가 사용될 때, 이들은 dsRNA의 길이가 변화하지 않도록 dsRNA 내의 리보뉴클레오티드를 대체한다. 또 다른 실시양태에서, 다이서-기질 dsRNA는 안티센스 가닥의 3'-말단부 상에 오버행을 갖고, 센스 가닥은 다이서 처리를 위해 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 센스 가닥의 5'-말단부는 포스페이트를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 안티센스 가닥의 5'-말단부는 포스페이트를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 또는 두 가닥 모두는 하나 이상의 2'-O-메틸 (2'OMe) 변형된 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 안티센스 가닥은 2'OMe 변형된 뉴클레오티드를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 안티센스 가닥은 2'OMe 변형된 뉴클레오티드로 이루어진 3'-오버행을 함유한다. 안티센스 가닥은 또한 추가의 2'OMe 변형된 뉴클레오티드을 포함할 수도 있다. 센스 및 안티센스 가닥은 생물학적 조건, 예컨대 세포의 세포질 내에서 발견되는 조건 하에 어닐링한다. 추가로, 다이서-기질 dsRNA의 서열 중의 하나, 특히 안티센스 가닥의 영역은 적어도 약 19개 뉴클레오티드의 서열 길이를 갖고, 여기서 이들 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 3'-말단부에 인접한 21-뉴클레오티드 영역 내에 있고, 표적 유전자로부터 생산된 RNA의 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보성이다. 추가로, 본 실시양태에 따르면, 다이서-기질 dsRNA는 또한 하나 이상의 다음과 같은 추가의 특성을 가질 수 있다: (a) 안티센스 가닥은 전형적인 21-mer로부터 우측 이동을 보이고 (즉, 안티센스 가닥은 전형적인 21-mer에 비해 분자의 우측 상에 뉴클레오티드를 포함한다); (b) 가닥은 완전히 상보성인 것은 아닐 수 있고, 즉, 가닥은 단순 미스매치 페어링 (pairing)을 포함할 수 있고; (c) 염기 변형, 예컨대 잠금 핵산(들)이 센스 가닥의 5'-말단부 내에 포함될 수 있다.

제3 실시양태에서, 센스 가닥은 약 25 내지 약 28개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 25, 26, 27, 또는 28개의 뉴클레오티드)를 포함하고, 여기서 센스 가닥의 3'-말단부 상의 2개의 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다. 센스 가닥은 5'-말단에서 포스페이트를 함유한다. 안티센스 가닥은 약 26 내지 약 30개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드)를 포함하고, 1-4개 뉴클레오티드의 3'-오버행을 함유한다. 3'-오버행을 포함하는 뉴클레오티드는 2'OMe 변형된 리보뉴클레오티드를 사용하여 변형된다. 안티센스 가닥은 3'-오버행에 인접한 안티센스 가닥의 제1 단량체에서 출발하고, 15-19개 뉴클레오티드를 3'-오버행에 인접한 제1 단량체로부터 연장시키는, 번갈아 존재하는 2'OMe 변형된 뉴클레오티드를 함유한다. 예를 들어, 27-뉴클레오티드 안티센스 가닥에서 안티센스 가닥의 5'-말단부의 제1 염기를 위치 번호 1로 계수할 때, 2'OMe 변형은 염기 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 26, 및 27에 위치할 것이다. 한 실시양태에서, 다이서-기질 dsRNA는 다음 구조를 갖는다:

(서열 1)

(서열 2)

여기서, "X" = RNA, "p" = 포스페이트기, "X" = 2'OMe RNA, "Y"는, 임의로 2'OMe RNA 단량체인 1, 2, 3, 또는 4개의 RNA 단량체로 이루어진 오버행 도메인이고, "D" = DNA이다. 상부 가닥이 센스 가닥이고, 하부 가닥이 안티센스 가닥이다.

제4 실시양태에서, 다이서-기질 dsRNA는 다이서에 의한 그의 처리를 향상시키는 몇몇의 특성을 갖는다. 본 실시양태에 따르면, dsRNA는 siRNA를 생성하기 위해 다이서에 의해 처리되기에 충분한 길이 및 적어도 하나의 다음 특성을 갖는다: (i) dsRNA는 비대칭이고, 예를 들어, 센스 가닥 상에 3'-오버행을 갖고; (ii) dsRNA는 다이서 결합의 배향 및 dsRNA의 활성 siRNA로의 처리를 유도하기 위해 안티센스 가닥 상에 변형된 3'-말단부를 갖는다. 본 실시양태에 따르면, 센스 가닥은 약 24 내지 약 30개 뉴클레오티드 (예를 들어, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드)를 포함하고, 안티센스 가닥은 약 22 내지 약 28개 뉴클레오티드 (예를 들어, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드)를 포함한다. 한 실시양태에서, 다이서-기질 dsRNA는 센스 가닥의 3'-말단부 상에 오버행을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 3'-말단부에 위치하는 적합한 변형제에 의해 다이서 결합 및 처리를 위해 변형된다. 적합한 변형제는 뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보뉴클레오티드, 비시클로뉴클레오티드 등, 및 입체 장애 분자, 예컨대 형광 분자 등을 포함한다. 뉴클레오티드 변형제가 사용될 때, 이들은 dsRNA의 길이가 변하지 않도록 dsRNA 내의 리보뉴클레오티드를 교체한다. 또 다른 실시양태에서, dsRNA는 센스 가닥의 3'-말단부 상에 오버행을 갖고, 안티센스 가닥은 다이서 처리를 위해 변형된다. 한 실시양태에서, 안티센스 가닥은 5'-포스페이트를 갖는다. 센스 및 안티센스 가닥은 생물학적 조건, 예컨대 세포의 세포질에서 발견되는 조건 하에 어닐링한다. 추가로, dsRNA의 서열 중의 하나, 특히 안티센스 가닥의 영역은 적어도 19개 뉴클레오티드의 서열 길이를 갖고, 여기서 이들 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 3'-말단부에 인접하고, 표적 유전자로부터 생산된 RNA의 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보성이다. 추가로, 본 실시양태에 따르면, 다이서-기질 dsRNA는 또한 하나 이상의 다음과 같은 추가의 특성을 가질 수 있다: (a) 안티센스 가닥은 전형적인 21-mer로부터 좌측 이동을 보이고 (즉, 안티센스 가닥은 전형적인 21-mer에 비해 분자의 좌측 상에 뉴클레오티드를 포함한다); (b) 가닥은 완전히 상보성인 것은 아닐 수 있고, 즉, 가닥은 단순 미스매치 페어링을 포함할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 다이서-기질 dsRNA는 센스 가닥이 25-염기쌍 길이이고 안티센스 가닥이 2개 염기의 3'-오버행을 갖는 27-염기쌍 길이인 비대칭 구조를 갖는다. 특정한 경우에, 비대칭 구조를 갖는 상기 dsRNA는 2개의 리보뉴클레오티드 대신에, 센스 가닥의 3'-말단부에서 2개의 데옥시뉴클레오티드를 추가로 함유한다. 특정한 다른 예에서, 비대칭 구조를 갖는 상기 dsRNA는 안티센스 가닥의 위치 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 및 25에서 2'OMe 변형을 추가로 함유한다 (여기서, 안티센스 가닥의 5'-말단에서 제1 염기는 위치 1이다). 특정한 추가의 예에서, 비대칭 구조를 갖는 상기 dsRNA는 1, 2, 3, 또는 4개의 2'OMe 뉴클레오티드를 포함하는, 안티센스 가닥 상의 3'-오버행을 추가로 함유한다 (예를 들어, 안티센스 가닥의 위치 26 및 27에서의 2'OMe 뉴클레오티드의 3'-오버행).

또 다른 실시양태에서, 다이서-기질 dsRNA는 먼저 적어도 19개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥 siRNA 서열을 선택함으로써 설계할 수 있다. 몇몇 예에서, 안티센스 siRNA는 약 24 내지 약 30개 뉴클레오티드의 길이를 제공하기 위해 5'-말단부에 약 5 내지 약 11개의 리보뉴클레오티드를 포함하도록 변형된다. 안티센스 가닥의 길이가 21개 뉴클레오티드이면, 3-9, 바람직하게는 4-7, 또는 보다 바람직하게는 6개 뉴클레오티드의 길이가 5'-말단부 상에 첨가될 수 있다. 첨가된 리보뉴클레오티드는 표적 유전자 서열에 상보성일 수 있지만, 표적 서열과 안티센스 siRNA 사이의 완전한 상보성은 요구되지 않는다. 즉, 생성된 안티센스 siRNA는 표적 서열과 실질적으로 상보성이다. 이어서, 약 22 내지 약 28개의 뉴클레오티드를 갖는 센스 가닥이 생산된다. 센스 가닥은 안티센스 가닥과 실질적으로 상보성이고, 따라서 생물학적 조건 하에 안티센스 가닥에 어닐링한다. 한 실시양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 다이서 처리를 유도하기 위해 변형된 3'-말단부를 함유하도록 합성된다. 또 다른 실시양태에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-오버행을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 센스 가닥은 다이서 결합 및 처리를 위해 변형된 3'-말단부를 함유하도록 합성되고, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-오버행을 갖는다.

관련 실시양태에서, 안티센스 siRNA는 약 22 내지 약 28개 뉴클레오티드의 길이를 제공하기 위해 5'-말단부 상에 약 1 내지 약 9개의 리보뉴클레오티드를 포함하도록 변형될 수 있다. 안티센스 가닥의 길이가 21개 뉴클레오티드이면, 1-7, 바람직하게는 2-5, 또는 보다 바람직하게는 4개의 리보뉴클레오티드가 3'-말단부 상에 첨가될 수 있다. 첨가된 리보뉴클레오티드는 임의의 서열을 가질 수 있다. 첨가된 리보뉴클레오티드는 표적 유전자 서열에 상보성일 수 있지만, 표적 서열과 안티센스 siRNA 사이의 완전한 상보성은 요구되지 않는다. 즉, 생성되는 안티센스 siRNA는 표적 서열과 실질적으로 상보성이다. 이어서, 약 24 내지 약 30개의 뉴클레오티드를 갖는 센스 가닥이 생산된다. 센스 가닥은 안티센스 가닥과 실질적으로 상보성이고, 따라서 생물학적 조건 하에 안티센스 가닥에 어닐링한다. 한 실시양태에서, 안티센스 가닥은 다이서 처리를 유도하기 위해 변형된 3'-말단부를 함유하도록 합성된다. 또 다른 실시양태에서, dsRNA의 센스 가닥은 3'-오버행을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 안티센스 가닥은 다이서 결합 및 처리를 위해 변형된 3'-말단부를 함유하도록 합성되고, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-오버행을 갖는다.

siRNA 서열을 설계하고, 합성하고, 변형시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여 적합한 다이서-기질 dsRNA 서열이 확인되고, 합성되고, 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 다이서-기질 dsRNA는 ALDH 유전자 발현을 침묵시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, ALDH mRNA를 표적으로 하는 다이서-기질 dsRNA는 담체 시스템, 예컨대 핵산-지질 입자를 이용하여 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 핵산-지질 입자는 (a) ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 하나 이상의 다이서-기질 dsRNA 분자; (b) 양이온성 지질 (예를 들어, DLinDMA, DLenDMA, DLin-K-C2-DMA, 및/또는 γ-DLenDMA); 및 (c) 비-양이온성 지질 (예를 들어, DPPC, DSPC, DSPE, 및/또는 콜레스테롤)을 포함한다. 특정한 경우에, 핵산-지질 입자는 입자의 응집을 방지하는 접합 지질 (예를 들어, PEG-DAA 및/또는 POZ-DAA)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다이서-기질 dsRNA, 및 그러한 dsRNA를 설계하고 합성하는 방법에 관련된 추가의 실시양태는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 20050244858, 20050277610, 및 20070265220, 2011/0071208에 기재되어 있다.

C. shRNA

"소형 헤어핀 RNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA"는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 침묵시키기 위해 사용될 수 있는 단단한 헤어핀 턴 (turn)을 만드는 짧은 RNA 서열을 포함한다. 본 발명의 shRNA는 화학적으로 합성되거나 또는 DNA 플라스미드 내의 전사 카세트로부터 전사될 수 있다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 기구에 의해 siRNA로 절단된 후 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC)에 결합된다.

본 발명의 shRNA는 일반적으로 약 15-60, 15-50, 또는 15-40개 (이중체) 뉴클레오티드 길이, 보다 일반적으로 약 15-30, 15-25, 또는 19-25개 (이중체) 뉴클레오티드 길이이고, 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23개 (이중체) 뉴클레오티드 길이이다 (예를 들어, 이중 가닥 shRNA의 각각의 상보성 서열은 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 또는 19-25개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23개 뉴클레오티드 길이이고, 이중 가닥 shRNA는 약 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 또는 19-25개 염기쌍 길이, 바람직하게는 약 18-22, 19-20, 또는 19-21개 염기쌍 길이이다). shRNA 이중체는 안티센스 가닥 상의 약 1 내지 약 4개 뉴클레오티드 또는 약 2 내지 약 3개 뉴클레오티드의 3' 오버행 및/또는 센스 가닥 상에 5'-포스페이트 말단을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, shRNA는 약 15 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 약 15-60, 15-55, 15-50, 15-45, 15-40, 15-35, 15-30, 또는 15-25개 뉴클레오티드 길이), 바람직하게는 약 19 내지 약 40개 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 약 19-40, 19-35, 19-30, 또는 19-25개 뉴클레오티드 길이), 보다 바람직하게는 약 19 내지 약 23개 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 19, 20, 21, 22, 또는 23개 뉴클레오티드 길이)의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 서열을 포함한다.

shRNA의 비제한적인 예는 단일 가닥 분자로부터 조립된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자 (여기서, 센스 및 안티센스 영역은 핵산-기반 또는 비-핵산-기반 링커에 의해 연결된다); 및 자가-상보성 센스 및 안티센스 영역을 갖는 헤어핀 2차 구조를 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, shRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 약 1 내지 약 25개 뉴클레오티드, 약 2 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 4 내지 약 15개 뉴클레오티드, 약 5 내지 약 12개 뉴클레오티드, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 초과의 뉴클레오티드를 포함하는 루프 구조에 의해 연결된다.

적합한 shRNA 서열은 siRNA 서열을 설계하고, 합성하고, 변형시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여 확인되고, 합성되고, 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 shRNA는 ALDH 유전자 발현을 침묵시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, ALDH mRNA를 표적으로 하는 shRNA는 담체 시스템, 예컨대 핵산-지질 입자를 이용하여 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 핵산-지질 입자는 (a) ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 하나 이상의 shRNA 분자; (b) 양이온성 지질 (예를 들어, DLinDMA, DLenDMA, DLin-K-C2-DMA, 및/또는 γ-DLenDMA); 및 (c) 비-양이온성 지질 (예를 들어, DPPC, DSPC, DSPE, 및/또는 콜레스테롤)을 포함한다. 특정한 경우에, 핵산-지질 입자는 입자의 응집을 방지하는 접합 지질 (예를 들어, PEG-DAA 및/또는 POZ-DAA)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 shRNA, 및 그러한 shRNA를 설계하고 합성하는 방법에 관련된 추가의 실시양태는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 공개 2011/0071208에 기재되어 있다.

D. aiRNA

siRNA와 마찬가지로, 비대칭 간섭 RNA (aiRNA)는 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC)를 동원하고, 안티센스 가닥의 5' 말단부에 비해 뉴클레오티드 10과 11 사이의 표적 서열의 서열-특이적 절단을 매개함으로써 포유동물 세포에서 다양한 유전자의 효과적인 침묵을 유도할 수 있다 (문헌 [Sun et al., Nat. Biotech., 26: 1379-1382 (2008)]). 일반적으로, aiRNA 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 짧은 RNA 이중체를 함유하고, 여기서 이중체는 안티센스 가닥의 3' 및 5' 말단부에서 오버행을 함유한다. aiRNA는 일반적으로 센스 가닥이 상보성 안티센스 가닥에 비해 두 말단부 모두에서 더 짧기 때문에 비대칭이다. 몇몇 측면에서, aiRNA 분자는 설계되고, 합성되고, siRNA 분자에 대해 사용된 것과 유사한 유사한 조건 하에 어닐링될 수 있다. 비제한적인 예로서, aiRNA 서열은 siRNA 서열을 선택하기 위해 상기 설명된 방법을 사용하여 선택되고 생성될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 다양한 길이 (예를 들어, 약 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17, 또는 14-17개 염기쌍, 보다 일반적으로 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 염기쌍)의 aiRNA 이중체는 관심있는 mRNA를 표적으로 하기 위해 안티센스 가닥의 3' 및 5' 말단부에 오버행을 갖도록 설계될 수 있다. 특정한 경우에, aiRNA 분자의 센스 가닥은 약 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17, 또는 14-17개 뉴클레오티드 길이, 보다 일반적으로 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드 길이이다. 특정한 다른 예에서, aiRNA 분자의 안티센스 가닥은 약 15-60, 15-50, 또는 15-40개 뉴클레오티드 길이, 보다 일반적으로 약 15-30, 15-25, 또는 19-25개 뉴클레오티드 길이이고, 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23개 뉴클레오티드 길이이다.

몇몇 실시양태에서, 5' 안티센스 오버행은 1, 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 비표적화 뉴클레오티드 (예를 들어, "AA", "UU", "dTdT" 등)을 함유한다. 다른 실시양태에서, 3' 안티센스 오버행은 1, 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 비표적화 뉴클레오티드 (예를 들어, "AA", "UU", "dTdT" 등)를 함유한다. 특정한 측면에서, 본원에 기재된 aiRNA 분자는 예를 들어 이중 가닥 (이중체) 영역 내에 및/또는 안티센스 오버행 내에 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, aiRNA 서열은 siRNA 서열에 대해 상기 설명된 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, aiRNA 분자는 2'OMe 뉴클레오티드, 예컨대, 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.

특정 실시양태에서, aiRNA 분자는 siRNA 분자, 예를 들어, 본원에 기재된 하나의 siRNA 분자의 안티센스 가닥에 상응하는 안티센스 가닥을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 aiRNA는 ALDH 유전자 발현을 침묵시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, ALDH mRNA를 표적으로 하는 aiRNA는 담체 시스템, 예컨대 핵산-지질 입자를 이용하여 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 핵산-지질 입자는 (a) ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 하나 이상의 aiRNA 분자; (b) 양이온성 지질 (예를 들어, DLinDMA, DLenDMA, DLin-K-C2-DMA, 및/또는 γ-DLenDMA); 및 (c) 비-양이온성 지질 (예를 들어, DPPC, DSPC, DSPE, 및/또는 콜레스테롤)을 포함한다. 특정한 경우에, 핵산-지질 입자는 입자의 응집을 방지하는 접합 지질 (예를 들어, PEG-DAA 및/또는 POZ-DAA)를 추가로 포함할 수 있다.

적합한 aiRNA 서열은 siRNA 서열을 설계하고, 합성하고, 변형시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여 확인되고, 합성되고, 변형될 수 있다. 본 발명의 aiRNA 분자에 관련된 추가의 실시양태는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 12/343,342 (2008년 12월 23일 출원), 및 미국 특허 출원 12/424,367 (2009년 4월 15일 출원)에 기재되어 있다.

E. miRNA

일반적으로, 마이크로RNA (miRNA)는 유전자 발현을 조절하는 약 21-23개 뉴클레오티드 길이의 단일 가닥 RNA 분자이다. miRNA는 이들이 그의 DNA로부터 전사되는 유전자에 의해 코딩되지만, miRNA는 단백질로 번역되지 않고 (비-코딩 RNA); 대신에, 각각의 일차 전사체 (pri-miRNA)는 프리-miRNA로 불리는 짧은 줄기-루프 구조로 처리되고, 최종적으로 기능적 성숙 miRNA로 처리된다. 성숙 miRNA 분자는 하나 이상의 메신저 RNA (mRNA) 분자에 부분적으로 또는 완전하게 상보성이고, 이들의 주요 기능은 유전자 발현을 하향조절하는 것이다. miRNA 분자의 확인은 예를 들어 문헌 [Lagos-Quintana et al., Science, 294:853-858]; [Lau et al., Science, 294:858-862]; 및 [Lee et al., Science, 294:862-864]에 기재되어 있다.

miRNA를 코딩하는 유전자는 처리된 성숙 miRNA 분자보다 훨씬 더 길다. miRNA는 처음에 캡 및 폴리-A 테일 (tail)을 갖는 일차 전사체 또는 pri-miRNA로서 전사되고, 세포 핵에서 프리-miRNA로서 알려진 짧은, ~70 뉴클레오티드 줄기-루프 구조로 처리된다. 상기 처리는 동물에서 뉴클레아제 드로샤 (Drosha) 및 이중 가닥 RNA 결합 단백질 파샤 (Pasha)로 이루어진 마이크로프로세서 (Microprocessor) 복합체로 알려진 단백질 복합체에 의해 수행된다 (문헌 [Denli et al., Nature, 432:231-235 (2004)]). 이어서, 이들 프리-miRNA는 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC)의 형성을 또한 개시시키는 엔도뉴클레아제 다이서와의 상호작용에 의해 세포질에서 성숙 miRNA로 처리된다 (문헌 [Bernstein et al., Nature, 409:363-366 (2001)]). DNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 miRNA를 생성하는 주형으로서 기능할 수 있다.

다이서가 프리-miRNA 줄기-루프를 절단할 때, 2개의 상보성의 짧은 RNA 분자가 형성되지만, 단지 하나만이 RISC 복합체로 통합된다. 상기 가닥은 가이드 (guide) 가닥으로 알려져 있고, 5' 말단부의 안정성을 기초로 하여 RISC 복합체 내의 촉매적 활성 RNase인 아르고노트 (argonaute) 단백질에 의해 선택된다 (문헌 [Preall et al., Curr. Biol, 16:530-535 (2006)]). 남아있는 가닥 (항-가이드 또는 패신저 (passenger) 가닥으로서 공지됨)은 RISC 복합체 기질로서 분해된다 (문헌 [Gregory et al., Cell, 123:631-640 (2005)]). 활성 RISC 복합체 내로 통합 후에, miRNA 염기는 이들의 상보성 mRNA 분자와 쌍을 형성하고, 표적 mRNA 분해 및/또는 번역 침묵을 유도한다.

포유동물 miRNA 분자는 대체로 표적 mRNA 서열의 3' UTR 내의 부위에 상보성이다. 특정한 경우에, 표적 mRNA에 대한 miRNA의 어닐링은 단백질 번역 기구를 차단함으로써 단백질 번역을 억제한다. 특정한 다른 예에서, 표적 mRNA에 대한 miRNA의 어닐링은 RNA 간섭 (RNAi)과 유사한 과정을 통해 표적 mRNA의 절단 및 분해를 용이하게 한다. 또한, miRNA는 표적화된 mRNA에 대응하는 게놈 부위의 메틸화를 표적으로 할 수 있다. 일반적으로, miRNA는 miRNP로 총칭하는 단백질의 상보체와 함께 기능한다.

특정한 측면에서, 본원에 기재된 miRNA 분자는 약 15-100, 15-90, 15-80, 15-75, 15-70, 15-60, 15-50, 또는 15-40개 뉴클레오티드 길이, 보다 일반적으로 약 15-30, 15-25, 또는 19-25개 뉴클레오티드 길이이고, 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 다른 측면에서, miRNA 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, miRNA 서열은 siRNA 서열에 대해 상기 설명된 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, miRNA 분자는 2'OMe 뉴클레오티드, 예컨대, 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, miRNA 분자는 ALDH 유전자 발현을 침묵시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, ALDH mRNA를 표적으로 하는 miRNA는 담체 시스템, 예컨대 핵산-지질 입자를 이용하여 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 핵산-지질 입자는 (a) ALDH 유전자 발현을 표적으로 하는 하나 이상의 miRNA 분자; (b) 양이온성 지질 (예를 들어, DLinDMA, DLenDMA, DLin-K-C2-DMA, 및/또는 γ-DLenDMA); 및 (c) 비-양이온성 지질 (예를 들어, DPPC, DSPC, DSPE, 및/또는 콜레스테롤)을 포함한다. 특정한 경우에, 핵산-지질 입자는 입자의 응집을 방지하는 접합 지질 (예를 들어, PEG-DAA 및/또는 POZ-DAA)을 추가로 포함한다.

다른 실시양태에서, ALDH mRNA를 표적으로 하는 miRNA의 활성을 차단하는 하나 이상의 적용제는 본 발명의 지질 입자 (예를 들어, 핵산-지질 입자)를 이용하여 투여된다. 차단제의 예는 입체 차단 올리고뉴클레오티드, 잠금 핵산 올리고뉴클레오티드, 및 모르폴리노 올리고뉴클레오티드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 그러한 차단제는 직접 miRNA에 또는 표적 RNA 상의 miRNA 결합 부위에 결합할 수 있다.

V. 치료 핵산을 함유하는 담체 시스템

한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 치료 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA, 예컨대 dsRNA)을 함유하는 담체 시스템을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 담체 시스템은 지질-기반 담체 시스템, 예컨대 지질 입자 (예를 들어, SNALP), 양이온성 지질 또는 리포솜 핵산 복합체 (즉, 리포플렉스 (lipoplex)), 리포솜, 미셀 (micelle), 비로좀, 또는 이들의 혼합물이다. 다른 실시양태에서, 담체 시스템은 중합체-기반 담체 시스템, 예컨대 양이온성 중합체-핵산 복합체 (즉, 폴리플렉스 (polyplex))이다. 추가의 실시양태에서, 담체 시스템은 시클로덱스트린-기반 담체 시스템, 예컨대 시클로덱스트린 중합체-핵산 복합체이다. 추가의 실시양태에서, 담체 시스템은 단백질-기반 담체 시스템, 예컨대 양이온성 펩티드-핵산 복합체이다. 바람직하게는, 담체 시스템은 지질 입자, 예컨대 SNALP이다. 당업자는 본 발명의 치료 핵산이 또한 네이키드 (naked) 분자로서 전달될 수 있음을 이해할 것이다.

A. 지질 입자

특정한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 치료 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA, 예컨대 dsRNA) 및 하나 이상의 양이온성 (아미노) 지질 또는 그의 염을 포함하는 지질 입자를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 지질 입자는 하나 이상의 비-양이온성 지질을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 지질 입자는 입자 응집을 감소시키거나 억제할 수 있는 하나 이상의 접합 지질을 추가로 포함한다.

본 발명의 지질 입자는 바람직하게는 치료 핵산, 예컨대 간섭 RNA (예를 들어, siRNA), 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 입자의 응집을 억제하는 접합 지질을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 치료 핵산은 지질 입자 내의 치료 핵산이 수용액 내에서 뉴클레아제 분해에 대해서 저항성이 되도록 지질 입자의 지질 부분 내에서 완전히 캡슐화된다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 지질 입자는 포유동물, 예컨대 인간에 대해 실질적으로 무독성이다. 본 발명의 지질 입자는 대개 평균 직경이 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 또는 약 70 내지 약 90 nm이다. 본 발명의 지질 입자는 또한 일반적으로 지질:치료제 (예를 들어, 지질:핵산) 비율 (질량/질량비)이 약 1:1 내지 약 100:1, 약 1:1 내지 약 50:1, 약 2:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 20:1, 약 5:1 내지 약 15:1, 또는 약 5:1 내지 약 10:1이다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 지질 입자는 간섭 RNA (예를 들어, dsRNA, 예컨대 siRNA, 다이서-기질 dsRNA, shRNA, aiRNA, 및/또는 miRNA), 양이온성 지질 (예를 들어, 본원에 제시된 화학식 I-III의 하나 이상의 양이온성 지질 또는 그의 염), 비-양이온성 지질 (예를 들어, 하나 이상의 인지질 및 콜레스테롤의 혼합물), 및 입자의 응집을 억제하는 접합 지질 (예를 들어, 하나 이상의 PEG-지질 접합체)을 포함하는, 혈청에서 안정성인 핵산-지질 입자 (SNALP)이다. SNALP는 본원에 기재된 하나 이상의 유전자를 표적으로 하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 비변형된 및/또는 변형된 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)를 포함할 수 있다. 핵산-지질 입자 및 이들의 제조 방법은 예를 들어, 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 5,753,613; 5,785,992; 5,705,385; 5,976,567; 5,981,501; 6,110,745; 및 6,320,017; 및 PCT 공개 WO 96/40964에 기재되어 있다.

본 발명의 핵산-지질 입자에서, 핵산은 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화되어, 핵산을 뉴클레아제 분해로부터 보호할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산, 예컨대 간섭 RNA를 포함하는 SNALP는 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화되어, 뉴클레아제 분해로부터 핵산을 보호한다. 특정한 경우에, SNALP 내의 핵산은 37℃에서 적어도 약 20, 30, 45, 또는 60분 동안 뉴클레아제에 대한 입자의 노출 후에 실질적으로 분해되지 않는다. 특정한 다른 예에서, SNALP 내의 핵산은 입자를 혈청 내에서 37℃에서 적어도 약 30, 45, 또는 60분 동안 또는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 또는 36시간 동안 인큐베이팅한 후에 실질적으로 분해되지 않는다. 다른 실시양태에서, 핵산은 입자의 지질 부분과 복합체화한다. 본 발명의 제제의 이점 중 하나는 핵산-지질 입자 조성물이 포유동물, 예컨대 인간에 대해 실질적으로 무독성이라는 것이다.

용어 "완전히 캡슐화된"은 핵산-지질 입자 내의 핵산이 유리 DNA 또는 RNA를 유의하게 분해할 혈청 또는 뉴클레아제 검정에 노출된 후 유의하게 분해되지 않음을 나타낸다. 완전 캡슐화된 시스템에서, 정상적으로는 100%의 유리 핵산을 분해할 처리에서 바람직하게는 입자 내의 약 25% 미만의 핵산이 분해되고, 보다 바람직하게는 입자 내의 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 핵산이 분해된다. "완전히 캡슐화된"은 또한 핵산-지질 입자가 혈청에서 안정성임을, 즉, 입자가 생체 내 투여시에 이들의 성분 부분으로 신속하게 분해되지 않음을 나타낸다.

핵산의 측면에서, 완전 캡슐화는 핵산과 회합될 때 향상된 형광을 보이는 염료를 이용하는 막-불투과성 형광 염료 배제 검정을 수행함으로써 결정될 수 있다. 특정 염료, 예컨대 올리그린(OliGreen)^® 및 리보그린(RiboGreen)^® (인비트로젠 코포레이션 (Invitrogen Corp.); 미국 캘리포니아주 칼스바드)은 플라스미드 DNA, 단일 가닥 데옥시리보뉴클레오티드, 및/또는 단일- 또는 이중 가닥 리보뉴클레오티드의 정량적 결정을 위해 이용가능하다. 캡슐화는 염료를 리포솜 제제에 첨가하고, 생성되는 형광을 측정하고, 이것을 소량의 비이온성 세제의 첨가 시에 관찰된 형광에 비교함으로써 결정된다. 리포솜성 이중층의 세제-매개된 파괴는 캡슐화된 핵산을 방출하고, 이에 의해 핵산은 막-불투과성 염료와 상호작용할 수 있다. 핵산 캡슐화는 다음 식으로 계산될 수 있다: E = (I_o - I)/I_o (여기서, I/I_o는 세제의 첨가 전후의 형광 강도임) (문헌 [Wheeler et al., Gene Ther., 6:271-281 (1999)] 참조).

다른 실시양태에서, 본 발명은 복수의 핵산-지질 입자를 포함하는 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP) 조성물을 제공한다.

몇몇 경우에, SNALP 조성물은 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)의 입자가 그 내부에 캡슐화된 핵산을 갖도록, 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화된 핵산을 포함한다.

다른 예에서, SNALP 조성물은 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)의 투입 핵산이 입자 내에 캡슐화되도록, 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화된 핵산을 포함한다.

본 발명의 지질 입자의 의도된 용도에 따라, 성분의 비율은 상이할 수 있고, 특정 제제의 전달 효율은 예를 들어 엔도솜 방출 파라미터 (ERP) 검정을 이용하여 측정할 수 있다.

1. 양이온성 지질

임의의 다양한 양이온성 지질 또는 그의 염이 본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)에서, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 양이온성 지질 종 또는 비-양이온성 지질 종과 조합하여 사용될 수 있다. 양이온성 지질은 그의 (R) 및/또는 (S) 거울상 이성질체를 포함한다.

한 측면에서, 다음 구조를 갖는 화학식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염이 본 발명에서 유용하다:

<화학식 I>

상기 식에서, R¹ 및 R²는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 수소 (H) 또는 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, C₂-C₆ 알케닐, 또는 C₂-C₆ 알키닐이거나, R¹ 및 R²는 함께 연결되어 4 내지 6개의 탄소 원자 및 질소 (N), 산소 (O), 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자의 임의로 치환된 헤테로사이클 고리를 형성할 수 있고;

R³은 존재하지 않거나 또는 수소 (H) 또는 사급 아민을 제공하기 위한 C₁-C₆ 알킬이고;

R⁴ 및 R⁵는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 임의로 치환된 C₁₀-C₂₄ 알킬, C₁₀-C₂₄ 알케닐, C₁₀-C₂₄ 알키닐, 또는 C₁₀-C₂₄ 아실이고, 여기서 R⁴ 및 R⁵ 중 적어도 하나는 적어도 2개의 불포화 부위를 포함하고;

n은 0, 1, 2, 3, 또는 4이다.

몇몇 실시양태에서, R¹ 및 R²는 독립적으로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬, C₂-C₄ 알케닐, 또는 C₂-C₄ 알키닐이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, R¹ 및 R²는 둘 모두 메틸기이다. 다른 바람직한 실시양태에서, n은 1 또는 2이다. 다른 실시양태에서, R³은 pH가 양이온성 지질의 pKa를 초과할 때 존재하지 않고, R³은 아미노 헤드기가 양성자화되도록 pH가 양이온성 지질의 pKa 미만일 때 수소이다. 다른 실시양태에서, R³은 사급 아민을 제공하기 위한 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬이다. 추가의 실시양태에서, R⁴ 및 R⁵는 독립적으로 임의로 치환된 C₁₂-C₂₀ 또는 C₁₄-C₂₂ 알킬, C₁₂-C₂₀ 또는 C₁₄-C₂₂ 알케닐, C₁₂-C₂₀ 또는 C₁₄-C₂₂ 알키닐, 또는 C₁₂-C₂₀ 또는 C₁₄-C₂₂ 아실이고, 여기서 R⁴ 및 R⁵ 중 적어도 하나는 적어도 2개의 불포화 부위를 포함한다.

특정 실시양태에서, R⁴ 및 R⁵는 도데카디에닐 모이어티, 테트라데카디에닐 모이어티, 헥사데카디에닐 모이어티, 옥타데카디에닐 모이어티, 이코사디에닐 모이어티, 도데카트리에닐 모이어티, 테트라데카트리에닐 모이어티, 헥사데카트리에닐 모이어티, 옥타데카트리에닐 모이어티, 이코사트리에닐 모이어티, 아라키도닐 모이어티, 및 도코사헥사에노일 모이어티, 및 이들의 아실 유도체 (예를 들어, 리놀레오일, 리놀레노일, γ-리놀레노일 등)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 몇몇 예에서, R⁴ 및 R⁵ 중 하나는 분지형 알킬기 (예를 들어, 피타닐 모이어티) 또는 그의 아실 유도체 (예를 들어, 피타노일 모이어티)를 포함한다. 특정한 경우에, 옥타데카디에닐 모이어티는 리놀레일 모이어티이다. 특정한 다른 예에서, 옥타데카트리에닐 모이어티는 리놀레닐 모이어티 또는 γ-리놀레닐 모이어티이다. 특정 실시양태에서, R⁴ 및 R⁵ 는 둘 모두 리놀레일 모이어티, 리놀레닐 모이어티, 또는 γ-리놀레닐 모이어티이다. 특정 실시양태에서, 화학식 I의 양이온성 지질은 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLenDMA), 1,2-디리놀레일옥시-(N,N-디메틸)-부틸-4-아민 (C2-DLinDMA), 1,2-디리놀레오일옥시-(N,N-디메틸)-부틸-4-아민 (C2-DLinDAP), 또는 이들의 혼합물이다.

몇몇 실시양태에서, 화학식 I의 양이온성 지질은 하나 이상의 양이온과 함께 염 (바람직하게는 결정질 염)을 형성한다. 하나의 특정 실시양태에서, 화학식 I의 양이온성 지질은 그의 옥살레이트 (예를 들어, 헤미옥살레이트) 염이고, 이것은 바람직하게는 결정질 염이다.

양이온성 지질, 예컨대 DLinDMA 및 DLenDMA, 및 추가의 양이온성 지질의 합성은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 20060083780에 기재되어 있다. 양이온성 지질, 예컨대 C2-DLinDMA 및 C2-DLinDAP, 및 추가의 양이온성 지질의 합성은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 국제 특허 출원 WO2011/000106에 기재되어 있다.

또 다른 측면에서, 다음 구조를 갖는 화학식 II의 양이온성 지질 (또는 그의 염)이 본 발명에서 유용하다:

<화학식 II>

상기 식에서, R¹ 및 R²는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 임의로 치환된 C₁₂-C₂₄ 알킬, C₁₂-C₂₄ 알케닐, C₁₂-C₂₄ 알키닐, 또는 C₁₂-C₂₄ 아실이고; R³ 및 R⁴는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, C₂-C₆ 알케닐, 또는 C₂-C₆ 알키닐이거나, R³ 및 R⁴는 함께 연결되어 4 내지 6개의 탄소 원자 및 질소 및 산소로부터 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자의 임의로 치환된 헤테로사이클 고리를 형성할 수 있고; R⁵는 존재하지 않거나 또는 수소 (H) 또는 사급 아민을 제공하기 위한 C₁-C₆ 알킬이고; m, n, 및 p는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 0, 1, 또는 2이고, 단, m, n, 및 p는 동시에 0이 아니고; q는 0, 1, 2, 3, 또는 4이고; Y 및 Z는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 O, S, 또는 NH이다. 바람직한 실시양태에서, q는 2이다.

몇몇 실시양태에서, 화학식 II의 양이온성 지질은 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-C2-DMA; "XTC2" 또는 "C2K"), 2,2-디리놀레일-4-(3-디메틸아미노프로필)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-C3-DMA; "C3K"), 2,2-디리놀레일-4-(4-디메틸아미노부틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-C4-DMA; "C4K"), 2,2-디리놀레일-5-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥산 (DLin-K6-DMA), 2,2-디리놀레일-4-N-메틸페피아지노-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-MPZ), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA), 2,2-디올레오일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DO-K-DMA), 2,2-디스테아로일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DS-K-DMA), 2,2-디리놀레일-4-N-모르폴리노-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-MA), 2,2-디리놀레일-4-트리메틸아미노-[1,3]-디옥솔란 클로라이드 (DLin-K-TMA.Cl), 2,2-디리놀레일-4,5-비스(디메틸아미노메틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K²-DMA), 2,2-디리놀레일-4-메틸피페르진-[1,3]-디옥솔란 (D-Lin-K-N-메틸피페르진), 또는 이들의 혼합물이다. 바람직한 실시양태에서, 화학식 II의 양이온성 지질은 DLin-K-C2-DMA이다.

몇몇 실시양태에서, 화학식 II의 양이온성 지질은 하나 이상의 음이온과 함께 염 (바람직하게는 결정질 염)을 형성한다. 하나의 특정 실시양태에서, 화학식 II의 양이온성 지질은 그의 옥살레이트 (예를 들어, 헤미옥살레이트) 염이고, 이것은 바람직하게는 결정질 염이다.

양이온성 지질, 예컨대 DLin-K-DMA, 및 추가의 양이온성 지질의 합성은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 PCT 공개 WO 09/086558에 기재되어 있다. 양이온성 지질, 예컨대 DLin-K-C2-DMA, DLin-K-C3-DMA, DLin-K-C4-DMA, DLin-K6-DMA, DLin-K-MPZ, DO-K-DMA, DS-K-DMA, DLin-K-MA, DLin-K-TMA.Cl, DLin-K²-DMA, 및 D-Lin-K-N-메틸피페르진, 및 추가의 양이온성 지질의 합성은 그 개시내용을 모든 목적을 위해 전문을 본원에 참조로 포함시킨 PCT 출원 PCT/US2009/060251 (발명의 명칭: "Improved Amino Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids", 2009년 10월 9일 출원)에 기재되어 있다.

추가의 측면에서, 다음 구조를 갖는 화학식 III의 양이온성 지질 또는 그의 염이 본 발명에서 유용하다:

<화학식 III>

상기 식에서, R¹ 및 R²는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬, C₂-C₆ 알케닐, 또는 C₂-C₆ 알키닐이거나, R¹ 및 R²는 함께 연결되어 4 내지 6개의 탄소 원자 및 질소 (N), 산소 (O), 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자의 임의로 치환된 헤테로사이클 고리를 형성할 수 있고; R³은 존재하지 않거나 또는 수소 (H) 또는 사급 아민을 제공하기 위한 C₁-C₆ 알킬이고; R⁴ 및 R⁵는 존재하지 않거나 존재하고, 존재할 경우에 동일하거나 상이하고, 독립적으로 임의로 치환된 C₁-C₁₀ 알킬 또는 C₂-C₁₀ 알케닐이고; n은 0, 1, 2, 3, 또는 4이다.

몇몇 실시양태에서, R¹ 및 R²는 독립적으로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬, C₂-C₄ 알케닐, 또는 C₂-C₄ 알키닐이다. 바람직한 실시양태에서, R¹ 및 R²는 둘 모두 메틸기이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, R⁴ 및 R⁵는 둘 모두 부틸기이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, n은 1이다. 다른 실시양태에서, R³은 pH가 양이온성 지질의 pKa를 초과할 때 존재하지 않고, R³은 아미노 헤드기가 양성자화되도록 pH가 양이온성 지질의 pKa 미만일 때 수소이다. 다른 실시양태에서, R³은 사급 아민을 제공하기 위한 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬이다. 추가의 실시양태에서, R⁴ 및 R⁵는 독립적으로 임의로 치환된 C₂-C₆ 또는 C₂-C₄ 알킬 또는 C₂-C₆ 또는 C₂-C₄ 알케닐이다.

다른 실시양태에서, 화학식 III의 양이온성 지질은 아미노 헤드기와 하나 또는 두 알킬 쇄 사이에 에스테르 연결기를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 화학식 III의 양이온성 지질은 하나 이상의 음이온과 염 (바람직하게는 결정질 염)을 형성한다. 하나의 특정 실시양태에서, 화학식 III의 양이온성 지질은 그의 옥살레이트 (예를 들어, 헤미옥살레이트) 염이고, 이것은 바람직하게는 결정질 염이다.

화학식 III 내의 각각의 알킬 쇄가 위치 6, 9, 및 12에 시스 이중 결합 (즉, 시스,시스,시스-Δ⁶,Δ⁹,Δ¹²)을 함유하지만, 다른 실시양태에서, 하나 또는 둘 모두의 알킬 쇄 내의 이들 이중 결합 중 1, 2, 또는 3개는 트랜스 입체형태로 존재할 수 있다.

특히 바람직한 실시양태에서, 화학식 III의 양이온성 지질은 다음 구조를 갖는다:

양이온성 지질, 예컨대 γ-DLenDMA, 및 추가의 양이온성 지질의 합성은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 가출원 61/222,462 (발명의 명칭: "Improved Cationic Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids", 2009년 7월 1일 출원)에 기재되어 있다.

특정 실시양태에서, 다음 구조를 갖는 양이온성 지질이 본 발명에서 유용하다:

양이온성 지질, 예컨대 DLin-M-C3-DMA ("MC3"), 및 추가의 양이온성 지질 (예를 들어, MC3의 특정 유사체)의 합성은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 가출원 61/185,800 (발명의 명칭: "Novel Lipids and Compositions for the Delivery of Therapeutics", 2009년 6월 10일 출원), 및 미국 특허 가출원 61/287,995 (발명의 명칭: "Methods and Compositions for Delivery of Nucleic Acids", 2009년 12월 18일 출원)에 기재되어 있다.

본 발명의 지질 입자에 포함될 수 있는 다른 양이온성 지질 또는 그의 염의 예는 양이온성 지질, 예컨대 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 WO2011/000106에 기재된 것, 및 양이온성 지질, 예컨대 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 (DODAC), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DODMA), 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DSDMA), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 (DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP), 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일)콜레스테롤 (DC-Chol), N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄트리플루오로아세테이트 (DOSPA), 디옥타데실아미도글리실 스페르민 (DOGS), 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디엔옥시)프로판 (CLinDMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸-1-(시스,시스-9',1-2'-옥타데카디엔옥시)프로판 (CpLinDMA), N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민 (DMOBA), 1,2-N,N'-디올레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 (DOcarbDAP), 1,2-N,N'-디리놀레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 (DLincarbDAP), 1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레이옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판 (DLin-DAC), 1,2-디리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판 (DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판 (DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판 (DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판 (DLin-MPZ), 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올 (DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오 (DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판 (DLin-EG-DMA), 1,2-디올레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DO-C-DAP), 1,2-디미리스트올레오일-3-디메틸아미노프로판 (DMDAP), 1,2-디올레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 (DOTAP.Cl), 디리놀레일메틸-3-디메틸아미노프로피오네이트 (DLin-M-C2-DMA; 또한 DLin-M-K-DMA 또는 DLin-M-DMA로도 알려짐), 및 이들의 혼합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 지질 입자에 포함될 수 있는 추가의 양이온성 지질 또는 그의 염은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 20090023673에 기재되어 있다.

양이온성 지질, 예컨대 CLinDMA, 및 추가의 양이온성 지질의 합성은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 20060240554에 기재되어 있다. 양이온성 지질, 예컨대 DLin-C-DAP, DLinDAC, DLinMA, DLinDAP, DLin-S-DMA, DLin-2-DMAP, DLinTMA.Cl, DLinTAP.Cl, DLinMPZ, DLinAP, DOAP, 및 DLin-EG-DMA, 및 추가의 양이온성 지질의 합성은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 PCT 공개 WO 09/086558에 기재되어 있다. 양이온성 지질, 예컨대 DO-C-DAP, DMDAP, DOTAP.Cl, DLin-M-C2-DMA, 및 추가의 양이온성 지질의 합성은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 PCT 출원 PCT/US2009/060251 (발명의 명칭: "Improved Amino Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids", 2009년 10월 9일 출원)에 기재되어 있다. 많은 다른 양이온성 지질 및 관련 유사체의 합성은 각각 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 5,208,036; 5,264,618; 5,279,833; 5,283,185; 5,753,613; 및 5,785,992; 및 PCT 공개 WO 96/10390에 기재되어 있다. 추가로, 양이온성 지질의 많은 시판 제제, 예컨대, 리포펙틴(LIPOFECTIN)^® (인비트로젠으로부터 이용가능한 DOTMA 및 DOPE 포함); 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)^® (인비트로젠으로부터 이용가능한 DOSPA 및 DOPE 포함); 및 트랜스펙탐(TRANSFECTAM)^® (프로메가 코프 (Promega Corp.)로부터 이용가능한 DOGS 포함)이 사용될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 양이온성 지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 50 몰% 내지 약 90 몰%, 약 50 몰% 내지 약 85 몰%, 약 50 몰% 내지 약 80 몰%, 약 50 몰% 내지 약 75 몰%, 약 50 몰% 내지 약 70 몰%, 약 50 몰% 내지 약 65 몰%, 약 50 몰% 내지 약 60 몰%, 약 55 몰% 내지 약 65 몰%, 또는 약 55 몰% 내지 약 70 몰% (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)를 구성한다. 특정 실시양태에서, 양이온성 지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 50 몰%, 51 몰%, 52 몰%, 53 몰%, 54 몰%, 55 몰%, 56 몰%, 57 몰%, 58 몰%, 59 몰%, 60 몰%, 61 몰%, 62 몰%, 63 몰%, 64 몰%, 또는 65 몰% (또는 그의 임의의 비율)를 구성한다.

다른 실시양태에서, 양이온성 지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 2 몰% 내지 약 60 몰%, 약 5 몰% 내지 약 50 몰%, 약 10 몰% 내지 약 50 몰%, 약 20 몰% 내지 약 50 몰%, 약 20 몰% 내지 약 40 몰%, 약 30 몰% 내지 약 40 몰%, 또는 약 40 몰% (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)를 구성한다.

본 발명의 지질 입자에 사용하기 적합한 양이온성 지질의 추가의 비율 및 범위는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 PCT 공개 WO 09/127060, U.S. 특허 출원 공개 US 2011/0071208, PCT 공개 WO2011/000106, 및 U.S. 특허 출원 공개 US 2011/0076335에 기재되어 있다.

본 발명의 지질 입자에 존재하는 양이온성 지질의 비율은 목표량이고, 제제 내에 존재하는 양이온성 지질의 실제량은 예를 들어 ± 5 몰%만큼 상이할 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 1:57 지질 입자 (예를 들어, SNALP) 제제에서, 양이온성 지질의 목표량은 57.1 몰%이지만, 양이온성 지질의 실제량은 목표량의 ± 5 몰%, ± 4 몰%, ± 3 몰%, ± 2 몰%, ± 1 몰%, ± 0.75 몰%, ± 0.5 몰%, ± 0.25 몰%, 또는 ± 0.1 몰%일 수 있음을 이해하여야 하고, 여기서 제제의 나머지는 다른 지질 성분 (입자 내에 존재하는 총 지질의 100 몰%까지 첨가함)으로 이루어진다.

2. 비- 양이온성 지질

본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)에서 사용된 비-양이온성 지질은 안정한 복합체를 생산할 수 있는 임의의 다양한 중성의 하전되지 않은, 쯔비터이온성, 또는 음이온성 지질일 수 있다.

비-양이온성 지질의 비제한적인 예는 인지질, 예컨대 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 라이소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 달걀 (egg) 스핑고미엘린 (ESM), 세팔린, 카르디오리핀, 포스파티드산, 세레브로시드, 디세틸포스페이트, 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE), 팔미토일올레이올-포스파티딜글리세롤 (POPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트 (DOPE-mal), 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸-포스파티딜에탄올아민, 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민 (DEPE), 스테아로일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (SOPE), 라이소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 다른 디아실포스파티딜콜린 및 디아실포스파티딜에탄올아민 인지질이 또한 사용될 수 있다. 이들 지질 내의 아실기는 바람직하게는 C₁₀-C₂₄ 탄소 쇄를 갖는 지방산으로부터 유래된 아실기, 예를 들어, 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일, 또는 올레오일이다.

비-양이온성 지질의 추가의 예는 스테롤, 예컨대 콜레스테롤 및 그의 유도체를 포함한다. 콜레스테롤 유도체의 비제한적인 예는 극성 유사체, 예컨대 5α-콜레스타놀, 5β-코프로스타놀, 콜레스테릴-(2'-히드록시)-에틸 에테르, 콜레스테릴-(4'-히드록시)-부틸 에테르, 및 6-케토콜레스타놀; 비-극성 유사체, 예컨대 5α-콜레스탄, 콜레스테논, 5α-콜레스타논, 5β-콜레스타논, 및 콜레스테릴 데카노에이트; 및 이들의 혼합물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 콜레스테롤 유도체는 극성 유사체, 예컨대 콜레스테릴-(4'-히드록시)-부틸 에테르이다. 콜레스테릴-(2'-히드록시)-에틸 에테르의 합성은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 PCT 공개 WO 09/127060에 기재되어 있다.

몇몇 실시양태에서, 지질 입자 (예를 들어, SNALP) 내에 존재하는 비-양이온성 지질은 하나 이상의 인지질 및 콜레스테롤 또는 그의 유도체의 혼합물을 포함하거나 그로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 지질 입자 (예를 들어, SNALP) 내에 존재하는 비-양이온성 지질은 하나 이상의 인지질, 예를 들어, 콜레스테롤이 없는 지질 입자 제제를 포함하거나 그로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 지질 입자 (예를 들어, SNALP) 내에 존재하는 비-양이온성 지질은 콜레스테롤 또는 그의 유도체, 예를 들어, 인지질이 없는 지질 입자 제제를 포함하거나 그로 이루어진다.

본 발명에서 사용하기 적합한 비-양이온성 지질의 다른 예는 비-인 함유 지질, 예컨대, 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤리시놀레에이트, 헥사데실 스테아레이트, 이소프로필 미리스테이트, 양쪽성 아크릴계 중합체, 트리에탄올아민-라우릴 술페이트, 알킬-아릴 술페이트 폴리에틸옥실화 지방산 아미드, 디옥타데실디메틸 암모늄 브로마이드, 세라미드, 스핑고미엘린 등을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 비-양이온성 지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 10 몰% 내지 약 60 몰%, 약 20 몰% 내지 약 55 몰%, 약 20 몰% 내지 약 45 몰%, 약 20 몰% 내지 약 40 몰%, 약 25 몰% 내지 약 50 몰%, 약 25 몰% 내지 약 45 몰%, 약 30 몰% 내지 약 50 몰%, 약 30 몰% 내지 약 45 몰%, 약 30 몰% 내지 약 40 몰%, 약 35 몰% 내지 약 45 몰%, 약 37 몰% 내지 약 42 몰%, 또는 약 35 몰%, 36 몰%, 37 몰%, 38 몰%, 39 몰%, 40 몰%, 41 몰%, 42 몰%, 43 몰%, 44 몰%, 또는 45 몰% (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)를 구성한다.

지질 입자가 인지질 및 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체의 혼합물을 함유하는 실시양태에서, 혼합물은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 40 몰%, 45 몰%, 50 몰%, 55 몰%, 또는 60 몰%까지 구성할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 혼합물 내의 인지질 성분은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 2 몰% 내지 약 20 몰%, 약 2 몰% 내지 약 15 몰%, 약 2 몰% 내지 약 12 몰%, 약 4 몰% 내지 약 15 몰%, 또는 약 4 몰% 내지 약 10 몰% (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)를 구성할 수 있다. 바람직한 특정 실시양태에서, 혼합물 내의 인지질 성분은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 10 몰%, 약 5 몰% 내지 약 9 몰%, 약 5 몰% 내지 약 8 몰%, 약 6 몰% 내지 약 9 몰%, 약 6 몰% 내지 약 8 몰%, 또는 약 5 몰%, 6 몰%, 7 몰%, 8 몰%, 9 몰%, 또는 10 몰% (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)를 구성할 수 있다. 비제한적인 예로서, 인지질 및 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 1:57 지질 입자 제제는 예를 들어, 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 34 몰% (또는 그의 임의의 비율)의 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체와의 혼합물 내에 인지질, 예컨대 DPPC 또는 DSPC를 약 7 몰% (또는 그의 임의의 비율)로 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 7:54 지질 입자 제제는 예를 들어, 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 32 몰% (또는 그의 임의의 비율)의 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체와의 혼합물 내에 인지질, 예컨대 DPPC 또는 DSPC를 약 7 몰% (또는 그의 임의의 비율)로 포함할 수 있다.

다른 실시양태에서, 혼합물 내의 콜레스테롤 성분은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 25 몰% 내지 약 45 몰%, 약 25 몰% 내지 약 40 몰%, 약 30 몰% 내지 약 45 몰%, 약 30 몰% 내지 약 40 몰%, 약 27 몰% 내지 약 37 몰%, 약 25 몰% 내지 약 30 몰%, 또는 약 35 몰% 내지 약 40 몰% (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)를 구성할 수 있다. 바람직한 특정 실시양태에서, 혼합물 내의 콜레스테롤 성분은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 25 몰% 내지 약 35 몰%, 약 27 몰% 내지 약 35 몰%, 약 29 몰% 내지 약 35 몰%, 약 30 몰% 내지 약 35 몰%, 약 30 몰% 내지 약 34 몰%, 약 31 몰% 내지 약 33 몰%, 또는 약 30 몰%, 31 몰%, 32 몰%, 33 몰%, 34 몰%, 또는 35 몰% (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)를 구성한다. 일반적으로, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 1:57 지질 입자 제제는 예를 들어, 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 7 몰% (또는 그의 임의의 비율)의 인지질, 예컨대 DPPC 또는 DSPC와의 혼합물 내에 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체를 약 34 몰% (또는 그의 임의의 비율)로 포함할 수 있다. 일반적으로, 인지질 및 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 7:54 지질 입자 제제는 예를 들어, 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 7 몰% (또는 그의 임의의 비율)의 인지질, 예컨대 DPPC 또는 DSPC와의 혼합물 내에 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체를 약 32 몰% (또는 그의 임의의 비율)로 포함할 수 있다.

지질 입자에 인지질이 없는 실시양태에서, 콜레스테롤 또는 그의 유도체는 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 25 몰%, 30 몰%, 35 몰%, 40 몰%, 45 몰%, 50 몰%, 55 몰%, 또는 60 몰%까지 구성할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 인지질이 없는 지질 입자 제제 내의 콜레스테롤 또는 그의 유도체는 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 25 몰% 내지 약 45 몰%, 약 25 몰% 내지 약 40 몰%, 약 30 몰% 내지 약 45 몰%, 약 30 몰% 내지 약 40 몰%, 약 31 몰% 내지 약 39 몰%, 약 32 몰% 내지 약 38 몰%, 약 33 몰% 내지 약 37 몰%, 약 35 몰% 내지 약 45 몰%, 약 30 몰% 내지 약 35 몰%, 약 35 몰% 내지 약 40 몰%, 또는 약 30 몰%, 31 몰%, 32 몰%, 33 몰%, 34 몰%, 35 몰%, 36 몰%, 37 몰%, 38 몰%, 39 몰%, 또는 40 몰% (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)를 구성할 수 있다. 비제한적인 예로서, 1:62 지질 입자 제제는 콜레스테롤을 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 37 몰% (또는 그의 임의의 비율)로 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 7:58 지질 입자 제제는 콜레스테롤을 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 35 몰% (또는 그의 임의의 비율)로 포함할 수 있다.

다른 실시양태에서, 비-양이온성 지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 90 몰%, 약 10 몰% 내지 약 85 몰%, 약 20 몰% 내지 약 80 몰%, 약 10 몰% (예를 들어, 인지질 단독), 또는 약 60 몰% (예를 들어, 인지질 및 콜레스테롤 또는 그의 유도체) (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)를 구성한다.

본 발명의 지질 입자에 사용하기 적합한 비-양이온성 지질의 추가의 비율 및 범위는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 PCT 공개 WO 09/127060, U.S. 특허 출원 공개 US 2011/0071208, PCT 공개 WO2011/000106, 및 U.S. 특허 출원 공개 US 2011/0076335에 기재되어 있다.

본 발명의 지질 입자에 존재하는 비-양이온성 지질의 비율은 목표량이고, 제제 내에 존재하는 비-양이온성 지질의 실제량은 예를 들어 ± 5 몰%만큼 상이할 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 1:57 지질 입자 (예를 들어, SNALP) 제제에서, 인지질의 목표량은 7.1 몰%이고 콜레스테롤의 목표량은 34.3 몰%이지만, 인지질의 실제량은 목표량의 ± 2 몰%, ± 1.5 몰%, ± 1 몰%, ± 0.75 몰%, ± 0.5 몰%, ± 0.25 몰%, 또는 ± 0.1 몰%이고, 콜레스테롤의 실제량은 목표량의 ± 3 몰%, ± 2 몰%, ± 1 몰%, ± 0.75 몰%, ± 0.5 몰%, ± 0.25 몰%, 또는 ± 0.1 몰%일 수 있음을 이해하여야 하고, 여기서 제제의 나머지는 다른 지질 성분 (입자 내에 존재하는 총 지질의 100 몰%까지 첨가함)으로 이루어진다. 이와 유사하게, 7:54 지질 입자 (예를 들어, SNALP) 제제에서, 인지질의 목표량은 6.75 몰%이고 콜레스테롤의 목표량은 32.43 몰%이지만, 인지질의 실제량은 목표량의 ± 2 몰%, ± 1.5 몰%, ± 1 몰%, ± 0.75 몰%, ± 0.5 몰%, ± 0.25 몰%, 또는 ± 0.1 몰%일 수 있고, 콜레스테롤의 실제량은 목표량의 ± 3 몰%, ± 2 몰%, ± 1 몰%, ± 0.75 몰%, ± 0.5 몰%, ± 0.25 몰%, 또는 ± 0.1 몰%일 수 있고, 여기서 제제의 나머지는 다른 지질 성분 (입자 내에 존재하는 총 지질의 100 몰%까지 첨가함)으로 이루어진다.

3. 지질 접합체

양이온성 및 비-양이온성 지질에 추가로, 본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 지질 접합체를 추가로 포함할 수 있다. 접합된 지질은 입자의 응집을 방지한다는 점에서 유용하다. 적합한 접합된 지질은 PEG-지질 접합체, POZ-지질 접합체, ATTA-지질 접합체, 양이온성-중합체-지질 접합체 (CPL), 및 이들의 혼합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 입자는 PEG-지질 접합체 또는 ATTA-지질 접합체를 CPL과 함께 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 지질 접합체는 PEG-지질이다. PEG-지질의 예는 예를 들어, PCT 공개 WO 05/026372에 기재된 디알킬옥시프로필에 결합된 PEG (PEG-DAA), 예를 들어, 미국 특허 공개 20030077829 및 2005008689에 기재된 디아실글리세롤에 결합된 PEG (PEG-DAG), 인지질, 예컨대 포스파티딜에탄올아민에 결합된 PEG (PEG-PE), 예를 들어, 미국 특허 5,885,613에 기재된 세라미드에 접합된 PEG, 콜레스테롤에 접합된 PEG 또는 그의 유도체, 및 이들의 혼합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 특허 문헌의 개시내용은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.

본 발명에서 사용하기 적합한 추가의 PEG-지질은 비제한적으로, mPEG2000-1,2-디-O-알킬-sn3-카르보모일글리세라이드 (PEG-C-DOMG)를 포함한다. PEG-C-DOMG의 합성은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 PCT 공개 WO 09/086558에 기재되어 있다. 또 다른 추가의 적합한 PEG-지질 접합체는 비제한적으로, 1-[8'-(1,2-디미리스토일-3-프로판옥시)-카르복스아미드-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-ω-메틸-폴리(에틸렌 글리콜) (2KPEG-DMG)을 포함한다. 2KPEG-DMG의 합성은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 7,404,969에 기재되어 있다.

PEG는 2개의 말단 히드록실기를 갖는 에틸렌 PEG 반복 단위의 수용성 선형 중합체이다. PEG는 그들의 분자량에 의해 분류되고; 예를 들어, PEG 2000은 평균 분자량이 약 2,000 달톤이고, PEG 5000은 평균 분자량이 약 5,000 달톤이다. PEG는 시그마 케미컬 캄파니 (Sigma Chemical Co.) 및 다른 회사로부터 상업적으로 이용가능하고, 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (MePEG-OH), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙시네이트 (MePEG-S), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙신이미딜 숙시네이트 (MePEG-S-NHS), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-아민 (MePEG-NH₂), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-트레실레이트 (MePEG-TRES), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-이미다졸릴-카르보닐 (MePEG-IM), 및 말단 메톡시기 대신에 말단 히드록실기를 함유하는 상기 화합물 (예를 들어, HO-PEG-S, HO-PEG-S-NHS, HO-PEG-NH₂ 등). 다른 PEG, 예컨대 미국 특허 6,774,180 및 7,053,150에 기재된 것 (예를 들어, mPEG (20 KDa) 아민)도 본 발명의 PEG-지질 접합체를 제조하기 위해 유용하다. 이들 특허 문헌의 개시내용은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다. 추가로, 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-아세트산 (MePEG-CH₂COOH)이 예를 들어 PEG-DAA 접합체를 비롯한 PEG-지질 접합체를 제조하기 위해 특히 유용하다.

본원에 기재된 PEG-지질 접합체의 PEG 모이어티의 평균 분자량은 약 550 달톤 내지 약 10,000 달톤일 수 있다. 특정한 경우에, PEG 모이어티의 평균 분자량은 약 750 달톤 내지 약 5,000 달톤 (예를 들어, 약 1,000 달톤 내지 약 5,000 달톤, 약 1,500 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 2,000 달톤 등)이다. 바람직한 실시양태에서, PEG 모이어티의 평균 분자량은 약 2,000 달톤 또는 약 750 달톤이다.

특정한 경우에, PEG는 임의로 알킬, 알콕시, 아실, 또는 아릴기로 치환될 수 있다. PEG는 지질에 직접 접합될 수 있거나, 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG를 지질에 커플링하기 위해 적합한 임의의 링커 모이어티, 예를 들어, 에스테르 비함유 링커 모이어티 및 에스테르 함유 링커 모이어티를 사용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 링커 모이어티는 에스테르 비함유 링커 모이어티이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "에스테르 비함유 링커 모이어티"는 카르복실 에스테르 결합 (-OC(O)-)을 함유하지 않는 링커 모이어티를 나타낸다. 적합한 에스테르 비함유 링커 모이어티는 아미도 (-C(O)NH-), 아미노 (-NR-), 카르보닐 (-C(O)-), 카르바메이트 (-NHC(O)O-), 우레아 (-NHC(O)NH-), 디술파이드 (-S-S-), 에테르 (-O-), 숙시닐 (-(O)CCH₂CH₂C(O)-), 숙신아미딜 (-NHC(O)CH₂CH₂C(O)NH-), 에테르, 디술파이드, 및 이들의 조합 (예컨대 카르바메이트 링커 모이어티 및 아미도 링커 모이어티를 모두 함유하는 링커)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 카르바메이트 링커가 PEG를 지질에 결합시키기 위해 사용된다.

다른 실시양태에서, 에스테르 함유 링커 모이어티가 PEG를 지질에 결합시키기 위해 사용된다. 적합한 에스테르 함유 링커 모이어티는 예를 들어, 카르보네이트 (-OC(O)O-), 숙시노일, 포스페이트 에스테르 (-O-(O)POH-O-), 술포네이트 에스테르, 및 이들의 조합물을 포함한다.

상이한 쇄 길이 및 포화도의 다양한 아실 쇄 기를 갖는 포스파티딜에탄올아민이 지질 접합체를 형성하기 위해 PEG에 접합될 수 있다. 그러한 포스파티딜에탄올아민은 상업적으로 이용가능하거나, 또는 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 단리되거나 합성될 수 있다. 탄소 쇄 길이가 C₁₀ 내지 C₂₀의 범위인 포화 또는 불포화 지방산을 함유하는 포스파티딜-에탄올아민이 바람직하다. 일- 또는 이-불포화 지방산 및 포화 및 불포화 지방산의 혼합물을 갖는 포스파티딜에탄올아민도 사용할 수 있다. 적합한 포스파티딜에탄올아민은 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 및 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

용어 "ATTA" 또는 "폴리아미드"는 비제한적으로, 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 6,320,017 및 6,586,559에 기재된 화합물을 포함한다. 이들 화합물은 다음 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:

<화학식 IV>

상기 식에서, R은 수소, 알킬 및 아실로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고; R¹은 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이거나; 또는 임의로, R 및 R¹ 및 이들이 부착되는 질소는 아지도 모이어티를 형성하고; R²는 수소, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 아릴 및 아미노산의 측쇠 중에서 선택된 군의 구성원이고; R³은 수소, 할로겐, 히드록시, 알콕시, 메르캅토, 히드라지노, 아미노 및 NR⁴R⁵ (여기서, R⁴ 및 R⁵는 독립적으로 수소 또는 알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고; n은 4 내지 80이고; m은 2 내지 6이고; p는 1 내지 4이고; q는 0 또는 1이다. 다른 폴리아미드가 본 발명의 화합물에서 사용될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

용어 "디아실글리세롤" 또는 "DAG"는 둘 모두가 에스테르 연결기에 의해 글리세롤의 1- 및 2-위치에 결합된 2 내지 30개의 탄소를 독립적으로 갖는 2개의 지방 아실 쇄 R¹ 및 R²를 갖는 화합물을 포함한다. 아실기는 포화되거나 또는 상이한 불포화도를 가질 수 있다. 적합한 아실기는 라우로일 (C₁₂), 미리스토일 (C₁₄), 팔미토일 (C₁₆), 스테아로일 (C₁₈), 및 이코소일 (C₂₀)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, R¹ 및 R²는 동일하고, 즉, R¹ 및 R²는 둘 모두 미리스토일 (즉, 디미리스토일)이거나, R¹ 및 R²는 둘 모두 스테아로일 (즉, 디스테아로일) 등이다. 디아실글리세롤은 다음 일반식을 포함한다:

<화학식 V>

용어 "디알킬옥시프로필" 또는 "DAA"는 둘 모두가 2 내지 30개의 탄소를 독립적으로 갖는 2개의 알킬 쇄 R¹ 및 R²를 갖는 화합물을 포함한다. 알킬기는 포화되거나 또는 상이한 불포화도를 가질 수 있다. 디알킬옥시프로필은 다음 일반식을 갖는다:

<화학식 VI>

바람직한 실시양태에서, PEG-지질은 다음 화학식을 갖는 PEG-DAA 접합체이다:

<화학식 VII>

상기 식에서, R¹ 및 R²는 독립적으로 선택되고, 약 10 내지 약 22개 탄소 원자를 갖는 장쇄 알킬기이고; PEG는 폴리에틸렌글리콜이고; L은 상기 설명된 에스테르 비함유 링커 모이어티 또는 에스테르 함유 링커 모이어티이다. 장쇄 알킬기는 포화 또는 불포화될 수 있다. 적합한 알킬기는 데실 (C₁₀), 라우릴 (C₁₂), 미리스틸 (C₁₄), 팔미틸 (C₁₆), 스테아릴 (C₁₈), 및 이코실 (C₂₀)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, R¹ 및 R²는 동일하고, 즉, R¹ 및 R²는 둘 모두 미리스틸 (즉, 디미리스틸)이거나, R¹ 및 R²는 둘 모두 스테아릴 (즉, 디스테아릴) 등이다.

상기 화학식 VII에서, PEG의 평균 분자량은 약 550 달톤 내지 약 10,000 달톤이다. 특정한 경우에, PEG의 평균 분자량은 약 750 달톤 내지 약 5,000 달톤 (예를 들어, 약 1,000 달톤 내지 약 5,000 달톤, 약 1,500 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 2,000 달톤 등)이다. 바람직한 실시양태에서, PEG의 평균 분자량은 약 2,000 달톤 또는 약 750 달톤이다. PEG는 알킬, 알콕시, 아실, 또는 아릴기로 임의로 치환될 수 있다. 특정 실시양태에서, 말단 히드록실기는 메톡시 또는 메틸기로 치환된다.

바람직한 실시양태에서, "L"은 에스테르 비함유 링커 모이어티이다. 적합한 비-에스테르 함유 링커는 아미도 링커 모이어티, 아미노 링커 모이어티, 카르보닐 링커 모이어티, 카르바메이트 링커 모이어티, 우레아 링커 모이어티, 에테르 링커 모이어티, 디술파이드 링커 모이어티, 숙신아미딜 링커 모이어티, 및 이들의 조합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 에스테르 비함유 링커 모이어티는 카르바메이트 링커 모이어티 (즉, PEG-C-DAA 접합체)이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 에스테르 비함유 링커 모이어티는 아미도 링커 모이어티 (즉, PEG--DAA 접합체)이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 에스테르 비함유 링커 모이어티는 숙신아미딜 링커 모이어티 (즉, PEG-S-DAA 접합체)이다.

특정 실시양태에서, PEG-지질 접합체는 다음으로부터 선택된다:

PEG-DAA 접합체는 당업자에게 알려진 표준 기술 및 시약을 사용하여 합성된다. PEG-DAA 접합체가 다양한 아미드, 아민, 에테르, 티오, 카르바메이트, 및 우레아 연결기를 함유할 것임을 알 것이다. 당업자는 상기 결합을 형성하기 위한 방법 및 시약이 공지되어 있고 쉽게 이용가능함을 알 것이다. 예를 들어, 문헌 [March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (Wiley 1992)]; [Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (VCH 1989)]; 및 [Furniss, VOGEL'S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY, 5th ed. (Longman 1989)]을 참조한다. 또한, 존재하는 임의의 기능적 기는 PEG-DAA 접합체 합성의 상이한 지점에서 보호 및 탈보호를 필요로 할 수 있음이 이해될 것이다. 당업자는 상기 기술이 공지되어 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Green and Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wiley 1991)]을 참조한다.

바람직하게는, PEG-DAA 접합체는 PEG-디데실옥시프로필 (C₁₀) 접합체, PEG-디라우릴옥시프로필 (C₁₂) 접합체, PEG-디미리스틸옥시프로필 (C₁₄) 접합체, PEG-디팔미틸옥시프로필 (C₁₆) 접합체, 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필 (C₁₈) 접합체이다. 이들 실시양태에서, PEG의 평균 분자량은 바람직하게는 약 750 또는 약 2,000 달톤이다. 하나의 특히 바람직한 실시양태에서, PEG-지질 접합체는 PEG2000-C-DMA를 포함하고, 여기서 "2000"은 PEG의 평균 분자량을 나타내고, "C"는 카르바메이트 링커 모이어티를 나타내고, "DMA"는 디미리스틸옥시프로필을 나타낸다. 또 다른 특히 바람직한 실시양태에서, PEG-지질 접합체는 PEG750-C-DMA를 포함하고, 여기서 "750"은 PEG의 평균 분자량을 나타내고, "C"는 카르바메이트 링커 모이어티를 나타내고, "DMA"는 디미리스틸옥시프로필을 나타낸다. 특정 실시양태에서, PEG의 말단 히드록실기는 메틸기로 치환된다. 당업자는 다른 디알킬옥시프로필이 본 발명의 PEG-DAA 접합체에서 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.

상기한 것에 추가로, 다른 친수성 중합체가 PEG 대신 사용될 수 있음은 당업자에게 쉽게 자명할 것이다. PEG 대신 사용될 수 있는 적합한 중합체의 예는 폴리비닐피롤리돈, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리히드록시프로필 메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 및 유도체화된 셀룰로스, 예컨대 히드록시메틸셀룰로스 또는 히드록시에틸셀룰로스를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

상기한 성분에 추가로, 본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 양이온성 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 지질 또는 CPL을 추가로 포함할 수 있다 (예를 들어, 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 문헌 [Chen et al., Bioconj. Chem., 11:433-437 (2000)]; 미국 특허 6,852,334; PCT 공개 WO 00/62813 참조).

적합한 CPL은 하기 화학식 VIII의 화합물을 포함한다.

<화학식 VIII>

A-W-Y

상기 식에서, A, W, 및 Y는 아래에서 설명되는 바와 같다.

화학식 VIII에서, "A"는 지질 앵커 (anchor)로서 작용하는 지질 모이어티, 예컨대 양친매성 지질, 중성 지질, 또는 소수성 지질이다. 적합한 지질의 예는 디아실글리세롤릴, 디알킬글리세롤릴, N-N-디알킬아미노, 1,2-디아실옥시-3-아미노프로판, 및 1,2-디알킬-3-아미노프로판을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

"W"는 중합체 또는 올리고머, 예컨대 친수성 중합체 또는 올리고머이다. 바람직하게는, 친수성 중합체는 비면역원성이거나 또는 낮은 고유한 면역원성을 갖는 생체적합성 중합체이다. 별법으로, 친수성 중합체는 적절한 아주반트 (adjuvant)와 함께 사용되면 약한 항원성일 수 있다. 적합한 비면역원성 중합체는 PEG, 폴리아미드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산/폴리글리콜산 공중합체, 및 이들의 조합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 250 내지 약 7,000 달톤이다.

"Y"는 다가양이온성 모이어티이다. 용어 다가양이온성 모이어티는 선택된 pH, 바람직하게는 생리학적 pH에서 양전하, 바람직하게는 적어도 2개의 양전하를 갖는 화합물, 유도체, 또는 기능적 기를 의미한다. 적합한 다가양이온성 모이어티는 염기성 아미노산 및 이들의 유도체, 예컨대 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 라이신, 및 히스티딘; 스페르민; 스페르미딘; 양이온성 덴드리머; 폴리아민; 폴리아민 당; 및 아미노 다당류를 포함한다. 다가양이온성 모이어티는 구조가 선형, 예컨대 선형 테트라라이신, 분지형 또는 덴드리머일 수 있다. 다가양이온성 모이어티는 선택된 pH 값에서 약 2 내지 약 15개의 양전하, 바람직하게는 약 2 내지 약 12개의 양전하, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 8개의 양전하를 갖는다. 사용되는 다가양이온성 모이어티의 선택은 요구되는 입자 적용의 종류에 의해 결정할 수 있다.

다가양이온성 모이어티 상의 전하는 전체 입자 모이어티 주위에 분포할 수 있거나, 또는 별법으로, 입자 모이어티의 하나의 특정 영역에 전하 밀도의 별개의 농축부, 예를 들어 전하 스파이크 (charge spike)일 수 있다. 전하 밀도가 입자 상에 분포되면, 전하 밀도는 동등하게 분포되거나 불균등하게 분포될 수 있다. 다가양이온성 모이어티의 전하 분포의 모든 변동은 본 발명에 의해 포함된다.

지질 "A" 및 비면역원성 중합체 "W"는 다양한 방법에 의해, 바람직하게는 공유 부착에 의해 부착될 수 있다. 당업자에게 공지된 방법이 "A" 및 "W"의 공유 부착을 위해 사용될 수 있다. 적합한 연결기는 아미드, 아민, 카르복실, 카르보네이트, 카르바메이트, 에스테르, 및 히드라존 연결기를 포함하고 이로 제한되지 않는다. "A" 및 " W"가 연결기를 제시하기 위해 상보성 기능적 기를 가져야 함은 당업자에게 자명할 것이다. 2개의 기, 즉 지질 상의 하나 및 중합체 상의 하나 사이의 반응은 목적하는 연결기를 제공할 것이다. 예를 들어, 지질이 디아실글리세롤이고, 말단 히드록실이 예를 들어 NHS 및 DCC로 활성화되어 활성 에스테르를 형성한 후, 아미노기를 함유하는 중합체와, 예컨대 폴리아미드와 반응하면 (예를 들어, 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 6,320,017 및 6,586,559 참조), 아미드 결합이 2개의 기 사이에 형성될 것이다.

특정한 경우에, 다가양이온성 모이어티는 부착된 리간드, 예컨대 표적화 리간드 또는 칼슘 복합체화를 위한 킬레이팅 모이어티를 가질 수 있다. 바람직하게는, 리간드가 부착된 후에, 양이온성 모이어티는 양전하를 유지한다. 특정한 경우에, 부착되는 리간드는 양전하를 갖는다. 적합한 리간드는 반응성 기능기를 갖는 화합물 또는 장치를 포함하고 이로 제한되지 않고, 지질, 양친매성 지질, 담체 화합물, 생체친화도 화합물, 생체 재료, 생체 중합체, 생물의학적 장치, 분석적으로 검출가능한 화합물, 치료 활성 화합물, 효소, 펩티드, 단백질, 항체, 면역 자극제, 방사성 표지, 형광원, 비오틴, 약물, 합텐, DNA, RNA, 다당류, 리포솜, 비로좀, 미셀, 이뮤노글로불린, 기능적 기, 다른 표적화 모이어티, 또는 독소를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 지질 접합체 (예를 들어, PEG-지질)는 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 0.1 몰% 내지 약 2 몰%, 약 0.5 몰% 내지 약 2 몰%, 약 1 몰% 내지 약 2 몰%, 약 0.6 몰% 내지 약 1.9 몰%, 약 0.7 몰% 내지 약 1.8 몰%, 약 0.8 몰% 내지 약 1.7 몰%, 약 0.9 몰% 내지 약 1.6 몰%, 약 0.9 몰% 내지 약 1.8 몰%, 약 1 몰% 내지 약 1.8 몰%, 약 1 몰% 내지 약 1.7 몰%, 약 1.2 몰% 내지 약 1.8 몰%, 약 1.2 몰% 내지 약 1.7 몰%, 약 1.3 몰% 내지 약 1.6 몰%, 또는 약 1.4 몰% 내지 약 1.5 몰% (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)를 구성한다.

다른 실시양태에서, 지질 접합체 (예를 들어, PEG-지질)는 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 0 몰% 내지 약 20 몰%, 약 0.5 몰% 내지 약 20 몰%, 약 2 몰% 내지 약 20 몰%, 약 1.5 몰% 내지 약 18 몰%, 약 2 몰% 내지 약 15 몰%, 약 4 몰% 내지 약 15 몰%, 약 2 몰% 내지 약 12 몰%, 약 5 몰% 내지 약 12 몰%, 또는 약 2 몰% (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)를 구성한다.

추가의 실시양태에서, 지질 접합체 (예를 들어, PEG-지질)는 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 4 몰% 내지 약 10 몰%, 약 5 몰% 내지 약 10 몰%, 약 5 몰% 내지 약 9 몰%, 약 5 몰% 내지 약 8 몰%, 약 6 몰% 내지 약 9 몰%, 약 6 몰% 내지 약 8 몰%, 또는 약 5 몰%, 6 몰%, 7 몰%, 8 몰%, 9 몰%, 또는 10 몰% (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)를 구성한다.

본 발명의 지질 입자에 사용하기 적합한 지질 접합체의 추가의 비율 및 범위는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 PCT 공개 WO 09/127060, U.S. 특허 출원 공개 US 2011/0071208, PCT 공개 WO2011/000106, 및 U.S. 특허 출원 공개 US 2011/0076335에 기재되어 있다.

본 발명의 지질 입자에 존재하는 지질 접합체 (예를 들어, PEG-지질)의 비율은 목표량이고, 제제 내에 존재하는 지질 접합체의 실제량은 예를 들어 ± 2 몰%만큼 상이할 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 1:57 지질 입자 (예를 들어, SNALP) 제제에서, 지질 접합체의 목표량은 1.4 몰%이지만, 지질 접합체의 실제량은 목표량의 ± 0.5 몰%, ± 0.4 몰%, ± 0.3 몰%, ± 0.2 몰%, ± 0.1 몰%, 또는 ± 0.05 몰%일 수 있음을 이해하여야 하고, 여기서 제제의 나머지는 다른 지질 성분 (입자 내에 존재하는 총 지질의 100 몰%까지 첨가함)으로 이루어진다. 이와 유사하게, 7:54 지질 입자 (예를 들어, SNALP) 제제에서, 지질 접합체의 목표량 6.76 몰%이지만, 지질 접합체의 실제량은 목표량의 ± 2 몰%, ± 1.5 몰%, ± 1 몰%, ± 0.75 몰%, ± 0.5 몰%, ± 0.25 몰%, 또는 ± 0.1 몰%일 수 있고, 여기서 제제의 나머지는 다른 지질 성분 (입자 내에 존재하는 총 지질의 100 몰%까지 첨가함)으로 이루어진다.

당업자는 지질 접합체의 농도가, 사용된 지질 접합체 및 지질 입자가 융합가능성이 되는 속도에 따라 상이할 수 있음을 이해할 것이다.

지질 접합체의 조성 및 농도를 제어함으로써, 지질 접합체가 지질 입자로부터 교환되는 속도, 및 다시 지질 입자가 융합가능성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 예를 들어, PEG-DAA 접합체가 지질 접합체로서 사용될 때, 지질 입자가 융합가능성이 되는 속도는 예를 들어 지질 접합체의 농도 변화, PEG의 분자량 변화, 또는 PEG-DAA 접합체 상의 알킬기의 쇄 길이 및 불포화도의 변화에 의해 상이할 수 있다. 추가로, 예를 들어, pH, 온도, 이온 강도 등을 비롯한 다른 변수가, 지질 입자가 융합가능성이 되는 속도를 변경 및/또는 제어하기 위해 사용될 수 있다. 지질 입자가 융합가능성이 되는 속도를 제어하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법은 본원 명세서의 내용을 통해 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 지질 접합체의 조성 및 농도를 제어함으로써 지질 입자 (예를 들어, SNALP) 크기를 제어할 수 있다.

B. 추가의 담체 시스템

본 발명에서 사용하기 적합한 추가의 지질-기반 담체 시스템의 비제한적인 예는 리포플렉스 (예를 들어, 미국 특허 공개 20030203865; 및 문헌 [Zhang et al., J. Control Release, 100:165-180 (2004)] 참조), pH-감수성 리포플렉스 (예를 들어, 미국 특허 공개 20020192275 참조), 가역적으로 마스킹된 (masked) 리포플렉스 (예를 들어, 미국 특허 공개 20030180950 참조), 양이온성 지질-기반 조성물 (예를 들어, 미국 특허 6,756,054; 및 미국 특허 공개 20050234232 참조), 양이온성 리포솜 (예를 들어, 미국 특허 공개 20030229040, 20020160038, 및 20020012998; 미국 특허 5,908,635; 및 PCT 공개 WO 01/72283 참조), 음이온성 리포솜 (예를 들어, 미국 특허 공개 20030026831 참조), pH-감수성 리포솜 (예를 들어, 미국 특허 공개 20020192274; 및 AU 2003210303 참조), 항체-코팅된 리포솜 (예를 들어, 미국 특허 공개 20030108597; 및 PCT 공개 WO 00/50008 참조), 세포 종류 특이적 리포솜 (예를 들어, 미국 특허 공개 20030198664 참조), 핵산 및 펩티드를 함유하는 리포솜 (예를 들어, 미국 특허 6,207,456 참조), 방출가능 친수성 중합체로 유도체화된 지질을 함유하는 리포솜 (예를 들어, 미국 특허 공개 20030031704 참조), 지질-포획 (entrapped) 핵산 (예를 들어, PCT 공개 WO 03/057190 및 WO 03/059322 참조), 지질-캡슐화된 핵산 (예를 들어, 미국 특허 공개 20030129221; 및 미국 특허 5,756,122 참조), 다른 리포솜성 조성물 (예를 들어, 미국 특허 공개 20030035829 및 20030072794; 및 미국 특허 6,200,599 참조), 리포솜과 에멀젼의 안정화된 혼합물 (예를 들어, EP1304160 참조), 에멀젼 조성물 (예를 들어, 미국 특허 6,747,014 참조), 및 핵산 마이크로-에멀젼 (예를 들어, 미국 특허 공개 20050037086 참조)을 포함한다.

본 발명에서 사용하기 적합한 중합체-기반 담체 시스템의 예는 양이온성 중합체-핵산 복합체 (즉, 폴리플렉스)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 폴리플렉스를 형성하기 위해, 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA)은 일반적으로 핵산을 세포 표면에서 음이온성 프로테오글리칸과 상호작용하고 세포내이입 (endocytosis)에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 양하전된 입자로 응축하는 선형, 분지형, 별, 또는 수지상 중합체성 구조를 갖는 양이온성 중합체로 복합체화된다. 몇몇 실시양태에서, 폴리플렉스는 양이온성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌이민 (PEI) (예를 들어, 미국 특허 6,013,240 참조; PEI의 선형 형태인 인 비보 (In vivo) jetPEI™로서 큐바이오젠, 인크. (Qbiogene, Inc., 미국 캘리포니아주 칼스바드)로부터 상업적으로 이용가능), 폴리프로필렌이민 (PPI), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 폴리-L-라이신 (PLL), 디에틸아미노에틸 (DEAE)-덱스트란, 폴리(β-아미노 에스테르) (PAE) 중합체 (예를 들어, 문헌 [Lynn et al., J. Am. Chem. Soc, 123:8155-8156 (2001)] 참조), 키토산, 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머 (예를 들어, 문헌 [Kukowska-Latallo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:4897-4902 (1996)] 참조), 포르피린 (예를 들어, 미국 특허 6,620,805 참조), 폴리비닐에테르 (예를 들어, 미국 특허 공개 20040156909 참조), 다환식 아미디늄 (예를 들어, 미국 특허 공개 20030220289 참조), 일차 아민, 이민, 구아니딘, 및/또는 이미다졸기를 포함하는 다른 중합체 (예를 들어, 미국 특허 6,013,240; PCT 공개 WO/9602655; PCT 공개 WO95/21931; 문헌 [Zhang et al., J. Control Release, 100:165-180 (2004)]; 및 [Tiera et al., Curr. Gene Ther., 6:59-71 (2006)] 참조), 및 이들의 혼합물로 복합체화된 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리플렉스는 미국 특허 공개 20060211643, 20050222064, 20030125281, 및 20030185890, 및 PCT 공개 WO 03/066069에 기재된 양이온성 중합체-핵산 복합체; 미국 특허 공개 20040071654에 기재된 생분해성 폴리(β-아미노 에스테르) 중합체-핵산 복합체; 미국 특허 공개 20040142475에 기재된 중합체성 매트릭스를 함유하는 마이크로입자; 미국 특허 공개 20030157030에 기재된 다른 마이크로입자 조성물; 미국 특허 공개 20050123600에 기재된 응축된 핵산 복합체; 및 AU 2002358514 및 PCT 공개 WO 02/096551에 기재된 나노캡슐화 및 마이크로캡슐화 조성물을 포함한다.

특정한 경우에, 간섭 RNA는 시클로덱스트린 또는 그의 중합체로 복합체화될 수 있다. 시클로덱스트린-기반 담체 시스템의 비제한적인 예는 미국 특허 공개 20040087024에 기재된 시클로덱스트린-변형된 중합체-핵산 복합체; 미국 특허 6,509,323, 6,884,789, 및 7,091,192에 기재된 선형 시클로덱스트린 공중합체-핵산 복합체; 및 미국 특허 7,018,609에 기재된 시클로덱스트린 중합체-복합체화제-핵산 복합체를 포함한다. 특정한 다른 예에서, 간섭 RNA는 펩티드 또는 폴리펩티드로 복합체화될 수 있다. 단백질-기반 담체 시스템의 예는 PCT 공개 WO95/21931에 기재된 양이온성 올리고펩티드-핵산 복합체를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

VI . 지질 입자의 제조

본 발명의 지질 입자, 예를 들어 핵산, 예컨대 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)가 입자의 지질 부분 내에 포획되어 분해로부터 보호되는 SNALP는 연속적인 혼합 방법, 직접 희석 공정, 및 인-라인 (in-line) 희석 공정을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 형성될 수 있다.

특정 실시양태에서, 양이온성 지질은 화학식 I-III의 지질 또는 그의 염을 단독으로 또는 다른 양이온성 지질과 조합하여 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 비-양이온성 지질은 달걀 스핑고미엘린 (ESM), 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜콜린 (POPC), 디팔미토일-포스파티딜콜린 (DPPC), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸-포스파티딜에탄올아민, 14:0 PE (1,2-디미리스토일-포스파티딜에탄올아민 (DMPE)), 16:0 PE (1,2-디팔미토일-포스파티딜에탄올아민 (DPPE)), 18:0 PE (1,2-디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE)), 18:1 PE (1,2-디올레오일-포스파티딜에탄올아민 (DOPE)), 18:1 트랜스 PE (1,2-디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민 (DEPE)), 18:0-18:1 PE (1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민 (SOPE)), 16:0-18:1 PE (1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE)), 폴리에틸렌 글리콜-기반 중합체 (예를 들어, PEG 2000, PEG 5000, PEG-변형된 디아실글리세롤, 또는 PEG-변형된 디알킬옥시프로필), 콜레스테롤, 그의 유도체, 또는 이들의 조합물이다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 연속적인 혼합 방법, 예를 들어, 제1 저장기에 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA)을 포함하는 수용액을 제공하고, 제2 저장기에 유기 지질 용액을 제공하고 (여기서, 유기 지질 용액 내에 존재하는 지질은 유기 용매, 예를 들어, 저급 알칸올, 예컨대 에탄올에 가용화됨), 지질 소포체 (vesicle) 내에 핵산을 캡슐화하는 지질 소포체 (예를 들어, 리포솜)를 실질적으로 즉시 생산하기 위해 유기 지질 용액이 수용액과 혼합되도록 수용액을 유기 지질 용액과 혼합하는 것을 포함하는 공정을 통해 생산된 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP)를 제공한다. 상기 공정 및 이 공정을 수행하기 위한 장치는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 20040142025에 상세히 기재되어 있다.

지질 및 완충제 용액을 혼합 환경 내로, 예컨대 혼합 챔버에 연속적으로 도입하면, 지질 용액과 완충제 용액이 연속적으로 희석되고, 이에 의해 혼합시에 실질적으로 즉시 지질 소포체를 생성한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "지질 용액과 완충제 용액의 연속적인 희석" (및 변형 표현)은 일반적으로 지질 용액이 소포체 생성을 달성하기에 충분한 힘으로 수화 공정에서 충분히 신속하게 희석됨을 의미한다. 핵산을 포함하는 수용액을 유기 지질 용액과 혼합함으로써, 유기 지질 용액은 핵산-지질 입자를 생산하기 위해 완충제 용액 (즉, 수용액)의 존재 하에 연속적인 단계적인 희석을 거친다.

연속적인 혼합 방법을 이용하여 형성된 핵산-지질 입자는 일반적으로 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 120 nm, 110 nm, 100 nm, 90 nm, 또는 80 nm, 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 또는 150 nm 미만 (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)의 크기를 갖는다. 이렇게 형성된 입자는 응집하지 않고, 임의로 균일한 입자 크기를 달성하기 위해 크기별로 분류된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 지질 소포체 (예를 들어, 리포솜) 용액을 형성하고, 그 즉시 지질 소포체 용액을 직접 제어된 양의 희석 완충제를 함유하는 수집 용기 내로 도입하는 것을 포함하는 직접 희석 공정을 통해 생산된 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP)를 제공한다. 바람직한 측면에서, 수집 용기는 희석을 용이하게 하기 위해 수집 용기의 내용물을 교반하도록 형성된 하나 이상의 요소를 포함한다. 한 측면에서, 수집 용기 내에 존재하는 희석 완충제의 양은 도입된 지질 소포체 용액의 부피와 실질적으로 동일하다. 비제한적인 예로서, 45% 에탄올 내의 지질 소포체 용액은 동일한 부피의 희석 완충제를 함유하는 수집 용기 내에 도입될 때 보다 작은 입자를 유리하게 생성할 것이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 희석 완충제를 함유하는 제3 저장기가 제2 혼합 영역에 유체 연결된 인-라인 희석 공정을 통해 생산된 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP)를 제공한다. 본 실시양태에서, 제1 혼합 영역에 형성된 지질 소포체 (예를 들어, 리포솜) 용액은 즉시 제2 혼합 영역 내의 희석 완충제와 직접 혼합된다. 바람직한 측면에서, 제2 혼합 영역은 지질 소포체 용액 및 희석 완충제 유동이 180°정반대의 유동으로서 만나도록 배열된 T-연결기를 포함하지만; 보다 작은 각도, 예를 들어, 약 27° 내지 약 180° (예를 들어, 약 90°)를 제공하는 연결기가 사용될 수 있다. 펌프 메카니즘은 완충제를 제어가능한 유동으로 제2 혼합 영역으로 전달한다. 한 측면에서, 제2 혼합 영역에 제공되는 희석 완충제의 유속은 제1 혼합 영역으로부터 그로 도입되는 지질 소포체 용액의 유속과 실질적으로 동일하도록 제어된다. 상기 실시양태는 유리하게는 제2 혼합 영역에서 지질 소포체 용액과 혼합되는 희석 완충제의 유동, 따라서 제2 혼합 공정 내내 완충제 내의 지질 소포체 용액의 농도에 대한 보다 큰 제어를 허용한다. 상기 희석 완충제 유속의 제어는 유리하게는 감소된 농도에서 작은 입자 크기의 형성을 허용한다.

상기 공정 및 상기 직접 희석 및 인-라인 희석 공정을 수행하기 위한 장치는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 20070042031에 상세히 기재되어 있다.

직접 희석 및 인-라인 희석 공정을 이용하여 형성된 일반적으로 핵산-지질 입자는 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 120 nm, 110 nm, 100 nm, 90 nm, 또는 80 nm, 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 또는 150 nm 미만 (또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)의 크기를 갖는다. 이렇게 형성된 입자는 응집하지 않고, 임의로 균일한 입자 크기를 달성하기 위해 크기별로 분류된다.

필요한 경우, 본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 리포솜의 크기별 분류를 위해 이용가능한 임의의 방법에 의해 크기별로 분류될 수 있다. 크기별 분류는 목적하는 크기 범위 및 입자 크기의 비교적 좁은 분포를 달성하기 위해 수행될 수 있다.

몇몇의 기술이 입자를 요구되는 크기로 분류하기 위해 이용가능하다. 리포솜에 대해 사용되고 본 발명의 입자에 대해 동등하게 적용가능한 한 크기별 분류 방법은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 4,737,323에 기재되어 있다. 조 (bath) 또는 프로브 초음파 처리에 의한 입자 현탁액의 초음파 처리는 크기를 크기가 약 50 nm 미만인 입자로 점진적으로 감소시킨다. 균질화는 더 큰 입자를 보다 작은 입자로 분해하기 위해 전단 에너지에 의존하는 또 다른 방법이다. 전형적인 균질화 절차에서, 입자는 선택된 입자 크기, 일반적으로 약 60 내지 약 80 nm가 관찰될 때까지 표준 에멀젼 균질화기를 통해 재순환된다. 두 방법 모두에서, 입자 크기 분포는 통상적인 레이저 빔 입자 크기 식별, 또는 QELS에 의해 모니터링될 수 있다.

작은 세공의 폴리카르보네이트 막 또는 비대칭 세라믹 막을 통한 입자의 압출도 입자 크기를 비교적 잘 규정된 크기 분포로 감소시키기 위한 효과적인 방법이다. 일반적으로, 현탁액을 목적하는 입자 크기 분포가 달성될 때까지 막을 통해 1회 이상 순환시킨다. 입자는 크기의 점차적인 감소를 달성하기 위해 연속적으로 보다 작은 세공의 막을 통해 압출될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 입자 내에 존재하는 핵산은 예를 들어 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 09/744,103에 기재된 바와 같이 예비응축된다.

다른 실시양태에서, 방법은 본 발명의 조성물을 사용하여 세포의 리포펙션 (lipofection)을 수행하기에 유용한 비-지질 다가양이온을 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 비-지질 다가양이온의 예는 헥사디메트린 브로마이드 (상표명 폴리브렌(POLYBRENE)^® 하에 알드리치 케미칼 캄파니 (Aldrich Chemical Co., 미국 위스콘신주 밀워키)로 판매됨) 또는 헥사디메트린의 다른 염을 포함한다. 다른 적합한 다가양이온은 예를 들어 폴리-L-오르니틴, 폴리-L-아르기닌, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 폴리알릴아민, 및 폴리에틸렌이민의 염을 포함한다. 이들 염의 첨가는 바람직하게는 입자가 형성된 후에 실시된다.

몇몇 실시양태에서, 형성된 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP) 내의 핵산 대 지질 비 (질량/질량비)는 약 0.01 내지 약 0.2, 약 0.05 내지 약 0.2, 약 0.02 내지 약 0.1, 약 0.03 내지 약 0.1, 또는 약 0.01 내지 약 0.08일 것이다. 출발 물질 (투입)의 비도 상기 범위 내에 해당한다. 다른 실시양태에서, 입자 제제는 약 400 ㎍ 핵산/10 mg 총 지질 또는 약 0.01 내지 약 0.08, 보다 바람직하게는 약 0.04의 핵산 대 지질 질량비 (1.25 mg의 총 지질/50 ㎍의 핵산에 대응함)를 이용한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 입자는 약 0.08의 핵산:지질 질량비를 갖는다.

다른 실시양태에서, 형성된 핵산-지질 입자 (예를 들어, SNALP) 내의 지질 대 핵산 비 (질량/질량비)는 약 1 (1:1) 내지 약 100 (100:1), 약 5 (5:1) 내지 약 100 (100:1), 약 1 (1:1) 내지 약 50 (50:1), 약 2 (2:1) 내지 약 50 (50:1), 약 3 (3:1) 내지 약 50 (50:1), 약 4 (4:1) 내지 약 50 (50:1), 약 5 (5:1) 내지 약 50 (50:1), 약 1 (1:1) 내지 약 25 (25:1), 약 2 (2:1) 내지 약 25 (25:1), 약 3 (3:1) 내지 약 25 (25:1), 약 4 (4:1) 내지 약 25 (25:1), 약 5 (5:1) 내지 약 25 (25:1), 약 5 (5:1) 내지 약 20 (20:1), 약 5 (5:1) 내지 약 15 (15:1), 약 5 (5:1) 내지 약 10 (10:1), 또는 약 5 (5:1), 6 (6:1), 7 (7:1), 8 (8:1), 9 (9:1), 10 (10:1), 11 (11:1), 12 (12:1), 13 (13:1), 14 (14:1), 15 (15:1), 16 (16:1), 17 (17:1), 18 (18:1), 19 (19:1), 20 (20:1), 21 (21:1), 22 (22:1), 23 (23:1), 24 (24:1), 또는 25 (25:1), 또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위일 것이다. 출발 물질 (투입)의 비도 상기 범위 내에 해당한다.

이전에 논의한 바와 같이, 지질은 CPL을 추가로 포함할 수 있다. SNALP-CPL (CPL-함유 SNALP)의 제조를 위한 다양한 일반적인 방법이 본원에서 논의된다. 2가지 일반적인 기술은 "삽입 후" 기술, 즉 예를 들어 예비형성된 SNALP 내로의 CPL의 삽입, 및 CPL이 예를 들어 SNALP 형성 단계 동안 지질 혼합물 내에 포함되는 "표준" 기술을 포함한다. 삽입 후 기술은 CPL을 주로 SNALP 이중층 막의 외면에 갖는 SNALP를 생성하는 반면, 표준 기술은 내면 및 외면 둘 모두에 CPL을 갖는 SNALP를 제공한다. 방법은 인지질 (콜레스테롤을 함유할 수 있는)로 제조된 소포체 및 PEG-지질 (예컨대 PEG-DAA 및 PEG-DAG)을 함유하는 소포체에 특히 유용하다. SNALP-CPL의 제조 방법은 예를 들어, 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 5,705,385; 6,586,410; 5,981,501; 6,534,484; 및 6,852,334; 미국 특허 공개 20020072121; 및 PCT 공개 WO 00/62813에 교시되어 있다.

VII . 키트

본 발명은 또한 키트 형태의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 지질 입자의 다양한 요소 (예를 들어, 활성제 또는 치료제, 예컨대 입자의 핵산 및 개별 지질 성분)를 보유하기 위해 구획화된 용기를 포함한다. 바람직하게는, 키트는 본원에 제시된 방법 중의 하나에 의해 생산된 본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)를 보유하는 용기 (예를 들어, 바이알 또는 앰플)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 엔도솜 막 불안정화제 (예를 들어, 칼슘 이온)을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 일반적으로 본 발명의 입자 조성물을 제약상 허용되는 담체 내의 현탁액으로서 또는 탈수 형태로, 이들의 재수화 (동결건조될 경우) 및 투여를 위한 지시서와 함께 함유한다.

본 발명의 SNALP 제제는 관심있는 특정 세포, 조직, 또는 장기를 우선적으로 표적화하도록 조정될 수 있다. SNALP의 우선적인 표적화는 SNALP의 조성물 자체를 제어함으로써 수행할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 키트는 이들 지질 입자를 포함하고, 여기서 입자는 현탁액으로서 또는 탈수 형태로 용기 내에 존재한다.

특정한 경우에, 지질 입자의 표면에 표적화 모이어티가 부착되는 것이 입자의 표적화를 추가로 향상시키기 위해 바람직할 수 있다. 표적화 모이어티 (예를 들어, 항체, 단백질 등)를 지질 (예컨대, 본 발명의 입자에 사용되는 것)에 부착시키는 방법은 당업자에게 알려져 있다.

VIII . 지질 입자의 투여

일단 형성되면, 본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA, 예컨대 dsRNA)의 세포 내로의 도입에 특히 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA)를 세포 내로 도입하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA)은 감염된 세포, 예컨대 세망내피 세포 (예를 들어, 대식세포, 단핵세포 등), 및 섬유모세포, 내피 세포 (예컨대 혈관의 내부 표면을 덮는 세포), 및/또는 혈소판 세포를 비롯한 다른 세포 종류 내로 도입된다. 방법은 상기 설명된 바와 같이 시험관 내에서 또는 생체 내에서 먼저 입자를 형성한 후, 입자를 간섭 RNA가 세포로 전달되기에 충분한 시간 동안 세포와 접촉시킴으로써 수행할 수 있다.

본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 이들이 혼합되거나 접촉되는 거의 모든 세포 종류에 흡착될 수 있다. 일단 흡착되면, 입자는 세포의 일부에 의해 세포내이입되거나, 지질을 세포막과 교환하거나, 또는 세포와 융합될 수 있다. 입자의 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA) 부분의 전달 또는 통합은 이들 경로의 임의의 하나를 통해 발생할 수 있다. 특히, 융합이 발생할 때, 입자 막은 세포막 내에 통합되고, 입자의 내용물은 세포내 유체와 조합된다.

본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 단독으로 또는 투여 경로 및 표준 제약 실무에 따라 선택된 제약상 허용되는 담체 (예를 들어, 생리학적 염수 또는 포스페이트 완충제)와의 혼합물로 투여될 수 있다. 일반적으로, 통상적인 완충 염수 (예를 들어, 135-150 mM NaCl)는 제약상 허용되는 담체로서 사용될 것이다. 다른 적합한 담체는 예를 들어, 물, 완충된 물, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등, 예를 들어 안정성 향상을 위한 당단백질, 예컨대 알부민, 지단백질, 글로불린 등을 포함한다. 추가의 적합한 담체는 예를 들어 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)]에 기재되어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산매, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 어구 "제약상 허용되는"은 인간에게 투여될 때 알레르기 또는 유사한 불리한 반응을 생성하지 않는 분자 엔티티 (entity) 및 조성물을 의미한다.

제약상 허용되는 담체는 일반적으로 지질 입자 형성 후에 첨가된다. 따라서, 지질 입자 (예를 들어, SNALP)가 형성된 후에, 입자는 제약상 허용되는 담체, 예컨대 통상적인 완충 염수 내에 희석될 수 있다.

제약 제제 내의 입자의 농도는 넓게, 즉, 약 0.05% 미만, 대체로 적어도 약 2 내지 5%로부터 약 10 내지 90 중량%까지 크게 상이할 수 있고, 선택된 특정 투여 방식에 따라 유체 부피, 점도 등에 의해 주로 선택될 것이다. 예를 들어, 농도는 처리와 관련된 유체 부하를 저하시키기 위해 감소될 수 있다. 이것은 아테롬성 동맥경화증-연관 울혈성 심부전증 또는 중증 고혈압 환자에서 특히 바람직할 수 있다. 별법으로, 자극성 지질로 이루어진 입자는 투여 부위에서 염증을 완화하기 위해 낮은 농도로 희석될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 통상적인, 잘 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 수용액은 사용을 위해 포장되거나 무균 조건 하에서 여과되고 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수용액과 조합된다. 조성물은 생리학적 조건과 근접하게 만들기 위해 필요한 제약상 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조정 및 완충제, 장성 조정제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 및 염화칼슘을 함유할 수 있다. 추가로, 입자 현탁액은 보관시 유리 라디칼 및 지질-과산화 손상에 대해 지질을 보호하는 지질-보호제를 포함할 수 있다. 친지성 유리 라디칼 켄처 (quencher), 예컨대 알파토코페롤, 및 수용성 철-특이적 킬레이터, 예컨대 페리옥사민이 적합하다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 간섭 RNA 서열 (예를 들어, siRNA)을 포함하는 하나 이상의 핵산의 치료 목적의 전달을 위한 방법에서 특히 유용하다. 특히, 하나 이상의 ALDH 이소자임의 전사 및/또는 번역을 하향조절하거나 침묵시킴으로써 인간의 생체내 알콜중독 치료 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

A. 생체내 투여

생체 내 요법을 위한 전신 전달, 예를 들어 신체 시스템, 예컨대 순환을 통한 치료 핵산의 먼 표적 세포로의 전달은 핵산-지질 입자, 예컨대 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 PCT 공개 WO 05/007196, WO 05/121348, WO 05/120152, 및 WO 04/002453에 기재된 것을 사용하여 달성되었다. 본 발명은 또한 혈청 내의 뉴클레아제 분해로부터 핵산을 보호하고, 비-면역원성이고, 크기가 작고, 반복 투여에 적합한 완전히 캡슐화된 지질 입자를 제공한다.

생체 내 투여를 위해, 투여는 당업계에 공지된 임의의 방식, 예를 들어 주사, 경구 투여, 흡입 (예를 들어, 비내 또는 기관내), 경피 적용, 또는 직장내 투여에 의해 실시될 수 있다. 투여는 단일 또는 분할 용량으로 실시될 수 있다. 제약 조성물은 비경구로, 즉, 관절내, 정맥내, 복강내, 피하, 또는 근내 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 제약 조성물은 볼러스 (bolus) 주사에 의해 정맥내 또는 복강 내로 투여될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,286,634 참조). 세포내 핵산 전달은 또한 문헌 [Straubringer et al., Methods Enzymol., 101:512 (1983)]; [Mannino et al., Biotechniques, 6:682 (1988)]; [Nicolau et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6:239 (1989)]; 및 [Behr, Acc. Chem. Res., 26:274 (1993)]에 논의되어 있다. 지질-기반 치료제를 투여하는 또 다른 방법은 예를 들어, 미국 특허 3,993,754; 4,145,410; 4,235,871; 4,224,179; 4,522,803; 및 4,588,578에 기재되어 있다. 지질 입자는 질환 부위에서의 직접 주사에 의해 또는 질환 부위로부터 먼 부위에서의 주사에 의해 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp.70-71(1994)] 참조). 상기한 참고문헌은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.

본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)가 정맥 내로 투여되는 실시양태에서, 입자의 총 주사된 용량의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%가 주사 약 8, 12, 24, 36, 또는 48시간 후에 혈장 내에 존재한다. 다른 실시양태에서, 지질 입자의 총 주사된 용량의 약 20%, 30%, 40% 초과 및 약 60%, 70% 또는 80%의 큰 비율이 주사 약 8, 12, 24, 36, 또는 48시간 후에 혈장 내에 존재한다. 특정한 경우에, 약 10% 초과의 복수의 입자가 투여 약 1시간 후에 포유동물의 혈장 내에 존재한다. 특정한 다른 예에서, 지질 입자의 존재는 입자의 투여 적어도 약 1시간 후에 검출가능하다. 몇몇 실시양태에서, 치료 핵산, 예컨대 간섭 RNA 분자의 존재는 투여 약 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 또는 96시간 후에 세포에서 검출가능하다. 다른 실시양태에서, 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)에 의한 표적 서열, 예컨대 바이러스 또는 숙주 서열의 발현의 하향조절은 투여 약 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 또는 96시간 후에 검출가능하다. 또 다른 실시양태에서, 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)에 의한 표적 서열, 예컨대 바이러스 또는 숙주 서열의 발현의 하향조절은 감염된 세포 및/또는 감염될 수 있는 세포에서 우선적으로 발생한다. 추가의 실시양태에서, 투여 부위에 가까운 또는 먼 부위에서 세포 내의 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)의 존재 또는 효과는 투여 약 12, 24, 48, 72, 또는 96시간 후에, 또는 약 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 또는 28일 후에 검출가능하다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 비경구 또는 복강내 투여된다.

본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 적합한 성분과 조합하여, 흡입을 통해 (예를 들어, 비내 또는 기관내) 투여되는 에어로졸 제제 (즉, 이들은 "분무될 수 있다")로 제조될 수 있다 (Brigham et al., Am. J. Sci., 298:278 (1989) 참조). 에어로졸 제제는 허용되는 압축 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등 내에 도입될 수 있다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 비내 스프레이, 흡입, 및/또는 다른 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 비내 에어로졸 스프레이를 통해 핵산 조성물을 직접 폐에 전달하는 방법은 예를 들어 미국 특허 5,756,353 및 5,804,212에 기재되어 있다. 이와 유사하게, 비내 마이크로입자 수지 및 라이소포스파티딜-글리세롤 화합물을 사용한 약물의 전달 (미국 특허 5,725,871)도 제약 업계에 잘 공지되어 있다. 유사하게, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 매트릭스 형태의 경점막 약물 전달이 미국 특허 5,780,045에 기재되어 있다. 상기한 특허 문헌의 개시내용은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.

예를 들어, 관절내 (관절 내의), 정맥내, 근내, 피부내, 복강내, 및 피하 경로에 의한 것과 같은 비경구 투여를 위해 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제제를 의도된 수여자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성, 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 비후제, 안정화제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 본 발명의 실행시에, 조성물은 바람직하게는 예를 들어 정맥내 주입에 의해, 경구, 국소, 복강내, 방광내, 또는 경막내 경로로 투여된다.

일반적으로, 정맥내 투여될 때, 지질 입자 제제는 적합한 제약 담체와 함께 제제화된다. 많은 제약상 허용되는 담체가 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 적합한 제제는 예를 들어 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)]에서 볼 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충된 물, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등이 사용될 수 있고, 안정성 향상을 위해 당단백질, 예컨대 알부민, 지단백질, 글로불린 등을 포함할 수 있다. 일반적으로, 통상적인 완충 염수 (135-150 mM NaCl)가 제약상 허용되는 담체로서 사용될 것이지만, 다른 적합한 담체도 충분할 것이다. 이들 조성물은 통상적인 리포솜성 멸균 기술, 예컨대 여과에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건과 근접하게 만들기 위해 필요한 제약상 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조정 및 완충제, 장성 조정제, 습윤제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 및 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 상기 언급된 기술을 사용하여 멸균될 수 있거나, 또는 별법으로, 멸균 조건 하에 생산될 수 있다. 생성되는 수용액은 사용을 위해 포장되거나 무균 조건 하에서 여과되고 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수용액과 조합된다.

특정 용도에서, 본원에 개시된 지질 입자는 경구 투여를 통해 개체에게 전달될 수 있다. 입자는 부형제와 함께 포함되고, 섭취가능한 정제, 구강정 (buccal tablet), 트로키, 캡슐, 알약, 로젠지, 엘릭시르, 구강세척액, 현탁액, 경구 스프레이, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다 (예를 들어, 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 5,641,515, 5,580,579, 및 5,792,451 참조). 이들 경구 투여 형태는 또한 다음을 함유할 수 있다: 결합제, 젤라틴; 부형제, 윤활제, 및/또는 향미제. 단위 투여 형태가 캡슐일 경우, 이것은 상기 설명된 물질에 추가로, 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅으로서 또는 투여 단위의 물리적 형태를 다른 방식으로 변형하기 위해 존재할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여 형태의 제조에 사용되는 임의의 물질은 제약학상 순수하고 사용되는 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다.

일반적으로, 이들 경구 제제는 적어도 약 0.1% 또는 그 초과의 지질 입자를 함유할 수 있지만, 입자의 비율은 물론 상이할 수 있고, 편리하게는 총 제제의 중량 또는 부피의 약 1% 또는 2% 내지 약 60% 또는 70% 또는 그 초과일 수 있다. 따라서, 각각의 치료상 유용한 조성물 내의 입자의 양은 적합한 투여량이 화합물의 임의의 제시된 단위 용량에서 얻어지는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관 기한 및 다른 약리학상 고려사항과 같은 인자가 그러한 제약 제제의 제조 기술의 당업자에게 의해 고려될 것이고, 따라서, 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.

경구 투여를 위해 적합한 제제는 다음으로 이루어질 수 있다: (a) 액체 용액, 예컨대 희석제, 예컨대 물, 염수, 또는 PEG 400에 현탁된 유효량의 포장된 치료 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA); (b) 액체, 고체, 과립, 또는 젤라틴으로서 각각 소정량의 치료 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA)을 함유하는 캡슐, 향낭 (sachet), 또는 정제; (c) 적절한 액체 내의 현탁액; 및 (d) 적합한 에멀젼. 정제 형태는 하나 이상의 락토스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 인산칼슘, 옥수수 전분, 감자 전분, 미세결정질 셀룰로스, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 탈크, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 및 다른 부형제, 착색제, 충전제, 결합제, 희석제, 완충제, 보습제, 보존제, 향미제, 염료, 붕해제, 및 제약상 적합한 담체를 포함할 수 있다. 로젠지 형태는 향미제, 예를 들어, 수크로스 내의 치료 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA), 및 치료 핵산을 불활성 베이스, 예컨대 젤라틴 및 글리세린 내에 포함하는 향정 (pastille) 또는 수크로스 및 치료 핵산 이외에 당업계에 공지된 담체를 함유하는 아카시아 에멀젼, 겔 등을 포함할 수 있다.

이들의 용도의 또 다른 예에서, 지질 입자는 넓은 범위의 국소 투여 형태 내로 포함될 수 있다. 예를 들어, 핵산-지질 입자, 예컨대 SNALP를 함유하는 현탁액은 겔, 오일, 에멀젼, 국소 크림, 페이스트, 연고, 로션, 포움, 무스 (mousse) 등으로서 제제화되고 투여될 수 있다.

본 발명의 지질 입자의 제약 제제를 제조할 때, 빈 입자 또는 외부 표면과 결합된 치료제, 예컨대 핵산을 갖는 입자를 감소시키거나 제거하기 위해 정제된 다량의 입자를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 다양한 숙주에서 실행될 수 있다. 바람직한 숙주는 포유동물 종, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간 및 침팬지 및 다른 비인간 영장류), 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 설치류 (예를 들어, 래트 및 마우스), 토끼, 및 돼지를 포함한다.

투여된 입자의 양은 치료 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA) 대 지질의 비, 사용된 특정 치료 핵산, 치료할 질환 또는 장애, 환자의 연령, 체중 및 상태, 및 임상의의 판단에 따라 결정될 것이지만, 일반적으로 약 0.01 내지 약 50 mg/kg (체중), 바람직하게는 약 0.1 내지 약 5 mg/kg (체중), 또는 약 10⁸-10¹⁰ 입자/투여 (예를 들어, 주사)일 것이다.

B. 시험관내 투여

시험관 내 적용을 위해, 치료 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA)의 전달은 배양액에서 성장한, 식물 또는 동물 기원, 척추동물 또는 무척추동물, 및 임의의 조직 또는 종류의 임의의 세포로의 전달일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 동물 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다.

세포 및 지질 입자 사이의 접촉은 시험관 내에서 수행될 때, 생물학상 적합한 매질에서 발생한다. 입자의 농도는 특정 용도에 따라 크게 상이하지만, 일반적으로 약 1 μ몰 내지 약 10 mmol이다. 지질 입자를 사용한 세포의 처리는 일반적으로 생리학적 온도 (약 37℃)에서 약 1 내지 48시간, 바람직하게는 약 2 내지 4시간 동안 수행한다.

바람직한 실시양태의 한 군에서, 지질 입자 현탁액은 약 10³ 내지 약 10⁵ 세포/ml, 보다 바람직하게는 약 2 x 10⁴ 세포/ml의 세포 밀도를 갖는 60-80% 융합도 (confluent)의 플레이팅된 세포에 첨가된다. 세포에 첨가된 현탁액의 농도는 바람직하게는 약 0.01 내지 0.2 ㎍/ml, 보다 바람직하게는 약 0.1 ㎍/ml이다.

세포의 조직 배양이 필요할 수 있는 정도로, 이것은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Freshney, Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3rd Ed., Wiley-Liss, New York (1994)], [Kuchler et al., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc. (1977)], 및 이들에서 인용된 참고문헌은 세포 배양에 대한 전반적인 지침을 제공한다. 배양된 세포 시스템은 종종 세포의 단층 형태일 것이지만, 세포 현탁액도 사용된다.

엔도솜 방출 파라미터 (ERP) 검정을 사용하여, 본 발명의 SNALP 또는 다른 지질 입자의 전달 효율을 최적화할 수 있다. ERP 검정은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 20030077829에 상세히 기재되어 있다. 보다 특히, ERP 검정의 목적은 결합/흡수 또는 엔도솜 막과의 융합/탈안정화에 대한 그의 상대적인 효과를 기초로 하여 SNALP 또는 다른 지질 입자의 다양한 양이온성 지질 및 헬퍼 (helper) 지질 성분의 효과를 구분하는 것이다. 상기 검정에 의해, SNALP 또는 다른 지질 입자의 각각의 성분이 전달 효율에 영향을 주고 이에 의해 SNALP 또는 다른 지질 입자를 최적화하는 정도를 정량적으로 결정할 수 있다. 대체로, ERP 검정은 리포터 단백질 (예를 들어, 루시페라제, β-갈락토시다제, 초록 형광 단백질 (GFP) 등)의 발현을 측정하고, 몇몇 예에서, 발현 플라스미드에 대해 최적화된 SNALP 제제가 또한 간섭 RNA를 캡슐화하기 위해 적절할 것이다. 다른 예에서, ERP 검정은 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)의 존재 또는 부재 하에 표적 서열의 전사 또는 번역의 하향조절을 측정하기 위해 조정될 수 있다. 각각의 다양한 SNALP 또는 다른 지질 입자에 대한 ERP를 비교함으로써, 최적화된 시스템, 예를 들어, 세포에서 최대 흡수를 보이는 SNALP 또는 다른 지질 입자를 쉽게 결정할 수 있다.

C. 지질 입자의 전달을 위한 세포

본 발명의 조성물 및 방법은 특히 생체 내에서 ALDH 유전자 발현을 최적화함으로써 알콜중독을 치료하기 위해 매우 적합하다. 본 발명은 포유동물, 예컨대, 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트 및 기니 피그), 토끼, 돼지, 및 영장류 (예를 들어 원숭이, 침팬지, 및 인간)를 비롯한 임의의 척추동물 종으로부터의 매우 다양한 세포 종류에 대해 실시될 수 있다.

D. 지질 입자의 검출

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 대상체 내에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 시간 또는 그 초과의 시간에서 검출가능하다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 지질 입자 (예를 들어, SNALP)는 대상체 내에서 입자의 투여 약 8, 12, 24, 48, 60, 72, 또는 96시간, 또는 약 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 22, 24, 25, 또는 28일 후에 검출가능하다. 입자의 존재는 대상체로부터 세포, 조직, 또는 다른 생물학적 샘플 내에서 검출할 수 있다. 입자는 예를 들어 입자의 직접 검출, 치료 핵산, 예컨대 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) 서열의 검출, 관심있는 표적 서열의 검출 (즉, 관심있는 서열의 발현 또는 감소된 발현의 검출에 의한), EBOV 단백질 (예를 들어, 인터페론)에 의해 조절되는 화합물의 검출, 대상체 내에서 바이러스 부하의 검출, 또는 이들의 조합에 의해 검출할 수 있다.

1. 입자의 검출

본 발명의 지질 입자, 예컨대 SNALP는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 표지는 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 직접 또는 간접적으로 지질 입자의 성분에 결합될 수 있다. 매우 다양한 표지가 사용될 수 있고, 표지는 요구되는 감수성, 지질 입자 성분과의 접합 용이성, 안정성 요건, 및 이용가능한 기구 및 처리 규정에 따라 선택된다. 적합한 표지는 형광 표지, 예컨대 형광 염료 (예를 들어, 플루오레세인 및 유도체, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 및 오레곤 그린(Oregon Green)™; 로다민 및 유도체, 예컨대 텍사스 레드 (Texas red), 테트라로디민 이소티오시아네이트 (TRITC) 등, 디곡시게닌, 비오틴, 피코에리트린, AMCA, CyDyes™, 등; 방사성 표지, 예컨대 ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, ³²P, ³³P 등; 효소, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 등; 분광 비색 표지, 예컨대 콜로이드성 금 (colloidal gold) 또는 착색 유리 또는 플라스틱 비드, 예컨대 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 표지는 당업계에 공지된 임의의 수단을 이용하여 검출할 수 있다.

2. 핵산의 검출

핵산 (예를 들어, 간섭 RNA)은 당업자에게 잘 공지된 임의의 많은 수단에 의해 본원에서 검출되고 정량된다. 핵산의 검출은 잘 공지된 방법, 예컨대 서던 (Southern) 분석, 노던 분석, 겔 전기영동, PCR, 방사성 표지, 섬광 계수, 및 친화도 크로마토그래피에 의해 진행될 수 있다. 추가의 분석적 생화학적 방법, 예컨대 분광광도법, 방사선 촬영, 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 박막 크로마토그래피 (TLC), 및 과다확산 (hyperdiffusion) 크로마토그래피도 사용될 수 있다.

핵산 혼성화 방식의 선택은 중요하지 않다. 다양한 핵산 혼성화 방식이 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 통상적인 방식은 샌드위치 검정 및 경쟁 또는 전치 (displacement) 검정을 포함한다. 혼성화 기술은 예를 들어 문헌 ["Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach," Eds. Hames and Higgins, IRL Press (1985)에 일반적으로 기재되어 있다.

혼성화 검정의 민감도는 검출할 표적 핵산의 수를 증가시키는 핵산 증폭 시스템의 사용을 통해 향상될 수 있다. 분자 프로브로서 사용하기 위한 서열 증폭 또는 후속적인 서브클로닝을 위한 핵산 단편의 생성에 적합한 시험관내 증폭 기술은 알려져 있다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), Qβ-레플리카제 증폭, 및 다른 RNA 중합효소 매개된 기술 (예를 들어, NASBA™)을 비롯하여 상기 시험관내 증폭 방법을 통해 당업자를 안내하기에 충분한 기술의 예는 문헌 [Sambrook et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000)]; 및 [Ausubel et al., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (2002)]; 및 미국 특허 4,683,202; [PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990)]; [Arnheim & Levinson (October 1, 1990), C&EN 36]; [The Journal Of NIH Research, 3:81 (1991)]; [Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173 (1989)]; [Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990)]; [Lomell et al., J. Clin. Chem., 35:1826 (1989)]; [Landegren et al., Science, 241:1077 (1988)]; [Van Brunt, Biotechnology, 8:291 (1990)]; [Wu and Wallace, Gene, 4:560 (1989)]; [Barringer et al., Gene, 89: 117 (1990)]; 및 [Sooknanan and Malek, Biotechnology, 13:563 (1995)]에서 볼 수 있다. 시험관 내에서 증폭된 핵산의 개선된 클로닝 방법은 미국 특허 5,426,039에 기재되어 있다. 당업계에서 설명된 다른 방법은 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA™, 캔젠 (Cangene), 미국 온타리오주 미시쏘가) 및 Q-레플리카제 시스템이다. 선택된 서열이 존재하는 경우에만 PCR 또는 LCR 프라이머가 연장되거나 라이게이션되도록 설계된 이들 시스템은 돌연변이체를 확인하기 위해 직접 이용될 수 있다. 별법으로, 선택된 서열은 일반적으로 예를 들어 비특이적 PCR 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있고, 증폭된 표적 영역은 추후 돌연변이를 나타내는 특이적 서열에 대해 프로빙될 수 있다. 상기한 참고문헌은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.

예를 들어 시험관 내 증폭 방법에서 프로브로서 사용하기 위한, 유전자 프로브로서 또는 억제제 성분으로서 사용하기 위한 핵산은 일반적으로 예를 들어 문헌 [Needham VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159 (1984)]에 기재된 바와 같이 자동화 합성기를 사용하여 문헌 [Beaucage et al., Tetrahedron Letts., 22: 1859 1862 (1981)]에 기재된 고상 포스포르아미다이트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성된다. 필요한 경우, 폴리뉴클레오티드의 정제는 일반적으로 문헌 [Pearson et al., J. Chrom., 255:137 149 (1983)]에 기재된 천연 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 음이온 교환 HPLC에 의해 수행된다. 합성 폴리뉴클레오티드의 서열은 문헌 [Maxam and Gilbert (1980) in Grossman and Moldave (eds.) Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499]의 화학적 분해 방법을 사용하여 확인될 수 있다.

전사 수준을 결정하기 위한 별도의 수단은 계내 (in situ) 혼성화이다. 계내 혼성화 검정은 잘 공지되어 있고, 문헌 [Angerer et al., Methods Enzymol, 152:649 (1987)]에 일반적으로 설명되어 있다. 계내 혼성화 검정에서, 세포는 고체 지지체, 일반적으로 유리 슬라이드에 고정된다. DNA가 프로빙되어야 할 경우, 세포를 열 또는 알칼리로 변성시킨다. 이어서, 세포를 표지된 특이적 프로브의 어닐링을 허용하는 온도에서 혼성화 용액과 접촉시킨다. 프로브는 바람직하게는 방사성 동위원소 또는 형광 리포터로 표지된다.

IX . 실시예

본 발명을 구체적인 예에 의해 보다 상세히 설명할 것이다. 다음 실시예는 예시의 목적으로 제공되고, 본 발명을 어떠한 방식으로도 제한하고자 의도되지 않는다. 당업자는 본질적으로 동일한 결과를 얻기 위해 변경 또는 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 파라미터를 쉽게 알 것이다.

실시예 1.

본 실시예는 ALDH2를 표적으로 하는 siRNA를 함유하는, 혈청에서 안정성인 핵산-지질 입자 (SNALP)가 시험관 내에서 뮤린 간세포 세포주에서 알데히드 데히드로게나제 2 유전자 발현을 감소시킴을 입증한다.

물질:

본 연구에 사용된 모든 siRNA 분자는 표준 절차를 이용하여 화학적으로 합성하고 어닐링하였다.

본 연구에 사용된 알데히드 데히드로게나제 2 (ALDH2)-표적화 siRNA 서열:

여기서, 'r'은 리보뉴클레오티드를 나타내고 'm'은 2'-O-메틸화 리보뉴클레오티드를 나타내고, 이들 접두사의 결여는 데옥시뉴클레오티드를 나타낸다.

추가로, 비-표적화 siRNA를 연구에서 대조군으로서 포함시켰다. 상기 siRNA는 반딧불이 루시페라제 유전자를 표적으로 하고, 포유동물 세포에서 임의의 특이적 유전자 침묵 활성을 갖는 것으로 의도되지 않는다.

방법:

핵산-지질 입자는 다음과 같은 "1:57" 제제로 이루어졌다: 1.4% PEG2000-C-DMA; 57.1% DLinDMA; 7.1% DPPC; 및 34.3% 콜레스테롤. 일반적으로, 1:57 제제에서, DLinDMA의 양은 57.1 몰% ± 5 몰%이고, 지질 접합체의 양은 1.4 몰% ± 0.5 몰%이었고, 1:57 제제의 나머지는 비-양이온성 지질 (예를 들어, 인지질, 콜레스테롤, 또는 2개의 혼합물)로 이루어졌고, 최종 siRNA/지질 비는 약 0.11 대 0.15 (wt/wt)이었다. siRNA-로딩된 입자의 형성 시에, 평균 입자 크기는 직경이 85 - 100 nm이었다.

포유동물 세포 처리 및 mRNA 분석:

일차 간세포는 마우스로부터 단리하고, 96-웰 플레이트에서 부착 배양물로서 유지하였다. ALDH-2 표적화 또는 비-표적화 대조군 SNALP를 0.03125 내지 0.5 ㎍/mL의 siRNA 농도로 배양 배지에 첨가하였고; 각각의 처리 조건은 삼중의 웰에서 수행하였다. SNALP의 존재 하에 약 24 h 인큐베이션 후에, 세포를 수거하고, mRNA 분석을 위해 용해시켰다. 세포 용해물 내의 마우스 ALDH2 mRNA는 분지형 DNA 검정 (퀀티젠^®, 아피메트릭스)을 이용하여 측정하고, 마우스 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH)에 대해 정규화하였다.

결과:

표 A는 임의로 "100.0%"로 설정된 미처리 배양 웰에서 측정된 GAPDH-정규화된 ALDH2 mRNA의 양 (9개의 반복시험 웰의 평균, ± 6.9% 표준 편차)에 비해 지질-핵산 처리의 유전자 침묵 활성 (삼중 웰의 평균, ± 표준 편차)을 보여준다.

<표 A>

결론:

마우스 ALDH2를 표적으로 하는 4개의 모든 siRNA 제제는 단리된 일차 마우스 간세포에서 용량-반응 방식으로 유전자 침묵 활성을 보였다. 시험된 4개 중에서, 이중체 1이 가장 높은 활성을 보였고, 이중체 4가 가장 작은 활성을 보였다.

실시예 2

본 실시예는 ALDH2를 표적으로 하는 siRNA를 포함하는 SNALP가 정맥내 투여 경로를 통해 전체 동물 시스템에서 알데히드 데히드로게나제 2 유전자 발현을 감소시킴을 보여준다.

물질:

본 연구에서 사용된 마우스 ALDH-2 siRNA 이중체 1 및 비-표적화 대조군은 실시예 1에 설명되어 있다.

방법:

SNALP 제제를 실시예 1에 설명된 바와 같이 제조하였다.

동물 처리:

암컷 BALB/c 마우스를 할란 랩스 (Harlan Labs)로부터 입수하였다. 동물에게 측면 꼬리 정맥에서 10 mL/kg 정맥내 주사를 통해 단일 용량의 SNALP-제제화된 siRNA, 또는 포스페이트-완충 염수를 투여하였다. 투여된 siRNA 투여량은 0.025, 0.050 또는 0.25 mg/kg (체중)이었다. SNALP 주사 약 48 h 후에, 동물을 안락사시키고, 간 조직을 RNA레이터(RNAlater)^® RNA 안정화 용액 내로 수집하였다.

조직 분석:

간 조직을 본질적으로 문헌 [Judge et al., 2006, Molecular Therapy 13:494]에 기재된 바와 같은 퀀티젠^® 분지형 DNA 검정 (파노믹스 (Panomics), 미국 캘리포니아주 프리몬트; 현재 아피메트릭스의 자회사)을 사용하여 GAPDH mRNA 수준에 대해 정규화된 마우스 ALDH2 mRNA 수준에 대해 분석하였다.

결과:

표 B는 임의로 "100.0%"로 설정된 대조군 PBS-처리 동물에서 측정된 GAPDH-정규화된 ALDH2 mRNA의 양 (6마리의 동물의 평균, ± 6.3% 표준 편차)에 비해 SNALP 처리의 유전자 침묵 활성 (3마리 동물의 평균, ± 표준 편차)을 보여준다.

<표 B>

결론:

마우스 ALDH2를 표적으로 하는 SNALP-제제화된 siRNA 1의 단일 정맥내 투여는 마우스에서 용량-반응 방식으로 ALDH2 유전자 침묵 활성을 생성하였다.

실시예 3.

본 실시예는 본 발명의 혈청에서 안정성인 핵산-지질 입자를 제조하기 위한 방법을 설명한다.

siRNA 분자는 표준 절차를 이용하여 화학적으로 합성하고 어닐링한다.

몇몇 실시양태에서, siRNA 분자는 다음 지질로 이루어진, 혈청에서 안정성인 핵산-지질 입자 내로 캡슐화된다: (1) 지질 접합체 PEG2000-C-DMA (3-N-[(-메톡시폴리(에틸렌 글리콜)2000)카르바모일]-1,2-디미리스틸옥시프로필아민); (2) 양이온성 지질, 예를 들어 DLinDMA; (3) 인지질 DPPC (1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린) (아반티 폴라 리피즈 (Avanti Polar Lipids; 미국 앨라배마주 알라바스터)); 및 (4) 합성 콜레스테롤 (시그마-알드리치 코포레이션 (Sigma-Aldrich Corp.; 미국 미주리주 세인트루이스)) (각각 몰비 1.4:57.1:7.1:34.3). 즉, siRNA 분자는 다음과 같은 "1:57" 제제의 핵산-지질 입자 내로 캡슐화된다: 1.4% PEG2000-C-DMA; 57.1% 양이온성 지질; 7.1% DPPC; 및 34.3% 콜레스테롤. 1:57 제제는 표적 제제이고, 존재하는 지질 (양이온성 및 비-양이온성 지질 둘 모두)의 양 및 제제 내에 존재하는 지질 접합체의 양은 상이할 수 있음을 이해하여야 한다. 일반적으로, 1:57 제제에서, 양이온성 지질의 양은 57.1 몰% ± 5 몰%이고, 지질 접합체의 양은 1.4 몰% ± 0.5 몰%이고, 1:57 제제의 나머지는 비-양이온성 지질 (예를 들어, 인지질, 콜레스테롤, 또는 2개의 혼합물)로 이루어진다. 제제는 그 전부가 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 US2007/0042031에 기재된 공정을 이용하여 제조한다. 형성시에, 핵산-지질 입자는 PBS에 대해 투석하고, 사용 전에 0.2 ㎛를 통해 필터 멸균한다. 평균 입자 크기는 75 - 90 nm 범위일 수 있고, 여기서 최종 siRNA/지질 비는 0.15 (wt/wt)이다.

실시예 4.

본 실시예는 시험관 내에서 인간 세포에서 ALDH2 유전자 발현의 siRNA-매개된 감소를 설명한다.

물질:

이들 연구에 사용된 모든 siRNA 분자는 표준 절차를 이용하여 화학적으로 합성하고 어닐링하였다.

본 실시예에서 표 A는 본 실시예에 기재된 실험에서 사용된 알데히드 데히드로게나제 2 (ALDH2)-표적화 siRNA 서열을 보여준다:

<표 A>

방법:

핵산-지질 입자는 다음과 같은 "1:57" 제제로 이루어졌다: 1.4% PEG2000-C-DMA; 57.1% DLinDMA; 7.1% DPPC; 및 34.3% 콜레스테롤. 일반적으로, 1:57 제제에서, DLinDMA의 양은 57.1 몰% ± 5 몰%이고, 지질 접합체의 양은 1.4 몰% ± 0.5 몰%이었고, 1:57 제제의 나머지는 비-양이온성 지질 (예를 들어, 인지질, 콜레스테롤, 또는 2개의 혼합물)로 이루어졌고, 최종 siRNA/지질 비는 약 0.11 대 0.15 (wt/wt)이었다. siRNA-로딩된 입자의 형성 시에, 평균 입자 크기는 직경 85 - 100 nm이었다.

포유동물 세포 처리 및 mRNA 분석: HepG2 (인간 간세포 암종) 세포를 96-웰 플레이트에서 부착 배양물로서 유지하였다. ALDH-2 표적화 또는 비-표적화 대조군 핵산-지질 입자를 3.91 및 15.63 ㎍/mL의 siRNA 농도로 배양 배지에 첨가하였고; 각각의 처리 조건은 이중의 웰에서 수행하였다. 핵산-지질 입자의 존재 하에 약 48 h 인큐베이션 후에, 세포를 수거하고, mRNA 분석을 위해 용해시켰다. 세포 용해물 내의 인간 ALDH2 mRNA는 분지형 DNA 검정 (파노믹스, 미국 캘리포니아주 프리몬트; 현재 아피메트릭스의 자회사)을 이용하여 측정하고, 인간 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH)에 대해 정규화하였다.

결과:

본 실시예에서 표 B는 임의로 "100.0%"로 설정된 미처리 배양 웰에서 측정된 GAPDH-정규화된 ALDH2 mRNA의 양 (2개의 반복시험 웰의 평균, ± 7.4% 표준 편차)에 비해 핵산-지질 처리의 유전자 침묵 활성 (이중 웰의 평균, ± 표준 편차)을 보여준다.

<표 B>

결론:

지질 입자 내에 제제화된 6개의 모든 siRNA는 인간 HepG2 세포에서 ALDH2 활성을 용량-반응 방식으로 침묵시켰다. 시험된 6개의 siRNA 중에서, siRNA 2가 가장 높은 활성을 보였고, siRNA 3이 가장 작은 활성을 보였다.

본원 명세서에서 언급되는 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 간행물은 본 발명의 설명과 비일치하지 않는 정도로 그 전부가 본원에 참조로 포함된다.

위 내용으로부터, 본 발명의 구체적인 실시양태를 예시의 목적으로 본원에서 설명하였지만, 본 발명의 취지와 범위로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> PROTIVA BIOTHERAPEUTICS INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR SILENCING ALDEHYDE DEHYDROGENASE <130> TEKM-074/02WO 31118-2484 <150> US 61/599,238 <151> 2012-02-15 <150> US 61/543,700 <151> 2011-10-05 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dicer-substracte dsRNA oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> n = any ribonucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> modified_base <222> (24)..(25) <223> n = any deoxyribonucleic acid <400> 1 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 25 <210> 2 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dicer-substracte dsRNA oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(8) <223> n = any ribonucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> n = any 2'OMe modified ribonucleic acid <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) 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ribonucleic acid <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> n = any 2'OMe modified ribonucleic acid <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> n = any ribonucleic acid <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> n = any 2'OMe modified ribonucleic acid <220> <221> modified_base <222> (26)..(28) <223> n = any ribonucleic acid, 2'OMe ribonucleic acid or absent <220> <221> modified_base <222> (29)..(29) <223> n = any ribonucleic acid or 2'OMe ribonucleic acid <400> 2 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 29 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 3 aacaagauau acugagaaat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 4 uuucucagua uaucuuguug g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 5 gcagcaaaug agcaauaaat t 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 6 uuuauugcuc auuugcugcu u 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 7 ggagaaugug uaugacgaat t 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'Ome modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'Ome modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'Ome modified RNA base <400> 8 uucgucauac acauucuccu g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 9 cgacgccguc agcaggaaat t 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 10 uuuccugcug acggcgucgu g 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 11 guggaugaaa cucaguuuaa g 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 12 uaaacugagu uucauccacc u 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 13 guggaugaaa cucaguuuaa g 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 14 ggaugaaacu caguuuaaga a 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 15 cuuaaacuga guuucaucca c 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 16 ggaugaaacu caguuuaaga a 21 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 17 cugucuucac aaaggauuug g 21 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 18 aaauccuuug ugaagacagc u 21 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldehyde dehydrogenase 2 targeting siRNA molecule <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'OMe modified RNA base <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'OMe modified RNA base <400> 19 cugucuucac aaaggauuug g 21

Claims (66)

1. 알데히드 데히드로게나제 (ALDH) 유전자 발현을 침묵시키는 간섭 RNA를 포함하고, 여기서 간섭 RNA는 센스 가닥 및 상보성 안티센스 가닥을 포함하며 약 15 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이의 이중 가닥 영역을 포함하는 것인 조성물.
2. 제1항에 있어서, 간섭 RNA가 siRNA, 다이서(Dicer)-기질 dsRNA, shRNA, aiRNA, 프리(pre)-miRNA, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 이중 가닥 RNA (dsRNA)인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 간섭 RNA가 약 19 내지 약 25개 뉴클레오티드 길이의 이중 가닥 영역을 포함하는 것인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 간섭 RNA가 화학적으로 합성된 것인 조성물.
5. 제1항에 있어서, 간섭 RNA가 간섭 RNA의 한 가닥 또는 두 가닥 모두에서 3' 오버행(overhang)을 포함하는 것인 조성물.
6. 제1항에 있어서, 간섭 RNA가 이중 가닥 영역 내에 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.
7. 제6항에 있어서, 이중 가닥 영역 내의 약 30% 미만의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.
8. 제6항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 (2'OMe) 뉴클레오티드인 조성물.
9. 제8항에 있어서, 2'OMe 뉴클레오티드가 2'OMe-구아노신 뉴클레오티드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오티드, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인 조성물.
10. 제1항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 간섭 RNA가 알데히드 데히드로게나제2 (ALDH2) 유전자 발현을 침묵시키는 것인 조성물.
12. (a) 제1항의 간섭 RNA;
    (b) 양이온성 지질; 및
    (c) 비-양이온성 지질
    을 포함하는 핵산-지질 입자.
13. 제11항에 있어서, 양이온성 지질이 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLenDMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (γ-DLenDMA), 이들의 염, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인 핵산-지질 입자.
14. 제12항에 있어서, 양이온성 지질이 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-C2-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA), 이들의 염, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인 핵산-지질 입자.
15. 제12항에 있어서, 양이온성 지질이 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노) 부타노에이트 (DLin-M-C3-DMA), 디리놀레일메틸-3-디메틸아미노프로피오네이트 (DLin-M-C2-DMA), 이들의 염, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인 핵산-지질 입자.
16. 제12항에 있어서, 비-양이온성 지질이 인지질인 핵산-지질 입자.
17. 제12항에 있어서, 비-양이온성 지질이 콜레스테롤 또는 그의 유도체인 핵산-지질 입자.
18. 제12항에 있어서, 비-양이온성 지질이 인지질 및 콜레스테롤 또는 그의 유도체의 혼합물인 핵산-지질 입자.
19. 제16항 또는 제18항에 있어서, 인지질이 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인 핵산-지질 입자.
20. 제12항에 있어서, 비-양이온성 지질이 DPPC 및 콜레스테롤의 혼합물인 핵산-지질 입자.
21. 제12항에 있어서, 입자의 응집을 억제하는 접합 지질을 추가로 포함하는 핵산-지질 입자.
22. 제21항에 있어서, 입자의 응집을 억제하는 접합 지질이 폴리에틸렌글리콜 (PEG)-지질 접합체인 핵산-지질 입자.
23. 제22항에 있어서, PEG-지질 접합체가 PEG-디아실글리세롤 (PEG-DAG) 접합체, PEG-디알킬옥시프로필 (PEG-DAA) 접합체, PEG-인지질 접합체, PEG-세라미드 (PEG-Cer) 접합체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산-지질 입자.
24. 제22항에 있어서, PEG-지질 접합체가 PEG-DAA 접합체인 핵산-지질 입자.
25. 제24항에 있어서, PEG-DAA 접합체가 PEG-디데실옥시프로필 (C₁₀) 접합체, PEG-디라우릴옥시프로필 (C₁₂) 접합체, PEG-디미리스틸옥시프로필 (C₁₄) 접합체, PEG-디팔미틸옥시프로필 (C₁₆) 접합체, PEG-디스테아릴옥시프로필 (C₁₈) 접합체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산-지질 입자.
26. 제21항에 있어서, 입자의 응집을 억제하는 접합 지질이 폴리옥사졸린 (POZ)-지질 접합체인 핵산-지질 입자.
27. 제26항에 있어서, POZ-지질 접합체가 POZ-DAA 접합체인 핵산-지질 입자.
28. 제12항에 있어서, 간섭 RNA가 입자 내에 완전히 캡슐화되는 것인 핵산-지질 입자.
29. 제12항에 있어서, 입자의 지질:간섭 RNA 질량비가 약 5:1 내지 약 15:1인 핵산-지질 입자.
30. 제12항에 있어서, 입자의 중앙 직경이 약 30 nm 내지 약 150 nm인 핵산-지질 입자.
31. 제12항에 있어서, 양이온성 지질이 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 50 몰% 내지 약 65 몰%를 차지하는 것인 핵산-지질 입자.
32. 제12항에 있어서, 비-양이온성 지질이 인지질 및 콜레스테롤 또는 그의 유도체의 혼합물을 포함하고, 여기서 인지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 4 몰% 내지 약 10 몰%를 차지하고, 콜레스테롤 또는 그의 유도체는 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 30 몰% 내지 약 40 몰%를 차지하는 것인 핵산-지질 입자.
33. 제32항에 있어서, 인지질이 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 9 몰%를 차지하고, 콜레스테롤 또는 그의 유도체가 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 32 몰% 내지 약 37 몰%를 차지하는 것인 핵산-지질 입자.
34. 제21항에 있어서, 입자의 응집을 억제하는 접합 지질이 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 0.5 몰% 내지 약 2 몰%를 차지하는 것인 핵산-지질 입자.
35. 제12항의 핵산-지질 입자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
36. 세포를 제12항의 핵산-지질 입자와 접촉시키는 것을 포함하는, ALDH 유전자 발현을 침묵시키는 간섭 RNA를 세포 내로 도입하는 방법.
37. 제36항에 있어서, 세포가 포유동물에서의 것인 방법.
38. 제36항에 있어서, 세포가 입자를 포유동물에게 전신 경로를 통해 투여함으로써 접촉되는 것인 방법.
39. 제36항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
40. 제36항에 있어서, 포유동물이 알콜중독으로 진단된 것인 방법.
41. 제36항에 있어서, 간섭 RNA가 세포 내에서 ALDH2 유전자 발현을 침묵시키는 것인 방법.
42. ALDH 유전자 발현의 침묵을 필요로 하는 포유동물에게 제12항의 핵산-지질 입자를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 ALDH 유전자 발현을 침묵시키는 방법.
43. 제42항에 있어서, 입자가 전신 경로를 통해 투여되는 것인 방법.
44. 제42항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
45. 제44항에 있어서, 인간이 알콜중독에 걸린 것인 방법.
46. 제42항에 있어서, 입자의 투여가 포유동물에서 ALDH RNA 수준을 입자의 부재 하에서의 ALDH RNA 수준에 비해 적어도 약 50% 감소시키는 것인 방법.
47. 제42항에 있어서, 핵산-지질 입자가 ALDH2 유전자 발현을 침묵시키는 것인 방법.
48. 인간에게 치료 유효량의 제12항의 핵산-지질 입자를 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 알콜중독과 연관된 하나 이상의 증상을 치료 및/또는 개선하는 방법.
49. 제48항에 있어서, 입자가 전신 경로를 통해 투여되는 것인 방법.
50. 제48항에 있어서, 인간이 알콜중독 상태인 방법.
51. 제48항에 있어서, 핵산-지질 입자의 간섭 RNA가 인간에서 ALDH2 유전자의 발현을 억제하는 것인 방법.
52. ALDH 발현의 억제를 필요로 하는 포유동물에게 치료 유효량의 제12항의 핵산-지질 입자를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 ALDH 발현을 억제하는 방법.
53. 제52항에 있어서, 입자가 전신 경로를 통해 투여되는 것인 방법.
54. 제52항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
55. 제54항에 있어서, 인간이 알콜중독 상태인 방법.
56. 제52항에 있어서, 입자의 투여가 포유동물에서 ALDH 유전자 발현을 입자의 부재 하에서의 ALDH 유전자 발현에 비해 적어도 약 50% 감소시키는 것인 방법.
57. 제52항에 있어서, ALDH2의 발현이 포유동물에서 억제되는 것인 방법.
58. 인간에게 치료 유효량의 제12항의 핵산-지질 입자를 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 알콜중독을 예방 및/또는 치료하는 방법.
59. 제58항에 있어서, 입자가 전신 경로를 통해 투여되는 것인 방법.
60. 제58항에 있어서, 인간이 알콜중독에 걸린 것인 방법.
61. 제58항에 있어서, 핵산-지질 입자의 간섭 RNA가 인간에서 ALDH2 유전자의 발현을 억제하는 것인 방법.
62. 본원의 실시예 4의 표 A에 제시된 식별자 1, 식별자 2, 식별자 3, 식별자 4, 식별자 5 및 식별자 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이중 가닥 siRNA 분자.
63. 본원의 실시예 4의 표 A에 제시된 단일 가닥 센스 가닥 분자로부터 선택되는 단일 가닥 RNA 분자.
64. 본원의 실시예 4의 표 A에 제시된 단일 가닥 안티센스 가닥 분자로부터 선택되는 단일 가닥 RNA 분자.
65. 살아있는 세포에서 ALDH 유전자 발현을 억제하기 위한, 본 발명의 siRNA 분자의 용도.
66. 살아있는 세포에서 ALDH 유전자 발현을 억제하기 위한, 본 발명의 제약 조성물의 용도.