CN104968354A - 增加器官或器官外植体的活力或寿命的方法 - Google Patents

增加器官或器官外植体的活力或寿命的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104968354A
CN104968354A CN201280069608.9A CN201280069608A CN104968354A CN 104968354 A CN104968354 A CN 104968354A CN 201280069608 A CN201280069608 A CN 201280069608A CN 104968354 A CN104968354 A CN 104968354A
Authority
CN
China
Prior art keywords
optionally substituted
modified
formula
nucleic acid
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280069608.9A
Other languages
English (en)
Inventor
斯蒂芬·邦塞尔
安东宁·德富热罗勒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Moderna Inc
Original Assignee
Moderna Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Moderna Therapeutics Inc filed Critical Moderna Therapeutics Inc
Publication of CN104968354A publication Critical patent/CN104968354A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及制造和优化用于改良器官活力和/或寿命的经修饰mRNA分子的组合物和方法。

Description

增加器官或器官外植体的活力或寿命的方法
序列表引用
本申请随电子格式的序列表一起提交。名为M14PCTSEQLST.txt的序列表文件是在2012年12月21日创建且大小为845,739个字节。电子格式的序列表中的信息以全文引用的方式并入本文中。
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年12月21日提交的标题为Methods of Increasing the Viability orLongevity of an Organ or Organ Explant的美国临时申请号61/578,271的权益，所述美国临时申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
发明领域
本发明涉及用于制造经修饰mRNA的组合物和方法。
发明背景
器官的保存，无论是对于研究来说还是在试图增加活力或寿命以待未来的移植机会方面，都是一个热点研究领域。在历史上，保存已经聚焦于利用试图减少对器官或组织的损害的装置和组合物来进行温度和缺血控制。已经利用再灌注和浸泡溶液在努力减轻细胞损伤方面取得了一定的成功。还使用了如离体器官照护系统和便携式器官室等装置来延长器官和组织的可用寿命。
然而，仍需要更稳固的系统来用于直接调节细胞和组织的生理机能以延长器官活力，同时避免破坏性反应系统就位，如自由基破坏和免疫系统活化。
本发明提供了经修饰的RNA分子，具体地说是经修饰的mRNA分子，它们经由改良蛋白质合成而发挥优化细胞生理机能的功能。所述优化涉及并入到将递送相关可翻译转录物的mRNA分子中的新颖化学性质的使用。
天然存在的RNA是由4种基本的核糖核苷酸合成而得：ATP、CTP、UTP和GTP，但可能含有经转录后修饰的核苷酸。此外，已经在RNA中鉴别了大约100种不同的核苷修饰(Rozenski,J,Crain,P和McCloskey,J.(1999).The RNA Modification Database:1999年更新.Nucl Acids Res 27:196-197)。
本文中描述了核苷修饰对RNA的免疫刺激潜能、稳定性和翻译效率的作用和因此而带来的能增强蛋白质表达、产生治疗剂和提供可用于器官寿命的工具的益处。
发明概要
本文中描述了制造和优化用于改良细胞活力的经修饰mRNA分子的组合物和方法。具体地说，公开了用于增加器官、组织、其外植体或部分的活力或寿命的方法。
在一个实施方案中，提供了一种增加器官或组织外植体或其部分的活力或寿命的方法，包括使所述器官或组织外植体或其部分与包含经修饰RNA(例如，经修饰mRNA)的组合物接触。可以用本发明的组合物处理任何器官、组织或其部分。器官可以选自心脏、肺脏、脑、肝脏、基底神经节、脑干髓质、中脑、脑桥、小脑、大脑皮层、下丘脑、眼睛、垂体、甲状腺、甲状旁腺、食管、胸腺、肾上腺、阑尾、膀胱、胆囊、肠(例如，大肠和小肠)、肾脏、胰腺、脾脏、胃、皮肤、前列腺、睾丸、卵巢或子宫。组织可以选自心瓣膜、骨、静脉、中耳、软骨、肌腱或韧带。
在一个实施方案中，经修饰RNA组合物包含配制的经修饰mRNA，且所述制剂可以选自生理盐水、脂质、类脂质、类脂质、聚合物、脂质体制剂、脂质纳米粒子、快速消除型脂质纳米粒子、动态聚缀合物制剂、atuplexes、DBTC制剂、PLGA聚合物、基于鱼精蛋白的试剂、细胞穿透性肽、糖缀合物、水凝胶、密封剂(例如，外科用密封剂)或类固醇，和基于细胞的载体系统。
在一个实施方案中，将经修饰mRNA施用于宿主生物体。该宿主生物体可以是供体或接受者宿主。捐赠并非必然表明存在接受者生物体。可以在不存在接受者的情况下进行器官或组织的捐赠(或收集)。
在一个实施方案中，对供体生物体进行施用是在用于移出器官或组织的任何程序之前或在移出期间发生。施用可以通过浸泡、接触或通过递送到供体或接受者的血液来进行。此外，可以通过使用医用装置、系统或组件(如离体器官照护系统)或与其组合而至少部分地帮助施用。
在一个实施方案中，所施用的经修饰mRNA是经配制的药物组合物。
在一个实施方案中，经修饰mRNA编码能充当自由基清除剂或免疫抑制剂的多肽。
在一个实施方案中，经修饰mRNA编码如蛋白a4β1、VCAM-1、VEGF、神经调节蛋白1或胸腺素β-4等蛋白质。
以下发明描述中阐述了本发明的各种实施方案的细节。本发明的其它特征、目标和优点将从发明说明和图式以及权利要求书中显而易见。
发明详述
本文中描述了制造和优化用于改良细胞活力的经修饰mRNA分子的组合物和方法。具体地说，公开了经由使用经修饰RNA分子来增加器官、组织或其外植体的活力或寿命的方法。
一般来说，引入到细胞中的外源性核酸，特别是病毒核酸，会诱导固有的免疫反应，从而导致干扰素(IFN)产生和细胞死亡。然而，对于能够以体内或离体方式向细胞内递送核酸，例如核糖核酸(RNA)，以便引起所述核酸的细胞内翻译且产生编码蛋白质的治疗剂、诊断剂、试剂和生物测定非常感兴趣。特别重要的是非整合性核酸的递送和功能，因为以整合到靶细胞中为特征的核酸在表达水平方面总体上不精确，会不利地转移到后代和相邻细胞，且会有相当大的突变风险。
本文中部分提供了编码能够调节细胞状态、功能和/或活性的多肽的核酸分子以及制造和使用这些核酸和多肽的方法。如本文中且如同在申请中的、共同拥有的申请，即2011年8月5日提交的国际申请PCT/US2011/046861和2011年10月3日提交的PCT/US2011/054636中所描述，这些经修饰的核酸分子能够降低引入了所述经修饰的核酸分子的细胞群体的固有免疫活性，因而提高该细胞群体中的蛋白质产生效率，所述申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
经修饰的核酸分子(经修饰的RNA)
本发明提供了核酸，包括RNA，如mRNA，其含有一个或多个经修饰的核苷(称为“经修饰的核酸”或“经修饰的核酸分子”)，其具有有用的性质，包括对引入了mRNA的细胞中的固有免疫反应缺乏实质性诱导。因为这些经修饰的核酸提高了蛋白质产生效率、核酸的细胞内滞留和所接触细胞的活力，以及具有降低的免疫原性，所以具有这些性质的这些核酸在本文中被称为“增强型”核酸或经修饰的RNA。
术语“核酸”在其最广泛意义上包括了包含经由磷酸二酯键连接的核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。这些聚合物常称为寡核苷酸。
示例性核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂交物。它们还可以包括RNAi诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核糖酶、催化性DNA、tRNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体、载体等。在优选实施方案中，经修饰的核酸分子是一种或多种信使RNA(mRNA)。如本文中所使用的经修饰的mRNA还可以称为“mmRNA”。如本文中所描述，本发明的核酸基本上不会诱导引入了mRNA的细胞的固有免疫反应。
在一些实施方案中，核酸是可翻译的。
提供了含有一个可翻译区和一个、两个或多于两个不同的核苷修饰的经修饰核酸。在一些实施方案中，相对于相应的未经修饰的核酸，经修饰的核酸在引入了所述核酸的细胞中展现减少的降解。
在另一个方面，本公开提供了包含可以破坏大沟相互作用(例如结合)伴侣与核酸的结合的核苷酸的化合物，其中所述核苷酸与大沟相互作用(例如结合)伴侣的结合亲和力有所降低。
在一些实施方案中，化学修饰可以位于核苷酸的糖部分上。
在一些实施方案中，化学修饰可以位于核苷酸的磷酸酯骨架上。
在某些实施方案中，需要使引入到细胞中的经修饰的核酸在细胞内降解，例如，如果需要蛋白质产生的精确定时时。因而，本发明提供了一种含有降解域的经修饰的核酸，其能够在细胞内以定向方式受作用。
修饰
本发明的经修饰的核酸和经修饰的mRNA(mmRNA)可以含有一个、两个或更多个不同的修饰。在一些实施方案中，经修饰的核酸分子和mmRNA可以含有一个、两个或更多个不同的核苷或核苷酸修饰。在一些实施方案中，引入到细胞中的经修饰的核酸分子或mmRNA(例如具有一个或多个mmRNA分子)与未经修饰的核酸分子或mmRNA相比可以在所述细胞中展现减少的降解。
经修饰的核酸分子和mmRNA可以包括任何可用的修饰，如对糖、核碱基(例如对核碱基的一个或多个修饰，如通过用任选地经取代的氨基、任选地经取代的硫醇基、任选地经取代的烷基(例如甲基或乙基)或卤基(例如氯基或氟基)置换或取代嘧啶核碱基的原子)或核苷间键(例如对磷酸二酯骨架的一个或多个修饰)的修饰。在某些实施方案中，修饰存在于糖与核苷间键二者中(例如一个或多个修饰，如存在于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂交物中)。本文中描述了其它修饰。
如本文中所描述，本发明的经修饰的核酸分子和mmRNA基本上不会诱导引入了所述mRNA的细胞的固有免疫反应。在某些实施方案中，可能需要使引入到所述细胞中的经修饰的核酸分子或经修饰的mRNA在细胞内降解。举例来说，如果需要蛋白质产生的精确定时，则可能优选使经修饰的核酸分子或经修饰的mRNA降解。因而，在一些实施方案中，本发明提供了一种含有降解域的经修饰的核酸分子，其能够在细胞内以定向方式受作用。在另一个方面，本公开提供了包含可以破坏大沟相互作用(例如结合)伴侣与核酸的结合(例如在与未经修饰的核苷酸相比，经修饰的核苷酸与大沟相互作用伴侣的结合亲和力有所降低的情况下)的核苷或核苷酸的核酸。
经修饰的核酸分子和mmRNA可以任选地包括其它试剂(例如RNAi诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核糖酶、催化性DNA、tRNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体、载体等)。在一些实施方案中，经修饰的核酸分子或mmRNA可以包括一种或多种信使RNA(mRNA)和一种或多种经修饰的核苷或核苷酸(例如mmRNA分子)。这些经修饰的核酸分子和mmRNA的详情如下。
经修饰的核酸
本发明的经修饰的核酸或mmRNA可以包括编码目的多肽的连接核苷的第一区、位于所述第一区的5'末端的第一侧翼区和位于所述第一区的3'末端的第二侧翼区。
在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(Ia)或式(Ia-1)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
U为O、S、N(RU)nu或C(RU)nu，其中nu为整数0到2且各RU独立地为H、卤基或任选地经取代的烷基；
---为单键或不存在；
R1'、R2'、R1"、R2"、R1、R2、R3、R4和R5如果存在则各自独立地为H、卤基、羟基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基、任选地经取代的羟基烷氧基、任选地经取代的氨基、叠氮基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基或不存在；其中R3与R1'、R1"、R2'、R2"或R5中的一者或多者的组合(例如R1'与R3的组合、R1"与R3的组合、R2'与R3的组合、R2"与R3的组合或R5与R3的组合)可以连接在一起以形成任选地经取代的亚烷基或任选地经取代的杂亚烷基，且与其所连接的碳一起提供任选地经取代的杂环基(例如双环、三环或四环杂环基)；其中R5与R1'、R1"、R2'或R2"中的一者或多者的组合(例如R1'与R5的组合、R1"与R5的组合、R2'与R5的组合或R2"与R5的组合)可以连接在一起以形成任选地经取代的亚烷基或任选地经取代的杂亚烷基，且与其所连接的碳一起提供任选地经取代的杂环基(例如双环、三环或四环杂环基)；且其中R4与R1'、R1"、R2'、R2"、R3或R5中的一者或多者的组合可以连接在一起以形成任选地经取代的亚烷基或任选地经取代的杂亚烷基，且与其所连接的碳一起提供任选地经取代的杂环基(例如双环、三环或四环杂环基)；
m'和m"各自独立地为整数0到3(例如0到2、0到1、1到3或1到2)；
Y1、Y2和Y3各自独立地为O、S、Se、-NRN1-、任选地经取代的亚烷基或任选地经取代的杂亚烷基，其中RN1为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的芳基或不存在；
各Y4独立地为H、羟基、硫醇基、硼烷基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的硫代烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基或任选地经取代的氨基；
各Y5独立地为O、S、Se、任选地经取代的亚烷基(例如亚甲基)或任选地经取代的杂亚烷基；
n为整数1到100,000；且
B为核碱基(例如嘌呤、嘧啶或其衍生物)，其中B与R1'的组合、B与R2'的组合、B与R1"的组合或B与R2"的组合可以与其所连接的碳一起任选地形成双环基团(例如双环杂环基)，或其中B、R1"与R3的组合或B、R2"与R3的组合可以任选地形成三环或四环基团(例如三环或四环杂环基，如在本文的式(IIo)-(IIp)中)。在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括经修饰的核糖。
在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(Ia-2)-(Ia-5)的连接核苷或其药学上可接受的盐或立体异构体。
在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(Ib)或式(Ib-1)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
U为O、S、N(RU)nu或C(RU)nu，其中nu为整数0到2且各RU独立地为H、卤基或任选地经取代的烷基；
---为单键或不存在；
R1、R3'、R3"和R4各自独立地为H、卤基、羟基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基、任选地经取代的羟基烷氧基、任选地经取代的氨基、叠氮基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基或不存在；且其中R1与R3'的组合或R1与R3"的组合可以一起形成任选地经取代的亚烷基或任选地经取代的杂亚烷基(例如以产生锁核酸)；
各R5独立地为H、卤基、羟基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基或不存在；
Y1、Y2和Y3各自独立地为O、S、Se、-NRN1-、任选地经取代的亚烷基或任选地经取代的杂亚烷基，其中RN1为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基或任选地经取代的芳基；
各Y4独立地为H、羟基、硫醇基、硼烷基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基或任选地经取代的氨基；
n为整数1到100,000；且
B为核碱基。
在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(Ic)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
U为O、S、N(RU)nu或C(RU)nu，其中nu为整数0到2且各RU独立地为H、卤基或任选地经取代的烷基；
---为单键或不存在；
B1、B2和B3各自独立地为核碱基(例如嘌呤、嘧啶或其衍生物，如本文中所描述)、H、卤基、羟基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基、任选地经取代的羟基烷氧基、任选地经取代的氨基、叠氮基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基或任选地经取代的氨基炔基，其中B1、B2和B3之一且仅一者为核碱基；
Rb1、Rb2、Rb3、R3和R5各自独立地为H、卤基、羟基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基、任选地经取代的羟基烷氧基、任选地经取代的氨基、叠氮基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基或任选地经取代的氨基炔基；
Y1、Y2和Y3各自独立地为O、S、Se、-NRN1-、任选地经取代的亚烷基或任选地经取代的杂亚烷基，其中RN1为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基或任选地经取代的芳基；
各Y4独立地为H、羟基、硫醇基、硼烷基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的硫代烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基或任选地经取代的氨基；
各Y5独立地为O、S、Se、任选地经取代的亚烷基(例如亚甲基)或任选地经取代的杂亚烷基；
n为整数1到100,000；且
其中包括U的环可以包括一个或多个双键。
在特定的实施方案中，包括U的环不具有介于U-CB3Rb3之间或介于CB3Rb3-CB2Rb2之间的双键。
在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(Id)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
U为O、S、N(RU)nu或C(RU)nu，其中nu为整数0到2且各RU独立地为H、卤基或任选地经取代的烷基；
各R3独立地为H、卤基、羟基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基、任选地经取代的羟基烷氧基、任选地经取代的氨基、叠氮基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基或任选地经取代的氨基炔基；
Y1、Y2和Y3各自独立地为O、S、Se、-NRN1-、任选地经取代的亚烷基或任选地经取代的杂亚烷基，其中RN1为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基或任选地经取代的芳基；
各Y4独立地为H、羟基、硫醇基、硼烷基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的硫代烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基或任选地经取代的氨基；
各Y5独立地为O、S、任选地经取代的亚烷基(例如亚甲基)或任选地经取代的杂亚烷基；
n为整数1到100,000；且
B为核碱基(例如嘌呤、嘧啶或其衍生物)。
在一些实施方案中，经修饰的核酸分子或经修饰的mRNA包括n个具有式(Ie)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
U'和U"各自独立地为O、S、N(RU)nu或C(RU)nu，其中nu为整数0到2且各RU独立地为H、卤基或任选地经取代的烷基；
各R6独立地为H、卤基、羟基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基、任选地经取代的羟基烷氧基、任选地经取代的氨基、叠氮基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基或任选地经取代的氨基炔基；
各Y5'独立地为O、S、任选地经取代的亚烷基(例如亚甲基或亚乙基)或任选地经取代的杂亚烷基；
n为整数1到100,000；且
B为核碱基(例如嘌呤、嘧啶或其衍生物)。
在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(If)或式(If-1)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
U'和U"各自独立地为O、S、N、N(RU)nu或C(RU)nu，其中nu为整数0到2且各RU独立地为H、卤基或任选地经取代的烷基(例如U'为O且U"为N)；
---为单键或不存在；
R1'、R2'、R1"、R2"、R3和R4各自独立地为H、卤基、羟基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基、任选地经取代的羟基烷氧基、任选地经取代的氨基、叠氮基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基或不存在；且其中R1'与R3的组合、R1"与R3的组合、R2'与R3的组合或R2"与R3的组合可以一起形成任选地经取代的亚烷基或任选地经取代的杂亚烷基(例如，以产生锁核酸)；m'和m"各自独立地为整数0到3(例如0到2、0到1、1到3或1到2)；
Y1、Y2和Y3各自独立地为O、S、Se、-NRN1-、任选地经取代的亚烷基或任选地经取代的杂亚烷基，其中RN1为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的芳基或不存在；
各Y4独立地为H、羟基、硫醇基、硼烷基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的硫代烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基或任选地经取代的氨基；
各Y5独立地为O、S、Se、任选地经取代的亚烷基(例如亚甲基)或任选地经取代的杂亚烷基；
n为整数1到100,000；且
B为核碱基(例如嘌呤、嘧啶或其衍生物)。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-(Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，包括U的环具有一个或两个双键。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-(Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，R1、R1'和R1"如果存在则各自为H。在其它实施方案中，R2、R2'和R2"如果存在则各自独立地为H、卤基(例如氟基)、羟基，或任选地经取代的烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)，或任选地经取代的烷氧基烷氧基。在特定的实施方案中，烷氧基烷氧基为-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基)。在一些实施方案中，s2为0，s1为1或2，s3为0或1，且R'为C1-6烷基。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，R2、R2'和R2"如果存在则各自为H。在其它实施方案中，R1、R1'和R1"如果存在则各自独立地为H、卤基(例如氟基)、羟基，或任选地经取代的烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)，或任选地经取代的烷氧基烷氧基。在特定的实施方案中，烷氧基烷氧基为-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基)。在一些实施方案中，s2为0，s1为1或2，s3为0或1，且R'为C1-6烷基。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，R3、R4和R5各自独立地为H、卤基(例如氟基)、羟基、任选地经取代的烷基或任选地经取代的烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)或任选地经取代的烷氧基烷氧基。在特定的实施方案中，R3是H，R4是H，R5是H，或R3、R4和R5都是H。在特定的实施方案中，R3是C1-6烷基，R4是C1-6烷基，R5是C1-6烷基，或R3、R4和R5都是C1-6烷基。在特定的实施方案中，R3和R4都是H，且R5是C1-6烷基。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，R3与R5连接在一起以形成任选地经取代的亚烷基或任选地经取代的杂亚烷基，且与其所连接的碳一起提供任选地经取代的杂环基(例如双环、三环或四环杂环基，如反-3',4'类似物，其中R3与R5连接在一起以形成杂亚烷基(例如-(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3-，其中b1、b2和b3各自独立地为整数0到3)。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，R3与R1'、R1"、R2'、R2"或R5中的一者或多者连接在一起以形成任选地经取代的亚烷基或任选地经取代的杂亚烷基，且与其所连接的碳一起提供任选地经取代的杂环基(例如双环、三环或四环杂环基，R3与R1'、R1"、R2'、R2"或R5中的一者或多者连接在一起以形成杂亚烷基(例如-(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3-，其中b1、b2和b3各自独立地为整数0到3)。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，R5与R1'、R1"、R2'或R2"中的一者或多者连接在一起以形成任选地经取代的亚烷基或任选地经取代的杂亚烷基，且与其所连接的碳一起提供任选地经取代的杂环基(例如双环、三环或四环杂环基，R5与R1'、R1"、R2'或R2"中的一者或多者连接在一起以形成杂亚烷基(例如-(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3-，其中b1、b2和b3各自独立地为整数0到3)。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，各Y2独立地为O、S或-NRN1-，其中RN1为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基或任选地经取代的芳基。在特定的实施方案中，Y2为NRN1-，其中RN1为H或任选地经取代的烷基(例如C1-6烷基，如甲基、乙基、异丙基或正丙基)。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，各Y3独立地为O或S。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，R1为H；各R2独立地为H、卤基(例如氟基)、羟基，或任选地经取代的烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)，或任选地经取代的烷氧基烷氧基(例如-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基，如其中s2为0，s1为1或2，s3为0或1，且R'为C1-6烷基)；各Y2独立地为O或-NRN1-，其中RN1为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基或任选地经取代的芳基(例如，其中RN1为H或任选地经取代的烷基(例如C1-6烷基，如甲基、乙基、异丙基或正丙基))；且各Y3独立地为O或S(例如S)。在其它实施方案中，R3为H、卤基(例如氟基)、羟基、任选地经取代的烷基或任选地经取代的烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)，或任选地经取代的烷氧基烷氧基。在其它实施方案中，各Y1独立地为O或-NRN1-，其中RN1为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基或任选地经取代的芳基(例如，其中RN1为H或任选地经取代的烷基(例如C1-6烷基，如甲基、乙基、异丙基或正丙基))；且各Y4独立地为H、羟基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的硫代烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基或任选地经取代的氨基。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-(Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，各R1独立地为H、卤基(例如氟基)、羟基，或任选地经取代的烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)，或任选地经取代的烷氧基烷氧基(例如-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基，如其中s2为0，s1为1或2，s3为0或1，且R'为C1-6烷基)；R2为H；各Y2独立地为O或-NRN1-，其中RN1为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基或任选地经取代的芳基(例如，其中RN1为H或任选地经取代的烷基(例如C1-6烷基，如甲基、乙基、异丙基或正丙基))；且各Y3独立地为O或S(例如S)。在其它实施方案中，R3为H、卤基(例如氟基)、羟基、任选地经取代的烷基或任选地经取代的烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)，或任选地经取代的烷氧基烷氧基。在其它实施方案中，各Y1独立地为O或-NRN1-，其中RN1为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基或任选地经取代的芳基(例如，其中RN1为H或任选地经取代的烷基(例如C1-6烷基，如甲基、乙基、异丙基或正丙基))；且各Y4独立地为H、羟基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的硫代烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基或任选地经取代的氨基。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-(Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，包括U的环呈β-D(例如β-D-ribo)构型。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-(Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，包括U的环呈α-L(例如α-L-ribo)构型。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-(Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，一个或多个B不是假尿苷(ψ)或5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，约10％到约100％的B核碱基不是ψ或m5C(例如n个B中有10％到20％、10％到35％、10％到50％、10％到60％、10％到75％、10％到90％、10％到95％、10％到98％、10％到99％、20％到35％、20％到50％、20％到60％、20％到75％、20％到90％、20％到95％、20％到98％、20％到99％、20％到100％、50％到60％、50％到75％、50％到90％、50％到95％、50％到98％、50％到99％、50％到100％、75％到90％、75％到95％、75％到98％、75％到99％和75％到100％不是ψ或m5C)。在一些实施方案中，B不是ψ或m5C。
在经修饰的核酸或mmRNA(例如式(Ia)-(Ia-5)、式(Ib)-(If-1)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr))的一些实施方案中，当B为选自胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和腺嘌呤的未经修饰的核碱基时，则Y1、Y2或Y3中至少一者不是O。
在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括经修饰的核糖。在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(IIa)-(IIc)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体。在特定的实施方案中，U为O或C(RU)nu，其中nu为整数0到2且各RU独立地为H、卤基或任选地经取代的烷基(例如U为-CH2-或-CH-)。在其它实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为H、卤基、羟基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基、任选地经取代的羟基烷氧基、任选地经取代的氨基、叠氮基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基或不存在(例如R1和R2各自独立地为H、卤基、羟基、任选地经取代的烷基或任选地经取代的烷氧基；R3和R4各自独立地为H或任选地经取代的烷基；且R5为H或羟基)，且为单键或双键。
在特定的实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(IIb-1)-(IIb-2)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体。在一些实施方案中，U为O或C(RU)nu，其中nu为整数0到2且各RU独立地为H、卤基或任选地经取代的烷基(例如U为-CH2-或-CH-)。在其它实施方案中，R1和R2各自独立地为H、卤基、羟基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基、任选地经取代的羟基烷氧基、任选地经取代的氨基、叠氮基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基或不存在(例如R1和R2各自独立地为H、卤基、羟基、任选地经取代的烷基或任选地经取代的烷氧基，例如H、卤基、羟基、烷基或烷氧基)。在特定的实施方案中，R2为羟基或任选地经取代的烷氧基(例如甲氧基、乙氧基或本文中所描述的任何烷氧基)。
在特定的实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(IIc-1)-(IIc-4)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体。在一些实施方案中，U为O或C(RU)nu，其中nu为整数0到2且各RU独立地为H、卤基或任选地经取代的烷基(例如U为-CH2-或-CH-)。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自独立地为H、卤基、羟基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基、任选地经取代的羟基烷氧基、任选地经取代的氨基、叠氮基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基或不存在(例如R1和R2各自独立地为H、卤基、羟基、任选地经取代的烷基或任选地经取代的烷氧基，例如H、卤基、羟基、烷基或烷氧基；且各R3独立地为H或任选地经取代的烷基))。在特定的实施方案中，R2为任选地经取代的烷氧基(例如甲氧基或乙氧基或本文中所描述的任何烷氧基)。在特定的实施方案中，R1为任选地经取代的烷基，且R2为羟基。在其它实施方案中，R1为羟基，且R2为任选地经取代的烷基。在其它实施方案中，R3为任选地经取代的烷基。
在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括非环状经修饰的核糖。在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(IId)-(IIf)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括非环状经修饰的己糖醇。在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(IIg)-(IIj)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括具有缩小或扩大的核糖环的糖部分。在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(IIk)-(IIm)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中R1'、R1"、R2'和R2"各自独立地为H、卤基、羟基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基或不存在；且其中R2'与R3的组合或R2"与R3的组合可以一起形成任选地经取代的亚烷基或任选地经取代的杂亚烷基。
在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括经修饰的锁核糖。在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(IIn)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中R3'为O、S或-NRN1-，其中RN1为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基或任选地经取代的芳基且R3"为任选地经取代的亚烷基(例如-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-)或任选地经取代的杂亚烷基(例如-CH2NH-、-CH2CH2NH-、-CH2OCH2-或-CH2CH2OCH2-)(例如R3'为O且R3"为任选地经取代的亚烷基(例如-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-))。
在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(IIn-1)-(II-n2)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中R3'为O、S或-NRN1-，其中RN1为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基或任选地经取代的芳基且R3"为任选地经取代的亚烷基(例如-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-)或任选地经取代的杂亚烷基(例如-CH2NH-、-CH2CH2NH-、-CH2OCH2-或-CH2CH2OCH2-)(例如R3'为O且R3"为任选地经取代的亚烷基(例如-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-))。
在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括可形成四环杂环基的经修饰的锁核糖。在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括n个具有式(IIo)的连接核苷：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中R12a、R12c、T1'、T1"、T2'、T2"、V1和V3如本文中所描述。
经修饰的核酸或mmRNA的任何化学式都可以包括本文中所描述的一个或多个核碱基(例如式(b1)-(b43))。
在一个实施方案中，本发明提供了制备包含至少一种核苷酸的经修饰的核酸或mmRNA(例如mmRNA分子)的方法，其中所述经修饰的核酸包含如n个具有如本文中所定义的式(Ia)的核苷：
所述方法包括使如本文中所定义的式(IIIa)化合物：
与RNA聚合酶和cDNA模板反应。
在另一个实施方案中，本发明提供了扩增包含至少一种核苷酸的经修饰的核酸或mmRNA(例如mmRNA分子)的方法，所述方法包括：使如本文中所定义的式(IIIa)化合物与引物、cDNA模板和RNA聚合酶反应。
在一个实施方案中，本发明提供了制备包含至少一种核苷酸的经修饰的核酸或mmRNA(例如mmRNA分子)的方法，其中所述经修饰的核酸包含如n个具有如本文中所定义的式(Ia-1)的核苷：
所述方法包括使如本文中所定义的式(IIIa-1)化合物：
与RNA聚合酶和cDNA模板反应。
在另一个实施方案中，本发明提供了扩增包含至少一种核苷酸的经修饰的核酸或mmRNA(例如mmRNA分子)的方法，所述方法包括使如本文中所定义的式(IIIa-1)化合物与引物、cDNA模板和RNA聚合酶反应。
在一个实施方案中，本发明提供了制备包含至少一种核苷酸的经修饰的mRNA(例如mmRNA分子)的方法，其中所述聚核苷酸包含如n个具有如本文中所定义的式(Ia-2)的核苷：
所述方法包括使如本文中所定义的式(IIIa-2)化合物：
与RNA聚合酶和cDNA模板反应。
在另一个实施方案中，本发明提供了扩增包含至少一种核苷酸的经修饰的mRNA(例如mmRNA分子)的方法，所述方法包括：
使如本文中所定义的式(IIIa-2)化合物与引物、cDNA模板和RNA聚合酶反应。
在一些实施方案中，所述反应可以重复1到约7,000次。在本文中的任何实施方案中，B可以是具有式(b1)-(b43)的核碱基。
经修饰的核酸和mmRNA可以任选地包括本文中所描述的5'和/或3'侧翼区。
经修饰的RNA(例如mmRNA)分子
本发明还包括经修饰的RNA(mmRNA)分子的构筑块，例如经修饰的核糖核苷、经修饰的核糖核苷酸。举例来说，这些mmRNA可以用于制备本发明的经修饰的核酸或mmRNA。
在一些实施方案中，构筑块分子具有式(IIIa)或式(IIIa-1)：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述取代基如本文中(例如针对式(Ia)和式(Ia-1))所描述，且其中当B为选自胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和腺嘌呤的未经修饰的核碱基时，则Y1、Y2或Y3中至少一者不是O。
在一些实施方案中，可以并入经修饰的核酸或mmRNA中的构筑块分子具有式(IVa)-(IVb)：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中B如本文中所描述(例如(b1)-(b43)中的任一者)。在特定的实施方案中，式(IVa)或式(IVb)与经修饰的尿嘧啶(例如式(b1)-(b9)、式(b21)-(b23)和式(b28)-(b31)中的任一者，如式(b1)、式(b8)、式(b28)、式(b29)或式(b30))组合。在特定的实施方案中，式(IVa)或式(IVb)与经修饰的胞嘧啶(例如式(b10)-(b14)、式(b24)、式(b25)和式(b32)-(b36)中的任一者，如式(b10)或式(b32))组合。在特定的实施方案中，式(IVa)或式(IVb)与经修饰的鸟嘌呤(例如式(b15)-(b17)和式(b37)-(b40)中的任一者)组合。在特定的实施方案中，式(IVa)或式(IVb)与经修饰的腺嘌呤(例如式(b18)-(b20)和式(b41)-(b43)中的任一者)组合。
在一些实施方案中，可以并入经修饰的核酸分子或mmRNA中的构筑块分子具有式
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中B如本文中所描述(例如(b1)-(b43)中的任一者)。在特定的实施方案中，式(IVc)-(IVk)之一与经修饰的尿嘧啶(例如式(b1)-(b9)、式(b21)-(b23)和式(b28)-(b31)中的任一者，如式(b1)、式(b8)、式(b28)、式(b29)或式(b30))组合。在特定的实施方案中，式(IVc)-(IVk)之一与经修饰的胞嘧啶(例如式(b10)-(b14)、式(b24)、式(b25)和式(b32)-(b36)中的任一者，如式(b10)或式(b32))组合。在特定的实施方案中，式(IVc)-(IVk)之一与经修饰的鸟嘌呤(例如式(b15)-(b17)和式(b37)-(b40)中的任一者)组合。在特定的实施方案中，式(IVc)-(IVk)之一与经修饰的腺嘌呤(例如式(b18)-(b20)和式(b41)-(b43)中的任一者)组合。
在其它实施方案中，可以并入经修饰的核酸分子或mmRNA中的构筑块分子具有式(Va)或式(Vb)：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中B如本文中所描述(例如(b1)-(b43)中的任一者)。
在其它实施方案中，可以并入经修饰的核酸分子或mmRNA中的构筑块分子具有式(IXa)-(IXd)：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中B如本文中所描述(例如(b1)-(b43)中的任一者)。在特定的实施方案中，式(IXa)-(IXd)之一与经修饰的尿嘧啶(例如式(b1)-(b9)、式(b21)-(b23)和式(b28)-(b31)中的任一者，如式(b1)、式(b8)、式(b28)、式(b29)或式(b30))组合。在特定的实施方案中，式(IXa)-(IXd)之一与经修饰的胞嘧啶(例如式(b10)-(b14)、式(b24)、式(b25)和式(b32)-(b36)中的任一者，如式(b10)或式(b32))组合。在特定的实施方案中，式(IXa)-(IXd)之一与经修饰的鸟嘌呤(例如式(b15)-(b17)和式(b37)-(b40)中的任一者)组合。在特定的实施方案中，式(IXa)-(IXd)之一与经修饰的腺嘌呤(例如式(b18)-(b20)和式(b41)-(b43)中的任一者)组合。
在其它实施方案中，可以并入经修饰的核酸分子或mmRNA中的构筑块分子具有式(IXe)-(IXg)：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中B如本文中所描述(例如(b1)-(b43)中的任一者)。在特定的实施方案中，式(IXe)-(IXg)之一与经修饰的尿嘧啶(例如式(b1)-(b9)、式(b21)-(b23)和式(b28)-(b31)中的任一者，如式(b1)、式(b8)、式(b28)、式(b29)或式(b30))组合。在特定的实施方案中，式(IXe)-(IXg)之一与经修饰的胞嘧啶(例如式(b10)-(b14)、式(b24)、式(b25)和式(b32)-(b36)中的任一者，如式(b10)或式(b32))组合。在特定的实施方案中，式(IXe)-(IXg)之一与经修饰的鸟嘌呤(例如式(b15)-(b17)和式(b37)-(b40)中的任一者)组合。在特定的实施方案中，式(IXe)-(IXg)之一与经修饰的腺嘌呤(例如式(b18)-(b20)和式(b41)-(b43)中的任一者)组合。
在其它实施方案中，可以并入经修饰的核酸分子或mmRNA中的构筑块分子具有式(IXh)-(IXk)：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中B如本文中所描述(例如(b1)-(b43)中的任一者)。在特定的实施方案中，式(IXh)-(IXk)之一与经修饰的尿嘧啶(例如式(b1)-(b9)、式(b21)-(b23)和式(b28)-(b31)中的任一者，如式(b1)、式(b8)、式(b28)、式(b29)或式(b30))组合。在特定的实施方案中，式(IXh)-(IXk)之一与经修饰的胞嘧啶(例如式(b10)-(b14)、式(b24)、式(b25)和式(b32)-(b36)中的任一者，如式(b10)或式(b32))组合。在特定的实施方案中，式(IXh)-(IXk)之一与经修饰的鸟嘌呤(例如式(b15)-(b17)和式(b37)-(b40)中的任一者)组合。在特定的实施方案中，式(IXh)-(IXk)之一与经修饰的腺嘌呤(例如式(b18)-(b20)和式(b41)-(b43)中的任一者)组合。
在其它实施方案中，可以并入经修饰的核酸分子或mmRNA中的构筑块分子具有式(IXl)-(IXr)：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中r1和r2各自独立地为整数0到5(例如0到3、1到3或1到5)，且B如本文中所描述(例如(b1)-(b43)中的任一者)。在特定的实施方案中，式(IXl)-(IXr)之一与经修饰的尿嘧啶(例如式(b1)-(b9)、式(b21)-(b23)和式(b28)-(b31)中的任一者，如式(b1)、式(b8)、式(b28)、式(b29)或式(b30))组合。在特定的实施方案中，式(IXl)-(IXr)之一与经修饰的胞嘧啶(例如式(b10)-(b14)、式(b24)、式(b25)和式(b32)-(b36)中的任一者，如式(b10)或式(b32))组合。在特定的实施方案中，式(IXl)-(IXr)之一与经修饰的鸟嘌呤(例如式(b15)-(b17)和式(b37)-(b40)中的任一者)组合。在特定的实施方案中，式(IXl)-(IXr)之一与经修饰的腺嘌呤(例如式(b18)-(b20)和式(b41)-(b43)中的任一者)组合。
在一些实施方案中，可以并入经修饰的核酸分子或mmRNA中的构筑块分子可以选自：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中各r独立地为整数0到5(例如0到3、1到3或1到5)。
在一些实施方案中，可以并入经修饰的核酸分子或mmRNA中的构筑块分子可以选自：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中各r独立地为整数0到5(例如0到3、1到3或1到5)且s1如本文中所描述。
在一些实施方案中，可以并入核酸(例如RNA、mRNA或mmRNA)中的构筑块分子是经修饰的尿苷(例如选自：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中Y1、Y3、Y4、Y6和r如本文中所描述(例如各r独立地为整数0到5，如0到3、1到3或1到5))。
在一些实施方案中，可以并入经修饰的核酸分子或mmRNA中的构筑块分子是经修饰的胞苷(例如选自：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中Y1、Y3、Y4、Y6和r如本文中所描述(例如各r独立地为整数0到5，如0到3、1到3或1到5))。举例来说，可以并入经修饰的核酸分子或mmRNA中的构筑块分子可以是：或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中各r独立地为整数0到5(例如0到3、1到3或1到5)。
在一些实施方案中，可以并入经修饰的核酸分子或mmRNA中的构筑块分子是经修饰的腺苷(例如选自：
或立体异构体，其中Y1、Y3、Y4、Y6和r如本文中所描述(例如各r独立地为整数0到5，如0到3、1到3或1到5))。
在一些实施方案中，可以并入经修饰的核酸分子或mmRNA中的构筑块分子是经修饰的鸟苷(例如选自：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中Y1、Y3、Y4、Y6和r如本文中所描述(例如各r独立地为整数0到5，如0到3、1到3或1到5))。
在一些实施方案中，化学修饰可以包括用N置换环(例如嘧啶核苷，如胞嘧啶或尿嘧啶)的C-5处的C基团(例如用>NRN1基团置换C-5处的>CH基团，其中RN1为H或任选地经取代的烷基)。举例来说，可以并入经修饰的核酸分子或mmRNA中的mmRNA分子可以是：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中各r独立地为整数0到5(例如0到3、1到3或1到5)。
在另一个实施方案中，化学修饰可以包括用卤基(例如Br、Cl、F或I)或任选地经取代的烷基(例如甲基)置换胞嘧啶的C-5处的氢。举例来说，可以并入经修饰的核酸或mmRNA中的mmRNA分子可以是：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中各r独立地为整数0到5(例如0到3、1到3或1到5)。
在又一个实施方案中，化学修饰可以包括由C-4位置上的NH2与C-5位置上的碳原子形成的稠环。举例来说，可以并入经修饰的核酸分子或mmRNA中的构筑块分子可以是：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中各r独立地为整数0到5(例如0到3、1到3或1到5)。
糖上的修饰
可以并入核酸(例如本文中所描述的RNA或mRNA)中的经修饰的核苷和核苷酸可以在核糖核酸的糖上被修饰。举例来说，2'羟基(OH)可以经许多不同的“氧基”或“脱氧基”取代基修饰或置换。2'位置上的示例性取代包括但不限于H、卤基、任选地经取代的C1-6烷基；任选地经取代的C1-6烷氧基；任选地经取代的C6-10芳氧基；任选地经取代的C3-8环烷基；任选地经取代的C3-8环烷氧基；任选地经取代的C6-10芳氧基；任选地经取代的C6-10芳基-C1-6烷氧基、任选地经取代的C1-12(杂环基)氧基；糖(例如核糖、戊糖或本文中所描述的任何糖)；聚乙二醇(PEG)、-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，其中R是H或任选地经取代的烷基，且n为整数0到20(例如0到4、0到8、0到10、0到16、1到4、1到8、1到10、1到16、1到20、2到4、2到8、2到10、2到16、2到20、4到8、4到10、4到16和4到20)；“锁”核酸(LNA)，其中2'-羟基由C1-6亚烷基或C1-6杂亚烷基桥连接到同一核糖的4'-碳，其中示例性桥包括亚甲基、亚丙基、醚或氨基桥；如本文中所定义的氨基烷基；如本文中所定义的氨基烷氧基；如本文中所定义的氨基；和如本文中所定义的氨基酸。
一般来说，RNA包括糖基核糖，它是具有氧的5元环。示例性非限制性的经修饰的核苷酸包括置换核糖中的氧(例如用S、Se或亚烷基，如亚甲基或亚乙基置换)；加入双键(例如用环戊烯基或环己烯基置换核糖)；核糖的缩环(例如形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的扩环(例如形成具有额外的碳或杂原子的6或7元环，如还具有氨基磷酸酯骨架的失水己糖醇、阿卓糖醇、甘露醇、环己烷基、环己烯基和吗啉基)；多环形式(例如三环；和“解锁”形式，如二醇核酸(GNA)(例如R-GNA或S-GNA，其中核糖被连接到磷酸二酯键的二醇单元置换)、苏糖核酸(TNA，其中核糖经α-L-呋喃苏阿糖基-(3'→2')置换)、和肽核酸(PNA，其中2-氨基-乙基-甘氨酸键置换核糖和磷酸二酯骨架)。糖基还可以含有一个或多个立体化学构型与核糖中的相应碳的立体化学构型相反的碳。因而，经修饰的核酸分子或mmRNA可以包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。
磷酸酯骨架上的修饰
可以如本文中所描述并入到核酸(例如，RNA或mRNA)中的经修饰核苷和核苷酸可以在磷酸酯骨架上被修饰。可以通过用不同的取代基置换一个或多个氧原子来修饰所述骨架的磷酸酯基。此外，经修饰的核苷和核苷酸可以包括用如本文中所描述的经修饰的磷酸酯全面置换未经修饰的磷酸酯部分。经修饰的磷酸基的实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸盐、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、膦酸烷基或芳基酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非键联氧都被硫置换。磷酸酯连接子还可以通过用氮(桥连氨基磷酸酯)、硫(桥连硫代磷酸酯)和碳(桥连亚甲基膦酸酯)置换键联氧而被修饰。
核碱基上的修饰
本公开提供了经修饰的核苷和核苷酸。如本文中所描述，“核苷”被定义为含有五碳糖分子(戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱嘌呤或嘧啶或其衍生物的化合物。如本文中所描述，“核苷酸”被定义为由磷酸酯基组成的核苷。经修饰的核苷酸(例如经修饰的mRNA)可以通过如本文中所描述的任何可用的方法合成(例如用化学、酶学或重组方式合成，以包括一个或多个经修饰或非天然的核苷)。
经修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且涵盖核苷酸和/或包含非标准或经修饰碱基的经修饰的核苷酸之间所形成的碱基对，其中氢键供体和氢键受体的配置允许非标准碱基与标准碱基之间或两个互补非标准碱基结构之间发生氢键键结。所述非标准碱基配对的一个实例是经修饰的核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。
可以如本文中所描述并入到核酸(例如RNA或mRNA)中的经修饰的核苷和核苷酸可以在核碱基上被修饰。RNA中所发现的核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。DNA中所发现的核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。这些核碱基可以被修饰或被完全置换以通过破环大沟结合伴侣的结合而提供具有增强的性质(例如对核酸酶的抗性)的核酸。
以下表1标示了各典型核苷酸的化学面。圆圈标示了构成对应化学区的原子。
表1
在一些实施方案中，B是经修饰的尿嘧啶。示例性经修饰的尿嘧啶包括具有式(b1)-(b5)的尿嘧啶：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
是单键或双键；
T1'、T1"、T2'和T2"各自独立地为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基或任选地经取代的硫代烷氧基，或T1'与T1"的组合或T2'与T2"的组合连接在一起(例如呈T2)以形成O(氧代)、S(硫代)或Se(硒代)；
V1和V2各自独立地为O、S、N(RVb)nv或C(RVb)nv，其中nv是整数0到2，且各RVb独立地为H、卤基、任选地经取代的氨基酸、任选地经取代的烷基、任选地经取代的卤烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的羟基烷基、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的羟基炔基、任选地经取代的氨基烷基(例如经N保护基取代，如本文中所描述的任何N保护基，例如三氟乙酰基)、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基、任选地经取代的酰基氨基烷基(例如经N保护基取代，如本文中所描述的任何N保护基，例如三氟乙酰基)、任选地经取代的烷氧基羰基烷基、任选地经取代的烷氧基羰基烯基、任选地经取代的烷氧基羰基炔基或任选地经取代的烷氧基羰基烷氧基(例如任选地经本文中所描述的任何取代基取代，如选自(1)-(21)的针对烷基的取代基)；
R10是H、卤基、任选地经取代的氨基酸、羟基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的羟基烷基、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的羟基炔基、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烷氧基羰基烷基、任选地经取代的烷氧基羰基烯基、任选地经取代的烷氧基羰基炔基、任选地经取代的烷氧基羰基烷氧基、任选地经取代的羧基烷氧基、任选地经取代的羧基烷基或任选地经取代的氨基甲酰烷基；
R11是H或任选地经取代的烷基；
R12a是H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的羟基烷基、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的羟基炔基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基或任选地经取代的氨基炔基、任选地经取代的羧基烷基(例如任选地经羟基取代)、任选地经取代的羧基烷氧基、任选地经取代的羧基氨基烷基或任选地经取代的氨基甲酰烷基；且
R12c是H、卤基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的硫代烷氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的羟基烷基、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的羟基炔基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基或任选地经取代的氨基炔基。
其它示例性经修饰的尿嘧啶包括具有式(b6)-(b9)的尿嘧啶：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
是单键或双键；
T1'、T1"、T2'和T2"各自独立地为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基或任选地经取代的硫代烷氧基，或T1'与T1"的组合连接在一起(例如呈T1)或T2'与T2"的组合连接在一起(例如呈T2)以形成O(氧代)、S(硫代)或Se(硒代)，或T1和T2各自独立地为O(氧代)、S(硫代)或Se(硒代)；
W1和W2各自独立地为N(RWa)nw或C(RWa)nw，其中nw是整数0到2，且各RWa独立地为H、任选地经取代的烷基或任选地经取代的烷氧基；
各V3独立地为O、S、N(RVa)nv或C(RVa)nv，其中nv为整数0到2，且各RVa独立地为H、卤基、任选地经取代的氨基酸、任选地经取代的烷基、任选地经取代的羟基烷基、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的羟基炔基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的烷杂环基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基或任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷基(例如经N保护基取代，如本文中所描述的任何N保护基，例如三氟乙酰基或磺烷基)、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基、任选地经取代的酰基氨基烷基(例如经N保护基取代，如本文中所描述的任何N保护基，例如三氟乙酰基)、任选地经取代的烷氧基羰基烷基、任选地经取代的烷氧基羰基烯基、任选地经取代的烷氧基羰基炔基、任选地经取代的烷氧基羰基酰基、任选地经取代的烷氧基羰基烷氧基、任选地经取代的羧基烷基(例如任选地经羟基和/或O-保护基取代)、任选地经取代的羧基烷氧基、任选地经取代的羧基氨基烷基或任选地经取代的氨基甲酰烷基(例如任选地经本文中所描述的任何取代基取代，如选自(1)-(21)的针对烷基的取代基)，且其中RVa和R12c可以与其所连接的碳原子一起形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的芳基或任选地经取代的杂环基(例如5或6元环)；
R12a是H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的羟基烷基、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的羟基炔基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基、任选地经取代的羧基烷基(例如任选地经羟基和/或O-保护基取代)、任选地经取代的羧基烷氧基、任选地经取代的羧基氨基烷基、任选地经取代的氨基甲酰烷基或不存在；
R12b是H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的羟基烷基、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的羟基炔基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基、任选地经取代的烷芳基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的烷杂环基、任选地经取代的氨基酸、任选地经取代的烷氧基羰基酰基、任选地经取代的烷氧基羰基烷氧基、任选地经取代的烷氧基羰基烷基、任选地经取代的烷氧基羰基烯基、任选地经取代的烷氧基羰基炔基、任选地经取代的烷氧基羰基烷氧基、任选地经取代的羧基烷基(例如任选地经羟基和/或O-保护基取代)、任选地经取代的羧基烷氧基、任选地经取代的羧基氨基烷基或任选地经取代的氨基甲酰烷基，
其中R12b与T1'的组合或R12b与R12c的组合可以一起形成任选地经取代的杂环基；且
R12c是H、卤基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的硫代烷氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基或任选地经取代的氨基炔基。
其它示例性经修饰的尿嘧啶包括具有式(b28)-(b31)的尿嘧啶：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
T1和T2各自独立地为O(氧代)、S(硫代)或Se(硒代)；
RVb'和RVb"各自独立地为H、卤基、任选地经取代的氨基酸、任选地经取代的烷基、任选地经取代的卤烷基、任选地经取代的羟基烷基、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的羟基炔基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷基(例如经N保护基取代，如本文中所描述的任何N保护基，例如三氟乙酰基或磺烷基)、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基、任选地经取代的酰基氨基烷基(例如经N保护基取代，如本文中所描述的任何N保护基，例如三氟乙酰基)、任选地经取代的烷氧基羰基烷基、任选地经取代的烷氧基羰基烯基、任选地经取代的烷氧基羰基炔基、任选地经取代的烷氧基羰基酰基、任选地经取代的烷氧基羰基烷氧基、任选地经取代的羧基烷基(例如任选地经羟基和/或O-保护基取代)、任选地经取代的羧基烷氧基、任选地经取代的羧基氨基烷基或任选地经取代的氨基甲酰烷基(例如任选地经本文中所描述的任何取代基取代，如选自(1)-(21)的针对烷基的取代基)(例如RVb'是任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的氨基烷基，例如经N保护基取代，如本文中所描述的任何N保护基，例如三氟乙酰基或磺烷基)；
R12a是H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的羧基氨基烷基、任选地经取代的氨基烷基(例如经N保护基取代，如本文中所描述的任何N保护基，例如三氟乙酰基或磺烷基)、任选地经取代的氨基烯基或任选地经取代的氨基炔基；且
R12b是H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的羟基烷基、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的羟基炔基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基(例如经N保护基取代，如本文中所描述的任何N保护基，例如三氟乙酰基或磺烷基)、
任选地经取代的烷氧基羰基酰基、任选地经取代的烷氧基羰基烷氧基、任选地经取代的烷氧基羰基烷基、任选地经取代的烷氧基羰基烯基、任选地经取代的烷氧基羰基炔基、任选地经取代的烷氧基羰基烷氧基、任选地经取代的羧基烷氧基、任选地经取代的羧基烷基或任选地经取代的氨基甲酰烷基。
在特定的实施方案中，T1是O(氧代)，且T2是S(硫代)或Se(硒代)。在其它实施方案中，T1是S(硫代)，且T2是O(氧代)或Se(硒代)。在一些实施方案中，RVb'是H、任选地经取代的烷基或任选地经取代的烷氧基。
在其它实施方案中，R12a和R12b各自独立地为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基或任选地经取代的羟基烷基。在特定的实施方案中，R12a是H。在其它实施方案中，R12a和R12b都是H。
在一些实施方案中，R12b的各RVb'独立地为任选地经取代的氨基烷基(例如经N保护基取代，如本文中所描述的任何N保护基，例如三氟乙酰基或磺烷基)、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基或任选地经取代的酰基氨基烷基(例如经N保护基取代，如本文中所描述的任何N保护基，例如三氟乙酰基)。在一些实施方案中，任选地经取代的氨基烷基的氨基和/或烷基经以下中的一项或多项取代：任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的磺烷基、任选地经取代的羧基(例如经O-保护基取代)、任选地经取代的羟基(例如经O-保护基取代)、任选地经取代的羧基烷基(例如经O-保护基取代)、任选地经取代的烷氧基羰基烷基(例如经O-保护基取代)或N-保护基。在一些实施方案中，任选地经取代的氨基烷基经任选地经取代的磺烷基或任选地经取代的烯基取代。在特定的实施方案中，R12a和RVb"都是H。在特定的实施方案中，T1是O(氧代)，且T2是S(硫代)或Se(硒代)。
在一些实施方案中，RVb'是任选地经取代的烷氧基羰基烷基或任选地经取代的氨基甲酰烷基。
在特定的实施方案中，R12a、R12b、R12c或RVa的任选的取代基是聚乙二醇基(例如-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'是H或C1-20烷基)；或氨基-聚乙二醇基(例如-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且各RN1独立地为氢或任选地经取代的C1-6烷基)。
在一些实施方案中，B是经修饰的胞嘧啶。示例性经修饰的胞嘧啶包括化合物(b10)-(b14)：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
T3'和T3"各自独立地为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基或任选地经取代的硫代烷氧基，或T3'与T3"的组合连接在一起(例如呈T3)以形成O(氧代)、S(硫代)或Se(硒代)；
各V4独立地为O、S、N(RVc)nv或C(RVc)nv，其中nv为整数0到2，且各RVc独立地为H、卤基、任选地经取代的氨基酸、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的烷杂环基或任选地经取代的炔基氧基(例如任选地经本文中所描述的任何取代基取代，如选自(1)-(21)的针对烷基的取代基)，其中R13b与RVc的组合可以一起形成任选地经取代的杂环基；
各V5独立地为N(RVd)nv或C(RVd)nv，其中nv是整数0到2，且各RVd独立地为H、卤基、任选地经取代的氨基酸、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的烷杂环基或任选地经取代的炔基氧基(例如任选地经本文中所描述的任何取代基取代，如选自(1)-(21)的针对烷基的取代基)(例如V5是-CH或N)；
R13a和R13b各自独立地为H、任选地经取代的酰基、任选地经取代的酰基氧基烷基、任选地经取代的烷基或任选地经取代的烷氧基，其中R13b与R14的组合可以一起形成任选地经取代的杂环基；
各R14独立地为H、卤基、羟基、硫醇基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氨基酸、任选地经取代的烷基、任选地经取代的卤烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的羟基烷基(例如经O-保护基取代)、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的羟基炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基、任选地经取代的酰基氧基烷基、任选地经取代的氨基(例如-NHR，其中R是H、烷基、芳基或磷酰基)、叠氮基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的烷杂环基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基或任选地经取代的氨基烷基；且
R15和R16各自独立地为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基。
其它示例性经修饰的胞嘧啶包括具有式(b32)-(b35)的化合物：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
T1和T3各自独立地为O(氧代)、S(硫代)或Se(硒代)；
R13a和R13b各自独立地为H、任选地经取代的酰基、任选地经取代的酰基氧基烷基、任选地经取代的烷基或任选地经取代的烷氧基，其中R13b与R14的组合可以一起形成任选地经取代的杂环基；
各R14独立地为H、卤基、羟基、硫醇基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氨基酸、任选地经取代的烷基、任选地经取代的卤烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的羟基烷基(例如经O-保护基取代)、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的羟基炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基、任选地经取代的酰基氧基烷基、任选地经取代的氨基(例如-NHR，其中R是H、烷基、芳基或磷酰基)、叠氮基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的烷杂环基、任选地经取代的氨基烷基(例如羟基烷基、烷基、烯基或炔基)、任选地经取代的氨基烯基或任选地经取代的氨基炔基；且
R15和R16各自独立地为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基(例如R15是H，且R16是H或任选地经取代的烷基)。
在一些实施方案中，R15是H，且R16是H或任选地经取代的烷基。在特定的实施方案中，R14是H、酰基或羟基烷基。在一些实施方案中，R14是卤基。在一些实施方案中，R14与R15都是H。在一些实施方案中，R15与R16都是H。在一些实施方案中，R14和R15和R16各自为H。在其它实施方案中，R13a和R13b各自独立地为H或任选地经取代的烷基。
经修饰的胞嘧啶的其它非限制性实例包括具有式(b36)的化合物：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
各R13b独立地为H、任选地经取代的酰基、任选地经取代的酰基氧基烷基、任选地经取代的烷基或任选地经取代的烷氧基，其中R13b与R14b的组合可以一起形成任选地经取代的杂环基；
R14a和R14b各自独立地为H、卤基、羟基、硫醇基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氨基酸、任选地经取代的烷基、任选地经取代的卤烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的羟基烷基(例如经O-保护基取代)、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的氨基烷氧基、任选地经取代的烷氧基烷氧基、任选地经取代的酰基氧基烷基、任选地经取代的氨基(例如-NHR，其中R是H、烷基、芳基、磷酰基、任选地经取代的氨基烷基或任选地经取代的羧基氨基烷基)、叠氮基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的烷杂环基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基或任选地经取代的氨基炔基；且
各R15独立地为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基。
在特定的实施方案中，R14b是任选地经取代的氨基酸(例如任选地经取代的赖氨酸)。在一些实施方案中，R14a是H。
在一些实施方案中，B是经修饰的鸟嘌呤。示例性经修饰的鸟嘌呤包括具有式(b15)-(b17)的化合物：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
T4'、T4"、T5'、T5"、T6'和T6"各自独立地为H、任选地经取代的烷基或任选地经取代的烷氧基，且其中T4'与T4"的组合(例如呈T4)或T5'与T5"的组合(例如呈T5)或T6'与T6"的组合连接在一起(例如呈T6)，形成O(氧代)、S(硫代)或Se(硒代)；
V5和V6各自独立地为O、S、N(RVd)nv或C(RVd)nv，其中nv为整数0到2，且各RVd独立地为H、卤基、硫醇基、任选地经取代的氨基酸、氰基、脒基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔基氧基(例如任选地经本文中所描述的任何取代基取代，如选自(1)-(21)的针对烷基的取代基)、任选地经取代的硫代烷氧基或任选地经取代的氨基；且
R17、R18、R19a、R19b、R21、R22、R23和R24各自独立地为H、卤基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的硫代烷氧基、任选地经取代的氨基或任选地经取代的氨基酸。
示例性经修饰的鸟苷包括具有式(b37)-(b40)的化合物：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
各T4'独立地为H、任选地经取代的烷基或任选地经取代的烷氧基，且各T4独立地为O(氧代)、S(硫代)或Se(硒代)；
R18、R19a、R19b和R21各自独立地为H、卤基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的硫代烷氧基、任选地经取代的氨基或任选地经取代的氨基酸。
在一些实施方案中，R18为H或任选地经取代的烷基。在其它实施方案中，T4是氧代基。在一些实施方案中，R19a和R19b各自独立地为H或任选地经取代的烷基。
在一些实施方案中，B是经修饰的腺嘌呤。示例性经修饰的腺嘌呤包括具有式(b18)-(b20)的化合物：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
各V7独立地为O、S、N(RVe)nv或C(RVe)nv，其中nv为整数0到2，且各RVe独立地为H、卤基、任选地经取代的氨基酸、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基或任选地经取代的炔基氧基(例如任选地经本文中所描述的任何取代基取代，如选自(1)-(21)的针对烷基的取代基)；
各R25独立地为H、卤基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的硫代烷氧基或任选地经取代的氨基；
R26a和R26b各自独立地为H、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氨基酸、任选地经取代的氨基甲酰烷基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的羟基烷基、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的羟基炔基、任选地经取代的烷氧基或聚乙二醇基(例如-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基)；或氨基-聚乙二醇基(例如-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且各RN1独立地为氢或任选地经取代的C1-6烷基)；
各R27独立地为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的硫代烷氧基或任选地经取代的氨基；
各R28独立地为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基；且
各R29独立地为H、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氨基酸、任选地经取代的氨基甲酰烷基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的羟基烷基、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的烷氧基或任选地经取代的氨基。
示例性经修饰的腺嘌呤包括具有式(b41)-(b43)的化合物：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中
各R25独立地为H、卤基、硫醇基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的硫代烷氧基或任选地经取代的氨基；
R26a和R26b各自独立地为H、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氨基酸、任选地经取代的氨基甲酰烷基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的羟基烷基、任选地经取代的羟基烯基、任选地经取代的羟基炔基、任选地经取代的烷氧基或聚乙二醇基(例如-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基)；或氨基-聚乙二醇基(例如-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且各RN1独立地为氢或任选地经取代的C1-6烷基)；且
各R27独立地为H、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的硫代烷氧基或任选地经取代的氨基。
在一些实施方案中，R26a是H，且R26b是任选地经取代的烷基。在一些实施方案中，R26a和R26b各自独立地为任选地经取代的烷基。在特定的实施方案中，R27是任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基或任选地经取代的硫代烷氧基。在其它实施方案中，R25是任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基或任选地经取代的硫代烷氧基。
在特定的实施方案中，R26a、R26b或R29的任选取代基是聚乙二醇基(例如-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基)；或氨基-聚乙二醇基(例如-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且各RN1独立地为氢或任选地经取代的C1-6烷基)。
在一些实施方案中，B可以具有式(b21)：
其中X12独立地为O、S、任选地经取代的亚烷基(例如亚甲基)或任选地经取代的杂亚烷基，xa为整数0到3，且R12a和T2如本文中所描述。
在一些实施方案中，B可以具有式(b22)：
其中R10'独立地为任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烷氧基羰基烷基、任选地经取代的烷氧基羰基烯基、任选地经取代的烷氧基羰基炔基、任选地经取代的烷氧基羰基烷氧基、任选地经取代的羧基烷氧基、任选地经取代的羧基烷基或任选地经取代的氨基甲酰烷基，且R11、R12a、T1和T2如本文中所描述。
在一些实施方案中，B可以具有式(b23)：
其中R10为任选地经取代的杂环基(例如任选地经取代的呋喃基、任选地经取代的噻吩基或任选地经取代的吡咯基)、任选地经取代的芳基(例如任选地经取代的苯基或任选地经取代的萘基)或本文中(例如针对R10)所描述的任何取代基；且其中R11(例如H或本文中所描述的任何取代基)、R12a(例如H或本文中所描述的任何取代基)、T1(例如氧代基或本文中所描述的任何取代基)和T2(例如氧代基或本文中所描述的任何取代基)如本文中所描述。
在一些实施方案中，B可以具有式(b24)：
其中R14'独立地为任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的烷芳基、任选地经取代的烷杂环基、任选地经取代的氨基烷基、任选地经取代的氨基烯基、任选地经取代的氨基炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烷氧基羰基烷基、任选地经取代的烷氧基羰基烯基、任选地经取代的烷氧基羰基炔基、任选地经取代的烷氧基羰基烷氧基、任选地经取代的羧基烷氧基、任选地经取代的羧基烷基或任选地经取代的氨基甲酰烷基，且R13a、R13b、R15和T3如本文中所描述。
在一些实施方案中，B可以具有式(b25)：
其中R14'为任选地经取代的杂环基(例如任选地经取代的呋喃基、任选地经取代的噻吩基或任选地经取代的吡咯基)、任选地经取代的芳基(例如任选地经取代的苯基或任选地经取代的萘基)或本文中(例如针对R14或R14')所描述的任何取代基；且其中R13a(例如H或本文中所描述的任何取代基)、R13b(例如H或本文中所描述的任何取代基)、R15(例如H或本文中所描述的任何取代基)和T3(例如氧代基或本文中所描述的任何取代基)如本文中所描述。
在一些实施方案中，B是选自胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶的核碱基。在一些实施方案中，B可以是：
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的尿嘧啶。具有经修饰的尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤基-尿苷(例如5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧基乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧基乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨基甲酰甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，即，具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2'-O-甲基-尿苷(Um)、5,2'-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2'-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2'-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨基甲酰甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2'-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2'-F-阿糖-尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的胞嘧啶。具有经修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲酰基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤基-胞苷(例如5-碘-胞苷)、5-羟基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、扎布拉林、5-氮杂-扎布拉林、5-甲基-扎布拉林、5-氮杂-2-硫代-扎布拉林、2-硫代-扎布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖西丁(lysidine)(k2C)、α-硫代-胞苷、2'-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2'-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2'-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2'-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2'-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2'-O-三甲基-胞苷(m4 2Cm)、1-硫代-胞苷、2'-F-阿糖-胞苷、2'-F-胞苷和2'-OH-阿糖-胞苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的腺嘌呤。具有经修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤基-嘌呤(例如2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤基-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲基硫代-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲基硫代-N6-异戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘氨酰氨基甲酰-腺苷(g6A)、N6-苏氨酰氨基甲酰-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰-腺苷(m6t6A)、2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨基甲酰-腺苷(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m6 2A)、N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰-腺苷(hn6A)、2-甲基硫代-N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2'-O-甲基-腺苷(Am)、N6,2'-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2'-O-三甲基-腺苷(m6 2Am)、1,2'-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2'-F-阿糖-腺苷、2'-F-腺苷、2'-OH-阿糖-腺苷和N6-(19-氨基-五氧杂十九基)-腺苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OHyW)、修饰不足的羟基怀丁苷(OHyW*)、7-脱氮-鸟苷、辫苷(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露醇基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m1G)、N2-甲基-鸟苷(m2G)、N2,N2-二甲基-鸟苷(m2 2G)、N2,7-二甲基-鸟苷(m2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鸟苷(m2,2,7G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、α-硫代-鸟苷、2'-O-甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2 2Gm)、1-甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2,7Gm)、2'-O-甲基-肌苷(Im)、1,2'-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2'-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)(Gr(p))、1-硫代-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、2'-F-阿糖-鸟苷和2'-F-鸟苷。
核苷酸的核碱基可以独立地选自嘌呤、嘧啶、嘌呤或嘧啶类似物。举例来说，核碱基可以各自独立地选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或次黄嘌呤。在另一个实施方案中，核碱基还可以包括例如碱基的天然存在的和合成的衍生物，包括吡唑并[3,4-d]嘧啶、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤基(例如8-溴基)、8-氨基、8-硫醇基、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-经取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基(尤其是5-溴)、5-三氟甲基和其它5-经取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、脱氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、脱氮腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、吡唑并[3,4-d]嘧啶、咪唑并[1,5-a]1,3,5-三嗪酮、9-脱氮嘌呤、咪唑并[4,5-d]吡嗪、噻唑并[4,5-d]嘧啶、吡嗪-2-酮、1,2,4-三嗪、哒嗪和1,3,5-三嗪。尽管使用速记符号A、G、C、T或U描绘核苷酸，但各字母是指其代表性碱基和/或衍生物，例如A包括腺嘌呤或腺嘌呤类似物，例如7-脱氮腺嘌呤)。
核苷间键上的修饰
可以并入经修饰的核酸或mmRNA分子中的经修饰的核苷和核苷酸可以在核苷间键(例如磷酸酯骨架)上被修饰。可以通过用不同的取代基置换一个或多个氧原子来修饰所述骨架的磷酸酯基。此外，经修饰的核苷和核苷酸可以包括用如本文中所描述的经修饰的磷酸酯全面置换未经修饰的磷酸酯部分。经修饰的磷酸基的实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸盐、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、膦酸烷基或芳基酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非键联氧都被硫置换。磷酸酯连接子还可以通过用氮(桥连氨基磷酸酯)、硫(桥连硫代磷酸酯)和碳(桥连亚甲基膦酸酯)置换键联氧而被修饰。
提供经α-硫取代的磷酸酯部分以通过非天然硫代磷酸酯骨架键联而赋予RNA和DNA聚合物以稳定性。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增强的核酸酶抗性且随后在细胞环境中具有较长半衰期。还预期硫代磷酸酯连接的经修饰的核酸或mmRNA分子可通过细胞固有免疫分子的较弱结合/活化来减小固有免疫反应。
在具体的实施方案中，经修饰的核苷是5'-O-(1-硫代磷酸酯)-腺苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-胞苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-鸟苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-尿苷或5'-O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷
5'-O-(1-硫代磷酸酯)-腺苷
5'-O-(1-硫代磷酸酯)-胞苷
5'-O-(1-硫代磷酸酯)-鸟苷
5'-O-(1-硫代磷酸酯)-尿苷
5'-O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷
经修饰的糖、核碱基和核苷间键的组合
本发明的经修饰的核酸和mmRNA可以包括对糖、核碱基和/或核苷间键的修饰的组合。这些组合可以包括本文中所描述的任何一个或多个修饰。举例来说，本文中在式(Ia)、式(Ia-1)-(Ia-3)、式(Ib)-(If)、式(IIa)-(IIp)、式(IIb-1)、式(IIb-2)、式(IIc-1)-(IIc-2)、式(IIn-1)、式(IIn-2)、式(IVa)-(IVl)和式(IXa)-(IXr)中所描述的任何核苷酸可以与本文中所描述的任何核碱基(例如式(b1)-(b43)中所示者或本文中所描述的任何其它核碱基)组合。
经修饰的核酸和mmRNA分子的合成
根据本发明使用的经修饰的核酸可以根据任何可用的技术来制备，包括但不限于化学合成、酶促合成(一般称为体外转录)、较长前体的酶促或化学裂解等。合成RNA的方法在本领域中是已知的(参见例如Gait,M.J.(编)Oligonucleotide synthesis:a practicalapproach,Oxford[Oxfordshire],Washington,DC:IRL Press,1984；和Herdewijn,P.(编)Oligonucleotide synthesis:methods and applications,Methods in Molecular Biology,第288卷(Clifton,N.J.)Totowa,N.J.:Humana Press,2005；两个文献都以引用的方式并入本文中)。
本文中所公开的经修饰的核酸可以使用以下一般方法和程序，由容易获得的起始材料制备。应了解，除非另外阐述，否则在给出了典型的或优选的工艺条件(即，反应温度、时间、反应物摩尔比、溶剂、压力等)时，也可以使用其它工艺条件。最佳反应条件可能随所使用的特定反应物或溶剂而变化，但所述条件可由本领域技术人员利用常规优化程序来确定。
本文中所描述的工艺可以根据本领域中已知的任何合适的方法进行监测。举例来说，产物形成可以通过如核磁共振光谱法(例如1H或13C)、红外光谱法、分光光度法(例如UV-可见光)、质谱法等光谱手段，或通过如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法等色谱法进行监测。
经修饰的核苷和核苷酸的制备可能涉及各种化学基团的保护和脱保护。对保护和脱保护的需要以及适当保护基的选择可以由本领域技术人员容易地确定。保护基的化学性质可以在例如Greene等,Protective Groups in Organic Synthesis,第2版,Wiley&Sons,1991中获知，该文献以全文引用的方式并入本文中。
本文中所描述的工艺的反应可以在合适的溶剂中进行，所述溶剂可以由有机合成领域的技术人员容易地选择。合适的溶剂可以在进行反应的温度下，即，在可以介于所述溶剂的冻结温度到所述溶剂的沸腾温度范围内的温度下基本上不与起始材料(反应物)、中间物或产物反应。给定反应可以在一种溶剂或一种以上溶剂的混合物中进行。取决于特定反应步骤，可以选择适合特定反应步骤的溶剂。
经修饰的核苷和核苷酸的外消旋混合物的拆分可以利用本领域中已知的许多方法中的任一种来进行。一种实例方法包括使用“手性拆分酸”进行部分再结晶，所述手性拆分酸是光学活性成盐有机酸。适用于部分再结晶方法的拆分剂为例如光学活性酸，如酒石酸的D和L形式、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸或各种光学活性樟脑磺酸。外消旋混合物的拆分还可以通过在填充有光学活性拆分剂(例如二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)的柱上洗脱来进行。合适的洗脱溶剂组成可以由本领域技术人员确定。
经修饰的核酸可以根据以下文献中所描述的合成方法来制备：Ogata等,Journal ofOrganic Chemistry 74:2585-2588,2009；Purmal等,Nucleic Acids Research 22(1):72-78,1994；Fukuhara等,Biochemistry,1(4):563-568,1962；和Xu等,Tetrahedron,48(9):1729-1740,1992，各文献是以全文引用的方式并入。
经修饰的核酸不必沿所述分子的整个长度均匀地被修饰。经修饰的核酸分子不必沿所述分子的整个长度均匀地被修饰。核酸中不同的位置上可以存在不同的核酸修饰和/或骨架结构。本领域技术人员应了解，核苷酸类似物或其它修饰可以位于核酸中使得所述核酸的功能基本上不降低的任何位置上。修饰还可以是5'或3'末端修饰。所述核酸可以含有至少一个经修饰的核苷酸和最多100％经修饰的核苷酸，或任何介于其间的百分比，如至少5％经修饰的核苷酸、至少10％经修饰的核苷酸、至少25％经修饰的核苷酸、至少50％经修饰的核苷酸、至少80％经修饰的核苷酸或至少90％经修饰的核苷酸。举例来说，所述核酸可以含有经修饰的嘧啶，如尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，核酸中的至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶可以被经修饰的尿嘧啶置换。经修饰的尿嘧啶可以由具有单一独特结构的一种化合物置换，或可以由具有不同结构(例如2、3、4种或更多种独特结构)的多种化合物置换。在一些实施方案中，核酸中的至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶可以被经修饰的胞嘧啶置换。经修饰的胞嘧啶可以由具有单一独特结构的一种化合物置换，或可以由具有不同结构(例如2、3、4种或更多种独特结构)的多种化合物置换。
总体上，本公开的经修饰mRNA，即本文中的“mmRNA”的最短长度可以是可能足以编码二肽的mRNA序列的长度。在另一个实施方案中，mRNA序列的长度可能足以编码三肽。在另一个实施方案中，mRNA序列的长度可能足以编码四肽。在另一个实施方案中，mRNA序列的长度可能足以编码五肽。在另一个实施方案中，mRNA序列的长度可能足以编码六肽。在另一个实施方案中，mRNA序列的长度可能足以编码七肽。在另一个实施方案中，mRNA序列的长度可能足以编码八肽。在另一个实施方案中，mRNA序列的长度可能足以编码九肽。在另一个实施方案中，mRNA序列的长度可能足以编码十肽。
经修饰核酸分子序列可以编码的二肽的实例包括但不限于肌肽和鹅肌肽。
总体上，本发明的经修饰mRNA的长度多于30个核苷酸。在另一个实施方案中，所述RNA分子的长度多于35个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少40个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少45个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少55个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少60个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少60个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少80个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少90个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少100个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少120个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少140个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少160个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少180个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少200个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少250个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少300个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少350个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少400个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少450个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少500个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少600个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少700个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少800个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少900个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少1000个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少1100个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少1200个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少1300个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少1400个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少1500个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少1600个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少1800个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少2000个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少2500个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少3000个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少4000个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少5000个核苷酸或多于5000个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少5000个核苷酸或多于6000个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少7000个核苷酸或多于7000个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少8000个核苷酸或多于8000个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少9000个核苷酸或多于9000个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少10,000个核苷酸或多于10,000个核苷酸。
核酸中的不同位置上可以存在不同的核苷酸修饰和/或骨架结构。本领域技术人员应了解，核苷酸类似物或其它修饰可以位于核酸中使得所述核酸的功能基本上不降低的任何位置上。修饰还可以是5'或3'末端修饰。所述核酸可以含有至少一个经修饰的核苷酸和最多100％经修饰的核苷酸，或任何介于其间的百分比，如至少50％经修饰的核苷酸、至少80％经修饰的核苷酸或至少90％经修饰的核苷酸。举例来说，一种或多种或所有类型的核苷酸(例如嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任何一个或多个或所有)在本发明的聚核苷酸或其给定预定序列区域中可能均匀地或可能不均匀地被修饰。在一些实施方案中，本发明的聚核苷酸(或其给定序列区域)中的所有核苷酸X都经过修饰，其中X可以是核苷酸A、G、U、C中的任一者，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一者。
不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间键(例如骨架结构)可以存在于经修饰的核酸或mmRNA中的不同位置上。本领域技术人员应了解，核苷酸类似物或其它修饰可以位于经修饰的核酸或mmRNA中使得所述经修饰的核酸或mmRNA的功能基本上不降低的任何位置。修饰还可以是5'或3'末端修饰。经修饰的核酸或mmRNA可以含有约1％到约100％的经修饰的核苷酸，或任何介于其间的百分比(例如1％到20％、1％到25％、1％到50％、1％到60％、1％到70％、1％到80％、1％到90％、1％到95％、10％到20％、10％到25％、10％到50％、10％到60％、10％到70％、10％到80％、10％到90％、10％到95％、10％到100％、20％到25％、20％到50％、20％到60％、20％到70％、20％到80％、20％到90％、20％到95％、20％到100％、50％到60％、50％到70％、50％到80％、50％到90％、50％到95％、50％到100％、70％到80％、70％到90％、70％到95％、70％到100％、80％到90％、80％到95％、80％到100％、90％到95％、90％到100％和95％到100％)。
在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括经修饰的嘧啶(例如经修饰的尿嘧啶/尿苷或经修饰的胞嘧啶/胞苷)。在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA分子中的尿嘧啶或尿苷可以经约1％到约100％的经修饰的尿嘧啶或经修饰的尿苷(例如1％到20％、1％到25％、1％到50％、1％到60％、1％到70％、1％到80％、1％到90％、1％到95％、10％到20％、10％到25％、10％到50％、10％到60％、10％到70％、10％到80％、10％到90％、10％到95％、10％到100％、20％到25％、20％到50％、20％到60％、20％到70％、20％到80％、20％到90％、20％到95％、20％到100％、50％到60％、50％到70％、50％到80％、50％到90％、50％到95％、50％到100％、70％到80％、70％到90％、70％到95％、70％到100％、80％到90％、80％到95％、80％到100％、90％到95％、90％到100％和95％到100％的经修饰的尿嘧啶或经修饰的尿苷)置换。经修饰的尿嘧啶或尿苷可以由具有单一独特结构的一种化合物置换，或可以由具有不同结构(例如2、3、4种或更多种如本文中所描述的独特结构)的多种化合物置换。在一些实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA分子中的胞嘧啶或胞苷可以经约1％到约100％的经修饰的胞嘧啶或经修饰的胞苷(例如1％到20％、1％到25％、1％到50％、1％到60％、1％到70％、1％到80％、1％到90％、1％到95％、10％到20％、10％到25％、10％到50％、10％到60％、10％到70％、10％到80％、10％到90％、10％到95％、10％到100％、20％到25％、20％到50％、20％到60％、20％到70％、20％到80％、20％到90％、20％到95％、20％到100％、50％到60％、50％到70％、50％到80％、50％到90％、50％到95％、50％到100％、70％到80％、70％到90％、70％到95％、70％到100％、80％到90％、80％到95％、80％到100％、90％到95％、90％到100％和95％到100％的经修饰的胞嘧啶或经修饰的胞苷)置换。经修饰的胞嘧啶或胞苷可以由具有单一独特结构的一种化合物或由具有不同结构(例如2、3、4种或更多种如本文中所描述的独特结构)的多种化合物置换。
在一些实施方案中，本公开提供了合成包括n个具有式(Ia-1)的连接核苷的经修饰的核酸或mmRNA的方法：
所述方法包括：
a)使具有式(IV-1)的核苷酸：
与具有式(V-1)的亚磷酰胺化合物反应：
其中Y9是H、羟基、磷酰基、焦磷酸酯基、硫酸酯基、氨基、硫醇基、任选地经取代的氨基酸或肽(例如包括2到12个氨基酸)；且P1、P2和P3各自独立地为合适的保护基；且表示固体载体；
以获得具有式(VI-1)的经修饰核酸或mmRNA：
以及
b)氧化或硫化具有式(V)的经修饰核酸或mmRNA，以产生具有式(VII-1)的经修饰核酸或mmRNA：
以及
c)去除保护基以产生具有式(Ia)的经修饰核酸或mmRNA。
在一些实施方案中，将步骤a)和b)重复1到约10,000次。在一些实施方案中，所述方法还包括选自腺苷、胞嘧啶、鸟苷和尿嘧啶的核苷酸(例如构筑块分子)。在一些实施方案中，所述核碱基可以是嘧啶或其衍生物。在一些实施方案中，所述经修饰的核酸或mmRNA是可翻译的。
在一些实施方案中，经修饰的核酸和mmRNA的其它组分是任选的，并且是有益的。举例来说，提供5'未翻译区(UTR)和/或3'UTR，其中任一者或两者可以独立地含有一个或多个不同的核苷修饰。在所述实施方案中，核苷修饰还可以存在于所述可翻译区中。还提供了含有Kozak序列的经修饰核酸和mmRNA。
另外，提供了含有一个或多个内含子核苷酸序列的核酸，所述内含子核苷酸序列能够从所述核酸中切除。
以下流程1到流程11中提供了并入经修饰的核酸或mmRNA(例如RNA或mRNA)中的经修饰核苷酸的示例性合成。流程1提供了用于对核苷(包括经修饰的核苷)进行磷酸化的一般方法。
流程1
可以使用各种保护基来控制反应。举例来说，流程2提供了使用多个保护和脱保护步骤来促进糖的5'位置而非2'和3'羟基的磷酸化。
流程2
经修饰的核苷酸可以用任何可用的方式来合成。流程3、4和7提供了合成具有经修饰的嘌呤核碱基的经修饰核苷酸的示例性方法；且流程5和6分别提供了合成具有经修饰的假尿苷或假异胞苷的经修饰核苷酸的示例性方法。
流程3
流程5
流程6
流程7
流程8和9提供了经修饰的核苷酸的示例性合成。流程10提供了用于产生核苷酸的非限制性生物催化法。
流程8
流程9
流程10
流程11提供了经修饰的尿嘧啶的示例性合成，其中N1位置经如其它地方所提供的R12b修饰，且核糖的5'位置被磷酸化。T1、T2、R12a、R12b和r如本文中所提供。这种合成以及其优化型式可以用于修饰其它嘧啶核碱基和嘌呤核碱基(参见例如式(b1)-(b43))和/或用于安置一个或多个磷酸基(例如在糖的5'位置)。这种烷基化反应还可以用于在本文中所描述的任何核碱基中的任何反应性基团(例如氨基)(例如胞嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的Watson-Crick碱基配对面中的氨基)上包括一个或多个任选地经取代的烷基。
流程11
mmRNA中的核苷酸的组合
以下表2中提供了经修饰的核苷酸和经修饰的核苷酸组合的其它实例。经修饰的核苷酸的这些组合可以用于形成本发明的经修饰的核酸或mmRNA。除非另外说明，否则经修饰的核苷酸可以完全取代本发明的经修饰核酸或mmRNA的天然核苷酸。作为一个非限制性实例，可以用本文中所描述的经修饰核苷取代天然核苷酸尿苷。在另一个非限制性实例中，可以用本文中所公开的经修饰的核苷中的至少一种部分地取代(例如约0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99.9％)天然核苷酸尿苷。
表2
以下表3中提供了经修饰的核苷酸组合的其它实例。经修饰的核苷酸的这些组合可以用于形成本发明的经修饰的核酸分子或mmRNA。
表3
在一些实施方案中，至少25％的胞嘧啶被具有式(b10)-(b14)的化合物置换(例如至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％被置换)。
在一些实施方案中，至少25％的尿嘧啶被具有式(b1)-(b9)的化合物置换(例如至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％被置换)。
在一些实施方案中，至少25％的胞嘧啶被具有式(b10)-(b14)的化合物置换且至少25％的尿嘧啶被具有式(b1)-(b9)的化合物置换(例如至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％被置换)。
末端架构修饰：5'-加帽
5'-帽结构通过帽结合蛋白(CBP)与poly(A)结合蛋白缔合以形成成熟环状mRNA物质而负责结合mRNA CBP，所述mRNA CBP负责细胞中的mRNA稳定性和翻译胜任能力。所述帽还有助于去除5'近端内含子，所述5'近端内含子是在mRNA剪接期间去除。
内源性信使RNA(mRNA)分子可以在成熟mRNA分子5'端上含有5'帽结构。5'帽含有介于5'-最末端的核苷酸与鸟嘌呤核苷酸之间的5'-5'三磷酸酯键。缀合的鸟嘌呤核苷酸可以被甲基化以产生N7-甲基-鸟苷酸残基。mRNA的5'端的末端和/或前端转录的核苷酸的核糖还可以任选地被2'-O-甲基化。通过鸟苷酸帽结构的水解和裂解进行的5'脱帽可以靶向核酸分子(如mRNA分子)以便降解。
对本发明的经修饰mRNA的修饰可以产生不可水解的帽结构，从而防止脱帽且因而增加mRNA半衰期。因为帽结构水解需要使5'-ppp-5'磷酸二酯键裂解，所以在加帽反应期间可以使用经修饰的核苷酸。举例来说，得自于New England Biolabs(Ipswich，MA)的牛痘病毒加帽酶可以根据制造商说明书与α-硫代-鸟苷核苷酸一起使用，以便在5'-ppp-5'帽中建立硫代磷酸酯键。可以使用其它经修饰的鸟苷核苷酸，如α-甲基-膦酸和硒代磷酸核苷酸。
其它修饰包括但不限于在糖环的2'-羟基上对mRNA的5'末端和/或5'前端核苷酸的核糖进行2'-O-甲基化(如上文所述)。可以使用多个独特的5'帽结构来产生合成mRNA分子的5'帽。
帽类似物，在本文中也称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物或者结构或功能帽类似物，在其化学结构上不同于天然(即，内源性、野生型或生理性)5'帽，不过保留了帽功能。帽类似物可以用化学方式(即，非酶方式)或酶方式合成，和/或连接到核酸分子。许多化学帽类似物被用于对合成mRNA分子进行共转录加帽。
举例来说，抗-反向帽类似物(ARCA)帽含有5'-5'-三磷酸酯鸟嘌呤-鸟嘌呤键，其中一个鸟嘌呤含有N7甲基以及3'-O-甲基(即，N7,3'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸酯-5'-鸟苷(m7G-3'mppp-G)；其可以等效地称为3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G)。另一个未经修饰的鸟嘌呤的3'-O原子连接到经加帽的核酸分子(例如mRNA或mmRNA)的5'末端核苷酸。N7-甲基化和3'-O-甲基化鸟嘌呤提供了经加帽的核酸分子(例如mRNA或mmRNA)的末端部分。
另一个示例性帽为mCAP，其类似于ARCA但在鸟苷上具有2'-O-甲基(即，N7,2'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸酯-5'-鸟苷，m7Gm-ppp-G)。
尽管帽类似物允许核酸分子在体外转录反应中的伴随性加帽，但多达20％的转录物可能仍然未被加帽。此现象以及帽类似物与由内源性细胞转录机制产生的核酸内源性5'帽结构的结构差异可能导致翻译能力下降和细胞稳定性下降。
本发明的经修饰的mRNA还可以在转录后使用酶进行加帽，以便产生更逼真的5'帽结构。如本文中所使用，短语“更逼真的”是指某一特征在结构上或功能上很能反映或模拟内源性或野生型特征。也就是说，与现有技术的合成特征或类似物等相比，“更逼真的”特征更好地代表了内源性、野生型、天然的或生理的细胞功能和/或结构，或在一个或多个方面的性能优于相应的内源性、野生型、天然的或生理的特征。本发明的更逼真的5'帽结构的非限制性实例为与本领域中已知的合成5'帽结构(或野生型、天然的或生理的5'帽结构)相比尤其具有增强的帽结合蛋白结合、增加的半衰期、降低的5'核酸内切酶敏感性和/或减少的5'脱帽现象的5'帽结构。举例来说，重组牛痘病毒加帽酶和重组2'-O-甲基转移酶可以在mRNA的5'末端核苷酸与鸟嘌呤帽核苷酸之间建立典型的5'-5'-三磷酸酯键，其中所述帽鸟嘌呤含有N7甲基化且所述mRNA的5'末端核苷酸含有2'-O-甲基。所述结构称为Cap1结构这种帽产生较高翻译能力和细胞稳定性且减少细胞促炎性细胞因子的活化，例如与本领域中已知的其它5'帽类似物结构相比。帽结构包括但不限于7mG(5')ppp(5')N,pN2p(cap 0)、7mG(5')ppp(5')NlmpNp(cap 1)和7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp(cap 2)。
因为经修饰的mRNA可以在转录后被加帽，且因为这个过程更有效，所以可以将几乎100％的经修饰mRNA加帽。这与当帽类似物在体外转录反应过程中连接到mRNA时的约80％形成对照。
根据本发明，5'末端帽可以包括内源性帽或帽类似物。根据本发明，5'末端帽可以包含鸟嘌呤类似物。可用的鸟嘌呤类似物包括但不限于肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
IRES序列
此外，提供了含有内部核糖体进入位点(IRES)的核酸。IRES可以充当唯一核糖体结合位点，或可以充当mRNA的多个核糖体结合位点之一。含有超过一个功能性核糖体结合位点的mRNA可以编码若干种由核糖体独立地翻译的肽或多肽(“多顺反子mRNA”)。当核酸具备有IRES时，还任选地提供第二可翻译区。可根据本发明使用的IRES序列的实例包括但不限于得自于小核糖核酸病毒(例如FMDV)、害虫病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心脊炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、鼠类白血病病毒(MLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的IRES序列。
末端架构修饰：多聚腺苷酸尾
在RNA加工期间，将腺嘌呤核苷酸的长链(多聚腺苷酸尾)正常地加入到信使RNA(mRNA)分子中以便增加所述分子的稳定性。在转录后立即使转录物的3'端裂解以释放3'羟基。然后多聚腺苷酸聚合酶将腺嘌呤核苷酸链加入到RNA中。所述过程称为聚腺苷酸化，加入了多聚腺苷酸尾，所述多聚腺苷酸尾的长度介于100与250个残基之间。
已经发现，独特的多聚腺苷酸尾长度为本发明的经修饰RNA提供了某些优点。
总体上，本发明的多聚腺苷酸尾的长度多于30个核苷酸。在另一个实施方案中，多聚腺苷酸尾的长度多于35个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少40个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少45个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少55个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少60个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少60个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少80个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少90个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少100个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少120个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少140个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少160个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少180个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少200个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少250个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少300个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少350个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少400个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少450个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少500个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少600个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少700个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少800个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少900个核苷酸。在另一个实施方案中，所述长度是至少1000个核苷酸。在一些实施方案中，经修饰mRNA包括约35到约3,000个核苷酸(例如35到50、35到100、35到250、35到500、30到750、35到1,000、35到1,500、35到2,000、35到2,500、50到100、50到250、50到500、50到750、50到1,000、50到1,500、50到2,000、50到2,500、50到3,000、100到500、100到750、100到1,000、100到1,500、100到2,000、100到2,500、100到3,000、500到750、500到1,000、500到1,500、500到2,000、500到2,500、500到3,000、1,000到1,500、1,000到2,000、1,000到2,500、1,000到3,000、1,500到2,000、1,500到2,500、1,500到3,000、2,000到3,000、2,000到2,500和2,500到3,000)。
在一个实施方案中，相对于整个经修饰RNA分子的长度设计多聚腺苷酸尾。这一设计可以基于经修饰RNA的编码区的长度、经修饰RNA(如mRNA)的特定特征或区域的长度或基于由经修饰RNA表达的最终产物的长度。
在这种情形下，多聚腺苷酸尾的长度可能比经修饰RNA或其特征的大10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。多聚腺苷酸尾还可以设计为其所属经修饰RNA的一部分。在这种情形下，多聚腺苷酸尾可以是构筑体的总长度或所述构筑体减去所述多聚腺苷酸尾后的总长度的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。此外，经工程改造的结合位点和经修饰mRNA与多聚腺苷酸结合蛋白的缀合可以增强表达。
另外，多个不同的经修饰mRNA可以使用经修饰的核苷酸在多聚腺苷酸尾的3'末端经由3'端一起连接到多聚腺苷酸结合蛋白(PABP)。可以在相关细胞系中进行转染实验，且在转染后12小时、24小时、48小时、72小时和第7天，可以利用ELISA测定蛋白质产量。
在一个实施方案中，对本发明的经修饰的mRNA进行设计而包括polyA-G四联体。G四联体是四个鸟嘌呤核苷酸的环状氢键键结阵列，其可以由DNA和RNA中的富G序列形成。在这个实施方案中，G四联体被并入多聚腺苷酸尾的末端。在不同的时间点测定所得mmRNA分子的稳定性、蛋白质产量和其它参数，包括半衰期。已经发现，polyA-G四联体使得蛋白质产量相当于单独使用具有120个核苷酸的多聚腺苷酸尾时所见的蛋白质产量的至少75％。
经修饰RNA的用途
改良器官、组织或外植体活力和/或寿命
本发明解决了器官救援和移植领域中长久以来的需求。对新收集的器官和组织的损害和破坏往往是快速而又不可逆的。如本文中所描述的经修饰mRNA可以用于增加器官或组织外植体或其部分的活力或寿命。用这样的方式，可以增加收集与移植或收集与研究之间的时间，从而为长距离移植匹配提供更多的机会。举例来说，可以通过浸泡或注射或注射到宿主而使器官和组织与编码可充当自由基清除剂的蛋白质的经修饰mRNA接触。用这样的方式，器官将遭受较少破坏并且在更长的时间内具有活力。经修饰和/或经配制的mRNA本身也可以充当自由基清除剂。
可以对任何器官、组织或其部分(例如细胞)施用本发明的组合物。器官可以选自心脏、肺脏、脑、肝脏、基底神经节、脑干髓质、中脑、脑桥、小脑、大脑皮层、下丘脑、眼睛、垂体、甲状腺、甲状旁腺、食管、胸腺、肾上腺、阑尾、膀胱、胆囊、大肠、小肠、肾脏、胰腺、脾脏、胃、皮肤、前列腺、睾丸、卵巢或子宫。组织可以选自本文中所描述的任何器官；结缔组织，如但不限于软骨(例如食道软骨、膝部软骨、耳软骨、鼻软骨)；肌肉，如但不限于平滑肌和心肌(例如心瓣膜)、肌腱、韧带、骨(例如骨髓)、角膜、中耳和静脉。也可以对器官或组织的任何部分施用本发明的组合物。作为一个非限制性实例，可以对眼睛的一部分(如角膜)施用本发明的组合物。作为另一个非限制性实例，可以在移植皮肤和/或毛囊之前、期间和/或之后对毛发和/或毛囊施用本发明的组合物。
在一个实施方案中，在移植之前对整个器官、组织或其部分施用本发明的组合物。作为一个非限制性实例，可以在移植之前对整个器官、组织或其部分施用包含经修饰mRNA的本发明组合物。作为另一个非限制性实例，可以在移植之前对所述器官、组织或其部分的一部分施用本发明的包含经修饰mRNA的第一组合物，并且可以对所述器官、组织或其部分的另一部分施用第二组合物。第一组合物和第二组合物可以包含相同或不同的经修饰mRNA。第一组合物和第二组合物可以包含超过一种经修饰mRNA。
在一个实施方案中，将本文中所描述的组合物施用于超过一个器官、组织或其部分。
在一个实施方案中，可以将本文中所描述的组合物施用于两个器官、组织或其部分。作为一个非限制性实例，可以在移植给单个接受者之前、期间和/或之后用本文中所描述的组合物处理肾脏和胰腺或心脏和肾脏，或心脏和肝脏或肺脏和肾脏或肺脏和肝脏，或心脏和肺脏。可以对各器官施用相同或不同的组合物。
在一个实施方案中，可以将本文中所描述的组合物施用于三个或更多个器官、组织或其部分。作为一个非限制性实例，可以在移植给单个接受者之前、期间和/或之后用本文中所描述的组合物处理心脏、肝脏和肾脏，或心脏、肾脏和胰腺，或心脏、肺脏和肝脏。可以对各器官施用相同或不同的组合物。
在一个实施方案中，所述经修饰RNA组合物包含配制的经修饰mRNA，且所述制剂可以选自本文中所描述的那些制剂，包括脂质、类脂质、类脂质、聚合物、脂质体制剂、纳米粒子、动态聚缀合物制剂、atuplexes、DBTC制剂、PLGA聚合物、基于鱼精蛋白的试剂、细胞穿透性肽、糖或类固醇的缀合物和基于细胞的载体系统。
在一个实施方案中，将经修饰mRNA施用于宿主生物体。该宿主生物体可以是供体或接受者宿主。它可以是哺乳动物，且该哺乳动物可以是人类。还预期所述组合物将可用于兽医应用或需要器官活力(例如，完整性或寿命)的任何应用。捐赠并非必然表明存在接受者生物体。可以在不存在接受者的情况下进行器官或组织的捐赠(或收集)。
在一个实施方案中，向所述供体生物体进行施用是在用于移出所述器官或组织的任何程序之前或在移出所述器官或组织期间或在移出所述器官或组织之后发生。施用可以通过浸泡、接触、注射或通过递送到供体或接受者的血液来进行。此外，可以通过使用医用装置、系统或组件(如离体器官照护系统)或与其组合而至少部分地帮助施用。
在另一个实施方案中，在移植之前对器官、组织或其部分施用本发明的组合物，且对宿主施用本发明的组合物。施用于宿主的组合物可以与用于处理器官、组织或其部分的组合物相同或不同。施用于宿主的组合物和施用于器官、组织或其部分的组合物可以包含超过一种经修饰mRNA。
在另一个实施方案中，本文中所描述的组合物可以在移植之前、期间和/或之后施用于静脉(例如，股静脉和隐静脉)。
在一个实施方案中，在从宿主移出之前、期间和/或之后将本文中所描述的组合物注射到器官、组织和/或其部分中。本文中所描述的组合物可以施用于欲移植的整个器官、器官的一部分、整个组织、组织的部分和/或至少一个细胞。
在一个实施方案中，移植期间所使用的流体可以包含有包含经修饰mRNA的组合物。举例来说，可以将经修饰mRNA加入到移植时所使用的流体或者器官、组织或其部分在移植过程中可能接触的流体中。
在一个实施方案中，本文中所描述的经修饰核酸可以使用电穿孔(例如，流式电穿孔)装载到组织和/或器官的细胞中。甲基转移酶抑制剂和/或核酸酶可以用于改良活力且增强转基因表达(参见例如US20060205081、US20070059833、WO2006089152和WO2007030674；各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，所施用的组合物包含配制的经修饰mRNA。
在一个实施方案中，经修饰mRNA编码能充当自由基清除剂或免疫抑制剂的多肽。
在一个实施方案中，经修饰mRNA可以在施用于器官、组织和/或其部分之前被囊封在水凝胶或密封剂中。可以在移植程序之前、期间和/或之后对器官、组织和/或其部分施用含有经修饰mRNA的密封。作为一个非限制性实例，可以用密封剂或水凝胶配制经修饰的mRNA，且然后在移植之前施用于器官、组织和/或其部分。作为另一个非限制性实例，在移植程序之前、期间和/或之后用密封剂或水凝胶配制可编码蛋白质(如目的多肽)的经修饰mRNA。
在一个实施方案中，经修饰mRNA编码蛋白质，如目的多肽。本发明的目的多肽可以包括但不限于作为自由基清除剂的蛋白质、作为免疫抑制剂的蛋白质、蛋白a4β1、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)、VEGF、神经调节蛋白1(NRG1)、胸腺素β-4、主要组织相容性复合体(MHC)、人类白细胞抗原(HLA)、热休克蛋白(HSP)、b细胞白血病/淋巴瘤因子2(BCL-2)、一氧化氮合成酶(NOS)、白介素-4、白介素-10、转化生长因子β-1(TGF-β1)、血红素加氧酶1(HO-1或HMOX1)、杀伤细胞免疫球蛋白受体(KIR)、天然杀伤细胞(NK)、蛋白激酶C(PKC)抑制剂，且在表4中列出了靶点。
靶点选择
根据本发明，经修饰核酸至少包含编码至少一种目的多肽的连接核苷的第一区。表4中列出了本发明的目的多肽或“靶点”的非限制性实例。表4中示出了对编码目的多肽的基因的描述以及国家生物技术信息中心(NCBI)核苷酸参考标识符(NM Ref)和NCBI肽参考标识符(NP Ref)。对于任何特定基因，可能存在一种或多种变体或同种型。在这些变体或同种型存在的情况下，也将它们示于表中。本领域技术人员应了解，表中公开了潜在侧接区。在开放阅读框的5'(上游)或3'(下游)的各核苷酸序列中编码这些侧接区。通过教示核苷酸参考序列明确且具体地公开了所述开放阅读框。因此，编码蛋白质的所教示的侧接序列被视为侧接区。还有可能利用一种或多种可获得的数据库或算法进一步表征5'和3'侧接区。数据库已经注释了NCBI序列的侧接区中所含有的特征，并且这些在本领域中是可获得的。
表4.靶点
预防或减少固有细胞免疫反应活化
本文中所描述的经修饰的核酸分子(例如mmRNA)可减少细胞中的固有免疫反应。术语“固有免疫反应”包括对一般来源于病毒或细菌的外源性单股核酸的细胞反应，其涉及诱导细胞因子表达和释放(尤其是干扰素)和细胞死亡。还在固有细胞免疫反应期间减少蛋白质合成。尽管消除细胞中的固有免疫反应是有利的，但本发明提供了在不会完全消除所述反应的情况下基本上减少免疫反应(包括干扰素信号转导)的经修饰的mRNA。在一些实施方案中，与由相应的未经修饰的核酸诱导的免疫反应相比，所述免疫反应被减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％或超过99.9％。所述减少可以用1型干扰素的表达或活性水平或如toll样受体(例如TLR7和TLR8)等干扰素调控基因的表达来度量。固有免疫反应的减少还可以用在向细胞群体一次或多次施用经修饰的RNA后的细胞死亡的减少来度量；例如细胞死亡比在相应的未经修饰的核酸的情况下所观测到的细胞死亡频率低10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％或超过95％。此外，细胞死亡可能会影响少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％或少于0.01％的与经修饰的核酸分子接触的细胞。
本公开提供了经修饰的核酸分子在靶细胞群体中的重复引入(例如转染)，例如以体外、离体或体内方式。接触细胞群体的步骤可以重复一次或多次(如两次、三次、四次、五次或多于五次)。在一些实施方案中，使细胞群体与经修饰的核酸接触的步骤重复了许多次，从而足以在所述细胞群体中实现预定蛋白质翻译效率。鉴于核酸修饰使得靶细胞群体的细胞毒性降低，可在多种细胞类型中实现所述重复转染。
本发明的经修饰的核酸，包括本文中所教示的修饰组合，可以具有优越的性质，使得它们更适合呈治疗形态形式。
治疗剂
本文中所描述的经修饰核酸(经修饰RNA)和由经修饰核酸翻译的蛋白质可以用作治疗剂。举例来说，本文中所描述的经修饰核酸可以施用于受试者，其中所述经修饰核酸经过体内翻译以在所述受试者中产生治疗肽。提供了用于治疗或预防人类和其它哺乳动物的疾病或病状的组合物、方法、试剂盒和试剂。本发明的活性治疗剂包括经修饰核酸、含有经修饰核酸或由经修饰核酸翻译的多肽的细胞、由经修饰核酸翻译的多肽和与含有经修饰核酸或由经修饰核酸翻译的多肽的细胞接触的细胞。
在某些实施方案中，提供了含有一种或多种含有编码可提高哺乳动物受试者的免疫性的蛋白质的可翻译区的经修饰核酸以及可诱导抗体依赖性细胞毒性的蛋白质的组合治疗剂。举例来说，提供了含有一种或多种编码曲妥珠单抗的核酸和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的治疗剂。确切地说，所述组合治疗剂可用于对曲妥珠单抗显现出诱导抗性的Her2+乳腺癌患者。(参见例如Albrecht,Immunotherapy.2(6):795-8(2010)；以全文引用的方式并入本文中)。
提供了使用本文中所描述的经修饰核酸在细胞群体中诱导重组多肽翻译的方法。所述翻译可以是在体内、离体、在培养物中或在体外发生的。使所述细胞群体与有效量的含有具有至少一个核苷修饰和编码重组多肽的可翻译区的核酸的组合物接触。所述群体在使所述核酸定位到所述细胞群体的一个或多个细胞中且在所述细胞中由核酸翻译重组多肽的条件下接触。
至少部分地基于靶组织、靶细胞类型、施用手段、核酸的物理特征(例如，经修饰核苷的尺寸和范围)和其它决定因素提供有效量的组合物。总体上，有效量的组合物在细胞中提供了有效的蛋白质产生，优选比含有相应未经修饰的核酸的组合物更有效。效率增加可以由细胞转染(即，用核酸转染的细胞的百分比)增加、由核酸进行的蛋白质翻译增加、核酸降解减少(例如，如由经修饰核酸进行的蛋白质翻译的持续时间增加所显示)或宿主细胞的固有免疫反应减少加以证明。
本发明的方面是有关在有需要的哺乳动物受试者中体内诱导重组多肽翻译的方法。其中，使用本文中所描述的递送方法向受试者施用有效量的含有具有至少一个核苷修饰和编码所述重组多肽的可翻译区的核酸的组合物。按一定量且在使得核酸定位到受试者的细胞中且在所述细胞中由核酸翻译重组多肽的其它条件下提供核酸。可以用一轮或不止一轮核酸施用靶向其中核酸被定位的细胞或存在所述细胞的组织。
本发明的其它方面涉及将含有经修饰核酸的细胞移植给哺乳动物受试者。向哺乳动物受试者施用细胞，如局部植入(例如，局部或皮下施用)、器官递送或全身注射(例如，静脉内注射或吸入)对本领域技术人员是已知的，在药学上可接受的载体中配制细胞同样是已知的。配制含有经修饰核酸的组合物用于肌肉内、经动脉、眼内、阴道、直肠、腹膜内、静脉内、鼻内、皮下、经内窥镜、经皮、肌肉内、心室内、皮内、鞘内、局部(例如利用粉末、软膏、乳膏剂、凝胶剂、洗剂和/或滴剂)、粘膜、经鼻、经肠、肿瘤内、通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；鼻喷雾和/或气雾剂，和/或经由门静脉导管施用。在一些实施方案中，对所述组合物进行配制以用于延长释放。在具体实施方案中，经修饰核酸分子或复合物和/或其药物组合物、预防组合物、诊断组合物或成像组合物可以用允许经修饰核酸分子或复合物越过血脑屏障、血管屏障或其它上皮屏障的方式施用。
然而，考虑到药物递送科学中有可能取得的进步，本公开涵盖通过任何适当途径递送经修饰的核酸分子或复合物和/或其药物组合物、预防组合物、诊断组合物或成像组合物。
施用了治疗剂的受试者罹患疾病、病症或有害病状，或有显现疾病、病症或有害病状的风险。提供了基于这些而对受试者进行鉴别、诊断和分类的方法，所述方法可以包括临床诊断、生物标记物水平、全基因组关联研究(GWAS)和本领域中已知的其它方法。
在某些实施方案中，所施用的经修饰核酸引导一种或多种提供了翻译了重组多肽的细胞中基本上不存在的功能活性的重组多肽的产生。举例来说，缺少的功能活性在本质上可以是酶活性、结构活性或基因调控活性。在相关实施方案中，所施用的经修饰核酸引导一种或多种能增加(例如以协同方式)翻译了重组多肽的细胞中存在但基本上不足的功能活性的重组多肽的产生。
在其它实施方案中，所施用的经修饰核酸引导一种或多种能置换翻译了重组多肽的细胞中基本上不存在的多肽(或多种多肽)的重组多肽的产生。所述不存在可能是由于编码基因或其调控路径的基因突变所致。在一些实施方案中，所述重组多肽使细胞中的内源性蛋白质的水平增加到合乎需要的水平；这种增加可以使内源性蛋白质的水平从低于正常的水平达到正常水平，或从正常水平达到高于正常的水平。
或者，所述重组多肽起拮抗细胞表面上所存在的或从细胞中分泌的内源性蛋白活性的作用。通常，内源性蛋白质的活性对受试者有害，例如，由于内源性蛋白质突变，从而造成活性或定位改变所致。另外，所述重组多肽直接或间接地拮抗细胞表面上所存在的或从细胞中分泌的生物学部分的活性。所拮抗的生物学部分的实例包括脂质(例如胆固醇)、脂蛋白(例如低密度脂蛋白)、核酸、碳水化合物、蛋白质毒素(如志贺毒素和破伤风毒素)或小分子毒素(如肉毒杆菌毒素、霍乱毒素和白喉毒素)。另外，所拮抗的生物分子可以是展现不合需要的活性(如细胞毒性活性或细胞抑制性活性)的内源性蛋白质。
对本文中所描述的重组蛋白质进行工程改造以便定位在细胞内，可能定位在特定隔室(如核)内，或被工程改造以便从细胞中分泌或移位到细胞的质膜。
用于疾病和病状的治疗剂
提供了通过还原缺失蛋白活性或压制异常蛋白活性来治疗或预防以缺失或异常蛋白活性为特征的疾病的症状的方法。因为在引入经修饰mRNA后快速引发蛋白质产生，所以与病毒DNA载体相比，本发明的化合物特别有利于治疗急性疾病，如脓毒病、中风和心肌梗塞。此外，本发明的经修饰mRNA缺乏转录调控在可实现蛋白质产量的精确滴定方面是有利的。
在一些实施方案中，经修饰mRNA可以来源于cDNA。
在一些实施方案中，根据本发明的经修饰mRNA和它们的编码多肽可以用于治疗目的。在一些实施方案中，根据本发明的经修饰mRNA和它们的编码多肽可以用于治疗多种疾病、病症和/或病状中的任一种，包括但不限于以下各项中的一种或多种：自身免疫性病症(例如糖尿病、狼疮、多发性硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎)；炎性病症(例如关节炎、骨盆炎性疾病)；传染性疾病(例如病毒感染(例如HIV、HCV、RSV)、细菌传染、真菌感染、脓毒病)；神经系统病症(例如阿兹海默氏病、亨廷顿氏病、自闭症、杜兴氏肌营养不良)；心血管病症(例如动脉粥样硬化、高胆固醇血症、血栓形成、凝血障碍、血管生成病症，如黄斑变性)；增殖性病症(例如癌症、良性赘生物)；呼吸系统病症(例如慢性阻塞性肺病)；消化系统病症(例如炎性肠病、溃疡)；肌骨胳病症(例如纤维肌痛、关节炎)；内分泌、代谢和营养病症(例如糖尿病、骨质疏松症)；泌尿系统病症(例如肾病)；心理病症(例如抑郁症、精神分裂症)；皮肤病症(例如创伤、湿疹)；血液和淋巴病症(例如贫血、血友病)；等等。
以功能障碍或异常蛋白活性为特征的疾病包括囊性纤维化、镰状细胞贫血、大疱性表皮松解症、肌萎缩性侧索硬化和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症。本发明提供了一种通过引入含有本文中所提供的经修饰核酸的基于核酸或细胞的治疗剂来治疗受试者的所述病状或疾病的方法，其中所述经修饰核酸编码可拮抗或压制受试者细胞中所存在的异常蛋白活性的蛋白质。功能障碍蛋白质的具体实例是囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)基因的错义突变变体，所述变体产生CFTR蛋白的功能障碍蛋白变体，由此引起囊性纤维化。
以缺失(或基本上减弱以致不存在适当的蛋白质功能)蛋白活性为特征的疾病包括囊性纤维化、C型尼曼-匹克病、β重型地中海贫血、杜兴氏肌营养不良、胡尔勒氏综合征、亨特氏综合征和甲型血友病。所述蛋白质可能不存在，或实质上无功能。本发明提供了一种治疗受试者的所述病状或疾病的方法，所述方法包括引入含有本文中所提供的经修饰核酸的基于核酸或细胞的治疗剂，其中所述经修饰核酸编码可还原受试者的靶细胞缺失的蛋白活性的蛋白质。功能障碍蛋白质的具体实例是囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)基因的无义突变变体，所述变体产生CFTR蛋白的非功能蛋白变体，由此引起囊性纤维化。
因而，提供了治疗哺乳动物受试者的囊性纤维化的方法，所述方法包括在细胞中存在有效量的CTFR多肽的条件下使受试者的细胞与具有编码功能CFTR多肽的可翻译区的经修饰核酸接触。优选的靶细胞是上皮细胞、内皮细胞和间皮细胞，如肺脏，且施用方法是鉴于靶组织而确定；即，对于肺递送，RNA分子经过配制以便通过吸入施用。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者的高脂血症的方法，其将编码最近通过基因组研究表征的蛋白质—分拣蛋白(Sortilin)的经修饰mRNA分子引入受试者的细胞群体中，从而改善受试者的高脂血症。SORT1基因编码称为分拣蛋白的跨高尔基体网状(TGN)跨膜蛋白。基因研究已显示，5名个体中有一个在使他们倾向于具有低水平低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)的SORT1基因的1p13基因座中具有单核苷酸多形现象rs12740374。约30％的人中所存在的次要等位基因的各拷贝使LDL胆固醇改变8mg/dL，而约5％的人群中所存在的次要等位基因的两个拷贝使LDL胆固醇降低16mg/dL。次要等位基因的携带者还显示心肌梗塞的风险降低40％。在小鼠中进行的功能体内研究描述了小鼠肝组织中的SORT1过度表达导致显著降低LDL胆固醇水平，降低多达80％，且静默SORT1使LDL胆固醇增加约200％(Musunuru K等,From noncoding variant tophenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus.Nature 2010；466:714-721；以全文引用的方式并入本文中)。
细胞命运的调节
提供了在目标哺乳动物细胞中诱导细胞命运变化的方法。所述目标哺乳动物细胞可以是前体细胞，且所述变化可以包括驱动分化成谱系或阻断所述分化。或者，所述目标哺乳动物细胞可以是分化的细胞，且所述细胞命运变化包括驱动去分化成多潜能前体细胞或阻断所述去分化，如使癌细胞去分化成癌干细胞。在需要改变细胞命运的情形下，在可诱导细胞命运变化的条件下将有效量的编码细胞命运诱导性多肽的mRNA引入到靶细胞中。在一些实施方案中，经修饰mRNA可用于将细胞亚群从第一表型重调到第二表型。所述重调可以是暂时的或永久的。
任选地，所述重调诱导靶细胞呈现中间表型。
另外，本发明的方法由于转染效率较高、能够再转染细胞和可维持靶细胞中所产生的重组多肽的量而尤其可用于产生诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)。此外，预期使用本文中所描述的方法产生的iPS细胞的使用可降低畸胎瘤形成的发病率。
还提供了减少靶细胞群体中的细胞分化的方法。举例来说，使含有一种或多种前体细胞类型的靶细胞群体与具有有效量的编码多肽的经修饰mRNA的组合物在可翻译所述多肽且减少前体细胞分化的条件下接触。在非限制性实施方案中，靶细胞群体含有哺乳动物受试者或组织中受外科程序影响的损伤组织。所述前体细胞是例如基质前体细胞、神经前体细胞或间质前体细胞。
在一个具体实施方案中，提供了可编码一个或多个分化因子Gata4、Mef2c和Tbx4的经修饰核酸。这些mRNA产生的因子被引入到成纤维细胞中且驱动重调成心肌细胞。所述重调可以在体内进行，其使含mRNA的贴片或其它材料与受损心脏组织接触以帮助心脏再生。与纤维化相反，所述过程促进心肌细胞生成。
靶向病原性生物体；纯化生物材料
本文中提供了使用可编码细胞抑制性或细胞毒性多肽的经修饰mRNA靶向病原性微生物(如细菌、酵母、原生动物、寄生虫等等)的方法。优选被引入到目标病原性生物体中的mRNA含有在所述目标病原性生物体中专门或优先翻译所述mRNA以减少治疗剂的可能的脱靶效应的经修饰核苷或其它核酸序列修饰。所述方法可用于从生物材料(包括血液、精液、卵子)和移植材料(包括胚胎、组织和器官)中去除病原性生物体。
靶向患病细胞
本文中提供了使用可编码细胞抑制性或细胞毒性多肽的经修饰mRNA来靶向病原性或患病细胞，特别是癌细胞的方法。优选被引入到目标病原性细胞中的mRNA含有在所述目标病原性细胞中专门或优先翻译所述mRNA以减少治疗剂的可能的脱靶效应的经修饰核苷或其它核酸序列修饰。或者，本发明提供了能够靶向经修饰mRNA以优先结合并进入目标病原性细胞中的靶向部分。
蛋白质产生
本文中所提供的方法可用于提高细胞培养过程中的蛋白质产物产率。在含有多种宿主细胞的细胞培养物中，相对于相应的未经修饰的核酸，引入本文中所描述的经修饰mRNA能增加蛋白质产生效率。所述蛋白质产生效率增加可以例如通过显示细胞转染增加、由核酸进行的蛋白质翻译增加、核酸降解减少和/或宿主细胞的固有免疫反应减少来证明。可以利用ELISA测量蛋白质产量，且可以利用本领域中已知的各种功能测定来测量蛋白活性。蛋白质产生可以在连续或分批式哺乳动物过程中产生。
另外，优化特定多肽在潜在目标性细胞系或细胞系集合中的表达是有用的，特别是经工程改造的蛋白质，如具有已知活性的参考蛋白的蛋白变体。在一个实施方案中，提供了一种优化经工程改造的蛋白质在靶细胞中的表达的方法，其包括：提供多种靶细胞类型，且使所述多种靶细胞类型各自独立地与编码经工程改造的多肽的经修饰mRNA接触。另外，可以改变培养条件以增加蛋白质产生效率。随后，检测和/或定量所述多种靶细胞类型中的经工程改造的多肽的存在和/或水平，从而允许通过选择与其相关的有效靶细胞和细胞培养条件来优化经工程改造的多肽的表达。当经工程改造的多肽含有一种或多种翻译后修饰或具有显著三级结构(这种情形往往使有效蛋白质产生复杂化)时，所述方法特别有用。
基因静默
本文中所描述的经修饰mRNA可用于使一个或多个靶基因在细胞群体中的表达静默(即，对其进行阻止或使其显著减少)。将编码能够引导序列特异性组蛋白H3甲基化的多肽的经修饰mRNA在使所述多肽能得以翻译且经由组蛋白H3甲基化和随后的异染色质形成来减少靶基因的基因转录的条件下引入到所述群体中的细胞中。在一些实施方案中，静默机制是对哺乳动物受试者中所存在的细胞群体进行。作为非限制性实例，可用的靶基因是突变的Janus激酶2家族成员，其中表达突变靶基因的哺乳动物受试者罹患由异常激酶活性所致的骨髓增生性疾病。
本文中还提供了经修饰mRNA和siRNA的共同施用。如在酵母中所显示，序列特异性反静默是一种用于改变细胞功能的有效机制。裂殖酵母需要两种RNAi复合物用于siRNA介导的异染色质组装：RNA诱导的转录静默(RITS)复合物和RNA指导的RNA聚合酶复合物(RDRC)(Motamedi等,Cell 2004,119,789-802；以全文引用的方式并入本文中)。在裂殖酵母中，RITS复合物含有siRNA结合Argonaute家族蛋白Ago1、染色质域蛋白质Chp1和Tas3。裂殖酵母RDRC复合物由RNA依赖性RNA聚合酶Rdp1、假定RNA解旋酶Hrr1和多聚腺苷酸聚合酶家族蛋白Cid12构成。这两种复合物需要Dicer核糖核酸酶和Clr4组蛋白H3甲基转移酶以便具有活性。总之，Ago1结合经由Rdp1共同转录产生的dsRNA转录物的Dicer介导的裂解产生的siRNA分子，且允许Chp1、Tas3、Hrr1和Clr4与注定发生甲基化和组蛋白修饰且随后被压入转录静默异染色质中的DNA区域发生序列特异性直接缔合。尽管这种机制以与DNA的着丝粒区域顺式的方式起作用，不过有可能通过针对特定DNA区域用双股siRNA进行共同转染并且伴随siRNA核糖核酸酶Eri1的RNAi引导的静默而发生序列特异性反式静默(Buhler等,Cell 2006,125,873-886；以全文引用的方式并入本文中)。
生物学路径的调节
被引入到细胞中的经修饰mRNA的快速翻译提供了一种调节目标生物学路径的理想机制。所述调节包括给定路径的拮抗或激动。在一个实施方案中，提供了一种用于拮抗细胞中的生物学路径的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的包含编码重组多肽的经修饰核酸的组合物在能将所述核酸定位到所述细胞中且所述重组多肽能够在所述细胞由所述核酸翻译的条件下接触，其中所述重组多肽抑制在所述生物学路径中具有功能的多肽的活性。示例性生物学路径是在如多发性硬化、类风湿性关节炎、牛皮癣、红斑狼疮、强直性脊椎炎、结肠炎或克罗恩氏病等自身免疫性或炎性病症中存在缺陷的路径；确切地说，对IL-12和IL-23信号传导路径的拮抗具有特定效用。(参见Kikly K,Liu L,Na S,SedgwickJD(2006)Curr.Opin.Immunol.18(6):670-5；以全文引用的方式并入本文中)。
此外，提供了编码趋化因子受体拮抗剂的经修饰核酸；例如，HIV进入宿主细胞中需要趋化因子受体CXCR-4和CCR-5(Arenzana-Seisdedos F等,(1996)Nature.Oct3；383(6599):400；以全文引用的方式并入本文中)。
或者，提供了激动细胞中的生物学路径的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的编码重组多肽的经修饰核酸在能将所述核酸定位到所述细胞中且所述重组多肽能够在所述细胞由所述核酸翻译的条件下接触，且所述重组多肽诱导在所述生物学路径中具有功能的多肽的活性。示例性激动生物学路径包括调节细胞命运决定的路径。所述激动是可逆的，或者是不可逆的。
细胞核酸递送
本发明的方法增强体内、离体或在培养物中对细胞群体的核酸递送。举例来说，使含有多种宿主细胞(例如真核细胞，如酵母或哺乳动物细胞)的细胞培养物与含有具有至少一个核苷修饰和任选地存在的可翻译区的经增强核酸的组合物接触。所述组合物总体上还含有转染试剂或能增加经增强的核酸吸收到宿主细胞中的效率的其它化合物。相对于相应的未经修饰的核酸，经增强的核酸展现在细胞群体中的滞留量有所提高。经增强的核酸的滞留量大于未经修饰的核酸的滞留量。在一些实施方案中，它比未经修饰的核酸的滞留量大至少约50％、75％、90％、95％、100％、150％、200％或多于200％。所述滞留优点可以通过用经增强的核酸进行一轮转染来实现，或可以在重复数轮转染之后获得。
在一些实施方案中，经增强的核酸与一种或多种其它核酸一起递送给靶细胞群体。所述递送可以同时进行，或在递送一种或多种其它核酸之前递送经增强的核酸。其它一种或多种核酸可以是经修饰的核酸或未经修饰的核酸。应了解，最初存在的经增强核酸基本上不诱导细胞群体的固有免疫反应，且此外，后来存在的未经修饰的核酸不会激活固有免疫反应。就此而言，如果希望存在于靶细胞群体中的蛋白质是由未经修饰的核酸翻译而来，则经增强的核酸可能本身不含可翻译区。
细胞表面上的配体或受体的表达
在本文中所描述的一些方面和所述方面的实施方案中，经修饰的RNA可用于表达细胞表面上的配体或配体受体(例如归巢部分)。连接于细胞表面的配体或配体受体部分可以允许所述细胞在体内与组织或药剂具有所需要的生物学相互作用。配体可以是抗体、抗体片段、适体、肽、维生素、碳水化合物、蛋白质或多肽、受体(例如细胞表面受体)、粘附分子、糖蛋白、糖残基、治疗剂、药物、粘多糖或其任何组合。举例来说，配体可以是识别癌细胞特异性抗原的抗体，使得细胞能够优先与肿瘤细胞相互作用以允许经修饰细胞的肿瘤特异性定位。配体可以赋予细胞组合物在欲处理的组织中积累的能力，因为优选的配体可能能够与欲处理的组织的外部面上的靶分子相互作用。一般优选与其它组织具有有限交叉反应性的配体。
在一些情况下，配体可以充当允许细胞靶向特定组织或与特定配体相互作用的归巢部分。所述归巢部分可以包括但不限于特定结合对的任何成员、抗体、单克隆抗体或其衍生物或类似物，包括但不限于：Fv片段、单链Fv(scFv)片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、单域抗体、骆驼化抗体和抗体片段、人源化抗体和抗体片段，和上述各项的多价型式；多价结合试剂，包括但不限于：单特异性或双特异性抗体，如以二硫键稳定的Fv片段、scFv串联体((SCFV)2片段)、双功能抗体、三功能抗体或四功能抗体，其典型地为共价键结或另外被稳定化(即，由亮氨酸拉链或螺旋体稳定化)的scFv片段；且其它归巢部分包括例如适体、受体和融合蛋白。
在一些实施方案中，所述归巢部分可以是表面结合抗体，其可以允许调整细胞靶向特异性。这尤其有用，因为可以针对所希望的靶向位点的目的表位产生高度特异性抗体。在一个实施方案中，细胞表面上表达了多种抗体，且各抗体可以对所希望的靶点具有不同的特异性。所述方法可以增加归巢相互作用的亲合力和特异性。
熟练技术人员可以基于细胞的所需定位或功能来选择任何归巢部分，举例来说，雌激素受体配体，如它莫西芬，可以使细胞靶向细胞表面上的雌激素受体数目有所增加的雌激素依赖性乳腺癌细胞。配体/受体相互作用的其它非限制性实例包括CCRI(例如在类风湿性关节炎和/或多发性硬化中用于治疗发炎的关节组织或脑)、CCR7、CCR8(例如靶向淋巴结组织)、CCR6、CCR9、CCR10(例如靶向肠组织)、CCR4、CCR10(例如用于靶向皮肤)、CXCR4(例如用于总体增强迁移)、HCELL(例如用于治疗炎症和炎性病症、骨髓)、α4β7(例如用于肠粘膜靶向)、VLA-4/VCAM-1(例如靶向内皮)。总体来说，与靶向(例如癌转移)有关的任何受体都可以用于本文中所描述的方法和组合物中。
细胞死亡的介体
在一个实施方案中，经修饰的核酸分子组合物可以用于通过增加死亡受体、死亡受体配体或其组合的表达而在细胞(例如癌细胞)中诱导细胞凋亡。这种方法可以用于在任何所希望的细胞中诱导细胞死亡且特别适用于治疗细胞会发出天然细胞凋亡信号的癌症。
可以通过集中于由属于肿瘤坏死因子(TNF)受体/配体超家族的若干种“死亡受体”与其配体之间的多种相互作用组成的最终效应机制的多个独立的信号传导路径来诱导细胞凋亡。得到最充分表征的死亡受体是CD95(“Fas”)、TNFRI(p55)、死亡受体3(DR3或Apo3/TRAMO)、DR4和DR5(apo2-TRAIL-R2)。细胞凋亡的最终效应机制可以是称为半胱天冬酶的一系列蛋白酶的活化。这些半胱天冬酶的活化导致一系列重要细胞蛋白裂解和细胞死亡。死亡受体/配体诱导的细胞凋亡的分子机制在本领域中是众所周知的。举例来说，Fas/FasL介导的细胞凋亡是由三个FasL分子结合从而诱导Fas受体经由C末端死亡域(DD)三聚而诱导，这又会募集衔接蛋白FADD(具有死亡域的Fas相关蛋白)和半胱天冬酶8。这种三分子复合物Fas/FAIDD/半胱天冬酶8的寡聚反应导致原酶半胱天冬酶8蛋白水解裂解形成活性半胱天冬酶8，半胱天冬酶8又通过蛋白水解作用活化其它下游半胱天冬酶(包括半胱天冬酶3)来引发细胞凋亡过程。死亡配体在形成三聚物或更高级的结构时总体上是细胞凋亡性的。作为单体，它们可以通过与三聚物竞争结合死亡受体而充当抗细胞凋亡剂。
在一个实施方案中，经修饰的核酸分子组合物编码死亡受体(例如Fas、TRAIL、TRAMO、TNFR、TLR等)。通过转染经修饰的RNA使细胞表达死亡受体变得易受由可活化该受体的配体所诱导的死亡影响。类似地，在经转染的细胞接触靶细胞时，使细胞例如在它们的表面上表达死亡配体将诱导具有所述受体的细胞死亡。在另一个实施方案中，经修饰的RNA组合物编码死亡受体配体(例如FasL、TNF等)。在另一个实施方案中，经修饰的RNA组合物编码半胱天冬酶(例如半胱天冬酶3、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9等)。在癌细胞往往展现不能适当地分化成非增殖性或受控增殖性形式的情况下，在另一个实施方案中，合成的经修饰RNA组合物编码死亡受体和其适当活化配体。在另一个实施方案中，合成的经修饰RNA组合物编码当表达于如癌症干细胞等癌细胞中时将诱导细胞分化成非病原性或非自更新性表型(例如降低细胞生长速率、减少细胞分裂等)或诱导细胞进入休眠细胞期(例如G0休止期)的分化因子。
本领域技术人员应了解，使用细胞凋亡诱导技术可能要求使经修饰的核酸分子适当地靶向例如肿瘤细胞，以防止不希望有的广泛大片的细胞死亡。因而，可以使用识别癌症抗原的递送机制(例如连接配体或抗体、靶向脂质体等)，使得经修饰的核酸分子仅表达于癌细胞中。
经修饰的核酸分子的示例性性质
大沟相互作用伴侣
本文中所描述的经修饰的核酸分子，例如经修饰的mRNA(mmRNA)，可以破坏与能通过与核苷酸或核酸的大沟面相互作用(例如结合)来检测RNA配体且对其作出反应的识别受体的相互作用。因而，包含如本文中所描述的经修饰的核苷酸或核酸(如经修饰的RNA)的RNA配体可减少与大沟结合伴侣的相互作用，且因此减少固有免疫反应，或促炎性细胞因子的表达和分泌，或两者。
大沟相互作用(例如结合)伴侣的实例包括但不限于以下核酸酶和解旋酶。在细胞膜内，TLR(Toll样受体)3、7和8可以对单股和双股RNA作出反应。在细胞质内，DEX(D/H)解旋酶和ATP酶的超家族2类成员可以感知RNA以引发抗病毒反应。这些解旋酶包括RIG-I(视黄酸诱导基因I)和MDA5(黑素瘤分化相关基因5)。其它实例包括遗传学和生理学实验室蛋白2(LGP2)、含有HIN-200域的蛋白质或含有解旋酶域的蛋白质。
多肽变体
提供了编码与参考多肽序列具有一定的同一性的变体多肽的核酸。如本领域中已知的术语“同一性”是指两种或更多种肽的序列之间的关系，如通过比较所述序列而确定。在本领域中，“同一性”还意指肽之间的序列相关性程度，如由两个或更多个氨基酸残基串之间的匹配数目所决定。
“同一性”度量利用特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)得到的两个或更多个序列中的较小者与间隙比对(如果有)之间的同一匹配的百分比。可以利用已知的方法容易地计算相关肽的同一性。所述方法包括但不限于以下文献中所描述的方法：ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.M.编,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第1部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,HumanaPress,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编,M.Stockton Press,New York,1991；和Carillo等,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)，全部以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，多肽变体具有与参考多肽相同或类似的活性。或者，相对于参考多肽，所述变体具有改变的活性(例如增高或降低)。总体来说，本发明的特定聚核苷酸或多肽的变体将与特定参考聚核苷酸或多肽具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，如利用本文中所描述和本领域技术人员已知的序列对比程序和参数所确定。
如本领域技术人员所公认，蛋白质片段、功能蛋白域和同源蛋白质也被视为在本发明的范围内。举例来说，本文中提供了长度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或多于100个氨基酸的参考蛋白质的任何蛋白质片段(意指比参考多肽序列短至少一个氨基酸残基但在其它方面同一的多肽序列)。在另一个实例中，根据本发明，可以利用包括与本文中所描述的任何序列具有约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％同一性的约20、约30、约40、约50或约100个氨基酸的延伸段的任何蛋白质。在某些实施方案中，根据本发明利用的蛋白质序列包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变，如本文中提供或提到的任何序列中所示。
多肽库
还提供了含有核苷修饰的聚核苷酸库，其中所述聚核苷酸个别地含有编码多肽(如抗体、蛋白结合伴侣、支架蛋白和本领域中已知的其它多肽)的第一核酸序列。优选地，所述聚核苷酸是呈适用于直接引入到靶细胞宿主中的形式的mRNA，所述靶细胞宿主又合成编码多肽。
在某些实施方案中，产生了多种蛋白质变体，各变体具有不同的氨基酸修饰，且对其进行测试以确定就药物动力学、稳定性、生物相容性和/或生物活性或如表达水平等生物物理学性质而言最佳的变体。所述库可以含有10、102、103、104、105、106、107、108、109或超过109种可能的变体(包括一个或多个残基的取代、缺失和一个或多个残基的插入)。
多肽-核酸复合物
适当的蛋白质翻译涉及许多与mRNA缔合的多肽和核酸的物理聚集。本发明提供了含有蛋白质与核酸的缀合物的复合物，其含有具有一个或多个核苷修饰(例如至少两个不同的核苷修饰)的可翻译mRNA和一种或多种与所述mRNA结合的多肽。总体来说，所提供的蛋白质的量可有效防止或减少引入了所述复合物的细胞的固有免疫反应。
靶向部分
在本发明的实施方案中，提供经修饰的核酸以在细胞表面上表达蛋白结合伴侣或受体，由此可以起在体内或体外使细胞靶向特定组织空间或与特定部分相互作用的作用。合适的蛋白结合伴侣包括抗体和其功能片段、支架蛋白或肽。另外，经修饰的核酸可以用于引导脂质、碳水化合物或其它生物学部分的合成和细胞外定位。
如本文中所描述，本发明的经修饰核酸的一个有用特征是能够减少细胞对外源性核酸的固有免疫反应。提供了用于滴定、减少或消除细胞或细胞群体中的免疫反应的方法。在一些实施方案中，使细胞与含有第一剂量的包括可翻译区和至少一个核苷修饰的第一外源性核酸的第一组合物接触，且测定所述细胞对所述第一外源性核酸的固有免疫反应水平。随后，使所述细胞与第二组合物接触，所述第二组合物包括第二剂量的第一外源性核酸，与所述第一剂量相比，所述第二剂量含有较少量的所述第一外源性核酸。
或者，使所述细胞与第一剂量的第二外源性核酸接触。所述第二外源性核酸可以含有一个或多个可能与所述第一外源性核酸相同或不同的经修饰核苷，或替代地，所述第二外源性核酸可能不含经修饰核苷。使细胞与第一组合物和/或第二组合物接触的步骤可以重复一次或多次。
另外，任选地测定细胞中的蛋白质产生(例如蛋白质翻译)的效率，且所述细胞可以用第一组合物和/或第二组合物重复再转染，直到实现目标蛋白质产生效率为止。
如本文中所描述，提供了具有基本上不可翻译的序列的mRNA。所述mRNA在施用于受试者时作为疫苗可以是有效的。此外，条件是施用所述疫苗的受试者可以是哺乳动物，更优选为人类且最优选为患者。
还提供了含有一个或多个非编码区的经修饰核酸。所述经修饰核酸总体上未经过翻译，但能够结合且螯合一个或多个翻译机制组件，如核糖体蛋白或转移RNA(tRNA)，从而有效地减少细胞中的蛋白表达。经修饰核酸可以含有小核RNA(sno-RNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)或Piwi相互作用RNA(piRNA)。
免疫反应的活化：疫苗
在本发明的一个实施方案中，mRNA分子可以用来引发或激发生物体中的免疫反应。欲递送的mRNA分子可以编码免疫原性肽或多肽，并且可以编码超过一种所述肽或多肽。
另外，某些经修饰的核苷或其组合在引入到经修饰的核酸中时会活化固有的免疫反应。所述活化性经修饰的核酸(例如经修饰的mRNA)在与多肽或其它疫苗组合时可用作佐剂。在某些实施方案中，所述经活化的经修饰mRNA含有编码可用作疫苗的多肽序列的可翻译区，从而提供自辅助能力。
在一个实施方案中，本发明的经修饰的核酸分子和/或mmRNA可以编码免疫原。编码免疫原的经修饰的核酸分子和/或mmRNA的递送可以活化免疫反应。作为一个非限制性实例，编码免疫原的经修饰核酸分子和/或mmRNA可以递送到细胞中以触发多个固有反应路径(参见国际公布号WO2012006377；以全文引用的方式并入本文中)。作为另一个非限制性实例，本发明的编码免疫原的经修饰核酸分子和mmRNA可以按足够大的剂量递送给脊椎动物以便对所述脊椎动物具有免疫原性(参见国际公布号WO2012006372和WO2012006369；各自以全文引用的方式并入本文中)。
本发明的经修饰的核酸分子或mmRNA可以编码用于疫苗的多肽序列，并且还可以包含抑制剂。所述抑制剂可以阻碍抗原呈递和/或抑制本领域中已知的各种路径。作为一个非限制性实例，本发明的经修饰的核酸分子或mmRNA可以与可阻碍抗原呈递的抑制剂组合用于疫苗(参见国际公布号WO2012089225和WO2012089338；各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，本发明的经修饰的核酸分子或mmRNA可以是自复制RNA。自复制RNA分子可以增强RNA的递送效率和经封围的基因产物的表达。在一个实施方案中，经修饰的核酸分子或mmRNA可以包括本文中所描述和/或本领域中已知的至少一个修饰。在一个实施方案中，可以设计自复制RNA，以使得自复制RNA不会诱导感染性病毒粒子的产生。作为一个非限制性实例，可以利用美国公布号US20110300205和国际公布号WO2011005799中所描述的方法来设计自复制RNA，所述美国公布和国际公布各自以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，本发明的自复制经修饰核酸分子或mmRNA可以编码可提高免疫反应的蛋白质。作为一个非限制性实例，经修饰的核酸分子和/或mmRNA可以是可编码至少一种抗原的自复制mRNA(参见美国公布号US20110300205和国际公布号WO2011005799；各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，本发明的自复制经修饰核酸或mmRNA可以使用本文中所描述或本领域中已知的方法来配制。作为一个非限制性实例，自复制RNA可以利用Geall等(Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines,PNAS 2012；PMID:22908294；以全文引用的方式并入本文中)所描述的方法进行配制以便递送。
在一个实施方案中，本发明的经修饰的核酸分子或mmRNA可以编码两亲性和/或免疫原性两亲性肽。
在一个实施方案中，本发明的经修饰核酸分子或mmRNA的制剂还可以包含两亲性和/或免疫原性两亲性肽。作为一个非限制性实例，包含两亲性和/或免疫原性两亲性肽的经修饰核酸分子或mmRNA可以如美国公布号US20110250237以及国际公布号WO2010009277和WO2010009065中所描述进行配制，所述美国公布和国际公布各自以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，本发明的经修饰的核酸分子和mmRNA可以是免疫刺激性的。作为一个非限制性实例，经修饰的核酸分子和mmRNA可以编码所有或一部分正义或负义股RNA病毒基因组(参见国际公布号WO2012092569和美国公布号US20120177701，各自以全文引用的方式并入本文中)。在另一个非限制性实例中，本发明的免疫刺激性经修饰核酸分子或mmRNA可以与如本文中所描述和/或本领域中已知的赋形剂一起配制以便施用(参见国际公布号WO2012068295和美国公布号US20120213812，各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，利用本文中所描述的方法配制的疫苗的反应可以通过加入各种化合物来诱导治疗作用而增强。作为一个非限制性实例，疫苗制剂可以包括MHC II结合肽或具有MHC II结合肽的类似的序列的肽(参见国际公布号WO2012027365、WO2011031298和美国公布号US20120070493、US20110110965，各自以全文引用的方式并入本文中)。作为另一个实例，疫苗制剂可以包含可对受试者中的烟碱残基产生抗体反应的经修饰的烟碱化合物(参见国际公布号WO2012061717和美国公布号US20120114677，各自以全文引用的方式并入本文中)。
药物组合物
配制、施用、递送和给药
本发明提供了经修饰的核酸和mmRNA组合物和复合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合。药物组合物可以任选地包含一种或多种其它活性物质，例如治疗和/或预防活性物质。药剂的配制和/或制造中的一般考虑因素可以例如在以下文献中获知：Remington:The Science and Practice of Pharmacy第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005(以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，将组合物施用于人类、人类患者或受试者。出于本公开的目的，短语“活性成分”泛指如本文中所描述的欲递送的经修饰核酸和mmRNA。
尽管对本文中所提供的药物组合物的描述主要是针对适合施用于人类的药物组合物，但熟练技术人员应了解，所述组合物一般适合施用于所有种类的动物。已充分了解对适合施用于人类的药物组合物进行的修饰是为了使所述组合物适合施用于各种动物，且具有一般技能的兽医药理学家仅利用普通实验(如果有)即能设计和/或进行所述修饰。预期施用所述药物组合物的受试者包括但不限于人类和/或其它灵长类动物；哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，如牛、猪、马、羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业上相关的鸟类，如鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
本文中所描述的药物组合物的制剂可以利用药理学领域中已知的或今后开发的任何方法来制备。一般来说，所述制备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分缔合，然后在必要和/或需要时使产物成形和/或包装成所希望的单剂量或多剂量单元的步骤。
根据本发明的药物组合物可以呈散装形式、呈单次单位剂量形式和/或呈多个单次单位剂量形式加以制备、包装和/或出售。如本文中所使用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的个别量。活性成分的量一般等于将施用于受试者的活性成分的剂量和/或所述剂量的适宜分量，如所述剂量的一半或三分之一。
本发明提供了经修饰的核酸分子和含有与其它可递送部分缔合的经修饰核酸的复合物。因而，本发明提供了包含一种或多种经修饰核酸或者一种或多种所述复合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。药物组合物可以任选地包含一种或多种其它治疗活性物质。在一些实施方案中，组合物被施用于人类。
根据本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其它成分的相对量将取决于所治疗的受试者的身份、体型和/或病状并且还取决于施用组合物的途径而变化。举例来说，所述组合物可以包含介于0.1％与100％(w/w)之间，例如介于与50％之间、介于1％与30％之间、介于5％与80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
在一个实施方案中，提供了含有有效量的经工程改造以避免经修饰核酸所进入的细胞的固有免疫反应的经修饰核酸(例如mRNA)的制剂。经修饰核酸总体上包括编码目的多肽的核苷酸序列。
当施用于受试者时，本文中所描述的药物组合物可以提供由经修饰mRNA产生的蛋白质。药物组合物可以任选地包含一种或多种其它治疗活性物质。根据一些实施方案，提供了施用将被递送给有需要的受试者的包含一种或多种蛋白质的药物组合物的方法。在一些实施方案中，组合物被施用于人类受试者。在另一个实施方案中，组合物被施用于是患者的受试者。
在一个实施方案中，本文中所描述的药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的载体。
制剂
本发明的经修饰的核酸和mmRNA可以使用一种或多种赋形剂来配制以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如从所述经修饰的核酸或mmRNA的储槽式制剂释放)；(4)改变生物分布(例如使经修饰的核酸或mmRNA靶向特定的组织或细胞类型)；(5)增加所编码的蛋白质的体内翻译；和/或(6)改变所编码蛋白质的体内释放型态。除了如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等传统赋形剂以外，本发明的赋形剂还可以包括但不限于类脂质、脂质体、脂质纳米粒子、聚合物、脂质复合物、核-壳型纳米粒子、肽、蛋白质、被经修饰的核酸或mmRNA转染过的细胞(例如以供移植到受试者体内)、透明质酸酶、纳米粒子模拟物和其组合。因此，本发明的制剂可以包括一种或多种赋形剂，各赋形剂的量一起增加经修饰的核酸或mmRNA的稳定性、增加经修饰的核酸或mmRNA对细胞的转染、增加经修饰的核酸或mmRNA编码的蛋白质的表达，和/或改变经修饰的核酸或mmRNA编码的蛋白质的释放型态。此外，本发明的经修饰的核酸和mmRNA可以使用自组装核酸纳米粒子来配制。
本文中所描述的药物组合物的制剂可以利用药理学领域中已知的或今后开发的任何方法来制备。一般来说，所述制备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分缔合的步骤。
可以用于本发明的制剂可以如PCT/US2012/68714中所描述来制备；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
根据本公开的药物组合物可以以散装形式、以单一单位剂量形式和/或以多个单一单位剂量形式加以制备、包装和/或出售。如本文中所使用，“单位剂量”是指包含预定量的活性成分的药物组合物的个别量。活性成分的量一般可以等于将施用于受试者的活性成分的剂量和/或所述剂量的适宜分量，包括但不限于所述剂量的一半或三分之一。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其它成分的相对量可取决于所治疗的受试者的身份、体型和/或病状并且还取决于施用组合物的途径而变化。举例来说，所述组合物可以包含介于0.1％与99％(w/w)之间的活性成分。
在一些实施方案中，本文中所描述的经修饰的mRNA制剂可以含有至少一种经修饰的mRNA。所述制剂可以含有1、2、3、4或5种经修饰的mRNA。在一个实施方案中，所述制剂含有至少三种经修饰的mRNA编码蛋白质。在一个实施方案中，所述制剂含有至少五种经修饰的mRNA编码蛋白质。
药物制剂可以另外包含药学上可接受的赋形剂，如本文中所使用，所述赋形剂在适于所希望的特定剂型时包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等等。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备所述组合物的技术在本领域中是已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；以全文引用的方式并入本文中)。本公开的范围内可以涵盖使用常规赋形剂介质，除非达到任何常规赋形剂介质可能与物质或其衍生物不相容的程度，如因产生任何不合需要的生物学效应或另外以不利方式与药物组合物的任何其它组分相互作用所致。
在一些实施方案中，可以增大和/或减小脂质纳米粒子的粒度。粒度变化可能能够帮助对抗生物反应，如但不限于炎症，或可能增加递送给哺乳动物的经修饰mRNA的生物学效应。
在一个实施方案中，用于本发明的经修饰mRNA可以如PCT/US2012/69610中所描述进行配制，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
制造药物组合物时所使用的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、表面活性剂和/或乳化剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油剂。所述赋形剂可以任选地包括在本发明的药物制剂中。
在某些实施方案中，所述制剂包括一种或多种细胞穿透剂，例如转染剂。在一个具体实施方案中，将核糖核酸与转染剂(或其混合物)混合，且将所得混合物用于转染细胞。优选转染剂是阳离子脂质组合物，特别是单价和多价阳离子脂质组合物，更特别是LIPOFECTACE、DMRIE-C、DMRIE、DOTAP、DOSPA和DOSPER；和树状大分子组合物，特别是G5-G10树状大分子，包括致密星形树状大分子、PAMAM树状大分子、接枝树状大分子以及称为树状接枝物和“SUPERFECT”的树状大分子。在第二具体转染方法中，核糖核酸与核酸结合基团缀合，例如聚胺且更特别是精胺，然后被引入到细胞中或与转染剂(或其混合物)混合，且将所得混合物用于转染细胞。在第三具体实施方案中，将一种或多种增强转染的肽、蛋白质或蛋白质片段(包括融合肽或蛋白质、输送或运输肽或蛋白质、受体-配体肽或蛋白质、或核定位肽或蛋白质和/或它们的经修饰类似物(例如经精胺修饰的肽或蛋白质)或其组合)的混合物与将被引入到细胞中的核糖核酸混合并且复合，任选地与转染剂混合，且将所得混合物用于转染细胞。此外，使转染剂的组分(例如脂质、阳离子脂质或树状大分子)直接或经由连接或间隔基团与所选肽、蛋白质或蛋白质片段共价缀合。对这一实施方案特别感兴趣的是肽或蛋白质为融合肽或蛋白质、膜渗透肽或蛋白质、输送或运输肽或蛋白质，或起细胞靶向作用。将肽或蛋白质转染剂复合物与核糖核酸合并，且用于转染。
类脂质
已经广泛描述了类脂质的合成，且含有这些化合物的制剂特别适合于递送经修饰的核酸分子或mmRNA(参见Mahon等,Bioconjug Chem.2010 21:1448-1454；Schroeder等,J Intern Med.2010 267:9-21；Akinc等,Nat Biotechnol.2008 26:561-569；Love等,Proc NatlAcad Sci U S A.2010 107:1864-1869；Siegwart等,Proc Natl Acad Sci U S A.2011108:12996-3001；全部以全文引用的方式并入本文中)。
尽管已经使用这些类脂质在啮齿动物和非人类灵长类动物中有效地递送双股小干扰RNA分子(参见Akinc等,Nat Biotechnol.2008 26:561-569；Frank-Kamenetsky等,Proc NatlAcad Sci U S A.2008 105:11915-11920；Akinc等,Mol Ther.2009 17:872-879；Love等,ProcNatl Acad Sci U S A.2010 107:1864-1869；Leuschner等,Nat Biotechnol.2011 29:1005-1010；全部以全文引用的方式并入本文中)，但本公开描述了其制剂和在递送单股经修饰核酸分子或mmRNA方面的用途。可以制备含有这些类脂质的复合物、胶团、脂质体或粒子，且因此可以有效递送经修饰的核酸分子或mmRNA，如根据经由局部化和/或全身性施用途径注射类脂质制剂后产生编码蛋白质所判断。经修饰的核酸分子或mmRNA的类脂质复合物可以通过各种手段施用，包括但不限于静脉内、肌肉内或皮下途径。
核酸的体内递送可能受许多参数影响，包括但不限于制剂组成、粒子PEG化的特性、负载度、寡核苷酸与脂质比率和生物物理学参数，如但不限于粒度(Akinc等,Mol Ther.2009 17:872-879；以全文引用的方式并入本文中)。作为一个实例，聚(乙二醇)(PEG)脂质的锚链长度的小变化可以对体内功效产生显著作用。可以测试具有不同的类脂质，包括但不限于五[3-(1-月桂基氨基丙酰基)]-三乙烯四胺盐酸盐(TETA-5LAP；也称为98N12-5，参见Murugaiah等,Analytical Biochemistry,401:61(2010)；以全文引用的方式并入本文中)、C12-200(包括衍生物和变体)和MD1的制剂的体内活性。
Akinc等,Mol Ther.2009 17:872-879公开了本文中称为“98N12-5”的类脂质，并且该文献是以全文引用的方式并入。
Love等,Proc Natl Acad Sci U S A.2010 107:1864-1869以及Liu和Huang,MolecularTherapy.2010669-670公开了本文中称为“C12-200”的类脂质；两个文献都以全文引用的方式并入本文中。类脂质制剂可以包括除经修饰的核酸分子或mmRNA以外还包含3种或4种或更多种组分的粒子。作为一个实例，具有某些类脂质的制剂包括但不限于98N12-5，且可以含有42％类脂质、48％胆固醇和10％PEG(C14烷基链长度)。作为另一个实例，具有某些类脂质的制剂包括但不限于C12-200，且可以含有50％类脂质、10％二硬脂酰磷脂酰胆碱、38.5％胆固醇和1.5％PEG-DMG。
在一个实施方案中，与类脂质一起配制以用于全身性静脉内施用的经修饰核酸分子或mmRNA可以靶向肝脏。举例来说，使用经修饰的核酸分子或mmRNA且包含42％98N12-5、48％胆固醇和10％PEG-脂质的脂质摩尔组成(具有总脂质:经修饰的核酸或mmRNA为约7.5:1的最终重量比和处于PEG脂质上的C14烷链长度，平均粒度大约50-60nm)的最终优化静脉内制剂可以使所述制剂对肝脏的分布大于90％。(参见Akinc等,MolTher.2009 17:872-879；以全文引用的方式并入本文中)。在另一个实例中，使用C12-200(参见美国临时申请61/175,770和已公布的国际申请WO2010129709，各自以全文引用的方式并入本文中)类脂质的静脉内制剂可以具有50/10/38.5/1.5的C12-200/二硬脂酰磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-DMG摩尔比，其中7:1的总脂质:经修饰的核酸分子或mmRNA重量比和80nm的平均粒度可以将经修饰的核酸分子或mmRNA有效递送到肝细胞(参见Love等,ProcNatl Acad Sci U S A.2010 107:1864-1869，以全文引用的方式并入本文中)。在另一个实施方案中，含有MD1类脂质的制剂可以用于在体内将经修饰的核酸分子或mmRNA有效递送到肝细胞。用于肌肉内或皮下途径的优化类脂质制剂的特征可以取决于靶细胞类型和制剂扩散通过细胞外基质进入血流中的能力而显著变化。尽管由于内皮膜孔的尺寸之故需要小于150 nm的粒度以便进行有效的肝细胞递送(参见Akinc等,Mol Ther.2009 17:872-879，以全文引用的方式并入本文中)，但使用类脂质配制的经修饰核酸分子或mmRNA向其它细胞类型(包括但不限于内皮细胞、骨髓细胞和肌细胞)递送所述制剂可能不受类似的尺寸限制。已经报道了使用类脂质制剂将siRNA体内递送到如骨髓细胞和内皮等其它非肝细胞的细胞(参见Akinc等,Nat Biotechnol.2008 26:561-569；Leuschner等,Nat Biotechnol.2011 29:1005-1010；Cho等,Adv.Funct.Mater.2009 19:3112-3118；第八届国际JudahFolkman会议(8th International Judah Folkman Conference),Cambridge,MA，2010年10月8-9日；各自以全文引用的方式并入本文中)。在有效递送到如单核细胞等骨髓细胞的情况下，类脂质制剂可以具有类似的组分摩尔比。类脂质和其它组分(包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-DMG)的不同比率可以用于优化经修饰的核酸或mmRNA的制剂以便递送到不同的细胞类型，包括但不限于肝细胞、骨髓细胞、肌细胞等。举例来说，组分摩尔比可以包括但不限于50％C12-200、10％二硬脂酰磷脂酰胆碱、38.5％胆固醇和1.5％PEG-DMG(参见Leuschner等,Nat Biotechnol 2011 29:1005-1010；以全文引用的方式并入本文中)。类脂质制剂用于经由皮下或肌肉内递送将核酸局部递送到细胞(如但不限于脂肪细胞和肌细胞)的用途可能不要求所有所希望的制剂组分都用于全身性递送，且因而可能仅包含类脂质和经修饰的核酸分子或mmRNA。
不同的类脂质的组合可以用于改良经修饰的核酸分子或mmRNA引导的蛋白质产生的功效，因为类脂质可能能够增加经修饰的核酸分子或mmRNA对细胞的转染；和/或增加所编码蛋白质的翻译(参见Whitehead等,Mol.Ther.2011,19:1688-1694，以全文引用的方式并入本文中)。
在某些实施方案中，所述制剂可能至少包括经修饰核酸和递送剂。在一些实施方案中，所述递送剂可以包含允许mmRNA的局部化和全身性递送的基于类脂质的制剂。
本文中所描述的药物组合物包括基于类脂质的制剂，从而允许mmRNA的局部化和全身性递送。
脂质体、脂质复合物和脂质纳米粒子
本发明的经修饰的核酸分子和mmRNA可以使用一种或多种脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子来配制。在一个实施方案中，经修饰的核酸分子或mmRNA的药物组合物包括脂质体。脂质体是可能主要由脂质双分子层构成且可以用作递送载具以便施用营养物质和药物制剂的人工制备的囊泡。脂质体可以具有不同的尺寸，如但不限于直径可能为数百纳米且可能含有由狭窄水性隔室隔开的一系列同心双分子层的多层囊泡(MLV)、直径可能小于50nm的小型单室囊泡(SUV)和直径可能介于50与500nm之间的大型单室囊泡(LUV)。脂质体设计可以包括但不限于调理素或配体以便改良脂质体与不健康组织的连接或活化事件，如但不限于胞吞作用。脂质体可以含有较低或较高pH值以便改良药物制剂的递送。
脂质体的形成可以取决于物理化学特征，如但不限于所捕获的药物制剂和脂质体成分、分散脂质囊泡的介质的特性、所捕获的物质的有效浓度和其潜在毒性、应用和/或递送囊泡期间所涉及的任何其它过程、最佳化尺寸、打算应用的囊泡的多分散性和储存寿命，和批次间可再现性以及大规模生产安全且有效的脂质体产物的可能性。
在一个实施方案中，本文中所描述的药物组合物可以包括但不限于脂质体，如由1,2-二油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)脂质体、得自于Marina Biotech的DiLa2脂质体(Bothell，WA)、1,2-二亚麻油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚麻油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧环戊烷(DLin-KC2-DMA)和MC3(US20100324120；以全文引用的方式并入本文中)形成的脂质体和可以递送小分子药物的脂质体，如但不限于得自于Janssen Biotech,Inc.(Horsham，PA)的在一个实施方案中，本文中所描述的药物组合物可以包括但不限于脂质体，如先前已描述且显示适合体外和体内寡核苷酸递送的由合成稳定化质粒-脂质粒子(SPLP)或稳定化核酸脂质粒子(SNALP)而形成的脂质体(参见Wheeler等,Gene Therapy.1999 6:271-281；Zhang等,Gene Therapy.19996:1438-1447；Jeffs等,Pharm Res.2005 22:362-372；Morrissey等,Nat Biotechnol.20052:1002-1007；Zimmermann等,Nature.2006 441:111-114；Heyes等,J Contr Rel.2005107:276-287；Semple等,Nature Biotech.2010 28:172-176；Judge等,J Clin Invest.2009119:661-673；deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132；全部以全文引用的方式并入本文中)。Wheeler等的原始制造方法是清洁剂透析法，该方法后来被Jeffs等加以改良且称为自发性囊泡形成法。脂质体制剂由3到4种脂质组分以及经修饰的核酸分子或mmRNA构成。如Jeffs等所描述，作为一个实例，脂质体可以含有但不限于55％胆固醇、20％二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、10％PEG-S-DSG和15％1,2-二油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)。如Heyes等所描述，作为另一个实例，某些脂质体制剂可以含有但不限于48％胆固醇、20％DSPC、2％PEG-c-DMA和30％阳离子脂质，其中所述阳离子脂质可以是1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DSDMA)、DODMA、DLin-DMA或1,2-二亚麻烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)。
在一个实施方案中，药物组合物可以包括有可能为了递送可编码至少一种免疫原的mmRNA而形成的脂质体。可以用脂质体囊封mmRNA，或可使其容纳在水性核心中，然后可以用脂质体囊封所述水性核心(参见国际公布号WO2012031046、WO2012031043、WO2012030901和WO2012006378；各自以全文引用的方式并入本文中)。在另一个实施方案中，可编码免疫原的mmRNA可以用阳离子水包油乳液配制，其中乳液粒子包含油核心和可以与将所述分子锚定到所述乳液粒子的mmRNA相互作用的阳离子脂质(参见国际公布号WO2012006380；以全文引用的方式并入本文中)。在又一个实施方案中，脂质制剂可以至少包括阳离子脂质、可以增强转染的脂质和至少一种含有与脂质部分连接的亲水性头部基团的脂质(国际公布号WO2011076807和美国公布号20110200582；各自以全文引用的方式并入本文中)。在另一个实施方案中，编码免疫原的经修饰mRNA可以用脂质囊泡配制，所述脂质囊泡可以在官能化脂质双分子层之间具有交联(参见美国公布号20120177724，以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，经修饰的mRNA可以用脂质囊泡配制，所述脂质囊泡可以在官能化脂质双分子层之间具有交联。
在一个实施方案中，经修饰的mRNA可以用脂质-聚阳离子复合物配制。脂质-聚阳离子复合物的形成可以利用本领域中已知的和/或如美国公布号20120178702(以全文引用的方式并入本文中)中所描述的方法来实现。作为一个非限制性实例，聚阳离子可以包括阳离子肽或多肽，如但不限于聚赖氨酸、聚鸟氨酸和/或聚精氨酸，以及国际公布号WO2012013326(以全文引用的方式并入本文中)中所描述的阳离子肽。在另一个实施方案中，经修饰的mRNA可以用脂质-聚阳离子复合物配制，所述脂质-聚阳离子复合物还可以包括中性脂质，如但不限于胆固醇或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
可能影响脂质体制剂的因素为但不限于阳离子脂质组分的选择、阳离子脂质饱和度、PEG化的特性、所有组分的比率和生物物理学参数(如尺寸)。在Semple等(Semple等,Nature Biotech.2010 28:172-176；以全文引用的方式并入本文中)的一个实例中，脂质体制剂由57.1％阳离子脂质、7.1％二棕榈酰磷脂酰氯、34.3％胆固醇和1.4％PEG-c-DMA构成。作为另一个实例，改变阳离子脂质的组成可以更有效地将siRNA递送到不同的抗原呈递细胞(Basha等,Mol Ther.2011 19:2186-2200；以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子(LNP)制剂中的PEG的比率可以增加或降低，和/或PEG脂质的碳链长度可以在从C14到C18经修饰以改变LNP制剂的药物动力学和/或生物分布。作为一个非限制性实例，LNP制剂可以含有1％到5％的PEG-c-DOMG与阳离子脂质、DSPC和胆固醇相比的脂质摩尔比。在另一个实施方案中，PEG-c-DOMG可以用PEG脂质置换，如但不限于PEG-DSG(1,2-二硬脂酰-sn-甘油甲氧基聚乙二醇)或PEG-DPG(1,2-二棕榈酰-sn-甘油甲氧基聚乙二醇)。阳离子脂质可以选自本领域中已知的任何脂质，如但不限于DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200和DLin-KC2-DMA。
在一个实施方案中，阳离子脂质可以选自但不限于以下各项中所描述的阳离子脂质：国际公布号WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724、WO201021865和WO2008103276、美国专利号7,893,302、7,404,969和8,283,333以及美国专利公布号US20100036115和US20120202871；各国际公布以全文引用的方式并入本文中。在另一个实施方案中，阳离子脂质可以选自但不限于国际公布号WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365和WO2012044638中所描述的式A；各国际公布以全文引用的方式并入本文中。在又一个实施方案中，阳离子脂质可以选自但不限于国际公布号WO2008103276的式CLI-CLXXIX、美国专利号7,893,302的式CLI-CLXXIX、美国专利号7,404,969的式CLI-CLXXXXII和美国专利公布号US20100036115的式I-VI；所述国际公布、美国专利和美国公布各自以全文引用的方式并入本文中。作为一个非限制性实例，阳离子脂质可以选自：(20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-9-胺、(1Z,19Z)-N5N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-8-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基二十二碳-13,16-二烯-5-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基二十一碳-12,15-二烯-4-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-6-胺、(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-7-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-10-胺、(15Ζ,18Ζ)-Ν,Ν-二甲基二十四碳-15,18-二烯-5-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-4-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-9-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-8-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-7-胺、(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-6-胺、(22Z,25Z)-N,N-二甲基三十一碳-22,25-二烯-10-胺、(21Z,24Z)-N,N-二甲基三十碳-21,24-二烯-9-胺、(18Z)-N,N-二甲基二十七碳-18-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十六碳-17-烯-9-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-7-胺、N,N-二甲基二十七碳-10-胺、(20Z,23Z)-N-乙基-N-甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺、1-[(11Z,14Z)-1-壬基二十碳-11,14-二烯-1-基]吡咯烷、(20Z)-N,N-二甲基二十七碳-20-烯-10-胺、(15Z)-N,N-二甲基二十七碳-15-烯-10-胺、(14Z)-N,N-二甲基二十九碳-14-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十九碳-17-烯-10-胺、(24Z)-N,N-二甲基三十三碳-24-烯-10-胺、(20Z)-N,N-二甲基二十九碳-20-烯-10-胺、(22Z)-N,N-二甲基三十一碳-22-烯-10-胺、(16Z)-N,N-二甲基二十五碳-16-烯-8-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十七碳-8-胺、1-[(1S,2R)-2-己基环丙基]-N,N-二甲基十九碳-10-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十九碳-10-胺、N,N-二甲基-21-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]二十一碳-10-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]十九碳-10-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十六碳-8-胺、Ν,Ν-二甲基-[(1R,2S)-2-十一基环丙基]十四碳-5-胺、N,N-二甲基-3-{7-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]庚基}十二碳-1-胺、1-[(1R,2S)-2-庚基环丙基]-Ν,Ν-二甲基十八碳-9-胺、1-[(1S,2R)-2-癸基环丙基]-N,N-二甲基十五碳-6-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十五碳-8-胺、R-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、S-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吡咯烷、(2S)-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-[(5Z)-辛-5-烯-1-基氧基]丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}氮杂环丁烷、(2S)-1-(己氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、(2S)-1-(庚氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、Ν,Ν-二甲基-1-(壬氧基)-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺；(2S)-N,N-二甲基-1-[(6Z,9Z,12Z)-十八碳-6,9,12-三烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(戊氧基)丙-2-胺、(2S)-1-(己氧基)-3-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基丙-2-胺、1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]-Ν,Ν-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(13Z,16Z)-二十二碳-13,16-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z,16Z)-二十二碳-13,16-二烯-1-基氧基]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧基]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(9Z)-十六碳-9-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2R)-N,N-二甲基-H(1-甲基辛基)氧基]-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、(2R)-1-[(3,7-二甲基辛基)氧基]-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-(辛氧基)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]辛基}氧基)丙-2-胺、N,N-二甲基-1-{[8-(2-辛基环丙基)辛基]氧基}-3-(辛氧基)丙-2-胺和(11E,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-11,20,2-三烯-10-胺，或其药学上可接受的盐或立体异构体。
在一个实施方案中，阳离子脂质可以通过本领域中已知的和/或如国际公布号WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724和WO201021865中所描述的方法来合成；所述国际公布各自以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，LNP制剂可以含有PEG-c-DOMG，脂质摩尔比为3％。在另一个实施方案中，LNP制剂可以含有PEG-c-DOMG，脂质摩尔比为1.5％。
在一个实施方案中，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)。在一个实施方案中，LNP制剂可以含有本领域中已知的阳离子脂质PEG-DMG 2000和至少一种其它组分。在另一个实施方案中，LNP制剂可以含有本领域中已知的阳离子脂质PEG-DMG 2000、DSPC和胆固醇。作为一个非限制性实例，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC和胆固醇。作为另一个非限制性实例，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC和胆固醇，其摩尔比为2:40:10:48(参见例如Geall等,Nonviral delivery of self-amplifying RNAvaccines,PNAS 2012；PMID:22908294；以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，LNP制剂可以利用国际公布号WO2011127255或WO2008103276中所描述的方法来配制，所述国际公布各自以全文引用的方式并入本文中。作为一个非限制性实例，本文中所描述的经修饰RNA可以如WO2011127255和/或WO2008103276(各自以全文引用的方式并入本文中)中所描述而囊封在LNP制剂中。作为另一个非限制性实例，本文中所描述的经修饰RNA可以如美国公布号20120207845(以全文引用的方式并入本文中)中所描述经配制而呈纳米粒子形式，以便通过肠胃外途径递送。
在一个实施方案中，本文中所描述的LNP制剂可以包含聚阳离子组合物。作为一个非限制性实例，聚阳离子组合物可以选自美国专利公布号US20050222064(以全文引用的方式并入本文中)的式1-60。在另一个实施方案中，包含聚阳离子组合物的LNP制剂可以用于体内和/或体外递送本文中所描述的经修饰的RNA。
在一个实施方案中，本文中所描述的LNP制剂可以另外包含穿透性增强分子。非限制性穿透性增强分子描述于美国专利公布号US20050222064(以全文引用的方式并入本文中)中。
在一个实施方案中，药物组合物可以用脂质体配制，如但不限于DiLa2脂质体(MarinaBiotech，Bothell，WA)、(Marina Biotech，Bothell，WA)、基于中性DOPC(1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)的脂质体(例如针对卵巢癌的siRNA递送(Landen等,Cancer Biology&Therapy 20065(12)1708-1713)；以全文引用的方式并入本文中)和经透明质酸涂布的脂质体(Quiet Therapeutics，Israel)。
纳米粒子制剂可以是包含碳水化合物载体和经修饰核酸分子(例如mmRNA)的碳水化合物纳米粒子。作为一个非限制性实例，碳水化合物载体可以包括但不限于经酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料、辛烯基琥珀酸植物糖原、植物糖原β-糊精、经酸酐修饰的植物糖原β-糊精。(参见例如国际公布号WO2012109121；以全文引用的方式并入本文中)。
可以通过用称为快速消除型脂质纳米粒子(reLNP)的生物可降解阳离子脂质置换阳离子脂质来改良脂质纳米粒子制剂。可离子化的阳离子脂质，如但不限于DLinDMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA，已经显示在血浆和组织中随时间积累，并且可能是毒性的潜在来源。快速消除型脂质的快速代谢可以使脂质纳米粒子在大鼠中的耐受性和治疗指数改良1mg/kg剂量到10mg/kg剂量的数量级。包括酶促降解的酯键可以改良阳离子组分的降解和代谢概况，同时仍维持reLNP制剂的活性。所述酯键可以内部方式位于脂质链内，或其可以末端方式位于脂质链的末端。内部酯键可以置换脂质链中的任何碳。
在一个实施方案中，内部酯键可以位于饱和碳的任一侧。reLNP的非限制性实例包括：
在一个实施方案中，可以通过递送可能包括纳米物质、聚合物和免疫原的脂质纳米粒子来引发免疫反应。(美国公布号20120189700和国际公布号WO2012099805；各自以全文引用的方式并入本文中)。所述聚合物可以囊封所述纳米物质或部分囊封所述纳米物质。所述免疫原可以是重组蛋白质、本文中所描述的经修饰的RNA。在一个实施方案中，所述脂质纳米粒子可以经过配制以用于疫苗，如但不限于针对病原体的疫苗。
脂质纳米粒子可以经过工程改造以改变粒子的表面性质，故脂质纳米粒子可以穿透粘膜屏障。粘液位于粘膜组织上，如但不限于口腔(例如颊部膜和食道膜和扁桃体组织)、眼、胃肠道(例如胃、小肠、大肠、结肠、直肠)、鼻、呼吸道(例如鼻、咽、气管和支气管膜)、生殖道(例如阴道、子宫颈和尿道膜)。大于10-200nm的纳米粒子就较高药物囊封效率和提供一系列药物的持续递送的能力而言是优选的，我们认为这些纳米粒子过大而无法快速扩散通过粘膜屏障。粘液连续地分泌、排出、丢弃或消化并再循环，故可以在数秒或几小时内从黏膜组织中去除大部分捕获的离子。已经用低分子量聚乙二醇(PEG)密集涂布的较大聚合物纳米粒子(直径200nm-500nm)扩散通过粘液仅比相同离子在水中的扩散低4到6倍(Lai等,PNAS 2007 104(5):1482-487；Lai等,Adv Drug Deliv Rev.2009 61(2):158-171；各自以全文引用的方式并入本文中)。纳米粒子的输送可以使用穿透速率和/或包括但不限于光脱色后荧光恢复(FRAP)和高分辨率多粒子追踪(MPT)等荧光显微镜检查技术来测定。作为一个非限制性实例，可以穿透粘膜屏障的组合物可以如美国专利号8,241,670(以全文引用的方式并入本文中)中所描述来制造。
经工程改造以穿透粘液的脂质纳米粒子可以包含聚合物材料(即，聚合物核心)和/或聚合物-维生素缀合物和/或三嵌段共聚物。所述聚合物材料可以包括但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚(苯乙烯)、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳酯。所述聚合物材料可以是可生物降解的和/或生物相容的。所述聚合物材料可以另外经过照射。作为一个非限制性实例，所述聚合物材料可以经γ照射(参见例如国际申请号WO201282165，以全文引用的方式并入本文中)。特定聚合物的非限制性实例包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(羟基乙酸)(PGA)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-羟基乙酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-己内酯-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-PEO-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-PPO-D,L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、聚L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟基丙酯(HPMA)、聚乙二醇、聚L-谷氨酸、聚(羟基酸)、聚酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烯(如聚乙烯和聚丙烯)、聚二醇(如聚(乙二醇)(PEG))、聚氧化烯(PEO)、聚对苯二甲酸烷二酯(如聚(对苯二甲酸乙二酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯(如聚(乙酸乙烯酯))、聚卤化乙烯(如聚(氯乙烯)(PVC))、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯、衍生化纤维素(如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素)、丙烯酸聚合物(如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)和其共聚物和混合物)、聚二氧六环酮和其共聚物、聚羟基烷酯、富马酸丙二酯、聚甲醛、泊洛沙姆、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-己内酯)和三亚甲基碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮。脂质纳米粒子可以经共聚物涂布或与共聚物缔合，如但不限于嵌段共聚物和(聚(乙二醇))-(聚(环氧丙烷))-(聚(乙二醇))三嵌段共聚物(参见例如美国公布20120121718和美国公布20100003337和美国专利号8,263,665；各自以全文引用的方式并入本文中)。所述共聚物可以是一般认为安全的(GRAS)的聚合物且所述脂质纳米粒子的形成可以用不产生新化学实体的方式。举例来说，所述脂质纳米粒子可以包含不形成新化学实体的泊洛沙姆涂布的PLGA纳米粒子，所述纳米粒子仍能够快速穿透人类粘液(Yang等,Angew.Chem.Int.Ed.2011 50:2597-2600；以全文引用的方式并入本文中)。
聚合物-维生素缀合物的维生素可以是维生素E。所述缀合物的维生素部分可以经其它合适的组分取代，如但不限于维生素A、维生素E、其它维生素、胆固醇、疏水性部分或其它表面活性剂的疏水性组分(例如固醇链、脂肪酸、烃链和氧化烯链)。
经工程改造以穿透粘液的脂质纳米粒子可以包括表面改变剂，如但不限于mmRNA、阴离子蛋白质(例如牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如阳离子表面活性剂，例如二甲基二(十八基)-溴化铵)、糖或糖衍生物(例如环糊精)、核酸、聚合物(例如肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、溶粘蛋白剂(例如N-乙酰半胱氨酸、艾蒿、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、大青、乙酰半胱氨酸、溴己胺、羧甲司坦、依普拉酮、巯乙磺酸钠、溴环已胺醇、水合蒎醇、多米奥醇、来托司坦、司替罗宁、硫普罗宁、凝溶胶蛋白、胸腺素β4链道酶α、奈替克新、厄多司坦)和各种DNA酶，包括rhDNA酶。表面改变剂可以嵌入或陷入粒子表面或安排(例如通过涂布、吸附、共价键结或其它工艺)在脂质纳米粒子表面上。(参见例如美国公布20100215580和美国公布20080166414；各自以全文引用的方式并入本文中)。
粘液穿透性脂质纳米粒子可以包含至少一种本文中所描述的mmRNA。所述mmRNA可以囊封在脂质纳米粒子中和/或安排在粒子表面上。所述mmRNA可以与脂质纳米粒子共价偶合。粘液穿透性脂质纳米粒子的制剂可以包含多种纳米粒子。此外，所述制剂可以含有可与粘液相互作用且改变周围粘液的结构和/或粘附性质从而减少粘液粘附的粒子，所述粘液粘附可以增加粘液穿透性脂质纳米粒子向粘膜组织的递送。
在一个实施方案中，经修饰的核酸分子或mmRNA配制为脂质复合物，如而不限于ATUPLEXTM系统、DACC系统、DBTC系统和得自于Silence Therapeutics(London，UnitedKingdom)的其它siRNA脂质复合物技术、得自于(Cambridge，MA)的STEMFECTTM和基于聚乙烯亚胺(PEI)或鱼精蛋白的靶向型和非靶向型核酸递送(Aleku等,Cancer Res.2008 68:9788-9798；Strumberg等,Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76-78；Santel等,Gene Ther 2006 13:1222-1234；Santel等,Gene Ther 2006 13:1360-1370；Gutbier等,Pulm Pharmacol.Ther.2010 23:334-344；Kaufmann等,Microvasc Res 201080:286-293Weide等,J Immunother.2009 32:498-507；Weide等,J Immunother.200831:180-188；Pascolo Expert Opin.Biol.Ther.4:1285-1294；Fotin-Mleczek等,2011 J.Immunother.34:1-15；Song等,Nature Biotechnol.2005,23:709-717；Peer等,Proc Natl AcadSci U S A.2007 6；104:4095-4100；deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132；全部以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，还可以构筑所述制剂或改变组合物，使得它们被动地或主动地针对体内的不同细胞类型，包括但不限于肝细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、抗原呈递细胞和白细胞(Akinc等,Mol Ther.2010 18:1357-1364；Song等,Nat Biotechnol.200523:709-717；Judge等,J Clin Invest.2009 119:661-673；Kaufmann等,Microvasc Res 201080:286-293；Santel等,Gene Ther 2006 13:1222-1234；Santel等,Gene Ther 200613:1360-1370；Gutbier等,Pulm Pharmacol.Ther.2010 23:334-344；Basha等,Mol.Ther.201119:2186-2200；Fenske和Cullis,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:25-44；Peer等,Science.2008319:627-630；Peer和Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127-1133；全部以全文引用的方式并入本文中)。被动靶向肝细胞的制剂的一个实例包括基于DLin-DMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA的脂质纳米粒子制剂，所述制剂已显示结合载脂蛋白E且促进这些制剂体内结合和吸收到肝细胞中(Akinc等,Mol Ther.2010 18:1357-1364；以全文引用的方式并入本文中)。制剂还可以通过其表面上的不同配体(其例证如但不限于叶酸、转铁蛋白、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc))的表达和抗体靶向方法而选择性地靶向(Kolhatkar等,Curr DrugDiscov Technol.2011 8:197-206；Musacchio和Torchilin,Front Biosci.2011 16:1388-1412；Yu等,Mol Membr Biol.2010 27:286-298；Patil等,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.200825:1-61；Benoit等,Biomacromolecules.2011 12:2708-2714；Zhao等,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:309-319；Akinc等,Mol Ther.2010 18:1357-1364；Srinivasan等,Methods Mol Biol.2012 820:105-116；Ben-Arie等,Methods Mol Biol.2012 757:497-507；Peer 2010 J ControlRelease.20:63-68；Peer等,Proc Natl Acad Sci U S A.2007 104:4095-4100；Kim等,MethodsMol Biol.2011 721:339-353；Subramanya等,Mol Ther.2010 18:2028-2037；Song等,NatBiotechnol.2005 23:709-717；Peer等,Science.2008 319:627-630；Peer和Lieberman,GeneTher.2011 18:1127-1133；全部以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，经修饰的核酸分子或mmRNA配制为固体脂质纳米粒子。固体脂质纳米粒子(SLN)可以是球形的，平均直径介于10到1000nm之间。SLN拥有可以溶解亲脂性分子且可以用表面活性剂和/或乳化剂加以稳定的固体脂质核心基质。在另一个实施方案中，脂质纳米粒子可以是自组装脂质-聚合物纳米粒子(参见Zhang等,ACS Nano,2008,2(8),第1696-1702页；以全文引用的方式并入本文中)。
脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子可以用于改良经修饰的核酸分子或mmRNA引导蛋白质产生的功效，因为这些制剂可能能够增加经修饰的核酸分子或mmRNA对细胞的转染；和/或增加所编码蛋白质的翻译。一个这样的实例涉及使用脂质囊封以便能够有效地全身性递送聚复合物质粒DNA(Heyes等,Mol Ther.2007 15:713-720；以全文引用的方式并入本文中)。脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子还可以用于增加经修饰的核酸分子或mmRNA的稳定性。
在一个实施方案中，本发明的经修饰的核酸分子和/或mmRNA可以经过配置以用于控制释放和/或靶向递送。如本文中所使用，“控制释放”是指药物组合物或化合物释放型态符合能实现治疗结果的特定释放模式。在一个实施方案中，经修饰的核酸分子或mmRNA可以囊封到本文中所描述的和/或本领域中已知的递送剂中以用于控制释放和/或靶向递送。如本文中所使用，术语“囊封”意指封围、环绕或包覆。在涉及本发明化合物的制剂时，囊封可以是基本上囊封、完全囊封或部分囊封。术语“基本上囊封”意指至少大于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.9％或大于99.999％的本发明药物组合物或化合物可以封围、环绕或包覆在所述递送剂内。“部分囊封”意指少于10％、10％、20％、30％、40％50％或更少的本发明药物组合物或化合物可以封围、环绕或包覆在所述递送剂内。有利的是，囊封可以通过使用荧光和/或电子显微照片测量本发明药物组合物或化合物的逸出或活性来确定。举例来说，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％的本发明药物组合物或化合物囊封在所述递送剂中。
在一个实施方案中，控制释放制剂可以包括但不限于三嵌段共聚物。作为一个非限制性实例，所述制剂可以包括两种不同类型的三嵌段共聚物(国际公布号WO2012131104和WO2012131106；各自以全文引用的方式并入本文中)。
在另一个实施方案中，经修饰的核酸分子或mmRNA可以囊封到脂质纳米粒子或快速消除型脂质纳米粒子中，且然后所述脂质纳米粒子或快速消除型脂质纳米粒子可以囊封到本文中所描述的和/或本领域中已知的聚合物、水凝胶和/或外科用密封剂中。作为一个非限制性实例，聚合物、水凝胶或外科用密封剂可以是PLGA、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、(Nanotherapeutics,Inc.，Alachua，FL)、(HalozymeTherapeutics，San Diego，CA)、如纤维蛋白原聚合物(Ethicon Inc.，Cornelia，GA)等外科用密封剂、(Baxter International,Inc，Deerfield，IL)、基于PEG的密封剂和(Baxter International,Inc，Deerfield，IL)。
在另一个实施方案中，脂质纳米粒子可以囊封到本领域中已知的可在注射到受试者体内时形成凝胶的任何聚合物中。作为一个非限制性实例，所述脂质纳米粒子可以囊封到可生物降解的聚合物基质中。
在一个实施方案中，用于控制释放和/或靶向递送的经修饰核酸分子或mmRNA制剂还可以包括至少一个控制释放涂层。控制释放涂层包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、和纤维素衍生物，如乙基纤维素水分散体和
在一个实施方案中，控制释放和/或靶向递送制剂可以包含至少一种可降解聚酯，所述可降解聚酯可以含有聚阳离子侧链。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)和其组合。在另一个实施方案中，可降解聚酯可以包括PEG缀合以便形成PEG化聚合物。
在一个实施方案中，本发明的经修饰核酸分子和/或mmRNA可以囊封在治疗性纳米粒子中。治疗性纳米粒子可以利用本文中所描述的和本领域中已知的方法来配制，如但不限于国际公布号WO2010005740、WO2010030763、WO2010005721、WO2010005723、WO2012054923、美国公布号US20110262491、US20100104645、US20100087337、US20100068285、US20110274759、US20100068286和US20120288541以及美国专利号8,206,747、8,293,276、8,318,208和8,318,211；各自以全文引用的方式并入本文中。在另一个实施方案中，治疗性聚合物纳米粒子可以利用美国公布号US20120140790(以全文引用的方式并入本文中)中所描述的方法加以鉴别。
在一个实施方案中，治疗性纳米粒子可以经过配制以用于持续释放。如本文中所使用，“持续释放”是指药物组合物或化合物在特定的时间段内符合释放速率。所述时间段可以包括但不限于数小时、数天、数周、数月和数年。作为一个非限制性实例，持续释放纳米粒子可以包含聚合物和治疗剂，如但不限于本发明的经修饰核酸分子和mmRNA(参见国际公布号2010075072和美国公布号US20100216804、US20110217377和US20120201859，各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，治疗性纳米粒子可以经过配制以具有靶特异性。作为一个非限制性实例，所述治疗性纳米粒子可以包括皮质类固醇(参见国际公布号WO2011084518，以全文引用的方式并入本文中)。在一个实施方案中，本发明的治疗性纳米粒子可以经过配制以具有癌症特异性。作为一个非限制性实例，治疗性纳米粒子可以经配制而呈国际公布号WO2008121949、WO2010005726、WO2010005725、WO2011084521和美国公布号US20100069426、US20120004293和US20100104655中所描述的纳米粒子形式，所述国际公布和美国公布各自以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，本发明的纳米粒子可以包含聚合物基质。作为一个非限制性实例，所述纳米粒子可以包含两种或更多种聚合物，如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羟基酸、聚丙基延胡索酸酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)或其组合。
在一个实施方案中，所述治疗性纳米粒子包含二嵌段共聚物。在一个实施方案中，所述二嵌段共聚物可以包括借PEG与聚合物的组合，所述聚合物为如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羟基酸、聚丙基延胡索酸酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)或其组合。
作为一个非限制性实例，所述治疗性纳米粒子包含PLGA-PEG嵌段共聚物(参见美国公布号US20120004293和美国专利号8,236,330，各自以全文引用的方式并入本文中)。在另一个非限制性实例中，所述治疗性纳米粒子是包含PEG与PLA或PEG与PLGA的二嵌段共聚物的隐形纳米粒子(参见美国专利号8,246,968，以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，所述治疗性纳米粒子可以包含多嵌段共聚物(参见例如美国专利号8,263,665和8,287,910；各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，本文中所描述的嵌段共聚物可以包括在包含非聚合物胶团和嵌段共聚物的聚离子复合物中。(参见例如美国公布号20120076836；以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，所述治疗性纳米粒子可以包含至少一种丙烯酸聚合物。丙烯酸聚合物包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸与甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯和其组合。
在一个实施方案中，所述治疗性纳米粒子可以包含至少一种本文中所描述的和/或本领域中已知的阳离子聚合物。
在一个实施方案中，所述治疗性纳米粒子可以包含至少一种含胺的聚合物，如但不限于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(酰胺-胺)树状大分子、聚(β-氨基酯)(参见例如美国专利号8,287,849；以全文引用的方式并入本文中)和其组合。
在一个实施方案中，所述治疗性纳米粒子可以包含至少一种可降解聚酯，所述可降解聚酯可以含有聚阳离子侧链。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)和其组合。在另一个实施方案中，可降解聚酯可以包括PEG缀合以便形成PEG化聚合物。
在另一个实施方案中，所述治疗性纳米粒子可以包括至少一个靶向配体的缀合。所述靶向配体可以是本领域中已知的任何配体，如但不限于单克隆抗体。(Kirpotin等,CancerRes.2006 66:6732-6740；以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，所述治疗性纳米粒子可以经配制而呈水溶液形式，所述水溶液可以用于靶向癌症(参见国际公布号WO2011084513和美国公布号US20110294717，各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，经修饰的核酸分子或mmRNA可以囊封在合成纳米载体中、与合成纳米载体键结和/或与合成纳米载体缔合。合成纳米载体包括但不限于国际公布号WO2010005740、WO2010030763、WO201213501、WO2012149252、WO2012149255、WO2012149259、WO2012149265、WO2012149268、WO2012149282、WO2012149301、WO2012149393、WO2012149405、WO2012149411和WO2012149454以及美国公布号US20110262491、US20100104645、US20100087337和US20120244222，所述国际公布和美国公布各自以全文引用的方式并入本文中。合成纳米载体可以使用本领域中已知的和/或本文中所描述的方法配制。作为一个非限制性实例，合成纳米载体可以利用国际公布号WO2010005740、WO2010030763和WO201213501以及美国公布号US20110262491、US20100104645、US20100087337和US20120244222中所描述的方法来配制，所述国际公布和美国公布各自以全文引用的方式并入本文中。在另一个实施方案中，合成纳米载体制剂可以利用国际公布号WO2011072218和美国专利号8,211,473中所描述的方法冻干，所述国际公布和美国专利各自以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，合成纳米载体可以含有反应性基团以释放本文中所描述的经修饰核酸分子和/或mmRNA(参见国际公布号WO20120952552和美国公布号US20120171229，各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，合成纳米载体可以含有免疫刺激剂以增强由递送合成纳米载体所致的免疫反应。作为一个非限制性实例，合成纳米载体可以包含Th1免疫刺激剂，所述免疫刺激剂可以增强免疫系统的基于Th1的反应(参见国际公布号WO2010123569和美国公布号US20110223201，各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，合成纳米载体可以经过配制以用于靶向释放。在一个实施方案中，合成纳米载体经过配制以便在规定pH值下和/或在所希望的时间间隔后释放经修饰的核酸分子和/或mmRNA。作为一个非限制性实例，合成的纳米粒子可以经过配制以便在24小时后和/或在pH4.5下释放经修饰的mRNA分子和/或mmRNA(参见国际公布号WO2010138193和WO2010138194以及美国公布号US20110020388和US20110027217，各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，合成纳米载体可以经过配制以用于控制和/或持续释放本文中所描述的经修饰的核酸分子和/或mmRNA。作为一个非限制性实例，用于持续释放的合成纳米载体可以利用本领域中已知的、本文中所描述的和/或如国际公布号WO2010138192和美国公布号20100303850中所描述的方法进行配制，所述国际公布和美国公布各自以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，合成纳米载体可以经过配制以用作疫苗。在一个实施方案中，合成纳米载体可以囊封至少一种经修饰的核酸分子和/或mmRNA，所述经修饰的核酸分子和/或mmRNA编码至少一种抗原。作为一个非限制性实例，合成纳米载体可以包括至少一种抗原和用于疫苗剂型的赋形剂(参见国际公布号WO2011150264和美国公布号US20110293723，各自以全文引用的方式并入本文中)。作为另一个非限制性实例，疫苗剂型可以包括至少两种含相同或不同抗原的合成纳米载体和赋形剂(参见国际公布号WO2011150249和美国公布号US20110293701，各自以全文引用的方式并入本文中)。可以利用本文中所描述的、本领域中已知的和/或国际公布号WO2011150258和美国公布号US20120027806中所描述的方法选择疫苗剂型，所述国际公布和美国公布各自以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，合成纳米载体可以包含至少一种经修饰的核酸分子和/或mmRNA，所述经修饰的核酸分子和/或mmRNA编码至少一种佐剂。在另一个实施方案中，合成纳米载体可以包含至少一种经修饰的核酸分子和/或mmRNA和佐剂。作为一个非限制性实例，包含佐剂的合成纳米载体可以利用国际公布号WO2011150240和美国公布号US20110293700中所描述的方法进行配制，所述国际公布和美国公布各自以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，合成纳米载体可以囊封至少一种经修饰的核酸分子和/或mmRNA，所述经修饰的核酸分子和/或mmRNA编码来自于病毒的肽、片段或区域。作为一个非限制性实例，合成纳米载体可以包括但不限于国际公布号WO2012024621、WO201202629、WO2012024632以及美国公布号US20120064110、US20120058153和US20120058154中所描述的纳米载体，所述国际公布和美国公布各自以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，所述纳米粒子可以经优化以用于口服施用。所述纳米粒子可以包含至少一种阳离子生物聚合物，如但不限于壳聚糖或其衍生物。作为一个非限制性实例，所述纳米粒子可以利用美国公布号20120282343中所描述的方法进行配制；所述美国公布以全文引用的方式并入本文中。
聚合物、可生物降解的纳米粒子和核-壳型纳米粒子
本发明的经修饰核酸分子和mmRNA可以使用天然的和/或合成的聚合物来配制。可以用于递送的聚合物的非限制性实例包括但不限于DYNAMIC(Arrowhead Research Corp.，Pasadena，CA)；得自于Bio(Madison，WI)和RocheMadison(Madison，WI)的制剂；PHASERXTM聚合物制剂，如而不限于SMARTT POLYMERTECHNOLOGYTM(Seattle，WA)、DMRI/DOPE、泊洛沙姆、得自于Vical(San Diego，CA)的佐剂、壳聚糖、得自于Calando Pharmaceuticals(Pasadena，CA)的环糊精、树状大分子和聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)聚合物、RONDELTM(RNAi/寡核苷酸纳米粒子递送)聚合物(Arrowhead Research Corporation，Pasadena，CA)和pH值反应性嵌段共聚物，如但不限于PHASERXTM(Seattle，WA)。
壳聚糖制剂的一个非限制性实例包括带正电的壳聚糖的核心和带负电的底物的外部部分(美国公布号20120258176；以全文引用的方式并入本文中)。壳聚糖包括但不限于N-三甲基壳聚糖、单-N-羧基甲基壳聚糖(MCC)、N-棕榈酰壳聚糖(NPCS)、EDTA-壳聚糖、低分子量壳聚糖、壳聚糖衍生物或其组合。
在一个实施方案中，本发明中所使用的聚合物已经历了加工以减少和/或抑制不需要的物质(如但不限于细菌)连接到所述聚合物的表面。所述聚合物可以利用本领域中已知的和/或描述的和/或国际公布号WO2012150467中描述的方法进行加工，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中。
PLGA制剂的一个非限制性实例包括但不限于PLGA可注射储槽(例如其是通过将PLGA溶解在66％N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中且其余为水性溶剂和亮丙瑞林而形成。注射后，PLGA和亮丙瑞林肽沉淀到皮下空间中)。
这些聚合物方法中有许多已显示在体内向细胞的细胞质中递送寡核苷酸方面的功效(综述于deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132中；以全文引用的方式并入本文中)。能在体内稳固地递送核酸，在此情况下加上小干扰RNA(siRNA)的两种聚合物方法是动态聚缀合物和基于环糊精的纳米粒子。这些递送方法中的第一种使用动态聚缀合物，并且已经显示在小鼠体内向肝细胞中有效地递送siRNA和静默内源性靶点mRNA(Rozema等,Proc Natl Acad Sci U S A.2007 104:12982-12887；以全文引用的方式并入本文中)。这种特定的方法是多组分聚合物系统，其关键特征包括膜活性聚合物，核酸(在这种情况下为siRNA)经由二硫键与所述聚合物共价偶合且其中PEG(用于电荷掩蔽)和N-乙酰半乳糖胺(用于肝细胞靶向)基团是经由pH值敏感性键连接(Rozema等,Proc Natl Acad SciU S A.2007 104:12982-12887；以全文引用的方式并入本文中)。在与肝细胞结合且进入到核内体中时，所述聚合物复合物在低pH值环境中分解，其中所述聚合物暴露其正电荷，导致siRNA从所述聚合物中进行核内体逸出和细胞质释放。通过用甘露醇基团置换N-乙酰半乳糖胺基团，显示我们可以从表达去唾液酸糖蛋白受体的肝细胞改变成靶向窦内皮细胞和库柏法细胞。另一种聚合物方法涉及使用转铁蛋白靶向的含环糊精的聚阳离子纳米粒子。这些纳米粒子已显示表达转铁蛋白受体的尤因氏肉瘤肿瘤细胞中的EWS-FLI1基因产物的靶向静默(Hu-Lieskovan等,Cancer Res.2005 65:8984-8982；以全文引用的方式并入本文中)，且在这些纳米粒子中配制的siRNA在非人类灵长类动物中耐受性良好(Heidel等,Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715-21；以全文引用的方式并入本文中)。这两种递送策略都并入了使用靶向递送和核内体逸出机制的合理方法。
聚合物制剂可以允许经修饰的核酸分子或mmRNA持续或延迟释放(例如在肌肉内或皮下注射后)。经修饰的核酸分子或mmRNA的释放型态有所改变可能导致例如所编码的蛋白质在延长的时间段内翻译。所述聚合物制剂还可以用于增加经修饰的核酸分子或mmRNA的稳定性。先前已经使用可生物降解的聚合物来保护除mmRNA以外的核酸免于降解，并且已经显示引起体内有效负载的持续释放(Rozema等,Proc Natl Acad Sci U S A.2007 104:12982-12887；Sullivan等,Expert Opin Drug Deliv.2010 7:1433-1446；Convertine等,Biomacromolecules.2010年10月1日；Chu等,Acc Chem Res.2012年1月13日；Manganiello等,Biomaterials.2012 33:2301-2309；Benoit等,Biomacromolecules.201112:2708-2714；Singha等,Nucleic Acid Ther.2011 2:133-147；deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132；Schaffert和Wagner,Gene Ther.2008 16:1131-1138；Chaturvedi等,ExpertOpin Drug Deliv.2011 8:1455-1468；Davis,Mol Pharm.2009 6:659-668；Davis,Nature 2010464:1067-1070；各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，药物组合物可以是持续释放制剂。在另一个实施方案中，持续释放制剂可以用于皮下递送。持续释放制剂可以包括但不限于PLGA微球体、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、(Nanotherapeutics,Inc.，Alachua，FL)、(Halozyme Therapeutics，San Diego，CA)、如纤维蛋白原聚合物(Ethicon Inc.，Cornelia，GA)等外科用密封剂、(Baxter International,Inc，Deerfield，IL)、基于PEG的密封剂和(Baxter International,Inc，Deerfield，IL)。
作为一个非限制性实例，经修饰的mRNA可以通过制备具有可调释放速率(例如数天和数周)的PLGA微球体且将经修饰的mRNA囊封在PLGA微球体中同时在囊封工艺期间维持经修饰mRNA的完整性而配制成PLGA微球体。EVAc是不可生物降解的生物相容的聚合物，其广泛用于临床前持续释放植入应用(例如延长释放产品Ocusert(一种用于青光眼的毛果芸香碱眼用插入物)或黄体酮节育器(一种持续释放黄体酮的子宫内装置)；经皮递送系统Testoderm、Duragesic和Selegiline；导管)。泊洛沙姆F-407 NF是聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯的亲水性非离子型表面活性剂三嵌段共聚物，其在低于5℃的温度下具有低粘度且在高于15℃的温度下形成固体凝胶。基于PEG的外科用密封剂包含两种合成的PEG组分，所述两种组分在递送装置中混合，可以在一分钟内制备，在3分钟内密封，且在30天内再吸收。和天然聚合物能够在施用部位就地胶凝。它们已经显示通过离子相互作用与蛋白质和肽治疗候选物相互作用，以提供稳定作用。
还可以通过不同的配体的表达而选择性地靶向聚合物制剂，如但不限于叶酸、转铁蛋白和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)所例证(Benoit等,Biomacromolecules.201112:2708-2714；Rozema等,Proc Natl Acad Sci U S A.2007 104:12982-12887；Davis,MolPharm.2009 6:659-668；Davis,Nature 2010 464:1067-1070；各自以全文引用的方式并入本文中)。
本发明的经修饰核酸分子和mmRNA可以与聚合物化合物一起或用聚合物化合物配制。所述聚合物可以包括至少一种聚合物，如但不限于聚乙烯、聚乙二醇(PEG)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、PEG接枝PLL、阳离子脂质聚合物、可生物降解的阳离子脂质聚合物、聚乙烯亚胺(PEI)、交联支化聚(烯亚胺)、聚胺衍生物、经修饰的泊洛沙姆、可生物降解的聚合物、可生物降解的弹性聚合物、可生物降解的嵌段共聚物、可生物降解的无规共聚物、可生物降解的聚酯共聚物、可生物降解的聚酯嵌段共聚物、可生物降解的聚酯嵌段无规共聚物、多嵌段共聚物、可生物降解的线性共聚物、聚[α-(4-氨基丁基)-L-羟基乙酸](PAGA)、可生物降解的交联阳离子多嵌段共聚物、聚碳酸酯、聚酐、聚羟基酸、聚丙基延胡索酸酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、丙烯酸聚合物、含胺的聚合物、右旋糖酐聚合物、右旋糖酐聚合物衍生物或其组合。
作为一个非限制性实例，本发明的经修饰核酸分子或mmRNA可以与如美国专利号6,177,274中所描述的PEG接枝PLL型聚合物化合物一起配制；所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。所述制剂可以用于体外转染细胞或用于体内递送经修饰的核酸分子和mmRNA。在另一个实例中，经修饰的核酸分子和mmRNA可以悬浮于含阳离子聚合物的溶液或介质、干燥药物组合物或如美国公布号20090042829和20090042825中所描述的能够干燥的溶液中；所述美国公布各自以全文引用的方式并入本文中。
作为另一个非限制性实例，本发明的经修饰核酸分子或mmRNA可以与PLGA-PEG嵌段共聚物(参见美国公布号US20120004293和美国专利号8,236,330，各自以全文引用的方式并入本文中)或PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物(参见美国专利号6,004,573，以全文引用的方式并入本文中)一起配制。作为一个非限制性实例，本发明的经修饰核酸分子或mmRNA可以跟PEG与PLA或PEG与PLGA的二嵌段共聚物一起配制(参见美国专利号8,246,968，以全文引用的方式并入本文中)。
聚胺衍生物可以用于递送核酸分子和/或mmRNA或者治疗和/或预防疾病或者包括在可植入或可注射装置中(美国公布号20100260817，以全文引用的方式并入本文中)。作为一个非限制性实例，药物组合物可以包括经修饰的核酸分子和mmRNA以及美国公布号20100260817(其内容以全文引用的方式并入本文中)中所描述的聚胺衍生物。作为一个非限制性实例，本发明的经修饰核酸或mmRNA可以使用聚酰胺聚合物递送，如但不限于包含通过组合碳水化合物叠氮化物单体与包含二炔单元的寡胺制备的1,3-偶极加成聚合物的聚合物(美国专利号8,236,280；以全文引用的方式并入本文中中)。
本发明的经修饰核酸分子和/或mmRNA可以与至少一种丙烯酸聚合物一起配制。丙烯酸聚合物包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸与甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯和其组合。
在一个实施方案中，本发明的经修饰的核酸分子和/或mmRNA可以与国际公布号WO2011115862、WO2012082574和WO2012068187以及美国公布号20120283427中所描述的至少一种聚合物和/或其衍生物一起配制，所述国际公布和美国公布各自以全文引用的方式并入本文中。在另一个实施方案中，本发明的经修饰的核酸分子或mmRNA可以与如以全文引用的方式并入本文中的WO2011115862中所描述的具有式Z的聚合物一起配制。在又一个实施方案中，经修饰的核酸分子或mmRNA可以与如国际公布号WO2012082574或WO2012068187中所描述的具有式Z、Z'或Z"的聚合物一起配制，所述国际公布各自以全文引用的方式并入本文中。与本发明的经修饰的核酸和/或经修饰的mRNA一起配制的聚合物可以利用国际公布号WO2012082574或WO2012068187中所描述的方法来合成，所述国际公布各自以全文引用的方式并入本文中。
本发明的经修饰的核酸分子和/或mmRNA的制剂可以包括至少一种含胺的聚合物，如但不限于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(酰胺-胺)树状大分子或其组合。
举例来说，本发明的经修饰的核酸分子和/或mmRNA可以用药物化合物配制，包括聚(烯亚胺)、可生物降解的阳离子脂质聚合物、可生物降解的嵌段共聚物、可生物降解的聚合物或可生物降解的无规共聚物、可生物降解的聚酯嵌段共聚物、可生物降解的聚酯聚合物、可生物降解的聚酯无规共聚物、可生物降解的线性共聚物、PAGA、可生物降解的交联阳离子多嵌段共聚物或其组合。可生物降解的阳离子脂质聚合物可以利用本领域中已知的和/或美国专利号6,696,038、美国申请号20030073619和20040142474中所描述的方法来制造，所述美国专利和所述美国申请各自以全文引用的方式并入本文中。聚(烯亚胺)可以使用本领域中已知的和/或如美国公布号20100004315中所描述的方法来制造，所述美国公布以全文引用的方式并入本文中。可生物降解的聚合物、可生物降解的嵌段共聚物、可生物降解的无规共聚物、可生物降解的聚酯嵌段共聚物、可生物降解的聚酯聚合物或可生物降解的聚酯无规共聚物可以使用本领域中已知的和/或如美国专利号6,517,869和6,267,987中所描述的方法来制造，所述美国专利的内容各自以全文引用的方式并入本文中。可生物降解的线性共聚物可以使用本领域中已知的和/或如美国专利号6,652,886中所描述的方法来制造。PAGA聚合物可以使用本领域中已知的和/或如美国专利号6,217,912中所描述的方法来制造，所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。PAGA聚合物可以与如但不限于聚L-赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、组蛋白、亲和素、鱼精蛋白、聚交酯和聚(丙交酯-乙交酯)等聚合物共聚以形成共聚物或嵌段共聚物。可生物降解的交联阳离子多嵌段共聚物可以利用本领域中已知的和/或如美国专利号8,057,821或美国公布号2012009145中所描述的方法来制造，所述美国专利和所述美国公布各自以全文引用的方式并入本文中。举例来说，多嵌段共聚物可以使用与支化聚乙烯亚胺相比具有独特模式的线性聚乙烯亚胺(LPEI)嵌段来合成。此外，组合物或药物组合物可以利用本领域中已知的、本文中所描述的或如美国公布号20100004315或美国专利号6,267,987和6,217,912中所描述的方法来制造，所述美国公布和美国专利各自以全文引用的方式并入本文中。
本发明的经修饰的核酸分子和mmRNA可以与至少一种可能含有聚阳离子侧链的可降解聚酯一起配制。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)和其组合。在另一个实施方案中，可降解聚酯可以包括PEG缀合以便形成PEG化聚合物。
本发明的经修饰的核酸分子和mmRNA可以与至少一种可交联聚酯一起配制。可交联聚酯包括本领域中已知的和美国公布号20120269761中所描述的可交联聚酯，所述美国公布以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，本文中所描述的聚合物可以与脂质末端PEG缀合。作为一个非限制性实例，PLGA可以与脂质末端PEG缀合，从而形成PLGA-DSPE-PEG。作为另一个非限制性实例，用于本发明的PEG缀合物描述于国际公布号WO2008103276中，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中。所述聚合物可以使用如但不限于美国专利号8,273,363中所描述的缀合物等配体缀合物进行缀合，所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，本文中所描述的经修饰的核酸分子和/或mmRNA可以与另一种化合物缀合。缀合物的非限制性实例描述于美国专利号7,964,578和7,833,992中，所述美国专利各自以全文引用的方式并入本文中。在另一个实施方案中，本发明的经修饰的RNA可以与如美国专利号7,964,578和7,833,992中所描述的具有式1-122的缀合物缀合，所述美国专利各自以全文引用的方式并入本文中。本文中所描述的经修饰的RNA可以与如但不限于金等金属缀合。(参见例如Giljohann等,Journ.Amer.Chem.Soc.2009 131(6):2072-2073；以全文引用的方式并入本文中)。在另一个实施方案中，本文中所描述的经修饰的核酸分子和/或mmRNA可以缀合和/或囊封在金纳米粒子中。(国际公布号WO201216269和美国公布号20120302940；各自以全文引用的方式并入本文中)。
如以全文引用的方式并入本文中的美国公布号20100004313中所描述，基因递送组合物可以包括核苷酸序列和泊洛沙姆。举例来说，本发明的经修饰的核酸和mmRNA可以用于美国公布号20100004313中所描述的含泊洛沙姆的基因递送组合物中。
在一个实施方案中，本发明的聚合物制剂可以通过使可能包括阳离子载体的所述聚合物制剂与可能跟胆固醇和聚乙二醇基团共价键结的阳离子脂质聚合物接触而加以稳定。所述聚合物制剂可以使用美国公布号20090042829中所描述的方法与阳离子脂质聚合物接触，所述美国公布以全文引用的方式并入本文中。所述阳离子载体可以包括但不限于聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-聚胺、二脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子化明胶、壳聚糖、1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵氯化物(DOTMA)、1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)、3B-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇盐酸盐)、二(十七基)酰胺基甘氨酰亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基铵溴化物(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基铵溴化物(DMRIE)、N,N-二油基-N,N-二甲基铵氯化物(DODAC)和其组合。
本发明的经修饰的核酸分子和/或mmRNA可以用一种或多种聚合物的聚复合物配制(美国公布号20120237565和20120270927；各自以全文引用的方式并入本文中)。在一个实施方案中，所述聚复合物包含两种或更多种阳离子聚合物。所述阳离子聚合物可以包含聚(乙烯亚胺)(PEI)，如线性PEI。
本发明的经修饰的核酸分子和mmRNA还可以使用聚合物、脂质和/或其它可生物降解的试剂(如但不限于磷酸钙)的组合配制为纳米粒子。组分可以组合在核-壳型、杂交式和/或逐层构造中，以允许细调纳米粒子，从而可以增强经修饰的核酸分子和mmRNA的递送(Wang等,Nat Mater.2006 5:791-796；Fuller等,Biomaterials.2008 29:1526-1532；DeKoker等,Adv Drug Deliv Rev.2011 63:748-761；Endres等,Biomaterials.2011 32:7721-7731；Su等,Mol Pharm.2011年6月6日；8(3):774-87；各自以全文引用的方式并入本文中)。作为一个非限制性实例，所述纳米粒子可以包含多种聚合物，如但不限于亲水性-疏水性聚合物(例如PEG-PLGA)、疏水性聚合物(例如PEG)和/或亲水性聚合物(国际公布号WO20120225129；以全文引用的方式并入本文中)。
可生物降解的磷酸钙纳米粒子与脂质和/或聚合物的组合已经显示能体内递送经修饰的核酸分子和mmRNA。在一个实施方案中，经脂质涂布的磷酸钙纳米粒子(还可能含有靶向配体，如茴香酰胺)可以用于递送本发明的经修饰的核酸分子和mmRNA。举例来说，为了在小鼠转移性肺模型中有效递送siRNA，使用经脂质涂布的磷酸钙纳米粒子(Li等,J Contr Rel.2010 142:416-421；Li等,J Contr Rel.2012 158:108-114；Yang等,Mol Ther.2012 20:609-615；以全文引用的方式并入本文中)。这一递送系统组合靶向纳米粒子和用于增强核内体逸出的组分磷酸钙，以便改良siRNA的递送。
在一个实施方案中，磷酸钙与PEG-聚阴离子嵌段共聚物可以用于递送经修饰的核酸分子和mmRNA(Kazikawa等,J Contr Rel.2004 97:345-356；Kazikawa等,J Contr Rel.2006111:368-370；以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，可以使用PEG-电荷转变聚合物(Pitella等,Biomaterials.201132:3106-3114)来形成纳米粒子以递送本发明的经修饰的核酸分子和mmRNA。PEG-电荷转变聚合物可以通过在酸性pH值下裂解成聚阳离子，因而增强核内体逸出来改良PEG-聚阴离子嵌段共聚物。
核-壳型纳米粒子的使用另外聚焦于阳离子交联纳米凝胶核心和各种壳体的高通量合成方法(Siegwart等,Proc Natl Acad Sci U S A.2011 108:12996-13001)。可以通过改变纳米粒子的核心和壳体组分的化学组成而精确地控制聚合物纳米粒子的复合、递送和内在化。举例来说，核-壳型纳米粒子可以在胆固醇共价连接到纳米粒子之后将siRNA有效地递送到小鼠肝细胞。
在一个实施方案中，包含中间PLGA层和含PEG的外部中性脂质层的空心脂质核心可以用于递送本发明的经修饰的核酸分子和mmRNA。作为一个非限制性实例，在携带表达荧光素酶的肿瘤的小鼠中，已经确定与常规脂质复合物相比，脂质-聚合物-脂质杂交物纳米粒子显著抑制荧光素酶表达(Shi等,Angew Chem Int Ed.2011 50:7027-7031；以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，脂质纳米粒子可以包含本文中所公开的经修饰核酸分子的核心和聚合物壳。聚合物壳可以是本文中所描述的任何聚合物且在本领域中是已知的。在另一个实施方案中，聚合物壳可以用于保护核心中的经修饰的核酸。
描述了与本发明的经修饰核酸分子一起使用的核-壳型纳米粒子，且所述核-壳型纳米粒子可以利用以全文引用的方式并入本文中中本文的美国专利号8,313,777中所描述的方法形成。
在一个实施方案中，核-壳型纳米粒子可以包含本文中所公开的经修饰核酸分子的核心和聚合物壳。聚合物壳可以是本文中所描述的任何聚合物且在本领域中是已知的。在另一个实施方案中，聚合物壳可以用于保护核心中的经修饰的核酸分子。
肽和蛋白质
本发明的经修饰的核酸分子和mmRNA可以与肽和/或蛋白质一起配制，以便增加经修饰的核酸分子或mmRNA对细胞的转染。在一个实施方案中，肽(如但不限于细胞穿透肽)和蛋白质和能够进行细胞内递送的肽可以用于递送药物制剂。可以与本发明的药物制剂一起使用的细胞穿透肽的一个非限制性实例包括与聚阳离子连接以便有助于递送到细胞内空间的细胞穿透肽序列，例如HIV衍生的TAT肽、穿膜肽、转运肽或hCT衍生的细胞穿透肽(参见例如Caron等,Mol.Ther.3(3):310-8(2001)；Langel,Cell-Penetrating Peptides:Processes and Applications(CRC Press,Boca Raton FL,2002)；El-Andaloussi等,Curr.Pharm.Des.11(28):3597-611(2003)；和Deshayes等,Cell.Mol.Life Sci.62(16):1839-49(2005)，全部以引用的方式并入本文中)。所述组合物还可以经过配制以包括细胞穿透剂，例如脂质体，所述细胞穿透剂增强所述组合物向细胞内空间的递送。本发明的经修饰的核酸分子和mmRNA可以与肽和/或蛋白质复合，如但不限于得自于Aileron Therapeutics(Cambridge，MA)和Permeon Biologics(Cambridge，MA)的肽和/或蛋白质，以便能够进行细胞内递送(Cronican等,ACS Chem.Biol.2010 5:747-752；McNaughton等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2009 106:6111-6116；Sawyer,Chem Biol Drug Des.2009 73:3-6；Verdine和Hilinski,MethodsEnzymol.2012；503:3-33；全部以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，细胞穿透多肽可以包含第一域和第二域。所述第一域可以包含增压多肽。所述第二域可以包含蛋白质结合伴侣。如本文中所使用，“蛋白质结合伴侣”包括但不限于抗体和其功能片段、支架蛋白质或肽。所述细胞穿透多肽还可以包含针对所述蛋白质结合伴侣的细胞内结合伴侣。所述细胞穿透多肽可能能够由可能引入经修饰的核酸分子或mmRNA的细胞分泌。
包括肽或蛋白质的制剂可以用于增加经修饰的核酸分子或mmRNA对细胞的转染、改变经修饰的核酸分子或mmRNA的生物分布(例如通过靶向特定的组织或细胞类型)和/或增加所编码蛋白质的翻译。(参见例如国际公布号WO2012110636；以全文引用的方式并入本文中)。
细胞
本发明的经修饰的核酸分子和mmRNA可以离体转染到细胞中，随后移植到受试者中。作为非限制性实例，所述药物组合物可以包括用于向肝脏和骨髓细胞中递送经修饰的RNA的红细胞、用于递送经修饰的核酸分子和mmRNA的呈病毒样粒子(VLP)形式的病毒体，和用于递送经修饰的RNA的电穿孔细胞，如但不限于得自于(Gaithersburg，MD)和得自于(Lyon，France)。已经记录了使用红细胞、病毒粒子和电穿孔细胞递送除mmRNA以外的有效负载(Godfrin等,Expert Opin Biol Ther.201212:127-133；Fang等,Expert Opin Biol Ther.2012 12:385-389；Hu等,Proc Natl Acad Sci U SA.2011 108:10980-10985；Lund等,Pharm Res.2010 27:400-420；Huckriede等,J LiposomeRes.2007；17:39-47；Cusi,Hum Vaccin.2006 2:1-7；de Jonge等,Gene Ther.2006 13:400-411；全部以全文引用的方式并入本文中)。经修饰的核酸分子和mmRNA可以在通过国际公布号WO2011085231和美国公布号20110171248中所描述的方法合成的合成VLP中递送，所述国际公布和美国公布各自以全文引用的方式并入本文中。
本发明的经修饰核酸分子和mmRNA的基于细胞的制剂可以用于确保细胞转染(例如用于细胞载体中)、改变经修饰的核酸分子或mmRNA的生物分布(例如通过使细胞载体靶向特定的组织或细胞类型)和/或增加所编码蛋白质的翻译。
引入细胞中
本领域中已知多种方法适合于将核酸引入到细胞中，包括病毒和非病毒介导的技术。典型的非病毒介导的技术的实例包括但不限于电穿孔、磷酸钙介导的转移、核转染、声致穿孔、热冲击、磁性转染、脂质体介导的转移、微量注射、微弹轰击介导的转移(纳米粒子)、阳离子聚合物介导的转移(DEAE-右旋糖酐、聚乙烯亚胺、聚乙二醇(PEG)等等)或细胞融合。
声致穿孔或细胞声处理技术使用声音(例如超声频率)调节细胞质膜的穿透性。声致穿孔法在本领域中是已知的并且得以教示，例如在其与美国专利公布20100196983中的细菌有关时和在其与例如美国专利公布20100009424中的其它细胞类型有关时，所述美国专利公布各自以全文引用的方式并入本文中。
电穿孔技术在本领域中也是众所周知的。在一个实施方案中，经修饰的核酸分子或mmRNA可以通过如实施例8中所描述的电穿孔来递送。
透明质酸酶
肌肉内或皮下局部注射本发明的经修饰核酸分子或mmRNA可以包括透明质酸酶，透明质酸酶催化透明质酸水解。通过催化透明质酸水解，作为间质障壁的一种成分的透明质酸酶降低了透明质酸的粘度，从而增加了组织穿透性(Frost,Expert Opin.Drug Deliv.(2007)4:427-440；以全文引用的方式并入本文中)。这可用于加速其分散和经转染细胞所产生的编码蛋白质的全身性分布。或者，透明质酸酶可以用于增加暴露于经肌肉内或皮下施用的本发明的经修饰核酸分子或mmRNA的细胞的数目。
纳米粒子模拟物
本发明的经修饰核酸分子和mmRNA可以囊封在纳米粒子模拟物内和/或吸附于纳米粒子模拟物。纳米粒子模拟物可以模拟递送功能生物体或粒子，如但不限于病原体、病毒、细菌、真菌、寄生虫、朊病毒和细胞。作为一个非限制性实例，本发明的经修饰mRNA可以囊封在非病毒粒子中，所述非病毒粒子可以模拟病毒的递送功能(参见国际公布号WO2012006376，以全文引用的方式并入本文中)。
纳米管
本发明的经修饰的核酸分子或mmRNA可以连接或以其它方式结合于至少一个纳米管，如但不限于玫瑰状纳米管、具有一对底部与一个连接件的玫瑰状纳米管、碳纳米管和/或单壁碳纳米管。经修饰的核酸分子或mmRNA可以通过力结合于纳米管，如但不限于空间力、离子力、共价力和/或其它力。
在一个实施方案中，纳米管可以向细胞中释放一种或多种经修饰的核酸分子或mmRNA。可以改变至少一个纳米管的尺寸和/或表面结构，以便控制身体内的纳米管的相互作用和/或与本文中所公开的经修饰核酸分子或mmRNA连接或结合。在一个实施方案中，可以改变与至少一个纳米管的构筑块连接的构筑块和/或官能团以调整纳米管的尺寸和/或性质。作为一个非限制性实例，可以改变纳米管的长度以阻碍纳米管通过正常血管的壁中的孔，但仍足够小以便通过肿瘤组织的血管中的较大孔。
在一个实施方案中，至少一个纳米管还可以涂布有递送增强化合物，包括聚合物，如但不限于聚乙二醇。在另一个实施方案中，至少一个纳米管和/或经修饰的mRNA可以与药学上可接受的赋形剂和/或递送媒介物混合。
在一个实施方案中，经修饰的mRNA连接和/或以其它方式结合于至少一个玫瑰状纳米管。所述玫瑰状纳米管可以利用本领域中已知的工艺和/或通过国际公布号WO2012094304中所描述的工艺来形成，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中。至少一种经修饰的mRNA可以通过如国际公布号WO2012094304中所描述的工艺连接和/或以其它方式结合于至少一个玫瑰状纳米管，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中，其中玫瑰状纳米管或形成玫瑰状纳米管模块在可以促使至少一种经修饰的mRNA连接或以其它方式结合于所述玫瑰状纳米管的条件下混合在含至少一种经修饰的mRNA的水性介质中。
在一个实施方案中，经修饰的核酸分子或mmRNA可以连接和/或以其它方式结合于至少一个碳纳米管。作为一个非限制性实例，经修饰的核酸分子或mmRNA可以结合于连接剂，且所述连接剂可以结合于碳纳米管(参见例如美国专利号8,246,995；以全文引用的方式并入本文中)。所述碳纳米管可以是单壁纳米管(参见例如美国专利号8,246,995；以全文引用的方式并入本文中)。
缀合物
本发明的经修饰核酸分子和mmRNA包括缀合物，如共价键结于载体或靶向基团或包括两个能一起产生融合蛋白的编码区的经修饰核酸分子或mmRNA(例如携带靶向基团和治疗性蛋白质或肽)。
本发明的缀合物包括天然存在的物质，如蛋白质(例如人类血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如右旋糖酐、支链淀粉、甲壳素、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸)；或脂质。所述配体还可以是重组或合成的分子，如合成聚合物，例如合成的聚氨基酸、寡核苷酸(例如适体)。聚氨基酸的实例包括聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-羟基乙酸)共聚物、二乙烯醚-顺丁烯二酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模拟聚胺、树状聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺季盐或α螺旋肽。
教示聚核苷酸缀合物(特别是RNA)的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717,5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241,5,391,723、5,416,203,5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941、6,294,664、6,320,017、6,576,752、6,783,931、6,900,297、7,037,646；所述美国专利各自以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，本发明的缀合物可以充当本发明的经修饰核酸分子和mmRNA的载体。所述缀合物可以包含阳离子聚合物，如但不限于聚胺、聚赖氨酸、聚烯亚胺和聚乙烯亚胺，其可以与聚(乙二醇)接枝。作为一个非限制性实例，所述缀合物可以类似于聚合物缀合物，且所述聚合物缀合物的合成方法描述于美国专利号6,586,524中，所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。
所述缀合物还可以包括靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如结合规定细胞类型(如肾细胞)的抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白质A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、多价甘露醇、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双磷酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模拟物或适体。
靶向基团可以是蛋白质，例如糖蛋白；或肽，例如对共配体具有特定亲和力的分子；或抗体，例如结合指定的细胞类型(如癌细胞、内皮细胞或骨细胞)的抗体。靶向基团还可以包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽物质，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、多价甘露醇、多价岩藻糖或适体。所述配体可以是例如脂多糖或p38 MAP激酶活化剂。
所述靶向基团可以是能够靶向特定受体的任何配体。实例包括但不限于叶酸、GalNAc、半乳糖、甘露醇、甘露醇-6P、适体、整合素受体配体、趋化因子受体配体、转铁蛋白、生物素、血清素受体配体、PSMA、内皮肽、GCPII、生长抑素、LDL和HDL配体。在特定的实施方案中，所述靶向基团是适体。所述适体可能未经修饰或具有本文中所公开的修饰的任何组合。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以包括化学修饰，如但不限于类似于锁核酸的修饰。
教示锁核酸(LNA)(如得自于Santaris的锁核酸)的制备的代表性美国专利包括但不限于以下各项：美国专利号6,268,490、6,670,461、6,794,499、6,998,484、7,053,207、7,084,125和7,399,845，所述美国专利各自以全文引用的方式并入本文中。
教示PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262，所述美国专利各自以引用的方式并入本文中。关于PNA化合物的其它教示内容可以在Nielsen等,Science,1991,254,1497-1500中获得。
作为本发明的特征的一些实施方案包括具有硫代磷酸酯骨架的经修饰核酸或mmRNA和具有其它经修饰骨架的寡核苷酸，且确切地说，上文参考的美国专利号5,489,677的--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚胺基)或MMI骨架]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯骨架表示为--O—P(O)2--O--CH2--]和上文参考的美国专利号5,602,240的酰胺骨架。在一些实施方案中，作为本文的特征的聚核苷酸具有上文参考的美国专利号5,034,506的吗啉基骨架结构。
2'位置上的修饰也可能有助于递送。优选地，2'位置上的修饰不位于多肽编码序列中，即，不在可翻译区中。2'位置上的修饰可以位于5'UTR、3'UTR和/或尾区中。2'位置上的修饰可以包括2'位置上的以下各项之一：H(即，2'-脱氧)；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是经取代或未经取代的C1到C10烷基或C2到C10烯基和炔基。示例性合适的修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1到约10。在其它实施方案中，经修饰的核酸或mmRNA包括2'位置上的以下各项之一：C1到C10低级烷基、经取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、经取代的硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、用于改良药物动力学性质的基团或用于改良药效学性质的基团和具有类似性质的其它取代基。在一些实施方案中，所述修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等,Helv.Chim.Acta,1995,78:486-504)，即，烷氧基-烷氧基。另一个示例性修饰为2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3)2，也称为2'-DMAOE，如以下本文实施例中所描述；和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即，2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2，也如以下本文实施例中所描述。其它修饰包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)和2'-氟(2'-F)。还可以在其它位置进行类似的修饰，特别是3'末端核苷酸上或2'-5'键结dsRNA中的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置上。本发明的聚核苷酸还可以具有糖模拟物，如代替戊呋喃糖基糖的环丁基部分。教示所述经修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920，且所述美国专利各自以引用的方式并入本文中。
在其它实施方案中，经修饰的核酸分子或mmRNA共价缀合于细胞穿透多肽。所述细胞穿透肽还可以包括信号序列。本发明的缀合物可以经设计以增加稳定性；增加细胞转染；和/或改变生物分布(例如靶向特定的组织或细胞类型)。
自组装纳米粒子
核酸自组装纳米粒子
自组装纳米粒子具有界限分明的尺寸，所述尺寸可以精确地控制，因为核酸股可以容易地再程控。举例来说，靶向癌症的纳米递送载体的最佳粒度是20-100nm，在直径大于20nm时可避免肾清除且通过增强穿透性和滞留效应来增强对某些肿瘤的递送。使用自组装核酸纳米粒子，尺寸和形状均匀的单一群体精确地控制靶向癌症的配体的空间定向和密度以便增强递送。作为一个非限制性实例，使用短DNA片段和治疗性siRNA的可程控自组装来制备寡核苷酸纳米粒子。这些纳米粒子与可控制的粒度以及靶配体位置和密度在分子上同一。DNA片段和siRNA自组装于一步反应中以产生DNA/siRNA四面体纳米粒子以便进行靶向体内递送。(Lee等,Nature Nanotechnology 2012 7:389-393；以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，本文中所公开的经修饰核酸分子和mmRNA可以配制为自组装纳米粒子。作为一个非限制性实例，核酸可以用于制造纳米粒子，所述纳米粒子可以用于本发明的经修饰核酸分子和/或mmRNA的递送系统(参见例如国际公布号WO2012125987；以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，核酸自组装纳米粒子可以包含本文中所公开的经修饰核酸分子或mmRNA的核心和聚合物壳。聚合物壳可以是本文中所描述的任何聚合物且在本领域中是已知的。在另一个实施方案中，聚合物壳可以用于保护核心中的经修饰的核酸分子和mmRNA。
基于聚合物的自组装纳米粒子
聚合物可以用于形成能自组装形成纳米粒子的薄片。这些纳米粒子可以用于递送本发明的经修饰的核酸和mmRNA。在一个实施方案中，这些自组装纳米粒子可以是由RNA发夹的长聚合物形成的微海绵，所述长聚合物在自组装形成微海绵之前形成结晶‘褶状’薄片。这些微海绵是密集包装的海绵样微粒，其可以充当有效载体并且可能能够向细胞递送货物。微海绵的直径可以为1um到300nm。所述微海绵可以与本领域中已知的其它试剂复合以形成更大的微海绵。作为一个非限制性实例，微海绵可以与用于形成可促进细胞吸收的外层的试剂复合，如聚阳离子聚乙烯亚胺(PEI)。这种复合物可以形成在高温(150℃)下保持稳定的250nm直径的粒子(Grabow和Jaegar,Nature Materials 2012,11:269-269；以全文引用的方式并入本文中)。另外，这些微海绵可能能够展现超常的防止核糖核酸酶降解的保护程度。
在另一个实施方案中，基于聚合物的自组装纳米粒子(如但不限于微海绵)可以是完全可程控的纳米粒子。可以精确地控制纳米粒子的几何形状、尺寸和化学计量以产生最佳纳米粒子用于递送货物，如但不限于经修饰的核酸分子和mmRNA。
在一个实施方案中，基于聚合物的纳米粒子可以包含本文中所公开的经修饰核酸分子和mmRNA的核心和聚合物壳。聚合物壳可以是本文中所描述的任何聚合物且在本领域中是已知的。在另一个实施方案中，聚合物壳可以用于保护核心中的经修饰的核酸分子和mmRNA。
无机纳米粒子
本发明的经修饰核酸分子或mmRNA可以配制于无机纳米粒子中(美国专利号8,257,745，以全文引用的方式并入本文中)。无机纳米粒子可以包括但不限于遇水膨胀的粘土物质。作为一个非限制性实例，无机纳米粒子可以包括由简单硅酸盐制造的合成蒙脱石粘土(参见例如美国专利号5,585,108和8,257,745，各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，无机纳米粒子可以包含本文中所公开的经修饰核酸的核心和聚合物壳。聚合物壳可以是本文中所描述的任何聚合物且在本领域中是已知的。在另一个实施方案中，聚合物壳可以用于保护核心中的经修饰的核酸。
半导体和金属纳米粒子
本发明的经修饰核酸分子或mmRNA可以配制于包含半导体或金属材料的水可分散性纳米粒子中(美国公布号20120228565；以全文引用的方式并入本文中)或形成磁性纳米粒子(美国公布号20120265001和20120283503；各自以全文引用的方式并入本文中)。水可分散性纳米粒子可以是疏水性纳米粒子或亲水性纳米粒子。
在一个实施方案中，半导体和/或金属纳米粒子可以包含本文中所公开的经修饰核酸的核心和聚合物壳。聚合物壳可以是本文中所描述的任何聚合物且在本领域中是已知的。在另一个实施方案中，聚合物壳可以用于保护核心中的经修饰的核酸。
凝胶和水凝胶
在一个实施方案中，本文中所公开的经修饰mRNA可以囊封到本领域中已知的可在注射到受试者体内时形成凝胶的任何水凝胶中。水凝胶是聚合物链的网络，所述聚合物链是亲水性的且被发现有时呈以水为分散介质的胶态凝胶形式。水凝胶是高吸附性(它们可以含有超过99％的水)天然或合成聚合物。水凝胶还由于其显著水含量而拥有非常类似于天然组织的可挠度。本文中所描述的水凝胶可以用于囊封生物相容的、可生物降解的和/或多孔的脂质纳米粒子。
作为一个非限制性实例，水凝胶可以是经适体功能化的水凝胶。适体功能化的水凝胶可以使用核酸杂交进行程控以释放一种或多种经修饰核酸分子和/或mmRNA。(Battig等,J.Am.Chem.Society.2012 134:12410-12413；以全文引用的方式并入本文中)。
作为另一个非限制性实例，水凝胶可以成形为反蛋白石。
蛋白石水凝胶展现较高膨胀比且膨胀动力学也是更快的数量级。国际公布号WO2012148684中描述了产生蛋白石水凝胶的方法和蛋白石水凝胶的描述，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中。
在又一个非限制性实例中，水凝胶可以是抗细菌的水凝胶。抗细菌的水凝胶可以包含药学上可接受的盐或有机材料，如但不限于医药级和/或医用级银盐和芦荟胶或提取物。(国际公布号WO2012151438，以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，经修饰的mRNA可以囊封在脂质纳米粒子中，然后所述脂质纳米粒子可以囊封到水凝胶中。
在一个实施方案中，本文中所公开的经修饰mRNA可以囊封到本领域中已知的任何凝胶中。作为一个非限制性实例，所述凝胶可以是氟尿嘧啶可注射凝胶或含有本领域中已知的化合物和/或药物的氟尿嘧啶可注射凝胶。作为另一个实例，经修饰的mRNA可以囊封在含有肾上腺素的氟尿嘧啶凝胶中(参见例如Smith等,Cancer Chemotherapty andPharmacology,199944(4):267-274；以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，本文中所公开的经修饰核酸分子和/或mmRNA可以囊封到纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶或纤维蛋白胶液中。在另一个实施方案中，经修饰的核酸分子和/或mmRNA可以配制在脂质纳米粒子或快速消除型脂质纳米粒子中，之后囊封到纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶或纤维蛋白胶液中。在又一个实施方案中，经修饰的核酸分子和/或mmRNA可以配制为脂质复合物，之后囊封到纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶或纤维蛋白胶液中。纤维蛋白凝胶、水凝胶和胶液包含两种组分，即，纤维蛋白原溶液和富含钙的凝血酶溶液(参见例如Spicer和Mikos,Journal of Controlled Release 2010.148:49-55；Kidd等,Journal of Controlled Release 2012.157:80-85；各自以全文引用的方式并入本文中)。可以改变纤维蛋白凝胶、水凝胶和/或胶液的组分的浓度以改变所述凝胶、水凝胶和/或胶液的特征、网络筛孔尺寸和/或降解特征，如但不限于改变纤维蛋白凝胶、水凝胶和/或胶液的释放特征。(参见例如Spicer和Mikos,Journal of Controlled Release 2010.148:49-55；Kidd等,Journal of Controlled Release 2012.157:80-85；Catelas等,Tissue Engineering2008.14:119-128；各自以全文引用的方式并入本文中)。这个特征在用于递送本文中所公开的经修饰mRNA时是有利的。(参见例如Kidd等,Journal of Controlled Release 2012.157:80-85；Catelas等,Tissue Engineering 2008.14:119-128；各自以全文引用的方式并入本文中)。
阳离子和阴离子
本文中所公开的经修饰核酸分子的制剂可以包括阳离子或阴离子。在一个实施方案中，所述制剂包括金属阳离子，如但不限于Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg+和其组合。作为一个非限制性实例，制剂可以包括聚合物和经修饰的mRNA与金属阳离子的复合物(参见例如美国专利号6,265,389和6,555,525，各自以全文引用的方式并入本文中)。
模制的纳米粒子和微粒
本文中所公开的经修饰核酸分子和/或mmRNA可以配制在纳米粒子和/或微粒中。这些纳米粒子和/或微粒可以模制成任何尺寸、形状和化学性质。作为一个实例，可以使用LIQUIDA(Morrisville，NC)的技术制造所述纳米粒子和/或微粒(参见例如国际公布号WO2007024323；以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，模制的纳米粒子可以包含本文中所公开的经修饰核酸分子和/或mmRNA的核心和聚合物壳。聚合物壳可以是本文中所描述的任何聚合物且在本领域中是已知的。在另一个实施方案中，聚合物壳可以用于保护核心中的经修饰的核酸分子和/或mmRNA。
纳米外壳(NanoJacket)和纳米脂质体
本文中所公开的经修饰核酸分子和/或mmRNA可以配制在Keystone Nano(StateCollege，PA)的纳米外壳和纳米脂质体中。纳米外壳是由体内天然存在的包括磷酸钙并且还可能包括少量硅酸盐的化合物制造。纳米外壳的尺寸可以在5到50nm范围内，并且可以用于递送亲水性和疏水性化合物，如但不限于经修饰的核酸分子和/或mmRNA。
纳米脂质体由脂质制造，如但不限于体内天然存在的脂质。纳米脂质体的尺寸可以在60-80nm范围内，并且可以用于递送亲水性和疏水性化合物，如但不限于经修饰的核酸分子和/或mmRNA。在一个方面，本文中所公开的经修饰的核酸是配制在如但不限于神经酰胺纳米脂质体等纳米脂质体中。
赋形剂
在适合于所需要的特定剂型时，药物制剂可以另外包含药学上可接受的赋形剂，如本文中所使用，所述赋形剂包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等等。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备所述组合物的技术本领域中是已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；以全文引用的方式并入本文中)。本公开的范围内可以涵盖使用常规赋形剂介质，除非达到任何常规赋形剂介质都可能与物质或其衍生物不相容的程度，如通过产生任何不合需要的生物学效应或以不利方式与药物组合物的任何其它组分相互作用。
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施方案中，赋形剂可能被批准用于人类和用于兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂可能由美国食品与药品管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂可能属于药物等级。在一些实施方案中，赋形剂可能满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
制造药物组合物时所使用的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、分散和/或成粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油剂。所述赋形剂可以任选地包括在药物制剂中。所述组合物还可以包括如可可脂和栓剂蜡等赋形剂、着色剂、涂布剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。
示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、无水淀粉、玉米淀粉、糖粉等和/或其组合。
示例性粒化剂和/或分散剂包括但不限于马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜耳豆胶、柑桔渣、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯吡咯烷酮)(交联聚维酮)、羧甲基淀粉钠(羟基乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠盐(交联羧甲基纤维素)、甲基纤维素、预胶凝淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝月桂基硫酸钠、季铵化合物等和/或其组合。
示例性表面活性剂和/或乳化剂包括但不限于天然乳化剂(例如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄芪胶、克罗珠克(chondrux)、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶态粘土(例如膨润土[硅酸铝]和[硅酸镁铝])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、三醋精单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(例如羧基聚甲烯、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合物)、角叉菜胶、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素钠、粉末纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、山梨醇酐脂肪酸酯(例如聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯聚氧乙烯山梨醇酐聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯山梨醇酐单棕榈酸酯山梨醇酐单硬脂酸酯山梨醇酐三硬脂酸酯甘油单油酸酯、山梨醇酐单油酸酯聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯单硬脂酸酯聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚甲醛硬脂酸酯和蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯醚(例如聚氧乙烯月桂基醚聚(乙烯吡咯烷酮)、二乙二醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸钠、西曲溴铵、氯化十六烷基吡啶、氯化苯甲烃铵、多库酯钠等和/或其组合。
示例性粘合剂包括但不限于淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇)；天然和合成树胶(例如阿拉伯胶、海藻酸钠、爱尔半藻提取物、盘沃胶(panwar gum)、印度树胶、依莎贝果壳粘液(mucilageof isapol husks)、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、硅酸镁铝和落叶松阿拉伯半聚乳糖(larch arabogalactan))；海藻酸盐；聚环氧乙烷；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇；等等；和其组合。
示例性防腐剂可以包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其它防腐剂。示例性抗氧化剂包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和/或亚硫酸钠。示例性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸单水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。示例性抗微生物防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、溴代硝基丙二醇、鲸蜡基三甲基溴化铵、氯化十六烷基吡啶、氯己定、氯代丁醇、氯甲酚、氯二甲苯酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、咪脲、酚、苯氧基乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞。示例性抗真菌防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。示例性醇防腐剂包括但不限于乙醇、聚乙二醇、酚、酚类化合物、双酚、氯代丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯乙醇。示例性酸性防腐剂包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其它防腐剂包括但不限于生育酚、生育酚乙酸酯、甲磺酸去铁铵(deteroxime mesylate)、鲸蜡基三甲基溴化铵、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸钠(SLS)、月桂基乙醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、 NEOLONETM、KATHONTM和/或
示例性缓冲剂包括但不限于：柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、d-葡糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、果糖酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、碱式磷酸钙、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、缓血酸胺、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇等等和/或其组合。
示例性润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、甘油山嵛酸酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠等等和其组合。
示例性油剂包括但不限于杏仁油、杏核油、鳄梨油、巴巴苏仁油、香柠檬油、黑醋栗籽油、琉璃苣油、杜松油、春黄菊油、加拿大低酸菜油、苋蒿子油、巴西棕榈蜡油、蓖麻油、肉桂油、可可脂、椰子油、鱼肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、桉树油、月见草油、鱼油、麻籽油、香叶醇油、葫芦油、葡萄籽油、榛果油、海索草油、肉豆蔻酸异丙酯油、霍霍巴油、夏威夷胡桃油、熏衣类油、熏衣草油、柠檬油、木姜子油、澳洲坚果油、锦葵油、芒果籽油、白芒花籽油、貂油、肉豆蔻油、橄榄油、橙油、大西洋胄胸鲷油、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂栗籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀香木油、山茶花油、香薄荷油、沙棘油、芝蔴油、牛油树脂、硅酮油、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、椿花油、香根草油、胡桃油和小麦胚芽油。示例性油剂包括但不限于硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、环状聚甲基硅氧烷(cyclomethicone)、癸二酸二乙酯、二甲基硅氧烷360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅酮油和/或其组合。
根据配方设计师的判断，组合物中可以存在如可可脂和栓剂蜡、着色剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂等赋形剂。
递送
考虑到药物递送科学中有可能取得的进步，本公开涵盖通过任何适当途径递送经修饰的核酸分子或mmRNA以用于治疗、制药、诊断或成像中的任一项。递送可以是裸递送或配制递送。
裸递送
本发明的经修饰核酸分子或mmRNA可以裸递送到细胞。如本文中所使用，“裸”是指递送不含促进转染的药剂的经修饰核酸分子或mmRNA。举例来说，递送到细胞的经修饰核酸分子或mmRNA可以不含修饰。可以使用本领域中已知的和本文中所描述的施用途径将裸的经修饰核酸分子或mmRNA递送到细胞。
配制递送
本发明的经修饰核酸分子或mmRNA可以使用本文中所描述的方法进行配制。所述制剂可以含有可能经修饰和/或未经修饰的经修饰核酸分子或mmRNA。所述制剂还可以包括但不限于细胞穿透剂、药学上可接受的载体、递送剂、可生物消化的或生物相容的聚合物、溶剂和持续释放递送储槽。可以使用本领域中已知的和本文中所描述的施用途径将经配制的经修饰核酸分子或mmRNA递送到细胞。
所述组合物还可以经配制以用于以本领域中的若干种方式中的任一种直接递送到器官或组织，包括但不限于直接浸泡或沐浴，经由导管，利用凝胶剂、粉末、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、洗剂和/或滴剂，通过使用如经组合物涂布或浸渍的编织材料或可生物降解的材料等底物，等等。
施用
本发明的经修饰核酸分子或mmRNA可以通过产生治疗上有效的结果的任何途径来施用。这些途径包括但不限于经肠内、经胃肠、硬膜外、口服、经皮、硬膜外、脑内(施用到大脑中)、脑室内(施用到脑室中)、经上皮(施用到皮肤上)、真皮内(施用到皮肤本身中)、皮下(皮肤下)、经鼻施用(经由鼻子)、静脉内(施用到静脉中)、动脉内(施用到动脉中)、肌肉内(施用到肌肉中)、心内(施用到心脏中)、骨内输注(输注到骨髓中)、鞘内(施用到脊椎管中)、腹膜内(输注或注射到腹膜中)、膀胱内输注、玻璃体内(经由眼睛)、阴茎海绵体注射(注射到阴茎根部)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、经皮(经由完好皮肤扩散以实现全身分布)、经粘液(经由粘膜扩散)、吹入法(鼻吸)、舌下、唇下、灌肠剂、滴眼剂(施用到结膜上)或滴耳剂。在具体的实施方案中，组合物可以呈允许其越过血脑屏障、血管屏障或其它上皮屏障的方式施用。以下描述本发明的经修饰核酸或mmRNA的非限制性施用途径。
肠胃外和注射施用
用于肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除活性成分以外，液体剂型还可以包含本领域中常用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油剂(确切地说，棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇酐脂肪酸酯和其混合物。除惰性稀释剂以外，口服组合物还可以包括佐剂，如润湿剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在有关肠胃外施用的某些实施方案中，将组合物与如醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合等增溶剂混合。
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液，可以根据已知的技术，使用合适的分散剂、润湿剂和/或悬浮剂来配制。无菌可注射制剂可以是无毒肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如1,3-丁二醇溶液。可以采用的可接受媒介物和溶剂是水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。照惯例采用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。出于这一目的，可以采用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。可使用如油酸等脂肪酸来制备可注射剂。
举例来说，可以通过经由细菌截留滤器进行过滤，和/或通过并入可以在使用前溶解或分散在无菌水或其它无菌可注射介质中的呈无菌固体组合物形式的灭菌剂对可注射制剂进行灭菌。
为了延长活性成分的效果，经常需要延缓活性成分从皮下或肌肉内注射的吸收。这可以伴随使用具有不良水溶解度的结晶或非结晶材料的液体悬浮液。药物的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率又可能取决于晶体尺寸和结晶形式。或者，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收伴随着使药物溶解或悬浮于油媒介物中。通过形成药物处于如聚丙交酯-聚乙交酯等可生物降解的聚合物中的微胶囊基质来制造可注射的储槽形式。取决于药物与聚合物的比率和所使用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储槽式可注射制剂。
直肠和阴道施用
用于直肠或阴道施用的组合物典型地为栓剂，所述栓剂可以通过将组合物与如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡等合适的无刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在环境温度下为固体，但在体温下为液体，且因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性成分。
口服施用
用于口服施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除活性成分以外，液体剂型还可以包含本领域中常用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油剂(确切地说，棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇酐脂肪酸酯和其混合物。除惰性稀释剂以外，口服组合物还可以包括佐剂，如润湿剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在肠胃外施用的某些实施方案中，将组合物与如醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合等增溶剂混合。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉末和颗粒剂。在所述固体剂型中，将活性成分与至少一种药学上可接受的惰性赋形剂(如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或填充剂或增量剂(例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸)、粘合剂(例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶)、湿润剂(例如甘油)、崩解剂(例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠)、溶液阻滞剂(例如石蜡)、吸收加速剂(例如季铵化合物)、润湿剂(例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯)、吸附剂(例如高岭土和膨润土)和润滑剂(例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠)和其混合物混合。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型可以包含缓冲剂。
局部或经皮施用
如本文中所描述，可以配制含有本发明的经修饰核酸分子或mmRNA的组合物以便局部施用。皮肤可能是递送的理想靶部位，因为它容易进入。不仅可以使基因表达局限于皮肤，从而可能避免非特异性毒性，而且可以局限于皮肤内的特定层和细胞类型。
所递送的组合物的皮肤表达部位将取决于核酸递送途径。通常考虑三种途径用于将经修饰的核酸分子或mmRNA递送到皮肤：(i)局部施用(例如用于局部/区域性治疗)；(ii)真皮内注射(例如用于局部/区域性治疗)；和(iii)全身递送(例如用于治疗影响皮肤与皮肤外区域的皮肤病)。可以利用本领域中已知的若干种不同的方法将经修饰的核酸分子或mmRNA递送到皮肤。大部分局部递送方法已经显示对DNA的递送有效，如但不限于局部施用非阳离子脂质体-DNA复合物、阳离子脂质体-DNA复合物、粒子介导的基因转染(基因枪)、穿刺介导的基因转染和病毒递送方法。在递送核酸之后，已经在许多不同的皮肤细胞类型中检测到基因产物，包括但不限于基底角化细胞、皮脂腺细胞、真皮成纤维细胞和真皮巨噬细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了多种敷料(例如伤口敷料)或绷带(例如粘性绷带)用于便利地和/或有效地进行本发明的方法。典型地，敷料或绷带可以包含足量的本文中所描述的药物组合物和/或经修饰核酸分子或mmRNA，以允许使用者对受试者进行多次治疗。
在一个实施方案中，本发明提供了经修饰的核酸分子或mmRNA组合物以便用超过一次注射进行递送。
在一个实施方案中，在局部和/或经皮施用之前，组织的至少一个区域，如皮肤，可以受可增加穿透性的装置和/或溶液处理。在一个实施方案中，所述组织可以受摩擦装置处理以增加对皮肤的穿透性(参见美国专利公布号20080275468，以全文引用的方式并入本文中)。在另一个实施方案中，所述组织可以受超声强化装置处理。超声强化装置可以包括但不限于美国公布号20040236268以及美国专利号6,491,657和6,234,990中所描述的装置；所述美国公布和美国专利各自以全文引用的方式并入本文中。增强对组织的穿透性的方法描述于美国公布号20040171980和20040236268以及美国专利号6,190,315中；所述美国公布和美国专利各自以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，可以在递送本文中所描述的经修饰mRNA的制剂之前使用装置来增加对组织的穿透性。可以利用本领域中已知的和/或美国专利号6,190,315中所描述的方法来测量对皮肤的穿透性，所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。作为一个非限制性实例，可以利用美国专利号6,190,315中所描述的药物递送方法来递送经修饰的mRNA制剂，所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。
在另一个非限制性实例中，可以在组织可能受可增加穿透性的装置处理之前、期间和/或之后用局部麻醉剂低共熔混合物(EMLA)乳膏剂处理组织。Katz等(Anesth Analg(2004)；98:371-76；以全文引用的方式并入本文中)显示，通过使用EMLA乳膏剂与低能量的组合，在利用低能量超声预处理之后最快5分钟即可见浅表皮肤镇痛作用开始。
在一个实施方案中，可以在处理组织以增加穿透性之前、期间和/或之后将增强剂应用于组织。增强剂包括但不限于运输增强剂、物理增强剂和空化增强剂。增强剂的非限制性实例描述于美国专利号6,190,315中，所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，可以在递送本文中所描述的经修饰mRNA的制剂之前使用装置来增加对组织的穿透性，所述制剂还可以含有激发免疫反应的物质。在另一个非限制性实例中，可以利用美国公布号20040171980和20040236268中所描述的方法来递送含有可激发免疫反应的物质的制剂，所述美国公布各自以全文引用的方式并入本文中。
用于局部和/或经皮施用组合物的剂型可以包括软膏、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、粉末、溶液、喷雾、吸入剂和/或贴片。总体上，在可能有需要时在无菌条件下将活性成分与药学上可接受的赋形剂和/或任何所需防腐剂和/或缓冲剂混合。
另外，本发明涵盖使用经皮贴片，所述经皮贴片经常具有向身体提供化合物的控制递送的附加优点。所述剂型可以例如通过将化合物溶解和/或分配于适当介质中来制备。或者或另外，可以通过提供速率控制膜和/或通过将化合物分散于聚合物基质和/或凝胶中来控制速率。
适合于局部施用的制剂包括但不限于液体和/或半液体制剂，如搽剂、洗剂、水包油和/或油包水乳液(如乳膏剂、软膏和/或糊剂)和/或溶液和/或悬浮液。可局部施用的制剂可以例如包含约0.1％到约10％(w/w)活性成分，但活性成分的浓度可以高达活性成分在溶剂的溶解度极限。用于局部施用的制剂还可以包含一种或多种本文中所描述的其它成分。
储槽式施用
如本文中所描述，在一些实施方案中，组合物是配制呈储槽形式以用于延长释放。总体上，特定器官或组织(“靶组织”)为施用靶。
在本发明的一些方面，经修饰的核酸分子或mmRNA在空间上滞留在靶组织内或与靶组织邻近。提供了通过使靶组织(其含有一个或多个靶细胞)与组合物在所述组合物(确切地说，所述组合物的核酸组分)基本上滞留在所述靶组织内，意指至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％的组合物滞留在所述靶组织中的条件下接触而向哺乳动物受试者的靶组织提供组合物的方法。有利的是，通过测量进入一个或多个靶细胞的组合物中所存在的核酸的量来测定滞留量。举例来说，施用于受试者的核酸中有至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％在施用后的一段时间存在于细胞内。举例来说，使用含有核糖核酸和转染试剂的水性组合物向哺乳动物受试者进行肌肉内注射，且通过测量肌肉细胞中所存在的核糖核酸的量来测定组合物的滞留量。
本发明的方面是有关通过使靶组织(含有一个或多个靶细胞)与组合物在使得所述组合物基本上滞留在所述靶组织中的条件下接触而向哺乳动物受试者的靶组织提供组合物的方法。所述组合物含有有效量的核酸分子或mmRNA，使得至少一个靶细胞中产生目的多肽。所述组合物总体上含有细胞穿透剂，但也涵盖“裸”核酸(如无细胞穿透剂或其它药剂的核酸)，和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，所述制剂包括引起有效量的核酸分子基本上滞留在含有所述细胞的靶组织中的药学上可接受的载体。
在一些情况下，组织中的细胞所产生的蛋白质的量合乎需要地有所增加。优选地，蛋白质产量的这种增加在空间上局限于靶组织内的细胞。因而，提供了增加哺乳动物受试者的组织中的目的蛋白质的产量的方法。提供了含有经修饰的核酸分子或mmRNA的组合物，其特征在于确定可在预定体积的靶组织内所含有的相当大百分比的细胞中产生目的多肽的组合物的单位量。
在另一个实施方案中，提供了用于产生含有经修饰核酸的体内储槽的组合物。举例来说，所述组合物含有可生物溶蚀的生物相容性聚合物、以可有效塑化聚合物且与其形成凝胶的量存在的溶剂，和经核糖核酸修饰的核酸。在某些实施方案中，所述组合物还包括如本文中所描述的细胞穿透剂。在其它实施方案中，所述组合物还含有触变量的触变剂，所述触变剂可与所述聚合物混合，以便有效形成触变组合物。其它组合物包括稳定剂、填充剂、螯合剂或缓冲剂。
在其它实施方案中，提供了持续释放递送储槽，如用于向患者的环境(意指器官或组织部位)施用经修饰核酸。所述储槽总体上含有经核糖核酸修饰的核酸和挠性链聚合物，其中经修饰核酸和挠性链聚合物都被包埋在交联基质蛋白的多孔基质内。通常，孔隙尺寸小于1mm，如900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、100nm或小于100nm。通常，挠性链聚合物是亲水性的。通常，挠性链聚合物的分子量为至少50kDa，如75kDa、100kDa、150kDa、200kDa、250kDa、300kDa、400kDa、500kDa或大于500kDa。通常，挠性链聚合物的持续长度比基质蛋白的持续长度短10％，如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或小于1％。通常，挠性链聚合物的电荷类似于基质蛋白的。在一些实施方案中，挠性链聚合物将交联基质蛋白的基质的有效孔隙尺寸变成能够使经工程改造的核糖核酸从基质持续扩散到包含经修饰核酸能够进入的细胞的周围组织中的尺寸。
在一些实施方案中，所述组合物包括多种不同的经修饰核酸分子或mmRNA，其中一种或多于一种经修饰的核酸分子或mmRNA编码目的多肽。任选地，所述组合物还含有细胞穿透剂以辅助所述组合物的细胞内递送。确定在预定体积的靶组织内所含有的相当大百分比的细胞中产生目的多肽所需的组合物剂量(总体上，不会在与预定体积的靶组织相邻或远离靶组织的组织中诱导目的多肽的显著产生)。继这种确定之后，将所确定的剂量直接引入哺乳动物受试者的组织中。
在一个实施方案中，本发明提供了经修饰的核酸分子或mmRNA以便用超过一次注射或利用分次剂量注射进行递送。
在一个实施方案中，可以使用小型一次性药物储存器、贴片泵或渗透泵将本发明保留在靶组织附近。贴片泵的非限制性实例包括由(Franklin Lakes，NJ)、InsuletCorporation(Bedford，MA)、SteadyMed Therapeutics(San Francisco，CA)、Medtronic(Minneapolis，MN)(例如MiniMed)、UniLife(York，PA)、Valeritas(Bridgewater，NJ)和SpringLeaf Therapeutics(Boston，MA)制造和/或出售的贴片泵。渗透泵的非限制性实例包括由(Cupertino，CA)制造的渗透泵(例如和
经肺施用
药物组合物可以呈适合于经由口腔进行经肺施用的制剂形式制备、包装和/或出售。所述制剂可以包含有包含活性成分且具有在约0.5nm到约7nm或约1nm到约6nm范围内的直径的干燥粒子。所述组合物适合呈干燥粉末形式，以便使用包含干燥粉末储存器(可以将推进剂物流导向所述干燥粉末储存器以分散粉末)和/或使用自推进溶剂/粉末分配容器的的装置，如包含溶解和/或悬浮于密封容器中的低沸点推进剂中的活性成分的装置进行施用。所述粉末包含粒子，其中以重量计至少98％的粒子具有大于0.5nm的直径，且以数目计至少95％的粒子具有小于7nm的直径。或者，以重量计至少95％的粒子具有大于1nm的直径，且以数目计至少90％的粒子具有小于6nm的直径。干燥粉末组合物可以包括如糖等固体细粉状稀释剂，且以单位剂量形式方便地提供。
低沸点推进剂总体上包括在大气压下沸点低于65℉的液体推进剂。总体上，推进剂可以构成组合物的50％到99.9％(w/w)，且活性成分可以构成组合物的0.1％到20％(w/w)。推进剂可以进一步包含其它成分，如液体非离子和/或固体阴离子表面活性剂和/或固体稀释剂(其粒度可以与包含活性成分的粒子大致相同)。
作为一个非限制性实例，本文中所描述的经修饰核酸分子或mmRNA可以利用美国专利号8,257,685中所描述的方法进行配制以用于经肺递送；所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。
所配制的用于经肺递送的药物组合物可以提供呈溶液和/或悬浮液的液滴形式的活性成分。所述制剂可以呈任选地无菌的且包含活性成分的水溶液和/或稀醇溶液和/或悬浮液的形式制备、包装和/或出售，且可以使用任何喷雾和/或雾化装置方便地施用。所述制剂还可以包含一种或多种其它成分，包括但不限于如糖精钠等调味剂、挥发性油、缓冲剂、表面活性剂和/或如羟基苯甲酸甲酯等防腐剂。由这种施用途径提供的液滴可以具有在约0.1nm到约200nm范围内的平均直径。
鼻内、经鼻和经口腔施用
本文中所描述的可用于经肺递送的制剂可用于药物组合物的鼻内递送。适合于鼻内施用的另一种制剂是包含活性成分且具有约0.2μm到500μm的平均粒度的粗粉末。所述制剂是以吸取鼻烟的方式施用，即，通过从拿在鼻子附近的粉末容器经由鼻通道快速吸入。
适合于经鼻施用的制剂可以例如包含约低至0.1％(w/w)且多达100％(w/w)的活性成分，且可以包含一种或多种本文中所描述的其它成分。药物组合物可以以适合于口腔施用的制剂形式加以制备、包装和/或出售。所述制剂可以例如呈使用常规方法制造的片剂和/或口含片形式，且可以包含例如0.1％到20％(w/w)活性成分，其余包含在口中可溶解和/或可降解的组合物和任选地存在的一种或多种本文中所描述的其它成分。或者，适合于口腔施用的制剂可以包含有包含活性成分的粉末状和/或烟雾状和/或气雾状溶液和/或悬浮液。所述粉末状、烟雾状和/或气雾状制剂在分散时可以具有在约0.1nm到约200nm范围内的平均粒度和/或液滴尺寸，且还可以包含一种或多种本文中所描述的任何其它成分。
经眼施用
药物组合物可以呈适合于经眼施用的制剂形式制备、包装和/或出售。所述制剂可以例如呈包括例如活性成分于水性或油性液体赋形剂中的0.1/1.0％(w/w)溶液和/或悬浮液的滴眼剂形式。所述滴剂还可以包含缓冲剂、盐和/或一种或多种其它的本文中所描述的任何其它成分。其它可经眼施用的可用制剂包括包含呈微晶形式和/或呈脂质体制剂形式的活性成分的制剂。本发明的范围内涵盖滴耳剂和/或滴眼剂。可以制备含有药物组合物的多层薄膜装置以便递送到眼睛和/或周围组织。
有效负载施用：可检测剂和治疗剂
本文中所描述的经修饰核酸分子或mmRNA可用于许多不同的需要向生物靶点递送物质(“有效负载”)，例如递送可检测物质以便检测靶点，或递送治疗剂的情形。检测方法可以包括但不限于体外成像和体内成像法，例如免疫组织化学术、生物发光成像(BLI)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)、电子显微术、X射线计算机断层扫描、Raman成像、光学相干断层扫描、吸收成像、热成像、荧光反射成像、荧光显微术、荧光分子断层扫描成像、核磁共振成象、X射线成像、超声波成像、光声成像、实验室测定，或需要标签化/染色/成像的任何情形。
经修饰的核酸分子或mmRNA可以经设计以便以任何有用的定向包括连接子和有效负载。在一个实施方案中，经修饰核酸分子可以在任何化学上适当的位置与有效负载(例如可检测剂或治疗剂)共价键结。举例来说，使用具有两端的连接子将一端连接于有效负载并且将另一端连接于核碱基，如在脱氮腺苷或脱氮鸟苷的C-7或C-8位置或者胞嘧啶或尿嘧啶的N-3或C-5位置。本发明的聚核苷酸可以包括超过一个有效负载(例如标记和转录抑制剂)以及可裂解连接子。
在一个实施方案中，经修饰的核苷酸是经修饰的三磷酸7-脱氮-腺苷，其中可裂解连接子的一端连接于7-脱氮-腺嘌呤的C7位置，所述连接子的另一端连接于抑制剂(例如，连接于胞苷上的核碱基的C5位置)，且标记(例如Cy5)连接于所述连接子的中心(参见例如美国专利号7,994,304的图5以及第9栏和第10栏中的化合物1，即A*无帽pCp C5 Parg，所述美国专利以引用的方式并入本文中)。在经修饰的三磷酸7-脱氮-腺苷并入编码区后，所得聚核苷酸的可裂解连接子连接于标记和抑制剂(例如聚合酶抑制剂)。在所述连接子裂解(例如在还原条件下还原具有可裂解二硫键部分的连接子)后，释放所述标记和抑制剂。本文中描述了其它连接子和有效负载(例如治疗剂、可检测标记和细胞穿透性效负载)。
以下流程12描绘了经修饰的核苷酸，其中核碱基腺嘌呤连接于7-脱氮腺嘌呤的C-7碳处的连接子。另外，流程12描绘了其中连接子和有效负载(例如可检测剂)并入到mRNA的3'端上的经修饰的核苷酸。二硫键裂解和使硫醇基1,2-加成到炔丙酯上将释放所述可检测剂。其余结构(例如，在流程12中描绘为pApC5Parg)为抑制剂。经修饰的核苷酸的结构是重要的，因为系链抑制剂会在空间上干扰聚合酶并入第二碱基的能力。因而，重要的是系链的长度足以影响第二碱基的并入且抑制剂的立体化学定向可抑制或阻止第二核苷酸和后续核苷酸进入生长中的聚核苷酸股中。
流程12
举例来说，本文中所描述的经修饰核酸分子或mmRNA可以用于再程控诱导型多潜能干细胞(iPS细胞)，所述诱导型多潜能干细胞可以直接追踪与簇中的总细胞相比经转染的细胞。在另一个实例中，可以经由连接子连接于经修饰核酸分子或mmRNA且可以荧光标记的药物可以用来体内(例如细胞内)追踪药物。其它实例包括但不限于经修饰的核酸分子或mmRNA用于向细胞中进行可逆药物递送。
本文中所描述的经修饰核酸分子或mmRNA可用于使有效负载(例如可检测剂或治疗剂)细胞内靶向特定细胞器。示例性细胞内靶可以包括但不限于晚期mRNA加工的核定位，或与含有抑制剂的mRNA连接的核定位序列(NLS)。
另外，本文中所描述的经修饰核酸分子或mmRNA可以用于向细胞或组织中(例如在活动物中)递送治疗剂。举例来说，本文中所描述的经修饰核酸或mmRNA可用于递送高极性化学治疗剂以杀死癌细胞。经由连接子连接于治疗剂的经修饰核酸分子或mmRNA可以有助于膜穿透，从而允许治疗剂进入细胞中以到达细胞内靶点。
在一个实例中，连接子连接于核糖环的2'位置和/或经修饰核酸分子或mmRNA的3'和/或5'位置上(参见例如国际公布号WO2012030683，以全文引用的方式并入本文中)。所述连接子可以是本文中所公开的、本领域中已知的和/或国际公布号WO2012030683中所公开的任何连接子，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中。
在另一个实例中，经修饰的核酸分子或mmRNA可以经由可裂解连接子连接于经修饰的核酸分子或mmRNA病毒抑制肽(VIP)。所述可裂解连接子可以将VIP和染料释放到细胞中。在另一个实例中，经修饰的核酸分子或mmRNA可以经由连接子连接到负责一些细菌毒素(如霍乱毒素、白喉毒素和百日咳毒素)的作用的ADP核糖基化物。这些毒素蛋白质是修饰人类细胞中的靶蛋白质的ADP核糖基转移酶。举例来说，霍乱毒素ADP核糖基化物G蛋白通过导致从小肠内壁分泌大量流体来修饰人类细胞，由此导致危及生命的腹泻。
在一些实施方案中，所述有效负载可以是治疗剂，如细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂或其它治疗剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括可能对细胞有害的任何药剂。实例包括但不限于紫杉酚、细胞分裂抑素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺红菌素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、类美登素(例如美登醇)(参见美国专利号5,208,020，其全文并入本文中)、CC-1065(参见美国专利号5,475,092、5,585,499、5,846,545，全部以引用的方式并入本文中)和其类似物或同源物。放射性离子包括但不限于碘(例如碘125或碘131)、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸根、钴、钇90、钐153和镨。其它治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷基化剂(例如甲氮芥、硫替派苯丁酸氮芥、CC-1065、苯丙氨酸氮芥、亚硝脲氮芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二氨铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环(例如道诺比星(先前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(先前的放线菌素)、争光霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱、长春花碱、紫杉酚和类美登素)。
在一些实施方案中，所述有效负载可以是可检测剂，如但不限于各种有机小分子、无机化合物、纳米粒子、酶或酶底物、荧光材料、发光材料(例如鲁米诺)、生物发光材料(例如荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白)、化学发光材料、放射性材料(例如18F、67Ga、81mKr、82Rb、111In、123I、133Xe、201Tl、125I、35S、14C、3H或99mTc(例如过锝酸根(锝(VII)酸根、TcO4 -))和造影剂(例如金(例如金纳米粒子)、钆(例如螯合Gd)、氧化铁(例如超顺磁氧化铁(SPIO)、单晶氧化铁纳米粒子(MION)和超小超顺磁氧化铁(USPIO))、锰螯合物(例如Mn-DPDP)、硫酸钡、碘化造影剂(碘海醇)、微泡或全氟化碳)。所述光学上可检测的标记包括例如而不限于4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸；吖啶和衍生物(例如吖啶和异硫氰酸吖啶)；5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二酰亚胺-3,5-二磺酸酯；N-(4-苯胺基-l-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；BODIPY；亮黄；香豆素和衍生物(例如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)和7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151))；花青染料；四氯四溴荧光素；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5'5"-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素；二乙烯三胺五乙酸酯；4,4'-二异硫氰酸二氢芪-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]-萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红和衍生物(例如曙红和异硫氰酸曙红)；藻红和衍生物(例如藻红B和异硫氰酸藻红)；乙锭；荧光素和衍生物(例如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2',7'-二甲氧-4'5'-二氯-6-羧基荧光素、荧光素、异硫氰酸荧光素、X-罗丹明-5-(和-6)-异硫氰酸酯(QFITC或XRITC)和荧光胺)；2-[2-[3-[[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(3-磺基丙基)-2H-苯并[e]吲哚-2-亚基]亚乙基]-2-[4-(乙氧基羰基)-1-哌嗪基]-1-环戊烯-1-基]乙烯基]-1,1-二甲基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚鎓氢氧化物与n,n-二乙基乙胺的内盐化合物(1:1)(IR144)；5-氯-2-[2-[3-[(5-氯-3-乙基-2(3H)-苯并噻唑-亚基)亚乙基]-2-(二苯基氨基)-1-环戊烯-1-基]乙烯基]-3-乙基苯并噻唑鎓高氯酸盐(IR140)；异硫氰酸孔雀绿；4-甲基伞形酮邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副蔷薇苯胺；酚红；B藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物(例如芘、丁酸芘和琥珀酰亚胺基1-芘)；丁酸量子点；活性红4(CibacronTM亮红3B-A)；罗丹明和衍生物(例如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B、磺酰氯罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、异硫氰酸罗丹明X、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(得克萨斯红)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)四甲基罗丹明和异硫氰酸四甲基若丹明(TRITC))；核黄素；玫红酸；铽螯合物衍生物；花青3(Cy3)；花青5(Cy5)；花青5.5(Cy5.5)、花青7(Cy7)；IRD 700；IRD 800；Alexa 647；La Jolta蓝；酞菁；和萘酞菁。在一些实施方案中，可检测标记可以是荧光染料，如Cy5和Cy3。
在一些实施方案中，所述可检测剂可以是在活化后变得可检测的不可检测前体(例如荧光四嗪-荧光团构筑体(例如四嗪-BODIPY FL、四嗪-俄勒冈绿488或四嗪-BODIPYTMR-X)或酶可活化的荧光剂(例如(VisEn Medical)))。可使用经酶标记的组合物的体外测定包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀测定、免疫荧光、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)和Western印迹分析。
当利用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶对化合物进行酶标记时，可以通过测定适当底物转化成产物的转化率来检测酶标记。
本公开涵盖除本文中所描述的那些标记以外的标记，包括但不限于其它光学上可检测的标记。可以使用标准化学方法将标记连接到本公开的经修饰核苷酸的任何位置，使得所述标记可以在可裂解连接子裂解后从所并入的碱基移除。
组合
核酸分子或mmRNA可以与一种或多种其它治疗剂、预防剂、诊断剂或成像剂组合使用。“与……组合”不希望暗示药剂必须同时施用和/或经配制用于一起递送，但这些递送方法在本公开的范围内。组合物可以与一种或多种其它所需要的治疗剂或医学程序同时、在其之前或之后施用。总体上，各药剂将以针对该药剂确定的剂量和/或时间表施用。在一些实施方案中，本公开涵盖药物、预防剂、诊断剂或成像组合物与可以改良其生物利用率、减少和/或调节其代谢、抑制其排泄和/或调节其在体内的分布的药剂组合递送。作为一个非限制性实例，核酸分子或mmRNA可以与用于治疗癌症或控制过度增殖细胞的药剂组合使用。在以全文引用的方式并入本文中的美国专利号7,964,571中，描述了用于治疗实体原发性或转移性肿瘤的组合疗法，所述组合疗法使用包括编码白介素-12的DNA质粒与脂质聚合物的药物组合物，而且还施用至少一种抗癌剂或化学治疗剂。此外，编码抗增殖分子的本发明核酸分子和mmRNA可以与脂质聚合物一起处于药物组合物中(参见例如以全文引用的方式并入本文中的美国公布号20110218231，其要求包含编码抗增殖分子的DNA质粒和脂质聚合物的药物组合物)，所述药物组合物可以与至少一种化学治疗剂或抗癌剂一起施用。
细胞穿透性有效负载
在一些实施方案中，并入核酸(例如RNA或mRNA)中的经修饰核苷酸和经修饰核酸分子还可以包括可以是细胞穿透部分或可增强组合物的细胞内递送的药剂的有效负载。举例来说，所述组合物可以包括但不限于促进对细胞内空间的递送的细胞穿透性肽序列，例如HIV衍生的TAT肽、穿透肽、转运子或hCT衍生的细胞穿透性肽，参见例如Caron等,(2001)Mol Ther.3(3):310-8；Langel,Cell-Penetrating Peptides:Processes and Applications(CRC Press,Boca Raton FL 2002)；El-Andaloussi等,(2005)Curr Pharm Des.11(28):3597-611；和Deshayes等,(2005)Cell Mol Life Sci.62(16):1839-49；所有文献都以引用的方式并入本文中。所述组合物还可以经配制以包括可增强组合物向细胞内空间的递送的细胞穿透剂，例如脂质体。
生物学靶
本文中所描述的并入核酸(例如RNA或mRNA)中的经修饰核苷酸和经修饰核酸分子可以用于将有效负载递送到存在或可以产生特定配体的任何生物学靶。所述配体可以共价或非共价地结合生物学靶。
生物学靶的实例包括但不限于生物聚合物，例如抗体、核酸(如RNA和DNA)、蛋白质、酶；蛋白质的实例包括但不限于酶、受体和离子通道。在一些实施方案中，所述靶可以是组织或细胞类型特异性标记物，例如特异性表达于所选组织或细胞类型上的蛋白质。在一些实施方案中，所述靶可以是受体，如但不限于质膜受体和核受体；更特定实例包括但不限于G蛋白偶合受体、细胞孔蛋白质、转运蛋白、表面表达的抗体、HLA蛋白、MHC蛋白和生长因子受体。
给药
本发明所提供的方法包括向有需要的受试者施用根据本发明的经修饰mRNA和其编码蛋白质或复合物。可以使用能有效预防、治疗、诊断疾病、病症和/或病状(例如与工作记忆损伤有关的疾病、病症和/或病状)或对其进行成像的任何量和任何施用途径向受试者施用核酸、蛋白质或复合物或其药物、成像、诊断或预防组合物。取决于受试者的物种、年龄和总体病状、疾病严重程度、特定组合物、其施用模式、其活性模式等等，所需要的准确量将因受试者而异。根据本发明的组合物典型地经配制呈易于施用和剂量均匀性的剂量单位形式。然而，应了解，本发明组合物的总日用量可以由主治医师在合理医学判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗上有效的、预防上有效的或适当的成像剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和所述病症的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或相符合的药物；和医学领域中众所周知的类似因素。
在某些实施方案中，根据本发明的组合物可以每天一次或多次以足以每天递送约0.0001mg/kg到约100mg/kg、约0.001mg/kg到约0.05mg/kg、约0.005mg/kg到约0.05mg/kg、约0.001mg/kg到约0.005mg/kg、约0.05mg/kg到约0.5mg/kg、约0.01mg/kg到约50mg/kg、约0.1mg/kg到约40mg/kg、约0.5mg/kg到约30mg/kg、约0.01mg/kg到约10mg/kg、约0.1mg/kg到约10mg/kg或约1mg/kg到约25mg/kg受试者体重的剂量水平施用，以获得所希望的治疗、诊断、预防或成像作用。可以每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天、每三天、每周、每两周、每三周或每四周递送所希望的剂量。在某些实施方案中，所希望的剂量可以使用多次施用(例如二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或更多次施用)来递送。
根据本发明，已经发现用分次剂量方案施用mmRNA可在哺乳动物受试者中产生较高蛋白质水平。如本文中所使用，“分次剂量”是将单次单位剂量或总日剂量分成两次或更多次剂量，例如单次单位剂量的两次或更多次施用。如本文中所使用，“单次单位剂量”是在一次剂量/一次/单一途径/单一接触点(即，单个施用事件)所施用的任何治疗剂的剂量。如本文中所施用，“总日剂量”是在24小时周期内给予的或处方规定的量。其可以作为单次单位剂量施用。在一个实施方案中，本发明的mmRNA是以分次剂量形式施用于受试者。mmRNA可以仅用缓冲液配置或经配制呈本文中所描述的制剂形式。
剂型
本文中所描述的药物组合物可以配制成本文中所描述的剂型，如局部、鼻内、气管内或可注射(例如静脉内、眼内、玻璃体内、肌肉内、心内、腹膜内、皮下)剂型。
液体剂型
用于肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除活性成分以外，液体剂型还可以包含本领域中常用的惰性稀释剂，包括但不限于水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油剂(确切地说，棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇酐脂肪酸酯和其混合物。在肠胃外施用的某些实施方案中，可以将组合物与如醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合等增溶剂混合。
可注射剂型
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液，可以根据已知的技术来配制且可以包括合适的分散剂、润湿剂和/或悬浮剂。无菌可注射制剂可以是无毒肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如1,3-丁二醇溶液。可以采用的可接受媒介物和溶剂包括但不限于水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。照惯例采用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。出于这一目的，可以采用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。可使用如油酸等脂肪酸来制备可注射剂。
举例来说，可以通过经由细菌截留滤器进行过滤，和/或通过并入可以在使用前溶解或分散在无菌水或其它无菌可注射介质中的呈无菌固体组合物形式的灭菌剂对可注射制剂进行灭菌。
为了延长活性成分的效果，可能需要延缓活性成分从皮下或肌肉内注射的吸收。这可以伴随使用具有不良水溶解度的结晶或非结晶材料的液体悬浮液。经修饰的mRNA的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率又可能取决于晶体尺寸和结晶形式。或者，肠胃外施用的经修饰mRNA的延迟吸收可以伴随着使经修饰mRNA溶解或悬浮于油媒介物中。通过形成经修饰mRNA在如聚丙交酯-聚乙交酯等可生物降解的聚合物中的微胶囊基质来制造可注射的储槽形式。取决于经修饰mRNA与聚合物的比率和所使用的特定聚合物的性质，可以控制经修饰mRNA的释放速率。其它可生物降解的聚合物的实例包括但不限于聚(原酸酯)和聚(酐)。可以通过将经修饰的mRNA包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储槽式可注射制剂。
经肺剂型
本文中所描述的可用于经肺递送的制剂还可以用于药物组合物的鼻内递送。适合于鼻内施用的另一种制剂可以是包含活性成分且具有约0.2μm到500μm的平均粒度的粗粉末。所述制剂可以是以吸取鼻烟的方式施用，即，通过从拿在鼻子附近的粉末容器经由鼻通道快速吸入。
适合于经鼻施用的制剂可以例如包含约至少0.1％(w/w)且多达100％(w/w)的活性成分，且可以包含一种或多种本文中所描述的其它成分。药物组合物可以呈适合于口腔施用的制剂形式制备、包装和/或出售。所述制剂可以例如呈使用常规方法制造的片剂和/或口含片形式，且可以含有例如约0.1％到20％(w/w)活性成分，其中其余可以包含在口中可溶解和/或可降解的组合物和任选地存在的一种或多种本文中所描述的其它成分。或者，适合于口腔施用的制剂可以包含有包含活性成分的粉末状和/或烟雾状和/或雾状溶液和/或悬浮液。所述粉末状、烟雾状和/或雾状制剂在分散时可以具有在约0.1nm到约200nm范围内平均粒度和/或液滴尺寸，且还可以包含一种或多种本文中所描述的任何其它成分。
药剂的配制和/或制造中的一般考虑因素可以例如在以下文献中获悉：Remington:The Science and Practice of Pharmacy第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005(以全文引用的方式并入本文中)。
包衣或壳体
可以制备具有包衣和壳体(如肠溶衣和药物配制领域中众所周知的其它包衣)的片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂等固体剂型。它们可以任选地包含遮光剂，且可以具有使得它们仅释放活性成分或优先在肠道的某一部分任选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。可以采用类似类型的固体组合物作为使用如乳糖以及高分子量聚乙二醇等等赋形剂的软填充明胶胶囊和硬填充明胶胶囊的填充剂。
药物组合物的性质
可以用一种或多种以下性质表征本文中所描述的药物组合物：
生物利用率
与缺乏如本文中所描述的递送剂的组合物相比，经修饰的核酸分子在与如本文中所描述的递送剂一起配制成组合物时可以展现生物利用率增加。如本文中所使用，术语“生物利用率”是指施用于哺乳动物的给定量的经修饰核酸分子的全身利用率。可以通过在化合物施用到哺乳动物之后测量化合物的未改变形式的曲线下面积(AUC)或最大血清或血浆浓度(Cmax)来评定生物利用率。AUC是沿纵座标(Y轴)的化合物血清或血浆浓度相对于沿横坐标(X轴)的时间绘制的曲线下面积的测定值。总体上，可以使用本领域技术人员已知的和如G.S.Banker,Modern Pharmaceutics,Drugs and the Pharmaceutical Sciences,第72卷,Marcel Dekker,New York,Inc.,1996中所描述的方法计算特定化合物的AUC，所述文献以引用的方式并入本文中。
Cmax值为向哺乳动物施用化合物后哺乳动物血清或血浆中所达到的最大化合物浓度。可以使用本领域技术人员已知的方法测量特定化合物的Cmax值。如本文中所使用的短语“增加生物利用率”或“改良药物动力学”意指当与如本文中所描述的递送剂共同施用时，与不进行所述共同使用时相比，所述哺乳动物中的第一经修饰核酸分子的全身利用率(测量为AUC、Cmax或Cmin)更大。在一些实施方案中，经修饰的核酸分子的生物利用率可以增加至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
治疗窗口
与所施用的缺乏如本文中所描述的递送剂的经修饰核酸分子组合物治疗窗口相比，经修饰的核酸分子在与如本文中所描述的递送剂一起配制成组合物时可以展现所施用的经修饰核酸分子组合物的治疗窗口有所增加。如本文中所使用，“治疗窗口”是指很可能引发治疗效果的血浆浓度范围或作用部位处的治疗活性物质的水平的范围。在一些实施方案中，经修饰的核酸分子在与如本文中所描述的递送剂一起共同施用时的治疗窗口可以增加至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
分布体积
相对于缺乏如本文中所描述的递送剂的经修饰核酸分子组合物，经修饰的核酸分子在与如本文中所描述的递送剂一起配制成组合物时可以展现有所改良的分布体积(Vdist)，例如减少或靶向。分布体积(Vdist)使体内药物的量与血液或血浆中的药物浓度相关联。如本文中所使用，术语“分布体积”是指在与血液或血浆中相同的浓度下体内所含有的药物总量所需的流体体积：Vdist等于体内药物的量/血液或血浆中的药物浓度。举例来说，对于10mg剂量和10mg/L的血浆浓度，分布体积将为1升。分布体积体现了药物存在于血管外组织中所达到的程度。较大的分布体积体现了与血浆蛋白结合相比，化合物结合组织组分的倾向。在一种临床情形下，可以使用Vdist来确定实现稳态浓度的负载体量。在一些实施方案中，经修饰的核酸分子在与如本文中所描述的递送剂一起共同施用时的分布体积可以减少至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％。
生物效应
在一个实施方案中，递送给动物的经修饰mRNA的生物效应可以通过分析动物中的蛋白质表达进行分类。蛋白质表达可以由分析从施用本发明的经修饰mRNA的哺乳动物收集的生物样品来确定。在一个实施方案中，可以优选由施用于哺乳动物的经修饰mRNA编码的至少50pg/ml表达蛋白。举例来说，对于由递送给哺乳动物的经修饰mRNA编码的蛋白质来说，50-200pg/ml蛋白质表达可以看作哺乳动物中的蛋白质的治疗有效量。
利用质谱法检测经修饰的核酸
质谱法(MS)是可以在分子转变成离子之后提供关于其结构和分子质量/浓度信息的分析技术。首先使分子电离以获得正电荷或负电荷，然后使它们穿过质量分析器，根据其质量/电荷(m/z)比到达检测器的不同区域。
使用质谱仪进行质谱法分析，所述质谱仪包括用于电离碎裂样品且产生带电分子供进一步分析用的离子源。举例来说，可以利用电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、光致电离、电子电离、快速原子轰击(FAB)/液体二次电离(LSIMS)、基质辅助激光解吸/电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子喷雾电离和粒子束电离进行样品的电离。熟练技术人员应了解，电离方法的选择可以基于欲测量的分析物、样品类型、检测器类型、正模式对比负模式的选择等来决定。
在样品已经电离之后，可以分析由此产生的带正电或带负电的离子以确定质荷比(即，m/z)。适合于测定质荷比的分析器包括四极分析器、离子阱分析器和飞行时间分析器。可以使用若干种检测模式检测离子。举例来说，可以检测所选离子(即，使用选择性离子检测模式(SIM))，或者可以使用扫描模式，例如多重反应监测(MRM)或所选反应监测(SRM)来检测离子。
液相色谱-多重反应监测(LC-MS/MRM)与肽标准物的稳定同位素标记型稀释联用已经显示是一种用于蛋白质验证的有效方法(例如Keshishian等,Mol Cell Proteomics 2009 8:2339-2349；Kuhn等,Clin Chem 2009 55:1108-1117；Lopez等,Clin Chem 2010 56:281-290；各自以全文引用的方式并入本文中)。不同于生物标记物发现研究中频繁使用的非靶向型质谱法，靶向型MS方法是聚焦于仪器对复杂混合物中的数十种到数百种所选肽的全面分析能力的基于肽序列的MS模式。通过将检测和断裂仅限于来源于目的蛋白质的那些肽，与发现模式MS方法相比，显著改良了敏感性和可再现性。这种对蛋白质的基于质谱的多重反应监测(MRM)定量方法可以显著影响经由临床样品的快速靶向型多路蛋白表达分析来发现和定量生物标记物。
在一个实施方案中，可以利用MRM-MS方法分析可能含有由本发明的至少一种经修饰mRNA编码的至少一种蛋白质的生物样品。生物样品的定量还可以包括但不限于经同位素标记的肽或蛋白质作为内标物。
根据本发明，生物样品在获自受试者后可以经历酶消化。如本文中所使用，术语“消化”意指分解成较短的肽。如本文中所使用，短语“处理样品以消化蛋白质”意指以分解样品中的蛋白质的方式处置样品。这些酶包括但不限于胰蛋白酶、胞内蛋白酶Glu-C和糜蛋白酶。在一个实施方案中，可以使用酶消化可能含有由本发明的至少一种经修饰mRNA编码的至少一种蛋白质的生物样品。
在一个实施方案中，可以使用电喷雾电离分析可能含有由本发明的经修饰mRNA编码的蛋白质的生物样品中的蛋白质。电喷雾电离(ESI)质谱(ESIMS)使用电能辅助离子从溶液中转移到气相，然后利用质谱对其进行分析。可以使用本领域中已知的方法(例如Ho等,Clin Biochem Rev.2003 24(1):3-12；以全文引用的方式并入本文中)分析样品。溶液中所含有的离子物质可以通过分散带电液滴的细喷雾、蒸发溶剂和喷射来自于带电液滴的离子以产生高度带电的液滴雾而转移到气相中。可以使用至少1、至少2、至少3或至少4个质量分析器，如但不限于四极质量分析器，来分析高度带电的液滴雾。此外，质谱法可以包括纯化步骤。作为一个非限制性实例，第一个四极可以经过设定以选择单一m/z比率，以便其可以过滤出具有不同的m/z比率的其它分子离子，由此可以消除MS分析之前的复杂而又费时的样品纯化程序。
在一个实施方案中，可以在串联ESIMS系统(例如MS/MS)中分析可能含有由本发明的经修饰mRNA编码的蛋白质的生物样品中的蛋白质。作为非限制性实例，可以使用产物扫描(或子离子扫描)、前体扫描(母离子扫描)、中性丢失或多重反应监测来分析液滴。
在一个实施方案中，可以使用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱法(MALDIMS)分析可能含有由本发明的经修饰mRNA编码的蛋白质的生物样品。MALDI提供大分子和小分子(如蛋白质)的无损汽化和电离。在MALDI分析中，首先使分析物与较大摩尔过量的基质化合物一起共结晶，所述基质化合物还可以包括但不限于吸收紫外线的弱有机酸。MALDI中所使用的基质的非限制性实例是α-氰基-4-羟基肉桂酸、3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸和2,5-二羟基苯甲酸。激光照射分析物-基质混合物可以引起基质和分析物汽化。激光引发的解吸提供了完整分析物的高离子产率，且允许在高精度下测量化合物。可以使用本领域中已知的方法(例如Lewis,Wei和Siuzdak,Encyclopedia of Analytical Chemistry2000:5880-5894；以全文引用的方式并入本文中)分析样品。作为非限制性实例，MALDI分析中所使用的质量分析器可以包括线性飞行时间(TOF)、TOF反射器或傅里叶变换质量分析器。
在一个实施方案中，可以使用干滴法形成分析物-基质混合物。将生物样品与基质混合以产生饱和基质溶液，其中基质:样品比率是约5000:1。然后允许饱和基质溶液的等分试样(约0.5-2.0μL)干燥以形成分析物-基质混合物。
在一个实施方案中，可以使用薄层法形成分析物-基质混合物。首先形成基质均匀膜，然后应用样品，且可以被基质吸附以形成分析物-基质混合物。
在一个实施方案中，可以使用厚层法形成分析物-基质混合物。利用硝基纤维素基质添加剂形成基质均匀膜。在获得均匀的硝基纤维素基质层后，应用样品且吸附到基质中以形成分析物-基质混合物。
在一个实施方案中，可以使用夹层法形成分析物-基质混合物。如同薄层法来制备基质晶体薄层，随后加入三氟乙酸水溶液、样品和基质的液滴。然后使样品吸附到基质中以形成分析物-基质混合物。
试剂盒和装置
试剂盒
本发明提供了多种试剂盒来用于方便地和/或有效地实施本发明的方法。典型地，试剂盒将包含足够数量和/或数目的组分以允许使用者对受试者进行多次治疗和/或进行多次实验。
在一个方面，本发明提供了用于蛋白质产生的试剂盒，其包含有包含可翻译区的第一经修饰核酸分子或mmRNA。所述试剂盒还可以包含包装和说明书和/或用于形成制剂组合物的递送剂。所述递送剂可以包含生理盐水、缓冲溶液、类脂质或本文中所公开的任何递送剂。
在一个方面，本发明提供了用于蛋白质产生的试剂盒，其包含有：包含可翻译区和核酸修饰的第一分离核酸，其中所述核酸可能能够避开可能引入了所述第一分离核酸的细胞的固有免疫反应；以及包装和说明书。所述试剂盒可能还包含用于形成制剂组合物的递送剂。所述递送组合物可以包含类脂质。所述类脂可以选自C12-200、98N12-5和MD1。
在一个实施方案中，缓冲溶液可以包括氯化钠、氯化钙、磷酸盐和/或EDTA。在另一个实施方案中，缓冲溶液可以包括但不限于生理盐水、含2mM钙的生理盐水、5％蔗糖、含2mM钙的5％蔗糖、5％甘露醇、含2mM钙的5％甘露醇、林格氏乳酸盐、氯化钠、含2mM钙的氯化钠和甘露糖(参见例如美国公布号20120258046；以全文引用的方式并入本文中)。在另一个实施方案中，可以使缓冲溶液沉淀或可以将其冻干。可以改变各组分的量以便能够获得一致的且可再现的较高浓度的生理盐水或简单缓冲液制剂。还可以改变所述组分以便在一段时间内和/或在各种条件下增加缓冲溶液中的经修饰核酸分子和mmRNA的稳定性。
在一个方面，本发明提供了用于蛋白质产生的试剂盒，其包含：包含可翻译区的第一分离核酸，其是以当引入靶细胞中时可有效产生所要量的由可翻译区编码的蛋白质的量提供；包含抑制核酸的第二核酸，其是以可有效地基本上抑制细胞的固有免疫反应的量提供；以及包装和说明书。
在一个方面，本发明提供了用于蛋白质产生的试剂盒，其包含有：包含可翻译区的经修饰核酸分子或mmRNA，其中所述核酸展现由细胞核酸酶所致的降解有所减少；以及包装和说明书。
在一个方面，本发明提供了用于蛋白质产生的试剂盒，其包含有：包含可翻译区和核苷修饰的第一分离核酸，其中所述核酸展现由细胞核酸酶所致的降解有所减少；以及包装和说明书。
在一个方面，本发明提供了用于蛋白质产生的试剂盒，其包含有：包含可翻译区和至少两个不同的核苷修饰的第一分离核酸，其中所述核酸展现了由细胞核酸酶所致的降解有所减少；以及包装和说明书。
在一个方面，本发明提供了用于蛋白质产生的试剂盒，其包含有：包含可翻译区和至少一个核苷修饰的第一分离核酸，其中所述核酸展现了由细胞核酸酶所致的降解有所减少；包含抑制核酸的第二核酸；以及包装和说明书。
在一些实施方案中，所述第一分离核酸包含信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，所述mRNA包含至少一个选自以下的核苷：吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。
在一些实施方案中，所述mRNA包含至少一个选自以下的核苷：5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、扎布拉林(zebularine)、5-氮杂-扎布拉林、5-甲基-扎布拉林、5-氮杂-2-硫代-扎布拉林、2-硫代-扎布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。
在一些实施方案中，所述mRNA包含至少一个选自以下的核苷：2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。
在一些实施方案中，所述mRNA包含至少一个选自以下的核苷：肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。
在另一个方面，本公开提供了用于蛋白质产生的组合物，其包含有：包含可翻译区和核苷修饰的第一分离核酸，其中所述核酸展现出由细胞核酸酶所致的降解有所减少；和适合于翻译所述第一核酸的可翻译区的哺乳动物细胞。
装置
本发明提供了将经修饰核苷和核苷酸并入编码目的蛋白质的如核糖核酸(RNA)等核酸中的装置，尤其是便携式装置。这些装置在稳定制剂中含有试剂以合成制剂中的经修饰RNA，以便可立即递送给有需要的受试者，如人类患者。所述目的蛋白质的非限制性实例包括用于伤口愈合的生长因子和/或血管生成刺激剂、用于帮助感染控制的肽抗生素和用于快速刺激对新鉴别的病毒的免疫反应的抗原。
在一些实施方案中，所述装置是独立的，且任选地能够进行无线远程访问以获得关于合成和/或分析所产生的核酸的说明书。所述装置能够机动合成至少一种核酸且优选地合成数目不受限制的不同的核酸序列。在某些实施方案中，所述装置能够由一个或少数个体运输。在其它实施方案中，所述装置经过调整以装配在桌面或工作台上。在其它实施方案中，所述装置经过调整以装进手提箱、背包或类似大小的物体中。在其它实施方案中，所述装置经过调整以装进车辆，如汽车、卡车或救护车，或军用车辆，如坦克或人员运输车中。产生编码目的蛋白质的经修饰mRNA所必需的信息存在于所述装置中所存在的计算机可读介质内。
在一些实施方案中，所述装置能够与核酸和多肽序列数据库通信(例如无线通信)。所述装置含有至少一个样品区组，用于插入一个或多个样品容器。所述样品容器能够接受呈液体或其它形式的许多材料，如模板DNA、核苷酸、酶、缓冲液和其它试剂。所述样品容器还能够通过与样品区组接触而被加热和冷却。所述样品区组总体上与具有用于至少一个样品区组的一个或多个电子控制单元的装置底座通信。样品区组优选含有加热模块，所述加热模块能够将样品容器和其内含物加热和/或冷却到介于约与高于之间的温度。所述装置底座与如电池或外部电源等电源通信。所述装置还含有用于存储和分配供RNA合成用的材料的构件。
任选地，所述样品区组含有用于分离所合成的核酸的模块。或者，所述装置含有可操作地连接到所述样品区组的分离模块。优选地，所述装置含有用于分析所合成的核酸的构件。所述分析包括序列同一性(如由杂交所显示)、不存在不需要的序列、测量所合成mRNA的完整性(如利用微流体粘度测定法与分光光度测定法组合)和经修饰RNA的浓度和/或效能(如利用分光光度测定法)。
在某些实施方案中，所述装置与用于检测获自受试者的生物材料中所存在的病原体的构件(例如IBIS PLEX-ID系统(Abbott))组合用于微生物鉴别。
适用于递送本文中所描述的真皮内药物组合物的装置包括短针装置，如美国专利4,886,499、5,190,521、5,328,483、5,527,288、4,270,537、5,015,235、5,141,496和5,417,662中所描述的装置，所述美国专利各自以全文引用的方式并入本文中。真皮内组合物可以利用限制针在皮肤中的有效穿透长度的装置施用，如PCT公布WO 99/34850(以全文引用的方式并入本文中)和其功能等效物中所描述的装置。经由液体射流注射器和/或经由可刺穿角质层且产生能到达真皮的射流的针将液体组合物递送到真皮的射流注射装置是合适的。射流注射装置描述于例如美国专利5,480,381、5,599,302、5,334,144、5,993,412、5,649,912、5,569,189、5,704,911、5,383,851、5,893,397、5,466,220、5,339,163、5,312,335、5,503,627、5,064,413、5,520,639、4,596,556、4,790,824、4,941,880、4,940,460以及PCT公布WO97/37705和WO 97/13537中；所述美国专利和PCT公布各自以全文引用的方式并入本文中。使用压缩气体使呈粉末形式的疫苗加速通过皮肤外层到达真皮的弹道式粉末/粒子递送装置是合适的。或者或另外，常规注射器可以用于真皮内施用的经典芒图氏方法。
在一些实施方案中，所述装置可以是泵或包含用于越过血脑屏障施用本发明化合物或组合物的导管。所述装置包括但不限于加压嗅觉器官递送装置、离子电渗装置、多层微流体装置等等。所述装置可以是便携的或固定的。它们可能是可植入的或在外部系到身体，或其组合。
用于施用的装置可以用于根据本文中所教示的单次、多次或分次给药方案递送本发明的经修饰核酸分子或mmRNA。以下描述这样的装置。
预期本领域中已知的用于向细胞、器官和组织进行多次施用的方法和装置与本文中作为本发明的实施方案公开的方法和组合物联合使用。这些包括例如具有多个针的方法和装置、采用例如腔管或导管的杂交装置以及利用热、电流或辐射驱动机构的装置。
根据本发明，可以利用这些多次施用装置来递送本文所预期的单次、多次或分次剂量。
Bahrami等描述了用于向实性组织递送治疗剂的方法，且教示于例如美国专利公布20110230839中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Bahrami，将针阵列并入可在所述实性组织中的任何位置沿各针的长度递送基本上等量的流体的装置中。
Kodgule等描述了用于越过生物组织递送生物材料的装置，且教示于例如美国专利公布20110172610中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Kodgule，将由一种或多种金属制造且具有约200微米到约350微米的外径和至少100微米的长度的多个空心微针并入到可递送肽、蛋白质、碳水化合物、核酸分子、脂质和其它药学活性成分或其组合的装置中。
Gunday等描述了用于向组织递送治疗剂的递送探针，且教示于例如美国专利公布20110270184中，各文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Gunday，将多个针并入到可在启动位置和停用位置之间移动所连接的胶囊剂以便经由所述针将药剂迫出胶囊剂的装置中。
Assaf描述了多次注射医学设备且教示于例如美国专利公布20110218497中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Assaf，将多个针并入到具有与一个或多个所述针连接的腔室和用于在每次注射后以医用流体连续再填充所述腔室的构件的装置中。
在一个实施方案中，经修饰的核酸分子或mmRNA是经由至少3个针皮下或肌肉内同时或在60分钟周期内施用到三个不同的、任选地相邻的部位(例如同时或在60分钟周期内施用到4、5、6、7、8、9或10个部位)。分次剂量可以使用美国专利公布号20110230839和20110218497中所描述的装置同时施用到相邻组织，各美国专利公布以全文引用的方式并入本文中。
Forsell描述了用于将物质注射到患者体内的至少部分可植入的系统，确切地说是阴茎勃起刺激系统，且教示于例如美国专利公布20110196198中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Forsell，将多个针并入到可与一个或多个外壳一起植入与患者的左右阴茎海绵体相邻处的装置中。还植入储存器和泵以经由针供应药物。
Berenson描述了用于经皮递送治疗有效量的铁的方法，且教示于例如美国专利公布20100130910中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Berenson，可以使用多个针在角质层中建立多个微通道以增强离子导入贴片上的离子铁的经皮递送。
Kodgule等描述了用于越过生物组织递送生物材料的方法，且教示于例如美国专利公布20110196308中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Kodgule，将含有治疗活性成分的多个可生物降解的微针并入到可递送蛋白质、碳水化合物、核酸分子、脂质和其它药学活性成分或其组合的装置中。
Donovan描述了包含肉毒杆菌毒素组合物的经皮贴片，且教示于例如美国专利公布20080220020中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Donovan，将多个针并入到可经由凸出皮肤角质层而不使血管破裂的所述针将肉毒杆菌毒素递送到角质层下的贴片中。
可以将可容纳约0.2到15mL液体制剂的小型一次性药物储存器或贴片泵放在皮肤上且使用小口径针(例如26到34规格)连续经皮下递送所述制剂。作为非限制性实例，贴片泵可以是具有30到34规格的针的50mm×76mm×20mm受载弹簧(BDTMMicroinfuser，Franklin Lakes NJ)、用于递送如胰岛素等药物的具有2mL储存器的41mm×62mm×17mm贴片泵Insulet Corporation Bedford，MA)，或具有0.5到10mL储存器的43-60mm直径、10mm厚贴片泵SteadyMed Therapeutics，San Francisco，CA)。此外，所述贴片泵可以是电池供电和/或可再充电的。
Toubia描述了用于向低温治疗位置施用活性剂的低温探针，且教示于例如美国专利公布20080140061中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Toubia，将多个针并入到可将活性剂接收到腔室中且将所述药剂施用到组织的探针中。
Stock等描述了用于治疗或预防炎症或促进关节健康的方法，且教示于例如美国专利公布20090155186中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Stock，将多个针并入到可施用含有信号转导调节化合物的组合物的装置中。
Kimmell等描述了多部位注射系统，且教示于例如美国专利公布20100256594中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Kimmell，将多个针并入到可经由所述针向角质层中递送药物的装置中。
Dekker等描述了用于向真皮内隔室递送干扰素的方法，且教示于例如美国专利公布20050181033中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Dekker，将出口的暴露高度介于0与1mm之间的多个针并入到可通过以介于0.3mm与2mm之间的深度递送物质来改良药物动力学和生物利用率的装置中。
Desai描述了用于向组织细胞递送基因、酶和生物剂的方法，且教示于例如美国专利公布20030073908中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Desai，将多个针并入到可插入体内且经由所述针递送药物流体的装置中。
Lee等描述了以成纤维细胞治疗心律不齐的方法，且教示于例如美国专利公布20040005295中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Lee，将多个针并入到可将成纤维细胞递送到组织的局部区域中的装置中。
Shachar等描述了使用磁控泵治疗脑肿瘤的方法，且教示于例如美国专利7,799,012(方法)和7,799,016(装置)中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Shachar，将多个针并入到可经由所述针以受控制速率推注药剂的泵中。
Versi等描述了治疗雌性哺乳动物的膀胱功能障碍的方法，且教示于例如美国专利8,029,496中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Versi，将微针阵列并入到可将治疗剂经由所述针递送到膀胱三角中的装置中。
Angel等描述了微针经皮输送装置，且教示于例如美国专利7,364,568中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Angel，将多个针并入到可经由从不同方向插入身体表面的针将物质输送到所述表面的装置中。微针经皮输送装置可以是实心微针系统或空心微针系统。作为一个非限制性实例，实心微针系统可以具有多达0.5mg容量，每cm2具有300-1500个约150-700μm高的经药物涂布的实心微针。微针可穿透角质层且在皮肤中滞留较短持续时间(例如20秒到15分钟)。在另一个实例中，空心微针系统具有多达3mL容量，每cm2使用15到20个约950μm高的微针递送液体制剂。微针可穿透皮肤以允许液体制剂从所述装置流入皮肤中。空心微针系统可以佩带1到30分钟，取决于制剂体积和粘度。
Dalton等描述了用于皮下输注的装置，且教示于例如美国专利7,150,726中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Dalton，将多个针并入到可经由所述针将流体递送到皮下组织中的装置中。
Mikszta等描述了用于经由微型插管真皮内递送疫苗和基因治疗剂的装置和方法，且教示于例如美国专利7,473,247中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Mitszta，将至少一个空心微针并入到可将疫苗递送到受试者的皮肤达到介于0.025mm与2mm之间的深度的装置中。
Pettis等描述了递送胰岛素的方法，且教示于例如美国专利7,722,595中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Pettis，将两个针并入到装置中，其中两个针实质上同时插入皮肤中，第一个针的深度小于2.5mm以向真皮内隔室递送胰岛素，而第二个针的深度大于2.5mm且小于5.0mm以向皮下隔室递送胰岛素。
Kochamba等描述了抽吸式皮肤注射递送，且教示于例如美国专利6,896,666中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Kochamba，将相对于彼此相邻的多个针并入到可将流体注射到皮层下的装置中。
Down等描述了用于经由皮肤抽取或递送物质的装置，且教示于例如美国专利6,607,513中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Down，并入到装置中的多个皮肤穿透成员具有约100微米到约2000微米的长度且为约30到50规格。
Palmer等描述了用于向皮肤递送物质的装置，且教示于例如美国专利6,537,242中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Palmer，将微针阵列并入到使用延伸组合件来增强针与皮肤的接触且提供更均匀的物质递送的装置中。
Zamoyski描述了用于局部药物递送的灌注装置，且教示于例如美国专利6,468,247中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Zamoyski，将多个皮下注射针并入到可在撤回皮下注射针时将所述皮下注射针的内含物注射到组织中的装置中。
Prausnitz等描述了通过改良微针与人类皮肤之间的相互作用来增强越过组织输送药物和生物分子的方法，且教示于例如美国专利6,743,211中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Prausnitz，将多个微针并入到能够提供刚性更大且可变形性较小的微针应用表面的装置中。
Ting等描述了用于器官内施用药剂的装置，且教示于例如美国专利6,077,251中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Ting，将具有用于增强施用的侧孔的多个针并入到通过向针腔室中延伸和从针腔室中撤回所述针将药剂从储存器迫入所述针中且将所述药剂注射到靶器官中的装置中。
Brown描述了多针夹持器和皮下多通道输注口，且教示于例如美国专利4,695,273中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Brown，将针夹持器上的多个针经由输注口的隔膜插入且与所述输注口中的孤立腔室连通。
Horn描述了双针皮下注射器，且教示于例如美国专利3,552,394中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Horn，并入到所述装置中的两个针间隔小于68mm，且可以具有不同的类型和长度，因而能够注射到不同的深度。
Hershberg描述了具有多个针和多个流体隔室的注射器，且教示于例如美国专利3,572,336中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Hershberg，将多个针并入到具有多个流体隔室且能够同时施用不能过混合以供一次注射用的不相容药物的注射器中。
Eliscu等描述了用于真皮内注射流体的外科用仪器，且教示于例如美国专利2,588,623中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Eliscu，将多个针并入到以更广泛分散度经真皮内注射流体的仪器中。
Hung描述了用于向多个乳腺管同时递送物质的设备，且教示于例如EP 1818017中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Hung，将多个腔管并入到可经由导管网络的孔口插入且向导管网络递送流体的装置中。
Tkebuchava描述了用于向心脏或其它器官的组织中引入药物的导管，且教示于例如WO2006138109中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Tkebuchava，并入两个弯针，所述弯针进入呈平坦轨道形式的器官壁。
Mckay等描述了用于递送药剂的装置，且教示于例如WO2006118804中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Mckay，将多个针(各针上具有多个孔口)并入到可促进对组织(如脊椎间盘的内部盘空间)的区域性递送的装置中。
Pettis描述了用于将免疫调节物质直接递送到哺乳动物皮肤内的真皮内空间中的方法，且教示于例如WO2004020014中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Pettis，将多个针并入到可经由所述针将物质递送到介于0.3mm与2mm之间的深度的装置中。
Pettis等描述了用于将物质施用到皮肤中的至少两个隔室中以实现全身吸收和改良药物动力学的方法和装置，且教示于例如WO2003094995中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Pettis，将长度介于约300μm与约5mm之间的多个针并入到可同时向真皮内和皮下组织隔室中递送的装置中。
Zimmerman等描述了具有针和卷筒的药物递送装置，且教示于例如WO2012006259中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Zimmerman，将位于卷筒中的多个空心针并入到可在卷筒旋转时经由针递送储存器中的内含物的装置中。
如支架等药物递送装置在本领域中是已知的且教示于例如美国公布号US20060020329、US20040172127和US20100161032中，所述美国公布的内容以全文引用的方式并入本文中。本文中所描述的经修饰核酸分子和mmRNA的制剂可以使用支架递送。另外，本文中所使用的支架可能能够以相同或不同的递送速率递送多种经修饰核酸分子和/或制剂。支架制造商的非限制性实例包括(Miami，FL)Boston Scientific Corporation(Natick，MA)Medtronic(Minneapolis，MN)和Abbott(Abbott Park，IL)
Ingber等描述了描述本领域中已知的器官、组织和/或其部分的离体系统的方法和装置，且教示于例如国际公布号WO2012166903中；所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Ingber，在一个实施方案中，可以通过在欲移植细胞的受试者中植入装置、取出植入装置和所述装置中的组织、和向所述组织提供灌注流体来离体维持组织。在另一个实施方案中，可以将从受试者取出的组织植入第二受试者中。
利用导管和/或腔管的方法和装置
使用导管和腔管的方法和装置可以用于按照单次、多次或分次给药方案来施用本发明的mmRNA。以下描述这样的方法和装置。
Jacoby等描述了基于导管递送骨骼肌成肌细胞到受损心脏的心肌，且教示于例如美国专利公布20060263338中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Jacoby，将多个针并入到至少一部分被插入血管中且经由所述针递送细胞组合物到受试者心脏的局部区域中的装置中。
Deem等描述了使用神经毒素治疗哮喘的设备，且教示于例如美国专利公布20060225742中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Deem，将多个针并入到可经由所述针将神经毒素递送到支气管组织中的装置中。
Nayak描述了用于施用多组分疗法的方法，且教示于例如美国专利7,699,803中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Nayak，可以将多个注射套管并入到装置中，其中可以包括深度槽以便控制治疗物质在组织内的递送深度。
McIntyre等描述了用于切出通道且递送至少一种治疗剂到所希望的组织区域的外科用装置，且教示于例如美国专利8,012,096中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据McIntyre，将多个针并入到可分配治疗剂到通道周围的组织区域中且特别适于经心肌血管重建手术的装置中。
Versi等描述了治疗雌性哺乳动物的膀胱功能障碍的方法，且教示于例如美国专利8,029,496中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Versi，将微针阵列并入到可将治疗剂经由所述针直接递送到膀胱三角中的装置中。
Yeshurun等描述了用于递送流体到挠性生物屏障中的装置和方法，且教示于例如美国专利7,998,119(装置)和8,007,466(方法)中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Yeshurun，所述装置上的微针可穿透并延伸到所述挠性生物屏障中且经由空心微针的孔口注射流体。
Bonner等描述了用于经心外膜注射物质到具有心外膜表面且安置在躯干内的心脏组织的一个区域中的方法，且教示于例如美国专利7,628,780中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Bonner，所述装置具有细长轴和远端注射头以便驱动针进入组织中且经由针将药剂注射到组织中。
Nielsen等描述了用于密封刺痕的装置，且教示于例如美国专利7,972,358中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Nielsen，将多个针并入到可递送闭合剂到穿刺道周围的组织中的装置中。
Chiu等描述了用于肌生成和血管生成的方法，且教示于例如美国专利6,551,338中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Chiu，将最大直径为至少1.25mm且长度可有效提供6到20mm穿刺深度的5到15个针并入到可插入心肌附近且经由至少一些所述针中的导管向所述心肌供应外源性血管生成因子或肌生成因子的装置中。
Bolmsj等描述了用于治疗前列腺组织的方法，且教示于例如美国专利6,524,270中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Bolmsj，包括可经由尿道插入的导管的装置具有至少一个可延伸到周围前列腺组织中的空心尖端。经由所述尖端将收敛剂和止痛药施用到所述前列腺组织中。
Findlay等描述了用于向骨内部位输注流体的方法，且教示于例如美国专利6,761,726中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Findlay，将多个针并入到能够穿透被一层软材料覆盖的材料硬壳且递送流体到达所述材料硬壳下的预定距离的装置中。
Vigil等描述了用于注射药物到血管壁中的装置，且教示于例如美国专利5,713,863中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Vigil，将多个注射器安装在所述装置中的各挠性管上，所述装置经由多腔管导管将药物流体引入到所述挠性管中和所述注射器外以便输注到血管壁中。
Faxon等描述了用于递送治疗剂和/或诊断剂到躯体通道周围的组织的导管，且教示于例如美国专利5,464,395中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Faxon，将至少一个针套管并入到可经由所述针递送所需要的药剂到所述组织的导管中，所述针凸出在所述导管外。
Orr描述了用于递送治疗剂的气囊导管，且教示于例如WO2010024871中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Orr，将多个针并入到可递送治疗剂到组织内的不同深度的装置中。在另一个方面，可以使用药物洗脱气囊来递送本文中所描述的制剂。所述药物洗脱气囊可以用于靶病变应用，如但不限于支架内再狭窄、治疗扭曲血管病变、分叉病变、股骨/腘病变和膝下病变。
Perry等描述了用于递送治疗剂(例如经修饰的核酸分子或mmRNA)到布置在腔管周围的组织的装置，且教示于例如美国专利公布US20100125239中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Perry，导管具有气囊，所述气囊可以利用本领域中已知的和Perry所描述的方法涂布有治疗剂。当气囊膨胀时，所述治疗剂将接触周围组织。所述装置可以另外具有热源以改变气囊上的涂层的温度以释放治疗剂到所述组织。
利用电流的方法和装置
利用电流的方法和装置可以用于根据本文中所教示的单次、多次或分次给药方案递送本发明的mmRNA。以下描述这样的方法和装置。
Marquez描述了一种电胶原蛋白诱导疗法装置，且教示于例如美国专利公布20090137945中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Marquez，将多个针并入到可重复刺穿皮肤且在皮肤中抽吸最初施加于所述皮肤的物质的一部分的装置中。
Etheredge等描述了一种电动系统，且教示于例如美国专利公布20070185432中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Etheredge，将微针并入到利用电流驱动药物经由所述针进入靶向治疗部位的装置中。
Matsumura等描述了一种离子电渗装置，且教示于例如美国专利7,437,189中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Matsumura，将多个针并入到能够以较高速度或较高效率递送可离子化的药物到活体中的装置中。
Hoffmann等描述了通过无针注射和电穿孔经真皮内递送生物活性剂，且教示于例如美国专利7,171,264中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Hoffmann，将一个或多个无针注射器并入到电穿孔装置中且无针注射与电穿孔的组合足以将所述药剂引入到皮肤、肌肉或粘膜中的细胞中。
Lundkvist等描述了用于电渗透介导的细胞内递送的方法，且教示于例如美国专利6,625,486中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Lundkvist，将一对针电极并入到导管中。将所述导管放置于身体腔管中，随后延伸所述针电极以穿透到所述腔管周围的组织中。然后，所述装置经由至少一个所述针电极引入药剂且在治疗部位通过这对针电极施加电场以允许所述药剂通过细胞膜进入细胞中。
Levin等描述了用于经皮免疫的递送系统，且教示于例如WO2006003659中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Levin，将多个电极并入到可在电极之间应用电能以便在皮肤中产生微通道以有助于经皮递送的装置中。
Schomacker描述了用于向皮肤中递送RF能量的方法，且教示于例如WO2011163264中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Schomacker，将多个针并入到可应用真空以使得皮肤与板接触，以便针经由板上的孔插入皮肤中且递送RF能量的装置中。
可以使用电穿孔使细胞、粒子或囊泡负载有核酸。流式电穿孔使用受到电场作用的悬浮液流体。
以下描述了流式电穿孔装置、电穿孔方法和工艺：Dzekunov等，且教示于例如US7,029,916、US 7,771,984、7141425WO2003018751 WO2005113820、US20110065171中；Holaday等，且教示于例如US 6,773,669、US20050019311中；Meserol等，且教示于例如US 6,074,605和US 5,720,921中，各文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Dzekunov、Holaday和Meserol，含有电极的腔室可以用于对样品(例如细胞和组织)进行电穿孔。在以全文引用的方式并入本文中的US20080138877中，Dzekunov描述了可以含有样品(例如欲电穿孔的细胞的悬浮液)的电穿孔腔室。根据Dzekunov的WO2007021993，其内容以全文引用的方式并入本文中，电极可以放在不同的位置(例如螺旋几何结构)上以实现最佳电场。作为一个非限制性实例，流式电穿孔装置可用于产生感染性载体(参见例如US 7,186,559，其内容以全文引用的方式并入本文中)。
Dzekunov描述了用于优化电穿孔的方法，且教示于例如WO2010009252和US20120088842中，各文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Dzekunov，将电脉冲与其它电穿孔参数一起使用以增加电穿孔介质中的电导率。
Dzekunov等描述了一种用于进行流动电穿孔的方法，且教示于例如WO2004031353和US20040115784中，各文献以全文引用的方式并入本文中。根据Dzekunov，电穿孔可以通过使样品移位越过电场线或就量值而言基本上恒定的电场来实现。
Liu等描述了使用电穿孔将抗原装载到细胞中的方法，且教示于例如US20040214333、US20060134067、WO2004074451和WO2007028041中，各文献的内容以全文引用的方式并入本文中。另外，Liu等在WO2006063301和US2006165668中也描述了一种使用电穿孔将基因转移到癌细胞的方法，各文献以全文引用的方式并入本文中。
Li等描述了一种使用电穿孔暂时修饰细胞的方法，且教示于例如WO2009126789和US20090257991中，各文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
Li等描述了用于在电穿孔期间屏蔽电极的设备和方法，且教示于例如WO2007021994中，其内容以全文引用的方式并入本文中。根据Li，如传导性和水可渗透性屏障等屏障可以按操作关系用于电极。
Dzekunov等描述了计算机化电穿孔装置和方法，且教示于例如WO2006060409和US 7,991,559中，各自的内容以全文引用的方式并入本文中。根据Dzekunov，电穿孔装置可以是由具有用户定义的处理控制的计算机控制的流式电穿孔装置。
定义
在本说明书的不同地方，公开了本公开化合物的取代基的群组和范围。明确希望本公开包括所述群组和范围的成员的每一个个别子组合。举例来说，术语“C1-6烷基”明确希望个别地公开了甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
约：如本文中所使用，术语“约”意指所述值+/-10％。
组合施用：如本文中所使用，术语“组合施用”意指同时或在使得各药剂对患者的作用可以重叠的时间间隔内向受试者施用两种或更多种药剂(例如编码抗微生物多肽的经修饰核酸或mmRNA(例如抗细菌多肽)，所述抗微生物多肽例如有本文中所描述的抗微生物多肽和抗微生物剂(例如本文中所描述的抗微生物多肽或小分子抗微生物化合物))。在一些实施方案中，它们彼此在约60、30、15、10、5或1分钟内施用。在一些实施方案中，药剂的施用间隔得足够靠近，从而实现组合(例如协同)效果。
动物：如本文中所使用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施方案中，非人类动物是哺乳动物(例如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、羊、牛、灵长类动物或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼和蠕虫。在一些实施方案中，动物是转基因动物、经基因工程改造的动物或克隆。
目的抗原或所需抗原：如本文中所使用，术语“目的抗原”或“所需抗原”包括由本文中所描述的抗体和片段、其突变体、变体和变化形式免疫特异性结合的本文中所提供的蛋白质和其它生物分子。目的抗原的实例包括但不限于胰岛素、胰岛素样生长因子、hGH、tPA、细胞因子，如白介素(IL)，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18；干扰素(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNΩ或IFNτ；肿瘤坏死因子(TNF)，如TNFα和TNFβ、TNFγ、TRAIL；G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1和VEGF。
约：如本文中所使用，如应用到一个或多个目的值的术语“约”是指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，除非另有说明或另外从上下文显而易见(除非所述数字将超过可能的值的100％)，否则术语“约”是指在所述参考值的任一方向上(大于或小于)属于25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小百分比内的值范围。
缔合：如本文中所使用，术语“缔合”、“缀合”、“键联”、“连接”和“系栓”在关于两个或更多个部分使用时意指所述部分彼此直接或经由一个或多个充当键联剂的其它部分物理缔合或连接，以形成足够稳定的结构，使得所述部分在使用所述结构的条件(例如生理条件)下保持物理缔合。“缔合”不必严格经由直接共价化学键结来进行。也可能建议足够稳定的基于离子键结或氢键键结或杂交的连接性，使得“缔合”的实体保持物理缔合。
双功能：如本文中所使用，术语“双功能”是指任何物质、分子或部分能够具有或维持至少两种功能。所述功能可以实现相同的结果或不同的结果。产生所述功能的结构可以相同或不同。举例来说，本发明的双功能经修饰RNA可以编码细胞毒性肽(第一功能)，同时包含编码RNA的核苷自身具有细胞毒性(第二功能)。在这个实例中，递送双功能经修饰RNA到癌细胞将不仅产生可以改善或治疗癌症的肽或蛋白质分子，而且将递送核苷的细胞毒性有效负载到细胞，经修饰RNA将会发生降解而不是对其进行翻译。
生物相容：如本文中所使用，术语“生物相容”意指与活细胞、组织、器官或系统相容，从而造成极小的或不造成损伤、毒性或免疫系统排斥风险。
可生物降解：如本文中所使用，术语“可生物降解”意指能够在活物作用下分解为无害产物。
生物活性：如本文中所使用，短语“生物活性”是指的任何物质在生物系统和/或生物体中具有活性的特征。举例来说，在施用于生物体时对该生物体具有生物影响的物质被视为具有生物活性。在特定的实施方案中，如果即使本发明的核酸分子的一部分具有生物活性或可模拟被视为生物学上相关的活性，则所述核酸分子也可以被视为具有生物活性。
化学术语：以下提供对从“酰基”到“硫醇”的各种化学术语的定义。
如本文中所使用的术语“酰基”表示经由如本文中所定义的羰基连接于母分子基团的如本文中所定义的氢或烷基(例如卤烷基)，且其例子有甲酰基(即，甲醛基)、乙酰基、丙酰基、丁酰基等等。示例性未经取代的酰基包括1到7、1到11或1到21个碳。在一些实施方案中，烷基进一步经1、2、3或4个如本文中所描述的取代基取代。
如本文中所使用的术语“酰氨基”表示经由如本文中所定义的氨基连接于母分子基团的如本文中所定义的酰基(即，-N(RN1)-C(O)-R，其中R是H或任选地经取代的C1-6、C1-10或C1-20烷基，且RN1如本文中所定义)。示例性未经取代的酰基胺基包括1到41个碳(例如1到7、1到13、1到21、2到7、2到13、2到21或2到41个碳)。在一些实施方案中，烷基进一步经1、2、3或4个如本文中所描述的取代基取代，且/或氨基是-NH2或-NHRN1，其中RN1独立地为OH、NO2、NH2、NRN2 2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、烷基或芳基，且各RN2可以是H、烷基或芳基。
如本文中所使用的术语“酰氧基”表示经由氧原子连接于母分子基团的如本文中所定义的酰基(即-O-C(O)-R，其中R是H或任选地经取代的C1-6、C1-10或C1-20烷基)。示例性未经取代的酰氧基包括1到21个碳(例如1到7或1到11个碳)。在一些实施方案中，烷基进一步经1、2、3或4个如本文中所描述的取代基取代，且/或氨基是-NH2或-NHRN1，其中RN1独立地为OH、NO2、NH2、NRN2 2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、烷基或芳基，且各RN2可以是H、烷基或芳基。
如本文中所使用的术语“烷芳基”表示经由如本文中所定义的亚烷基连接于母分子基团的如本文中所定义的芳基。示例性未经取代的烷芳基具有7到30个碳(例如7到16或7到20个碳，如C1-6烷-C6-10芳基、C1-10烷-C6-10芳基或C1-20烷-C6-10芳基)。在一些实施方案中，亚烷基和芳基各自可以进一步经1、2、3或4个如本文中针对相应基团所定义的取代基取代。前面有前缀“烷-”的其它基团是以相同方式定义，其中除非另作说明，否则“烷”是指C1-6亚烷基，且所连接的化学结构如本文中所定义。
术语“烷环烷基”表示经由如本文中所定义的亚烷基(例如具有1到4、1到6、1到10或1到20个碳的亚烷基)连接于母分子基团的如本文中所定义的环烷基。在一些实施方案中，亚烷基和环烷基各自可以进一步经1、2、3或4个如本文中针对相应基团所定义的取代基取代。
除非另有说明，否则如本文中所使用的术语“烯基”表示含有一个或多个碳-碳双键的具有2到20个碳(例如2到6或2到10个碳)的单价直链或支链基团，且其例子有乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基等等。烯基包括顺式异构体和反式异构体。烯基可以任选地经1、2、3或4个独立地选自如本文中所定义的氨基、芳基、环烷基或杂环基(例如杂芳基)的取代基或本文中所描述的任何示例性烷基取代基取代。
除非另有说明，否则术语“烯氧基”表示具有式-OR的化学取代基，其中R是C2-20烯基(例如C2-6或C2-10烯基)。示例性烯氧基包括乙烯氧基、丙烯氧基等等。在一些实施方案中，烯基可以进一步经1、2、3或4个如本文中所定义的取代基(例如羟基)取代。
术语“烷杂芳基”是指经由如本文中所定义的亚烷基连接于母分子基团的如本文中所定义的杂芳基。示例性未经取代的烷杂芳基具有2到32个碳(例如2到22、2到18、2到17、2到16、3到15、2到14、2到13或2到12个碳，如C1-6烷-C1-12杂芳基、C1-10烷-C1-12杂芳基或C1-20烷-C1-12杂芳基)。在一些实施方案中，亚烷基和杂芳基各自可以进一步经1、2、3或4个如本文中针对相应基团所定义的取代基取代。烷杂芳基是烷杂环基的一个子集。
术语“烷杂环基”表示经由如本文中所定义的亚烷基连接于母分子基团的如本文中所定义的杂环基。示例性未经取代的烷杂环基具有2到32个碳(例如2到22、2到18、2到17、2到16、3到15、2到14、2到13或2到12个碳，如C1-6烷-C1-12杂环基、C1-10烷-C1-12杂环基或C1-20烷-C1-12杂环基)。在一些实施方案中，亚烷基和杂环基各自可以进一步经1、2、3或4个如本文中针对相应基团所定义的取代基取代。
除非另有说明，否则术语“烷氧基”表示具有式-OR的化学取代基，其中R是C1-20烷基(例如C1-6或C1-10烷基)。示例性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如正丙氧基和异丙氧基)、叔丁氧基等等。在一些实施方案中，烷基可以进一步经1、2、3或4个如本文中所定义的取代基(例如羟基或烷氧基)取代。
术语“烷氧基烷氧基”表示经烷氧基取代的烷氧基。示例性未经取代的烷氧基烷氧基包括介于2到40个之间的碳(例如2到12或2到20个碳，如C1-6烷氧基-C1-6烷氧基、C1-10烷氧基-C1-10烷氧基或C1-20烷氧基-C1-20烷氧基)。在一些实施方案中，各烷氧基可以进一步经1、2、3或4个如本文中所定义的取代基取代。
术语“烷氧基烷基”表示经烷氧基取代的烷基。示例性未经取代的烷氧基烷基包括介于2到40个之间的碳(例如2到12或2到20个碳，如C1-6烷氧基-C1-6烷基、C1-10烷氧基-C1-10烷基或C1-20烷氧基-C1-20烷基)。在一些实施方案中，烷基和烷氧基各自可以进一步经1、2、3或4个如本文中针对相应基团所定义的取代基取代。
如本文中所使用的术语“烷氧基羰基”表示经由羰基原子连接于母分子基团的如本文中所定义的烷氧基(例如-C(O)-OR，其中R是H或任选地经取代的C1-6、C1-10或C1-20烷基)。示例性未经取代的烷氧基羰基包括1到21个碳(例如1到11或1到7个碳)。在一些实施方案中，烷氧基进一步经1、2、3或4个如本文中所描述的取代基取代。
如本文中所使用的术语“烷氧基羰基烷氧基”表示经如本文中所定义的烷氧基羰基取代的如本文中所定义的烷氧基(例如-O-烷基-C(O)-OR，其中R是任选地经取代的C1-6、C1-10或C1-20烷基)。示例性未经取代的烷氧基羰基烷氧基包括3到41个碳(例如3到10、3到13、3到17、3到21或3到31个碳，如C1-6烷氧基羰基-C1-6烷氧基、C1-10烷氧基羰基-C1-10烷氧基或C1-20烷氧基羰基-C1-20烷氧基)。在一些实施方案中，各烷氧基还独立地经1、2、3或4个如本文中所描述的取代基(例如羟基)取代。
如本文中所使用的术语“烷氧基羰基烷基”表示经如本文中所定义的烷氧基羰基取代的如本文中所定义的烷基(例如-烷基-C(O)-OR，其中R是任选地经取代的C1-20、C1-10或C1-6烷基)。示例性未经取代的烷氧基羰基烷基包括3到41个碳(例如3到10、3到13、3到17、3到21或3到31个碳，如C1-6烷氧基羰基-C1-6烷基、C1-10烷氧基羰基-C1-10烷基或C1-20烷氧基羰基-C1-20烷基)。在一些实施方案中，各烷基和烷氧基还独立地经1、2、3或4个如本文中所描述的取代基(例如羟基)取代。
除非另有说明，否则如本文中所使用的术语“烷基”包括具有1到20个碳(例如1到10个或1到6个)的直链和支链饱和基团。烷基的例子有甲基、乙基、正丙基和异丙基、伯丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基、新戊基等等，且可以任选地经一、二、三个或在烷基具有两个或更多个碳的情况下经四个独立地选自以下各项的取代基取代：(1)C1-6烷氧基；(2)C1-6烷基亚磺酰基；(3)如本文中所定义的氨基(例如未经取代的氨基(即，-NH2)或经取代的氨基(即，-N(RN1)2，其中RN1如针对氨基所定义)；(4)C6-10芳基-C1-6烷氧基；(5)叠氮基；(6)卤基；(7)(C2-9杂环基)氧基；(8)羟基；(9)硝基；(10)氧代基(例如羧醛或酰基)；(11)C1-7螺环基；(12)硫代烷氧基；(13)硫醇；(14)-CO2RA'，其中RA'是选自(a)C1-20烷基(例如C1-6烷基)、(b)C2-20烯基(例如C2-6烯基)、(c)C6-10芳基、(d)氢、(e)C1-6烷-C6-10芳基、(f)氨基-C1-20烷基、(g)聚乙二醇-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基，和(h)氨基-聚乙二醇-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且各RN1独立地为氢或任选地经取代的C1-6烷基；(15)-C(O)NRB'RC'，其中RB'和RC'各自独立地选自(a)氢、(b)C1-6烷基、(c)C6-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(16)-SO2RD'，其中RD'是选自(a)C1-6烷基、(b)C6-10芳基、(c)C1-6烷-C6-10芳基和(d)羟基；(17)-SO2NRE'RF'，其中RE'和RF'各自独立地选自(a)氢、(b)C1-6烷基、(c)C6-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(18)-C(O)RG'，其中RG'是选自(a)C1-20烷基(例如C1-6烷基)、(b)C2-20烯基(例如C2-6烯基)、(c)C6-10芳基、(d)氢、(e)C1-6烷-C6-10芳基、(f)氨基-C1-20烷基、(g)聚乙二醇-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基，和(h)氨基-聚乙二醇-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且各RN1独立地为氢或任选地经取代的C1-6烷基；(19)-NRH'C(O)RI'，其中RH'是选自(a1)氢和(b1)C1-6烷基，且RI'是选自(a2)C1-20烷基(例如C1-6烷基)、(b2)C2-20烯基(例如C2-6烯基)、(c2)C6-10芳基、(d2)氢、(e2)C1-6烷-C6-10芳基、(f2)氨基-C1-20烷基、(g2)聚乙二醇-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基，和(h2)氨基-聚乙二醇-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且各RN1独立地为氢或任选地经取代的C1-6烷基；(20)-NRJ'C(O)ORK'，其中RJ'是选自(a1)氢和(b1)C1-6烷基，且RK'是选自(a2)C1-20烷基(例如C1-6烷基)、(b2)C2-20烯基(例如C2-6烯基)、(c2)C6-10芳基、(d2)氢、(e2)C1-6烷-C6-10芳基、(f2)氨基-C1-20烷基、(g2)聚乙二醇-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基，和(h2)氨基-聚乙二醇-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且各RN1独立地为氢或任选地经取代的C1-6烷基；和(21)脒。在一些实施方案中，这些基团各自可以如本文中所描述进一步经取代。举例来说，C1-烷芳基的亚烷基可以进一步经氧代基取代以获得相应的芳酰基取代基。
如本文中所使用的术语“亚烷基”和前缀“烷-”表示通过去除两个氢原子而得自于直链或支链饱和烃的饱和二价烃基，且其例子有亚甲基、亚乙基、亚异丙基等等。术语“Cx-y亚烷基”和前缀“Cx-y烷-”表示具有介于x个与y个之间的碳的亚烷基。x的示例性值为1、2、3、4、5和6，且y的示例性值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20(例如C1-6、C1-10、C2-20、C2-6、C2-10或C2-20亚烷基)。在一些实施方案中，亚烷基可以进一步经1、2、3或4个如本文中针对烷基所定义的取代基取代。
如本文中所使用的术语“烷基亚磺酰基”表示经由-S(O)-基团连接于母分子基团的烷基。示例性未经取代的烷基亚磺酰基具有1到6、1到10或1到20个碳。在一些实施方案中，烷基可以进一步经1、2、3或4个如本文中所定义的取代基取代。
如本文中所使用的术语“烷基亚磺酰基烷基”表示经烷基亚磺酰基取代的如本文中所定义的烷基。示例性未经取代的烷基亚磺酰基烷基具有2到12、2到20或2到40个碳。在一些实施方案中，各烷基可以进一步经1、2、3或4个如本文中所定义的取代基取代。
如本文中所使用的术语“炔基”表示含有碳-碳三键的具有2到20个碳原子(例如2到4、2到6或2到10个碳)的单价直链或支链基团，且其例子有乙炔基、1-丙炔基等等。炔基可以任选地经1、2、3或4个独立地选自如本文中所定义的芳基、环烷基或杂环基(例如杂芳基)或本文中所描述的示例性烷基取代基中的任一者的取代基取代。
除非另有说明，否则术语“炔基氧基”表示具有式-OR的化学取代基，其中R是C2-20炔基(例如C2-6或C2-10炔基)。示例性炔基氧基包括乙炔基氧基、丙炔基氧基等等。在一些实施方案中，炔基可以进一步经1、2、3或4个如本文中所定义的取代基(例如羟基)取代。
如本文中所使用的术语“脒”表示-C(＝NH)NH2基团。
如本文中所使用的术语“氨基”表示-N(RN1)2，其中各RN1独立地为H、OH、NO2、N(RN2)2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、N-保护基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、烷芳基、环烷基、烷环烷基、羧基烷基、磺烷基、杂环基(例如杂芳基)或烷杂环基(例如烷杂芳基)，其中这些所述RN1基团各自可以如本文中针对各基团所定义而任选地经取代；或两个RN1组合形成杂环基或N-保护基，且其中各RN2独立地为H、烷基或芳基。本发明的氨基可以是未经取代的氨基(即，-NH2)或经取代的氨基(即，-N(RN1)2)。在一个优选实施方案中，氨基为-NH2或-NHRN1，其中RN1独立地为OH、NO2、NH2、NRN2 2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、烷基、羧基烷基、磺烷基或芳基，且各RN2可为H、C1-20烷基(例如C1-6烷基)或C6-10芳基。
如本文中所描述的术语“氨基酸”是指具有侧链、氨基和酸基(例如羧基-CO2H或磺酸基-SO3H)的分子，其中所述氨基酸经侧链、氨基或酸基(例如侧链)连接于母分子基团。在一些实施方案中，氨基酸经羰基连接于母分子基团，其中所述侧链或氨基连接于所述羰基。示例性侧链包括任选地经取代的烷基、芳基、杂环基、烷芳基、烷杂环基、氨基烷基、氨基甲酰烷基和羧基烷基。示例性氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、羟基正缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、吡咯赖氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、氨基乙磺酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。氨基酸可以任选地经一、二、三个或在氨基酸基团具有两个或更多个碳的情况下经四个独立地选自以下各项的取代基取代：(1)C1-6烷氧基；(2)C1-6烷基亚磺酰基；(3)如本文中所定义的氨基(例如未经取代的氨基(即，-NH2)或经取代的氨基(即，-N(RN1)2，其中RN1如针对氨基所定义)；(4)C6-10芳基-C1-6烷氧基；(5)叠氮基；(6)卤基；(7)(C2-9杂环基)氧基；(8)羟基；(9)硝基；(10)氧代基(例如甲醛或酰基)；(11)C1-7螺环基；(12)硫代烷氧基；(13)硫醇；(14)-CO2RA'，其中RA'是选自(a)C1-20烷基(例如C1-6烷基)、(b)C2-20烯基(例如C2-6烯基)、(c)C6-10芳基、(d)氢、(e)C1-6烷-C6-10芳基、(f)氨基-C1-20烷基、(g)聚乙二醇-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基，和(h)氨基-聚乙二醇-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且各RN1独立地为氢或任选地经取代的C1-6烷基；(15)-C(O)NRB'RC'，其中RB'和RC'各自独立地选自(a)氢、(b)C1-6烷基、(c)C6-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(16)-SO2RD'，其中RD'是选自(a)C1-6烷基、(b)C6-10芳基、(c)C1-6烷-C6-10芳基和(d)羟基；(17)-SO2NRE'RF'，其中RE'和RF'各自独立地选自(a)氢、(b)C1-6烷基、(c)C6-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(18)-C(O)RG'，其中RG'是选自(a)C1-20烷基(例如C1-6烷基)、(b)C2-20烯基(例如C2-6烯基)、(c)C6-10芳基、(d)氢、(e)C1-6烷-C6-10芳基、(f)氨基-C1-20烷基、(g)聚乙二醇-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基，和(h)氨基-聚乙二醇-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且各RN1独立地为氢或任选地经取代的C1-6烷基；(19)-NRH'C(O)RI'，其中RH'是选自(a1)氢和(b1)C1-6烷基，且RI'是选自(a2)C1-20烷基(例如C1-6烷基)、(b2)C2-20烯基(例如C2-6烯基)、(c2)C6-10芳基、(d2)氢、(e2)C1-6烷-C6-10芳基、(f2)氨基-C1-20烷基、(g2)聚乙二醇-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基，和(h2)氨基-聚乙二醇-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且各RN1独立地为氢或任选地经取代的C1-6烷基；(20)-NRJ'C(O)ORK'，其中RJ'是选自(a1)氢和(b1)C1-6烷基，且RK'是选自(a2)C1-20烷基(例如C1-6烷基)、(b2)C2-20烯基(例如C2-6烯基)、(c2)C6-10芳基、(d2)氢、(e2)C1-6烷-C6-10芳基、(f2)氨基-C1-20烷基、(g2)聚乙二醇-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR'，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且R'为H或C1-20烷基，和(h2)氨基-聚乙二醇-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1，其中s1为整数1到10(例如1到6或1到4)，s2和s3各自独立地为整数0到10(例如0到4、0到6、1到4、1到6或1到10)，且各RN1独立地为氢或任选地经取代的C1-6烷基；和(21)脒。在一些实施方案中，这些基团各自可以如本文中所描述进一步经取代。
如本文中所使用的术语“氨基烷氧基”表示经如本文中所定义的氨基取代的如本文中所定义的烷氧基。烷基和氨基各自可以进一步经1、2、3或4个如本文中针对相应基团所描述的取代基(例如CO2RA'，其中RA'是选自(a)C1-6烷基、(b)C6-10芳基、(c)氢和(d)C1-6烷-C6-10芳基，例如羧基)取代。
如本文中所使用的术语“氨基烷基”表示经如本文中所定义的氨基取代的如本文中所定义的烷基。烷基和氨基各自可以进一步经1、2、3或4个如本文中针对相应基团所描述的取代基(例如CO2RA'，其中RA'是选自(a)C1-6烷基、(b)C6-10芳基、(c)氢和(d)C1-6烷-C6-10芳基，例如羧基)取代。
如本文中所使用的术语“芳基”表示具有一个或两个芳香环的单环、双环或多环碳环系统，且其例子有苯基、萘基、1,2-二氢萘基、1,2,3,4-四氢萘基、蒽基、菲基、芴基、茚满基、茚基等等，且可以任选地经1、2、3、4或5个独立地选自以下各项的取代基取代：(1)C1-7酰基(例如羧醛)；(2)C1-20烷基(例如C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、C1-6烷基亚磺酰基-C1-6烷基、氨基-C1-6烷基、叠氮基-C1-6烷基、(羧醛)-C1-6烷基、卤基-C1-6烷基(例如全氟烷基)、羟基-C1-6烷基、硝基-C1-6烷基或C1-6硫代烷氧基-C1-6烷基)；(3)C1-20烷氧基(例如C1-6烷氧基，如全氟烷氧基)；(4)C1-6烷基亚磺酰基；(5)C6-10芳基；(6)氨基；(7)C1-6烷-C6-10芳基；(8)叠氮基；(9)C3-8环烷基；(10)C1-6烷-C3-8环烷基；(11)卤基；(12)C1-12杂环基(例如C1-12杂芳基)；(13)(C1-12杂环基)氧基；(14)羟基；(15)硝基；(16)C1-20硫代烷氧基(例如C1-6硫代烷氧基)；(17)-(CH2)qCO2RA'，其中q为整数0到4，且RA'是选自(a)C1-6烷基、(b)C6-10芳基、(c)氢和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(18)-(CH2)qCONRB'RC'，其中q为整数0到4且其中RB'和RC'独立地选自(a)氢、(b)C1-6烷基、(c)C6-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(19)-(CH2)qSO2RD'，其中q为整数0到4且其中RD'是选自(a)烷基、(b)C6-10芳基和(c)烷-C6-10芳基；(20)-(CH2)qSO2NRE'RF'，其中q为整数0到4且其中RE'和RF'各自独立地选自(a)氢、(b)C1-6烷基、(c)C6-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(21)硫醇；(22)C6-10芳基氧基；(23)C3-8环烷氧基；(24)C6-10芳基-C1-6烷氧基；(25)C1-6烷-C1-12杂环基(例如C1-6烷-C1-12杂芳基)；(26)C2-20烯基；和(27)C2-20炔基。在一些实施方案中，这些基团各自可以如本文中所描述进一步经取代。举例来说，C1-烷芳基或C1-烷杂环基的亚烷基可以进一步经氧代基取代，以获得相应的芳酰基和(杂环基)酰基取代基。
如本文中所使用的术语“芳基烷氧基”表示经由氧原子连接于母分子基团的如本文中所定义的烷芳基。示例性未经取代的烷氧基烷基包括7到30个碳(例如7到16个或7到20个碳，如C6-10芳基-C1-6烷氧基、C6-10芳基-C1-10烷氧基或C6-10芳基-C1-20烷氧基)。在一些实施方案中，芳基烷氧基可以经1、2、3或4个如本文中所定义的取代基取代。
除非另有说明，否则术语“芳氧基”表示具有式-OR'的化学取代基，其中R'是具有6到18个碳的芳基。在一些实施方案中，芳基可以经1、2、3或4个如本文中所定义的取代基取代。
如本文中所使用的术语“芳酰基”表示经由羰基连接于母分子基团的如本文中所定义的芳基。示例性未经取代的芳酰基具有7到11个碳。在一些实施方案中，芳基可以经1、2、3或4个如本文中所定义的取代基取代。
术语“叠氮基”表示-N3基团，其也可以表示为-N＝N＝N。
如本文中所使用的术语“双环”是指具有两个环的结构，所述环可以是芳香族或非芳香族的。双环结构包括如本文中所定义的螺环基，和共有一个或多个桥的两个环，其中所述桥可以包括一个原子或包括两个、三个或更多个原子的链。示例性双环基团包括双环碳环基，其中第一环和第二环是如本文中所定义的碳环基；双环芳基，其中第一环和第二环是如本文中所定义的芳基；双环杂环基，其中第一环是杂环基且第二环是碳环基(例如芳基)或杂环基(例如杂芳基)；和双环杂芳基，其中第一环是杂芳基且第二环是碳环基(例如芳基)或杂环基(例如杂芳基)。在一些实施方案中，双环基可以经1、2、3或4个如本文中针对环烷基、杂环基和芳基所定义的取代基取代。
如本文中所使用的术语“碳环”和“碳环基”是指任选地经取代的C3-12单环、双环或三环结构，其中可以是芳香族或非芳香族的所述环是由碳原子形成。碳环结构包括环烷基、环烯基和芳基。
如本文中所使用的术语“氨基甲酰基”表示-C(O)-N(RN1)2，其中各RN1的含义可在本文中所提供的“氨基”的定义中获得。
如本文中所使用的术语“氨基甲酰烷基”表示经如本文中所定义的氨基甲酰基取代的如本文中所定义的烷基。烷基可以进一步经1、2、3或4个如本文中所描述的取代基取代。
如本文中所使用的术语“氨基甲酰基”是指具有结构-NRN1C(＝O)OR或-OC(＝O)N(RN1)2的氨基甲酸酯基，其中各RN1的含义可在本文中所提供的“氨基”的定义中获得，且R是如本文中所定义的烷基、环烷基、烷环烷基、芳基、烷芳基、杂环基(例如杂芳基)或烷杂环基(例如烷杂芳基)。
如本文中所使用的术语“羰基”表示C(O)基团，其还可以表示为C＝O。
术语“羧醛”表示具有结构-CHO的酰基。
如本文中所使用的术语“羧基”意指-CO2H。
如本文中所使用的术语“羧基烷氧基”表示经如本文中所定义的羧基取代的如本文中所定义的烷氧基。所述烷氧基可以进一步经1、2、3或4个如本文中针对烷基所描述的取代基取代。
如本文中所使用的术语“羧基烷基”表示经如本文中所定义的羧基取代的如本文中所定义的烷基。烷基可以进一步经1、2、3或4个如本文中所描述的取代基取代。
如本文中所使用的术语“氰基”表示-CN基团。
除非另有说明，否则术语“环烷氧基”表示具有式-OR的化学取代基，其中R是如本文中所定义的C3-8环烷基。所述环烷基可以进一步经1、2、3或4个如本文中所描述的取代基取代。示例性未经取代的环烷氧基具有3到8个碳。
除非另有说明，否则如本文中所使用的术语“环烷基”表示具有3到8个碳的单价饱和或不饱和非芳香族环烃基，且其例子有环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、双环[2.2.1.]庚基等等。当环烷基包括一个碳-碳双键时，环烷基可以称为“环烯基”。示例性环烯基包括环戊烯基、环己烯基等等。本发明的环烷基可以任选地经以下各项取代：(1)C1-7酰基(例如羧醛)；(2)C1-20烷基(例如C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、C1-6烷基亚磺酰基-C1-6烷基、氨基-C1-6烷基、叠氮基-C1-6烷基、(羧醛)-C1-6烷基、卤基-C1-6烷基(例如全氟烷基)、羟基-C1-6烷基、硝基-C1-6烷基或C1-6硫代烷氧基-C1-6烷基)；(3)C1-20烷氧基(例如C1-6烷氧基，如全氟烷氧基)；(4)C1-6烷基亚磺酰基；(5)C6-10芳基；(6)氨基；(7)C1-6烷-C6-10芳基；(8)叠氮基；(9)C3-8环烷基；(10)C1-6烷-C3-8环烷基；(11)卤基；(12)C1-12杂环基(例如C1-12杂芳基)；(13)(C1-12杂环基)氧基；(14)羟基；(15)硝基；(16)C1-20硫代烷氧基(例如C1-6硫代烷氧基)；(17)-(CH2)qCO2RA'，其中q是整数0到4，且RA'是选自(a)C1-6烷基、(b)C6-10芳基、(c)氢和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(18)-(CH2)qCONRB'RC'，其中q为整数0到4且其中RB'和RC'是独立地选自(a)氢、(b)C6-10烷基、(c)C6-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(19)-(CH2)qSO2RD'，其中q为整数0到4且其中RD'是选自(a)C6-10烷基、(b)C6-10芳基和(c)C1-6烷-C6-10芳基；(20)-(CH2)qSO2NRE'RF'，其中q为整数0到4且其中RE'和RF'各自独立地选自(a)氢、(b)C6-10烷基、(c)C6-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(21)硫醇；(22)C6-10芳氧基；(23)C3-8环烷氧基；(24)C6-10芳基-C1-6烷氧基；(25)C1-6烷-C1-12杂环基(例如C1-6烷-C1-12杂芳基)；(26)氧代基；(27)C2-20烯基；和(28)C2-20炔基。在一些实施方案中，这些基团各自可以如本文中所描述进一步经取代。举例来说，C1-烷芳基或C1-烷杂环基的亚烷基可以进一步经氧代基取代，以获得相应的芳酰基和(杂环基)酰基取代基。
术语“非对映异构体”意指不是彼此的镜象且不可重合的立体异构体。
如本文中关于药剂所使用的术语“有效量”是足以实现有益的或所希望的结果(例如临床结果)的量，且因而，“有效量”取决于应用其的情形。举例来说，在施用可治疗癌症的药剂的情形下，药剂的有效量为例如与不施用药剂的情况下所获得的反应相比足以实现如本文中所定义的对癌症的治疗的量。
如本文中所使用的术语“对映异构体”意指本发明化合物的各个别光学活性形式具有至少80％(即，至少90％为一种对映异构体且至多10％为另一种对映异构体)，优选具有至少90％且更优选具有至少98％的光学纯度或对映异构过量(如利用本领域中标准的方法所测定)。
如本文中所使用的术语“卤基”表示选自溴、氯、碘或氟的卤素。
如本文中所使用的术语“卤代烷氧基”表示经卤素基团(即，F、Cl、Br或I)取代的如本文中所定义的烷氧基。卤代烷氧基可以经一、二、三个或在烷基具有两个或更多个碳的情况下经四个卤素取代。卤代烷氧基包括全氟烷氧基(例如-OCF3)、-OCHF2、-OCH2F、-OCCl3、-OCH2CH2Br、-OCH2CH(CH2CH2Br)CH3和-OCHICH3。在一些实施方案中，所述卤代烷氧基可以进一步经1、2、3或4个如本文中针对烷基所描述的取代基取代。
如本文中所使用的术语“卤代烷基”表示经卤素基团(即，F、Cl、Br或I)取代的如本文中所定义的烷基。卤代烷基可以经一、二、三个或在烷基具有两个或更多个碳的情况下经四个卤素取代。卤代烷基包括全氟烷基(例如-CF3)、-CHF2、-CH2F、-CCl3、-CH2CH2Br、-CH2CH(CH2CH2Br)CH3和-CHICH3。在一些实施方案中，所述卤代烷基可以进一步经1、2、3或4个如本文中针对烷基所描述的取代基取代。
如本文中所使用的术语“杂亚烷基”是指如本文中所定义的亚烷基中有一个或两个组成碳原子各自经氮、氧或硫置换。在一些实施方案中，杂亚烷基可以进一步经1、2、3或4个如本文中针对亚烷基所描述的取代基取代。
如本文中所使用的术语“杂芳基”表示如本文中所定义的芳香族杂环基的子集，即，其在单环或多环的环系统内含有4n+2个π电子。示例性未经取代的杂芳基具有1到12(例如1到11、1到10、1到9、2到12、2到11、2到10或2到9)个碳。在一些实施方案中，杂芳基经1、2、3或4个如针对杂环基所定义的取代基取代。
除非另有说明，否则如本文中所使用的术语“杂环基”表示含有一、二、三或四个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5、6或7元环。5元环具有0到2个双键，且6元环和7元环具有0到3个双键。示例性未经取代的杂环基具有1到12(例如1到11、1到10、1到9、2到12、2到11、2到10或2到9)个碳。术语“杂环基”还表示具有桥连多环结构的杂环化合物，其中一个或多个碳和/或杂原子桥连单环的两个不相邻成员，例如奎宁环基。术语“杂环基”包括其中上述杂环中的任一者与一、二或三个碳环(例如芳基环、环己烷环、环己烯环、环戊烷环、环戊烯环)或另一个单环杂环(如吲哚基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基等等)稠合的双环、三环和四环基团。稠合杂环基的实例包括莨菪烷和1,2,3,5,8,8a-六氢中氮茚。杂环化合物包括吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡啶基、哌啶基、高哌啶基、吡嗪基、哌嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁唑基、噁唑烷基、异噁唑基、异噁唑烷基、吗啉基、硫代吗啉基、噻唑基、噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、吲哚基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、喹喏啉基、二氢喹喏啉基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噻二唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑烷基、异噻唑基、三唑基、四唑基、噁二唑基(例如1,2,3-噁二唑基)、嘌呤基、噻二唑基(例如1,2,3-噻二唑基)、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、二氢吲哚基、二氢喹啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、二氢异喹啉基、吡喃基、二氢吡喃基、二噻唑基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基等等，包括其二氢和四氢形式，其中一个或多个双键被还原且经氢置换。其它示例性杂环基包括：2,3,4,5-四氢-2-氧代-噁唑基；2,3-二氢-2-氧代-1H-咪唑基；2,3,4,5-四氢-5-氧代-1H-吡唑基(例如2,3,4,5-四氢-2-苯基-5-氧代-1H-吡唑基)；2,3,4,5-四氢-2,4-二氧代-1H-咪唑基(例如2,3,4,5-四氢-2,4-二氧代-5-甲基-5-苯基-1H-咪唑基)；2,3-二氢-2-硫酮基-1,3,4-噁二唑基(例如2,3-二氢-2-硫酮基-5-苯基-1,3,4-噁二唑基)；4,5-二氢-5-氧代-1H-三唑基(例如4,5-二氢-3-甲基-4-氨基-5-氧代-1H-三唑基)；1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代吡啶基(例如1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代-3,3-二乙基吡啶基)；2,6-二氧代-哌啶基(例如2,6-二氧代-3-乙基-3-苯基哌啶基)；1,6-二氢-6-氧代嘧啶基；1,6-二氢-4-氧代嘧啶基(例如2-(甲硫基)-1,6-二氢-4-氧代-5-甲基嘧啶-1-基)；1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代嘧啶基(例如1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代-3-乙基嘧啶基)；1,6-二氢-6-氧代-哒嗪基(例如1,6-二氢-6-氧代-3-乙基哒嗪基)；1,6-二氢-6-氧代-1,2,4-三嗪基(例如1,6-二氢-5-异丙基-6-氧代-1,2,4-三嗪基)；2,3-二氢-2-氧代-1H-吲哚基(例如3,3-二甲基-2,3-二氢-2-氧代-1H-吲哚基和2,3-二氢-2-氧代-3,3'-螺丙烷-1H-吲哚-1-基)；1,3-二氢-1-氧代-2H-异-吲哚基；1,3-二氢-1,3-二氧代-2H-异-吲哚基；1H-苯并吡唑基(例如1-(乙氧基羰基)-1H-苯并吡唑基)；2,3-二氢-2-氧代-1H-苯并咪唑基(例如3-乙基-2,3-二氢-2-氧代-1H-苯并咪唑基)；2,3-二氢-2-氧代-苯并噁唑基(例如5-氯-2,3-二氢-2-氧代-苯并噁唑基)；2,3-二氢-2-氧代-苯并噁唑基；2-氧代-2H-苯并吡喃基；1,4-苯并二噁烷基；1,3-苯并二噁烷基；2,3-二氢-3-氧代-4H-1,3-苯并噻嗪基；3,4-二氢-4-氧代-3H-喹唑啉基(例如2-甲基-3,4-二氢-4-氧代-3H-喹唑啉基)；1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代-3H-喹唑啉基(例如1-乙基-1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代-3H-喹唑啉基)；1,2,3,6-四氢-2,6-二氧代-7H-嘌呤基(例如1,2,3,6-四氢-1,3-二甲基-2,6-二氧代-7H-嘌呤基)；1,2,3,6-四氢-2,6-二氧代-1H-嘌呤基(例如1,2,3,6-四氢-3,7-二甲基-2,6-二氧代-1H-嘌呤基)；2-氧代苯并[c,d]吲哚基；1,1-二氧代-2H-萘并[1,8-c,d]异噻唑基；和1,8-萘二甲酰胺基。其它杂环化合物包括3,3a,4,5,6,6a-六氢-吡咯并[3,4-b]吡咯-(2H)-基和2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基、高哌嗪基(或二氮杂环庚烷基)、四氢吡喃基、二噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、氧杂环己烷基、硫杂环庚烷基、氮杂环辛烷基、氧杂环辛烷基和硫杂环辛烷基。杂环基还包括具有下式的基团：
其中
E'是选自-N-和-CH-；F'是选自-N＝CH-、-NH-CH2-、-NH-C(O)-、-NH-、-CH＝N-、-CH2-NH-、-C(O)-NH-、-CH＝CH-、-CH2-、-CH2CH2-、-CH2O-、-OCH2-、-O-和-S-；且G'是选自-CH-和-N-。本文中所提到的任何杂环基可以任选地经一、二、三、四或五个独立地选自以下各项的取代基取代：(1)C1-7酰基(例如羧醛)；(2)C1-20烷基(例如C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、C1-6烷基亚磺酰基-C1-6烷基、氨基-C1-6烷基、叠氮基-C1-6烷基、(羧醛)-C1-6烷基、卤基-C1-6烷基(例如全氟烷基)、羟基-C1-6烷基、硝基-C1-6烷基或C1-6硫代烷氧基-C1-6烷基)；(3)C1-20烷氧基(例如C1-6烷氧基，如全氟烷氧基)；(4)C1-6烷基亚磺酰基；(5)C6-10芳基；(6)氨基；(7)C1-6烷-C6-10芳基；(8)叠氮基；(9)C3-8环烷基；(10)C1-6烷-C3-8环烷基；(11)卤基；(12)C1-12杂环基(例如C2-12杂芳基)；(13)(C1-12杂环基)氧基；(14)羟基；(15)硝基；(16)C1-20硫代烷氧基(例如C1-6硫代烷氧基)；(17)-(CH2)qCO2RA'，其中q为整数0到4，且RA'是选自(a)C1-6烷基、(b)C6-10芳基、(c)氢和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(18)-(CH2)qCONRB'RC'，其中q为整数0到4且其中RB'和RC'独立地选自(a)氢、(b)C1-6烷基、(c)C6-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(19)-(CH2)qSO2RD'，其中q为整数0到4且其中RD'是选自(a)C1-6烷基、(b)C6-10芳基和(c)C1-6烷-C6-10芳基；(20)-(CH2)qSO2NRE'RF'，其中q为整数0到4且其中RE'和RF'各自独立地选自(a)氢、(b)C1-6烷基、(c)C6-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(21)硫醇；(22)C6-10芳氧基；(23)C3-8环烷氧基；(24)芳基烷氧基；(25)C1-6烷-C1-12杂环基(例如C1-6烷-C1-12杂芳基)；(26)氧代；(27)(C1-12杂环基)亚氨基；(28)C2-20烯基；和(29)C2-20炔基。在一些实施方案中，这些基团各自可以如本文中所描述进一步经取代。举例来说，C1-烷芳基或C1-烷杂环基的亚烷基可以进一步经氧代基取代，以获得相应的芳酰基和(杂环基)酰基取代基。
如本文中所使用的术语“(杂环基)亚氨基”表示经由亚氨基连接于母分子基团的如本文中所定义的杂环基。在一些实施方案中，所述杂环基可以经1、2、3或4个如本文中所定义的取代基取代。
如本文中所使用的术语“(杂环基)氧基”表示经由氧原子连接于母分子基团的如本文中所定义的杂环基。在一些实施方案中，所述杂环基可以经1、2、3或4个如本文中所定义的取代基取代。
如本文中所使用的术语“(杂环基)酰基”表示经由羰基连接于母分子基团的如本文中所定义的杂环基。在一些实施方案中，所述杂环基可以经1、2、3或4个如本文中所定义的取代基取代。
如本文中所使用的术语“烃”表示仅由碳和氢原子组成的基团。
如本文中所使用的术语“羟基”表示-OH基团。
如本文中所使用的术语“羟基烯基”表示经1到3个羟基取代的如本文中所定义的烯基，条件是不超过一个羟基可以连接于烷基的单个碳原子，且其例子有二羟基丙烯基、羟基异戊烯基等等。
如本文中所使用的术语“羟基烷基”表示经1到3个羟基取代的如本文中所定义的烷基，条件是不超过一个羟基可以连接于烷基的单个碳原子，且其例子有羟基甲基、二羟基丙基等等。
如本文中所使用的术语“异构体”意指任何本发明化合物的任何互变异构体、立体异构体、对映异构体或非对映异构体。应认识到，本发明化合物可以具有一个或多个手性中心和/或双键，且因此以立体异构体形式存在，如双键异构体(即，几何E/Z异构体)或非对映异构体(例如对映异构体(即，(+)或(-))或顺/反异构体)。根据本发明，本文中所示的化学结构以及因此本发明的化合物涵盖所有相应的立体异构体，也就是立体异构纯形式(例如几何纯、对映异构纯或非对映异构纯)和对映异构体与立体异构体的混合物，例如外消旋物。本发明化合物的对映异构体与立体异构体的混合物典型地可以利用众所周知的方法拆分成其组分对映异构体或立体异构体，如手性相气相色谱法、手性相高效液相色谱法、使化合物结晶为手性盐复合物，或使化合物在手性溶剂中结晶。对映异构体和立体异构体还可以利用众所周知的不对称合成法由立体异构纯或对映异构纯中间物、试剂和催化剂获得。
如本文中所使用的术语“N上经保护的氨基”是指连接一个或两个如本文中所定义的N-保护基的如本文中所定义的氨基。
如本文中所使用的术语“N-保护基”表示意在防止氨基在合成程序期间发生不希望的反应的基团。Greene,“Protective Groups in Organic Synthesis”,第3版(John Wiley&Sons,New York,1999)中公开了常用N-保护基，所述文献以引用的方式并入本文中。N-保护基包括酰基、芳酰基或氨基甲酰基，如甲酰基、乙酰基、丙酰基、特戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基，和手性助剂，如经保护或未经保护的D-氨基酸、L-氨基酸或D,L-氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等等；含磺酰基的基团，如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等等；形成氨基甲酸酯的基团，如苯甲基氧基羰基、对氯苯甲基氧基羰基、对甲氧基苯甲基氧基羰基、对硝基苯甲基氧基羰基、2-硝基苯甲基氧基羰基、对溴苯甲基氧基羰基、3,4-二甲氧基苯甲基氧基羰基、3,5-二甲氧基苯甲基氧基羰基、2,4-二甲氧基苯甲基氧基羰基、4-甲氧基苯甲基氧基羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲基氧基羰基、3,4,5-三甲氧基苯甲基氧基羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苯甲基氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、叔丁氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙基氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙基氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、环戊基氧基羰基、金刚烷基氧基羰基、环己基氧基羰基、苯硫基羰基等等；烷芳基，如苯甲基、三苯甲基、苯甲基氧基甲基等等；和硅烷基，如三甲基甲硅烷基等等。优选N-保护基为甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、特戊酰基、叔丁基乙酰基、丙氨酰基、苯磺酰基、苯甲基、叔丁氧基羰基(Boc)和苯甲基氧基羰基(Cbz)。
如本文中所使用的术语“硝基”表示-NO2基团。
如本文中所使用的术语“氧代”表示＝O。
如本文中所使用的术语“全氟烷基”表示如本文中所定义的烷基中与烷基键结的各氢基被氟基置换。全氟烷基的例子有三氟甲基、五氟乙基等等。
如本文中所使用的术语“全氟烷氧基”表示如本文中所定义的烷氧基中与烷氧基键结的各氢基被氟基置换。全氟烷氧基的例子有三氟甲氧基、五氟乙氧基等等。
如本文中所使用的术语“螺环基”表示两端键结于母基团的同一碳原子以形成螺环基的C2-7亚烷基双基(diradical)，并且还表示两端键结于同一原子的C1-6杂亚烷基双基。形成螺环基的杂亚烷基可以含有1、2、3或4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子。在一些实施方案中，将双基所连接的碳原子排除在外，螺环基包括1到7个碳。本发明的螺环基可以任选地经1、2、3或4个本文中作为环烷基和/或杂环基的任选取代基而提供的取代基取代。
如本文中所使用的术语“立体异构体”是指某一化合物(例如具有本文中所描述的任何化学式的化合物)可能具有的所有可能的不同的异构以及构象形式，尤其是基本分子结构的所有可能的立体化学和构象异构形式、所有非对映异构体、对映异构体和/或构象异构体。一些本发明化合物可以呈不同的互变异构形式，所有互变异构形式都包括在本发明的范围内。
如本文中所使用的术语“磺烷基”表示经磺酸基-SO3H取代的如本文中所定义的烷基。在一些实施方案中，烷基可以进一步经1、2、3或4个如本文中所描述的取代基取代。
如本文中所使用的术语“磺酰基”表示-S(O)2-基团。
如本文中所使用的术语“硫代烷芳基”表示具有式-SR的化学取代基，其中R是烷芳基。在一些实施方案中，烷芳基可以进一步经1、2、3或4个如本文中所描述的取代基取代。
如本文中所使用的术语“硫代烷杂环基”表示具有式-SR的化学取代基，其中R是烷杂环基。在一些实施方案中，烷杂环基可以进一步经1、2、3或4个如本文中所描述的取代基取代。
如本文中所使用的术语“硫代烷氧基”表示具有式-SR的化学取代基，其中R是如本文中所定义的烷基。在一些实施方案中，烷基可以进一步经1、2、3或4个如本文中所描述的取代基取代。
术语“硫醇”表示-SH基团。
化合物：如本文中所使用，术语“化合物”意在包括所示结构的所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。
本文中所描述的化合物可以是不对称的(例如具有一个或多个立体中心)。除非另外指出，否则意味着所有立体异构体，如对映异构体和非对映异构体。含有经不对称取代的碳原子的本公开化合物可以呈光学活性形式或外消旋形式加以分离。关于如何由光学活性起始材料制备光学活性形式的方法在本领域中是已知的，如通过拆分外消旋混合物或通过立体选择性合成来实现。烯烃、C＝N双键等等的许多几何异构体也可以存在于本文中所描述的化合物中，且本公开中涵盖所有这些稳定异构体。描述了本公开化合物的顺式和反式几何异构体，且其可以分离为异构体混合物或单独的异构形式。
本公开的化合物还包括互变异构形式。互变异构形式由用相邻双键交换单键且伴随质子迁移而产生。互变异构形式包括质子转移互变异构体，其为具有相同经验化学式和总电荷的异构质子化状态。质子转移互变异构体的实例包括酮-烯醇配对、酰胺-亚胺酸配对、内酰胺-内酰亚胺配对、酰胺-亚胺酸配对、烯胺-亚胺配对，和其中质子可能占据杂环系统的两个或更多个位置的环形形式，如1H-咪唑和3H-咪唑、1H-1,2,4-三唑、2H-1,2,4-三唑和4H-1,2,4-三唑、1H-异吲哚和2H-异吲哚以及1H-吡唑和2H-吡唑。互变异构形式可以通过适当取代而处于平衡状态或在空间上锁定为一种形式。
本公开的化合物还包括中间物或最终化合物中存在的原子的所有同位素。“同位素”是指具有相同原子序数但由于核中的中子数不同而具有不同质量数的原子。举例来说，氢同位素包括氚和氘。
可以利用常规方法制备本公开的化合物和盐与溶剂或水分子的组合，以便形成溶剂合物和水合物。
保守：如本文中所使用，术语“保守”是指聚核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基分别是在所比较的两个或更多个序列的相同位置上未经改变的核苷酸或氨基酸残基。相对保守的核苷酸或氨基酸是在与序列中其它地方出现的核苷酸或氨基酸相比更相关的序列中保守的核苷酸或氨基酸。
在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此100％同一，则称其为“完全保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，则称其为“高度保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性、约95％、约98％或约99％同一性，则称其为“高度保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有至少30％同一性、至少40％同一性、至少50％同一性、至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，则称其为“保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有约30％同一性、约40％同一性、约50％同一性、约60％同一性、约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性、约95％同一性、约98％同一性或约99％同一性，则称其为“保守的”。序列的保守性可以适用于寡核苷酸或多肽的整个长度，或可以适用于其部分、区域或特征。
控制释放：如本文中所使用，术语“控制释放”是指药物组合物或化合物释放型态符合能实现治疗结果的特定释放模式。
环状或环化：如本文中所使用，术语“环状”是指存在连续环。环状分子不必是环形的，只是接合而形成亚单位的不间断链。环状分子，如本发明的经工程改造的RNA或mRNA，可以是单个单位或多聚体或包含一种或多种具有复杂或高级结构的组分。
细胞生长抑制：如本文中所使用，“细胞生长抑制”是指抑制、减少、压制细胞(例如哺乳动物细胞(例如人类细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合的生长、分裂或繁殖。
细胞毒性：如本文中所使用，“细胞毒性”是指杀死细胞(例如哺乳动物细胞(例如人类细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合或对该细胞(例如哺乳动物细胞(例如人类细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合造成有害的、有毒的或致命的作用。
递送：如本文中所使用，“递送”是指递送化合物、物质、实体、部分、货物蛋白或有效负载的动作或方式。
递送剂：如本文中所使用，“递送剂”是指至少部分地有助于在体内将核酸分子递送给靶向细胞的任何物质。
不稳定：如本文中所使用，术语“不稳定”或“不稳定区域”意指区域或分子的稳定性比同一区域或分子的起始、野生型或天然形式弱。
可检测标记：如本文中所使用，“可检测标记”是指与容易利用本领域中已知的方法(包括射线照相术、荧光、化学发光、酶活性、吸光度等等)加以检测的另一个实体连接、合并或缔合的一种或多种标记物、信号或部分。可检测标记包括放射性同位素、荧光团、发色团、酶、染料、金属离子、如生物素、亲和素、抗生蛋白链菌素和半抗原等配体、量子点等等。可检测标记可以位于本文中所公开的肽或蛋白质中的任何位置上。它们可以处于氨基酸、肽或蛋白质内或位于N或C末端上。
消化：如本文中所使用，术语“消化”意指分裂成较小的片块或组分。当涉及多肽或蛋白质时，消化产生肽。
远端：如本文中所使用，术语“远端”意指位于远离中心或远离目的点或区域处。
剂量分割因子(DSF)-剂量分割处理的PUD除以总日剂量或单次单位剂量的PUD的比率。所述值得自于对给药方案群组的比较。
囊封：如本文中所使用，术语“囊封”意指封围、环绕或包覆。
工程改造：如本文中所使用，本发明的实施方案在它们经设计而具有不同于起始点、野生型或天然分子的特征或性质(无论是结构的还是化学的)时被“工程改造”。
外来体：如本文中所使用，“外来体”是哺乳动物细胞分泌的囊泡。
表达：如本文中所使用，核酸序列的“表达”是指一个或多个以下事件：(1)由DNA序列产生RNA模板(例如通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'端加工)；(3)RNA翻译成多肽或蛋白质；和(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
特征：如本文中所使用，“特征”是指特性、性质或独特的要素。
制剂：如本文中所使用，“制剂”包括至少一种经修饰的核酸分子或mmRNA和递送剂。
片段：如本文中所使用的“片段”是指部分。举例来说，蛋白质片段可以包含通过消化从培养细胞中分离的全长蛋白而获得的多肽。
功能：如本文中所使用，“功能”生物分子是呈可展现其所特有的性质和/或活性的形式的生物分子。
同源性：如本文中所使用，术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性或相似性，则其被认为是彼此“同源的”。术语“同源的”必然是指至少两个序列(聚核苷酸或多肽序列)之间的比较。根据本发明，如果两个聚核苷酸序列编码的多肽与至少一个具有至少约20个氨基酸的延伸段具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％同一性，则其被认为是同源的。在一些实施方案中，同源聚核苷酸序列的特征在于能够编码具有至少4到5个唯一指定的氨基酸的延伸段。对于长度不到60个核苷酸的聚核苷酸序列，由编码具有至少4到5个唯一指定的氨基酸的延伸段的能力决定同源性。根据本发明，如果两个蛋白质序列与至少一个具有至少约20个氨基酸的延伸段具有至少约50％、60％、70％、80％或90％同一性，则所述蛋白质序列被认为是同源的。
同一性：如本文中所使用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如寡核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。举例来说，两个聚核苷酸序列的同一性百分比的计算可以通过出于最佳比较目的比对两个序列来进行(例如可以在第一和第二核酸序列之一或两者中引入间隙以便进行最佳比对，且出于比较目的可以忽视不同一的序列)。在某些实施方案中，出于比较目的而加以比对的序列的长度为参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较相应核苷酸位置上的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则所述分子在该位置上同一。两个序列之间的同一性百分比是所述序列所共有的同一位置的数目的函数，其考虑了间隙数目和各间隙的长度，需要引入所述间隙以便对两个序列进行最佳比对。序列比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来实现。举例来说，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用如以下文献中所描述的方法来确定：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.编,Academic Press,New York,1993；Sequence Analysis inMolecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Computer Analysis of SequenceData,第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,Humana Press,New Jersey,1994；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编,M Stockton Press,New York,1991，各文献以引用的方式并入本文中。举例来说，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用Meyers和Miller(CABIOS,1989,4:11-17；以全文引用的方式并入本文中)的算法来确定，所述算法已经并入到ALIGN程序(2.0版)中，所述程序使用PAM120权重残基表、间隙长度罚分12和间隙罚分4。或者，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵来确定。通常用于确定序列之间的同一性百分比的方法包括但不限于Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48:1073(1988)中所公开的方法，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
用于确定同一性的技术编码于公众可利用的计算机程序中。用于确定两个序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG程序包，Devereux,J.等,Nucleic AcidsResearch,12(1),387(1984)；以全文引用的方式并入本文中；BLASTP、BLASTN和FASTA，Atschul,S.F.等,J.Molec.Biol.,215,403(1990)；以全文引用的方式并入本文中。
抑制基因的表达：如本文中所使用，短语“抑制基因的表达”意指引起基因的表达产物的量减少。表达产物可以是从所述基因转录而来的RNA(例如mRNA)或由从所述基因转录而来的mRNA翻译的多肽。典型地，mRNA的水平减少导致由其翻译的多肽的水平减少。表达水平可以使用用于测量mRNA或蛋白质的标准技术来测定。
体外：如本文中所使用，术语“体外”是指事件发生在人造环境中，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在皮氏培养皿中等，而不是在生物体(例如动物、植物或微生物)内。
体内：如本文中所使用，术语“体内”是指事件发生在生物体(例如动物、植物或微生物或其细胞或组织)内。
分离：如本文中所使用，术语“分离”是指物质或实体已经与跟它缔合(无论是在自然界中或是在实验环境下)的组分中的至少一些分离。分离的物质相对于它们所缔合的物质来说，可以具有不同的纯度水平。分离的物质和/或实体可以与最初跟它们缔合的其它组分中的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多分离。在一些实施方案中，分离的试剂的纯度大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％。如本文中所使用，如果物质基本上不含其它组分，那么它就是“纯的”。基本上分离：“基本上分离”意指化合物基本上与自身形成或对它进行检测所处的环境分离。部分分离可以包括例如富含本公开的化合物的组合物。基本分离可以包括以重量计含有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％本公开的化合物或其盐的组合物。用于分离化合物和其盐的方法是本领域中的常规方法。
连接子：如本文中所使用，连接子是指原子团，例如10到1,000个原子，且可以由原子或基团构成，如但不限于碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺。所述连接子可以在第一端连接到核碱基或糖部分上的经修饰核苷或核苷酸，且在第二端连接到有效负载，例如可检测剂或治疗剂。所述连接子的长度可能足以不会干扰到核酸序列中的并入。所述连接子可以用于任何可用的目的，例如用于形成mmRNA多聚体(例如经由两个或更多个经修饰核酸分子或mmRNA分子的键结)或mmRNA缀合物，以及用于施用如本文中所描述的有效负载。可以并入连接子中的化学基团的实例包括但不限于烷基、烯基、炔基、酰胺基、氨基、醚、硫醚、酯、亚烷基、杂亚烷基、芳基或杂环基，各基团可以如本文中所描述任选地经取代。连接子的实例包括但不限于不饱和烷烃、聚乙二醇(例如乙二醇或丙二醇单体单元，例如二乙二醇、二丙二醇、三乙二醇、三丙二醇、四乙二醇或四乙二醇)和右旋糖酐聚合物和其衍生物。其它实例包括但不限于连接子内的可裂解部分，如例如二硫键(-S-S-)或偶氮键(-N＝N-)，所述可裂解部分可以使用还原剂或光解作用来裂解。可选择性裂解的键的非限制性实例包括例如可以使用三(2-羧基乙基)膦(TCEP)或其它还原剂和/或光解作用加以裂解的酰胺键，以及可以例如通过酸性或碱性水解加以裂解的酯键。
微RNA(miRNA)结合位点：如本文中所使用，微RNA(miRNA)结合位点表示核酸转录物中至少与miRNA的“种子”区域结合的核苷酸位置或区域。
经修饰：如本文中所使用，“经修饰”是指本发明分子的状态或结构有所改变。可以用许多方式修饰分子，包括以化学、结构和功能方式。在一个实施方案中，通过引入非天然核苷和/或核苷酸来修饰本发明的mRNA分子。
粘液：如本文中所使用，“粘液”是指具有粘性且包含粘蛋白糖蛋白的天然物质。
天然存在：如本文中所使用，“天然存在”意指在无人工帮助的情况下存在于自然界中。
非人类脊椎动物：如本文中所使用，“非人类脊椎动物”包括除了智人以外的所有脊椎动物，包括野生的和驯化的物种。非人类脊椎动物的实例包括但不限于哺乳动物，如羊驼、爪哇野牛、美洲野牛、骆驼、猫、牛、鹿、狗、驴、大额牛、山羊、豚鼠、马、美洲驼、骡、猪、兔、驯鹿、绵羊、水牛和牦牛。
脱靶：如本文中所使用，“脱靶”是指针对任何一个或多个靶点、基因或细胞转录物的任何非预期效应。
开放阅读框：如本文中所使用，“开放阅读框”或“ORF”是指在给定阅读框中不含终止密码子的序列。
可操作地连接：如本文中所使用，短语“可操作地连接”是指两个或更多个分子、构筑体、转录物、实体、部分等等之间的功能性连接。
抗体决定簇：如本文中所使用，“抗体决定簇”是指抗体的抗原结合位点。
患者：如本文中所使用，“患者”是指可能寻求或需要治疗、要求治疗、正接受治疗、将接受治疗的受试者，或因特定疾病或病状而受训练有素的专业人员照护的受试者。
肽：如本文中所使用，“肽”的长度小于或等于50个氨基酸，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
药学上可接受的：本文中采用短语“药学上可接受的”来指化合物、材料、组合物和/或剂型在合理医学判断的范围内适合与人类和动物的组织接触使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称。
药学上可接受的赋形剂：如本文中所使用的短语“药学上可接受的赋形剂”是指除本文中所描述的化合物以外且具有在患者中基本上无毒且非炎性的性质的任何成分(例如能够悬浮或溶解活性化合物的媒介物)。赋形剂可以包括例如：抗粘附剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣剂、压缩助剂、崩解剂、染料(颜料)、软化剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣剂、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷用油墨、吸附剂、悬浮或分散剂、甜味剂和水合水。示范性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二碱式)、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯基吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚烯吡酮、聚维酮、预胶凝淀粉、对羟苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羟基乙酸淀粉钠、山梨醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
药学上可接受的盐：本公开还包括本文中所描述的化合物的药学上可接受的盐。如本文中所使用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中通过将所存在的酸或碱部分转化成其盐形式(例如通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)对母体化合物进行改性。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(如胺类)的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基(如羧酸)的碱金属盐或有机盐等等。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果冻酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等等，以及无毒铵盐、季铵盐和胺阳离子盐，包括但不限于铵、四甲铵盐、四乙铵盐、甲胺盐、二甲胺盐、三甲胺盐、三乙胺盐、乙胺盐等等。本公开的药学上可接受的盐包括例如由无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可以利用常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。总体上，所述盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当碱或酸在水或有机溶剂或两者的混合物中反应来制备；总体上，优选非水性介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列举可在以下文献中获知：Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418页；Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编),Wiley-VCH,2008；和Berge等,Journal ofPharmaceutical Science,66,1-19(1977)，各文献以全文引用的方式并入本文中。
药学上可接受的溶剂合物：如本文中所使用的术语“药学上可接受的溶剂合物”意指其中将合适的溶剂分子并入晶格中的本发明化合物。合适的溶剂在所施用的剂量下在生理上是可耐受的。举例来说，溶剂合物可以通过从包括有机溶剂、水或其混合物的溶液中结晶、再结晶或沉淀来制备。合适的溶剂的实例是乙醇、水(例如单水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N'-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苯甲酯等等。当水是溶剂时，溶剂合物称为“水合物”。
药物动力学：如本文中所使用的“药物动力学”在它涉及决定施用于活生物体的物质的命运时，是指分子或化合物的任何一种或多种性质。将药物动力学分成若干个方面，包括吸收、分布、代谢和排泄的程度和速率。这通常称为ADME，其中：(A)吸收是物质进入血液循环的过程；(D)分布是物质在全身的体液和组织中分散或散布；(M)代谢(或生物转化)是母体化合物不可逆转化成子代谢物；和(E)排泄(或消除)是指物质从体内去除。在罕见的情况下，一些药物在身体组织中不可逆地累积。
药理效应：如本文中所使用，“药理效应”是在生物体或系统与外源性药剂接触或暴露于外源性药剂后在所述生物体或系统中出现的可测量的生物现象。药理效应可以产生治疗上有效的结果，如治疗疾病、病症、病状或感染、改良其一种或多种症状、对其进行诊断、预防和延迟其发作。所述生物现象的测量可以是定量的、定性的或相对于另一个生物现象来进行的。定量测量值可以是统计上显著的。定性测量值可以用程度或种类表示且可以具有至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的不同性。它们可以观察为存在或不存在、较好或较差、较大或较小。外源性药剂在涉及药理效应时为对生物体或系统来说完全或部分是外来的药剂。举例来说，对野生型生物分子的修饰无论是结构上的还是化学上的都将产生外源性药剂。同样，野生型分子并入到生物体或系统中并非天然地存在的化合物、分子或物质中或与其组合也将产生外源性药剂。本发明的经修饰mRNA包含外源性药剂。药理效应的实例包括但不限于细胞计数变化，如嗜中性白细胞、网织红细胞、粒细胞、红血球(红细胞)、巨核细胞、血小板、单核细胞、结缔组织巨噬细胞、表皮郎格罕氏细胞、破骨细胞、树突状细胞、小神经胶质细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、细胞毒性T细胞、天然杀手T细胞、B细胞、天然杀手细胞或网织红细胞的增加或减少。药理效应还包括本领域技术人员已知的血液化学性质、pH值、血红蛋白、红细胞压积的变化、酶(如但不限于肝脏酶AST和ALT)的水平变化、脂质型态、电解质、代谢标记物、激素或其它标记物或型态的变化。
物理化学：如本文中所使用，“物理化学”意指或涉及物理和/或化学性质。
预防：如本文中所使用，术语“预防”是指部分或完全延迟感染、疾病、病症和/或病状发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟感染、特定疾病、病症和/或病状的进展；和/或降低显现与所述感染、疾病、病症和/或病状相关的病变的风险。
前药：本公开还包括本文中所描述的化合物的前药。如本文中所使用，“前药”是指呈以某种物质、分子或实体为基础，使其可在发生化学或物理变化时即能充当治疗剂的形式的任何物质、分子或实体。前药可以以某种方式共价键结或螯合且在施用于哺乳动物受试者之前、当时或之后释放或转变成活性药物部分。前药可以通过以一定方式修饰化合物中所存在的官能团来制备，以至于使所述修饰在常规操作中或在体内发生裂解以得到母体化合物。前药包括其中羟基、氨基、巯基或羧基键结于任何基团的化合物，当施用于哺乳动物受试者时发生裂解而分别形成游离羟基、氨基、巯基或羧基。前药的制备和使用论述于以下文献中：T.Higuchi和V.Stella,“Pro-drugs as Novel Delivery Systems”,A.C.S.研讨会丛刊第14卷；和Bioreversible Carriers in Drug Design,Edward B.Roche编,AmericanPharmaceutical Association and Pergamon Press,1987，两者都以全文引用的方式并入在此。
增殖：如本文中所使用，术语“增殖”意指生长、扩大或增加或引起快速生长、扩大或增加。“增殖”意指能够增殖。“抗增殖”意指具有与增殖性质相反或不符合的性质。
目的蛋白质：如本文中所使用，术语“目的蛋白质”或“所希望的蛋白质”包括本文中所提供的蛋白质和其片段、突变体、变体和变化形式。
近端：如本文中所使用，术语“近端”意指位于中心或相关点或区域附近。
假尿苷：如本文中所使用，假尿苷是指核苷尿苷的C苷异构体。“假尿苷类似物”是假尿苷的任何变型、变体、同种型或衍生物。举例来说，假尿苷类似物包括但不限于1-羧基甲基-假尿苷、1-丙炔基-假尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)和2'-O-甲基-假尿苷(ψm)。
纯化：如本文中所使用，“纯化”意指使得基本上为纯的或清除不需要的组分、材料污垢、混杂物或不纯物。
样品：如本文中所使用，术语“样品”是指其组织、细胞或组成部分(例如体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊髓液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液)的子集。样品还可以包括由完整生物体或其组织、细胞或组成部分的子集或其小部分或部分制备的匀浆、溶解物或提取物，包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部切片、泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官。样品还指培养基，如营养肉汤或凝胶，其可以含有细胞组分，如蛋白质或核酸分子。
信号序列：如本文中所使用，短语“信号序列”是指可以引导蛋白质转运或定位的序列。
单次单位剂量：如本文中所使用，“单次单位剂量”是在一次剂量中/一次/以单一途径/在单一接触点(即，单个施用事件中)所施用的任何治疗剂的剂量。
相似性：如本文中所使用，术语“相似性”是指聚合物分子之间，例如聚核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。聚合物分子彼此的相似性百分比的计算可以用与同一性百分比的计算相同的方式来进行，但相似性百分比的计算考虑了如本领域中所理解的保守取代。
分次剂量：如本文中所使用，“分次剂量”是将单次单位剂量或总日剂量分成两次或更多次剂量。
稳定：如本文中所使用，“稳定”是指化合物的稳固程度足以经受住从反应混合物中分离达到可用的纯度，且优选能够配制成有效治疗剂。
稳定化：如本文中所使用，术语“稳定化”、“稳定化的”、“稳定化的区域”意指使得或变得稳定。
受试者：如本文中所使用，术语“受试者”或“患者”是指可以例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的施用根据本发明的组合物的任何生物体。典型受试者包括动物(例如哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物和人类)和/或植物。
基本上：如本文中所使用，术语“基本上”是指展现相关特性或性质的总体程度或接近总体的范围或程度的定性条件。生物学领域技术人员应了解，生物学和化学现象即使发生也很少达到完全和/或进行到完全或者实现或避免绝对结果。因此本文中使用术语“基本上”来囊括许多生物学和化学现象中固有的潜在完全性缺乏。
基本上相等：如本文中所使用，在其涉及剂量之间的倍数差异时，该术语意指加/减2％。
基本上同时：如本文中所使用且在其涉及多次剂量时，该术语意指在2秒内。
罹患：“罹患”某一疾病、病症和/或病状的个体已经被诊断有或显示出某一疾病、病症和/或病状的一个或多个症状。
易受影响：易受某一疾病、病症和/或病状影响的个体尚未被诊断有和/或可能未展现所述疾病、病症和/或病状的症状，但具有显现某一疾病或其症状的倾向性。在一些实施方案中，易受某一疾病、病症和/或病状(例如癌症)影响的个体的特征可在于以下的一项或多项：(1)与显现所述疾病、病症和/或病状相关的基因突变；(2)与显现所述疾病、病症和/或病状相关的遗传多态性；(3)与所述疾病、病症和/或病状相关的蛋白质和/或核酸的表达和/或活性增加或降低；(4)与显现所述疾病、病症和/或病状相关的习惯和/或生活方式；(5)所述疾病、病症和/或病状的家族史；和(6)暴露于和/或感染与显现所述疾病、病症和/或病状相关的微生物。在一些实施方案中，易受某一疾病、病症和/或病状影响的个体将显现所述疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易受某一疾病、病症和/或病状影响的个体不会显现所述疾病、病症和/或病状。
持续释放：如本文中所使用，术语“持续释放”是指药物组合物或化合物释放型态符合特定时间段内的释放速率。
合成的：术语“合成的”意指由人手工生产、制备和/或制造。本发明的聚核苷酸或多肽或其它分子的合成可以是化学合成或酶促合成。
靶向细胞：如本文中所使用，“靶向细胞”是指任何一个或多个相关细胞。所述细胞可以在体外、体内、原位或在生物体的组织或器官中发现。所述生物体可以是动物，优选为哺乳动物，更优选为人类且最优选为患者。
治疗剂：术语“治疗剂”是指当施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或能引发所希望的生物学和/或药理学作用的任何药剂。
治疗有效量：如本文中所使用，术语“治疗有效量”意指欲递送的药剂(例如核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量在施用于罹患疾病、病症和/或病状或易受其影响的受试者时足以治疗所述疾病、病症和/或病状、改良其症状、进行诊断、预防所述疾病、病症和/或病状和/或延迟其发作。
治疗上有效的结果：如本文中所使用，术语“治疗上有效的结果”意指足以在罹患感染、疾病、病症和/或病状或易受其影响的受试者中治疗所述感染、疾病、病症和/或病状、改良其症状、诊断、预防所述感染、疾病、病症和/或病状和/或延迟其发作的结果。
总日剂量：如本文中所使用，“总日剂量”是在24小时周期内给予的或处方规定的量。其可以作为单次单位剂量施用。
转录因子：如本文中所使用，术语“转录因子”是指例如通过活化或压制转录而调控DNA转录成RNA的DNA结合蛋白。一些转录因子单独实现转录调控，而其它转录因子与其它蛋白质协同作用。一些转录因子可以在某些条件下活化和压制转录。总体来说，转录因子结合高度类似于靶基因的调控区中的特异性共同序列的特异性靶序列。转录因子可以调控单独靶基因或靶基因与其它分子的复合物的转录。
治疗：如本文中所使用，术语“治疗”是指部分或完全缓解、改善、改良、减轻特定疾病、病症和/或病状的一个或多个症状或特征、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或降低其发病率。举例来说，“治疗”癌症可能是指抑制肿瘤的存活、生长和/或扩散。出于降低显现与疾病、病症和/或病状相关的病变的风险的目的，对未展现疾病、病症和/或病状的迹象的受试者和/或仅展现疾病、病症和/或病状的早期迹象的受试者施用治疗。
未经修饰：如本文中所使用，“未经修饰”是指在以任何方式改变之前的任何物质、化合物或分子。未经修饰可以但并不总是指生物分子的野生型或天然形式。分子可以经历一系列修饰，因此，各经修饰的分子可以充当“未经修饰”的起始分子以进行后续修饰。
活力：如本文中所使用，术语“活力”是指物体(活生物体、人工系统、器官、组织、外植体等)维持自身或恢复其潜能的能力。在本发明的上下文中，可以通过使用经修饰mRNA来提高器官活力。“增加”器官或组织或外植体的“活力”是指提高所述器官、组织或外植体的可用性或完整性。“增加”器官或组织或外植体的“寿命”是指随时间变化延长所述器官或组织或外植体维持所希望的状态或恢复所希望的状态的能力。如本文中所使用，器官、组织或外植体“状态”是指生物的生理学、物理或化学状态。“可用状态”是所述器官、组织或外植体可以用于所希望的研究、实验、调查、试验或其它探索性事件的状态。“增加”器官、组织或外植体的“功能性”意指维持或提高所述器官、组织或外植体像正常情况那样起作用的能力。
等效形式和范围
本领域技术人员应认识到或仅使用常规实验就能够确定本文中所描述的根据本发明的具体实施方案的许多等效形式。不希望本发明的范围受限于上述发明描述，而是如所附权利要求书中所阐述。
在权利要求书中，除非有相反指示或另外由上下文显而易见，否则如“一个(种)”、“该”和“所述”等用词可以意指一个(种)或多于一个(种)。除非有相反指示或另外由上下文显而易见，否则如果一个、多于一个或所有群组成员存在于、用于给定产物或工艺中或者另外与其相关，则在群组中的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或发明描述被视为得到满足。本发明包括恰好一个群组成员存在于、用于给定产物或工艺中或另外与其相关的实施方案。本发明包括超过一个或所有群组成员存在于、用于给定产物或工艺中或另外与其相关的实施方案。
还应注意，术语“包含”意在为开放性的且允许包括其它要素或步骤。
在给出范围的情况下，包括终点。此外，应了解，除非另外指出或另外由上下文和本领域技术人员的理解显而易见，否则表达为范围的值可以采用本发明的不同实施方案中的所述范围内的任何具体值或子范围，除非上下文另外清楚规定，否则精确到所述范围下限单位的十分之一。
另外，应了解，属于现有技术的本发明的任何特定实施方案可以明确地从任何一项或多项权利要求中排除在外。由于认为所述实施方案为本领域技术人员所知，所以即使本文中未明确阐述排除，也可以将它们排除在外。本发明组合物的任何特定实施方案(例如由其编码的任何核酸或蛋白质；任何产生方法；任何使用方法等)都可以由于任何原因而从任何一项或多项权利要求中排除在外，而无论是否与现有技术的存在有关。
即使在引用时未明确陈述，所有引用源，例如本文中所引用的参考文献、公布、数据库、数据库条目和技术也是引用的方式并入本申请中。在引用源与本申请的叙述矛盾的情况下，应以本申请的叙述为准。
实施例
实施例1.经修饰的mRNA的产生
使用标准实验室方法和材料制造根据本发明的经修饰mRNA。
具有各种上游或下游添加(β-球蛋白、标签等)的开放阅读框是从DNA2.0(MenloPark，CA)订购，且典型地含有具有XbaI识别的多克隆位点。在收到构筑体后，将其复原且转化成化学上胜任的大肠杆菌。对于本发明，使用NEB DH5-α胜任大肠杆菌。根据NEB说明书，使用100ng质粒进行转化。方案如下：
1.将具有NEB 5-α胜任大肠杆菌细胞的管子在冰上解冻10分钟。
2.向细胞混合物中加入含有1pg到100ng质粒DNA的1到5μl。小心地轻弹管子4到5次，以混合细胞与DNA。不进行涡旋。
3.将混合物放在冰上30分钟。不进行混合。
4.在42℃下热冲击恰好30秒。不进行混合。
5.放在冰上5分钟。不进行混合。
6.吸移950μl室温SOC到混合物中。
7.放在37℃下60分钟。用力振荡(250rpm)或旋转。
8.将选择板升温到37℃。
9.通过轻弹管子和倒置来彻底混合细胞。
将50到100μl各稀释物涂抹到选择板上且在37℃下孵育过夜。或者，在30℃下孵育24到36小时或在25℃下孵育48小时。
然后使用单一集落接种5ml使用适当抗生素的LB生长培养基，且然后允许生长(250RPM，37℃)5小时。然后将这用于接种200ml培养基且允许在相同条件下生长过夜。
为了分离质粒(达850μg)，使用Invitrogen PureLinkTM HiPure Maxiprep试剂盒(Carlsbad，CA)，按照制造商说明书进行大量制备。
为了产生cDNA以用于体外转录(IVT)，首先使用如XbaI等限制酶将质粒线性化。利用XbaI的典型限制消化将包括以下：质粒1.0μg；10×缓冲液1.0μl；XbaI 1.5μl；dH20，达10μl；在37℃下孵育1小时。如果以实验室规模(<5μg)进行，则使用Invitrogen的PureLinkTM PCR Micro试剂盒(Carlsbad，CA)，根据制造商说明书净化反应。更大规模的纯化可能需要用具有更大负载容量的产品来进行，如Invitrogen的标准PureLinkTM PCR试剂盒(Carlsbad，CA)。净化之后，使用NanoDrop定量经线性化的载体，且使用琼脂糖凝胶电泳进行分析以证实线性化。
作为一个非限制性实例，G-CSF可以代表目的多肽。将实施例1到5中所述的步骤中所使用的序列示于表5中。应注意，表5中已经将起始密码子(ATG或AUG)加下划线。
表5.G-CSF序列
实施例2：用于cDNA产生的PCR
使用2×KAPA HiFiTM HotStart ReadyMix，利用Kapa Biosystems(Woburn，MA)进行用于制备cDNA的PCR程序。这个系统包括2×KAPA ReadyMix 12.5μl；正向引物(10μM)0.75μl；反向引物(10μM)0.75μl；模板cDNA 100ng；以及稀释到25.0μl的dH20。反应条件是95℃、5分钟和25个循环的98℃、20秒，然后是58℃、15秒，然后是72℃、45秒，然后是72℃、5分钟，然后是4℃到结束。
本发明的反向引物在mRNA中并入了poly-T120以代替poly-A120。具有较长或较短poly(T)区的其它反向引物可以用于调节mRNA中的poly(A)尾的长度。
使用Invitrogen的PureLinkTM PCR Micro试剂盒(Carlsbad，CA)，根据制造商说明书净化反应物(达5μg)。更大规模的反应将需要使用具有更大容量的产品进行净化。在净化之后，使用NanoDrop定量cDNA且利用琼脂糖凝胶电泳进行分析以证实cDNA具有所期望的尺寸。然后提交cDNA以进行测序分析，之后进行体外转录反应。
实施例3.体外转录
体外转录反应产生含有经修饰核苷酸或经修饰RNA的mRNA。使用天然和非天然三磷酸核苷酸(NTP)自制输入NTP混合物。
典型体外转录反应包括以下：
1.模板cDNA        1.0μg
2.10×转录缓冲液(400mM Tris-HCl pH8.0、190mM MgCl2、50mM DTT、10mM亚精胺)     2.0μl
3.定制NTP(各25mM)7.2μl
4.RNA酶抑制剂     20U
5.T7 RNA聚合酶    3000U
6.dH20           达20.0μl，以及
7.在37℃下孵育3小时到5小时。
粗IVT混合物可以在4℃下存储过夜以便第二天进行净化。然后使用1U无RNA酶的DNA酶来消化原始模板。在37℃下孵育15分钟之后，使用Ambion的MEGAclearTM试剂盒(Austin，TX)，按照制造商说明书纯化mRNA。这个试剂盒可以纯化达500μg的RNA。净化之后，使用NanoDrop定量RNA且利用琼脂糖凝胶电泳进行分析以证实RNA具有适当的尺寸且未发生RNA降解。
实施例4.mRNA的酶促加帽
如下进行mRNA的加帽，其中混合物包括：IVT RNA 60μg到180μg和dH20(达72μl)。在65℃下将混合物孵育5分钟以使RNA变性，然后立即转移到冰上。
该方案然后涉及混合10×加帽缓冲液(0.5M Tris-HCl(pH8.0)、60mM KCl、12.5mMMgCl2)(10.0μl)；20mM GTP(5.0μl)；20mM S-腺苷甲硫氨酸(2.5μl)；RNA酶抑制剂(100U)；2'-O-甲基转移酶(400U)；牛痘病毒加帽酶(鸟苷酰转移酶)(40U)；dH20(达28μl)；以及在37℃下孵育30分钟(对于60μg RNA)或多达2小时(对于180μg RNA)。
然后使用Ambion的MEGAclearTM试剂盒(Austin，TX)，按照制造商说明书纯化mRNA。在净化之后，使用NanoDrop(ThermoFisher，Waltham，MA)定量RNA且利用琼脂糖凝胶电泳进行分析以证实RNA具有适当的尺寸且未发生RNA降解。还可以通过进行反转录PCR以产生供测序用的cDNA来对RNA产物进行测序。
实施例5.多聚腺苷酸加尾反应
在cDNA中无多聚胸苷酸的情况下，必须在净化最终产物之前进行多聚腺苷酸加尾反应。这是通过混合已加帽的IVT RNA(100μl)、RNA酶抑制剂(20U)、10×加尾缓冲液(0.5M Tris-HCl(pH8.0)、2.5M NaCl、100mM MgCl2)(12.0μl)、20mM ATP(6.0μl)、多聚腺苷酸聚合酶(20U)、dH20(达123.5μl)且在37℃下孵育30分钟来进行。如果多聚腺苷酸尾已经在转录物中，则可以跳过加尾反应且直接着手于用Ambion的MEGAclearTM试剂盒进行净化(达500μg)。多聚腺苷酸聚合酶优选为表达于酵母中的重组酶。
实施例6.酶帽对比化学帽
示例性加帽结构。
可以在体外转录反应期间，使用以下化学RNA帽类似物，根据制造商方案伴随完成经修饰RNA的5'-加帽，以产生5'-鸟苷帽结构：3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G；G(5')ppp(5')A；G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')A；m7G(5')ppp(5')G(New England BioLabs，Ipswich，MA)。可以在转录后使用牛痘病毒加帽酶完成经修饰RNA的5'-加帽，以产生“Cap 0”结构：m7G(5')ppp(5')G(New England BioLabs，Ipswich，MA)。可以使用牛痘病毒加帽酶和2'-O-基-转移酶产生Cap 1结构，以产生：m7G(5')ppp(5')G-2'-O-甲基。可以由Cap 1结构产生Cap 2结构，紧跟着使用2'-O-甲基-转移酶进行5'-倒数第三个核苷酸的2'-O-甲基化。可以由Cap 2结构产生Cap 3结构，紧跟着使用2'-O-甲基-转移酶进行5'-倒数第四个核苷酸的2'-O-甲基化。酶优选来源于重组来源。
当转染到哺乳动物细胞中时，经修饰mRNA的稳定性可以介于12到18小时之间或超过18小时，例如24、36、48、60、72或超过72小时。
实施例7.化学帽对比酶衍生帽蛋白表达测定
可以将含有ARCA帽类似物或Cap1结构的编码人类G-CSF的合成mRNA以相等浓度转染到人原代角质细胞中。转染后6、12、24和36小时，可以利用ELISA测定分泌到培养基中的G-CSF的量。可向培养基中分泌较高水平的G-CSF的合成mRNA将对应于具有较高水平的翻译胜任力的帽结构的合成mRNA。
实施例8.化学帽对比酶衍生帽纯度分析
可以使用变性琼脂糖-脲凝胶电泳或HPLC分析来比较含有ARCA帽类似物或Cap1结构粗合成产物的编码人类G-CSF的合成mRNA的纯度。与具有多个谱带或条痕谱带的合成mRNA相比，电泳显示具有单个统一谱带的合成mRNA对应于较高纯度的产物。具有单个HPLC峰的合成mRNA也将对应于较高纯度的产物。效率较高的加帽反应将提供更纯的mRNA群体。
实施例9.化学帽对比酶衍生帽细胞因子分析
可以将含有ARCA帽类似物或Cap1结构的编码人类G-CSF的合成mRNA以多种浓度转染到人原代角质细胞中。转染后6、12、24和36小时，可以利用ELISA来测定分泌到培养基中的如TNF-α和IFN-β等促炎性细胞因子的量。可向培养基中分泌较高水平的促炎性细胞因子的合成mRNA将对应于含有免疫活化帽结构的合成mRNA。
实施例10.化学帽对比酶衍生帽加帽反应效率
可以在对加帽mRNA进行核酸酶处理之后利用LC-MS分析含有ARCA帽类似物或Cap1结构的编码人类G-CSF的合成mRNA的加帽反应效率。对加帽mRNA的核酸酶处理将产生游离核苷酸与加帽5'-5-三磷酸帽结构的混合物，可利用LC-MS进行检测。LC-MS谱图上的加帽产物的量可以表示为占得自于反应的总mRNA的百分比，且将对应于加帽反应效率。LC-MS显示，加帽反应效率较高的帽结构的加帽产物的量将较高。
实施例11.经修饰RNA或RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
将个别modRNA(200到400ng，体积20μl)或反转录PCR产物(200到400ng)装载到非变性1.2％琼脂糖E-凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上的孔中，且根据制造商方案跑胶12到15分钟。
12.以
将含经修饰RNA的TE缓冲液(1μl)用于Nanodrop UV吸收率读数，以定量得自于体外转录反应的各经修饰RNA的产率。
使用类脂质来配制经修饰mRNA
使用了用于体外转录的标准实验室方法和材料制造经修饰mRNA(mmRNA)，只是核苷酸混合物含有经修饰的核苷酸。对于未合并腺苷类似物的mmRNA，目的基因的开放阅读框(ORF)侧接含有强Kozak翻译起始信号的5'未翻译区(UTR)和以用于模板化添加多聚腺苷酸尾的寡(dT)序列终止的α-球蛋白3'UTR。在无寡(dT)序列的情况下合成含腺苷的mmRNA以允许转录后poly(A)聚合酶poly(A)加尾。在一些情况下，通过在100％置换相应的天然核苷酸或以所指示的百分比部分置换相应的天然核苷酸的体外转录期间并入表2中所指示的列表中的经化学修饰的核苷酸来修饰mmRNA。
在加入到细胞中之前通过以设定比率混合mmRNA与类脂质来配制经修饰mRNA以进行体外实验。体内制剂需要加入额外成分以有助于全身循环。为了测试这些类脂质形成适合体内研究的粒子的能力，将用于siRNA-类脂质制剂的标准配制工艺用作起始点。初始mmRNA-类脂质制剂由由42％类脂质、48％胆固醇和10％PEG构成的粒子组成，有可能进一步优化比率。在形成粒子之后，加入mmRNA且允许与复合物形成整体。使用标准染料排除测定来测定囊封效率。
实施例14.使用类脂质制剂在人类细胞体内表达经修饰RNA编码的蛋白质
可以使用各种不同的类脂质进行RNA转染，包括但不限于98N12-5、C12-200和MD1。已经证明98N12-5(Akinc等,Nat Biotechnol.2008 26:561-569；Frank-Kamenetsky等,Proc Natl Acad Sci U S A.2008 105:11915-11920；Akinc等,Mol Ther.2009 17:872-879；以全文引用的方式并入本文中)、C12-200(Love等,Proc Natl Acad Sci U S A.2010107:1864-1869)和MD1(Alnylam Oligonucleotide Therapeutic Society 2011年海报展示,http://www.alnylam.com/capella/wp-content/uploads/2011/09/ALNY-OTS-NextGenLNPs-Sep20111.pdf；以全文引用的方式并入本文中)在siRNA递送时是有效的，但未使用单股mmRNA进行测试。
以不同的类脂质:mmRNA比率凭经验测试用于测试体外转染的mmRNA:类脂质的比率。使用siRNA和类脂质的先前研究已经利用了2.5:1、5:1、10:1和15:1的类脂质:siRNAwt:wt比率。考虑到mmRNA相对于siRNA的长度较长，较低的类脂质:mmRNA wt:wt比率可以是有效的。另外，为了进行比较，还使用RNAiMax(Invitrogen)或TRANSIT-mRNA(Mirus Bio)阳离子脂质递送媒介物配制mmRNA。经类脂质配制的荧光素酶、GFP、G-CSF和EPO mmRNA表达所希望的蛋白质产物的能力可以利用有关荧光素酶表达的发光、针对GFP表达的流式细胞术和针对G-CSF和促红细胞生成素(EPO)分泌的ELISA来证实。
实施例15.使用类脂质制剂经静脉内注射后在体内表达经修饰RNA编码的蛋白质
可以使用各种不同的类脂质，包括98N12-5、C12-200和MD1，来进行制剂的全身静脉内施用。已经证明了98N12-5(Akinc等,Nat Biotechnol.2008 26:561-569；Frank-Kamenetsky等,Proc Natl Acad Sci U S A.2008 105:11915-11920；Akinc等,Mol Ther.2009 17:872-879)、C12-200(Love等,Proc Natl Acad Sci U S A.2010 107:1864-1869；Leuschner等,Nat Biotechnol 2011 29:1005-1010)和MD1(Alnylam OligonucleotideTherapeutic Society 2011年海报展示,http://www.alnylam.com/capella/wp-content/uploads/2011/09/ALNY-OTS-NextGenLNPs-Sep20111.pdf)在siRNA体内递送和mRNA静默时都是有效的，但未使用单股mmRNA进行测试。
可以将含有mmRNA的类脂质制剂经静脉内注射到动物体内。可以在从所述动物收集的血液和其它器官样品(如肝和脾)中评估mmRNA编码的蛋白质的表达。进行单次剂量静脉内研究还将允许评估所希望产物的表达的幅度、剂量反应和持久性。在一项研究中，可以使用基于类脂质的制剂，即基于98N12-5、C12-200、MD1和其它类脂质的制剂来将荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、人类G-CSF或人类促红细胞生成素(EPO)mmRNA递送给动物。在如先前所描述用类脂质制剂配制mmRNA之后，将动物分到接收生理盐水制剂或类脂质制剂的群组中，所述类脂质制剂含有选自荧光素酶、GFP、人类G-CSF和人类EPO的四种不同的mmRNA之一。在注射给动物之前，在PBS中稀释含有mmRNA的类脂质制剂。然后对动物施用在10mg/kg剂量到低达1ng/kg剂量范围内的单次剂量的经配制mmRNA，优选范围是10mg/kg到100ng/kg，取决于单位动物体重所注射的mmRNA的量。如果所述动物是小鼠，则对于20克小鼠来说，类脂质制剂的静脉内注射体积的最大值是0.2ml。在施用mmRNA-类脂质之后，可以在不同的时间点获得血清、组织和组织溶解物且测定mmRNA编码的产物的水平。用类脂质配制的荧光素酶、GFP、G-CSF和EPO mmRNA表达所希望的蛋白质产物的能力可以利用有关荧光素酶表达的发光、针对GFP表达的流式细胞术和针对G-CSF和促红细胞生成素(EPO)分泌的ELISA来证实。
还可以针对多剂量方案进行其它研究，以测定使用mmRNA的最大表达、评估mmRNA驱动的表达的饱和性(通过并行地或按顺序给予对照和活性mmRNA制剂来实现)和确定重复药物施用的可行性(通过相隔数周或数月给予mmRNA剂量，然后测定表达水平是否受如免疫原性等因素影响来实现)。除了检测所表达的蛋白产物以外，还可以通过分析得自于所测试的动物的样品并分别检测粒细胞和红细胞计数的增加来确定对如G-CSF和EPO等蛋白质的生理功能的评估。
实施例16.使用类脂质制剂经肌肉内和/或皮下注射后在体内表达经修饰RNA编码 的蛋白质
需要对经由肌肉内注射途径或皮下注射途径使用类脂质制剂递送寡核苷酸(包括siRNA)进行评估，因为先前对此没有过相关报道。将评估含mmRNA的类脂质制剂的肌肉内和/或皮下注射以确定它们是否能够产生所希望的蛋白质的局部和全身表达。
可以将含mmRNA的类脂质制剂经肌肉内和/或皮下注射给动物。可以在肌肉或皮下组织内和全身血液以及如肝和脾等其它器官中评估mmRNA编码的蛋白质的表达。将评估基于98N12-5、C12-200和MD1的类脂质制剂以及可能的其它基于类脂质的制剂递送荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、人类G-CSF或人类促红细胞生成素(EPO)mmRNA的能力。进行单次剂量研究还将允许评估所希望的产物的表达幅度、剂量反应和持久性。在如先前所描述用类脂质制剂配制mmRNA之后，将动物分到接收生理盐水制剂或含有选自荧光素酶、GFP、人类G-CSF、人类EPO这四种不同的mmRNA之一的类脂质制剂的群组中。注射之前，在PBS中稀释含有mmRNA的类脂质制剂，且对动物施用在50mg/kg到低达1ng/kg剂量范围内的单次肌肉内剂量的经配制mmRNA，优选范围是10mg/kg到100ng/kg。如果所测试的动物是小鼠，如果是一次性施用于后肢，则最大剂量可以是大约1mg mmRNA或低达0.02ng mmRNA。同样，对于皮下施用，在对动物施用介于400mg/kg到低达1ng/kg剂量范围内的单次皮下剂量的经配制mmRNA之前，将含mmRNA的类脂质制剂稀释于PBS中。优选剂量范围可以是80mg/kg到100ng/kg。如果所测试的动物是小鼠，如果剂量是一次性经皮下施用，则所施用的最大剂量可以是大约8mgmmRNA或低达0.02ng mmRNA。
对于20克小鼠，优选单次肌肉内注射的体积最大为0.025ml，且单次皮下注射的体积最大为0.2ml。取决于动物的体重来计算施用于动物的mmRNA剂量。在施用mmRNA-类脂质之后，可以在不同的时间点获得血清、组织和组织溶解物且测定mmRNA编码产物的水平。用类脂质配制的荧光素酶、GFP、G-CSF和EPO mmRNA表达所希望的蛋白质产物的能力可以利用有关荧光素酶表达的发光、针对GFP表达的流式细胞术以及针对G-CSF和促红细胞生成素(EPO)分泌的ELISA来证实。
还可以针对多剂量方案进行其它研究，以测定使用mmRNA的最大表达、评估mmRNA驱动的表达的饱和性(通过并行地或按顺序给予对照和活性mmRNA制剂来实现)和确定重复药物施用的可行性(通过相隔数周或数月给予mmRNA剂量，然后测定表达水平是否受如免疫原性等因素影响来实现)。还可以利用在一个时间点利用多个皮下或肌肉内注射部位的研究，来进一步增加mmRNA药物暴露和提高蛋白质产量。除了检测所表达的蛋白质产物以外，还可以通过分析得自于所测试的动物的样品并且分别检测粒细胞和红细胞计数的增加来评估如G-CSF和EPO等蛋白质的生理功能。
实施例17.VEGF-A的体外转染
经由反向转染将人类血管内皮生长因子同种型A(VEGF-A)修饰型mRNA(mRNA序列如SEQ ID NO:257中所示；序列中未显示具有约160个核苷酸的多聚腺苷酸尾；5'帽，Cap1)转染于24孔多孔板中的人类角质细胞中。使人类角质细胞在得自于Invitrogen(Carlsbad，CA)的具有补充物S7的培养基中生长直到它们达到50％到70％汇合度。用0、46.875、93.75、187.5、375、750和1500ng编码VEGF-A的经修饰mRNA(mmRNA)与得自于Invitrogen(Carlsbad，CA)的RNAIMAXTM的复合物转染所述细胞。RNA:RNAIMAXTM复合物是通过首先在室温下将RNA与无补充物培养基一起在5X体积稀释度下孵育10分钟而形成。在第二个小瓶中，在室温下将RNAIMAXTM试剂与无补充物培养基一起在10X体积稀释度下一起孵育10分钟。然后将RNA小瓶与RNAIMAXTM小瓶混合，且在室温下孵育20到30分钟，之后以逐滴方式加入到细胞中。
经人类角质细胞转染的经充分优化的编码VEGF-A的mRNA包括翻译期间的修饰，如天然三磷酸核苷(NTP)、各尿苷位点处的假尿苷和各胞嘧啶位点处的5-甲基胞嘧啶(假-U/5mC)、以及各尿苷位点的N1-甲基-假尿苷和各胞嘧啶位点的5-甲基胞嘧啶(N1-甲基-假-U/5mC)。用编码VEGF-A的mmRNA转染细胞，且对于各浓度，在转染后6、12、24和48小时使用得自于Invitrogen(Carlsbad，CA)的ELISA试剂盒，按照制造商推荐的说明书测量培养基中分泌的VEGF-A浓度(ρg/ml)。表6中所示的这些数据显示，编码VEGF-A的经修饰mRNA能够在人类角质细胞中得以翻译，且VEGF-A被输送到细胞外且释放到细胞外环境中。
表6.VEGF-A给药和蛋白质分泌
实施例18.VEGF修饰型mRNA的体外表达
利用已经与得自于Invitrogen(Carlsbad，CA)的脂质转染胺2000形成复合物的经修饰mRNA(mmRNA)VEGF-A(mRNA序列如SEQ ID NO:257中所示；序列中未显示具有约160个核苷酸的多聚腺苷酸尾；5'帽，Cap1；经5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰)，以表7中所示的浓度转染HEK293细胞。利用ELISA检测蛋白质表达且将蛋白质(pg/ml)示于表7中。
表7.蛋白质表达
实施例19.假尿苷和N1-甲基假尿苷的定向SAR
随着最近聚焦于嘧啶核苷假尿苷，设计了一系列结构-活性研究以研究含有对假尿苷或N1-甲基-假尿苷的修饰的mRNA。
设计本研究是用于探测当在N1位、C6位、2位、4位和磷酸酯骨架上进行修饰时链长度的效应、亲脂性的增加、环结构的存在和疏水性或亲水性相互作用的变化。还研究了稳定性。
为此，研究了多种修饰，包括烷基化、环烷化、烷基环烷化、芳基化、烷基芳基化、具有氨基的烷基化部分、具有羧酸基的烷基化部分和含有氨基酸带电部分的烷基化部分。烷基化程度总体上为C1-C6。化学修饰的实例包括表8和表9中所列出的那些。
表8.假尿苷和N1-甲基假尿苷SAR
表9.假尿苷和N1-甲基假尿苷SAR
实施例20.并入天然存在和非天然存在的核苷
将天然存在和非天然存在的核苷并入到编码目的多肽的mRNA中。表10和11中给出了这些核苷的实例。在本发明的聚核苷酸中研究了某些市售三磷酸核苷(NTP)。表11中给出了这些三磷酸核苷的选择。然后检验所得mRNA产生蛋白质、诱导细胞因子和/或产生治疗结果的能力。
表10.天然存在和非天然存在的核苷
化学修饰 化合物编号 天然存在
N4-甲基-胞嘧啶 1 Y
N4,N4-二甲基-2'-OMe-胞嘧啶 2 Y
5-氧乙酸-甲酯-尿苷 3 Y
N3-甲基-假-尿苷 4 Y
5-羟基甲基-胞嘧啶 5 Y
5-三氟甲基-胞嘧啶 6 N
5-三氟甲基-尿苷 7 N
5-甲基-氨基-甲基-尿苷 8 Y
5-羧基-甲基-氨基-甲基-尿苷 9 Y
5-羧基甲基氨基甲基-2'-OMe-尿苷 10 Y
5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷 11 Y
5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷 12 Y
5-甲氧基-羰基-甲基-尿苷 13 Y
5-甲氧基-羰基-甲基-2'-OMe-尿苷 14 Y
5-氧乙酸-尿苷 15 Y
3-(3-氨基-3-羧基丙基)-尿苷 16 Y
5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯 17 Y
5-(羧基羟基甲基)尿苷 18 Y
表11.非天然存在的三磷酸核苷
化学修饰 化合物编号 天然存在
N1-Me-GTP 1 N
2'-OMe-2-氨基-ATP 2 N
2'-OMe-假-UTP 3 Y
2'-OMe-6-Me-UTP 4 N
2'-叠氮基-2'-脱氧-ATP 5 N
2'-叠氮基-2'-脱氧-GTP 6 N
2'-叠氮基-2'-脱氧-UTP 7 N
2'-叠氮基-2'-脱氧-CTP 8 N
2'-氨基-2'-脱氧-ATP 9 N
2'-氨基-2'-脱氧-GTP 10 N
2'-氨基-2'-脱氧-UTP 11 N
2'-氨基-2'-脱氧-CTP 12 N
2-氨基-ATP 13 N
8-氮杂-ATP 14 N
黄苷-5'-TP 15 N
5-溴-CTP 16 N
2'-F-5-甲基-2'-脱氧-UTP 17 N
5-氨基烯丙基-CTP 18 N
2-氨基-核苷-TP 19 N
实施例21.并入对核碱基和碳水化合物(糖)的修饰
将天然存在和非天然存在的核苷并入到编码目的多肽的mRNA中。检验具有对核碱基和碳水化合物(糖)的修饰的市售核苷和NTP并入到mRNA中和产生蛋白质、诱导细胞因子和/或产生治疗结果的能力。表22和23中示出了这些核苷的实例。
表22.组合修饰
化学修饰 化合物编号
5-碘-2'-氟-脱氧尿苷 1
5-碘-胞苷 6
2'-溴-脱氧尿苷 7
8-溴-腺苷 8
8-溴-鸟苷 9
2,2'-脱水-胞苷盐酸盐 10
2,2'-脱水-尿苷 11
2'-叠氮基-脱氧尿苷 12
2-氨基-腺苷 13
N4-苯甲酰基-胞苷 14
N4-氨基-胞苷 15
2'-O-甲基-N4-乙酰基-胞苷 16
2'-氟-N4-乙酰基-胞苷 17
2'-氟-N4-Bz-胞苷 18
2'-O-甲基-N4-Bz-胞苷 19
2'-O-甲基-N6-Bz-脱氧腺苷 20
2'-氟-N6-Bz-脱氧腺苷 21
N2-异丁基-鸟苷 22
2'-氟-N2-异丁基-鸟苷 23
2'O-甲基-N2-异丁基-鸟苷 24
表23.天然存在的组合
在各表中，“UTP”代表三磷酸尿苷，“GTP”代表三磷酸鸟苷，“ATP”代表三磷酸腺苷，“CTP”代表三磷酸胞嘧啶，“TP”代表三磷酸酯且“Bz”代表苯甲基。
实施例22.体外VEGF PBMC研究
将500ng经5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰的VEGF mRNA(SEQ ID NO:257；序列中未显示具有约160个核苷酸的多聚腺苷酸尾；5'帽，Cap1)(VEGF 5mC/pU)、经5-甲基胞嘧啶和N1-甲基假尿苷完全修饰的VEGF mRNA(VEGF 5mC/N1mpU)或未经修饰的VEGF mRNA(VEGF unmod)用0.4μL脂质转染胺2000转染到得自于3名正常血液供体(D1、D2和D3)的外周血单核细胞(PBMC)中。还有各供体的未经处理的细胞作为对照。在转染后22小时收集上清液且进行ELISA，以测定蛋白表达和细胞因子诱导。将VEGF表达和IFN-α诱导示于表24中。
表24.蛋白质和细胞因子水平
实施例23.经修饰mRNA的体外表达
以表25和26中所示的浓度，用VEGF-A修饰型mRNA(mRNA序列如SEQ ID NO:257中所示；序列中未显示具有约160个核苷酸的多聚腺苷酸尾；5'帽，Cap1；经5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰)转染HEK293细胞，且用已经与得自于Invitrogen(Carlsbad，CA)的脂质转染胺2000复合的转化生长因子β(TGF-β)修饰型mRNA(mRNA序列258；序列中未显示具有约160个核苷酸的多聚腺苷酸尾；5'帽，Cap1；经5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰)正向转染HeLa细胞。利用ELISA检测蛋白表达且将蛋白质(pg/ml)也示于表25和26中。对于TGF-β，还测试了未经处理的细胞和脂质转染胺2000伪转染的对照组。
表25.VEGF-A蛋白表达
表26.TGF-β蛋白表达
转染量 750ng 250ng 83ng 伪转染 未经处理
蛋白质(pg/ml) 5058 4325 3210 2 0
应了解，所使用的词语为描述性而非限制性词语，且在本发明的更广泛的方面，可在不背离本发明的真实范围和精神的情况下在所附权利要求书的权限内作出改变。
尽管已经就所描述的若干个实施方案相当详尽地且以一定的特殊性描述了本发明，但不希望本发明将受任何所述细节或实施方案或任何特定实施方案限制，而是应参考所附权利要求书理解本发明，以便鉴于现有技术提供对所述权利要求书最广泛的可能解释，且因此有效地涵盖所希望的本发明范围。
本文中提到的所有公布、专利申请、专利和其它参考文献是以全文引用的方式并入。在有冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，章节标题、材料、方法和实施例仅为说明性的，而非意在具有限制性。

Claims (24)

1.一种用于增加器官或组织外植体或其部分的活力、功能或寿命的方法，包括使所述器官或组织外植体或其部分与包含经修饰mRNA的组合物接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述器官是选自肾脏、心脏、肺脏、肝脏、胰腺、肠、脾脏、皮肤和眼睛。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述组织外植体是选自心瓣膜、骨、静脉、中耳、软骨、肌腱和韧带。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述经修饰mRNA组合物包含配制的经修饰mRNA。
5.如权利要求4所述的方法，其中器官是心脏或肺脏，且所述制剂是选自生理盐水、脂质、类脂质、聚合物、脂质体制剂、脂质纳米粒子、快速消除型脂质纳米粒子、动态聚缀合物制剂、atuplexes、DBTC制剂、PLGA聚合物、基于鱼精蛋白的试剂、细胞穿透性肽、糖或类固醇的缀合物、水凝胶、密封剂和基于细胞的载体系统。
6.如权利要求5所述的方法，其中接触包括向宿主生物体施用所述经修饰mRNA。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述宿主生物体是供体生物体。
8.如权利要求7所述的方法，其中向所述供体生物体进行施用是在用于移出心脏、肺脏或胰腺的任何程序之前或在心脏、肺脏或胰腺移出期间发生。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述供体生物体是哺乳动物。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
11.如权利要求8所述的方法，其中施用是在心脏、肺脏或胰腺移出之前进行，并且是通过递送到所述供体的血液而实现。
12.如权利要求8所述的方法，其中施用是在心脏、肺脏或胰腺移出之前进行，并且是在从所述供体抽出所述血液之后通过递送到所述供体的血液而实现。
13.如权利要求8所述的方法，其中施用是在心脏、肺脏或胰腺移出期间进行，并且是通过递送到所述供体的血液而实现。
14.如权利要求8所述的方法，其中施用是在心脏、肺脏或胰腺移出期间进行，并且是通过递送到所述供体的胸腔而实现。
15.如权利要求11到14中任一项所述的方法，其中通过使用医用装置、系统或组件或与其组合而至少部分地帮助向所述血液的递送。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述医用装置是离体器官照护系统。
17.如权利要求5所述的方法，其中接触包括向接受者生物体施用所述经修饰mRNA。
18.如权利要求17所述的方法，其中对所述接受者生物体进行施用是在用于移出所述宿主心脏或肺脏的任何程序之前、在宿主心脏移出期间、在宿主心脏移出之后但在心脏或肺脏移植之前、在心脏移植期间或在心脏或肺脏移植之后发生。
19.如权利要求18所述的方法，其中通过使用医用装置、系统或组件或与其组合而至少部分地帮助向所述接受者生物体的施用。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述医用装置是离体器官照护系统。
21.一种药物组合物，其包含配制的经修饰mRNA，其中所述经修饰mRNA编码能充当自由基清除剂的多肽。
22.一种减少对器官或组织外植体的再灌注损伤的方法，包括使所述器官或组织外植体与配制的经修饰mRNA接触。
23.一种减轻生物体中的移植排斥反应的方法，包括使所述生物体与配制的经修饰mRNA接触，其中所述经修饰的mRNA编码免疫抑制剂。
24.如权利要求4所述的方法，其中所述配制的经修饰mRNA编码蛋白α4β1、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)、VEGF、神经调节蛋白1(NRG1)、胸腺素β-4、主要组织相容性复合体(MHC)、人类白细胞抗原(HLA)、热休克蛋白(HSP)、b细胞白血病/淋巴瘤因子2(BCL-2)、一氧化氮合成酶(NOS)、白介素-4、白介素-10、转化生长因子β-1(TGF-β1)、血红素加氧酶1(HO-1或HMOX1)、杀伤细胞免疫球蛋白受体(KIR)、天然杀伤细胞(NK)、蛋白激酶C(PKC)抑制剂。
CN201280069608.9A 2011-12-21 2012-12-21 增加器官或器官外植体的活力或寿命的方法 Pending CN104968354A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161578271P 2011-12-21 2011-12-21
US61/578,271 2011-12-21
PCT/US2012/071105 WO2013096709A2 (en) 2011-12-21 2012-12-21 Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104968354A true CN104968354A (zh) 2015-10-07

Family

ID=48655171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280069608.9A Pending CN104968354A (zh) 2011-12-21 2012-12-21 增加器官或器官外植体的活力或寿命的方法

Country Status (8)

Country Link
US (3) US20130165504A1 (zh)
EP (1) EP2793906A4 (zh)
JP (1) JP2015510495A (zh)
CN (1) CN104968354A (zh)
AU (2) AU2012358384A1 (zh)
CA (1) CA2859691A1 (zh)
RU (1) RU2014129863A (zh)
WO (1) WO2013096709A2 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795875A (zh) * 2012-04-30 2018-11-13 达特茅斯大学理事会 T细胞受体缺陷型t细胞组合物
CN109258625A (zh) * 2018-10-14 2019-01-25 青海大学 一种用于提高牦牛冷冻精液冻后品质的稀释液配方
CN110760542A (zh) * 2019-11-18 2020-02-07 天津大学 一种共表达znf580和vegf165双基因的质粒及应用
CN112725428A (zh) * 2021-02-22 2021-04-30 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Kir2dl4基因分型试剂盒和分型方法
CN112831553A (zh) * 2021-02-22 2021-05-25 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Kir2dl3基因分型试剂盒和分型方法
CN113519505A (zh) * 2021-09-01 2021-10-22 宁波西敦医药包衣科技有限公司 环保水性交联剂生物组织保存材料及其制备方法
CN115633676A (zh) * 2021-07-20 2023-01-24 台湾卫生研究院 角膜保存液

Families Citing this family (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8153435B1 (en) 2005-03-30 2012-04-10 Tracer Detection Technology Corp. Methods and articles for identifying objects using encapsulated perfluorocarbon tracers
US9308181B2 (en) 2006-03-06 2016-04-12 Nuvo Research Inc. Topical formulations, systems and methods
US9642912B2 (en) 2006-03-06 2017-05-09 Crescita Therapeutics Inc. Topical formulations for treating skin conditions
DK3338765T3 (en) 2009-12-01 2019-03-04 Translate Bio Inc STEROID DERIVATIVE FOR THE SUPPLY OF MRNA IN HUMANGENETIC DISEASES
DK3243526T3 (da) 2010-07-06 2020-02-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Levering af rna til at udløse flere immunsignalveje
WO2012006369A2 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Novartis Ag Immunisation of large mammals with low doses of rna
CN103153284B (zh) 2010-07-06 2015-11-25 诺华股份有限公司 含有其pKa值有利于RNA递送的脂质的脂质体
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
HUE058667T2 (hu) 2010-08-31 2022-09-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilált liposzómák immunogént kódoló RNS szállítására
EP2625189B1 (en) 2010-10-01 2018-06-27 ModernaTX, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2627351B1 (en) 2010-10-11 2018-12-26 GlaxoSmithKline Biologicals SA Antigen delivery platforms
WO2012075040A2 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
WO2012170889A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cleavable lipids
ME03491B (me) 2011-06-08 2020-01-20 Translate Bio Inc Kompozicije lipidnih nanočestica i postupci za isporuku irnk
US11896636B2 (en) 2011-07-06 2024-02-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic combination compositions and uses thereof
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
HUE057725T2 (hu) 2011-10-03 2022-06-28 Modernatx Inc Módosított nukleozidok, nukleotidok és nukleinsavak és ezek felhasználása
EP2788033B1 (en) 2011-12-05 2017-05-31 Factor Bioscience Inc. Methods and products for transfecting cells
HRP20220717T1 (hr) 2011-12-16 2022-07-22 Modernatx, Inc. Modificirani pripravci mrna
ES2858523T3 (es) 2012-03-29 2021-09-30 Translate Bio Inc Nanopartículas neutras derivadas de lípidos
DK2830595T3 (da) 2012-03-29 2019-12-02 Translate Bio Inc Ioniserbare kationiske lipider
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US10501513B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
AU2013243947A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
WO2013185069A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Pulmonary delivery of mrna to non-lung target cells
US20150267192A1 (en) 2012-06-08 2015-09-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
WO2014028429A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Moderna Therapeutics, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of rna
US20150307542A1 (en) * 2012-10-03 2015-10-29 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
JP6510416B2 (ja) 2012-11-01 2019-05-08 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 細胞中でタンパク質を発現するための方法および生成物
ES2921623T3 (es) 2012-11-26 2022-08-30 Modernatx Inc ARN modificado terminalmente
WO2014159813A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
EP2971010B1 (en) 2013-03-14 2020-06-10 ModernaTX, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
LT2970456T (lt) 2013-03-14 2021-08-10 Translate Bio, Inc. Būdai ir kompozicijos, skirti mrnr koduojamų antikūnų pristatymui
EA201591229A1 (ru) 2013-03-14 2016-01-29 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы очистки матричной рнк
LT2968586T (lt) 2013-03-14 2018-11-26 Translate Bio, Inc. Cft mrnr kompozicijos bei su jomis susiję būdai ir panaudojimai
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
WO2014144196A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Synergistic enhancement of the delivery of nucleic acids via blended formulations
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
WO2014152030A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Removal of dna fragments in mrna production process
WO2014152027A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
PL3019619T3 (pl) 2013-07-11 2022-01-10 Modernatx, Inc. Kompozycje zawierające syntetyczne polinkleotydy kodujące białka powiązane z crispr i syntetyczne sgrna oraz sposoby ich stosowania
WO2015034928A1 (en) * 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015035364A1 (en) * 2013-09-09 2015-03-12 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Proteins for targeting neuronal nitric oxide synthase to muscle sarcolemma and related methods of use
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US10385088B2 (en) 2013-10-02 2019-08-20 Modernatx, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
ES2707966T3 (es) 2013-10-22 2019-04-08 Translate Bio Inc Terapia de ARNm para la deficiencia en síntesis de argininosuccinato
JP6506749B2 (ja) 2013-10-22 2019-04-24 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド フェニルケトン尿症のためのｍＲＮＡ療法
CN112618732A (zh) 2013-10-22 2021-04-09 夏尔人类遗传性治疗公司 用于递送信使rna的脂质制剂
CN105658800A (zh) 2013-10-22 2016-06-08 夏尔人类遗传性治疗公司 Mrna的cns递送及其用途
MX2016009771A (es) 2014-01-31 2016-11-14 Factor Bioscience Inc Metodos y productos para la produccion y administracion de acido nucleico.
EP3104889B1 (en) 2014-02-10 2021-10-13 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Activation of innate immunity for enhanced nuclear reprogramming of somatic cells with mrna
WO2015160706A1 (en) 2014-04-14 2015-10-22 University Of Maryland, College Park Office Of Technology Commercialization Solution blow spun polymer fibers, polymer blends therefor and methods of use thereof
HRP20220070T1 (hr) 2014-04-23 2022-04-01 Modernatx, Inc. Cjepiva nukleinske kiseline
WO2015164773A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods for purification of messenger rna
JP6557722B2 (ja) 2014-05-30 2019-08-07 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド 核酸の送達のための生分解性脂質
US10286086B2 (en) 2014-06-19 2019-05-14 Modernatx, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
CN106795142B (zh) 2014-06-24 2022-11-04 川斯勒佰尔公司 用于递送核酸的立体化学富集组合物
AU2015283954B2 (en) 2014-07-02 2020-11-12 Translate Bio, Inc. Encapsulation of messenger RNA
CA2955238A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
JP6767976B2 (ja) 2014-12-05 2020-10-14 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド 関節疾患の治療のためのメッセンジャーｒｎａ治療法
CN109477102A (zh) 2015-02-13 2019-03-15 菲克特生物科学股份有限公司 核酸产品及其施用方法
EP3900702A1 (en) 2015-03-19 2021-10-27 Translate Bio, Inc. Mrna therapy for pompe disease
EP3324979B1 (en) 2015-07-21 2022-10-12 ModernaTX, Inc. Infectious disease vaccines
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
WO2017031232A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
WO2017049286A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
EP3359670B2 (en) 2015-10-05 2024-02-14 ModernaTX, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
CN108473969B (zh) 2015-10-14 2022-09-13 川斯勒佰尔公司 用于增强生产的rna相关酶的修饰
JP6925688B2 (ja) 2015-10-22 2021-08-25 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド 水痘帯状疱疹ウイルス（ｖｚｖ）のための核酸ワクチン
WO2017070624A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
DK3718565T3 (da) 2015-10-22 2022-06-20 Modernatx Inc Vacciner mod respiratorisk virus
JP6921833B2 (ja) 2015-10-22 2021-08-18 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド ヒトサイトメガロウイルスワクチン
SI3386484T1 (sl) 2015-12-10 2022-06-30 Modernatx, Inc. Sestave in metode za dovajanje terapevtskih sredstev
CN109072223B (zh) 2016-04-08 2022-10-21 川斯勒佰尔公司 多聚体编码核酸及其用途
HRP20211569T1 (hr) 2016-06-07 2022-01-21 Modernatx, Inc. Modificirana rna koja kodira vegf-a polipeptide, formulacije, i upotrebe koje se na njih odnose
WO2017218524A1 (en) 2016-06-13 2017-12-21 Rana Therapeutics, Inc. Messenger rna therapy for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
BR112019000195A2 (pt) 2016-07-07 2019-04-24 Rubius Therapeutics, Inc. composições e métodos relacionados a sistemas celulares terapêuticos que expressam rna exógeno
WO2018010815A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Formulation for administration of rna
JP2019528284A (ja) 2016-08-17 2019-10-10 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 核酸産物およびその投与方法
SG11201901941YA (en) 2016-09-14 2019-04-29 Modernatx Inc High purity rna compositions and methods for preparation thereof
JP6980780B2 (ja) 2016-10-21 2021-12-15 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド ヒトサイトメガロウイルスワクチン
US10925958B2 (en) 2016-11-11 2021-02-23 Modernatx, Inc. Influenza vaccine
US11103578B2 (en) 2016-12-08 2021-08-31 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
US11384352B2 (en) 2016-12-13 2022-07-12 Modernatx, Inc. RNA affinity purification
US11253605B2 (en) 2017-02-27 2022-02-22 Translate Bio, Inc. Codon-optimized CFTR MRNA
EP3609534A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. BROAD SPECTRUM VACCINE AGAINST THE INFLUENZA VIRUS
WO2018170256A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
WO2018170260A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Respiratory syncytial virus vaccine
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
WO2018170347A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Modernatx, Inc. Zoonotic disease rna vaccines
US11905525B2 (en) 2017-04-05 2024-02-20 Modernatx, Inc. Reduction of elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
US11173190B2 (en) 2017-05-16 2021-11-16 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mRNA encoding CFTR
EP3638215A4 (en) 2017-06-15 2021-03-24 Modernatx, Inc. RNA FORMULATIONS
US11740242B2 (en) 2017-07-14 2023-08-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modulating biomarkers to increase tumor immunity and improve the efficacy of cancer immunotherapy
WO2019036685A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. METHODS FOR HPLC ANALYSIS
WO2019036683A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. ANALYTICAL METHODS BY HPLC
MA49913A (fr) 2017-08-18 2021-05-05 Modernatx Inc Variants d'arn polymérase
AU2018326799A1 (en) 2017-08-31 2020-02-27 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
EP3681514A4 (en) 2017-09-14 2021-07-14 ModernaTX, Inc. RNA VACZINE AGAINST ZIKA VIRUS
AU2018392716A1 (en) 2017-12-20 2020-06-18 Translate Bio, Inc. Improved composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
MA54676A (fr) 2018-01-29 2021-11-17 Modernatx Inc Vaccins à base d'arn contre le vrs
CN108990964B (zh) * 2018-08-09 2022-01-28 华东理工大学 细胞冻存液
WO2020041793A1 (en) 2018-08-24 2020-02-27 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
CA3130888A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Modernatx, Inc. Rna polymerase variants for co-transcriptional capping
US11851694B1 (en) 2019-02-20 2023-12-26 Modernatx, Inc. High fidelity in vitro transcription
WO2021003300A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 Chien Kenneth R Mesenchymal stem cells or stromal cells harboring modified rnas encoding vegf and bmp polypeptides
US10501404B1 (en) 2019-07-30 2019-12-10 Factor Bioscience Inc. Cationic lipids and transfection methods
JP2021185136A (ja) 2020-04-22 2021-12-09 ビオエンテッヒ・アールエヌエイ・ファーマシューティカルズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング コロナウイルスワクチン
WO2021222074A1 (en) * 2020-04-28 2021-11-04 Ohio University Methods for extending the shelf-life of stored donor blood and/or red blood cells and treated red blood cell compositions produced thereby
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
CA3219195A1 (en) * 2021-06-03 2022-12-08 Magle Chemoswed Ab A pharmaceutically acceptable aqueous gel composition for mrna delivery
WO2023061985A2 (en) 2021-10-12 2023-04-20 Modernatx, Inc. Compositions comprising modified rna encoding vegf-a and methods of use
WO2023084013A1 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Modernatx, Inc. Compositions comprising modified rna encoding vegf-a and methods of use
WO2024002985A1 (en) 2022-06-26 2024-01-04 BioNTech SE Coronavirus vaccine

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110143397A1 (en) * 2005-08-23 2011-06-16 Katalin Kariko Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5332671A (en) * 1989-05-12 1994-07-26 Genetech, Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor and DNA encoding same
US5869230A (en) * 1995-03-30 1999-02-09 Beth Israel Hospital Association Gene transfer into the kidney
WO1999006073A1 (en) * 1997-07-31 1999-02-11 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for the treatment of grafts
AU2003251770B9 (en) * 2002-07-01 2009-06-04 H. Lundbeck A/S Recombinant tissue protective cytokines and encoding nucleic acids thereof for protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues, and organs
US20050013870A1 (en) * 2003-07-17 2005-01-20 Toby Freyman Decellularized extracellular matrix of conditioned body tissues and uses thereof
PL2578685T3 (pl) * 2005-08-23 2020-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna zawierający zmodyfikowane nukleozydy i sposoby jego zastosowania
DE102006051516A1 (de) * 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
KR102171849B1 (ko) * 2009-12-07 2020-10-30 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 세포 리프로그래밍을 위한 정제된 변형 ｒｎａ를 포함하는 ｒｎａ 제제
EP2558571A4 (en) * 2010-04-16 2014-09-24 Immune Disease Inst Inc DELAYED POLYPEPTIDE EXPRESSION FROM MODIFIED SYNTHETIC RNAS AND USES THEREOF
JP2014511687A (ja) * 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110143397A1 (en) * 2005-08-23 2011-06-16 Katalin Kariko Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795875A (zh) * 2012-04-30 2018-11-13 达特茅斯大学理事会 T细胞受体缺陷型t细胞组合物
CN109258625A (zh) * 2018-10-14 2019-01-25 青海大学 一种用于提高牦牛冷冻精液冻后品质的稀释液配方
CN110760542A (zh) * 2019-11-18 2020-02-07 天津大学 一种共表达znf580和vegf165双基因的质粒及应用
CN110760542B (zh) * 2019-11-18 2022-07-26 天津大学 一种共表达znf580和vegf165双基因的质粒及应用
CN112725428A (zh) * 2021-02-22 2021-04-30 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Kir2dl4基因分型试剂盒和分型方法
CN112831553A (zh) * 2021-02-22 2021-05-25 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Kir2dl3基因分型试剂盒和分型方法
CN115633676A (zh) * 2021-07-20 2023-01-24 台湾卫生研究院 角膜保存液
CN113519505A (zh) * 2021-09-01 2021-10-22 宁波西敦医药包衣科技有限公司 环保水性交联剂生物组织保存材料及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015510495A (ja) 2015-04-09
AU2012358384A1 (en) 2014-07-31
WO2013096709A2 (en) 2013-06-27
RU2014129863A (ru) 2016-02-10
EP2793906A4 (en) 2016-01-13
EP2793906A2 (en) 2014-10-29
US20130165504A1 (en) 2013-06-27
AU2016202985A1 (en) 2016-05-26
CA2859691A1 (en) 2013-06-27
WO2013096709A3 (en) 2014-12-31
US20160205924A1 (en) 2016-07-21
US20150051268A1 (en) 2015-02-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7047002B2 (ja) 化学修飾ｍＲＮＡ
CN104968354A (zh) 增加器官或器官外植体的活力或寿命的方法
JP6971953B2 (ja) 修飾ポリヌクレオチドを封入する脂質ナノ粒子を含む組成物
RU2649364C2 (ru) Составы на основе модифицированного нуклеозида, нуклеотида и нуклеиновой кислоты
US20150030576A1 (en) Methods and compositions for targeting agents into and across the blood-brain barrier
JP2017523777A (ja) ポリヌクレオチドの末端修飾
US20140378538A1 (en) Methods of responding to a biothreat
CN104411338A (zh) 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸
CN105980401A (zh) 编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸
US20140343129A1 (en) Modified nucleic acids, and acute care uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20151007