CN103458920A - 表现出gip受体活性的胰高血糖素类似物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了胰高血糖素类似物，其在GIP受体表现出高活性，并因此意图用于治疗糖尿病与肥胖症。在示例性实施方案中，本申请的胰高血糖素类似物在GIP受体表现的EC50在纳摩尔或皮摩尔范围内。

Description

表现出GIP受体活性的胰高血糖素类似物
相关申请的引用
本申请要求于2010年12月22日提交的美国临时专利申请61/426,285号以及2011年8月3日提交的美国临时专利申请61/514,609号的优先权，通过引用将上述两篇申请整体并入本文。
通过引用并入电子提交的材料
将与本文同时提交的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表通过引用整体并入本文，序列表信息如下：190Kb ACII(Text)，文件名为“DOCS-#1756766-v1-45700A_SeqListing.txt”，创建于2011年12月16日。
发明背景
根据美国糖尿病协会国家糖尿病简报的最新数据，美国有2360万名儿童和成年人患有糖尿病。每年有160万名年龄在20岁或以上的人被诊断为糖尿病的新病例。根据美国医学协会期刊(Journal of theAmerican Medical Association)最近发表的一项研究，超过三分之二的美国成年人为超重或肥胖(Flegal et al.,JAMA303(3)：235-241(2010))，而这部分人口的三分之一以上为肥胖。
肠促胰岛素激素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)是天然存在的肽激素。GLP-1和GIP均以葡萄糖依赖的方式刺激胰岛素合成与分泌，而不会产生低血糖(参见例如Nauck et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.76:912-917(1993)以及Irwin et al.,Regul.Pept.153:70-76(2009))。
GLP-1已被证明能有效作为糖尿病的辅助治疗，且与减重相关。然而，目前对以GIP为靶标的疗法仍不清楚的是能否通过拮抗该激素的作用(例如通过GIP受体拮抗作用)或通过模拟或增强GIP的作用而实现成功治疗糖尿病与肥胖症。
发明简述
本文提供了肽，其是GIP激动剂肽，意图将其用于治疗有需要的个体，例如患糖尿病和肥胖症的个体。
天然的胰高血糖素不会活化GIP受体，且通常在GLP-1受体具有天然GLP-1的约1%的活性。在一些实施方案中，所述肽为胰高血糖素类似物，其包含基于天然人胰高血糖素的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的结构，但其与SEQ ID NO:1在一个或多个位置有所不同，其中该差异或修饰能增强所述类似物在GIP受体的激动剂活性。此类胰高血糖素类似物将在GIP受体具有比天然胰高血糖素更高的激动剂活性，且在某些情况下，高于天然的GIP的激动剂活性。在一些或任何实施方案中，所述GIP激动剂具有至少0.1%的GIP百分比效能。在本申请的某些或任何方面，所述胰高血糖素类似物还在胰高血糖素受体与GLP-1受体之一或二者表现出激动剂活性。因此，本文提供了GIP激动剂、GIP-GLP-1双功能激动剂、GIP-胰高血糖素双功能激动剂以及GIP-GLP-1-胰高血糖素三功能激动剂。
在示例性实施方案中，本申请的GIP激动剂肽对于对人GLP-1受体的相对于GIP受体的选择性低于100倍。在一些或任何实施方案中，所述GIP激动剂肽的GIP百分比效能与胰高血糖素百分比效能和/或GLP-1百分比效能相差(高于或低于)20倍或10倍以内。
在本申请的一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含(i)包含咪唑侧链的氨基酸，其位于第1位；(ii)DPP-IV保护性氨基酸，其位于第2位；(iii)包含非天然酰基或烷基的氨基酸，其任选地位于第9、10、12、16、20或37至43位中的任意位置，且任选地，所述非天然酰基或烷基通过间隔物(spacer)连接至所述氨基酸；(iv)α螺旋稳定氨基酸，其位于第16、17、18、19、20或21位中的一个或多个位置上；以及(v)至多十个(例如至多1、2、3、4、5、6、7、8或9个)相对于SEQ ID NO:1的另外的氨基酸修饰。在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含(i)包含咪唑侧链的氨基酸，其位于第1位；(ii)DPP-IV保护性氨基酸，其位于第2位，任选地为氨基异丁酸；(iii)包含非天然酰基或烷基的氨基酸，其任选地位于第9、10、12、16、20或37至43位中的任意位置，且任选地，所述非天然酰基或烷基通过间隔物连接至所述氨基酸；(iv)α,α-双取代氨基酸，其位于第20位；以及(v)至多十个(例如至多1、2、3、4、5、6、7、8或9个)相对于SEQ ID NO:1的另外的氨基酸修饰。在其他示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含(i)包含咪唑侧链的氨基酸，其位于第1位；(ii)DPP-IV保护性氨基酸，其位于第2位，任选地为氨基异丁酸；(iii)包含非天然酰基或烷基的氨基酸，其任选地位于第9、10、12、16、20或37至43位中的任意位置，且任选地，所述非天然酰基或烷基通过间隔物连接至所述氨基酸；(iv)α螺旋稳定氨基酸，其位于第16至21位中的一个或多个位置，任选地为第16位，其中所述类似物在第20位不包含α螺旋稳定氨基酸；以及(v)至多十个(例如至多1、2、3、4、5、6、7、8或9个)相对于SEQ ID NO:1的另外的氨基酸修饰。在示例性实施方案中，当所述胰高血糖素类似物缺乏亲水性部分时，所述胰高血糖素类似物表现出至少0.1%的GIP百分比效能(例如至少1%、至少10%、至少20%)。在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物对人GLP-1受体的相对于GIP受体的选择性低于100倍(例如低于50倍、低于25倍、低于10倍)。在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物在GLP-1受体表现出的EC50是其在GIP受体表现出的EC50的100倍以内(例如50倍以内、20倍以内、10倍以内)。
在本申请中，所有以数字提及的具体氨基酸位置(例如，第28位)是指在天然胰高血糖素(SEQ ID NO:1)中的所述位置或在其任何类似物中的相对应位置处的氨基酸。例如，对于SEQ ID NO:1的第一个氨基酸缺失的胰高血糖素类似物，文中提及“第28位”表示该胰高血糖素类似物的相应第27位。同样地，对于在SEQ ID NO:1的N端之前添加一个氨基酸的胰高血糖素类似物，文中提及“第28位”表示该胰高血糖素类似物的相应第29位。
在一些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含SEQ ID NO:27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89以及90中的任一氨基酸序列，或SEQID NO:48、52、53以及74中的任一氨基酸序列，或SEQ ID NO:50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88以及92中的任一氨基酸序列。在一些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含基于母体序列的结构，但与母体序列在一个或多个位置有所差异，所述母体序列包含SEQ ID NO:27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89以及90中的任一氨基酸序列，或SEQ ID NO:48、52、53以及74中的任一氨基酸序列，或SEQ ID NO:50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88以及92中的任一氨基酸序列，下文中进一步描述。
本发明因此提供肽，其包含SEQ ID NO:28的序列、本质上由SEQID NO:28的序列组成或由SEQ ID NO:28的序列组成。还提供了肽，其包含SEQ ID NO:37的序列、本质上由SEQ ID NO:37的序列组成或由SEQ ID NO:37的序列组成。还提供了肽，其包含SEQ ID NO:89的序列、本质上由SEQ ID NO:89的序列组成或由SEQ ID NO:89的序列组成。本发明还提供肽，其包含SEQ ID NO:180的序列、本质上由SEQ ID NO:180的序列组成或由SEQ ID NO:180的序列组成。本发明另外提供肽，其包含SEQ ID NO:31的序列、本质上由SEQ ID NO:31的序列组成或由SEQ ID NO:31的序列组成。
本发明提供肽，其包含SEQ ID NO:184的序列：
HX2X3GTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29GPSSGX35PPPS(SEQ ID NO:184)
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或Gln类似物；
X10为Tyr或与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸；
X16为任何氨基酸，任选地为除Gly、Pro与Ser以外的任何氨基酸；
X18为Arg或Ala；
X20为带负电荷的氨基酸或电中性的氨基酸，任选地为AIB或Gln；
X21为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu；
X27为Leu、Ala、Nle或Met；
X28为Ala或酸性氨基酸(任选地为Asp或Glu)；
X29为Ala或Gly；
X35为Ala或碱性氨基酸(任选地为Arg或Lys)；
其中，当X28为酸性氨基酸时，X35为碱性氨基酸；
其中，当X10为Tyr时，所述肽在第40位包含与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸，其中，任选地，所述肽在第41位包含Gly，并且其中所述肽的C端氨基酸为酰胺化的氨基酸。
本发明还提供肽，其包含具有至多3个相对于SEQ ID NO:184的氨基酸修饰的SEQ ID NO:184的序列，其中所述类似物在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体中的每一个表现出激动剂活性。
本发明还提供了肽，其包含SEQ ID NO:185的序列：
HX2QGTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:185)
其中：
X2为AIB；
X10为Tyr或与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸；
X16为Glu、α,α-双取代的氨基酸或Lys；
X18为Arg或Ala；
X20为AIB或Gln；
X21为Asp或Glu；
X27为Leu、Nle或Met；
X28为Ala、Asp或Glu；
X29为Thr的Gly；
并且
其中，当X10为Tyr时，所述肽在第40位包含与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸，其中，任选地，所述肽在第41位包含Gly，并且
其中所述肽的C端氨基酸为酰胺化的氨基酸。
本发明还提供肽，其包含具有至多3个相对于SEQ ID NO:185的氨基酸修饰的SEQ ID NO:185的序列，其中所述类似物在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体中的每一个表现出激动剂活性。
本发明还提供肽，其包含SEQ ID NO:186的序列：
HX2X3GTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29(SEQ ID NO:186)
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或Gln类似物；
X10为Tyr或与C10至C26酰基或烷基共价连接的氨基酸；
X16为任何氨基酸，任选地为除Gly、Pro以及Ser以外的任何氨基酸；
X18为Arg或Ala；
X20为带负电荷的氨基酸或电中性的氨基酸，任选地为AIB或Gln；
X21为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu；
X27为Leu、Ala、Nle或Met；
X28为Ala或酸性氨基酸(任选地为Asp或Glu)；
X29为Ala、Gly或Thr；并且
其中所述肽包含任选地位于第10位的与C10至C26酰基或烷基共价连接的氨基酸，所述肽的C端氨基酸为酰胺化的氨基酸。
本发明还提供肽，其包含具有至多3个相对于SEQ ID NO:186的氨基酸修饰的SEQ ID NO:186的序列，其中所述类似物在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体中的每一个表现出激动剂活性。
本发明还提供肽，其包含SEQ ID NO:187的序列：
HX2QGTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29(SEQID NO:187)
其中：
X2为AIB；
X10为Tyr或与C10至C26酰基或烷基共价连接的氨基酸；
X16为Glu、α,α-双取代的氨基酸或Lys；
X18为Arg或Ala；
X20为带负电荷的氨基酸或电中性的氨基酸，任选地为AIB或Gln；
X21为Asp或Glu；
X27为Leu、Ala、Nle或Met；
X28为Ala、Asp或Glu；
X29为Gly或Thr；并且
其中所述肽包含任选地位于第10位的与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸，所述肽的C端氨基酸为酰胺化的氨基酸。
本发明还提供肽，其包含具有至多3个相对于SEQ ID NO:187的氨基酸修饰的SEQ ID NO:187的序列，其中所述类似物在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体中的每一个表现出激动剂活性。
如本文所述，本发明还提供SEQ ID NO:184、185、186与187中的任意一个的类似物，但X3或第3位的氨基酸为Gln或Gln类似物，或能降低胰高血糖素活性的氨基酸，包括本文中所述的那些氨基酸。在示例性实施方案中，能降低胰高血糖素活性的氨基酸为酸性、碱性或疏水性氨基酸(例如Glu、Orn或Nle)。任选地，位于第3位的氨基酸为Glu。
此外，本文提供具有GIP激动剂活性的胰高血糖素(SEQ ID NO:1)类似物，其包含：
(a)包含咪唑侧链的氨基酸，其位于第1位；
(b)位于第16位的具有通式IV的氨基酸：
Figure BDA0000369878840000071
其中n为1至7，其中R1与R2分别独立地选自H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，其中任选地，所述通式IV的氨基酸的侧链包含自由氨基；
(c)α,α-双取代的氨基酸，位于第20位；
(d)至多十个相对于SEQ ID NO:1的另外的氨基酸修饰；
其中，当所述类似物缺乏亲水性部分时，所述胰高血糖素类似物在GIP受体表现出至少0.1%的天然GIP的活性，其中所述胰高血糖素类似物对人GLP-1受体的相对于GIP受体的选择性低于100倍。
本文还提供二聚体或多聚体，其包含二个或更多个本申请的GIP激动剂肽。本文还提供缀合物，其包含本申请的GIP激动剂肽以及缀合部分。在某些方面，所述缀合物为融合的多肽，其包含与异源肽融合的本申请的GIP激动剂肽。本申请还提供试剂盒，其包含本申请所的GIP激动剂肽、二聚体、多聚体或缀合物(或以上的组合)。
本申请还提供药物组合物，其包含本申请的GIP激动剂肽、二聚体、多聚体或缀合物(或以上的组合)，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。所述药物组合物优选地为无菌的，且适合于胃肠外给药。所述药物组合物意图用于治疗或预防糖尿病或肥胖症，或与糖尿病或肥胖症相关的疾病状态的方法中。因此，在示例性实施方案中，本申请提供降低体重增加或诱发减重的方法、治疗或预防糖尿病或肥胖症的方法以及诱导肠道暂时性麻痹的方法。所述肽类似物与包含其的药物组合物的其它应用在下文提供。
附图简述
图1描述了5nmol/kg的SEQ ID NO:28的肽(○)、SEQ ID NO:37的肽(□)、SEQ ID NO:38的肽(▽)或SEQ ID NO:39的肽(◇)或注射载体对照(Δ)的小鼠的体重(g)相对于第一次注射后的时间的函数。
图2描述了体重总变化(%)，其是在小鼠注射载体对照或下列肽后第七天测量的：SEQ ID NO:138的肽，所述肽在第40位的Lys直接连接C16脂肪酰基；SEQ ID NO:143的肽，所述肽在第10位的4-氨基Phe残基上通过γ-Glu-γ-Glu二肽间隔物被酰基化；SEQ ID NO:144的肽，所述肽在第10位的4-氨基Phe被C16琥珀酰化；SEQ ID NO:139的肽，所述肽在第40位的Lys(其后为位于第41位的Gly)直接连接C16脂肪酰基；SEQ ID NO:140的肽，所述肽在第40位的Lys(其后为位于第41位的Gly)被C16琥珀酰化；SEQ ID NO:141的肽，所述肽在第40位的Lys(Lys后为位于第41位的Gly)通过β-Ala间隔物被C16琥珀酰化；或SEQ ID NO:142的肽，所述肽在第40位的Lys(其后为位于第41位的Gly)直接连接C18脂肪酰基。
图3A至3C关于包含琥珀酰基的酰基化肽。图3A表示不同酰基化氨基酸残基的化学结构。由左至右，(i)Lys残基直接被C16脂肪酸酰基化、(ii)Lys残基通过γ-谷氨酸间隔物被C16脂肪酸酰基化、(iii)Lys残基通过γ-Glu-γ-Glu二肽间隔物被C16脂肪酸酰基化以及(iv)Lys残基被C16琥珀酰化。图3B表示三个示例性琥珀酸酐的结构。图3C表SEQ ID NO:156的示合成示意图。
图4是注射载体对照(▽)或下列肽的小鼠的体重变化图(%)：SEQID NO:152的肽，其包含第16位的通过γ-谷氨酸间隔物与C16脂肪酰基共价连接的Lys残基(Δ)；SEQ ID NO:28的肽，其包含第10位的通过γ-谷氨酸与C16脂肪酰基共价连接的Lys残基(空心六边形)；SEQID NO:89的肽，其包含第40位的通过γ-Glu-γ-Glu二肽间隔物与C16脂肪酰基共价连接的Lys(□)；SEQ ID NO:145的肽，其包含第40位的通过γ-Glu-γ-Glu二肽间隔物与C16脂肪酰基共价连接的4-氨基Phe(○)；或SEQ ID NO:148的肽，其包含第10位的通过γ-Glu间隔物与C16脂肪酰基共价连接的4-氨基Phe(◇)。
图5A至5F关于双酰基化肽。图5A描述三种双酰基化化合物。(1).一个位点包含分支形式的两个酰基，(2).一个位点包含线性形式的两个酰基，(3)两个位点分别通过γ-Glu间隔物连接至脂肪酰基。图5B表示包含分支形式的两个不同大小的酰基的肽的合成示意图。图5C表示包含分支形式的两个相同大小的酰基的肽的合成示意图。图5D表示包含线性形式的两个酰基的肽的合成示意图。图5E表示小鼠接受载体对照注射或肽注射的研究的第七天测量的体重变化图(%)。图5F表示小鼠接受载体对照注射或肽注射的的研究的第七天测量的血糖水平(mg/dL)变化图。
图6描述了作为肽骨架一部分的Cys残基S-棕榈基烷基化(S-palmityl alkylation)。
图7描述了两种Cys残基的S-棕榈基烷基化(S-palmityl alkylated)，其中Cys残基为酰基化间隔物的一部分。在一种情况中(格子内左边的结构)，Cys连接至肽主链的Lys残基，且Cys是S-棕榈基烷基化的。在另一种情况中(格子内右边的结构)，Cys为二肽间隔物(γ-Glu-γ-Glu)的一部分，其中γ-Glu连接至肽主链的Lys残基，且Cys是S-棕榈基烷基化的。
图8是表示体重变化(%)图，其是小鼠被注射载体对照或下列九种酰基化肽之一后的第七天测量的：SEQ ID NO155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:166。
图9A与图9B关于包含两个肽的二聚体，其中至少一个包含酰基。图9A是描述同二聚体的结构，其中每个肽均包含位于第40位的Lys残基。每个Lys残基通过ε-NH2共价连接至Cys残基。每个Cys残基通过肽键结合至γ-Glu残基，γ-Glu残基连接至C16脂肪酰基。每个Cys残基的硫原子形成二硫键。图9B描述通过硫醚键连接的同二聚体的结构。每个肽包含位于第40位的Lys残基。上方的肽的Lys连接至Cys残基，Cys通过肽键结合至γ-Glu残基，γ-Glu残基连接至C16脂肪酰基。Cys残基的硫通过硫醚键与化学部分连接，所述化学部分连接至下方德肽的Lys残基。
图10表示小鼠被注射载体对照或下列肽后的体重变化(%)相对于注射后的时间的函数：SEQ ID NO:28(1或3nmol/kg)、SEQ ID NO:89(1或3nmol/kg)、SEQ ID NO:138(1或3nmol/kg)或SEQ ID NO:171(3nmol/kg)的肽。
图11表示小鼠被注射载体对照或下列肽后第21天测量的胰岛素水平图：SEQ ID NO:28(1或3nmol/kg)、SEQ ID NO:89(1或3nmol/kg)、SEQ ID NO:138(1或为3nmol/kg)或SEQ ID NO:171(3nmol/kg)的肽。
图12A至12C表示酰基化肽的示意图集合，每一个酰基化肽包含通过“迷你PEG”(miniPEG)间隔物与酰基共价连接的酰基化氨基酸。图12A表示SEQ ID NO:157的酰基化肽，图12B表示SEQ ID NO:158的酰基化肽，图12C表示SEQ ID NO:159的酰基化肽。
发明详述
本申请提供GIP激动剂肽(例如天然人胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的类似物(也称为“胰高血糖素类似物”)，SEQ ID NO:27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89以及90中任意一个的类似物，或SEQ ID NO:48、52、53以及74中任意一个的类似物，或SEQ ID NO:50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88以及92中任意一个的类似物，SEQ ID NO:184-199中任意一个的类似物)，其在GIP受体表现出激动剂活性。如本文所使用，术语“肽”包括2或更多个的氨基酸且通常少于100或少于50个氨基酸的序列。氨基酸可为天然存在的或编码的或非天然存在的或非编码的氨基酸。非天然存在的氨基酸是指不会在天然存在于体内，但仍可并入本文中所述的肽结构内的氨基酸。本文中使用的“非编码”是指不是下列20种氨基酸中任一种的L-异构体的氨基酸：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr。术语“GIP激动剂肽”表示能与GIP受体结合并激活下游信号转导的化合物。GIP激动剂肽可以在GIP受体具有任何水平的活性(例如绝对活性水平或相对活性水平)、GIP受体选择性或GIP百分比效能，如本文所述。例如，可见标题为“GIP受体活性”的章节。然而，此术语并不被解释为将所述化合物局限为仅在GIP受体具有活性。事实上，本申请的GIP激动剂肽可以在其他受体表现出另外的活性，这在本文中进一步讨论。例如，GIP激动剂肽可以在GLP-1受体和/或胰高血糖素受体表现出激动剂活性。
本申请的肽的活性
GIP受体活性
在一些或任何实施方案中，本申请的肽表现出对GIP受体活化的EC50为纳摩尔(nanomolar)范围。在示例性实施方案中，肽在GIP受体的EC50低于1000nM、低于900nM、低于800nM、低于700nM、低于600nM、低于500nM、低于400nM、低于300nM、低于200nM。在一些实施方案中，肽在GIP受体的EC50为约100nM或更低，例如约75nM或更低、约50nM或更低、约25nM或更低、约10nM或更低、约5nM或更低或约1nM或更低。在一些或任何实施方案中，本申请的肽表现出对GIP受体活化的EC50为皮摩尔(picomolar)范围。在示例性实施方案中，GIP激动剂肽在GIP受体的EC50低于1000pM、低于900pM、低于800pM、低于700pM、低于600pM、低于500pM、低于400pM、低于300pM、低于200pM。在一些实施方案中，肽在GIP受体的EC50为约100pM或更低，例如约75pM或更低、约50pM或更低、约25pM或更低、约10pM或更低、约5pM或更低或约1pM或更低。本文中使用的术语“约”表示大于或小于所述数值或数值范围10%，但并不意图将任何数值或数值范围仅指定为该较宽的定义。前面冠有“约”的各个数值或数值范围也意图涵盖所述绝对数值或数值范围的实施方案。
确定肽对于受体(例如GIP受体)的活化的EC50d的合适方法是本领域已知的。实施例2描述了一个示例性的体外测定，其中测量过表达GIP受体的HEK293细胞中荧光素酶活性所表示的cAMP诱导。
在一些或任何实施方案中，与天然人胰高血糖素相比，本申请的肽(例如胰高血糖素类似物、SEQ ID NO:27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89以及90中任何一个的类似物或SEQ ID NO:48、52、53以及74中任何一个的类似物或SEQ ID NO:50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88以及92中任何一个的类似物)在GIP受体表现出增强的活性。天然胰高血糖素(SEQ ID NO:1)不能活化GIP受体，天然胰高血糖素在GIP受体表现出的活性基本上为天然GIP的0%(例如小于0.001%、小于0.0001%)。肽在GIP受体相对天然胰高血糖素的相对活性被计算为(本申请的肽的EC50/天然胰高血糖素的EC50)×100%的反比。
肽在GIP受体相对天然GIP的相对活性被计算为(本申请的肽的EC50/天然GIP的EC50)×100%的反比(还将此数值称为“GIP百分比效能”)。
在本申请的一些或任何实施方案中，本申请的肽表现出至少或约0.1%的GIP百分比效能。在示例性实施方案中，所述肽在GIP受体表现出天然GIP活性的至少或约0.5%、至少或约1%、至少或约5%、至少或约10%、至少或约20%、至少或约30%、至少或约40%、至少或约50%、至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%、至少或约90%或至少或约100%。
在申请的一些本实施方案中，本申请的肽在GIP受体表现出的活性比天然GIP更高。在示例性实施方案中，GIP激动剂肽表现出至少或约125%、至少或约150%、至少或约175%、至少或约200%、至少或约300%、至少或约400%、至少或约500%、至少或约600%、至少或约700%、至少或约800%、至少或约900%或至少或约1000%的GIP百分比效能。在一些实施方案中，本文描述的GIP激动剂肽表现出不超过1000%或不超过10000%的GIP百分比效能。
在一些方面，本申请的肽表现出GIP百分比效能的范围为约0.001%至约10,000%、或约0.01%至约10,000%、或约0.1%至约10,000%、或约1%至约10,000%、或约0.001%至约5000%、或约0.01%至约5000%、或约0.1%至约5000%、或约0.1%至约1000%。
双功能激动剂
在一些或任何实施方案中，本申请的肽为双功能激动剂肽，其活化GIP受体以及除GIP受体之外的第二受体。
GIP/GLP-1双功能激动剂
例如，在一些方面，本申请的肽在GIP受体及GLP-1受体均表现出活性(“GLP-1/GIP受体双功能激动剂”)。在一些方面，所述肽在GLP-1受体及GIP受体表现出活性，但胰高血糖素活性已被显著降低或破坏，例如通过第3位的氨基酸修饰。例如，将此位置取代为酸性、碱性或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸或正亮氨酸)能降低胰高血糖素活性。在一些或任何实施方案中，GIP激动剂肽在胰高血糖素受体表现出的活性为天然胰高血糖活性的约10%或更低(例如约5%或更低、或约1%或更低、或约0.1%或更低)。
在一些或任何实施方案中，本申请的肽在GIP受体的EC50与其在GLP-1受体的EC50相差(高于或低于)约50倍或更少、约40倍或更少、约30倍或更少、约20倍或更少、或约10倍或更少、或约5倍或更少之内。例如，在GIP受体的EC50比在GLP-1受体的EC50高10倍或低10倍。在一些或任何实施方案中，本申请的肽的GIP百分比效能与GLP-1百分比效能相差(高于或低于)小于或约50、40、30、20、10或5倍。
因此，本申请的肽对人GLP-1受体的相对于GIP受体的选择性低于100倍。本文所使用术语分子对第一受体的相对于第二受体的“选择性”指下述比例：所述分子在第二受体的EC50除以所述分子在第一受体的EC50。例如，如果分子在第一受体的EC50为1nM，在第二受体的EC50为100nM，则其对第一受体的相对于第二受体的选择性为100倍。在示例性实施方案中，本申请的肽对人GLP-1受体的相对于GIP受体的选择性为低于100倍(例如低于或约90倍、低于或约80倍、低于或约70倍、低于或约60倍、低于或约50倍、低于或约40倍、低于或约30倍、低于或约20倍、低于或约10倍、低于或约5倍)。
在一些或任何实施方案中，与天然人胰高血糖素相比，本申请的肽在GLP-1受体表现出增强的活性。天然胰高血糖素在天然GLP-1受体的活性为天然GLP-1的约1%。肽在GLP-1受体相对天然胰高血糖素的相对活性计算为(本申请的肽的EC50/天然胰高血糖素的EC50)×100%的反比。
肽在GLP-1受体相对天然GLP-1的相对活性计算为(本申请的肽的EC50/天然GLP-1的EC50)×100%的反比。(还将此数值称为“GLP-1百分比效能”)。
在本申请的一些或任何实施方案中，本申请的肽表现出至少或约0.1%的GLP-1百分比效能。在示例性实施方案中，所述肽表现出至少或约0.5%、至少或约1%、至少或约5%、至少或约10%、至少或约20%、至少或约30%、至少或约40%、至少或约50%、至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%、至少或约90%或至少或约100%的GLP-1百分比效能。
在本申请的一些实施方案中，本申请的肽在GLP-1受体表现出的活性高于天然GLP-1。在示例性实施方案中，所述肽表现出至少或约125%、至少或约150%、至少或约175%至少或约200%、至少或约300%、至少或约400%、至少或约500%、至少或约600%、至少或约700%、至少或约800%、至少或约900%或至少或约1000%的GLP-1百分比效能。在一些实施方案中，本文描述的GIP激动剂肽表现出不超过1000%或不超过10000%的GIP百分比效能。
GIP/胰高血糖素双功能激动剂
例如，在一些方面，本申请的肽在GIP受体及胰高血糖素受体均表现出活性(“胰高血糖素/GIP受体双功能激动剂”)。在一些实施方案中，GLP-1活性被显著降低或破坏，例如通过第7位的氨基酸修饰(例如取代为Ile)，将第27或28位的氨基酸的C端的氨基酸缺失，从而得到27个或28个氨基酸的肽，或上述方式的组合。在一些实施方案中，本申请的肽在GLP-1受体表现出的活性为天然GLP-1的活性的约10%或更低(例如约5%或更少、或约1%或更低、或约0.1%或更低)。
在一些或任何实施方案中，本申请的肽在GIP受体的EC50与其在胰高血糖素受体的EC50相差(高于或低于)约50倍或更少、约40倍或更少、约30倍或更少、约20倍或更少、或约10倍或更少、或约5倍或更少之内。在一些或任何实施方案中，本申请的肽的GIP百分比效能与其胰高血糖素百分比效能相差(高于或低于)小于或约50、40、30、20、10或5倍。
在一些实施方案中，与天然人胰高血糖素相比，本申请的肽在胰高血糖素受体表现出增强的活性。肽在胰高血糖素受体相对天然胰高血糖素的相对活性计算为(本申请的肽的EC50/天然胰高血糖素的EC50)×100%的反比。(还将此数值称为“胰高血糖素百分比效能”)。
在本申请的一些实施方案中，本申请的肽表现出至少或约0.1%的胰高血糖素百分比效能。在示例性实施方案中，所述肽表现出至少或约0.5%、至少或约1%、至少或约5%、至少或约10%、至少或约20%、至少或约30%、至少或约40%、至少或约50%、至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%、至少或约90%或至少或约100%的天然胰高血糖素百分比效能。
在本申请的一些实施方案中，本申请的肽在胰高血糖素受体表现出的活性高于天然胰高血糖素。在示例性实施方案中，所述肽表现出至少或约125%、至少或约150%、至少或约175%、至少或约200%、至少或约300%、至少或约400%、至少或约500%、至少或约600%、至少或约700%、至少或约800%、至少或约900%或至少或约1000%的胰高血糖素百分比效能。在一些实施方案中，本申请的肽表现出不超过1000%或不超过10000%的胰高血糖素百分比效能。
三功能激动剂
在一些实施方案中，本申请的肽在除GIP受体以外的二个或更多受体表现出活性。因此，在一些方面，本申请提供GIP三功能激动剂肽。在一些方面，本申请的肽在胰高血糖素受体、GIP受体以及GLP-1受体中的每一个均表现出活性(“胰高血糖素/GIP/GLP-1三功能激动剂”)。
在一些实施方案中，本申请的肽在GIP受体的EC50与其在(a)GLP-1受体、(b)胰高血糖素受体或两者的EC50相差(高于或低于)约50倍或更少、约20倍或更少或约10倍或更少之内。在一些实施方案中，本申请的肽在GIP受体的EC50与其在GLP-1受体的EC50相差(高于或低于)约40倍、约30倍、约20倍以内，且任选地，与其在胰高血糖素受体的EC50相差约50倍以内。在一些实施方案中，本申请的肽的GIP百分比效能与(a)其GLP-1百分比效能、(b)其胰高血糖素百分比效能或两者相差(高于或低于)少于或约50倍、20倍或10倍。在一些实施方案中，本申请的肽的GIP百分比效能与其GLP-1百分比效能相差(高于或低于)约40倍、约30倍、约20倍以内，且任选地，与其胰高血糖素百分比效能相差约50倍以内。在一些实施方案中，本申请的肽不具有对人GLP-1受体相对于GIP受体的至少100倍的选择性。在示例性实施方案中，本申请的肽对人GLP-1受体相对于GIP受体的选择性小于100倍(例如，小于或约90倍、小于或约80倍、小于或约70倍、小于或约60倍、小于或约50倍、小于或约40倍、小于或约30倍、小于或约20倍、小于或约10倍、小于或约5倍)。
缺少GLP-1激动性和胰高血糖素激动性的GIP激动性
在一些实施方案中，本申请的肽仅在GIP受体表现出活性，而在任何其他受体不表现出活性，如GLP-1受体、胰高血糖素受体。在示例性实施方案中，本申请的肽在GIP受体表现出活性，并且胰高血糖素以及GLP-1活性被显著降低或破坏，例如通过第3和7位的氨基酸修饰。在一些实施方案中，本申请的肽的GLP-1百分比效能为约10%或更低(例如约5%或更低、或约1%或更低、或约0.1%或更低)。在一些实施方案中，本申请的肽的胰高血糖素百分比效能为约10%或更低(例如约5%或更低、或约1%或更低、或约0.1%或更低)。
缀合物的活性
在一些或任何实施方案中，如本文更进一步的说明，当本申请的肽与异源部分(例如亲水性部分)缀合时，与自由或未缀合形式的本申请的肽相比，表现出降低的活性(例如降低的百分比效能或更高的EC50)。因此，我们考虑到，当上述的绝对活性水平(如GIP百分比效能、GLP-1百分比效能或胰高血糖素百分比效能，但非相对比值)应用于缀合形式(例如聚乙二醇化)的肽时，绝对活性水平降低约10、20、30、40、50或100倍，并且，该成倍降低的活性水平也考虑在本申请的范围内。反之，当本申请的肽为未缀合的形式时，其表现出的GIP百分比效能高于本申请的肽与异源部分缀合时的效能约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约100倍或更多倍。
本申请的肽的结构
胰高血糖素类似物
在一些实施方案中，本申请的肽的与天然人胰高血糖素(SEQ IDNO:1)结构相近，例如，是天然人胰高血糖素的类似物(本文还称为“胰高血糖素类似物”或“胰高血糖素的肽类似物”)。本文所使用的“胰高血糖素类似物”和“胰高血糖素的肽类似物”以及其相似术语指与天然人胰高血糖素结构相似的肽，且这些术语并不绝对表示这些肽能活化胰高血糖素受体。
在一些或任何实施方案中，本申请的肽为天然人胰高血糖素(SEQID NO:1)的类似物，其包含基于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列，但与SEQ ID NO:1的差异在于所述胰高血糖素类似物的氨基酸序列包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，在某些情况下为16或更多个(例如17、18、19、20、21、22、23、24、25等))指定的或任选的氨基酸修饰。在一些或任何实施方案中，本申请的肽包含总共1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9或至多10个相对于天然人胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的另外的氨基酸修饰(例如指定的氨基酸修饰以外的氨基酸修饰)。例如，对于包含(a)包含咪唑侧链的氨基酸，其位于第1位，(b)DPP-IV保护性氨基酸，其位于第2位，(c)酰基化的氨基酸或烷基化的氨基酸，其位于第9、10、12、16、20或37-43中的任何位置，(d)α螺旋稳定氨基酸，其位于第16、17、18、19、20及21位中的一个或多个位置上以及(e)至多十个相对于SEQ ID NO:1的另外的氨基酸修饰的胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的类似物，本申请提供的胰高血糖素类似物包含(a)-(d)以及至多10个(a)-(d)中指定的氨基酸修饰以外的另外的氨基酸修饰。在一些或任何实施方案中，所述修饰为本文所述的任何修饰，例如酰基化、烷基化、聚乙二醇化、C端截短或第1、2、3、7、10、12、15、16、17、18、19、20、21、23、24、27、28以及29位中的一个或多个位置的氨基酸取代。
本文所使用的“氨基酸修饰”表示(i)将SEQ ID NO:1的氨基酸取代为不同的氨基酸(天然存在的或编码的或非编码的或非天然存在的氨基酸)、(ii)向SEQ ID NO:1添加氨基酸(天然存在的或编码的或非编码的或非天然存在的氨基酸)或(iii)缺失SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸。
在一些或任何实施方案中，氨基酸取代为保守型氨基酸取代，例如第2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29位中一个或多个位置氨基酸的保守型取代。本文所使用术语“保守型氨基酸取代”定义为一个氨基酸被取代为性质相近的另一氨基酸，所述性质例如大小、带电性、疏水性、亲水性和/或芳香性，并且包括下列五组之一内部的交换：
I.小的、脂肪族、非极性或弱极性残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II.极性、带负电荷的残基以及它们的酰胺或酯：
Asp、Asn、Glu、Gln、磺基丙氨酸(cysteic acid)以及同型磺基丙氨酸(homocysteic acid)；
III.极性、带正电荷的残基：
His、Arg、Lys、鸟氨酸(Orn)；
IV.大的、脂肪族、非极性的残基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、同型半胱氨酸；
V.大的、芳香族残基：
Phe、Tyr、Trp、乙酰苯丙氨酸(acetyl phenylalanine)。
在其他实施方案中，氨基酸取代不是保守型氨基酸取代，例如非保守型氨基酸取代。
如本文所使用，术语“带电荷的氨基酸”表示包含侧链的氨基酸，该侧链在生理pH的水溶液中带负电(即去质子的)或带正电(即质子化的)。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、同型磺基丙氨酸以及同型谷氨酸，而带正电的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸以及组氨酸。带电荷的氨基酸包括20种编码氨基酸中的带电荷的氨基酸，以及非典型或非天然存在或非编码的氨基酸中的带电荷的氨基酸。如本文所使用，术语“酸性氨基酸”表示包含第二酸性部分(氨基酸的α羧酸以外的)的氨基酸，所述第二酸性部分包括例如侧链羧酸或磺酸基团。
在一些实施方案中，本申请的肽包含与天然人胰高血糖素(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列具有至少25%的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的肽包含与SEQ ID NO:1具有至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或高于90%的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有上述序列同一性百分比的本申请的肽的氨基酸序列为本申请的肽的全长氨基酸序列。在一些实施方案中，具有上述序列同一性百分比的本申请的肽的氨基酸序列仅是本申请的肽的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中，本申请的肽包含与SEQ ID NO:1中的至少5个连续氨基酸(例如至少6、至少7、至少8、至少9、至少10个氨基酸)的参考氨基酸序列具有约A%或更高的序列同一性的氨基酸序列，其中所述参考氨基酸序列自SEQ ID NO:1的第C位的氨基酸开始，结束于SEQ ID NO:1的第D位的氨基酸，其中A为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99；C为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28；D为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29。上述参数中的任何且所有可能的组合均考虑在内，例如，A为90%，C与D为1和27、或6和27、或8和27、或10和27、或12和27、或16和27。
本文所述的天然人胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的类似物可包含任何数量氨基酸的肽主链，即，可为任何长度的肽。在一些实施方案中，本文描述的肽与SEQ ID NO:1的长度相同，即，长度为29个氨基酸。在一些实施方案中，本申请的肽的长度大于29个氨基酸，例如本申请的的肽包含1-21个氨基酸的C端延伸，如本文进一步所描述。因此，在一些实施方案中，本申请的多肽的长度为30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一些实施方案中，本申请的肽的长度至多为50个氨基酸。在一些实施方案中，由于与另一个肽融合，本申请的肽的长度大于29个氨基酸(例如大于50个氨基酸(例如长度至少或约60、至少或约70、至少或约80、至少或约90、至少或约100、至少或约150、至少或约200、至少或约250、至少或约300、至少或约350、至少或约400、至少或约450、至少或约500个氨基酸)。在其他实施方案中，本申请的肽的长度小于29个氨基酸，例如28、27、26、25、24、23个氨基酸。
根据上文的描述，在一些方面，本申请的肽为包含基于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的天然人胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的类似物，其包含一个或多个氨基酸修饰，所述修饰能影响GIP活性、胰高血糖素活性和/或GLP-1活性，增加稳定度(例如通过减少所述肽的降解(例如通过增强对DPP-IV蛋白酶的抗性))，增加溶解度，增加半衰期，延迟作用开始的时间，延长对GIP、胰高血糖素或GLP-1受体作用的持续时间，或以上的组合。这些氨基酸修饰，除了其他修饰，将于以下进一步描述，且这些修饰的任何一个能单独使用或组合使用。
包含非天然酰基的氨基酸
在一些或任何实施方案中，GIP激动剂肽为胰高血糖素(SEQ IDNO:1)的类似物，其包含含有非天然酰基的氨基酸(本文称为“酰基化氨基酸”，而不论其是如何制备的，例如通过向肽内并入之前已酰基化的氨基酸，或在合成后再将肽酰基化)。在一些或任一方面，酰基化氨基酸位于胰高血糖素类似物的第9、10、12、13、14、16、17、20、37、38、39、40、41、42或43位中的任意位置。在示例性的方面，酰基化氨基酸位于胰高血糖素类似物的第9、10、12、16、20或40中的任意位置，或位于第10、13、14、16、17或40位中的任意位置。在示例性的方面，酰基化氨基酸位于第10、14以及40位中的任意一个或多个位置上。在示例性的方面，酰基化氨基酸位于肽类似物的第10、12或16位中的任意位置。
在一些实施方案中，酰基化氨基酸使GIP激动剂肽具有以下的一个或多个性质：(i)延长的循环半衰期、(ii)延迟的作用开始的时间、(iii)延长的作用持续时间、(iv)增强的对蛋白酶(例如DPP-IV)的抗性、以及(v)增强的在GIP受体、GLP-1受体以及胰高血糖素受体中任意一个或多个的效能。
直接酰基化
在一些实施方案中，酰基被直接连接至GIP激动剂肽的氨基酸。根据一实施方案，GIP激动剂肽包含通过酯、硫酯或酰胺键直接连接至肽的酰基。
在具体方面，GIP激动剂肽包含通过将GIP激动剂肽的氨基酸的侧链的氨基、羟基或巯基直接酰基化而得到的酰基。在一些实施方案中，酰基化位于GIP激动剂肽的第9、10、12、13、14、16、17、20或40位(例如位于第10、14以及40位中的任意位置)。关于这方面，GIP激动剂肽包含SEQ ID NO:1的序列或其修饰的氨基酸序列，所述修饰的氨基酸序列包含一个或多个本文所述的氨基酸修饰，其中GIP激动剂肽的第9、10、12、13、14、16、17、20和40位的氨基酸中的至少一个(例如第10、14以及40位中的任意一个位置)是包含侧链氨基、羟基或巯基的氨基酸。
在一些实施方案中，包含侧链氨基的氨基酸为通式I的氨基酸：
Figure BDA0000369878840000221
在一些实施方案中，通式I的氨基酸是其中n为4(Lys)或n为3(Orn)的氨基酸。在一些实施方案中，所述包含侧链氨基的氨基酸为包含侧链氨基的芳香族氨基酸。在示例性的方面，包含侧链氨基的芳香族氨基酸为4-氨基-苯丙氨酸(4-氨基Phe)、对氨基苯甘氨酸、对氨基同型苯丙氨酸或3-氨基酪氨酸。在示例性的方面，包含侧链氨基的芳香族氨基酸为4-氨基-苯丙氨酸。
在其他实施方案中，所述包含侧链羟基的氨基酸为通式II的氨基酸:
Figure BDA0000369878840000222
在示例性实施方案中，所述通式II的氨基酸是其中n为1的氨基酸(Ser)。在示例性的方面，通式II的氨基酸是其中n为2的氨基酸(同型丝氨酸)。在相似的示例性实施方案中，所述包含侧链羟基的氨基酸为Thr或同型苏氨酸(homothreonine)。在相似的示例性实施方案中，所述包含侧链羟基的氨基酸为包含侧链羟基的芳香族氨基酸。在示例性的方面，包含侧链羟基的芳香族氨基酸为酪氨酸、同型酪氨酸、甲基酪氨酸或3-氨基酪氨酸。
在其他实施方案中，所述包含侧链巯基的氨基酸为通式III的氨基酸：
Figure BDA0000369878840000231
在示例性实施方案中，所述通式III的氨基酸为其中n为1的氨基酸(Cys)。
在一些其他实施方案中，包含侧链氨基、羟基或巯基的氨基酸为双取代的氨基酸，其包含与通式I、通式II或通式III相同的结构，但是与通式I、通式II或通式III的氨基酸的α碳键合的氢被第二侧链取代。
酰基化间隔物
在其他实施方案中，所述酰基通过间隔物连接至GIP激动剂肽的氨基酸，其中所述间隔物位于GIP激动剂肽的氨基酸和酰基中间。在一些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含位于所属肽和酰基中间的间隔物。在一些实施方案中，GIP激动剂肽与间隔物共价结合，间隔物与酰基共价结合。
在一些实施方案中，所述间隔物为包含侧链氨基、羟基或巯基的氨基酸，或包含含有侧链氨基、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。间隔物所连接的氨基酸可为包含能与间隔物连接的部分的任何氨基酸(例如单或双α-取代的氨基酸)。例如，包含侧链NH2、-OH或-COOH的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是适合的。关于此点，在某些方面，GIP激动剂肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其修饰的氨基酸序列，所述修饰的氨基酸序列包含一个或多个如本文所述的氨基酸修饰，其中第9、10、12、13、14、16、17、20以及37-43位的氨基酸中的至少一个(例如位于第10、14或40位)为包含侧链氨基、羟基或羧酸基的氨基酸。
在一些实施方案中，所述间隔物为包含侧链氨基、羟基或巯基的氨基酸，或包含含有侧链氨基、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。
当所述酰基通过间隔物的氨基连接时，在一些方面，所述酰基是通过α氨基或通过间隔物氨基酸的侧链氨基连接的。在酰基通过α氨基连接的情况下，所述间隔物氨基酸可为任何氨基酸。例如，所述间隔物氨基酸可为疏水性氨基酸，如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸。或者，在一些方面，间隔物氨基酸可为酸性残基，例如Asp、Glu、同型谷氨酸、同型磺基丙氨酸、磺基丙氨酸、γ-谷氨酸。
在酰基通过间隔物氨基酸的侧链氨基连接的情况下，间隔物氨基酸为包含侧链氨基的氨基酸，例如通式I的氨基酸(如Lys或Orn)。在这种情况下，α氨基及间隔物氨基酸的侧链氨基均连接酰基是可能的，使得所述GIP激动剂肽被双酰基化。本发明的实施方案包含这类双酰基化分子。在一些实施方案中，所述酰基连接至4-氨基苯丙氨酸、对氨基苯甘氨酸、对氨基同型苯丙氨酸或3-氨基酪氨酸。
当酰基通过间隔物的羟基连接时，所述氨基酸或二肽或三肽的一个氨基酸可以为通式II的氨基酸。在具体的示例性实施方案中，所述氨基酸为Ser。在相似的示例性实施方案中，所述酰基连接至Thr或同型苏氨酸。在相似的示例性实施方案中，所述酰基通过包含侧链羟基的芳香族氨基酸的羟基连接，所述芳香族氨基酸例如酪氨酸、同型酪氨酸、甲基酪氨酸或3-氨基酪氨酸。
当所述酰基通过间隔物的巯基连接时，所述氨基酸或二肽或三肽的一个氨基酸可以为通式III的氨基酸。在具体的示例性实施方案中，所述氨基酸为Cys。
在某些实施方案中，所述间隔物为亲水性双官能间隔物。在示例性实施方案中，所述亲水性双官能间隔物包含二个或更多个反应基团，例如氨基、羟基、巯基以及羧基，或以上的任意组合。在示例性实施方案中，所述亲水性双官能间隔物包含羟基及羧酸基团。在示例性实施方案中，所述亲水性双官能间隔物包含氨基及羧酸基团。在其他实施方案中，所述亲水性双官能间隔物包含巯基及羧酸基团。在具体的实施方案中，所述间隔物包括氨基聚(烷氧基)羧酸。在此方面，所述间隔物可包括，例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1-6的任意整数，且n为2-12的任意整数，例如8-氨基-3,6-二氧辛酸，可由Peptides International,Inc.(Louisville,KY)购得。
在示例性实施方案中，所述间隔物包含小的聚乙二醇部分(PEG)，其包含结构[-O-CH2-CH2-]n，其中n为2至16的整数(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16)。此类小的PEG本文称为“迷你PEG(miniPEG)”。在示例性方面，迷你PEG为官能化迷你PEG，其包含一个或多个官能团。合适的官能团包括，但不限于，氨基、羟基、巯基以及羧酸基，或以上的任意组合。在示例性方面，迷你PEG为迷你PEG酸，其包含结构{[-O-CH2-CH2-]n-COO-}，其中n是如上所定义。在示例性方面，迷你PEG为酰胺迷你PEG，其包含结构{-N-CH2-CH2-[-O-CH2-CH2-]n}，其中n是如上所定义。在示例性方面，迷你PEG为酰胺迷你PEG酸，其包含结构{-N-CH2-CH2-[-O-CH2-CH2-]n-COO-}，其中n是如上所定义。在用迷你PEG将氨基酸酰基化中使用的合适试剂可自供货商购得，例如Peptides International(Louisvelle,KY)。另外，用迷你PEG将氨基酸酰基化的合适技术在本申请中也有描述(见实施例1)。
在一些实施方案中，间隔物为疏水性双官能间隔物。疏水性双官能间隔物为本领域所公知。请参阅，例如Bioconjugate Techniques,G.T.Hermanson(Academic Press,San Diego,CA,1996)，通过引用将其整体并入本文。在示例性实施方案中，疏水性双官能间隔物包含二个或更多个反应基团，例如氨基、羟基、巯基以及羧基，或以上的任意组合。在示例性实施方案中，疏水性双官能间隔物包含羟基以及羧酸基团。在另一实施方案中，疏水性双官能间隔物包含氨基以及羧酸基团。在其他实施方案中，疏水性双官能间隔物包含巯基以及羧酸基团。包含羧酸基团以及羟基或巯基的合适的疏水性双官能间隔物为本领域所公知，包括例如8-羟基辛酸及8-硫醇辛酸。
在某些实施方案中，所述双官能间隔物不是包含介于羧基基团之间的1至7个碳原子的未分支亚甲基的双羧酸(dicarboxylic acid)。在某些实施方案中，所述双官能间隔物为包含介于羧基基团之间的1至7个碳原子的未分支亚甲基的双羧酸(dicarboxylic acid)。
在具体实施方案中，所述间隔物(例如氨基酸、二肽、三肽、亲水性双官能间隔物或疏水性双官能间隔物)的长度为3至10个原子(例如6至10个原子，如6、7、8、9或10个原子)。在更具体实施方案中，所述间隔物长度为约3至10个原子(如6至10个原子)，酰基为C12至C18脂肪酰基，例如C14脂肪酰基、C16脂肪酰基，使得间隔物和酰基的总长度是14至28个原子，例如约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个原子。在某些实施方案中，间隔物和酰基的长度是17至28个原子(例如19至26、19至21)。
根据某些或任一前述实施方案，所述双官能间隔物可为合成的或天然存在的含有3至10个原子长度的氨基酸主链的氨基酸(包括但不限于本文所述的任何氨基酸，例如6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸)。或者，所述间隔物可为具有3至10个(如6至10个原子)原子长度的肽主链的二肽或三肽间隔物。二肽或三肽间隔物的每一氨基酸可与二肽或三肽的其他氨基酸相同或与不同，且可独立地选自天然存在的或编码的和/或非天然存在的或非编码的氨基酸，包括，例如，天然存在的氨基酸(丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr))的D或L异构物中的任何一个，或非天然存在的或非编码的氨基酸的D或L异构物中的任何一个，所述非天然存在的或非编码的氨基酸选自β-丙氨酸(β-Ala)、N-α甲基丙氨酸(Me-Ala)、丁氨酸(Abu)、γ-丁氨酸(γ-Abu)、氨基己酸(ε-Ahx)、氨基异丁酸(Aib)、胺甲基吡咯羧酸、氨基哌啶羧酸、氨基丝氨酸(Ams)、氨基四氢吡喃-4-羧酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸(β-Asp)、吖丁啶羧酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基正戊酸(瓜氨酸，Cit)、β-环己基丙氨酸、乙酰胺甲基-半胱氨酸、乙酰二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dpr)、二羟苯丙氨酸(DOPA))、α,α-双甲基咪唑乙酸(DMTA))、γ-谷氨酸、同型丝氨酸(Hse)、羟基脯氨酸(Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基异亮氨酸(MeIle)、异哌啶酸(Isn)、甲基亮氨酸(MeLeu)、甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸、三甲基赖氨酸、甲醇基脯氨酸、甲硫氨酸-亚砜(Met(O))、甲硫氨酸-砜(Met(O2))、正亮氨酸(Nle)、甲基正亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对胺苯甲酸(PABA)、青霉胺(Pen)、甲基苯丙氨酸(MePhe)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-NO2))、4-氰基苯丙氨酸(Phe(4-CN))、苯甘氨酸(Phg)、六氢哌啶丙氨酸、六氢哌啶甘氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、吡咯啶基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、硒半胱氨酸(Sec)、O-苯基磷丝氨酸、4-氨基-3羟基-6甲基庚酸(Sta)、4-氨基-5环己基-3-羟基戊酸(ACHPA)、4-氨基-3羟基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1,2,3,4,-四氢-异喹啉-3-羧酸(Tic)、四氢吡喃甘氨酸、噻吩基丙氨酸(Thi)、O-苯基磷酪氨酸、O-磷酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、酪氨酸硫酸盐四丁基胺、甲基缬氨酸(MeVal)以及烷基化的3-巯基丙酸。在示例性方面，所述间隔物为Cys或Lys残基。
在一些实施方案中，间隔物包含总体负电荷，例如，包含一个或两个带负电氨基酸。在一些实施方案中，二肽不是一般结构A-B的二肽中的任何一种，其中A选自Gly、Gln、Ala、Arg、Asp、Asn、Ile、Leu、Val、Phe及Pro，B选自Lys、His、Trp。在一些实施方案中，二肽间隔物的氨基酸选自Ala、β-Ala、Leu、Pro、γ-氨基丁酸、Glu及γ-Glu。
在一些示例性实施方案中，GIP激动剂肽包含通过间隔物的氨基、羟基或巯基的酰基化而产生的酰基，所述间隔物连接至第9、10、12、13、14、16、17、20或37-43位(例如第10、14以及40位中的一个或多个位置)的氨基酸的侧链，或者位于GIP激动剂肽C端氨基酸。
在更具体的实施方案中，酰基连接于肽类似物的第9、10、12、13、14、16、17、20或37-43位中的任意位置(例如位于第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)的氨基酸，间隔物和酰基的长度为14至28个原子。在一些方面，第9、10、12、13、14、16、17、20或37-43位中的任意位置(例如第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)的氨基酸是通式I的氨基酸，例如Lys，或相对于通式I的双取代氨基酸。在更具体的实施方案中，所述肽类似物缺乏分子内桥，例如共价分子内桥。例如，胰高血糖素类似物可以是包含一个或多个用来稳定所述类似物α螺旋的α,α-双取代氨基酸(例如AIB)的胰高血糖素类似物。
酰基
所述酰基化氨基酸的酰基可为任何大小，例如任何长度的碳链，且可为线性的或分支的。在一些具体实施方案中，酰基为C4-C30脂肪酸。例如，酰基可为C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸中的任意一个。在一些实施方案中，所述酰基为C8至C20脂肪酸，例如C14脂肪酸或C16脂肪酸。
在其他实施方案中，所述酰基为胆汁酸。所述胆汁酸可为任何适合的胆汁酸，包括，但不限于，胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛胆酸、甘胆酸以及胆固醇酸。
在示例性实施方案中，所述酰基为琥珀酸或琥珀酸衍生物。本文所使用的“琥珀酸衍生物”意指包含取代的琥珀酸或取代的环琥珀酸(即琥珀酸酐)或取代的扩展环琥珀酸酐(即包含-C(O)-O-C(O)-部分以及3至5个另外的碳的6至8元环)的化合物，其中所述取代的琥珀酸、取代的环琥珀酸(即琥珀酸酐)或取代的扩展环琥珀酸酐被一个或多个烷基链或一个或多个官能化碳链所取代。
在示例性方面，所述琥珀酸衍生物包含通式V的结构：
Figure BDA0000369878840000281
其中R以及R’独立地为H、线性或分支的C4-C30碳链或线性或分支的C4-C30官能化碳链。在示例性实施方案中，R和/或R’为包含C4-C30烷基链的碳链。例如，所述烷基可为C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基中的任意一种。在一些实施方案中，所述烷基为C8至C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。在示例性方面，所述官能化碳链包含官能团，所述官能团包括但不限于羧基、巯基、氨基、酮基、硫氧基或酰胺基。
在示例性方面，所述琥珀酸衍生物为包含通式VI的结构的琥珀酸酐：
Figure BDA0000369878840000293
其中R以及R’独立地为H、线性或分支的C4-C30碳链或线性或分支的C4-C30官能化碳链。在示例性实施方案中，R和/或R’为包含C4-C30烷基链的碳链。例如，所述烷基可为C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基中的任意一种。在一些实施方案中，所述烷基为C8至C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。在示例性方面，所述官能化碳链包含官能团，所述官能团包括但不限于羧基、巯基、氨基、酮基、硫氧基或酰胺基。
在示例性方面，所述琥珀酸衍生物为琥珀酸酐衍生物，包括通式VII的衍生物：
Figure BDA0000369878840000292
其中n为1-4，且其中R以及R’独立地为H、线性或分支的C4-C30碳链或线性或分支的C4-C30官能化碳链。在示例性实施方案中，R和/或R’为包含C4-C30烷基链的碳链。例如，所述烷基可为C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基中的任意一种。在一些实施方案中，所述烷基为C8至C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。在示例性方面，所述官能化碳链包含官能团，所述官能团包括但不限于羧基、巯基、氨基、酮基、硫氧基或酰胺基。
当通式V-VI的R以及R’中只有一者为H时，所述酰基化氨基酸被称为“Cx琥珀酰基”。如本文所使用术语“Cx琥珀酰基(x为整数)”是指R为y个碳的烷基链、y=x-1且y不包含琥珀酰部分的碳的结构。例如，当R为C15烷基且R’为H时，通式VI的结构被称为C16琥珀酰基。例如，图3A描述C16琥珀酰基Lys，其中Lys在氨基被琥珀酰化。当通式V-VI的R或R’均不为H时，所述酰基化氨基酸被称为“Cx,Cx’琥珀酰基”。如本文所使用术语“Cx,Cx’琥珀酰基(x以及x’为整数)”指其中R为y个碳的烷基链，R’为y’个碳的烷基链，y’=x’-1的结构。例如，当R为C15烷基且R’为C13烷基时，通式VI的结构被称为C16,C14琥珀酰基。当所述琥珀酸衍生物为取代的扩展环琥珀酸酐，且通式VII的R或R’均不为H时，所述酰基化氨基酸被称为“Cx,Cx’-n-琥珀酰基”。如本文所使用术语“Cx,Cx’-n-琥珀酰基(x、x’以及n为整数)”指其中R为y个碳的烷基链，R’为y’个碳的烷基链，所述琥珀酸酐环延长n个碳的结构。例如，当R与R’为C15烷基而n=2时，通式VII的结构被称为C16,C16-2-琥珀酰基。
在示例性实施方案中，所述酰基为马来酸或马来酸衍生物。本文所使用的“马来酸衍生物”指包含取代的马来酸或取代的环马来酸(即马来酸酐)或取代的扩展环马来酸酐(即包含-C(O)-O-C(O)-部分以及3至5个另外的碳的6至8元环)的化合物，其中所述取代的马来酸、取代的环马来酸(即马来酸酐)或是取代的扩展环马来酸酐被一个或多个烷基链或一个或多个官能化碳链所取代。
在示例性方面，所述马来酸衍生物包含通式VIII的结构：
其中R以及R’独立地为H、线性或分支的C4-C30碳链或线性或分支的C4-C30官能化碳链。在示例性实施方案中，R和/或R’为包含C4-C30烷基链的碳链。例如，所述烷基可为C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基中的任意一种。在一些实施方案中，所述烷基为C8至C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。在示例性方面，所述官能化碳链包含官能团，所述官能团包括但不限于羧基、巯基、氨基、酮基、硫氧基或酰胺基。
在示例性方面，所述马来酸衍生物包括马来酸酐，其包含通式IX的结构：
其中R以及R’独立地为H、线性或分支的C4-C30碳链或线性或分支的C4-C30官能化碳链。在示例性实施方案中，R和/或R’为包含C4-C30烷基链的碳链。例如，所述烷基可为C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基中的任意一种。在一些实施方案中，所述烷基为C8至C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。在示例性方面，所述官能化碳链包含官能团，包括但不限于羧基、巯基、氨基、酮基、硫氧基或酰胺基。
在示例性方面，所述马来酸衍生物为马来酸酐衍生物，包括通式X的衍生物：
Figure BDA0000369878840000321
其中n为1-4，在两个非羰基碳之间具有至少一个C=C双键，且其中R以及R’独立地为H、线性或分支的C4-C30碳链或线性或分支的C4-C30官能化碳链。在示例性实施方案中，R和/或R’为包含C4-C30烷基链的碳链。例如，所述烷基可为C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基中的任意一种。在一些实施方案中，所述烷基为C8至C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。在示例性方面，所述官能化碳链包含官能团，包括但不限于羧基、巯基、氨基、酮基、硫氧基或酰胺基。
当通式VIII-IX的R以及R’中只有一者为H时，所述酰基化氨基酸被称为“Cx马来酰基”。如本文所使用，术语“Cx马来酰基(x为整数)”表示这样的结构，其中R为y个碳的烷基链，y=x-1，且y不包含马来酰基部分的碳。例如，当R为C15烷基且R’为H时，通式IX的结构被称为C16马来酰基。当通式VIII-IX的R或R’均不为H时，所述酰基化氨基酸被称为“Cx,Cx’马来酰基”。如本文所使用，术语“Cx,Cx’马来酰基(x以及x’为整数)”表示这样的结构，其中R为y个碳的烷基链，而R’为y’个碳的烷基链，y’=x’-1。例如，当R为C15烷基且R’为C13烷基时，通式IX的结构被称为C16,C14马来酰基。当所述马来酸衍生物为取代的扩展环马来酸酐，且通式X的R或R’均不为H时，所述酰基化氨基酸被称为“Cx,Cx’-n-马来酰基”。如本文所使用，术语“Cx,Cx’-n-马来酰基(x、x’以及n为整数)”表示这样的结构，其中R为y个碳的烷基链，R’为y’个碳的烷基链，所述马来酸酐环延长n个碳。例如，dang R与R’为C15烷基、n=2时，通式X的结构称为C16,C16-2-马来酰基。
连接酰基的方法
通过肽的氨基、羟基以及巯基将酰基连接至肽的合适方法为本领域所公知。例如，见实施例1(通过氨基进行酰基化的方法)，Miller，Biochem Biophys Res Commun218：377-382(1996)、Shimohigashi以及Stammer，Int J Pept Protein Res19：54-62(1982)以及Previero等人，Biochim Biophys Acta263：7-13(1972)(通过羟基进行酰基化的方法)；以及San and ilvius，J Pept Res66：169-180(2005)(通过巯基进行酰基化的方法)；Bioconjugate Chem."Chemical Modifications of Proteins：History and Applications"pages1,2-12(1990)；Hashimoto等人，Pharmacuetical Res."Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin andtheir Biological Activity"Vol.6,No：2pp.171-176(1989)。
在一些实施方案中，GIP激动剂肽通过GIP激动剂肽酰基化长链烷而包含酰基化氨基酸。在具体方面，所述长链烷包含氨基、羟基或巯基(例如十八烷胺(octadecylamine)、十四烷醇(tetradecanol)或十六烷硫醇(hexadecanethiol))，其与GIP激动剂肽的羧基或其活化形式反应。所述GIP激动剂肽的羧基或其活化形式可为GIP激动剂肽的氨基酸(例如谷氨酸、天冬氨酸)的侧链或可以是肽主链的一部分。
在示例性实施方案中，GIP激动剂肽通过连接至GIP激动剂肽的间隔物将长链烷酰基化而包含酰基。在具体方面，所述长链烷包含氨基、羟基或巯基，其与间隔物的羧基或其活化形式反应。包含羧基或其活化形式的合适的间隔物在本文中有描述，并包括例如双官能间隔物，如氨基酸、二肽、三肽、亲水性双官能间隔物以及疏水性双官能间隔物。
如本文所使用，术语“羧基的活化形式”表示具有通式R(C=O)X的羧基，其中X为离去基团，R为胰高血糖素类似物或间隔物。例如，羧基的活化形式可包括，但不局限于，酰基氯、酸酐以及酯类。在一些实施方案中，所述活化的羧基为具有N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)离去基团的酯。
关于长链烷是由胰高血糖素肽或间隔物酰基化的实施方案，长链烷可为任何大小，且可包含任何长度的碳链。长链烷可为线性的或分支的。在示例性实施方案中，长链烷为C4至C30烷。例如，长链烷可为C4烷、C6烷、C8烷、C10烷、C12烷、C14烷、C16烷、C18烷、C20烷、C22烷、C24烷、C26烷、C28烷或C30烷中的任何一种。在一些实施方案中，长链烷包含C8至C20烷，例如，C14烷、C16烷或C18烷。
此外，在一些实施方案中，GIP激动剂肽的氨基、羟基或巯基是用胆固醇酸酰基化的。在具体实施方案中，GIP激动剂肽通过烷基化的脱氨基Cys间隔物(即烷基化的3-巯基丙酸间隔物)连接至胆固醇酸。
当所述酰基为琥珀酸、琥珀酸衍生物、马来酸或马来酸衍生物时，所述肽是通过GIP激动剂肽的氨基、羟基或巯基与通式V、通式VI、通式VII、通式VIII、通式IX或通式X的琥珀酸、琥珀酸衍生物、马来酸或马来酸衍生物进行反应而被琥珀酰化/马来酰化。琥珀酰化的方法如本文所述。
其他酰基
在一些或任何实施方案中，肽包含酰基化氨基酸，其位于第9、10、12、13、14、16、17、20或37-43位(例如第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)以外的位置。酰基化氨基酸可位于GIP激动剂肽的任意位置，包括第1-29位中的任何位置、位于第29位氨基酸的C端的位置(例如位于第30、31、32、33、34、35、36、44、45、46、47位氨基酸等，或位于C端延伸中或位于C端的位置)，任选地，第二酰基化氨基酸位于第9、10、12、13、14、16、17、20或37-43位中的任何位置(例如位于第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)，条件是所述肽的GIP激动剂活性即使不增强也仍保留。非限制性实例包括第5、7、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28或29位。
与上述相符，在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含二个(或更多个)酰基化氨基酸，并且，当存在两个酰基时，可被认为是双重酰基化肽或双酰基化肽。在示例性方面，所有酰基化氨基酸位于第9、10、12、13、14、16、17、20或37-43位(例如第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)中的二个位置。在示例性方面，酰基化发生在第10、14以及40位中的二个位置。在示例性方面，所述肽在第10位包含第一酰基化氨基酸，在第40位包含第二酰基化氨基酸。
在其他示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含二个(或更多个)连接至肽主链的单个氨基酸的酰基。当存在两个酰基时，所述肽可被视为双重酰基化肽或双酰基化肽。两个(或更多个)酰基可为相同的酰基或不同的酰基，为线性或分支形式。例如，为获得分支形式，所述胰高血糖素类似物可包含一个酰基化氨基酸(其为肽主链的一部分)，所述酰基化氨基酸连接至包含至少三个官能团的间隔物，至少有两个官能团共价连接至酰基且一个官能团连接至所述肽主链的酰基化氨基酸。在示例性方面，分支形式可例如由下述方式实现：包含两个氨基(侧链氨基以及α氨基)的Lys残基用以直接连接至脂肪酰基或通过间隔物间接连接至脂肪酰基。在示例性方面，另外的间隔物可位于肽主链的氨基酸以及包含至少三个官能团的间隔物之间。例如，所述肽主链的氨基酸可(例如通过侧链)被连接至第一间隔物，所述第一间隔物连接至第二间隔物，其中所述第二间隔物包含至少三个官能团，至少两个官能团各共价连接至烷基且一个官能团连接至第一间隔物。
在所述烷基排列为线性形式的示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含一个酰基化氨基酸(其为肽主链的一部分)，所述酰基化氨基酸直接连接至第一酰基，所述第一酰基连接至间隔物，所述间隔物连接至第二酰基。
双重酰基化化合物的示例性结构如图5A所描述。
亲水性部分和酰基
所述包含酰基化氨基酸的GIP激动剂肽任选地进一步包含亲水性部分。在一些或任何实施方案中，所述亲水性部分包含聚乙二醇(PEG)链。可通过任何合适的方法，如本文所述的任一方法，并入亲水性部分。在这方面，所述GIP激动剂肽可包含具有任何本文所述的修饰的SEQ ID NO:1，其中第9、10、12、13、14、16、17、20以及37-43位中任意位置(例如第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)的至少一个氨基酸为酰基化氨基酸，且第16、17、21、24或29位、C端延伸内的位置或C端氨基酸中的至少一个氨基酸为Cys、Lys、Orn、同型半胱氨酸或Ac-Phe，其侧链共价键合至亲水性部分(例如PEG)。在一些实施方案中，GIP激动剂肽的第9、10、12、13、14、16、17、20以及37-43中任何位置(例如第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)的氨基酸连接至(任选地通过间隔物)酰基，且该氨基酸还连接至亲水性部分或还连接至与亲水性部分连接的Cys、Lys、Orn、同型半胱氨酸或Ac-Phe。
或者，所述酰基化胰高血糖素类似物可包含间隔物，其中所述间隔物为酰基化的且被修饰为包含亲水性部分。合适间隔物的非限制性实例包括包含选自以下的一种或多种氨基酸的间隔物：Cys、Lys、Orn、同型半胱氨酸和Ac-Phe。
在一些方面，一些实施方案中的GIP激动剂肽在连接亲水性部分的相同的氨基酸位置被酰基化或在不同的氨基酸位置被酰基化。非限制性实例包括第9、10、12、13、14、16、17、20或40位(例如第10、14以及40位中的一个或多个位置)的酰基化，位于胰高血糖素类似物C端部分(例如第24、28或29位)、C端延伸内(例如37-43)，或位于C端(通过添加C端Cys)中的一个或多个位置的PEG化。
在一些具体实施方案中，包含酰基化氨基酸的GIP激动剂肽缺乏分子内桥，例如共价分子内桥(例如内酰胺桥)。
包含非天然烷基的氨基酸
依照一些或任何实施方案，作为胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的类似物的GIP激动剂肽包含含有非天然烷基的氨基酸(本文中称为“烷基化氨基酸”，不论其是如何被制备的，例如通过向肽内并入事先已烷基化的氨基酸，或在合成肽后再将其烷基化)。在一些或任一方面，所述烷基化氨基酸位于第9、10、12、13、14、16、17、20、37、38、39、40、41、42或43位中的任何位置(例如第10、14及40位中的一个或多个位置)。在示例性的方面，所述烷基化氨基酸位于第9、10、12、16、20或40位中的任何位置，或位于第10、13、14、16、17或40位中的任何位置。在示例性的方面，所述烷基化氨基酸位于第10、12、16或40位中的任何位置或位于第10、12或16位中的任何位置。在示例性的方面，所述烷基化氨基酸位于第10、14以及40位中的任意一个或多个位置。
在一些实施方案中，烷基化氨基酸可使GIP激动剂肽具有以下一种或多种性质：(i)延长的循环半衰期、(ii)延迟的作用开始时间、(iii)延长的作用持续时间、(iv)增强的对蛋白酶(例如DPP-IV)的抗性以及(v)增强的在GIP受体、GLP-1受体以及胰高血糖素受体中任意一个或多个的效能。
直接烷基化
在一些实施方案中，烷基直接连接至GIP激动剂肽的氨基酸。根据一实施方案，GIP激动剂肽包含通过醚键、硫醚键或酰胺键连接至肽的烷基。
在具体方面，GIP激动剂肽包含通过GIP激动剂肽的氨基酸的侧链的氨基、羟基或巯基直接烷基化而产生的烷基。在一些或任何实施方案中，通过使氨基、羟基或巯基与活化的烷基反应，而将烷基连接至GIP激动剂肽的氨基酸。在一些方面，用离去基团使烷基活化，例如卤素、磺酸酯、吡啶巯基、铵盐或苯氧基。
在一些或任何实施方案中，所述烷基化氨基酸位于第9、10、12、13、14、16、17、20或40位之一(例如第10、14以及40位中的任意一个位置)或第10、12或16位之一。在这方面，所述GIP激动剂肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其修饰的氨基酸序列，所述修饰的氨基酸序列包含一个或多个如本文所述的氨基酸修饰，其中位于第9、10、12、13、14、16、17、20或40位(例如第10、14以及40位中的任意一个位置)的至少一个氨基酸为包含侧链氨基、羟基或巯基的氨基酸。
在一些实施方案中，所述包含侧链氨基的氨基酸为通式I的氨基酸。在一些实施方案中，所述通式I的氨基酸为其中n为4(Lys)或n为3(Orn)的氨基酸。在一些实施方案中，所述包含侧链氨基的氨基酸为包含侧链氨基的芳香族氨基酸。在示例性的方面，包含侧链氨基的芳香族氨基酸为4-氨基-苯丙氨酸(4-氨基-Phe)、对氨基苯甘氨酸、对氨基同型苯丙氨酸或3-氨基酪氨酸。在示例性的方面，包含侧链氨基的芳香族氨基酸为4-氨基-苯丙氨酸。
在其他实施方案中，所述包含侧链羟基的氨基酸为通式II的氨基酸。在一些示例性实施方案中，所述通式II的氨基酸为其中n为1(Ser)的氨基酸。在示例性的方面，通式II的氨基酸为其中n为2(同型丝氨酸)的氨基酸。在相似的示例性实施方案中，所述包含侧链羟基的氨基酸为Thr或同型苏氨酸。在相似的示例性实施方案中，所述包含侧链羟基的氨基酸为包含侧链羟基的芳香族氨基酸。在示例性的方面，包含侧链羟基的芳香族氨基酸为酪氨酸、同型酪氨酸、甲基酪氨酸或3-氨基酪氨酸。
在其他实施方案中，所述包含侧链巯基的氨基酸为通式III的氨基酸。在一些示例性实施方案中，所述通式III的氨基酸为其中n为1(Cys)的氨基酸。在一些或任一示例性实施方案中，所述通式III的氨基酸共价连接至烷基，例如非官能化或官能化的碳链。在示例性方面，所述氨基酸为S-棕榈基-烷基化(S-palmityl-alkylated)，即S-棕榈酸-烷基化(S-palmitate-alkylated)，其中Cys残基的硫原子共价结合至棕榈酸的β碳。在其他实施方案中，所述通式III的氨基酸是通过Cys残基的硫原子共价结合至Cn醋酸的β碳，其中n为4至30的整数。图6以及图7显示了S-棕榈酸-烷基化的不同方法的实例。
在其他实施方案中，包含侧链氨基、羟基、巯基的氨基酸为双取代的氨基酸，其包含与通式I、通式II或通式III相同的结构，但是与通式I、通式II或通式III的α碳键合的氢被第二侧链取代。
烷基化间隔物
在其他实施方案中，所述非天然烷基通过间隔物连接至GIP激动剂肽的氨基酸，其中所述间隔物位于GIP激动剂肽的氨基酸与非天然烷基之间。在一些实施方案中，GIP激动剂肽与间隔物共价结合，所述间隔物与非天然烷基共价结合。
在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物通过间隔物的氨基、羟基或巯基的烷基化的修饰而包含非天然烷基，所述间隔物连接至第9、10、12、13、14、16、17、20或37-43位之一(例如第10、14以及40位中的任意一个位置)的氨基酸侧链。在示例性实施方案中，通过使间隔物的氨基、羟基或巯基与带有离去基团(卤素、磺酸酯、吡啶巯基、铵盐或苯氧基)的烷基反应，而使烷基连接至所述间隔物。
间隔物所连接的氨基酸可为包含可允许连接间隔物的部分的任何氨基酸。例如，包含侧链NH2、-OH或-COOH的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是适合的。在此方面，所述烷基化胰高血糖素类似物可包含SEQ ID NO:1的修饰的氨基酸序列，其包含一个或多个本文所述的氨基酸修饰，且位于第9、10、12、13、14、16、17、20或37-43位(例如第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)的至少一个氨基酸被修饰为包含侧链氨基、羟基或羧基的任何氨基酸。
在一些实施方案中，所述间隔物为包含侧链氨基、羟基或巯基的氨基酸，或包含含有侧链氨基、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。间隔物所连接的氨基酸可为任何氨基酸(例如单或双α-取代的氨基酸)，其包含允许与间隔物连接的部分。例如，包含侧链NH2、-OH或-COOH的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是适合的。关于此点，在某些方面，所述GIP激动剂肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其修饰的氨基酸序列，所述修饰的氨基酸序列包含一个或多个本文所述的氨基酸修饰，其中位于第9、10、12、13、14、16、17、20以及37-43位(例如位于第10位、14或40位中的任何一个位置)的至少一个氨基酸为包含侧链氨基、羟基或羧基的氨基酸。
在一些实施方案中，所述间隔物为包含侧链氨基、羟基或巯基的氨基酸，或包含含有侧链氨基、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。
当所述烷基通过间隔物的氨基连接时，在一些方面，所述烷基是通过α氨基或通过间隔物氨基酸的侧链氨基连接的。在烷基通过α氨基连接的情况下，所述间隔物氨基酸可为任何氨基酸。例如所述间隔物氨基酸可为疏水性氨基酸，如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸。或者，在一些方面，间隔物氨基酸可为酸性残基，例如Asp、Glu、同型谷氨酸、同型磺基丙氨酸、磺基丙氨酸、γ-谷氨酸。
在烷基通过氨基酸间隔物的侧链氨基连接的情况下，间隔物为包含侧链氨基的氨基酸，例如通式I的氨基酸(如Lys或Orn)。在此情况下，α氨基及间隔物氨基酸的侧链氨基均连接烷基是可能的，使得所述GIP激动剂肽被双烷基化。本发明的实施方案包含这类双烷基化分子。在一些实施方案中，所述烷基连接至4-氨基苯丙氨酸、对氨基苯甘氨酸、对氨基同型苯丙氨酸或3-氨基酪氨酸。
当烷基通过间隔物的羟基连接时，所述氨基酸或二肽或三肽的一个氨基酸可为通式II的氨基酸。在具体的示例性实施方案中，所述氨基酸为Ser。在相似的示例性实施方案中，所述烷基连接至Thr或同型苏氨酸。在相似的示例性实施方案中，所述烷基是通过包含侧链羟基的芳香族氨基酸的羟基连接的，所述芳香族氨基酸例如酪氨酸、同型酪氨酸、甲基酪氨酸或3-氨基酪氨酸。
当所述烷基通过间隔物的巯基基团连接时，所述氨基酸或二肽或三肽的一个氨基酸可为通式III的氨基酸。在具体的示例性实施方案中，所述氨基酸为Cys。当所述烷基通过间隔物的巯基连接时，所述氨基酸或二肽或三肽的一个氨基酸可为通式III的氨基酸。在具体的示例性实施方案中，所述氨基酸为Cys。在示例性实施方案中，所述间隔物为Cys残基，Cys残基共价连接至烷基，例如非官能化或官能化的碳链。在示例性方面，所述Cys残基为S-棕榈基烷基化，即S-棕榈酸烷基化，任选地，其中Cys残基连接至作为肽主链一部分的Lys残基。在其他实施方案中，所述间隔物为包含Cys残基的二肽，Cys残基共价连接至烷基。在示例性方面，所述Cys为S-棕榈基烷基化，且所述Cys连接至间隔物的另一氨基酸，所述另一氨基酸连接至例如作为肽主链一部分的的Lys残基。实施例20提供可S-棕榈基烷基化的进一步示例。
在其他示例性实施方案中，所述间隔物为双官能间隔物，其包含(i)包含离去基团的第一末端，所述离去基团能与包含氨基、羟基或巯基的烷基反应，以及(ii)包含官能团的第二末端，所述官能团能与胰高血糖素类似物的氨基酸的侧链反应。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物的氨基酸为通式I的氨基酸(例如Lys)或通式II的氨基酸(例如Ser)，所述氨基酸被羧酸或羧酸衍生物官能化。在其他示例性方面，所述胰高血糖素类似物的氨基酸为通式III的氨基酸，且所述氨基酸被卤乙酰胺、马来酰亚胺(maleimido)或二硫官能化。在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物的氨基酸为被氨基、羟基或巯基官能化的包含侧链羧酸基团的氨基酸，例如Glu、Asp。
在某些或任何实施方案中，所述间隔物为亲水性双官能间隔物。在示例性实施方案中，所述亲水性双官能间隔物包含二个或更多个反应基团，例如氨基、羟基、巯基以及羧基，或以上的任意组合。在示例性实施方案中，所述亲水性双官能间隔物包含羟基及羧酸基团。在示例性实施方案中，所述亲水性双官能间隔物包含氨基及羧酸基团。在其他实施方案中，所述亲水性双官能间隔物包含巯基及羧酸基团。在具体的实施方案中，所述间隔物包括氨基(聚烷氧基)羧酸。在此方面，所述间隔物可包含例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1-6的任意整数，且n为2-12的任意整数，例如8-氨基-3,6-二氧辛酸，可由Peptides International,Inc.(Louisville,KY)购得。
在示例性实施方案中，间隔物包含小的聚乙二醇部分(PEG)，所述小的聚乙二醇部分包含结构[-O-CH2-CH2-]n，其中n为2至16的整数(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16)。此类小的PEG在本文称为“迷你PEG(miniPEG)”。在示例性方面，所述迷你PEG为官能化的迷你PEG，其包含一个或多个官能团。合适的官能团包括，但不限于，氨基、羟基、巯基以及羧基，或以上的任意组合。在示例性方面，所述迷你PEG为迷你PEG酸，其包含结构{[-O-CH2-CH2-]n-COO-}，其中n是如上所定义。在示例性方面，所述迷你PEG为酰胺迷你PEG，其包含结构{-N-CH2-CH2-[-O-CH2-CH2-]n}，其中n是如上所定义。在示例性方面，所述迷你PEG为酰胺迷你PEG酸，其包含结构{-N-CH2-CH2-[-O-CH2-CH2-]n-COO-}，其中n是如上所定义。用迷你PEG将氨基酸烷基化中使用的合适试剂可自供货商购得，例如Peptides International(Louisville,KY)。
在一些实施方案中，间隔物为疏水性双官能间隔物。疏水性双官能间隔物为本领域所公知。请参阅，例如Bioconjugate Techniques,G.T.Hermanson(Academic Press,San Diego,CA,1996)，通过引用将其整体并入本文。在示例性实施方案中，疏水性双官能间隔物包含二个或更多个反应基团，例如氨基、羟基、巯基以及羧基，或以上的任意组合。在示例性实施方案中，疏水性双官能间隔物包含羟基以及羧酸基团。在另一实施方案中，疏水性双官能间隔物包含氨基以及羧酸基团。在其他实施方案中，疏水性双官能间隔物包含巯基以及羧酸基团。包含羧酸基团以及羟基或巯基的合适的疏水性双官能间隔物为本领域所公知，并且包括例如8-羟基辛酸及8-硫醇辛酸。
在某些实施方案中，所述双官能间隔物不是包含在羧基之间的1至7个碳原子的未分支亚甲基的双羧酸。在某些实施方案中，所述双官能间隔物为包含在羧基之间的1至7个碳原子的未分支亚甲基的双羧酸。
在具体实施方案中，所述间隔物(例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水性双官能间隔物或疏水性双官能间隔物)长度为3至10个原子(例如6至10个原子，如6、7、8、9或10个原子)。在更具体的实施方案中，所述间隔物长度为约3至10个原子(如6至10个原子)，且所述非天然烷基为C12至C18烷基，例如C14烷基、C16烷基，使得间隔物和烷基的总长度是14至28个原子，例如约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个原子。在某些实施方案中，所述间隔物和烷基的长度是17至28个原子(例如19至26、19至21)。
根据某些或任一前述实施方案，所述双官能间隔物可为合成的或天然存在的氨基酸(包括但不限于如本文所述的任何氨基酸)，其包含长度为3至10个原子的氨基酸主链(例如：6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸)。或者，所述间隔物可为长度为3至10个原子(如6至10个原子)的肽主链的二肽或三肽间隔物。二肽或三肽间隔物的每一氨基酸可相同或与二肽或三肽的其他氨基酸不同，并且可独立地选自：天然存在的或编码的和/或非天然存在的或非编码的氨基酸，包括，例如，任何天然存在氨基酸(丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr))的D或L异构物，或任何非天然存在的或非编码的氨基酸的D或L异构物，非天然存在的或非编码的氨基酸选自β-丙氨酸(β-Ala)、N-α甲基丙氨酸(Me-Ala)、丁氨酸(Abu)、γ-丁氨酸(γ-Abu)、氨基己酸(ε-Ahx)、氨基异丁酸(Aib)、胺甲基吡咯羧酸、氨基哌啶羧酸、氨基丝氨酸(Ams)、氨基四氢吡喃-4-羧酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸(β-Asp)、吖丁啶羧酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基正戊酸(瓜氨酸，Cit)、β-环己基丙氨酸(Cha)、乙酰胺甲基-半胱氨酸、乙酰二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dpr)、二羟苯丙氨酸(DOPA))、α,α-双甲基咪唑乙酸(DMTA))、γ-谷氨酸(γ-Glu)、同型丝氨酸(Hse)、羟基脯氨酸(Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基异亮氨酸(MeIle)、异哌啶酸(Isn)、甲基亮氨酸(MeLeu)、甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸、三甲基赖氨酸、甲醇基脯氨酸、甲硫氨酸-亚砜(Met(O))、甲硫氨酸-砜(Met(O2))、正亮氨酸(Nle)、甲基正亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对胺苯甲酸(PABA)、青霉胺(Pen)、甲基苯丙氨酸(MePhe)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-NO2))、4-氰基苯丙氨酸(Phe(4-CN))、苯甘氨酸(Phg)、六氢哌啶丙氨酸、六氢哌啶甘氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、吡咯啶基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、硒半胱氨酸(Sec)、O-苯基磷丝氨酸、4-氨基-3羟基-6甲基庚酸(Sta)、4-氨基-5环己基-3-羟基戊酸(ACHPA)、4-氨基-3羟基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1,2,3,4,-四氢-异喹啉-3-羧酸(Tic)、四氢吡喃甘氨酸、噻吩基丙氨酸(Thi)、O-苯基磷酪氨酸、O-磷酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、酪氨酸硫酸盐四丁基胺、甲基缬氨酸(MeVal)以及烷基化的3-巯基丙酸。在示例性方面，所述间隔物为Cys残基。
在一些实施方案中，间隔物包含总体的负电荷，例如，包含一个或两个带负电氨基酸。在一些实施方案中，二肽不是一般结构A-B的二肽中的任何一种，其中A选自Gly、Gln、Ala、Arg、Asp、Asn、Ile、Leu、Val、Phe及Pro，B选自Lys、His、Trp。在一些实施方案中，二肽间隔物的氨基酸选自Ala、β-Ala、Leu、Pro、γ-氨基丁酸、Glu及γ-Glu。
在一些示例性实施方案中，GIP激动剂肽通过间隔物的氨基、羟基或巯基的烷基化而包含烷基，所述间隔物连接至第9、10、12、13、14、16、17、20或37-43位(例如第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)的氨基酸的侧链，或者位于GIP激动剂肽的C端氨基酸。
在更具体的实施方案中，烷基连接至肽类似物的第9、10、12、13、14、16、17、20或37-43位中的任意位置(例如位于第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)的氨基酸，间隔物和烷基的长度为14至28个原子。在一些方面，位于第9、10、12、13、14、16、17、20或37-43位中的任意位置(例如位于第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)的氨基酸为通式I的氨基酸，例如Lys，或相对于通式I的双取代氨基酸。在更具体的实施方案中，所述肽类似物缺乏分子内桥，例如共价分子内桥。例如，所述胰高血糖素类似物可以是包含一个或多个用来稳定类似物α螺旋结构的α,α-双取代氨基酸(例如AIB)的胰高血糖素类似物。
烷基
所述烷基化氨基酸的非天然烷基可为任何大小，例如任何长度的碳链，且可为线性的或分支的。在一些具体实施方案中，烷基为C4-C30烷基。例如，所述烷基可为C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基中的任何一种。在一些实施方案中，所述烷基为C8至C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。
在示例性实施方案中，所述烷基化氨基酸的非天然烷基为任何长度的官能化线性的或分支的碳链。在一些具体的实施方案中，所述碳链为C4至C30烷基。例如，所述烷基可为C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基中的任何一种。在一些实施方案中，所述烷基为C8至C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。在示例性方面，所述官能化碳链包含官能团，包括但不限于羧基、巯基、氨基、酮基、硫氧基或酰胺基。
在示例性实施方案中，所述非天然烷基为结构-Cx-COOH的羧基官能化碳链，其中x为整数，任选地为4-30的整数(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)，其中所述羧酸碳为α碳，Cx的每个碳被指定为β、γ、δ、ε等，其中β碳连接于α碳。例如，当x=4时，所述非天然烷基即被指定如下：Cε-Cδ-C-Cβ-CαOOH。在示例性实施方案中，所述羧基官能化碳链是通过羧基碳以外的碳(即Cx的一个碳)进行连接的。在示例性方面，所述羧基官能化碳链是通过羧基官能化碳链的β、γ、δ或ε碳与烷基化氨基酸的侧链连接的。在其他实施方案中，所述羧基官能化碳链是通过羧基官能化碳链的β、γ、δ或ε碳与间隔物的侧链连接的，所述间隔物连接至烷基化氨基酸。在示例性方面，所述羧基官能化碳链是通过羧基官能化碳链的β碳原子与烷基化氨基酸的侧链连接的。在其他实施方案中，所述羧基官能化碳链是通过羧基官能化碳链的β碳与间隔物的侧链连接的，所述间隔物连接至烷基化氨基酸。
连接烷基的方法
将烷基连接至氨基酸上的方法为本领域所公知。例如，用离去基团活化的烷基可与包含亲核侧链的氨基酸反应，所述亲核侧链例如包含氨基、羟基或巯基的侧链。在示例性方面，所述离去基团为卤素、磺酸酯、吡啶巯基、铵盐或苯氧基。
在示例性实施方案中，待连接烷基的氨基酸为Cys残基，且硫原子被烷基化，例如“S-烷基化”。在示例性实施方案中，所述Cys的硫与烷基的离去基团反应，所述烷基包含结构-Cx-COOH的羧基官能化碳链，其中x为整数，任选地为4-30的整数(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)，其中羧基碳为α碳，Cx的每个碳原子则指定为β、γ、δ、ε等，其中β碳连接于α碳。例如，当x=4时，所述非天然烷基即被指定如下：Cε-Cδ-C-Cβ-CαOOH。在示例性实施方案中，所述羧基官能化碳链是通过羧基碳以外的碳(即Cx的一个碳)进行连接的。在示例性方面，所述羧基官能化碳链是通过羧基官能化碳链的β、γ、δ或ε碳与烷基化氨基酸的侧链连接的。在其他实施方案中，所述羧基官能化碳链是通过羧基官能化碳链的β、γ、δ或ε碳与间隔物的侧链连接的，所述间隔物连接至烷基化氨基酸。在示例性方面，所述羧基官能化碳链是通过羧基官能化碳链的β碳与烷基化氨基酸的侧链连接的。在其他实施方案中，所述羧基官能化碳链是通过羧基官能化碳链的β碳与间隔物的侧链连接的，所述间隔物连接至烷基化氨基酸。
在示例性方面，所述离去基团为卤素(如碘、溴、氯或氟)，磺酸酯(如甲苯磺酸酯、三氟甲苯磺酸酯或氟磺酸酯)，吡啶巯基、铵盐、重氮盐、硝酸盐、磷酸盐或苯氧基。
在具体方面，所述烷基包含碘离去基团以及包含总数16个碳(包含羧基的碳)的羧基官能化碳链。利用碘-羧酸的烷基化可称为“S-棕榈基烷基化”，即“S-棕榈酸烷基化”。实施例1及20提供S-棕榈酸烷基化的进一步示例。
其他烷基
在一些方面，肽在第9、10、12、13、14、16、17、20或37-43位(例如第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)以外的位置包含烷基化氨基酸。所述烷基化氨基酸可位于GIP激动剂肽的任何位置，包括第1-29位、第29位氨基酸的C端的位置(例如位于第30、31、32、33、34、35、36、44、45、46、47位的氨基酸等，或位于C端延伸中或位于C端的位置)中的任何位置，任选地，第二烷基化氨基酸位于第9、10、12、13、14、16、17、20或37-43位中的任何位置(例如第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)，条件是所述肽的GIP激动剂活性即使不增强也仍被保留。非限制性实例包括第5、7、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28或29位。
与上述相符，在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含二个(或更多个)烷基化氨基酸。在示例性方面，所有烷基化氨基酸均位于第9、10、12、13、14、16、17、20或37-43位(例如第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)中的二个位置。在示例性方面，所述肽包含位于第10位的第一烷基化氨基酸和位于第40位的第二烷基化氨基酸。
在其他示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含连接至肽主链的一个氨基酸的另外烷基。两个(或更多个)烷基可为相同的烷基或不同的烷基，为分支的或线性的形式。例如，为获得分支形式，所述胰高血糖素类似物可包含一个烷基化氨基酸(其为肽主链的一部分)，该烷基化氨基酸连接至包含至少三个官能团的间隔物，至少有两个官能团各共价连接至烷基且一个官能团连接至所述肽主链的烷基化氨基酸。在示例性方面，分支形式可例如由下述方式实现：包含两个氨基(侧链氨基以及α氨基)的Lys残基用以直接连接至脂肪烷基或通过间隔物间接连接至脂肪烷基。在示例性方面，另外的间隔物可位于肽主链的氨基酸以及包含至少三个官能团的间隔物之间。例如，所述肽主链的氨基酸可(例如其通过侧链)连接至第一间隔物，所述第一间隔物连接至第二间隔物，其中所述第二间隔物包含至少三个官能团，至少两个官能团各共价连接至烷基且一个官能团连接至第一间隔物。
在所述烷基为线性形式的示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含一个烷基化氨基酸(其为肽主链的一部分)，该烷基化氨基酸直接连接至第一烷基，所述第一烷基连接至间隔物，所述间隔物连接至第二烷基。
双重烷基化化合物的示例性结构可由如图5A所描述的双重酰基化化合物推导而知。
亲水性部分和烷基
所述包含烷基化氨基酸的GIP激动剂肽任选地还包含亲水性部分。在一些具体实施方案中，所述亲水性部分包含聚乙二醇(PEG)链。在一些方面，可通过任何合适的方法(如本文所述的任一方法)并入亲水性部分。在这方面，所述GIP激动剂肽可包含包括本文所述的任何修饰的SEQ ID NO:1，其中GIP激动剂肽的第9、10、12、13、14、16、17、20以及37-43位中的任何位置(例如第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)的至少一个氨基酸包含烷基，且第16、17、21、24或29位、C端延伸内的位置或C端氨基酸中的至少一个氨基酸为Cys、Lys、Orn、同型半胱氨酸或Ac-Phe，其侧链共价键合至亲水性部分(例如PEG)。在一些实施方案中，GIP激动剂肽的第9、10、12、13、14、16、17、20以及37-43位中的任何位置(例如第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)的氨基酸连接至(任选地通过间隔物)烷基，且所述氨基酸还连接至亲水性部分或还连接至与亲水性部分连接的Cys、Lys、Orn、同型半胱氨酸或Ac-Phe，。
或者，所述烷基化胰高血糖素类似物可包含间隔物，其中所述间隔物被烷基化且被修饰为包含亲水性部分。合适间隔物的非限制性实例包括包含一个或多个选自以下的氨基酸的间隔物：Cys、Lys、Orn、同型半胱氨酸和Ac-Phe。
在一些方面，在一些实施方案中的GIP激动剂肽中，烷基化的氨基酸位置与连接亲水性部分的氨基酸位置相同或不同。非限制性实例包括烷基化位于第9、10、12、13、14、16、17、20或40位(例如第10、14以及40位中的任意一个或多个位置)，PEG化位于胰高血糖素类似物C端部分(例如第24、28或29位)、C端延伸内(例如37-43)或位于C端(通过添加C端Cys)中的一个或多个位置。
其他烷基实施方案
在具体实施方案中，包含烷基化氨基酸的GIP激动剂肽缺乏分子内桥，例如共价分子内桥(例如内酰胺桥)。
α螺旋的稳定和α螺旋稳定氨基酸
不受限于任何特定理论，所述的GIP激动剂肽(胰高血糖素类似物)包含螺旋结构，例如α螺旋。在一些或任何实施方案中，所述GIP激动剂肽包含可稳定α螺旋结构的氨基酸。因此，在一些方面，所述GIP激动剂肽包含一个或多个α螺旋稳定氨基酸。如本文所使用，术语“α螺旋促进氨基酸”可与“α螺旋稳定氨基酸”交替使用，均指能为GIP激动剂肽的α螺旋增加稳定性的氨基酸。α螺旋促进氨基酸是本领域中所公知。可参见例如：Lyu et al.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.88：5317-5320(1991)；Branden&Tooze，Introduction to Protein Structure，GarlandPublishing，New York，NY，1991；Fasman，Prediction of Protein Structureand the Principles of Protein Conformation，ed.Fasman，Plenum，NY，1989)。适合本文目的的合适的α螺旋促进氨基酸包括，但不限于：丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、α-氨基丁酸、α-氨基异丁酸(AIB)、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等。在一些实施方案中，α螺旋促进氨基酸为天然存在的蛋白的α螺旋的一部分的任何氨基酸，例如Leu、Phe、Ala、Met、Gly、Ile、Ser、Asn、Glu、Asp、Lys、Arg。
在示例性实施方案中，相比于甘氨酸或丙氨酸，所述α螺旋促进氨基酸为α螺旋提供更高的稳定性。在示例性实施方案中，所述α螺旋促进氨基酸为α,α-双取代氨基酸，例如AIB。
α螺旋：α螺旋促进氨基酸的位置
在本申请的一些或任一实施方案中，所述GIP激动剂肽包含与天然胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相似的氨基酸序列，且所述GIP激动剂肽在肽类似物的第16-21位中的一个或多个位置(例如第16、17、18、19、20、21位中的一个或多个位置)包含至少一个α螺旋促进氨基酸。在一些或任何实施方案中，所述肽类似物在第16、17、20以及21位中的1、2、3或全部的位置包含α螺旋促进氨基酸。
α螺旋：α,α-双取代氨基酸
在一些或任何实施方案中，所述α螺旋促进氨基酸为α,α-双取代氨基酸。在具体实施方案，所述α,α-双取代氨基酸包含R1以及R2，R1和R2各键合至α碳，其中R1以及R2各独立地选自任选地用羟基、酰胺、巯基、卤基所取代的C1-C4烷基，或R1以及R2与它们所连接的α碳形成环(例如C3-C8环)。在示例性实施方案中，R1以及R2各选自：甲基、乙基、丙基以及正丁基，或R1以及R2形成环辛烷或环庚烷(例如1-氨基环辛烷-1-羧酸)。在示例性实施方案中，R1与R2相同。在示例性实施方案中，R1与R2不同。在示例性方面，R1以及R2各为C1-C4烷基。在一些方面，R1以及R2各为C1或C2烷基。在示例性实施方案中，R1以及R2各为甲基，使得所述α,α-双取代氨基酸为α-氨基异丁酸(AIB)。在其他示例性实施方案，所述α,α-双取代氨基酸为ACPC。
在一些方面，本文所述的GIP激动剂肽包含一个或多个α,α-双取代氨基酸，且所述GIP激动剂肽特意地缺乏共价分子内桥(例如内酰胺)，因为所述α,α-双取代氨基酸能在缺乏共价桥时稳定α螺旋。在一些方面，所述GIP激动剂肽包含位于C端(第12-29位附近)的一个或多个α,α-双取代氨基酸。在一些或任何实施方案中，所述GIP激动剂肽的第16、17、18、19、20、21、24或29位中的1、2、3、4或更多个位置或第16、17、18、19、20或21位中的1、2、3、4或全部位置被α,α-双取代氨基酸所取代，例如氨基异丁酸(AIB)，被选自以下的相同或不同基团双取代的氨基酸：甲基、乙基、丙基以及正丁基或环辛烷或环庚烷(例如，1-氨基环辛烷-1-羧酸)。例如，当不存在分子内桥时(如非共价分子内桥(例如盐桥)或共价分子内桥(例如内酰胺))，用AIB取代第20位可增强GIP活性。在一些或任何实施方案中，第16、20、21或24位中的1、2、3或更多个位置被AIB取代。在示例性实施方案中，对应天然人胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的第2、16以及20位中的1、2或全部氨基酸被α,α-双取代氨基酸(如AIB)所取代。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物在第2和16位或第2和20位包含AIB。在其他示例性方面，所述胰高血糖素类似物在第2位包含D-Ser，在第16或20位包含AIB。
α螺旋：分子内桥
在示例性实施方案中，所述α螺旋促进氨基酸为通过分子内桥与GIP激动剂肽的另一氨基酸连接的氨基酸。在这类实施方案中，通过分子内桥相连接的两个氨基酸中的每一个都被认定为α螺旋促进氨基酸。在示例性实施方案中，所述GIP激动剂肽包含一个或二个分子内桥。在示例性实施方案中，所述GIP激动剂肽包含一个分子内桥以及至少一个其他α螺旋促进氨基酸，例如α,α-双取代氨基酸。
在一些实施方案中，所述分子内桥是通过非共价键连接GIP激动剂肽的两个部分的桥，所述非共价键包括，例如，范德华相互作用、氢键、离子键、疏水性相互作用、偶极-偶极相互作用等。在此方面，所述胰高血糖素类似物包含非共价分子内桥。在一些实施方案中，所述非共价分子内桥为盐桥。
在一些实施方案中，所述分子内桥是通过共价键连接GIP激动剂肽的两个部分的桥。在此方面，所述GIP激动剂肽包含共价分子内桥。
在一些实施方案中，所述分子内桥(例如非共价分子内桥、共价分子内桥)形成于相距三个氨基酸的两个氨基酸之间，例如第i以及i+4位的氨基酸，其中，i为12至25的任意整数(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24以及25)。更具体地，第12和16位、第16和20位、第20和24位或第24和28位的氨基酸对(即i=12、16、20或24的氨基酸对)的侧链彼此相连，进而稳定α螺旋。另外，i可为17。在一些具体实施方案中，所述GIP激动剂肽包含第17与21位氨基酸之间的分子内桥。在一些具体实施方案中，所述GIP激动剂肽包含第16与20位氨基酸或第12与16位氨基酸之间的分子内桥，以及位于第17与21位氨基酸之间的第二分子内桥。本申请考虑了包含一个或多个分子内桥的GIP激动剂肽。在第i和i+4位的氨基酸通过分子内桥连接的具体实施方案中，连接物的大小为约8个原子或约7-9个原子。
在其他实施方案中，所述分子内桥形成于相距二个氨基酸的两个氨基酸之间，例如位于第j与j+3位的氨基酸，其中j为12至26的任意整数(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以及26)。在一些具体实施方案中，j为17。在第j与j+3位的氨基酸通过分子内桥连接的具体实施方案中，连接物的大小为约6个原子或为约5-7个原子。
在其他实施方案中，所述分子内桥形成于相距六个氨基酸的两个氨基酸之间，例如位于第k与k+7位的氨基酸，其中k为12至22的任意整数(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21以及22)。在一些具体实施方案中，k为12、13或17。在示例性实施方案中，k为17。
α螺旋：参与分子内桥的氨基酸
能(共价或非共价)结合形成六原子连接桥的氨基酸对的实例包括Orn和Asp、Glu和通式I的氨基酸(其中n为2)、同型谷氨酸和通式I的氨基酸(其中n为1)，其中通式I如下：
Figure BDA0000369878840000511
能结合形成七原子连接桥的氨基酸对的实例包括Orn-Glu(内酰胺环)、Lys-Asp(内酰胺)或同型丝氨酸-同型谷氨酸(内酯)。可形成八原子接头的氨基酸对的实例包括Lys-Glu(内酰胺)；同型赖氨酸-Asp(内酰胺)；Orn-同型谷氨酸(内酰胺)；4-氨基Phe-Asp(内酰胺)；或Tyr-Asp(内酯)。可形成九原子接头的氨基酸对的实例包括同型赖氨酸-Glu(内酰胺)；Lys-同型谷氨酸(内酰胺)；4-氨基Phe-Glu(内酰胺)；或Tyr-Glu(内酯)。这些氨基酸上任一侧链可另外地被其他化学基团所取代，只要不破坏α螺旋的三维结构。本领域技术人员可考虑到其他能产生相似大小及理想效果的稳定结构的氨基酸对或氨基酸类似物，包括化学修饰的衍生物。例如，同型半胱氨酸-同型半胱氨酸二硫键的长度为六原子，可经进一步修饰而提供理想效果。
即使缺乏共价结合，上述氨基酸对(或本领域技术人员所能考虑到的相似配对)仍可通过非共价键向α螺旋提供增加的稳定性，例如，通过形成盐桥或氢键相互作用。因此，盐桥可形成于下列氨基酸对之间：Orn与Glu、Lys与Asp、同型丝氨酸与同型谷氨酸盐、Lys与Glu、Asp与Arg、同型赖氨酸与Asp、Orn与同型谷氨酸盐、4-氨基-苯丙氨酸与Asp、Tyr与Asp、同型赖氨酸与Glu、Lys与同型谷氨酸、4-氨基-苯丙氨酸与Glu或Tyr与Glu。在一些实施方案中，所述类似物包含位于任何下列氨基酸对之间的盐桥：Orn与Glu、Lys与Asp、Lys与Glu、Asp与Arg、同型赖氨酸与Asp、Orn与同型谷氨酸盐、同型赖氨酸与Glu、以及Lys与同型谷氨酸。盐桥可形成于其他带相反电荷侧链的氨基酸对之间。例如，参见Kallenbach et al.,Role of the PeptideBond in Protein Structure and Folding；in The Amide Linkage：StructuralSignificance in Chemistry,Biochemistry,and Materials Science,John Wiley&Sons,Inc.(2000)。
在一些实施方案中，非共价分子内桥为疏水性桥。根据一实施方案，所述类似物的α螺旋是通过在第j与j+3位或第i与i+4位并入疏水性氨基酸而稳定的。例如，i可为Tyr，i+4可为Val或Leu；i可为Phe，i+4可为Met；或i可为Phe，i+4可为Ile。应当理解，为了达到本文的目的，上述氨基酸配对是可颠倒，即第i位的氨基酸可位于第i+4位，同时，位于第i+4位的氨基酸则可位于第i位。应当理解，所述合适的氨基酸配对还可用于第j和j+3位。
α螺旋：共价分子内桥
在一些实施方案中，所述共价分子内桥为内酰胺环或内酰胺桥。所述内酰胺环的大小可因氨基酸侧链的长度而异，在一实施方案中，所述内酰胺是通过将鸟氨酸的侧链与天冬氨酸的侧链相连而形成。内酰胺桥及其制备方法为本领域所知。例如参见Houston,Jr.,et al.,JPeptide Sci1：274-282(2004)以及本文的实施例1。在一些实施方案中，所述类似物包含SEQ ID NO:1的修饰的序列以及位于第i与i+4位之间的内酰胺桥，其中i为上述所定义。在一些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含两个内酰胺桥：一个位于第16与20位的氨基酸之间，另一个位于第17与21位的氨基酸之间。在一些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含一个内酰胺桥以及一个盐桥。进一步的示例性实施方案于“实施例”章节中有描述。进一步的示例性实施方案包含下列配对，任选地为内酰胺桥：第12位的Glu与第16位的Lys；第12位的天然Lys与第16位的Glu；第16位的Glu与第20位的Lys；第16位的Lys与第20位的Glu；第20位的Glu与第24位的Lys；第20位的Lys与第24位的Glu；第24位的Glu与第28位的Lys；第24位的Lys与第28位的Glu。
在一些实施方案中，所述共价分子内桥为内酯。内酯桥的制备方法为本领域所知。例如参见Sheehan et al.,J Am Chem Soc95：875-879(1973)。
在一些方面，利用全碳氢交联系统(all-hydrocarbon cross-linkingsystem)，使用烯烃换位反应(olefin metathesis)将类似物的α螺旋的一或两个转弯(turn)进行交联。在情况下，所述GIP激动剂肽在第j与j+3位或第i与i+4位包含携带不同长度的烯烃侧链且配置为R或S的立体化学性的α-甲基化氨基酸。在一些实施方案中，所述烯烃侧链包含(CH2)n，其中n为1至6的任意整数。在一些实施方案中，对于8个原子的交联长度，n为3。在一些实施方案中，对于6个原子的交联长度，n为2。包含烯烃交联的示例性GIP激动剂肽描述于本文中的SEQID NO:17。形成此类分子内桥的合适方法为本领域所公知。例如参见Schafmeister et al.,J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)以及Walensky et al.,Science305：1466-1470(2004)。在其他实施方案中，所述类似物包含位于相邻螺旋转弯的O-烯丙基Ser残基，其通过铷催化的环闭合换位反应桥接。此类交联方法于Blackwell et al.,Angew,Chem.,Int.Ed.37：3281-3284(1998)中有所描述。
在具体方面，非天然硫醇双丙氨酸氨基酸(羊毛硫氨酸，常被用作半胱氨酸的拟肽物)被用来交联α螺旋的转弯。基于羊毛硫氨酸的环化作用的合适方法是本领域中所知。例如参见Matteucci et al.,TetrahedronLetters45：1399-1401(2004)；Mayer et al.,J.Peptide Res.51：432-436(1998)；Polinsky et al.,J.Med.Chem.35：4185-4194(1992)；Osapay etal.,J.Med.Chem.40：2241-2251(1997)；Fukase et al.,Bull.Chem.Soc.Jpn.65：2227-2240(1992)；Harpp et al.,J.Org.Chem.36：73-80(1971)；Goodman与Shao,Pure Appl.Chem.68：1303-1308(1996)；以及Osapayand Goodman,J.Chem.Soc.Chem.Commun.1599-1600(1993)。
在一些实施方案中，利用第i和i+7位的两个Glu残基之间的α,ω-二氨基烷烃索(例如1,4-二氨基丙烷以及1,5二氨基戊烷)来稳定类似物的α螺旋。这种索能形成9原子或更长的桥，其取决于二氨基烷烃索的长度。制备由此类索交联的肽的方法为本领域中已描述的技术。例如参见Phelan et al.,J.Am.Chem.Soc.119：455-460(1997)。
在其他实施方案中，二硫桥被用来进行交联类似物的α螺旋的一或两个转弯。或者，修饰的二硫桥被用来稳定类似物的α螺旋，在所述修饰的二硫桥中，一或二个硫原子被亚甲基基团所取代，进而形成立体异构大环。以二硫桥或基于硫的环化对肽进行修饰的方法描述于，例如Jackson et al.,J.Am.Chem.Soc.113：9391-9392(1991)以及Rudinger与Jost,Experientia20：570-571(1964)。
在其他实施方案中，利用第j和j+3位或第i和i+4位的两个His残基或His与Cys配对与金属原子结合进而稳定所述类似物的α螺旋。所述金属原子可为，例如Ru(III)、Cu(II)、Zn(II)或Cd(II)。此类基于金属结合的α螺旋的稳定方法为本领域中所知。例如参见Andrewsand Tabor,Tetrahedron55：11711-11743(1999)；Ghadiri et al.,J.Am.Chem.Soc.112：1630-1632(1990)；以及Ghadiri et al.,J.Am.Chem.Soc.119：9063-9064(1997)。
或者，可通过其他肽环化的方法稳定所述GIP激动剂肽的α螺旋，这些方法的综述可参见Davies,J.Peptide.Sci.9：471-501(2003)。可通过形成酰胺桥、硫醚桥、硫酯桥、尿素桥、氨基甲酸桥、磺胺桥等来稳定α螺旋。例如，可在C端和Cys残基的侧链之间形成硫酯桥。或者，可在带有巯基的氨基酸侧链(Cys)和带有羧酸的氨基酸侧链(例如Asp、Glu)之间形成硫酯桥。在另一个方法中，交联试剂(例如二羧酸，如辛二酸等)可在氨基酸侧链的两个官能团间形成连接，所述官能团例如自由氨基、羟基、巯基及以上的组合。
其他描述
以下提供本申请的胰高血糖素类似物的其他描述。如本文所讨论，下列描述的氨基酸的位置是参照于SEQ ID NO:1的氨基酸编号。另外，尽管下列描述是参考天然人胰高血糖素(SEQ ID NO:1)进行讨论(例如SEQ ID NO:1的修饰)，但是这些描述并不必然表示(i)此修饰存在于所有本申请的肽，以及(ii)制备本申请的肽的唯一方法仅以天然人胰高血糖素为起点并修饰该序列。事实上，这些描述是用来描述本申请的胰高血糖素类似物的一些实施方案，另外，本申请的肽不需天然人胰高血糖素作为起始材料，而可重新合成，如标题“制备肽的方法”章节中所述。
第1位
在一些实施方案中，胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO:1的第1位的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物的第1位为非His的氨基酸。在示例性方面，胰高血糖素类似物的第1位为大的芳香族氨基酸。在示例性实施方案中，所述大的芳香族氨基酸为Tyr、Phe、Trp、氨基-Phe(例如，4-氨基苯丙氨酸)、氯-Phe、硫-Phe、4-吡啶-Ala、甲基-Tyr或3-氨基Tyr。
在其他示例性实施方案中，胰高血糖素类似物在第1位包含含有咪唑侧链的氨基酸。在示例性方面，第1位的氨基酸包含通式A的结构：
Figure BDA0000369878840000561
其中R1以及R2分别独立地选自H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F以及至少一个H被F取代的(C1-C6)烷基。
在示例性方面，第1位的氨基酸为胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的天然残基L-组氨酸(His)，或His衍生物(His衍生物)，例如，α原子经修饰的His衍生物。在示例性方面，所述His衍生物为D-组氨酸、脱氨基组氨酸(desaminohistidine)、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸、同型组氨酸、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸或α,α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。
在其他方面，第1位的氨基酸为如本文所述的DPP-IV保护性氨基酸。在一些方面，DPP-IV保护性氨基酸为His衍生物。
第2位
在一些实施方案中，本申请的肽在第2位包含DPP-IV保护性氨基酸。如本文所使用，术语“DPP-IV保护性氨基酸”指能为本申请的肽提供针对二肽蛋白酶IV(DPP IV)的切割的显著抗性的氨基酸。在一些方面，所述DPP-IV保护性氨基酸为D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸或α-氨基异丁酸(AIB)之一。在一些方面，所述DPP-IV保护性氨基酸为α,α-双取代氨基酸。在一些方面，所述α,α-双取代氨基酸包含R1与R2，R1与R2均与α碳键合，其中R1与R2各独立地选自任选地用羟基、酰胺、巯基、卤素所取代的C1-C4烷基，或R1以及R2与它们所连接的α碳形成环。在一些方面，所述α,α-双取代氨基酸为AIB或1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACPC)。
如本文所使用，术语“C1-Cn烷基(其中n可为1至6)”表示具有1至指定数目碳原子的分支的或线性的烷基。典型的C1-C6烷基包括，但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。
在示例性实施方案中，所述DPP-IV保护性氨基酸为Ser的D-异构物(D-Ser)或其保守型氨基酸取代。例如，所述DPP-IV保护性氨基酸可包含-(C1-C4烷基)OH的侧链结构。任选地，当所述侧链结构包含-(C3烷基)OH或-(C4烷基)OH时，所述碳链可为线性的或分支的。
在示例性方面，当所述DPP-IV保护性氨基酸为D-Ser且所述第1位的氨基酸为His时，所述GIP激动剂肽不与异源部分缀合，例如亲水性部分(如PEG)。在本申请的其他方面，所述DPP-IV保护性氨基酸不是D-丝氨酸。
第3位
在一些实施方案中，胰高血糖素类似物包含位于第3位的酸性、碱性或疏水性氨基酸残基。不受限于任何特定理论，这样的胰高血糖素类似物表现出降低的胰高血糖素受体活性。在一些实施方案中，所述酸性、碱性或疏水性氨基酸为谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸。在一些方面，例如用谷氨酸、鸟氨酸或正亮氨酸取代的胰高血糖素类似物在胰高血糖素受体的活性为天然胰高血糖素活性的约10%或更低，例如，约1-10%，或约0.1-10%，或大于约0.1%但小于约10%。在一些实施方案中，胰高血糖素类似物表现出天然胰高血糖素的活性的约0.5%、约1%或约7%。
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物在第3位包含SEQ IDNO:1的天然氨基酸，例如，谷氨酰胺，或包含谷氨酰胺类似物。不受限于特定理论，包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素类似物在胰高血糖素受体不表现出活性的大量丧失，在一些情况下，所述包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素类似物增强胰高血糖素受体活性。在一些实施方案中，所述谷氨酰胺类似物在第3位包含含有结构I、II或III的侧链的氨基酸：
其中R1为C0-3烷基或C0-3杂烷基；R2为NHR4或C1-3烷基；R3为C1-3烷基；R4为H或C1-3烷基；X为NH、O或S；Y为NHR4、SR3或OR3。在一些实施方案中，X为NH或Y为NHR4。在一些实施方案中，R1为C0-2烷基或C1杂烷基。在一些实施方案中，R2为NHR4或C1烷基。在一些实施方案中，R4为H或C1烷基。在示例性实施方案中，提供包含结构I侧链的氨基酸，其中R1为CH2-S，X为NH，R2为CH3(乙酰胺甲基半胱氨酸，C(Acm))；R1为CH2，X为NH，R2为CH3(乙酰二胺丁酸,Dab(Ac))；R1为C0烷基，X为NH，R2为NHR4，R4为H(胺甲酰二胺丙酸，Dap(尿素))；或R1为CH2-CH2，X为NH，R2为CH3(乙酰鸟氨酸，Orn(Ac))。在示例性实施方案中，提供包含结构II侧链的氨基酸，其中R1为CH2，Y为NHR4，R4为CH3(甲基谷氨酸，Q(Me))；在示例性实施方案中，提供包含结构III侧链的氨基酸，其中R1为CH2，R4为H(甲硫氨酸亚砜，M(O))；在具体实施方案中，第3位的氨基酸被Dab(Ac)取代。
第7位
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物在第7位包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物第7位为Thr以外的氨基酸。在一些方面，第7位的氨基酸为大的、脂肪族氨基酸，例如，Ile、Leu、Ala等。不受限于特定理论，包含所述第7位氨基酸的胰高血糖素类似物被认为能大幅降低其在GLP-1受体的活性。
第9位
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物在第9位包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物第9位为Asp以外的氨基酸。在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含Asp以外的带负电荷氨基酸，例如Glu、同型谷氨酸、磺基丙氨酸、同型磺基丙氨酸。在一些方面，所述第9位的氨基酸为如本申请所讨论的酰基化氨基酸或烷基化氨基酸。
第10位
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物在第10位包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物第10位为Tyr以外的氨基酸。在一些方面，第10位的氨基酸为Trp。不受限于特定理论，与第10位为Tyr的对应肽相比，包含所述第10位氨基酸的胰高血糖素类似物被认为在GIP受体、GLP-1受体和/或胰高血糖素受体表现出的活性不降低。
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含如本申请所讨论的酰基化氨基酸或烷基化氨基酸。
第12位
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物在第12位包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物第10位为Lys以外的氨基酸。在一些方面，第12位的氨基酸为大的、脂肪族、非极性氨基酸，任选地为异亮氨酸。在一些方面，第12位的氨基酸为Arg。不受限于特定理论，包含大的、脂肪族、非极性氨基酸(如Ile)的胰高血糖素类似物在GIP受体表现出增加的活性。在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含如本文所讨论的酰基化氨基酸或烷基化氨基酸。
第15位
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物在第15位包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物第15位为Asp以外的氨基酸。在一些方面，第15位的氨基酸缺失或为谷氨酸、同型谷氨酸、磺基丙氨酸或同型磺基丙氨酸。不受限于特定理论，此类胰高血糖素类似物表现出提高的稳定性，例如，通过减少所述类似物随时间、特别是在酸性或碱性缓冲液中(如pH为5.5至8的缓冲液)中的降解或裂解。在一些实施方案中，包含此修饰的胰高血糖素类似物在25℃下，24小时后保留原类似物的至少75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
第16位
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物在第16位包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物第16位为Ser以外的氨基酸。在一些方面，第16位的氨基酸为谷氨酸或其他具有4个原子长度侧链的、带负电荷氨基酸，或者也可以是谷氨酰胺、同型谷氨酸或同型磺基丙氨酸，或具有含至少一个杂原子(例如，N、O、S、P)的侧链并且侧链长度为约4(或3-5)个原子的带电荷氨基酸中的任意一种。在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物在第16位包含选自以下的氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、同型谷氨酸、同型磺基丙氨酸、苏氨酸或甘氨酸，或选自以下的氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、同型谷氨酸以及同型磺基丙氨酸。
不受限于特定理论，所述胰高血糖素类似物表现出增强的稳定性，例如，通过减少所述肽随时间、特别是在酸性或碱性缓冲液中(如pH为5.5至8的缓冲液)中的降解或裂解。此类胰高血糖素类似物不易于受到Asp15-Ser16的肽键的切割。
在一些实施方案中，第16位的氨基酸为带负电荷的氨基酸，任选地与第20位的α螺旋促进氨基酸(例如，α,α-双取代氨基酸，或AIB)组合。此胰高血糖素类似物表现出GIP活性。
在其他实施方案中，所述胰高血糖素类似物在第16位包含Thr或如上所述的α螺旋促进氨基酸。在一些实施方案中，α螺旋促进氨基酸为AIB或Glu。
在一些方面，第16位的氨基酸为带正电荷的氨基酸，例如通式IV：
Figure BDA0000369878840000611
其中n为1至16、或1至10、或1至7、或1至6、或2至6、或2、或3、或4、或5，R1及R2各独立地选自：H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7以及(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，Lys。
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含如本文所讨论的酰基化氨基酸或烷基化氨基酸。
在其他实施方案中，第16位的氨基酸包含与异源部分缀合的侧链，如“缀合物”章节中所描述。
第17和18位
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物在第17位或第18位或两者包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，从而消除第17与18位的双碱性Arg-Arg位点。在一些实施方案中，胰高血糖素类似物在第17位或第18位或两者包含Arg以外的氨基酸。不受限于任何特定理论，去除双碱性位点被认为能增进胰高血糖素类似物的体内功效。在一些方面，所述第17位的氨基酸不是碱性氨基酸。在一些方面，第17位的氨基酸为脂肪族氨基酸。在一些实施方案中，第17位的氨基酸被本文所述的另一氨基酸取代，例如包含亲水性部分的氨基酸、α螺旋促进氨基酸。在一些实施方案中，α螺旋促进氨基酸与第j+3或i+4位的氨基酸形成非共价分子内桥。在一些方面，第17位的氨基酸为Gln。
在一些方面，第18位的氨基酸不是碱性氨基酸。在一些方面，第18位的氨基酸为脂肪族氨基酸。在一些实施方案中，第18位的氨基酸为小的脂肪族氨基酸，例如Ala。
在一些方面，第18位的氨基酸为小的脂肪族氨基酸，例如Ala，且第17位的氨基酸为Arg。在其他方面，第18位的氨基酸为小的脂肪族氨基酸，例如Ala，且第17位的氨基酸为Gln。
在一些方面，第17位的氨基酸为包含与异源部分缀合的侧链的氨基酸，如“缀合物”章节中所述。
第20位
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物在第20位包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，例如所述第20位的氨基酸为Gln以外的氨基酸。在一些方面，第20位的氨基酸为α螺旋促进氨基酸，例如上文所描述的α螺旋促进氨基酸。在一些方面，第20位的氨基酸为α,α-双取代氨基酸，例如AIB、ACPC。在一些实施方案中，所述α螺旋促进氨基酸与第j-3或i-4位的氨基酸形成非共价分子内桥。
在一些具体实施方案中，所述氨基酸为具有带电荷的或能形成氢键的侧链的亲水性氨基酸，且长度为至少约5个(或约4-6个)原子。例如，赖氨酸、瓜氨酸、精氨酸或鸟氨酸。在其他方面，第20位的氨基酸为Ser、Thr、Ala或AIB。
在一些方面，第20位的氨基酸为酰基化氨基酸或烷基化氨基酸，如本文所述。
在一些方面，第20位的氨基酸为为包含与异源部分缀合的侧链的氨基酸，如“缀合物”章节中所描述。
不受限于特定理论，此类胰高血糖素类似物在GLP-1受体和/或GIP受体表现出增强的活性，或者通过Gln脱酰胺反应表现出降低的降解，和/或表现出增加的稳定性。
第21位
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物在第21位包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，例如位于第21位的氨基酸为Asp以外的氨基酸。在示例性方面，第21位的氨基酸为Ser、Thr、Ala或AIB。在其他方面，第21位的氨基酸为Lys、Arg、Orn或瓜氨酸。在一些方面，第21位的氨基酸为Glu、同型谷氨酸或同型磺基丙氨酸。在一些方面，第21位的氨基酸为包含与异源部分缀合的侧链的氨基酸，如“缀合物”章节中所描述。
在一些实施方案中，第21位的氨基酸为α螺旋促进氨基酸。在一些实施方案中，所述α螺旋促进氨基酸与第j-3或i-4位的氨基酸形成非共价分子内桥。
不受限于特定理论，此类胰高血糖素类似物表现出降低的降解反应和/或增强的稳定性，所述降解是通过Asp的脱氢反应而形成环形琥珀酰亚胺中间产物、之后异构化形成异天冬氨酸盐而发生的降解。
第23位
在一些方面，所述胰高血糖素类似物包含在第23位包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰。在一些方面，第23位的氨基酸为Val以外的氨基酸，包括但不限于Ile。
第24位
在一些方面，所述胰高血糖素类似物在第24位包含相对于SEQ IDNO:1的氨基酸修饰。在一些方面，第24位的氨基酸为Gln以外的氨基酸Gln，例如，Ala、Asn、Cys。在一些方面，第24位的氨基酸为包含与异源部分缀合的侧链的氨基酸，如“缀合物”章节中所描述。
第27位
在一些方面，所述胰高血糖素类似物在第27位包含相对于SEQ IDNO:1的氨基酸修饰。在一些方面，第27位的氨基酸为Met以外的氨基酸。在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物在第27位包含能防止所述肽的氧化降解的氨基酸。在一些方面，第27位的氨基酸为甲硫氨酸亚砜、亮氨酸、异亮氨酸或正亮氨酸。在一些具体实施方案中，位于第27位的氨基酸为亮氨酸或正亮氨酸。
在其他方面，第27位的氨基酸为脂肪族氨基酸(例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile)或如本文所述的通式IV的氨基酸，例如Lys。在示例性实施方案中，第27位的氨基酸为Val或Lys。不受限于任何特定理论，此种氨基酸修饰会降低胰高血糖素活性。
第28位
在一些方面，所述胰高血糖素类似物在第28位包含相对于SEQ IDNO:1的氨基酸修饰。在一些方面，第28位的氨基酸为Asn以外的氨基酸。在一些方面，第28位的氨基酸为Ala、Ser、Thr或AIB。在一些方面，第28位的氨基酸为带电荷的氨基酸，例如带负电荷的氨基酸，如本文进一步的描述。参见“带电荷的C端”章节。在一些方面，第28位的氨基酸为Asp。
在示例性方面，第28位的氨基酸为如本文所述的通式IV的氨基酸。在示例性实施方案中，所述氨基酸为Lys。不受限于任何特定理论，此种氨基酸修饰降低胰高血糖素活性。
第29位
在一些方面，所述胰高血糖素类似物在第29位包含相对于SEQ IDNO:1的氨基酸修饰。在一些方面，所述第29位的氨基酸为Thr以外的氨基酸。在一些方面，所述第29位的氨基酸为Gly。在一些方面，所述第29位的氨基酸为Ala。
在一些方面，所述第29位的氨基酸为包含与异源部分缀合的侧链的氨基酸，如“缀合物”章节中所描述。
带电C端
在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1，所述胰高血糖素类似物包含一个或多个能向所述类似物的C端部分引入带电荷氨基酸的氨基酸取代和/或添加。在一些实施方案中，此类修饰可增加稳定性以及溶解度。如本文所使用，术语“带电荷的氨基酸”或“带电荷的残基”表示包含在生理pH值下、在水性溶液中带正电荷(即质子化的)或带负电荷(即去质子化的)的侧链的氨基酸。在一些方面，这些可引入带电荷氨基酸修饰的氨基酸取代和/或添加位于SEQ ID NO:1的第27位的C端位置。在一些实施方案中，1、2或3个(在一些情况下，大于3个)带电荷的氨基酸被引入C端部分(例如，第27位的C端的位置)。根据一些实施方案，位于第28和/或29位的天然氨基酸被带电荷的氨基酸取代，和/或在另一实施方案中，1至3个带电荷的氨基酸还被添加至所述类似物的C端。在示例性实施方案中，1、2或所有的带电荷氨基酸为带负电荷的。在一些实施方案中，所述带负电荷的氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、同型磺基丙氨酸或同型谷氨酸。在一些方面，这些修饰会增加溶解度或稳定性。在一些实施方案中，第30位不是带电荷的氨基酸。不受限于特定理论，带电荷的氨基酸(例如带负电荷的氨基酸，如Glu)会降低GIP活性。
C端截短
根据一些实施方案，本申请的胰高血糖素类似物通过C端截短1或2个氨基酸残基而被修饰。这样修饰的胰高血糖素肽在胰高血糖素受体以及GLP-1受体保留相似的活性与效能。在这方面，所述胰高血糖素肽可包含天然胰高血糖素类似物(SEQ ID NO:1)的氨基酸1-27或1-28，任选地具有本文所述的其他修饰。
电中性C端
在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1，所述胰高血糖素类似物在C端包含电中性基团(例如酰胺或酯)来替换α羧酸基团。不受限于任何特定理论，在示例性方面，此类修饰会增加所述胰高血糖素类似物在GLP-1受体的活性。因此，在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物为酰胺化肽，而所述C端残基包含酰胺来替换氨基酸的α羧酸。如本文所使用，一般性引用肽或类似物时意图包括具有修饰的氨基端、羧基端或氨基端与羧基端的肽。例如，以指定为标准氨基酸的氨基酸序列意图还包括末端羧基被酰胺基替换的氨基酸链。
C端延伸
在本申请的一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含1-21个氨基酸的C端延伸，所述C端延伸与第29位氨基酸融合。C端延伸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个氨基酸。在一些方面，所述C端延伸为任何下文“缀合物”章节所描述的异源肽。例如，在一些方面，所述延伸包含可形成Trp笼(Trp cage)结构的氨基酸序列，例如，所述延伸包含氨基酸序列GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:5)或其保守型取代的序列。在其他天然方面，所述1至21个氨基酸的延伸包含至少一个带电荷的氨基酸。在示例性方面，所述延伸包含X1-X2的氨基酸序列，其中X1为带电荷的氨基酸，X2为小的脂肪族氨基酸。在一些方面，X1为带正电荷的氨基酸，例如Arg。在一些方面，所述延伸包含Arg-Gly。
在一些实施方案中，所述延伸包含SEQ ID NO:5(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO:6(GGPSSGAPPPS)、SEQ ID NO:7(KRNRNNIA)或SEQID NO:8(KRNR)的氨基酸序列。在具体方面，所述氨基酸序列通过胰高血糖素类似物的C端氨基酸(例如第29位的氨基酸)进行连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:5-8中任一的氨基酸序列是通过肽键结合至所述胰高血糖素类似物的氨基酸29。在一些具体实施方案中，所述胰高血糖素类似物第29位的氨基酸为Gly，所述Gly与SEQ ID NO:5-8中任意氨基酸序列中的一个融合。
在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含能形成本领域所公知的结构Trp笼的延伸，参见，例如Paschek et al.,Proc Natl Acad Sci USA105(46)：17754-17759(2008)。在一些方面，所述延伸包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:5)或GGPSSGAPPPS(SEQID NO：6)或GPSSGRPPPS(SEQ ID NO:183)的氨基酸序列，或带有1、2或3个保守型氨基酸取代的上述序列之一。在示例性方面，当所述延伸包含SEQID NO:183的氨基酸序列时，所述第28位的氨基酸为带负电荷的氨基酸，例如Asp或Glu。
其他修饰
本申请的胰高血糖素相对于SEQ ID NO:1的其他修饰的描述可参见本说明书。上列的列举不是穷举，而仅仅是示例性的。
在一些实施方案中，本文所述的胰高血糖素类似物为糖基化、酰胺化、羧酸化、磷酸化、酯化、N-酰基化、通过如二硫桥环化或转化为盐(例如酸加成盐、碱加成盐)，和/或任选地二聚化、多聚化或聚合化或缀合化。
排除的肽
本申请的胰高血糖素类似物在结构上与下列文献中描述的表现出GIP受体激动剂活性的胰高血糖素类似物不同：国际专利申请PCTUS2009/47447(2009年6月16日提交)、美国申请61/073,274(2008年6月17日提交)、美国申请61/078,171(2008年7月3日提交)、美国申请61/090,448(2008年8月20日提交)、美国申请61/151,349(2009年2月10日提交)、美国申请61/187,578(2009年6月16日提交)、国际专利申请PCT/US2010-038825(2010年6月16日提交)；通过引用将以上文献整体并入本文。因此，在任一或所有实施方案中，本申请的胰高血糖素类似物不为下列文献中描述的任何胰高血糖素类似物或肽：国际专利申请PCT/US2009/47447(2009年6月16日提交，公开号WO2010/011439)、美国申请61/073,274(2008年6月17日提交)、美国申请61/078,171(2008年7月3日提交)、美国申请61/090,448(2008年8月20日提交)、美国申请61/151,349(2009年2月10日提交)、美国申请61/187,578(2009年6月16日提交)、国际专利申请PCT/US2010-038825(2010年6月16日提交，公开号WO2010/148089)、美国申请61/298,812(2010年1月27日提交)或国际专利申请PCT/US2011/022608(2011年1月26日提交，公开号WO2011/094337)。在示例性实施方案中，本申请的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不为(即除外)WO2010/011439中SEQ ID NO:1-262、WO2010/148089中SEQ ID NO:1-680或是PCT/US2011/022608中SEQ IDNO:1-1318中的任何一个或全部。
在示例性实施方案中，本申请的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不为(即除外)国际专利申请公开WO2010/011439中的SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261和/或262中任一或全部的肽。
在示例性实施方案中，本申请的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不为(即除外)国际专利申请公开WO2010/148089中的SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679和/或680中的任一或全部的肽。在示例性实施方案中本申请的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不为(即除外)国际专利申请公开WO2010/148089中的SEQ ID NO:657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669中任一或全部的肽，这些肽在本文中分别以SEQ ID NO:219-229表示。
在示例性实施方案中，本申请的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不为(即除外)国际专利申请公开WO/2011/094337中的SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024、1025、1026、1027、1028、1029、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1036、1037、1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1071、1072、1073、1074、1075、1076、1077、1078、1079、1080、1081、1082、1083、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096、1097、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110、1111、1112、1113、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1121、1122、1123、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134、1135、1136、1137、1138、1139、1140、1141、1142、1143、1144、1145、1146、1147、1148、1149、1150、1151、1152、1153、1154、1155、1156、1157、1158、1159、1160、1161、1162、1163、1164、1165、1166、1167、1168、1169、1170、1171、1172、1173、1174、1175、1176、1177、1178、1179、1180、1181、1182、1183、1184、1185、1186、1187、1188、1189、1190、1191、1192、1193、1194、1195、1196、1197、1198、1199、1200、1201、1202、1203、1204、1205、1206、1207、1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示例性实施方案
在示例性实施方案中，本申请的肽为胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的类似物，其包含(i)包含咪唑侧链的氨基酸，其位于第1位；(ii)DPP-IV保护性氨基酸，位于第2位；(iii)酰基化氨基酸或烷基化氨基酸，任选地位于第9、10、12、16、20或37-43位中的任意位置，其中，所述酰基或烷基任选地通过间隔物连接至所述氨基酸；(iv)α螺旋稳定氨基酸，位于第16-21位中的一个或多个位置；以及(v)至多十个相对于SEQID NO:1的另外的氨基酸修饰，其中当所述胰高血糖素类似物不与异源部分(例如亲水性部分(如PEG))缀合时，所述胰高血糖素类似物在GIP受体表现出的活性为天然GIP的活性的至少或约0.1%(例如，至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约80%、至少或约100%、至少或约500%)。
本文所述的胰高血糖素类似物可包含本文所述的任何活性谱，参见标题为“本申请的肽的活性”的章节。在示例性方面，胰高血糖素类似物表现出至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约300%或者至少或约500%的GIP百分比效能。在一些方面，所述胰高血糖素类似物还表现出至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约300%或者至少或约500%的GLP-1百分比效能。在其他或另外的方面，所述胰高血糖素类似物表现出至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%或至少或约100%的胰高血糖素百分比效能。因此，尽管所述胰高血糖素类似物可被认作GIP激动剂肽，但是在一些方面，所述胰高血糖素类似物还可当作GIP-GLP-1双功能激动剂、GIP-胰高血糖素双功能激动剂或GIP-GLP-1-胰高血糖素三功能激动剂。例如，所述肽可以在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体均表现出激动剂活性，其中所述肽在GIP受体表现出的EC50为其在GLP-1受体表现出的EC50的100倍以内(例如50倍、40倍、30倍、20倍、15倍、10倍或更少)，并且为其在胰高血糖素受体受体表现出的EC50的100倍以内(例如50倍、40倍、30倍、20倍、15倍、10倍或更少)。
在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含位于第1位的含有咪唑侧链的氨基酸。在示例性方面，所述第1位的氨基酸包含通式A的结构：
Figure BDA0000369878840000751
其中R1以及R2分别独立地选自：H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F以及至少一个H被F所取代的(C1-C6)烷基。
在示例性方面，第1位的氨基酸为胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的天然残基L-组氨酸(L-His)或为His衍生物，例如α原子被修饰的His衍生物。如本文所使用，术语“His衍生物”表示包含与至少一个碳原子连接的咪唑(例如包含通式A的结构)或取代的咪唑的化学部分。在示例性实施方案中，所述His衍生物包含与组氨酸相似的结构，但是α氨基、α碳或α羧酸被另一个化学部分所替换。在示例性实施方案中，所述His衍生物为α取代的组氨酸，其中连接至α碳的氢原子是被另一个化学部分所替换，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、羟基、甲氧基、乙氧基等。在一些方面，His衍生物为D-组氨酸、脱氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸、同型组氨酸、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸或α,α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。
在一些方面，所述第2位的DPP-IV保护性氨基酸为D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸或α-氨基异丁酸(α-AIB)之一。在一些方面，所述DPP-IV保护性氨基酸为D-Ser或其保守型氨基酸取代，或α,α-双取代氨基酸。在一些方面，所述α,α-双取代氨基酸包含R1和R2，R1和R2均与α碳键合，其中R1以及R2独立地选自任选地用羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1与R2与它们所连接的α碳形成环。在一些方面，所述α,α-双取代氨基酸为AIB。在示例性方面，当DPP-IV保护性氨基酸为D-Ser时，所述GIP激动剂肽不与异源部分(如亲水性部分(例如PEG))缀合。在本申请的其他方面，所述DPP-IV保护性氨基酸不为D-丝氨酸。
在一些方面，所述胰高血糖素类似物在第16、17、18、19、20或21位中的任何位置包含α螺旋稳定氨基酸。在一些方面，所述胰高血糖素类似物在第16、17、18、19、20或21位中的1、2、3、4、5或全部的位置包含α螺旋稳定氨基酸。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含位于第16、17、20以及21位的α螺旋稳定氨基酸。在一些方面，所述胰高血糖素类似物包含位于第16以及20位的α螺旋稳定氨基酸。在其他或另外的方面，所述胰高血糖素类似物包含位于第17以及21位的α螺旋稳定氨基酸。
在一些方面，当所述胰高血糖素类似物在第20位时包含α螺旋稳定氨基酸时，第20位的氨基酸为α,α-双取代氨基酸。在示例性方面，所述α,α-双取代氨基酸包含R1和R2，R1和R2均与α碳键合，其中R1以及R2独立地选自任选地用羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1与R2与它们所连接的α碳形成环。在一些实施方案中，所述α,α-双取代氨基酸为1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACPC)。在一些方面，第20位的α,α-双取代氨基酸为AIB。任选地，在一些实施方案中，当第20位的氨基酸为α,α-双取代氨基酸时，位于第16位的氨基酸为AIB以外的α螺旋稳定氨基酸。在示例性实施方案中，所述第16位的氨基酸为带电荷的氨基酸，例如带正电荷的氨基酸、带负电荷的氨基酸。在一些方面，当第20位的氨基酸为α,α-双取代氨基酸时，所述第16位的氨基酸为通式IV的带正电荷的氨基酸，例如Lys，或为带负电荷的氨基酸，如Glu。在一些方面，当第20位的氨基酸为α,α-双取代氨基酸时，所述第16位的氨基酸为电中性的氨基酸，如Ser、Ala、Gly。
因此，在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含(i)包含咪唑侧链的氨基酸，其位于第1位；(ii)DPP-IV保护性氨基酸，位于第2位，任选地为氨基异丁酸；(iii)包含非天然酰基或烷基的氨基酸，任选地位于第9、10、12、16、20或37-43位中的任意位置，任选地，其中所述非天然酰基或烷基通过间隔物连接至所述氨基酸；(iv)α,α-双取代氨基酸，位于第20位；以及(v)至多十个(例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9个)相对于SEQ ID NO:1的另外的氨基酸修饰。
在示例性实施方案中，当所述胰高血糖素类似物在第20位包含α,α-双取代氨基酸，且当所述胰高血糖素类似物缺乏亲水性部分时，所述胰高血糖素类似物表现出至少0.1%的GIP百分比效能(例如至少1%、至少10%、至少20%)。在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物在人GLP-1受体相对于GIP受体的选择性为低于100倍(例如，低于或约90倍、低于或约80倍、低于或约70倍、低于或约60倍、低于或约50倍、低于或约40倍、低于或约30倍、低于或约20倍、低于或约15倍、低于或约10倍、低于或约5倍)。在示例性方面，所述肽在GIP受体的EC50与其在GLP-1受体的EC50相差低于100倍(例如，低于或约90倍、低于或约80倍、低于或约70倍、低于或约60倍、低于或约50倍、低于或约40倍、低于或约30倍、低于或约20倍、低于或约15倍、低于或约10倍、低于或约5倍)，任选地，与其在胰高血糖素受体的EC50相差低于100倍(例如，低于或约90倍、低于或约80倍、低于或约70倍、低于或约60倍、低于或约50倍、低于或约40倍、低于或约30倍、低于或约20倍、低于或约15倍、低于或约10倍、低于或约5倍)。
在示例性实施方案中，当所述胰高血糖素类似物在第20位包含α,α-双取代氨基酸时，所述α,α-双取代氨基酸包含R1和R2，R1和R2均与α碳键合，其中R1以及R2独立地选自任选地用羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1与R2与它们所连接的α碳形成环。在示例性实施方案中，所述第20位的α,α-双取代氨基酸为AIB。另外，在示例性实施方案中，当所述胰高血糖素类似物在第20位包含α,α-双取代氨基酸时，第16位的氨基酸为非AIB的α螺旋稳定氨基酸。在示例性方面，第16位的氨基酸为带电荷的氨基酸，任选地为带负电荷的氨基酸(例如Glu或Asp)或带正电荷的氨基酸(例如Lys或Orn)。
在其他实施方案中，所述胰高血糖素类似物不包含位于第20位的α螺旋稳定氨基酸，且第16、17、18、19或21位中的一个或多个氨基酸为α螺旋稳定氨基酸。在一些方面，所述α螺旋稳定氨基酸位于第16位。在一些实施方案中，所述α螺旋稳定氨基酸为带负电荷的氨基酸(例如Glu)、带正电荷的氨基酸(例如包含通式IV的结构的氨基酸(例如Lys))或α,α-双取代氨基酸。在一些方面，所述α,α-双取代氨基酸包含R1和R2，R1和R2均与α碳键合，其中R1以及R2独立地选自任选地用羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1与R2与它们所连接的α碳形成环。在具体方面，位于第16位的α,α-双取代氨基酸为AIB。
在其他实施方案中，当所述胰高血糖素类似物不包含位于第20位的α螺旋稳定氨基酸，且第16、17、18、19或21位中的一个或多个氨基酸为α螺旋稳定氨基酸时，所述胰高血糖素类似物包含(i)位于所述肽类似物的第29位氨基酸的C端1-21个氨基酸的延伸，或(ii)位于第10、12或16位的酰基化氨基酸或烷基化氨基酸。在一些方面，所述胰高血糖素类似物包含位于肽类似物的第29位氨基酸的C端的1-21个氨基酸的延伸，且任选地，第29位的氨基酸为Gly。在一些方面，所述1-21个氨基酸的延伸是如本文所述的任何延伸，例如参见标题为“C端延伸”的章节。在一些方面，所述延伸包含能形成Trp笼结构的氨基酸序列，例如所述延伸包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列或其保守型取代的序列。在其他方面，所述1至21个氨基酸延伸包含至少一个带电荷的氨基酸。在示例性方面，所述延伸包含X1-X2的氨基酸序列，其中X1为带电荷的氨基酸，X2为小的脂肪族氨基酸。在一些方面，X1为带正电荷的氨基酸，例如Arg。在一些方面，所述延伸包含Arg-Gly。
因此，在其他示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含(i)包含咪唑侧链的氨基酸，位于第1位；(ii)DPP-IV保护性氨基酸，位于第2位，任选地为氨基异丁酸；(iii)包含非天然酰基或烷基的氨基酸，任选地位于第9、10、12、16、20或37-43位中的任何位置，任选地，其中所述非天然酰基或烷基通过间隔物连接至所述氨基酸；(iv)α螺旋稳定氨基酸，位于第16-21位中的一个或多个位置，任选地位于第16位，其中所述类似物在第20位不包含α螺旋稳定氨基酸；以及(v)至多十个(例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9个)相对于SEQ ID NO:1的另外的氨基酸修饰。在示例性方面，所述类似物在第20位不包含α,α双取代氨基酸(任选地为AIB)或选自以下的α螺旋稳定氨基酸：Leu、Phe、Ala、Met、Gly、Ile、Ser、Asn、Glu、Asp、Lys以及Arg。在示例性方面，与SEQ ID NO:1相比，所述胰高血糖素类似物在第20位未受到修饰，因此第20位为Gln残基，即，胰高血糖素在此位置的天然氨基酸。
在示例性实施方案中，当所述胰高血糖素类似物在第16-21位中的一个或多个位置(任选地位于第16位)包含α螺旋稳定氨基酸，所述类似物在第20位不包含α螺旋稳定氨基酸，且所述胰高血糖素类似物缺乏亲水性部分时，所述胰高血糖素类似物表现出至少0.1%的GIP百分比效能(例如，至少1%、至少10%或至少20%)。在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物对于人GLP-1受体相对于GIP受体的选择性低于100倍(例如，例如，低于或约90倍、低于或约80倍、低于或约70倍、低于或约60倍、低于或约50倍、低于或约40倍、低于或约30倍、低于或约20倍、低于或约15倍、低于或约10倍、低于或约5倍)。在示例性方面，所述肽在GIP受体的EC50与其在GLP-1受体的EC50相差低于100倍(例如，低于或约90倍、低于或约80倍、低于或约70倍、低于或约60倍、低于或约50倍、低于或约40倍、低于或约30倍、低于或约20倍、低于或约15倍、低于或约10倍、低于或约5倍)，任选地，与其在胰高血糖素受体的EC50相差低于100倍(例如，低于或约90倍、低于或约80倍、低于或约70倍、低于或约60倍、低于或约50倍、低于或约40倍、低于或约30倍、低于或约20倍、低于或约15倍、低于或约10倍、低于或约5倍)。
在示例性方面，当所述胰高血糖素类似物在第16-21位中的一个或多个位置包含α螺旋稳定氨基酸，且所述类似物在第20位不包含α螺旋稳定氨基酸时，所述胰高血糖素类似物在第16位包含α螺旋稳定氨基酸，任选地，其中所述α螺旋稳定氨基酸为带负电荷的氨基酸(例如Glu或Asp)或α,α-双取代氨基酸。所述第16位的α,α-双取代氨基酸可包含R1和R2，R1和R2均与α碳键合，其中R1以及R2独立地选自任选地用羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1与R2与它们所连接的α碳形成环。在示例性方面，第16位的氨基酸为AIB。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物在第18位包含小的脂肪族氨基酸，任选地为Ala，以及在第17位包含Arg。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物在第16至20位包含序列ERAAQ(SEQ ID NO:200)，或在第16至21位包含序列ERAAQD(SEQ ID NO:201)。
在示例性方面，所述胰高血糖素类似物在第9、10、12、16以及20位中的任一位置包含含有非天然酰基或烷基的氨基酸。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物在第9、10、12、13、14、16、17以及20位中的任意一个或多个位置包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物在第10以及14位中的任意一个或多个位置包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸。在一些方面，所述胰高血糖素类似物在第10、12或16位包含酰基化氨基酸或烷基化氨基酸。在示例性方面，所述酰基化氨基酸或烷基化氨基酸位于第14位。在一些方面，所述胰高血糖素类似物包含位于第29位氨基酸的C端得1至21个氨基酸的延伸，且在第37-43位的任何位置(例如，37、38、39、40、41、42、43)包含含有非天然酰基或烷基的氨基酸。在一些方面，所述含有非天然酰基或烷基的氨基酸位于第40位。
在示例性方面，酰基
在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含第29位氨基酸的C端的1至21个氨基酸的延伸，且在一些方面，所述延伸形成本领域中已知为Trp笼的结构。在一些方面，所述延伸包含氨基酸序列GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:5)或GGPSSGAPPPS(SEQ ID NO:6)或GPSSGRPPPS(SEQ ID NO:183)或带有1、2或3个保守型氨基酸取代的上述序列之一。在其他方面，所述延伸包含至少一个带电荷的氨基酸，例如，所述延伸包含氨基酸序列X1-X2，其中X1为带电荷的氨基酸(例如带正电荷的氨基酸(例如Arg))，X2为小的脂肪族氨基酸。在一些方面，所述延伸包含Arg-Gly。
在示例性方面，所述酰基化氨基酸或烷基化氨基酸包含通式I(任选地为Lys)、通式II(任选地为Cys)或通式III(任选地为Ser)的结构。任选地，在一些方面，所述酰基化氨基酸或烷基化氨基酸包含通式I的结构，例如Lys。
在一些实施方案中，所述酰基化或烷基化氨基酸为包含侧链氨基的芳香族氨基酸。在示例性方面，包含侧链氨基的芳香族氨基酸为4-氨基苯丙氨酸(4-氨基Phe)、对氨基苯甘氨酸、对氨基同型苯丙氨酸或3-氨基酪氨酸。在示例性方面，包含侧链氨基的芳香族氨基酸为4-氨基苯丙氨酸。在示例性方面，所述酰基化或烷基化氨基酸为通式II的氨基酸，其中n为2(同型丝氨酸)。在示例性方面，所述酰基化或烷基化氨基酸为Thr或同型苏氨酸。在示例性实施方案中，所述酰基化或烷基化氨基酸为包含侧链羟基的芳香族氨基酸，包括但不限于酪氨酸、同型酪氨酸、甲基酪氨酸或3-氨基酪氨酸。
在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含共价连接至Cx-琥珀酰基(Cx-succinoyl)的氨基酸，其中x为10至26的整数，任选地，12至18。在示例性方面，所述Cx-琥珀酰基通过间隔物连接至所述肽或胰高血糖素类似物。所述间隔物可为本文所述的任一间隔物。
在一些方面，所述酰基化氨基酸或烷基化氨基酸是通过间隔物连接至所述酰基或烷基。在一些方面，所述间隔物长度为3至10个原子。在一些方面，所述间隔物为氨基酸或二肽，且在一些方面，所述间隔物包含一个或二个酸性氨基酸残基，例如Glu。在一些方面，所述酰基或烷基通过间隔物连接至所述氨基酸，其中所述间隔物和所述酰基的总长度为约14至约28个原子。在一些方面，所述间隔物包含Cys。在一些方面，所述间隔物包含一个或二个γ-Glu。在一些方面，所述间隔物包含Lys。在一些方面，所述间隔物包含Cys、γ-Glu以及Lys中二个的组合，或二个γ-Glu残基。
在具体的方面，所述间隔物为Cys残基，其共价连接至烷基，例如非官能化的或官能化的碳链。在示例性方面，所述Cys残基被S-棕榈基(S-palmityl)烷基化(即S-棕榈酸烷基化)，任选地，其中所述Cys残基连接至作为肽主链的一部分的Lys残基。在其他实施方案中，所述间隔物为包含Cys残基的二肽，Cys残基共价连接至烷基。在示例性方面，所述Cys被S-棕榈基烷基化，且所述Cys连接至间隔物的另一氨基酸，另一氨基酸连接至例如作为肽主链的一部分的Lys残基。
在示例性方面，间隔物包含小的聚乙二醇部分(PEG)，其包含结构[-O-CH2-CH2-]n，其中n为2至16的整数(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16)。
关于所述酰基化氨基酸，在一些方面，所述酰基为C12至C18(例如，C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18)脂肪酰基。在一些方面，所述酰基为C14或C16脂肪酰基。在其他方面，所述酰基为琥珀酸或琥珀酸衍生物(例如通式V、VI或VII的琥珀酸衍生物)。在其他方面，所述酰基为马来酸或马来酸衍生物(例如，通式VIII、IX或X的马来酸衍生物)。
关于所述烷基化氨基酸，在一些方面，所述非天然烷基为结构为-Cx-COOH的羧基官能化的碳链，其中x为整数，任选地为4-30的整数(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)。
在示例性方面，所述肽或胰高血糖素类似物包含二个或更多个酰基或烷基。在这方面，所述肽或胰高血糖素类似物可为双酰基化或双重酰基化的肽。所述二个或更多个酰基或烷基可为线性形式，任选地中间插入间隔物。所述二个或更多个酰基或烷基可为分支形式，如本文所述。在示例性方面，所述二个酰基或烷基连接至Lys间隔物残基。
在本申请的一些方面，胰高血糖素类似物在第27位氨基酸的C端包含至少一个带电荷的氨基酸。例如，在一些方面，所述胰高血糖素类似物在第28位包含带电荷的氨基酸(例如，带负电荷的氨基酸)。在一些方面，所述带负电荷的氨基酸为Asp。在其他方面，第28位的氨基酸为带正电荷的氨基酸，例如，通式I的带正电荷氨基酸，例如Lys。
在可选的或另外的方面，所述胰高血糖素类似物在第27位、第29位或第27和29位包含氨基酸修饰。例如，在一些方面，第27位的氨基酸为Leu、Nle、Val或Lys，和/或在一些方面，第29位的氨基酸为Gly或Thr。
本文所述的胰高血糖素类似物可包含相对于SEQ ID NO:1的另外的氨基酸修饰，例如至多十个(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)另外的氨基酸修饰，如本文进一步所描述。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含下述一个或多个：
a)DPP-IV保护性氨基酸，其位于所述肽类似物第1位;
b)位于第3位的酸性氨基酸，任选地为Glu;
c)位于第7位的Ile;
d)位于第12位的Ile或Arg;
e)位于第15位的酸性氨基酸，任选地为Glu;
f)位于第18位的脂肪族氨基酸，任选地为Ala;
g)位于第21位的酸性氨基酸，任选地为Glu;
h)位于第24位的Asn、Ala或AIB;
i)位于第27位的脂肪族氨基酸，任选地为Ala、Leu或Nle;
j)位于第28位的酸性氨基酸(任选地为Glu)或脂肪族氨基酸(任选地为Ala);
k)位于第29位的脂肪族氨基酸，任选地为Ala;
l)位于C端的酰胺化修饰。
按照上述内容，在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQID NO:27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89以及90中任意的氨基酸序列，或SEQ ID NO:94-100、102-112、120-124、127-131中任意的氨基酸序列。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ IDNO:94-100、102-112、120-124、127-131中的任意序列或由SEQ ID NO:94-100、102-112、120-124、127-131中的任意序列组成。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ ID NO:28、29、31、37-41、43-46、76-80、83-87、89以及90中的任意序列或由SEQ ID NO:28、29、31、37-41、43-46、76-80、83-87、89以及90中的任意序列组成。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ ID NO:28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212以及230中的任意序列或由SEQ ID NO:28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212以及230中的任意序列组成。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ ID NO:27或由SEQ ID NO:27所组成。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ ID NO:30或由SEQID NO:30所组成。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ IDNO:32或由SEQ ID NO:32所组成。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ ID NO:33或由SEQ ID NO:33所组成。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ ID NO:35或由SEQ ID NO:35所组成。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ ID NO:36或由SEQ ID NO:36所组成。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ ID NO:28或由SEQ ID NO:28所组成。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ ID NO:37或由SEQ ID NO:37所组成。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ ID NO:89或由SEQID NO:89所组成。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ IDNO:31或由SEQ ID NO:31所组成。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ ID NO:180或由SEQ ID NO:180所组成。
本发明还提供肽，其包含SEQ ID NO:28的序列。在示例性方面，所述肽是由SEQ ID NO:28所组成。
本发明还提供肽，其包含SEQ ID NO:31的序列。在示例性方面，所述肽是由SEQ ID NO:31所组成。
本发明还提供肽，其包含SEQ ID NO:37的序列。在示例性方面，所述肽由SEQ ID NO:37组成。
本发明还提供肽，其包含SEQ ID NO:89的序列。在示例性方面，所述肽由SEQ ID NO:89组成。
本发明还提供肽，其包含SEQ ID NO:95的序列。在示例性方面，所述肽由SEQ ID NO:95组成。
本发明还提供肽，其包含SEQ ID NO:130的序列。在示例性方面，所述肽由SEQ ID NO:130组成。
此外，本文还提供肽，其包含SEQ ID NO:31的序列。在示例性方面，所述肽由SEQ ID NO:171组成。
本发明还提供肽，其包含SEQ ID NO:180的序列。在示例性方面，所述肽由SEQ ID NO:180组成。
本发明提供肽，其包含SEQ ID NO:184的序列，
HX2X3GTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29GPSSGX35PPPS(SEQ ID NO:184)
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或Gln类似物；
X10为Tyr或与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸；
X16为任何氨基酸，任选地为除Gly、Pro与Ser以外的任何氨基酸；
X18为Arg或Ala；
X20为带负电荷的氨基酸或电中性的氨基酸，任选地为AIB或Gln；
X21为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu；
X27为Leu、Ala、Nle或Met；
X28为Ala或酸性氨基酸(任选地为Asp或Glu)；
X29为Ala或Gly；
X35为Ala或碱性氨基酸(任选地为Arg或Lys)；
其中，当X28为酸性氨基酸时，X35为碱性氨基酸；
其中，当X10为Tyr时，所述肽在第40位包含与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸，其中，任选地，所述肽在第41位包含Gly，并且
其中所述肽的C端氨基酸为酰胺化的氨基酸。
在示例性方面，SEQ ID NO:184的X10为Tyr，所述肽在第40位包含共价连接至C12至C18的酰基或烷基的氨基酸，所述肽任选地在第41位包含Gly。在示例性方面，SEQ ID NO:184的X10为共价连接至C12至C18的酰基或烷基的氨基酸。
在示例性方面，SEQ ID NO:184的X20为Gln，任选地，第16位的氨基酸为带负电荷的氨基酸(例如Glu)。在示例性方面，SEQ IDNO:184的X18为Ala，且所述肽包含E16、R17、A18、A19以及Q20。
在其他示例性方面，SEQ ID NO:184的X20为AIB。任选地，SEQID NO:184的X16为AIB以外的任何氨基酸。
另外，在示例性方面，(i)SEQ ID NO:184的X28为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu，且SEQ ID NO:184的X35为碱性氨基酸，任选地为Arg或Lys；(ii)SEQ ID NO:184的X27、X28以及X29中仅有一个为Ala；(iii)所述肽在C端包含酰胺化的Gly。
本发明还提供肽，其包含具有相对于SEQ ID NO:184的至多3个氨基酸修饰(例如保守型取代)的SEQ ID NO:184的序列，其中所述类似物在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体均表现出激动剂活性。在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体中每一个的活性(例如，EC50)相互相差100倍以内(例如50倍以内、25倍以内、10倍以内)。
本发明还提供肽，其包含SEQ ID NO:185的序列
HX2QGTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:185)
其中：
X2为AIB；
X10为Tyr或与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸；
X16为Glu、α,α-双取代的氨基酸或Lys；
X18为Arg或Ala；
X20为AIB或Gln；
X21为Asp或Glu；
X27为Leu、Nle或Met；
X28为Ala、Asp或Glu；
X29为Thr的Gly；
并且，
其中，当X10为Tyr时，所述肽在第40位包含与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸，其中，任选地，所述肽在第41位包含Gly，并且
其中所述肽的C端氨基酸为酰胺化的氨基酸。
本发明还提供肽，其包含具有相对于SEQ ID NO:185的至多3个氨基酸修饰(例如保守型取代)的SEQ ID NO:185的序列，其中所述类似物在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体均表现出激动剂活性。在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体中每一个的活性(例如，EC50)相互相差100倍以内(例如50倍以内、25倍以内、10倍以内)。
本发明还提供肽，其包含SEQ ID NO:196的序列，
HX2X3GTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29GPSSGX35PPPS(SEQ ID NO:196)
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或Gln类似物或能降低胰高血糖素活性的氨基酸(任选地为Glu)；
X10为Tyr或与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸；
X16为任何氨基酸，任选地为除Gly、Pro以及Ser以外的任何氨基酸；
X18为Arg或Ala；
X20为带负电荷的氨基酸或电中性的氨基酸，任选地为AIB或Gln；
X21为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu；
X27为Leu、Ala、Nle或Met；
X28为Ala或酸性氨基酸(任选地为Asp或Glu)；
X29为Ala或Gly；
X35为Ala或碱性氨基酸(任选地为Arg或Lys)；
其中，当X28为酸性氨基酸时，X35为碱性氨基酸；
其中，当X10为Tyr时，所述肽在第40位包含与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸，其中，任选地，所述肽在第41位包含Gly，且
其中所述肽的C端氨基酸为酰胺化的氨基酸。
能降低胰高血糖素活性的其他氨基酸如本文所述。参见标题为“第3位”的章节。在示例性方面，X3为酸性、碱性或疏水性氨基酸(例如，谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸)。在示例性方面，X3为Glu。
本申请还提供肽，其包含SEQ ID NO:186的序列：
HX2X3GTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29(SEQ ID NO:186)
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或Gln类似物；
X10为Tyr或与C10至C26酰基或烷基共价连接的氨基酸；
X16为任何氨基酸，任选地为Gly、Pro以及Ser以外的任何氨基酸；
X18为Arg或Ala；
X20为带负电荷的氨基酸或电中性的氨基酸，任选地为AIB或Gln；
X21为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu；
X27为Leu、Ala、Nle或Met；
X28为Ala或酸性氨基酸(任选地为Asp或Glu)；
X29为Ala、Gly或Thr；并且
其中所述肽包含任选地位于第10位的与C10至C26酰基或烷基共价连接的氨基酸，所述肽的C端氨基酸为酰胺化的氨基酸。
在示例性方面，SEQ ID NO:186的X20为AIB。在示例性方面，X29为Thr，所述肽不包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:5)。在一些方面，SEQ ID NO:186的X20为AIB，X16为AIB以外的氨基酸。
在示例性方面，X20为Gln。在一些方面，X16为带负电荷的氨基酸，任选地为Glu。在示例性方面，X18为Ala，且任选地，所述肽包含E16、R17、A18、A19以及Q20。
在一些方面，SEQ ID NO:186的肽包含位于第29位氨基酸的C端的1至21个氨基酸的延伸，且任选地所述第29位的氨基酸为Gly。在示例性方面，所述延伸包含氨基酸序列GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:5)或其保守型取代的序列；或其中所述延伸包含序列X1-X2，其中X1为带电荷的氨基酸，X2为小的脂肪族氨基酸，任选地，其中X1为带正电荷的氨基酸。在一些方面，所述带正电荷的氨基酸为Arg，且任选地，所述肽包含Arg-Gly或由Arg-Gly组成。在具体方面，所述延伸包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列，随后为Lys或Lys-Gly，其中所述Lys共价连接至C10至C26酰基。
在示例性方面，所述肽包含SEQ ID NO:186，其中X2为AIB、X3为Gln、X10为与C10至C26酰基或烷基共价连接的氨基酸、X18为Arg或Ala、X20为AIB或Gln、X21为Asp或Glu、X29为Gly、C端氨基酸为酰胺化的氨基酸，其中第29位的Gly与GPSSGAPPPS融合，GPSSGAPPPS之后为Lys或Lys-Gly，其中所述Lys共价连接至C10-C26酰基。
本发明还提供肽，其包含具有相对于SEQ ID NO:186的至多3个氨基酸修饰(例如保守型取代)的SEQ ID NO:186的序列，其中所述类似物在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体均表现出激动剂活性。在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体中每一个的活性(例如，EC50)相互相差100倍以内(例如50倍以内、25倍以内、10倍以内)。
本发明提供肽包含SEQ ID NO:187的序列：
HX2QGTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29(SEQID NO:187)
其中：
X2为AIB；
X10为Tyr或与C10至C26酰基或烷基共价连接的氨基酸；
X16为Glu、α,α-双取代的氨基酸或Lys；
X18为Arg或Ala；
X20为带负电荷的氨基酸或电中性的氨基酸，任选地为AIB或Gln；
X21为Asp或Glu；
X27为Leu、Ala、Nle或Met；
X28为Ala、Asp或Glu；
X29为Gly或Thr；以及
其中所述肽包含任选地位于第10位的与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸，所述肽的C端氨基酸为酰肽化的氨基酸。
本发明还提供肽，其包含具有相对于SEQ ID NO:187的至多3个氨基酸修饰(例如保守型取代)的SEQ ID NO:187的序列，其中所述类似物在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体均表现出激动剂活性。在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体中每一个的活性(例如，EC50)相互相差100倍以内(例如50倍以内、25倍以内、10倍以内)。
本发明提供肽，其包含SEQ ID NO:198的序列：
HX2X3GTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29(SEQ ID NO:198)
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或Gln类似物或能降低胰高血糖素活性的氨基酸(例如，Glu)；
X10为Tyr或与C10至C26酰基或烷基共价连接的氨基酸；
X16为任何氨基酸，任选地为Gly、Pro以及Ser以外的任何氨基酸；
X18为Arg或Ala；
X20为带负电荷的氨基酸或电中性的氨基酸，任选地为AIB或Gln；
X21为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu；
X27为Leu、Ala、Nle或Met；
X28为Ala或酸性氨基酸(任选地为Asp或Glu)；
X29为Ala、Gly或Thr；且
其中所述肽包含任选地位于第10位的与C10至C26酰基或烷基共价连接的氨基酸，所述肽的C端氨基酸为酰胺化的氨基酸。
能降低胰高血糖素活性的其他氨基酸如本文所述。参见标题为“第3位”的章节。在示例性方面，X3为酸性、碱性或疏水性氨基酸(例如，谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸)。在示例性方面，X3为Glu。
本发明提供肽，其包含SEQ ID NO:184的序列。本发明提供肽，其包含SEQ ID NO:185的序列。本发明提供肽，其包含SEQ ID NO:196的序列。本发明提供肽，其包含SEQ ID NO:186的序列。本发明提供肽包含SEQ ID NO:187的序列。本发明提供肽，其包含SEQ IDNO:198的序列。
本文还提供具有GIP激动剂活性的胰高血糖素(SEQ ID NO:1)类似物，其包含：
(a)包含咪唑侧链的氨基酸，其位于第1位；
(b)通式IV的氨基酸，其位于第16位：
其中n为1至7，其中R1以及R2独立地选自：H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7以及(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，其中，任选地，所述通式IV的氨基酸得侧链包含自由的氨基；
(c)α,α-双取代氨基酸，其位于第20位；
(d)至多十个相对于SEQ ID NO:1的另外的氨基酸修饰；
其中，当所述类似物缺乏亲水性部分时，所述胰高血糖素类似物在GIP受体表现出至少0.1%的天然GIP活性，其中所述胰高血糖素类似物对于人GLP-1受体相对于GIP受体的选择性低于100倍。
在示例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素(SEQ IDNO:1)类似物包含以下中的一个或多个：
(a)包含咪唑侧链的氨基酸，其位于第1位；
(b)通式IV的氨基酸，其位于第16位：
Figure BDA0000369878840000921
其中n为1至7，其中R1以及R2独立地选自：H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7以及(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，其中，任选地，所述通式IV的氨基酸的侧链包含自由的氨基；
(c)α,α-双取代氨基酸，其位于第20位；
(d)至多十个相对于SEQ ID NO:1的另外的氨基酸修饰；
其中，当所述类似物缺乏异源部分(例如，亲水性部分(例如，PEG))时，所述胰高血糖素类似物在GIP受体表现出至少或约0.1%(例如，至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约80%、至少或约100%、至少或约500%)的天然GIP活性。在示例性方面，所述肽在GIP受体的EC50与其在GLP-1受体的EC50相差低于100倍(例如，低于或约90倍、低于或约80倍、低于或约70倍、低于或约60倍、低于或约50倍、低于或约40倍、低于或约30倍、低于或约20倍、低于或约15倍、低于或约10倍、低于或约5倍)，任选地，与其在胰高血糖素受体的EC50相差低于100倍(例如，低于或约90倍、低于或约80倍、低于或约70倍、低于或约60倍、低于或约50倍、低于或约40倍、低于或约30倍、低于或约20倍、低于或约15倍、低于或约10倍、低于或约5倍)。
在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物在第1位包含包含通式A的结构的氨基酸：
Figure BDA0000369878840000931
其中R1以及R2独立地选自：H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F以及至少一个H被F所取代的(C1-C6)烷基。
在示例性方面，位于第1位的氨基酸为胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的天然残基L-组氨酸(His)，或His衍生物，例如D-组氨酸、脱氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰组氨酸、同型组氨酸、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸或α,α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。
在示例性方面，所述胰高血糖素类似物在第16位包含通式IV的氨基酸，在(b)中为同型赖氨酸、Lys、Orn或2,4-二氨基丁酸(Dab)。
在示例性方面，第20位的氨基酸(例如所述α,α-双取代氨基酸)包含R1和R2，R1和R2均与α碳键合，其中R1以及R2独立地选自任选地用羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1与R2与它们所连接的α碳形成环。在示例性方面，位于第20位的α,α-双取代氨基酸为AIB。在其他示例性方面，所述第20位的α,α-双取代氨基酸为ACPC。
在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含至多十个相对于SEQID NO:1的另外的修饰。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物在第2、12、17、18、21、24、27、28以及29位中的一个或多个位置包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸取代。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含下列的一个或多个：
i.位于第2位的DPP-IV保护性氨基酸，任选地为AIB或D-Ser；
ii.位于第12位的大的、脂肪族、非极性氨基酸，任选地为Ile；
iii.位于第17位的Arg以外的氨基酸，任选地为Gln；
iv位于第18位的小的、脂肪族的氨基酸，任选地为Ala；
v.位于第21位的Asp以外的氨基酸，任选地为Glu；
vi.位于第24位的Gln以外的氨基酸，任选地为Asn或Ala；
vii.位于第27位的Met以外的氨基酸，任选地为Leu；
viii.位于第28位的Asn以外的氨基酸，任选地为Ala；
ix.位于第29位的Thr以外的氨基酸，任选地为Gly；以及
x.位于第29位氨基酸的C端的1至21个氨基酸的延伸。
在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含GPSSGAPPPS或GPSSGAPPPSC的延伸。
在示例性方面，所述胰高血糖素类似物在第1位包含位于His、在第16位包含Lys，在第20位包含AIB，而在第17-18位不包含Gln-Ala。
在其他示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含SEQ IDNO:48、52、53以及74中任意的氨基酸序列。该胰高血糖素类似物与SEQ ID NO:27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89以及90的序列结构相似，但前述的胰高血糖素类似物(SEQ ID NO:48、52、53以及74)并不包含酰基化氨基酸或烷基化氨基酸。
在其他示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含SEQ IDNO:50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88以及92中任意的氨基酸序列；或SEQ ID NO:114-119、125、126以及133中任意的氨基酸序列；或SEQ ID NO:139-144、150-153、208、210以及211中任意的氨基酸序列。该胰高血糖素类似物在第1位包含大的、芳香族氨基酸，例如Tyr。
在一些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含SEQ ID NO:27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、90、94-100、102-112、120-124以及127-131中任意的氨基酸序列，或SEQ ID NO:48、52、53以及74中任意的氨基酸序列，或SEQ ID NO:50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、92、114-119、125、126以及133中任意的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含SEQID NO:28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212以及230中任意的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含基于母体序列的结构，但在一个或多个位置与所述母体序列不同，所述母体序列包含SEQ IDNO:27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、90、94-100、102-112、120-124以及127-131中任意的序列；或SEQ ID NO:48、52、53以及74中任意的序列；或SEQ ID NO:50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、92、114-119、125、126以及133中任意的序列，或SEQ ID NO:28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212以及230中任意的序列。
在一些或任何实施方案中，本申请的肽为母体序列的类似物，所述母体序列包含SEQ ID NO:27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、90、94-100、102-112、120-124以及127-131中任意的序列，或SEQ IDNO:48、52、53以及74中任意的序列，或SEQ ID NO:50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、92、114-119、125、126以及133中任意的序列，或SEQ ID NO:28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212以及230中任意的序列，本申请的肽包含基于上述母体序列的氨基酸序列的氨基酸序列，但与所述母体序列不同之处在于所述类似物的氨基酸序列包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、1011、12、13、14、15以及在一些情况下为16或更多个(例如，17、18、19、20、21、22、23、24、25等)指定的或任选的氨基酸修饰。在一些或任何实施方案中，本申请的肽包含总数为1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9或至多10个相对于母体序列的另外氨基酸修饰，所述母体序列包含SEQ ID NO:27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、90、94-100、102-112、120-124以及127-131中任意的序列，或SEQ ID NO:48、52、53以及74中任意的序列，或SEQ ID NO:50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、92、114-119、125、126以及133中任意的序列，或SEQ ID NO:28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212以及230中任意的序列。在一些或任何实施方案中，所述修饰为本文关于胰高血糖素类似物描述的任何修饰，例如，酰基化、烷基化、聚乙二醇化、C端截短、第1、2、3、7、10、12、15、16、17、18、19、20、21、23、24、27、28以及29位中的一个或多个位置的氨基酸取代。
在一些或任何实施方案中，所述修饰为氨基酸取代或替换，例如保守型氨基酸取代。在一些方面，所述保守型取代为替换第2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29位中一个或多个位置的氨基酸。在其他实施方案中，所述氨基酸取代不为保守型氨基酸取代，例如非保守型氨基酸取代。
在一些实施方案中，本申请的肽包含与母体序列的氨基酸序列具有至少25%序列同一性的氨基酸序列，所述母体序列包含SEQ ID NO:27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、90、94-100、102-112、120-124以及127-131中任意的序列，或SEQ ID NO:48、52、53以及74中任意的序列，或SEQ ID NO:50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、92、114-119、125、126以及133中任意的序列，或SEQ ID NO:28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212以及230中任意的序列。在一些实施方案中，本申请的肽包含与所述母体序列具有至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或大于90%的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的具有上述序列同一性百分比的肽的氨基酸序列为本申请的肽的全长氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的具有上述序列同一性百分比的肽的氨基酸序列为本申请的肽的部分氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的肽包含与母氨基酸序列中至少5个(例如，至少6、至少7、至少8、至少9、至少10个氨基酸)连续氨基酸的参考氨基酸序列具有约A%或更高的序列同一性的氨基酸序列，其中所述参考氨基酸序列自SEQ ID NO:1位置C的氨基酸开始，并结束于SEQ ID NO:1位置D的氨基酸，其中A为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99；C为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，D为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29。还考虑到上述参数的任何以及所有可能的组合，包括但不限于，例如，其中A为90%，C与D为1与27，或6与27，或8与27，或10与27，或12与27，或16与27。
本文所述包含SEQ ID NO:27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89以及90中任意的序列，或SEQ ID NO:48、52、53以及74中任意的序列，或SEQ ID NO:50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88以及92中任意的序列，或SEQ ID NO:28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212以及230中任意的序列的母体序列的类似物可包含任何氨基酸数目的肽主链，即可为任何长度的肽。在一些实施方案中，本文所述的肽与SEQ ID NO:1的长度相同，即长度为29个氨基酸。在一些实施方案中，本申请的肽的长度大于29个氨基酸，例如，本申请的肽包含1-21个氨基酸C端延伸，如说明书中进一步所描述。因此，在一些实施方案中，本申请的肽的长度为30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一些实施方案中，本申请的肽的长度至多为50个氨基酸。在一些实施方案中，由于与另一肽融合，本申请的肽的长度大于29个氨基酸(例如，大于50个氨基酸，例如，长度为至少或约60、至少或约70、至少或约80、至少或约90、至少或约100、至少或约150、至少或约200、至少或约250、至少或约300、至少或约350、至少或约400、至少或约450、至少或约500个氨基酸)。在其他实施方案中，本申请的肽的长度小于29个氨基酸，例如28、27、26、25、24、23个氨基酸。
按照上述内容，在一些方面，本申请的肽为母体序列的类似物，所述母体序列包含SEQ ID NO:27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、90、94-100、102-112、120-124以及127-131中任意的序列，或SEQ ID NO:48、52、53以及74中任意的序列，或SEQ ID NO:50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、92、114-119、125、126以及133中任意的序列，或SEQ ID NO:28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212以及230中任意的序列，所述类似物的序列包含一个或多个氨基酸修饰，这些修饰会影响GIP活性、胰高血糖素活性和/或GLP-1活性，增加稳定性(例如，通过降低所述肽的降解(例如，通过提高对DPP-IV蛋白酶的抗性))，增加溶解度，增加半衰期，延迟作用开始的时间，延长在GIP、胰高血糖素或GLP-1受体作用的持续时间，或以上的任意组合。关于胰高血糖素类似物的这些氨基酸修饰以及其他修饰在本文进一步描述，并且任何这些修饰都可单独存在或组合存在。
制备肽的方法
可通过本技术领域所公知的方法获得本申请的胰高血糖素类似物。重新合成肽的合适方法于下列文献中已有描述，例如，Chan etal.,Fmoc Solid Phase peptide Synthesis,Oxford UniversityPress,Oxford,United Kingdom,2005；Peptide and Protein DrugAnalysis,ed. Reid,R.,Marcel Dekker,Inc.,2000；Epitope Mapping,ed.Westwood et al.,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2000；以及美国专利5,449,752。制备本申请的肽的其它示例性方法于实施例1中有所描述。
在一些实施方案中，本文所述的肽由公司商业合成，例如Synpep(Dublin,CA)、Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg,MD)以及Multiple Peptide Systems (San Diego,CA)。在此方面，所述肽可为合成的、重组的、分离的和/或纯化的。
另外，在本申请的类似物不包含任何非编码或非天然的氨基酸的情况下，可通过标准的重组方法，利用能编码所述类似物的氨基酸序列的核酸重组产生所述胰高血糖素类似物。参见，如Sambrook etal.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual. 3rd ed.,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,NY 2001；以及Ausubel et al.,Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing Associates与John Wiley &Sons,NY,1994。
在一些实施方案中，本申请的胰高血糖素类似物为分离的。本文所使用的术语“分离的”表示已脱离其天然环境。在示例性实施方案中，所述类似物是通过重组方法制备的，并所述类似物从宿主细胞中分离出来。
在一些实施方案中，本申请的胰高血糖素类似物经纯化的。本文所使用的术语“纯化”是指分离基本上不含污染物的形式的分子或化合物，在一些方面，所述污染物在天然或自然环境中通常与所述分子或化合物相联，术语“纯化”表示因与原始组合物中的其他组分分离而纯度提升。所述纯化的肽或化合物包含例如基本上不含核酸分子、脂质以及碳水化合物或在肽的化学合成时所使用或形成的其他起始材料或中间产物的肽。“纯度”被认为是相对的术语，且不必要被解读为绝对纯度或绝对富集或是绝对选择。在一些方面，纯度为至少或约50%、至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%或至少或约90%(例如至少或约91%、至少或约92%、至少或约93%、至少或约94%、至少或约95%、至少或约96%、至少或约97%、至少或约98%、至少或约99%或约100%)。
缀合物
本发明还提供缀合物，其包含与异源部分缀合的一个或多个本文所述的胰高血糖素类似物。如本文所使用，术语“异源部分”与“缀合部分”为同义，且表示与本文所述的胰高血糖素类似物不同的任何分子(化学的或生物化学的，天然存在的或非编码的)。可连接本文所述的任何类似物的示例性的缀合部分包括但不限于异源肽或多肽(包括例如血浆蛋白)、靶向剂、免疫球蛋白或其部分(例如，可变区、CDR或Fc区)、诊断标签(诸如放射性同位素、荧光团或酶标签)、包括水聚合物在内的聚合物或其他治疗剂或诊断剂。在一些实施方案中，提供包含本发明的类似物和血浆蛋白的缀合物，其中所述血浆蛋白选自白蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原及球蛋白。在一些实施方案中，缀合物的血浆蛋白部分为白蛋白或转铁蛋白。在一些实施方案中，所述缀合物包含一个或多个本文所述的胰高血糖素类似物以及下述中的一个或多个：肽(其与本文所述的胰高血糖素和/或GLP-1受体活性胰高血糖素类似物不同)、多肽、核酸分子、抗体或其片段、聚合物、量子点、小分子、毒素、诊断剂、碳水化合物、氨基酸。
在一些实施方案中，所述异源部分为与本文所述的胰高血糖素类似物不同的肽，所述缀合物为融合肽或嵌合肽。在一些实施方案中，所述异源部分为1-21个氨基酸的肽延伸。在具体实施方案中，所述延伸连接至所述胰高血糖素类似物的C端，例如连接至第29位的氨基酸。
在一些具体方面，所述延伸为单氨基酸或二肽。在具体实施方案中，所述延伸包含选自以下的氨基酸：带电荷的氨基酸(例如，带负电荷的氨基酸(如Glu)、带正电荷的氨基酸)、包含亲水性部分的氨基酸。在一些方面，所述延伸为Gly、Glu、Cys、Gly-Gly、Gly-Glu。
在一些实施方案中，所述延伸包含SEQ ID NO:5(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO:6(GGPSSGAPPPS)、SEQ ID NO:7(KRNRNNIA)或SEQID NO:8(KRNR)的氨基酸序列。在具体方面，所述氨基酸序列是通过所述胰高血糖素类似物的C端氨基酸(如位于第29位的氨基酸)连接的。在一些实施方案中，SEQ ID NO:5-8中的任意氨基酸序列是通过肽键与胰高血糖素类似物的氨基酸29结合的。在一些具体实施方案中，所述胰高血糖素类似物的第29位氨基酸为Gly，且所述Gly与SEQID NO:5-8中的一个氨基酸序列融合。
在一些实施方案中，所述异源部分为聚合物。在一些实施方案中，所述聚合物选自：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯或其衍生物(包括聚烯烃二醇、聚烯烃氧化物、聚烯烃对酞酸酯)、丙烯酸或甲基丙基酸酯(包括：聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸十二酯)、聚(甲基苯丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(异丙基丙烯酸酯)、聚(异丁基丙烯酸酯)，及聚(丙烯酸十八酯))、聚乙烯化合物(包括聚乙烯醇、聚乙烯酯、聚乙烯醚、聚乙烯卤化物、聚(乙酸乙烯)和聚乙烯氢吡咯酮)、葡聚糖苷、聚硅氧烷、聚胺甲酸酯及其共聚物，纤维素(包括烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素酯、纤维素醚、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲纤维素、羟丁基甲纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素羧乙基纤维素、三醋酸纤维素和磺酸纤维素钠)、聚丙烯、聚乙烯(包括聚(乙二醇)、聚(环氧乙烯)，聚(对苯二甲酸乙二酯)及聚苯乙烯)。
在一些方面，所述聚合物为生物可降解的聚合物，包括合成的生物可降解的聚合物(例如乳酸及乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚(正)酯、聚胺甲酸酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)，以及聚(乳酸-己内酯共聚物)，以及自然的生物可降解的聚合物(例如藻酸盐及其他多糖类，包括葡聚糖、纤维素、胶原蛋白，以上的化学衍生物(化学基团(例如烷基、烯基)的取代、添加、氢氧化、氧化，及本领域技术人员公知的其他修饰)，白蛋白及其他亲水性蛋白(例如玉蜀黍及其他醇溶蛋白以及疏水性蛋白质))，及以上的任何共聚物或混合物。通常，此类材料可经由酶促水解或经由体内水暴露(通过表面或整体侵蚀)而降解。
在一些方面，所述聚合物为生物粘附性聚合物，例如于H.S.Sawhney,C.P.Pathak and J.A.Hubbell in Macromolecules,1993,26,581-587(通过引用将其并入本文)所述的可生物腐蚀的水凝胶、聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白(glutin)、聚酸酐、聚丙烯酸、藻酸盐、几丁质、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸十二酯)、聚(甲基苯丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(异丙基丙烯酸酯)、聚(异丁基丙烯酸酯)及聚(丙烯酸十八酯)。
在一些实施方案中，所述聚合物为水溶性或亲水性聚合物。亲水性聚合物于“亲水性部分”章节中有进一步的描述。合适的水溶性聚合物是本领域中已知的，包括，例如聚乙烯吡咯酮、羟丙基纤维素(HPC;Klucel)、羟丙基甲基纤维素(HPMC;Methocel)、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、羟丙基乙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素(Ethocel)、羟乙基纤维素，各种烷基纤维素、羟烷基纤维素，各种酯纤维素、羧基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、醋酸乙烯/巴豆酸共聚物，聚羟烷甲基丙烯酸、羟甲基甲基丙烯酸、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、马来酸酐/甲基乙烯酯共聚物、聚烯醇、聚丙烯酸钠盐及钙盐、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、羧酸聚甲烷、羧酸烯聚合物、聚氧乙烯、聚氧丙烯共聚物、甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物、羧甲基酰胺、甲基丙烯酯钾盐-二烯苯共聚物、聚氧乙烯乙二醇、聚环氧乙烷，及以上的衍生物、盐和组合。
在具体实施方案中，所述聚合物为聚烯烃二醇，包括，例如聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，所述异源部分为碳水化合物。在一些实施方案中，所述碳水化合物为单糖(例如：葡萄糖、半乳糖、果糖)、双糖(例如：蔗糖、乳糖、麦芽糖)，寡糖(例如棉子糖、水苏糖)或多糖(例如淀粉、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、几丁质、胼胝质，海带聚糖，木聚糖，甘露聚糖，岩藻聚糖，半乳糖甘露聚糖)。
在一些实施方案中，所述异源部分为脂质。在一些实施方案中，所述脂质为脂肪酸(二十碳酸、前列腺素、白三烯素、凝血脂素、N-酰基胆胺)、甘油脂(例如：单、双、三取代甘油)，甘油磷脂(如磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)，神经鞘脂质(例如：神经胺醇、脑酰胺)，固醇类(例如：类固醇、胆固醇)，戊烯醇，糖脂质，聚酮化合物。油、腊质、胆固醇、固醇、脂溶性维生素、单酸甘油、二酸甘油、三酸甘油、磷脂质。
在一些实施方案中，所述异源部分通过非共价或共价键连接至本申请的类似物。在示例性方面，所述异源部分通过连接物连接至本申请的类似物。可通过共价化学键、物理力(诸如静电、氢、离子、范德华力，或疏水性或亲水性交互作用)而实现连接。可使用各种非共价偶联体系，包括生物素-抗生物素蛋白(biotin-avidin)、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞粘附分子伴侣，或对于彼此具有亲和力的任何结合伴侣或其片段。
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物是通过直接共价连接与缀合部分连接的，所述直接共价连接是通过所述类似物的目标氨基酸残基与有机衍生剂反应，所述有机衍生剂能与这些目标氨基酸的选定侧链或N端或C端残基反应。所述类似物或缀合部分的反应基团包括，例如，醛基、氨基、酯基、巯基、α-卤素乙酰基、马来酰亚氨基或肼基。衍生剂包括，例如，马来酰亚胺苯甲酰硫化琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基缀合)，戊二醛，琥珀酸酐，或本领域已知的其他试剂。或者，缀合部分可通过中间载体间接地连接于所述类似物，所述中间载体例如多糖或多肽载体。多糖载体的实例包括氨基葡聚糖(aminodextran)。多肽载体的实例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、及其共聚物，以及前述氨基酸或其他氨基酸(例如丝氨酸)的混合聚合物，从而为得到的加载载体提供良好的溶解度性质。
半胱胺酰基残基通常与α-乙酸卤素(及相应的胺类)进行反应，例如氯乙酸或氯乙酰胺，以产生羧甲基或羧基酰胺甲基衍生物。半胱胺酰基残基还通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸，氯乙酰磷酸酯，N-烷基马来酰亚胺，二硫化3-硝基-2-吡啶，二硫化甲基2-吡啶，对氯汞苯甲酸，2-氯汞4-硝基苯酚，或氯-7-硝基苯-2-氧-1,3-二唑反应而衍生。
组胺酰基残基通过在pH5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应而衍生，因为该试剂对于组胺酰基侧链的相对特异性的。对溴苯酰甲基溴也可用；此反应的优选条件是在0.1M的二甲砷酸钠、pH6.0下进行。
赖氨酰基及氨基端残基与琥珀酸及其他羧酸酐进行反应。利用这些试剂的衍生化具有反转赖氨酰基残基的电荷的效果。其他适于衍生含α氨基的残基的试剂包括亚胺酯(例如甲基吡啶亚胺甲酯)、吡哆醛磷酸、吡哆醛、氢氯硼化物、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2,4-戊二酮以及与乙醛酸的转胺酶催化反应。
精胺酰基残基可通过与一种或多种常规反应剂发生反应而进行修饰，包括苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-环己烷二酮及茚三酮。精胺酸残基的衍生反应需要在碱性环境下进行，因其胍官能团具有较高的pKa。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸的ε氨基反应。
酪氨酰基残基的具体修饰可特别通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷的反应而将光谱标签引入酪氨酰基残基来实现。最常见的是，将N-乙酰咪唑及四硝基甲烷用于分别形成O-乙酰酪胺酰类及3-氮衍生物。
羧基侧基团(天冬胺酰基或谷胺酰基)是通过与碳化二亚胺(R-N=C=N-R')反应而被选择性修饰的，其中R及R'为不同烷基，例如1-环已基-3-(2-吗琳基-4-乙基)-碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4,4-二甲基戊基)-碳化二亚胺。此外，天冬胺酰基或谷胺酰基残基通过与铵离子反应而转变为天冬酰胺基或谷酰胺基。
其他修饰包括脯氨酸及赖氨酸的氢氧化，丝氨酰基及苏氨酰基残基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸及组氨酸侧链的α氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,pp.79-86(1983))，天冬酰胺或谷酰胺酸的去酰胺化，N端氨基的乙酰基化和/或C端羧酸基的酰胺化或酯化。
另一种共价修饰涉及将糖苷与所述类似物化学或酶偶联。糖类可与(a)精氨酸及组氨酸，(b)自由羧基，(c)自由巯基(例如半胱氨酸的巯基)，(d)自由羟基(例如丝氨酸、苏氨酸及羟基脯氨酸的羟基)，(e)芳基(例如酪氨酸或色氨酸的芳基)，或(f)谷酰胺酸的酰胺基。这些方法描述于于1987年9月11日公开的WO87/05330，以及Aplin andWriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259-306(1981)。
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物是通过所述胰高血糖素类似物的氨基酸的侧链与异源部分之间的共价连接与异源部分缀合的。在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物是通过第16、17、21、24或29位、或C端延伸中的位置、或C端氨基酸或这些位置的组合上的氨基酸的侧链与异源部分缀合的。在一些方面，共价连接至异源部分(例如，包含异源部分的氨基酸)的氨基酸为Cys、Lys、Orn、同型半胱氨酸或Ac-Phe，且所述氨基酸的侧链与异源部分共价键合。
在一些实施方案中，所述缀合物包含将胰高血糖素类似物连接至所述异源部分的连接物。在一些方面，连接物包含长度为1至约60个原子、1至30个原子或更长，2至5个原子、2至10个原子、5至10个原子、10至20个原子的原子链。在某些实施方案中，所述链的原子全为碳原子。在某些实施方案中，连接物主链中的链原子选自碳、氧、氮及硫。可根据期望的溶解度(亲水性)而选择链原子及连接物，从而提供溶解度更好的缀合物。在某些实施方案中，连接物提供官能团，所述官能团受到目标组织或器官或细胞中存在的酶或其他催化剂或水解条件的切割。在某些实施方案中，连接物的长度足够长，能减少空间位阻的可能性。若连接物为共价键或肽键且缀合物为多肽，则整体缀合物可为融合蛋白。此类肽连接物可为任何长度。示例性连接物的长度为约1至50个氨基酸，5至50、3至5、5至10、5至15或10至30个氨基酸。可选地，通过本领域技术人员公知的基因重组工程方法制备这类融合蛋白。
缀合物：Fc融合物
如上所述，在一些实施方案中，所述类似物与免疫球蛋白或其部分(例如：可变区、CDR或Fc区)缀合(例如融合)。已知类型的免疫球蛋白(Ig)包括：IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc区为Ig重链的C端区，负责结合Fc受体，Fc受体表现活性，例如再循环(导致延长的半衰期)，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，及补体依赖性细胞毒性(CDC)。
例如，根据某些定义，人IgG的重链Fc区由Cys226延伸至重链的C端。“铰链区”一般是由人IgG1的Glu216延伸至Pro230(通过比对参与半胱氨酸结合的半胱氨酸，其他IgG同型的铰链区可与IgG1序列比对)。IgG的Fc区包括两个恒定结构域CH2和CH3。人IgG的Fc区的CH2结构域通常由第231位氨基酸延伸至第341位氨基酸。人IgG的Fc区的CH3结构域通常由第342位氨基酸延伸至第447位氨基酸。免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或各区域的氨基酸编号是参照Kabat et al.1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,Bethesda,Md。在相关实施方案中，Fc区可包括一个或多个天然或经修饰的免疫球蛋白重链的恒定区(除CH1外)，例如，IgG及IgA的CH2与CH3区，或IgE的CH3及CH4区。
适合的缀合部分包括包含FcRn结合位点的免疫球蛋白序列部分。FcRn是补救受体(salvage receptor)，负责回收免疫球蛋白并将其送回血液中循环。已基于X光结晶法描述了IgG的Fc部分中能结合FcRn受体的区域(Burmeister et al.1994,Nature372:379)。FcRn与Fc的主要接触区域接近于CH2和CH3结构域的连接处。Fc-FcRn接触均位于单一IgG的重链内。主要接触位点包括CH2结构域中第248、250至257、272、285、288、290至291、308至311、及314位的氨基酸残基，以及CH3结构域中第385至387、428及433至436位的氨基酸残基。
某些缀合部分可以包括或不包括FcγR结合位点。FcγR负责ADCC及CDC。Fc区中与FcγR直接接触的位置的实例为第234至239位氨基酸(低铰链区)，第265至269位氨基酸(B/C环)，第297至299位氨基酸(C'/E环)，及第327至332位氨基酸(F/G环)(Sondermann etal,Nature406:267-273,2000)。IgE的低铰链区也参与FcRI结合(Henry,etal,Biochemistry36,15568-15578,1997)。参与IgA受体结合的残基描述于Lewis et al.，(J Immunol.175:6694-701,2005)。参与IgE受体结合的氨基酸残基已描述于Sayers et al.(J Biol Chem.279(34):35320-5,2004)。
可对免疫球蛋白的Fc区进行氨基酸修饰。这类变体Fc区包含Fc区的CH3结构域(第342至447位残基)中的至少一个氨基酸修饰，和/或Fc区的CH2结构域(第231至341位残基)中的至少一个氨基酸修饰。据信可增加对FcRn的亲和力的突变包括T256A、T307A、E380A，及N434A(Shields et al.2001,J.Biol.Chem.276:6591)。其他突变可降低Fc区与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB，和/或FcγRIIIA的结合，而不显著减少对FcRn的亲和力。例如，将Fc区中第297位的天冬酰胺取代为丙氨酸或另一氨基酸可除去高度保守的N-糖基化，并可导致免疫原性降低并伴随Fc区半衰期的延长，以及减少与FcγRs的结合(Routledge etal.1995,Transplantation60:847;Friend et al.1999，Transplantation68:1632;Shieldsetal.1995,J.Biol.Chem.276:6591)。IgG1的第233至236位的氨基酸修饰可减少与FcγRs的结合(Ward and Ghetie1995,Therapeutic Immunology2:77及Armour et al.1999,Eur.J.Immunol.29:2613)。某些示例性氨基酸取代公开于美国专利第7,355,008及7,381,408号，通过引用将其整体并入本文。
缀合物：亲水性部分
可进一步修饰本文所述的胰高血糖素类似物，以提供其在生理pH下、水性溶液中的溶解度以及稳定性，同时保留与天然胰高血糖素相关的高生物活性。可在用于使蛋白与活化的聚合物分子反应的任何合适的条件下，使亲水性部分(如PEG基团)连接至所述类似物。可使用本领域已知的任何方法，包含通过酰基化、还原性烷基化、Michael加成(Michael addition)、巯基烷基化或通过PEG部分上的反应基团(例如醛基、氨基、酯基、巯基、α-卤素乙酰基、马来酰亚氨基或肼基)与目标化合物的反应基团(例如醛基、氨基、酯基、巯基、α-卤素乙酰基、马来酰亚氨基、肼基)反应的其他化学选择性缀合/连接方法。可用于连接水溶性聚合物与一个或多个蛋白的活化基团包括，但不限于，砜、马来酰亚胺、巯基、巯基、三氟甲基磺酸盐、tresylate、氮丙啶、环氧乙烷、5-吡啶基以及α-卤化酰基，例如α-碘乙酸、α-溴乙酸、α-氯乙酸。若通过还原性烷基化连接于所述类似物，所选聚合物应具有单一反应醛基，从而可控制聚合程度。请参阅，例如：Kinstler et al.,Adv.Drug.Delivery Rev.54:477-485(2002)；Roberts et al.,Adv.Drug Delivery Rev.54:459-476(2002);and Zalipsky et al.,Adv.Drug Delivery Rev.16：157-182(1995)。
在具体方面，具有巯基的类似物的氨基酸残基被亲水性部分（如PEG）所修饰。在一些实施方案中，所述巯基在Michael加成反应中被马来酰亚胺活化的PEG修饰，得到PEG化的类似物，其包含如下所示的硫醚连接：
Figure BDA0000369878840001071
在一些实施方案中，巯基在亲核取代反应中被卤素乙酰基活化PEG修饰，产生包含硫醚连接的PEG化的类似物。
合适的亲水性部分包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇(例如POG)、聚氧乙基化山梨醇、聚氧乙基化丙三醇(POG)、聚氧化烯、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇共聚物、单甲氧基聚乙二醇、单-(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯氢吡咯酮、聚1,3-二氧环戊烷、聚1,3,6-三氧环戊烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(可为同聚合物或随机共聚物)、聚N-乙烯氢吡咯酮聚乙二醇、丙二醇(PPG)同聚合物及其他聚环氧烷化合物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、结肠酸或其他多糖聚合物、Ficoll或葡聚糖及其混合物。葡聚糖为主要通过α1-6键连接的葡萄糖亚单元的多糖聚合物。葡聚糖有多种可用的分子量范围，例如约1kD至约100kD，或约5、10、15或20kD至约20、30、40、50、60、70、80或90kD。线性的或分支的亲水性聚合物在考虑范围内。得到的缀合物制备物可以主要可为单分散或多分散，并可以具有约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分/类似物。
在一些或任何实施方案中，所述胰高血糖素类似物是通过所述胰高血糖素类似物的氨基酸的侧链与亲水性部分之间的共价连接于亲水性部分缀合的。在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物是通过第16、17、21、24或29位、或C端延伸中的位置、或C端氨基酸、或上述位置的组合的氨基酸的侧链与亲水性部分缀合的。在一些方面，所述共价连接至亲水性部分(例如，包含亲水性部分的氨基酸)的氨基酸为Cys、Lys、Orn、同型半胱氨酸或Ac-Phe，且所述氨基酸的侧链与亲水性部分(例如PEG)共价键合。
缀合物：rPEG
在一些或任何实施方案中，本申请的缀合物包含与辅助类似物融合的具有GIP受体激动剂活性的胰高血糖素类似物，辅助类似物能形成与化学聚乙二醇(例如重组聚乙二醇分子(rPEG))相似的延展构象，例如，描述于国际专利申请WO2009/023270及美国专利申请公开US2008/0286808。在一些方面，所述rPEG分子为包含甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸或脯氨酸中一个或多个的多肽。在某些方面，rPEG为同聚合物，例如聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丙氨酸或聚脯氨酸。在其他实施方案中，rPEG包含两种重复氨基酸，例如聚(Gly-Ser)、聚(Gly-Glu)、聚(Gly-Ala)、聚(Gly-Asp)、聚(Gly-Pro)、聚(Ser-Glu)等。在一些方面，rPEG包含三种不同类型的氨基酸，例如聚(Gly-Ser-Glu)。在具体方面，rPEG增加胰高血糖素和/或GLP-1激动剂类似物的半衰期。在某些方面，rPEG具有净正电荷或净负电荷。在某些方面，rPEG缺少二级结构。在某些实施方案中，rPEG的长度大于或等于10个氨基酸，在某些实施方案中，长度为约40至50个氨基酸。在某些方面，辅助肽通过肽键或蛋白酶切割位点与本申请的类似物的N端或C端融合，或被插入本申请类似物的环中。在某些方面，rPEG包含亲和力标签或连接至大于5kDa的聚乙二醇。在某些实施方案中，rPEG赋予本申请类似物增加的水力学半径、血清半衰期、蛋白酶抗性或溶解度，且在某些方面，赋予本申请类似物降低的免疫原性。
缀合物：多聚体
本发明还提供本申请的类似物的多聚体或二聚体，包括同多聚体或异多聚体、或同二聚体或异二聚体。可利用本领域技术人员已知的标准的连接剂和方法将二个或更多个类似物连接在一起。例如，可通过使用双官能巯基交联剂和双官能氨基交联剂在二个肽间形成二聚体，尤其是用半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸或乙酰苯丙氨酸取代的类似物。所述二聚体可为同二聚体或异二聚体。在示例性实施方案中，连接两个(或更多个)类似物的连接物为PEG，例如5kDaPEG或20kDa PEG。在一些实施方案中，所述连接物为二硫键。例如，二聚体中每个单体可包含Cys残基(例如，位于末端或中间的Cys)，每个Cys残基的硫原子参与二硫键的形成。在示例性方面，二聚体上的每个单体均通过硫醚键连接。在示例性方面，一个单体得Lys残基的ε氨基与Cys残基键合，Cys残基通过化学部分与另一单体的Lys残基的ε胺连接。制备硫醚键合二聚体的方法在本说明书中有进一步说明。在一些方面，单体通过末端氨基酸(例如，N端或C端)、中间氨基酸或至少一个单体的末端氨基酸与至少一个其他单体的中间氨基酸连接。在具体方面，单体不通过N端氨基酸连接。在一些方面，多聚体的单体以“尾对尾(tail-to-tail)”的方向连接在一起，其中每个单体的C端氨基酸连接在一起。
前药
本发明还提供本文所述的肽以及类似物的前药。如本文所使用，术语“前药”被定义为经化学修饰后表现出其完全药理效用的任何化合物。
在示例性实施方案中，所述前药为基于酰胺的肽前药，与2010年6月24日公开的国际专利申请公开WO/2010/071807中所描述的相似。此类前药意图用来延迟药物作用开始的时间以及延长药物的半衰期。延迟的作用开始时间的优点在于其允许前药在活化前分布到全身。因此，给予所述前药可去除给药时峰值活性引发的并发症，并且增加母药的治疗指数。
在示例性方面，所述前药包含下列结构：A-B-Q；其中Q为本文所述的肽或类似物；A为氨基酸或是羟基酸；B为N-烷基化氨基酸，其通过A-B间的酰胺键和Q的氨基与Q连接；其中A、B或Q的连接至A-B的氨基酸为非编码氨基酸，而且其中在生理条件下、在PBS中，A-B从Q的化学切割半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周。如本文所使用，术语“羟基酸”表示氨基酸，其α碳的氨基被羟基所取代。
在一些实施方案中，所述二肽前药组成部分具有通式I的一般结构：
Figure BDA0000369878840001101
其中R1、R2、R4及R8独立地选自：H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2，(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2，(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)及C1-C12烷基(A)(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S及O的杂原子，或R1及R2和它们所连接的原子形成C3-C12环烷基或芳基，或R4及R8与它们所连接的原子形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7及(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或R4及R3与它们所连接的原子形成4元、5元或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基或R6及R2与它们所连接的原子形成4元、5元或6元杂环，以及
R7选自H和OH。
在其他实施方案中，所述二肽前药组成部分具有通式I的一般结构：
Figure BDA0000369878840001111
其中R1、R2、R4及R8独立地选自：H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)、及C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S及O的杂原子，或R1及R2与它们所连接的原子形成C3-C12环烷基，或R4及R8与它们所连接的原子形成C3-C6环烷基；
R3选自(C1-C18烷基)、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、及(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或R4及R3与它们所连接的原子形成4元、5元或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6及R1与它们所连接的原子形成4元、5元或6元的杂环；
R7选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH及卤素。
在一些实施方案中，R8为H且R5为NHR6。
在一些实施方案中，所述二肽前药组成部分具有通式I的结构，其中
R1以及R8独立地为H或C1-C8烷基；
R2以及R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7以及CH2(C3-C9杂芳基)，或R1以及R2与它们所连接的原子形成C3-C12环烷基或芳基；
R5为NHR6；且
R6为H或C1-C8烷基。
在其他实施方案中，所述二肽前药组成部分包含上述通式I的结构，其中
R1以及R8独立地为H或C1-C8烷基；
R2以及R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7以及CH2(C3-C9杂芳基)，或R1以及R2与它们所连接的原子形成C3-C12环烷基；
R3为C1-C18烷基；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C8烷基；以及
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH以及卤素。
按照本发明形成的前药的半衰期取决于二肽前药组成部分的取代基、其位置及其所连接的氨基酸。例如，前药可包含本文所述的肽或类似物，其中二肽前药组成部分通过所述肽或类似物中N端氨基酸的α氨基连接。在此实施方案中，具有例如约1小时的t1/2的前药包含具有下列结构的二肽前药组成部分：
Figure BDA0000369878840001121
其中R1以及R2分别为C1-C18烷基或芳基；或R1以及R2通过-(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4以及R8均为氢；
R5为氨基。
在其他实施方案中，具有例如约1小时t1/2的前药包含结构如下的二肽前药组成部分：
其中R1以及R2独立地为C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；或R1以及R2通过-(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4以及R8均为氢；
R5为NH2；
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH以及卤素。
此外，具有连接至本文所述的肽或类似物的N端α氨基酸的二肽前药组成部分并具有例如约6至约24小时的t1/2的前药包含结构如下的二肽前药组成部分：
Figure BDA0000369878840001132
其中R1以及R2独立地选自氢、C1-C18烷基以及芳基，或R1以及R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基或者R3及R4与它们所连接的原子形成4-12杂环；
R4以及R8独立地选自氢、C1-C8烷基及芳基；以及R5为氨基；
条件为R1以及R2不为氢且R4或R8之一为氢。
在某些实施方案中，具有连接至本文所述的肽或类似物的N端α氨基酸的二肽前药组成部分的并具有例如约12至约72小时的t1/2或在某些实施方案中具有约12至约48小时的t1/2的前药包含下述结构的二肽前药组成部分：
其中R1以及R2独立地选自氢、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2以及(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或R1以及R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基或者R3及R4与它们所连接的原子形成4-12杂环；
R4以及R8独立地选自氢、C1-C8烷基以及(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；以及
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH以及卤素；
条件为R1以及R2不为氢且R4或R8至少之一为氢。
在一些实施方案中，具有连接至本文所述的肽或类似物的N端α氨基酸的二肽前药组成部分并具有例如约12至约72小时的t1/2或在某些实施方案中具有约12至约48小时的t1/2的前药包含下述结构的二肽前药组成部分：
Figure BDA0000369878840001144
其中R1以及R2独立地选自氢、C1-C8烷基以及(C1-C4烷基)NH2，或R1以及R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基或者R3及R4与它们所连接的原子形成4-6杂环；
R4选自氢以及C1-C8烷基；以及
R5为NH2；
条件为R1以及R2不为氢。
在其他实施方案中，具有连接至本文所述的肽或类似物的N端α氨基酸的二肽前药组成部分并具有例如约12至约72小时的t1/2或在某些实施方案中具有约12至约48小时的t1/2的前药包含下述结构的二肽前药组成部分：
Figure BDA0000369878840001155
其中R1以及R2独立地选自氢、C1-C8烷基以及(C1-C4烷基)NH2；
R3为C1-C6烷基；
R4为氢；以及
R5为NH2；
条件为R1以及R2不为氢。
在其他实施方案中，具有连接至本文所述的肽或类似物的N端α氨基酸的二肽前药组成部分并具有例如约12至约72小时的t1/2或在某些实施方案中具有约12至约48小时的t1/2的前药包含下述结构的二肽前药组成部分：
其中R1以及R2独立地选自氢、C1-C8烷基以及(C1-C4烷基)NH2，或R1以及R2是通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基；
R4为(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；以及
R7选自氢、C1-C8烷基以及(C0-C4烷基)OH；
条件为R1以及R2不为氢。
另外，提供了具有连接至本文所述的肽和类似物的N端α氨基酸的二肽前药组成部分并具有例如约72至约168小时的t1/2的前药，其中所述二肽前药组成部分具有下述结构：
Figure BDA0000369878840001153
其中R1选自氢、C1-C8烷基以及芳基；
R3为C1-C18烷基；
R4以及R8均为氢；以及
R5为氨基或N-取代氨基或羟基；
条件为若R1为烷基或芳基，则R1以及R5与它们所连接的原子形成4-11杂环。
在一些实施方案中，所述二肽前药组成部分具有如下结构：
Figure BDA0000369878840001163
其中R1选自氢、C1-C8烷基以及(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基；
R4以及R8均为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6以及R1与它们所连接的原子形成4元、5元或6元杂环；并且
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH以及卤素；
条件为若R1为烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，则R1以及R5与它们所连接的原子形成4-11杂环。
在一些实施方案中，所述二肽前药组成部分与本文所述的肽或类似物的内部氨基酸的侧链氨基连接。在此实施方案中，具有例如约1小时的t1/2的前药具有以下结构：
Figure BDA0000369878840001162
其中R1以及R2独立地为C1-C8烷基或芳基；或R1以及R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4以及R8均为氢；以及R5为氨基。
在一些实施方案中，具有例如约1小时t1/2的前药具有如下结构：
Figure BDA0000369878840001171
其中R1以及R2独立地为C1-C8烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；或R1以及R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4以及R8均为氢；
R5为NH2；且
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH以及卤素。
此外，其具有例如约6-约24小时的t1/2并具有连接至内部氨基酸侧链的二肽前药组成部分的前药包含结构如下的二肽前药组成部分：
Figure BDA0000369878840001172
其中R1以及R2独立地选自氢、C1-C8烷基及芳基，或R1以及R2通过-(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基或R3以及R4与它们所连接的原子形成4-12杂环；
R4以及R8独立地为C1-C18烷基或芳基；且
R5为氨基或N-取代的氨基；
条件为R1以及R2不为氢且R4或R8之一为氢。
在某些实施方案中，具有例如约12至约72小时的t1/2或在某些实施方案中约12至约48小时的t1/2并具有接至内部氨基酸侧链的二肽前药组成部分的前药包含下述结构的二肽前药组成部分：
Figure BDA0000369878840001173
其中R1以及R2独立地选自氢、C1-C8烷基以及(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或R1以及R2通过-(CH2)p-所连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或R3以及R4与它们连接的原子形成4-12杂环；
R4以及R8独立地为氢、C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C8烷基，或R6以及R2与它们所连接的原子形成4、5或6元杂环；并且
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH以及卤素；
条件为R1以及R2不为氢，且R4或R8至少之一为氢。
此外，提供了其具有例如约72至约168小时的t1/2并具有接至本文所述的肽或类似物的内部氨基酸侧链的二肽前药组成部分的前药，其中所述二肽前药组成部分具有下述结构：
Figure BDA0000369878840001181
其中R1以及R2独立地选自氢、C1-C18烷基以及芳基；
R3为C1-C18烷基；
R4以及R8均为氢；以及
R5为氨基或N-取代的氨基或羟基；
条件为当R1以及R2独立地为烷基或芳基时，R1或R2通过(CH2)p连接至R5，其中p为2-9。
在一些实施方案中，提供了其具有例如约72至约168小时的t1/2并具有接至本文所述的肽或类似物的内部氨基酸侧链的二肽前药组成部分的前药，其中所述二肽前药组成部分具有下述结构：
Figure BDA0000369878840001182
其中R1选自氢、C1-C18烷基以及(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基；
R4以及R8均为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H或C1-C8烷基，或R6以及R1与它们所连接的原子形成4、5或6元杂环；以及
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基，(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH以及卤素；
条件为，若R1以及R2均独立地为烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，则R1或R2通过(CH2)p连接至R5，其中p为2-9。
在一些实施方案中，所述二肽前药组成部分连接至本文所述的肽或类似物的内部氨基酸的侧链氨基，其中所述内部氨基酸包含通式II的结构：
Figure BDA0000369878840001191
其中n为选自1至4的整数。在一些实施方案中，n为3或4，以及在一些实施方案中，所述内部的氨基酸为赖氨酸。在一些实施方案中，所述二肽前药组成部分连接至本文所述肽或类似物的第12、16、17、18、20、28或29位的氨基酸的侧链的伯胺。在一些实施方案中，所述第12、16、17、18、20、28或29位的氨基酸包含通式II的结构：
Figure BDA0000369878840001192
其中n为选自1至4的整数，所述二肽前药组成部分通过酰胺键连接至氨基酸侧链。在一些实施方案中，n为4，所述氨基酸位于第20位。
在另一实施方案中，所述二肽前药组成部分通过芳香族氨基酸的芳基上的氨基连接至所述肽或类似物。在一些实施方案中，所述芳香族氨基酸为本文所述的肽或类似物的内部氨基酸，然而，所述芳香族氨基酸也可为N端氨基酸。在一些实施方案中，所述芳香族氨基酸选自氨基苯丙氨酸、氨基-萘基丙氨酸、氨基色氨酸、氨基苯甘氨酸、氨基同型苯丙氨酸以及氨基酪氨酸。在一些实施方案中，与二肽前药组成部分形成酰胺键的伯胺位所述芳基的对位。在一些实施方案中，所述芳香胺包含通式III的结构：
Figure BDA0000369878840001201
其中m为1至3的整数。
在所述二肽前药组成部分通过芳香族氨基酸的芳基上的氨基连接至本文所述的肽或类似物的这些实施方案中，具有例如约1小时t1/2的前药具有如下二肽结构：
Figure BDA0000369878840001202
其中R1以及R2独立地为C1-C18烷基或芳基；
R3为C1-C18烷基或R3以及R4与它们所连接的原子形成4-12杂环；
R4以及R8独立地选自氢、C1-C18烷基以及芳基；以及R5为氨基或羟基。
在一些实施方案中，所述二肽前药组成部分通过芳香族氨基酸的芳基上的氨基连接至本文所述的肽或类似物，具有例如约1小时t1/2的前药具有如下二肽结构：
Figure BDA0000369878840001211
其中R1以及R2独立地为C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基或R3以及R4与它们所连接的原子形成4-12杂环；
R4以及R8独立地选自氢、C1-C18烷基以及(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7由；
R5为NH2或OH；以及
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH以及卤素。
此外，提供了具有通过芳香族氨基酸连接的二肽前药组成部分具有例如约6至约24小时的t1/2的前药，其中所述二肽包含如下结构：
其中R1选自氢、C1-C18烷基以及芳基，或R1以及R2通过-(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基或R3以及R4与它们所连接的原子形成4-6杂环；
R4以及R8独立地选自氢、C1-C18烷基以及芳基；以及R5为氨基或N取代的氨基。
在一些实施方案中，提供了具有通过芳香族氨基酸连接的二肽前药组成部分具有例如约6至约24小时的t1/2的前药，其中所述二肽包含如下结构：
Figure BDA0000369878840001213
其中R1选自氢、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2以及(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基或R3以及R4与它们所连接的原子形成4-6杂环；
R4以及R8独立地选自氢、C1-C18烷基以及(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NHR6；
R6为H、C1-C8烷基或R6以及R1与它们所连接的原子形成4、5或6元杂环；以及
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH以及卤素。
此外，提供了具有通过芳香族氨基酸连接的二肽前药组成部分具有例如约72至约168小时的t1/2的前药，其中所述二肽包含如下结构：
Figure BDA0000369878840001221
其中R1以及R2独立地选自氢、C1-C8烷基及芳基；
R3为C1-C18烷基或R3以及R4与它们所连接的原子形成4-6杂环；
R4以及R8均为氢；以及
R5选自氨基、N取代的氨基以及羟基。
在一些实施方案中，提供了具有通过芳香族氨基酸连接的二肽前药组成部分具有例如约72至约168小时的t1/2的前药，其中所述二肽包含如下结构：
Figure BDA0000369878840001222
其中R1以及R2独立地选自氢、C1-C8烷基、(C1-C4烷基)COOH以及(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或R1以及R5与它们所连接的原子形成4-11杂环；
R3为C1-C18烷基或R3以及R4与它们所连接的原子形成4-6杂环；
R4为氢或与R3形成4-6杂环；
R8为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H或C1-C8烷基，或R6以及R1与它们所连接的原子形成4、5或6元杂环；以及
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH以及卤素。
在一些实施方案中，所述二肽前药组成部分通过伯胺与芳香族氨基酸连接，所述伯胺是所述芳香族氨基酸的芳基取代基，其中所述芳香族氨基酸位于本文所述的肽或类似物的第10、13、22或25位(基于天然胰高血糖素的编号，参见如SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，连接二肽前药组成部分的芳香族氨基酸位于本文所述的肽或类似物的第22位。
根据一些实施方案，二肽前药组成部分连接至本文所述的肽或类似物的N端氨基，包括例如，胰高血糖素相关的肽或骨钙素，以及前述的类似物、衍生物以及缀合物，其中二肽前药组成部分包含如下结构：
Figure BDA0000369878840001231
其中R1选自H以及C1-C8烷基；
R2以及R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C5-C9杂芳基)，或R1以及R2与它们所连接的原子形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C3-C6)环烷基，或R4以及R3与它们所连接的原子形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或R6以及R2与它们所连接的原子形成5或6元杂环；以及
R7选自H以及OH。在一些实施方案中，R1为H或C1-C8烷基，R2选自H、C1-C6烷基、CH2OH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6环烷基)以及CH2(C6芳基)R7，或R6以及R2与它们所连接的原子形成5元杂环，R3为C1-C6烷基，以及R4选自H、C1-C4烷基、(C3-C6)环烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH以及(C0-C4烷基)(C6芳基)R7，或R3以及R4与它们所连接的原子形成5元杂环。在另一实施方案中，R3为CH3，R5为NHR6，以及在另一实施方案中，R3以及R4与它们所连接的原子形成5元杂环，R5为NHR6。
根据另一实施方案，二肽前药组成部分连接至本文所述的肽或类似物的N端氨基，其中二肽前药组成部分包含如下结构：
Figure BDA0000369878840001241
其中R1选自H以及C1-C8烷基；
R2以及R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C5-C9杂芳基)，或R1以及R2与它们所连接的原子形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C3-C6)环烷基，或R4以及R3与它们所连接的原子形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或R6以及R2与它们所连接的原子形成5或6元杂环；
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH以及卤素。在一些实施方案中，R1为H或C1-C8烷基，R2选自H、C1-C6烷基、CH2OH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6环烷基)以及CH2(C6芳基)R7，或R6以及R2与它们所连接的原子形成5元杂环，R3为C1-C6烷基，而R4选自H、C1-C4烷基、(C3-C6)环烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH以及(C0-C4烷基)(C6芳基)R7，或R3以及R4与它们所连接的原子形成5元杂环。在进一步的实施方案中，R3为CH3，R5为NHR6，且在另一进一步的实施方案中，R3以及R4与它们所连接的原子形成5元杂环，R5为NHR6。
药物组合物、用途和试剂盒
盐
在一些实施方案中，所述胰高血糖素类似物为盐的形式，例如，药学上可接受的盐。如本文所使用，术语“药学上可接受的盐”表示保留母体化合物的生物活性且不具有生物学上或其他方面不希望的性质的化合物的盐。可在最后分离及纯化所述类似物时原位制备所述盐，或通过使自由的碱官能团与合适的酸反应单独制备所述盐。本申请的许多化合物能通过氨基以及羧基或类似的基团的存在而形成酸和/或碱盐。
药学上可接受的酸加成盐可从无机酸或有机酸制得。代表性的酸加成盐包括，但不限于，醋酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、安息酸盐、苯磺酸酯、重硫酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半磺酸盐、庚酸盐、已酸盐、反丁烯二酸盐、氯化氢、溴化氢、碘化氢、2-羟乙基磺酸盐(isothionate)、乳酸盐、马来酸盐、甲烷磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果冻酸盐、过硫酸盐、3-苯氨基丙酸、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、重碳酸盐、对甲苯磺酸盐以及十一酸盐。由无机酸衍生的盐包括氢氯盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等。由有机酸衍生的盐包括醋酸盐、丙酸盐、乙醇酸盐、丙酮酸盐、草酸盐、苹果酸、丙二酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、反丁烯二酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、桂皮酸盐、杏仁酸盐、甲基磺酸盐、乙基磺酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐等。可用来形成药学上可接受的酸加成盐的酸的实例包括，例如，无机酸，例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸以及磷酸，以及有机酸，例如草酸、马来酸、琥珀酸以及柠檬酸。
也可在最后分离及纯化水杨酸来源时原位制备碱加成盐，或使含羧酸的部分与合适的碱(例如药学上可接受金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或)与氨水或有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备碱加成盐。药学上可接受的盐包括，但不限于，基于碱金属或碱土金属的阳离子，如锂、钠、钾、钙、镁以及铝盐等，以及无毒性的四级铵以及胺阳离子，包含氨水、四甲铵、四乙铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、三乙基铵、二乙基铵以及乙基铵等。可用来形成碱加成盐的其他代表性的有机胺类包括，例如乙烯二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。有机碱衍生的盐包括，但不限于，伯胺、仲胺以及叔胺的盐。
另外，碱性含氮基团可与本申请的类似物季铵化为低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基以及丁基氯化物、溴化物以及碘化物；长链卤化物，例如癸基、月桂基、十四基以及硬脂基氯化物、溴化物以及碘化物；芳基烷基卤化物，如苯甲基以及苯乙基溴化物等。可从而得到水溶性或油溶性或可分散的产物。
制剂
根据某些实施方案，提供药物组合物，其中所述组合物包含本申请的胰高血糖素类似物或其药学上可接受的盐，及药学上可接受的载体。如本文所使用，术语“药学上可接受载体”包括任何标准的药学载体，例如磷酸盐缓冲液、水、诸如油/水、水/油的乳化剂，及各种湿润剂。所述术语还包含经由美国联邦政府管理机构所批准或美国药典中列出的用于动物(包括人)的任何成分。
所述药物组合物可包含任何药学上可接受的成分，包括，例如，酸化剂、添加剂、吸附剂、推喷剂、空气置换剂、碱化试剂、防结块剂、抗凝聚剂着色剂、抗菌防腐剂、抗氧化剂、防腐剂、碱、黏合剂、缓冲剂、螯合剂、涂布剂、干燥剂、清洁剂、稀释剂、消毒剂、崩解佐剂、分散剂、助溶剂、染料、润滑剂、乳化剂、乳化稳定剂、填充剂、膜形成剂、风味增强剂、助流剂、胶凝剂、粒化剂、保湿剂、润滑剂、黏膜黏着剂、软膏基、软膏、油性赋形剂、有机碱、片状碱(pastillebases)、色素、可塑剂、磨光剂、防腐剂、多价螯合剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、安定剂、栓剂基体、表面活性剂、清洁剂、悬浮剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张力剂、增黏剂、吸水剂、水相互共溶剂、软水剂或湿润剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物包含下列组分中的任一种或组合：阿拉伯胶、醋磺内酯钾(Acesulfame K)、乙酰柠檬酸三丁酯、洋菜、白蛋白、无水酒精、变性酒精、稀释酒精、油桐酸、藻酸、脂肪族聚酯、铝氧、氢氧化铝、十八酸铝、支链淀粉、α-直链淀粉、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、阿斯巴甜、注射用制菌水、皂土、皂黏土乳、羟基氯苯胺、阳性皂、安息香酸、苄醇、安息酸甲苯、溴硝醇、丁基羟基甲氧苯、二丁基羟基甲苯、羟苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸丁酯钠、褐藻酸钙、抗坏血酸钙、碳酸钙、环己胺磺钙、磷酸氢钙(无水)、磷酸氢钙(2个结晶水)、磷酸钙、丙酸钙、硅酸钙、山梨酸钙、十八酸钙、硫酸钙、半水合硫酸钙、菜籽油、卡波姆、二氧化碳、羟甲基纤维素钙、羟甲基纤维素钙、β-胡萝卜素、鹿角菜胶、篦麻油、氢化篦麻油、阳离子乳化蜡、乙酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、粉状纤维素、硅化微晶纤维素、羧甲基纤维素钠盐、十八十六醇、溴化十六基三甲铵、十六碳醇、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、胆固醇、氯己定醋酸盐、氯己定葡糖酸盐、氯己定二盐酸盐、二氟氯乙烷(HCFC)、氯二氟甲烷、氟氯碳化物(CFC)、4-氯苯氧基乙醇、氯二甲酚、玉米糖浆固体物、无水柠檬酸、单水合柠檬酸、可可脂、着色剂、玉米油、棉花子油、甲酚、m-甲酚、o-甲酚、对甲酚、交联羧甲基纤维素钠盐、交联聚维酮、环己基氨基磺酸、环糊精、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、无水右旋糖、双咪唑烷基脲、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、邻苯二乙酸、二氟乙烷(HFC)、二甲基-β-环糊精、环糊精化合物，例如、二甲基乙醚、邻苯二甲酸二甲酯、四乙酸乙二胺二钾、四乙酸乙二胺二钠、磷酸氢二钠、多库酯钙、多库酯钾、多库酯钠、五倍子酸十二酯、十二烷基三甲基溴化铵、四乙酸乙二胺二钠钙、乙二胺四乙酸、葡乙胺、乙醇、乙基纤维素、五倍子酸乙酯、月桂酸乙酯、乙麦芽醇、油酸乙酯、羟苯甲酸乙酯、羟苯甲酸乙酯钾盐、羟苯甲酸乙酯钠盐、乙香草醛、果糖、果糖液、经研磨的果糖、无热原的果糖、粉状果糖、反丁烯二酸、明胶、葡萄糖、葡萄糖液、饱和植物脂肪酸的甘油酯混合物、甘油酯、山萮酸甘油酯、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、自发性乳化单硬脂酸甘油酯、硬脂酸棕榈酸甘油酯、甘氨酸、甘油、四氢呋喃聚乙二醇醚、瓜尔胶、七氟丙烷(HFC)、十六烷基三甲基溴化铵、高果糖糖浆、人血清白蛋白、碳氢化合物(HC)、稀释氢氯酸、氢化植物油第二型、羟乙基纤维素、2-羟乙基-β-环糊精、羟丙基纤维素、低取代羟丙基纤维素、2-羟丙基-β-环糊精、羟丙基甲纤维素、羟丙甲纤维素酞酸酯、咪唑烷基脲、靛胭脂、离子交换树脂、铁氧化物、异丙醇、肉荳蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、等张盐溶液、高岭土、乳酸、乳糖醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇、无水羊毛脂、卵磷脂、硅酸镁铝、碳酸镁、正常碳酸镁、无水碳酸镁、碳酸氢氧镁、氢氧化镁、月桂醇硫酸酯镁盐、氧化镁、硅酸镁、硬脂酸镁、三硅酸镁、无水三硅酸镁、苹果酸、麦芽、麦芽糖醇、麦芽糖醇溶液、麦芽糖糊精、麦芽酚、麦芽糖、甘露醇、中链脂肪酸甘油三酯、葡甲胺、薄荷醇、甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯、油酸甲酯、羟苯甲酯、羟苯甲酯钾盐、羟苯甲酯钠盐、微晶纤维素及羧甲基纤维素钠盐、矿物油、轻质矿物油、液体石蜡羊毛醇、油、橄榄油、单乙醇胺、高岭石、柘酸辛酯、油酸、软脂酸、石蜡、花生油、凡士林、凡士林羊毛醇、药用釉料、苯酚、液化苯酚、苯氧乙醇、苯氧丙醇、苯乙醇、醋酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、波拉克林、波拉克林钾、泊洛沙姆、葡聚糖、聚乙二醇、聚氧乙烯、聚丙烯酸树脂、聚乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物、聚甲基丙烯酸树脂、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚山梨酯、硬脂酸聚氧乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钾、苯甲酸钾、碳酸氢钾、亚硫酸氢钾、氯化钾、柠檬酸钾、无水柠檬酸钾、磷酸氢钾、焦亚硫酸钾、磷酸二氢钾、丙酸钾、山梨酸钾、聚维酮、丙醇、丙酸、碳酸丙烯酯、丙二醇、藻酸丙二醇酯、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯钾、对羟基苯甲酸丙酯钠、硫酸鱼精蛋白、菜子油、林格氏溶液、糖精、糖精铵、糖精钙、糖精钠、红花子油、皂石、血清蛋白、芝麻油、胶态氧化硅、胶态二氧化硅、藻酸钠、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、碳酸氢钠、亚硫酸氢钠、氯化钠、无水柠檬酸钠、柠檬酸钠二水合物、氯化钠、环拉酸钠、四乙酸乙二胺钠、十二基硫酸钠、月桂硫酸钠、焦亚硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、无水丙酸钠、丙酸钠、山梨酸钠、羧甲淀粉钠、硬脂反丁烯二酸钠、亚硫酸钠、山梨酸、山梨坦酯、山梨醇、山梨醇溶液70%、大豆油、鲸蜡、淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、预胶化淀粉、灭菌玉米淀粉、硬脂酸、纯化硬脂酸，硬脂醇、蔗糖、糖类、可压性蔗糖、蔗糖粉、蔗糖球形颗粒、转化糖、Sugartab、Sunset Yellow FCF、合成石蜡、滑石粉、酒石酸、酒石黄、四氟乙烷(HFC)、可可脂、硫柳汞、二氧化钛、α-生育酚、乙酸生育酚、α酸式琥珀酸生育酚、β生育酚、δ生育酚、γ生育酚、黄蓍胶、甘油三乙酸酯、柠檬酸三丁酯、三乙醇胺、柠檬酸三乙酯、三甲基-β-环糊精、三甲基十四烷基氯化铵、Tris缓冲液、乙二胺四乙基三钠、香草醛、第一型氢化植物油、水、软水、硬水、无二氧化碳水、无热原水、注射用水、无菌吸入水、无菌注射用水、无菌透析水、蜡、阴离子乳化蜡、卡那巴蜡、阳离子乳化蜡、十六醇酯蜡、微晶蜡、非离子性乳化蜡、塞剂蜡、白腊、黄蜡、液体石蜡、羊毛脂、黄原酸胶、木糖醇、玉米蛋白、丙酸锌、锌盐、硬脂酸锌盐，或Handbookof Pharmaceutical Excipients,Third Edition,A.H.Kibbe_PharmaceuticalPress,London,UK,2000(通过引用将其整体并入本文)中的任何赋形剂。Remington’s Pharmaceutical Sciences,Sixteenth Edition,E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)公开了用于配制药学上可接受的组合物中的各种组分及其制剂的已知技术，通过引用将其整体并入本文。除非任何常规试剂与药物组合物不相容，否则考虑其在药物组合物中的用途。补充活性成分也可并入组合物中。
在某些实施方案中，前述可存在于药物组合物的成分为任何浓度范围，例如，至少为A，其中A为0.0001%w/v、0.001%w/v、0.01%w/v、0.1%w/v、1%w/v、2%w/v、5%w/v、10%w/v、20%w/v、30%w/v、40%w/v、50%w/v、60%w/v、70%w/v、80%w/v或90%w/v。在某些实施方案中，前述可存在于药物组合物的成分为任何浓度，例如，至多为B，其中B为90%w/v、80%w/v、70%w/v、60%w/v、50%w/v、40%w/v、30%w/v、20%w/v、10%w/v、5%w/v、2%w/v、1%w/v、0.1%w/v、0.001%w/v或0.0001%。在其他实施方案中，前述可存在于药物组合物的成分为任何浓度范围，例如，约A至约B。在某些实施方案中，A为0.0001%，B为90%。
在一些实施方案中，所述药学上可接受成份选自糖类(例如，葡萄糖、蔗糖海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、葡聚糖、甘醇、葡聚糖、蜜二糖、蜜三糖、棉子糖、甘露三糖、水苏糖、麦芽糖、乳酮糖、麦芽酮糖或异麦芽酮糖或这些糖类的组合)、糖醇(例如，乙二醇、甘油、赤藻糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、甘露醇、山梨醇、半乳糖醇、艾杜糖醇、异马尔托环醇、麦芽糖醇、乳糖纯或山梨醇或这些糖醇的组合)、盐(例如氯化钠)、乳化剂或表面活化剂(例如，聚山梨醇酯、例如聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯或环氧乙烷及环氧丙烷的嵌段共聚物)、冻干保护剂及以上的混合物。例如，存在如糖类或糖醇的赋形剂，例如，浓度约为20mg/ml至约40mg/ml，或25至45mg/ml，例如35mg/ml。
可配制所述药物组合物以达到生理学相容的pH值。在某些实施方案中，所述药物组合物的pH值可以为至少5、至少5.5、至少6、至少6.5、至少7、至少7.5、至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10或至少10.5，高至并包括11，其取决于配方及给药途径，例如4至7，或4.5至5.5。在示例性实施方案中，所述药物组合物可包含缓冲剂以达到生理学相容的pH值。缓冲剂可包含在所需pH值下具有缓冲能力的任何化合物，例如，磷酸盐缓冲液(例如PBS)、三乙醇胺、Tris、二羟乙甘氨酸(bicine)、TAPS、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(tricine)、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲基胂酸盐(cacodylate)、MES、醋酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或其他药学上可接受缓冲剂。在具体实施方案中，缓冲剂强度为至少0.5mM、至少1mM、至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少60mM、至少70mM、至少80mM、至少90mM、至少100mM、至少120mM、至少150mM或至少200mM。在具体实施方案中，缓冲剂强度不超过300mM(例如最大为200mM、最大为100mM、最大为90mM、最大为80mM、最大为70mM、最大为60mM、最大为50mM、最大为40mM、最大为30mM、最大为20mM、最大为10mM、最大为5mM、最大为1mM)。例如，所述缓冲剂浓度可为约2mM至约100mM，或约10mM至约50mM。
给药途径
以下关于给药途径的讨论仅为说明示例性实施方案，不应解释为在任何方面限制范围。
合适的口服给药制剂可包含(a)液体溶液，例如溶解于稀释剂(如水、盐水或橙汁)中的有效量的本申请的类似物；(b)包含预定量的固态或颗粒状的活性成份的胶囊、药袋、锭剂、片剂以及含片；(c)粉末；(d)配制于合适液体中的悬浮液；以及(e)合适的乳化剂。液体制剂可包含稀释剂，如水以及醇，例如，乙醇、苯甲醇以及聚乙烯醇，可添加或不添加药学上可接受的表面活性剂。胶囊形式可为一般的硬式或软式外壳明胶式，其包含如表面活性剂、润滑剂以及惰性填料，例如乳糖、蔗糖、磷酸钙以及玉米淀粉。片剂形式可包含以下中一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸、微晶纤维素、洋槐、明胶、瓜尔豆胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基钠、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸以及其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂乙基其他药学上相容的赋形剂。锭剂形式可包含调味的本申请的类似物，通常是蔗糖以及阿拉伯胶或黄蓍胶，以及包含于惰性碱中的本申请的类似物的粒状形式，例如明胶以及甘油或蔗糖，以及相思树胶、乳化剂，凝胶等，包含本领域已知的其他赋形剂。
单独的或与其他合适的成份组合的本申请的类似物可经由肺给药递送，并可制成可通过吸入给药的气雾剂制剂。这些气雾剂制剂可置于加压的可接受推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。其还可被配制为用于非加压制剂的药物，例如在喷雾器或气化喷雾器中。此类喷雾制剂还可用于粘膜喷雾。在一些实施方案中，所述类似物被配制在粉末混合剂或微颗粒或纳米颗粒中。合适的肺用制剂为本领域技术人员所公知。参见如Qian et al.,Int J Pharm366：218-220(2009)；Adjei以及Garren,Pharmaceutical Research,7(6)：565-569(1990)；Kawashima et al.,J Controlled Release62(1-2)：279-287(1999)；Liuetal.,Pharm Res10(2)：228-232(1993)；国际专利申请公开WO2007/133747以及WO2007/141411。
适合用于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂以及溶质，所述溶质能使所述制剂与计划的接受给药者的血液等张，适合用于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌悬液，其可包含悬浮剂、助溶剂、增稠剂、稳定剂以及防腐剂。术语“胃肠外”表示不通过消化道，而是通过其他途径，如皮下、肌肉、脊椎内或静脉内。本申请的类似物可与生理学可接受的稀释剂在药学载体中给药，例如无菌液体或液体混合物，包括水、盐水、葡萄糖水溶液以及相关的糖类溶液，醇类如乙醇或十六醇、二醇，例如丙二醇或聚乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、酮缩醇如2,2-二甲基-1,3-二氧环戊烷基-4-甲醇、乙醚、聚(乙醚甘油)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯或乙酰化脂肪酸甘油酯，可添加或不添加药学上可接受的表面活性剂，例如皂或去垢剂、悬浮剂，例如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素或羧甲基纤维素或乳化剂以及其他药学用佐剂。
可用于肠胃外制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉花籽油、玉米油、橄榄油、石油以及矿物油。可用于肠胃外制剂的合适脂肪酸包括油酸、硬脂酸，以及异硬脂酸。油酸乙酯以及肉豆蔻酸异丙酯为合适的脂肪酸酯的实例。
用于肠胃外制剂的合适的皂包括脂肪碱金属、铵以及三乙醇胺盐，合适的去垢剂包括(a)阳离子去垢剂，例如二甲基二烷基卤化铵，以及烷基吡啶卤化物；(b)阴离子清洁剂，例如烷基、芳基以及烯烃磺酸盐、烷基、烯烃、醚以及单甘油酯磺酸盐以及磺酸琥珀酸酯；(c)非离子性去垢剂，例如氧化脂肪胺、烷醇酰胺脂肪酸以及聚氧乙烯聚氧丙烯共聚合物；(d)两性去垢剂，例如烷基-β-氨基丙酸酯，以及2-烷基-咪唑咻季铵盐，以及(e)以上的混合物。
肠胃外制剂通常于溶液中包含以重量计约0.5%至约25%的本申请的类似物。可使用防腐剂以及缓冲液。为了最小化或消除注射部位的刺激，此类组合物可包含一种或多种具有约12至约17的亲水性亲油性平衡(HLB)值的非离子表面活性剂。表面活性剂在这些制剂中的量通常为以重量计约5%至约15%。合适的表面活性剂包括聚乙二醇山梨醇酐脂肪酸酯，例如山梨醇酐单油酸酯以及氧化乙烯与疏水碱的高分子量加成物，其是经由氧化丙烯与丙二醇缩合而得。所述肠胃外制剂可以存在于单元剂量或多剂量的密封容器中，例如安瓿以及药瓶，并可于冻干的条件下保存，仅须于即将使用前添加无菌液体赋形剂，例如，注射用水。即用注射溶液以及悬液可由如前述的无菌粉末、颗粒以及片剂制备。
可按照本发明制备可注射的制剂。对于用于可注射组合物的有效医药载体的要求为本领域技术人员所熟知的(参见如Pharmaceuticsand Pharmacy Practice,J.B.Lippincott Company,Philadelphia,PA,Bankerand Chalmers,eds.,pages238-250(1982)，以及ASHP Handbook on Injec表Drugs,Toissel,4th ed.,pages622-630(1986))。
此外，本申请的类似物可通过与各种基底混合制成栓剂用于直肠给药，所述基底例如乳化基底或水溶性基底。适合用于阴道给药的制剂可为阴道栓剂、卫生棉条、乳霜、凝胶、软膏、泡沫或喷剂制剂，其包含活性成分以及本领域技术人员所公知的合适载体。
本领域技术人员能够理解，除了上述的药物组合物，本申请的类似物还可配制为包合物，例如环糊精包合物或脂质体。
剂量
当治疗GIP受体激动作用、GIP/GLP-1受体双重激动作用、GIP/胰高血糖素受体双重激动作用或GIP/GLP-1/胰高血糖素受体三重激动作用能发挥作用的疾病中，本申请的类似物是有用的。为了本申请的目的，本申请类似物的给药量或剂量应足以在合理时间段、在个体或动物中实现效果，例如，治疗性或预防性反应。例如，本申请类似物的剂量应足以在给药起1至4分钟、1至4小时、1至4周或更长的时间(如5至20周或更多周)的时间段内，如本文所述刺激细胞分泌cAMP，或足以降低哺乳动物的血糖水平、血脂水平、摄食水平或体重。在示例性实施方案中，时间段可更长。所述剂量将取决于本申请的具体类似物的功效，动物(如人)的状态，以及待治疗的动物(如人)的体重。
用来确定给药剂量的许多测定均为本领域所公知。为了本文的目的，可使用以下测定法来确定哺乳动物给药的起始剂量，包括在将指定剂量的本申请类似物给予哺乳动物后，将血糖水平下降的程度与来自一组给予不同剂量类似物的哺乳动物中血糖水平下降的程度相比较。可通过本领域所公知的方式测定给予一定剂量后的血糖水平下降程度，包括如实施例11中所描述的方法。
本申请类似物的剂量还取决于给予本申请的具体类似物时可能伴随产生的任何副作用的存在、性质以及程度。通常，主治医生会考虑多种因素来确定治疗个体患者所用的本申请类似物的使用剂量，例如年龄、体重、一般健康情况、饮食、性别、所给予的本申请类似物、给药途径以及所治疗的疾病状态的严重性。作为举例但不意图限制本发明，本申请类似物的剂量可为约0.0001至约1g/kg所治疗的个体的体重/天、约0.0001至约0.001g/kg体重/天或约0.01mg至约1g/kg体重/天。在示例性实施方案中，所述剂量可以是每周总剂量，约1mg至约40mg、或约4mg至约30mg、或约4至约20mg、或约10至约20mg、或约12mg至约30mg。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含本申请的任何类似物，其纯度水平适合用来给予患者。在一些实施方案中，所述类似物具有至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的纯度水平，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在一些方面，药物组合物包含浓度为至少A的本申请的类似物，其中A为约0.001mg/ml、约0.01mg/ml、约0.1mg/ml、约0.5mg/ml、约1mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约6mg/ml、约7mg/ml、约8mg/ml、约9mg/ml、约10mg/ml、约11mg/ml、约12mg/ml、约13mg/ml、约14mg/ml、约15mg/ml、约16mg/ml、约17mg/ml、约18mg/ml、约19mg/ml、约20mg/ml、约21mg/ml、约22mg/ml、约23mg/ml、约24mg/ml、约25mg/ml或更高。在一些实施方案中，所述药物组合物包含浓度为至多B的类似物，其中B为约30mg/ml、约25mg/ml、约24mg/ml、约23mg/ml、约22mg/ml、约21mg/ml、约20mg/ml、约19mg/ml、约18mg/ml、约17mg/ml、约16mg/ml、约15mg/ml、约14mg/ml、约13mg/ml、约12mg/ml、约11mg/ml、约10mg/ml、约9mg/ml、约8mg/ml、约7mg/ml、约6mg/ml、约5mg/ml、约4mg/ml、约3mg/ml、约2mg/ml、约1mg/ml或约0.1mg/ml。在一些实施方案中，所述组合物可包含浓度范围为A至B mg/ml的类似物，例如，约0.001至约30.0mg/ml。
靶向形式
本领域技术人员能容易地理解到，可以以任何方式修饰本申请的类似物，使得本申请类似物的治疗或预防功效可通过修饰而增强。例如，本申请的类似物可直接与靶向部分缀合或经过连接物间接与靶向部分缀合。将化合物(例如本文所述的胰高血糖素类似物)与靶向部分缀合的方法为本领域所公知。参见，例如，Wadhwa et al.,J DrugTargeting,3,111-127(1995)以及美国专利第5,087,616号。如本文所使用，术语“靶向部分”表示能特异性地识别并结合细胞表面受体的任何分子或试剂，使得所述靶向部分引导本申请类似物递送至表面表达所述受体(胰高血糖素受体、GLP-1受体)的细胞群体。靶向部分包括，但不限于，抗体或其片段、肽、激素、生长因子、细胞因子以及能与细胞表面受体结合(例如，上皮细胞生长因子受体(EGFR)、T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、CD28、血小板衍生的生长因子受体(PDGF)，烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)等)的任何其他天然或非天然配体。如本文所使用，“连接物”为能使两个分开的实体彼此结合的键、分子或分子的基团。连接物可提供两个实体之间优化的间隔，或可进一步提供允许两个实体彼此分开的不稳定的连接。不稳定的连接包括光可裂解基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分以及酶可裂解基团。在一些实施方案中，术语“连接物”表示能将本申请的类似物与靶向部分桥接的任何试剂或分子。本领域技术人员可知，本申请类似物上对其功能非必需的位点为理想的用于连接连接物和/或靶向部分的位点，只要连接物和/或靶向部分在连接至本申请的类似物后，不影响本申请的类似物的功能，即，刺激细胞分泌cAMP从而治疗糖尿病或肥胖症的功能。
控释制剂
可选地，本文所述的胰高血糖素类似物可被修饰为贮库形式，使得本申请的类似物释放至给药个体体内的方式是在时间以及体内位置方面受到控制(参见如美国专利4,450,150)。例如，本申请类似物的贮库形式可为可植入的组合物，其包含本申请的类似物以及多孔或无孔材料，例如聚合物，其中本申请的类似物被封装于或扩散于材料和/或无孔材料的降解。然后，所述贮库被植入体内所需的位置，本申请的类似物从该植入物以预定的速率释放。
在示例性方面，所述药物组合物经修饰后具有任何类型的体内释放性质。在一些方面，所述药物组合物即时释放、受控释放、持续释放、延长释放、延后释放或双相释放剂型。配制受控释放的肽的方法为本领域所公知。参见如Qian et al.,J Pharm374：46-52(2009)以及国际专利申请公开WO2008/130158、WO2004/033036、WO2000/032218；以及WO1999/040942。
本申请的组合物可进一步包含如胶束或脂质体，或其他封装形式，或以延长释放形式的给药，以提供延长的贮存和/或递送效果。本申请的药学制剂可根据任何方案进行给药，例如，每天(每天1次、每天2次、每天3次、每天4次、每天5次、每天6次)、每周三次、每周二次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每周、两周一次、三周一次、每月一次或每两个月一次。
组合
本发明所描述的胰高血糖素类似物可单独给药或与其他治疗剂联合给药，所述其他治疗剂是用来治疗或预防本申请所描述的任何疾病或医学状态。例如，本文所述的胰高血糖素类似物可与抗糖尿病或抗肥胖药剂共同给药(同时或相继)。本领域公知或研究中的抗糖尿病药剂包括胰岛素、瘦素、肽YY(PYY)、胰肽(PP)、纤维母细胞生长因子21(FGF21)、Y2Y4受体激动剂、磺酰脲类，例如甲苯磺丁脲(Orinase)、乙酰苯磺酰环己脲(Dymelor)、杜拉唑胺(Tolinase)、氯磺丙脲(Diabinese)、克吡噻(Glucotrol)、甘布若(Diabeta、Micronase、Glynase)、格列美脲(Amaryl)或格列齐特(Diamicron)，氯茴苯酸类，例如瑞格列耐(Prandin)或拿贴葛奈(Starlix)，双胍类，例如二甲双胍(Glucophage)或苯乙双胍，硫偶氮啶二酮类，例如罗格列酮(Avandia)、吡格列酮(Actos)或曲格列酮(Rezulin)，或其他PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的葡萄糖苷酶抑制剂，例如米格列醇(Glyset)、阿卡波糖(Precose/Glucobay)，艾塞那肽(Byetta)或普兰林肽，二肽蛋白酶-4(DPP-IV)抑制剂，例如维达格利普丁或西塔葛菌素，SGLT1(钠离子依赖型葡萄糖转运蛋白1)抑制剂，葡萄糖激酶活化剂(GKA)，胰高血糖素受体拮抗剂(GRA)，或果糖-1,6-双磷酸酶(FBPase)抑制剂。
本领域公知的或研究中的抗肥胖药剂包括食欲抑制剂，包括苯乙胺型兴奋剂、芬特明(任选为芬氟拉明或右芬氟拉明)、二乙基丙酸(
Figure BDA0000369878840001371
)、苯二甲吗啉(
Figure BDA0000369878840001372
、
Figure BDA0000369878840001373
)、苄非他明(
Figure BDA0000369878840001374
)、西布曲明(
Figure BDA0000369878840001376
、
Figure BDA0000369878840001377
)；利莫那班()、其他类大麻受体拮抗剂，调酸素，盐酸氟西汀(Prozac)；Qnexa(托吡酯和芬特明)、Excalia(安非他酮和唑尼沙胺)或Contrave(安非他酮和纳曲酮)；或脂酶抑制剂，类似于XENICAL(奥利司他)或西替利司他(还称ATL-962)，或GT389-255。
在一些实施方案中，本申请所描述的肽与用来治疗非酒精性脂肪肝病或NASH的药剂共同给药。用来治疗非酒精性脂肪肝病的药剂包括熊果酸脱氧胆酸(也称为Actigall、URSO以及Ursodiol)，甲福明(Glucophage)、罗格列酮(Avandia)、安妥明、吉非罗齐、多黏菌素B以及甜菜碱。
在一些实施方案中，本申请所描述的肽与用来治疗神经退行性疾病(如帕金森氏症)的药剂共同给药。抗帕金森氏症药剂为本领域所公知，且包括，但不限于，左旋多巴、甲基多巴肼、抗胆碱能药、溴隐亭、普拉克索以及罗平尼咯、金刚烷胺以及雷沙吉兰。
鉴于前述内容，本申请进一步提供还包含这些其他治疗剂之一的药物组合物以及试剂盒。另外的治疗剂可与本申请的类似物同时或相继给药。在一些方面，所述类似物是在其他治疗剂给药之前进行给药，另一方面，所述类似物在其他治疗剂给药之后进行给药。
用途
基于本文首次提供的信息，能考虑到本申请的组合物(例如相关的药物组合物)可用于治疗这样的疾病或医学状态，其中例如，在GIP受体、GLP-1受体或两者缺乏活性是所述疾病或医学状态发生和/或进展的因素。因此，本申请提供治疗或预防患者中的疾病或医学状态的方法，其中所述疾病或医学状态的发生和/或进展与缺乏GIP受体活化和/或GLP-1受体活化相关。所述方法包括向患者提供足以治疗或预防所述疾病或医学状态的量的本文所述的任何组合物或缀合物。
在一些实施方案中，所述疾病或医学状态为代谢综合征。代谢综合征还称代谢综合征X、胰岛素抵抗综合征、雷文氏综合征，是影响超过五千万美国人的疾病。代谢综合征的典型特征为具有下列风险因子中至少三项或更多项：(1)腹部肥胖(腹部内或周围有过量脂肪组织)；(2)致动脉粥样化的血脂异常(血脂肪病症包括高水平的甘油三酯、低水平的HDL胆固醇、高水平的LDL胆固醇，其增加斑块在动脉壁的累积)；(3)血压升高；(4)胰岛素抵抗或葡萄糖不耐受；(5)易血栓状态(如血液中有高水平纤维蛋白原或纤维蛋白溶酶原活化抑制剂1)；以及(6)易炎症症状态(如血中C-反应蛋白升高)。其他风险因子可包括衰老、激素失衡及遗传倾向性。
代谢综合征与冠心病及与动脉粥状斑块累积相关的其他疾病的风险增加有关，所述其他疾病例如中风或周边血管疾病，称为动脉粥样心血管疾病(ASCVD)。代谢综合征的患者可以从早期的胰岛素抵抗发展为真正的二型糖尿病，ASCVD的风险进一步增加。不受任何特定理论的限制，胰岛素抵抗、代谢综合征及心血管疾病之间的关系可涉及一个或多个同时发生的病理机制，包括胰岛素刺激血管舒张受损、胰岛素抵抗相关的、因氧化应激增加而导致NO利用性的降低以及脂肪细胞衍生激素的异常，例如脂联素(Lteif and Mather,Can.J.Cardiol﹑20(suppl.B):66B-76B(2004))。
根据2001年国家胆固醇教育计划的成人治疗准则(ATP III)，同一个体具有下列任何三个性状则符合代谢综合征标准：(a)腹部肥胖(男性腰围超过102cm，女性腰围超过88cm)；(b)血清甘油三酯(150mg/dl或更高)；(c)HDL胆固醇(男性为40mg/dl以下，女性为50mg/dl以下)；(d)血压(130/85或更高)；(e)空腹血糖(110mg/dl或更高)。根据世界卫生组织(WHO)，具有高胰岛素水平(快速升高的血糖或仅餐后升高的血糖)以及下列至少两项标准的个体符合代谢综合征标准：(a)腹部肥胖(腰臀比大于0.9，身体质量指数至少30kg/m2，或腰围超过37英寸)；(b)胆固醇参数显示甘油三酯至少150mg/dl或HDL胆固醇低于35mg/dl；(c)血压为140/90或更高，或正在治疗高血压。(Mathur,Ruchi,“Metabolic Syndrome,”ed.Shiel,Jr.,William C.,MedicineNet.com,May11,2009)。
为本文的目的，若个体符合2001年国家胆固醇教育计划的成人治疗准则或WHO指定的标准之一或两者，则所述个体视为患有代谢综合征。
不受任何特定理论的限制，本文所述的组合物和缀合物可用于治疗代谢综合征。因此，本发明提供预防或治疗个体中代谢综合征的方法或降低其1、2、3或更多风险因子的方法，包括将本文所述的组合物以能有效预防或治疗代谢综合征或其危险因子的量提供给个体。
在一些实施方案中，所述方法用于治疗高血糖医学状态。在示例性方面，所述高血糖医学状态为糖尿病、一型糖尿病、二型糖尿病或妊娠糖尿病，包括胰岛素依赖型或非胰岛素依赖型。在一些方面，本方法通过减少糖尿病的一个或多个并发症(包括肾病、视网膜病以及心血管病)来治疗高血糖医学状态。
在一些方面，所述疾病或医学状态为肥胖症。在一些方面，所述肥胖症为药物引发的肥胖症。在一些方面，此方法通过预防或降低患者的体重增加或增加体重减少来治疗肥胖症。在一些方面，所述方法通过降低食欲、减少进食量，降低患者体内的脂肪水平或降低食物通过消化系统中的移动速率来治疗肥胖症。
由于肥胖症与其他疾病的发生或进展相关，治疗肥胖症的方法可进一步用于减少与肥胖症相关的并发症，包括心血管疾病(冠状动脉疾病、中风、周围血管疾病、缺血再灌注等)、高血压、二型糖尿病的发生、高血脂以及肌肉骨骼疾病。因此，本申请提供治疗或预防这些肥胖症相关并发症的方法。
在一些实施方案中，所述疾病或医学状态为非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。非酒精性脂肪肝病(NAFLD)指多种类型的肝脏疾病，从单纯脂肪肝(脂肪变性)到非酒精性脂肪肝炎(NASH)到肝硬化(不可逆的，肝脏晚期瘢痕形成)。所有NAFLD阶段的共性在于肝脏细胞(肝细胞)内的脂肪积累(脂肪浸润)。单纯脂肪肝是某些类型的脂肪、甘油三酯在肝脏细胞中的异常积累，无炎症或瘢痕。在NASH中，脂肪积累与不同程度的肝脏炎症(肝炎)及瘢痕形成(纤维化)有关。所述炎症细胞可破坏肝细胞(肝细胞坏死)。在术语“脂肪肝炎”及“脂肪坏死”中，脂肪是指脂肪浸润，肝炎是指肝脏炎症，坏死是指遭破坏的肝脏细胞。NASH最终可导致肝脏瘢痕形成(纤维化)，以及随后的不可逆的晚期瘢痕(肝硬化)。由NASH所造成的肝硬化是NAFLD系列中最终且最严重的阶段。(Mendler,Michel,“Fatty Liver：Nonalcoholic Fatty Liver Disease(NAFLD)and Nonalcoholic Steatohepatitis(NASH),”ed.Schoenfield,Leslie J.,MedicineNet.com,August29,2005)。
酒精性肝病或酒精诱导性肝病包括三种生理上不同的肝脏疾病，其与过量酒精摄取有关或由过量酒精摄取造成：脂肪肝(脂肪变性)、慢性或急性肝炎，以及肝硬化。酒精性肝炎可从轻度肝炎(异常实验室测试结果是其唯一指征)至严重肝功能异常(伴随并发症，例如黄疸(因胆红素滞留所导致的皮肤发黄)、肝性脑病变(因肝脏衰竭所导致的神经功能异常)、腹水症(腹部液体堆积)、出血性食道静脉曲张(食道静脉曲张)，异常血液凝固及昏迷)。在组织学上，酒精性肝炎的表征为肝脏细胞气球样退化、具有嗜中性粒细胞的炎症，以及有时有马洛里氏小体(细胞中间丝蛋白的异常聚集)。肝硬化的解剖学特征是遍布于肝脏的节结兼具有纤维化。(Worman,Howard J.,“Alcoholic Liver Disease”,Columbia University Medical Center website)。
不受限于任何特定理论，本文所述的组合物及缀合物可用于治疗酒精性肝病、NAFLD或其任何阶段，包括例如脂肪变性、脂肪肝炎、肝炎、肝炎症反应、NASH、肝硬化或其并发症。因此，本申请提供预防或治疗个体酒精性肝病、NAFLD或其任何阶段的方法，包括将本文所述组合物以能有效预防或治疗酒精性肝病、NAFLD或其任何阶段的量提供给所述个体。这类治疗方法包括降低下列的1、2、3或更多项：肝脂肪含量、肝硬化的发生或进展、肝细胞癌的发生、炎症指标，例如异常肝脏酶水平(如天冬氨酸转胺酶(AST)和/或丙氨酸转胺酶(ALT)，或乳酸去氢酶(LDH))、血清铁蛋白升高、胆红素升高和/或纤维化指标，例如TGF-β水平升高。在示例性实施方案中，所述组合物用于治疗发展超过单纯性脂肪肝(脂肪变性)并显现炎症或肝炎指征的患者。这类方法可导致，例如，AST和/或ALT水平降低。
GLP-1以及exendin-4已被证实具有一定的神经保护效果。本申请还提供本文所述组合物在治疗神经退行性疾病中的用途，所述神经退行性疾病包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、其他脱髓鞘相关疾病、老年痴呆症、皮质下痴呆、动脉硬化性痴呆、后天免疫不全相关痴呆或其他痴呆症、中枢神经系统恶性肿瘤、创伤性脑损伤、脊髓损伤、中风或脑缺血、脑血管炎、癫痫症、亨廷顿氏症、妥瑞氏症、吉巴综合征、威尔逊症、皮克氏症、神经炎症疾病、脑炎、脑脊髓炎或病毒性、真菌性或细菌性脑膜炎，或中枢神经系统感染、传染性蛋白颗粒疾病、小脑共济失调症、小脑退化、脊髓小脑退化症、弗利德氏失调症、毛细管扩张性运动失调、脊髓性肌肉萎缩症、渐进性核上神经麻痹、肌张力不全症、肌肉痉挛、颤抖、色素沉着性视网膜炎、纹状体黑质退化症、粒线体脑肌病、神经元蜡样脂褐质储积症、肝性脑病变、肾性脑病变、代谢性脑病变、毒素诱导性脑病变，及放射线诱导性脑损害。
在一些实施方案中，所述组合物与向医院环境中的非糖尿病患者(例如，给予接受胃肠外营养或全胃肠外营养的患者)胃肠外给予营养素联合使用。非限制性实例包括手术患者、昏迷患者、患消化道疾病或无功能消化道的患者(例如因手术移除、阻塞、吸收能力受损)、克隆氏症、溃疡性大肠炎、胃肠道阻塞、胃肠道瘘管、急性胰脏炎、缺血性肠病、胃肠道大手术、某些先天胃肠道畸形、长时间腹泻、手术导致的短肠综合征、休克患者，正经历痊愈过程的患者常接受胃肠外给予碳水化合物以及脂质、电解质、矿物质、维生素及氨基酸的各种组合。包含本文所述的GIP激动剂肽以及胰高血糖素拮抗剂肽的组合物以及胃肠外营养素组合物可同时给予，或不同时给予，分别先后给予，只要胃肠外营养素组合物被消化时所述组合物能发挥所需的生物学效应。例如，胃肠外营养素可每天给予1、2或3次，所述组合物的给药为每2天1次、每周三次、每周二次、每周一次、每二周一次、每三周一次或每月一次。
如本文所使用的术语“治疗”包括预防具体病症或疾病状态、或减轻具体病症或疾病状态的症状、和/或预防或消除所述症状。例如，如本文所使用的术语“治疗糖尿病”一般指朝正常水平的方向改变血糖水平，并可视给定情况包括升高或降低血糖水平。
如本文所使用，“有效量”或“治疗有效量”的胰高血糖素肽表示无毒性、但足以使所述肽提供所需功效的量。例如，一种所需功效是能预防或治疗低血糖症，例如，通过提高血糖水平。本申请的胰高血糖素肽能的另一个所需功效包括治疗高血糖症，例如，使测量的血糖水平改变接近正常，或诱导体重下降/预防体重增加，例如，测量到体重降低，或预防或降低体重增加，或使体脂分布正常化。“有效”量在个体之间不同，这取决于个体的年龄及一般情况，给药模式等等。因此，并非一定可以指定精确的“有效量”。然而，任一个案中的“有效量”可由本领域技术人员利用例行实验确定。
个体
关于上述治疗方法，所述患者为任何个体。在一些实施方案中，所述个体为哺乳动物。如本文所使用，术语“哺乳动物”表示哺乳类的任何脊椎动物，包括但不限于，任何单孔类、有袋类以及胎盘类。在一些实施方案中，所述哺乳动物为啮齿目的哺乳动物，例如小鼠以及仓鼠，以及兔形目的哺乳动物，例如兔。在示例性实施方案中，哺乳类为食肉目，包括猫以及犬。在示例性实施方案中，所述哺乳动物为偶蹄目，包括牛以及猪，或奇蹄目，包括马。在一些情况下，所述哺乳动物为灵长目、新世界猴或猕猴，或类人猿目(人以及猿)。在具体实施方案中，所述哺乳动物为人。
试剂盒
根据一实施方案，本申请的胰高血糖素类似物可作为试剂盒的一部分。因此，在一些实施方案中，提供用来给予有需要的患者胰高血糖素类似物的试剂盒，其中所述试剂盒包含本文所述的胰高血糖素类似物。
在一实施方案中，伴随所述试剂盒提供了用来给予个体所述胰高血糖素类似物的装置。在一些方面，所述装置为注射器针、笔式装置、喷射注射器或其他无针注射器。所述试剂盒可选地或另外地包括一个或多个容器，例如药瓶、管、瓶子、单室或多室预填充注射器、药筒、输注泵(外部或植入式)、喷射注射器、预填充笔式装置等，任选地容纳冻干形式或水性形式的胰高血糖素类似物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含使用说明书。根据一实施方案，所述试剂盒的装置为气雾剂分散装置，其中所述组合物预装于所述气雾剂装置内。在另一实施方案中，所述试剂盒包含注射器与针，在一实施方案中，无菌胰高血糖素组合物预装于注射器中。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含使用说明。在一些方面，所述使用说明包含本文所述的任何方法的使用说明。所述使用说明可另外包含维持健康饮食和/或锻炼计划的说明。所述说明可为书面手册的形式，或电子文件的形式，例如，包含所述说明的计算机可读存贮装置。
下列实施例仅用来说明本发明，不是在任何方面限制本发明的范围。
实施例
实施例1
以下提供合成本申请的肽类似物的示例性方法
胰高血糖素的肽片段的合成
材料：
实施例中所描述的所有肽均为酰胺化，除非另有说明。
MBHA树脂(4-甲基二苯甲胺聚苯乙烯树脂)用于肽合成。MBHA树脂，100-180网目，1%DVB交联聚苯乙烯；装载0.7-1.0mmol/g)、Boc保护氨基酸及Fmoc保护氨基酸购自Midwest Biotech。在AppliedBiosystem430A肽合成仪上、利用Boc保护氨基酸进行固相肽合成。利用Applied Biosystems Model433肽合成仪进行Fmoc保护氨基酸的合成。
肽合成(Boc氨基酸/HF切割)：
这些类似物的合成是在Applied Biosystem Model430A肽合成仪进行的。通过依次将氨基酸添加至含有2mmol Boc保护氨基酸的芯(cartridge)中而构建合成的肽。具体地，所述合成是利用Boc DEPBT-活化的单偶联进行的。在偶联步骤的最后，以TFA处理肽树脂以去除N端的Boc保护基团。用二甲基甲酰胺(DMF)反复洗涤，将该重复循环重复所需的偶联步骤数。组装之后，以20%哌啶处理去除侧链保护Fmoc，接着用DIC进行酰基化。在整个合成的最后，以二氯甲烷(DCM)干燥所述肽树脂，并用无水氢氟酸将肽自树脂切割下来。
关于内酰胺化，对Glu以及Lys选择正交保护基(例如Glu(Fm)，Lys(Fmoc))。去除保护基后、在HF切割前，如先前所描述进行环化作用(例如国际专利申请公开WO2008/101017)。
肽树脂的HF处理
使用无水氢氟酸处理所述肽树脂，通常能获得约350mg(约50%产率)的粗制去保护肽。具体地，将所述肽树脂(30mg至200mg)置于氢氟酸反应容器进行切割。添加500μl的对甲酚(p-cresol)至所述容器作为碳阳离子清除剂。所述容器连接至氢氟酸系统，并浸于甲醇/干冰混合物中。用真空泵将所述容器抽真空，并将10ml氢氟酸蒸馏至所述反应容器。在建立真空之后，将肽树脂和氢氟酸的反应混合物于0℃搅拌一小时，然后快速移除氢氟酸(10至15分钟)。将所述容器小心地移动，并填充约35ml乙醚以沉淀所述肽并提取对甲酚及因氢氟酸处理所产生的小分子有机保护基。利用特氟龙滤器过滤所述混合物，并重复两次以移除所有过量甲酚。弃掉滤液。将所述沉淀的肽溶解于约20ml的10%乙酸(aq)中。收集包含所需肽的滤液并冻干。
在以下条件下进行粗制的溶解肽的分析型HPLC分析：4.6×30mmXterra C8，1.50ml/min，220nm，A缓冲液：0.1%三氟乙酸(TFA)/10%丙烯腈(ACN)，B缓冲液：0.1%TFA/100%ACN，梯度为15分钟内5-95%的B。将提取物用水稀释两倍，并上样至2.2×25cm Vydac C4预制反相柱，利用Waters HPLC系统(A缓冲液：0.1%TFA/10%ACN，B缓冲液：0.1%TFA/10%ACN，梯度为120分钟内0-100%的B，流速15.00ml/min)用乙腈梯度洗脱。纯化的肽的HPLC分析显示出大于95%的纯度，并以电喷雾离子化质谱分析(ESI-MS)确认肽的结构。
肽酰基化
按如下制备酰基化的肽制备。利用CS Bio4886肽合成仪或Applied Biosystems430A肽合成仪在固相载体树脂上合成肽。使用Schnolzer et al.,Int.J.Peptide Protein Res.40：180-193(1992)中所述使用原位中和化学法。对于酰基化的肽，待酰基化的目标氨基酸残基(例如相对于SEQ ID NO:3的氨基酸位置编号的第10位)被Nε-FMOC赖氨酸残基所取代。以含20%哌啶的DMF对N端完全BOC保护的肽处理30分钟以去除FMOC/甲酰基。与自由ε-氨基Lys残基的偶联是通过下列方式实现的：将十倍摩尔过量的FMOC保护间隔物氨基酸(例如FMOC-Glu-OtBu)或酰基链(例如CH3(CH2)14-COOH)以及PyBOP或DEPBT偶联试剂于DMF/N,N-二异丙基乙胺(DIEA)中进行偶联。然后去除间隔物氨基酸的FMOC基团，然后重复与酰基链偶联。最后以100%TFA处理，去除任何侧链保护基及N端BOC基团。以5%DIEA/DMF中和肽树脂，干燥肽树脂，然后用95:5的HF/对甲酚于0℃作用1小时，将其从载体切割下来。乙醚提取后，以5%乙酸(HOAc)溶液溶解粗制肽。以ESI-MS确认所述溶液的样本含有正确分子量的肽。通过RP-HPLC、利用线性梯度的10%乙腈(CH3CN)/0.1%TFA至0.1%TFA溶于100%CH3CN纯化正确的肽。Vydac C1822mm×250mm蛋白质柱被用于进行纯化。通常能以20：80的缓冲液比例完全洗脱酰基化的肽类似物。将各部分收集在一起，用分析型RP-HPLC检查纯度。将纯的部分冻干，得到白色固态的肽。
若肽包含内酰胺桥以及待酰基化的目标残基，则按照上文所述通过将氨基酸加至肽主链进行酰基化。
二重酰基化或双酰基化的制备方法如下。利用CS Bio4886肽合成仪或Applied Biosystems430A肽合成仪在固相载体树脂上合成肽。使用Schnolzer et al.,Int.J.Peptide Protein Res.40：180-193(1992)中所述的原位中和化学法。对于两位点双重酰基化的肽，待酰基化的目标氨基酸残基(例如相对于SEQ ID NO:3的氨基酸位置编号的第10与40位)被Nε-FMOC赖氨酸残基所取代。以含20%哌啶的DMF对N端完全BOC保护的肽处理30分钟，去除FMOC/甲酰基。与自由ε-氨基Lys残基的偶联是通过下列方式实现：将十倍摩尔过量的FMOC保护间隔物氨基酸(例如FMOC-Glu-OtBu)或酰基链(例如CH3(CH2)14-COOH)以及PyBOP或DEPBT偶联试剂于DMF/DIEA中进行偶联。然后去除间隔物氨基酸的FMOC基团，然后重复与酰基链偶联。最后以100%TFA处理，去除任何侧链保护基及N端BOC基团。以5%DIEA/DMF中和肽树脂，干燥肽树脂，然后用95:5的HF/对甲酚于0℃作用1小时，将其从载体切割下来。乙醚提取后，以5%HOAc溶液溶解粗制肽。以ESI-MS确认所述溶液的样本含有正确分子量的肽。通过RP-HPLC、利用线性梯度的10%CH3CN/0.1%TFA至0.1%TFA溶于100%CH3CN纯化正确的肽。Vydac C1822mm×250mm蛋白质柱被用于纯化。通常能以20：80的缓冲液比例完全洗脱酰基化的肽类似物。将各部分收集在一起，用分析型RP-HPLC检查纯度。将纯的部分冻干，得到白色固态的肽。
单位点分支二重酰基化的制备方法如下。利用CS Bio4886肽合成仪或Applied Biosystems430A肽合成仪在固相载体树脂上合成肽。使用Schnolzer et al.,Int.J.Peptide Protein Res.40：180-193(1992)中所述的原位中和化学法。对于酰基化的肽，待酰基化的目标氨基酸残基(例如相对于SEQ ID NO:3的氨基酸位置编号的第10位)被Nε-FMOC赖氨酸残基所取代。以含20%哌啶的DMF对N端完全BOC保护的肽处理30分钟，去除FMOC/甲酰基。与Lys残基通过C端的偶联是通过下列方式实现：将十倍摩尔过量的ε-氨基和α-氨基FMOC保护的间隔物氨基酸(例如FMOC-Lys(FMOC)-OH)以及PyBOP或DEPBT偶联试剂于DMF/DIEA中进行偶联。然后去除间隔物氨基酸的FMOC基团，然后将ε-氨基和α-氨基分别与酰基链偶联。最后以100%TFA处理，去除任何侧链保护基及N端BOC基团。以5%DIEA/DMF中和肽树脂，干燥肽树脂，然后用95:5的HF/对甲酚于0℃作用1小时，将其从载体切割下来。乙醚提取后，以5%HOAc溶液溶解粗制肽。以ESI-MS确认所述溶液的样本含有正确分子量的肽。通过RP-HPLC、利用线性梯度的10%CH3CN/0.1%TFA至0.1%TFA溶于100%CH3CN纯化正确的肽。Vydac C1822mm×250mm蛋白质柱被用于纯化。通常能以20：80的缓冲液比例完全洗脱酰基化的肽类似物。将各部分收集在一起，用分析型RP-HPLC检查纯度。将纯的部分冻干，得到白色固态的肽。
单位点线性二重酰基化的制备方法如下。利用CS Bio4886肽合成仪或Applied Biosystems430A肽合成仪在固相载体树脂上合成肽。使用Schnolzer et al.,Int.J.Peptide Protein Res.40：180-193(1992)中所述的原位中和化学法。对于酰基化的肽，待酰基化的目标氨基酸残基(例如相对于SEQ ID NO:3的氨基酸位置编号的第10位)被Nε-FMOC赖氨酸残基所取代。以含20%哌啶的DMF对N端完全BOC保护的肽处理30分钟，去除FMOC/甲酰基。与自由ε-氨基Lys残基的偶联是通过下列方式实现：将十倍摩尔过量的FMOC保护间隔物氨基酸(例如FMOC-Glu-OtBu)或酰基链(例如CH3(CH2)14-COOH)以及PyBOP或DEPBT偶联试剂于DMF/DIEA中进行偶联。然后去除间隔物氨基酸的FMOC基团，然后与在脂肪酸尾部用保护氨基酸官能化的酰基链(例如FmocNH-(CH2)11-COOH)偶联。用含20%哌啶的DMF处理得到的单酰基化的氨基酸，去除FMOC保护基，然后与酰基链偶联。最后以100%TFA处理，去除任何侧链保护基及N端BOC基团。以5%DIEA/DMF中和肽树脂，干燥肽树脂，然后用95:5的HF/对甲酚于0℃作用1小时，将其从载体切割下来。乙醚提取后，以5%HOAc溶液溶解粗制肽。以ESI-MS确认所述溶液的样本含有正确分子量的肽。通过RP-HPLC、利用线性梯度的10%CH3CN/0.1%TFA至0.1%TFA溶于100%CH3CN纯化正确的肽。Vydac C1822mm×250mm蛋白质柱被用于纯化。通常能以20：80的缓冲液比例完全洗脱酰基化的肽类似物。将各部分收集在一起，用分析型RP-HPLC检查纯度。将纯的部分冻干，得到白色固态的肽。
在双位点二重酰基化或单位点二重酰基化的情况下，两个与肽偶联的酰基链可相同或不同。当两者为不同的酰基链时，待酰基化的目标氨基酸肽被两个不同的保护基取代。例如Nε-FMOC赖氨酸残基与Nε-ivDde赖氨酸残基(双位点二重酰基化)或FMOC Lys(ivDde)-OH(单位点二重酰基，852082Novabiochem)。以含20%哌啶的DMF对N端完全BOC保护的肽处理30分钟，去除FMOC/甲酰基。自由的ε-氨基赖氨酸残基与酰基或是间隔物氨基酸偶联，然后与酰基偶联。以2%肼/DMF处理所得的单酰基化肽，以去除(ivDde)保护基。自由氨基赖氨酸残基与酰基或间隔物氨基酸偶联，然后与酰基偶联。以上述方法分离双酰基化的肽。
合成双酰基化肽的实例(胰高血糖素Aib2E16A18L27D28CexK40(C16γE-K-γEC12)G41-酰胺，具有SEQ ID NO:211的氨基酸序列)如图5B所示，并在下文进一步描述。
将0.28g(0.2mmol)的mbha-树脂(Midwest Biotech)置于反应容器中，接着于CSBio336肽合成仪中，以DEPBT/DIEA活化的Boc氨基酸单偶联组装下列序列。
Boc-HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSK(Fmoc)G-mbha树脂
将Boc保护的肽树脂转移至手动反应容器中，以20%哌啶/DMF在室温下处理10分钟。将所述树脂过滤，用DMF洗涤三次，加入FmocLys(ivDde)-OH的活化溶液(EMD-Novabiochem)(之前通过于4.0ml(0.5M)DEPBT/D MF中溶解2mmolFmoc Lys(ivDde)制备，并加入0.35ml(2mmol)DIEA)。
将肽树脂于室温下混合16小时，然后过滤，用DMF洗涤三次，用20%哌啶/DMF处理10分钟。将树脂过滤，用DMF洗涤数次，加入Fmoc Glu-OBzl的活化溶液(之前通过于4.0ml(0.5M)DEPBT/DMF中溶解2mmolFmoc Glu-OBzl制备，并加入0.35ml DIEA)。将反应于室温下混合1小时，然后过滤，用DMF洗涤树脂。再一次用20%哌啶/DMF处理后，将树脂用DMF洗涤数次，并加入棕榈酸的活化溶液以完成第40位侧链赖氨酸的α氨基的酰基化(之前通过将2mmol棕榈酸溶解于4.0ml(0.5M)DEPBT/DMF中并加入0.35ml的DIEA来制备)。将反应混合1小时。
将肽树脂过滤，用DMF洗涤，用2%肼/DMF在室温处理15分钟，过滤后用DMF洗涤数次。加入Fmoc Glu-OBzl活化溶液(与上述相同)，在室温下反应混合1小时。所述树脂分为三份，用于在ε-赖氨酸氨基进行最后的酰基化。在此情况下，向其中的一份加入月桂酸活化溶液。事先将1mmol的月桂酸(Aldrich)溶解于2.0ml(0.5M)DEPBT/DMF中，并加入0.175ml DIEA来制备。此反应混合1小时，过滤，用DMF洗涤，然后用二氯甲烷洗涤。用50%TFA/DCM处理去除N端Boc基团，以5%DIEA/DCM中和后，在冰浴中进行1小时的氢氟酸切割，以对甲酚作为清除剂。将氢氟酸蒸发后，将残余物悬浮在乙醚中，将肽/树脂混合物过滤并以乙醚洗涤。将肽提取到乙酸水溶液中，并以HPLC分析(4.6×50mm Zorbax SB-C8,1ml/min,45℃,214nm(0.5A)A=0.1%TFA,B=0.1%TFA/90%ACN)。将剩余的切割提取物上样至21.2×250mm Amberchrom XT20柱，在Pharmacia FPLC上运行0.1%TFA/乙腈梯度进行纯化。
将组分83至86组合起来，冷冻、干燥后，得到22.3mg的SEQ IDNO:211的肽，其纯度为90%+。理论的分子量=5202.9，ESI检测所得的质量为5202.0。
通过琥珀酰化的肽酰基化
琥珀酰化肽的制备方法如下。利用CS Bio4886肽合成仪或Applied Biosystems430A肽合成仪在固相载体树脂上合成肽。使用Schnolzer et al.,Int.J.Peptide Protein Res.40：180-193(1992)中所述的原位中和化学法。对于琥珀酰化的肽，待酰基化的目标氨基酸残基(例如相对于SEQ ID NO:3的氨基酸编号的第10位)被Nε-FMOC赖氨酸残基所取代。以含20%哌啶的DMF对N端完全BOC保护的肽处理10分钟，去除FMOC/甲酰基。将所述树脂过滤，以DMF/DCM洗涤，并重新悬浮于DCM中。与自由ε-氨基Lys残基的偶联是通过下列方式实现：将十倍摩尔过量的正十六烷基琥珀酸酐(TCl)与4-二甲基氨基吡啶(DMAP)偶联。将树脂混合过夜，过滤，用DCM洗涤，并用50%TFA/DCM处理以去除任何侧链保护基及N端BOC。以5%DIEA/DMF中和肽树脂，干燥肽树脂，以95:5的HF/对甲酚于0℃作用1小时，将其从载体切割下来。乙醚提取后，以5%HOAc溶液溶解粗制肽。通过HPLC分析确认所述溶液的样本。将剩余的乙酸溶液上样至10×250mm Amberchrom XT20柱进行纯化。在运行TFA/ACN水溶液梯度，同时收集组分并在214nm下监测UV。将纯的部分冻干，得到固态的肽。
合成琥珀酰化肽的实例(胰高血糖素Aib2E16A18L27D28CexK40(C16琥珀酰)G41-酰胺，具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列)如图3C所示，并在下文进一步描述。
将0.28gm(0.2mmol)的mbha-树脂(Midwest Biotech)置于反应容器中，在CSBio336肽合成仪中，利用DEPBT/DIEA活化单偶联组装下述序列。
Boc-HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSK(Fmoc)G-mbha树脂
将约三分之一Boc保护的肽树脂转移至手动反应容器中，用20%哌啶/DMF室温下处理10分钟。将树脂过滤，用DMF洗涤三次，用氯甲烷洗涤两次，并重悬浮于10ml的DCM中。加入324mg(1mmol)的正十六烷基琥珀酸酐(TCI)以及2至3mg的4-二甲基氨基吡啶(Aldrich)。
将树脂于室温下混合过夜，然后过滤，用DMF洗涤二次，用50%TFA/DCM处理1至2分钟。将树脂过滤，用DCM洗涤数次，通过5%DIEA/DCM洗涤进行中和，并转移至氢氟酸反应容器。用5ml的液态氢氟酸与0.5ml的对甲酚清除剂进行氢氟酸切割。在冰浴中搅拌1小时后，真空去除氢氟酸并将残余物悬浮于乙醚中。用烧结的玻璃漏斗过滤悬浮物，用乙醚洗涤固体，并将肽提取到15ml的50%乙酸水溶液中。HPLC分析后(4.6×50mm Zorbax SB-C8,1ml/min,45℃,214nm,A=0.1%TFA,B=0.1%TFA/90%ACN，梯度=10分钟内30%B至90%B)，将切割提取物上样至21.2×250mm Amberchrom XT20柱进行纯化。运行TFA/乙腈水溶液梯度，同时收集组分并监测UV吸光度。组分55至56经鉴定为单一组分，并将其冷冻干燥。回收得到32.5mg纯度90%+的产物(DLS-027-68B)。理论的分子量=4720.3，ESI检测所得的质量为4717.0。
肽烷基化(例如，S-烷基化)
合成烷基化(例如S-烷基化)肽的实例(胰高血糖素Aib2E16A18L27D29Cex Cys40(S-2棕榈基)酰胺，具有SEQ ID NO:164的氨基酸序列)如图6所示，并在下文进一步描述。
将0.28gm(0.2mmol)的mbha-树脂(Midwest Biotech)置于CSBio反应容器中，在CSBio336肽合成仪中，利用DEPBT/DIEA活化单偶联组装下述序列。
HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSC-酰胺
将肽树脂转移至氢氟酸反应容器，用10ml的液态氢氟酸与1ml的对甲酚清除剂于冰浴中反应1小时，进行氢氟酸切割。将氢氟酸蒸发后，将残余物悬浮于乙醚中，将肽与树脂在烧结的玻璃漏斗过滤。用乙醚洗涤并快速风干后，将肽提取到50%乙酸水溶液中。HPLC分析后(4.6×50mm Zorbax SB-C8,1ml/min,45℃,214nm(0.5A)A=0.1%TFA,B=0.1%TFA/90%ACN,30%至90%B，10min)。将切割提取物用水稀释3至4倍，上样至22.2×250mm Amberchrom XT20柱，用aq TFA/CAN梯度进行纯化，将起始反应池在相同柱上再纯化，得到产物79mg，纯度95%。理论的分子量=4313.7，ESI检测所得的质量为4312.0
将16mg(3.7μmol)的上述自由巯基肽悬浮于1ml的甲醇中，伴随氮气流下搅拌，加入配制于1ml甲醇(MeOH)中的1.5μl四甲基胍，然后加入配制于0.5mg四氢呋喃(THF)中的3mg(7.8μmol)2-碘十六烷酸(2-碘棕榈酸)。2-碘十六烷酸是事先通过用溶于丙酮(DLS-027-52)的碘化钾处理2-溴十六烷酸制备而得的。烷基化反应加热10分钟，期间大部分溶剂蒸发。将残余物溶解于乙酸水溶液，用HPLC分析，并发现其疏水性高于起始肽。将剩余的乙酸溶液上样至10×250mmAmberchrom XT20柱进行纯化。运行aq.TFA/ACN梯度，同时收集组分中并监测214nm下的UV。将组分64至68组合起来，冷冻干燥后得到6.1mg材料(SEQ ID NO:164的肽)，其纯度为90%+。理论的分子量=4568.1，MALDI检测所得的质量为4568.79。
当肽的C端包含赖氨酸而非半胱氨酸时，可将肽可制备有主链赖氨酸。待N烷基化的目标氨基酸残基被Nε-FMOC赖氨酸残基所取代。用含20%哌啶的DMF对N端完全BOC保护的肽处理30分钟，去除赖氨酸残基的FMOC/甲酰基。将半胱氨酸残基与自由ε-氨基赖氨酸残基偶联。然后，通过如上文所述与2-碘棕榈酸反应将半胱氨酸残基烷基化。
通过“迷你PEG”间隔物的肽酰基化
通过迷你PEG间隔物合成酰基化肽的实例(具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的肽)如下所述：
将0.28gm(0.2mmol)的4-甲基二苯甲按(mbha)树脂(MidwestBiotech,Inc.,Fishers,IN)置于反应容器中，在CSBio336肽合成仪中，利用Boc氨基酸和3-(二乙氧基磷酰基氧基)-3H-苯并[d][1,2,3]三嗪-4-酮/N,N-二异丙基乙胺(DEPBT/DIEA)活化单偶联组装下述序列。
Boc-HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSK(Fmoc)G-mbha
将约三分之一Boc保护肽树脂转移至手动反应容器中，用20%哌啶/二甲基甲酰胺室温下处理10分钟。将树脂过滤，用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤数次，加入Fmoc酰胺PEG4活化溶液(事先通过将487.5mg(1.0mmol)N-Fmoc酰胺dPEG4酸(Peptides International,Louisville,KY)溶解于2.0ml(0.5M)的DEPBT/DMF中并加入0.175ml(1mmol)二异丙基乙胺来制备)。于室温下混合反应约1小时。
将肽树脂过滤，用DMF洗涤，再用20%哌啶/DMF处理10分钟。将树脂过滤，用DMF洗涤数次，加入Fmoc Glu-Obzl活化溶液(事先通过将470mg(1mmol)Fmoc Glu-γ-OBzl(Aapptec,Louisville,KY)溶解于2.0ml(0.5M)DEPBT/DMF中并加入0.175ml(1mmol)DIEA来制备)。于室温下反应混合1小时。
将肽树脂再次过滤，用DMF洗涤，用20%哌啶/DMF在室温下处理10分钟。将树脂过滤，用DMF洗涤数次，加入棕榈酸活化溶液(事先通过将256mg(1mmol)棕榈酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)溶解于2.0ml(0.5M)DEPBT/DMF中并加入0.175ml DIEA来制备)。反应于室温下混合1小时。
最后，将肽树脂过滤，用DMF洗涤，用二氯甲烷洗涤，然后用50%TFA/DCM处理去除N端Boc基团。1至2分钟后，将树脂过滤，用DMF洗涤数次，接着以5%DIEA/DCM溶液洗涤。将风干的肽树脂转移至氢氟酸反应容器，用5ml的液态氢氟酸与0.5ml对甲酚清除剂进行氢氟酸切割。在冰浴中混合1小时后，真空去除氢氟酸并用乙醚悬浮残余物。将肽/树脂混合物在烧结的玻璃漏斗中过滤，用乙醚洗涤，并快速风干。将肽提取到10ml的50%乙酸水溶液，进行HPLC分析(4.6×50mm Zorbax SB-C8,1ml/min,214nm,A=0.1%TFA,B=0.1%TFA/90%ACN,梯度=10分钟内30%B至90%B)。将剩余的粗提物用水稀释三倍，上样至22.2×250mm Amberchrom XT20柱，利用TFA/ACN水溶液梯度进行纯化。将最初的纯化池在相同柱上再纯化，得到19mg纯度90%+的产物。理论的分子量=5010.6，ESI检测的质量为5008.0。
用N-Fmoc酰胺dPEG酸重复相同的步骤。在一个实例中，使用N-Fmoc酰胺dPEG8酸(Peptides International,Louisville,KY)，在另一实例中则使用N-Fmoc酰胺dPEG2酸(Peptides International,Louisville,KY)。酰基化肽的结构如图12A至12C所示。
肽二聚化-二硫键二聚化
合成二硫键二聚肽的实例如下所述：
将0.28gm(0.2mmol)的mbha-树脂(Midwest Biotech)置于CSBio反应容器中，在CSBio336肽合成仪中，利用Boc氨基酸和DEPBT/DIEA活化单偶联组装下述序列。
Boc-HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSK(Fmoc)G-酰胺
将Boc保护的肽树脂转移至手动反应容器中，用20%哌啶/DMF室温下处理10分钟。将树脂过滤，用DMF彻底洗涤，然后用Fmoc Cys(Trt)活化溶液(事先通过将1.17gm(2.0mmol)的Fmoc Cys(Trt)-OH(Aapptec)溶解于4.0ml(0.5M)DEPBT/DMF中并加入0.35ml(2mmol)DIEA来制备)进行酰基化。反应于室温下混合2小时，然后过滤，用DMF洗涤，并以相同步骤加入Fmoc Glu-OBzl，然后加入棕榈酸。
最后，将树脂过滤，用DMF洗涤，用二氯甲烷洗涤，用50%TFA/DCM处理1至2分钟。用5%DIEA/DCM中和后，将肽树脂转移至氢氟酸反应容器，用10ml的液态氢氟酸与1ml的对甲酚清除剂在冰浴中反应1小时进行氢氟酸切割。蒸发氢氟酸后，用乙醚悬浮残余物，将肽及树脂在烧结的玻璃漏斗中过滤。用乙醚洗涤并快速风干后，将肽提取到50%乙酸水溶液中。HPLC分析后(4.6×50mm ZorbaxSB-C8,1ml/min,45℃,214nm,A=0.1%TFA,B=0.1%TFA/90%ACN,30%B至90%B,10分钟)，将切割提取物用水稀释三至四倍，上样至21.2×250mm Amberchrom XT20柱，利用aq.TFA/ACN梯度进行纯化。将纯化组分64至67组合起来，冷冻干燥后，得到58.7mg的材料，HPLC纯度为90%+。
DLS-027-97A理论的分子量=4866.47，ESI检测所得的质量为4864.0。
HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSK(Cys(SH)γE-C16)G-酰胺
将18.6mg(3.8μmol)的上述肽溶解于2.0ml的3M胍/0.05M tris(pH8.5)，加入1ml二甲基亚砜。反应暴露于空气中并于室温搅拌。6小时后，与起始肽相比的分析型HPLC显示存在疏水性更强的峰。
将反应混合物用20ml的0.1%TFA稀释，上样至10×250mmAmberchrom XT20柱。利用0.1%TFA/乙腈梯度进行纯化，同时监测220nm下的UV吸光度。将组分68至72组合起来冻干后得到5.5mg的纯化二聚体。
HPLC纯度为90%+。理论的分子量=9743.99，MALDI检测所得的质量为9745.1。DLS-027-98B。所得二聚体的结构如图9A所示。
肽二聚化-硫醚二聚化
合成硫醚二聚体的实例如下所述：
将0.28gm(0.2mmol)的mbha-树脂(Midwest Biotech)置于反应容器中，在CSBio336肽合成仪中，利用DEPBT/DIEA活化单偶联组装下述序列。
Boc-HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSK(Fmoc)G-mbha
将三分之一Boc保护的肽树脂转移至手动反应容器中，用20%哌啶/DMF在室温下处理10分钟。用DMF洗涤数次后，加入Boc Dap(Fmoc)活化溶液(事先通过将426mg(1mmol)Boc Dap(Fmoc)-OH(Chem-Impex)溶解于2.0ml(0.5M)DEPBT/DMF中并加入0.175ml(1mmol)DIEA来制备)。反应于室温下混合2小时，过滤，用DMF洗涤，并如上文所述用20%哌啶/DMF再处理。DMF洗涤后，以溴乙酸活化溶液(事先通过将139mg(1mmol)溴乙酸(Aldrich)溶解于2.0ml(0.5M)DEPBT/DMF中并加入0.175ml的DIEA来制备)将树脂酰基化。反应于室温下混合1至2小时，然后过滤，用DMF洗涤树脂，接着用DCM洗涤。用50%TFA/DCM于室温下处理肽树脂2分钟，然后过滤，用DCM洗涤，用5%DIEA/DCM进行中和。将得到的肽树脂转移至氢氟酸反应容器，用5ml的液态氢氟酸与0.5ml的对甲酚进行氢氟酸切割。在冰浴中搅拌1小时，蒸发氢氟酸，并用乙醚悬浮残余物。将树脂/肽混合物在烧结的玻璃漏斗中过滤，用乙醚洗涤。将肽提取到50%乙酸水溶液，用HPLC分析粗产物(4.6×50mm Zorbax SB-C8,1ml/min,45℃,214nm,A=0.1%TFA,B=0.1%TFA/90%ACN,梯度=10分钟内30%B至90%B)。将切割提取物上样至21.2×250mm AmberchromXT20柱，利用TFA/乙腈水溶液梯度进行纯化，同时监测220nm下的UV吸光度。将组分48至53组合起来，经冷冻干燥后，得到18mg具有K40的SEQ ID NO:89的肽(Dap-BrAcetyl)，纯度为90%+。理论的分子量=4602.8，ESI检测所得的质量为4616.0。
HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSK(Dap-BrAcetyl)G-酰胺
将15mg(3.2μmol)的上述K40(Dap-BrAcetyl)肽以及15mg SEQID NO:89K40(CysγE-C16)的肽溶解于3.0ml的7M尿素/0.05M tris(pH8.6)，在室温混合，同时监测HPLC反应进程。30分钟后，大部分起始材料的波峰高度减小，同时出现为主要组分的新的波峰。将反应混合物用25ml0.1%TFA稀释，上样至10×250mm Amberchrom XT20柱进行纯化。运行TFA/乙腈水溶液梯度，同时监测220nm下的UV吸光度。将组分57至61组合起来，冷冻干燥后，得到7.1mg的硫醚二聚体。HPLC纯度=90%+，理论的分子量=9401.4，MALDI检测所得的质量为9402.8。二聚体的结构如图9B所示。
肽PEG化
对于肽聚乙二醇化，将40kDa的甲氧基聚(乙二醇)碘乙酰胺(NOF)与摩尔当量的肽在7M尿素，50mM Tris-HCl缓冲液中反应，利用将肽和PEG溶解为澄清的溶液所需的最少溶剂量(通常，对于使用2至3mg肽的反应，需要的溶剂量少于2ml)。在室温下剧烈搅拌4至6小时，用分析型RP-HPLC分析所述反应。PEG化的产物的滞留时间减少，由此可与起始材料区分。使用Vydac C4柱进行纯化，条件与初始肽纯化的条件相似。在50：50的缓冲液比例附近，洗脱开始。寻找纯的PEG化肽的部分并将其冻干。产率大于50%，每次反应所有所不同。使用质谱的分析
利用具有标准ESI离子源的Sciex API-III电喷雾四极棒质谱仪取得质谱。使用的电离条件如下：ESI于正离子模式；离子喷雾电压3.9kV；喷孔电势60V。所用喷雾气体及气帘气为氮气，流速为0.9L/min。在每步0.5Th600至1800Thompsons及2msec驻留时间下记录质谱。将样品(约1mg/ml)溶解于含1%乙酸的50%乙腈水溶液，并通过外部注射泵以5ml/min的速率导入。
当通过ESI-MS分析PBS溶液中的肽时，根据制造商所提供的操作指南(Millipore Corporation,Billerica,MA,见Millipore网站www.millipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737)，先使用含有0.6μl C4树脂的ZipTip固相提取吸管尖进行脱盐。
高效液相色谱(HPLC)分析：
利用高效液相色谱(HPLC)及MALDI分析初步分析这些粗制肽，以得到它们在磷酸缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH7.2)中的相对转化率的大体情况。将粗制肽样品溶解于1mg/ml浓度的PBS缓冲液。将1ml所得溶液保存于1.5ml的HPLC瓶，然后密封并于37℃孵育。在不同时间间隔取出100μl的小份，冷却至室温并进行HPLC分析。
使用Beckman System Gold Chromatography系统，使用214nm的UV检测器进行HPLC分析。在150mm×4.6mm C18Vydac柱上进行HPLC分析。流速为1ml/min。溶剂A含有配制于蒸馏水中的0.1%TFA，溶剂B含有配制于90%CH3CN中的0.1%TFA。使用线性梯度(15分钟内40至70%B)。使用Peak Simple Chromatography软件收集并分析数据。
水解的起始速率用于测量各个前药的解离速率常数。前药及药物的浓度从其各自的峰面积估计。通过作出不同时间间隔下的前药浓度对数图而确定前药的一级解离速率常数。此图中的斜率为速率常数“k”。然后，利用公式t1/2=0.693/k计算不同前药的降解半衰期。
实施例2
本实施例描述测试本申请的肽的生物活性的示例性方法，所述方法涉及测定cAMP合成。
在基于萤火虫荧光素酶的报导基因测定中测量胰高血糖素类似物引发cAMP的能力。将共转染了受体(胰高血糖素受体、GLP-1受体或GIP受体)和连接至cAMP反应元件的荧光素酶基因的HEK293细胞在补充有0.25%牛生长血清(HyClone,Logan,UT)的DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中低血清孵育16小时，接着与胰高血糖素、GLP-1、GIP或是新的胰高血糖素类似物的连续稀释液一起在96孔包被了聚-D-赖氨酸的“Biocoat”微量板(BD Biosciences,San Jose,CA)中、37℃下、5%CO2下孵育5小时。在孵育结束时，将100μl的LucLite发光底物试剂(Perkin Elmer,Wellesley,MA)添加至各孔。轻轻摇动板，避光孵育10分钟，并于MicroBeta-1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)上测量光输出。使用Origin软件(OriginLab,Northampton,MA)计算50%有效浓度(EC50)。
实施例3
本实施例描述测定本申请的肽的稳定性的示例性方法。
将各个胰高血糖素类似物溶于水或PBS中，进行初始HPLC分析。调整pH值(4、5、6、7)后，将样本于37℃孵育一段规定时间并通过HPLC再分析，确定肽的完整性。测定感兴趣的具体的肽的浓度，并且相对初始分析，计算剩余完整百分比。
实施例4
本实施例描述测定本申请的肽的溶解度的示例性方法。
在0.01N HCl中制备胰高血糖素(或类似物)的溶液(1mg/ml或3mg/ml)。用0.01N HCl将100μl的原液稀释为1ml，并测量UV吸光度(276nm)。用200至250μl0.1M的Na2HPO4(pH9.2)将剩余原液的pH调整至7。将溶液于4℃静置过夜，然后离心。用0.01N HCl将100μl的上清液稀释为1ml，并测定UV吸光度(两次重复)。
因体积增加而补偿初始吸光读值，下列计算用来建立百分比溶解度。
Figure BDA0000369878840001581
实施例5
本实施例描述测定肽与受体的结合的示例性方法。
在竞争结合测定中测量肽对胰高血糖素受体的亲和力，利用邻近闪烁测定技术。将用邻近闪烁测定缓冲液(0.05M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCl，0.1%w/v牛血清白蛋白)制备的肽的连续3倍稀释液在白色/透明底96孔板(Corning Inc.,Acton,MA)中与0.05nM(3-[125I]-碘酪胺酰基)Tyr10胰高血糖素(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)(每孔1-6μg)、由过表达人胰高血糖素受体的细胞制备得的细胞质膜片段、以及1mg/孔的经聚乙烯亚胺处理的小麦胚芽A型凝集素邻近闪烁测定珠混合。在旋转振荡器上、800rpm下振荡5分钟后，将板于室温下孵育12小时，然后于MicroBeta1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)上进行读取。测量孔中非特异性结合(NSB)放射性，“冷”天然配体的浓度大于测试样品中的最高浓度4倍，且在没有竞争物的孔中检测总结合放射性。特异性结合百分比按如下计算：特异性结合%=((结合-NSB)/(总结合-NSB))×100。使用Origin软件(OriginLab,Northampton,MA)确定IC50值。
实施例6
基本上以实施例1描述的方法制备至少包含第1位的Tyr、第2位的AIB(用于DPP-IV抗性)、第16位的Lys、第20位的AIB、及第27至29位的Leu、Ala、及Gly的下列肽，并基本上如实施例2所述，体外测试其在GLP-1受体、胰高血糖素受体与GIP受体的激动剂活性：
在GLP-1受体(GLP-1R)、胰高血糖素受体(GR)、与GIP受体(GIPR)的EC50如表1所提供。
表1
Figure BDA0000369878840001591
相对活性是肽的活性相对于天然激素的活性
实施例7
基本上以实施例1描述的方法制备基于mt-263的结构的其他肽mt-395(SEQ ID NO:15)、mt-396(SEQ ID NO:16)、mt-397(SEQ ID NO:17)以及mt-398(SEQ ID NO:18)，并基本如实施例2所述进行体外测试。在GLP-1R、GR、与GIPR的EC50如表2所示。
表2
相对活性是肽的活性相对于天然激素的活性
实施例8
基本上以实施例1描述的方法制备包含第1位的Tyr、第2位的AIB(用于DPP-IV抗性)、第16位的Glu与第20位的Lys(由第16和20位之间的内酰胺桥接)、及第27至29位的Leu-Ala-Gly、以及第30至39位的GPSSGAPPPS的其他肽，并基本如实施例2所述测试其在GLP-1受体、胰高血糖素受体与GIP受体的激动剂活性。制备并测试缺乏内酰胺的其他肽。活性分析结果示于表3。
表3
Figure BDA0000369878840001602
相对活性是肽的活性相对于天然激素的活性
实施例9
基本上由实施例1所述的方法制备本申请的示例性肽类似物。每个肽类似物包含基于天然胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中天然His位于第1位、DPP-IV保护性氨基酸位于第2位、酰基化氨基酸位于第10位、一个或多个α螺旋稳定氨基酸位于肽类似物的第16至21位中、以及其他修饰。所有肽在C端被酰胺化。然后，以实施例2所述的方法，测试这些肽在胰高血糖素受体、GLP-1受体以及GIP受体的活性。表4总结了多种不同活性分析的结果。
表4
Figure BDA0000369878840001621
CEX=GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:5)
酰基=C16酰基
表4中每个肽类似物均表现出在胰高血糖素、GLP-1以及GIP受体的高活性。值得注意的是，每个肽类似物在GIP受体表现出的EC50<0.5nM，大部分肽类似物在GIP受体表现出的EC50<0.1nM。这些肽类似物还在GLP-1受体表现出高活性，EC50≤0.008nM。缺乏第3位Glu的肽在胰高血糖受体表现出高活性，每个肽类似物均表现出EC50<0.03nM。
总地来说，包含位于第20位的AIB、或位于第16位的Glu与C端延伸组合的肽类似物在GIP受体表现出高活性。此外，与第2位包含d-Ser的对应肽类似物相比，在第2位包含AIB的肽类似物通常在GIP受体表现出更好的活性(例如，比较SEQ ID NO:2与3，或SEQ IDNO:5与6在GIP受体的EC50)
实施例10
基本上由实施例1所述的方法制备本申请的示例性肽类似物。这些肽类似物结构相似，包含基于天然胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中天然His位于第1位、DPP-IV保护性氨基酸位于第2位、α螺旋稳定氨基酸位于第16位，但是在本组肽类似物中，酰基化氨基酸存在于不同位置。所有肽在C端均被酰胺化。以实施例2所述的方法，测试这些肽在胰高血糖素受体、GLP-1受体以及GIP受体的活性。表5总结了部分制备并测试的肽的多种不同活性分析的结果。
表5
如表5所示，与SEQ ID NO:42的未酰基化肽类似物相比，在第9和12位中任意位置包含酰基化氨基酸的肽类似物表现出提高的GIP活性。然而，并非所有制备并测试的酰基化肽类似物均表现出提高的GIP活性。在除第9和12位以外的位置酰基化的一个肽即类似物在GIP受体表现出减弱的活性。
实施例11
本实施例描述本申请的示例性胰高血糖素类似物的体内活性。
在饮食诱导肥胖(DIO)小鼠中测试具有SEQ ID NO:28、37至39以及134之一的氨基酸序列的GIP受体活性胰高血糖素类似物的体内活性，并与给予胰高血糖素激动剂类似物或载体对照的小鼠的体内活性比较。每个测试组有十九只小鼠，每只小鼠皮下注射10nmol/kg剂量的肽或载体对照。在给药后第0、1、3、5以及7天测量体重与进食量，同时于第0天与第7天测量空腹血糖水平。在第0天与第7天测量血糖之前，小鼠禁食6小时。另外于给药后第5天测量即时血糖水平。
在给药后七天，与注射载体对照的小鼠相比，所有注射GIP受体活性胰高血糖素类似物的小鼠的体重均显著降低(降低约11%至约27%)。另外，在给药后七天，所有注射GIP受体活性胰高血糖素类似物的小鼠的血糖水平均明显降低(降低约43%至约65%)。
在雄性db/db小鼠中进行另一项研究，分析GIP受体活性胰高血糖素类似物的体内活性。在本研究中，将20nmol/kg剂量的具有SEQID NO:28、31、37、135和136之一之一的氨基酸序列的GIP受体活性胰高血糖素类似物皮下注射至小鼠。将载体对照给予对照组小鼠。在给药前以及给药后第1、2、4、8、24、48以及72小时测定血糖水平。在给药前以及给药后72小时测量体重。与DIO小鼠研究中所观测的结果相符，与载体对照组相比，所有给予GIP受体活性胰高血糖素类似物的小鼠的体重均明显降低(降低约2%至约5%)。此外，所有接受GIP受体活性胰高血糖素类似物的小鼠的血糖水平均降低。
实施例12
本实施例描述其他示例性肽的结构。
基本上如实施例1所描述的方法制备胰高血糖素类似物，表6描述这些类似物的结构。基本上如实施例2所述，测试这些胰高血糖素类似物在胰高血糖素受体、GLP-1受体以及GIP受体的活性。
表6
Figure BDA0000369878840001641
Figure BDA0000369878840001651
实施例13
基本上如实施例1所描述的方法制备胰高血糖素类似物，表7描述这些类似物的结构。基本上如实施例2所述，测试这些胰高血糖素类似物在胰高血糖素受体、GLP-1受体以及GIP受体的活性。
表7
Figure BDA0000369878840001661
实施例14
基本上如实施例1所描述的方法制备胰高血糖素类似物，表8描述这些类似物的结构。这些类似物的完整描述提供在序列表中，表8提供每个类似物的SEQ ID NO。基本上以如实施例2所述的方法，测试这些胰高血糖素类似物在胰高血糖素受体、GLP-1受体以及GIP受体的活性。
Figure BDA0000369878840001662
为了测试这些肽的体内活性，在每周一、三、五，将5或10nmol/kg的表8中的肽(天然肽除外)皮下注射至DIO小鼠(C57B66小鼠)，持续四周。用高脂、致糖尿病饮食喂饲小鼠。如图1所示，与载体对照相比，接受其中一种肽的小鼠体重降低。
实施例15
基本上以实施例1描述的方法制备酰基化的肽，其包含SEQ IDNO:1(天然胰高血糖素)的氨基酸序列，其中第1位为Tyr、第2位为AIB、第3位为Glu、第12位为Ile、第16位为Lys、第17位为Gln、第18位为Ala、第20位为AIB、第21位为Glu、第24位为Asn、第27位为Leu、第28位为Ala、第29位为Gly、然后是氨基酸序列GPSSGSPPPS(SEQ ID NO:5)，并C端为酰胺化。这些肽的酰基化类型、酰基化间隔物类型和/或酰基化氨基酸的位置不同。不同的酰基化残基如图3所描述。基本上以实施例2所述的方法测试这些肽在胰高血糖素受体、GLP-1受体以及GIP受体的体外活性。表9总结了各个肽的结构与活性。
通过下列方法测试表9所列肽的体内活性：在周一、三、五，将10nmol/kg剂量的肽注射入DIO小鼠(平均体重49.0g)，持续一周。在第0、2、4、6及7天测量小鼠体重及摄食量，于第0及7天测量血糖水平。
如图2所示，接受酰基化肽注射的小鼠的总体重到第7天至少下降5%。
实施例16
基本上以实施例1描述的方法制备酰基化的肽，其包含SEQ IDNO:1(天然胰高血糖素)的氨基酸序列，其中第2位为AIB、第16位为Glu(第16位酰基化的情况除外)、第18位为Ala、第27位为Leu、第28位为Asp、第29位为Gly、然后是氨基酸序列GPSSGSPPPS(SEQID NO:5)，且C端为酰胺化。这些肽的酰基化类型、酰基化间隔物类型和/或酰基化氨基酸的位置不同。基本上以实施例2所述的方法测试这些肽在胰高血糖素受体、GLP-1受体以及GIP受体的体外活性。表10总结了各个肽的结构与活性。
Figure BDA0000369878840001701
Figure BDA0000369878840001711
实施例17
测试从表10中选择的肽(SEQ ID NO:145、148以及152)以及SEQID NO:28与29的肽在高脂致糖尿病饮食的DIO小鼠(初始平均体重58.0g)的体内活性。在第0天及第3天皮下注射10nmol/kg剂量(按照初始平均体重)的肽。于第0、1、3、5、及7天测量小鼠体重及摄食量，于第0天及第7天测量血糖水平。
如图4所示，与载体对照相比，接受一种肽注射的小鼠的体重在7天期间中降低。到第7天，接受肽注射的小鼠的总体重减少至少5%，其中两只小鼠到第7天的总体重减少至少10%。
实施例18
基本上如实施例1所述方法制备包含“迷你PEG”间隔物的酰基化肽。图12提供了这些酰基化肽的结构的示意图。基本上以实施例2所述的方法测试这些包含迷你PEG间隔物的肽在胰高血糖素受体、GLP-1受体以及GIP受体的体外活性，并比较其与未包含间隔物或包含E间隔物的酰基化肽的活性。本实验中的所有肽包含天然胰高血糖素的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，其中第2位为AIB、第16位为Glu、第18位为Ala、第28位为Leu、第28位为Asp、第29位为Gly、然后是氨基酸序列GPSSGSPPPSK(SEQ ID NO:9)，其中K为酰基化氨基酸，且C端为酰胺化。表11总结了各个肽的结构与活性。
Figure BDA0000369878840001731
实施例19
制备双酰基化肽。两个肽包含单酰基化氨基酸残基，该残基携带两个分支形式的酰基化：一个肽在第10位具有分支酰基化，第二个肽在第40位具有分支酰基化。图5(上方)描述携带两个分支形式的酰基化的单酰基化Lys残基的结构。在另一个例子中，肽包含一个酰基化氨基酸残基，该残基携带两个线性形式的酰基化。图5A(中间)描述携带C12酰基化的单酰基化Lys残基的结构，C12酰基化以线性形式通过E间隔物连接至C16酰基化。在另一个例子中，肽包含两个酰基化氨基酸残基：一个位于第10位，另一个位于第40位。图5(下方)描述通过E间隔物携带C16酰基化的每个酰基化Lys残基的结构。括号表示Lys残基是通过第11-39位的主链氨基酸连接的。
基本如实施例2所述，测试携带两个酰基化的肽在GLP-1受体、胰高血糖素受体与GIP受体的体外活性，结果显示于表12。
Figure BDA0000369878840001741
Figure BDA0000369878840001751
在第0天，将表12的肽以及两个二聚体(如实施例22及图9所描述)和另两个肽(SEQ ID NO:28以及SEQ ID NO:89的肽)皮下一次注射至DIO小鼠内(剂量为10nmol/kg)。注射前，给予DIO小鼠致糖尿病饮食，小鼠平均体重为60g。于第0、1、3、5、及7天测量小鼠体重及摄食量，于第0及7天测量空腹血糖水平。
如图5E所示，在实验第7天，与注射载体对照的小鼠相比，接受肽注射的小鼠的体重降低。
如图5F所示，与注射载体对照的小鼠相比，接受肽注射的小鼠的血糖水平降低。
实施例20
以三种方式进行肽的S-烷基化。第一种方式，S-棕榈基烷基化Cys残基为肽主链的一部分。烷基化Cys残基位于第40位。结构如图6(下)所示，列为序列表的SEQ ID NO:164。第二种方式，将S-棕榈基烷基化Cys残基连接至Lys残基，所述Lys残基位于肽的第40位。得到的结构如图7(Cys-S-棕榈基)所示，列为序列表的SEQ ID NO:165。第三种方式，S-棕榈基烷基化Cys残基连接至间隔物残基(γ-谷氨酸)，所述间隔物连接至位于肽的第40位的Lys残基。得到的结构如图7(γE-Cys-S-棕榈基)所示，列为序列表的SEQ ID NO:166。S-烷基化肽是以实施例1所述的方法制备。
基本上以实施例2所述的方法测试肽在胰高血糖素受体、GLP-1受体以及GIP受体的体外活性。每个肽在各受体的EC50列于表13。
Figure BDA0000369878840001761
实施例21
通过皮下注射10nmol/kg体重至DIO小鼠内，测试前述实施例中所选出肽的体内活性。小鼠平均体重为60g，每组八只小鼠。
测试的肽包括具有γ-谷氨酸间隔物的酰基化肽，具有两个γ-谷氨酸二肽间隔物的酰基化肽，C16琥珀酰基化肽，具有迷你PEG间隔物(包含(-O-CH2-CH2-)n的结构,其中n为2)的酰基化肽，具有迷你PEG间隔物(包含(-O-CH2-CH2-)n的结构，其中n为4)的酰基化肽，具有迷你PEG间隔物(包含(-O-CH2-CH2-)n的结构，其中n为8)的酰基化肽，S-棕榈基烷基化肽(其中Lys为主链残基且Cys为Lys与酰基间的间隔物)，以及S-棕榈基烷基化肽(其中Lys为主链残基且γ-谷氨酸-Cys为Lys与酰基间的二肽间隔物)。在第0、1、3、5以及7天，测量体重与摄食量，在第0以及第7天测量血糖。
如图8所示，第七天测量时，许多测试的肽均导致体重总改变降低至少5%。
实施例22
制备三个同二聚体，其中每个同二聚体包含两个SEQ ID NO:167的肽。每个SEQ ID NO:167的肽的C端Lys残基(第40位)被酰胺化(而不包含α羧酸)，且该Lys残基的ε-NH2基团与Cys残基肽键结合，Cys残基与γ-谷氨酸残基连接。γ-谷氨酸残基与C16酰基连接。二聚体的每一半均通过二硫键或硫醚键连接至另一半。实施例1中详细描述了同二聚体的合成。
得到的产物的结构如图9A及9B所示。
基本上以实施例2所述的方法测试同二聚体在胰高血糖素受体、GLP-1受体以及GIP受体的体外活性。每个肽在各受体的EC50列于表14。
实施例23
向DIO小鼠(平均体重为54g，每组八只小鼠)皮下注射下表中四种肽中的一种，以1nmol/kg/天或3nmol/kg/天，或每天注射载体对照。肽的结构以及其在胰高血糖素受体、GLP-1受体以及GIP受体的体外活性列于表15。
表15
Figure BDA0000369878840001791
自第0天(第一次注射当天)开始，每隔一天测量体重与进食量。于第0及19天测量身体组成，于第0、7、14及20天测量即时血糖水平。在第20天，在葡萄糖注射后0、15、20、60、120分钟测量ipGTT(1g/kg)。第22天(过夜禁食后)进行解剖分析(肝脏与胰脏)以及最终采血测量。
如图10所示，给予表15肽注射的所有动物的体重均降低。与给予载体对照的小鼠相比，第19天时，给予表15肽注射的所有动物的摄食量减少。如图11所示，与载体对照相比，给予肽的动物中胰岛素水平(第21天测量)降低。值得注意的是，体重减少量最大的小鼠也是胰岛素水平最低的小鼠。
实施例24
选择实施例21所评估的表现出降低体重能力的肽，用于其他突变研究，其中以多种方式中的一种修饰肽的C端部分内的氨基酸。第一种方式，改变具有SEQ ID NO:89序列的肽，使得第27、28或29位的氨基酸被丙氨酸残基取代。另一种方式，将具有SEQ ID NO:28序列的肽修饰为第28位为Glu，第35位为Arg。理论上，这两个氨基酸间的盐桥能形成盐桥而稳定所述肽的C端部分中的Trp笼结构。最后，将具有SEQ ID NO:28序列的肽修饰为在C端氨基酸包含Gly。基本上以实施例2所述的方法，测试这些肽以及与SEQ ID NO:89的肽或SEQ ID NO:28的肽相似的其他肽在胰高血糖素受体、GLP-1受体以及GIP受体的体外活性，结果列于表16。
Figure BDA0000369878840001811
实施例25
基本上如实施例1所描述的方法制备肽，并且基本上如本文所述，测试其在胰高血糖素受体、GLP-1受体以及GIP受体的体外活性。表17提供了每个肽的结构与EC50值(nM)。
Figure BDA0000369878840001821
将文中引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请、及专利)通过引用并入本文，如同单独地和特别地表明通过引用并入本文并在本文列出其整体的各个参考文献相同的程度。
除非文中另作指示或前后文明显相互冲突，应将在描述本发明的文中(尤其是在以下权利要求的文中)的术语“a”及“an”及“the”及类似指示物的使用解释为涵盖单数及复数。除非另作指示，术语“包含”、“具有”、“包括”及“含有”应作为开放式术语解释(即意指“包括，但不限于”)。
除非文中另作指示，文中引述值的范围仅是作为提及落于所述范围的各个单独值及各终点的简便方法，且将各个单独值及终点并入说明书中如同其单独引述于文中。
除非文中另作指示或者前后文明显地相互冲突，文中所述的所有方法可以任何合适顺序进行。除非另作主张，否则文中提供的任何及所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅是为了更好地阐述本发明，而并非对本发明的范围做出限制。不应将说明书中的语言解释为指示任何未主张的要素为实施本发明的所必要的。
本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明者已知为实施本发明的最佳方式。本领域技术人员在阅读先前说明后应当明白这些优选实施方案的变化。本发明人预期本领域技术人员可使用这些合适的变化，且本发明人预期本发明可以除明确说明于文中的方式之外的方式实施。因此，本发明包括由适用法条所许可的所附权利要求中所引述的主题内容的所有修改及等效方式。此外，除非文中另作指示或者前后文明显地相互冲突，否则本发明涵盖前述要素的所有可能变化的任何组合。
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Claims (136)

1.胰高血糖素(SEQ ID NO:1)类似物，其包含：
a.包含咪唑侧链的氨基酸，其位于第1位；
b.DPP-IV保护性氨基酸，其位于第2位，任选地为AIB；
c.酰基化的氨基酸或烷基化的氨基酸，其位于第9、10、12、16、20或37-43位中的任意位置，任选地，其中所述酰基或烷基通过间隔物连接至所述氨基酸；
d.α,α-双取代的氨基酸，其位于第20位；以及
e.至多十个相对于SEQ ID NO:1的另外的氨基酸修饰，
其中，当所述胰高血糖素类似物缺乏亲水性部分时，所述胰高血糖素类似物表现出至少0.1%的GIP百分比效能，其中，所述胰高血糖素类似物对人GLP-1受体的相对于GIP受体的选择性低于100倍。
2.如权利要求1所述的胰高血糖素类似物，其中，所述α,α-双取代的氨基酸包含R1和R2，R1和R2中的每一个与α碳键合，其中所述R1和R2各自独立地选自任选地用羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1及R2与它们所连接的α碳形成环。
3.如权利要求2所述的胰高血糖素类似物，其中位于第20位的α,α-双取代的为AIB。
4.如权利要求1至3中任一项所述的胰高血糖素类似物，其中位于第16位的氨基酸为除AIB以外的α螺旋稳定氨基酸。
5.如权利要求4所述的胰高血糖素类似物，其中位于第16位的氨基酸为带电荷的氨基酸，任选地为带负电荷的氨基酸或带正电荷的氨基酸。
6.如权利要求5所述的胰高血糖素类似物，其中所述带电荷的氨基酸为Glu或Lys。
7.胰高血糖素(SEQ ID NO:1)类似物，其包含：
a.包含咪唑侧链的氨基酸，其位于第1位；
b.DPP-IV保护性氨基酸，其位于第2位，任选地为AIB；
c.酰基化的氨基酸或烷基化的氨基酸，其位于第9、10、12、16、20或37-43位中的任意位置，任选地，其中所述酰基或烷基通过间隔物连接至所述氨基酸；
d.α螺旋稳定氨基酸，其位于第16位-第21位中的一个或多个位置，任选地位于第16位，其中所述类似物在第20位不包含α螺旋稳定氨基酸；以及
e.至多十个相对于SEQ ID NO:1的另外的氨基酸修饰；
其中当所述胰高血糖素类似物缺乏亲水性部分时，所述胰高血糖素类似物表现出至少0.1%的GIP百分比效能，其中所述胰高血糖素类似物对人GLP-1受体的相对于GIP受体的选择性低于100倍。
8.如权利要求7所述的胰高血糖素类似物，其在第16位包含α螺旋稳定氨基酸，任选地，所述α螺旋稳定氨基酸为带负电荷的氨基酸或α,α-双取代的氨基酸。
9.如权利要求8所述的胰高血糖素类似物，其中所述带负电荷的氨基酸为Glu。
10.如权利要求8所述的胰高血糖素类似物，其中所述α,α-双取代的氨基酸包含R1和R2，R1和R2中的每一个与α碳键合，其中所述R1和R2各自独立地选自任选地用羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1及R2与它们所连接的α碳形成环。
11.如权利要求10所述的胰高血糖素类似物，其中所述α,α-双取代的氨基酸为AIB。
12.如权利要求7至11中任一项所述的胰高血糖素类似物，其在第18位包含小的脂肪族氨基酸，任选地为Ala，并且在第17位包含Arg。
13.如权利要求7至12中任一项所述的胰高血糖素类似物，其中与SEQ ID NO:1相比，所述类似物的第20位未经修饰。
14.如权利要求1至13中任一项所述的胰高血糖素类似物，其包含(i)第29位氨基酸的C端的1至21个氨基酸的延伸，或(ii)所述酰基化或烷基化的氨基酸位于第10、12或16位。
15.如权利要求1至14中任一项所述的胰高血糖素类似物，其中位于第1位的氨基酸为His或His衍生物。
16.如权利要求1至15中任一项所述的胰高血糖素类似物，其中位于第2位的氨基酸为α,α-双取代的氨基酸。
17.如权利要求16所述的胰高血糖素类似物，其中所述α,α-双取代的氨基酸包含R1和R2，R1和R2中的每一个与α碳键合，其中所述R1和R2各自独立地选自任选地用羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1及R2与它们所连接的α碳形成环。
18.如权利要求17所述的胰高血糖素类似物，其中位于第2位的α,α-双取代氨基酸为AIB。
19.如权利要求1至18中任一项所述的胰高血糖素类似物，其包含第29位氨基酸的C端的1至21个氨基酸的延伸。
20.如权利要求19所述的胰高血糖素类似物，其中位于第29位的氨基酸为Gly。
21.如权利要求19或20所述的胰高血糖素类似物，其中所述延伸包含形成Trp笼结构的氨基酸序列。
22.如权利要求21所述的胰高血糖素类似物，其中所述延伸包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列或其保守型取代的序列。
23.如权利要求19或20所述的胰高血糖素类似物，其中所述延伸包含至少一个带电荷的氨基酸。
24.如权利要求23所述的胰高血糖素类似物，其中所述延伸包含X1-X2的氨基酸序列，其中X1为带电荷的氨基酸，X2为小的脂肪族氨基酸。
25.如权利要求24所述的胰高血糖素类似物，其中X1为带正电荷的氨基酸。
26.如权利要求25所述的胰高血糖素类似物，其中X1为Arg。
27.如权利要求26所述的胰高血糖素类似物，其中所述延伸包含Arg-Gly。
28.如权利要求1至13和15至27中任一项所述的胰高血糖素类似物，其中(i)包含非天然酰基或烷基的氨基酸位于第10位，或(ii)所述胰高血糖素类似物包含第29位氨基酸的C端的1至21个氨基酸的延伸，以及在第37-43位中的任意位置、任选地在第40位包含酰基化的氨基酸或烷基化的氨基酸。
29.如权利要求1至27所述的胰高血糖素类似物，其中所述酰基化的氨基酸或烷基化的氨基酸位于第14位。
30.如权利要求1至29中任一项所述的胰高血糖素类似物，其中所述酰基或烷基连接至包含如通式I(任选地为Lys)、通式II(任选地为Cys)或通式III(任选地为Ser)的结构的氨基酸，其中所述通式I、II以及III分别如下：
Figure FDA0000369878830000051
Figure FDA0000369878830000052
Figure FDA0000369878830000053
31.如权利要求1至29所述的胰高血糖素类似物，其中所述酰基或烷基的氨基酸连接至氨基-Phe或Tyr。
32.如权利要求1至31中任一项所述的胰高血糖素类似物，其中所述酰基或烷基通过长度为3至10个原子的间隔物连接至氨基酸。
33.如权利要求1至32中任一项所述的胰高血糖素类似物，其中所述间隔物为氨基酸或二肽。
34.如权利要求33所述的胰高血糖素类似物，其中所述间隔物包含一个或二个酸性氨基酸残基。
35.如权利要求1-34中任一项所述的胰高血糖素类似物，其中所述酰基化的氨基酸或烷基化的氨基酸通过间隔物连接至所述酰基或烷基，其中所述间隔物和所述酰基的总长度为约14至约28个原子。
36.如权利要求1至35中任一项所述的胰高血糖素类似物，其中所述酰基化的氨基酸或烷基化的氨基酸连接至C12至C18脂肪酰基。
37.如权利要求36所述的胰高血糖素类似物，其中所述酰基为C14或C16脂肪酰基。
38.如权利要求1至37中任一项所述的胰高血糖素类似物，其在第27位氨基酸的C端包含至少一个带电荷的氨基酸。
39.如权利要求38所述的胰高血糖素类似物，其在第28位包含带电荷的氨基酸。
40.如权利要求38或39所述的胰高血糖素类似物，其中所述带电荷的氨基酸为带负电荷的氨基酸。
41.如权利要求40所述的胰高血糖素类似物，其中所述带负电荷的氨基酸为Asp。
42.如权利要求38或39所述的胰高血糖素类似物，其中所述带电荷的氨基酸为带正电荷的氨基酸。
43.如权利要求42所述的胰高血糖素类似物，其中所述带正电荷的氨基酸为通式I的氨基酸：
44.如权利要求43所述的胰高血糖素类似物，其中位于第28位的通式I的氨基酸为Lys。
45.如权利要求1至44中任一项所述的胰高血糖素类似物，其在第27位、第29位或第27位与第29位包含氨基酸修饰。
46.如权利要求45所述的胰高血糖素类似物，其中位于第27位的氨基酸为Leu、Nle、Val或Lys。
47.如权利要求45或46所述的胰高血糖素类似物，其中位于第29位的氨基酸为Gly或Thr。
48.如权利要求1至47中任一项所述的胰高血糖素类似物，其包含以下中的一个或多个：
i.位于第1位的DPP-IV保护性氨基酸，；
ii.位于第3位的酸性氨基酸，任选地为Glu；
iii.位于第7位的Ile；
iv.位于第12位的Ile或Arg；
v.位于第15位的酸性氨基酸，任选地为Glu；
vi.位于第18位的脂肪族氨基酸，任选地为Ala；
vii.位于第21位的酸性氨基酸，任选地为Glu；
viii.位于第24位的Asn、Ala或AIB；
ix.位于第27位的脂肪族氨基酸，任选地为Ala或Leu或Nle；
x.位于第28位的酸性氨基酸，任选地为Glu，或脂肪族氨基酸，任选地为Ala；
xi.位于第29位的脂肪族氨基酸，任选地为Ala；
xii.C端酰胺化。
49.如权利要求1至48中任一项所述的胰高血糖素类似物，其包含SEQ ID NO:184-199中的任意氨基酸序列。
50.如权利要求1至48中任一项所述的胰高血糖素类似物，其包含SEQ ID NO:28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212以及230中的任意序列。
51.如权利要求50所述的胰高血糖素类似物，其包含SEQ ID NO:28、37、89、95、130、171以及180中的任意氨基酸序列。
52.肽，其包含如下序列：
(a)SEQ ID NO:184，
HX2X3GTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29GPSSGX35PPPS(SEQ ID NO:184)
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或Gln类似物；
X10为Tyr或与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸；
X16为任何氨基酸，任选地为除Gly、Pro和Ser以外的任何氨基酸；
X18为Arg或Ala；
X20为带负电荷的氨基酸或电中性的氨基酸，任选地为AIB或Gln；
X21为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu；
X27为Leu、Ala、Nle或Met；
X28为Ala或酸性氨基酸(任选地为Asp或Glu)；
X29为Ala或Gly；
X35为Ala或碱性氨基酸(任选地为Arg或Lys)；
其中当X28为酸性氨基酸时，X35为碱性氨基酸；
其中当X10为Tyr时，所述肽在第40位包含与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸，其中任选地，所述肽在第41位包含Gly，
其中所述肽的C端氨基酸为酰胺化的氨基酸；
或
(b)具有至多3个相对于SEQ ID NO:184的氨基酸修饰的SEQ IDNO:184，其中所述肽在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体中的每一个表现出激动剂活性。
53.如权利要求52所述的肽，其中X10为Tyr，所述肽在第40位包含与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸，所述肽任选地在第41位包含Gly。
54.如权利要求52或53所述的肽，其中X10为与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸。
55.如权利要求52至54中任一项所述的肽，其中X20为Gln。
56.如权利要求55所述的肽，其中位于第16位的氨基酸为带负电荷的氨基酸，任选地为Glu。
57.如权利要求56所述的肽，其中X18为Ala。
58.如权利要求52至54中任一项所述的肽，其中X20为AIB。
59.如权利要求58所述的肽，其中X16为除AIB以外的任何氨基酸。
60.如权利要求52至59中任一项所述的肽，其中(i)X28为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu，X35为碱性氨基酸，任选地为Arg或Lys；(ii)X27、X28与X29中仅有一个是Ala；(iii)所述肽在C端包含酰胺化的Gly。
61.如权利要求52至60中任一项所述的肽，其中至多3个氨基酸修饰为保守型取代。
62.肽，其包含如下序列：
(a)SEQ ID NO:185，
HX2QGTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:185)
其中：
X2为AIB；
X10为Tyr或与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸；
X16为Glu、α,α-双取代的氨基酸或Lys；
X18为Arg或Ala；
X20为AIB或Gln；
X21为Asp或Glu；
X27为Leu、Nle或Met；
X28为Ala、Asp或Glu；
X29为Thr的Gly；并且
其中当X10为Tyr时，所述肽在第40位包含与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸，其中任选地，所述肽在第41位包含Gly，
其中所述肽的C端氨基酸为酰胺化的氨基酸；
或
(b)具有至多3个相对于SEQ ID NO:185的氨基酸修饰的SEQ ID NO:185，其中所述肽在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体中的每一个表现出激动剂活性。
63.如权利要求62所述的肽，其中至多3个氨基酸修饰为保守型取代。
64.肽，其包含：
(a)SEQ ID NO:186的序列，
HX2X3GTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29(SEQ ID NO:186)
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或Gln类似物；
X10为Tyr或与C10至C26酰基或烷基共价连接的氨基酸；
X16为任何氨基酸，任选地为除Gly、Pro以及Ser以外的任何氨基酸；
X18为Arg或Ala；
X20为带负电荷的氨基酸或电中性的氨基酸，任选地为AIB或Gln；
X21为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu；
X27为Leu、Ala、Nle或Met；
X28为Ala或酸性氨基酸(任选地为Asp或Glu)；
X29为Ala、Gly或Thr；并且
其中所述肽包含任选地位于第10位的与C10至C26酰基或烷基共价连接的氨基酸，所述肽的C端氨基酸为酰胺化的氨基酸；
或
(b)具有至多3个相对于SEQ ID NO:186的氨基酸修饰的SEQ IDNO:186，其中所述肽在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体中的每一个表现出激动剂活性。
65.如权利要求64所述的肽，其中X20为AIB。
66.如权利要求65所述的肽，其中X29为Thr，所述肽不包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:5)。
67.如权利要求65或66所述的肽，其中X16为除AIB以外的氨基酸。
68.如权利要求64所述的肽，其中X20为Gln。
69.如权利要求68所述的肽，其中第16位的氨基酸为带负电荷的氨基酸，任选地为Glu。
70.如权利要求69所述的肽，其中X18为Ala。
71.如权利要求64、65和67至70中任一项所述的肽，其包含第29位氨基酸的C端的1至21个氨基酸的延伸。
72.如权利要求71所述的肽，其中第29位氨基酸为Gly。
73.如权利要求71或72所述的肽，其中所述延伸包含氨基酸序列GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:5)或其保守型取代的序列；或其中所述延伸包含序列X1-X2，其中X1为带电荷的氨基酸，X2为小的脂肪族氨基酸，任选地，X1为带正电的氨基酸。
74.如权利要求73所述的肽，其中所述带正电的氨基酸为Arg。
75.如权利要求74所述的肽，其中所述延伸包含Arg-Gly或由Arg-Gly组成。
76.如权利要求73所述的肽，其中所述延伸包含氨基酸序列GPSSGAPPPS(SEQ ID NO:5)，随后为Lys或Lys-Gly，其中Lys共价连接至C10至C26酰基。
77.如权利要求64所述的肽，其包含SEQ ID NO:186，其中X2为AIB，X3为Gln，X10为与C10至C26酰基或烷基共价连接的氨基酸，X18为Arg或Ala，X20为AIB或Gln，X21为Asp或Glu，X29为Gly，C端氨基酸为酰胺化的氨基酸，其中第29位的Gly与GPSSGAPPPS融合，随后为Lys或Lys-Gly，其中Lys共价连接至C10-C26酰基。
78.如权利要求64至77中任一项所述的肽，其中至多3个氨基酸修饰物为保守型取代。
79.肽，其包含：
(a)SEQ ID NO:187的序列，
HX2QGTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29(SEQID NO:187)
其中：
X2为AIB；
X10为Tyr或与C10至C26酰基或烷基共价连接的氨基酸；
X16为Glu、α,α-双取代的氨基酸或Lys；
X18为Arg或Ala；
X20为带负电荷的氨基酸或电中性的氨基酸，任选地为AIB或Gln；
X21为Asp或Glu；
X27为Leu、Ala、Nle或Met；
X28为Ala、Asp或Glu；
X29为Gly或Thr；以及
其中所述肽包含任选地位于第10位的与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸，所述肽的C端氨基酸为酰胺化的氨基酸；
或
(b)具有至多3个相对于SEQ ID NO:187的氨基酸修饰的SEQ IDNO:187，其中所述肽在人GIP受体、人GLP-1受体以及人胰高血糖素受体中的每一个表现出激动剂活性。
80.如权利要求80所述的肽，其中至多3个氨基酸修饰物为保守型取代。
81.肽，其包含SEQ ID NO:188的序列，或具有至多3个相对于SEQ ID NO:188的氨基酸修饰的SEQ ID NO:188的序列，其中所述肽在人GIP受体以及人GLP-1受体中的每一个表现出激动剂活性。
82.肽，其包含SEQ ID NO:189的序列，或具有至多3个相对于SEQ ID NO:189的氨基酸修饰的SEQ ID NO:189的序列，其中所述肽对于人GIP受体以及人GLP-1受体中的每一个表现出激动剂活性。
83.肽，其包含SEQ ID NO:190的序列，或具有至多3个相对于SEQ ID NO:190的氨基酸修饰的SEQ ID NO:190的序列，其中所述肽在人GIP受体以及人GLP-1受体中的每一个表现出激动剂活性。
84.肽，其包含SEQ ID NO:191的序列，或具有至多3个相对于SEQ ID NO:191的氨基酸修饰的SEQ ID NO:191的序列，其中所述肽在人GIP受体以及人GLP-1受体中的每一个表现出激动剂活性。
85.肽，其包含SEQ ID NO:192的序列，或具有至多3个相对于SEQ ID NO:192的氨基酸修饰的SEQ ID NO:192的序列，其中所述肽在人GIP受体以及人GLP-1受体中的每一个表现出激动剂活性，任选地，所述肽在人胰高血糖素受体表现出激动剂活性。
86.肽，其包含SEQ ID NO:193的序列，或具有至多3个相对于SEQ ID NO:193的氨基酸修饰的SEQ ID NO:193的序列，其中所述肽在人GIP受体以及人GLP-1受体中的每一个表现出激动剂活性，任选地，所述肽在人胰高血糖素受体表现出激动剂活性。
87.肽，其包含SEQ ID NO:194的序列，或具有至多3个相对于SEQ ID NO:194的氨基酸修饰的SEQ ID NO:194的序列，其中所述肽在人GIP受体以及人GLP-1受体中的每一个表现出激动剂活性，任选地，所述肽在人胰高血糖素受体表现出激动剂活性。
88.肽，其包含SEQ ID NO:195的序列，或具有至多3个相对于SEQ ID NO:195的氨基酸修饰的SEQ ID NO:195的序列，其中所述肽在人GIP受体以及人GLP-1受体中的每一个表现出激动剂活性，任选地，所述肽在人胰高血糖素受体表现出激动剂活性。
89.如权利要求52至88中任一项所述的肽，其中所述C12-C18脂肪酰基或烷基为C14至C16脂肪酰基或烷基，任选地通过间隔物连接。
90.如权利要求52至89中任一项所述的肽，其中所述与C12至C18酰基或烷基共价连接的氨基酸为与C12至C18酰基或烷基共价连接的Lys或氨基-Phe或Tyr或Cys。
91.如权利要求52至90中任一项所述的肽，其中所述间隔物为氨基酸或二肽，任选地，其中所述间隔物包含一个或二个酸性氨基酸残基。
92.肽，其包含SEQ ID NO:28的序列。
93.肽，其包含SEQ ID NO:37的序列。
94.肽，其包含SEQ ID NO:89的序列。
95.肽，其包含SEQ ID NO:171的序列。
96.肽，其包含SEQ ID NO:180的序列。
97.具有GIP激动剂活性的胰高血糖素(SEQ ID NO:1)类似物，其包含：
(a)包含咪唑侧链的氨基酸，其位于第1位；
(b)通式IV的氨基酸，其位于第16位：
其中n为1至7，其中R1与R2分别独立地选自H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7以及(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，其中任选地，所述通式IV的氨基酸的侧链包含自由氨基；
(c)α,α-双取代的氨基酸，位于第20位；
(d)至多十个相对于SEQ ID NO:1的另外的氨基酸修饰；
其中当所述类似物缺乏亲水性部分时，所述胰高血糖素类似物在GIP受体表现出至少0.1%的天然GIP的活性，其中所述胰高血糖素类似物对人GLP-1受体的相对于GIP受体的选择性低于100倍。
98.如权利要求97所述的胰高血糖素类似物，其中位于第1位的氨基酸为His或His衍生物。
99.如权利要求97或98所述的胰高血糖素类似物，其中(b)中所述通式IV的氨基酸为同型赖氨酸、Lys、Orn或2,4-二氨基丁酸(Dab)。
100.如权利要求97至99中任一项所述的胰高血糖素类似物，其中所述α,α-双取代的氨基酸包含R1和R2，R1和R2中的每一个与α碳键合，其中所述R1和R2各自独立地选自任选地用羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1及R2与它们所连接的α碳形成环。
101.如权利要求100所述的胰高血糖素类似物，其中位于第20位的α,α-双取代的氨基酸为AIB。
102.如权利要求97至101中任一项所述的胰高血糖素类似物，其包含以下中的一个或多个：
a位于第2位的DPP-IV保护性氨基酸，任选地为AIB或D-Ser；
b.位于第12位的大的、脂肪族、非极性氨基酸，任选地为Ile；
c.位于第17位的除Arg以外的氨基酸，任选地为Gln；
d.位于第18位的小的、脂肪族氨基酸，任选地为Ala；
e.位于第21位的除Asp以外的氨基酸，任选地为Glu；
f.位于第24位的除Gln以外的氨基酸，任选地为Asn或Ala；
g.位于第27位的除Met以外的氨基酸，任选地为Leu；
h.位于第28位的除Asn以外的氨基酸，任选地为Ala；
i.位于第29位的除Thr以外的氨基酸，任选地为Gly；
j.第29位氨基酸的C端的1至21个氨基酸的延伸；以及
k.SEQ ID NO:48、52、53以及74中任意所示的氨基酸序列。
103.类似物，其包含具有至多三个相对于母体序列的氨基酸修饰的母体序列，其中所述母体序列为SEQ ID NO:27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、90、94-100、102-112、120-124、及127-131中的任意序列，或SEQ ID NO:48、52、53及74中的任意序列，或SEQ IDNO:50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、92、114-119、125、126及133中的任意序列，其中所述氨基酸修饰选自：
a位于第2位的DPP-IV保护性氨基酸，任选地为AIB或D-Ser；
b.位于第12位的大的、脂肪族、非极性氨基酸，任选地为Ile；
c.位于第17位的除Arg以外的氨基酸，任选地为Gln；
d.位于第18位的小的、脂肪族氨基酸，任选地为Ala；
e.位于第21位的除Asp以外的氨基酸，任选地为Glu；
f.位于第24位的除Gln以外的氨基酸，任选地为Asn或Ala；
g.位于第27位的除Met以外的氨基酸，任选地为Leu；
h.位于第28位的除Asn以外的氨基酸，任选地为Ala；
i.位于第29位的除Thr以外的氨基酸，任选地为Gly；
j.第29位氨基酸的C端的1至21个氨基酸的延伸；以及
k.SEQ ID NO:48、52、53以及74中任意所示的氨基酸序列。
104.如前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物对人GLP-1受体的相对于GIP受体的选择性低于100倍。
105.如前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物在GIP受体的EC50处于其在GLP-1受体的EC50的约50倍内。
106.如前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物在GIP受体的EC50处于其在GLP-1受体的EC50的约40倍内。
107.如前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物在GIP受体的EC50处于其在GLP-1受体的EC50的约30倍内。
108.如前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物在GIP受体的EC50处于其在GLP-1受体的EC50的约20倍内。
109.如前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物在GIP受体的EC50处于其在GLP-1受体的EC50的约10倍内。
110.如前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物在GIP受体的EC50处于其在GLP-1受体的EC50的约5倍内。
111.如前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物表现出至少1%的GIP百分比效能。
112.如权利要求111所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GIP百分比效能为至少10%。
113.如权利要求112所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GIP百分比效能大于15%或大于20%。
114.如权利要求113所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GIP百分比效能为至少50%。
115.如权利要求114所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GIP百分比效能大于或约为100%。
116.如前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物表现出至少1%的GLP-1百分比效能。
117.如权利要求116所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GLP-1百分比效能为至少10%。
118.如权利要求117所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GLP-1百分比效能为至少50%。
119.如权利要求118所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GLP-1百分比效能大于或约为100%。
120.如前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GIP百分比效能高于或低于GLP-1百分比效能10倍以内。
121.如前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽，其中胰高血糖素百分比效能为至少1%。
122.如权利要求121所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素百分比效能为至少10%。
123.如权利要求122所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素百分比效能为至少50%。
124.如权利要求123所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素百分比效能为大于或约为100%。
125.如前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GIP百分比效能高于或低于胰高血糖素百分比效能10倍以内。
126.二聚体或多聚体，其包含二个或更多个前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽。
127.缀合物，其包含前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽以及缀合部分。
128.如权利要求127所述的缀合物，其中所述胰高血糖素类似物与异源肽类似物融合。
129.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽、权利要求126所述的二聚体或多聚体、权利要求127或128所述的缀合物、或以上的组合，以及药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
130.在有需要的个体中降低体重增加或诱发减重的方法，包括将能有效降低体重增加或诱发减重的量的权利要求129所述的药物组合物给予有需要的患者。
131.如权利要求130所述的方法，其中所述量能有效治疗有需要的个体的肥胖症。
132.治疗糖尿病的方法，包括将能有效降低血液葡萄糖水平的量的权利要求129所述的药物组合物给予有需要的患者。
133.诱导有需要的个体中肠道暂时性麻痹的方法，包括将能有效诱导肠道暂时性麻痹的量的权利要求129所述的药物组合物给予有需要的患者。
134.前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽、权利要求126所述的二聚体或多聚体、权利要求127或128所述的缀合物或以上的组合在制备用于治疗糖尿病、降低体重增加或诱发减重、或诱导肠道暂时性麻痹的药物中的用途。
135.前述权利要求中任一项所述的胰高血糖素类似物或肽、权利要求126所述的二聚体或多聚体、权利要求127或128所述的缀合物或以上的组合在治疗糖尿病或肥胖症、降低体重增加或诱发减重、或诱导肠道暂时性麻痹中的用途。
136.本文所述的肽，任选地为本文所述的胰高血糖素类似物。
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