''Procédé d'immobilisation de cellules microbiennes globulaires par
adhésion à un support solide".
Cette invention a été réalisée par Monsieur M. DE BREMAEKER, Madame M.GENNEN, Messieurs G.J.KAYEM, P.G.ROUXHET, J.L.VAN HAECHT, de la Faculté des Sciences Agronomiques de l'Université Catholique de Louvain, B-1348 Louvain-la-Neuve (Belgique).
L'invention a pour objet un procédé d'immobilisation de cellules microbiennes globulaires distribuées sous forme d'une couche régulière sur un support solide, sans l'intervention d'un agent externe.
L'invention a également pour objet la couche de cellules microbiennes ainsi obtenues.
On connait déjà des procédés d'immobilisation de cellules microbiennes, faisant appel à la fixation sur un support, à la formation de flocons ou à l'inclusion dans une matrice. L'immobilisation par fixation, également appelée adhésion ou adsorption, sur un support solide présente par rapport aux autres procédés l'avantage de maintenir un contact direct de l'ensemble de la population microbienne avec le milieu liquide et, en conséquence, de réduire la limitation, par les phénomènes diffusionnels, de la vitesse de transfert des substances nutritives ou des substances produites par les microorganismes.
L'immobilisation par fixation sur un support solide peut se réaliser avec certains organismes, notamment des bactéries, en laissant se développer la population microbienne au contact du support. Toutefois cette technique présente l'inconvénient d'exiger un temps de contact assez long des cellules avec le support, en présence de substances nutritives, et de
ne pas permettre le contrôle de la densité et de la morphologie du film de cellules immobilisées.
Pour fixer des microorganismes sur un support sans développement de la population microbienne, certains procédés font appel à l'usage de réactifs chi- . miques destinés à former un lien entra le support et les cellules; cependant l'addition d'agents chimiques peut être indésirable pour certaines applica-
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tion de réactions chimiques nuisibles.
Dans certains procédés n'utilisant pas d'agents chimiques, on dépose les microorganismes dans des pores ou dans des zones du support protégées du flux direct du liquide ambiant. Ces procédés présentent l'inconvénient de donner une.distribution très hétérogène des microorganismes sur la surface du support; ils ne permettent pas d'obtenir des forces d'adhésion microorganisme-support importantes et contraignent donc l'utilisateur à travailler avec un faible flux de liquide.
Le procédé par adsorption simple présente l'avantage d'une grande simplicité et ne fait pas appel à l'utilisation d'agents externes intervenant pour la liaison entre les cellules et le support. Les procédés par adsorption développés jusqu'à présent n'ont pas permis d'obtenir une couche unique et régulière de cellules adhérant fortement au support.
La présente invention, qui s'applique à l'immobilisation de cellules microbiennes globulaires, remédie à ces divers inconvénients et a pour but de fixer une couche cellulaire unique, distribuée régulièrement sur toute la surface du support, adhérant fortement au support, sans l'intervention d'un agent externe. De plus, les cellules ainsi immobilisées suivant le procédé de la présente invention présentent un degré de viabilité élevé, c'està-dire qu'une proportion élevée d'entre elles conserve la capacité de réali-
p ser notamment des réactions enzymatiques et de se reproduire dans un milieu approprié.
Un des buts de l'invention est de fixer une couche cellulaire unique, distribuée régulièrement sur toute la surface du support, adhérant fortement au support.
Un autre but de l'invention est d'obtenir des complexes stables formés d'une couche cellulaire unique et du support,pouvant être utilisés directement dans des réacteurs, par exemple de fermentation.
L'invention, telle que caractérisée dans les revendications, consiste à conditionner les cellules microbiennes globulaires dans un milieu aqueux,par exemple dans de l'eau pure, et ensuite à les amener en contact avec la surface du support.
Les cellules mises au contact du support sans un tel conditionnement n'y adhèrent pas et sont entraînées dès que le support est placé dans un flux liquide. L'effet de ce conditionnement n'est pas complètement expliqué.
Il est cependant démontré, dans le cas du conditionnement de Saccharomyces cerevisiae par conservation dans l'eau pure, qu'au cours du conditionnement la cellule. relâche des substances chimiques dans le milieu ambiant, que la surface de la paroi cellulaire subit des modifications, que le conditionnement diminue la composante électrostatique répulsive entre la cellule et le verre, que le conditionnement en milieu oxygéné est plus efficace qu'un conditionnement en milieu anaérobie. Il a également été démontré qu'un lavage de la cellule à l'eau après le conditionnement diminue les effets bénéfiques de celui-ci.. De préférence c'est dans le milieu de conditionnement que les cellules sont mises au contact de la surface du support.
Les supports solides utilisés suivant la présente invention comprennent des matériaux solides minéraux et organiques. Le support à utiliser peut être poreux ou non; pour certaines applications il peut être préférable d'utiliser un support non poreux et ne présentant pas des alvéoles en surface, de manière à ce que toutes les cellules immobilisées puissent être directement exposées au flux d'un liquide.
Parmi les composés minéraux, citons l'utilisation de silice, de silicates et d'aluminosilicates, d'oxydes métalliques, de métaux et de leurs alliages etc.. On peut utiliser par exemple le verre, une céramique, le laitier, le sable.
Parmi les composés organiques, citons l'utilisation de polymères et/ou copolymères synthétiques, par exemple les polyamides, les polyesters, les po-
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cités ci-avant ne constituent que des exemples de supports pouvant être utilisés suivant la présente invention et ne sont nullement limitatifs. Pour le choix du support, on tiendra compte à la fois de considérations physiques et mécaniques, économiques et opérationnelles.
Les supports utilisés peuvent se présenter sous des formes très diverses,par exemple de granules, poudre, billes, plaques, tubes, films, membranes, tissus, tricots, fils, fibres, profilés quelconques.
Par cellules microbiennes globulaires on comprend les microorganismes unicellulaires et les assemblages de microorganismes du type, par exemple, des levures, des bactéries, des microchampignons.
, Par couche cellulaire on comprend une couche cellulaire unique ou monocouche présentant sur la surface du support approximativement une assise cellulaire, qui peut être caractérisée par un nombre de cellules par unité �e surface, désigné par le terme densité de cellules immobilisées.
Le milieu aqueux de conditionnement est de préférence l'eau pure qui est le milieu le plus simple du point de vue chimique et économique. Il n'est pas exclu d'utiliser des solutions aqueuses de composés minéraux et/ou organiques. L'homme de l'art pourra faire choix de ces composés suivant les besoins et les objectifs à atteindre.
Il a été également découvert que.le moment de la récolte des cellules agit
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procédé de la présente invention. Cet effet bénéfique peut éventuellement s'additionner à celui obtenu par le conditionnement des cellules avant fixation sur le support solide.
Pour les cultures de Saccharomyces cerevisiae effectuées en milieu glucose, on obtient les meilleurs résultats en effectuant la récolte soit dans la phase où le glucose est consommé et l'éthanol produit, soit dans la phase stationnaire finale, plutôt que dans la phase stationnaire intermédiaire, qui sépare la phase où la levure produit l'éthanol et la phase où la cellule consomme l'éthanol produit antérieurement.
Pour mieux illustrer cet effet du moment de la récolte des cellules, on a effectué une culture de Saccharomyces cerevisiae dans le milieu suivant : 50 g/1 glucose, 20 g/1 yeast extract, 2 g/1 KH2PO4, 2g/l
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peuvent être situés sur la figure 1 donnant la concentration cellulaire de la culture en fonction du temps. Sur cette courbe la première phase de croissance exponentielle ABC correspond à la production d'éthanol à partir de glucose; après une phase stationnaire intermédiaire CD apparait une nouvelle phase de croissance exponentielle DE, pendant laquelle l'éthanol produit antérieurement est consommé par la levure.
Le conditionnement appliqué aux cellules récoltées est le suivant: 3 lavages à l'eau, remise en suspension dans l'eau à une concentration d'environ
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La suspension est versée dans un récipient au fond duquel se trouve une plaque de verre. On laisse sédimenter 24 heures; ensuite on lave la plaque durant 20 minutes par un flux laminaire d'eau de 4 mm d'épaisseur de vitesse moyenne de 8 cm/sec.
Les plaques sont examinées en microscopie optique; toutes les cellules immobilisées adhèrent au verre; leur densité est déterminée par comptage.
La figure 2 présente la quantité de cellules fixées par unité de surface du support en fonction du moment de la récolte.
Dans les cas les moins favorables le conditionnement a encore un effet bénéfique. En effet, si les cellules n'avaient été conditionnées de la manière décrite, la densité de cellules immobilisées serait extrêmement faible, inférieure à 600 cellules/mm<2>, et les cellules seraient distribuées de manière irrégulière.
La figure 3 présente l'évolution de la quantité de cellules fixées sur le polycarbonate suivant le moment de la récolte. On procède comme ci-dessus mais la plaque de verre est remplacée par une plaque de polycarbonate. Les résultats obtenus montrent l'effet bénéfique du choix du moment de la récolte combiné avec le conditionnement des cellules avant adhésion à un support solide. Si ce choix est à conseiller pour des raisons d'efficacité, il n'est pas absolument nécessaire de l'effectuer pour l'application du procédé faisant l'objet de la présente invention.
Le procédé d'immobilisation de cellules microbiennes globulaires par adhésion à un support solide est caractérisé en ce que les cellules microbiennes globulaires sont. conditionnées dans un milieu aqueux, de préférence dans de l'eau pure et ensuite sont mises en contact avec le support solide. Le contact a lieu sur toute ou une partie de la surface du support. Suivant une réalisation préférentielle de l'invention, le3 cellules sont mises au contact de la surface du support dans le milieu aqueux de conditionnement, par exemple par introduction du support dans le milieu de conditionnement des cellules. La durée du conditionnement des cellules doit être suffisante pour l'obtention des effets recherchés. Elle est en général d'au moins 5 heures et de préférence d'au moins 10 heures.
Des durées plus courtes ou plus longues peuvent être choisies en fonction du type de cellule et du matériau constituant le support, des modes opératoires et des conditions adoptées pour le conditionnement des cellules.
La température du milieu de conditionnement doit être choisie de manière à atteindre l'objectif recherché sans perte appréciable de la viabilité..des
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est en général d'environ 30[deg.]C.
Suivant une variante du procédé faisant l'objet de la présente invention, les cellules microbiennes sont récoltées dans les zones de temps de culture donnant les quantités élevées de cellules fixées et ensuite conditionnées dans un milieu aqueux comme décrit ci-avant.
Dans le cas de cultures de Saccharomyces cerevisiae la récolte a lieu soit à la fin de la phase exponentielle de croissance où le glucose est consommé et l'éthanol produit, représentée à la figure 1 par la courbe BC, soit dans la phase stationnaire finale, représentée par la courbe EF, où la cellule consomme l'éthanol produit, antérieurement. La récolte des cellules microbiennes dans la zone CD, correspondant à la première phase stationnaire est à déconseiller pour des raisons d'efficacité. On constate en effet que dans cette zone, les quantités de cellules fixées sont les plus faibles.
Dans le cas d'autres cellules microbiennes, il suffira,pour déterminer le moment de la récolte le plus favorable, de tracer les courbes donnant la densité de cellules immobilisées en fonction du moment de la récolte.
Les avantages obtenus grâce à cette invention sont l'obtention d'une assise unique de cellules toutes fixées au support, d'une quantité élevée de cellules immobilisées par unité de surface du support,d'une distribution régulière des cellules sur la surface du support, d'une forte adhésion des cellules au support.
L'immobilisation de cellules en une assise unique et régulière adhérant fortement au support présente l'avantage d'éliminer la diffusion, à travers un lit de cellules, des substances nutritives et.des métabolites produits, de permettre l'utilisation d'un flux élevé de liquide au contact des cellules et donc une diminution des limitations diffusionnelles à proximité de celles-ci, de permettre une regénération homogène de toute la population immobilisée, de permettre l'utilisation des cellules immobilisées sur support aussi bien en lit agité qu'en lit fixe.
Ces avantages sont particulièrement précieux pour certaines utilisations de ces cellules immobilisées, telles que l'assimilation ou la production de substances de poids moléculaire élevé, la réalisation d'un dispositif d'ensemencement en continu ou la réalisation d'un dispositif permettant de récolter des cellules de première génération n'ayant pas donné de cellules filles.
Le fait de ne pas introduire d'agent chimique autre que le support au contact des cellules et d'utiliser un support chimiquement inerte est un avantage appréciable pour certaines applications des cellules immobilisées.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs ci-après.
Exemple.1
On effectue une culture de Saccharomyces cerevisiae dans le milieu suivant : 30 g/1 glucose, 7 g/1 yeast nitrogen base, 20 mg/1 histidine pH 5.4. On effectue la récolte après 24 heures soit, pour les conditions de culture utilisées,en début de la phase stationnaire. Le traitement appliqué aux cellules récolcées est le suivant: 3 lavages à l'eau, remise en suspension dans l'eau à une concentration d'environ 250.106 cellules/ml, agitation de la suspension à 30[deg.]C pendant 24 heures dans un erlenmeyer bouché par un tampon d'ouate. Cette suspension est versée dans un récipient au fond duquel se trouve une plaque de verre préalablement nettoyée; le niveau de la suspension est de 7 mm au-dessus de la surface du verre.
On laisse sédimenter 24 heures; ensuite on lave la plaque durant 20 minutes par un flux laminaire d'eau de 4 mm d'épaisseur et de vitesse moyenne de 8 cm/sec. Les plaques sont examinées en microscopie optique; toutes les cellules immobilisées adhèrent au verre; leur densité est déterminée par comptage.
(. Pour un essai effectué, la densité des cellules en différents points d'une même plaque a les valeurs suivantes: 19000, 19600, 18300,
17000, 18500 cellules/mm<2>.
Pour un essai effectué à partir d'une autre culture, la densité des cellules en différents points d'une même plaque a les valeurs suivantes: 25600, 25400, 26300, 28600, 28300, 28400, 24400, 24200, 26800,
21300, 21000, 23300, 24600, 28300 cellules/mm<2>.
Les cellules immobilisées sont donc distribuées de manière régulière, formant une couche homogène. Le traitement des cellules ainsi im-
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gardent la capacité de réduire spontanément le bleu de méthylène.
Un essai comparatif a été réalisé dans les mêmes conditions que ci-dessus mais sans conditionnement des cellules microbiennes. Les résultats montrent que la densité de cellules immobilisées est inférieure à 600 cellules/mm<2>. Les cellules sont distribuées de manière irrégulière et ne forment pas une couche cellulaire homogène.
Exemple.2
On effectue une culture de Saccharomyces cerevisiae dans le milieu suivant: 50 g/1 glucose, 20 g/1 yeast extract, 2 g/1 KH2SO4, 2 g/1
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naire.
Le conditionnement appliqué aux cellules récoltées et le mode de mise en contact des cellules avec le support sont les mêmes que ceux décrits à l'exemple 1, mais la plaque de verre est remplacée par une plaque de polycarbonate. Les cellules immobilisées sont distribuées de manière régulière, formant une couche homogène dont la densité est de 6000 à 8000 cellules/mm2.
Le test au bleu de méthylène donne les mêmes résultats que pour l'exemple
1. Les cellules ainsi immobilisées gardent la capacité de se multiplier.
REVENDICATIONS.
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res par adhésion à un support solide, caractérisé en ce que les cellules microbiennes globulaires sont conditionnées dans un milieu aqueux et ensuite sont mises en contact avec le support solide.
'' Method of immobilizing globular microbial cells by
adhesion to a solid support ".
This invention was made by Mr. M. DE BREMAEKER, Mrs. M.GENNEN, Messrs. GJKAYEM, PGROUXHET, JLVAN HAECHT, from the Faculty of Agronomic Sciences of the Catholic University of Louvain, B-1348 Louvain-la-Neuve (Belgium).
The subject of the invention is a method of immobilizing globular microbial cells distributed in the form of a regular layer on a solid support, without the intervention of an external agent.
The invention also relates to the layer of microbial cells thus obtained.
Processes for immobilizing microbial cells are already known, using attachment to a support, formation of flakes or inclusion in a matrix. Immobilization by fixation, also called adhesion or adsorption, on a solid support has, compared to other methods, the advantage of maintaining direct contact of the entire microbial population with the liquid medium and, consequently, of reducing the limitation, by diffusional phenomena, of the speed of transfer of nutrients or substances produced by microorganisms.
Immobilization by fixation on a solid support can be carried out with certain organisms, in particular bacteria, by allowing the microbial population to develop in contact with the support. However, this technique has the drawback of requiring a fairly long contact time of the cells with the support, in the presence of nutritive substances, and of
do not allow control of the density and morphology of the film of immobilized cells.
To fix microorganisms on a support without development of the microbial population, certain methods call for the use of chemical reagents. mics intended to form a link between the support and the cells; however, the addition of chemical agents may be undesirable for certain applications.
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tion of harmful chemical reactions.
In certain processes not using chemical agents, the microorganisms are deposited in pores or in areas of the support protected from the direct flow of the ambient liquid. These methods have the disadvantage of giving a very heterogeneous distribution of the microorganisms on the surface of the support; they do not make it possible to obtain significant microorganism-support adhesion forces and therefore force the user to work with a low flow of liquid.
The simple adsorption process has the advantage of great simplicity and does not require the use of external agents involved in the connection between the cells and the support. The adsorption processes developed so far have not made it possible to obtain a single and regular layer of cells adhering strongly to the support.
The present invention, which applies to the immobilization of globular microbial cells, overcomes these various drawbacks and aims to fix a single cell layer, regularly distributed over the entire surface of the support, strongly adhering to the support, without the intervention of an external agent. In addition, the cells thus immobilized according to the method of the present invention have a high degree of viability, that is to say that a high proportion of them retains the ability to perform
In particular, it can be used for enzymatic reactions and to reproduce in an appropriate medium.
One of the aims of the invention is to fix a single cellular layer, distributed regularly over the entire surface of the support, strongly adhering to the support.
Another object of the invention is to obtain stable complexes formed from a single cell layer and from the support, which can be used directly in reactors, for example fermentation.
The invention, as characterized in the claims, consists in conditioning the globular microbial cells in an aqueous medium, for example in pure water, and then bringing them into contact with the surface of the support.
The cells brought into contact with the support without such conditioning do not adhere to it and are entrained as soon as the support is placed in a liquid flow. The effect of this conditioning is not fully explained.
It is however demonstrated, in the case of the conditioning of Saccharomyces cerevisiae by conservation in pure water, that during the conditioning of the cell. releases chemicals into the environment, changes the cell wall surface, conditioning decreases the repellant electrostatic component between cell and glass, conditioning in oxygenated media is more effective than conditioning in the environment anaerobic. It has also been shown that washing the cell with water after conditioning reduces the beneficial effects thereof. Preferably, it is in the conditioning medium that the cells are brought into contact with the surface of the cell. support.
The solid supports used according to the present invention comprise solid mineral and organic materials. The support to be used can be porous or not; for certain applications it may be preferable to use a non-porous support and not having cells on the surface, so that all of the immobilized cells can be directly exposed to the flow of a liquid.
Among the mineral compounds, mention may be made of the use of silica, silicates and aluminosilicates, metal oxides, metals and their alloys, etc. Glass, ceramic, slag, sand can be used, for example.
Among the organic compounds, mention may be made of the use of synthetic polymers and / or copolymers, for example polyamides, polyesters, poly-
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mentioned above constitute only examples of supports which can be used according to the present invention and are in no way limiting. When choosing the support, both physical and mechanical, economic and operational considerations will be taken into account.
The supports used can be in very diverse forms, for example granules, powder, beads, plates, tubes, films, membranes, fabrics, knits, threads, fibers, any profiles.
By globular microbial cells is understood the unicellular microorganisms and the assemblies of microorganisms of the type, for example, yeasts, bacteria, micro-fungi.
By cellular layer is understood a single cellular layer or monolayer having on the surface of the support approximately a cellular base, which can be characterized by a number of cells per unit e surface, designated by the term density of immobilized cells.
The aqueous conditioning medium is preferably pure water which is the simplest medium from the chemical and economic point of view. It is not excluded to use aqueous solutions of mineral and / or organic compounds. Those skilled in the art will be able to choose these compounds according to the needs and the objectives to be achieved.
It has also been discovered that the time of cell harvesting acts
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method of the present invention. This beneficial effect can possibly be added to that obtained by conditioning the cells before fixing to the solid support.
For the cultures of Saccharomyces cerevisiae carried out in a glucose medium, the best results are obtained by carrying out the harvest either in the phase where the glucose is consumed and the ethanol produced, or in the final stationary phase, rather than in the intermediate stationary phase, which separates the phase where the yeast produces ethanol and the phase where the cell consumes the ethanol produced previously.
To better illustrate this effect at the time of cell harvesting, a culture of Saccharomyces cerevisiae was carried out in the following medium: 50 g / 1 glucose, 20 g / 1 yeast extract, 2 g / 1 KH2PO4, 2g / l
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can be located in Figure 1 giving the cell concentration of the culture as a function of time. On this curve the first phase of exponential growth ABC corresponds to the production of ethanol from glucose; after an intermediate stationary phase CD appears a new phase of exponential growth DE, during which the ethanol produced previously is consumed by the yeast.
The conditioning applied to the harvested cells is as follows: 3 washes with water, resuspended in water at a concentration of approximately
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The suspension is poured into a container at the bottom of which is a glass plate. It is left to sediment for 24 hours; then the plate is washed for 20 minutes with a laminar flow of water with a thickness of 4 mm and an average speed of 8 cm / sec.
The plates are examined by light microscopy; all immobilized cells adhere to the glass; their density is determined by counting.
Figure 2 shows the quantity of cells fixed per unit area of the support depending on the time of harvest.
In the least favorable cases, conditioning still has a beneficial effect. Indeed, if the cells had not been conditioned in the manner described, the density of immobilized cells would be extremely low, less than 600 cells / mm 2, and the cells would be distributed irregularly.
Figure 3 shows the evolution of the quantity of cells attached to the polycarbonate depending on the time of harvest. The procedure is as above, but the glass plate is replaced by a polycarbonate plate. The results obtained show the beneficial effect of the choice of the time of harvest combined with the conditioning of the cells before adhesion to a solid support. If this choice is to be advised for reasons of efficiency, it is not absolutely necessary to make it for the application of the process which is the subject of the present invention.
The method of immobilizing globular microbial cells by adhesion to a solid support is characterized in that the globular microbial cells are. conditioned in an aqueous medium, preferably in pure water and then are brought into contact with the solid support. The contact takes place on all or part of the surface of the support. According to a preferred embodiment of the invention, the 3 cells are brought into contact with the surface of the support in the aqueous conditioning medium, for example by introducing the support into the conditioning medium of the cells. The duration of the conditioning of the cells must be sufficient to obtain the desired effects. It is generally at least 5 hours and preferably at least 10 hours.
Shorter or longer durations can be chosen according to the type of cell and the material constituting the support, the operating methods and the conditions adopted for the conditioning of the cells.
The temperature of the packaging medium must be chosen so as to achieve the desired objective without appreciable loss of viability.
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is generally about 30 [deg.] C.
According to a variant of the process which is the subject of the present invention, the microbial cells are harvested in the culture time zones giving the high quantities of fixed cells and then conditioned in an aqueous medium as described above.
In the case of Saccharomyces cerevisiae cultures, the harvest takes place either at the end of the exponential growth phase where the glucose is consumed and the ethanol produced, represented in FIG. 1 by the curve BC, or in the final stationary phase, represented by the curve EF, where the cell consumes the ethanol produced, previously. The collection of microbial cells in the CD area, corresponding to the first stationary phase is not recommended for reasons of efficiency. In fact, it can be seen that in this zone, the quantities of fixed cells are the lowest.
In the case of other microbial cells, it will suffice, to determine the most favorable harvest time, to draw the curves giving the density of immobilized cells as a function of the harvest time.
The advantages obtained thanks to this invention are the obtaining of a single base of cells all fixed to the support, of a high quantity of cells immobilized per unit area of the support, of a regular distribution of the cells on the surface of the support. , strong adhesion of the cells to the support.
The immobilization of cells in a single and regular base strongly adhering to the support has the advantage of eliminating the diffusion, through a bed of cells, of nutritive substances and of the metabolites produced, of allowing the use of a flux. high of liquid in contact with the cells and therefore a reduction of the diffusion limits near these, to allow a homogeneous regeneration of the whole immobilized population, to allow the use of the cells immobilized on support as well in agitated bed as in fixed bed.
These advantages are particularly valuable for certain uses of these immobilized cells, such as the assimilation or production of substances of high molecular weight, the production of a device for continuous seeding or the production of a device for harvesting first generation cells that did not produce daughter cells.
The fact of not introducing a chemical agent other than the support in contact with the cells and of using a chemically inert support is an appreciable advantage for certain applications of the immobilized cells.
The present invention will be better understood with the aid of the nonlimiting examples below.
Example.1
A culture of Saccharomyces cerevisiae is carried out in the following medium: 30 g / 1 glucose, 7 g / 1 yeast nitrogen base, 20 mg / 1 histidine pH 5.4. The harvest is carried out after 24 hours, that is, for the culture conditions used, at the start of the stationary phase. The treatment applied to the harvested cells is as follows: 3 washes with water, resuspension in water at a concentration of approximately 250.106 cells / ml, stirring of the suspension at 30 [deg.] C for 24 hours in an Erlenmeyer flask covered with a cotton ball. This suspension is poured into a container at the bottom of which is a previously cleaned glass plate; the level of the suspension is 7 mm above the surface of the glass.
It is left to sediment for 24 hours; then the plate is washed for 20 minutes with a laminar flow of water 4 mm thick and at an average speed of 8 cm / sec. The plates are examined by light microscopy; all immobilized cells adhere to the glass; their density is determined by counting.
(. For a test carried out, the density of the cells at different points on the same plate has the following values: 19000, 19600, 18300,
17000, 18500 cells / mm <2>.
For a test carried out from another culture, the density of the cells at different points on the same plate has the following values: 25600, 25400, 26300, 28600, 28300, 28400, 24400, 24200, 26800,
21300, 21000, 23300, 24600, 28300 cells / mm <2>.
The immobilized cells are therefore distributed regularly, forming a homogeneous layer. The processing of cells thus im-
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retain the ability to spontaneously reduce methylene blue.
A comparative test was carried out under the same conditions as above but without conditioning the microbial cells. The results show that the density of immobilized cells is less than 600 cells / mm <2>. The cells are distributed irregularly and do not form a homogeneous cell layer.
Example 2
A culture of Saccharomyces cerevisiae is carried out in the following medium: 50 g / 1 glucose, 20 g / 1 yeast extract, 2 g / 1 KH2SO4, 2 g / 1
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nary.
The packaging applied to the harvested cells and the method of bringing the cells into contact with the support are the same as those described in Example 1, but the glass plate is replaced by a polycarbonate plate. The immobilized cells are distributed regularly, forming a homogeneous layer with a density of 6000 to 8000 cells / mm2.
The methylene blue test gives the same results as for the example
1. The cells thus immobilized keep the capacity to multiply.
CLAIMS.
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res by adhesion to a solid support, characterized in that the globular microbial cells are conditioned in an aqueous medium and then are brought into contact with the solid support.