"Procédé d'immobilisation de cellules microbiennes globulaires par
adhésion à un support solide".
Cette invention a été réalisée par Monsieur M. DE BREMAEKER, Madame M.GENNEN, Messieurs G.J.KAYEM, P.G.ROUXHET, J.L.VAN.HAECHT, de la Faculté des Sciences Agronomiques de l'Université Catholique de Louvain, B-1348 Louvain-La-Neuve (Belgique).
L'invention a pour objet un procédé d'immobilisation de cellules microbiennes globulaires distribuées sous forme d'une couche-régulière sur un support solide, par l'intermédiaire de particules colloldales.
L'invention a également pour objet la couche de cellules microbiennes ainsi obtenues.
On connaît déjà des procédés d'immobilisation de cellules mi-
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flocons ou à l'inclusion dans une matrice. L1 immobilisation par fixation, également appelée adsorption ou adhésion, sur un support solide présente par rapport aux autres procédés l'avantage de maintenir un contact direct de l'ensemble de la population microbienne avec le milieu liquide et, en conséquence, de réduire la limitation par les phénomènes diffusionnels du transfert des substances nutritives ou des substances produites par les microorganismes. Elle présente également l'avantage de fournir un système dont la géométrie ne peut pas se modifier au cours de l'utilisation.
Le procédé faisant l'objet du brevet belge 804.502 est relatif à l'obtention de flocons de cellules microbiennes par la formation de chélate entre les cellules et des hydroxydes métalliques. Il présente l'inconvénient de ne pas maintenir un contact direct de l'ensemble de la population microbienne immobilisée avec le milieu liquide. Le brevet USA
4.115.198, visant principalement l'immobilisation d'enzymes sur un support mais mentionnant la possibilité d'immobiliser des cellules entières, fait appel à un recouvrement du support par précipitation sur ce dernier d'un oxyde métallique hydraté.
Il est souligné dans l'exposé de ce brevet que le mélange des particules de support avec l'oxyde métallique déjà précipité ne donne pas un matériau sur lequel peut se réaliser l'immobilisation; la fixation des substances biologiquement actives est attribuée à la formation de chélate. Ce procédé présente l'inconvénient de former nécessairement des précipités en présence du support, ce qui exige la manipulation de réactifs chimiques et lie la reproductibilité des résultats à un contrale rigoureux de la composition chimique de la solution mise en présence du support.
Un des objets de la présente invention est de développer un procédé d'immobilisation des cellules microbiennes par un procédé simple
et efficace ne nécessitant pas de modes opératoires compliqués.
La présente invention a pour but de fixer une couche cellulaire unique, distribuée régulièrement sur toute la surface du support, adhérant fortement au support, par l'intermédiaire de particules colloidales.
Les cellules immobilisées suivant le procédé de la présente invention présentent un degré Je viabilité élevé, c'est-à-dire qu'une proportion élevée d'entre elles conserve la capacité de réaliser notamment des réactions enzymatiques et de se reproduire dans un milieu approprié.
Un autre but de l'invention est d'obtenir des complexes stables formés d'une couche cellulaire unique et du support pouvant être utilisés directement dans des réacteurs, par exemple de fermentation. Par complexes stables,on comprend également des complexes de nature différente
(support et/ou cellule microbienne) pouvant être combinés et utilisés par exemple sous forme de couches lamellaires multiples. On peut par exemple superposer sur un même support des couches cellulaires immobilisées de différents microorganismes, ou superposer une série de complexes constitués chacun d'un support auquel est fixée une couche cellulaire, les microorganismes étant de nature identique ou différente d'une couche à l'autre ou au sein de la même couche. Toutes les combinaisons sont possibles tout en ne sortant pas du cadre de la présente invention.
L'invention, telle que caractérisée dans les revendications, consiste à traiter, préalablement à l'immobilisation, les cellules ou le support solide par des particules colloïdales, de manière à former une couche régulière de particules colloïdales sur les cellules ou le support so-
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le s'explique par une résultante favorable des interactions aux interfaces. Parmi ces interactions on peut distinguer les interactions électrostatiques
(charge-charge et charge-dipOle), les interactions de Van der Waals, les liaisons hydrogène.
Etant donné l'importance des interactions électrostatiques charge-charge, le fait que le colloïde aie une charge superficielle opposée à celle de la cellule et à celle du support est un élément très favorable; il n'est cependant pas indispensable. On peut adsorber sur le support les particules colloïdales formées indépendamment et mettre ensuite les cellules en contact avec le support ainsi traité. On peut adsorber sur les cellules les particules colloïdales formées indépendamment et ensuite adsorber les cellules ainsi traitées sur le support.
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superficiellement le métal, de manière à former à sa surface une couche régulière de particules colloïdales de ce métal et mettre ensuite les cellules microbiennes en contact avec le support ainsi traité.
Les supports solides utilisés suivant la présente invention comprennent des matériaux solides minéraux et organiques. Le support à utiliser peut être poreux ou non; pour certaines applications il peut être préférable d'utiliser un support non poreux et ne présentant pas des alvéoles en surface, de manière à ce que toutes les cellules immobilisées puissent être directement exposées au flux d'un liquide. Parmi les composés minéraux, citons l'utilisation de silice, de silicates et d'aluminosilicates, d'oxydes métalliques, de métaux et de leurs alliages etc... On peut utiliser par exemple le verre, une céramique, le laitier, le sable.
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polymères synthétiques, par exemple les polyamides, les polyesters, les polyoléfines, les composés vinyliques.
Les composés minéraux et organiques cités ci-avant ne constituent que des exemples de supports pouvant être utilisés suivant la présente invention et ne sont nullement limitatifs. Pour le choix du support, on tiendra compte à la fois de considérations physiques et mécaniques, économiques et opérationnelles.
Les supports utilisés peuvent se présenter sous des formes très diverses, par exemple de granules, poudre, billet*, claques, tube"; films, membranes, tissus, tricots, fils, fibres, profilés quelconques.
Par cellules microbiennes globulaires,on comprend les microorganismes unicellulaires et les assemblages de microorganismes du type, par exemple, des levures, des bactéries, des microchampignons.
Par couche cellulaire,on comprend une couche cellulaire unique ou monocouche présentant sur la surface du support approximativement une assise cellulaire, qui peut être caractérisée par un nombre de cellules par unité de surface, désigné par le terme densité de cellules immobilisées.
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vention pour le traitement des cellules ou du support solide sont utilisées sous forme d'une suspension, par exemple dans l'eau. Toutefois pour le traitement du support on peut utiliser une suspension en milieu non aqueux, par exemple dans un solvant organique tel qu'un alcool:
Parmi les particules colloïdales utilisées on utilisera de préférence cel-
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le, soit de la suspension cellulaire, possèdent une charge superficielle du signe contraire de la charge des cellules et/ou du support. A titre d'exemple citons les oxydes et hydroxydes métalliques et les colloïdes organiques.
Parmi les hydroxydes métalliques, citons à titre d'exemple l'oxyde et l'hydroxyde de fer et d'aluminium et leurs combinaisons amorphes ou cristalli-
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Parmi les colloïdes organiques, citons à titre d'exemple les suspensions de type latex naturel ou syntnetique.
Dans le cas du traitement du support solide par une suspension de particules colloïdales formées indépendamment, les conditions opératoires doivent permettre aux particules colloïdales d'entrer en contact avec le support et de le recouvrir de manière à obtenir une couche régulière de particules colloïdales sur celui-ci. Le moyen le plus simple et non limitatif pour réaliser ce contact est d'utiliser la sédimentation d'une suspension de volume et de concentration suffisantes. L'homme de l'art fera le choix du pH, de la concentration, de la température pour obtenir les effets recherchés.
Suivant une variante de la présente invention on traite superficiellement le support solide constitué d'un métal de manière à former à sa surface une couche régulière de particules colloïdales d'oxyde et/ou d'hydroxyde de ce métal et on met ensuite les cellules microbiennes en contact avec le support ainsi traité.
Divers matériaux métalliques peuvent convenir pour ce traitement superficiel, en vue de former à leur surface des particules colloïdales. A titre d'exemple, citons l'aluminium, le fer, le titane et leurs alliages.
L'homme de l'art fera choix du type de traitement, chimique; électrochimi-
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Dans le cas de l'aluminium, on peut créer cette couche unique de particules colloïdales par un simple traitement à la soude caustique, par exemple par utilisation de NaOH (IN) à une température de 22[deg.]C pendant 5 minutes. On obtient de cette manière une surface matte très régulière. Par ce traitement, on forme à la surface de l'aluminium des particules colloïdales d'oxyde hydraté d'Al.
Suivant cette invention il n'est pas nécessaire d'effectuer un séchage du support, même après la fixation des particules colloïdales formées antérieurement.
Suivant une autre variante du procédé, les cellules microbiennes peuvent être traitées préalablement à leur immobilisation sur un support solide, par une suspension de particules colloïdales. Les particules colloïdales
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soit sous forme d'une suspension aqueuse ou autre. Eventuellement, les cellules peuvent être dispersées dans la suspension de particules colloïdales. Le temps de contact et les quantités de cellules et de particules colloïdales mises en présence doivent être tels que les cellules puissent être recouvertes d'une couche de particules collotdales.
L'immobilisation des cellules microbiennes est obtenue par mise en contact de la cellule avec le support, l'un des deux étant couvert de particules colloïdales. Cette immobilisation est obtenue par la mise en présence avec le support d'une suspension aqueuse de cellules microbiennes. d'une concentration suffisante pour réaliser la couche cellulaire. Après un temps de contact de quelques heures et l'élimination par lavage des cellules non fixées, on constate la fixation d'une couche cellulaire sur le support. Cette durée de contact doit être suffisante et est en général d'environ 4 heures. Ceci n'exclut pas des durées plus courtes ou plus longues. Dans le cas d'un temps de contact trop prolongé, par exemple de 24 heures, entre la suspension cellulaire et le support, on constate une proportion
de viabilité des cellules plus faible.
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d'une assise unique de cellules fixées au support, d'une quantité élevée de cellules immobilisées par unité de surface du support, d'une distribution régulière des cellules sur la surface du support, d'une forte adhésion des cellules au support.
L'immobilisation de cellules en une assise unique et régulière adhérant fortement au support présente l'avantage d'éliminer la diffusion, à travers un lit de cellules, des substances nutritives et des métabolites produits, de permettre l'utilisation d'un flux élevé de liquide au contact des cellules et donc une diminution des limitations diffusionnelles à proximité de celles-ci, de permettre une régénération homogène de toute la population immobilisée, de permettre l'utilisation des cellules immobilisées sur support aussi bien en lit agité qu'en lit fixe. Ces avantages sont particulièrement précieux pour certaines utilisations de ces cellules immobilisées,telles que l'assimilation ou la production de susbstances de poids moléculai-
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dispositif permettant de récolter des cellules de première génération,n'ayant pas donné de cellules filles. Le fait de ne pas impliquer l'utilisation de solutions de sels hydrolysables, est également un avantage.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs ci-après.
Exemple.
On dispose d'une suspension aqueuse d'hydroxyde d'aluminium préparée suivant Brace et Matijevic (J. Inorganic Nuclear Chemistry, 35,
3641, 1973); les particules ont la forme de sphères dont le diamètre moyen
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2.0 à 3. 0 109 particules/ml et de pH 9,1 à température ambiante dans un récipient au fond duquel est placée une plaque de verre; le niveau de la suspension est à 1 cm au-dessus de la surface du verre. On laisse sédimenter les particules d'alumine pendant 12 à 15 heures. Ensuite on lave la lame de verre par un flux laminaire d'eau de 2 mm d'épaisseur. Après 30 minutes de lavage à une vitesse moyenne de 10 cm/sec., on arrive à un nombre stationnaire de particules fixées égal à environ 1,5 109 particules/cm<2>,ce qui correspond bien à une couche unique et assez dense de particules d'hy- droxyde d'aluminium sur le verre.
La plaque de verre ainsi conditionnée est placée dans un ré- cipient dans lequel on verse une suspension de Saccharomyces cerevisiae d'une concentration de 30 à 50.106 cellules/ml, à un pH compris entre ; et 9; le niveau de la suspension cellulaire est à 0.5 cm au-dessus de la surface du verre. Après 3 à 4 heures de contact, on lave la lame de verre dans un flux d'eau de 2 mm d'épaisseur, à une vitesse de 20 cm/sec., pendant 15 à 20 minutes.
Les cellules immobilisées sont examinées en microscopie optique et comptées. Les cellules immobilisées sont distribuées de manière régulière, formant une couche cellulaire homogène dont la densité est donnée au tableau I.
TABLEAU.1
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Une proportion d'au moins 90 7. des cellules immobilisées ne se colorent pas par le bleu de méthylène et gardent donc la capacité de réduire spontanément celui-ci. Les cellules ainsi immobilisées gardent la capacité de se multiplier.
Un essai comparatif a été réalisé dans les mêmes conditions que ci-dessus mais sans traitement du support par des particules colloïdales; les résultats montrent que la densité de cellules immobilisées est inférieure à 600 cellules/mm<2>. Les cellules sont distribuées de manière irrégulière et ne forment pas une couche cellulaire homogène.
Exemple.2
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vant Matijevic et Scheiner (J. Colloid Interface Sci., 63, 509, 1978); les particules ont la forme de cubes dont les angles sont arrondis et dont la
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concentration d'au moins 8.10[deg.] particules/ml, à température ambiante dans un récipient au fond duquel est placée une plaque de verre; le niveau de la suspension est de 1 cm au-dessus de la surface du verre. Après une attente de 22 heures, qui permet aux particules de sédimenter, les plaques sont lavées par un flux laminaire d'eau de 2mm d'épaisseur. Un lavage à une vitesse moyenne de 41 cm/sec pendant 10 minutes conduit à un nombre
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qui correspond bien à une couche unique de particules d'hématite serrées les unes contre les autres.
On prépare une suspension de Saccharomyces cerevisiae d'une
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sirée (4 ou 6). On verse cette suspension dans un récipient dans lequel se trouvent des plaques de verre recouvertes d'aine couche d'hématite comme décrit ci-dessus; le niveau de la suspension est à 1 cm au-dessus de la surface du verre. Après avoir laissé reposer durant 4 heures, on lave les plaques par un flux laminaire d'une solution de même pH que le pH de la suspension cellulaire; le liquide de lavage a une épaisseur de 2 mm et une vitesse moyenne de 14 cm/sec.; le lavage est poursuivi durant un temps donné (10, 30 ou 60 minutes).
Les plaques sont examinées en microscopie optique et les cellules fixées sont comptées. Les cellules immobilisées sont distribuées de manière régulière formant une couche cellulaire homogène dont la densité est donnée au tableau II.
La densité de cellules immobilisées est plus faible que dans l'exemple 1, ce qui s'explique par la dimension plus grande des particules d'hématite, qui donne au joint entre les cellules et le support des propriétés différentes.
TABLEAU.IL
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che de particules d'hématite.
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Les cellules ainsi immobilisées gardent la capacité de se multiplier. Les résultats du test au bleu de méthylène sont également présentés au tableau II. Il faut souligner que la perte de la capacité de réduire le bleu de méthylène de la part d'une certaine proportion de cellules n'est pas due à leur immobilisation. L'examen des cellules libres conservées dans l'eau pendant 4 heures donne des résultats semblables à ceux rapportés au tableau II.
Exemple.3
Une tôle d'aluminium est dégraissée par une solution de poly-
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5 minutes à température ambiante puis rincée à l'eau. La tôle ainsi traitée est maintenue au contact d'eau chaude à 98[deg.]C pendant 10 à 15 minutes. On obtient ainsi une surface matte très régulière.
La tOle ainsi conditionnée est placée dans un récipient dans lequel on verse une suspension de Saccharomyces cerevisiae d'une concentration de 30 à 50.106 cellules/ml, dont le pH est compris entre 4 et 9. Cette opération et le lavage ultérieurs sont réalisés de la manière décrite dans l'exemple 1.
Les cellules immobifisées sont distribuées de manière régulière tentant une couche cellulaire homogène dont la densité est donnée au tableau III.
TABLEAU.III
Immobilisation de Saccharomyces cerevisiae sur une tôle d'aluminium dégraissée, puis traitée à la soude et à l'eau chaude.
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[deg.] dent la capacité de réduire le bleu de méthylène. Les cellules ainsi immo-
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La quantité de cellules immobilisées est plus élevée que dans l'exemple 1, en raison de la texture différente du joint entre la cellule et le support.
Un essai comparatif a été réalisé dans les mêmes conditions que ci-dessus, en dégraissant seulement la tôle d'aluminium et en la lavant à l'eau distillée; les résultats montrent que la densité de cellules immobilisées est négligeable.
Exemple.4
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à l'eau.à 22[deg.]C. La tôle ainsi conditionnée est placée dans un récipient dans lequel on verse une suspension de Saccharomyces cerevisiae à pH compris entre 4 et 9. Cette opération et le lavage ultérieurs sont réalisés de la manière décrite à l'exemple 1. On obtient ainsi la fixation de 33700
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Les résultats du test au bleu de méthylène et du test de multiplication cellulaire sont les mêmes qu'à l'exemple 3.
t Exemple.5
On dispose de la suspension d'hydroxyde d'aluminium utilisée pour l'exemple 1. On dispose d'une suspension de cellules de Saccharomyces cerevisiae. On mélange une certaine quantité de la suspension d'hydroxyde d'aluminium et une certaine quantité de la suspension cellulaire dans des tubes en polypropylène, de manière à obtenir 40 ml du mélange à une concentration cellulaire de 106 cellules/ml et une concentration d'hydroxyde d'aluminium variable. Les tubes sont ensuite agités pendant un temps donné à température ambiante.
Une partie des particules d'hydroxyde d'aluminium s'adsorbe sur les cellules de levure. Pour mesurer la quantité d'hydroxyde d'aluminium adsorbé on laisse sédimenter les cellules à température ambiante; on dose les particules restant en suspension par turbidimétrie; on dose les particules adsorbées par analyse de l'aluminium par absorption atomique après traitement acide du sédiment de cellules.
Un examen de l'évolution de la quantité fixée en fonction du temps de contact entre les cellules et les particules colloïdales, à pH 6, montre que l'on obtient une valeur stationnaire après 15 heures.
Des expériences répétées pour différentes concentrations initiales en hydroxyde d'aluminium permettent d'obtenir une courbe donnant la quantité de particules colloïdales fixées en fonction de leur concentration en suspension et ce, pour des pH de 4, 6 et 8. Les résultats obtenus montrent que l'on peut fixer 1580 particules d'aluminium par cellule de levu-
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l'adsorption d'une couche serrée de particules d'hydroxyde d'aluminium correspondrait à 1780 particules par cellule. Les cellules peuvent donc être recouvertes d'une couche de particules colloïdales.
Après ce traitement les cellules peuvent être fixées sur une plaque de verre par une opération de sédimentation suivie d'un lavage des cellules excédentaires.
Les cellules ainsi conditionnées ont gardé la capacité de se multiplier.
REVENDICATIONS.
a
1. Procédé d'immobilisation de cellules microbiennes globulaires -sur un support solide, caractérisé eu ce que, préalablement à l'immobilisation, les cellules ou le support solide sont traités de manière à former une couche unique de particules collotdales sur les cellules ou le support solide.
"Method for immobilizing globular microbial cells by
adhesion to a solid support ".
This invention was made by Mr. M. DE BREMAEKER, Mrs. M.GENNEN, Messrs. GJKAYEM, PGROUXHET, JLVAN.HAECHT, from the Faculty of Agronomic Sciences of the Catholic University of Louvain, B-1348 Louvain-La- Neuve (Belgium).
The subject of the invention is a method of immobilizing globular microbial cells distributed in the form of a regular layer on a solid support, by means of colloidal particles.
The invention also relates to the layer of microbial cells thus obtained.
Methods for immobilizing mid-cells are already known
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flakes or inclusion in a matrix. L1 immobilization by fixation, also called adsorption or adhesion, on a solid support has, compared to other methods, the advantage of maintaining direct contact of the entire microbial population with the liquid medium and, consequently, of reducing the limitation by the diffusional phenomena of the transfer of nutrients or substances produced by microorganisms. It also has the advantage of providing a system whose geometry cannot change during use.
The process which is the subject of Belgian patent 804.502 relates to obtaining microbial cell flakes by the formation of chelates between the cells and metal hydroxides. It has the drawback of not maintaining direct contact of the entire immobilized microbial population with the liquid medium. The USA patent
4,115,198, mainly aimed at immobilizing enzymes on a support but mentioning the possibility of immobilizing whole cells, calls for covering the support by precipitation on the latter of a hydrated metal oxide.
It is emphasized in the description of this patent that the mixture of the support particles with the already precipitated metal oxide does not give a material on which the immobilization can be carried out; the fixation of biologically active substances is attributed to the formation of chelate. This process has the disadvantage of necessarily forming precipitates in the presence of the support, which requires the handling of chemical reagents and links the reproducibility of the results to a rigorous control of the chemical composition of the solution brought into contact with the support.
One of the objects of the present invention is to develop a method for immobilizing microbial cells by a simple method
and effective without the need for complicated procedures.
The present invention aims to fix a single cellular layer, regularly distributed over the entire surface of the support, strongly adhering to the support, by means of colloidal particles.
The cells immobilized according to the method of the present invention have a high degree of viability, that is to say that a high proportion of them retains the capacity in particular to carry out enzymatic reactions and to reproduce in an appropriate medium. .
Another object of the invention is to obtain stable complexes formed from a single cell layer and from the support which can be used directly in reactors, for example fermentation. By stable complexes, we also understand complexes of different nature
(support and / or microbial cell) which can be combined and used for example in the form of multiple lamellar layers. It is possible, for example, to superimpose on the same support immobilized cell layers of different microorganisms, or to superimpose a series of complexes each consisting of a support to which a cell layer is fixed, the microorganisms being of identical nature or different from one layer to the other. or within the same layer. All combinations are possible while not departing from the scope of the present invention.
The invention, as characterized in the claims, consists in treating, before immobilization, the cells or the solid support with colloidal particles, so as to form a regular layer of colloidal particles on the cells or the solid support.
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le is explained by a favorable result of interactions at interfaces. Among these interactions we can distinguish electrostatic interactions
(charge-charge and charge-dipOle), Van der Waals interactions, hydrogen bonds.
Given the importance of electrostatic charge-charge interactions, the fact that the colloid has a surface charge opposite to that of the cell and that of the support is a very favorable element; however, it is not essential. The colloidal particles formed independently can be adsorbed on the support and then put the cells in contact with the support thus treated. It is possible to adsorb on the cells the colloidal particles formed independently and then to adsorb the cells thus treated on the support.
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the surface of the metal, so as to form on its surface a regular layer of colloidal particles of this metal and then bring the microbial cells into contact with the support thus treated.
The solid supports used according to the present invention comprise solid mineral and organic materials. The support to be used can be porous or not; for certain applications it may be preferable to use a non-porous support and not having cells on the surface, so that all of the immobilized cells can be directly exposed to the flow of a liquid. Among the mineral compounds, let us quote the use of silica, silicates and aluminosilicates, metallic oxides, metals and their alloys etc ... One can use for example glass, a ceramic, the slag, the sand .
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synthetic polymers, for example polyamides, polyesters, polyolefins, vinyl compounds.
The mineral and organic compounds mentioned above constitute only examples of supports which can be used according to the present invention and are in no way limiting. When choosing the support, both physical and mechanical, economic and operational considerations will be taken into account.
The supports used can be in very diverse forms, for example of granules, powder, ticket *, slaps, tube "; films, membranes, fabrics, knits, threads, fibers, any profiles.
The term “globular microbial cells” includes unicellular microorganisms and assemblies of microorganisms of the type, for example, yeasts, bacteria, micro-fungi.
By cell layer is understood a single cell layer or monolayer having on the surface of the support approximately a cell base, which can be characterized by a number of cells per unit area, designated by the term density of immobilized cells.
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vention for the treatment of cells or solid support are used in the form of a suspension, for example in water. However, for the treatment of the support, a suspension can be used in a non-aqueous medium, for example in an organic solvent such as an alcohol:
Among the colloidal particles used, it is preferable to use this.
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the, or of the cell suspension, have a surface charge of the opposite sign of the charge of the cells and / or of the support. By way of example, let us cite metallic oxides and hydroxides and organic colloids.
Examples of metal hydroxides include iron and aluminum oxide and hydroxide and their amorphous or crystalline combinations.
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Among the organic colloids, let us cite, by way of example, suspensions of the natural or syntnetic latex type.
In the case of the treatment of the solid support with a suspension of colloidal particles formed independently, the operating conditions must allow the colloidal particles to come into contact with the support and to cover it so as to obtain a regular layer of colloidal particles thereon. this. The simplest and non-limiting way to make this contact is to use the sedimentation of a suspension of sufficient volume and concentration. Those skilled in the art will choose the pH, the concentration, the temperature to obtain the desired effects.
According to a variant of the present invention, the solid support consisting of a metal is treated superficially so as to form on its surface a regular layer of colloidal particles of oxide and / or hydroxide of this metal and the microbial cells are then placed. in contact with the support thus treated.
Various metallic materials may be suitable for this surface treatment, in order to form colloidal particles on their surface. Examples include aluminum, iron, titanium and their alloys.
Those skilled in the art will choose the type of treatment, chemical; electrochemical
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In the case of aluminum, this single layer of colloidal particles can be created by a simple treatment with caustic soda, for example by using NaOH (IN) at a temperature of 22 [deg.] C for 5 minutes. This gives a very regular mat surface. By this treatment, colloidal particles of Al hydrated oxide are formed on the surface of the aluminum.
According to this invention, it is not necessary to dry the support, even after the colloidal particles formed previously have been fixed.
According to another variant of the process, the microbial cells can be treated prior to their immobilization on a solid support, with a suspension of colloidal particles. Colloidal particles
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either in the form of an aqueous suspension or other. Optionally, the cells can be dispersed in the suspension of colloidal particles. The contact time and the quantities of cells and colloidal particles brought into contact must be such that the cells can be covered with a layer of colloidal particles.
The immobilization of microbial cells is obtained by bringing the cell into contact with the support, one of the two being covered with colloidal particles. This immobilization is obtained by bringing the aqueous suspension of microbial cells into contact with the support. of sufficient concentration to achieve the cell layer. After a contact time of a few hours and the removal by washing of the non-fixed cells, there is the fixing of a cell layer on the support. This contact time must be sufficient and is generally around 4 hours. This does not exclude shorter or longer durations. In the case of a too prolonged contact time, for example 24 hours, between the cell suspension and the support, a proportion is observed
lower cell viability.
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a single base of cells fixed to the support, a high quantity of cells immobilized per unit area of the support, a regular distribution of the cells on the surface of the support, a strong adhesion of the cells to the support.
The immobilization of cells in a single and regular base strongly adhering to the support has the advantage of eliminating the diffusion, through a bed of cells, of the nutritive substances and metabolites produced, of allowing the use of a high flux. of liquid in contact with the cells and therefore a reduction in the diffusion limits in the vicinity of these, to allow a homogeneous regeneration of the entire immobilized population, to allow the use of the cells immobilized on a support both in a stirred bed and in a bed fixed. These advantages are particularly valuable for certain uses of these immobilized cells, such as the assimilation or the production of molecular weight substances.
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device for harvesting first generation cells, which have not produced daughter cells. The fact of not involving the use of hydrolyzable salt solutions is also an advantage.
The present invention will be better understood with the aid of the nonlimiting examples below.
Example.
There is an aqueous suspension of aluminum hydroxide prepared according to Brace and Matijevic (J. Inorganic Nuclear Chemistry, 35,
3641, 1973); the particles have the shape of spheres whose average diameter
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2.0 to 3.09 109 particles / ml and pH 9.1 at room temperature in a container at the bottom of which is placed a glass plate; the level of the suspension is 1 cm above the surface of the glass. The alumina particles are left to sediment for 12 to 15 hours. Then the glass slide is washed with a laminar flow of water 2 mm thick. After 30 minutes of washing at an average speed of 10 cm / sec., We arrive at a stationary number of fixed particles equal to about 1.5 109 particles / cm <2>, which corresponds well to a single and fairly dense layer. particles of aluminum hydroxide on the glass.
The glass plate thus conditioned is placed in a container into which a suspension of Saccharomyces cerevisiae with a concentration of 30 to 50.106 cells / ml is poured, at a pH between; and 9; the level of the cell suspension is 0.5 cm above the surface of the glass. After 3 to 4 hours of contact, the glass slide is washed in a flow of water 2 mm thick, at a speed of 20 cm / sec., For 15 to 20 minutes.
The immobilized cells are examined by light microscopy and counted. The immobilized cells are distributed regularly, forming a homogeneous cell layer, the density of which is given in Table I.
TABLE.1
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A proportion of at least 90% of the immobilized cells does not stain with methylene blue and therefore retain the capacity to spontaneously reduce this. The cells thus immobilized keep the capacity to multiply.
A comparative test was carried out under the same conditions as above but without treatment of the support with colloidal particles; the results show that the density of immobilized cells is less than 600 cells / mm <2>. The cells are distributed irregularly and do not form a homogeneous cell layer.
Example 2
<EMI ID = 15.1>
vant Matijevic and Scheiner (J. Colloid Interface Sci., 63, 509, 1978); the particles are in the form of cubes with rounded corners and the
<EMI ID = 16.1>
concentration of at least 8.10 [deg.] particles / ml, at room temperature in a container at the bottom of which is placed a glass plate; the level of the suspension is 1 cm above the surface of the glass. After a wait of 22 hours, which allows the particles to sediment, the plates are washed by a laminar flow of water 2 mm thick. Washing at an average speed of 41 cm / sec for 10 minutes leads to a number
<EMI ID = 17.1>
which corresponds well to a single layer of hematite particles pressed against each other.
A suspension of Saccharomyces cerevisiae of a
<EMI ID = 18.1>
sirée (4 or 6). This suspension is poured into a container in which there are glass plates covered with a layer of hematite as described above; the level of the suspension is 1 cm above the surface of the glass. After having allowed to stand for 4 hours, the plates are washed with a laminar flow of a solution of the same pH as the pH of the cell suspension; the washing liquid has a thickness of 2 mm and an average speed of 14 cm / sec .; washing is continued for a given time (10, 30 or 60 minutes).
The plates are examined by light microscopy and the fixed cells are counted. The immobilized cells are distributed regularly forming a homogeneous cell layer, the density of which is given in Table II.
The density of immobilized cells is lower than in Example 1, which is explained by the larger size of the hematite particles, which gives the joint between the cells and the support different properties.
TABLE.IL
<EMI ID = 19.1>
che of hematite particles.
<EMI ID = 20.1>
The cells thus immobilized keep the capacity to multiply. The results of the methylene blue test are also presented in Table II. It should be emphasized that the loss of the ability to reduce methylene blue from a certain proportion of cells is not due to their immobilization. Examination of the free cells stored in water for 4 hours gives results similar to those reported in Table II.
Example. 3
An aluminum sheet is degreased with a poly-
<EMI ID = 21.1>
5 minutes at room temperature then rinsed with water. The sheet thus treated is kept in contact with hot water at 98 [deg.] C for 10 to 15 minutes. This gives a very regular mat surface.
The sheet thus conditioned is placed in a container into which a suspension of Saccharomyces cerevisiae with a concentration of 30 to 50.106 cells / ml is poured, the pH of which is between 4 and 9. This operation and the subsequent washing are carried out from the as described in Example 1.
The immobilized cells are distributed regularly, attempting a homogeneous cell layer, the density of which is given in Table III.
TABLE.III
Immobilization of Saccharomyces cerevisiae on a degreased aluminum sheet, then treated with soda and hot water.
<EMI ID = 22.1>
<EMI ID = 23.1>
[deg.] dent the ability to reduce methylene blue. The cells thus immo-
<EMI ID = 24.1>
The amount of immobilized cells is higher than in Example 1, due to the different texture of the joint between the cell and the support.
A comparative test was carried out under the same conditions as above, by degreasing only the aluminum sheet and washing it with distilled water; the results show that the density of immobilized cells is negligible.
Example. 4
<EMI ID = 25.1>
with water. at 22 [deg.] C. The sheet thus conditioned is placed in a container into which a suspension of Saccharomyces cerevisiae at pH between 4 and 9 is poured. This operation and the subsequent washing are carried out as described in Example 1. The fixation of 33700
<EMI ID = 26.1>
The results of the methylene blue test and of the cell multiplication test are the same as in Example 3.
t Example.5
The suspension of aluminum hydroxide used for example 1 is available. A suspension of Saccharomyces cerevisiae cells is available. A certain amount of the aluminum hydroxide suspension and a certain amount of the cell suspension are mixed in polypropylene tubes, so as to obtain 40 ml of the mixture at a cell concentration of 106 cells / ml and a concentration of variable aluminum hydroxide. The tubes are then agitated for a given time at room temperature.
Part of the aluminum hydroxide particles adsorb on the yeast cells. To measure the quantity of aluminum hydroxide adsorbed, the cells are allowed to sediment at room temperature; the particles remaining in suspension are assayed by turbidimetry; the adsorbed particles are assayed by analysis of aluminum by atomic absorption after acid treatment of the cell sediment.
An examination of the evolution of the quantity fixed as a function of the contact time between the cells and the colloidal particles, at pH 6, shows that a stationary value is obtained after 15 hours.
Repeated experiments for different initial concentrations of aluminum hydroxide make it possible to obtain a curve giving the quantity of colloidal particles fixed as a function of their concentration in suspension and this, for pHs 4, 6 and 8. The results obtained show that 1580 aluminum particles can be fixed per yeast cell
<EMI ID = 27.1>
<EMI ID = 28.1>
the adsorption of a tight layer of aluminum hydroxide particles would correspond to 1780 particles per cell. The cells can therefore be covered with a layer of colloidal particles.
After this treatment, the cells can be fixed on a glass plate by a sedimentation operation followed by washing the excess cells.
The cells thus conditioned have kept the capacity to multiply.
CLAIMS.
at
1. Method for immobilizing globular microbial cells - on a solid support, characterized in that, prior to immobilization, the cells or the solid support are treated so as to form a single layer of colloidal particles on the cells or the solid support.