"Procédé d'immobilisation de cellules microbiennes globulaires par
adhésion à un support solide".
Cette invention a été réalisée par Monsieur M. DE BREMAEKER,
Madame M. GENNEN, Messieurs G. J. KAYEM, P.G.ROUXHET,
J. L. VAN HAECHT, de la Faculté des Sciences Agronomiques de l'Université Catholique de Louvain, B-1348 Louvain-la-Neuve (Belgique).
L'invention a pour objet un procédé d'immobilisation de
cellules microbiennes globulaires sous forme d'une couche régulière
sur un support solide, par l'adsorption d'ions métalliques sur le support
solide et /ou les cellules microbiennes.
L'invention a également pour objet la couche de cellules microbiennes
ainsi obtenues.
On connaît déjà des procédés d'immobilisation de cellules
microbiennes, faisant appel à la fixation sur un support, à la formation
de flocons ou à l'inclusion dans une matrice. L'immobilisation par fixation,
/ également appelée adsorption ou adhésion, sur un support solide présente par rapport aux autres procédés, l'avantage de maintenir un contact direct de l'ensemble de la population microbienne avec le milieu liquide et, en conséquence, de réduire la limitation, par les phénomènes diffusionnels, du transport des substances nutritives ou des substances produites par
les microorganismes. Elle présente également l'avantage de fournir un système dont la géométrie ne peut se modifier au cours de l'utilisation.
Le procédé faisant l'objet du brevet U.S.A. 3.821.086 permet la formation de flocons de cellules microbiennes sous l'action de poly-
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flocons par la formation de chélates entre les cellules microbiennes et des hydroxydes métalliques.
Ces procédés présentent l'inconvénient de ne pas maintenir un contact direct de l'ensemble de la population microbienne immobilisée avec le milieu liquide.
Le procédé décrit dans le brevet U. S. A . 4.115.198, visant principalement l'immobilisation d'enzymes mais mentionnant la possibilité d'immobiliser des cellules entières, fait appel à un recouvrement d'un support par précipitation sur ce dernier d'un oxyde métallique hydraté. La fixation des substances biologiquement actives est attribuée à la formation de chélates.
Ce procédé présente l'inconvénient de former nécessairement des précipités, ce qui exige un contrôle des caractéristiques de ces précipités.
Il est connu également de traiter par des métaux de transition un support organique, ensuite de le sécher et dele mettre en contact en milieu agité avec les cellules. (Ann. N. Y. Acad.Sci. 1979, 326, 249-54). Ce procédé présente l'inconvénient d'être limité à un support organique, d'exiger un séchage, qui est une opération longue et coûteuse, et de ne pas permettre un recouvrement régulier de la surface du support.
Un des objets de la présente invention est de développer un procédé d'immobilisation des cellules microbiennes globulaires par un procédé simple et efficace ne nécessitant pas de modes opératoires compliqué s .
La présente invention, basée sur l'adsorption d'ions métalliques sur les cellules microbiennes et/ou le support solide, a pour but
de fixer une couche cellulaire unique, distribuée régulièrement sur toute la surface du support et y adhérant fortement.
Les cellules immobilisées suivant le procédé de la présente invention présentent un degré de viabilité élevé, c'est-à-dire qu'une proportion élevée d'entre elles conserve la capacité de réaliser notamment des réactions enzymatiques et de se reproduire dans un milieu approprié.
Un autre but de l'invention est d'obtenir des complexes stables formés d'une couche cellulaire unique et du support pouvant être utilisés directement dans des réacteurs, par exemple de fermentation. Par complexes stables, on comprend également des complexes de nature différente
(support et/ou cellule) pouvant par exemple être combinés et utilisés sous forme de couches lamellaires multiples. On peut par exemple superposer sur un même support des couches cellulaires immobilisées de différents microorganismes, ou superposer une série de complexes constitués chacun d'un support auquel est fixée une couche cellulaire, les microorganismes étant de nature identique ou différente d'une couche à l'autre ou au sein de la même couche. Toutes les combinaisons sont possibles tout en ne sortant pas du cadre de la présente convention.
L'invention, telle que caractérisée dans les revendications, consiste à traiter, préalablement à l'immobilisation, les cellules et/ou le support, par des solutions contenant des ions métalliques simples et/ou des ions métalliques polynucléaires formés par association de plusieurs atomes métalliques, d'oxygènc et d'hydrogène. Ces ions simples et/ou polynucléaires s'adsorbent sur les matériaux traités.
Le lien entre les cellules et le support s'explique par une résultante favorable des interactions aux interfaces cellule-solution, support-solution et cellule-support. Parmi ces interactions, on peut distinguer les interactions électrostatiques (charge-charge et charge-dipôle), les interactions de Van der Waals, les liaisons hydrogène. Etant donné l'importance des interactions électrostatiques charge-charge, le fait que les ions adsorbés diminuent la charge du support ou de la cellule, ou rendent la charge de l'un de signe contraire à la charge de l'autre est un élément très favorable.
Pour expliquer le comportement des systèmes et le choix des conditions opératoires, il faut également tenir compte des propriétés chimiques de ces ions en fonction du pH.
Les supports solides utilisés suivant la présente invention comprennent des matériaux solides minéraux et organiques. Le support
à utiliser peut être poreux ou non ; pour certaines applications il peut être préférable d'utiliser un support non poreux et ne présentant pas des alvéoles en surface, de manière à ce que toutes les cellules immobilisées puissent être directement exposées au flux d'un liquide. Parmi les composés minéraux, citons l'utilisation de silice, de silicates et d'aluminosilicates, d'oxydes métalliques, de métaux et de leurs alliages, etc... On peut utiliser par exemple le verre, une céramique, le laitier, le sable. Parmi les composés organiques, citons l'utilisation de polymères et/ou copolymères synthétiques, par exemple les polyamides, les polyesters, les polyoléfines, les composés vinyliques.
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et ne sont nullement limitatifs. Pour le choix du support, on tiendra compte à la fois de considérations physiques et mécaniques, économiques et opérationnelles.
Les supports utilisés peuvent se présenter sous des formes très diverses, par exemple de granules, poudre, billes, plaques, tubes, filins, membranes, tissus, tricots, fils, fibres, profilés quelconques.
Par cellules microbiennes globulaires on comprend les
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du type, par exemple, des levures, des bactéries, des microchampignons.
Par couche cellulaire, on comprend une couche cellulaire unique ou monocouche présentant sur la surface du support approximativement une assise cellulaire, qui peut être caractérisée par un nombre
de cellules par unité de surface, designé par le terme densité de cellules immobilisée s.
Les solutions aqueuses contenant des ions métalliques simples ou polynucléaires utilisées suivant la présente invention sont obtenues à partir de sels métalliques, par exemple de chlorure, nitrate, sulfate, de magnésium et d'alcalino-terreux, d'aluminium, de métaux de transitions, notamment Cr, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, ces exemples n'étant pas limitatifs.
Pour obtenir des solutions d'ions métalliques simples, leur concentration doit être assez faible, leur pH assez bas et la température assez basse pour que, dans les conditions opératoires, la réaction des
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formation d'ions polynucléaires ou de précipité.
Les ions métalliques polynucléaires sont formés par association de plusieurs atomes métalliques identiques ou différents, d'oxygène, d'hydrogène et éventuellement d'autres éléments.
Pour obtenir des solutions d'ions métalliques polynucléaires, la concentration, le pH, la température et l'âge des solutions doivent être tels que la réaction des atomes métalliques avec l'oxygène et l'hydroxyle, et d'autres anions éventuellement présents dans la solution, donne lieu à la formation d'ions polynucléaires mais pas de précipité. Suivant les conditions qu'il recherche, l'homme de l'art peut faire varier la nature du
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des ablutions et introduire des réactifs, par exemple des complexants, susceptibles d'agir sur les processus chimiques impliquant les éléments métallique s .
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des ions métalliques simples et polynucléaires.
Suivant une première forme de réalisation de la présente invention, les cellules microbiennes globulaires sont traitées par des solutions aqueuses contenant des ions métalliques simples. Ce traitement
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10 ml d'une suspension de Saccharomyces cerevisiae à la concentration d'environ 500.106 cellulee/ml et 10 ml d'une solution de nitrate d'aluminium de 2 à 200 mg Al./l dans un tube de verre d'une contenance de 30 ml.
Le tube bouché est agité pendant 24 h à 25*C. Le pH des suspensions varie de 3,6 à 3,9 suivant leur composition. Les cellules sont séparées
de la solution par centrifugation et l'aluminium restant dans le surnageant est dosé par absorption atomique, la quantité d'aluminium fixé est déterminée par différence.
Les résultats obtenus indiquent que la quantité d'aluminium
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caractéristiques d'une adsorption spécifique.
Suivant une variante de réalisation du procédé, les supports solides sont traités par des solutions contenant des ions métalliques simples. Ce traitement est réalisé par exemple en immergeant le support solide dans une solution aqueuse contenant les ions ; le volume et la concentration de la solution sont choisis de manière à absorber une quantité suffisante d'ions à la surface du support.
Suivant une autre variante, on traite à la fois les cellules et
le support par des solutions contenant des ions métalliques simples. Dans ce cas, on opère comme ci-dessus pour chacun des traitements et on effectue ensuite l'immobilisation des cellules sur le support.
Suivant une deuxième forme de réalisation de la présente
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de réalisation comme indiqué ci-avant.
Il n'est pas exclu d'envisager le traitement des cellules par des solutions contenant des ions métalliques simples et du support solide par des solutions contenant des ions métalliques polynucléaires et inversément. Toutes les formes de combinaison sont possibles sans sortir du cadre de la présente invention.
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possède des groupements organiques capables de former des chélates avec les ions. n n'est pas nécessaire de sécher le support après son traitement par les ions. Moyennant une formulation correcte on peut se contenter de traiter les cellules par les ions.
Les avantages obtenus grâce à cette invention sont l'obtention d'une assise unique de cellules toutes fixées au support, d'une quantité élevée de cellules immobilisées par unité de surface du support, d'une distribution régulière des cellules sur la surface du support, d'une forte adhésion des cellules au support. L'immobilisation de cellules en une assise unique et régulière adhérant fortement au support présente l'avantage d'éli-
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et des métabolites produits à proximité de celles-ci, de permettre l'utili- sati on d'un. flux élevé de liquide au contact de cellules et donc une diminution des limitations diffusionnelles, de permettre une régénération homogène de toute la population immobilisée, de permettre l'utilisation des cellules immobilisées sur support aussi bien en lit agité qu'en lit fixe.
Ces avantages sont particulièrement précieux pour certaines utilisations
de ces cellules immobilisées, telles que l'assimilation ou la production de substances de poids moléculaire élevé, la réalisation d'un dispositif d'ensemencement en continu ou la réalisation d'un dispositif permettant de récolter des cellules de première génération n'ayant pas donné de cellules filles. Le fait de ne pas introduire d'agent chimique autre que le support au contact des cellules et d'utiliser un support chimiquement inerte est un avantage appréciable pour certaines applications des cellules immobilisées.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs ci-après.
Exemple 1.
On introduit simultanément 10 ml d'une suspension de Saccharomyces cerevisiae à la concentration d'environ 500.106 cellules/ml et
10 ml d'une solution aqueuse de nitrate d'aluminium d'une concentration de
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des ions simples. Ensuite, on verse la suspension dans un récipient dans lequel se trouve "ne plaque de verre. La hauteur de la suspension est de
0. 5 cm au-dessus du niveau de la plaque. Après environ 5 minutes, la plaque de verre est soumise à un lavage durant 20 minutes par un flux laminaire d'eau d'épaisseur de 4 mm et de vitesse moyenne de 8 cm/sec. Les plaques sont examinées en microscopie optique et les cellules immobilisées sont comptées.
Les cellules immobilisées sont distribuées de manière régulière, formant une couche cellulaire homogène d'une densité de 40 000 cel-
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immobilisées gardent la capacité de réduire spontanément ce colorant.
r Un essai comparatif a été réalisé dans les mêmes conditions
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irrégulière et ne forment pas une couche cellulaire homogène.
Exemple 2.
On procède comme décrit dans l'exemple 1 sauf que le support
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On obtient également une couche cellulaire régulière de cellules adhérant au support et résistant aux conditions de lavage décrites
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Exemple 3.
On procède comme décrit dans l'exemple 1, sauf que la suspension de cellules dans la solution aqueuse de nitrate d'aluminium est centrifugée à 2000 g durant 5 minutes et que les cellules sont remises en suspension dans l'eau, cette suspension étant versée sur la plaque de verre.
On obtient également une couche cellulaire régulière de cellules adhérant au support et résistant aux.conditions de lavage décrites
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Exemple 4.
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Le pH est soit laissé tel quel, soit ajusté à 3 par HN03.
Les récipients sont fermés et agités pendant 1 h. à température ambiante;
à ce stade les ions ferriques dissous sont des ions simples. Ensuite les suspensions cellulaires, contenant un excès d'ions, sont versées dans un récipient dans lequel se trouvent des plaques de verre. La hauteur de la solution est de 1 cm au-dessus de la surface du verre. Après 4 h , moment auquel la solution contient à la fois des ions simples et des ions polynucléaires, les plaques sont lavées durant 30 minutes par un flux d'eau d'une épaisseur de 4 mm et d'une vitesse moyenne de 8 cm/sec. Les plaques sont examinées en microscopie optique et les cellules immobilisées sont comptées.
Tableau 1 : Résultats d'immobilisation sur le verre de cellules de Saccharomyces cerevisiae par traitement de celles-ci et du support par des solutions contenant des ions ferriques.
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de manière régulière, formant une couche cellulaire homogène dont la densité est donnée au tableau 1.
Il faut souligner qu'aucun précipité d'un composé du fer ne ! se forme dans ces conditions opératoires.
Le test au bleu de méthylène indique que 90 à 99 % des cellules immobilisées gardent la capacité de réduire spontanément le colorant, Les cellules immobilisées gardent la capacité de se multiplier.
Exemple 5.
On mélange dans des récipients en plastique 20 ml d'une suspension de Saccharomyces cerevisiae à la concentration d'environ 400.106 cellules/ml et 20 ml d'une solution fraîchement préparée de nitrate fer-
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Les récipients sont fermés et agités durant 15 h. à température ambiante. Ensuite la suspension cellulaire est centrifugée à 2000 g durant 5 minutes ; le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans l'eau. Cette suspension est versée sur des plaques de verre comme décrit dans l'exemple 4 ; les plaques sont lavées et examinées comme décrit dans l'exemple 1.
On obtient une couche régulière unique de cellules adhérant
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Les conditions physico-chimiques (concentration, pH, Sge) de la solution ferrique au contact des cellules sont telles qu'elle contient des (ions) polynucléaires. De plus, elle ne contient aucun précipité d'un composé du fer, ce qui présente l'avantage d'obtenir un dépôt très régulier adhérant fortement au support.
Exemple 6.
Des plaques de verre sont immergées pendant un temps donné dans des solutions aqueuses fraîchement préparées de nitrate
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de traitement sont telles qu'elle contient des ions polynucléaires ; elle
ne contient aucun précipité d'un composé du fer.
Les plaques ainsi traitées sont rincées à l'eau et placées dans un récipient dans lequel on verse 50 ml d'une suspension cellulaire de Saccharomyces cerevisiae à la concentration d'environ 250.106 cellules/ ml. Après 4 h les plaques sont lavées durant 30 minutes par un flux laminaire d'eau d'une épaisseur de 4 mm et d'une vitesse moyenne de
8 cm/sec. Les plaques sont examinées en microscopie optique et les cellules immobilisées sont comptées.
Dans tous les cas, les cellules immobilisées sont distribuées de manière régulière, formant une couche cellulaire homogène dont la densité est présentée au tableau 2.
Les résultats du test au bleu de méthylène et du test de multiplication cellulaire sont les mêmes que pour l'exemple 4.
Tableau 2 : Résultats d'immobilisation de cellules de saccharomyces
cerevisiae sur le verre par traitement préalable du support par une solution contenant des ions ferriques.
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Exemple 7.
On mélange 20 ml d'une suspension de Saccharomyces cerevisiae avec 20 ml d'une solution agueuse fraîchement préparée, de nitrate
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ambiante, les cellules sont alors séparées de la solution par centrifugation à 2 000 g pendant 5 minutes, et remises en suspension dans 40 ml d'eau ou d'une solution de HN03 à pH 3.
Des plaques de verre sont immergées dans une solution aqueuse
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La durée du trempage est soit de une heure, soit de deux jours. Ensuite
les plaques sont rincées à l'eau.
Les plaques de verre humides, ainsi traitées par les ions métalliques, sont placées dans un récipient dans lequel on verse la suspension cellulaire dont les cellules ont été traitées par des ions métalliques. On met ainsi en présence :
- soit les plaques maintenues 2 jours au contact de la solution ferrique et les cellules traitées et remises en suspension dans l'eau
- soit les plaque? maintenues 2 jours au contact de la solution ferrique et les cellules traitées et remises en suspension à pH 3.
- soit les plaques maintenues 1 heure au contact de la solution ferrique et les cellules traitées et remises en suspension dans l'eau.
On laisse reposer durant 4 h ; ensuite on lave les plaques durant 20 min par un flux laminaire d'eau de 4 mm d'épaisseur et de vitesse moyenne de 8 cm/sec. Les plaques sont examinées en microscopie optique et les cellules immobilisées sont comptées.
Dans tous les cas les cellules immobilisées sont distribuées de manière régulière, formant une couche cellulaire homogène dont la
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REVENDICATIONS.
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un support solide, caractésisé en ce que l'on traite, préalablement
à l'immobilisation les cellules et/ou le support solide par des solution! contenant des ions métalliques simples et/ou polynucléaires.
"Method for immobilizing globular microbial cells by
adhesion to a solid support ".
This invention was made by Mr. M. DE BREMAEKER,
Madame M. GENNEN, Messrs G. J. KAYEM, P.G.ROUXHET,
J. L. VAN HAECHT, of the Faculty of Agronomic Sciences of the Catholic University of Louvain, B-1348 Louvain-la-Neuve (Belgium).
The subject of the invention is a method for immobilizing
globular microbial cells as a regular layer
on a solid support, by the adsorption of metal ions on the support
solid and / or microbial cells.
The invention also relates to the layer of microbial cells.
thus obtained.
Methods for immobilizing cells are already known
microbials, using fixation on a support, training
flakes or when included in a matrix. Immobilization by fixation,
/ also called adsorption or adhesion, on a solid support present compared to other methods, the advantage of maintaining direct contact of the entire microbial population with the liquid medium and, consequently, of reducing the limitation, by the diffusional phenomena, transport of nutrients or substances produced by
microorganisms. It also has the advantage of providing a system whose geometry cannot change during use.
The process which is the subject of U.S.A. Patent 3,821,086 allows the formation of microbial cell flakes under the action of poly-
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flakes by the formation of chelates between microbial cells and metal hydroxides.
These methods have the drawback of not maintaining direct contact of the entire immobilized microbial population with the liquid medium.
The process described in the U. S. A. 4,115,198, mainly aimed at immobilizing enzymes but mentioning the possibility of immobilizing whole cells, calls for covering a support by precipitation on the latter of a hydrated metal oxide. The fixation of biologically active substances is attributed to the formation of chelates.
This process has the drawback of necessarily forming precipitates, which requires checking the characteristics of these precipitates.
It is also known to treat an organic support with transition metals, then to dry it and to bring it into contact in an agitated medium with the cells. (Ann. N. Y. Acad. Sci. 1979, 326, 249-54). This method has the disadvantage of being limited to an organic support, of requiring drying, which is a long and costly operation, and of not allowing a regular covering of the surface of the support.
One of the objects of the present invention is to develop a method for immobilizing globular microbial cells by a simple and effective method which does not require complicated procedures.
The present invention, based on the adsorption of metal ions on microbial cells and / or the solid support, aims to
to fix a single cellular layer, regularly distributed over the entire surface of the support and strongly adhering thereto.
The cells immobilized according to the method of the present invention have a high degree of viability, that is to say that a high proportion of them retains the capacity in particular to carry out enzymatic reactions and to reproduce in an appropriate medium. .
Another object of the invention is to obtain stable complexes formed from a single cell layer and from the support which can be used directly in reactors, for example fermentation. By stable complexes, we also understand complexes of different nature
(support and / or cell) can for example be combined and used in the form of multiple lamellar layers. It is possible, for example, to superimpose on the same support immobilized cell layers of different microorganisms, or to superimpose a series of complexes each consisting of a support to which a cell layer is fixed, the microorganisms being of identical nature or different from one layer to the other. or within the same layer. All combinations are possible without departing from the scope of this agreement.
The invention, as characterized in the claims, consists in treating, before immobilization, the cells and / or the support, with solutions containing simple metal ions and / or polynuclear metal ions formed by association of several atoms metallic, oxygen and hydrogen. These simple and / or polynuclear ions adsorb on the treated materials.
The link between cells and support is explained by a favorable result of interactions at the cell-solution, support-solution and cell-support interfaces. Among these interactions, we can distinguish electrostatic interactions (charge-charge and charge-dipole), Van der Waals interactions, hydrogen bonds. Given the importance of the charge-charge electrostatic interactions, the fact that the adsorbed ions reduce the charge of the support or of the cell, or make the charge of one sign contrary to the charge of the other is a very important element. favorable.
To explain the behavior of the systems and the choice of operating conditions, it is also necessary to take into account the chemical properties of these ions as a function of pH.
The solid supports used according to the present invention comprise solid mineral and organic materials. The support
to be used may or may not be porous; for certain applications it may be preferable to use a non-porous support and not having cells on the surface, so that all of the immobilized cells can be directly exposed to the flow of a liquid. Among the mineral compounds, let us quote the use of silica, silicates and aluminosilicates, metallic oxides, metals and their alloys, etc ... One can use for example glass, a ceramic, the slag, the sand. Among the organic compounds, mention may be made of the use of synthetic polymers and / or copolymers, for example polyamides, polyesters, polyolefins, vinyl compounds.
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and are in no way limiting. When choosing the support, both physical and mechanical, economic and operational considerations will be taken into account.
The supports used can be in very diverse forms, for example granules, powder, beads, plates, tubes, ropes, membranes, fabrics, knits, threads, fibers, any profiles.
By globular microbial cells we understand the
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of the type, for example, yeasts, bacteria, micro-fungi.
By cellular layer is understood a single cellular layer or monolayer having on the surface of the support approximately a cellular foundation, which can be characterized by a number
cells per unit area, designated by the term immobilized cell density s.
The aqueous solutions containing simple or polynuclear metal ions used according to the present invention are obtained from metal salts, for example chloride, nitrate, sulfate, magnesium and alkaline-earth, aluminum, transition metals, in particular Cr, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, these examples not being limiting.
To obtain solutions of simple metal ions, their concentration must be low enough, their pH low enough and the temperature low enough so that, under the operating conditions, the reaction of
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formation of polynuclear ions or precipitate.
Polynuclear metal ions are formed by the association of several identical or different metal atoms, oxygen, hydrogen and possibly other elements.
To obtain solutions of polynuclear metal ions, the concentration, pH, temperature and age of the solutions must be such that the reaction of the metal atoms with oxygen and hydroxyl, and other anions possibly present in the solution gives rise to the formation of polynuclear ions but no precipitate. Depending on the conditions he seeks, a person skilled in the art can vary the nature of the
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ablutions and the introduction of reagents, for example complexing agents, capable of acting on the chemical processes involving the metallic elements.
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simple and polynuclear metal ions.
According to a first embodiment of the present invention, the globular microbial cells are treated with aqueous solutions containing simple metal ions. This treatment
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10 ml of a suspension of Saccharomyces cerevisiae at a concentration of approximately 500.106 cells / ml and 10 ml of an aluminum nitrate solution of 2 to 200 mg Al./l in a glass tube with a capacity of 30 ml.
The stoppered tube is stirred for 24 h at 25 ° C. The pH of the suspensions varies from 3.6 to 3.9 depending on their composition. Cells are separated
of the solution by centrifugation and the aluminum remaining in the supernatant is assayed by atomic absorption, the quantity of aluminum fixed is determined by difference.
The results obtained indicate that the amount of aluminum
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characteristics of a specific adsorption.
According to an alternative embodiment of the method, the solid supports are treated with solutions containing simple metal ions. This treatment is carried out for example by immersing the solid support in an aqueous solution containing the ions; the volume and the concentration of the solution are chosen so as to absorb a sufficient quantity of ions on the surface of the support.
According to another variant, both the cells and
support with solutions containing simple metal ions. In this case, the procedure is as above for each of the treatments and the cells are then immobilized on the support.
According to a second embodiment of this
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as described above.
It is not excluded to envisage the treatment of the cells with solutions containing simple metal ions and of the solid support with solutions containing polynuclear metal ions and vice versa. All forms of combination are possible without departing from the scope of the present invention.
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has organic groups capable of forming chelates with ions. It is not necessary to dry the support after its treatment with ions. With the correct formulation, we can simply treat the cells with ions.
The advantages obtained thanks to this invention are the obtaining of a single base of cells all fixed to the support, of a high quantity of cells immobilized per unit area of the support, of a regular distribution of the cells on the surface of the support. , strong adhesion of the cells to the support. The immobilization of cells in a single and regular base strongly adhering to the support has the advantage of
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and metabolites produced near them, to allow the use of one. high flow of liquid in contact with cells and therefore a reduction in diffusional limitations, to allow homogeneous regeneration of the entire immobilized population, to allow the use of cells immobilized on a support both in an agitated bed and in a fixed bed.
These benefits are particularly valuable for certain uses
of these immobilized cells, such as the assimilation or production of substances of high molecular weight, the production of a continuous seeding device or the production of a device for harvesting first generation cells which do not have donated daughter cells. The fact of not introducing a chemical agent other than the support in contact with the cells and of using a chemically inert support is an appreciable advantage for certain applications of the immobilized cells.
The present invention will be better understood with the aid of the nonlimiting examples below.
Example 1.
10 ml of a suspension of Saccharomyces cerevisiae at a concentration of approximately 500.106 cells / ml are simultaneously introduced and
10 ml of an aqueous solution of aluminum nitrate with a concentration of
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single ions. Then, the suspension is poured into a container in which there is a glass plate. The height of the suspension is
0.5 cm above the level of the plate. After approximately 5 minutes, the glass plate is subjected to washing for 20 minutes by a laminar flow of water with a thickness of 4 mm and an average speed of 8 cm / sec. The plates are examined by light microscopy and the immobilized cells are counted.
The immobilized cells are distributed regularly, forming a homogeneous cell layer with a density of 40,000 cells.
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immobilized retain the ability to spontaneously reduce this dye.
r A comparative test was carried out under the same conditions
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irregular and do not form a homogeneous cell layer.
Example 2.
The procedure is as described in Example 1 except that the support
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A regular cellular layer of cells is also obtained, adhering to the support and resistant to the washing conditions described.
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Example 3.
The procedure is as described in Example 1, except that the suspension of cells in the aqueous aluminum nitrate solution is centrifuged at 2000 g for 5 minutes and the cells are resuspended in water, this suspension being poured on the glass plate.
A regular cellular layer of cells is also obtained, adhering to the support and resistant to the washing conditions described.
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Example 4.
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The pH is either left as is or adjusted to 3 by HN03.
The containers are closed and shaken for 1 hour. at room temperature;
at this stage the dissolved ferric ions are simple ions. Then the cell suspensions, containing an excess of ions, are poured into a container in which there are glass plates. The height of the solution is 1 cm above the surface of the glass. After 4 h, at which time the solution contains both simple and polynuclear ions, the plates are washed for 30 minutes with a stream of water with a thickness of 4 mm and an average speed of 8 cm / dry. The plates are examined by light microscopy and the immobilized cells are counted.
Table 1: Results of immobilization on the glass of Saccharomyces cerevisiae cells by treatment of these and of the support with solutions containing ferric ions.
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regularly, forming a homogeneous cell layer, the density of which is given in Table 1.
It should be emphasized that no precipitate of an iron compound does! is formed under these operating conditions.
The methylene blue test indicates that 90 to 99% of the immobilized cells retain the capacity to spontaneously reduce the dye. The immobilized cells retain the ability to multiply.
Example 5.
20 ml of a suspension of Saccharomyces cerevisiae at a concentration of approximately 400.106 cells / ml and 20 ml of a freshly prepared solution of ferric nitrate are mixed in plastic containers.
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The containers are closed and shaken for 15 h. at room temperature. Then the cell suspension is centrifuged at 2000 g for 5 minutes; the supernatant is removed and the cells are resuspended in water. This suspension is poured onto glass plates as described in Example 4; the plates are washed and examined as described in Example 1.
A single regular layer of adhering cells is obtained
<EMI ID = 24.1>
The physico-chemical conditions (concentration, pH, Sge) of the ferric solution in contact with the cells are such that it contains polynuclear (ions). In addition, it does not contain any precipitate of an iron compound, which has the advantage of obtaining a very regular deposit which adheres strongly to the support.
Example 6.
Glass plates are immersed for a given time in freshly prepared aqueous solutions of nitrate
<EMI ID = 25.1>
treatment are such that it contains polynuclear ions; she
does not contain any precipitate of an iron compound.
The plates thus treated are rinsed with water and placed in a container into which 50 ml of a cell suspension of Saccharomyces cerevisiae at a concentration of approximately 250.106 cells / ml are poured. After 4 h the plates are washed for 30 minutes by a laminar flow of water with a thickness of 4 mm and an average speed of
8 cm / sec. The plates are examined by light microscopy and the immobilized cells are counted.
In all cases, the immobilized cells are distributed regularly, forming a homogeneous cell layer whose density is presented in Table 2.
The results of the methylene blue test and of the cell multiplication test are the same as for Example 4.
Table 2: Results of immobilization of saccharomyces cells
cerevisiae on the glass by prior treatment of the support with a solution containing ferric ions.
<EMI ID = 26.1>
Example 7.
20 ml of a suspension of Saccharomyces cerevisiae are mixed with 20 ml of a freshly prepared aqueous solution of nitrate
<EMI ID = 27.1>
ambient, the cells are then separated from the solution by centrifugation at 2000 g for 5 minutes, and resuspended in 40 ml of water or of an HNO 3 solution at pH 3.
Glass plates are immersed in an aqueous solution
<EMI ID = 28.1>
The soaking time is either one hour or two days. Then
the plates are rinsed with water.
The wet glass plates, thus treated with metal ions, are placed in a container into which the cell suspension is poured, the cells of which have been treated with metal ions. We thus bring together:
- either the plates maintained for 2 days in contact with the ferric solution and the cells treated and resuspended in water
- either the plates? maintained for 2 days in contact with the ferric solution and the treated cells and resuspended at pH 3.
- or the plates kept for 1 hour in contact with the ferric solution and the treated cells and resuspended in water.
Leave to stand for 4 h; then the plates are washed for 20 min by a laminar flow of water 4 mm thick and at an average speed of 8 cm / sec. The plates are examined by light microscopy and the immobilized cells are counted.
In all cases, the immobilized cells are distributed regularly, forming a homogeneous cell layer whose
<EMI ID = 29.1>
CLAIMS.
<EMI ID = 30.1>
a solid support, characterized in that it is treated beforehand
to immobilize the cells and / or the solid support with solutions! containing simple and / or polynuclear metal ions.